Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Naggamit ka og bersyon sa browser nga limitado ang suporta sa CSS. Para sa pinakamaayong kasinatian, among girekomendar nga mogamit ka og updated nga browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Dugang pa, aron masiguro ang padayon nga suporta, among gipakita ang site nga walay mga style ug JavaScript.
Nagpakita og carousel nga gilangkoban og tulo ka slide sa usa ka higayon. Gamita ang mga buton nga Previous ug Next aron mobalhin sa tulo ka slide matag higayon, o gamita ang mga buton sa slider sa katapusan aron mobalhin sa tulo ka slide matag higayon.
Ang blood-brain barrier ug ang blood-brain barrier nagpugong sa mga biotherapeutic agent nga makaabot sa ilang mga target sa central nervous system, sa ingon nakababag sa epektibo nga pagtambal sa mga sakit sa neurological. Aron makadiskubre og bag-ong mga brain transporter in vivo, among gipaila ang usa ka T7 phage peptide library ug sunod-sunod nga gikolekta ang dugo ug cerebrospinal fluid (CSF) gamit ang usa ka cannulated conscious large pool model sa mga ilaga. Ang mga espesipikong phage clone gipadaghan pag-ayo sa CSF pagkahuman sa upat ka hugna sa pagpili. Ang pagsulay sa indibidwal nga mga kandidato nga peptide nagpadayag og labaw sa 1000 ka pilo nga pagpayaman sa CSF. Ang bioactivity sa peptide-mediated delivery sa utok gikumpirma sa 40% nga pagkunhod sa lebel sa amyloid-β sa cerebrospinal fluid gamit ang usa ka BACE1 peptide inhibitor nga nalambigit sa nailhan nga bag-ong transit peptide. Kini nga mga resulta nagsugyot nga ang mga peptide nga giila sa in vivo phage selection methods mahimong mapuslanon nga mga sakyanan alang sa systemic delivery sa macromolecules sa utok nga adunay therapeutic effect.
Ang panukiduki sa central nervous system (CNS) targeted therapy naka-focus sa pag-ila sa mga na-optimize nga tambal ug mga ahente nga nagpakita sa mga kabtangan sa CNS-targeting, nga adunay gamay nga paningkamot sa pagdiskobre sa mga mekanismo nga nagduso sa aktibo nga paghatud sa tambal sa utok. Nagsugod na kini sa pagbag-o karon tungod kay ang paghatud sa tambal, labi na ang dagkong mga molekula, usa ka hinungdanon nga bahin sa moderno nga pag-uswag sa tambal sa neuroscience. Ang palibot sa central nervous system maayo nga gipanalipdan sa cerebrovascular barrier system, nga gilangkoban sa blood-brain barrier (BBB) ​​​​ug sa blood-brain barrier (BCBB)1, nga naghimo niini nga mahagiton sa paghatud sa mga tambal sa utok1,2. Gibanabana nga hapit tanan nga dagkong molekula nga tambal ug labaw sa 98% sa gagmay nga molekula nga tambal ang giwagtang gikan sa utok3. Mao nga hinungdanon kaayo ang pag-ila sa bag-ong mga sistema sa transportasyon sa utok nga naghatag episyente ug piho nga paghatud sa mga therapeutic nga tambal sa CNS 4,5. Bisan pa, ang BBB ug BCSFB naghatag usab usa ka maayo kaayo nga oportunidad alang sa paghatud sa tambal samtang kini mosulod ug mosulod sa tanan nga mga istruktura sa utok pinaagi sa halapad nga vasculature niini. Busa, ang kasamtangang mga paningkamot sa paggamit sa dili-invasive nga mga pamaagi sa paghatud sa utok kasagaran gibase sa mekanismo sa receptor-mediated transport (PMT) gamit ang endogenous BBB6 receptor. Bisan pa sa bag-o nga mga importanteng pag-uswag gamit ang transferrin receptor pathway7,8, gikinahanglan ang dugang nga pag-uswag sa mga bag-ong sistema sa paghatud nga adunay gipauswag nga mga kabtangan. Tungod niini, ang among tumong mao ang pag-ila sa mga peptide nga makahimo sa pag-mediate sa transportasyon sa CSF, tungod kay kini sa prinsipyo magamit sa paghatud sa mga macromolecule sa CNS o sa pag-abli sa mga bag-ong agianan sa receptor. Sa partikular, ang mga piho nga receptor ug transporter sa cerebrovascular system (BBB ug BSCFB) mahimong magsilbing potensyal nga target alang sa aktibo ug piho nga paghatud sa mga biotherapeutic nga tambal. Ang Cerebrospinal fluid (CSF) usa ka secretory nga produkto sa choroid plexus (CS) ug direktang nakigkontak sa interstitial fluid sa utok pinaagi sa subarachnoid space ug ventricular space4. Bag-ohay lang gipakita nga ang subarachnoid cerebrospinal fluid mokaylap og sobra sa interstitium sa utok9. Nanghinaut mi nga maka-access sa parenchymal space gamit kining subarachnoid inflow tract o direkta pinaagi sa BBB. Aron makab-ot kini, among gipatuman ang usa ka lig-on nga in vivo phage selection strategy nga sulundon nga makaila sa mga peptide nga gidala sa bisan hain niining duha ka managlahing agianan.
Karon among gihulagway ang usa ka sequential in vivo phage display screening method nga adunay CSF sampling nga giubanan sa high throughput sequencing (HTS) aron mabantayan ang inisyal nga mga hugna sa pagpili nga adunay labing taas nga library diversity. Ang screening gihimo sa mga ilaga nga adunay mahunahunaon nga permanente nga gitanom nga dako nga cisterna (CM) cannula aron malikayan ang kontaminasyon sa dugo. Importante, kini nga pamaagi nagpili sa parehas nga pag-target sa utok ug mga peptide nga adunay kalihokan sa transportasyon tabok sa cerebrovascular barrier. Gigamit namo ang mga T7 phage tungod sa ilang gamay nga gidak-on (~60 nm)10 ug gisugyot nga kini angay alang sa pagdala sa mga vesicle nga nagtugot sa transcellular crossing sa endothelial ug/o epithelial-medulla barrier. Pagkahuman sa upat ka hugna sa panning, ang mga populasyon sa phage gi-isolate nga nagpakita sa kusog nga in vivo CSF ​​​​enrichment ug cerebral microvessel association. Importante, among nakumpirma ang among mga nahibal-an pinaagi sa pagpakita nga ang gipalabi ug kemikal nga gi-synthesize nga labing maayo nga kandidato nga mga peptide makahimo sa pagdala sa kargamento sa protina ngadto sa cerebrospinal fluid. Una, ang mga pharmacodynamic nga epekto sa CNS natukod pinaagi sa paghiusa sa usa ka nanguna nga transit peptide nga adunay usa ka inhibitor sa BACE1 peptide. Gawas pa sa pagpakita nga ang in vivo functional screening strategies makaila sa bag-ong brain transport peptides isip epektibong protein cargo carriers, gilauman namo nga ang susamang functional selection approaches mahimong importante usab sa pag-ila sa bag-ong brain transport pathways.
Base sa plaque-forming units (PFU), human sa phage packaging step, usa ka library sa random 12-mer linear T7 phage peptides nga adunay diversity nga gibana-bana nga 109 ang gidisenyo ug gihimo (tan-awa ang Materials and Methods). Importante nga matikdan nga among gisusi pag-ayo kini nga library sa wala pa ang in vivo panning. Ang PCR amplification sa mga sample sa phage library gamit ang modified primers nakamugna og mga amplicon nga direktang magamit sa HTS (Supplementary Fig. 1a). Tungod sa a) HTS11 sequencing errors, b) epekto sa kalidad sa primers (NNK)1-12, ug c) ang presensya sa wild-type (wt) phage (skeleton inserts) sa standby library, usa ka sequence filtering procedure ang gipatuman aron makuha lamang ang napamatud-an nga impormasyon sa sequence (Supplementary Fig. 1b). Kini nga mga filter steps magamit sa tanang HTS sequencing libraries. Para sa standard library, usa ka total nga 233,868 reads ang nakuha, diin 39% ang nakapasar sa filter criteria ug gigamit para sa library analysis ug selection para sa sunod nga mga round (Supplementary Figure 1c–e). Ang mga nabasa kasagaran mga multiple sa 3 ka base pairs ang gitas-on nga adunay peak sa 36 ka nucleotides (Supplementary Fig. 1c), nga nagpamatuod sa library design (NNK) 1-12. Talalupangdon nga gibana-bana nga 11% sa mga miyembro sa librarya adunay sulod nga 12-dimensional wild-type (wt) backbone PAGISRELVDKL insert, ug halos katunga sa mga sequence (49%) adunay mga insertion o deletion. Ang HTS sa librarya nagpamatuod sa taas nga diversity sa mga peptide sa librarya: labaw sa 81% sa mga peptide sequence ang nakit-an kausa ra ug 1.5% ra ang nahitabo sa ≥4 ka kopya (Supplementary Fig. 2a). Ang mga frequency sa amino acids (aa) sa tanang 12 ka posisyon sa repertoire maayo ang correlation sa mga frequency nga gilauman alang sa gidaghanon sa mga codon nga namugna sa degenerate NKK repertoire (Supplementary Fig. 2b). Ang naobserbahan nga frequency sa aa residues nga gi-encode niining mga insert maayo ang correlation sa gikalkulo nga frequency (r = 0.893) (Supplementary Fig. 2c). Ang pag-andam sa mga phage libraries para sa injection naglakip sa mga lakang sa amplification ug pagtangtang sa endotoxin. Kini kaniadto gipakita nga posibleng makapakunhod sa diversity sa mga phage libraries12,13. Busa, among gi-sequence ang usa ka plate-amplified phage library nga gi-endotoxin removal ug gitandi kini sa orihinal nga library aron mabanabana ang frequency sa AA. Usa ka kusog nga correlation (r = 0.995) ang naobserbahan tali sa orihinal nga pool ug sa amplified ug purified pool (Supplementary Fig. 2d), nga nagpakita nga ang kompetisyon tali sa mga clone nga gi-amplified sa mga plate gamit ang T7 phage wala hinungdan sa dakong bias. Kini nga pagtandi gibase sa frequency sa mga tripeptide motif sa matag library, tungod kay ang diversity sa mga library (~109) dili hingpit nga makuha bisan sa HTS. Ang frequency analysis sa aa sa matag posisyon nagpadayag sa usa ka gamay nga position-dependent bias sa katapusang tulo ka posisyon sa gisulod nga repertoire (Supplementary Fig. 2e). Sa konklusyon, among nahinapos nga ang kalidad ug diversity sa library madawat ug gamay ra nga mga pagbag-o sa diversity ang naobserbahan tungod sa amplification ug pag-andam sa mga phage libraries tali sa daghang mga hugna sa pagpili.
