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血液脳関門は、生物学的治療薬が中枢神経系の標的に到達するのを阻害し、神経疾患の効果的な治療を妨げています。生体内で新規脳輸送体を発見するため、T7ファージペプチドライブラリーを導入し、カニューレを挿入した意識のあるラットの大型プールモデルを用いて、血液と脳脊髄液（CSF）を連続的に採取しました。4回の選択後、特定のファージクローンがCSF中に高濃度で濃縮されました。個々の候補ペプチドの試験では、CSF中で1000倍以上の濃縮が確認されました。同定された新規輸送ペプチドに結合したBACE1ペプチド阻害剤を用いて脳脊髄液中のアミロイドβレベルを40%減少させることで、ペプチドを介した脳への送達の生物活性が確認されました。これらの結果は、生体内ファージ選択法によって同定されたペプチドが、治療効果のある高分子を脳に全身送達するための有用な担体となる可能性を示唆しています。
中枢神経系（CNS）を標的とした治療研究は、主にCNSを標的とする特性を示す最適化された薬剤や薬剤の特定に重点が置かれており、脳への能動的な薬剤送達を促進するメカニズムの発見にはあまり力が注がれてこなかった。しかし、薬剤送達、特に高分子薬剤の送達は現代の神経科学における薬剤開発の不可欠な部分となっているため、この状況は変わりつつある。中枢神経系の環境は、血液脳関門（BBB）と血液脳関門（BCSFB）1からなる脳血管関門システムによって十分に保護されているため、薬剤を脳に送達することは困難である1,2。ほぼすべての高分子薬剤と98%以上の低分子薬剤が脳から排除されると推定されている3。そのため、治療薬をCNSに効率的かつ特異的に送達する新しい脳輸送システムを特定することが非常に重要である4,5。しかし、BBBとBCSFBは、脳の広範な血管系を介して脳のすべての構造に浸透し、侵入するため、薬剤送達のための優れた機会も提供する。したがって、脳への非侵襲的送達方法を使用する現在の取り組みは、主に内因性BBB6受容体を使用した受容体介在輸送（PMT）のメカニズムに基づいています。トランスフェリン受容体経路を使用した最近の重要な進歩7,8にもかかわらず、特性が改善された新しい送達システムのさらなる開発が必要です。この目的のために、私たちの目標は、原理的には中枢神経系に高分子を送達したり、新しい受容体経路を開いたりするために使用できるCSF輸送を媒介できるペプチドを特定することでした。特に、脳血管系（BBBおよびBSCFB）の特定の受容体および輸送体は、生物学的治療薬の能動的かつ特異的な送達の潜在的な標的として機能します。脳脊髄液（CSF）は脈絡叢（CS）の分泌物であり、くも膜下腔および脳室腔を介して脳の間質液と直接接触しています4。最近、くも膜下腔の脳脊髄液が脳の間質に過剰に拡散することが示されました9。私たちは、このくも膜下腔流入路を利用するか、または血液脳関門（BBB）を直接通過して実質空間にアクセスしたいと考えています。これを実現するために、これら2つの異なる経路のいずれかによって輸送されるペプチドを理想的に同定する、堅牢な生体内ファージ選択戦略を実施しました。
本稿では、CSFサンプリングとハイスループットシーケンス（HTS）を組み合わせた、生体内ファージディスプレイスクリーニング法を逐次的に実施し、ライブラリーの多様性が最も高い初期選択ラウンドをモニタリングする方法について述べる。スクリーニングは、血液汚染を避けるため、永久的に大槽（CM）カニューレを埋め込んだ意識のあるラットで実施した。重要なことに、このアプローチでは、脳を標的とするペプチドと、脳血管バリアを通過する輸送活性を持つペプチドの両方を選択する。我々は、T7ファージをその小さなサイズ（約60 nm）10のために使用し、内皮および／または上皮髄質バリアの細胞間通過を可能にする小胞の輸送に適していると示唆した。4回のパニングの後、生体内CSF濃縮と脳微小血管との強い関連性を示すファージ集団を分離した。重要なことに、我々は、好ましい化学合成された最良候補ペプチドがタンパク質カーゴを脳脊髄液に輸送できることを実証することで、我々の知見を確認することができた。まず、主要な輸送ペプチドとBACE1ペプチド阻害剤を組み合わせることで、中枢神経系における薬力学的効果を確立しました。生体内機能スクリーニング戦略によって、新規の脳輸送ペプチドを効果的なタンパク質輸送体として同定できることを実証したことに加え、同様の機能選択アプローチが、新規の脳輸送経路の同定においても重要になると期待されます。
プラーク形成単位（PFU）に基づいて、ファージパッケージングステップの後、約109の多様性を持つランダムな12mer線状T7ファージペプチドのライブラリーが設計され、作成されました（材料と方法を参照）。in vivoパニングの前にこのライブラリーを慎重に分析したことに注意することが重要です。改変プライマーを使用したファージライブラリーサンプルのPCR増幅により、HTSに直接適用可能なアンプリコンが生成されました（補足図1a）。a）HTS11のシーケンスエラー、b）プライマー（NNK）1-12の品質への影響、c）スタンバイライブラリーに野生型（wt）ファージ（スケルトンインサート）が存在するため、検証済みのシーケンス情報のみを抽出するために、シーケンスフィルタリング手順が実施されました（補足図1b）。これらのフィルタリング手順は、すべてのHTSシーケンスライブラリーに適用されます。標準ライブラリでは、合計 233,868 リードが得られ、そのうち 39% がフィルター基準を通過し、ライブラリ解析と後続ラウンドの選択に使用されました (補足図 1c–e)。リードは主に 3 塩基対の倍数の長さで、36 ヌクレオチドにピークがありました (補足図 1c)。これはライブラリ設計 (NNK) 1-12 を裏付けています。注目すべきは、ライブラリメンバーの約 11% が 12 次元の野生型 (wt) バックボーン PAGISRELVDKL インサートを含み、配列のほぼ半分 (49%) が挿入または欠失を含んでいたことです。ライブラリの HTS により、ライブラリ内のペプチドの多様性が高いことが確認されました。ペプチド配列の 81% 以上が 1 回しか見つからず、4 コピー以上出現したのはわずか 1.5% でした (補足図 2a)。レパートリーの 12 箇所すべてのアミノ酸 (aa) の頻度は、縮重 NKK レパートリーによって生成されるコドンの数に対して期待される頻度とよく相関していた (補足図 2b)。これらの挿入によってコードされる aa 残基の観察頻度は、計算された頻度とよく相関していた (r = 0.893) (補足図 2c)。注入用のファージ ライブラリーの調製には、増幅とエンドトキシンの除去のステップが含まれる。これは、ファージ ライブラリーの多様性を低下させる可能性があることが以前に示されている 12,13。そのため、エンドトキシン除去を受けたプレート増幅ファージ ライブラリーをシーケンスし、元のライブラリーと比較して AA の頻度を推定した。元のプールと増幅および精製されたプールの間には強い相関 (r = 0.995) が観察され (補足図 2d)、T7 ファージを使用してプレート上で増幅されたクローン間の競合が大きなバイアスを引き起こさなかったことが示された。この比較は、各ライブラリーにおけるトリペプチドモチーフの頻度に基づいています。これは、HTSを使用してもライブラリーの多様性（約109）を完全に捉えることができないためです。各位置のアミノ酸の頻度分析により、入力されたレパートリーの最後の3つの位置にわずかな位置依存バイアスがあることが明らかになりました（補足図2e）。結論として、ライブラリーの品質と多様性は許容範囲内であり、数回の選択ラウンド間のファージライブラリーの増幅と準備により、多様性にわずかな変化しか見られなかったと結論付けました。
