Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of Compatibiliteitsmodus uit te schakelen in Internet Explorer).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Toont een carrousel van drie dia's tegelijk.Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door drie dia's tegelijk te bladeren, of gebruik de schuifknoppen aan het einde om door drie dia's tegelijk te bladeren.
De bloed-hersenbarrière en de bloed-hersenbarrière voorkomen dat biotherapeutische middelen hun doel in het centrale zenuwstelsel bereiken, waardoor een effectieve behandeling van neurologische aandoeningen wordt belemmerd.Om nieuwe hersentransporters in vivo te ontdekken, introduceerden we een T7-faagpeptidebibliotheek en serieel verzameld bloed en cerebrospinale vloeistof (CSF) met behulp van een gecanuleerd bewust groot poolmodel van ratten.Na vier selectieronden waren specifieke faagklonen sterk verrijkt in CSF.Testen van individuele kandidaat-peptiden onthulde meer dan 1000-voudige verrijking in CSF.De biologische activiteit van de peptide-gemedieerde afgifte aan de hersenen werd bevestigd door een 40% verlaging van het niveau van amyloïde-β in de cerebrospinale vloeistof met behulp van een BACE1-peptideremmer gekoppeld aan het geïdentificeerde nieuwe transitpeptide.Deze resultaten suggereren dat de peptiden geïdentificeerd door in vivo faagselectiewerkwijzen bruikbare dragers kunnen zijn voor systemische afgifte van macromoleculen aan de hersenen met een therapeutisch effect.
Onderzoek naar gerichte therapieën op het centrale zenuwstelsel (CZS) is grotendeels gericht op het identificeren van geoptimaliseerde medicijnen en middelen die CZS-gerichte eigenschappen vertonen, met minder moeite om de mechanismen te ontdekken die actieve medicijnafgifte aan de hersenen stimuleren.Dit begint nu te veranderen nu medicijnafgifte, met name grote moleculen, een integraal onderdeel is van de moderne neurowetenschappelijke medicijnontwikkeling.De omgeving van het centrale zenuwstelsel wordt goed beschermd door het cerebrovasculaire barrièresysteem, bestaande uit de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​​​en de bloed-hersenbarrière (BCBB)1, waardoor het een uitdaging is om medicijnen naar de hersenen af ​​te leveren1,2.Geschat wordt dat bijna alle geneesmiddelen met grote moleculen en meer dan 98% van de geneesmiddelen met kleine moleculen uit de hersenen worden geëlimineerd3.Daarom is het erg belangrijk om nieuwe hersentransportsystemen te identificeren die zorgen voor een efficiënte en specifieke afgifte van therapeutische medicijnen aan het CZS 4,5.De BBB en BCSFB bieden echter ook een uitstekende mogelijkheid voor medicijnafgifte, aangezien ze alle structuren van de hersenen binnendringen en binnendringen via het uitgebreide vaatstelsel.De huidige inspanningen om niet-invasieve toedieningsmethoden aan de hersenen te gebruiken, zijn dus grotendeels gebaseerd op het mechanisme van receptor-gemedieerd transport (PMT) met behulp van de endogene BBB6-receptor.Ondanks recente belangrijke vorderingen met behulp van de transferrinereceptorroute7,8, is verdere ontwikkeling van nieuwe toedieningssystemen met verbeterde eigenschappen vereist.Hiertoe was ons doel om peptiden te identificeren die CSF-transport kunnen mediëren, aangezien ze in principe kunnen worden gebruikt om macromoleculen aan het CZS af te leveren of om nieuwe receptorroutes te openen.Met name specifieke receptoren en transporters van het cerebrovasculaire systeem (BBB en BSCFB) kunnen dienen als potentiële doelwitten voor de actieve en specifieke afgifte van biotherapeutische geneesmiddelen.Cerebrospinale vloeistof (CSF) is een secretieproduct van de choroïde plexus (CS) en staat in direct contact met de interstitiële vloeistof van de hersenen via de subarachnoïdale ruimte en de ventriculaire ruimte4.Onlangs is aangetoond dat subarachnoïdaal hersenvocht overmatig in het interstitium van de hersenen diffundeert9.We hopen toegang te krijgen tot de parenchymale ruimte met behulp van dit subarachnoïdale instroomkanaal of rechtstreeks via de BBB.Om dit te bereiken, hebben we een robuuste in vivo faagselectiestrategie geïmplementeerd die idealiter peptiden identificeert die door een van deze twee verschillende routes worden getransporteerd.
We beschrijven nu een sequentiële in vivo faagdisplay-screeningsmethode met CSF-bemonstering gekoppeld aan high throughput sequencing (HTS) om initiële selectierondes met de hoogste bibliotheekdiversiteit te volgen.Screening werd uitgevoerd op bewuste ratten met een permanent geïmplanteerde grote cisterna (CM) canule om bloedverontreiniging te voorkomen.Belangrijk is dat deze benadering zowel hersentargeting als peptiden met transportactiviteit over de cerebrovasculaire barrière selecteert.We gebruikten T7-fagen vanwege hun kleine formaat (~60 nm)10 en suggereerden dat ze geschikt zijn voor het transport van blaasjes die transcellulaire doorgang van de endotheliale en/of epitheliale medulla-barrière mogelijk maken.Na vier ronden van panning werden faagpopulaties geïsoleerd die sterke in vivo CSF-verrijking en cerebrale microvaatjesassociatie vertoonden.Belangrijk is dat we onze bevindingen konden bevestigen door aan te tonen dat de geprefereerde en chemisch gesynthetiseerde beste kandidaat-peptiden in staat zijn om eiwitlading naar de cerebrospinale vloeistof te transporteren.Eerst werden de farmacodynamische effecten van het CZS vastgesteld door een leidend transitpeptide te combineren met een remmer van het BACE1-peptide.Naast het aantonen dat in vivo functionele screeningstrategieën nieuwe hersentransportpeptiden kunnen identificeren als effectieve eiwitdragers, verwachten we dat vergelijkbare functionele selectiebenaderingen ook belangrijk zullen worden bij het identificeren van nieuwe hersentransportroutes.
Op basis van plaquevormende eenheden (PFU) werd na de faagverpakkingsstap een bibliotheek van willekeurige 12-meer lineaire T7-faagpeptiden met een diversiteit van ongeveer 109 ontworpen en gemaakt (zie Materialen en methoden).Het is belangrijk op te merken dat we deze bibliotheek zorgvuldig hebben geanalyseerd voordat we in vivo pannen.PCR-amplificatie van faagbibliotheekmonsters met behulp van gemodificeerde primers genereerde amplicons die direct van toepassing waren op HTS (aanvullende figuur 1a).Vanwege a) HTS11-sequencingfouten, b) impact op de kwaliteit van primers (NNK) 1-12, en c) de aanwezigheid van wildtype (wt) faag (skelet-inserts) in de standby-bibliotheek, werd een procedure voor het filteren van sequenties geïmplementeerd om alleen geverifieerde sequentie-informatie te extraheren (aanvullende figuur 1b).Deze filterstappen zijn van toepassing op alle HTS-sequencingbibliotheken.Voor de standaardbibliotheek werden in totaal 233.868 reads verkregen, waarvan 39% voldeed aan de filtercriteria en werd gebruikt voor bibliotheekanalyse en selectie voor volgende rondes (aanvullende figuur 1c – e).De aflezingen waren overwegend veelvouden van 3 basenparen lang met een piek bij 36 nucleotiden (aanvullende figuur 1c), wat het bibliotheekontwerp (NNK) 1-12 bevestigt.Met name bevatte ongeveer 11% van de leden van de bibliotheek een 12-dimensionale wildtype (wt) ruggengraat PAGISRELVDKL-insertie, en bijna de helft van de sequenties (49%) bevatte inserties of deleties.De HTS van de bibliotheekbibliotheek bevestigde de grote diversiteit aan peptiden in de bibliotheek: meer dan 81% van de peptidesequenties werd slechts één keer gevonden en slechts 1, 5% kwam voor in ≥4 kopieën (aanvullende figuur 2a).De frequenties van aminozuren (aa) op alle 12 posities in het repertoire correleerden goed met de verwachte frequenties voor het aantal codons gegenereerd door het gedegenereerde NKK-repertoire (aanvullende figuur 2b).De waargenomen frequentie van aa-residuen gecodeerd door deze inserts correleerde goed met de berekende frequentie ( r = 0, 893) (aanvullende figuur 2c).De bereiding van faagbibliotheken voor injectie omvat de stappen van amplificatie en verwijdering van endotoxine.Eerder is aangetoond dat dit mogelijk de diversiteit van faagbibliotheken vermindert.Daarom hebben we de sequentie bepaald van een plaat-geamplificeerde faagbibliotheek die endotoxineverwijdering had ondergaan en deze vergeleken met de oorspronkelijke bibliotheek om de frequentie van AA te schatten.Er werd een sterke correlatie ( r = 0, 995) waargenomen tussen de oorspronkelijke pool en de geamplificeerde en gezuiverde pool (aanvullende figuur 2d), wat aangeeft dat competitie tussen klonen geamplificeerd op platen met behulp van T7-faag geen grote vertekening veroorzaakte.Deze vergelijking is gebaseerd op de frequentie van tripeptidemotieven in elke bibliotheek, aangezien de diversiteit aan bibliotheken (~ 109) zelfs met HTS niet volledig kan worden vastgelegd.Frequentieanalyse van aa op elke positie onthulde een kleine positieafhankelijke afwijking in de laatste drie posities van het ingevoerde repertoire (aanvullende figuur 2e).Concluderend concludeerden we dat de kwaliteit en diversiteit van de bibliotheek acceptabel waren en dat er slechts kleine veranderingen in diversiteit werden waargenomen als gevolg van amplificatie en bereiding van faagbibliotheken tussen verschillende selectieronden.
