Tack för att du besöker Nature.com. Du använder en webbläsarversion med begränsat CSS-stöd. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). För att säkerställa fortsatt support visar vi dessutom webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Visar en karusell med tre bilder samtidigt. Använd knapparna Föregående och Nästa för att bläddra igenom tre bilder åt gången, eller använd skjutreglageknapparna i slutet för att bläddra igenom tre bilder åt gången.
Blod-hjärnbarriären och blod-hjärnbarriären förhindrar att bioterapeutiska medel når sina mål i det centrala nervsystemet, vilket hindrar effektiv behandling av neurologiska sjukdomar. För att upptäcka nya hjärntransportörer in vivo introducerade vi ett T7-fagpeptidbibliotek och serieinsamlade blod och cerebrospinalvätska (CSF) med hjälp av en kanylerad "medveten stor poolmodell" av råttor. Specifika fagkloner var höganrikade i CSF efter fyra selektionsrundor. Testning av individuella kandidatpeptider avslöjade mer än 1000-faldig anrikning i CSF. Bioaktiviteten hos den peptidmedierade leveransen till hjärnan bekräftades genom en 40% minskning av nivån av amyloid-β i cerebrospinalvätskan med hjälp av en BACE1-peptidhämmare kopplad till den identifierade nya transitpeptiden. Dessa resultat tyder på att de peptider som identifierats med in vivo-fagselektionsmetoder kan vara användbara vehiklar för systemisk leverans av makromolekyler till hjärnan med en terapeutisk effekt.
Forskning om riktad terapi inom centrala nervsystemet (CNS) har till stor del fokuserat på att identifiera optimerade läkemedel och medel som uppvisar CNS-riktade egenskaper, med mindre ansträngning för att upptäcka de mekanismer som driver aktiv läkemedelsleverans till hjärnan. Detta börjar förändras nu då läkemedelsleverans, särskilt stora molekyler, är en integrerad del av modern neurovetenskaplig läkemedelsutveckling. Miljön i det centrala nervsystemet är väl skyddad av det cerebrovaskulära barriärsystemet, som består av blod-hjärnbarriären (BBB) ​​och blod-hjärnbarriären (BCBB)1, vilket gör det utmanande att leverera läkemedel till hjärnan1,2. Det uppskattas att nästan alla stora molekylära läkemedel och mer än 98 % av småmolekylära läkemedel elimineras från hjärnan3. Det är därför det är mycket viktigt att identifiera nya hjärntransportsystem som ger effektiv och specifik leverans av terapeutiska läkemedel till CNS4,5. BBB och BCSFB utgör dock också en utmärkt möjlighet för läkemedelsleverans eftersom de penetrerar och kommer in i alla strukturer i hjärnan genom dess omfattande kärlsystem. De nuvarande ansträngningarna att använda icke-invasiva metoder för leverans till hjärnan är således till stor del baserade på mekanismen för receptormedierad transport (PMT) med hjälp av den endogena BBB6-receptorn. Trots de senaste viktiga framstegen med hjälp av transferrinreceptorvägen7,8 krävs vidareutveckling av nya leveranssystem med förbättrade egenskaper. För detta ändamål var vårt mål att identifiera peptider som kan mediera CSF-transport, eftersom de i princip skulle kunna användas för att leverera makromolekyler till CNS eller för att öppna nya receptorvägar. I synnerhet kan specifika receptorer och transportörer i det cerebrovaskulära systemet (BBB och BSCFB) fungera som potentiella mål för aktiv och specifik leverans av bioterapeutiska läkemedel. Cerebrospinalvätska (CSF) är en sekretorisk produkt från choroid plexus (CS) och är i direkt kontakt med hjärnans interstitiella vätska genom subaraknoidalrummet och ventrikulärrummet4. Nyligen har det visats att subaraknoidal cerebrospinalvätska diffunderar i överdriven mängd in i hjärnans interstitium9. Vi hoppas kunna komma åt det parenkymala utrymmet med hjälp av denna subaraknoidala inflödeskanal eller direkt genom BBB. För att uppnå detta implementerade vi en robust in vivo-fagselektionsstrategi som idealiskt identifierar peptider som transporteras via endera av dessa två distinkta vägar.
Vi beskriver nu en sekventiell in vivo-fagdisplayscreeningsmetod med CSF-provtagning kopplad till högkapacitetssekvensering (HTS) för att övervaka initiala selektionsrundor med högsta biblioteksdiversitet. Screening utfördes på vakna råttor med en permanent implanterad stor cisternakanyl (CM) för att undvika blodkontaminering. Viktigt är att denna metod selekterar både hjärninriktade peptider och peptider med transportaktivitet över den cerebrovaskulära barriären. Vi använde T7-fager på grund av deras lilla storlek (~60 nm)10 och föreslog att de är lämpliga för transport av vesiklar som möjliggör transcellulär korsning av endotel- och/eller epitel-medulla-barriären. Efter fyra omgångar av vaskning isolerades fagpopulationer som uppvisade stark in vivo CSF-anrikning och cerebral mikrokärlsassociation. Viktigt är att vi kunde bekräfta våra resultat genom att visa att de föredragna och kemiskt syntetiserade bästa kandidatpeptiderna kan transportera proteinlast in i cerebrospinalvätskan. Först fastställdes de farmakodynamiska effekterna av CNS genom att kombinera en ledande transitpeptid med en hämmare av BACE1-peptiden. Förutom att visa att funktionella screeningstrategier in vivo kan identifiera nya hjärntransportpeptider som effektiva proteintransportörer, förväntar vi oss att liknande funktionella selektionsmetoder också kommer att bli viktiga för att identifiera nya hjärntransportvägar.
