Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Toont een carrousel met drie dia's tegelijk. Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door drie dia's tegelijk te bladeren, of gebruik de schuifregelaars aan het einde om door drie dia's tegelijk te bladeren.
De bloed-hersenbarrière verhindert dat biofarmaceutische middelen hun doelwitten in het centrale zenuwstelsel bereiken, waardoor een effectieve behandeling van neurologische aandoeningen wordt belemmerd. Om nieuwe transporteiwitten in de hersenen in vivo te ontdekken, introduceerden we een T7-faagpeptidenbibliotheek en verzamelden we sequentieel bloed en hersenvocht (CSF) met behulp van een gecanuleerd, bewust model met een grote pool van ratten. Specifieke faagklonen werden sterk verrijkt in het CSF na vier selectierondes. Tests van individuele kandidaatpeptiden lieten een verrijking van meer dan 1000-voudig in het CSF zien. De bioactiviteit van de peptide-gemedieerde aflevering aan de hersenen werd bevestigd door een reductie van 40% in het amyloïde-β-niveau in het hersenvocht met behulp van een BACE1-peptide-remmer gekoppeld aan het geïdentificeerde nieuwe transportpeptide. Deze resultaten suggereren dat de peptiden die zijn geïdentificeerd met behulp van in vivo faagselectiemethoden nuttige dragers kunnen zijn voor systemische aflevering van macromoleculen aan de hersenen met een therapeutisch effect.
Onderzoek naar therapieën gericht op het centrale zenuwstelsel (CZS) heeft zich grotendeels gericht op het identificeren van geoptimaliseerde geneesmiddelen en middelen met CZS-gerichte eigenschappen, met minder aandacht voor het ontdekken van de mechanismen die actieve geneesmiddelafgifte aan de hersenen mogelijk maken. Dit begint nu te veranderen, aangezien geneesmiddelafgifte, met name van grote moleculen, een integraal onderdeel is van de moderne neurowetenschappelijke geneesmiddelenontwikkeling. De omgeving van het centrale zenuwstelsel wordt goed beschermd door het cerebrovasculaire barrièresysteem, bestaande uit de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​en de bloed-hersenbarrière (BCSFB)¹, waardoor het lastig is om geneesmiddelen naar de hersenen te transporteren¹,². Naar schatting worden bijna alle geneesmiddelen met grote moleculen en meer dan 98% van de geneesmiddelen met kleine moleculen uit de hersenen verwijderd³. Daarom is het van groot belang om nieuwe transportsystemen in de hersenen te identificeren die zorgen voor een efficiënte en specifieke afgifte van therapeutische geneesmiddelen aan het CZS⁴,⁵. De BBB en BCSFB bieden echter ook een uitstekende mogelijkheid voor geneesmiddelafgifte, omdat ze via het uitgebreide vaatstelsel alle structuren van de hersenen kunnen binnendringen. De huidige inspanningen om niet-invasieve methoden voor toediening aan de hersenen te gebruiken, zijn grotendeels gebaseerd op het mechanisme van receptor-gemedieerd transport (PMT) via de endogene BBB6-receptor. Ondanks recente belangrijke vooruitgang met behulp van de transferrinereceptorroute7,8 is verdere ontwikkeling van nieuwe toedieningssystemen met verbeterde eigenschappen noodzakelijk. Ons doel was daarom om peptiden te identificeren die in staat zijn tot CSF-transport, aangezien deze in principe gebruikt zouden kunnen worden om macromoleculen naar het centrale zenuwstelsel te transporteren of om nieuwe receptorroutes te openen. Met name specifieke receptoren en transporters van het cerebrovasculaire systeem (BBB en BSCFB) kunnen dienen als potentiële doelwitten voor de actieve en specifieke toediening van biofarmaceutische geneesmiddelen. Cerebrospinale vloeistof (CSF) is een secretieproduct van de plexus choroideus (CS) en staat in direct contact met de interstitiële vloeistof van de hersenen via de subarachnoïdale ruimte en de ventrikelruimte4. Recent is aangetoond dat subarachnoïdale cerebrospinale vloeistof excessief diffundeert in het interstitium van de hersenen9. We hopen de parenchymruimte te bereiken via dit subarachnoïdale instroomkanaal of rechtstreeks via de bloed-hersenbarrière. Om dit te bereiken, hebben we een robuuste in vivo fagenselectiestrategie geïmplementeerd die idealiter peptiden identificeert die via een van deze twee verschillende routes worden getransporteerd.
We beschrijven nu een sequentiële in vivo faagdisplay-screeningmethode met CSF-bemonstering in combinatie met high-throughput sequencing (HTS) om de eerste selectierondes met de hoogste bibliotheekdiversiteit te monitoren. De screening werd uitgevoerd op bewuste ratten met een permanent geïmplanteerde canule in de grote cisterna (CM) om bloedverontreiniging te voorkomen. Belangrijk is dat deze aanpak zowel peptiden selecteert die gericht zijn op de hersenen als peptiden met transportactiviteit over de cerebrovasculaire barrière. We gebruikten T7-fagen vanwege hun kleine formaat (~60 nm)¹⁰ en veronderstelden dat ze geschikt zijn voor het transport van blaasjes die transcellulaire passage van de endotheel- en/of epitheliale-medullabarrière mogelijk maken. Na vier panningrondes werden faagpopulaties geïsoleerd die een sterke in vivo CSF-verrijking en associatie met cerebrale microvaten vertoonden. Belangrijk is dat we onze bevindingen konden bevestigen door aan te tonen dat de geprefereerde en chemisch gesynthetiseerde beste kandidaatpeptiden in staat zijn om eiwitlading naar het hersenvocht te transporteren. Allereerst werden de farmacodynamische effecten op het centrale zenuwstelsel vastgesteld door een belangrijk transportpeptide te combineren met een remmer van het BACE1-peptide. Naast het aantonen dat in vivo functionele screeningstrategieën nieuwe transportpeptiden in de hersenen kunnen identificeren als effectieve dragers van eiwitladingen, verwachten we dat soortgelijke functionele selectiemethoden ook belangrijk zullen worden bij het identificeren van nieuwe transportroutes in de hersenen.
Op basis van plaquevormende eenheden (PFU) werd na de faagverpakkingsstap een bibliotheek van willekeurige 12-mer lineaire T7-faagpeptiden met een diversiteit van ongeveer 10⁹ ontworpen en gecreëerd (zie Materialen en Methoden). Het is belangrijk op te merken dat we deze bibliotheek zorgvuldig hebben geanalyseerd vóór in vivo panning. PCR-amplificatie van faagbibliotheekmonsters met behulp van gemodificeerde primers genereerde amplicons die direct toepasbaar waren voor HTS (Aanvullende Fig. 1a). Vanwege a) HTS11-sequentiefouten, b) de invloed op de kwaliteit van primers (NNK)1-12 en c) de aanwezigheid van wildtype (wt) fagen (skeletinserts) in de standby-bibliotheek, werd een sequentiefilterprocedure geïmplementeerd om alleen geverifieerde sequentie-informatie te extraheren (Aanvullende Fig. 1b). Deze filterstappen zijn van toepassing op alle HTS-sequentiebibliotheken. Voor de standaardbibliotheek werden in totaal 233.868 reads verkregen, waarvan 39% voldeed aan de filtercriteria en werd gebruikt voor bibliotheekanalyse en selectie voor volgende rondes (Aanvullende figuur 1c-e). De reads waren overwegend veelvouden van 3 basenparen lang, met een piek bij 36 nucleotiden (Aanvullende figuur 1c), wat het bibliotheekontwerp (NNK) 1-12 bevestigt. Opvallend is dat ongeveer 11% van de bibliotheekleden een 12-dimensionale wildtype (wt) backbone PAGISRELVDKL-insert bevatte, en bijna de helft van de sequenties (49%) inserties of deleties bevatte. De HTS van de bibliotheek bevestigde de hoge diversiteit aan peptiden in de bibliotheek: meer dan 81% van de peptidesequenties werd slechts één keer gevonden en slechts 1,5% kwam in ≥4 kopieën voor (Aanvullende figuur 2a). De frequenties van aminozuren (aa) op alle 12 posities in het repertoire correleerden goed met de frequenties die verwacht werden voor het aantal codons gegenereerd door het gedegenereerde NKK-repertoire (Aanvullende Fig. 2b). De waargenomen frequentie van aa-residuen gecodeerd door deze inserts correleerde goed met de berekende frequentie (r = 0,893) (Aanvullende Fig. 2c). De voorbereiding van faagbibliotheken voor injectie omvat de stappen van amplificatie en verwijdering van endotoxine. Eerder is aangetoond dat dit de diversiteit van faagbibliotheken potentieel kan verminderen12,13. Daarom hebben we een op platen geamplificeerde faagbibliotheek gesequenceerd die een endotoxineverwijdering had ondergaan en deze vergeleken met de oorspronkelijke bibliotheek om de frequentie van AA te schatten. Er werd een sterke correlatie (r = 0,995) waargenomen tussen de oorspronkelijke pool en de geamplificeerde en gezuiverde pool (Aanvullende Fig. 2d), wat aangeeft dat competitie tussen klonen die op platen met T7-faag zijn geamplificeerd geen grote vertekening veroorzaakte. Deze vergelijking is gebaseerd op de frequentie van tripeptide-motieven in elke bibliotheek, aangezien de diversiteit van de bibliotheken (~109) zelfs met HTS niet volledig kan worden vastgelegd. Frequentieanalyse van aminozuren op elke positie onthulde een kleine positieafhankelijke bias in de laatste drie posities van het ingevoerde repertoire (aanvullende figuur 2e). Concluderend kunnen we stellen dat de kwaliteit en diversiteit van de bibliotheek acceptabel waren en dat er slechts kleine veranderingen in diversiteit werden waargenomen als gevolg van de amplificatie en preparatie van de faagbibliotheken tussen de verschillende selectierondes.