Seriële cerebrospinale vloeistofbemonstering kan worden uitgevoerd door chirurgisch een canule in de CM van bewuste ratten te implanteren om identificatie van T7-faag die intraveneus (iv) is geïnjecteerd via de BBB en / of BCSFB (Fig. 1a-b) te vergemakkelijken.We gebruikten twee onafhankelijke selectiearmen (armen A en B) in de eerste drie ronden van in vivo selectie (Fig. 1c).We hebben geleidelijk de strengheid van de selectie verhoogd door de totale hoeveelheid faag die in de eerste drie selectierondes werd geïntroduceerd, te verminderen.Voor de vierde panningronde combineerden we monsters van takken A en B en voerden we drie aanvullende onafhankelijke selecties uit.Om de in vivo eigenschappen van T7-faagdeeltjes in dit model te bestuderen, werd wildtype faag (PAGISRELVDKL-masterinsert) via de staartader in ratten geïnjecteerd.Herstel van fagen uit hersenvocht en bloed op verschillende tijdstippen toonde aan dat relatief kleine T7 icosahedrale fagen een snelle initiële klaringsfase uit het bloedcompartiment hadden (aanvullende figuur 3).Op basis van de toegediende titers en het bloedvolume van de ratten berekenden we dat slechts ongeveer 1% gew.faag van de toegediende dosis werd 10 minuten na intraveneuze injectie in het bloed gedetecteerd.Na deze initiële snelle afname werd een tragere primaire klaring gemeten met een halfwaardetijd van 27,7 minuten.Belangrijk is dat er slechts zeer weinig fagen uit het CSF-compartiment werden gehaald, wat wijst op een lage achtergrond voor migratie van wildtype fagen naar het CSF-compartiment (aanvullende figuur 3).Gemiddeld werden slechts ongeveer 1 x 10-3% titers van T7-faag in het bloed en 4 x 10-8% van aanvankelijk geïnfundeerde fagen gedetecteerd in de cerebrospinale vloeistof gedurende de gehele bemonsteringsperiode (0-250 min).Met name de halfwaardetijd (25,7 min) van wildtype faag in cerebrospinale vloeistof was vergelijkbaar met die waargenomen in bloed.Deze gegevens tonen aan dat de barrière die het CSF-compartiment van het bloed scheidt, intact is in CM-gecanuleerde ratten, waardoor in vivo selectie van faagbibliotheken mogelijk is om klonen te identificeren die gemakkelijk vanuit het bloed naar het CSF-compartiment worden getransporteerd.
(a) Het opzetten van een methode voor het opnieuw bemonsteren van cerebrospinale vloeistof (CSF) uit een grote pool.(b) Schematische weergave van de cellulaire locatie van de barrière van het centrale zenuwstelsel (CZS) en de selectiestrategie die wordt gebruikt om peptiden te identificeren die de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​en de bloed-hersenbarrière passeren.( c ) In vivo stroomschema voor faagdisplayscreening.In elke selectieronde werden fagen (dierlijke identificatiemiddelen binnen de pijlen) intraveneus geïnjecteerd.Twee onafhankelijke alternatieve takken (A, B) worden gescheiden gehouden tot de 4e selectieronde.Voor selectieronden 3 en 4 werd elke faagkloon geëxtraheerd uit CSF handmatig gesequenced.( d ) Kinetiek van fagen geïsoleerd uit bloed (rode cirkels) en hersenvocht (groene driehoeken) tijdens de eerste selectieronde bij twee gecanuleerde ratten na intraveneuze injectie van de T7-peptidebibliotheek (2 x 1012 fagen / dier).Blauwe vierkanten geven de gemiddelde beginconcentratie van faag in het bloed aan, berekend op basis van de hoeveelheid geïnjecteerde faag, rekening houdend met het totale bloedvolume.De zwarte vierkanten geven het snijpunt aan van de y-lijn geëxtrapoleerd uit bloedfaagconcentraties.( e, f ) Presenteer de relatieve frequentie en verdeling van alle mogelijke overlappende tripeptidemotieven die in het peptide worden gevonden.Het aantal gevonden motieven in 1000 metingen wordt weergegeven.Aanzienlijk (p < 0,001) verrijkte motieven zijn gemarkeerd met rode stippen.( e ) Correlatie-spreidingsdiagram waarin de relatieve frequentie van het tripeptide-motief van de geïnjecteerde bibliotheek wordt vergeleken met van bloed afkomstige faag van dieren #1.1 en #1.2.( f ) Correlatie-spreidingsdiagram waarin de relatieve frequenties van dierlijke faag-tripeptidemotieven # 1.1 en # 1.2 geïsoleerd in bloed en hersenvocht worden vergeleken.(g, h) Sequentie-ID-weergave van faag verrijkt in bloed (g) versus geïnjecteerde bibliotheken en faag verrijkt in CSF (h) versus bloed na een ronde van in vivo selectie bij beide dieren.De grootte van de eenletterige code geeft aan hoe vaak dat aminozuur op die positie voorkomt.Groen = polair, paars = neutraal, blauw = basisch, rood = zuur en zwart = hydrofobe aminozuren.Afbeelding 1a, b is ontworpen en geproduceerd door Eduard Urich.