Baserat på plackbildande enheter (PFU), efter fagpaketeringssteget, designades och skapades ett bibliotek av slumpmässiga 12-mer linjära T7-fagpeptider med en diversitet på cirka 109 (se Material och metoder). Det är viktigt att notera att vi noggrant analyserade detta bibliotek före in vivo-panning. PCR-amplifiering av fagbiblioteksprover med modifierade primers genererade amplikoner som var direkt tillämpliga på HTS (kompletterande figur 1a). På grund av a) HTS11-sekvenseringsfel, b) påverkan på primerkvaliteten (NNK)1-12, och c) närvaron av vildtypsfager (wt) (skelettinsatser) i standby-biblioteket, implementerades en sekvensfiltreringsprocedur för att endast extrahera verifierad sekvensinformation (kompletterande figur 1b). Dessa filtersteg gäller alla HTS-sekvenseringsbibliotek. För standardbiblioteket erhölls totalt 233 868 avläsningar, varav 39 % klarade filterkriterierna och användes för biblioteksanalys och urval för efterföljande omgångar (kompletterande figur 1c–e). Avläsningarna var övervägande multiplar av 3 baspar i längd med en topp vid 36 nukleotider (kompletterande figur 1c), vilket bekräftar biblioteksdesignen (NNK) 1-12. Det är värt att notera att cirka 11 % av biblioteksmedlemmarna innehöll en 12-dimensionell vildtyps (wt) ryggradsinsert av PAGISRELVDKL, och nästan hälften av sekvenserna (49 %) innehöll insertioner eller deletioner. HTS för biblioteksbiblioteket bekräftade den höga mångfalden av peptider i biblioteket: mer än 81 % av peptidsekvenserna hittades endast en gång och endast 1,5 % förekom i ≥4 kopior (kompletterande figur 2a). Frekvenserna av aminosyror (aa) vid alla 12 positioner i repertoaren korrelerade väl med de frekvenser som förväntades för antalet kodoner som genereras av den degenererade NKK-repertoaren (kompletterande figur 2b). Den observerade frekvensen av aa-rester som kodas av dessa insertioner korrelerade väl med den beräknade frekvensen (r = 0,893) (kompletterande figur 2c). Beredningen av fagbibliotek för injektion inkluderar stegen amplifiering och avlägsnande av endotoxin. Detta har tidigare visat sig potentiellt minska mångfalden hos fagbibliotek 12,13. Därför sekvenserade vi ett plattamplifierat fagbibliotek som hade genomgått endotoxinavlägsnande och jämförde det med det ursprungliga biblioteket för att uppskatta frekvensen av AA. En stark korrelation (r = 0,995) observerades mellan den ursprungliga poolen och den amplifierade och renade poolen (kompletterande figur 2d), vilket indikerar att konkurrens mellan kloner amplifierade på plattor med T7-fag inte orsakade någon större bias. Denna jämförelse är baserad på frekvensen av tripeptidmotiv i varje bibliotek, eftersom mångfalden av bibliotek (~109) inte kan fångas helt ens med HTS. Frekvensanalys av aa vid varje position avslöjade en liten positionsberoende bias i de tre sista positionerna i den inmatade repertoaren (kompletterande figur 2e). Sammanfattningsvis drog vi slutsatsen att bibliotekets kvalitet och mångfald var acceptabla och endast mindre förändringar i mångfald observerades på grund av amplifiering och beredning av fagbibliotek mellan flera selektionsrundor.
Seriell provtagning av cerebrospinalvätska kan utföras genom att kirurgiskt implantera en kanyl i ryggmärgen (CM) hos vakna råttor för att underlätta identifiering av T7-fag injicerad intravenöst (iv) via BBB och/eller BCSFB (Fig. 1a-b). Vi använde två oberoende selektionsarmar (armar A och B) under de tre första omgångarna av in vivo-selektion (Fig. 1c). Vi ökade gradvis stringensen i selektionen genom att minska den totala mängden fag som introducerades under de tre första selektionsomgångarna. För den fjärde panoreringsrundan kombinerade vi prover från grenarna A och B och utförde ytterligare tre oberoende selektioner. För att studera in vivo-egenskaperna hos T7-fagpartiklar i denna modell injicerades vildtypsfag (PAGISRELVDKL masterinsert) i råttor via svansvenen. Återvinning av fager från cerebrospinalvätska och blod vid olika tidpunkter visade att relativt små T7 ikosaedriska fager hade en snabb initial clearancefas från blodkompartmentet (kompletterande figur 3). Baserat på de administrerade titrarna och råttornas blodvolym beräknade vi att endast cirka 1 viktprocent fag från den administrerade dosen detekterades i blodet 10 minuter efter intravenös injektion. Efter denna initiala snabba minskning mättes en långsammare primär clearance med en halveringstid på 27,7 minuter. Viktigt är att endast mycket få fager återfanns från CSF-kompartmentet, vilket indikerar en låg bakgrund för migration av vildtypsfager in i CSF-kompartmentet (kompletterande figur 3). I genomsnitt detekterades endast cirka 1 x 10⁻³ % titrar av T7-fag i blodet och 4 x 10⁻³ % av initialt infunderade fager i cerebrospinalvätskan under hela provtagningsperioden (0–250 min). Anmärkningsvärt är att halveringstiden (25,7 min) för vildtypsfag i cerebrospinalvätska var liknande den som observerades i blod. Dessa data visar att barriären som separerar CSF-facket från blodet är intakt i CM-kanylerade råttor, vilket möjliggör in vivo-selektion av fagbibliotek för att identifiera kloner som lätt transporteras från blodet in i CSF-facket.