Seriële bemonstering van hersenvocht kan worden uitgevoerd door chirurgisch een canule in de CM van bewuste ratten te implanteren om de identificatie van intraveneus (iv) geïnjecteerde T7-fagen via de BBB en/of BCSFB te vergemakkelijken (Fig. 1a-b). We gebruikten twee onafhankelijke selectiearmen (armen A en B) in de eerste drie rondes van in vivo-selectie (Fig. 1c). We verhoogden geleidelijk de strengheid van de selectie door de totale hoeveelheid geïntroduceerde fagen in de eerste drie rondes te verlagen. Voor de vierde panningronde combineerden we monsters van armen A en B en voerden we drie extra onafhankelijke selecties uit. Om de in vivo-eigenschappen van T7-faagdeeltjes in dit model te bestuderen, werd wildtype-faag (PAGISRELVDKL master insert) via de staartader in ratten geïnjecteerd. Terugwinning van fagen uit hersenvocht en bloed op verschillende tijdstippen toonde aan dat relatief kleine T7-icosahedrale fagen een snelle initiële klaringfase uit het bloedcompartiment hadden (Aanvullende Fig. 3). Op basis van de toegediende titers en het bloedvolume van de ratten berekenden we dat slechts ongeveer 1% van het gewicht van de faag van de toegediende dosis in het bloed werd gedetecteerd 10 minuten na intraveneuze injectie. Na deze aanvankelijke snelle daling werd een langzamere primaire klaring gemeten met een halfwaardetijd van 27,7 minuten. Belangrijk is dat slechts zeer weinig fagen werden teruggevonden in het hersenvocht, wat wijst op een lage achtergrond voor de migratie van wildtype fagen naar het hersenvocht (aanvullende figuur 3). Gemiddeld werd slechts ongeveer 1 x 10⁻³% titer T7-faag in het bloed en 4 x 10⁻⁸% van de initieel toegediende fagen gedetecteerd in het hersenvocht gedurende de gehele bemonsteringsperiode (0-250 min). Opvallend is dat de halfwaardetijd (25,7 min) van wildtype fagen in het hersenvocht vergelijkbaar was met die in het bloed. Deze gegevens tonen aan dat de barrière tussen het hersenvochtcompartiment en het bloed intact is bij ratten met een CM-canule, waardoor in vivo selectie van faagbibliotheken mogelijk is om klonen te identificeren die gemakkelijk vanuit het bloed naar het hersenvochtcompartiment worden getransporteerd.
(a) Het opzetten van een methode voor het opnieuw bemonsteren van hersenvocht (CSF) uit een grote pool. (b) Diagram dat de cellulaire locatie van de barrière van het centrale zenuwstelsel (CZS) en de selectiestrategie toont die gebruikt wordt om peptiden te identificeren die de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​passeren. (c) Stroomschema van in vivo faagdisplay-screening. In elke selectieronde werden fagen (dieridentificaties binnen de pijlen) intraveneus geïnjecteerd. Twee onafhankelijke alternatieve takken (A, B) worden apart gehouden tot de 4e selectieronde. Voor selectierondes 3 en 4 werd elke uit CSF geëxtraheerde faagkloon handmatig gesequenceerd. (d) Kinetiek van fagen geïsoleerd uit bloed (rode cirkels) en hersenvocht (groene driehoeken) tijdens de eerste selectieronde in twee gecanuleerde ratten na intraveneuze injectie van de T7-peptidebibliotheek (2 x 10¹² fagen/dier). Blauwe vierkanten geven de gemiddelde initiële concentratie van fagen in het bloed weer, berekend op basis van de hoeveelheid geïnjecteerde fagen, rekening houdend met het totale bloedvolume. De zwarte vierkanten geven het snijpunt aan van de y-lijn, geëxtrapoleerd uit de fagenconcentraties in het bloed. (e,f) Toont de relatieve frequentie en verdeling van alle mogelijke overlappende tripeptide-motieven die in het peptide zijn gevonden. Het aantal gevonden motieven in 1000 metingen wordt weergegeven. Significante (p < 0,001) verrijkte motieven zijn gemarkeerd met rode stippen. (e) Correlatie-spreidingsdiagram dat de relatieve frequentie van het tripeptide-motief van de geïnjecteerde bibliotheek vergelijkt met bloedafgeleide fagen van dieren #1.1 en #1.2. (f) Correlatie-spreidingsdiagram dat de relatieve frequenties van dierlijke fagen-tripeptide-motieven #1.1 en #1.2, geïsoleerd in bloed en hersenvocht, vergelijkt. (g, h) Sequentie-ID-weergave van fagen verrijkt in bloed (g) versus geïnjecteerde bibliotheken en fagen verrijkt in hersenvocht (h) versus bloed na een ronde in vivo-selectie in beide dieren. De grootte van de éénlettercode geeft aan hoe vaak dat aminozuur op die positie voorkomt. Groen = polair, paars = neutraal, blauw = basisch, rood = zuur en zwart = hydrofobe aminozuren. Figuur 1a, b is ontworpen en geproduceerd door Eduard Urich.