連続的な脳脊髄液サンプリングは、意識のあるラットの脳脊髄液にカニューレを外科的に埋め込むことで実施でき、BBBおよび/またはBCSFBを介して静脈内（iv）に注入されたT7ファージの同定を容易にする（図1a-b）。最初の3回のin vivo選択では、2つの独立した選択アーム（アームAとB）を使用した（図1c）。最初の3回の選択ラウンドで導入したファージの総量を減らすことで、選択の厳密性を徐々に高めた。4回目のパニングラウンドでは、ブランチAとBのサンプルを組み合わせ、さらに3回の独立した選択を行った。このモデルでT7ファージ粒子のin vivo特性を研究するために、野生型ファージ（PAGISRELVDKLマスターインサート）を尾静脈を介してラットに注入した。異なる時点における脳脊髄液および血液からのファージの回収により、比較的小型のT7正二十面体ファージは血液コンパートメントからの初期クリアランス段階が速いことが示された（補足図3）。投与された力価とラットの血液量に基づいて、静脈内注射後10分で血液中に検出されたファージは投与量の約1重量％のみであったと計算した。この初期の急速な減少の後、半減期27.7分のより遅い一次クリアランスが測定された。重要なことに、CSFコンパートメントから回収されたファージはごくわずかであり、野生型ファージのCSFコンパートメントへの移行のバックグラウンドが低いことを示している（補足図3）。平均して、全サンプリング期間（0～250分）にわたって、血液中のT7ファージ力価は約1×10⁻³％、最初に注入されたファージの4×10⁻⁸％のみが脳脊髄液中に検出された。特筆すべきは、脳脊髄液中の野生型ファージの半減期（25.7分）が血液中の半減期と類似していたことである。これらのデータは、脳脊髄液と血液を隔てるバリアがCMカニューレ挿入ラットにおいて無傷であることを示しており、生体内でファージライブラリーを選択して、血液から脳脊髄液へ容易に輸送されるクローンを同定することが可能である。
(a) 大量の脳脊髄液 (CSF) を再サンプリングする方法の設定。(b) 中枢神経系 (CNS) バリアの細胞内位置と、血液脳関門 (BBB) を通過するペプチドおよび血液脳関門を同定するために使用される選択戦略を示す図。(c) 生体内ファージディスプレイスクリーニングのフローチャート。各選択ラウンドで、ファージ (矢印内の動物識別子) を静脈内注射した。2 つの独立した代替分岐 (A、B) は、4 回目の選択ラウンドまで別々に保持される。選択ラウンド 3 および 4 では、CSF から抽出された各ファージクローンを手動でシーケンスした。(d) T7 ペプチドライブラリー (2 x 1012 ファージ/動物) を静脈内注射した後、カニューレを挿入した 2 匹のラットで最初の選択ラウンド中に血液 (赤い円) および脳脊髄液 (緑の三角形) から分離されたファージの動態。青い四角は、総血液量を考慮して、注入されたファージの量から計算された、血液中のファージの平均初期濃度を示します。黒い四角は、血液中のファージ濃度から外挿された y 線の交点を示します。(e,f) ペプチド中に見られるすべての重複するトリペプチドモチーフの相対頻度と分布を示します。1000 回の読み取りで見つかったモチーフの数を示します。有意に (p < 0.001) 濃縮されたモチーフは赤い点でマークされています。(e) 注入されたライブラリーのトリペプチドモチーフの相対頻度と動物 #1.1 および #1.2 由来の血液由来ファージの相対頻度を比較した相関散布図。(f) 血液および脳脊髄液で分離された動物ファージトリペプチドモチーフ #1.1 および #1.2 の相対頻度を比較した相関散布図。 （g、h）血液中に濃縮されたファージ（g）と注入ライブラリー、および脳脊髄液中に濃縮されたファージ（h）と血液中のファージの配列ID表示。両動物において、1回の生体内選択後。1文字コードのサイズは、そのアミノ酸がその位置に出現する頻度を示します。緑＝極性アミノ酸、紫＝中性アミノ酸、青＝塩基性アミノ酸、赤＝酸性アミノ酸、黒＝疎水性アミノ酸。図1a、bはEduard Urichによって設計および作成されました。
ファージペプチドライブラリーを2匹のCMインストゥルメントラット（クレードAとB）に注入し、脳脊髄液と血液からファージを分離した（図1d）。ライブラリーの初期の急速なクリアランスは、野生型ファージと比較してそれほど顕著ではなかった。注入したライブラリーの平均半減期は、両動物において血液中では24.8分で、野生型ファージと同様であり、脳脊髄液中では38.5分であった。各動物の血液および脳脊髄液のファージサンプルをHTSにかけ、同定されたすべてのペプチドについて短いトリペプチドモチーフの存在を分析した。トリペプチドモチーフは、構造形成とペプチド-タンパク質相互作用の最小限の基盤を提供するため選択された14,15。注入したファージライブラリーと両動物の血液から抽出したクローンとの間でモチーフの分布に良好な相関が見られた（図1e）。このデータは、ライブラリーの組成が血液コンパートメントでわずかに濃縮されているだけであることを示している。アミノ酸頻度とコンセンサス配列は、Weblogo16ソフトウェアの改良版を使用して各位置でさらに解析されました。興味深いことに、血液中のグリシン残基が強く濃縮されていることがわかりました（図1g）。血液をCSFから選択されたクローンと比較すると、モチーフの強い選択といくつかの選択解除が観察され（図1f）、特定のアミノ酸が12メンバーの所定の位置に優先的に存在していました（図1h）。注目すべきことに、脳脊髄液では個体間で有意な差がありましたが、血液中のグリシン濃縮は両方の動物で観察されました（補足図4a～j）。動物#1.1と#1.2の脳脊髄液中の配列データを厳密にフィルタリングした後、合計964個と420個のユニークな12merペプチドが得られました（補足図1d～e）。分離されたファージクローンは増幅され、2回目のin vivo選択にかけられました。第２ラウンドの選択から抽出されたファージを各動物でHTSにかけ、同定されたすべてのペプチドをモチーフ認識プログラムへの入力として使用し、トリペプチドモチーフの出現を分析した（図２a、b、ef）。CSFから回収されたファージの第１サイクルと比較すると、AおよびBの分岐におけるCSF中の多くのモチーフのさらなる選択と非選択が観察された（図２）。ネットワーク識別アルゴリズムを適用して、それらが一貫した配列の異なるパターンを表しているかどうかを判定した。代替クレードA（図２c、d）とクレードB（図２g、h）でCSFによって回収された１２次元配列の間には明確な類似性が観察された。各分岐におけるプールされた分析により、１２merペプチドの異なる選択プロファイル（補足図５c、d）と、第１ラウンドの選択と比較して第２ラウンドの選択後のプールされたクローンのCSF/血液力価比が時間とともに増加することが明らかになった（補足図５e）。
