Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om continue ondersteuning te garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Geeft een carrousel van drie dia's tegelijk weer. Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door drie dia's tegelijk te bladeren, of gebruik de schuifknoppen aan het einde om door drie dia's tegelijk te bladeren.
De bloed-hersenbarrière en de bloed-hersenbarrière verhinderen dat biotherapeutische middelen hun doel bereiken in het centrale zenuwstelsel, waardoor een effectieve behandeling van neurologische aandoeningen wordt belemmerd. Om nieuwe hersentransporters in vivo te ontdekken, introduceerden we een T7-faagpeptidebibliotheek en verzamelden we serieel bloed en cerebrospinaalvocht (CSF) met behulp van een gecanuleerd, bewust groot poolmodel van ratten. Specifieke faagklonen waren sterk verrijkt in CSF na vier selectierondes. Testen van individuele kandidaatpeptiden toonden een meer dan 1000-voudige verrijking in CSF. De bioactiviteit van de peptide-gemedieerde afgifte aan de hersenen werd bevestigd door een 40% reductie van het amyloïde-β-gehalte in het CSF met behulp van een BACE1-peptideremmer gekoppeld aan het geïdentificeerde nieuwe transitpeptide. Deze resultaten suggereren dat de peptiden die zijn geïdentificeerd met behulp van in vivo faagselectiemethoden, nuttige vehikels kunnen zijn voor systemische afgifte van macromoleculen aan de hersenen met een therapeutisch effect.
Onderzoek naar gerichte therapie voor het centrale zenuwstelsel (CZS) heeft zich grotendeels gericht op het identificeren van geoptimaliseerde geneesmiddelen en middelen met CZS-gerichte eigenschappen, met minder inspanning om de mechanismen te ontdekken die actieve geneesmiddelafgifte aan de hersenen aansturen. Dit begint nu te veranderen, aangezien geneesmiddelafgifte, met name grote moleculen, een integraal onderdeel is van moderne neurowetenschappelijke geneesmiddelontwikkeling. De omgeving van het centrale zenuwstelsel wordt goed beschermd door het cerebrovasculaire barrièresysteem, bestaande uit de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​​​en de bloed-hersenbarrière (BCBB)1, waardoor het een uitdaging is om geneesmiddelen naar de hersenen af ​​te leveren1,2. Naar schatting worden bijna alle grootmoleculaire geneesmiddelen en meer dan 98% van de kleinmoleculaire geneesmiddelen uit de hersenen geëlimineerd3. Daarom is het erg belangrijk om nieuwe hersentransportsystemen te identificeren die zorgen voor efficiënte en specifieke afgifte van therapeutische geneesmiddelen aan het CZS4,5. De BBB en BCSFB bieden echter ook een uitstekende mogelijkheid voor geneesmiddelafgifte, omdat ze alle structuren van de hersenen binnendringen via de uitgebreide bloedvaten. De huidige inspanningen om niet-invasieve methoden voor toediening aan de hersenen te gebruiken, zijn dus grotendeels gebaseerd op het mechanisme van receptor-gemedieerd transport (PMT) met behulp van de endogene BBB6-receptor. Ondanks recente belangrijke ontwikkelingen met behulp van de transferrinereceptorroute7,8, is verdere ontwikkeling van nieuwe toedieningssystemen met verbeterde eigenschappen vereist. Daartoe was ons doel om peptiden te identificeren die in staat zijn om CSF-transport te bemiddelen, aangezien deze in principe gebruikt kunnen worden om macromoleculen naar het CZS te brengen of om nieuwe receptorroutes te openen. Met name specifieke receptoren en transporters van het cerebrovasculaire systeem (BBB en BSCFB) kunnen dienen als potentiële doelwitten voor de actieve en specifieke toediening van biotherapeutische geneesmiddelen. Cerebrospinaalvocht (CSF) is een secretieproduct van de plexus choroïdeus (CS) en staat in direct contact met het interstitiële vocht van de hersenen via de subarachnoïdale ruimte en de ventriculaire ruimte4. Onlangs is aangetoond dat subarachnoïdaal cerebrospinaalvocht overmatig diffundeert in het interstitium van de hersenen9. We hopen de parenchymale ruimte te bereiken via dit subarachnoïdale instroomkanaal of rechtstreeks via de BBB. Om dit te bereiken, hebben we een robuuste in-vivo fagenselectiestrategie geïmplementeerd die idealiter peptiden identificeert die via een van deze twee verschillende routes worden getransporteerd.
We beschrijven nu een sequentiële in-vivo fagedisplayscreeningmethode met CSF-bemonstering gekoppeld aan high-throughput sequencing (HTS) om de initiële selectierondes met de hoogste bibliotheekdiversiteit te monitoren. De screening werd uitgevoerd op bewuste ratten met een permanent geïmplanteerde grote cisterna (CM)-canule om bloedcontaminatie te voorkomen. Belangrijk is dat deze aanpak zowel hersengerichte peptiden als peptiden met transportactiviteit door de cerebrovasculaire barrière selecteert. We gebruikten T7-fagen vanwege hun kleine formaat (~60 nm)10 en suggereerden dat ze geschikt zijn voor het transport van blaasjes die transcellulaire passage van de endotheliale en/of epitheel-medulla-barrière mogelijk maken. Na vier panningrondes werden faagpopulaties geïsoleerd die een sterke in-vivo CSF-verrijking en cerebrale microvatassociatie vertoonden. Belangrijk is dat we onze bevindingen konden bevestigen door aan te tonen dat de geprefereerde en chemisch gesynthetiseerde beste kandidaatpeptiden in staat zijn om eiwitlading naar de cerebrospinale vloeistof te transporteren. Ten eerste werden de farmacodynamische effecten van het CZS vastgesteld door een leidend transitpeptide te combineren met een remmer van het BACE1-peptide. Naast het aantonen dat in-vivo functionele screeningstrategieën nieuwe hersentransportpeptiden kunnen identificeren als effectieve dragers van eiwitvracht, verwachten we dat vergelijkbare functionele selectiemethoden ook belangrijk zullen worden bij het identificeren van nieuwe hersentransportroutes.
Op basis van plaquevormende eenheden (PFU) werd na de faagverpakkingsstap een bibliotheek van willekeurige 12-mer lineaire T7-faagpeptiden met een diversiteit van ongeveer 109 ontworpen en gecreëerd (zie Materialen en Methoden). Het is belangrijk om te vermelden dat we deze bibliotheek zorgvuldig hebben geanalyseerd vóór de in-vivo panning. PCR-amplificatie van faagbibliotheekmonsters met behulp van gemodificeerde primers genereerde amplicons die direct toepasbaar waren op HTS (aanvullende figuur 1a). Vanwege a) HTS11-sequentiefouten, b) impact op de kwaliteit van primers (NNK)1-12, en c) de aanwezigheid van wildtype (wt) fagen (skeletinserts) in de standby-bibliotheek, werd een sequentiefilterprocedure geïmplementeerd om alleen geverifieerde sequentie-informatie te extraheren (aanvullende figuur 1b). Deze filterstappen zijn van toepassing op alle HTS-sequentiebibliotheken. Voor de standaardbibliotheek werden in totaal 233.868 reads verkregen, waarvan 39% voldeed aan de filtercriteria en werd gebruikt voor bibliotheekanalyse en selectie voor volgende rondes (aanvullende figuur 1c-e). De reads waren overwegend veelvouden van 3 basenparen lang met een piek op 36 nucleotiden (aanvullende figuur 1c), wat het bibliotheekontwerp (NNK) 1-12 bevestigde. Opvallend was dat ongeveer 11% van de bibliotheekleden een 12-dimensionale wildtype (wt) backbone PAGISRELVDKL-insert bevatte, en bijna de helft van de sequenties (49%) inserties of deleties bevatte. De HTS van de bibliotheek bevestigde de hoge diversiteit aan peptiden in de bibliotheek: meer dan 81% van de peptidesequenties werd slechts één keer gevonden en slechts 1,5% kwam voor in ≥ 4 kopieën (aanvullende figuur 2a). De frequenties van aminozuren (aa) op alle 12 posities in het repertoire correleerden goed met de verwachte frequenties voor het aantal codons gegenereerd door het gedegenereerde NKK-repertoire (aanvullende figuur 2b). De waargenomen frequentie van aa-residuen gecodeerd door deze inserts correleerde goed met de berekende frequentie (r = 0,893) (aanvullende figuur 2c). De voorbereiding van faagbibliotheken voor injectie omvat de stappen van amplificatie en verwijdering van endotoxine. Eerder is aangetoond dat dit mogelijk de diversiteit van faagbibliotheken vermindert12,13. Daarom hebben we een met een plaat versterkte faagbibliotheek gesequenced die endotoxineverwijdering had ondergaan en deze vergeleken met de oorspronkelijke bibliotheek om de frequentie van AA te schatten. Er werd een sterke correlatie (r = 0,995) waargenomen tussen de oorspronkelijke pool en de versterkte en gezuiverde pool (aanvullende figuur 2d), wat aangeeft dat competitie tussen klonen die op platen waren versterkt met T7-faag geen grote vertekening veroorzaakte. Deze vergelijking is gebaseerd op de frequentie van tripeptidemotieven in elke bibliotheek, aangezien de diversiteit aan bibliotheken (~109) zelfs met HTS niet volledig kan worden vastgelegd. Frequentieanalyse van de aminozuren op elke positie toonde een kleine positieafhankelijke bias aan in de laatste drie posities van het ingevoerde repertoire (Aanvullende figuur 2e). Concluderend concludeerden we dat de kwaliteit en diversiteit van de bibliotheek acceptabel waren en dat er slechts kleine veranderingen in diversiteit werden waargenomen als gevolg van amplificatie en voorbereiding van fagenbibliotheken tussen verschillende selectierondes.