We injecteerden een faagpeptidebibliotheek in twee CM-instrumentratten (clades A en B) en isoleerden fagen uit hersenvocht en bloed (Figuur 1d). De aanvankelijke snelle klaring van de bibliotheek was minder uitgesproken in vergelijking met de wildtype faag. De gemiddelde halfwaardetijd van de geïnjecteerde bibliotheek in beide dieren was 24,8 minuten in het bloed, vergelijkbaar met wildtype faag, en 38,5 minuten in het hersenvocht. Bloed- en hersenvochtmonsters van fagen van elk dier werden onderworpen aan HTS en alle geïdentificeerde peptiden werden geanalyseerd op de aanwezigheid van een kort tripeptidemotief. Tripeptidemotieven werden gekozen omdat ze een minimale basis bieden voor structuurvorming en peptide-eiwitinteracties14,15. We vonden een goede correlatie in de verdeling van motieven tussen de geïnjecteerde faagbibliotheek en klonen die uit het bloed van beide dieren waren geëxtraheerd (Figuur 1e). De gegevens geven aan dat de samenstelling van de bibliotheek slechts marginaal verrijkt is in het bloedcompartiment. De frequenties van aminozuren en consensussequenties werden verder geanalyseerd op elke positie met behulp van een aangepaste versie van de Weblogo16-software. Interessant genoeg vonden we een sterke verrijking van glycineresiduen in het bloed (Fig. 1g). Bij vergelijking van bloed met klonen geselecteerd uit hersenvocht werden sterke selectie en enige deselectie van motieven waargenomen (Fig. 1f), en bepaalde aminozuren waren bij voorkeur aanwezig op vooraf bepaalde posities in de 12-mer peptiden (Fig. 1h). Opvallend is dat de individuele dieren significant verschilden in hersenvocht, terwijl de verrijking van glycine in het bloed bij beide dieren werd waargenomen (Aanvullende Fig. 4a-j). Na strenge filtering van de sequentiedata in het hersenvocht van dieren #1.1 en #1.2 werden in totaal 964 en 420 unieke 12-mer peptiden verkregen (Aanvullende Fig. 1d-e). De geïsoleerde faagklonen werden vermenigvuldigd en onderworpen aan een tweede ronde van in vivo selectie. Fagen die uit de tweede selectieronde waren geëxtraheerd, werden in elk dier onderworpen aan HTS en alle geïdentificeerde peptiden werden gebruikt als input voor een motiefherkenningsprogramma om het voorkomen van tripeptide-motieven te analyseren (Fig. 2a, b, ef). In vergelijking met de eerste cyclus van de fagen die uit het hersenvocht (CSF) werden teruggevonden, observeerden we verdere selectie en deselectie van veel motieven in het CSF in takken A en B (Fig. 2). Een netwerkidentificatiealgoritme werd toegepast om te bepalen of ze verschillende patronen van consistente sequentie vertegenwoordigden. Een duidelijke gelijkenis werd waargenomen tussen de 12-dimensionale sequenties die door CSF werden teruggevonden in alternatieve clade A (Fig. 2c, d) en clade B (Fig. 2g, h). De gecombineerde analyse in elke tak onthulde verschillende selectieprofielen voor 12-mer peptiden (Aanvullende Fig. 5c,d) en een toename van de CSF/bloed-titerverhouding in de loop van de tijd voor gecombineerde klonen na de tweede selectieronde in vergelijking met de eerste selectieronde (Aanvullende Fig. 5e).
Verrijking van motieven en peptiden in hersenvocht door twee opeenvolgende rondes van in vivo functionele faagdisplayselectie.
Alle fagen uit het hersenvocht die in de eerste ronde van elk dier (dieren #1.1 en #1.2) werden teruggewonnen, werden vermenigvuldigd, HT-gesequenced en samen opnieuw geïnjecteerd (2 x 10¹⁰ fagen/dier) in 2 ratten met een SM-canule (#1.1 → #1.1, 2.1 en 2.2, 1.2 → 2.3 en 2.4). (a,b,e,f) Correlatie-spreidingsdiagrammen die de relatieve frequentie van tripeptide-motieven van alle uit hersenvocht afgeleide fagen in de eerste en tweede selectieronde vergelijken. Relatieve frequentie en verdeling van motieven die alle mogelijke overlappende tripeptiden vertegenwoordigen die in peptiden in beide oriëntaties zijn gevonden. Het aantal gevonden motieven in 1000 metingen wordt weergegeven. Motieven die significant (p < 0,001) werden geselecteerd of uitgesloten in een van de vergeleken bibliotheken zijn gemarkeerd met rode stippen. (c, d, g, h) Sequentielogo-weergave van alle CSF-rijke sequenties van 12 aminozuren lang, gebaseerd op ronde 2 en 1 van in vivo-selectie. De grootte van de éénlettercode geeft aan hoe vaak dat aminozuur op die positie voorkomt. Om het logo weer te geven, wordt de frequentie van CSF-sequenties die uit individuele dieren tussen twee selectierondes zijn geëxtraheerd, vergeleken en worden de verrijkte sequenties in de tweede ronde weergegeven: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 en (h) #1.2–#2.4. De meest verrijkte aminozuren op een bepaalde positie in (c, d) dieren nr. 2.1 en nr. 2.2 of (g, h) in dieren nr. 2.3 en nr. 2.4 worden in kleur weergegeven. Groen = polair, paars = neutraal, blauw = basisch, rood = zuur en zwart = hydrofobe aminozuren.
Na de derde selectieronde identificeerden we 124 unieke peptidesequenties (#3.1 en #3.2) uit 332 CSF-gereconstitueerde faagklonen die waren geïsoleerd uit twee dieren (Aanvullende figuur 6a). De sequentie LGSVS (18,7%) had het hoogste relatieve aandeel, gevolgd door de wildtype-inserts PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) en SARGSWREIVSLS (2,2%). In de laatste, vierde ronde voegden we twee onafhankelijk geselecteerde takken samen van drie verschillende dieren (Figuur 1c). Van de 925 gesequenceerde faagklonen die uit CSF waren geïsoleerd, vonden we in de vierde ronde 64 unieke peptidesequenties (Aanvullende figuur 6b), waarbij het relatieve aandeel van de wildtype-faag daalde tot 0,8%. De meest voorkomende CSF-klonen in de vierde ronde waren LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) en RLSSVDSDLSGC (3,2%). De lengtevariatie van de geselecteerde peptiden is te wijten aan nucleotide-inserties/deleties of premature stopcodons in de primers van de bibliotheek bij gebruik van gedegenereerde codons voor het ontwerpen van de NNK-bibliotheek. Premature stopcodons genereren kortere peptiden en worden geselecteerd omdat ze het gunstige aminozuurmotief bevatten. Langere peptiden kunnen het gevolg zijn van inserties/deleties in de primers van de synthetische bibliotheken. Hierdoor wordt het ontworpen stopcodon buiten het leesraam geplaatst en wordt het gelezen totdat er een nieuw stopcodon stroomafwaarts verschijnt. Over het algemeen hebben we verrijkingsfactoren berekend voor alle vier selectierondes door de invoergegevens te vergelijken met de uitvoergegevens van de monsters. Voor de eerste screeningsronde gebruikten we wildtype faagtiters als niet-specifieke achtergrondreferentie. Interessant genoeg was de negatieve faagselectie zeer sterk in de eerste CSF-cyclus, maar niet in het bloed (Fig. 3a). Dit kan te wijten zijn aan de lage waarschijnlijkheid van passieve diffusie van de meeste leden van de peptidebibliotheek naar het CSF-compartiment, of aan het feit dat fagen over het algemeen efficiënter in de bloedbaan worden vastgehouden of verwijderd dan bacteriofagen. In de tweede panningronde werd echter een sterke selectie van fagen in het CSF waargenomen in beide clades, wat suggereert dat de vorige ronde verrijkt was met fagen die peptiden vertonen die de opname in het CSF bevorderen (Fig. 3a). Opnieuw zonder significante verrijking in het bloed. Ook in de derde en vierde ronde waren de faagklonen significant verrijkt in het CSF. Door de relatieve frequentie van elke unieke peptidesequentie te vergelijken tussen de laatste twee selectierondes, vonden we dat de sequenties in de vierde selectieronde nog sterker verrijkt waren (Fig. 3b). In totaal werden 931 tripeptide-motieven geëxtraheerd uit alle 64 unieke peptidesequenties met behulp van beide peptideoriëntaties. De meest verrijkte motieven in de vierde ronde werden nader onderzocht op hun verrijkingsprofielen over alle rondes heen, vergeleken met de geïnjecteerde bibliotheek (drempelwaarde: 10% verrijking) (Aanvullende figuur 6c). Algemene selectiepatronen lieten zien dat de meeste bestudeerde motieven verrijkt waren in alle voorgaande rondes van beide selectietakken. Sommige motieven (bijv. SGL, VSG, LGS GSV) waren echter voornamelijk afkomstig uit alternatieve clade A, terwijl andere (bijv. FGW, RTN, WGF, NTR) verrijkt waren in alternatieve clade B.
Validatie van het CSF-transport van met CSF verrijkte, via fagen weergegeven peptiden en gebiotinyleerde leaderpeptiden gekoppeld aan streptavidine-payloads.