(a) Upprättande av en metod för att ta nya prover av cerebrospinalvätska (CSF) från en stor pool. (b) Diagram som visar den cellulära placeringen av centrala nervsystemets (CNS) barriär och den selektionsstrategi som används för att identifiera peptider som passerar blod-hjärnbarriären (BBB) ​​och blod-hjärnbarriären. (c) Flödesschema för in vivo-fagdisplayscreening. I varje selektionsrunda injicerades fager (djuridentifierare inuti pilarna) intravenöst. Två oberoende alternativa grenar (A, B) hålls separata fram till den fjärde selektionsrundan. För selektionsrunda 3 och 4 sekvenserades varje fagklon extraherad från CSF manuellt. (d) Kinetik för fag isolerad från blod (röda cirklar) och cerebrospinalvätska (gröna trianglar) under den första selektionsrundan i två kanylerade råttor efter intravenös injektion av T7-peptidbiblioteket (2 x 1012 fager/djur). Blå rutor indikerar den genomsnittliga initiala koncentrationen av fag i blodet, beräknad från mängden injicerad fag, med hänsyn till den totala blodvolymen. De svarta rutorna indikerar skärningspunkten för y-linjen extrapolerad från blodfagkoncentrationer. (e, f) Presenterar den relativa frekvensen och fördelningen av alla möjliga överlappande tripeptidmotiv som finns i peptiden. Antalet motiv som hittats i 1000 avläsningar visas. Signifikant (p < 0,001) är berikade motiv markerade med röda prickar. (e) Korrelationsspridningsdiagram som jämför den relativa frekvensen av tripeptidmotivet i det injicerade biblioteket med blod-härledda fager från djuren #1.1 och #1.2. (f) Korrelationsspridningsdiagram som jämför de relativa frekvenserna av djurfag-tripeptidmotiv #1.1 och #1.2 isolerade i blod och cerebrospinalvätska. (g, h) Sekvens-ID-representation av fag berikad i blod (g) kontra injicerade bibliotek och fag berikad i CSF (h) kontra blod efter en omgång av in vivo-selektion hos båda djuren. Storleken på den enbokstavliga koden indikerar hur ofta den aminosyran förekommer i den positionen. Grönt = polärt, lila = neutralt, blått = basiskt, rött = surt och svart = hydrofoba aminosyror. Figur 1a, b designades och producerades av Eduard Urich.
Vi injicerade ett fagpeptidbibliotek i två CM-instrumentråttor (klader A och B) och isolerade fagen från cerebrospinalvätska och blod (Figur 1d). Den initiala snabba clearance av biblioteket var mindre uttalad jämfört med vildtypsfagen. Den genomsnittliga halveringstiden för det injicerade biblioteket i båda djuren var 24,8 minuter i blod, liknande vildtypsfagen, och 38,5 minuter i CSF. Blod- och cerebrospinalvätskefagprover från varje djur utsattes för HTS och alla identifierade peptider analyserades med avseende på närvaron av ett kort tripeptidmotiv. Tripeptidmotiv valdes eftersom de ger en minimal grund för strukturbildning och peptid-protein-interaktioner14,15. Vi fann en god korrelation i fördelningen av motiv mellan det injicerade fagbiblioteket och kloner extraherade från blodet från båda djuren (Fig. 1e). Data indikerar att bibliotekets sammansättning endast är marginellt anrikad i blodkompartmentet. Aminosyrafrekvenser och konsensussekvenser analyserades vidare vid varje position med hjälp av en anpassning av Weblogo16-programvaran. Intressant nog fann vi en stark anrikning av glycinrester i blodet (Fig. 1g). När blod jämfördes med kloner selekterade från CSF observerades stark selektion och viss borttagning av motiv (Fig. 1f), och vissa aminosyror var företrädesvis närvarande vid förutbestämda positioner i 12-mer-molekylen (Fig. 1h). Det är värt att notera att individuella djur skilde sig signifikant åt i cerebrospinalvätska, medan anrikning av glycin i blodet observerades hos båda djuren (Kompletterande Fig. 4a–j). Efter stringent filtrering av sekvensdata i cerebrospinalvätskan från djuren #1.1 och #1.2 erhölls totalt 964 respektive 420 unika 12-mer-peptider (Kompletterande Fig. 1d–e). De isolerade fagklonerna amplifierades och utsattes för en andra omgång av in vivo-selektion. Fag extraherad från den andra selektionsomgången utsattes för HTS hos varje djur och alla identifierade peptider användes som input till ett motivigenkänningsprogram för att analysera förekomsten av tripeptidmotiv (Fig. 2a, b, ef). Jämfört med den första cykeln av fagen som utvunnits från CSF observerade vi ytterligare selektion och avselektion av många motiv i CSF i grenarna A och B (Fig. 2). En nätverksidentifieringsalgoritm tillämpades för att bestämma om de representerade olika mönster av konsekvent sekvens. En tydlig likhet observerades mellan de 12-dimensionella sekvenserna som utvunnits av CSF i alternativ klad A (Fig. 2c, d) och klad B (Fig. 2g, h). Den poolade analysen i varje gren avslöjade olika selektionsprofiler för 12-merpeptider (kompletterande Fig. 5c, d) och en ökning av CSF/blodtiterförhållandet över tid för poolade kloner efter den andra selektionsrundan jämfört med den första selektionsrundan (kompletterande Fig. 5e).
Anrikning av motiv och peptider i cerebrospinalvätska genom två på varandra följande omgångar av in vivo funktionell fagdisplayselektion.
