Gràcies per visitar Nature.com. Esteu utilitzant una versió del navegador amb compatibilitat limitada amb CSS. Per a una millor experiència, us recomanem que utilitzeu un navegador actualitzat (o que desactiveu el mode de compatibilitat a l'Internet Explorer). A més, per garantir una assistència contínua, mostrem el lloc web sense estils ni JavaScript.
Mostra un carrusel de tres diapositives alhora. Feu servir els botons Anterior i Següent per moure's per tres diapositives alhora o feu servir els botons lliscants del final per moure's per tres diapositives alhora.
La barrera hematoencefàlica i la barrera hematoencefàlica impedeixen que els agents bioterapèutics arribin als seus objectius en el sistema nerviós central, cosa que dificulta el tractament eficaç de les malalties neurològiques. Per descobrir nous transportadors cerebrals in vivo, vam introduir una biblioteca de pèptids del fag T7 i vam recollir en sèrie sang i líquid cefaloraquidi (LCR) utilitzant un model de rates canulades de grans quantitats conscients. Els clons específics del fag es van enriquir molt en LCR després de quatre rondes de selecció. Les proves de pèptids candidats individuals van revelar un enriquiment de més de 1000 vegades en LCR. La bioactivitat de l'administració mediada per pèptids al cervell es va confirmar amb una reducció del 40% en el nivell de β-amiloide en el líquid cefaloraquidi utilitzant un inhibidor del pèptid BACE1 vinculat al nou pèptid de trànsit identificat. Aquests resultats suggereixen que els pèptids identificats pels mètodes de selecció de fags in vivo poden ser vehicles útils per a l'administració sistèmica de macromolècules al cervell amb un efecte terapèutic.
La recerca en teràpies dirigides al sistema nerviós central (SNC) s'ha centrat principalment en la identificació de fàrmacs i agents optimitzats que presentin propietats dirigides al SNC, amb menys esforç en descobrir els mecanismes que impulsen l'administració activa de fàrmacs al cervell. Això comença a canviar ara, ja que l'administració de fàrmacs, especialment de molècules grans, és una part integral del desenvolupament modern de fàrmacs en neurociència. L'entorn del sistema nerviós central està ben protegit pel sistema de barrera cerebrovascular, que consisteix en la barrera hematoencefàlica (BHE) i la barrera hematoencefàlica (BHE)1, cosa que dificulta l'administració de fàrmacs al cervell1,2. S'estima que gairebé tots els fàrmacs de molècules grans i més del 98% dels fàrmacs de molècules petites s'eliminen del cervell3. És per això que és molt important identificar nous sistemes de transport cerebral que proporcionin una administració eficient i específica de fàrmacs terapèutics al SNC4,5. Tanmateix, la BHE i la BHE també presenten una excel·lent oportunitat per a l'administració de fàrmacs, ja que penetren i entren a totes les estructures del cervell a través de la seva extensa vasculatura. Per tant, els esforços actuals per utilitzar mètodes no invasius d'administració al cervell es basen en gran mesura en el mecanisme de transport mediat per receptors (PMT) mitjançant el receptor BBB6 endogen. Malgrat els avenços clau recents en l'ús de la via del receptor de la transferrina7,8, cal un major desenvolupament de nous sistemes d'administració amb propietats millorades. Amb aquesta finalitat, el nostre objectiu era identificar pèptids capaços de mediar el transport del LCR, ja que en principi es podrien utilitzar per administrar macromolècules al SNC o per obrir noves vies receptores. En particular, els receptors i transportadors específics del sistema cerebrovascular (BBB i BSCFB) poden servir com a dianes potencials per a l'administració activa i específica de fàrmacs bioterapèutics. El líquid cefaloraquidi (LCR) és un producte secretor del plexe coroide (SC) i està en contacte directe amb el líquid intersticial del cervell a través de l'espai subaracnoïdal i l'espai ventricular4. Recentment s'ha demostrat que el líquid cefaloraquidi subaracnoïdal es difon excessivament a l'interstici del cervell9. Esperem accedir a l'espai parenquimàtic utilitzant aquest tracte d'entrada subaracnoïdal o directament a través de la BHE. Per aconseguir-ho, hem implementat una robusta estratègia de selecció de fags in vivo que idealment identifica els pèptids transportats per qualsevol d'aquestes dues vies diferents.
Ara descrivim un mètode de cribratge seqüencial in vivo de visualització de fags amb mostreig de LCR juntament amb seqüenciació d'alt rendiment (HTS) per controlar les rondes de selecció inicials amb la diversitat de biblioteques més alta. El cribratge es va realitzar en rates conscients amb una cànula de cisterna gran (CM) implantada permanentment per evitar la contaminació de la sang. És important destacar que aquest enfocament selecciona tant pèptids dirigits al cervell com pèptids amb activitat de transport a través de la barrera cerebrovascular. Vam utilitzar fags T7 a causa de la seva petita mida (~60 nm)10 i vam suggerir que són adequats per al transport de vesícules que permeten el creuament transcel·lular de la barrera endotelial i/o epitelial-medul·lar. Després de quatre rondes de cribratge, es van aïllar poblacions de fags que mostraven un fort enriquiment in vivo de LCR i una associació de microvasos cerebrals. És important destacar que vam poder confirmar les nostres troballes demostrant que els pèptids candidats preferits i sintetitzats químicament són capaços de transportar càrrega proteica al líquid cefaloraquidi. Primer, es van establir els efectes farmacodinàmics del SNC combinant un pèptid de trànsit líder amb un inhibidor del pèptid BACE1. A més de demostrar que les estratègies de cribratge funcional in vivo poden identificar nous pèptids de transport cerebral com a portadors de càrrega de proteïnes eficaços, esperem que enfocaments de selecció funcional similars també esdevinguin importants per identificar noves vies de transport cerebral.
Basant-se en unitats formadores de plaques (PFU), després del pas d'empaquetament del fag, es va dissenyar i crear una biblioteca de pèptids aleatoris de fags T7 lineals de 12 mers amb una diversitat d'aproximadament 109 (vegeu Materials i mètodes). És important tenir en compte que vam analitzar acuradament aquesta biblioteca abans del panning in vivo. L'amplificació per PCR de mostres de la biblioteca de fags mitjançant encebadors modificats va generar amplicons que eren directament aplicables a HTS (Figura suplementària 1a). A causa de a) errors de seqüenciació HTS11, b) impacte en la qualitat dels encebadors (NNK)1-12, i c) la presència de fags de tipus salvatge (wt) (insercions d'esquelet) a la biblioteca en espera, es va implementar un procediment de filtratge de seqüències per extreure només informació de seqüència verificada (Figura suplementària 1b). Aquests passos de filtre s'apliquen a totes les biblioteques de seqüenciació HTS. Per a la biblioteca estàndard, es van obtenir un total de 233.868 lectures, de les quals el 39% van superar els criteris de filtre i es van utilitzar per a l'anàlisi i selecció de biblioteques per a rondes posteriors (Figura suplementària 1c-e). Les lectures eren predominantment múltiples de 3 parells de bases de longitud amb un pic a 36 nucleòtids (Fig. suplementària 1c), confirmant el disseny de la biblioteca (NNK) 1-12. Cal destacar que aproximadament l'11% dels membres de la biblioteca contenien un insert PAGISRELVDKL de tipus salvatge (wt) de 12 dimensions, i gairebé la meitat de les seqüències (49%) contenien insercions o delecions. L'HTS de la biblioteca va confirmar l'alta diversitat de pèptids a la biblioteca: més del 81% de les seqüències de pèptids es van trobar només una vegada i només l'1,5% es van produir en ≥4 còpies (Fig. suplementària 2a). Les freqüències d'aminoàcids (aa) a les 12 posicions del repertori es van correlacionar bé amb les freqüències esperades per al nombre de codons generats pel repertori NKK degenerat (Fig. suplementària 2b). La freqüència observada de residus d'aa codificats per aquests inserts es va correlacionar bé amb la freqüència calculada (r = 0,893) (Fig. suplementària 2c). La preparació de biblioteques de fagos per a la injecció inclou els passos d'amplificació i eliminació d'endotoxines. Anteriorment s'ha demostrat que això redueix potencialment la diversitat de les biblioteques de fagos12,13. Per tant, vam seqüenciar una biblioteca de fagos amplificada en placa que havia estat sotmesa a eliminació d'endotoxines i la vam comparar amb la biblioteca original per estimar la freqüència d'AA. Es va observar una forta correlació (r = 0,995) entre el conjunt original i el conjunt amplificat i purificat (Fig. suplementària 2d), cosa que indica que la competència entre clons amplificats en plaques utilitzant el fag T7 no va causar un biaix important. Aquesta comparació es basa en la freqüència de motius tripeptídics a cada biblioteca, ja que la diversitat de biblioteques (~109) no es pot capturar completament ni tan sols amb HTS. L'anàlisi de freqüència d'aa a cada posició va revelar un petit biaix dependent de la posició a les tres últimes posicions del repertori introduït (Fig. suplementària 2e). En conclusió, vam concloure que la qualitat i la diversitat de la biblioteca eren acceptables i només es van observar canvis menors en la diversitat a causa de l'amplificació i la preparació de les biblioteques de fagos entre diverses rondes de selecció.