(a) Verrijkingsverhoudingen berekend in alle vier rondes (R1-R4) op basis van geïnjecteerde (input = I) faagtiters (PFU) en bepaalde CSF-faagtiters (output = O). Verrijkingsfactoren voor de laatste drie rondes (R2-R4) werden berekend door vergelijking met de vorige ronde en de eerste ronde (R1) met gewichtsgegevens. Open balken representeren hersenvocht, gearceerde balken representeren plasma. (***p<0,001, gebaseerd op de t-toets van Student). (b) Lijst van de meest voorkomende faagpeptiden, gerangschikt naar hun relatieve verhouding tot alle fagen verzameld in CSF na ronde 4 van selectie. De zes meest voorkomende faagklonen zijn gekleurd, genummerd en hun verrijkingsfactoren tussen ronde 3 en 4 van selectie worden weergegeven (inzetstukken). (c,d) De zes meest verrijkte faagklonen, lege faag- en parentale faagpeptidebibliotheken uit ronde 4 werden afzonderlijk geanalyseerd in een CSF-bemonsteringsmodel. CSF- en bloedmonsters werden verzameld op de aangegeven tijdstippen. (c) Gelijke hoeveelheden van 6 kandidaat-faagklonen (2 x 10¹⁰ fagen/dieren), lege fagen (#1779) (2 x 10¹⁰ fagen/dieren) en stock faagpeptidebibliotheken (2 x 10¹² fagen/dieren) werden afzonderlijk via de staartader aan het geïnjecteerde dier toegediend. De CSF-farmacokinetiek van elke geïnjecteerde faagkloon en faagpeptidebibliotheek in de loop van de tijd wordt weergegeven. (d) toont de gemiddelde CSF/bloed-verhouding voor alle teruggevonden fagen/ml gedurende de bemonsteringsperiode. (e) Vier synthetische leiderpeptiden en één gescrambelde controlepeptide werden via hun N-terminus met biotine aan streptavidine gekoppeld (tetrameerweergave), gevolgd door injectie (staartader intraveneus, 10 mg streptavidine/kg). Minstens drie geïntubeerde ratten (N = 3). CSF-monsters werden verzameld op de aangegeven tijdstippen en de streptavidineconcentraties werden gemeten met behulp van een CSF-anti-streptavidine ELISA (nd = niet gedetecteerd). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, gebaseerd op ANOVA-test). (f) Vergelijking van de aminozuursequentie van de meest verrijkte faagpeptidekloon #2002 (paars) met andere geselecteerde faagpeptideklonen uit de 4e selectieronde. Identieke en vergelijkbare aminozuurfragmenten zijn kleurgecodeerd.
Van alle verrijkte fagen in de vierde ronde (Fig. 3b) werden zes kandidaatklonen geselecteerd voor verdere individuele analyse in het CSF-monsternamemodel. Gelijke hoeveelheden van de zes kandidaat-faag-, lege faag- (zonder insert) en profaagpeptidebibliotheken werden geïnjecteerd in drie gecanuleerde CM-dieren, en de farmacokinetiek werd bepaald in CSF- (Fig. 3c) en bloedtesten (Aanvullende Fig. 7). Alle geteste faagklonen richtten zich op het CSF-compartiment op een niveau dat 10-1000 keer hoger was dan dat van de lege controlefaag (#1779). Klonen #2020 en #2077 hadden bijvoorbeeld ongeveer 1000 keer hogere CSF-titers dan de controlefaag. Het farmacokinetische profiel van elk geselecteerd peptide is verschillend, maar ze hebben allemaal een hoog CSF-homingvermogen. We observeerden een constante afname in de tijd voor klonen #1903 en #2011, terwijl voor klonen #2077, #2002 en #2009 een toename gedurende de eerste 10 minuten zou kunnen duiden op actief transport, maar dit moet nog worden geverifieerd. Klonen #2020, #2002 en #2077 stabiliseerden op een hoog niveau, terwijl de CSF-concentratie van kloon #2009 langzaam afnam na de aanvankelijke toename. Vervolgens vergeleken we de relatieve frequentie van elke CSF-kandidaat met de bloedconcentratie (Fig. 3d). De correlatie tussen de gemiddelde titer van elke CSF-kandidaat en de bloedtiter op alle meetmomenten toonde aan dat drie van de zes kandidaten significant verrijkt waren in het bloed-CSF. Interessant genoeg vertoonde kloon #2077 een hogere stabiliteit in het bloed (Aanvullende figuur 7). Om te bevestigen dat de peptiden zelf in staat zijn om actief andere ladingen dan faagdeeltjes naar het CSF-compartiment te transporteren, synthetiseerden we vier leaderpeptiden die aan de N-terminus, waar de peptiden zich aan het faagdeeltje hechten, met biotine waren gederivatiseerd. Gebiotinyleerde peptiden (nrs. 2002, 2009, 2020 en 2077) werden geconjugeerd met streptavidine (SA) om multimeervormen te verkrijgen die de faagstructuur enigszins nabootsen. Deze vorm stelde ons ook in staat om de SA-blootstelling in bloed en hersenvocht te meten als ladingtransporterende eiwitpeptiden. Belangrijk is dat de faaggegevens vaak konden worden gereproduceerd wanneer synthetische peptiden in deze SA-geconjugeerde vorm werden toegediend (Fig. 3e). De gescrambelde peptiden vertoonden een lagere initiële blootstelling en een snellere klaring uit het CSF, met ondetecteerbare niveaus binnen 48 uur. Om inzicht te krijgen in de transportroutes van deze peptide-faagklonen naar de CSF-ruimte, analyseerden we de lokalisatie van individuele faagpeptiden met behulp van immunohistochemie (IHC) om faagdeeltjes direct te detecteren 1 uur na intraveneuze injectie in vivo. Opvallend is dat klonen #2002, #2077 en #2009 konden worden gedetecteerd door sterke kleuring in hersencapillairen, terwijl controlefaag (#1779) en kloon #2020 niet werden gedetecteerd (Aanvullende figuur 8). Dit suggereert dat deze peptiden bijdragen aan het effect op de hersenen door de bloed-hersenbarrière te passeren. Verdere gedetailleerde analyse is nodig om deze hypothese te testen, aangezien de BSCFB-route mogelijk ook betrokken is. Bij het vergelijken van de aminozuursequentie van de meest verrijkte kloon (#2002) met andere geselecteerde peptiden, werd opgemerkt dat sommige ervan vergelijkbare aminozuurverlengingen hebben, wat kan duiden op een vergelijkbaar transportmechanisme (Fig. 3f).
Vanwege het unieke plasmaprofiel en de significante toename van de CSF-concentratie in de loop van de tijd, werd faagdisplaykloon #2077 verder onderzocht gedurende een langere periode van 48 uur. Deze kloon was in staat de snelle toename van de CSF-concentratie te reproduceren die werd waargenomen in samenhang met aanhoudende SA-niveaus (Fig. 4a). Wat betreft de andere geïdentificeerde faagklonen, vertoonde #2077 een sterke kleuring voor hersencapillairen en een significante colocalisatie met het capillaire marker-lectine bij hogere resolutie, en mogelijk ook enige kleuring in de parenchymruimte (Figuur 4b). Om te onderzoeken of peptide-gemedieerde farmacologische effecten in het centrale zenuwstelsel konden worden verkregen, voerden we een experiment uit waarbij gebiotinyleerde versies van i) het #2077 transitpeptide en ii) het BACE1-remmerpeptide werden gemengd met SA in twee verschillende verhoudingen. Voor de ene combinatie gebruikten we alleen de BACE1-remmerpeptide en voor de andere een verhouding van 1:3 van BACE1-remmerpeptide tot #2077-peptide. Beide monsters werden intraveneus toegediend en de concentraties van bèta-amyloïde peptide 40 (Aβ40) in bloed en hersenvocht werden in de loop van de tijd gemeten. Aβ40 werd in het hersenvocht gemeten omdat dit de BACE1-remming in het hersenparenchym weerspiegelt. Zoals verwacht verlaagden beide complexen de bloedspiegels van Aβ40 significant (Fig. 4c, d). Echter, alleen monsters die een mengsel bevatten van peptide nr. 2077 en een aan SA gekoppelde remmer van het BACE1-peptide veroorzaakten een significante afname van Aβ40 in het hersenvocht (Fig. 4c). De gegevens tonen aan dat peptide nr. 2077 in staat is het 60 kDa SA-eiwit naar het centrale zenuwstelsel te transporteren en tevens farmacologische effecten induceert met aan SA gekoppelde remmers van het BACE1-peptide.