Alla cerebrospinalvätskefager som utvanns från den första omgången av varje djur (djur #1.1 och #1.2) poolades, amplifierades, HT-sekvenserades och återinjicerades tillsammans (2 x 1010 fager/djur) 2 SM-kanulerade råttor (#1.1 → #). 2.1 och 2.2, 1.2 → 2.3 och 2.4). (a, b, e, f) Korrelationsspridningsdiagram som jämför den relativa frekvensen av tripeptidmotiv för alla CSF-härledda fager i den första och andra selektionsrundan. Relativ frekvens och fördelning av motiv som representerar alla möjliga överlappande tripeptider som finns i peptider i båda orienteringarna. Antalet motiv som hittades i 1000 avläsningar visas. Motiv som signifikant (p < 0,001) selekterades eller exkluderades i ett av de jämförda biblioteken är markerade med röda prickar. (c, d, g, h) Sekvenslogotyprepresentation av alla CSF-rika 12 aminosyror långa sekvenser baserade på omgång 2 och 1 av in vivo-selektion. Storleken på den enbokstavliga koden indikerar hur ofta den aminosyran förekommer vid den positionen. För att representera logotypen jämförs frekvensen av CSF-sekvenser extraherade från individuella djur mellan två selektionsrundor och de berikade sekvenserna i den andra omgången visas: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 och (h) #1.2–#2.4. De mest berikade aminosyrorna vid en given position i (c, d) djur nr 2.1 och nr 2.2 eller (g, h) i djur nr 2.3 och nr 2.4 visas i färg. Grön = polär, lila = neutral, blå = basisk, röd = sur och svart = hydrofoba aminosyror.
Efter den tredje selektionsrundan identifierade vi 124 unika peptidsekvenser (#3.1 och #3.2) från 332 CSF-rekonstituerade fagkloner isolerade från två djur (kompletterande figur 6a). Sekvensen LGSVS (18,7 %) hade den högsta relativa andelen, följt av vildtypsinsatserna PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) och SARGSWREIVSLS (2,2 %). I den sista fjärde omgången poolade vi två oberoende selekterade grenar från tre separata djur (figur 1c). Av de 925 sekvenserade fagklonerna som utvanns från CSF, fann vi i den fjärde omgången 64 unika peptidsekvenser (kompletterande figur 6b), bland vilka den relativa andelen vildtypsfager sjönk till 0,8 %. De vanligaste CSF-klonerna i den fjärde omgången var LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) och RLSSVDSDLSGC (3, 2 %). %). Längdintervallet för de selekterade peptiderna beror på nukleotidinsertioner/deletioner eller för tidiga stoppkodoner i biblioteksprimrarna när degenererade kodoner används för NNK-biblioteksdesign. För tidiga stoppkodoner genererar kortare peptider och väljs ut eftersom de innehåller det gynnsamma aa-motivet. Längre peptider kan vara resultatet av insertioner/deletioner i primrarna i de syntetiska biblioteken. Detta placerar det designade stoppkodonet utanför ramen och läser det tills ett nytt stoppkodon dyker upp nedströms. I allmänhet beräknade vi anrikningsfaktorer för alla fyra selektionsrundorna genom att jämföra indata med provutdata. För den första screeningsrundan använde vi vildtypsfagtitrar som en ospecifik bakgrundsreferens. Intressant nog var negativ fagselektion mycket stark i den första CSF-cykeln, men inte i blod (Fig. 3a), vilket kan bero på den låga sannolikheten för passiv diffusion av de flesta medlemmarna i peptidbiblioteket in i CSF-avdelningen, eller så tenderar relativa fager att behållas eller avlägsnas mer effektivt från blodomloppet än bakteriofager. I den andra panoreringsrundan observerades dock stark selektion av fager i CSF i båda kladerna, vilket tyder på att den föregående omgången var berikad med fager som uppvisade peptider som främjar CSF-upptag (Fig. 3a). Återigen, utan signifikant blodberikning. Även i den tredje och fjärde omgången var fagklonerna signifikant berikade med CSF. Genom att jämföra den relativa frekvensen av varje unik peptidsekvens mellan de två sista selektionsomgångarna fann vi att sekvenserna var ännu mer berikade i den fjärde selektionsomgången (Fig. 3b). Totalt 931 tripeptidmotiv extraherades från alla 64 unika peptidsekvenser med båda peptidorienteringarna. De mest berikade motiven i den fjärde omgången undersöktes närmare med avseende på deras anrikningsprofiler över alla omgångar jämfört med det injicerade biblioteket (gränsvärde: 10 % anrikning) (kompletterande figur 6c). Generella selektionsmönster visade att de flesta av de studerade motiven var berikade i alla tidigare omgångar av båda selektionsgrenarna. Vissa motiv (t.ex. SGL, VSG, LGS GSV) kom dock huvudsakligen från alternativ klad A, medan andra (t.ex. FGW, RTN, WGF, NTR) var berikade i alternativ klad B.
Validering av CSF-transport av CSF-berikade fagvisade peptider och biotinylerade ledarpeptider konjugerade till streptavidin-nyttolaster.
(a) Anrikningsförhållanden beräknade i alla fyra omgångarna (R1-R4) baserat på injicerade (input = I) fag (PFU) titrar och bestämda CSF-fagtitrar (output = O). Anrikningsfaktorer för de sista tre omgångarna (R2-R4) beräknades genom jämförelse med föregående omgång och första omgång (R1) med viktdata. Öppna staplar är cerebrospinalvätska, skuggade staplar är plasma. (***p < 0,001, baserat på Students t-test). (b) Lista över de vanligaste fagpeptiderna, rangordnade efter deras relativa andel till alla fager som samlats in i CSF efter omgång 4 av urvalet. De sex vanligaste fagklonerna är markerade i färg, numrerade och deras anrikningsfaktorer mellan omgång 3 och 4 av urvalet (infällningar). (c, d) De sex mest anrikade fagklonerna, tomma fag- och parentala fagpeptidbibliotek från omgång 4 analyserades individuellt i en CSF-provtagningsmodell. CSF- och blodprover samlades in vid de angivna tidpunkterna. (c) Lika mängder av 6 kandidatfagkloner (2 x 1010 fager/djur), tomma fager (#1779) (2 x 1010 fager/djur) och stockfagpeptidbibliotek (2 x 1012 fager/djur). Injicera minst 3 cm3 administreras separat till det kanylerade djuret via svansvenen. CSF-farmakokinetiken för varje injicerad fagklon och fagpeptidbibliotek över tid visas. (d) visar det genomsnittliga CSF/blod-förhållandet för alla återvunna fager/ml under provtagningstiden. (e) Fyra syntetiska ledarpeptider och en krypterad kontroll kopplades med biotin till streptavidin via deras N-terminal (tetramerdisplay) följt av injektion (svansven iv, 10 mg streptavidin/kg). Minst tre intuberade råttor (N = 3). CSF-prover samlades in vid de angivna tidpunkterna och streptavidinkoncentrationerna mättes med CSF-anti-streptavidin-ELISA (nd = ej detekterad). (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, baserat på ANOVA-test). (f) Jämförelse av aminosyrasekvensen för den mest berikade fagpeptidklonen #2002 (lila) med andra utvalda fagpeptidkloner från den fjärde selektionsrundan. Identiska och liknande aminosyrafragment är färgkodade.