Ang serial cerebrospinal fluid sampling mahimong himoon pinaagi sa pag-implant og cannula sa CM sa mga ilaga nga adunay panimuot aron mapadali ang pag-ila sa T7 phage nga gi-inject sa intravenous (iv) pinaagi sa BBB ug/o BCSFB (Fig. 1a-b). Migamit kami og duha ka independent selection arms (arms A ug B) sa unang tulo ka hugna sa in vivo selection (Fig. 1c). Hinay-hinay namong gipataas ang stringency sa selection pinaagi sa pagkunhod sa kinatibuk-ang gidaghanon sa phage nga gipaila sa unang tulo ka hugna sa selection. Alang sa ikaupat nga hugna sa panning, among gihiusa ang mga sample gikan sa mga branch A ug B ug naghimo og tulo ka dugang nga independent selections. Aron tun-an ang in vivo properties sa T7 phage particles niini nga modelo, ang wild-type phage (PAGISRELVDKL master insert) gi-inject sa mga ilaga pinaagi sa tail vein. Ang pagbawi sa mga phage gikan sa cerebrospinal fluid ug dugo sa lain-laing mga time point nagpakita nga ang medyo gagmay nga T7 icosahedral phages adunay paspas nga initial clearance phase gikan sa blood compartment (Supplementary Fig. 3). Base sa mga titer nga gihatag ug sa gidaghanon sa dugo sa mga ilaga, among gikalkulo nga gibana-bana lang nga 1% nga wt. phage gikan sa gihatag nga dosis ang nakita sa dugo 10 minutos human sa intravenous injection. Human niining inisyal nga paspas nga pagkunhod, usa ka hinay nga primary clearance ang gisukod nga adunay half-life nga 27.7 minutos. Importante, pipila ra kaayo ka phage ang nakuha gikan sa CSF compartment, nga nagpakita sa ubos nga background alang sa wild-type phage migration ngadto sa CSF compartment (Supplementary Fig. 3). Sa aberids, mga 1 x 10-3% lang ka titer sa T7 phage sa dugo ug 4 x 10-8% sa inisyal nga infused phage ang nakita sa cerebrospinal fluid sa tibuok sampling period (0-250 min). Talalupangdon nga ang half-life (25.7 min) sa wild-type phage sa cerebrospinal fluid parehas sa naobserbahan sa dugo. Kini nga datos nagpakita nga ang babag nga nagbulag sa CSF compartment gikan sa dugo wala madaot sa mga ilaga nga gi-cannulate sa CM, nga nagtugot sa in vivo nga pagpili sa mga phage libraries aron mailhan ang mga clone nga dali nga madala gikan sa dugo ngadto sa CSF compartment.
(a) Pag-andam og pamaagi para sa pag-re-sampling sa cerebrospinal fluid (CSF) gikan sa usa ka dako nga pool. (b) Dayagram nga nagpakita sa lokasyon sa selula sa central nervous system (CNS) barrier ug ang estratehiya sa pagpili nga gigamit sa pag-ila sa mga peptide nga motabok sa blood-brain barrier (BBB) ​​​​ug sa blood-brain barrier. (c) In vivo phage display screening flowchart. Sa matag hugna sa pagpili, ang mga phage (mga animal identifier sulod sa mga pana) gi-inject pinaagi sa intravenous. Duha ka independente nga alternatibong mga sanga (A, B) ang gilain hangtod sa ika-4 nga hugna sa pagpili. Para sa selection rounds 3 ug 4, ang matag phage clone nga gikuha gikan sa CSF gi-sequence sa mano-mano. (d) Kinetics sa phage nga nahimulag gikan sa dugo (pula nga mga lingin) ug cerebrospinal fluid (berde nga mga trianggulo) atol sa unang hugna sa pagpili sa duha ka cannulated nga mga ilaga human sa intravenous injection sa T7 peptide library (2 x 1012 phages/hayop). Ang mga asul nga kwadro nagpakita sa aberids nga inisyal nga konsentrasyon sa phage sa dugo, nga gikalkulo gikan sa gidaghanon sa gi-inject nga phage, nga gikonsiderar ang kinatibuk-ang gidaghanon sa dugo. Ang mga itom nga kwadro nagpakita sa punto sa interseksyon sa linya sa y nga gi-extrapolate gikan sa mga konsentrasyon sa phage sa dugo. (e,f) Ipakita ang relatibong frequency ug distribusyon sa tanang posibleng nagsapaw-sapaw nga mga motif sa tripeptide nga makita sa peptide. Ang gidaghanon sa mga motif nga makita sa 1000 nga pagbasa gipakita. Makahuluganon (p < 0.001) ang mga enriched motif gimarkahan og pula nga mga tuldok. (e) Correlation scatterplot nga nagtandi sa relatibong frequency sa tripeptide motif sa gi-inject nga librarya uban sa phage nga gikan sa dugo gikan sa mga hayop #1.1 ug #1.2. (f) Correlation scatterplot nga nagtandi sa relatibong frequency sa mga motif sa tripeptide sa phage sa hayop #1.1 ug #1.2 nga nahimulag sa dugo ug cerebrospinal fluid. (g, h) Representasyon sa Sequence ID sa phage nga enriched sa dugo (g) batok sa gi-inject nga mga librarya ug phage nga enriched sa CSF (h) batok sa dugo human sa usa ka hugna sa in vivo selection sa duha ka hayop. Ang gidak-on sa usa ka letra nga code nagpakita kung unsa ka subsob nga makita ang amino acid sa maong posisyon. Berde = polar, purpura = neutral, asul = basic, pula = acidic ug itom = hydrophobic amino acids. Ang Figure 1a, b gidisenyo ug gihimo ni Eduard Urich.
