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血液脳関門は、生物学的治療薬が中枢神経系の標的に到達することを阻害し、神経疾患の有効な治療を阻害する。生体内で新規脳輸送体を発見するため、我々はT7ファージペプチドライブラリを導入し、ラットのカニューレ挿入意識下大規模プールモデルを用いて血液および脳脊髄液（CSF）を連続的に採取した。4ラウンドの選択後、特定のファージクローンがCSF中に高度に濃縮された。個々の候補ペプチドを試験したところ、CSF中で1000倍以上の濃縮が明らかになった。同定された新規輸送ペプチドに結合したBACE1ペプチド阻害剤を用いて脳脊髄液中のアミロイドβ濃度が40%減少したことから、ペプチドを介した脳への送達の生物活性が確認された。これらの結果は、生体内ファージ選択法によって同定されたペプチドが、治療効果を有する高分子を脳に全身送達するための有用な輸送体となる可能性を示唆している。
中枢神経系（CNS）標的療法の研究は、これまで主にCNS標的特性を示す最適化された薬剤や薬剤の特定に重点が置かれており、脳への能動的な薬剤送達を促進するメカニズムの解明にはそれほど力を入れられてきませんでした。しかし、薬剤送達、特に高分子の送達が現代の神経科学薬剤開発において不可欠な要素となっているため、この状況は変わりつつあります。中枢神経系の環境は、血液脳関門（BBB）と血液脳関門（BCBB）からなる脳血管関門システムによって十分に保護されているため、脳への薬剤送達は困難を極めています1,2。ほぼすべての高分子薬剤と98%以上の低分子薬剤は脳から排除されると推定されています3。そのため、治療薬を効率的かつ特異的にCNSに送達する新たな脳輸送システムを特定することが非常に重要です4,5。しかし、BBBとBCSFBは、広範な血管系を通して脳のあらゆる構造に​​浸透し、薬剤を送達する絶好の機会でもあります。したがって、脳への非侵襲的送達法を用いる現在の取り組みは、主に内因性BBB6受容体を用いた受容体介在輸送（PMT）のメカニズムに基づいています。トランスフェリン受容体経路を用いた最近の重要な進歩7,8にもかかわらず、特性が改善された新しい送達システムのさらなる開発が必要です。この目的のために、私たちの目標は、脳脊髄液（CSF）輸送を媒介するペプチドを同定することでした。これらのペプチドは、原理的には高分子を中枢神経系（CNS）に送達したり、新しい受容体経路を開拓したりするために使用できるためです。特に、脳血管系の特定の受容体およびトランスポーター（BBBおよびBSCFB）は、生物学的治療薬の能動的かつ特異的な送達のための潜在的な標的となり得ます。脳脊髄液（CSF）は脈絡叢（CS）の分泌産物であり、くも膜下腔および脳室腔を介して脳の間質液と直接接触しています4。最近、くも膜下脳脊髄液が脳の間質へ過剰に拡散することが示されました9。我々は、このくも膜下流入路、あるいは脳脊髄液脳脊髄液脳脊髄液脳脊髄液（BBB）を直接介して実質腔へアクセスすることを目指しています。これを実現するために、これら2つの異なる経路のいずれかによって輸送されるペプチドを理想的に同定する、堅牢なin vivoファージ選択戦略を導入しました。
我々は現在、最も多様性の高いライブラリでの初期選択ラウンドをモニタリングするために、脳脊髄液サンプリングとハイスループットシーケンス（HTS）を組み合わせた連続in vivoファージディスプレイスクリーニング法について述べる。スクリーニングは、血液汚染を避けるために永久的に埋め込まれた大脳槽（CM）カニューレを用いて、意識のあるラットで実施した。重要なことは、このアプローチが脳標的ペプチドと脳血管関門を通過する輸送活性ペプチドの両方を選択することである。我々は、その小さなサイズ（約60 nm）10 のためにT7ファージを使用し、これが内皮および/または上皮髄質関門の細胞間通過を可能にする小胞の輸送に適していると示唆した。4ラウンドのパニングの後、強力なin vivo CSF濃縮および脳微小血管への結合を示すファージ集団が分離された。重要なことは、好ましい、そして化学的に合成された最良の候補ペプチドがタンパク質カーゴを脳脊髄液に輸送できることを実証することによって、我々の発見を確認することができたことである。まず、主要な輸送ペプチドとBACE1ペプチドの阻害剤を組み合わせることで、中枢神経系への薬力学的効果を確立しました。in vivo機能スクリーニング戦略によって、効果的なタンパク質輸送キャリアとして新規脳輸送ペプチドを同定できることを実証しただけでなく、同様の機能選択アプローチが新規脳輸送経路の同定においても重要になると期待されます。
プラーク形成単位（PFU）に基づいて、ファージパッケージングステップの後、多様性が約109のランダムな12-mer線状T7ファージペプチドのライブラリが設計され、作成された（材料と方法を参照）。in vivoパニングの前にこのライブラリを慎重に分析したことに注意することが重要です。修正されたプライマーを使用したファージライブラリサンプルのPCR増幅により、HTSに直接適用可能なアンプリコンが生成されました（補足図1a）。a）HTS11シーケンスエラー、b）プライマー（NNK）1-12の品質への影響、およびc）スタンバイライブラリ内の野生型（wt）ファージ（スケルトンインサート）の存在により、検証されたシーケンス情報のみを抽出するためにシーケンスフィルタリング手順が実装されました（補足図1b）。これらのフィルター手順は、すべてのHTSシーケンスライブラリに適用されます。標準ライブラリでは、合計 233,868 個のリードが得られ、そのうち 39 % がフィルター基準を通過し、後続のラウンドのライブラリ分析および選択に使用されました (補足図 1c–e)。リードは主に 3 塩基対の倍数の長さで、36 ヌクレオチドにピークがありました (補足図 1c)。これは、ライブラリ設計 (NNK) 1-12 を確認しています。特に、ライブラリ メンバーの約 11 % に 12 次元の野生型 (wt) バックボーン PAGISRELVDKL インサートが含まれており、配列のほぼ半分 (49 %) に挿入または削除が含まれていました。ライブラリ ライブラリの HTS により、ライブラリ内のペプチドの多様性が高いことが確認されました。ペプチド配列の 81 % 以上が 1 回だけ見つかり、1.5 % のみが 4 コピー以上で発生しました (補足図 2a)。レパートリーの 12 の位置すべてにおけるアミノ酸 (aa) の頻度は、縮重 NKK レパートリーによって生成されるコドンの数に対して予想される頻度とよく相関していました (補足図 2b)。これらの挿入物によってコードされている aa 残基の観察された頻度は、計算された頻度 (r = 0.893) とよく相関していました (補足図 2c)。注入用のファージライブラリの調製には、増幅とエンドトキシンの除去の手順が含まれます。これは、以前にファージライブラリの多様性を低下させる可能性があることが示されています12,13。そのため、エンドトキシン除去を行ったプレート増幅ファージライブラリを配列決定し、元のライブラリと比較して AA の頻度を推定しました。元のプールと増幅および精製されたプールの間には強い相関 (r = 0.995) が観察され (補足図 2d)、T7 ファージを使用してプレート上で増幅されたクローン間の競合によって大きな偏りが生じなかったことを示しています。この比較は、各ライブラリにおけるトリペプチドモチーフの頻度に基づいています。これは、HTSを用いてもライブラリの多様性（約109）を完全に捉えることができないからです。各位置のアミノ酸の頻度分析により、入力されたレパートリーの最後の3つの位置に、位置依存的なわずかな偏りが見られました（補足図2e）。結論として、ライブラリの品質と多様性は許容範囲内であり、複数回の選抜の間に増幅とファージライブラリの調製が行われたことによる多様性の変化はわずかであったと結論付けました。