We injecteerden een faagpeptidebibliotheek in twee CM-instrumentratten (clades A en B) en geïsoleerde faag uit hersenvocht en bloed (Figuur 1d).De initiële snelle klaring van de bibliotheek was minder uitgesproken in vergelijking met de wildtype faag.De gemiddelde halfwaardetijd van de geïnjecteerde bibliotheek bij beide dieren was 24,8 minuten in bloed, vergelijkbaar met wildtype fagen, en 38,5 minuten in CSF.Bloed- en cerebrospinale vloeistoffaagmonsters van elk dier werden onderworpen aan HTS en alle geïdentificeerde peptiden werden geanalyseerd op de aanwezigheid van een kort tripeptidemotief.Tripeptide-motieven werden gekozen omdat ze een minimale basis bieden voor structuurvorming en peptide-eiwitinteracties14,15.We vonden een goede correlatie in de verdeling van motieven tussen de geïnjecteerde faagbibliotheek en klonen geëxtraheerd uit het bloed van beide dieren (figuur 1e).De gegevens geven aan dat de samenstelling van de bibliotheek slechts marginaal is verrijkt in het bloedcompartiment.Aminozuurfrequenties en consensussequenties werden op elke positie verder geanalyseerd met behulp van een aanpassing van de Weblogo16-software.Interessant genoeg vonden we een sterke verrijking in bloedglycineresiduen (Fig. 1g).Wanneer bloed werd vergeleken met klonen geselecteerd uit CSF, werden sterke selectie en enige deselectie van motieven waargenomen (Fig. 1f), en bepaalde aminozuren waren bij voorkeur aanwezig op vooraf bepaalde posities in het 12-lid (Fig. 1h).Met name verschilden individuele dieren significant in hersenvocht, terwijl bij beide dieren verrijking met bloedglycine werd waargenomen (aanvullende figuren 4a-j).Na stringente filtering van sequentiegegevens in de cerebrospinale vloeistof van dieren #1.1 en #1.2, werden in totaal 964 en 420 unieke 12-meer peptiden verkregen (aanvullende figuur 1d-e).De geïsoleerde faagklonen werden geamplificeerd en onderworpen aan een tweede ronde van in vivo selectie.Faag geëxtraheerd uit de tweede selectieronde werd onderworpen aan HTS in elk dier en alle geïdentificeerde peptiden werden gebruikt als input voor een motiefherkenningsprogramma om het voorkomen van tripeptidemotieven te analyseren (Fig. 2a, b, ef).Vergeleken met de eerste cyclus van de faag teruggewonnen uit CSF, zagen we verdere selectie en deselectie van vele motieven in CSF in takken A en B (Fig. 2).Er werd een netwerkidentificatie-algoritme toegepast om te bepalen of ze verschillende patronen van consistente volgorde vertegenwoordigden.Er werd een duidelijke overeenkomst waargenomen tussen de 12-dimensionale sequenties die door CSF werden teruggewonnen in alternatieve clade A (Fig. 2c, d) en clade B (Fig. 2g, h).De gepoolde analyse in elke tak onthulde verschillende selectieprofielen voor 12-meer peptiden (aanvullende figuur 5c, d) en een toename van de CSF / bloedtiterverhouding in de loop van de tijd voor gepoolde klonen na de tweede selectieronde vergeleken met de eerste selectieronde (aanvullende figuur 5e).).
Verrijking van motieven en peptiden in cerebrospinale vloeistof door twee opeenvolgende rondes van in vivo functionele faagdisplay-selectie.
Alle cerebrospinale vloeistof fagen teruggewonnen uit de eerste ronde van elk dier (dieren #1.1 en #1.2) werden samengevoegd, geamplificeerd, HT-gesequenced en samen opnieuw geïnjecteerd (2 x 1010 fagen/dier) 2 SM gecanuleerde ratten (#1.1 → #).2.1 en 2.2, 1.2 → 2.3 en 2.4).( a, b, e, f ) Correlatie-spreidingsdiagrammen die de relatieve frequentie van tripeptidemotieven van alle CSF-afgeleide fagen in de eerste en tweede selectieronde vergelijken.Relatieve frequentie en verdeling van motieven die alle mogelijke overlappende tripeptiden vertegenwoordigen die in peptiden in beide oriëntaties worden gevonden.Het aantal gevonden motieven in 1000 metingen wordt weergegeven.Motieven die significant (p < 0,001) zijn geselecteerd of uitgesloten in een van de vergeleken bibliotheken, worden gemarkeerd met rode stippen.(c, d, g, h) Weergave van het sequentielogo van alle CSF-rijke sequenties met een lengte van 12 aminozuren op basis van ronde 2 en 1 van in vivo selectie.De grootte van de eenletterige code geeft aan hoe vaak dat aminozuur op die positie voorkomt.Om het logo weer te geven, wordt de frequentie van CSF-sequenties geëxtraheerd uit individuele dieren tussen twee selectierondes vergeleken en worden de verrijkte sequenties in de tweede ronde weergegeven: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 en (h) #1.2–#2.4.De meest verrijkte aminozuren op een bepaalde positie in (c, d) dieren nr.2.1 en nee.2.2 of (g, h) bij dieren nee.2.3 en nee.2.4 worden in kleur weergegeven.Groen = polair, paars = neutraal, blauw = basisch, rood = zuur en zwart = hydrofobe aminozuren.
Na de derde selectieronde identificeerden we 124 unieke peptidesequenties (# 3.1 en # 3.2) van 332 CSF-gereconstitueerde faagklonen geïsoleerd uit twee dieren (aanvullende figuur 6a).De sequentie LGSVS (18,7%) had het hoogste relatieve aandeel, gevolgd door de wild-type inserts PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) en SARGSWREIVSLS (2,2%).In de laatste vierde ronde hebben we twee onafhankelijk geselecteerde takken van drie afzonderlijke dieren samengevoegd (Fig. 1c).Van de 925 gesequenced faagklonen teruggewonnen uit CSF, vonden we in de vierde ronde 64 unieke peptidesequenties (aanvullende figuur 6b), waaronder het relatieve aandeel van wildtype fagen daalde tot 0, 8%.De meest voorkomende CSF-klonen in de vierde ronde waren LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) en RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Het lengtebereik van de geselecteerde peptiden is het gevolg van nucleotide-inserties/deleties of voortijdige stopcodons in de bibliotheekprimers bij gebruik van gedegenereerde codons voor NNK-bibliotheekontwerp.Voortijdige stopcodons genereren kortere peptiden en worden geselecteerd omdat ze het gunstige aa-motief bevatten.Langere peptiden kunnen het gevolg zijn van inserties/deleties in de primers van de synthetische bibliotheken.Dit plaatst het ontworpen stopcodon buiten het frame en leest het totdat een nieuw stopcodon stroomafwaarts verschijnt.Over het algemeen berekenden we verrijkingsfactoren voor alle vier de selectierondes door de invoergegevens te vergelijken met de voorbeelduitvoergegevens.Voor de eerste screeningsronde gebruikten we wildtype faagtiters als een niet-specifieke achtergrondreferentie.Interessant is dat negatieve faagselectie erg sterk was in de eerste CSF-cyclus, maar niet in bloed (Fig. 3a), wat mogelijk te wijten is aan de lage waarschijnlijkheid van passieve diffusie van de meeste leden van de peptidenbibliotheek in het CSF-compartiment of relatieve fagen hebben de neiging om efficiënter te worden vastgehouden of verwijderd uit de bloedbaan dan bacteriofagen.In de tweede ronde van panning werd echter in beide clades een sterke selectie van fagen in CSF waargenomen, wat suggereert dat de vorige ronde was verrijkt met fagen die peptiden vertoonden die CSF-opname bevorderen (figuur 3a).Nogmaals, zonder noemenswaardige bloedverrijking.Ook in de derde en vierde ronde waren de faagklonen significant verrijkt in CSF.Door de relatieve frequentie van elke unieke peptidesequentie tussen de laatste twee selectieronden te vergelijken, ontdekten we dat de sequenties nog meer verrijkt waren in de vierde selectieronde (figuur 3b).Er werden in totaal 931 tripeptide-motieven geëxtraheerd uit alle 64 unieke peptidesequenties met behulp van beide peptide-oriëntaties.De meest verrijkte motieven in de vierde ronde werden nauwkeuriger onderzocht op hun verrijkingsprofielen in alle rondes in vergelijking met de geïnjecteerde bibliotheek (cut-off: 10% verrijking) (aanvullende figuur 6c).Algemene selectiepatronen toonden aan dat de meeste bestudeerde motieven in alle voorgaande ronden van beide selectietakken waren verrijkt.Sommige motieven (bijv. SGL, VSG, LGS GSV) waren echter overwegend afkomstig uit alternatieve clade A, terwijl andere (bijv. FGW, RTN, WGF, NTR) waren verrijkt met alternatieve clade B.
Validatie van CSF-transport van CSF-verrijkte faag-getoonde peptiden en gebiotinyleerde leiderpeptiden geconjugeerd aan streptavidine-payloads.