El mostreig seriat de líquid cefaloraquidi es pot realitzar implantant quirúrgicament una cànula a la medul·la mandibular (CM) de rates conscients per facilitar la identificació del fag T7 injectat per via intravenosa (iv) a través de la BHE i/o la BSFB (Fig. 1a-b). Vam utilitzar dos braços de selecció independents (braços A i B) en les tres primeres rondes de selecció in vivo (Fig. 1c). Vam augmentar gradualment el rigor de la selecció disminuint la quantitat total de fag introduït en les tres primeres rondes de selecció. Per a la quarta ronda de selecció, vam combinar mostres de les branques A i B i vam realitzar tres seleccions independents addicionals. Per estudiar les propietats in vivo de les partícules del fag T7 en aquest model, es va injectar el fag de tipus salvatge (inserció mestre PAGISRELVDKL) a rates a través de la vena caudal. La recuperació de fags del líquid cefaloraquidi i la sang en diferents moments va mostrar que els fags icosaèdrics T7 relativament petits tenien una fase d'eliminació inicial ràpida del compartiment sanguini (Fig. suplementària 3). Basant-nos en els títols administrats i el volum sanguini de les rates, vam calcular que només es va detectar aproximadament un 1% en pes del fag de la dosi administrada a la sang 10 minuts després de la injecció intravenosa. Després d'aquest ràpid descens inicial, es va mesurar una eliminació primària més lenta amb una vida mitjana de 27,7 minuts. És important destacar que només es van recuperar molt pocs fags del compartiment del LCR, cosa que indica un baix nivell de fons per a la migració de fags de tipus salvatge al compartiment del LCR (Fig. suplementària 3). De mitjana, només es van detectar aproximadament 1 x 10-3% de títols de fag T7 a la sang i 4 x 10-8% dels fags inicialment infosos al líquid cefaloraquidi durant tot el període de mostreig (0-250 min). Cal destacar que la vida mitjana (25,7 min) del fag de tipus salvatge al líquid cefaloraquidi va ser similar a la observada a la sang. Aquestes dades demostren que la barrera que separa el compartiment del LCR de la sang està intacta en rates canulades amb CM, permetent la selecció in vivo de biblioteques de fagos per identificar clons que es transporten fàcilment de la sang al compartiment del LCR.
(a) Configuració d'un mètode per a la re-mostra de líquid cefaloraquidi (LCR) d'una gran quantitat. (b) Diagrama que mostra la ubicació cel·lular de la barrera del sistema nerviós central (SNC) i l'estratègia de selecció utilitzada per identificar pèptids que creuen la barrera hematoencefàlica (BHE) i la barrera hematoencefàlica. (c) Diagrama de flux de cribratge de fags in vivo. A cada ronda de selecció, els fags (identificadors d'animals dins de les fletxes) es van injectar per via intravenosa. Dues branques alternatives independents (A, B) es mantenen per separat fins a la quarta ronda de selecció. Per a les rondes de selecció 3 i 4, cada clon de fag extret del LCR es va seqüenciar manualment. (d) Cinètica del fag aïllat de la sang (cercles vermells) i del líquid cefaloraquidi (triangles verds) durant la primera ronda de selecció en dues rates cannulades després de la injecció intravenosa de la biblioteca de pèptids T7 (2 x 1012 fags/animal). Els quadrats blaus indiquen la concentració inicial mitjana del fag a la sang, calculada a partir de la quantitat de fag injectat, tenint en compte el volum total de sang. Els quadrats negres indiquen el punt d'intersecció de la línia y extrapolada a partir de les concentracions de fag a la sang. (e, f) Presenten la freqüència i la distribució relatives de tots els possibles motius tripeptídics superposats que es troben al pèptid. Es mostra el nombre de motius trobats en 1000 lectures. Els motius enriquits significativament (p < 0,001) estan marcats amb punts vermells. (e) Diagrama de dispersió de correlació que compara la freqüència relativa del motiu tripeptídic de la biblioteca injectada amb el fag derivat de la sang dels animals #1.1 i #1.2. (f) Diagrama de dispersió de correlació que compara les freqüències relatives dels motius tripeptídics del fag animal #1.1 i #1.2 aïllats en sang i líquid cefaloraquidi. (g, h) Representació de l'ID de seqüència del fag enriquit en sang (g) versus biblioteques injectades i fag enriquit en LCR (h) versus sang després d'una ronda de selecció in vivo en ambdós animals. La mida del codi d'una lletra indica la freqüència amb què apareix l'aminoàcid en aquesta posició. Verd = polar, porpra = neutre, blau = bàsic, vermell = àcid i negre = aminoàcids hidròfobs. Les figures 1a i b van ser dissenyades i produïdes per Eduard Urich.