意識のあるラットの CM にカニューレを外科的に埋め込むことで、連続的な脳脊髄液サンプルを採取し、BBB および/または BCSFB を介して静脈内 (iv) に注入された T7 ファージの識別を容易にすることができます (図 1a-b)。in vivo 選択の最初の 3 ラウンドでは、2 つの独立した選択アーム (アーム A および B) を使用しました (図 1c)。最初の 3 ラウンドの選択で導入されたファージの総量を減らすことで、選択の厳しさを徐々に高めました。4 ラウンド目のパニングでは、分岐 A と B からのサンプルを組み合わせて、さらに 3 つの独立した選択を実行しました。このモデルにおける T7 ファージ粒子の in vivo 特性を調べるために、野生型ファージ (PAGISRELVDKL マスター インサート) をラットの尾静脈から注入しました。異なる時点での脳脊髄液および血液からのファージの回収により、比較的小型の T7 イコサヘドロンファージは血液コンパートメントから急速に初期クリアランス段階に入ったことが示された (補足図 3)。投与した力価とラットの血液量に基づき、静脈内注射後 10 分で投与量の約 1% 重量のファージのみが血液中に検出されたと計算した。この初期の急速な減少の後、半減期 27.7 分のより緩やかな初期クリアランスが測定された。重要なのは、脳脊髄液コンパートメントから回収されたファージが非常に少数であったことであり、これは脳脊髄液コンパートメントへの野生型ファージの移動のバックグラウンドが低いことを示している (補足図 3)。平均して、血液中の T7 ファージ力価は約 1 x 10-3%、脳脊髄液中には最初に注入されたファージの 4 x 10-8% のみが検出され、サンプル採取期間全体 (0～250 分) にわたって検出された。注目すべきことに、野生型ファージの脳脊髄液中における半減期（25.7分）は、血液中で観察されたものと類似していました。これらのデータは、脳脊髄液（CM）カニューレ挿入ラットにおいて、脳脊髄液（CSF）コンパートメントと血液を隔てるバリアが損なわれていないことを実証しており、ファージライブラリをin vivoで選択することで、血液からCSFコンパートメントへ容易に輸送されるクローンを同定することが可能です。
(a) 大規模プールから脳脊髄液 (CSF) を再サンプリングする方法の設定。 (b) 中枢神経系 (CNS) 関門の細胞内位置と、血液脳関門 (BBB) を通過するペプチドおよび血液脳関門を識別するために使用される選択戦略を示す図。 (c) in vivo ファージディスプレイスクリーニングのフローチャート。選択の各ラウンドで、ファージ (矢印内の動物識別子) を静脈内注入しました。2 つの独立した代替ブランチ (A、B) は、選択の 4 ラウンド目まで別々に保持されます。選択ラウンド 3 および 4 では、CSF から抽出した各ファージクローンを手動で配列決定しました。 (d) T7 ペプチドライブラリ (2 x 1012 ファージ/動物) を静脈内注入した後、カニューレを挿入した 2 匹のラットでの最初の選択ラウンド中に血液 (赤丸) および脳脊髄液 (緑三角) から分離されたファージの動態。青い四角は、血液中のファージの平均初期濃度を示しています。これは、全血液量を考慮して、注入されたファージの量から計算されました。黒い四角は、血液中のファージ濃度から外挿された y 線の交点を示しています。 (e、f) ペプチドで見つかったすべての重複する可能性のあるトリペプチド モチーフの相対頻度と分布を示します。1000 回の読み取りで見つかったモチーフの数が表示されます。有意に (p < 0.001) 濃縮されたモチーフは赤い点でマークされています。 (e) 注入されたライブラリのトリペプチド モチーフの相対頻度を、動物 #1.1 および #1.2 の血液由来ファージと比較した相関散布図。 (f) 血液と脳脊髄液で分離された動物ファージ トリペプチド モチーフ #1.1 および #1.2 の相対頻度を比較した相関散布図。 (g, h) 血液中に濃縮されたファージ (g) と注入されたライブラリー、および脳脊髄液中に濃縮されたファージ (h) と血液を、両動物におけるin vivo選択後の配列IDで表したもの。1文字コードの大きさは、そのアミノ酸がその位置で出現する頻度を示す。緑 = 極性アミノ酸、紫 = 中性アミノ酸、青 = 塩基性アミノ酸、赤 = 酸性アミノ酸、黒 = 疎水性アミノ酸。図1a、bはEduard Urichによって設計・作成された。
ファージペプチドライブラリを2匹のCMインストゥルメントラット（クレードAおよびB）に注入し、脳脊髄液および血液からファージを単離しました（図1d）。ライブラリの初期の急速な消失は、野生型ファージと比較してそれほど顕著ではありませんでした。両動物における注入ライブラリの平均半減期は、血中では野生型ファージと同様に24.8分、脳脊髄液では38.5分でした。各動物の血液および脳脊髄液ファージサンプルをHTSにかけ、同定されたすべてのペプチドについて、短いトリペプチドモチーフの存在について分析しました。トリペプチドモチーフは、構造形成およびペプチド-タンパク質相互作用14,15の最小限の基盤を提供するため選択されました。注入したファージライブラリと両動物の血液から抽出したクローンとの間で、モチーフの分布に良好な相関関係が見られました（図1e）。データは、ライブラリの構成が血液コンパートメントでわずかに濃縮されていることを示しています。 Weblogo16ソフトウェアを改変し、各位置におけるアミノ酸頻度とコンセンサス配列をさらに解析しました。興味深いことに、血中グリシン残基に強い濃縮が見られました（図1g）。血液を脳脊髄液（CSF）から選抜したクローンと比較したところ、モチーフの強い選択と一部の脱選択が観察され（図1f）、特定のアミノ酸が12メンバー配列中の所定の位置に優先的に存在していました（図1h）。特に、個々の動物の脳脊髄液には大きな違いがありましたが、血中グリシンの濃縮は両方の動物で観察されました（補足図4a～j）。動物#1.1と#1.2の脳脊髄液中の配列データを厳密にフィルタリングした結果、合計964個と420個のユニークな12-merペプチドが得られました（補足図1d～e）。