( a ) Verrijkingsverhoudingen berekend in alle vier de ronden (R1-R4) op basis van geïnjecteerde (input = I) faag (PFU) titers en bepaalde CSF-faagtiters (output = O).Verrijkingsfactoren voor de laatste drie rondes (R2-R4) werden berekend door vergelijking met de vorige ronde en de eerste ronde (R1) met gewichtsgegevens.Open staven zijn hersenvocht, gearceerde staven zijn plasma.(***p<0,001, gebaseerd op Student's t-test).( b ) Lijst van de meest voorkomende faagpeptiden, gerangschikt volgens hun relatieve verhouding tot alle fagen verzameld in CSF na selectieronde 4.De zes meest voorkomende faagklonen zijn gemarkeerd in kleur, genummerd en hun verrijkingsfactoren tussen ronde 3 en 4 van selectie (inzet).( c, d ) De zes meest verrijkte faagklonen, lege faag- en ouderfaag-peptidebibliotheken uit ronde 4 werden afzonderlijk geanalyseerd in een CSF-bemonsteringsmodel.CSF- en bloedmonsters werden verzameld op de aangegeven tijdstippen.( c ) Gelijke hoeveelheden van 6 kandidaat-faagklonen (2 x 1010 fagen / dieren), lege fagen (# 1779) (2 x 1010 fagen / dieren) en voorraad faagpeptidebibliotheken (2 x 1012 fagen / dieren) Injecteer ten minste 3 CM wordt afzonderlijk toegediend aan het gecanuleerde dier via de staartader.De CSF-farmacokinetiek van elke geïnjecteerde faagkloon en faagpeptidebibliotheek in de loop van de tijd wordt getoond.(d) toont de gemiddelde verhouding CSF/bloed voor alle herstelde fagen/ml gedurende de bemonsteringstijd.(e) Vier synthetische leiderpeptiden en één gecodeerde controle werden gekoppeld met biotine aan streptavidine via hun N-terminus (tetrameerdisplay) gevolgd door injectie (staartader iv, 10 mg streptavidine/kg).Ten minste drie geïntubeerde ratten (N = 3).).CSF-monsters werden verzameld op de aangegeven tijdstippen en streptavidineconcentraties werden gemeten met CSF-anti-streptavidine-ELISA (nd = niet gedetecteerd).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, gebaseerd op ANOVA-test).(f) Vergelijking van de aminozuursequentie van de meest verrijkte faagpeptidekloon #2002 (paars) met andere geselecteerde faagpeptideklonen uit de 4e selectieronde.Identieke en vergelijkbare aminozuurfragmenten zijn kleurgecodeerd.
Van alle verrijkte fagen in de vierde ronde (figuur 3b) werden zes kandidaat-klonen geselecteerd voor verdere individuele analyse in het CSF-bemonsteringsmodel.Gelijke hoeveelheden van zes kandidaat-faag-, lege faag- (geen insert) en profaag-peptidebibliotheken werden geïnjecteerd in drie gecanuleerde CM-dieren en de farmacokinetiek werd bepaald in CSF- (Fig. 3c) en bloed- (aanvullende Fig. 7) assays.Alle geteste faagklonen richtten zich op het CSF-compartiment op een niveau dat 10-1000 keer hoger was dan dat van de lege controlefaag (#1779).Klonen #2020 en #2077 hadden bijvoorbeeld ongeveer 1000 keer hogere CSF-titers dan controlefaag.Het farmacokinetische profiel van elk geselecteerd peptide is anders, maar ze hebben allemaal een hoog CSF-homing-vermogen.We zagen een constante afname in de loop van de tijd voor klonen #1903 en #2011, terwijl voor klonen #2077, #2002 en #2009 een toename gedurende de eerste 10 minuten zou kunnen wijzen op actief transport, maar dit moet worden geverifieerd.Klonen #2020, #2002 en #2077 stabiliseerden zich op hoge niveaus, terwijl de CSF-concentratie van kloon #2009 langzaam afnam na de initiële toename.Vervolgens vergeleken we de relatieve frequentie van elke CSF-kandidaat met zijn bloedconcentratie (Fig. 3d).De correlatie van de gemiddelde titer van elke CSF-kandidaat met zijn bloedtiter op alle bemonsteringsmomenten toonde aan dat drie van de zes kandidaten significant verrijkt waren in bloed-CSF.Interessant is dat kloon # 2077 een hogere bloedstabiliteit vertoonde (aanvullende figuur 7).Om te bevestigen dat de peptiden zelf in staat zijn om actief andere lading dan faagdeeltjes naar het CSF-compartiment te transporteren, hebben we vier leiderpeptiden gesynthetiseerd die zijn gederivatiseerd met biotine aan de N-terminus waar de peptiden zich hechten aan het faagdeeltje.Gebiotinyleerde peptiden (nrs. 2002, 2009, 2020 en 2077) werden geconjugeerd met streptavidine (SA) om multimere vormen te verkrijgen die de faaggeometrie enigszins nabootsten.Dit formaat stelde ons ook in staat om SA-blootstelling in bloed en hersenvocht te meten als vrachtvervoerende eiwitpeptiden.Belangrijk is dat faaggegevens vaak konden worden gereproduceerd wanneer synthetische peptiden werden toegediend in dit SA-geconjugeerde formaat (figuur 3e).De gecodeerde peptiden hadden minder initiële blootstelling en snellere CSF-klaring met niet-detecteerbare niveaus binnen 48 uur.Om inzicht te krijgen in de afgifteroutes van deze peptidefaagklonen in de CSF-ruimte, analyseerden we de lokalisatie van individuele faagpeptidehits met behulp van immunohistochemie (IHC) om faagdeeltjes direct te detecteren 1 uur na intraveneuze injectie in vivo.Met name konden klonen #2002, #2077 en #2009 worden gedetecteerd door sterke kleuring in hersencapillairen, terwijl controlefaag (#1779) en kloon #2020 niet werden gedetecteerd (aanvullende figuur 8).Dit suggereert dat deze peptiden juist bijdragen aan het effect op de hersenen door de BBB te kruisen.Verdere gedetailleerde analyse is vereist om deze hypothese te testen, aangezien de BSCFB-route ook betrokken kan zijn.Bij het vergelijken van de aminozuursequentie van de meest verrijkte kloon (#2002) met andere geselecteerde peptiden, werd opgemerkt dat sommige van hen vergelijkbare aminozuurextensies hebben, wat kan wijzen op een vergelijkbaar transportmechanisme (Fig. 3f).
Vanwege zijn unieke plasmaprofiel en significante toename van CSF in de loop van de tijd, werd faagdisplay-kloon #2077 verder onderzocht gedurende een langere periode van 48 uur en was hij in staat om de snelle toename van CSF te reproduceren die werd waargenomen in samenhang met aanhoudende SA-niveaus (Fig. 4a).Met betrekking tot andere geïdentificeerde faagklonen, kleurde #2077 sterk voor hersencapillairen en vertoonde significante colokalisatie met capillaire marker-lectine wanneer bekeken met hogere resolutie en mogelijk enige kleuring in de parenchymale ruimte (Figuur 4b).Om te onderzoeken of peptide-gemedieerde farmacologische effecten konden worden verkregen in het CZS, voerden we een experiment uit waarbij gebiotinyleerde versies van i) het #2077 transitpeptide en ii) het BACE1-remmerpeptide werden gemengd met SA in twee verschillende verhoudingen.Voor één combinatie gebruikten we alleen de BACE1-peptideremmer en voor de andere gebruikten we een 1:3-verhouding van BACE1-peptideremmer tot #2077-peptide.Beide monsters werden intraveneus toegediend en bloed- en cerebrospinale vloeistofniveaus van bèta-amyloïde peptide 40 (Abeta40) werden in de loop van de tijd gemeten.Abeta40 werd gemeten in CSF omdat het BACE1-remming in het hersenparenchym weerspiegelt.Zoals verwacht, verlaagden beide complexen de bloedspiegels van Abeta40 significant (Fig. 4c, d).Alleen monsters die een mengsel van peptide nr.2077 en een remmer van het BACE1-peptide geconjugeerd aan SA veroorzaakten een significante afname van Abeta40 in de cerebrospinale vloeistof (figuur 4c).De gegevens laten zien dat peptide nr.2077 is in staat het SA-eiwit van 60 kDa naar het CZS te transporteren en induceert ook farmacologische effecten met SA-geconjugeerde remmers van het BACE1-peptide.