Nag-inject mi og phage peptide library sa duha ka CM instrument rats (clades A ug B) ug gi-isolate ang phage gikan sa cerebrospinal fluid ug dugo (Figure 1d). Ang inisyal nga paspas nga clearance sa library dili kaayo klaro kon itandi sa wild-type phage. Ang aberids nga half-life sa gi-inject nga library sa duha ka hayop kay 24.8 minutos sa dugo, susama sa wild-type phage, ug 38.5 minutos sa CSF. Ang mga sample sa phage sa dugo ug cerebrospinal fluid gikan sa matag hayop gipailalom sa HTS ug ang tanang nailhan nga peptides gi-analisa para sa presensya sa usa ka mubo nga tripeptide motif. Gipili ang mga tripeptide motif tungod kay kini naghatag og gamay nga basehan para sa pagporma sa istruktura ug mga interaksyon sa peptide-protein14,15. Nakakita mi og maayong correlation sa distribusyon sa mga motif tali sa gi-inject nga phage library ug mga clone nga gikuha gikan sa dugo sa duha ka hayop (Fig. 1e). Ang datos nagpakita nga ang komposisyon sa library gamay ra ang pagka-enriched sa blood compartment. Ang mga amino acid frequencies ug consensus sequences gi-analisa pa sa matag posisyon gamit ang adaptation sa Weblogo16 software. Makapainteres, nakakita kami og kusog nga pagpayaman sa mga residue sa glycine sa dugo (Fig. 1g). Sa dihang gitandi ang dugo sa mga clone nga gipili gikan sa CSF, naobserbahan ang kusog nga pagpili ug pipila ka deselection sa mga motif (Fig. 1f), ug ang pipila ka amino acid mas gusto nga anaa sa gitakda nang daan nga mga posisyon sa 12-member (Fig. 1h). Talalupangdon nga ang indibidwal nga mga hayop managlahi pag-ayo sa cerebrospinal fluid, samtang ang pagpayaman sa glycine sa dugo naobserbahan sa duha ka hayop (Supplementary Fig. 4a–j). Human sa hugot nga pagsala sa datos sa sequence sa cerebrospinal fluid sa mga hayop #1.1 ug #1.2, usa ka total nga 964 ug 420 nga talagsaon nga 12-mer peptides ang nakuha (Supplementary Fig. 1d–e). Ang nahimulag nga mga clone sa phage gi-amplify ug gipailalom sa ikaduhang hugna sa in vivo selection. Ang phage nga gikuha gikan sa ikaduhang hugna sa pagpili gipailalom sa HTS sa matag hayop ug ang tanan nga nailhan nga mga peptide gigamit isip input sa usa ka programa sa pag-ila sa motif aron ma-analisa ang pagkahitabo sa mga motif sa tripeptide (Fig. 2a, b, ef). Kon itandi sa unang siklo sa phage nga nakuha gikan sa CSF, among naobserbahan ang dugang nga pagpili ug pagtangtang sa pagpili sa daghang mga motif sa CSF sa mga sanga A ug B (Fig. 2). Usa ka network identification algorithm ang gigamit aron mahibal-an kung kini nagrepresentar ba sa lainlaing mga sumbanan sa makanunayon nga han-ay. Usa ka klaro nga pagkaparehas ang naobserbahan tali sa 12-dimensional nga mga han-ay nga nakuha sa CSF sa alternatibong clade A (Fig. 2c, d) ug clade B (Fig. 2g, h). Ang pooled analysis sa matag sanga nagpadayag sa lainlaing mga profile sa pagpili alang sa 12-mer peptides (Supplementary Fig. 5c,d) ug usa ka pagtaas sa CSF/blood titer ratio sa paglabay sa panahon alang sa pooled clones pagkahuman sa ikaduhang hugna sa pagpili kon itandi sa unang hugna sa pagpili (Supplementary Fig. 5e).
Pagpauswag sa mga motif ug peptide sa cerebrospinal fluid pinaagi sa duha ka sunod-sunod nga hugna sa in vivo functional phage display selection.
Ang tanang cerebrospinal fluid phages nga nakuha gikan sa unang hugna sa matag hayop (mga hayop #1.1 ug #1.2) gi-pool, gi-amplify, gi-HT-sequence ug gi-reinject pag-usab (2 x 1010 phages/hayop) 2 SM cannulated nga mga ilaga (#1.1 → #). 2.1 ug 2.2, 1.2 → 2.3 ug 2.4). (a,b,e,f) Mga correlation scatterplots nga nagtandi sa relatibong frequency sa mga tripeptide motif sa tanang CSF-derived phages sa una ug ikaduhang hugna sa pagpili. Relatibong frequency ug distribusyon sa mga motif nga nagrepresentar sa tanang posibleng nagsapaw-sapaw nga mga tripeptide nga makita sa mga peptide sa duha ka oryentasyon. Ang gidaghanon sa mga motif nga makita sa 1000 ka pagbasa gipakita. Ang mga motif nga significantly (p < 0.001) napili o wala gilakip sa usa sa gitandi nga mga librarya gi-highlight gamit ang mga pulang tuldok. (c, d, g, h) Representasyon sa logo sa sequence sa tanang CSF-rich 12 amino acid long sequences base sa rounds 2 ug 1 sa in vivo selection. Ang gidak-on sa one-letter code nagpakita kon unsa ka subsob makita ang amino acid sa maong posisyon. Aron irepresentar ang logo, ang frequency sa CSF sequences nga gikuha gikan sa indibidwal nga mga hayop taliwala sa duha ka selection rounds gitandi ug ang enriched sequences sa ikaduhang round gipakita: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ug (h) #1.2–#2.4. Ang pinaka-enriched amino acids sa usa ka gihatag nga posisyon sa (c, d) nga mga hayop no. 2.1 ug no. 2.2 o (g, h) sa mga hayop no. 2.3 ug no. 2.4 gipakita sa kolor. Berde = polar, purple = neutral, asul = basic, pula = acidic ug itom = hydrophobic amino acids.
Human sa ikatulong hugna sa pagpili, among nailhan ang 124 ka talagsaon nga peptide sequences (#3.1 ug #3.2) gikan sa 332 ka CSF-reconstituted phage clones nga nahimulag gikan sa duha ka hayop (Supplementary Fig. 6a). Ang sequence nga LGSVS (18.7%) adunay pinakataas nga relatibong proporsyon, gisundan sa wild-type inserts nga PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ug SARGSWREIVSLS (2.2%). Sa katapusang ikaupat nga hugna, among gihiusa ang duha ka independente nga gipili nga mga sanga gikan sa tulo ka managlahing hayop (Fig. 1c). Sa 925 ka sequenced phage clones nga nakuha gikan sa CSF, sa ikaupat nga hugna nakakita kami og 64 ka talagsaon nga peptide sequences (Supplementary Fig. 6b), diin ang relatibong proporsyon sa wild-type phage miubos ngadto sa 0.8%. Ang labing komon nga mga CSF clone sa ikaupat nga hugna mao ang LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ug RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). Ang gitas-on sa mga napili nga peptide tungod sa mga nucleotide insertion/deletion o premature stop codons sa mga library primer kung mogamit og degenerate codons para sa disenyo sa NNK library. Ang premature stop codons makamugna og mas mubo nga mga peptide ug gipili tungod kay kini adunay paborableng aa motif. Ang mas taas nga mga peptide mahimong resulta sa mga insertion/deletion sa mga primer sa synthetic libraries. Kini nagpahimutang sa gidisenyo nga stop codon sa gawas sa frame ug nagbasa niini hangtod nga ang usa ka bag-ong stop codon makita sa ubos nga bahin. Sa kinatibuk-an, among gikalkulo ang mga enrichment factors para sa tanang upat ka selection rounds pinaagi sa pagtandi sa input data sa sample output data. Alang sa unang hugna sa screening, among gigamit ang wild-type phage titers isip non-specific background reference. Makapainteres, ang negatibo nga pagpili sa phage kusog kaayo sa unang siklo sa CSF, apan dili sa dugo (Fig. 3a), nga mahimong tungod sa ubos nga posibilidad sa passive diffusion sa kadaghanan sa mga miyembro sa peptide library ngadto sa CSF compartment o ang relatibong mga phage lagmit nga mas episyente nga mapadayon o matangtang gikan sa agos sa dugo kaysa mga bacteriophage. Bisan pa, sa ikaduhang hugna sa panning, ang kusog nga pagpili sa mga phage sa CSF naobserbahan sa duha ka clade, nga nagsugyot nga ang miaging hugna gipayaman sa mga phage nga nagpakita sa mga peptide nga nagpasiugda sa pag-uptake sa CSF (Fig. 3a). Sa makausa pa, nga walay dakong pagpayaman sa dugo. Usab sa ikatulo ug ikaupat nga hugna, ang mga phage clone gipayaman pag-ayo sa CSF. Kung itandi ang relatibong frequency sa matag talagsaon nga peptide sequence tali sa katapusang duha ka hugna sa pagpili, among nakita nga ang mga sequence mas gipayaman pa sa ikaupat nga hugna sa pagpili (Fig. 3b). Usa ka total nga 931 ka tripeptide motif ang nakuha gikan sa tanan nga 64 ka talagsaon nga peptide sequence gamit ang duha ka peptide orientations. Ang labing gipadato nga mga motif sa ikaupat nga hugna mas gisusi pag-ayo alang sa ilang mga profile sa pagpadato sa tanang hugna kon itandi sa gi-inject nga librarya (cut-off: 10% nga pagpadato) (Supplementary Fig. 6c). Ang kinatibuk-ang mga sumbanan sa pagpili nagpakita nga kadaghanan sa gitun-an nga mga motif gipadato sa tanang miaging hugna sa duha ka sanga sa pagpili. Bisan pa, ang ubang mga motif (pananglitan SGL, VSG, LGS GSV) kasagaran gikan sa alternatibong clade A, samtang ang uban (pananglitan FGW, RTN, WGF, NTR) gipadato sa alternatibong clade B.
Pag-validate sa transportasyon sa CSF sa mga peptide nga gipakita sa phage nga gipayaman sa CSF ug mga biotinylated leader peptide nga gihiusa sa mga payload sa streptavidin.