単離されたファージクローンは増幅され、2回目のin vivo選抜にかけられました。 2回目の選択で抽出したファージを各動物でHTSにかけ、同定されたすべてのペプチドをモチーフ認識プログラムの入力として使用し、トリペプチドモチーフの出現を分析しました（図2a、b、ef）。CSFから回収したファージの最初のサイクルと比較して、ブランチAとBのCSFで多くのモチーフのさらなる選択と選択解除が観察されました（図2）。ネットワーク識別アルゴリズムを適用して、それらが一貫した配列の異なるパターンを表しているかどうかを判断しました。代替クレードA（図2c、d）とクレードB（図2g、h）のCSFによって回収された12次元配列の間には明らかな類似性が観察されました。各ブランチのプール解析により、12-merペプチドの異なる選択プロファイル（補足図5c、d）と、1回目の選択と比較して2回目の選択後のプールされたクローンのCSF/血液力価比の経時的な増加が明らかになりました（補足図5e）。
生体内での機能的ファージディスプレイ選択の 2 回連続による脳脊髄液中のモチーフとペプチドの濃縮。
各動物（動物＃1.1および＃1.2）の1回目の選択から回収されたすべての脳脊髄液ファージをプールし、増幅し、HTシーケンスし、一緒に（2 x 1010ファージ/動物）2匹のSMカニューレ挿入ラット（＃1.1 → ＃）。2.1と2.2、1.2 → 2.3と2.4）。（a、b、e、f）1回目と2回目の選択ラウンドでのすべてのCSF由来ファージのトリペプチドモチーフの相対頻度を比較した相関散布図。両方向のペプチドで見つかったすべての可能性のある重複トリペプチドを表すモチーフの相対頻度と分布。1000回の読み取りで見つかったモチーフの数が表示されます。比較したライブラリの1つで有意に（p < 0.001）選択または除外されたモチーフは、赤い点で強調表示されています。 (c、d、g、h) in vivo 選択の第 2 ラウンドおよび第 1 ラウンドに基づく、すべての CSF に富む 12 アミノ酸の長い配列の配列ロゴ表示。1 文字コードのサイズは、そのアミノ酸がその位置で発生する頻度を示します。ロゴを表すために、2 つの選択ラウンド間で個々の動物から抽出された CSF 配列の頻度を比較し、第 2 ラウンドでエンリッチされた配列を示します：(c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 および (h) #1.2–#2.4。特定の位置で最もエンリッチされたアミノ酸は、(c、d) 動物番号 2.1 および 2.2、または (g、h) 動物番号 2.3 および 2.4 で色で表示されます。緑 = 極性、紫 = 中性、青 = 塩基性、赤 = 酸性、黒 = 疎水性アミノ酸。
3回目の選択後、2匹の動物から単離された332個のCSF再構成ファージクローンから、124個のユニークなペプチド配列（#3.1と#3.2）を同定した（補足図6a）。配列LGSVS（18.7%）の相対割合が最も高く、次いで野生型インサートPAGISRELVDKL（8.2%）、MRWFFSHASQGR（3%）、DVAKVS（3%）、TWLFSLG（2.2%）、およびSARGSWREIVSLS（2.2%）が続いた。最後の4回目のラウンドでは、3匹の別々の動物から独立して選択された2つのブランチをプールした（図1c）。CSFから回収された925個の配列決定されたファージクローンのうち、4回目のラウンドで64個のユニークなペプチド配列が見つかり（補足図6b）、その中で野生型ファージの相対割合は0.8%に低下した。第 4 ラウンドで最も多かった CSF クローンには、LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%)、LGSVS (17%)、GFVRFRLSNTR (14%)、KVAWRVFSLFWK (7%)、SVHGV (5%)、GRPQKINGARVC (3.6%)、RLSSVDSDLSGC (3.2%) がありました。 %))。選択されたペプチドの長さの範囲は、NNK ライブラリ設計に縮重コドンを使用する場合、ライブラリ プライマー内のヌクレオチドの挿入/削除または早期終止コドンによるものです。早期終止コドンは短いペプチドを生成し、好ましい aa モチーフを含むため選択されます。より長いペプチドは、合成ライブラリのプライマーへの挿入/削除によって発生する可能性があります。これにより、設計された終止コドンがフレームの外側に配置され、下流に新しい終止コドンが現れるまでそれが読み取られます。一般に、入力データとサンプルの出力データを比較することにより、4 つの選択ラウンドすべてのエンリッチメント係数を計算しました。スクリーニングの第1ラウンドでは、非特異的な背景参照として野生型ファージ力価を使用しました。興味深いことに、最初の脳脊髄液（CSF）サイクルでは陰性ファージ選択が非常に強かったのに対し、血液ではそうではありませんでした（図3a）。これは、ペプチドライブラリのほとんどのメンバーが脳脊髄液（CSF）コンパートメントに受動拡散する可能性が低いため、あるいは相対的にファージはバクテリオファージよりも血流中に効率的に保持または除去される傾向があるためと考えられます。しかし、第2ラウンドのパニングでは、両方の系統においてCSF中のファージの強い選択が観察されました。これは、前回のラウンドで脳脊髄液（CSF）への取り込みを促進するペプチドを提示するファージが濃縮されていたことを示唆しています（図3a）。ここでも、血液中の有意な濃縮は見られませんでした。第3ラウンドと第4ラウンドでも、ファージクローンは脳脊髄液中に有意に濃縮されていました。最後の2ラウンドの選択における各ユニークペプチド配列の相対頻度を比較したところ、第4ラウンドの選択では配列がさらに濃縮されていることがわかりました（図3b）。両ペプチド配向を用いて、64個の固有ペプチド配列すべてから合計931個のトリペプチドモチーフを抽出しました。第4ラウンドで最もエンリッチメントが高かったモチーフについては、注入したライブラリと比較して、全ラウンドにおけるエンリッチメントプロファイルをより詳細に調べました（カットオフ：10%エンリッチメント）（補足図6c）。一般的な選択パターンから、研究対象としたモチーフのほとんどが、両選択枝の以前の全ラウンドでエンリッチメントされていたことが示されました。しかし、一部のモチーフ（例：SGL、VSG、LGS GSV）は主に代替系統Aに由来し、他のモチーフ（例：FGW、RTN、WGF、NTR）は代替系統Bにエンリッチメントされていました。
脳脊髄液に濃縮されたファージディスプレイペプチドおよびストレプトアビジンペイロードに結合したビオチン化リーダーペプチドの脳脊髄液輸送の検証。