Av alla berikade fager i den fjärde omgången (Fig. 3b) valdes sex kandidatkloner ut för vidare individuell analys i CSF-provtagningsmodellen. Lika mängder av sex kandidatfag-, tomma fag- (utan insert) och profagpeptidbibliotek injicerades i tre kanulerade CM-djur, och farmakokinetiken bestämdes i CSF- (Fig. 3c) och blod- (Kompletterande Fig. 7) analyser. Alla testade fagkloner riktade in sig på CSF-kompartmentet på en nivå 10-1000 gånger högre än den tomma kontrollfagen (#1779). Till exempel hade klonerna #2020 och #2077 cirka 1000 gånger högre CSF-titrar än kontrollfagen. Den farmakokinetiska profilen för varje vald peptid är olika, men alla har en hög CSF-målsökande förmåga. Vi observerade en konstant minskning över tid för klonerna #1903 och #2011, medan för klonerna #2077, #2002 och #2009 en ökning under de första 10 minuterna kan indikera aktiv transport men behöver verifieras. Klonerna #2020, #2002 och #2077 stabiliserades på höga nivåer, medan CSF-koncentrationen av klon #2009 långsamt minskade efter den initiala ökningen. Vi jämförde sedan den relativa frekvensen av varje CSF-kandidat med dess blodkoncentration (Fig. 3d). Korrelationen mellan medeltitern för varje CSF-kandidat och dess blodtiter vid alla provtagningstillfällen visade att tre av de sex kandidaterna var signifikant anrikade i blod-CSF. Intressant nog visade klon #2077 högre blodstabilitet (kompletterande figur 7). För att bekräfta att peptiderna själva kan aktivt transportera annan last än fagpartiklar in i CSF-avdelningen, syntetiserade vi fyra ledarpeptider derivatiserade med biotin vid N-terminalen där peptiderna fäster vid fagpartikeln. Biotinylerade peptider (nr 2002, 2009, 2020 och 2077) konjugerades med streptavidin (SA) för att erhålla multimera former som något imiterade faggeometri. Detta format gjorde det också möjligt för oss att mäta SA-exponering i blod och cerebrospinalvätska som lasttransporterande proteinpeptider. Viktigt är att fagdata ofta kunde reproduceras när syntetiska peptider administrerades i detta SA-konjugerade format (Fig. 3e). De blandade peptiderna hade lägre initial exponering och snabbare CSF-clearance med odetekterbara nivåer inom 48 timmar. För att få insikt i leveransvägarna för dessa peptidfagkloner in i CSF-utrymmet analyserade vi lokaliseringen av individuella fagpeptidträffar med hjälp av immunhistokemi (IHC) för att direkt detektera fagpartiklar 1 timme efter intravenös injektion in vivo. Det är värt att notera att klonerna #2002, #2077 och #2009 kunde detekteras genom stark färgning i hjärnkapillärer, medan kontrollfag (#1779) och klon #2020 inte detekterades (kompletterande figur 8). Detta tyder på att dessa peptider bidrar till effekten på hjärnan just genom att korsa BBB. Ytterligare detaljerad analys krävs för att testa denna hypotes, eftersom BSCFB-vägen också kan vara involverad. Vid jämförelse av aminosyrasekvensen för den mest berikade klonen (#2002) med andra utvalda peptider noterades att vissa av dem har liknande aminosyraförlängningar, vilket kan indikera en liknande transportmekanism (Fig. 3f).
På grund av sin unika plasmaprofil och signifikanta ökning av CSF över tid undersöktes fagdisplayklon #2077 vidare under en längre 48-timmarsperiod och kunde reproducera den snabba ökningen av CSF som observerades i samband med bibehållna SA-nivåer (Fig. 4a). Beträffande andra identifierade fagkloner färgades #2077 starkt för hjärnkapillärer och visade signifikant kolokalisering med kapillärmarkörlektin när den betraktades med högre upplösning och möjligen viss färgning i parenkymutrymmet (Figur 4b). För att undersöka om peptidmedierade farmakologiska effekter kunde erhållas i CNS utförde vi ett experiment där biotinylerade versioner av i) transitpeptiden #2077 och ii) BACE1-hämmarpeptiden blandades med SA i två olika förhållanden. För den ena kombinationen använde vi endast BACE1-peptidhämmaren och för den andra använde vi ett 1:3-förhållande av BACE1-peptidhämmare till #2077-peptid. Båda proverna administrerades intravenöst och nivåerna av beta-amyloidpeptid 40 (Abeta40) i blod och cerebrospinalvätska mättes över tid. Abeta40 mättes i CSF eftersom det återspeglar BACE1-hämning i hjärnparenkymet. Som förväntat minskade båda komplexen signifikant blodnivåerna av Abeta40 (Fig. 4c, d). Emellertid orsakade endast prover innehållande en blandning av peptid nr 2077 och en hämmare av BACE1-peptiden konjugerad till SA en signifikant minskning av Abeta40 i cerebrospinalvätskan (Fig. 4c). Data visar att peptid nr 2077 kan transportera 60 kDa SA-proteinet in i CNS och även inducerar farmakologiska effekter med SA-konjugerade hämmare av BACE1-peptiden.