Vam injectar una biblioteca de pèptids fags a dues rates d'instrument CM (clades A i B) i vam aïllar el fag del líquid cefaloraquidi i la sang (Figura 1d). L'eliminació ràpida inicial de la biblioteca va ser menys pronunciada en comparació amb el fag de tipus salvatge. La semivida mitjana de la biblioteca injectada en ambdós animals va ser de 24,8 minuts en sang, similar al fag de tipus salvatge, i de 38,5 minuts en LCR. Les mostres de sang i líquid cefaloraquidi de cada animal es van sotmetre a HTS i tots els pèptids identificats es van analitzar per detectar la presència d'un motiu tripeptídic curt. Es van escollir els motius tripeptídics perquè proporcionen una base mínima per a la formació d'estructures i les interaccions pèptid-proteïna14,15. Vam trobar una bona correlació en la distribució de motius entre la biblioteca de fags injectada i els clons extrets de la sang d'ambdós animals (Fig. 1e). Les dades indiquen que la composició de la biblioteca només està marginalment enriquida al compartiment sanguini. Les freqüències d'aminoàcids i les seqüències de consens es van analitzar més a fons a cada posició mitjançant una adaptació del programari Weblogo16. Curiosament, vam trobar un fort enriquiment en residus de glicina a la sang (Fig. 1g). Quan es va comparar la sang amb clons seleccionats del LCR, es va observar una forta selecció i una certa desselecció de motius (Fig. 1f), i certs aminoàcids estaven presents preferentment en posicions predeterminades en els 12 membres (Fig. 1h). Cal destacar que els animals individuals difereixen significativament en el líquid cefaloraquidi, mentre que es va observar un enriquiment de glicina a la sang en ambdós animals (Fig. suplementària 4a-j). Després d'un filtratge rigorós de les dades de seqüència en el líquid cefaloraquidi dels animals #1.1 i #1.2, es van obtenir un total de 964 i 420 pèptids únics de 12 mers (Fig. suplementària 1d-e). Els clons de fags aïllats es van amplificar i es van sotmetre a una segona ronda de selecció in vivo. Els fags extrets de la segona ronda de selecció es van sotmetre a HTS en cada animal i tots els pèptids identificats es van utilitzar com a entrada per a un programa de reconeixement de motius per analitzar l'ocurrència de motius tripeptídics (Fig. 2a, b, ef). En comparació amb el primer cicle del fag recuperat del LCR, vam observar una major selecció i desselecció de molts motius al LCR a les branques A i B (Fig. 2). Es va aplicar un algoritme d'identificació de xarxa per determinar si representaven patrons diferents de seqüència consistent. Es va observar una clara similitud entre les seqüències de 12 dimensions recuperades pel LCR al clade alternatiu A (Fig. 2c, d) i al clade B (Fig. 2g, h). L'anàlisi agrupada a cada branca va revelar diferents perfils de selecció per a pèptids de 12 mers (Fig. suplementària 5c, d) i un augment de la relació de títols LCR/sang al llarg del temps per als clons agrupats després de la segona ronda de selecció en comparació amb la primera ronda de selecció (Fig. suplementària 5e).
Enriquiment de motius i pèptids en líquid cefaloraquidi mitjançant dues rondes successives de selecció de fags funcionals in vivo.
Tots els fags del líquid cefaloraquidi recuperats de la primera ronda de cada animal (animals #1.1 i #1.2) es van agrupar, amplificar, seqüenciar per HT i reinjectar junts (2 x 1010 fags/animal) a 2 rates cannulades SM (#1.1 → #). 2.1 i 2.2, 1.2 → 2.3 i 2.4). (a, b, e, f) Diagrames de dispersió de correlació que comparen la freqüència relativa dels motius tripeptídics de tots els fags derivats del LCR a la primera i segona ronda de selecció. Freqüència relativa i distribució dels motius que representen tots els possibles tripèptids superposats trobats en pèptids en ambdues orientacions. Es mostra el nombre de motius trobats en 1000 lectures. Els motius que es van seleccionar o excloure significativament (p < 0,001) en una de les biblioteques comparades es destaquen amb punts vermells. (c, d, g, h) Representació del logotip de seqüència de totes les seqüències llargues de 12 aminoàcids riques en LCR basades en les rondes 2 i 1 de selecció in vivo. La mida del codi d'una lletra indica la freqüència amb què es produeix aquest aminoàcid en aquesta posició. Per representar el logotip, es compara la freqüència de les seqüències de LCR extretes d'animals individuals entre dues rondes de selecció i es mostren les seqüències enriquides a la segona ronda: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 i (h) #1.2–#2.4. Els aminoàcids més enriquits en una posició determinada en (c, d) els animals núm. 2.1 i núm. 2.2 o (g, h) en els animals núm. 2.3 i núm. 2.4 es mostren en color. Verd = polar, porpra = neutre, blau = bàsic, vermell = àcid i negre = aminoàcids hidròfobs.
Després de la tercera ronda de selecció, vam identificar 124 seqüències peptídiques úniques (#3.1 i #3.2) de 332 clons de fags reconstituïts amb CSF aïllats de dos animals (Fig. suplementària 6a). La seqüència LGSVS (18,7%) va tenir la proporció relativa més alta, seguida dels inserts de tipus salvatge PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) i SARGSWREIVSLS (2,2%). A la quarta ronda final, vam agrupar dues branques seleccionades independentment de tres animals separats (Fig. 1c). Dels 925 clons de fags seqüenciats recuperats del CSF, a la quarta ronda vam trobar 64 seqüències peptídiques úniques (Fig. suplementària 6b), entre les quals la proporció relativa de fags de tipus salvatge va baixar al 0,8%. Els clons de CSF més comuns a la quarta ronda van ser LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) i RLSSVDSDLSGC (3,2%). El rang de longitud dels pèptids seleccionats es deu a insercions/delecions de nucleòtids o codons d'aturada prematurs als encebadors de la biblioteca quan s'utilitzen codons degenerats per al disseny de biblioteques NNK. Els codons d'aturada prematurs generen pèptids més curts i es seleccionen perquè contenen el motiu aa favorable. Els pèptids més llargs poden resultar d'insercions/delecions als encebadors de les biblioteques sintètiques. Això posiciona el codó d'aturada dissenyat fora del marc i el llegeix fins que apareix un nou codó d'aturada més avall. En general, vam calcular els factors d'enriquiment per a les quatre rondes de selecció comparant les dades d'entrada amb les dades de sortida de la mostra. Per a la primera ronda de cribratge, vam utilitzar títols de fags de tipus salvatge com a referència de fons no específica. Curiosament, la selecció negativa de fags va ser molt forta en el primer cicle del LCR, però no a la sang (Fig. 3a), cosa que pot ser deguda a la baixa probabilitat de difusió passiva de la majoria dels membres de la biblioteca de pèptids al compartiment del LCR o als fags relatius que tendeixen a ser retinguts o eliminats del torrent sanguini de manera més eficient que els bacteriòfags. Tanmateix, en la segona ronda de selecció, es va observar una forta selecció de fags al LCR en ambdós clades, cosa que suggereix que la ronda anterior es va enriquir en fags que mostren pèptids que promouen l'absorció del LCR (Fig. 3a). De nou, sense un enriquiment significatiu de la sang. També en la tercera i quarta rondes, els clons de fags es van enriquir significativament en LCR. Comparant la freqüència relativa de cada seqüència peptídica única entre les dues últimes rondes de selecció, vam trobar que les seqüències es van enriquir encara més a la quarta ronda de selecció (Fig. 3b). Es van extreure un total de 931 motius tripeptídics de les 64 seqüències peptídiques úniques utilitzant ambdues orientacions peptídiques. Els motius més enriquits de la quarta ronda es van examinar més de prop pels seus perfils d'enriquiment en totes les rondes en comparació amb la biblioteca injectada (límit: 10% d'enriquiment) (Fig. suplementària 6c). Els patrons generals de selecció van mostrar que la majoria dels motius estudiats es van enriquir en totes les rondes anteriors d'ambdues branques de selecció. Tanmateix, alguns motius (per exemple, SGL, VSG, LGS GSV) eren predominantment del clade alternatiu A, mentre que altres (per exemple, FGW, RTN, WGF, NTR) es van enriquir en el clade alternatiu B.
Validació del transport en LCR de pèptids visualitzats en fagos enriquits amb LCR i pèptids líders biotinilats conjugats amb càrregues d'estreptavidina.