(a) 注入された（入力 = I）ファージ（PFU）力価と、決定された脳脊髄液（CSF）ファージ力価（出力 = O）に基づき、全4ラウンド（R1～R4）で計算された濃縮率。最後の3ラウンド（R2～R4）の濃縮係数は、前のラウンドおよび最初のラウンド（R1）と重量データの比較により計算された。白抜きのバーは脳脊髄液、網掛けのバーは血漿である。（***p<0.001、Student's t-testに基づく）。（b）選択ラウンド4後に脳脊髄液中に収集されたすべてのファージに対する相対的な割合に従ってランク付けされた、最も豊富なファージペプチドのリスト。最も一般的な6つのファージクローンは、選択ラウンド3と4の間の濃縮係数と番号で強調表示されている（挿入図）。 (c, d) ラウンド4で最も濃縮された6つのファージクローン、空のファージ、および親ファージペプチドライブラリを、髄液サンプリングモデルで個別に分析しました。髄液と血液サンプルは、示された時点で採取しました。(c) 6つの候補ファージクローン（2 x 1010ファージ/動物）、空のファージ（#1779）（2 x 1010ファージ/動物）、およびストックファージペプチドライブラリ（2 x 1012ファージ/動物）を等量ずつ注入します。カニューレを挿入した動物に、尾静脈から少なくとも3 CMを個別に投与します。注入した各ファージクローンおよびファージペプチドライブラリの髄液薬物動態を経時的に示します。(d) は、サンプリング時間中に回収されたすべてのファージ/mLの平均髄液/血液比を示しています。 (e) 4つの合成リーダーペプチドと1つのスクランブルコントロールを、N末端を介してビオチンでストレプトアビジンに結合させ（テトラマーディスプレイ）、その後注射（尾静脈iv、ストレプトアビジン10 mg/kg）した。少なくとも3匹の挿管ラット（N = 3）。 ）。示された時点で脳脊髄液（CSF）サンプルを採取し、CSF抗ストレプトアビジンELISAによってストレプトアビジン濃度を測定した（nd = 検出されず）。（*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、ANOVA検定に基づく）。（f）最も濃縮されたファージペプチドクローン＃2002（紫）のアミノ酸配列と、第4ラウンドの選択から選択された他のファージペプチドクローンとの比較。同一および類似のアミノ酸断片は色分けされている。
第4ラウンドで濃縮されたすべてのファージ（図3b）のうち、6つの候補クローンがCSFサンプリングモデルでさらに個別に分析するために選択されました。6つの候補ファージ、空のファージ（インサートなし）、およびプロファージペプチドライブラリの等量を3匹のカニューレ挿入CM動物に注入し、CSF（図3c）および血液（補足図7）アッセイで薬物動態を測定しました。テストされたすべてのファージクローンは、空のコントロールファージ（＃1779）よりも10〜1000倍高いレベルでCSFコンパートメントをターゲットにしました。たとえば、クローン＃2020と＃2077は、コントロールファージよりも約1000倍高いCSF力価を示しました。選択された各ペプチドの薬物動態プロファイルは異なりますが、それらはすべて高いCSFホーミング能力を持っています。クローン#1903と#2011では時間の経過とともに一定の減少が見られましたが、クローン#2077、#2002、#2009では最初の10分間の増加は能動輸送を示唆している可能性がありますが、検証が必要です。クローン#2020、#2002、#2077は高濃度で安定しましたが、クローン#2009の脳脊髄液（CSF）濃度は最初の増加後、ゆっくりと減少しました。次に、各CSF候補の相対頻度を血中濃度と比較しました（図3d）。すべてのサンプリング時間における各CSF候補の平均力価と血中力価の相関関係から、6つの候補のうち3つが血中CSF中に有意に濃縮されていることが示されました。興味深いことに、クローン#2077はより高い血中安定性を示しました（補足図7）。ペプチド自体がファージ粒子以外の貨物を脳脊髄液（CSF）コンパートメントへ能動的に輸送できることを確認するため、ペプチドがファージ粒子に結合するN末端をビオチンで誘導体化した4つのリーダーペプチドを合成しました。ビオチン化ペプチド（番号2002、2009、2020、および2077）をストレプトアビジン（SA）と結合させ、ファージの形状をある程度模倣した多量体を得ました。この形式により、貨物輸送タンパク質ペプチドとしての血液および脳脊髄液中のSA曝露量を測定することも可能になりました。重要なことは、合成ペプチドをこのSA結合形式で投与すると、ファージのデータがしばしば再現できることです（図3e）。スクランブルペプチドは初期曝露量が少なく、CSFからのクリアランスが速く、48時間以内に検出限界以下になりました。これらのペプチドファージクローンの脳脊髄液（CSF）空間への送達経路を解明するため、静脈内注射1時間後にファージ粒子を生体内で直接検出する免疫​​組織化学（IHC）を用いて、個々のファージペプチドヒットの局在を分析した。特に、クローン＃2002、＃2077、＃2009は脳毛細血管で強い染色によって検出できたのに対し、コントロールファージ（＃1779）とクローン＃2020は検出されなかった（補足図8）。これは、これらのペプチドがまさにBBBを通過することによって脳への効果に寄与していることを示唆している。BSCFB経路も関与している可能性があるため、この仮説を検証するにはさらに詳細な分析が必要である。最も濃縮されたクローン（＃2002）のアミノ酸配列を他の選択されたペプチドと比較すると、それらのいくつかは類似したアミノ酸伸長を有し、類似した輸送メカニズムを示唆している可能性があることが判明した（図3f）。
その独特な血漿プロファイルと、時間の経過に伴う脳脊髄液（CSF）の顕著な増加のため、ファージディスプレイクローン#2077を、さらに長期間（48時間）にわたって調査したところ、持続的なSAレベルと関連して観察されたCSFの急速な増加を再現することができました（図4a）。同定されたその他のファージクローンと比較して、#2077は脳毛細血管に対して強い染色性を示し、高解像度で観察すると毛細血管マーカーレクチンとの顕著な共局在を示し、実質間隙にも染色が見られる可能性がありました（図4b）。ペプチドによる薬理効果がCNSで得られるかどうかを調べるために、i) #2077トランジットペプチドとii) BACE1阻害ペプチドのビオチン化バージョンを、SAと2つの異なる比率で混合する実験を行いました。1つの組み合わせではBACE1ペプチド阻害薬のみを使用し、もう1つではBACE1ペプチド阻害薬と#2077ペプチドを1:3の比率で使用しました。両サンプルは静脈内投与され、血中および脳脊髄液中のβアミロイドペプチド40（Abeta40）濃度を経時的に測定した。Abeta40は脳実質におけるBACE1阻害を反映するため、脳脊髄液（CSF）中で測定した。予想通り、両複合体は血中Abeta40濃度を有意に低下させた（図4c、d）。しかし、ペプチド番号2077とSAに結合したBACE1ペプチド阻害剤の混合物を含むサンプルのみが、脳脊髄液中のAbeta40濃度を有意に低下させた（図4c）。このデータは、ペプチド番号2077が60 kDaのSAタンパク質を中枢神経系（CNS）へ輸送し、SA結合型BACE1ペプチド阻害剤との薬理作用も誘導することを示す。