(a) Klonal injektion (2 × 10 fager/djur) av T7-fag som visar långsiktiga farmakokinetiska profiler för CSF-peptid #2077 (RLSSVDSDLSGC) och oinjicerad kontrollfag (#1779) i minst tre CM-intuberade råttor. (b) Konfokalmikroskopisk bild av representativa kortikala mikrokärl i faginjicerade råttor (2 × 10 10 fager/djur) som visar motfärgning av peptid #2077 och kärl (lektin). Dessa fagkloner administrerades till 3 råttor och fick cirkulera i 1 timme före perfusion. Hjärnorna delades upp och färgades med polyklonala FITC-märkta antikroppar mot T7-fagkapsiden. Tio minuter före perfusion och efterföljande fixering administrerades DyLight594-märkt lektin intravenöst. Fluorescerande bilder som visar lektinfärgning (röd) av den luminala sidan av mikrokärl och fager (grön) i lumen av kapillärer och perivaskulär hjärnvävnad. Skalstapeln motsvarar 10 µm. (c, d) Biotinylerad BACE1-hämmande peptid ensam eller i kombination med biotinylerad transitpeptid #2077 kopplades till streptavidin följt av intravenös injektion av minst tre kanylerade CM-råttor (10 mg streptavidin/kg). BACE1-peptidhämmarmedierad reduktion av Aβ40 mättes med Aβ1-40 ELISA i blod (rött) och cerebrospinalvätska (orange) vid de angivna tidpunkterna. För bättre tydlighet ritas en streckad linje i grafen i skala 100%. (c) Procentuell reduktion av Aβ40 i blod (röda trianglar) och cerebrospinalvätska (orange trianglar) hos råttor behandlade med streptavidin konjugerat till transitpeptid #2077 och BACE1-hämmande peptid i förhållandet 3:1. (d) Procentuell minskning av Aβ40 i blod (röda cirklar) och cerebrospinalvätska (orange cirklar) hos råttor behandlade med streptavidin kopplat till endast en BACE1-hämmande peptid. Aβ-koncentrationen i kontrollen var 420 pg/ml (standardavvikelse = 101 pg/ml).
Fagdisplay har framgångsrikt tillämpats inom flera områden inom biomedicinsk forskning17. Denna metod har använts för in vivo-studier av vaskulär diversitet18,19 såväl som studier riktade mot hjärnkärl20,21,22,23,24,25,26. I denna studie utvidgade vi tillämpningen av denna selektionsmetod inte bara till direkt identifiering av peptider riktade mot hjärnkärl, utan också till upptäckten av kandidater med aktiva transportegenskaper för att korsa blod-hjärnbarriären. Vi beskriver nu utvecklingen av en in vivo-selektionsprocedur hos CM-intuberade råttor och demonstrerar dess potential att identifiera peptider med CSF-målsökande egenskaper. Med hjälp av T7-fagen som uppvisar ett bibliotek av 12-mer slumpmässiga peptider kunde vi visa att T7-fagen är tillräckligt liten (ungefär 60 nm i diameter)10 för att anpassas till blod-hjärnbarriären och därigenom direkt korsa blod-hjärnbarriären eller choroidplexus. Vi observerade att CSF-skörd från kanulerade CM-råttor var en välkontrollerad funktionell screeningsmetod in vivo, och att den extraherade fagen inte bara band till kärlen utan också fungerade som en transportör över blod-hjärnbarriären. Genom att samtidigt samla in blod och applicera HTS på CSF och blodhärledda fager bekräftade vi dessutom att vårt val av CSF inte påverkades av blodanrikning eller lämplighet för expansion mellan selektionsrundor. Blodkompartmentet är dock en del av selektionsproceduren, eftersom fager som kan nå CSF-kompartmentet måste överleva och cirkulera i blodomloppet tillräckligt länge för att anrika sig själva i hjärnan. För att extrahera tillförlitlig sekvensinformation från rå HTS-data implementerade vi filter anpassade till plattformsspecifika sekvenseringsfel i analysarbetsflödet. Genom att införliva kinetiska parametrar i screeningmetoden bekräftade vi den snabba farmakokinetiken för vildtyps T7-fager (t½ ~ 28 min) i blod24, 27, 28 och bestämde även deras halveringstid i cerebrospinalvätska (t½ ~ 26 min) per minut. Trots liknande farmakokinetiska profiler i blod och cerebrospinalvätska kunde endast 0,001 % av blodkoncentrationen av fag detekteras i cerebrospinalvätska, vilket indikerar låg bakgrundsmobilitet av vildtyps-T7-fag över blod-hjärnbarriären. Detta arbete belyser vikten av den första selektionsrundan vid användning av in vivo-panoreringsstrategier, särskilt för fagsystem som snabbt elimineras från cirkulationen, eftersom få kloner kan nå CNS-kompartmentet. Således var minskningen av biblioteksdiversitet mycket stor i den första omgången, eftersom endast ett begränsat antal kloner så småningom samlades in i denna mycket strikta CSF-modell. Denna in vivo-panoreringsstrategi inkluderade flera selektionssteg såsom aktiv ackumulering i CSF-kompartmentet, klonöverlevnad i blodkompartmentet och snabbt avlägsnande av T7-fagkloner från blodet inom de första 10 minuterna (fig. 1d och kompletterande fig. 4M). Således identifierades olika fagkloner i CSF efter den första omgången, även om samma initiala pool användes för enskilda djur. Detta tyder på att flera strikta urvalssteg för källbibliotek med ett stort antal biblioteksmedlemmar resulterar i en betydande minskning av mångfalden. Därför kommer slumpmässiga händelser att bli en integrerad del av den initiala urvalsprocessen, vilket i hög grad påverkar resultatet. Det är troligt att många av klonerna i det ursprungliga biblioteket hade en mycket liknande benägenhet för CSF-anrikning. Men även under samma experimentella förhållanden kan urvalsresultaten skilja sig åt på grund av det lilla antalet av varje specifik klon i den initiala poolen.