2回の連続した生体内機能的ファージディスプレイ選択による脳脊髄液中のモチーフおよびペプチドの濃縮。
各動物（動物 #1.1 および #1.2）の最初のラウンドから回収されたすべての脳脊髄液ファージをプールし、増幅し、HT シーケンスして、一緒に再注入しました（2 x 1010 ファージ/動物）2 SM カニューレ挿入ラット（#1.1 → #2.1 および 2.2、1.2 → 2.3 および 2.4）。（a、b、e、f）最初の選択ラウンドと 2 番目の選択ラウンドのすべての CSF 由来ファージのトリペプチドモチーフの相対頻度を比較した相関散布図。両方の方向のペプチドで見つかったすべての可能な重複トリペプチドを表すモチーフの相対頻度と分布。1000 回の読み取りで見つかったモチーフの数を示します。比較したライブラリの 1 つで有意に（p < 0.001）選択または除外されたモチーフは、赤い点で強調表示されています。 (c、d、g、h) 生体内選択の第 2 ラウンドと第 1 ラウンドに基づく、CSF に豊富に含まれる 12 アミノ酸長のすべての配列の配列ロゴ表現。1 文字コードのサイズは、そのアミノ酸がその位置にどのくらいの頻度で出現するかを示します。ロゴを表現するために、2 つの選択ラウンドの間に個々の動物から抽出された CSF 配列の頻度を比較し、第 2 ラウンドで濃縮された配列を示します。(c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 および (h) #1.2–#2.4。(c、d) 動物番号 2.1 および番号 2.2、または (g、h) 動物番号 2.3 および番号 2.4 の特定の位置で最も濃縮されたアミノ酸が色で示されています。緑 = 極性、紫 = 中性、青 = 塩基性、赤 = 酸性、黒 = 疎水性アミノ酸。
3回目の選択ラウンドの後、2匹の動物から分離された332個のCSF再構成ファージクローンから124個のユニークなペプチド配列（#3.1と#3.2）を特定しました（補足図6a）。配列LGSVS（18.7%）が最も高い相対割合を示し、続いて野生型挿入配列PAGISRELVDKL（8.2%）、MRWFFSHASQGR（3%）、DVAKVS（3%）、TWLFSLG（2.2%）、SARGSWREIVSLS（2.2%）が続きました。最後の4回目のラウンドでは、3匹の別々の動物から独立して選択された2つのブランチをプールしました（図1c）。CSFから回収された925個の配列決定済みファージクローンのうち、4回目のラウンドでは64個のユニークなペプチド配列が見つかりました（補足図6b）。その中で野生型ファージの相対割合は0.8%に低下しました。第 4 ラウンドで最も一般的な CSF クローンは、LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%)、LGSVS (17%)、GFVRFRLSNTR (14%)、KVAWRVFSLFWK (7%)、SVHGV (5%)、GRPQKINGARVC (3.6%)、RLSSVDSDLSGC (3.2%) でした。選択されたペプチドの長さの範囲は、NNK ライブラリー設計に縮重コドンを使用した場合のライブラリー プライマーのヌクレオチド挿入/欠失または早期終止コドンによるものです。早期終止コドンはより短いペプチドを生成し、好ましい aa モチーフを含むため選択されます。合成ライブラリーのプライマーの挿入/欠失により、より長いペプチドが生じる可能性があります。これにより、設計された終止コドンがフレーム外に配置され、下流に新しい終止コドンが現れるまで読み取られます。一般的に、入力データとサンプル出力データを比較することにより、4 つの選択ラウンドすべてについて濃縮係数を計算しました。最初のスクリーニングラウンドでは、非特異的なバックグラウンド参照として野生型ファージ力価を使用しました。興味深いことに、最初のCSFサイクルではファージのネガティブセレクションが非常に強かったのですが、血液ではそうではありませんでした（図3a）。これは、ペプチドライブラリーのほとんどのメンバーがCSFコンパートメントに受動的に拡散する確率が低いか、相対ファージがバクテリオファージよりも効率的に血流から保持または除去される傾向があるためかもしれません。しかし、2回目のパニングラウンドでは、両方のクレードでCSF中のファージの強い選択が観察され、前のラウンドではCSFの取り込みを促進するペプチドを発現するファージが濃縮されていたことが示唆されました（図3a）。ここでも、有意な血液濃縮はありませんでした。また、3回目と4回目のラウンドでも、ファージクローンはCSFで有意に濃縮されていました。最後の2つの選択ラウンド間で各ユニークペプチド配列の相対頻度を比較すると、4回目の選択ラウンドでは配列がさらに濃縮されていることがわかりました（図3b）。 64 個のユニークなペプチド配列すべてから、両方のペプチド配向を使用して合計 931 個のトリペプチドモチーフが抽出されました。第 4 ラウンドで最も濃縮されたモチーフは、注入されたライブラリと比較して、すべてのラウンドにわたる濃縮プロファイルについてより詳細に調べられました (カットオフ: 10% 濃縮) (補足図 6c)。選択の一般的なパターンは、研究されたモチーフのほとんどが、両方の選択ブランチのすべての以前のラウンドで濃縮されていることを示しました。ただし、一部のモチーフ (SGL、VSG、LGS GSV など) は主に代替クレード A に由来し、他のモチーフ (FGW、RTN、WGF、NTR など) は代替クレード B に濃縮されていました。
ストレプトアビジンペイロードに結合した、脳脊髄液濃縮ファージディスプレイペプチドおよびビオチン化リーダーペプチドの脳脊髄液輸送の検証。