(a) 少なくとも3匹のCM挿管ラットにおける脳脊髄液（CSF）ペプチド#2077（RLSSVDSDLSGC）および未注入対照ファージ（#1779）の長期薬物動態プロファイルを示すT7ファージのクローン注入（動物1匹あたり2×10ファージ）を示す。(b) ファージ注入ラット（動物1匹あたり2×10ファージ）の代表的な皮質微小血管の共焦点顕微鏡画像。ペプチド#2077と血管（レクチン）の対比染色を示す。これらのファージクローンを3匹のラットに投与し、灌流前に1時間循環させた。脳を切片化し、T7ファージカプシドに対するFITC標識ポリクローナル抗体で染色した。灌流および固定の10分前に、DyLight594標識レクチンを静脈内投与した。微小血管の内腔側レクチン染色（赤色）と毛細血管および血管周囲脳組織の内腔におけるファージ染色（緑色）を示す蛍光画像。スケールバーは10 µmに相当する。（c, d）ビオチン化BACE1阻害ペプチド単独、またはビオチン化トランジットペプチド#2077と併用し、ストレプトアビジンに結合させた後、少なくとも3匹のカニューレ挿入CMラットに静脈内投与した（ストレプトアビジン10 mg/kg）。BACE1ペプチド阻害剤によるAβ40減少は、示された時点における血液（赤色）および脳脊髄液（オレンジ色）中のAβ1-40 ELISAにより測定された。より明瞭にするため、グラフ上に100%スケールで点線を引いている。 (c) トランジットペプチド#2077とBACE1阻害ペプチドを3:1の比率で結合させたストレプトアビジンを投与したラットの血中Aβ40（赤三角）および脳脊髄液（オレンジ三角）中のAβ40の減少率。(d) BACE1阻害ペプチドを結合させたストレプトアビジンのみを投与したラットの血中Aβ40（赤丸）および脳脊髄液（オレンジ丸）中のAβ40の減少率。対照群のAβ濃度は420 pg/ml（標準偏差101 pg/ml）であった。
ファージディスプレイは、生物医学研究のいくつかの分野でうまく適用されてきました17。この方法は、in vivo 血管多様性研究18,19 や脳血管を標的とした研究20,21,22,23,24,25,26 に使用されています。本研究では、この選択法の適用範囲を、脳血管を標的とするペプチドの直接同定だけでなく、血液脳関門を通過する能動輸送特性を持つ候補ペプチドの発見にも拡張しました。現在、CM 挿管ラットにおける in vivo 選択手順の開発について説明し、脳脊髄液 (CSF) ホーミング特性を持つペプチドを同定する可能性を実証しています。12 mer のランダムペプチドのライブラリを表示する T7 ファージを使用して、T7 ファージが血液脳関門に適応するのに十分小さい (直径約 60 nm)10 ため、血液脳関門または脈絡叢を直接通過できることを実証できました。カニューレ挿入されたCMラットからの脳脊髄液（CSF）採取は、よく制御されたin vivo機能スクリーニング法であり、抽出されたファージは血管系に結合するだけでなく、血液脳関門を通過するトランスポーターとしても機能することを観察しました。さらに、血液採取とCSFおよび血液由来ファージへのHTSの同時適用により、選択ラウンド間の血液濃縮や増殖適応度がCSFの選択に影響しないことを確認しました。しかし、血液コンパートメントは選択手順の一部であり、CSFコンパートメントに到達できるファージは、脳内で濃縮されるのに十分な時間、血流中で生存して循環する必要があるためです。生のHTSデータから信頼性の高いシーケンス情報を抽出するために、分析ワークフローにプラットフォーム固有のシーケンスエラーに適合したフィルターを実装しました。スクリーニング法に速度論的パラメータを組み込むことにより、野生型 T7 ファージの血中における迅速な薬物動態 (t½ ~ 28 分) を確認し24, 27, 28、また脳脊髄液中の半減期 (t½ ~ 26 分) も 1 分あたりに決定しました。血中および CSF 中の同様の薬物動態プロファイルにもかかわらず、ファージの血中濃度の 0.001% しか CSF 中に検出されず、野生型 T7 ファージの血液脳関門を介したバックグラウンド移動度が低いことを示しています。この研究は、in vivo パニング戦略を使用する場合、特に循環から急速に除去されるファージシステムの場合、CNS コンパートメントに到達できるクローンが少ないため、最初の選択ラウンドの重要性を強調しています。したがって、最初のラウンドでは、この非常に厳密な CSF モデルで最終的に限られた数のクローンのみが収集されたため、ライブラリの多様性の減少が非常に大きかったです。この in vivo パニング戦略には、CSF コンパートメントでの活発な蓄積、血液コンパートメントでのクローンの生存、および最初の 10 分以内の血液からの T7 ファージクローンの迅速な除去など、いくつかの選択ステップが含まれていました (図 1d および補足図 4M)。したがって、最初のラウンドの後、個々の動物に同じ初期プールが使用されたにもかかわらず、CSF で異なるファージクローンが特定されました。これは、ライブラリ メンバーの数が多いソース ライブラリに対して複数の厳密な選択ステップを実行すると、多様性が大幅に減少することを示唆しています。したがって、ランダム イベントは初期選択プロセスの不可欠な部分になり、結果に大きな影響を与えます。元のライブラリ内のクローンの多くは、非常によく似た CSF エンリッチメント傾向を持っていた可能性があります。ただし、同じ実験条件下でも、初期プール内の各特定のクローンの数が少ないために選択結果が異なる場合があります。
脳脊髄液中に濃縮されたモチーフは、血液中のものとは異なります。興味深いことに、個々の動物の血液中で、グリシンに富むペプチドへの最初のシフトが観察されました（図 1g、補足図 4e、4f）。グリシンペプチドを含むファージはより安定しており、循環から除去される可能性が低いと考えられます。しかし、これらのグリシンに富むペプチドは脳脊髄液サンプルでは検出されなかったため、キュレーションされたライブラリは、血液中での選択段階と脳脊髄液中に蓄積される段階の 2 つの異なる選択段階を経たことが示唆されます。4 回目の選択で得られた脳脊髄液濃縮クローンは、広範囲にテストされました。個別にテストされたクローンのほぼすべてが、ブランクのコントロールファージと比較して脳脊髄液中に濃縮されていることが確認されました。1 つのペプチドヒット（#2077）をさらに詳しく調べました。このペプチドは、他のヒットと比較して血漿半減期が長く（図3dおよび補足図7）、興味深いことに、C末端にシステイン残基を含んでいました。 ペプチドにシステインを付加すると、アルブミン29に結合して薬物動態特性を改善できることが最近示されました。 これは現在ペプチド#2077では不明であり、さらなる研究が必要です。 一部のペプチドは、CSF濃縮において価数依存性を示しました（データ未掲載）。これは、T7カプシドの表示された表面形状に関連している可能性があります。 使用したT7システムでは、ファージ粒子あたり各ペプチドの5〜15コピーを示しました。 