Motiven som är berikade i CSF skiljer sig från de i blodet. Intressant nog noterade vi den första förskjutningen mot glycinrika peptider i blodet hos enskilda djur. (Fig. 1g, kompletterande figurer 4e, 4f). Fag innehållande glycinpeptider kan vara mer stabila och mindre benägna att tas ur cirkulationen. Dessa glycinrika peptider detekterades dock inte i cerebrospinalvätskeproverna, vilket tyder på att de kurerade biblioteken genomgick två olika selektionssteg: ett i blodet och ett annat som fick ackumuleras i cerebrospinalvätskan. CSF-berikade kloner som resulterade från den fjärde selektionsrundan har testats omfattande. Nästan alla individuellt testade kloner bekräftades vara berikade i CSF jämfört med blank kontrollfag. En peptidträff (#2077) undersöktes mer i detalj. Den visade en längre plasmahalveringstid jämfört med andra träffar (Figur 3d och kompletterande figur 7), och intressant nog innehöll denna peptid en cysteinrest vid C-terminalen. Det har nyligen visats att tillsats av cystein till peptider kan förbättra deras farmakokinetiska egenskaper genom att binda till albumin 29. Detta är för närvarande okänt för peptid #2077 och kräver ytterligare studier. Vissa peptider uppvisade ett valensberoende i CSF-anrikning (data visas ej), vilket kan vara relaterat till den visade ytgeometrin hos T7-kapsiden. T7-systemet vi använde visade 5–15 kopior av varje peptid per fagpartikel. IHC utfördes på kandidatfagkloner injicerade intravenöst i hjärnbarken hos råttor (kompletterande figur 8). Data visade att minst tre kloner (nr 2002, nr 2009 och nr 2077) interagerade med BBB. Det återstår att avgöra om denna BBB-interaktion resulterar i ackumulering av CSF eller förflyttning av dessa kloner direkt till BCSFB. Viktigt är att vi visar att de utvalda peptiderna behåller sin CSF-transportkapacitet när de syntetiseras och binds till proteinlasten. Bindning av N-terminala biotinylerade peptider till SA upprepar i huvudsak de resultat som erhölls med deras respektive fagkloner i blod och cerebrospinalvätska (Fig. 3e). Slutligen visar vi att huvudpeptid #2077 kan främja hjärnaktiviteten hos en biotinylerad peptidhämmare av BACE1 konjugerad till SA, vilket orsakar uttalade farmakodynamiska effekter i CNS genom att signifikant minska Abeta40-nivåerna i CSF (Fig. 4). Vi kunde inte identifiera några homologer i databasen genom att utföra en peptidsekvenshomologisökning av alla träffar. Det är viktigt att notera att storleken på T7-biblioteket är ungefär 109, medan den teoretiska biblioteksstorleken för 12-merer är 4 x 1015. Därför valde vi endast en liten del av diversitetsutrymmet för 12-merpeptidbiblioteket, vilket kan innebära att fler optimerade peptider kan identifieras genom att utvärdera det intilliggande sekvensutrymmet för dessa identifierade träffar. Hypotetiskt kan en av anledningarna till att vi inte har funnit några naturliga homologer av dessa peptider vara avselektion under evolutionen för att förhindra okontrollerad inträde av vissa peptidmotiv i hjärnan.
Sammantaget ger våra resultat en grund för framtida arbete för att identifiera och karakterisera transportsystemen i den cerebrovaskulära barriären in vivo mer i detalj. Den grundläggande uppbyggnaden av denna metod är baserad på en funktionell selektionsstrategi som inte bara identifierar kloner med cerebrala vaskulära bindningsegenskaper, utan också inkluderar ett kritiskt steg där framgångsrika kloner har inneboende aktivitet för att korsa biologiska barriärer in vivo in i CNS-kompartmentet. Målet är att belysa transportmekanismen för dessa peptider och deras preferens för bindning till mikrovaskulaturen specifikt för hjärnregionen. Detta kan leda till upptäckten av nya vägar för transport av BBB och receptorer. Vi förväntar oss att de identifierade peptiderna kan binda direkt till cerebrovaskulära receptorer eller till cirkulerande ligander som transporteras genom BBB eller BCSFB. Peptidvektorerna med CSF-transportaktivitet som upptäckts i detta arbete kommer att undersökas ytterligare. Vi undersöker för närvarande hjärnspecificiteten hos dessa peptider för deras förmåga att korsa BBB och/eller BCSFB. Dessa nya peptider kommer att vara extremt värdefulla verktyg för potentiell upptäckt av nya receptorer eller signalvägar och för utveckling av nya högeffektiva plattformar för leverans av makromolekyler, såsom biologiska läkemedel, till hjärnan.