(a) Ràtios d'enriquiment calculades en les quatre rondes (R1-R4) basades en els títols de fags (PFU) injectats (entrada = I) i els títols de fags del LCR determinats (sortida = O). Els factors d'enriquiment per a les tres últimes rondes (R2-R4) es van calcular en comparació amb la ronda anterior i la primera ronda (R1) amb dades de pes. Les barres obertes són líquid cefaloraquidi, les barres ombrejades són plasma. (***p <0,001, basat en la prova t de Student). (b) Llista dels pèptids de fags més abundants, classificats segons la seva proporció relativa respecte a tots els fags recollits al LCR després de la ronda 4 de selecció. Els sis clons de fags més comuns estan ressaltats en color, numerats i els seus factors d'enriquiment entre les rondes 3 i 4 de selecció (insercions). (c, d) Els sis clons de fags més enriquits, les biblioteques de pèptids de fags buits i parentals de la ronda 4 es van analitzar individualment en un model de mostreig de LCR. Es van recollir mostres de LCR i sang en els moments indicats. (c) Quantitats iguals de 6 clons de fags candidats (2 x 1010 fags/animals), fags buits (núm. 1779) (2 x 1010 fags/animals) i biblioteques de pèptids de fags estoc (2 x 1012 fags/animals). Injectar almenys 3 CM i administrar-los a l'animal cannulat per separat a través de la vena caudal. Es mostra la farmacocinètica del LCR de cada clon de fag i biblioteca de pèptids de fags injectats al llarg del temps. (d) mostra la relació mitjana LCR/sang per a tots els fags/ml recuperats durant el temps de mostreig. (e) Quatre pèptids líders sintètics i un control barrejat es van unir amb biotina a estreptavidina a través del seu extrem N-terminal (visualització de tetràmers) seguit d'injecció (vena caudal iv, 10 mg d'estreptavidina/kg). Almenys tres rates intubades (N = 3). ). Es van recollir mostres de LCR en els punts de temps indicats i es van mesurar les concentracions d'estreptavidina mitjançant ELISA anti-estreptavidina en LCR (nd = no detectat). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, basat en la prova ANOVA). (f) Comparació de la seqüència d'aminoàcids del clon de pèptids fags més enriquit #2002 (morat) amb altres clons de pèptids fags seleccionats de la 4a ronda de selecció. Els fragments d'aminoàcids idèntics i similars estan codificats per colors.
De tots els fags enriquits a la quarta ronda (Fig. 3b), es van seleccionar sis clons candidats per a una anàlisi individual posterior en el model de mostreig de LCR. Es van injectar quantitats iguals de sis biblioteques de pèptids de fags candidats, fags buits (sense insert) i profags a tres animals CM canulats, i la farmacocinètica es va determinar en assaigs de LCR (Fig. 3c) i sang (Fig. suplementària 7). Tots els clons de fags provats es van dirigir al compartiment del LCR a un nivell 10-1000 vegades superior al del fag de control buit (núm. 1779). Per exemple, els clons núm. 2020 i núm. 2077 tenien títols de LCR unes 1000 vegades superiors als del fag de control. El perfil farmacocinètic de cada pèptid seleccionat és diferent, però tots tenen una alta capacitat de localització del LCR. Vam observar una disminució constant al llarg del temps per als clons #1903 i #2011, mentre que per als clons #2077, #2002 i #2009 un augment durant els primers 10 minuts podria indicar transport actiu, però cal verificar-lo. Els clons #2020, #2002 i #2077 es van estabilitzar a nivells alts, mentre que la concentració de LCR del clon #2009 va disminuir lentament després de l'augment inicial. A continuació, vam comparar la freqüència relativa de cada candidat a LCR amb la seva concentració a la sang (Fig. 3d). La correlació del títol mitjà de cada candidat a LCR amb el seu títol a la sang en tots els moments de mostreig va mostrar que tres dels sis candidats estaven significativament enriquits en LCR a la sang. Curiosament, el clon #2077 va mostrar una major estabilitat a la sang (Figura suplementària 7). Per confirmar que els propis pèptids són capaços de transportar activament càrrega diferent de partícules de fag al compartiment del LCR, vam sintetitzar quatre pèptids líders derivatitzats amb biotina a l'extrem N-terminal, on els pèptids s'uneixen a la partícula del fag. Els pèptids biotinilats (núm. 2002, 2009, 2020 i 2077) es van conjugar amb estreptavidina (SA) per obtenir formes multimèriques que imitaven en certa manera la geometria del fag. Aquest format també ens va permetre mesurar l'exposició a SA a la sang i al líquid cefaloraquidi com a pèptids proteics transportadors de càrrega. És important destacar que les dades del fag sovint es podien reproduir quan s'administraven pèptids sintètics en aquest format conjugat amb SA (Fig. 3e). Els pèptids barrejats tenien menys exposició inicial i una eliminació més ràpida del LCR amb nivells indetectables en 48 hores. Per obtenir informació sobre les vies d'administració d'aquests clons de pèptids del fag a l'espai del LCR, vam analitzar la localització de les accions individuals dels pèptids del fag mitjançant immunohistoquímica (IHC) per detectar directament partícules de fag 1 hora després de la injecció intravenosa in vivo. Cal destacar que els clons #2002, #2077 i #2009 es van poder detectar mitjançant una forta tinció als capil·lars cerebrals, mentre que el fag de control (#1779) i el clon #2020 no es van detectar (Figura suplementària 8). Això suggereix que aquests pèptids contribueixen a l'efecte sobre el cervell precisament creuant la BHE. Cal una anàlisi més detallada per provar aquesta hipòtesi, ja que la ruta BSCFB també hi pot estar implicada. En comparar la seqüència d'aminoàcids del clon més enriquit (#2002) amb altres pèptids seleccionats, es va observar que alguns d'ells tenen extensions d'aminoàcids similars, cosa que pot indicar un mecanisme de transport similar (Fig. 3f).
A causa del seu perfil plasmàtic únic i l'augment significatiu del LCR al llarg del temps, el clon de visualització de fags #2077 es va explorar més a fons durant un període més llarg de 48 hores i va ser capaç de reproduir el ràpid augment del LCR observat en associació amb nivells sostinguts de SA (Fig. 4a). Pel que fa a altres clons de fags identificats, el #2077 es va tenyir fortament per als capil·lars cerebrals i va mostrar una colocalització significativa amb la lectina marcadora capil·lar quan es va observar a una resolució més alta i possiblement alguna tinció a l'espai parenquimal (Figura 4b). Per investigar si es podien obtenir efectes farmacològics mediats per pèptids al SNC, vam realitzar un experiment en què es van barrejar versions biotinilades de i) el pèptid de trànsit #2077 i ii) el pèptid inhibidor de BACE1 amb SA en dues proporcions diferents. Per a una combinació vam utilitzar només l'inhibidor de pèptid BACE1 i per a l'altra vam utilitzar una proporció d'1:3 d'inhibidor de pèptid BACE1 a pèptid #2077. Ambdues mostres es van administrar per via intravenosa i es van mesurar els nivells de pèptid beta-amiloide 40 (Abeta40) en sang i líquid cefaloraquidi al llarg del temps. L'Abeta40 es va mesurar en LCR, ja que reflecteix la inhibició de BACE1 al parènquima cerebral. Com s'esperava, ambdós complexos van reduir significativament els nivells sanguinis d'Abeta40 (Fig. 4c, d). Tanmateix, només les mostres que contenien una barreja del pèptid núm. 2077 i un inhibidor del pèptid BACE1 conjugat amb SA van causar una disminució significativa d'Abeta40 en el líquid cefaloraquidi (Fig. 4c). Les dades mostren que el pèptid núm. 2077 és capaç de transportar la proteïna SA de 60 kDa al SNC i també indueix efectes farmacològics amb inhibidors del pèptid BACE1 conjugats amb SA.