候補リードファージクローンをラットの大脳皮質に静脈内注入してIHCを実施しました（補足図8）。この BBB 相互作用が CSF の蓄積につながるのか、それともこれらのクローンが直接 BCSFB に移動するのかどうかはまだ解明されていません。重要な点として、選択したペプチドは合成されタンパク質カーゴに結合したときに CSF 輸送能力を保持することを示しています。N 末端ビオチン化ペプチドの SA への結合は、血液および脳脊髄液中のそれぞれのファージクローンで得られた結果を本質的に繰り返します (図 3e)。最後に、リードペプチド #2077 は、SA に結合した BACE1 のビオチン化ペプチド阻害剤の脳作用を促進し、CSF 中の Abeta40 レベルを大幅に低下させることで CNS に顕著な薬力学的効果をもたらすことを示しています (図 4)。すべてのヒットに対してペプチド配列相同性検索を実行しましたが、データベースで相同体は特定できませんでした。 T7ライブラリのサイズは約109であるのに対し、12-merの理論的なライブラリサイズは4 x 1015であることに留意することが重要です。したがって、我々は12-merペプチドライブラリの多様性空間のごく一部しか選択していません。これは、同定されたヒットの隣接配列空間を評価することで、より最適化されたペプチドを同定できる可能性があることを意味します。仮説的に言えば、これらのペプチドの天然相同体が見つかっていない理由の一つは、特定のペプチドモチーフが脳に制御不能に侵入するのを防ぐための進化の過程での選択解除である可能性があります。
我々の研究結果を総合すると、脳血管関門の輸送システムを生体内でより詳細に同定し、その特徴を明らかにするための今後の研究の基盤となる。この方法の基本的な構成は、脳血管結合特性を持つクローンを同定するだけでなく、成功したクローンが生体内で生物学的関門を通過して中枢神経系区画へ移行する固有の活性を持つという重要なステップを含む機能的選択戦略に基づいている。これらのペプチドの輸送機構と、脳領域特有の微小血管系への結合選好性を解明することが、我々の研究の目的である。これは、BBBおよび受容体輸送のための新たな経路の発見につながる可能性がある。同定されたペプチドは、脳血管受容体、あるいはBBBまたはBCSFBを介して輸送される循環リガンドに直接結合できると期待される。本研究で発見された脳脊髄液輸送活性を持つペプチドベクターについては、今後さらに研究を進める予定である。現在、これらのペプチドのBBBおよび／またはBCSFB通過能力に関する脳特異性について調査中である。これらの新しいペプチドは、新しい受容体や経路の潜在的な発見や、生物製剤などの高分子を脳に送達するための新しい高効率プラットフォームの開発にとって、極めて貴重なツールとなるでしょう。
前述の方法の改変法を使用して、大脳槽（CM）にカニューレを挿入する。麻酔したWistarラット（200〜350 g）を定位固定装置に取り付け、剃毛して無菌的に準備した頭皮に正中切開を施して頭蓋骨を露出させた。上部サッシュの領域に2つの穴を開け、穴に固定ネジを締める。ステンレス鋼製カニューレをCMに定位的に誘導するために、外側後頭稜にも穴を開ける。カニューレの周囲に歯科用セメントを塗布し、ネジで固定する。光硬化およびセメントの硬化後、皮膚の傷口を4/0上中縫合糸で閉じる。カニューレが適切に配置されていることは、脳脊髄液（CSF）の自然漏出によって確認される。ラットを定位固定装置から取り出し、適切な術後ケアと疼痛管理を行い、脳脊髄液中に血液の兆候が認められるまで少なくとも1週間回復させます。Wistarラット（Crl:WI/Han）はCharles River社（フランス）から入手しました。すべてのラットは特定の病原体フリー（SPF）環境で飼育されました。すべての動物実験は、スイス・バーゼル市獣医局の承認を受け、動物実験許可番号2474（ラットの脳脊髄液および脳における治療候補物質の濃度測定による能動脳輸送の評価）に従って実施されました。
ラットの意識を穏やかに保ち、CMカニューレを手に持ちます。カニューレからチョウセンアサガオを取り出し、自発的に流出する脳脊髄液10µlを採取します。カニューレの開存性が最終的に損なわれたため、本研究では血液混入や変色の兆候のない透明な脳脊髄液サンプルのみを使用しました。同時に、尾の先端の小さな切開部から約10～20µlの血液をヘパリン（Sigma-Aldrich）入りのチューブに採取しました。T7ファージの静脈内注射後、様々な時点で脳脊髄液（CSF）と血液を採取しました。CSFサンプルを採取する前に、カテーテルのデッドボリュームに相当する約5～10µlの液を廃棄しました。
ライブラリは、T7Selectシステムマニュアル（Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996）に記載されている通り、T7Select 10-3bベクターを用いて作製した。簡単に説明すると、ランダムな12-mer DNAインサートを以下の形式で合成した。
NNKコドンは、インサート内の二重終止コドンおよびアミノ酸過剰発現を回避するために使用されました。Nは各ヌクレオチドを手動で混合した等モル比であり、Kはアデニンおよびシトシンヌクレオチドを手動で混合した等モル比です。1本鎖領域は、dNTP（Novagen）およびKlenow酵素（New England Biolabs）とともにKlenowバッファー（New England Biolabs）中で3時間37°Cでさらにインキュベートすることにより、二本鎖DNAに変換されました。反応後、二本鎖DNAはEtOH沈殿により回収されました。得られたDNAは制限酵素EcoRIおよびHindIII（ともにRoche製）で消化されました。切断および精製（QIAquick、Qiagen）されたインサート（T4リガーゼ、New England Biolabs）は、10Bカプシド遺伝子のアミノ酸348の後に、事前に切断されたT7ベクターにインフレームでライゲーションされました。ライゲーション反応液は、in vitroパッケージングの前に16℃で18時間インキュベートした。in vitroファージパッケージングは​​、T7Select 10-3bクローニングキット（Novagen社）の説明書に従って行った。パッケージング溶液は、大腸菌（BLT5615、Novagen社）を用いて1回増幅し、溶解した。ライセートは遠心分離し、滴定した後、グリセロールストック溶液として-80℃で凍結した。
独自の454/Rocheアンプリコン融合プライマーを用いて、培養液またはプレートで増幅したファージ可変領域を直接PCR増幅する。順方向融合プライマーには、可変領域（NNK）12（テンプレート特異的）、GS FLX Titanium Adapter A、および4塩基のライブラリキー配列（TCAG）を挟む配列が含まれている（補足図1a）。
リバース融合プライマーには、捕捉ビーズに付着したビオチンと、エマルジョン PCR 中のクローン増幅に必要な GS FLX チタン アダプター B も含まれています。