(a) Mga ratio sa pagpayaman nga gikalkulo sa tanang upat ka hugna (R1-R4) base sa gi-inject nga (input = I) phage (PFU) titers ug gitino nga CSF phage titers (output = O). Ang mga enrichment factor sa katapusang tulo ka hugna (R2-R4) gikalkulo pinaagi sa pagtandi sa miaging hugna ug sa unang hugna (R1) nga adunay datos sa gibug-aton. Ang mga open bar kay cerebrospinal fluid, ang mga shaded bar kay plasma. (***p<0.001, base sa Student's t-test). (b) Lista sa labing daghang phage peptides, gi-ranggo sumala sa ilang relatibong proporsyon sa tanang phages nga nakolekta sa CSF human sa hugna 4 sa pagpili. Ang unom ka labing komon nga phage clones gi-highlight sa kolor, ginumerohan ug ang ilang mga enrichment factors tali sa hugna 3 ug 4 sa pagpili (mga inset). (c,d) Ang unom ka labing gipayaman nga phage clones, walay sulod nga phage ug parental phage peptide libraries gikan sa hugna 4 gisusi nga tagsa-tagsa sa usa ka CSF sampling model. Ang mga sample sa CSF ug dugo gikolekta sa gipakita nga mga punto sa oras. (c) Parehas nga gidaghanon sa 6 ka kandidato nga phage clones (2 x 1010 phages/hayop), walay sulod nga phages (#1779) (2 x 1010 phages/hayop) ug stock phage peptide libraries (2 x 1012 phages/hayop). I-inject ang labing menos 3 CM nga gilain sa cannulated nga hayop pinaagi sa tail vein. Ang CSF pharmacokinetics sa matag gi-inject nga phage clone ug phage peptide library sa paglabay sa panahon gipakita. (d) nagpakita sa average nga CSF/blood ratio para sa tanang nakuha nga phages/mL sa paglabay sa panahon sa sampling. (e) Upat ka synthetic leader peptides ug usa ka scrambled control ang gi-link sa biotin ngadto sa streptavidin pinaagi sa ilang N-terminus (tetramer display) gisundan sa injection (tail vein iv, 10 mg streptavidin/kg). Labing menos tulo ka intubated nga mga ilaga (N = 3). ). Ang mga sample sa CSF gikolekta sa gipakita nga mga punto sa oras ug ang mga konsentrasyon sa streptavidin gisukod gamit ang CSF anti-streptavidin ELISA (nd = wala mamatikdi). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, base sa ANOVA test). (f) Pagtandi sa amino acid sequence sa pinaka-enriched nga phage peptide clone #2002 (purpura) uban sa ubang pinili nga phage peptide clones gikan sa ika-4 nga hugna sa pagpili. Ang parehas ug susamang mga tipik sa amino acid gi-color-code.
Sa tanang enriched phages sa ikaupat nga hugna (Fig. 3b), unom ka candidate clones ang gipili alang sa dugang nga individual analysis sa CSF sampling model. Parehas nga gidaghanon sa unom ka candidate phage, empty phage (walay insert) ug prophage peptide libraries ang gi-inject sa tulo ka cannulated CM animals, ug ang pharmacokinetics gitino sa CSF (Fig. 3c) ug blood (Supplementary Fig. 7) assays. Ang tanang phage clones nga gisulayan nag-target sa CSF compartment sa lebel nga 10-1000 ka pilo nga mas taas kaysa sa empty control phage (#1779). Pananglitan, ang mga clones #2020 ug #2077 adunay mga 1000 ka pilo nga mas taas nga CSF titers kaysa control phage. Lahi ang pharmacokinetic profile sa matag napili nga peptide, apan silang tanan adunay taas nga CSF homing ability. Nakabantay mi og makanunayong pagkunhod sa paglabay sa panahon para sa mga clone #1903 ug #2011, samtang para sa mga clone #2077, #2002 ug #2009 ang pagtaas sa unang 10 ka minuto mahimong magpakita og aktibong transportasyon apan kinahanglan nga susihon. Ang mga clone #2020, #2002, ug #2077 milig-on sa taas nga lebel, samtang ang konsentrasyon sa CSF sa clone #2009 hinayhinay nga mikunhod human sa inisyal nga pagtaas. Dayon among gitandi ang relatibong frequency sa matag kandidato sa CSF sa konsentrasyon sa dugo niini (Fig. 3d). Ang korelasyon sa mean titer sa matag kandidato sa CSF sa titer sa dugo niini sa tanang oras sa sampling nagpakita nga tulo sa unom ka kandidato ang adunay dakong kantidad sa CSF sa dugo. Makapainteres, ang clone #2077 nagpakita og mas taas nga kalig-on sa dugo (Supplementary Figure 7). Aron makumpirma nga ang mga peptide mismo makahimo sa aktibong pagdala sa kargamento gawas sa mga partikulo sa phage ngadto sa kompartamento sa CSF, among gi-synthesize ang upat ka leader peptides nga gi-derivatize sa biotin sa N-terminus diin ang mga peptide motapot sa partikulo sa phage. Ang mga biotinylated peptides (nos. 2002, 2009, 2020 ug 2077) gi-conjugate sa streptavidin (SA) aron makakuha og multimeric nga mga porma nga medyo nagsundog sa geometry sa phage. Kini nga format nagtugot usab kanamo sa pagsukod sa exposure sa SA sa dugo ug cerebrospinal fluid isip mga cargo-transporting protein peptides. Importante, ang datos sa phage kanunay nga makopya kung ang mga synthetic peptides gi-administer niining SA-conjugated format (Fig. 3e). Ang scrambled peptides adunay gamay nga inisyal nga exposure ug mas paspas nga CSF clearance nga adunay dili mamatikdan nga lebel sulod sa 48 ka oras. Aron makakuha og panabut sa mga agianan sa paghatud niining mga peptide phage clones ngadto sa CSF space, among gisusi ang lokalisasyon sa indibidwal nga phage peptide hits gamit ang immunohistochemistry (IHC) aron direktang makit-an ang mga phage particle 1 ka oras pagkahuman sa intravenous injection in vivo. Ilabi na, ang mga clone #2002, #2077, ug #2009 mahimong mamatikdan pinaagi sa kusog nga pagmantsa sa mga capillary sa utok, samtang ang control phage (#1779) ug clone #2020 wala mamatikdi (Supplementary Figure 8). Kini nagsugyot nga kini nga mga peptide nakatampo sa epekto sa utok pinaagi sa pagtabok sa BBB. Gikinahanglan ang dugang detalyado nga pag-analisar aron masulayan kini nga hypothesis, tungod kay ang ruta sa BSCFB mahimo usab nga nalambigit. Sa pagtandi sa amino acid sequence sa labing enriched clone (#2002) sa ubang pinili nga mga peptide, namatikdan nga ang uban niini adunay parehas nga amino acid extensions, nga mahimong magpakita sa parehas nga mekanismo sa transportasyon (Fig. 3f).
Tungod sa talagsaon nga plasma profile ug dakong pagtaas sa CSF sa paglabay sa panahon, ang phage display clone #2077 gisusi pa sulod sa mas taas nga 48-oras nga panahon ug nakahimo sa pagsubli sa paspas nga pagtaas sa CSF nga naobserbahan inubanan sa padayon nga lebel sa SA (Fig. 4a). Mahitungod sa ubang nailhan nga phage clones, ang #2077 kusganong gi-stain para sa mga capillary sa utok ug nagpakita og dakong colocalization uban sa capillary marker lectin kon tan-awon sa mas taas nga resolusyon ug posible nga pipila ka pag-stain sa parenchymal space (Figure 4b). Aron imbestigahan kon ang peptide-mediated pharmacological effects makuha ba sa CNS, naghimo kami og eksperimento diin ang biotinylated nga mga bersyon sa i) ang #2077 transit peptide ug ii) ang BACE1 inhibitor peptide gisagol sa SA sa duha ka lain-laing ratios. Para sa usa ka kombinasyon, gigamit lang namo ang BACE1 peptide inhibitor ug para sa lain, gigamit namo ang 1:3 nga ratio sa BACE1 peptide inhibitor ngadto sa #2077 peptide. Ang duha ka sample gi-inject pinaagi sa intravenous ug ang lebel sa beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) sa dugo ug cerebrospinal fluid gisukod sa paglabay sa panahon. Ang Abeta40 gisukod sa CSF tungod kay kini nagpakita sa pagpugong sa BACE1 sa brain parenchyma. Sama sa gilauman, ang duha ka complexes mikunhod pag-ayo sa lebel sa dugo sa Abeta40 (Fig. 4c, d). Bisan pa, ang mga sample lamang nga adunay sagol nga peptide no. 2077 ug usa ka inhibitor sa BACE1 peptide nga gi-conjugate sa SA ang hinungdan sa dakong pagkunhod sa Abeta40 sa cerebrospinal fluid (Fig. 4c). Ang datos nagpakita nga ang peptide no. 2077 makahimo sa pagdala sa 60 kDa SA protein ngadto sa CNS ug nag-induce usab og mga pharmacological effect gamit ang SA-conjugated inhibitors sa BACE1 peptide.