( a ) Klonale injectie (2 x 105 fagen / dier) van T7-faag die langdurige farmacokinetische profielen vertoont van CSF-peptide # 2077 (RLSSVDSDLSGC) en niet-geïnjecteerde controlefaag (# 1779) bij ten minste drie CM-geïntubeerde ratten.( b ) Confocaal microscopisch beeld van representatieve corticale microvaten in faag-geïnjecteerde ratten (2 x 1010 fagen / dier) die tegenkleuring van peptide # 2077 en vaten (lectine) tonen.Deze faagklonen werden toegediend aan 3 ratten en men liet ze 1 uur circuleren voorafgaand aan perfusie.Hersenen werden doorgesneden en gekleurd met polyklonale FITC-gelabelde antilichamen tegen het T7-faagcapside.Tien minuten voorafgaand aan perfusie en daaropvolgende fixatie werd DyLight594-gelabeld lectine intraveneus toegediend.Fluorescerende beelden die lectinekleuring (rood) tonen van de luminale zijde van microvaatjes en fagen (groen) in het lumen van haarvaten en perivasculair hersenweefsel.De schaalbalk komt overeen met 10 µm.(c, d) Gebiotinyleerd BACE1-remmend peptide alleen of in combinatie met gebiotinyleerd transitpeptide #2077 werd gekoppeld aan streptavidine gevolgd door intraveneuze injectie van ten minste drie gecanuleerde CM-ratten (10 mg streptavidine/kg).BACE1-peptideremmer-gemedieerde reductie in Aβ40 werd gemeten door Aβ1-40 ELISA in bloed (rood) en cerebrospinale vloeistof (oranje) op de aangegeven tijdstippen.Voor meer duidelijkheid is er een stippellijn op de grafiek getekend op een schaal van 100%.( c ) Percentage verlaging van Aβ40 in bloed (rode driehoeken) en hersenvocht (oranje driehoeken) bij ratten die werden behandeld met streptavidine geconjugeerd aan transitpeptide #2077 en BACE1-remmend peptide in een verhouding van 3:1.( d ) Percentage verlaging van bloed Aβ40 (rode cirkels) en cerebrospinale vloeistof (oranje cirkels) van ratten behandeld met streptavidine gekoppeld aan alleen een BACE1-remmend peptide.De Ap-concentratie in de controle was 420 pg/ml (standaarddeviatie = 101 pg/ml).
Faagweergave is met succes toegepast in verschillende gebieden van biomedisch onderzoek17.Deze methode is gebruikt voor in vivo vasculaire diversiteitsstudies18,19 evenals studies gericht op hersenvaten20,21,22,23,24,25,26.In deze studie hebben we de toepassing van deze selectiemethode niet alleen uitgebreid tot de directe identificatie van peptiden gericht op hersenvaten, maar ook tot de ontdekking van kandidaten met actieve transporteigenschappen om de bloed-hersenbarrière te passeren.We beschrijven nu de ontwikkeling van een in vivo selectieprocedure bij CM-geïntubeerde ratten en demonstreren het potentieel ervan om peptiden met CSF-homing-eigenschappen te identificeren.Met behulp van de T7-faag die een bibliotheek van 12-meer willekeurige peptiden weergeeft, konden we aantonen dat de T7-faag klein genoeg is (ongeveer 60 nm in diameter)10 om te worden aangepast aan de bloed-hersenbarrière, waardoor hij direct de bloed-hersenbarrière of choroïde plexus passeert.We hebben waargenomen dat CSF-oogst van gecanuleerde CM-ratten een goed gecontroleerde in vivo functionele screeningmethode was en dat de geëxtraheerde faag niet alleen aan het vaatstelsel bond, maar ook functioneerde als een transporteur door de bloed-hersenbarrière.Bovendien hebben we, door gelijktijdig bloed te verzamelen en HTS toe te passen op CSF en van bloed afgeleide fagen, bevestigd dat onze keuze voor CSF niet werd beïnvloed door bloedverrijking of geschiktheid voor expansie tussen selectierondes.Het bloedcompartiment maakt echter deel uit van de selectieprocedure, aangezien fagen die het CSF-compartiment kunnen bereiken, moeten overleven en lang genoeg in de bloedbaan moeten circuleren om zich in de hersenen te verrijken.Om betrouwbare sequentie-informatie uit onbewerkte HTS-gegevens te extraheren, hebben we filters geïmplementeerd die zijn aangepast aan platformspecifieke sequentiefouten in de analyseworkflow.Door kinetische parameters in de screeningsmethode op te nemen, bevestigden we de snelle farmacokinetiek van wildtype T7-fagen (t½ ~ 28 min) in bloed24, 27, 28 en bepaalden we ook hun halfwaardetijd in hersenvocht (t½ ~ 26 min) per minuut).Ondanks vergelijkbare farmacokinetische profielen in bloed en CSF, kon slechts 0,001% van de bloedconcentratie van faag worden gedetecteerd in CSF, wat wijst op een lage achtergrondmobiliteit van wildtype T7-faag door de bloed-hersenbarrière.Dit werk benadrukt het belang van de eerste selectieronde bij het gebruik van in vivo panning-strategieën, vooral voor faagsystemen die snel uit de circulatie worden verwijderd, aangezien maar weinig klonen het CZS-compartiment kunnen bereiken.In de eerste ronde was de afname in bibliotheekdiversiteit dus erg groot, aangezien uiteindelijk slechts een beperkt aantal klonen werd verzameld in dit zeer strikte CSF-model.Deze in vivo panning-strategie omvatte verschillende selectiestappen, zoals actieve accumulatie in het CSF-compartiment, kloonoverleving in het bloedcompartiment en snelle verwijdering van T7-faagklonen uit het bloed binnen de eerste 10 minuten (figuur 1d en aanvullende figuur 4M).).Aldus werden na de eerste ronde verschillende faagklonen geïdentificeerd in CSF, hoewel dezelfde initiële pool werd gebruikt voor individuele dieren.Dit suggereert dat meerdere strikte selectiestappen voor bronbibliotheken met een groot aantal bibliotheekleden resulteren in een aanzienlijke vermindering van de diversiteit.Daarom zullen willekeurige gebeurtenissen een integraal onderdeel worden van het initiële selectieproces, wat een grote invloed zal hebben op het resultaat.Het is waarschijnlijk dat veel van de klonen in de oorspronkelijke bibliotheek een zeer vergelijkbare CSF-verrijkingsneiging hadden.Zelfs onder dezelfde experimentele omstandigheden kunnen de selectieresultaten echter verschillen vanwege het kleine aantal van elke specifieke kloon in de initiële verzameling.