その後、増幅産物は454 GS-FLX Titaniumプロトコルに従い、454/Rocheピロシークエンシングにかけられました。マニュアルサンガーシークエンシング（Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer）では、T7ファージDNAをPCRで増幅し、以下のプライマーペアを用いてシークエンシングを行いました。
個々のプラークから得られたインサートを、Roche Fast Start DNAポリメラーゼキット（製造元の指示に従って）を用いてPCR増幅した。ホットスタート（95℃で10分）およびブーストサイクル（95℃で50秒、50℃で1分、72℃で1分）を35回実施した。
ライブラリー由来のファージ、野生型ファージ、髄液および血液から回収したファージ、または個々のクローンを、大腸菌BL5615を用いて、TBブロス（Sigma Aldrich）または500 cm2ディッシュ（Thermo Scientific）中で37℃、4時間増幅した。プレートからのファージ抽出は、Tris-EDTA緩衝液（Fluka Analytical）でプレートを洗浄するか、滅菌ピペットチップでプラークを回収することにより行った。培養上清または抽出緩衝液から、ポリエチレングリコール（PEG 8000）沈殿（Promega）を1回行うことでファージを単離し、Tris-EDTA緩衝液に再懸濁した。
増幅されたファージは、エンドトキシン除去ビーズ（Miltenyi Biotec社製）を用いて2～3回のエンドトキシン除去処理を経て、静脈内（IV）投与（動物1頭あたり500μl）された。第1ラウンドでは2×1012個のファージ、第2ラウンドでは2×1010個のファージ、第3ラウンドおよび第4ラウンドでは動物1頭あたり2×109個のファージが投与された。各時点で採取された髄液（CSF）および血液サンプル中のファージ量は、製造元の指示（T7Selectシステムマニュアル）に従い、プラークカウント法で測定した。ファージ選択は、精製したライブラリーを尾静脈に注射するか、または前回の選択ラウンドで脳脊髄液から抽出したファージを再注射することによって実施し、その後の採取は脳脊髄液および血液サンプルからそれぞれ 10 分、30 分、60 分、90 分、120 分、180 分、および 240 分後に実施した。合計 4 ラウンドの in vivo パニングを実施し、選択された 2 つのブランチは、最初の 3 ラウンドの選択中に別々に保管および分析された。最初の 2 ラウンドの選択で脳脊髄液から抽出されたすべてのファージインサートは、454/Roche ピロシークエンスにかけられ、最後の 2 ラウンドの選択で脳脊髄液から抽出されたすべてのクローンは手動で配列決定された。最初のラウンドの選択で得られたすべての血液ファージも、454/Roche ピロシークエンスにかけられた。ファージクローンの注入には、選択されたファージを500 cm2プレート上の大腸菌（BL5615）で37℃、4時間培養して増幅した。個別に選択され、手動で配列決定されたクローンはTB培地で増殖させた。ファージの抽出、精製、エンドトキシン除去（上記参照）後、動物1頭あたり2×1010個のファージを300 μlで片方の尾静脈に静脈内注入した。
配列データの前処理と定性フィルタリング。生の 454/Roche データは、ベンダーソフトウェアを使用して、バイナリ標準ストリームマップ形式 (sff) からピアソン人間可読形式 (fasta) に変換されました。ヌクレオチド配列のさらなる処理は、以下で説明するように、独自の C プログラムとスクリプト (未発表ソフトウェアパッケージ) を使用して実行されました。一次データの分析には、厳密な多段階フィルタリング手順が含まれます。有効な 12 mer 挿入 DNA 配列を含まないリードを除外するために、リードは、グローバル Needleman-Wunsch テストを使用して、開始ラベル (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT)、停止ラベル (TAAGCTTTGCGGCCGCACTCGAGTA)、およびバックグラウンド挿入 (CCCTGCAGGGATACCCGGGAGCTCGTCGAC) に対して順次アラインメントされました。アラインメントあたり最大 2 つの不一致を許容します31。したがって、開始タグと停止タグのないリード、およびバックグラウンド挿入を含むリード、つまり許容される不一致数を超えるアラインメントは、ライブラリから削除されました。残りのリードについては、開始マークから停止マークの前までの N 量体の DNA 配列を元のリード配列から切り出し、さらに処理しました (以下、「インサート」と呼びます)。インサートの翻訳後、プライマーの 5' 末端にある最初の停止コドンの後の部分がインサートから削除されます。さらに、プライマーの 3' 末端の不完全コドンにつながるヌクレオチドも削除されました。バックグラウンド配列のみを含むインサートを除外するために、アミノ酸パターン「PAG」で始まる翻訳されたインサートも削除されました。翻訳後の長さが 3 アミノ酸未満のペプチドはライブラリから削除されました。最後に、インサート プール内の冗長性を削除し、それぞれのユニークなインサートの頻度を決定します。この分析の結果には、ヌクレオチド配列 (インサート) とその (リード) 頻度のリストが含まれていました (補足図 1c および 2)。
N マー DNA 挿入を配列類似性でグループ化: 454/Roche 固有のシーケンス エラー (ホモポリマー延長のシーケンスに関する問題など) を排除し、重要度の低い冗長性を除去するために、以前にフィルタリングされた N マー DNA 配列挿入 (挿入) は類似性によって並べ替えられます。挿入 (一致しない塩基は最大 2 つまで許可) は、次のように定義される反復アルゴリズムを使用して並べ替えられます。挿入は、最初に頻度 (最高から最低) で並べ替えられ、挿入が同じ場合は、2 番目に長さ (最長から最短) で並べ替えられます。したがって、最も頻度が高く、最も長い挿入によって最初の「グループ」が定義されます。グループ頻度は、キー頻度に設定されます。次に、並べ替えられたリストに残っている各挿入を、ペアワイズ Needleman-Wunsch アライメントによってグループに追加しようとします。アライメント内の不一致、挿入、または削除の数が 2 のしきい値を超えない場合、挿入がグループに追加され、挿入が追加された頻度だけグループ全体の頻度が増加します。グループに追加された挿入配列は使用済みとしてマークされ、以降の処理から除外されます。挿入配列を既存のグループに追加できない場合、その挿入配列は適切な挿入頻度を持つ新しいグループを作成するために使用され、使用済みとしてマークされます。各挿入配列が新しいグループを形成するために使用されたか、既存のグループに追加できるようになった時点で、反復処理は終了します。最終的に、ヌクレオチドで構成されるグループ化された挿入配列は、ペプチド配列（ペプチドライブラリ）に変換されます。この解析の結果は、挿入配列とそれに対応する頻度のセットであり、連続リード数を構成します（補足図2）。