(a) Injecció clonal (2 × 10 fags/animal) del fag T7 que mostra els perfils farmacocinètics a llarg termini del pèptid CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) i del fag de control no injectat (#1779) en almenys tres rates intubades amb CM. (b) Imatge microscòpica confocal de microvasos corticals representatius en rates injectades amb fags (2 × 10 10 fags/animal) que mostra la contratinció del pèptid #2077 i els vasos (lectina). Aquests clons de fags es van administrar a 3 rates i es van deixar circular durant 1 hora abans de la perfusió. Els cervells es van seccionar i es van tenyir amb anticossos policlonals marcats amb FITC contra la càpsida del fag T7. Deu minuts abans de la perfusió i la posterior fixació, es va administrar lectina marcada amb DyLight594 per via intravenosa. Imatges fluorescents que mostren la tinció de lectina (vermell) del costat luminal dels microvasos i fags (verd) al lumen dels capil·lars i al teixit cerebral perivascular. La barra d'escala correspon a 10 µm. (c, d) El pèptid inhibidor de BACE1 biotinilat sol o en combinació amb el pèptid de trànsit biotinilat #2077 es va acoblar a estreptavidina seguit d'injecció intravenosa d'almenys tres rates CM canulades (10 mg d'estreptavidina/kg). La reducció d'Aβ40 mediada per l'inhibidor del pèptid BACE1 es va mesurar mitjançant ELISA Aβ1-40 en sang (vermell) i líquid cefaloraquidi (taronja) en els punts de temps indicats. Per a una millor claredat, es dibuixa una línia de punts al gràfic a una escala del 100%. (c) Percentatge de reducció de l'Aβ40 a la sang (triangles vermells) i al líquid cefaloraquidi (triangles taronges) en rates tractades amb estreptavidina conjugada amb el pèptid de trànsit #2077 i el pèptid inhibidor de BACE1 en una proporció de 3:1. (d) Percentatge de reducció de l'Aβ40 a la sang (cercles vermells) i al líquid cefaloraquidi (cercles taronges) de rates tractades només amb estreptavidina acoblada a un pèptid inhibidor de BACE1. La concentració d'Aβ en el control va ser de 420 pg/ml (desviació estàndard = 101 pg/ml).
La visualització en fags s'ha aplicat amb èxit en diverses àrees de la recerca biomèdica17. Aquest mètode s'ha utilitzat per a estudis de diversitat vascular in vivo18,19, així com per a estudis dirigits a vasos cerebrals20,21,22,23,24,25,26. En aquest estudi, hem ampliat l'aplicació d'aquest mètode de selecció no només a la identificació directa de pèptids dirigits a vasos cerebrals, sinó també al descobriment de candidats amb propietats de transport actiu per creuar la barrera hematoencefàlica. Ara descrivim el desenvolupament d'un procediment de selecció in vivo en rates intubades amb CM i demostrem el seu potencial per identificar pèptids amb propietats de localització al LCR. Utilitzant el fag T7 que mostra una biblioteca de pèptids aleatoris de 12 mers, vam poder demostrar que el fag T7 és prou petit (aproximadament 60 nm de diàmetre)10 per adaptar-se a la barrera hematoencefàlica, creuant així directament la barrera hematoencefàlica o el plexe coroide. Vam observar que la recol·lecció de LCR de rates CM canulades era un mètode de cribratge funcional in vivo ben controlat, i que el fag extret no només s'unia a la vasculatura, sinó que també funcionava com a transportador a través de la barrera hematoencefàlica. A més, en recollir sang i aplicar simultàniament HTS al LCR i als fags derivats de la sang, vam confirmar que la nostra elecció de LCR no estava influenciada per l'enriquiment de la sang ni l'aptitud per a l'expansió entre rondes de selecció. Tanmateix, el compartiment sanguini forma part del procediment de selecció, ja que els fags capaços d'arribar al compartiment del LCR han de sobreviure i circular pel torrent sanguini el temps suficient per enriquir-se al cervell. Per tal d'extreure informació de seqüència fiable de les dades HTS en brut, vam implementar filtres adaptats als errors de seqüenciació específics de la plataforma en el flux de treball d'anàlisi. En incorporar paràmetres cinètics al mètode de cribratge, vam confirmar la farmacocinètica ràpida dels fags T7 de tipus salvatge (t½ ~ 28 min) a la sang24, 27, 28 i també vam determinar la seva vida mitjana en el líquid cefaloraquidi (t½ ~ 26 min) per minut). Malgrat perfils farmacocinètics similars en sang i LCR, només es va poder detectar el 0,001% de la concentració sanguínia del fag al LCR, cosa que indica una baixa mobilitat de fons del fag T7 de tipus salvatge a través de la barrera hematoencefàlica. Aquest treball destaca la importància de la primera ronda de selecció quan s'utilitzen estratègies de panning in vivo, especialment per a sistemes de fags que s'eliminen ràpidament de la circulació, ja que pocs clons són capaços d'arribar al compartiment del SNC. Així, a la primera ronda, la reducció de la diversitat de la biblioteca va ser molt gran, ja que només es va recollir un nombre limitat de clons en aquest model de LCR molt estricte. Aquesta estratègia de panning in vivo va incloure diversos passos de selecció com ara l'acumulació activa al compartiment del LCR, la supervivència dels clons al compartiment de la sang i l'eliminació ràpida dels clons del fag T7 de la sang en els primers 10 minuts (Fig. 1d i Fig. suplementària 4M). Així, després de la primera ronda, es van identificar diferents clons de fags al LCR, tot i que es va utilitzar el mateix grup inicial per a animals individuals. Això suggereix que múltiples passos de selecció estrictes per a biblioteques d'origen amb un gran nombre de membres de la biblioteca resulten en una reducció significativa de la diversitat. Per tant, els esdeveniments aleatoris esdevindran una part integral del procés de selecció inicial, influint enormement en el resultat. És probable que molts dels clons de la biblioteca original tinguessin una propensió a l'enriquiment de CSF molt similar. Tanmateix, fins i tot en les mateixes condicions experimentals, els resultats de la selecció poden diferir a causa del petit nombre de cada clon en particular al grup inicial.
Els motius enriquits en LCR difereixen dels de la sang. Curiosament, vam observar el primer canvi cap a pèptids rics en glicina a la sang d'animals individuals. (Fig. 1g, Figs. suplementàries 4e, 4f). El fag que conté pèptids de glicina pot ser més estable i menys probable que es tregui de la circulació. Tanmateix, aquests pèptids rics en glicina no es van detectar a les mostres de líquid cefaloraquidi, cosa que suggereix que les biblioteques seleccionades van passar per dos passos de selecció diferents: un a la sang i un altre que es va permetre acumular-se al líquid cefaloraquidi. Els clons enriquits en LCR resultants de la quarta ronda de selecció s'han provat àmpliament. Es va confirmar que gairebé tots els clons provats individualment estaven enriquits en LCR en comparació amb el fag de control en blanc. Es va examinar amb més detall un encert de pèptid (núm. 2077). Va mostrar una vida mitjana plasmàtica més llarga en comparació amb altres encerts (Figura 3d i Figura suplementària 7), i curiosament, aquest pèptid contenia un residu de cisteïna a l'extrem C-terminal. Recentment s'ha demostrat que l'addició de cisteïna als pèptids pot millorar les seves propietats farmacocinètiques unint-se a l'albúmina 29. Això és actualment desconegut per al pèptid #2077 i requereix més estudis. Alguns pèptids van mostrar una dependència de valència en l'enriquiment del LCR (dades no mostrades), que pot estar relacionada amb la geometria superficial mostrada de la càpsida T7. El sistema T7 que vam utilitzar va mostrar de 5 a 15 còpies de cada pèptid per partícula de fag. L'IHC es va realitzar en clons de fags candidats injectats per via intravenosa a l'escorça cerebral de rates (Fig. suplementària 8). Les dades van mostrar que almenys tres clons (núm. 2002, núm. 2009 i núm. 2077) van interactuar amb la BHE. Queda per determinar si aquesta interacció de la BHE resulta en l'acumulació de LCR o en el moviment d'aquests clons directament al BCSFB. És important destacar que mostrem que els pèptids seleccionats conserven la seva capacitat de transport de LCR quan es sintetitzen i s'uneixen a la càrrega proteica. La unió de pèptids biotinilats N-terminals a SA essencialment repeteix els resultats obtinguts amb els seus respectius clons de fags en sang i líquid cefaloraquidi (Fig. 3e). Finalment, mostrem que el pèptid principal #2077 és capaç de promoure l'acció cerebral d'un inhibidor peptídic biotinilat de BACE1 conjugat amb SA, causant efectes farmacodinàmics pronunciats al SNC mitjançant la reducció significativa dels nivells d'Abeta40 al LCR (Fig. 4). No vam poder identificar cap homòleg a la base de dades realitzant una cerca d'homologia de seqüència peptídica de tots els resultats. És important tenir en compte que la mida de la biblioteca T7 és d'aproximadament 109, mentre que la mida teòrica de la biblioteca per a 12-mers és de 4 x 1015. Per tant, només vam seleccionar una petita fracció de l'espai de diversitat de la biblioteca de pèptids de 12-mers, cosa que pot significar que es poden identificar pèptids més optimitzats avaluant l'espai de seqüència adjacent d'aquests resultats identificats. Hipotèticament, una de les raons per les quals no hem trobat cap homòleg natural d'aquests pèptids podria ser la desselecció durant l'evolució per evitar l'entrada incontrolada de certs motius peptídics al cervell.