Seriële afname van cerebrospinaal vocht kan worden uitgevoerd door chirurgisch een canule in de CM van bewuste ratten te implanteren om de identificatie van intraveneus (iv) geïnjecteerde T7-faag via de BBB en/of BCSFB te vergemakkelijken (Fig. 1a-b). We gebruikten twee onafhankelijke selectiearmen (armen A en B) in de eerste drie ronden van de in-vivoselectie (Fig. 1c). We verhoogden de selectie geleidelijk door de totale hoeveelheid fage die in de eerste drie ronden werd geïntroduceerd te verlagen. Voor de vierde panningronde combineerden we monsters van takken A en B en voerden we drie aanvullende onafhankelijke selecties uit. Om de in-vivo-eigenschappen van T7-faagdeeltjes in dit model te bestuderen, werd wildtype faag (PAGISRELVDKL master insert) via de staartvene in ratten geïnjecteerd. Terugwinning van fagen uit cerebrospinaalvocht en bloed op verschillende tijdstippen toonde aan dat relatief kleine T7-icosahedrale fagen een snelle initiële klaringsfase uit het bloedcompartiment hadden (aanvullende figuur 3). Op basis van de toegediende titers en het bloedvolume van de ratten berekenden we dat slechts ongeveer 1% van de toegediende dosis faaggewicht in het bloed werd gedetecteerd 10 minuten na intraveneuze injectie. Na deze initiële snelle daling werd een langzamere primaire klaring gemeten met een halfwaardetijd van 27,7 minuten. Belangrijk is dat slechts zeer weinig fagen uit het CSF-compartiment werden teruggevonden, wat wijst op een lage achtergrond voor migratie van wildtype fagen naar het CSF-compartiment (aanvullende figuur 3). Gemiddeld werden slechts ongeveer 1 x 10-3% titers van T7-faag in het bloed en 4 x 10-8% van de aanvankelijk geïnfuseerde fagen in het CSF gedetecteerd gedurende de gehele bemonsteringsperiode (0-250 min). Opvallend was dat de halfwaardetijd (25,7 min) van wildtype fagen in cerebrospinaalvocht vergelijkbaar was met die in bloed. Deze gegevens tonen aan dat de barrière die het CSF-compartiment van het bloed scheidt intact is bij ratten met CM-canules, waardoor in vivo selectie van faagbibliotheken mogelijk is om klonen te identificeren die gemakkelijk vanuit het bloed naar het CSF-compartiment worden getransporteerd.
(a) Het opzetten van een methode voor het opnieuw bemonsteren van cerebrospinaalvocht (CSF) uit een grote pool. (b) Diagram dat de cellulaire locatie van de barrière van het centrale zenuwstelsel (CZS) en de selectiestrategie toont die is gebruikt om peptiden te identificeren die de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​​​en de bloed-hersenbarrière passeren. (c) Stroomschema voor in vivo fagedisplayscreening. In elke selectieronde werden fagen (dierlijke identificatiegegevens binnen de pijlen) intraveneus geïnjecteerd. Twee onafhankelijke alternatieve takken (A, B) worden apart bewaard tot de 4e selectieronde. Voor selectierondes 3 en 4 werd elke faagkloon die uit CSF was geëxtraheerd, handmatig gesequenced. (d) Kinetiek van fagen geïsoleerd uit bloed (rode cirkels) en cerebrospinaalvocht (groene driehoeken) tijdens de eerste selectieronde in twee gecanuleerde ratten na intraveneuze injectie van de T7-peptidebibliotheek (2 x 1012 fagen/dier). Blauwe vierkanten geven de gemiddelde initiële concentratie van fagen in het bloed aan, berekend op basis van de hoeveelheid geïnjecteerde fagen, rekening houdend met het totale bloedvolume. De zwarte vierkanten geven het snijpunt aan van de y-lijn geëxtrapoleerd uit bloedfaagconcentraties. (e,f) Presenteer de relatieve frequentie en distributie van alle mogelijke overlappende tripeptidemotieven die in het peptide zijn gevonden. Het aantal motieven gevonden in 1000 metingen wordt weergegeven. Significant (p < 0,001) verrijkte motieven zijn gemarkeerd met rode stippen. (e) Correlatie-spreidingsdiagram dat de relatieve frequentie van het tripeptidemotief van de geïnjecteerde bibliotheek vergelijkt met bloedafgeleide fagen van dieren #1.1 en #1.2. (f) Correlatie-spreidingsdiagram dat de relatieve frequenties vergelijkt van dierlijke faag-tripeptidemotieven #1.1 en #1.2 geïsoleerd in bloed en cerebrospinale vloeistof. (g, h) Sequentie-ID-weergave van fagen verrijkt in bloed (g) versus geïnjecteerde bibliotheken en fagen verrijkt in hersenvocht (h) versus bloed na een ronde in vivo selectie in beide dieren. De grootte van de éénlettercode geeft aan hoe vaak dat aminozuur op die positie voorkomt. Groen = polair, paars = neutraal, blauw = basisch, rood = zuur en zwart = hydrofobe aminozuren. Figuur 1a, b is ontworpen en geproduceerd door Eduard Urich.