(a) Clonal injection (2 × 10 phages/hayop) sa T7 phage nga nagpakita sa long-term pharmacokinetic profiles sa CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) ug wala gi-inject nga control phage (#1779) sa labing menos tulo ka CM-intubated nga mga ilaga. (b) Confocal microscopic nga imahe sa representatibo nga cortical microvessels sa mga ilaga nga gi-inject sa phage (2 × 10 10 phages/hayop) nga nagpakita sa counterstaining sa peptide #2077 ug mga ugat (lectin). Kini nga mga phage clone gihatag sa 3 ka ilaga ug gitugotan nga mo-circulate sulod sa 1 ka oras sa wala pa ang perfusion. Ang mga utok gi-section ug gi-stain gamit ang polyclonal FITC-labeled antibodies batok sa T7 phage capsid. Napulo ka minuto sa wala pa ang perfusion ug ang sunod nga fixation, ang DyLight594-labeled lectin gihatag pinaagi sa intravenous. Mga hulagway sa fluorescent nga nagpakita sa lectin staining (pula) sa luminal nga bahin sa mga microvessel ug phage (berde) sa lumen sa mga capillary ug perivascular brain tissue. Ang scale bar katumbas sa 10 µm. (c, d) Ang Biotinylated BACE1 inhibitory peptide nga nag-inusara o inubanan sa biotinylated transit peptide #2077 gi-couple sa streptavidin gisundan sa intravenous injection sa labing menos tulo ka cannulated CM rats (10 mg streptavidin/kg). Ang BACE1 peptide inhibitor-mediated reduction sa Aβ40 gisukod pinaagi sa Aβ1-40 ELISA sa dugo (pula) ug cerebrospinal fluid (orange) sa gipakita nga mga time point. Para sa mas klaro nga pagklaro, usa ka tuldok-tuldok nga linya ang gidrowing sa graph sa sukdanan nga 100%. (c) Porsyento sa pagkunhod sa Aβ40 sa dugo (pula nga mga trianggulo) ug cerebrospinal fluid (orange nga mga trianggulo) sa mga ilaga nga gitambalan og streptavidin nga gihiusa sa transit peptide #2077 ug BACE1 inhibitory peptide sa 3:1 nga ratio. (d) Porsyento sa pagkunhod sa dugo nga Aβ40 (pula nga mga lingin) ug cerebrospinal fluid (orange nga mga lingin) sa mga ilaga nga gitambalan og streptavidin nga gihiusa sa usa ka BACE1 inhibitory peptide lamang. Ang konsentrasyon sa Aβ sa kontrol kay 420 pg/ml (standard deviation = 101 pg/ml).
Malampusong gigamit ang phage display sa daghang mga natad sa biomedical nga panukiduki17. Kini nga pamaagi gigamit alang sa in vivo vascular diversity studies18,19 ingon man mga pagtuon nga nagtumong sa cerebral vessels20,21,22,23,24,25,26. Niini nga pagtuon, among gipalapdan ang aplikasyon niini nga pamaagi sa pagpili dili lamang sa direktang pag-ila sa mga peptide nga nagtumong sa cerebral vessels, apan usab sa pagdiskobre sa mga kandidato nga adunay aktibo nga mga kabtangan sa transportasyon aron makatabok sa blood-brain barrier. Karon among gihulagway ang pag-uswag sa usa ka in vivo nga pamaagi sa pagpili sa mga ilaga nga gi-intubate sa CM ug gipakita ang potensyal niini sa pag-ila sa mga peptide nga adunay mga kabtangan sa CSF homing. Gamit ang T7 phage nga nagpakita sa usa ka librarya sa 12-mer random peptides, among napamatud-an nga ang T7 phage igo nga gamay (gibana-bana nga 60 nm ang diametro)10 aron mapahiangay sa blood-brain barrier, sa ingon direkta nga nakatabok sa blood-brain barrier o choroid plexus. Among naobserbahan nga ang pag-ani sa CSF gikan sa mga cannulated CM rats usa ka maayong pagkontrol nga in vivo functional screening method, ug nga ang nakuha nga phage dili lang nakagapos sa vasculature apan naglihok usab isip transporter tabok sa blood-brain barrier. Dugang pa, pinaagi sa dungan nga pagkolekta sa dugo ug pag-apply sa HTS sa CSF ug mga phage nga gikan sa dugo, among gikumpirma nga ang among pagpili sa CSF wala maimpluwensyahan sa pagpayaman sa dugo o kaangayan alang sa pagpalapad taliwala sa mga hugna sa pagpili. Bisan pa, ang compartment sa dugo kabahin sa pamaagi sa pagpili, tungod kay ang mga phage nga makahimo sa pag-abot sa CSF compartment kinahanglan nga mabuhi ug mo-circulate sa bloodstream nga igo nga gidugayon aron mapayaman ang ilang kaugalingon sa utok. Aron makakuha og kasaligan nga impormasyon sa sequence gikan sa hilaw nga datos sa HTS, among gipatuman ang mga filter nga gipahaum sa mga sayop sa sequencing nga espesipiko sa platform sa workflow sa pag-analisa. Pinaagi sa paglakip sa mga kinetic parameter sa pamaagi sa screening, among gikumpirma ang paspas nga pharmacokinetics sa wild-type T7 phages (t½ ~ 28 min) sa dugo24, 27, 28 ug gitino usab ang ilang half-life sa cerebrospinal fluid (t½ ~ 26 min) kada minuto). Bisan pa sa parehas nga mga profile sa pharmacokinetic sa dugo ug CSF, 0.001% ra sa konsentrasyon sa phage sa dugo ang nakita sa CSF, nga nagpakita sa ubos nga background mobility sa wild-type T7 phage tabok sa blood-brain barrier. Kini nga trabaho nagpasiugda sa kamahinungdanon sa unang hugna sa pagpili kung gamiton ang mga estratehiya sa in vivo panning, labi na sa mga sistema sa phage nga dali nga natangtang gikan sa sirkulasyon, tungod kay pipila ra ka mga clone ang makaabot sa CNS compartment. Busa, sa unang hugna, ang pagkunhod sa library diversity dako kaayo, tungod kay limitado ra ang gidaghanon sa mga clone ang nakolekta sa katapusan niining estrikto kaayo nga modelo sa CSF. Kini nga estratehiya sa in vivo panning naglakip sa daghang mga lakang sa pagpili sama sa aktibo nga akumulasyon sa CSF compartment, clone survival sa blood compartment, ug paspas nga pagtangtang sa mga T7 phage clone gikan sa dugo sulod sa unang 10 ka minuto (Fig. 1d ug Supplementary Fig. 4M). Busa, pagkahuman sa unang hugna, lainlaing mga phage clone ang nailhan sa CSF, bisan kung ang parehas nga inisyal nga pool gigamit alang sa indibidwal nga mga hayop. Kini nagsugyot nga ang daghang estrikto nga mga lakang sa pagpili alang sa mga source library nga adunay daghang mga miyembro sa librarya moresulta sa usa ka dakong pagkunhod sa diversity. Busa, ang mga random nga panghitabo mahimong usa ka integral nga bahin sa inisyal nga proseso sa pagpili, nga dako ang impluwensya sa resulta. Lagmit nga daghan sa mga clone sa orihinal nga librarya adunay parehas nga CSF enrichment propensity. Bisan pa, bisan sa parehas nga mga kondisyon sa eksperimento, ang mga resulta sa pagpili mahimong magkalainlain tungod sa gamay nga gidaghanon sa matag partikular nga clone sa inisyal nga pool.