En conjunt, els nostres resultats proporcionen una base per a futurs treballs per identificar i caracteritzar els sistemes de transport de la barrera cerebrovascular in vivo amb més detall. La configuració bàsica d'aquest mètode es basa en una estratègia de selecció funcional que no només identifica clons amb propietats d'unió vascular cerebral, sinó que també inclou un pas crític en què els clons reeixits tenen activitat intrínseca per creuar les barreres biològiques in vivo cap al compartiment del SNC. L'objectiu és elucidar el mecanisme de transport d'aquests pèptids i la seva preferència per unir-se a la microvasculatura específica de la regió cerebral. Això pot conduir al descobriment de noves vies per al transport de la BHE i els receptors. Esperem que els pèptids identificats puguin unir-se directament als receptors cerebrovasculars o als lligands circulants transportats a través de la BHE o el BCSFB. Els vectors peptídics amb activitat de transport del LCR descoberts en aquest treball s'investigaran més a fons. Actualment estem investigant l'especificitat cerebral d'aquests pèptids per la seva capacitat de creuar la BHE i/o el BCSFB. Aquests nous pèptids seran eines extremadament valuoses per al descobriment potencial de nous receptors o vies i per al desenvolupament de noves plataformes altament eficients per a l'administració de macromolècules, com ara biològics, al cervell.
Canular la cisterna gran (MC) utilitzant una modificació del mètode descrit anteriorment. Es van muntar rates Wistar anestesiades (200-350 g) en un aparell estereotàxic i es va fer una incisió mitjana sobre el cuir cabellut afaitat i preparat asèpticament per exposar el crani. Perforar dos forats a la zona de la faixa superior i fixar els cargols de fixació als forats. Es va perforar un forat addicional a la cresta occipital lateral per al guiatge estereotàctic d'una cànula d'acer inoxidable a la MC. Aplicar ciment dental al voltant de la cànula i fixar-la amb cargols. Després del fotocurat i l'enduriment del ciment, la ferida de la pell es va tancar amb sutura supramida 4/0. La col·locació correcta de la cànula es confirma per la fuita espontània de líquid cefaloraquidi (LCR). Treure la rata de l'aparell estereotàxic, rebre l'atenció postoperatòria i el maneig del dolor adequats i deixar-la recuperar durant almenys una setmana fins que s'observin signes de sang al líquid cefaloraquidi. Les rates Wistar (Crl:WI/Han) es van obtenir de Charles River (França). Totes les rates es van mantenir en condicions específiques lliures de patògens. Tots els experiments amb animals van ser aprovats per l'Oficina Veterinària de la ciutat de Basilea, Suïssa, i es van dur a terme d'acord amb la Llicència Animal núm. 2474 (Avaluació del transport cerebral actiu mitjançant la mesura dels nivells de candidats terapèutics en el líquid cefalorraquidi i el cervell de la rata).
Mantingueu suaument la rata conscient amb la cànula CM a la mà. Traieu la Datura de la cànula i recolliu 10 µl de líquid cefaloraquidi que flueix espontàniament. Com que la permeabilitat de la cànula es va veure compromesa en última instància, només es van incloure en aquest estudi mostres de líquid cefaloraquidi clares sense evidència de contaminació o decoloració de la sang. En paral·lel, es van extreure aproximadament entre 10 i 20 μl de sang d'una petita incisió a la punta de la cua en tubs amb heparina (Sigma-Aldrich). Es va recollir LCR i sang en diversos moments després de la injecció intravenosa del fag T7. Es van descartar aproximadament entre 5 i 10 μl de líquid abans de recollir cada mostra de LCR, que correspon al volum mort del catèter.
Les biblioteques es van generar utilitzant el vector T7Select 10-3b tal com es descriu al manual del sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Breument, es va sintetitzar un insert d'ADN aleatori de 12 mers en el format següent:
El codó NNK es va utilitzar per evitar codons d'aturada dobles i la sobreexpressió d'aminoàcids a l'insert. N és una proporció equimolar barrejada manualment de cada nucleòtid, i K és una proporció equimolar barrejada manualment de nucleòtids d'adenina i citosina. Les regions monocatenàries es van convertir en ADN bicatenari mitjançant una incubació addicional amb dNTP (Novagen) i enzim Klenow (New England Biolabs) en tampó Klenow (New England Biolabs) durant 3 hores a 37 °C. Després de la reacció, l'ADN bicatenari es va recuperar mitjançant precipitació amb EtOH. L'ADN resultant es va digerir amb enzims de restricció EcoRI i HindIII (ambdós de Roche). L'insert clivat i purificat (QIAquick, Qiagen) (ligasa T4, New England Biolabs) es va lligar llavors en el marc de treball en un vector T7 preclivat després de l'aminoàcid 348 del gen de la càpsida 10B. Les reaccions de lligació es van incubar a 16 °C durant 18 hores abans de l'envasament in vitro. L'empaquetament de fagos in vitro es va dur a terme segons les instruccions subministrades amb el kit de clonació T7Select 10-3b (Novagen) i la solució d'empaquetament es va amplificar una vegada fins a la lisi utilitzant Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Els lisats es van centrifugar, titrar i congelar a -80 °C com a solució stock de glicerol.
Amplificació per PCR directa de les regions variables del fag amplificades en brou o placa utilitzant encebadors de fusió 454/Roche-amplicó patentats. L'encebador de fusió directa conté seqüències que flanquegen la regió variable (NNK) 12 (específica de la plantilla), l'adaptador de titani GS FLX A i una seqüència clau de biblioteca de quatre bases (TCAG) (Figura suplementària 1a):
El primer de fusió inversa també conté biotina unida a microesferes de captura i l'adaptador B de titani GS FLX necessari per a l'amplificació clonal durant la PCR d'emulsió:
Els amplicons es van sotmetre a piroseqüenciació 454/Roche segons el protocol 454 GS-FLX Titanium. Per a la seqüenciació manual de Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), l'ADN del fag T7 es va amplificar per PCR i es va seqüenciar amb els següents parells de primers:
Els inserts de plaques individuals es van sotmetre a amplificació per PCR utilitzant el kit de polimerasa d'ADN Roche Fast Start (segons les instruccions del fabricant). Es va realitzar un inici en calent (10 min a 95 °C) i 35 cicles de reforç (50 s a 95 °C, 1 min a 50 °C i 1 min a 72 °C).