(a) 注入された (入力 = I) ファージ (PFU) 力価と測定された CSF ファージ力価 (出力 = O) に基づいて、4 ラウンド (R1-R4) すべてで計算された濃縮率。最後の 3 ラウンド (R2-R4) の濃縮係数は、前のラウンドおよび重量データを使用した最初のラウンド (R1) と比較して計算されました。白抜きの棒グラフは脳脊髄液、網掛けの棒グラフは血漿です。(***p<0.001、スチューデントの t 検定に基づく)。(b) 選択のラウンド 4 後に CSF で収集されたすべてのファージに対する相対的な割合に従ってランク付けされた、最も豊富なファージ ペプチドのリスト。最も一般的な 6 つのファージ クローンは色で強調表示され、番号が付けられ、選択のラウンド 3 と 4 の間の濃縮係数 (挿入図) が示されています。(c,d) ラウンド 4 からの最も濃縮された 6 つのファージ クローン、空のファージ、および親ファージ ペプチド ライブラリーは、CSF サンプリング モデルで個別に分析されました。示された時点で、CSF および血液サンプルを採取した。(c) 6 つの候補ファージクローン (2 x 1010 ファージ/動物)、空のファージ (#1779) (2 x 1010 ファージ/動物)、およびストックファージペプチドライブラリー (2 x 1012 ファージ/動物) を等量ずつ、尾静脈を介してカニューレを挿入した動物に別々に投与した。注入した各ファージクローンおよびファージペプチドライブラリーの CSF 薬物動態を時間経過とともに示す。(d) は、サンプリング時間全体にわたって回収されたすべてのファージ/mL の平均 CSF/血液比を示す。(e) 4 つの合成リーダーペプチドと 1 つのスクランブルコントロールを、N 末端を介してストレプトアビジンにビオチンで連結し (テトラマー表示)、その後、注射 (尾静脈 iv、10 mg ストレプトアビジン/kg) した。少なくとも 3 匹の挿管されたラット (N = 3)。 )。 ) 示された時点で CSF サンプルを採取し、CSF 抗ストレプトアビジン ELISA によりストレプトアビジン濃度を測定した (nd = 検出されず)。 (*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、ANOVA 検定に基づく)。 (f) 最も濃縮されたファージ ペプチド クローン #2002 (紫色) のアミノ酸配列と、第 4 ラウンドの選択から選択された他のファージ ペプチド クローンとの比較。同一および類似のアミノ酸断片は色分けされている。
第 4 ラウンドで濃縮されたすべてのファージ (図 3b) のうち、6 つの候補クローンが、CSF サンプリング モデルでのさらなる個別分析のために選択されました。6 つの候補ファージ、空のファージ (挿入なし)、およびプロファージ ペプチド ライブラリーを等量ずつ、カニューレを挿入した 3 匹の CM 動物に注入し、CSF (図 3c) および血液 (補足図 7) アッセイで薬物動態が決定されました。テストされたすべてのファージ クローンは、空のコントロール ファージ (#1779) よりも 10 ～ 1000 倍高いレベルで CSF コンパートメントを標的としました。たとえば、クローン #2020 および #2077 は、コントロール ファージよりも約 1000 倍高い CSF 力価を示しました。選択された各ペプチドの薬物動態プロファイルは異なりますが、すべて高い CSF ホーミング能力を持っています。クローン #1903 と #2011 では時間の経過とともに一定の減少が観察されたが、クローン #2077、#2002、#2009 では最初の 10 分で増加が見られ、能動輸送を示している可能性があるが検証する必要がある。クローン #2020、#2002、#2077 は高レベルで安定し、クローン #2009 の CSF 濃度は最初の増加後にゆっくりと減少した。次に、各 CSF 候補の相対頻度をその血中濃度と比較した (図 3d)。すべてのサンプリング時間における各 CSF 候補の平均力価と血中力価の相関は、6 つの候補のうち 3 つが血中 CSF に有意に濃縮されていることを示した。興味深いことに、クローン #2077 はより高い血中安定性を示した (補足図 7)。ペプチド自体がファージ粒子以外の貨物を脳脊髄液コンパートメントに能動的に輸送できることを確認するため、ペプチドがファージ粒子に結合するN末端にビオチンを付加した4つのリーダーペプチドを合成した。ビオチン化ペプチド（No. 2002、2009、2020、2077）をストレプトアビジン（SA）と結合させて、ファージの形状をある程度模倣した多量体を得た。この形式により、貨物輸送タンパク質ペプチドとして血液および脳脊髄液中のSA曝露を測定することもできた。重要なことに、合成ペプチドをこのSA結合形式で投与した場合、ファージのデータはしばしば再現できた（図3e）。スクランブルペプチドは初期曝露が少なく、脳脊髄液からのクリアランスが速く、48時間以内に検出限界以下となった。これらのペプチドファージクローンのCSF空間への送達経路を解明するために、in vivoでの静脈内注射後1時間後にファージ粒子を直接検出する免疫​​組織化学（IHC）を用いて、個々のファージペプチドヒットの局在を分析した。注目すべきことに、クローン#2002、#2077、および#2009は脳毛細血管で強い染色により検出されたが、コントロールファージ（#1779）およびクローン#2020は検出されなかった（補足図8）。これは、これらのペプチドがBBBを通過することによって脳への影響に寄与していることを示唆している。BSCFB経路も関与している可能性があるため、この仮説を検証するにはさらに詳細な分析が必要である。最も濃縮されたクローン（#2002）のアミノ酸配列を他の選択されたペプチドと比較すると、それらのいくつかは類似したアミノ酸伸長を持っていることが注目され、これは同様の輸送メカニズムを示している可能性がある（図3f）。
独自の血漿プロファイルと時間の経過に伴う CSF の大幅な増加のため、ファージ ディスプレイ クローン #2077 は、より長い 48 時間にわたってさらに調査され、持続的な SA レベルに関連して観察された CSF の急速な増加を再現することができました (図 4a)。他の同定されたファージ クローンに関して、#2077 は脳毛細血管に強く染色され、高解像度で観察すると毛細血管マーカー レクチンと有意な共局在を示し、実質空間にも染色が見られました (図 4b)。ペプチドを介した薬理作用が CNS で得られるかどうかを調べるために、i) #2077 トランジット ペプチドと ii) BACE1 阻害ペプチドのビオチン化バージョンを 2 つの異なる比率で SA と混合する実験を行いました。1 つの組み合わせでは BACE1 ペプチド阻害のみを使用し、もう 1 つの組み合わせでは BACE1 ペプチド阻害と #2077 ペプチドの 1:3 の比率を使用しました。両方のサンプルを静脈内投与し、血中および脳脊髄液中のβアミロイドペプチド40（Aβ40）濃度を経時的に測定した。Aβ40は脳実質におけるBACE1阻害を反映するため、脳脊髄液中で測定した。予想通り、両方の複合体は血中Aβ40濃度を有意に低下させた（図4c、d）。しかし、ペプチド番号2077とSAに結合したBACE1ペプチド阻害剤の混合物を含むサンプルのみが、脳脊髄液中のAβ40濃度を有意に低下させた（図4c）。このデータは、ペプチド番号2077が60 kDaのSAタンパク質を中枢神経系に輸送することができ、またSA結合BACE1ペプチド阻害剤との薬理作用も誘導することを示している。