De motieven verrijkt met CSF verschillen van die in het bloed.Interessant genoeg merkten we de eerste verschuiving op naar glycinerijke peptiden in het bloed van individuele dieren.(Fig. 1g, aanvullende figuren 4e, 4f).Faag die glycinepeptiden bevat, kan stabieler zijn en minder snel uit de circulatie worden gehaald.Deze glycine-rijke peptiden werden echter niet gedetecteerd in de cerebrospinale vloeistofmonsters, wat suggereert dat de gecureerde bibliotheken door twee verschillende selectiestappen gingen: een in het bloed en een andere liet zich ophopen in de cerebrospinale vloeistof.CSF-verrijkte klonen die het resultaat zijn van de vierde selectieronde zijn uitgebreid getest.Van bijna alle afzonderlijk geteste klonen werd bevestigd dat ze verrijkt waren in CSF in vergelijking met blanco controlefaag.Eén peptidehit (#2077) werd in meer detail onderzocht.Het vertoonde een langere plasmahalfwaardetijd in vergelijking met andere treffers (figuur 3d en aanvullende figuur 7), en interessant genoeg bevatte dit peptide een cysteïneresidu aan de C-terminus.Onlangs is aangetoond dat de toevoeging van cysteïne aan peptiden hun farmacokinetische eigenschappen kan verbeteren door binding aan albumine 29.Dit is momenteel onbekend voor peptide #2077 en vereist verder onderzoek.Sommige peptiden vertoonden een valentie-afhankelijkheid in CSF-verrijking (gegevens niet getoond), wat mogelijk verband houdt met de weergegeven oppervlaktegeometrie van de T7-capside.Het T7-systeem dat we gebruikten toonde 5-15 kopieën van elk peptide per faagdeeltje.IHC werd uitgevoerd op kandidaat-leidende faagklonen die intraveneus in de hersenschors van ratten werden geïnjecteerd (aanvullende figuur 8).De gegevens toonden aan dat ten minste drie klonen (nr. 2002, nr. 2009 en nr. 2077) interactie hadden met de BBB.Het moet nog worden bepaald of deze BBB-interactie resulteert in de accumulatie van CSF of de verplaatsing van deze klonen rechtstreeks naar de BCSFB.Belangrijk is dat we laten zien dat de geselecteerde peptiden hun CSF-transportcapaciteit behouden wanneer ze worden gesynthetiseerd en gebonden aan de eiwitlading.Binding van N-terminale gebiotinyleerde peptiden aan SA herhaalt in wezen de resultaten verkregen met hun respectievelijke faagklonen in bloed en cerebrospinale vloeistof (Fig. 3e).Ten slotte laten we zien dat loodpeptide #2077 de hersenwerking van een gebiotinyleerde peptideremmer van BACE1 geconjugeerd aan SA kan bevorderen, wat uitgesproken farmacodynamische effecten in het CZS veroorzaakt door Abeta40-niveaus in CSF aanzienlijk te verlagen (Fig. 4).We konden geen homologen in de database identificeren door een peptidesequentiehomologie-zoekopdracht uit te voeren van alle treffers.Het is belangrijk op te merken dat de grootte van de T7-bibliotheek ongeveer 109 is, terwijl de theoretische bibliotheekgrootte voor 12-meren 4 x 1015 is. Daarom hebben we slechts een klein deel van de diversiteitsruimte van de 12-meer peptidebibliotheek geselecteerd, wat kan betekenen dat meer geoptimaliseerde peptiden kunnen worden geïdentificeerd door de aangrenzende sequentieruimte van deze geïdentificeerde treffers te evalueren.Hypothetisch gezien kan een van de redenen waarom we geen natuurlijke homologen van deze peptiden hebben gevonden, de deselectie tijdens de evolutie zijn om te voorkomen dat bepaalde peptidemotieven ongecontroleerd de hersenen binnendringen.
Alles bij elkaar vormen onze resultaten een basis voor toekomstig werk om de transportsystemen van de cerebrovasculaire barrière in vivo in meer detail te identificeren en te karakteriseren.De basisopzet van deze methode is gebaseerd op een functionele selectiestrategie die niet alleen klonen met cerebrale vasculaire bindingseigenschappen identificeert, maar ook een cruciale stap bevat waarin succesvolle klonen intrinsieke activiteit hebben om in vivo biologische barrières in het CZS-compartiment te doorbreken.is het ophelderen van het transportmechanisme van deze peptiden en hun voorkeur voor binding aan de microvasculatuur die specifiek is voor het hersengebied.Dit kan leiden tot de ontdekking van nieuwe routes voor het transport van de BBB en receptoren.We verwachten dat de geïdentificeerde peptiden direct kunnen binden aan cerebrovasculaire receptoren of aan circulerende liganden die door de BBB of BCSFB worden getransporteerd.De in dit werk ontdekte peptidevectoren met CSF-transportactiviteit zullen verder worden onderzocht.We onderzoeken momenteel de hersenspecificiteit van deze peptiden op hun vermogen om de BBB en/of BCSFB te passeren.Deze nieuwe peptiden zullen uiterst waardevolle hulpmiddelen zijn voor de potentiële ontdekking van nieuwe receptoren of routes en voor de ontwikkeling van nieuwe zeer efficiënte platforms voor de levering van macromoleculen, zoals biologische geneesmiddelen, aan de hersenen.
Canuleer de grote cisterna (CM) met een wijziging van de eerder beschreven methode.Verdoofde Wistar-ratten (200-350 g) werden op een stereotaxisch apparaat geplaatst en er werd een mediane incisie gemaakt over de geschoren en aseptisch geprepareerde hoofdhuid om de schedel bloot te leggen.Boor twee gaten in de buurt van de bovenste vleugel en draai de bevestigingsschroeven in de gaten vast.Er werd een extra gat geboord in de laterale achterhoofdkam voor stereotactische geleiding van een roestvrijstalen canule in de CM.Breng tandcement aan rond de canule en zet vast met schroeven.Na foto-uitharding en cementverharding werd de huidwond gesloten met 4/0 supramide hechtdraad.Correcte plaatsing van de canule wordt bevestigd door spontane lekkage van cerebrospinale vloeistof (CSF).Verwijder de rat uit het stereotactische apparaat, ontvang passende postoperatieve zorg en pijnbestrijding en laat hem gedurende ten minste een week herstellen totdat er tekenen van bloed worden waargenomen in het hersenvocht.Wistar-ratten (Crl:WI/Han) werden verkregen van Charles River (Frankrijk).Alle ratten werden onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden.Alle dierexperimenten werden goedgekeurd door het veterinaire bureau van de stad Basel, Zwitserland, en werden uitgevoerd in overeenstemming met dierenvergunning nr. 2474 (Assessment of Active Brain Transport by Measurement Levels of Therapeutic Candidates in the Cerebrospinal Fluid and Brain of Rat).
Houd de rat voorzichtig bij bewustzijn met de CM-canule in de hand.Verwijder Datura uit de canule en vang 10 µl spontaan stromend hersenvocht op.Omdat de doorgankelijkheid van de canule uiteindelijk in het gedrang kwam, werden alleen heldere hersenvochtmonsters zonder bewijs van bloedverontreiniging of verkleuring in dit onderzoek opgenomen.Tegelijkertijd werd ongeveer 10-20 μl bloed uit een kleine incisie aan het uiteinde van de staart genomen in buisjes met heparine (Sigma-Aldrich).CSF en bloed werden verzameld op verschillende tijdstippen na intraveneuze injectie van T7-faag.Ongeveer 5-10 μl vloeistof werd weggegooid voordat elk CSF-monster werd verzameld, wat overeenkomt met het dode volume van de katheter.
Bibliotheken werden gegenereerd met behulp van de T7Select 10-3b-vector zoals beschreven in de T7Select-systeemhandleiding (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).In het kort werd een willekeurig 12-meer DNA-insert gesynthetiseerd in het volgende formaat:
Het NNK-codon werd gebruikt om dubbele stopcodons en overexpressie van aminozuren in het insert te voorkomen.N is een handmatig gemengde equimolaire verhouding van elk nucleotide, en K is een handmatig gemengde equimolaire verhouding van adenine- en cytosinenucleotiden.Enkelstrengige gebieden werden omgezet in dubbelstrengig DNA door verdere incubatie met dNTP (Novagen) en Klenow-enzym (New England Biolabs) in Klenow-buffer (New England Biolabs) gedurende 3 uur bij 37°C.Na de reactie werd dubbelstrengs DNA teruggewonnen door middel van EtOH-precipitatie.Het resulterende DNA werd geknipt met restrictie-enzymen EcoRI en HindIII (beide van Roche).Het gesplitste en gezuiverde (QIAquick, Qiagen) insert (T4-ligase, New England Biolabs) werd vervolgens in-frame geligeerd in een vooraf gesplitste T7-vector na aminozuur 348 van het 10B-capsidegen.Ligatiereacties werden 18 uur bij 16°C geïncubeerd voorafgaand aan in vitro verpakken.Faagverpakking in vitro werd uitgevoerd volgens de instructies geleverd bij de T7Select 10-3b-kloneringskit (Novagen) en de verpakkingsoplossing werd eenmaal geamplificeerd tot lysis met behulp van Escherichia coli (BLT5615, Novagen).De lysaten werden gecentrifugeerd, getitreerd en ingevroren bij -80°C als voorraadoplossing van glycerol.