We injecteerden een faagpeptidebibliotheek in twee CM-instrumentratten (clades A en B) en isoleerden fagen uit cerebrospinaalvocht en bloed (Figuur 1d). De initiële snelle klaring van de bibliotheek was minder uitgesproken vergeleken met de wildtype faag. De gemiddelde halfwaardetijd van de geïnjecteerde bibliotheek in beide dieren was 24,8 minuten in bloed, vergelijkbaar met die van de wildtype faag, en 38,5 minuten in CSF. Bloed- en cerebrospinaalvochtfaagmonsters van elk dier werden onderworpen aan HTS en alle geïdentificeerde peptiden werden geanalyseerd op de aanwezigheid van een kort tripeptidemotief. Tripeptidemotieven werden gekozen omdat ze een minimale basis bieden voor structuurvorming en peptide-eiwitinteracties14,15. We vonden een goede correlatie in de verdeling van motieven tussen de geïnjecteerde faagbibliotheek en klonen geëxtraheerd uit het bloed van beide dieren (Figuur 1e). De gegevens geven aan dat de samenstelling van de bibliotheek slechts marginaal verrijkt is in het bloedcompartiment. Aminozuurfrequenties en consensussequenties werden op elke positie verder geanalyseerd met behulp van een aanpassing van de Weblogo16-software. Interessant genoeg vonden we een sterke verrijking van glycineresiduen in het bloed (Fig. 1g). Bij vergelijking van bloed met klonen geselecteerd uit CSF, werd sterke selectie en enige deselectie van motieven waargenomen (Fig. 1f), en waren bepaalde aminozuren preferentieel aanwezig op vooraf bepaalde posities in het 12-delige weefsel (Fig. 1h). Opvallend was dat individuele dieren significant verschilden in cerebrospinale vloeistof, terwijl verrijking met glycine in het bloed bij beide dieren werd waargenomen (Aanvullende Fig. 4a-j). Na stringente filtering van sequentiegegevens in de cerebrospinale vloeistof van dieren #1.1 en #1.2 werden in totaal 964 en 420 unieke 12-mere peptiden verkregen (Aanvullende Fig. 1d-e). De geïsoleerde faagklonen werden geamplificeerd en onderworpen aan een tweede ronde van in-vivoselectie. Fagen die uit de tweede selectieronde werden geëxtraheerd, werden in elk dier onderworpen aan HTS en alle geïdentificeerde peptiden werden gebruikt als input voor een motiefherkenningsprogramma om het voorkomen van tripeptidemotieven te analyseren (Fig. 2a, b, ef). Vergeleken met de eerste cyclus van de fagen die uit CSF werden teruggewonnen, observeerden we verdere selectie en deselectie van veel motieven in CSF in takken A en B (Fig. 2). Een netwerkidentificatiealgoritme werd toegepast om te bepalen of ze verschillende patronen van consistente sequentie vertegenwoordigden. Er werd een duidelijke gelijkenis waargenomen tussen de 12-dimensionale sequenties die door CSF werden teruggewonnen in alternatieve clade A (Fig. 2c, d) en clade B (Fig. 2g, h). De gepoolde analyse in elke tak onthulde verschillende selectieprofielen voor 12-mere peptiden (Aanvullende Fig. 5c, d) en een toename van de CSF/bloedtiterverhouding in de loop van de tijd voor gepoolde klonen na de tweede selectieronde in vergelijking met de eerste selectieronde (Aanvullende Fig. 5e).
Verrijking van motieven en peptiden in hersenvocht door twee opeenvolgende ronden van in vivo functionele faagdisplayselectie.
Alle fagen uit cerebrospinaal vocht die in de eerste ronde van elk dier werden teruggevonden (dieren #1.1 en #1.2) werden samengevoegd, geamplificeerd, HT-gesequentieerd en samen opnieuw geïnjecteerd (2 x 1010 fagen/dier) in 2 SM-gecanuleerde ratten (#1.1 → #). 2.1 en 2.2, 1.2 → 2.3 en 2.4). (a, b, e, f) Correlatiespreidingsdiagrammen die de relatieve frequentie van tripeptidemotieven van alle CSF-afgeleide fagen in de eerste en tweede selectieronde vergelijken. Relatieve frequentie en distributie van motieven die alle mogelijke overlappende tripeptiden in peptiden in beide oriëntaties vertegenwoordigen. Het aantal motieven dat in 1000 metingen werd gevonden, wordt weergegeven. Motieven die significant (p < 0,001) werden geselecteerd of uitgesloten in een van de vergeleken bibliotheken, worden gemarkeerd met rode stippen. (c, d, g, h) Sequentielogoweergave van alle CSF-rijke sequenties van 12 aminozuren lang, gebaseerd op ronde 2 en 1 van in vivo selectie. De grootte van de code met één letter geeft aan hoe vaak dat aminozuur op die positie voorkomt. Om het logo weer te geven, wordt de frequentie van CSF-sequenties die uit individuele dieren zijn geëxtraheerd tussen twee selectierondes vergeleken en worden de verrijkte sequenties in de tweede ronde weergegeven: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 en (h) #1.2–#2.4. De meest verrijkte aminozuren op een bepaalde positie in (c, d) dieren nr. 2.1 en nr. 2.2 of (g, h) in dieren nr. 2.3 en nr. 2.4 worden in kleur weergegeven. Groen = polair, paars = neutraal, blauw = basisch, rood = zuur en zwart = hydrofobe aminozuren.
Na de derde selectieronde identificeerden we 124 unieke peptidesequenties (#3.1 en #3.2) uit 332 met CSF gereconstitueerde faagklonen, geïsoleerd uit twee dieren (aanvullende figuur 6a). De sequentie LGSVS (18,7%) had het hoogste relatieve aandeel, gevolgd door de wildtype inserts PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) en SARGSWREIVSLS (2,2%). In de laatste vierde ronde bundelden we twee onafhankelijk geselecteerde takken van drie afzonderlijke dieren (figuur 1c). Van de 925 gesequencete faagklonen, die uit CSF waren teruggevonden, vonden we in de vierde ronde 64 unieke peptidesequenties (aanvullende figuur 6b), waarvan het relatieve aandeel wildtype fagen daalde tot 0,8%. De meest voorkomende CSF-klonen in de vierde ronde waren LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) en RLSSVDSDLSGC (3,2%). Het lengtebereik van de geselecteerde peptiden wordt bepaald door nucleotide-inserties/-deleties of premature stopcodons in de bibliotheekprimers bij gebruik van gedegenereerde codons voor het ontwerp van de NNK-bibliotheek. Premature stopcodons genereren kortere peptiden en worden geselecteerd omdat ze het gunstige aa-motief bevatten. Langere peptiden kunnen het gevolg zijn van inserties/deleties in de primers van de synthetische bibliotheken. Dit plaatst het ontworpen stopcodon buiten het frame en leest het totdat er stroomafwaarts een nieuw stopcodon verschijnt. Over het algemeen berekenden we verrijkingsfactoren voor alle vier selectierondes door de invoergegevens te vergelijken met de uitvoergegevens van het monster. Voor de eerste screeningsronde gebruikten we wildtype faagtiters als niet-specifieke achtergrondreferentie. Interessant genoeg was de negatieve faagselectie zeer sterk in de eerste CSF-cyclus, maar niet in bloed (Fig. 3a). Dit kan te wijten zijn aan de lage waarschijnlijkheid van passieve diffusie van de meeste leden van de peptidebibliotheek in het CSF-compartiment, of aan het feit dat relatieve fagen doorgaans efficiënter worden vastgehouden of verwijderd uit de bloedbaan dan bacteriofagen. In de tweede selectieronde werd echter in beide clades een sterke selectie van fagen in CSF waargenomen, wat suggereert dat de vorige ronde verrijkt was met fagen die peptiden bevatten die de opname van CSF bevorderen (Fig. 3a). Ook ditmaal zonder significante bloedverrijking. Ook in de derde en vierde ronde waren de faagklonen significant verrijkt in CSF. Door de relatieve frequentie van elke unieke peptidesequentie tussen de laatste twee selectierondes te vergelijken, ontdekten we dat de sequenties in de vierde selectieronde nog sterker verrijkt waren (Fig. 3b). In totaal werden 931 tripeptidemotieven geëxtraheerd uit alle 64 unieke peptidesequenties met behulp van beide peptide-oriëntaties. De meest verrijkte motieven in de vierde ronde werden nauwkeuriger onderzocht op hun verrijkingsprofielen in alle ronden vergeleken met de geïnjecteerde bibliotheek (cut-off: 10% verrijking) (Aanvullende figuur 6c). Algemene selectiepatronen lieten zien dat de meeste bestudeerde motieven verrijkt waren in alle voorgaande ronden van beide selectietakken. Sommige motieven (bijv. SGL, VSG, LGS GSV) waren echter voornamelijk afkomstig uit alternatieve clade A, terwijl andere (bijv. FGW, RTN, WGF, NTR) verrijkt waren in alternatieve clade B.
Validatie van CSF-transport van CSF-verrijkte, door fagen weergegeven peptiden en gebiotinyleerde leaderpeptiden geconjugeerd aan streptavidine-ladingen.