(a) 少なくとも 3 匹の CM チューブ入りラットにおける、CSF ペプチド #2077 (RLSSVDSDLSGC) および未注入のコントロール ファージ (#1779) の長期薬物動態プロファイルを示す T7 ファージのクローン注入 (2 × 10 ファージ/動物)。 (b) ペプチド #2077 と血管 (レクチン) の対比染色を示す、ファージ注入ラット (2 × 10 10 ファージ/動物) の代表的な皮質微小血管の共焦点顕微鏡画像。これらのファージ クローンは 3 匹のラットに投与され、灌流前に 1 時間循環させた。脳を切片化し、T7 ファージ カプシドに対する FITC 標識ポリクローナル抗体で染色した。灌流およびその後の固定の 10 分前に、DyLight594 標識レクチンを静脈内投与した。微小血管の内腔側のレクチン染色（赤）と毛細血管内腔および血管周囲脳組織のファージ（緑）を示す蛍光画像。スケールバーは10 µmに相当する。（c、d）ビオチン化BACE1阻害ペプチド単独、またはビオチン化トランジットペプチド#2077との組み合わせをストレプトアビジンに結合させ、少なくとも3匹のカニューレ挿入CMラットに静脈内注射（10 mgストレプトアビジン/kg）した。BACE1ペプチド阻害剤によるAβ40の減少は、示された時点で血液（赤）および脳脊髄液（オレンジ）中のAβ1-40 ELISAによって測定した。より分かりやすくするために、グラフ上に100%のスケールで点線を描いた。 (c) 輸送ペプチド#2077とBACE1阻害ペプチドを3:1の比率で結合させたストレプトアビジンで処理したラットの血液（赤い三角形）と脳脊髄液（オレンジ色の三角形）中のAβ40の減少率。(d) BACE1阻害ペプチドのみに結合させたストレプトアビジンで処理したラットの血液Aβ40（赤い丸）と脳脊髄液（オレンジ色の丸）中のAβ40の減少率。コントロールのAβ濃度は420 pg/ml（標準偏差=101 pg/ml）でした。
ファージディスプレイは、生物医学研究のいくつかの分野で成功裏に適用されてきました17。この方法は、生体内の血管多様性研究18,19や脳血管を標的とした研究20,21,22,23,24,25,26に使用されています。本研究では、この選択方法の適用範囲を、脳血管を標的とするペプチドの直接的な同定だけでなく、血液脳関門を通過する能動輸送特性を持つ候補の発見にも拡張しました。ここでは、CMを挿管したラットにおける生体内選択手順の開発について説明し、CSFホーミング特性を持つペプチドを同定する可能性を示します。12merランダムペプチドのライブラリーを表示するT7ファージを使用することで、T7ファージが血液脳関門に適応できるほど小さい（直径約60 nm）10ことを実証し、それによって血液脳関門または脈絡叢を直接通過できることを示しました。カニューレを挿入したCMラットからCSFを採取する方法は、生体内での機能スクリーニング方法として十分に制御されており、抽出されたファージは血管に結合するだけでなく、血液脳関門を通過する輸送体としても機能することが観察されました。さらに、血液を同時に採取し、CSFと血液由来のファージにHTSを適用することで、CSFの選択が血液濃縮や選択ラウンド間の増殖適性に影響されないことを確認しました。ただし、血液コンパートメントは選択手順の一部であり、CSFコンパートメントに到達できるファージは、脳内で濃縮されるのに十分な時間、血流中で生存して循環する必要があります。生のHTSデータから信頼性の高い配列情報を抽出するために、解析ワークフローでプラットフォーム固有のシーケンスエラーに適応したフィルターを実装しました。スクリーニング法に運動学的パラメータを組み込むことにより、血液中の野生型T7ファージの急速な薬物動態（t½ ~ 28分）24, 27, 28 と脳脊髄液中の半減期（t½ ~ 26分）を決定しました。血液と脳脊髄液の薬物動態プロファイルは類似しているにもかかわらず、脳脊髄液ではファージの血液濃度のわずか0.001%しか検出されず、野生型T7ファージの血液脳関門を通過するバックグラウンド移動度が低いことを示しています。この研究は、特に循環から急速に除去されるファージシステムの場合、in vivoパニング戦略を使用する際の最初の選択ラウンドの重要性を強調しています。これは、CNSコンパートメントに到達できるクローンが少ないためです。したがって、最初のラウンドでは、この非常に厳密な脳脊髄液モデルで最終的に収集されたクローンの数が限られていたため、ライブラリーの多様性の減少が非常に大きくなりました。この生体内パニング戦略には、CSFコンパートメントでの能動的な蓄積、血液コンパートメントでのクローン生存、最初の10分以内での血液からのT7ファージクローンの迅速な除去など、いくつかの選択ステップが含まれていました（図1dおよび補足図4M）。したがって、最初のラウンドの後、個々の動物に同じ初期プールが使用されたにもかかわらず、CSFで異なるファージクローンが同定されました。これは、多数のライブラリーメンバーを持つソースライブラリーに対する複数の厳密な選択ステップが多様性の大幅な減少をもたらすことを示唆しています。したがって、ランダムなイベントが初期選択プロセスの不可欠な部分となり、結果に大きく影響します。元のライブラリーの多くのクローンは、非常に類似したCSF濃縮傾向を持っていたと考えられます。しかし、同じ実験条件下であっても、初期プール内の各特定のクローンの数が少ないため、選択結果が異なる可能性があります。
脳脊髄液に豊富に含まれるモチーフは、血液中のモチーフとは異なります。興味深いことに、個々の動物の血液中でグリシンに富むペプチドへの最初のシフトが観察されました（図 1g、補足図 4e、4f）。グリシンペプチドを含むファージは、より安定しており、循環から除去される可能性が低いと考えられます。しかし、これらのグリシンに富むペプチドは脳脊髄液サンプルでは検出されなかったため、キュレーションされたライブラリーは、血液中と脳脊髄液中に蓄積されたもう 1 つの 2 つの異なる選択ステップを経たと考えられます。第 4 ラウンドの選択から得られた脳脊髄液に豊富に含まれるクローンは、広範囲にわたってテストされました。個別にテストされたクローンのほぼすべてが、ブランク コントロール ファージと比較して脳脊髄液に豊富に含まれていることが確認されました。1 つのペプチドヒット (#2077) がより詳細に調べられました。他のヒットと比較して血漿半減期が長いことが示され（図3dおよび補足図7）、興味深いことに、このペプチドはC末端にシステイン残基を含んでいた。ペプチドにシステインを追加すると、アルブミンに結合することで薬物動態特性が改善されることが最近示されている29。これはペプチド#2077については現在不明であり、さらなる研究が必要である。いくつかのペプチドはCSF濃縮において価数依存性を示した（データは示されていない）が、これはT7カプシドの表面形状に関連している可能性がある。我々が使用したT7システムでは、ファージ粒子あたり各ペプチドが5～15コピー存在した。