Els fags de biblioteques, fags de tipus salvatge, fags rescatats del LCR i la sang, o clons individuals es van amplificar en Escherichia coli BL5615 en brou de tuberculosi (Sigma Aldrich) o en plaques de 500 cm2 (Thermo Scientific) durant 4 h a 37 °C. Els fags es van extreure de les plaques esbandint-les amb tampó Tris-EDTA (Fluka Analytical) o recollint les plaques amb puntes de pipeta estèrils. Els fags es van aïllar del sobrenedant de cultiu o del tampó d'extracció amb una ronda de precipitació amb polietilenglicol (PEG 8000) (Promega) i es van resuspendre en tampó Tris-EDTA.
El fag amplificat es va sotmetre a 2-3 rondes d'eliminació d'endotoxines utilitzant perles d'eliminació d'endotoxines (Miltenyi Biotec) abans de la injecció intravenosa (IV) (500 μl/animal). A la primera ronda, es van introduir 2×1012 fags; a la segona, 2×1010 fags; a les tercera i quarta rondes de selecció, 2×109 fags per animal. El contingut de fags en mostres de LCR i sang recollides en els punts de temps indicats es va determinar mitjançant el recompte de plaques segons les instruccions del fabricant (manual del sistema T7Select). La selecció de fags es va realitzar mitjançant la injecció intravenosa de biblioteques purificades a la vena de la cua o mitjançant la reinjecció del fag extret del LCR de la ronda de selecció anterior, i les recol·leccions posteriors es van realitzar als 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min i 240 min respectivament de mostres de LCR i sang. Es van dur a terme un total de quatre rondes de panning in vivo en què les dues branques seleccionades es van emmagatzemar i analitzar per separat durant les tres primeres rondes de selecció. Tots els inserts de fags extrets del LCR de les dues primeres rondes de selecció es van sotmetre a piroseqüenciació 454/Roche, mentre que tots els clons extrets del LCR de les dues últimes rondes de selecció es van seqüenciar manualment. Tots els fags de la sang de la primera ronda de selecció també es van sotmetre a piroseqüenciació 454/Roche. Per a la injecció de clons de fags, els fags seleccionats es van amplificar en E. coli (BL5615) en plaques de 500 cm2 a 37 °C durant 4 hores. Els clons seleccionats individualment i seqüenciats manualment es van propagar en medi TB. Després de l'extracció dels fags, la purificació i l'eliminació de l'endotoxina (com s'ha descrit anteriorment), es van injectar per via intravenosa 2 × 1010 fags/animal en 300 μl en una vena de la cua.
Preprocessament i filtratge qualitatiu de les dades de seqüència. Les dades en brut de 454/Roche es van convertir d'un format de mapa de flux estàndard binari (sff) a un format llegible per humans de Pearson (fasta) mitjançant programari del proveïdor. El processament posterior de la seqüència de nucleòtids es va dur a terme mitjançant programes i scripts C propietaris (paquet de programari no publicat) tal com es descriu a continuació. L'anàlisi de les dades primàries inclou procediments estrictes de filtratge multietapa. Per filtrar les lectures que no contenien una seqüència d'ADN d'inserció de 12 mers vàlida, les lectures es van alinear seqüencialment amb l'etiqueta d'inici (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), l'etiqueta d'aturada (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) i l'inserció de fons (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) mitjançant la prova global de Needleman-Wunsch. L'alineació permet fins a 2 inconsistències per alineació31. Per tant, es van eliminar de la biblioteca les lectures sense etiquetes d'inici i aturada i les lectures que contenien insercions de fons, és a dir, alineacions que superen el nombre permès de desajustos. Pel que fa a les lectures restants, la seqüència d'ADN N-mer que s'estén des de la marca d'inici i acaba abans de la marca d'aturada es va excisar de la seqüència de lectura original i es va processar posteriorment (d'ara endavant, "inserció"). Després de la traducció de la inserció, la porció posterior al primer codó d'aturada a l'extrem 5' de l'encebador s'elimina de la inserció. A més, també es van eliminar els nucleòtids que conduïen a codons incomplets a l'extrem 3' de l'encebador. Per excloure les insercions que només contenien seqüències de fons, també es van eliminar les insercions traduïdes que comencen amb el patró d'aminoàcids "PAG". Es van eliminar de la biblioteca els pèptids amb una longitud posttraduccional inferior a 3 aminoàcids. Finalment, es va eliminar la redundància al conjunt d'insercions i es va determinar la freqüència de cada inserció única. Els resultats d'aquesta anàlisi van incloure una llista de seqüències de nucleòtids (insercions) i les seves freqüències (de lectura) (Figures suplementàries 1c i 2).
Agrupar els inserts d'ADN N-mer per similitud de seqüència: per eliminar els errors de seqüenciació específics de 454/Roche (com ara problemes amb la seqüenciació d'extensions d'homopolímers) i eliminar les redundàncies menys importants, els inserts de seqüència d'ADN N-mer filtrats prèviament (insercions) es classifiquen per similitud. insercions (es permeten fins a 2 bases no coincidents) utilitzant un algoritme iteratiu definit de la següent manera: les insercions es classifiquen primer per la seva freqüència (de més alta a més baixa) i, si són iguals, per la seva classificació secundària per longitud (de més llarga a més curta)). Així, les insercions més freqüents i més llargues defineixen el primer "grup". La freqüència del grup s'estableix a la freqüència clau. A continuació, es va intentar afegir al grup cada inserció que quedava a la llista ordenada mitjançant un alineament de Needleman-Wunsch per parells. Si el nombre de desajustos, insercions o delecions en un alineament no supera un llindar de 2, s'afegeix una inserció al grup i la freqüència general del grup augmenta segons la freqüència amb què s'ha afegit la inserció. Les insercions afegides a un grup es marquen com a utilitzades i s'exclouen del processament posterior. Si la seqüència d'inserció no es pot afegir a un grup ja existent, la seqüència d'inserció s'utilitza per crear un grup nou amb la freqüència d'inserció adequada i es marca com a utilitzada. La iteració finalitza quan cada seqüència d'inserció s'ha utilitzat per formar un grup nou o es pot incloure en un grup ja existent. Al cap i a la fi, les insercions agrupades que consisteixen en nucleòtids es tradueixen finalment en seqüències de pèptids (biblioteques de pèptids). El resultat d'aquesta anàlisi és un conjunt d'insercions i les seves freqüències corresponents que constitueixen el nombre de lectures consecutives (figura suplementària 2).
Generació de motius: A partir d'una llista de pèptids únics, es va crear una biblioteca que conté tots els patrons d'aminoàcids (aa) possibles, tal com es mostra a continuació. Cada patró possible de longitud 3 es va extreure del pèptid i es va afegir el seu patró invers juntament amb una biblioteca de motius comuns que conté tots els patrons (tripèptids). Es van seqüenciar biblioteques de motius altament repetitius i es va eliminar la redundància. A continuació, per a cada tripèptid de la biblioteca de motius, vam comprovar la seva presència a la biblioteca mitjançant eines computacionals. En aquest cas, s'afegeix la freqüència del pèptid que conté el tripèptid del motiu trobat i s'assigna al motiu de la biblioteca de motius ("nombre de motius"). El resultat de la generació de motius és una matriu bidimensional que conté totes les aparicions de tripèptids (motius) i els seus respectius valors, que són el nombre de lectures de seqüenciació que donen com a resultat el motiu corresponent quan les lectures es filtren, agrupen i es tradueixen. Mètriques tal com s'ha descrit detalladament anteriorment.