(a) Verrijkingsverhoudingen berekend in alle vier de ronden (R1-R4) op basis van geïnjecteerde (input = I) faag (PFU) titers en bepaalde CSF faag titers (output = O). Verrijkingsfactoren voor de laatste drie ronden (R2-R4) werden berekend door vergelijking met de vorige ronde en de eerste ronde (R1) met gewichtsgegevens. Open balken zijn cerebrospinaalvocht, gearceerde balken zijn plasma. (***p<0,001, gebaseerd op de t-toets van Student). (b) Lijst met de meest voorkomende faagpeptiden, gerangschikt op basis van hun relatieve aandeel ten opzichte van alle fagen verzameld in CSF na ronde 4 van de selectie. De zes meest voorkomende faagklonen zijn gemarkeerd in kleur, genummerd en hun verrijkingsfactoren tussen ronde 3 en 4 van de selectie (insets). (c,d) De zes meest verrijkte faagklonen, lege fagen en ouderlijke faagpeptidebibliotheken uit ronde 4 werden individueel geanalyseerd in een CSF-monsternamemodel. CSF- en bloedmonsters werden verzameld op de aangegeven tijdstippen. (c) Gelijke hoeveelheden van 6 kandidaat-faagklonen (2 x 1010 fagen/dieren), lege fagen (#1779) (2 x 1010 fagen/dieren) en voorraad faagpeptidebibliotheken (2 x 1012 fagen/dieren). Injecteer ten minste 3 CM wordt afzonderlijk via de staartvene aan het gecanuleerde dier toegediend. De CSF-farmacokinetiek van elke geïnjecteerde faagkloon en faagpeptidebibliotheek in de loop van de tijd wordt weergegeven. (d) toont de gemiddelde CSF/bloedverhouding voor alle teruggevonden fagen/ml gedurende de monsternameperiode. (e) Vier synthetische leaderpeptiden en één gescrambelde controle werden met biotine gekoppeld aan streptavidine via hun N-terminus (tetrameerdisplay), gevolgd door injectie (staartader iv, 10 mg streptavidine/kg). Ten minste drie geïntubeerde ratten (N = 3). CSF-monsters werden verzameld op de aangegeven tijdstippen en de streptavidineconcentraties werden gemeten met CSF anti-streptavidine ELISA (nd = niet gedetecteerd). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, gebaseerd op ANOVA-test). (f) Vergelijking van de aminozuursequentie van de meest verrijkte faagpeptidekloon #2002 (paars) met andere geselecteerde faagpeptideklonen uit de vierde selectieronde. Identieke en vergelijkbare aminozuurfragmenten zijn kleurgecodeerd.
Van alle verrijkte fagen in de vierde ronde (Fig. 3b) werden zes kandidaatklonen geselecteerd voor verdere individuele analyse in het CSF-monsternamemodel. Gelijke hoeveelheden van zes kandidaatfagen, lege fagen (geen insert) en profaagpeptidebibliotheken werden geïnjecteerd in drie gecanuleerde CM-dieren, en de farmacokinetiek werd bepaald in CSF- (Fig. 3c) en bloed- (Aanvullende Fig. 7) assays. Alle geteste faagklonen richtten zich op het CSF-compartiment op een niveau dat 10-1000 keer hoger was dan dat van de lege controlefaag (#1779). Klonen #2020 en #2077 hadden bijvoorbeeld ongeveer 1000 keer hogere CSF-titers dan de controlefaag. Het farmacokinetisch profiel van elk geselecteerd peptide is verschillend, maar ze hebben allemaal een hoog CSF-homingvermogen. We observeerden een constante afname in de loop van de tijd voor klonen #1903 en #2011, terwijl voor klonen #2077, #2002 en #2009 een toename gedurende de eerste 10 minuten zou kunnen wijzen op actief transport, maar dit moet nog worden geverifieerd. Klonen #2020, #2002 en #2077 stabiliseerden op een hoog niveau, terwijl de CSF-concentratie van kloon #2009 na de initiële toename langzaam afnam. Vervolgens vergeleken we de relatieve frequentie van elke CSF-kandidaat met de bloedconcentratie (Figuur 3d). De correlatie tussen de gemiddelde titer van elke CSF-kandidaat en de bloedtiter op alle bemonsteringsmomenten toonde aan dat drie van de zes kandidaten significant verrijkt waren met bloed-CSF. Interessant is dat kloon #2077 een hogere bloedstabiliteit vertoonde (Aanvullende Figuur 7). Om te bevestigen dat de peptiden zelf actief in staat zijn om andere lading dan faagdeeltjes naar het CSF-compartiment te transporteren, synthetiseerden we vier leaderpeptiden, gederivatiseerd met biotine aan de N-terminus waar de peptiden zich aan het faagdeeltje hechten. Gebiotinyleerde peptiden (nrs. 2002, 2009, 2020 en 2077) werden geconjugeerd met streptavidine (SA) om multimere vormen te verkrijgen die de faaggeometrie enigszins nabootsen. Dit formaat stelde ons ook in staat om de SA-blootstelling in bloed en cerebrospinale vloeistof te meten als ladingtransporterende eiwitpeptiden. Belangrijk is dat faaggegevens vaak konden worden gereproduceerd wanneer synthetische peptiden in dit SA-geconjugeerde formaat werden toegediend (Fig. 3e). De gescrambelde peptiden hadden een lagere initiële blootstelling en een snellere CSF-klaring met ondetecteerbare niveaus binnen 48 uur. Om inzicht te krijgen in de afgifteroutes van deze peptidefaagklonen in de CSF-ruimte, analyseerden we de lokalisatie van individuele faagpeptidehits met behulp van immunohistochemie (IHC) om faagdeeltjes direct 1 uur na intraveneuze injectie in vivo te detecteren. Opvallend was dat klonen #2002, #2077 en #2009 konden worden gedetecteerd door sterke kleuring in hersencapillairen, terwijl controlefaag (#1779) en kloon #2020 niet werden gedetecteerd (aanvullende figuur 8). Dit suggereert dat deze peptiden bijdragen aan het effect op de hersenen door juist de BBB te passeren. Verdere gedetailleerde analyse is nodig om deze hypothese te testen, aangezien de BSCFB-route mogelijk ook betrokken is. Bij vergelijking van de aminozuursequentie van de meest verrijkte kloon (#2002) met andere geselecteerde peptiden, werd opgemerkt dat sommige van hen vergelijkbare aminozuurextensies hebben, wat kan wijzen op een vergelijkbaar transportmechanisme (Fig. 3f).
Vanwege het unieke plasmaprofiel en de significante toename van CSF in de loop van de tijd, werd faagdisplaykloon #2077 verder onderzocht over een langere periode van 48 uur en was deze in staat de snelle toename van CSF te reproduceren die werd waargenomen in combinatie met aanhoudende SA-niveaus (Figuur 4a). Van de andere geïdentificeerde faagklonen kleurde #2077 sterk voor hersencapillairen en vertoonde het significante colocalisatie met capillaire markerlectine bij weergave met hogere resolutie en mogelijk enige kleuring in de parenchymruimte (Figuur 4b). Om te onderzoeken of peptide-gemedieerde farmacologische effecten in het CZS konden worden verkregen, voerden we een experiment uit waarbij gebiotinyleerde versies van i) het #2077-transitpeptide en ii) het BACE1-remmerpeptide werden gemengd met SA in twee verschillende verhoudingen. Voor de ene combinatie gebruikten we alleen de BACE1-peptideremmer en voor de andere een 1:3-verhouding van BACE1-peptideremmer tot #2077-peptide. Beide monsters werden intraveneus toegediend en de concentraties bèta-amyloïde peptide 40 (Abeta40) in het bloed en cerebrospinaalvocht werden in de loop van de tijd gemeten. Abeta40 werd gemeten in CSF, aangezien het de BACE1-remming in het hersenparenchym weerspiegelt. Zoals verwacht verlaagden beide complexen de bloedconcentraties van Abeta40 significant (Fig. 4c, d). Echter, alleen monsters met een mengsel van peptide nr. 2077 en een remmer van het BACE1-peptide geconjugeerd aan SA veroorzaakten een significante afname van Abeta40 in het cerebrospinaalvocht (Fig. 4c). De gegevens tonen aan dat peptide nr. 2077 het 60 kDa SA-eiwit naar het CZS kan transporteren en ook farmacologische effecten induceert met SA-geconjugeerde remmers van het BACE1-peptide.