Lahi ang mga motif nga gipayaman sa CSF sa mga naa sa dugo. Makapainteres, among namatikdan ang unang pagbalhin padulong sa glycine-rich peptides sa dugo sa indibidwal nga mga hayop. (Fig. 1g, Supplementary Figs. 4e, 4f). Ang mga phage nga adunay glycine peptides mahimong mas lig-on ug dili kaayo lagmit nga makuha gikan sa sirkulasyon. Bisan pa, kini nga mga glycine-rich peptides wala makit-i sa mga sample sa cerebrospinal fluid, nga nagsugyot nga ang mga curated libraries miagi sa duha ka lainlaing mga lakang sa pagpili: usa sa dugo ug ang lain gitugotan nga magtipon sa cerebrospinal fluid. Ang mga CSF-enriched clones nga resulta sa ikaupat nga hugna sa pagpili gisulayan pag-ayo. Halos tanan sa indibidwal nga gisulayan nga mga clone gikumpirma nga gipayaman sa CSF kumpara sa blank control phage. Usa ka peptide hit (#2077) ang gisusi sa mas detalyado. Nagpakita kini og mas taas nga plasma half-life kumpara sa ubang mga hit (Figure 3d ug Supplementary Figure 7), ug makapainteres, kini nga peptide adunay cysteine ​​​​residue sa C-terminus. Bag-ohay lang gipakita nga ang pagdugang sa cysteine ​​​​sa mga peptide makapauswag sa ilang mga kabtangan sa pharmacokinetic pinaagi sa pagbugkos sa albumin 29. Kini wala pa mahibal-i sa pagkakaron alang sa peptide #2077 ug nanginahanglan dugang nga pagtuon. Ang pipila ka mga peptide nagpakita og valence-dependency sa pagpayaman sa CSF (wala gipakita ang datos), nga mahimong may kalabotan sa gipakita nga geometry sa nawong sa T7 capsid. Ang sistema sa T7 nga among gigamit nagpakita og 5-15 ka kopya sa matag peptide matag phage particle. Ang IHC gihimo sa mga kandidato nga lead phage clones nga gi-inject sa intravenous ngadto sa cerebral cortex sa mga ilaga (Supplementary Fig. 8). Ang datos nagpakita nga labing menos tulo ka clones (No. 2002, No. 2009 ug No. 2077) nakig-interact sa BBB. Kinahanglan pa nga mahibal-an kung kini nga interaksyon sa BBB moresulta ba sa akumulasyon sa CSF o ang paglihok niini nga mga clone direkta sa BCSFB. Importante, among gipakita nga ang mga napili nga peptide nagpabilin sa ilang kapasidad sa transportasyon sa CSF kung gi-synthesize ug gibugkos sa kargamento sa protina. Ang pagbugkos sa N-terminal biotinylated peptides ngadto sa SA sa esensya nagsubli sa mga resulta nga nakuha uban sa ilang tagsa-tagsa ka phage clones sa dugo ug cerebrospinal fluid (Fig. 3e). Sa katapusan, among gipakita nga ang lead peptide #2077 makahimo sa pagpalambo sa aksyon sa utok sa usa ka biotinylated peptide inhibitor sa BACE1 nga gihiusa sa SA, nga hinungdan sa klaro nga pharmacodynamic nga mga epekto sa CNS pinaagi sa pagkunhod sa lebel sa Abeta40 sa CSF (Fig. 4). Wala kami makaila sa bisan unsang homologue sa database pinaagi sa paghimo og peptide sequence homology search sa tanang hit. Importante nga matikdan nga ang gidak-on sa T7 library gibana-bana nga 109, samtang ang theoretical library size para sa 12-mers kay 4 x 1015. Busa, mipili lang kami og gamay nga bahin sa diversity space sa 12-mer peptide library, nga mahimong magpasabot nga ang mas optimized nga mga peptide mahimong mailhan pinaagi sa pag-evaluate sa kasikbit nga sequence space niining mga nailhan nga hit. Sa pangagpas, usa sa mga rason nganong wala pa kami makakita og natural nga homologue niining mga peptide mao ang deselection atol sa ebolusyon aron mapugngan ang dili makontrol nga pagsulod sa pipila ka peptide motifs sa utok.
Kon tan-awon sa kinatibuk-an, ang among mga resulta naghatag ug basehan alang sa umaabot nga trabaho aron mailhan ug mailhan ang mga sistema sa transportasyon sa cerebrovascular barrier in vivo nga mas detalyado. Ang sukaranan nga pag-setup niini nga pamaagi gibase sa usa ka functional selection strategy nga dili lamang nag-ila sa mga clone nga adunay mga kabtangan sa cerebral vascular binding, apan naglakip usab sa usa ka kritikal nga lakang diin ang malampuson nga mga clone adunay intrinsic nga kalihokan aron motabok sa mga biological barrier in vivo ngadto sa CNS compartment. Mao ang pagpatin-aw sa mekanismo sa transportasyon niining mga peptide ug ang ilang gusto alang sa pagbugkos sa microvasculature nga espesipiko sa rehiyon sa utok. Mahimo kini nga mosangpot sa pagdiskobre sa bag-ong mga agianan alang sa transportasyon sa BBB ug mga receptor. Gilauman namo nga ang giila nga mga peptide mahimong direktang magbugkos sa mga cerebrovascular receptor o sa mga circulating ligand nga gidala pinaagi sa BBB o BCSFB. Ang mga peptide vector nga adunay kalihokan sa transportasyon sa CSF nga nadiskobrehan niini nga trabaho dugang nga imbestigahan. Sa pagkakaron, among gisusi ang espesipiko sa utok niining mga peptide alang sa ilang abilidad sa pagtabok sa BBB ug/o BCSFB. Kining mga bag-ong peptide mahimong bililhon kaayo nga mga himan alang sa potensyal nga pagdiskobre sa mga bag-ong receptor o mga agianan ug alang sa pagpalambo sa bag-o ug episyente nga mga plataporma alang sa paghatud sa mga macromolecule, sama sa biologics, ngadto sa utok.
I-cannulate ang dakong cisterna (CM) gamit ang usa ka pagbag-o sa nahisgotan na nga pamaagi. Ang mga na-anesthesia nga Wistar nga ilaga (200-350 g) gibutang sa usa ka stereotaxic apparatus ug usa ka median incision ang gihimo sa ibabaw sa gikiskis ug giandam nga anit aron makita ang bagolbagol. Mag-drill og duha ka buho sa dapit sa ibabaw nga sash ug ihigot ang mga fixing screw sa mga buho. Usa ka dugang nga buho ang gi-drill sa lateral occipital crest alang sa stereotactic guidance sa usa ka stainless steel cannula ngadto sa CM. Ibutang ang dental cement sa palibot sa cannula ug i-secure gamit ang mga screw. Human sa photo-curing ug cement hardening, ang samad sa panit gisirhan gamit ang 4/0 supramid suture. Ang hustong pagbutang sa cannula gikumpirma pinaagi sa kusang pagtulo sa cerebrospinal fluid (CSF). Kuhaa ang ilaga gikan sa stereotaxic apparatus, makadawat og angay nga postoperative care ug pain management, ug tugoti kini nga maulian sulod sa labing menos usa ka semana hangtod nga makita ang mga timailhan sa dugo sa cerebrospinal fluid. Ang mga Wistar nga ilaga (Crl:WI/Han) nakuha gikan sa Charles River (France). Ang tanang mga ilaga gihuptan ubos sa espesipikong mga kondisyon nga walay pathogen. Ang tanang mga eksperimento sa hayop giaprobahan sa Veterinary Office sa Dakbayan sa Basel, Switzerland, ug gihimo subay sa Animal License No. 2474 (Assessment of Active Brain Transport by Measuring Levels of Therapeutic Candidates in the Cerebrospinal Fluid and Brain of Rat).
Hinayhinaya nga hupti nga mahunahunaon ang ilaga samtang naggunit sa CM cannula. Kuhaa ang Datura gikan sa cannula ug kolektaha ang 10 µl nga spontaneous flowing cerebrospinal fluid. Tungod kay ang patency sa cannula sa katapusan nakompromiso, ang tin-aw nga mga sample sa cerebrospinal fluid nga walay ebidensya sa kontaminasyon sa dugo o pagkausab sa kolor ang gilakip niini nga pagtuon. Sa susama, gibana-bana nga 10–20 μl nga dugo ang gikuha gikan sa usa ka gamay nga incision sa tumoy sa ikog ngadto sa mga tubo nga adunay heparin (Sigma-Aldrich). Ang CSF ug dugo gikolekta sa lainlaing mga punto sa oras pagkahuman sa intravenous injection sa T7 phage. Gibana-bana nga 5–10 μl nga pluwido ang gilabay sa dili pa kolektahon ang matag sample sa CSF, nga katumbas sa dead volume sa catheter.
Ang mga librarya gihimo gamit ang T7Select 10-3b vector sama sa gihulagway sa manwal sa sistema sa T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Sa laktod nga pagkasulti, usa ka random nga 12-mer DNA insert ang gi-synthesize sa mosunod nga pormat:
Ang NNK codon gigamit aron malikayan ang double stop codons ug amino acid overexpression sa insert. Ang N usa ka manually mixed equimolar ratio sa matag nucleotide, ug ang K usa ka manually mixed equimolar ratio sa adenine ug cytosine nucleotides. Ang single stranded regions gi-convert ngadto sa double stranded DNA pinaagi sa dugang nga incubation gamit ang dNTP (Novagen) ug Klenow enzyme (New England Biolabs) sa Klenow buffer (New England Biolabs) sulod sa 3 ka oras sa 37°C. Human sa reaksyon, ang double-stranded DNA nakuha pinaagi sa EtOH precipitation. Ang resulta nga DNA gi-digest gamit ang restriction enzymes nga EcoRI ug HindIII (parehong gikan sa Roche). Ang cleaved ug purified (QIAquick, Qiagen) insert (T4 ligase, New England Biolabs) gi-ligate dayon in-frame ngadto sa usa ka pre-cleaved T7 vector human sa amino acid 348 sa 10B capsid gene. Ang mga ligation reaction gi-incubate sa 16°C sulod sa 18 ka oras sa wala pa ang in vitro packaging. Ang phage packaging in vitro gihimo sumala sa mga instruksyon nga gihatag sa T7Select 10-3b cloning kit (Novagen) ug ang packaging solution gi-amplify kausa aron ma-lysis gamit ang Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Ang mga lysate gi-centrifuge, gi-titrate ug gi-freeze sa -80° C. isip stock solution sa glycerol.