Normalització del nombre de motius i els diagrames de dispersió corresponents: el nombre de motius per a cada mostra es va normalitzar mitjançant
on ni és el nombre de lectures que contenen el tema i. Per tant, vi representa la freqüència percentual de lectures (o pèptids) que contenen el motiu i a la mostra. Els valors P per al nombre no normalitzat de motius es van calcular mitjançant la prova exacta de Fisher. Pel que fa als correlogrames del nombre de motius, les correlacions de Spearman es van calcular mitjançant el nombre normalitzat de motius amb R.
Per visualitzar el contingut d'aminoàcids a cada posició de la biblioteca de pèptids, es van crear els logogrames web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Primer, el contingut d'aminoàcids a cada posició del pèptid de 12 mers s'emmagatzema en una matriu de 20 × 12. A continuació, es genera un conjunt de 1000 pèptids que contenen el mateix contingut relatiu d'aminoàcids a cada posició en format fasta-sequence i es proporciona com a entrada a web-logo 3, que genera una representació gràfica del contingut relatiu d'aminoàcids a cada posició per a una biblioteca de pèptids determinada. Per visualitzar conjunts de dades multidimensionals, es van crear mapes de calor mitjançant una eina desenvolupada internament a R (biosHeatmap, un paquet R encara per publicar). Els dendrogrames presentats als mapes de calor es van calcular mitjançant el mètode de clústering jeràrquic de Ward amb la mètrica de distància euclidiana. Per a l'anàlisi estadística de les dades de puntuació de motius, els valors P per a la puntuació no normalitzada es van calcular mitjançant la prova exacta de Fisher. Els valors P per a altres conjunts de dades es van calcular a R mitjançant la prova t de Student o ANOVA.
Els clons de fags seleccionats i els fags sense inserts es van injectar per via intravenosa a través de la vena caudal (2 × 1010 fags/animal en 300 μl de PBS). Deu minuts abans de la perfusió i la posterior fixació, els mateixos animals van rebre una injecció intravenosa de 100 μl de lectina marcada amb DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minuts després de la injecció del fag, les rates van ser perfoses a través del cor amb 50 ml de PBS seguit de 50 ml de PFA/PBS al 4%. Les mostres de cervell es van fixar addicionalment durant la nit en PFA/PBS al 4% i es van submergir en sacarosa al 30% durant la nit a 4 °C. Les mostres es congelen ràpidament a la barreja OCT. L'anàlisi immunohistoquímica de mostres congelades es va realitzar a temperatura ambient en crioseccions de 30 µm bloquejades amb 1% de BSA i incubades amb anticossos policlonals marcats amb FITC contra el fag T7 (Novus NB 600-376A) a 4 °C. Incubar durant la nit. Finalment, les seccions es van rentar 3 vegades amb PBS i es van examinar amb un microscopi làser confocal (Leica TCS SP5).
Tots els pèptids amb una puresa mínima del 98% van ser sintetitzats per GenScript USA, biotinilats i liofilitzats. La biotina s'uneix mitjançant un separador triple de glicina addicional a l'extrem N-terminal. Comproveu tots els pèptids mitjançant espectrometria de masses.
L'estreptavidina (Sigma S0677) es va barrejar amb un excés equimolar de 5 vegades de pèptid biotinilat, pèptid inhibidor de BACE1 biotinilat o una combinació (proporció 3:1) de pèptid inhibidor de BACE1 biotinilat i pèptid inhibidor de BACE1 en DMSO al 5-10%/incubat en PBS. 1 hora a temperatura ambient abans de la injecció. Els pèptids conjugats amb estreptavidina es van injectar per via intravenosa a una dosi de 10 mg/kg en una de les venes caudals de rates amb cavitat cerebral.
La concentració de complexos estreptavidina-pèptid es va avaluar mitjançant ELISA. Les plaques de microtitració Nunc Maxisorp (Sigma) es van recobrir durant la nit a 4 °C amb 1,5 μg/ml d'anticòs de ratolí anti-estreptavidina (Thermo, MA1-20011). Després del bloqueig (tampó de bloqueig: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatina, 1% BSA) a temperatura ambient durant 2 hores, es va rentar la placa amb 0,05% Tween-20/PBS (tampó de rentat) durant 3 segons. Es van afegir mostres de LCR i plasma als pous diluïts amb tampó de bloqueig (plasma 1:10.000, LCR 1:115). A continuació, la placa es va incubar durant la nit a 4 °C amb anticossos de detecció (1 μg/ml, anti-estreptavidina-HRP, Novus NB120-7239). Després de tres passos de rentat, l'estreptavidina es va detectar per incubació en solució de substrat TMB (Roche) durant un màxim de 20 minuts. Després d'aturar el desenvolupament del color amb 1M H2SO4, es va mesurar l'absorbància a 450 nm.
La funció del complex estreptavidina-pèptid-inhibidor de BACE1 es va avaluar mitjançant ELISA Aβ(1-40) segons el protocol del fabricant (Wako, 294-64701). Breument, les mostres de LCR es van diluir en diluent estàndard (1:23) i es van incubar durant la nit a 4 °C en plaques de 96 pous recobertes amb l'anticòs de captura BNT77. Després de cinc passos de rentat, es va afegir l'anticòs BA27 conjugat amb HRP i es va incubar durant 2 hores a 4 °C, seguit de cinc passos de rentat. L'Aβ(1-40) es va detectar mitjançant incubació en solució TMB durant 30 minuts a temperatura ambient. Després que s'hagi aturat el desenvolupament del color amb la solució d'aturada, es mesura l'absorbància a 450 nm. Les mostres de plasma es van sotmetre a extracció en fase sòlida abans de l'ELISA Aβ(1-40). El plasma es va afegir a DEA al 0,2% (Sigma) en plaques de 96 pous i es va incubar a temperatura ambient durant 30 minuts. Després de rentar successivament les plaques SPE (Oasis, 186000679) amb aigua i metanol al 100%, es van afegir mostres de plasma a les plaques SPE i es va retirar tot el líquid. Les mostres es van rentar (primer amb metanol al 5% i després amb metanol al 30%) i es van eluir amb NH4OH al 2%/metanol al 90%. Després d'assecar l'eluat a 55 °C durant 99 min a corrent constant de N2, les mostres es van reduir en diluents estàndard i es va mesurar l'Aβ(1–40) tal com s'ha descrit anteriorment.
Com citar aquest article: Urich, E. et al. Lliurament de càrrega al cervell mitjançant pèptids de trànsit identificats in vivo. The Science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB i Moos T. Administració de fàrmacs macromoleculars al cervell mitjançant teràpia dirigida. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., i Martinez-Martinez, P. Administració de fàrmacs peptídics i proteics a través de la barrera hematoencefàlica. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM La barrera hematoencefàlica: un coll d'ampolla en el desenvolupament de fàrmacs cerebrals. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG i Byrd, A. Perspectives per a una millora de l'administració de fàrmacs i la seva orientació al cervell a través de la via plexe coroide-LCR. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernització de biofàrmacs amb cavalls de Troia moleculars per a l'administració al cervell. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, transport de pèptids mediat per receptors WM a través de la barrera hematoencefàlica. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Augmentar la penetració cerebral i l'eficàcia dels anticossos terapèutics mitjançant llançadores moleculars monovalents. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. El transport del receptor de transferrina (TfR) determina l'absorció cerebral de variants d'afinitat dels anticossos TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).