(a) Klonale injectie (2 × 106 fagen/dier) van T7-faag met farmacokinetische profielen op lange termijn van CSF-peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) en niet-geïnjecteerde controlefaag (#1779) in ten minste drie CM-geïntubeerde ratten. (b) Confocale microscopische opname van representatieve corticale microvaten in fage-geïnjecteerde ratten (2 × 106 fagen/dier) met tegenkleuring van peptide #2077 en vaten (lectine). Deze faagklonen werden toegediend aan 3 ratten en 1 uur laten circuleren vóór perfusie. Hersenen werden in coupes gesneden en gekleurd met polyklonale FITC-gelabelde antilichamen tegen de T7-faagcapside. Tien minuten vóór perfusie en daaropvolgende fixatie werd DyLight594-gelabelde lectine intraveneus toegediend. Fluorescentiebeelden tonen lectinekleuring (rood) van de luminale zijde van microvaten en fagen (groen) in het lumen van capillairen en perivasculair hersenweefsel. De schaalbalk komt overeen met 10 µm. (c, d) Gebiotinyleerd BACE1-remmend peptide, alleen of in combinatie met gebiotinyleerd transitpeptide #2077, werd gekoppeld aan streptavidine, gevolgd door intraveneuze injectie van ten minste drie gecanuleerde CM-ratten (10 mg streptavidine/kg). De door BACE1-peptideremmer gemedieerde reductie van Aβ40 werd gemeten met Aβ1-40 ELISA in bloed (rood) en cerebrospinaalvocht (oranje) op de aangegeven tijdstippen. Voor een betere duidelijkheid is een stippellijn getekend op de grafiek met een schaal van 100%. (c) Percentage verlaging van Aβ40 in bloed (rode driehoeken) en cerebrospinale vloeistof (oranje driehoeken) bij ratten behandeld met streptavidine geconjugeerd aan transitpeptide #2077 en BACE1-remmende peptide in een verhouding van 3:1. (d) Percentage verlaging van Aβ40 in bloed (rode cirkels) en cerebrospinale vloeistof (oranje cirkels) bij ratten behandeld met streptavidine gekoppeld aan alleen een BACE1-remmende peptide. De Aβ-concentratie in de controlegroep was 420 pg/ml (standaarddeviatie = 101 pg/ml).
Faagdisplay is met succes toegepast in verschillende gebieden van biomedisch onderzoek17. Deze methode is gebruikt voor in vivo vasculaire diversiteitsstudies18,19 en studies gericht op cerebrale vaten20,21,22,23,24,25,26. In deze studie hebben we de toepassing van deze selectiemethode niet alleen uitgebreid naar de directe identificatie van peptiden gericht op cerebrale vaten, maar ook naar de ontdekking van kandidaten met actieve transporteigenschappen om de bloed-hersenbarrière te passeren. We beschrijven nu de ontwikkeling van een in vivo selectieprocedure in CM-geïntubeerde ratten en demonstreren het potentieel ervan om peptiden met CSF-homing-eigenschappen te identificeren. Met behulp van de T7-faag die een bibliotheek van 12-mer willekeurige peptiden presenteerde, konden we aantonen dat de T7-faag klein genoeg is (ongeveer 60 nm in diameter)10 om zich aan te passen aan de bloed-hersenbarrière, waardoor hij direct de bloed-hersenbarrière of choroïde plexus passeert. We observeerden dat het oogsten van CSF uit gecanuleerde CM-ratten een goed gecontroleerde in-vivo functionele screeningsmethode was, en dat de geëxtraheerde fage zich niet alleen aan de bloedvaten bond, maar ook functioneerde als transporteur door de bloed-hersenbarrière. Door gelijktijdig bloed te verzamelen en HTS toe te passen op CSF en bloedafgeleide fagen, bevestigden we bovendien dat onze keuze van CSF niet werd beïnvloed door bloedverrijking of geschiktheid voor expansie tussen selectierondes. Het bloedcompartiment maakt echter wel deel uit van de selectieprocedure, aangezien fagen die het CSF-compartiment kunnen bereiken, lang genoeg in de bloedbaan moeten overleven en circuleren om zich in de hersenen te verrijken. Om betrouwbare sequentie-informatie uit ruwe HTS-data te extraheren, implementeerden we filters die waren aangepast aan platformspecifieke sequentiefouten in de analyseworkflow. Door kinetische parameters in de screeningmethode op te nemen, bevestigden we de snelle farmacokinetiek van wildtype T7-fagen (t½ ~ 28 min) in bloed24, 27, 28 en bepaalden we ook hun halfwaardetijd in cerebrospinaalvocht (t½ ~ 26 min) per minuut). Ondanks vergelijkbare farmacokinetische profielen in bloed en CSF, kon slechts 0,001% van de bloedconcentratie van fagen worden gedetecteerd in CSF, wat wijst op een lage achtergrondmobiliteit van wildtype T7-faag over de bloed-hersenbarrière. Dit werk benadrukt het belang van de eerste selectieronde bij het gebruik van in vivo panningstrategieën, met name voor faagsystemen die snel uit de circulatie worden verwijderd, aangezien weinig klonen het CZS-compartiment kunnen bereiken. In de eerste ronde was de reductie in bibliotheekdiversiteit dus erg groot, aangezien uiteindelijk slechts een beperkt aantal klonen werd verzameld in dit zeer strikte CSF-model. Deze in vivo panningstrategie omvatte verschillende selectiestappen, zoals actieve accumulatie in het CSF-compartiment, overleving van de kloon in het bloedcompartiment en snelle verwijdering van T7-faagklonen uit het bloed binnen de eerste 10 minuten (Fig. 1d en Aanvullende Fig. 4M). ). Zo werden na de eerste ronde verschillende faagklonen geïdentificeerd in CSF, hoewel dezelfde initiële pool werd gebruikt voor individuele dieren. Dit suggereert dat meerdere strikte selectiestappen voor bronbibliotheken met een groot aantal bibliotheekleden resulteren in een significante vermindering van de diversiteit. Daarom zullen willekeurige gebeurtenissen een integraal onderdeel worden van het initiële selectieproces, wat het resultaat sterk beïnvloedt. Het is waarschijnlijk dat veel van de klonen in de oorspronkelijke bibliotheek een zeer vergelijkbare neiging tot CSF-verrijking hadden. Echter, zelfs onder dezelfde experimentele omstandigheden kunnen selectieresultaten verschillen vanwege het kleine aantal van elke specifieke kloon in de initiële pool.