(a) Klonale injectie (2 × 10 fagen/dier) van T7-faag, waarbij de langetermijnfarmacokinetische profielen van CSF-peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) en niet-geïnjecteerde controlefaag (#1779) in ten minste drie met CM geïntubeerde ratten werden weergegeven. (b) Confocale microscopische afbeelding van representatieve corticale microvaten in met fagen geïnjecteerde ratten (2 × 10 10 fagen/dier), met tegenkleuring van peptide #2077 en vaten (lectine). Deze faagklonen werden toegediend aan 3 ratten en mochten 1 uur circuleren vóór perfusie. De hersenen werden in coupes gesneden en gekleurd met polyklonale FITC-gelabelde antilichamen tegen de T7-faagcapside. Tien minuten vóór perfusie en daaropvolgende fixatie werd DyLight594-gelabelde lectine intraveneus toegediend. Fluorescentiebeelden tonen lectinekleuring (rood) van de luminale zijde van microvaten en fagen (groen) in het lumen van capillairen en perivasculair hersenweefsel. De schaalbalk komt overeen met 10 µm. (c, d) Gebiotinyleerd BACE1-remmend peptide, alleen of in combinatie met gebiotinyleerd transitpeptide #2077, werd gekoppeld aan streptavidine, gevolgd door intraveneuze injectie van ten minste drie gecanuleerde CM-ratten (10 mg streptavidine/kg). De door BACE1-peptide-remmer gemedieerde reductie van Aβ40 werd gemeten met een Aβ1-40 ELISA in bloed (rood) en hersenvocht (oranje) op de aangegeven tijdstippen. Voor de duidelijkheid is een stippellijn op de grafiek getekend op een schaal van 100%. (c) Percentage reductie van Aβ40 in bloed (rode driehoeken) en hersenvocht (oranje driehoeken) bij ratten behandeld met streptavidine geconjugeerd aan transitpeptide #2077 en BACE1-remmend peptide in een verhouding van 3:1. (d) Percentage reductie van Aβ40 in bloed (rode cirkels) en hersenvocht (oranje cirkels) bij ratten behandeld met alleen streptavidine gekoppeld aan een BACE1-remmend peptide. De Aβ-concentratie in de controlegroep was 420 pg/ml (standaarddeviatie = 101 pg/ml).
Fagedisplay is met succes toegepast in verschillende gebieden van biomedisch onderzoek17. Deze methode is gebruikt voor in vivo studies naar vasculaire diversiteit18,19 en voor studies gericht op cerebrale bloedvaten20,21,22,23,24,25,26. In deze studie hebben we de toepassing van deze selectiemethode uitgebreid, niet alleen voor de directe identificatie van peptiden die zich richten op cerebrale bloedvaten, maar ook voor de ontdekking van kandidaten met actieve transporteigenschappen om de bloed-hersenbarrière te passeren. We beschrijven nu de ontwikkeling van een in vivo selectieprocedure bij geïntubeerde ratten met CM en tonen het potentieel ervan aan om peptiden met CSF-homing-eigenschappen te identificeren. Door gebruik te maken van de T7-fage die een bibliotheek van willekeurige peptiden van 12 aminozuren presenteert, konden we aantonen dat de T7-fage klein genoeg is (ongeveer 60 nm in diameter)10 om zich aan te passen aan de bloed-hersenbarrière en zo de bloed-hersenbarrière of de plexus choroideus direct te passeren. We hebben vastgesteld dat het oogsten van hersenvocht (CSF) uit gecanuleerde CM-ratten een goed gecontroleerde in vivo functionele screeningsmethode is, en dat de geëxtraheerde faag niet alleen aan de bloedvaten bindt, maar ook functioneert als transporteur over de bloed-hersenbarrière. Door gelijktijdig bloed af te nemen en HTS toe te passen op CSF- en bloedafgeleide fagen, hebben we bovendien bevestigd dat onze keuze voor CSF niet werd beïnvloed door bloedverrijking of geschiktheid voor expansie tussen selectierondes. Het bloedcompartiment maakt echter wel deel uit van de selectieprocedure, aangezien fagen die het CSF-compartiment kunnen bereiken, lang genoeg in de bloedbaan moeten overleven en circuleren om zich in de hersenen te verrijken. Om betrouwbare sequentie-informatie uit ruwe HTS-gegevens te halen, hebben we filters geïmplementeerd die zijn aangepast aan platformspecifieke sequentiefouten in de analyseworkflow. Door kinetische parameters in de screeningmethode op te nemen, bevestigden we de snelle farmacokinetiek van wildtype T7-fagen (t½ ~ 28 min) in bloed24, 27, 28 en bepaalden we ook hun halfwaardetijd in hersenvocht (t½ ~ 26 min per minuut). Ondanks vergelijkbare farmacokinetische profielen in bloed en hersenvocht, kon slechts 0,001% van de bloedconcentratie van fagen in het hersenvocht worden gedetecteerd, wat wijst op een lage achtergrondmobiliteit van wildtype T7-fagen over de bloed-hersenbarrière. Dit werk benadrukt het belang van de eerste selectieronde bij het gebruik van in vivo panningstrategieën, met name voor faagsystemen die snel uit de bloedsomloop worden verwijderd, aangezien slechts weinig klonen het centrale zenuwstelsel kunnen bereiken. De reductie in bibliotheekdiversiteit was in de eerste ronde dan ook zeer groot, aangezien uiteindelijk slechts een beperkt aantal klonen werd verzameld in dit zeer strikte hersenvochtmodel. Deze in vivo panningstrategie omvatte verschillende selectiestappen, zoals actieve accumulatie in het CSF-compartiment, overleving van klonen in het bloedcompartiment en snelle verwijdering van T7-faagklonen uit het bloed binnen de eerste 10 minuten (Fig. 1d en Aanvullende Fig. 4M). Na de eerste ronde werden dus verschillende faagklonen in het CSF geïdentificeerd, hoewel voor elk individueel dier dezelfde initiële pool werd gebruikt. Dit suggereert dat meerdere strenge selectiestappen voor bronbibliotheken met een groot aantal bibliotheekleden leiden tot een aanzienlijke vermindering van de diversiteit. Daarom zullen willekeurige gebeurtenissen een integraal onderdeel worden van het initiële selectieproces en het resultaat sterk beïnvloeden. Het is waarschijnlijk dat veel van de klonen in de oorspronkelijke bibliotheek een zeer vergelijkbare neiging tot CSF-verrijking hadden. Zelfs onder dezelfde experimentele omstandigheden kunnen de selectieresultaten echter verschillen als gevolg van het kleine aantal van elke specifieke kloon in de initiële pool.