Direktang PCR amplification sa mga rehiyon sa phage variable nga gi-amplify sa broth o plate gamit ang proprietary 454/Roche-amplicon fusion primers. Ang forward fusion primer adunay mga sequence nga nag-flank sa variable region (NNK) 12 (template-specific), GS FLX Titanium Adapter A, ug usa ka four-base library key sequence (TCAG) (Supplementary Figure 1a):
Ang reverse fusion primer adunay usab biotin nga gilakip sa capture beads ug ang GS FLX Titanium Adapter B nga gikinahanglan alang sa clonal amplification atol sa emulsion PCR:
Ang mga amplicon gipailalom dayon sa 454/Roche pyrosequencing sumala sa 454 GS-FLX Titanium protocol. Para sa manual Sanger sequencing (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ang T7 phage DNA gi-amplify pinaagi sa PCR ug gi-sequence gamit ang mosunod nga mga pares sa primer:
Ang mga insert gikan sa indibidwal nga mga plake gipailalom sa PCR amplification gamit ang Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (sumala sa instruksyon sa tiggama). Paghimo og hot start (10 min sa 95 °C) ug 35 ka boost cycles (50 s sa 95 °C, 1 min sa 50 °C, ug 1 min sa 72 °C).
Ang mga phage gikan sa mga librarya, wild-type phage, phage nga naluwas gikan sa CSF ug dugo, o indibidwal nga mga clone gi-amplify sa Escherichia coli BL5615 sa TB broth (Sigma Aldrich) o sa 500 cm2 nga mga plato (Thermo Scientific) sulod sa 4 ka oras sa 37°C. Ang mga phage gikuha gikan sa mga plato pinaagi sa paghugas sa mga plato gamit ang Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical) o pinaagi sa pagkolekta sa mga plake gamit ang sterile pipette tips. Ang mga phage gi-isolate gikan sa culture supernatant o extraction buffer gamit ang usa ka round sa polyethylene glycol (PEG 8000) precipitation (Promega) ug gi-resuspend sa Tris-EDTA buffer.
Ang gipalapdan nga phage gipailalom sa 2-3 ka hugna sa pagtangtang sa endotoxin gamit ang endotoxin removal beads (Miltenyi Biotec) sa wala pa ang intravenous (IV) injection (500 μl/hayop). Sa unang hugna, 2×1012 ka phage ang gipaila; sa ikaduha, 2×1010 ka phage; sa ikatulo ug ikaupat nga hugna sa pagpili, 2×109 ka phage matag hayop. Ang sulod sa phage sa CSF ug mga sample sa dugo nga nakolekta sa gipakita nga mga punto sa oras gitino pinaagi sa pag-ihap sa plake sumala sa mga instruksyon sa tiggama (T7Select system manual). Ang pagpili sa phage gihimo pinaagi sa intravenous injection sa mga purified libraries ngadto sa ugat sa ikog o pinaagi sa pag-re-injection sa phage nga gikuha gikan sa CSF gikan sa miaging hugna sa pagpili, ug ang sunod nga mga pag-ani gihimo sa 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, ug 240 min matag usa sa mga sample sa CSF ug dugo. Usa ka kinatibuk-an nga upat ka hugna sa in vivo panning ang gihimo diin ang duha ka napili nga mga sanga gilain nga gitipigan ug gisusi sa unang tulo ka hugna sa pagpili. Ang tanan nga phage inserts nga gikuha gikan sa CSF gikan sa unang duha ka hugna sa pagpili gipailalom sa 454/Roche pyrosequencing, samtang ang tanan nga clones nga gikuha gikan sa CSF gikan sa katapusang duha ka hugna sa pagpili gi-sequencing sa mano-mano. Ang tanan nga blood phages gikan sa unang hugna sa pagpili gipailalom usab sa 454/Roche pyrosequencing. Alang sa pag-inject sa mga phage clones, ang mga napili nga phages gi-amplify sa E. coli (BL5615) sa 500 cm2 nga mga plato sa 37°C sulod sa 4 ka oras. Ang tagsa-tagsa nga gipili ug mano-mano nga gi-sequence nga mga clones gipasanay sa TB medium. Human sa phage extraction, purification ug pagtangtang sa endotoxin (sama sa gihulagway sa ibabaw), 2×1010 phages/hayop sa 300 μl ang gi-inject sa intravenous ngadto sa usa ka tail vein.
Pag-preprocess ug qualitative filtering sa sequence data. Ang hilaw nga 454/Roche data gi-convert gikan sa binary standard stream map format (sff) ngadto sa Pearson human readable format (fasta) gamit ang vendor software. Ang dugang pagproseso sa nucleotide sequence gihimo gamit ang proprietary C programs ug scripts (unreleased software package) sama sa gihulagway sa ubos. Ang pag-analisa sa primary data naglakip sa estrikto nga multi-stage filtering procedures. Aron masala ang mga read nga walay balido nga 12mer insert DNA sequence, ang mga read gi-align nga sunod-sunod sa start label (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stop label (TAAGCTTGCGGCCGCCACTCGAGTA) ug background insert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGAC) gamit ang global Needleman-Wunsch test. alignment nga nagtugot hangtod sa 2 ka inconsistencies matag alignment31. Busa, ang mga read nga walay start ug stop tags ug mga read nga adunay background inserts, ie, mga alignment nga molapas sa gitugot nga gidaghanon sa mga mismatches, gikuha gikan sa library. Mahitungod sa nahibiling mga reads, ang N-mer DNA sequence nga nagsugod gikan sa start mark ug natapos sa wala pa ang stop mark gikuha gikan sa orihinal nga read sequence ug giproseso pa (dinhi gitawag nga "insert"). Human sa paghubad sa insert, ang bahin human sa unang stop codon sa 5′ nga tumoy sa primer gikuha gikan sa insert. Dugang pa, ang mga nucleotide nga mosangpot sa dili kompleto nga mga codon sa 3′ nga tumoy sa primer gikuha usab. Aron dili maapil ang mga insert nga adunay mga background sequence lamang, ang mga translated insert nga nagsugod sa amino acid pattern nga "PAG" gikuha usab. Ang mga peptide nga adunay post-translational nga gitas-on nga ubos sa 3 ka amino acid gikuha gikan sa library. Sa katapusan, kuhaa ang redundancy sa insert pool ug tinoa ang frequency sa matag talagsaon nga insert. Ang mga resulta niini nga pag-analisa naglakip sa usa ka lista sa mga nucleotide sequence (inserts) ug ang ilang (read) nga mga frequency (Supplementary Figures 1c ug 2).
Mga pagsal-ot sa DNA sa Grupo N-mer pinaagi sa pagkaparehas sa han-ay: Aron mawagtang ang 454/Roche-specific sequencing errors (sama sa mga problema sa sequencing homopolymer extensions) ug matangtang ang dili kaayo importante nga mga redundancy, ang mga na-filter na nga N-mer DNA sequence inserts (mga pagsal-ot) gi-sort pinaagi sa pagkaparehas. mga pagsal-ot (hangtod sa 2 ka dili magkatugma nga mga base nga gitugot) gamit ang usa ka iterative algorithm nga gihubit sama sa mosunod: ang mga pagsal-ot gi-sort una pinaagi sa ilang frequency (gikan sa pinakataas ngadto sa pinakaubos), ug kung parehas sila, pinaagi sa ilang ikaduhang pagsal-ot pinaagi sa gitas-on (pinakataas ngadto sa pinakamubo)). Busa, ang labing kanunay ug pinakataas nga mga pagsal-ot naghubit sa unang "grupo". Ang frequency sa grupo gibutang sa key frequency. Dayon, ang matag pagsal-ot nga nahabilin sa gisal-ot nga lista gisulayan nga idugang sa grupo pinaagi sa pairwise Needleman-Wunsch alignment. Kung ang gidaghanon sa mga dili pagkaparehas, pagsal-ot, o mga pagtangtang sa usa ka alignment dili molapas sa threshold nga 2, usa ka pagsal-ot ang idugang sa grupo, ug ang kinatibuk-ang frequency sa grupo madugangan kung unsa ka subsob ang pagsal-ot. Ang mga pagsal-ot nga gidugang sa usa ka grupo gimarkahan nga gigamit ug wala iapil sa dugang nga pagproseso. Kon ang insert sequence dili madugang sa usa ka grupo nga anaa na, ang insert sequence gamiton aron paghimo og bag-ong grupo nga adunay angay nga insert frequency ug markahan nga gigamit. Ang iteration matapos kon ang matag insertion sequence gigamit na aron pagporma og bag-ong grupo o mahimong ilakip sa usa ka grupo nga anaa na. Human sa tanan, ang gi-grupo nga mga insert nga gilangkoban sa mga nucleotide sa ngadto-ngadto gihubad ngadto sa peptide sequences (peptide libraries). Ang resulta niini nga pag-analisa mao ang usa ka hugpong sa mga insertion ug ang ilang katugbang nga mga frequency nga naglangkob sa gidaghanon sa sunod-sunod nga mga pagbasa (Supplementary Fig. 2).