De motieven die verrijkt zijn in CSF verschillen van die in het bloed. Interessant genoeg merkten we de eerste verschuiving op naar glycinerijke peptiden in het bloed van individuele dieren (Fig. 1g, Aanvullende Fig. 4e, 4f). Fagen die glycinepeptiden bevatten, zijn mogelijk stabieler en minder snel uit de bloedsomloop verwijderd. Deze glycinerijke peptiden werden echter niet gedetecteerd in de cerebrospinale vloeistofmonsters, wat suggereert dat de geselecteerde bibliotheken twee verschillende selectiestappen hebben doorlopen: één in het bloed en één waarbij de andere zich in de cerebrospinale vloeistof heeft opgehoopt. CSF-verrijkte klonen die voortkwamen uit de vierde selectieronde zijn uitgebreid getest. Bijna alle individueel geteste klonen bleken verrijkt te zijn in CSF in vergelijking met blanco controlefagen. Eén peptidehit (#2077) werd nader onderzocht. Het vertoonde een langere plasmahalfwaardetijd vergeleken met andere hits (Figuur 3d en Aanvullende Figuur 7), en interessant genoeg bevatte dit peptide een cysteïneresidu aan de C-terminus. Onlangs is aangetoond dat de toevoeging van cysteïne aan peptiden hun farmacokinetische eigenschappen kan verbeteren door binding aan albumine 29. Dit is momenteel onbekend voor peptide #2077 en vereist verder onderzoek. Sommige peptiden vertoonden een valentieafhankelijkheid in CSF-verrijking (gegevens niet getoond), wat mogelijk verband houdt met de weergegeven oppervlaktegeometrie van de T7-capside. Het T7-systeem dat we gebruikten vertoonde 5-15 kopieën van elk peptide per faagdeeltje. IHC werd uitgevoerd op kandidaat-leadfaagklonen die intraveneus in de hersenschors van ratten werden geïnjecteerd (Aanvullende Figuur 8). De gegevens toonden aan dat ten minste drie klonen (nr. 2002, nr. 2009 en nr. 2077) interageerden met de BBB. Het is nog maar de vraag of deze BBB-interactie resulteert in de accumulatie van CSF of de verplaatsing van deze klonen rechtstreeks naar de BCSFB. Belangrijk is dat we aantonen dat de geselecteerde peptiden hun CSF-transportcapaciteit behouden na synthese en binding aan de eiwitlading. De binding van N-terminale gebiotinyleerde peptiden aan SA herhaalt in wezen de resultaten die zijn verkregen met hun respectievelijke faagklonen in bloed en cerebrospinaalvocht (Fig. 3e). Tot slot tonen we aan dat leadpeptide #2077 in staat is om de hersenwerking van een gebiotinyleerde peptideremmer van BACE1, geconjugeerd aan SA, te bevorderen, wat leidt tot uitgesproken farmacodynamische effecten in het CZS door de Abeta40-niveaus in CSF significant te verlagen (Fig. 4). We konden geen homologen in de database identificeren door een zoekopdracht naar peptide-sequentiehomologie uit te voeren op alle hits. Het is belangrijk op te merken dat de omvang van de T7-bibliotheek ongeveer 109 is, terwijl de theoretische bibliotheekgrootte voor 12-mer 4 x 1015 is. Daarom hebben we slechts een klein deel van de diversiteitsruimte van de 12-mer peptidebibliotheek geselecteerd, wat zou kunnen betekenen dat meer geoptimaliseerde peptiden kunnen worden geïdentificeerd door de aangrenzende sequentieruimte van deze geïdentificeerde hits te evalueren. Hypothetisch gezien zou een van de redenen waarom we geen natuurlijke homologen van deze peptiden hebben gevonden, deselectie tijdens de evolutie kunnen zijn om de ongecontroleerde intrede van bepaalde peptidemotieven in de hersenen te voorkomen.
Samengevat bieden onze resultaten een basis voor toekomstig werk om de transportsystemen van de cerebrovasculaire barrière in vivo gedetailleerder te identificeren en te karakteriseren. De basisopzet van deze methode is gebaseerd op een functionele selectiestrategie die niet alleen klonen met cerebrale vasculaire bindende eigenschappen identificeert, maar ook een cruciale stap omvat waarin succesvolle klonen intrinsieke activiteit hebben om biologische barrières in vivo te passeren naar het CZS-compartiment. is het verhelderen van het transportmechanisme van deze peptiden en hun voorkeur voor binding aan de microvasculatuur die specifiek is voor de hersenregio. Dit kan leiden tot de ontdekking van nieuwe routes voor het transport van de BBB en receptoren. We verwachten dat de geïdentificeerde peptiden direct kunnen binden aan cerebrovasculaire receptoren of aan circulerende liganden die door de BBB of BCSFB worden getransporteerd. De in dit werk ontdekte peptidevectoren met CSF-transportactiviteit zullen verder worden onderzocht. We onderzoeken momenteel de hersenspecificiteit van deze peptiden op hun vermogen om de BBB en/of BCSFB te passeren. Deze nieuwe peptiden zullen uiterst waardevolle hulpmiddelen zijn voor de mogelijke ontdekking van nieuwe receptoren of routes en voor de ontwikkeling van nieuwe, uiterst efficiënte platformen voor de afgifte van macromoleculen, zoals biologische geneesmiddelen, aan de hersenen.
Canuleer de grote cisterna (CM) met behulp van een modificatie van de eerder beschreven methode. Verdoofde Wistar-ratten (200-350 g) werden op een stereotactisch apparaat geplaatst en er werd een mediane incisie gemaakt over de geschoren en aseptisch geprepareerde hoofdhuid om de schedel bloot te leggen. Boor twee gaten in het gebied van de bovenste sjerp en draai de bevestigingsschroeven in de gaten. Een extra gat werd geboord in de laterale occipitale kam voor stereotactische geleiding van een roestvrijstalen canule in de CM. Breng tandcement aan rond de canule en zet vast met schroeven. Na foto-uitharding en cementuitharding werd de huidwond gesloten met een 4/0 supramide hechting. De juiste plaatsing van de canule wordt bevestigd door spontane lekkage van cerebrospinaalvocht (CSF). Verwijder de rat uit het stereotactische apparaat, ontvang passende postoperatieve zorg en pijnbestrijding en laat hem of haar ten minste een week herstellen totdat er tekenen van bloed in het cerebrospinaalvocht worden waargenomen. Wistar-ratten (Crl:WI/Han) werden verkregen uit Charles River (Frankrijk). Alle ratten werden gehouden onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Veterinaire Dienst van de stad Bazel, Zwitserland, en werden uitgevoerd in overeenstemming met Diervergunning nr. 2474 (Beoordeling van actief hersentransport door het meten van de niveaus van therapeutische kandidaten in de cerebrospinale vloeistof en hersenen van ratten).
Houd de rat voorzichtig bij bewustzijn met de CM-canule in de hand. Verwijder Datura uit de canule en verzamel 10 µl spontaan stromend cerebrospinaalvocht. Omdat de doorgankelijkheid van de canule uiteindelijk was aangetast, werden alleen heldere monsters van cerebrospinaalvocht zonder tekenen van bloedverontreiniging of verkleuring in deze studie opgenomen. Tegelijkertijd werd ongeveer 10-20 µl bloed afgenomen via een kleine incisie aan het uiteinde van de staart in buisjes met heparine (Sigma-Aldrich). CSF en bloed werden op verschillende tijdstippen verzameld na intraveneuze injectie van T7-faag. Ongeveer 5-10 µl vloeistof werd weggegooid vóór elk CSF-monster, wat overeenkomt met het dode volume van de katheter.
Bibliotheken werden gegenereerd met behulp van de T7Select 10-3b-vector, zoals beschreven in de handleiding van het T7Select-systeem (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Kort gezegd werd een willekeurig 12-mer DNA-insert gesynthetiseerd in het volgende formaat:
Het NNK-codon werd gebruikt om dubbele stopcodons en overexpressie van aminozuren in de insert te voorkomen. N is een handmatig gemengde equimolaire verhouding van elke nucleotide, en K is een handmatig gemengde equimolaire verhouding van adenine- en cytosinenucleotiden. Enkelstrengs DNA werd omgezet in dubbelstrengs DNA door verdere incubatie met dNTP (Novagen) en Klenow-enzym (New England Biolabs) in Klenow-buffer (New England Biolabs) gedurende 3 uur bij 37 °C. Na de reactie werd het dubbelstrengs DNA gewonnen door EtOH-precipitatie. Het resulterende DNA werd verteerd met de restrictie-enzymen EcoRI en HindIII (beide van Roche). De gekliefde en gezuiverde (QIAquick, Qiagen) insert (T4-ligase, New England Biolabs) werd vervolgens in-frame geligeerd in een voorgekliefde T7-vector na aminozuur 348 van het 10B-capsidegen. Ligatiereacties werden 18 uur geïncubeerd bij 16 °C voorafgaand aan in-vitroverpakking. De in-vitroverpakking van de fagen werd uitgevoerd volgens de instructies van de T7Select 10-3b-kloneringskit (Novagen) en de verpakkingsoplossing werd eenmaal geamplificeerd voor lysis met behulp van Escherichia coli (BLT5615, Novagen). De lysaten werden gecentrifugeerd, getitreerd en ingevroren bij -80 °C als een voorraadoplossing van glycerol.