De motieven die in het hersenvocht (CSF) verrijkt zijn, verschillen van die in het bloed. Interessant genoeg zagen we de eerste verschuiving naar glycine-rijke peptiden in het bloed van individuele dieren (Fig. 1g, Aanvullende figuren 4e, 4f). Fagen die glycinepeptiden bevatten, zijn mogelijk stabieler en minder snel uit de bloedsomloop verwijderd. Deze glycine-rijke peptiden werden echter niet gedetecteerd in de hersenvochtmonsters, wat suggereert dat de samengestelde bibliotheken twee verschillende selectiestappen hebben doorlopen: één in het bloed en een andere waarbij ze zich in het hersenvocht konden ophopen. De in het CSF verrijkte klonen die het resultaat waren van de vierde selectieronde zijn uitgebreid getest. Bijna alle individueel geteste klonen bleken verrijkt te zijn in het CSF in vergelijking met de blanco controlefagen. Eén peptide-hit (#2077) werd nader onderzocht. Het vertoonde een langere plasmahalfwaardetijd in vergelijking met andere hits (Figuur 3d en Aanvullende Figuur 7), en interessant genoeg bevatte dit peptide een cysteïne-residu aan de C-terminus. Recent is aangetoond dat de toevoeging van cysteïne aan peptiden hun farmacokinetische eigenschappen kan verbeteren door binding aan albumine 29. Dit is momenteel onbekend voor peptide #2077 en vereist verder onderzoek. Sommige peptiden vertoonden een valentie-afhankelijkheid in CSF-verrijking (gegevens niet getoond), wat mogelijk verband houdt met de weergegeven oppervlaktegeometrie van de T7-capside. Het T7-systeem dat we gebruikten, toonde 5-15 kopieën van elk peptide per faagdeeltje. IHC werd uitgevoerd op kandidaat-faagklonen die intraveneus in de hersenschors van ratten werden geïnjecteerd (Aanvullende Figuur 8). De gegevens toonden aan dat ten minste drie klonen (nr. 2002, nr. 2009 en nr. 2077) interactie vertoonden met de bloed-hersenbarrière. Het moet nog worden vastgesteld of deze BBB-interactie resulteert in de accumulatie van CSF of in de directe verplaatsing van deze klonen naar de BCSFB. Belangrijk is dat we aantonen dat de geselecteerde peptiden hun CSF-transportcapaciteit behouden wanneer ze gesynthetiseerd en gebonden zijn aan de eiwitlading. De binding van N-terminaal gebiotinyleerde peptiden aan SA herhaalt in wezen de resultaten die zijn verkregen met hun respectievelijke faagklonen in bloed en hersenvocht (Fig. 3e). Ten slotte tonen we aan dat leadpeptide #2077 in staat is de hersenwerking te bevorderen van een gebiotinyleerde peptide-remmer van BACE1 geconjugeerd aan SA, wat leidt tot uitgesproken farmacodynamische effecten in het CZS door de Abeta40-niveaus in CSF significant te verlagen (Fig. 4). We konden geen homologen in de database vinden door een homologiezoekactie uit te voeren op alle gevonden peptidesequenties. Het is belangrijk op te merken dat de grootte van de T7-bibliotheek ongeveer 109 is, terwijl de theoretische bibliotheekgrootte voor 12-mers 4 x 10¹⁵ is. Daarom hebben we slechts een klein deel van de diversiteitsruimte van de 12-mer peptidebibliotheek geselecteerd, wat zou kunnen betekenen dat er meer geoptimaliseerde peptiden kunnen worden geïdentificeerd door de aangrenzende sequentieruimte van deze geïdentificeerde hits te evalueren. Hypothetisch gezien zou een van de redenen waarom we geen natuurlijke homologen van deze peptiden hebben gevonden, selectie tijdens de evolutie kunnen zijn om de ongecontroleerde instroom van bepaalde peptidemotieven in de hersenen te voorkomen.
Samengevat bieden onze resultaten een basis voor toekomstig onderzoek om de transportsystemen van de cerebrovasculaire barrière in vivo gedetailleerder te identificeren en te karakteriseren. De basisopzet van deze methode is gebaseerd op een functionele selectiestrategie die niet alleen klonen met cerebrale vasculaire bindingseigenschappen identificeert, maar ook een cruciale stap omvat waarbij succesvolle klonen intrinsieke activiteit vertonen om biologische barrières in vivo te passeren en het centrale zenuwstelsel (CZS) binnen te dringen. Het doel is om het transportmechanisme van deze peptiden en hun voorkeur voor binding aan de microvasculatuur specifiek voor het betreffende hersengebied op te helderen. Dit kan leiden tot de ontdekking van nieuwe transportroutes voor de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​en receptoren. We verwachten dat de geïdentificeerde peptiden rechtstreeks kunnen binden aan cerebrovasculaire receptoren of aan circulerende liganden die door de BBB of de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière (BCSFB) worden getransporteerd. De in dit onderzoek ontdekte peptidevectoren met CSF-transportactiviteit zullen verder worden onderzocht. We onderzoeken momenteel de hersenspecificiteit van deze peptiden voor hun vermogen om de BBB en/of BCSFB te passeren. Deze nieuwe peptiden zullen uiterst waardevolle hulpmiddelen zijn voor de potentiële ontdekking van nieuwe receptoren of signaalroutes en voor de ontwikkeling van nieuwe, zeer efficiënte platforms voor de toediening van macromoleculen, zoals biologische geneesmiddelen, aan de hersenen.
De grote cisterna (CM) wordt gecanuleerd met behulp van een gemodificeerde versie van de eerder beschreven methode. Verdoofde Wistar-ratten (200-350 g) werden in een stereotaxisch apparaat geplaatst en er werd een mediane incisie gemaakt in de geschoren en aseptisch voorbereide hoofdhuid om de schedel bloot te leggen. Er werden twee gaten geboord in het gebied van de bovenste schedelrand en de fixatieschroeven werden in de gaten bevestigd. Een extra gat werd geboord in de laterale occipitale kam voor stereotactische geleiding van een roestvrijstalen canule in de CM. Tandheelkundig cement werd rond de canule aangebracht en vastgezet met schroeven. Na foto-uitharding en cementharding werd de huidwond gesloten met een 4/0 supramid hechtdraad. De juiste plaatsing van de canule werd bevestigd door spontane lekkage van hersenvocht (CSF). De rat werd uit het stereotaxisch apparaat gehaald, kreeg de juiste postoperatieve zorg en pijnstilling en mocht minstens een week herstellen totdat er tekenen van bloed in het hersenvocht werden waargenomen. Wistar-ratten (Crl:WI/Han) werden verkregen van Charles River (Frankrijk). Alle ratten werden gehouden onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden. Alle dierexperimenten werden goedgekeurd door de Veterinaire Dienst van de stad Basel, Zwitserland, en werden uitgevoerd in overeenstemming met dierenvergunning nr. 2474 (Beoordeling van actief hersentransport door het meten van de concentraties van therapeutische kandidaten in het hersenvocht en de hersenen van ratten).
Houd de rat voorzichtig bij bewustzijn met de CM-canule in de hand. Verwijder Datura van de canule en verzamel 10 µl spontaan stromend hersenvocht. Omdat de doorgang van de canule uiteindelijk werd aangetast, werden alleen heldere hersenvochtmonsters zonder bloedverontreiniging of verkleuring in dit onderzoek opgenomen. Parallel daaraan werd ongeveer 10-20 µl bloed afgenomen via een kleine incisie aan het uiteinde van de staart in buisjes met heparine (Sigma-Aldrich). Hersenvocht en bloed werden verzameld op verschillende tijdstippen na intraveneuze injectie van T7-faag. Ongeveer 5-10 µl vloeistof werd weggegooid vóór elke afname van het hersenvochtmonster, wat overeenkomt met het dode volume van de katheter.
Bibliotheken werden gegenereerd met behulp van de T7Select 10-3b-vector zoals beschreven in de handleiding van het T7Select-systeem (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Kort gezegd werd een willekeurig 12-mer DNA-insert gesynthetiseerd in het volgende formaat:
Het NNK-codon werd gebruikt om dubbele stopcodons en overexpressie van aminozuren in het insert te vermijden. N staat voor een handmatig gemengde equimolaire verhouding van elk nucleotide, en K staat voor een handmatig gemengde equimolaire verhouding van adenine- en cytosinenucleotiden. Enkelstrengs gebieden werden omgezet in dubbelstrengs DNA door verdere incubatie met dNTP (Novagen) en Klenow-enzym (New England Biolabs) in Klenow-buffer (New England Biolabs) gedurende 3 uur bij 37 °C. Na de reactie werd het dubbelstrengs DNA teruggewonnen door precipitatie met ethanol. Het resulterende DNA werd verteerd met de restrictie-enzymen EcoRI en HindIII (beide van Roche). Het geknipte en gezuiverde (QIAquick, Qiagen) insert (T4-ligase, New England Biolabs) werd vervolgens in-frame geligeerd in een vooraf geknipte T7-vector na aminozuur 348 van het 10B-capsidegen. Ligeringsreacties werden 18 uur bij 16 °C geïncubeerd voorafgaand aan de in vitro verpakking. De in vitro verpakking van fagen werd uitgevoerd volgens de instructies van de T7Select 10-3b kloonkit (Novagen) en de verpakkingsoplossing werd eenmaal geamplificeerd tot lysering met behulp van Escherichia coli (BLT5615, Novagen). De lysaten werden gecentrifugeerd, getitreerd en ingevroren bij -80 °C als een stockoplossing van glycerol.