ラットの大脳皮質に静脈内注射された候補リードファージクローンに対してIHCを実施した（補足図8）。データは、少なくとも3つのクローン（No.2002、No.2009、No.2077）がBBBと相互作用することを示した。この BBB 相互作用が CSF の蓄積につながるのか、それともこれらのクローンが直接 BCSFB に移動するのかはまだ解明されていません。重要なことに、選択されたペプチドは合成されてタンパク質カーゴに結合しても CSF 輸送能力を保持していることが示されています。N 末端ビオチン化ペプチドの SA への結合は、血液および脳脊髄液中のそれぞれのファージクローンで得られた結果を基本的に再現します (図 3e)。最後に、リード ペプチド #2077 は、SA に結合した BACE1 のビオチン化ペプチド阻害剤の脳内作用を促進し、CSF 中の Abeta40 レベルを大幅に低下させることにより、CNS で顕著な薬力学的効果を引き起こすことが示されています (図 4)。すべてのヒットのペプチド配列相同性検索を実行しても、データベース内の相同体は特定できませんでした。 T7ライブラリーのサイズは約109であるのに対し、12merの理論上のライブラリーサイズは4×10¹⁵であることに注意が必要です。したがって、12merペプチドライブラリーの多様性空間のごく一部しか選択していないため、これらのヒットの隣接配列空間を評価することで、より最適化されたペプチドを特定できる可能性があります。仮説として、これらのペプチドの天然相同体が見つかっていない理由の一つとして、特定のペプチドモチーフが脳に無秩序に侵入するのを防ぐための進化過程における選択圧の減少が考えられます。
総合すると、我々の結果は、生体内の脳血管関門の輸送システムをより詳細に特定および特徴付ける将来の研究の基礎を提供する。この方法の基本的な設定は、脳血管結合特性を持つクローンを特定するだけでなく、成功したクローンが生体内で生物学的障壁を通過して中枢神経系コンパートメントに入る固有の活性を持つという重要なステップも含む機能選択戦略に基づいている。これらのペプチドの輸送メカニズムと、脳領域に特異的な微小血管系への結合に対するそれらの選択性を解明することである。これは、BBBと受容体の輸送のための新しい経路の発見につながる可能性がある。我々は、特定されたペプチドが脳血管受容体またはBBBまたはBCSFBを介して輸送される循環リガンドに直接結合できると期待している。この研究で発見されたCSF輸送活性を持つペプチドベクターは、さらに調査される予定である。我々は現在、BBBおよび/またはBCSFBを通過する能力に関して、これらのペプチドの脳特異性を調査している。これらの新しいペプチドは、新たな受容体や経路の発見、そして生物製剤などの高分子を脳に送達するための、非常に効率的な新しいプラットフォームの開発にとって、極めて貴重なツールとなるだろう。
前述の方法を改良して、大槽（CM）にカニューレを挿入する。麻酔をかけたWistarラット（200～350g）を定位固定装置に固定し、剃毛して無菌的に準備した頭皮上に正中切開を行い、頭蓋骨を露出させる。上顎骨の領域に2つの穴を開け、固定ネジを穴に固定する。さらに、後頭骨外側稜に穴を開け、定位固定装置を用いてステンレス鋼製カニューレをCMに挿入する。カニューレの周囲に歯科用セメントを塗布し、ネジで固定する。光硬化とセメント硬化後、皮膚創を4/0スプラミド縫合糸で閉じる。カニューレの適切な配置は、脳脊髄液（CSF）の自然漏出によって確認される。ラットを定位固定装置から外し、適切な術後ケアと疼痛管理を行い、脳脊髄液に血液の兆候が見られるまで少なくとも1週間回復させる。Wistarラット（Crl:WI/Han）はCharles River（フランス）から入手した。すべてのラットは特定病原体フリーの条件下で飼育した。すべての動物実験はスイス、バーゼル市の獣医局の承認を受け、動物実験許可番号2474（ラットの脳脊髄液および脳内の治療候補物質の濃度測定による能動的脳輸送の評価）に従って実施した。
CMカニューレを手に持ち、ラットを穏やかに意識を保たせる。カニューレからダチュラを取り外し、自発的に流れる脳脊髄液を10 µl採取する。カニューレの開通性が最終的に損なわれたため、血液汚染や変色の兆候がない透明な脳脊髄液サンプルのみがこの研究に含まれた。並行して、尾の先端の小さな切開から約10～20 μlの血液をヘパリン入りチューブ（Sigma-Aldrich）に採取した。T7ファージの静脈内注射後、さまざまな時点でCSFと血液を採取した。各CSFサンプルを採取する前に、カテーテルのデッドボリュームに相当する約5～10 μlの液体を廃棄した。
ライブラリーは、T7Selectシステムマニュアル（Novagen、Rosenbergら、InNovations 6、1-6、1996）に記載されているように、T7Select 10-3bベクターを使用して作成されました。簡単に説明すると、ランダムな12mer DNAインサートが次の形式で合成されました。
NNKコドンは、挿入配列中の二重終止コドンとアミノ酸の過剰発現を回避するために使用されました。Nは各ヌクレオチドの等モル比を手動で混合したもので、Kはアデニンとシトシンヌクレオチドの等モル比を手動で混合したものです。一本鎖領域は、dNTP（Novagen）とKlenow酵素（New England Biolabs）をKlenowバッファー（New England Biolabs）中で37℃で3時間インキュベートすることにより、二本鎖DNAに変換されました。反応後、二本鎖DNAはEtOH沈殿により回収されました。得られたDNAは、制限酵素EcoRIとHindIII（いずれもRoche製）で消化されました。切断および精製された（QIAquick、Qiagen）挿入配列（T4リガーゼ、New England Biolabs）は、10Bカプシド遺伝子のアミノ酸348の後に、事前に切断されたT7ベクターにインフレームで連結されました。ライゲーション反応は、in vitroパッケージングの前に16℃で18時間インキュベートした。in vitroでのファージパッケージングは​​、T7Select 10-3bクローニングキット（Novagen）に付属の説明書に従って行い、パッケージング溶液は、大腸菌（BLT5615、Novagen）を用いて溶解するまで1回増幅した。溶解液を遠心分離し、滴定後、グリセロールのストック溶液として-80℃で凍結保存した。
独自の454/Rocheアンプリコン融合プライマーを使用して、ブロスまたはプレートで増幅されたファージ可変領域の直接PCR増幅。フォワード融合プライマーには、可変領域（NNK）12（テンプレート特異的）、GS FLXチタンアダプターA、および4塩基ライブラリーキー配列（TCAG）を挟む配列が含まれています（補足図1a）。
逆融合プライマーには、捕捉ビーズに結合したビオチンと、エマルジョンPCR中のクローン増幅に必要なGS FLXチタンアダプターBも含まれている。