Directe PCR-amplificatie van variabele faagregio's, geamplificeerd in bouillon of plaat met behulp van gepatenteerde 454/Roche-amplicon fusieprimers. De forward fusion primer bevat sequenties die de variabele regio (NNK) 12 (template-specifiek), GS FLX Titanium Adapter A en een vier-basen bibliotheek sleutelsequentie (TCAG) flankeren (Aanvullende figuur 1a):
De reverse fusion primer bevat ook biotine gebonden aan capture beads en de GS FLX Titanium Adapter B die nodig is voor klonale amplificatie tijdens emulsie-PCR:
De amplicons werden vervolgens onderworpen aan 454/Roche pyrosequencing volgens het 454 GS-FLX Titanium protocol. Voor handmatige Sanger-sequencing (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) werd T7-faag-DNA geamplificeerd met PCR en gesequenced met de volgende primerparen:
Inzetstukken van individuele plaques werden onderworpen aan PCR-amplificatie met behulp van de Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (volgens de instructies van de fabrikant). Voer een hotstart uit (10 min bij 95 °C) en 35 boostcycli (50 s bij 95 °C, 1 min bij 50 °C en 1 min bij 72 °C).
Fagen uit bibliotheken, wildtype fagen, fagen uit hersenvocht en bloed, of individuele klonen werden gedurende 4 uur bij 37 °C geamplificeerd in Escherichia coli BL5615 in tuberculosebouillon (Sigma Aldrich) of in 500 cm2 schalen (Thermo Scientific). Fagen werden uit de platen geëxtraheerd door de platen te spoelen met Tris-EDTA-buffer (Fluka Analytical) of door de plaques te verzamelen met steriele pipetpunten. Fagen werden geïsoleerd uit kweeksupernatant of extractiebuffer met één ronde polyethyleenglycol (PEG 8000) precipitatie (Promega) en geresuspendeerd in Tris-EDTA-buffer.
De versterkte faag werd onderworpen aan 2-3 ronden van endotoxineverwijdering met behulp van endotoxineverwijderingskorrels (Miltenyi Biotec) voorafgaand aan intraveneuze (IV) injectie (500 μl/dier). In de eerste ronde werden 2×1012 fagen geïntroduceerd; in de tweede, 2×1010 fagen; in de derde en vierde selectieronde, 2×109 fagen per dier. Het faaggehalte in CSF en bloedmonsters verzameld op de aangegeven tijdstippen werd bepaald door plaquetelling volgens de instructies van de fabrikant (handleiding van het T7Select-systeem). De faagselectie werd uitgevoerd door intraveneuze injectie van gezuiverde bibliotheken in de staartvene of door herinjectie van fagen geëxtraheerd uit CSF uit de vorige selectieronde. De daaropvolgende oogsten werden uitgevoerd na respectievelijk 10 minuten, 30 minuten, 60 minuten, 90 minuten, 120 minuten, 180 minuten en 240 minuten in CSF en bloedmonsters. In totaal werden vier in vivo panningrondes uitgevoerd, waarbij de twee geselecteerde takken afzonderlijk werden opgeslagen en geanalyseerd tijdens de eerste drie selectierondes. Alle faaginserts die uit CSF werden geëxtraheerd in de eerste twee selectierondes, werden onderworpen aan 454/Roche-pyrosequencing, terwijl alle klonen die uit CSF werden geëxtraheerd in de laatste twee selectierondes handmatig werden gesequenced. Alle bloedfagen uit de eerste selectieronde werden eveneens onderworpen aan 454/Roche-pyrosequencing. Voor injectie van faagklonen werden geselecteerde fagen geamplificeerd in E. coli (BL5615) op 500 cm2-platen bij 37 °C gedurende 4 uur. Individueel geselecteerde en handmatig gesequenced klonen werden vermeerderd in TB-medium. Na faagextractie, zuivering en verwijdering van endotoxine (zoals hierboven beschreven), werden 2×1010 fagen/dier in 300 μl intraveneus geïnjecteerd in één staartvene.
Voorbewerking en kwalitatieve filtering van sequentiegegevens. Ruwe 454/Roche-gegevens werden omgezet van een binair standaard stream map-formaat (sff) naar een voor mensen leesbaar Pearson-formaat (fasta) met behulp van software van de leverancier. Verdere verwerking van de nucleotide-sequentie werd uitgevoerd met behulp van gepatenteerde C-programma's en scripts (niet-uitgebracht softwarepakket), zoals hieronder beschreven. De analyse van primaire gegevens omvat strikte meerstapsfilterprocedures. Om reads te filteren die geen geldige 12-mer insert DNA-sequentie bevatten, werden de reads sequentieel uitgelijnd op startlabel (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stoplabel (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) en achtergrondinsert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) met behulp van de globale Needleman-Wunsch-test. Uitlijning die maximaal 2 inconsistenties per uitlijning toestaat31. Daarom werden reads zonder start- en stoptags en reads met achtergrondinserts, d.w.z. uitlijningen die het toegestane aantal mismatches overschrijden, uit de bibliotheek verwijderd. Wat de resterende reads betreft, werd de N-mer DNA-sequentie die zich uitstrekte vanaf het startpunt tot en met het stoppunt, uit de oorspronkelijke readsequentie verwijderd en verder verwerkt (hierna "insert" genoemd). Na translatie van de insert werd het deel na het eerste stopcodon aan het 5'-uiteinde van de primer uit de insert verwijderd. Daarnaast werden ook nucleotiden verwijderd die leidden tot onvolledige codons aan het 3'-uiteinde van de primer. Om inserts met alleen achtergrondsequenties uit te sluiten, werden ook vertaalde inserts die begonnen met het aminozuurpatroon "PAG" verwijderd. Peptiden met een posttranslationele lengte van minder dan 3 aminozuren werden uit de bibliotheek verwijderd. Verwijder tot slot redundantie in de insertpool en bepaal de frequentie van elke unieke insert. De resultaten van deze analyse omvatten een lijst van nucleotidesequenties (inserts) en hun (read)frequenties (aanvullende figuren 1c en 2).
Groep N-mer DNA-inserts op sequentiegelijkenis: Om 454/Roche-specifieke sequentiefouten (zoals problemen met het sequencen van homopolymeerextensies) te elimineren en minder belangrijke redundanties te verwijderen, worden eerder gefilterde N-mer DNA-sequentie-inserts (inserts) gesorteerd op gelijkenis. inserties (maximaal 2 niet-overeenkomende basen toegestaan) met behulp van een iteratief algoritme dat als volgt is gedefinieerd: inserties worden eerst gesorteerd op hun frequentie (van hoog naar laag) en, indien ze hetzelfde zijn, op hun secundaire sortering op lengte (van langste naar kortste). De meest frequente en langste inserties definiëren dus de eerste "groep". De groepsfrequentie wordt ingesteld op de sleutelfrequentie. Vervolgens werd geprobeerd elke insertie die in de gesorteerde lijst overbleef, aan de groep toe te voegen door middel van paarsgewijze Needleman-Wunsch-uitlijning. Als het aantal mismatches, inserties of deleties in een uitlijning een drempelwaarde van 2 niet overschrijdt, wordt een insertie aan de groep toegevoegd en wordt de algehele groepsfrequentie verhoogd met hoe vaak de insertie werd toegevoegd. Inserties die aan een groep worden toegevoegd, worden gemarkeerd als gebruikt en uitgesloten van verdere verwerking. Als de insertiesequentie niet kan worden toegevoegd aan een reeds bestaande groep, wordt de insertiesequentie gebruikt om een ​​nieuwe groep te creëren met de juiste insertiefrequentie en gemarkeerd als gebruikt. De iteratie eindigt wanneer elke insertiesequentie is gebruikt om een ​​nieuwe groep te vormen of kan worden opgenomen in een reeds bestaande groep. Immers, gegroepeerde inserties bestaande uit nucleotiden worden uiteindelijk vertaald naar peptidesequenties (peptidebibliotheken). Het resultaat van deze analyse is een set inserties en hun bijbehorende frequenties die het aantal opeenvolgende reads bepalen (Aanvullende figuur 2).