Directe PCR-amplificatie van variabele faagregio's, geamplificeerd in bouillon of op een plaat, met behulp van gepatenteerde 454/Roche-amplicon-fusieprimers. De voorwaartse fusieprimer bevat sequenties die de variabele regio (NNK) 12 flankeren (templatespecifiek), GS FLX Titanium Adapter A en een vierbasige bibliotheeksleutelsequentie (TCAG) (Aanvullende figuur 1a):
De reverse fusion primer bevat tevens biotine gekoppeld aan capture beads en de GS FLX Titanium Adapter B, die nodig is voor klonale amplificatie tijdens emulsie-PCR:
De amplificatieproducten werden vervolgens onderworpen aan 454/Roche pyrosequencing volgens het 454 GS-FLX Titanium-protocol. Voor handmatige Sanger-sequencing (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) werd T7-faag-DNA geamplificeerd door PCR en gesequenced met de volgende primerparen:
Inzetstukken van individuele plaques werden onderworpen aan PCR-amplificatie met behulp van de Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (volgens de instructies van de fabrikant). Voer een hot start uit (10 min bij 95 °C) en 35 boostcycli (50 s bij 95 °C, 1 min bij 50 °C en 1 min bij 72 °C).
Fagen uit bibliotheken, wildtype fagen, fagen geïsoleerd uit hersenvocht en bloed, of individuele klonen werden vermenigvuldigd in Escherichia coli BL5615 in TB-bouillon (Sigma Aldrich) of in petrischalen van 500 cm² (Thermo Scientific) gedurende 4 uur bij 37 °C. Fagen werden van de platen geëxtraheerd door de platen te spoelen met Tris-EDTA-buffer (Fluka Analytical) of door de plaques te verzamelen met steriele pipetpunten. Fagen werden geïsoleerd uit het kweeksupernatant of de extractiebuffer met één ronde polyethyleenglycol (PEG 8000)-precipitatie (Promega) en opnieuw gesuspendeerd in Tris-EDTA-buffer.
De geamplificeerde fagen werden onderworpen aan 2-3 rondes van endotoxineverwijdering met behulp van endotoxineverwijderingskralen (Miltenyi Biotec) vóór intraveneuze (IV) injectie (500 μl/dier). In de eerste ronde werden 2×10¹² fagen geïntroduceerd; in de tweede 2×10¹⁰ fagen; in de derde en vierde selectieronde 2×10⁹ fagen per dier. Het fagengehalte in CSF- en bloedmonsters, verzameld op de aangegeven tijdstippen, werd bepaald door plaquetelling volgens de instructies van de fabrikant (handleiding van het T7Select-systeem). Faagselectie werd uitgevoerd door intraveneuze injectie van gezuiverde bibliotheken in de staartader of door herinjectie van fagen die uit CSF waren geëxtraheerd tijdens de vorige selectieronde. Vervolgens werden CSF- en bloedmonsters verzameld na respectievelijk 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min en 240 min. In totaal werden vier rondes van in vivo panning uitgevoerd, waarbij de twee geselecteerde takken afzonderlijk werden bewaard en geanalyseerd gedurende de eerste drie selectierondes. Alle uit hersenvocht (CSF) geëxtraheerde fagen uit de eerste twee selectierondes werden onderworpen aan 454/Roche pyrosequencing, terwijl alle klonen uit CSF uit de laatste twee selectierondes handmatig werden gesequenced. Alle bloedfagen uit de eerste selectieronde werden eveneens onderworpen aan 454/Roche pyrosequencing. Voor de injectie van faagklonen werden geselecteerde fagen vermenigvuldigd in E. coli (BL5615) op platen van 500 cm² bij 37 °C gedurende 4 uur. Individueel geselecteerde en handmatig gesequenced klonen werden vermeerderd in TB-medium. Na extractie, zuivering en verwijdering van endotoxine (zoals hierboven beschreven) werden 2 × 10¹⁰ fagen per dier in 300 μl intraveneus geïnjecteerd in één staartader.
Voorbewerking en kwalitatieve filtering van sequentiedata. Ruwe 454/Roche-data werden met behulp van software van de leverancier geconverteerd van een binair standaard stream map-formaat (sff) naar een door de mens leesbaar Pearson-formaat (fasta). Verdere verwerking van de nucleotidevolgorde werd uitgevoerd met behulp van eigen C-programma's en scripts (niet-uitgebracht softwarepakket), zoals hieronder beschreven. De analyse van primaire data omvat strikte meertraps filterprocedures. Om reads te filteren die geen geldige 12-mer insert-DNA-sequentie bevatten, werden de reads sequentieel uitgelijnd met startlabel (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stoplabel (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) en achtergrondinsert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) met behulp van de globale Needleman-Wunsch-test. Deze uitlijning stond maximaal 2 inconsistenties per uitlijning toe31. Daarom werden reads zonder start- en stoplabels en reads die achtergrondinserts bevatten, d.w.z. uitlijningen die het toegestane aantal mismatches overschreden, uit de bibliotheek verwijderd. Wat betreft de resterende reads, werd de N-mer DNA-sequentie die loopt van de startmarkering tot vóór de stopmarkering uit de oorspronkelijke readsequentie geknipt en verder verwerkt (hierna aangeduid als "insert"). Na vertaling van de insert werd het gedeelte na het eerste stopcodon aan het 5'-uiteinde van de primer verwijderd. Daarnaast werden ook nucleotiden die leiden tot onvolledige codons aan het 3'-uiteinde van de primer verwijderd. Om inserts uit te sluiten die alleen achtergrondsequenties bevatten, werden vertaalde inserts die beginnen met het aminozuurpatroon "PAG" ook verwijderd. Peptiden met een posttranslationele lengte van minder dan 3 aminozuren werden uit de bibliotheek verwijderd. Ten slotte werd redundantie in de insertpool verwijderd en de frequentie van elke unieke insert bepaald. De resultaten van deze analyse omvatten een lijst met nucleotidesequenties (inserts) en hun (read)frequenties (aanvullende figuren 1c en 2).
Groepering van N-mer DNA-inserts op basis van sequentieovereenkomst: Om 454/Roche-specifieke sequentiefouten (zoals problemen met het sequencen van homopolymeer-extensies) te elimineren en minder belangrijke redundanties te verwijderen, worden eerder gefilterde N-mer DNA-sequentie-inserts (inserts) gesorteerd op overeenkomst. Inserties (tot 2 niet-overeenkomende basen toegestaan) worden gesorteerd met behulp van een iteratief algoritme dat als volgt is gedefinieerd: inserties worden eerst gesorteerd op hun frequentie (van hoog naar laag), en als ze hetzelfde zijn, op hun lengte (van langst naar kortst). De meest frequente en langste inserties definiëren dus de eerste "groep". De groepsfrequentie wordt ingesteld op de sleutelfrequentie. Vervolgens werd geprobeerd elke insertie die in de gesorteerde lijst overbleef, aan de groep toe te voegen door middel van paarsgewijze Needleman-Wunsch-uitlijning. Als het aantal mismatches, inserties of deleties in een uitlijning een drempelwaarde van 2 niet overschrijdt, wordt een insertie aan de groep toegevoegd en wordt de totale groepsfrequentie verhoogd met het aantal keren dat de insertie is toegevoegd. Invoegingen die aan een groep worden toegevoegd, worden gemarkeerd als gebruikt en uitgesloten van verdere verwerking. Als de invoegsequentie niet aan een reeds bestaande groep kan worden toegevoegd, wordt de invoegsequentie gebruikt om een ​​nieuwe groep te creëren met de juiste invoegfrequentie en wordt deze gemarkeerd als gebruikt. De iteratie eindigt wanneer elke invoegsequentie is gebruikt om een ​​nieuwe groep te vormen of kan worden opgenomen in een reeds bestaande groep. Uiteindelijk worden gegroepeerde invoegingen, bestaande uit nucleotiden, vertaald naar peptidesequenties (peptidebibliotheken). Het resultaat van deze analyse is een set invoegingen en hun corresponderende frequenties die het aantal opeenvolgende aflezingen vormen (aanvullende figuur 2).