増幅産物は、454 GS-FLX Titaniumプロトコルに従って454/Rocheパイロシークエンシングに供された。手動サンガーシークエンシング（Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer）では、T7ファージDNAをPCRで増幅し、以下のプライマーペアを用いてシークエンシングした。
個々のプラークからのインサートを、Roche Fast Start DNA Polymerase Kit（製造元の指示に従って）を用いてPCR増幅した。ホットスタート（95℃で10分間）と35回のブーストサイクル（95℃で50秒、50℃で1分、72℃で1分）を行った。
ライブラリー由来のファージ、野生型ファージ、CSFおよび血液から回収されたファージ、または個々のクローンを、大腸菌BL5615を用いてTBブロス（Sigma Aldrich）または500 cm2ディッシュ（Thermo Scientific）で37℃で4時間増幅した。ファージは、プレートをTris-EDTAバッファー（Fluka Analytical）で洗浄するか、滅菌ピペットチップでプラークを回収することにより、プレートから抽出した。ファージは、ポリエチレングリコール（PEG 8000）沈殿（Promega）を1回行うことで培養上清または抽出バッファーから分離し、Tris-EDTAバッファーに再懸濁した。
増幅されたファージは、静脈内注射（500 μl/動物）の前に、エンドトキシン除去ビーズ（Miltenyi Biotec）を使用して2～3ラウンドのエンドトキシン除去に供された。第1ラウンドでは2×10¹²個のファージが導入され、第2ラウンドでは2×10¹⁰個のファージ、第3および第4選択ラウンドでは動物あたり2×10⁹個のファージが導入された。指定された時点で採取されたCSFおよび血液サンプル中のファージ含有量は、製造元の指示（T7Selectシステムマニュアル）に従ってプラークカウントによって決定された。ファージ選択は、精製されたライブラリーを尾静脈に静脈内注射するか、または前回の選択ラウンドでCSFから抽出されたファージを再注射することによって行われ、その後、CSFおよび血液サンプルはそれぞれ10分、30分、60分、90分、120分、180分、および240分に回収された。合計4回のin vivoパニングを実施し、最初の3回の選択ラウンドでは、選択された2つのブランチを別々に保存して分析した。最初の2回の選択ラウンドでCSFから抽出されたすべてのファージインサートは454/Rocheパイロシークエンシングに供し、最後の2回の選択ラウンドでCSFから抽出されたすべてのクローンは手動でシークエンシングした。最初の選択ラウンドのすべての血液ファージも454/Rocheパイロシークエンシングに供した。ファージクローンの注入のために、選択されたファージは500 cm2プレート上で37℃で4時間、E. coli (BL5615)で増幅した。個別に選択され手動でシークエンシングされたクローンはTB培地で増殖させた。ファージの抽出、精製、およびエンドトキシンの除去（上記のとおり）の後、2×1010ファージ/動物を300 μlで尾静脈に静脈内注射した。
シーケンスデータの前処理と定性フィルタリング。生の 454/Roche データは、ベンダーのソフトウェアを使用してバイナリ標準ストリームマップ形式 (sff) から Pearson 人間が読める形式 (fasta) に変換されました。ヌクレオチド配列のさらなる処理は、以下に説明するように、独自の C プログラムとスクリプト (未公開のソフトウェア パッケージ) を使用して実行されました。プライマリ データの分析には、厳密な多段階フィルタリング手順が含まれます。有効な 12mer 挿入 DNA 配列を含まないリードをフィルタリングするために、リードは、グローバル Needleman-Wunsch テストを使用して、開始ラベル (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT)、停止ラベル (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA)、およびバックグラウンド挿入 (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) に順次アライメントされました。アライメントごとに最大 2 つの不一致が許容されます 31。したがって、開始タグと停止タグのないリード、およびバックグラウンド挿入を含むリード、つまり許容されるミスマッチ数を超えるアライメントは、ライブラリから削除されました。残りのリードについては、開始マークから終了マークの手前まで伸びるN-mer DNA配列を元のリード配列から切り出し、さらに処理した（以下「インサート」と呼ぶ）。インサートの翻訳後、プライマーの5'末端の最初の終止コドンの後の部分をインサートから除去した。さらに、プライマーの3'末端で不完全なコドンにつながるヌクレオチドも除去した。バックグラウンド配列のみを含むインサートを除外するために、アミノ酸パターン「PAG」で始まる翻訳済みインサートも除去した。翻訳後の長さが3アミノ酸未満のペプチドはライブラリーから除去した。最後に、インサートプール内の冗長性を除去し、各固有のインサートの頻度を決定した。この解析の結果には、ヌクレオチド配列（インサート）とその（リード）頻度のリストが含まれる（補足図1cおよび2）。
配列類似性による N-mer DNA 挿入のグループ化: 454/Roche 特有のシーケンス エラー (ホモポリマー伸長のシーケンスの問題など) を排除し、重要度の低い冗長性を除去するために、以前にフィルタリングされた N-mer DNA 配列挿入 (挿入) は類似性によってソートされます。挿入 (最大 2 つの非一致塩基が許容されます) は、次のように定義される反復アルゴリズムを使用してソートされます。挿入は、まずその頻度 (高い順から低い順) でソートされ、同じ場合は、長さ (長い順から短い順) で二次的にソートされます。したがって、最も頻繁に出現し、最も長い挿入が最初の「グループ」を定義します。グループ頻度はキー頻度に設定されます。次に、ソートされたリストに残っている各挿入をペアワイズ Needleman-Wunsch アライメントによってグループに追加しようとします。アライメント内のミスマッチ、挿入、または欠失の数が 2 の閾値を超えない場合、挿入がグループに追加され、グループ全体の頻度は挿入が追加された頻度だけ増加します。グループに追加された挿入配列は使用済みとしてマークされ、以降の処理から除外されます。挿入配列を既存のグループに追加できない場合は、その挿入配列を使用して適切な挿入頻度を持つ新しいグループが作成され、使用済みとしてマークされます。各挿入配列が新しいグループの形成に使用されるか、既存のグループに含めることができるようになると、反復処理は終了します。最終的に、ヌクレオチドからなるグループ化された挿入配列はペプチド配列（ペプチドライブラリ）に翻訳されます。この解析の結果は、連続するリード数を構成する挿入配列とその対応する頻度のセットです（補足図2）。