Pagmugna og Motif: Base sa lista sa talagsaong mga peptide, usa ka librarya ang gihimo nga adunay sulod nga tanang posibleng mga amino acid pattern (aa) sama sa gipakita sa ubos. Ang matag posibleng pattern nga may gitas-on nga 3 gikuha gikan sa peptide ug ang inverse pattern niini gidugang uban sa usa ka komon nga motif library nga adunay sulod nga tanang mga pattern (tripeptides). Ang mga librarya sa mga motif nga balik-balik kaayo gisunod-sunod ug gikuha ang redundancy. Dayon, alang sa matag tripeptide sa motif library, among gisusi ang presensya niini sa librarya gamit ang mga computational tools. Niini nga kaso, ang frequency sa peptide nga adunay sulod nga nakit-an nga motif tripeptide gidugang ug gi-assign sa motif sa motif library (“gidaghanon sa mga motif”). Ang resulta sa pagmugna og motif usa ka two-dimensional array nga adunay sulod nga tanang panghitabo sa mga tripeptide (motifs) ug ang ilang tagsa-tagsa ka mga kantidad, nga mao ang gidaghanon sa mga sequencing reads nga moresulta sa katugbang nga motif kung ang mga reads gisala, gi-grupo, ug gihubad. Mga Metrics sama sa gihulagway sa detalye sa ibabaw.
Normalisasyon sa gidaghanon sa mga motif ug katugbang nga mga scatterplots: Ang gidaghanon sa mga motif para sa matag sample gi-normalize gamit ang
diin ang ni mao ang gidaghanon sa mga nabasa nga adunay hilisgutan nga i. Busa, ang vi nagrepresentar sa porsyento sa frequency sa mga nabasa (o peptides) nga adunay motif i sa sample. Ang mga P-values ​​​​para sa dili normal nga gidaghanon sa mga motif gikalkulo gamit ang eksaktong pagsulay ni Fisher. Mahitungod sa mga correlogram sa gidaghanon sa mga motibo, ang mga korelasyon ni Spearman gikalkulo gamit ang normal nga gidaghanon sa mga motibo gamit ang R.
Aron makita ang sulod sa mga amino acid sa matag posisyon sa peptide library, gihimo ang mga web logogram 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Una, ang sulod sa mga amino acid sa matag posisyon sa 12-mer peptide gitipigan sa usa ka 20×12 matrix. Dayon, usa ka set sa 1000 ka peptide nga adunay parehas nga relatibong sulod sa amino acid sa matag posisyon ang gihimo sa fasta-sequence format ug gihatag isip input sa web-logo 3, nga nagmugna og graphical nga representasyon sa relatibong sulod sa amino acid sa matag posisyon. para sa usa ka gihatag nga peptide library. Aron makita ang mga multidimensional dataset, gihimo ang mga heat maps gamit ang internally developed tool sa R ​​(biosHeatmap, usa ka R package nga wala pa gipagawas). Ang mga dendrogram nga gipresentar sa mga heat maps gikalkulo gamit ang hierarchical clustering method ni Ward gamit ang Euclidean distance metric. Para sa statistical analysis sa motif scoring data, ang mga P value para sa unnormalized scoring gikalkulo gamit ang Fisher's exact test. Ang mga P-value para sa ubang mga dataset gikalkulo sa R ​​gamit ang Student's t-test o ANOVA.
Ang pinili nga mga phage clone ug phage nga walay inserts gi-inject pinaagi sa intravenous pinaagi sa tail vein (2×1010 phages/animal sa 300 μl PBS). Napulo ka minuto sa wala pa ang perfusion ug ang sunod nga fixation, ang samang mga hayop gi-inject pinaagi sa intravenous og 100 μl nga DyLight594-labeled lectin (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minutos human sa phage injection, ang mga ilaga gi-perfuse pinaagi sa kasingkasing og 50 ml PBS gisundan sa 50 ml 4% PFA/PBS. Ang mga sample sa utok gi-fixed usab tibuok gabii sa 4% PFA/PBS ug gihumol sa 30% sucrose tibuok gabii sa 4°C. Ang mga sample gi-flash frozen sa OCT mixture. Ang immunohistochemical analysis sa mga frozen sample gihimo sa temperatura sa kwarto sa 30 µm cryosections nga gi-block sa 1% BSA ug gi-incubate sa polyclonal FITC-labeled antibodies batok sa T7 phage (Novus NB 600-376A) sa 4 °C. I-incubate sa tibuok gabii. Sa katapusan, ang mga seksyon gihugasan sa 3 ka beses gamit ang PBS ug gisusi gamit ang confocal laser microscope (Leica TCS SP5).
Ang tanang peptide nga adunay minimum nga kaputli nga 98% gi-synthesize sa GenScript USA, gi-biotinylated ug gi-lyophilize. Ang biotin gihigot pinaagi sa dugang nga triple glycine spacer sa N-terminus. Susiha ang tanang peptide gamit ang mass spectrometry.
Ang Streptavidin (Sigma S0677) gisagol sa 5-fold equimolar excess sa biotinylated peptide, biotinylated BACE1 inhibitory peptide, o kombinasyon (3:1 ratio) sa biotinylated BACE1 inhibitory peptide ug BACE1 inhibitory peptide sa 5–10% DMSO/gi-incubate sa PBS. 1 ka oras sa temperatura sa kwarto sa dili pa ang ineksyon. Ang mga peptide nga gi-conjugate sa Streptavidin gi-inject pinaagi sa intravenous sa dosis nga 10 mg/kg ngadto sa usa sa mga ugat sa ikog sa mga ilaga nga adunay cerebral cavity.
Ang konsentrasyon sa mga streptavidin-peptide complex gisusi gamit ang ELISA. Ang Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) gi-coat tibuok gabii sa 4°C gamit ang 1.5 μg/ml mouse anti-streptavidin antibody (Thermo, MA1-20011). Human sa blocking (blocking buffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) sa temperatura sa kwarto sulod sa 2 ka oras, hugasi ang plato gamit ang 0.05% Tween-20/PBS (wash buffer) sulod sa 3 segundos, ang mga sample sa CSF ug plasma gidugang sa mga atabay nga gi-dilute gamit ang blocking buffer (plasma 1:10,000, CSF 1:115). Ang plato gi-incubate dayon tibuok gabii sa 4°C gamit ang detection antibody (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Human sa tulo ka lakang sa paghugas, ang streptavidin nakita pinaagi sa pag-incubate sa TMB substrate solution (Roche) sulod sa hangtod sa 20 minutos. Human mahunong ang paglambo sa kolor gamit ang 1M H2SO4, sukda ang absorbance sa 450 nm.
Ang gimbuhaton sa streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor complex gisusi gamit ang Aβ(1-40) ELISA sumala sa protocol sa tiggama (Wako, 294-64701). Sa laktod nga pagkasulti, ang mga sample sa CSF gi-dilute sa standard diluent (1:23) ug gi-incubate tibuok gabii sa 4°C sa 96-well plates nga gi-coat og BNT77 capture antibody. Human sa lima ka lakang sa paghugas, ang HRP-conjugated BA27 antibody gidugang ug gi-incubate sulod sa 2 ka oras sa 4°C., gisundan sa lima ka lakang sa paghugas. Ang Aβ(1–40) nakita pinaagi sa incubation sa TMB solution sulod sa 30 minutos sa temperatura sa kwarto. Human mahunong ang paglambo sa kolor gamit ang stop solution, sukda ang absorbance sa 450 nm. Ang mga sample sa plasma gipailalom sa solid phase extraction sa wala pa ang Aβ(1–40) ELISA. Ang plasma gidugang sa 0.2% DEA (Sigma) sa 96-well plates ug gi-incubate sa temperatura sa kwarto sulod sa 30 minutos. Human sa sunod-sunod nga paghugas sa mga SPE plate (Oasis, 186000679) gamit ang tubig ug 100% methanol, ang mga plasma sample gidugang sa mga SPE plate ug ang tanang likido gikuha. Ang mga sample gihugasan (una gamit ang 5% methanol unya 30% methanol) ug gi-elute gamit ang 2% NH4OH/90% methanol. Human mamala ang eluate sa 55°C sulod sa 99 min sa kanunay nga N2 current, ang mga sample gipaubos sa standard diluents ug ang Aβ(1–40) gisukod sama sa gihulagway sa ibabaw.
Unsaon pagkutlo niini nga artikulo: Urich, E. et al. Paghatud sa kargamento ngadto sa utok gamit ang mga transit peptide nga giila in vivo. ang siyensya. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ug Moos T. Paghatud sa mga macromolecular nga tambal ngadto sa utok gamit ang naka-target nga terapiya. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., ug Martinez-Martinez, P. Paghatud sa mga tambal nga peptide ug protina tabok sa babag sa dugo-utok. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Ang babag sa dugo-utok: usa ka babag sa pagpalambo sa tambal sa utok. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, ug Byrd, A. Mga palaaboton alang sa gipauswag nga paghatud sa tambal ug pag-target sa utok pinaagi sa choroid plexus-CSF pathway. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisasyon sa mga biopharmaceutical gamit ang molekular nga mga Trojan horse para sa paghatud sa utok. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptor-mediated peptide transport tabok sa blood-brain barrier. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Pagdugang sa pagsulod sa utok ug kaepektibo sa mga therapeutic antibodies gamit ang monovalent molecular shuttles. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Ang transportasyon sa transferrin receptor (TfR) nagtino sa pagsuhop sa utok sa mga variant sa affinity sa mga antibody sa TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).