Motiefgeneratie: Op basis van een lijst met unieke peptiden werd een bibliotheek gecreëerd met alle mogelijke aminozuurpatronen (aa), zoals hieronder weergegeven. Elk mogelijk patroon van lengte 3 werd uit het peptide geëxtraheerd en het bijbehorende inverse patroon werd toegevoegd, samen met een gemeenschappelijke motiefbibliotheek die alle patronen (tripeptiden) bevatte. Bibliotheken met zeer repetitieve motieven werden gesequenced en redundantie werd verwijderd. Vervolgens controleerden we voor elk tripeptide in de motievenbibliotheek de aanwezigheid ervan met behulp van computationele tools. In dit geval werd de frequentie van het peptide dat het gevonden motieftripeptide bevat, toegevoegd en toegewezen aan het motief in de motievenbibliotheek ("aantal motieven"). Het resultaat van de motiefgeneratie is een tweedimensionale array met alle voorkomens van tripeptiden (motieven) en hun respectievelijke waarden, namelijk het aantal sequentielezingen dat resulteert in het corresponderende motief wanneer de lezingen worden gefilterd, gegroepeerd en vertaald. Metrieken zoals hierboven in detail beschreven.
Normalisatie van het aantal motieven en bijbehorende spreidingsdiagrammen: Het aantal motieven voor elk monster werd genormaliseerd met behulp van
waarbij ni het aantal reads is dat topic i bevat. Vi vertegenwoordigt dus de procentuele frequentie van reads (of peptiden) die motief i bevatten in de steekproef. P-waarden voor het niet-genormaliseerde aantal motieven werden berekend met behulp van Fisher's exacte toets. Wat betreft correlogrammen van het aantal motieven, werden Spearman's correlaties berekend met behulp van het genormaliseerde aantal motieven met R.
Om de aminozuren op elke positie in de peptidebibliotheek te visualiseren, werden weblogogrammen 32 en 33 (http://weblogo.threeplusone.com) gemaakt. Eerst werd de aminozuren op elke positie van het 12-mer peptide opgeslagen in een 20×12 matrix. Vervolgens werd een set van 1000 peptiden met dezelfde relatieve aminozuren op elke positie gegenereerd in fasta-sequentieformaat en als input geleverd aan weblogo 3, dat een grafische weergave van de relatieve aminozuren op elke positie genereert voor een gegeven peptidebibliotheek. Om multidimensionale datasets te visualiseren, werden heatmaps gemaakt met behulp van een intern ontwikkelde tool in R (biosHeatmap, een nog te verschijnen R-pakket). De dendrogrammen in de heatmaps werden berekend met behulp van Wards hiërarchische clustermethode met de Euclidische afstandsmetriek. Voor statistische analyse van motiefscoregegevens werden p-waarden voor niet-genormaliseerde scores berekend met behulp van Fishers exacte toets. P-waarden voor andere datasets werden berekend in R met behulp van de t-test van Student of ANOVA.
Geselecteerde faagklonen en fagen zonder inserts werden intraveneus geïnjecteerd via de staartvene (2×1010 fagen/dier in 300 μl PBS). Tien minuten vóór de perfusie en daaropvolgende fixatie werden dezelfde dieren intraveneus geïnjecteerd met 100 μl DyLight594-gelabeld lectine (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minuten na de faaginjectie werden ratten via het hart geperfuseerd met 50 ml PBS, gevolgd door 50 ml 4% PFA/PBS. Hersenmonsters werden bovendien gedurende de nacht gefixeerd in 4% PFA/PBS en gedurende de nacht geweekt in 30% sucrose bij 4 °C. De monsters worden snel ingevroren in het OCT-mengsel. Immunohistochemische analyse van ingevroren monsters werd uitgevoerd bij kamertemperatuur op 30 µm cryocoupes geblokkeerd met 1% BSA en geïncubeerd met polyklonale FITC-gelabelde antilichamen tegen T7-faag (Novus NB 600-376A) bij 4 °C. Incubeer gedurende de nacht. Tot slot werden de coupes driemaal gewassen met PBS en onderzocht met een confocale lasermicroscoop (Leica TCS SP5).
Alle peptiden met een minimale zuiverheid van 98% werden gesynthetiseerd door GenScript USA, gebiotinyleerd en gevriesdroogd. Biotine wordt gebonden via een extra drievoudige glycine-spacer aan de N-terminus. Controleer alle peptiden met massaspectrometrie.
Streptavidine (Sigma S0677) werd gemengd met een 5-voudige equimolaire overmaat gebiotinyleerd peptide, gebiotinyleerd BACE1-remmend peptide, of een combinatie (3:1-verhouding) van gebiotinyleerd BACE1-remmend peptide en BACE1-remmend peptide in 5-10% DMSO/geïncubeerd in PBS, 1 uur bij kamertemperatuur vóór injectie. Streptavidine-geconjugeerde peptiden werden intraveneus geïnjecteerd in een dosis van 10 mg/kg in een van de staartvenen van ratten met een hersenholte.
De concentratie streptavidine-peptidecomplexen werd bepaald met ELISA. Nunc Maxisorp microtiterplaten (Sigma) werden 's nachts bij 4 °C gecoat met 1,5 μg/ml muizen-anti-streptavidine-antilichaam (Thermo, MA1-20011). Na blokkering (blokkeringsbuffer: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatine, 1% BSA) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, werd de plaat gedurende 3 seconden gewassen met 0,05% Tween-20/PBS (wasbuffer). CSF- en plasmamonsters werden toegevoegd aan wells verdund met blokkeringsbuffer (plasma 1:10.000, CSF 1:115). De plaat werd vervolgens een nacht geïncubeerd bij 4 °C met detectie-antilichaam (1 μg/ml, anti-streptavidine-HRP, Novus NB120-7239). Na drie wasstappen werd streptavidine gedetecteerd door incubatie in TMB-substraatoplossing (Roche) gedurende maximaal 20 minuten. Nadat de kleurontwikkeling met 1 M H₂SO₄ is gestopt, wordt de absorptie gemeten bij 450 nm.
De functie van het streptavidine-peptide-BACE1-remmercomplex werd beoordeeld met Aβ(1-40) ELISA volgens het protocol van de fabrikant (Wako, 294-64701). Kort gezegd: CSF-monsters werden verdund in standaardverdunningsmiddel (1:23) en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C in 96-wells platen gecoat met BNT77-capture-antilichaam. Na vijf wasstappen werd HRP-geconjugeerd BA27-antilichaam toegevoegd en gedurende 2 uur geïncubeerd bij 4 °C, gevolgd door vijf wasstappen. Aβ(1–40) werd gedetecteerd door incubatie in TMB-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Nadat de kleurontwikkeling met de stopoplossing is gestopt, wordt de absorptie gemeten bij 450 nm. Plasmamonsters werden onderworpen aan vastefase-extractie voorafgaand aan Aβ(1–40) ELISA. Plasma werd toegevoegd aan 0,2% DEA (Sigma) in 96-wells platen en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na het achtereenvolgens wassen van de SPE-platen (Oasis, 186000679) met water en 100% methanol, werden plasmamonsters aan de SPE-platen toegevoegd en werd alle vloeistof verwijderd. De monsters werden gewassen (eerst met 5% methanol, vervolgens met 30% methanol) en geëlueerd met 2% NH4OH/90% methanol. Na het eluaat gedurende 99 minuten bij 55 °C met een constante N2-stroom te hebben gedroogd, werden de monsters gereduceerd in standaardverdunningsmiddelen en werd Aβ(1–40) gemeten zoals hierboven beschreven.
Hoe dit artikel te citeren: Urich, E. et al. Vrachtafgifte aan de hersenen met behulp van transitpeptiden die in vivo zijn geïdentificeerd. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB en Moos T. Toediening van macromoleculaire geneesmiddelen aan de hersenen met behulp van gerichte therapie. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. en Martinez-Martinez, P. Afgifte van peptide- en eiwitgeneesmiddelen door de bloed-hersenbarrière. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM De bloed-hersenbarrière: een knelpunt in de ontwikkeling van geneesmiddelen voor de hersenen. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG en Byrd, A. Vooruitzichten voor verbeterde medicijnafgifte en -targeting in de hersenen via de plexus choroïdeus-CSF-route. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisering van biofarmaceutica met moleculaire Trojaanse paarden voor toediening in de hersenen. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-receptor-gemedieerd peptidetransport over de bloed-hersenbarrière. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Vergroot de hersenpenetratie en effectiviteit van therapeutische antilichamen met behulp van monovalente moleculaire shuttles. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transferrinereceptor (TfR)-transport bepaalt de opname van affiniteitsvarianten van TfR-antilichamen in de hersenen. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).