モチーフ生成: 一意のペプチドのリストに基づいて、以下に示すように、考えられるすべてのアミノ酸パターン (aa) を含むライブラリが作成されました。長さ 3 の各パターンがペプチドから抽出され、その逆パターンがすべてのパターン (トリペプチド) を含む共通モチーフライブラリとともに追加されました。高度に反復するモチーフのライブラリがシーケンスされ、冗長性が除去されました。次に、モチーフライブラリ内の各トリペプチドについて、計算ツールを使用してライブラリ内での存在を確認しました。この場合、見つかったモチーフ トリペプチドを含むペプチドの頻度が追加され、モチーフライブラリ内のモチーフに割り当てられます (「モチーフの数」)。モチーフ生成の結果は、すべてのトリペプチド (モチーフ) の出現とそれぞれの値を含む 2 次元配列です。それぞれの値は、リードがフィルタリング、グループ化、翻訳されたときに、対応するモチーフとなるシーケンス リードの数です。メトリックは、上記で詳しく説明されています。
モチーフ数の正規化と対応する散布図：各サンプルのモチーフ数は、以下の方法で正規化されました。
ここで、ni はトピック i を含むリードの数です。したがって、vi はサンプル中のモチーフ i を含むリード (またはペプチド) の頻度の割合を表します。正規化されていないモチーフの数の p 値は、フィッシャーの正確確率検定を使用して計算されました。モチーフの数の相関図については、正規化されたモチーフの数を使用して R でスピアマンの相関が計算されました。
ペプチドライブラリの各位置におけるアミノ酸の含有量を視覚化するために、ウェブロゴグラム32、33（http://weblogo.threeplusone.com）が作成されました。まず、12merペプチドの各位置におけるアミノ酸の含有量が20×12マトリックスに格納されます。次に、各位置で同じ相対アミノ酸含有量を持つ1000個のペプチドのセットがfasta-sequence形式で生成され、ウェブロゴ3への入力として提供されます。ウェブロゴ3は、特定のペプチドライブラリの各位置における相対アミノ酸含有量のグラフ表現を生成します。多次元データセットを視覚化するために、Rで独自に開発されたツール（biosHeatmap、未公開のRパッケージ）を使用してヒートマップが作成されました。ヒートマップに表示されるデンドログラムは、ユークリッド距離メトリックを使用したWardの階層的クラスタリング法を使用して計算されました。モチーフスコアリングデータの統計分析では、正規化されていないスコアリングのP値はFisherの正確確率検定を使用して計算されました。その他のデータセットのp値は、Rを用いてスチューデントのt検定またはANOVAによって計算された。
選択されたファージクローンおよびインサートのないファージを尾静脈から静脈内注射した（300 μl PBSに2×10¹⁰ファージ/動物）。灌流およびその後の固定の10分前に、同じ動物に100 μlのDyLight594標識レクチン（Vector Laboratories Inc.、DL-1177）を静脈内注射した。ファージ注射後60分、ラットの心臓から50 mlのPBSを灌流し、続いて50 mlの4% PFA/PBSを灌流した。脳サンプルは、さらに4% PFA/PBSで一晩固定し、4℃で一晩30%スクロースに浸した。サンプルはOCT混合液で急速凍結した。凍結サンプルの免疫組織化学分析は、室温で1% BSAでブロッキングした30 µmの凍結切片を用い、T7ファージに対するポリクローナルFITC標識抗体（Novus NB 600-376A）と4℃でインキュベートして行った。一晩インキュベートした後、切片をPBSで3回洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡（Leica TCS SP5）で観察した。
純度98%以上のすべてのペプチドは、GenScript USA社によって合成され、ビオチン化後、凍結乾燥された。ビオチンは、N末端に付加された3つのグリシンスペーサーを介して結合している。すべてのペプチドは質量分析法を用いて確認した。
ストレプトアビジン（Sigma S0677）を、5～10% DMSO/PBS中で、ビオチン化ペプチド、ビオチン化BACE1阻害ペプチド、またはビオチン化BACE1阻害ペプチドとBACE1阻害ペプチドの組み合わせ（3:1の比率）の5倍等モル過剰量と混合し、室温で1時間インキュベートしてから注射した。ストレプトアビジン結合ペプチドを、脳腔を有するラットの尾静脈の1つに10 mg/kgの用量で静脈内注射した。
ストレプトアビジン-ペプチド複合体の濃度はELISAで評価した。Nunc Maxisorpマイクロタイタープレート（Sigma）に、1.5 μg/mlのマウス抗ストレプトアビジン抗体（Thermo、MA1-20011）を4℃で一晩コーティングした。ブロッキング（ブロッキングバッファー：140 nM NaCl、5 mM EDTA、0.05% NP40、0.25%ゼラチン、1% BSA）を室温で2時間行った後、プレートを0.05% Tween-20/PBS（洗浄バッファー）で3秒間洗浄した。次に、CSFおよび血漿サンプルをブロッキングバッファーで希釈し（血漿1:10,000、CSF 1:115）、ウェルに加えた。その後、プレートを検出抗体（1 μg/ml、抗ストレプトアビジン-HRP、Novus NB120-7239）とともに4℃で一晩インキュベートした。 3回の洗浄後、TMB基質溶液（ロシュ社製）中で最大20分間インキュベートすることにより、ストレプトアビジンを検出した。1M硫酸で発色反応を停止させた後、450nmにおける吸光度を測定した。
ストレプトアビジン-ペプチド-BACE1阻害剤複合体の機能は、製造元のプロトコル（和光純薬工業、294-64701）に従ってAβ(1-40) ELISAにより評価した。簡単に説明すると、CSFサンプルを標準希釈液（1:23）で希釈し、BNT77捕捉抗体でコーティングした96ウェルプレートで4℃で一晩インキュベートした。5回の洗浄後、HRP標識BA27抗体を添加し、4℃で2時間インキュベートした後、5回の洗浄を行った。Aβ(1–40)は、室温で30分間TMB溶液中でインキュベートすることにより検出した。停止液で発色を停止した後、450 nmの吸光度を測定した。血漿サンプルは、Aβ(1–40) ELISAの前に固相抽出を行った。血漿を96ウェルプレートの0.2% DEA（Sigma）に添加し、室温で30分間インキュベートした。SPEプレート（Oasis、186000679）を水と100%メタノールで順次洗浄した後、血漿サンプルをSPEプレートに添加し、すべての液体を除去した。サンプルを洗浄（最初に5%メタノール、次に30%メタノール）し、2% NH4OH/90%メタノールで溶出した。溶出液を55℃で99分間、一定のN2電流で乾燥させた後、サンプルを標準希釈液で還元し、上記のようにAβ(1–40)を測定した。
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