モチーフ生成: ユニークなペプチドのリストに基づいて、以下に示すように、考えられるすべてのアミノ酸パターン (aa) を含むライブラリを作成しました。長さ 3 の考えられる各パターンをペプチドから抽出し、その逆パターンを、すべてのパターン (トリペプチド) を含む共通モチーフ ライブラリとともに追加しました。高度に反復的なモチーフのライブラリをシーケンスし、冗長性を削除しました。次に、モチーフ ライブラリ内の各トリペプチドについて、計算ツールを使用してライブラリ内での存在を確認しました。この場合、見つかったモチーフ トリペプチドを含むペプチドの頻度が追加され、モチーフ ライブラリ内のモチーフに割り当てられます (「モチーフの数」)。モチーフ生成の結果は、トリペプチド (モチーフ) のすべての出現とそれぞれの値 (リードがフィルタリング、グループ化、および翻訳されたときに対応するモチーフになるシーケンス リードの数) を含む 2 次元配列です。メトリクスは上記で詳しく説明しました。
モチーフの数と対応する散布図の正規化：各サンプルのモチーフの数は、
ここで、niはトピックiを含むリード数です。したがって、viはサンプル中のモチーフiを含むリード（またはペプチド）の頻度（％）を表します。正規化されていないモチーフ数のP値は、Fisherの正確検定を用いて計算されました。モチーフ数の相関係数については、正規化されたモチーフ数とRを用いてスピアマンの相関係数を計算しました。
ペプチドライブラリの各位置のアミノ酸含有量を視覚化するために、ウェブロゴグラム32、33（http://weblogo.threeplusone.com）が作成された。まず、12-merペプチドの各位置のアミノ酸含有量を20×12のマトリックスに格納する。次に、各位置で同じ相対アミノ酸含有量を含む1000個のペプチドのセットをfasta-sequence形式で生成し、web-logo 3への入力として提供して、各位置の相対アミノ酸含有量のグラフィカル表現を生成する。特定のペプチドライブラリについて。多次元データセットを視覚化するために、Rの内部開発ツール（biosHeatmap、まだリリースされていないRパッケージ）を使用してヒートマップを作成した。ヒートマップに表示されるデンドログラムは、ユークリッド距離メトリックを使用したWardの階層的クラスタリング法を使用して計算された。モチーフスコアリングデータの統計分析では、Fisherの正確検定を使用して、正規化されていないスコアリングのP値を計算した。他のデータセットの P 値は、Student t 検定または ANOVA を使用して R で計算されました。
選択されたファージクローンおよびインサートのないファージを尾静脈から静脈内投与した（動物1頭あたり2×1010ファージ、300 μl PBS）。灌流および固定の10分前に、同じ動物にDyLight594標識レクチン（Vector Laboratories Inc.、DL-1177）100 μlを静脈内投与した。ファージ投与から60分後、ラットの心臓から50 mlのPBSを灌流し、続いて50 mlの4% PFA/PBSを灌流した。脳サンプルはさらに4% PFA/PBSで一晩固定し、30%スクロースに4℃で一晩浸漬した。サンプルはOCT混合液中で急速凍結した。凍結サンプルの免疫組織化学染色は、1% BSAでブロッキングした30µm凍結切片を用いて室温で行った。切片はFITC標識抗T7ファージポリクローナル抗体（Novus NB 600-376A）とともに4℃でインキュベートした。一晩インキュベートした後、切片をPBSで3回洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡（Leica TCS SP5）で観察した。
すべてのペプチドはGenScript USA社によって合成され、ビオチン化後、凍結乾燥されています（純度98%以上）。ビオチンはN末端の3重グリシンスペーサーを介して結合しています。すべてのペプチドは質量分析法を用いて検査されています。
ストレプトアビジン（Sigma S0677）を、ビオチン化ペプチド、ビオチン化BACE1阻害ペプチド、またはビオチン化BACE1阻害ペプチドとBACE1阻害ペプチドの組み合わせ（3:1の比率）の5倍モル過剰量と5～10% DMSOで混合し、PBSで1時間室温でインキュベートした後、注入した。ストレプトアビジン標識ペプチドは、脳空洞を有するラットの片方の尾静脈に10 mg/kgの用量で静脈内注入した。
ストレプトアビジン-ペプチド複合体の濃度はELISA法で評価した。Nunc Maxisorpマイクロタイタープレート（Sigma社製）を、1.5 μg/mlのマウス抗ストレプトアビジン抗体（Thermo社製、MA1-20011）で4℃、一晩コーティングした。室温で2時間ブロッキング（ブロッキングバッファー：140 nM NaCL、5 mM EDTA、0.05% NP40、0.25%ゼラチン、1% BSA）した後、0.05% Tween-20/PBS（洗浄バッファー）で3秒間プレートを洗浄した。ブロッキングバッファーで希釈したウェルに、髄液（CSF）および血漿（CSF）を添加した（血漿：1:10,000、CSF：1:115）。プレートを検出抗体（1μg/ml、抗ストレプトアビジン-HRP、Novus NB120-7239）とともに4℃で一晩インキュベートした。3回の洗浄ステップの後、ストレプトアビジンをTMB基質溶液（Roche社）中で最大20分間インキュベートして検出した。1M H2SO4で発色を停止させた後、450 nmの吸光度を測定する。
ストレプトアビジン-ペプチド-BACE1阻害剤複合体の機能は、製造元のプロトコル（Wako、294-64701）に従い、Aβ（1-40）ELISAによって評価した。簡潔に説明すると、髄液サンプルを標準希釈液（1:23）で希釈し、BNT77捕捉抗体を塗布した96ウェルプレートで4℃、一晩インキュベートした。5回の洗浄後、HRP標識BA27抗体を添加し、4℃で2時間インキュベートした後、5回の洗浄を実施した。Aβ（1-40）は、TMB溶液中で室温で30分間インキュベートすることにより検出した。発色を停止液で停止させた後、450 nmの吸光度を測定した。血漿サンプルは、Aβ（1-40）ELISAの前に固相抽出に供した。血漿を96ウェルプレート中の0.2% DEA（Sigma）に加え、室温で30分間インキュベートした。SPEプレート（Oasis、186000679）を水と100%メタノールで順次洗浄した後、血漿サンプルをSPEプレートに加え、液体をすべて除去した。サンプルは洗浄（まず5%メタノール、次に30%メタノール）し、2% NH4OH/90%メタノールで溶出した。溶出液を55℃、一定窒素流下で99分間乾燥させた後、サンプルを標準希釈液で還元し、上記のようにAβ(1-40)を測定した。
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