Directe PCR-amplificatie van faag-variabele regio's geamplificeerd in bouillon of plaat met behulp van gepatenteerde 454/Roche-amplicon-fusieprimers.De voorwaartse fusieprimer bevat sequenties die het variabele gebied (NNK) 12 (template-specifiek), GS FLX Titanium Adapter A flankeren, en een bibliotheeksleutelsequentie met vier basen (TCAG) (aanvullend figuur 1a):
De reverse fusion-primer bevat ook biotine dat is bevestigd aan capture-korrels en de GS FLX Titanium Adapter B die nodig is voor klonale amplificatie tijdens emulsie-PCR:
De amplicons werden vervolgens onderworpen aan 454/Roche pyrosequencing volgens het 454 GS-FLX Titanium-protocol.Voor handmatige Sanger-sequencing (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) werd T7-faag-DNA geamplificeerd door PCR en gesequenced met de volgende primerparen:
Inserts van individuele plaques werden onderworpen aan PCR-amplificatie met behulp van de Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (volgens de instructies van de fabrikant).Voer een warme start uit (10 min bij 95 °C) en 35 boostcycli (50 s bij 95 °C, 1 min bij 50 °C en 1 min bij 72 °C).
Faag uit bibliotheken, wildtype faag, faag gered uit CSF en bloed, of individuele klonen werden geamplificeerd in Escherichia coli BL5615 in TB-bouillon (Sigma Aldrich) of in schalen van 500 cm2 (Thermo Scientific) gedurende 4 uur bij 37°C.Faag werd van de platen geëxtraheerd door de platen te spoelen met Tris-EDTA-buffer (Fluka Analytical) of door de plaques te verzamelen met steriele pipetpunten.Faag werd geïsoleerd uit kweeksupernatant of extractiebuffer met één ronde polyethyleenglycol (PEG 8000) precipitatie (Promega) en opnieuw gesuspendeerd in Tris-EDTA-buffer.
De geamplificeerde faag werd onderworpen aan 2-3 rondes van endotoxineverwijdering met behulp van endotoxineverwijderingskorrels (Miltenyi Biotec) voorafgaand aan intraveneuze (IV) injectie (500 μl/dier).In de eerste ronde werden 2 x 1012 fagen geïntroduceerd;in de tweede, 2 x 1010 fagen;in de derde en vierde selectieronde 2x109 fagen per dier.Het faaggehalte in CSF en bloedmonsters die op de aangegeven tijdstippen werden verzameld, werd bepaald door plaquetelling volgens de instructies van de fabrikant (T7Select-systeemhandleiding).Faagselectie werd uitgevoerd door intraveneuze injectie van gezuiverde bibliotheken in de staartader of door herinjectie van faag geëxtraheerd uit CSF uit de vorige selectieronde, en daaropvolgende oogsten werden uitgevoerd na 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min en 240 min respectievelijk CSF en bloedmonsters.Er werden in totaal vier rondes van in vivo panning uitgevoerd waarbij de twee geselecteerde takken afzonderlijk werden opgeslagen en geanalyseerd tijdens de eerste drie selectierondes.Alle faaginserts geëxtraheerd uit CSF uit de eerste twee selectieronden werden onderworpen aan 454/Roche pyrosequencing, terwijl alle klonen geëxtraheerd uit CSF uit de laatste twee selectieronden handmatig werden gesequenced.Alle bloedfagen uit de eerste selectieronde werden ook onderworpen aan 454/Roche pyrosequencing.Voor injectie van faagklonen werden geselecteerde fagen geamplificeerd in E. coli (BL5615) op platen van 500 cm2 bij 37°C gedurende 4 uur.Individueel geselecteerde en handmatig gesequenced klonen werden vermeerderd in TB-medium.Na faagextractie, zuivering en verwijdering van endotoxine (zoals hierboven beschreven), werden 2 x 1010 fagen/dier in 300 μl intraveneus in één staartader geïnjecteerd.
Voorbewerking en kwalitatieve filtering van sequentiegegevens.Ruwe 454/Roche-gegevens werden geconverteerd van een binair standaard streammapformaat (sff) naar een door Pearson leesbaar formaat (fasta) met behulp van leverancierssoftware.Verdere verwerking van de nucleotidesequentie werd uitgevoerd met behulp van propriëtaire C-programma's en scripts (unreleased softwarepakket) zoals hieronder beschreven.De analyse van primaire gegevens omvat strikte meertraps filterprocedures.Om uitlezingen uit te filteren die geen geldige 12-mere insert-DNA-sequentie bevatten, werden de uitlezingen opeenvolgend uitgelijnd om label (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stoplabel (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) en achtergrondinsert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) te starten met behulp van de wereldwijde Needleman-Wunsch-test.uitlijning waardoor maximaal 2 inconsistenties per uitlijning mogelijk zijn31.Daarom werden reads zonder start- en stoptags en reads met achtergrondinserts, dwz uitlijningen die het toegestane aantal mismatches overschrijden, uit de bibliotheek verwijderd.Wat betreft de resterende uitlezingen, de N-mer DNA-sequentie die zich uitstrekte vanaf het startteken en eindigde voor het stopteken, werd uit de originele leessequentie weggesneden en verder verwerkt (hierna "invoegen" genoemd).Na translatie van de insert wordt het gedeelte na het eerste stopcodon aan het 5'-uiteinde van de primer uit de insert verwijderd.Bovendien werden ook nucleotiden verwijderd die leidden tot onvolledige codons aan het 3'-uiteinde van de primer.Om inserts uit te sluiten die alleen achtergrondsequenties bevatten, werden ook vertaalde inserts die beginnen met het aminozuurpatroon "PAG" verwijderd.Peptiden met een post-translationele lengte van minder dan 3 aminozuren werden uit de bibliotheek verwijderd.Verwijder ten slotte de redundantie in de insert-pool en bepaal de frequentie van elke unieke insert.De resultaten van deze analyse omvatten een lijst met nucleotidesequenties (inserts) en hun (lees) frequenties (aanvullende figuren 1c en 2).
Groepeer N-meer DNA-inserts op sequentieovereenkomst: Om 454/Roche-specifieke sequentiefouten (zoals problemen met het sequentiëren van homopolymeerextensies) te elimineren en minder belangrijke redundanties te verwijderen, worden eerder gefilterde N-mer DNA-sequentie-inserts (inserts) gesorteerd op overeenkomst.invoegingen (maximaal 2 niet-overeenkomende basen toegestaan) met behulp van een iteratief algoritme dat als volgt is gedefinieerd: invoegingen worden eerst gesorteerd op hun frequentie (hoogste naar laagste), en als ze hetzelfde zijn, op secundaire sortering op lengte (langste naar kortste) ).De meest frequente en langste invoegingen definiëren dus de eerste "groep".De groepsfrequentie is ingesteld op de sleutelfrequentie.Vervolgens werd geprobeerd elke insertie die in de gesorteerde lijst achterbleef aan de groep toe te voegen door paarsgewijze Needleman-Wunsch-uitlijning.Als het aantal mismatches, invoegingen of deleties in een uitlijning een drempelwaarde van 2 niet overschrijdt, wordt een invoeging aan de groep toegevoegd en wordt de algehele groepsfrequentie verhoogd met hoe vaak de invoeging is toegevoegd.Invoegingen die aan een groep worden toegevoegd, worden gemarkeerd als gebruikt en uitgesloten van verdere verwerking.Als de insert-reeks niet kan worden toegevoegd aan een reeds bestaande groep, wordt de insert-reeks gebruikt om een ​​nieuwe groep te maken met de juiste insert-frequentie en gemarkeerd als gebruikt.De iteratie eindigt wanneer elke invoegreeks is gebruikt om een ​​nieuwe groep te vormen of kan worden opgenomen in een reeds bestaande groep.Gegroepeerde inserts bestaande uit nucleotiden worden immers uiteindelijk vertaald in peptidesequenties (peptidebibliotheken).Het resultaat van deze analyse is een reeks inserties en hun overeenkomstige frequenties die het aantal opeenvolgende uitlezingen vormen (aanvullende afbeelding 2).