Motiefgeneratie: Op basis van een lijst met unieke peptiden werd een bibliotheek gemaakt met alle mogelijke aminozuurpatronen (aa), zoals hieronder weergegeven. Elk mogelijk patroon van lengte 3 werd uit het peptide geëxtraheerd en het inverse patroon werd toegevoegd aan een algemene motiefbibliotheek met alle patronen (tripeptiden). Bibliotheken met sterk herhalende motieven werden gesequenced en redundantie werd verwijderd. Vervolgens werd voor elk tripeptide in de motiefbibliotheek gecontroleerd of het aanwezig was in de bibliotheek met behulp van computertools. In dit geval wordt de frequentie van het peptide dat het gevonden motief-tripeptide bevat, toegevoegd en toegewezen aan het motief in de motiefbibliotheek ("aantal motieven"). Het resultaat van de motiefgeneratie is een tweedimensionale array met alle voorkomende tripeptiden (motieven) en hun respectievelijke waarden, namelijk het aantal sequentielezingen dat resulteert in het overeenkomstige motief wanneer de lezingen worden gefilterd, gegroepeerd en vertaald. Metrieken zoals hierboven gedetailleerd beschreven.
Normalisatie van het aantal motieven en bijbehorende spreidingsdiagrammen: Het aantal motieven voor elk monster werd genormaliseerd met behulp van
waarbij ni het aantal reads is dat onderwerp i bevat. Vi vertegenwoordigt dus de procentuele frequentie van reads (of peptiden) die motief i in het monster bevatten. P-waarden voor het niet-genormaliseerde aantal motieven werden berekend met behulp van de exacte toets van Fisher. Wat betreft correlogrammen van het aantal motieven, werden Spearman-correlaties berekend met behulp van het genormaliseerde aantal motieven met R.
Om de samenstelling van aminozuren op elke positie in de peptidebibliotheek te visualiseren, werden weblogogrammen 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) gemaakt. Eerst wordt de samenstelling van aminozuren op elke positie van het 12-mer peptide opgeslagen in een 20×12 matrix. Vervolgens wordt een set van 1000 peptiden met dezelfde relatieve aminozuursamenstelling op elke positie gegenereerd in fasta-sequentieformaat en als invoer gebruikt voor weblogo 3, dat een grafische weergave genereert van de relatieve aminozuursamenstelling op elke positie voor een gegeven peptidebibliotheek. Om multidimensionale datasets te visualiseren, werden heatmaps gemaakt met behulp van een intern ontwikkeld hulpmiddel in R (biosHeatmap, een nog niet uitgebracht R-pakket). De dendrogrammen in de heatmaps werden berekend met behulp van Ward's hiërarchische clusteringsmethode met de Euclidische afstandsmetriek. Voor de statistische analyse van motiefscoregegevens werden P-waarden voor niet-genormaliseerde scores berekend met behulp van Fisher's exacte toets. De p-waarden voor andere datasets werden in R berekend met behulp van de t-toets van Student of ANOVA.
Geselecteerde faagklonen en fagen zonder inserts werden intraveneus geïnjecteerd via de staartader (2×10¹⁰ fagen/dier in 300 μl PBS). Tien minuten vóór perfusie en daaropvolgende fixatie werden dezelfde dieren intraveneus geïnjecteerd met 100 μl DyLight594-gelabeld lectine (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minuten na de faaginjectie werden de ratten geperfuseerd via het hart met 50 ml PBS, gevolgd door 50 ml 4% PFA/PBS. Hersenweefselmonsters werden vervolgens een nacht gefixeerd in 4% PFA/PBS en een nacht geweekt in 30% sucrose bij 4°C. De monsters werden snel ingevroren in het OCT-mengsel. Immunohistochemische analyse van bevroren monsters werd uitgevoerd bij kamertemperatuur op 30 µm dikke cryosecties die geblokkeerd waren met 1% BSA en geïncubeerd met polyklonale FITC-gelabelde antilichamen tegen T7-faag (Novus NB 600-376A) bij 4 °C. Incubatie gedurende de nacht. Ten slotte werden de secties driemaal gewassen met PBS en onderzocht met een confocale lasermicroscoop (Leica TCS SP5).
Alle peptiden met een minimale zuiverheid van 98% werden gesynthetiseerd door GenScript USA, gebiotinyleerd en gelyofiliseerd. Biotine is gebonden via een extra drievoudige glycine-spacer aan de N-terminus. Alle peptiden werden gecontroleerd met behulp van massaspectrometrie.
Streptavidine (Sigma S0677) werd gemengd met een 5-voudige equimolaire overmaat van gebiotinyleerd peptide, gebiotinyleerd BACE1-remmend peptide, of een combinatie (verhouding 3:1) van gebiotinyleerd BACE1-remmend peptide en BACE1-remmend peptide in 5-10% DMSO/geïncubeerd in PBS. 1 uur bij kamertemperatuur vóór injectie. Streptavidine-geconjugeerde peptiden werden intraveneus geïnjecteerd met een dosis van 10 mg/kg in een van de staartaders van ratten met een hersenholte.
De concentratie van streptavidine-peptidecomplexen werd bepaald met behulp van ELISA. Nunc Maxisorp microtiterplaten (Sigma) werden een nacht bij 4°C gecoat met 1,5 μg/ml muis-anti-streptavidine-antilichaam (Thermo, MA1-20011). Na blokkering (blokkeerbuffer: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatine, 1% BSA) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, werd de plaat gewassen met 0,05% Tween-20/PBS (wasbuffer) gedurende 3 seconden. Vervolgens werden CSF- en plasmasamples toegevoegd aan de putjes, verdund met blokkeerbuffer (plasma 1:10.000, CSF 1:115). De plaat werd vervolgens een nacht bij 4°C geïncubeerd met detectie-antilichaam (1 μg/ml, anti-streptavidine-HRP, Novus NB120-7239). Na drie wasstappen werd streptavidine gedetecteerd door incubatie in TMB-substraatoplossing (Roche) gedurende maximaal 20 minuten. Nadat de kleurontwikkeling was gestopt met 1M H2SO4, werd de absorptie gemeten bij 450 nm.
De functie van het streptavidine-peptide-BACE1-remmercomplex werd beoordeeld met behulp van een Aβ(1-40) ELISA volgens het protocol van de fabrikant (Wako, 294-64701). Kort gezegd werden CSF-monsters verdund in een standaard verdunningsmiddel (1:23) en een nacht bij 4°C geïncubeerd in 96-wells platen gecoat met BNT77-vangstantilichaam. Na vijf wasstappen werd HRP-geconjugeerd BA27-antilichaam toegevoegd en gedurende 2 uur bij 4°C geïncubeerd, gevolgd door vijf wasstappen. Aβ(1-40) werd gedetecteerd door incubatie in TMB-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Nadat de kleurontwikkeling was gestopt met stopoplossing, werd de absorptie gemeten bij 450 nm. Plasmonsters werden vóór de Aβ(1-40) ELISA onderworpen aan vastefase-extractie. Plasma werd toegevoegd aan 0,2% DEA (Sigma) in 96-wells platen en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na het achtereenvolgens wassen van de SPE-platen (Oasis, 186000679) met water en 100% methanol, werden plasmamonsters aan de SPE-platen toegevoegd en werd alle vloeistof verwijderd. De monsters werden gewassen (eerst met 5% methanol, daarna met 30% methanol) en geëlueerd met 2% NH4OH/90% methanol. Na het drogen van het eluaat bij 55 °C gedurende 99 minuten onder een constante N2-stroom, werden de monsters gereduceerd in standaard verdunningsmiddelen en werd Aβ(1–40) gemeten zoals hierboven beschreven.
Hoe dit artikel te citeren: Urich, E. et al. Cargo delivery to the brain using transit peptides identified in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB en Moos T. Toediening van macromoleculaire geneesmiddelen aan de hersenen met behulp van gerichte therapie. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., en Martinez-Martinez, P. Afgifte van peptide- en eiwitgeneesmiddelen over de bloed-hersenbarrière. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM De bloed-hersenbarrière: een knelpunt in de ontwikkeling van geneesmiddelen voor de hersenen. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, en Byrd, A. Vooruitzichten voor verbeterde medicijntoediening en -targeting naar de hersenen via de plexus choroideus-CSF-route. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisering van biofarmaceutica met moleculaire Trojaanse paarden voor toediening aan de hersenen. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-receptor-gemedieerd peptidetransport over de bloed-hersenbarrière. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Verbetering van de hersenpenetratie en werkzaamheid van therapeutische antilichamen met behulp van monovalente moleculaire shuttles. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transport van de transferrinereceptor (TfR) bepaalt de opname in de hersenen van affiniteitsvarianten van TfR-antilichamen. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).