Motiefgeneratie: op basis van een lijst met unieke peptiden werd een bibliotheek gemaakt met alle mogelijke aminozuurpatronen (aa) zoals hieronder weergegeven.Elk mogelijk patroon van lengte 3 werd geëxtraheerd uit het peptide en het omgekeerde patroon ervan werd toegevoegd samen met een gemeenschappelijke motiefbibliotheek die alle patronen (tripeptiden) bevatte.Bibliotheken met zeer repetitieve motieven werden gesequenced en redundantie verwijderd.Vervolgens hebben we voor elk tripeptide in de motiefbibliotheek gecontroleerd op zijn aanwezigheid in de bibliotheek met behulp van computationele hulpmiddelen.In dit geval wordt de frequentie van het peptide dat het gevonden motieftripeptide bevat toegevoegd en toegewezen aan het motief in de motiefbibliotheek ("aantal motieven").Het resultaat van het genereren van motieven is een tweedimensionale array die alle voorkomens van tripeptiden (motieven) en hun respectieve waarden bevat.Statistieken zoals hierboven in detail beschreven.
Normalisatie van het aantal motieven en bijbehorende scatterplots: het aantal motieven voor elk monster werd genormaliseerd met behulp van
waarbij ni het aantal reads is dat topic i bevat.Vi vertegenwoordigt dus de procentuele frequentie van uitlezingen (of peptiden) die motief i in het monster bevatten.P-waarden voor het niet-genormaliseerde aantal motieven werden berekend met behulp van Fisher's exact-test.Met betrekking tot correlogrammen van het aantal motieven, werden de correlaties van Spearman berekend met behulp van het genormaliseerde aantal motieven met R.
Om de inhoud van aminozuren op elke positie in de peptidebibliotheek te visualiseren, werden weblogogrammen 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) gemaakt.Eerst wordt het gehalte aan aminozuren op elke positie van het 12-meer peptide opgeslagen in een 20x12 matrix.Vervolgens wordt een set van 1000 peptiden met hetzelfde relatieve aminozuurgehalte op elke positie gegenereerd in fasta-sequentieformaat en geleverd als invoer voor web-logo 3, dat een grafische weergave genereert van het relatieve aminozuurgehalte op elke positie.voor een gegeven peptidebibliotheek.Om multidimensionale datasets te visualiseren, werden heatmaps gemaakt met behulp van een intern ontwikkelde tool in R (biosHeatmap, een nog uit te brengen R-pakket).De dendrogrammen gepresenteerd in de warmtekaarten werden berekend met behulp van Ward's hiërarchische clustermethode met de Euclidische afstandsmetriek.Voor statistische analyse van motiefscoregegevens werden P-waarden voor niet-genormaliseerde scores berekend met behulp van Fisher's exact-test.P-waarden voor andere datasets werden berekend in R met behulp van Student's t-test of ANOVA.
Geselecteerde faagklonen en fagen zonder inserts werden intraveneus geïnjecteerd via de staartader (2 x 1010 fagen/dier in 300 μl PBS).Tien minuten voorafgaand aan perfusie en daaropvolgende fixatie werden dezelfde dieren intraveneus geïnjecteerd met 100 μl DyLight594-gelabeld lectine (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minuten na faaginjectie werden ratten door het hart geperfundeerd met 50 ml PBS gevolgd door 50 ml 4% PFA/PBS.Hersenmonsters werden bovendien overnacht gefixeerd in 4% PFA/PBS en overnacht gedrenkt in 30% sucrose bij 4°C.Monsters worden snel ingevroren in het OCT-mengsel.Immunohistochemische analyse van bevroren monsters werd uitgevoerd bij kamertemperatuur op 30 µm cryosecties geblokkeerd met 1% BSA en geïncubeerd met polyklonale FITC-gelabelde antilichamen tegen T7-faag (Novus NB 600-376A) bij 4 °C.Incubeer 's nachts.Ten slotte werden de secties 3 keer gewassen met PBS en onderzocht met een confocale lasermicroscoop (Leica TCS SP5).
Alle peptiden met een minimale zuiverheid van 98% werden gesynthetiseerd door GenScript USA, gebiotinyleerd en gevriesdroogd.Biotine is gebonden via een extra drievoudige glycine-spacer aan de N-terminus.Controleer alle peptiden met behulp van massaspectrometrie.
Streptavidine (Sigma S0677) werd gemengd met een 5-voudige equimolaire overmaat van gebiotinyleerd peptide, gebiotinyleerd BACE1-remmend peptide of een combinatie (verhouding 3:1) van gebiotinyleerd BACE1-remmend peptide en BACE1-remmend peptide in 5-10% DMSO/geïncubeerd in PBS.1 uur bij kamertemperatuur vóór injectie.Streptavidine-geconjugeerde peptiden werden intraveneus geïnjecteerd in een dosis van 10 mg/kg in een van de staartaderen van ratten met een hersenholte.
De concentratie van streptavidine-peptidecomplexen werd beoordeeld met ELISA.Nunc Maxisorp-microtiterplaten (Sigma) werden overnacht bij 4°C gecoat met 1,5 ug/ml muizen-anti-streptavidine-antilichaam (Thermo, MA1-20011).Na blokkering (blokkeringsbuffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatine, 1% BSA) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, was de plaat met 0,05% Tween-20/PBS (wasbuffer) gedurende 3 seconden, CSF- en plasmamonsters werden toegevoegd aan putjes verdund met blokkeerbuffer (plasma 1:10.000, CSF 1:115 ).De plaat werd vervolgens een nacht bij 4°C geïncubeerd met detectie-antilichaam (1 ug/ml, anti-streptavidine-HRP, Novus NB120-7239).Na drie wasstappen werd streptavidine gedetecteerd door incubatie in TMB-substraatoplossing (Roche) gedurende maximaal 20 minuten.Meet na het stoppen van de kleurontwikkeling met 1M H2SO4 de absorptie bij 450 nm.
De functie van het streptavidine-peptide-BACE1-remmercomplex werd bepaald door Aß(1-40) ELISA volgens het protocol van de fabrikant (Wako, 294-64701).In het kort werden CSF-monsters verdund in standaard verdunningsmiddel (1:23) en overnacht bij 4°C geïncubeerd in platen met 96 putjes bekleed met BNT77-capture-antilichaam.Na vijf wasstappen werd aan HRP geconjugeerd antilichaam BA27 toegevoegd en 2 uur bij 4°C geïncubeerd, gevolgd door vijf wasstappen.Aβ(1-40) werd gedetecteerd door incubatie in TMB-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Nadat de kleurontwikkeling is gestopt met stopoplossing, meet u de absorptie bij 450 nm.Plasmamonsters werden voorafgaand aan Aβ(1–40) ELISA onderworpen aan extractie in de vaste fase.Plasma werd toegevoegd aan 0,2% DEA (Sigma) in platen met 96 putjes en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd.Na achtereenvolgens wassen van de SPE-platen (Oasis, 186000679) met water en 100% methanol, werden plasmamonsters aan de SPE-platen toegevoegd en werd alle vloeistof verwijderd.Monsters werden gewassen (eerst met 5% methanol, daarna 30% methanol) en geëlueerd met 2% NH4OH/90% methanol.Na het drogen van het eluaat bij 55°C gedurende 99 min bij constante N2-stroom, werden de monsters verdunnen in standaard verdunningsmiddelen en werd Aβ(1–40) gemeten zoals hierboven beschreven.
Hoe dit artikel te citeren: Urich, E. et al.Vrachtlevering aan de hersenen met behulp van in vivo geïdentificeerde transitpeptiden.de wetenschap.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB en Moos T. Levering van macromoleculaire geneesmiddelen aan de hersenen met behulp van gerichte therapie.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., en Martinez-Martinez, P. Levering van peptide- en eiwitgeneesmiddelen door de bloed-hersenbarrière.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM De bloed-hersenbarrière: een knelpunt in de ontwikkeling van geneesmiddelen voor de hersenen.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, en Byrd, A. Vooruitzichten voor verbeterde medicijnafgifte en targeting op de hersenen via de choroïde plexus-CSF-route.Farmaceutisch onderzoek 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisering van biofarmaceutica met moleculaire Trojaanse paarden voor hersenafgifte.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-receptor-gemedieerd peptidetransport door de bloed-hersenbarrière.Endocr. Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Verhoog de hersenpenetratie en werkzaamheid van therapeutische antilichamen met behulp van monovalente moleculaire shuttles.Neuron 81, 49-60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transport van transferrinereceptor (TfR) bepaalt de opname door de hersenen van affiniteitsvarianten van TfR-antilichamen.J Exp Med 211, 233-244, 10.1084/jem.20131660 (2014).