Kanulera den stora cisterna (CM) med hjälp av en modifiering av den tidigare beskrivna metoden. Bedövade Wistar-råttor (200-350 g) monterades på en stereotaxisk apparat och ett mediant snitt gjordes över den rakade och aseptiskt preparerade hårbotten för att exponera skallen. Borra två hål i området kring den övre bågen och fäst fästskruvarna i hålen. Ett ytterligare hål borrades i den laterala occipitala kammen för stereotaktisk styrning av en kanyl av rostfritt stål in i CM. Applicera tandcement runt kanylen och fäst med skruvar. Efter fotohärdning och cementhärdning förslöts hudsåret med 4/0 supramidsutur. Korrekt placering av kanylen bekräftas genom spontant läckage av cerebrospinalvätska (CSF). Ta bort råttan från den stereotaxiska apparaten, få lämplig postoperativ vård och smärtlindring och låt den återhämta sig i minst en vecka tills tecken på blod observeras i cerebrospinalvätskan. Wistar-råttor (Crl:WI/Han) erhölls från Charles River (Frankrike). Alla råttor hölls under specifika patogenfria förhållanden. Alla djurförsök godkändes av veterinärmyndigheten i staden Basel, Schweiz, och utfördes i enlighet med djurlicens nr 2474 (Bedömning av aktiv hjärntransport genom mätning av nivåer av terapeutiska kandidater i cerebrospinalvätskan och hjärnan hos råtta).
Håll råttan försiktigt vid medvetande med CM-kanylen i handen. Ta bort spikklubban från kanylen och samla in 10 µl spontant flödande cerebrospinalvätska. Eftersom kanylens öppenhet i slutändan äventyrades, inkluderades endast klara cerebrospinalvätskeprover utan tecken på blodkontaminering eller missfärgning i denna studie. Parallellt togs cirka 10–20 µl blod från ett litet snitt i svansspetsen ner i rör med heparin (Sigma-Aldrich). CSF och blod samlades in vid olika tidpunkter efter intravenös injektion av T7-fagen. Cirka 5–10 µl vätska kasserades innan varje CSF-prov samlades in, vilket motsvarar kateterns dödvolym.
Bibliotek genererades med hjälp av T7Select 10-3b-vektorn enligt beskrivningen i T7Select-systemmanualen (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Kortfattat syntetiserades en slumpmässig 12-mer DNA-insats i följande format:
NNK-kodonet användes för att undvika dubbla stoppkodoner och överuttryck av aminosyror i insatsen. N är ett manuellt blandat ekvimolärt förhållande av varje nukleotid, och K är ett manuellt blandat ekvimolärt förhållande av adenin- och cytosinnukleotider. Enkelsträngade regioner omvandlades till dubbelsträngat DNA genom ytterligare inkubation med dNTP (Novagen) och Klenow-enzym (New England Biolabs) i Klenow-buffert (New England Biolabs) i 3 timmar vid 37°C. Efter reaktionen utvanns dubbelsträngat DNA genom EtOH-utfällning. Det resulterande DNA:t digererades med restriktionsenzymerna EcoRI och HindIII (båda från Roche). Det klyvda och renade (QIAquick, Qiagen) insatsen (T4-ligas, New England Biolabs) ligerades sedan in-frame in i en förklyvd T7-vektor efter aminosyra 348 i 10B-kapsidgenen. Ligeringsreaktionerna inkuberades vid 16°C i 18 timmar före in vitro-paketering. Fagpaketering in vitro utfördes enligt instruktionerna som medföljde T7Select 10-3b-kloningskitet (Novagen) och paketeringslösningen amplifierades en gång för lysering med Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lysaten centrifugerades, titrerades och frystes vid -80 °C som en stamlösning av glycerol.
Direkt PCR-amplifiering av fagvariabla regioner amplifierade i buljong eller platta med hjälp av patentskyddade 454/Roche-amplikon-fusionsprimrar. Den framåtriktade fusionsprimern innehåller sekvenser som flankerar den variabla regionen (NNK) 12 (mallspecifik), GS FLX Titanium Adapter A och en fyrbasig biblioteksnyckelsekvens (TCAG) (kompletterande figur 1a):
Omvänd fusionsprimern innehåller även biotin fäst vid infångningskulor och GS FLX Titanium Adapter B som krävs för klonal amplifiering under emulsions-PCR:
Amplikonerna utsattes sedan för 454/Roche-pyrosekvensering enligt 454 GS-FLX Titanium-protokollet. För manuell Sanger-sekvensering (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) amplifierades T7-fag-DNA med PCR och sekvenserades med följande primerpar:
Insatser från individuella plack PCR-amplifierades med Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (enligt tillverkarens instruktioner). Utför en varmstart (10 min vid 95 °C) och 35 boostcykler (50 s vid 95 °C, 1 min vid 50 °C och 1 min vid 72 °C).
Fag från bibliotek, vildtypsfag, fag räddad från CSF och blod, eller individuella kloner amplifierades i Escherichia coli BL5615 i TB-buljong (Sigma Aldrich) eller i 500 cm2-skålar (Thermo Scientific) i 4 timmar vid 37°C. Fag extraherades från plattorna genom att skölja plattorna med Tris-EDTA-buffert (Fluka Analytical) eller genom att samla in placken med sterila pipettspetsar. Fag isolerades från kultursupernatant eller extraktionsbuffert med en omgång polyetylenglykol (PEG 8000)-fällning (Promega) och resuspenderades i Tris-EDTA-buffert.
Den amplifierade fagen utsattes för 2–3 omgångar av endotoxinavlägsnande med hjälp av endotoxinavlägsnande kulor (Miltenyi Biotec) före intravenös (IV) injektion (500 μl/djur). I den första omgången introducerades 2×1012 fager; i den andra 2×1010 fager; i den tredje och fjärde selektionsrundan 2×109 fager per djur. Faginnehållet i CSF- och blodprover som samlats in vid de angivna tidpunkterna bestämdes genom plackräkning enligt tillverkarens instruktioner (T7Select-systemmanual). Fagurektion utfördes genom intravenös injektion av renade bibliotek i svansvenen eller genom återinjektion av fag extraherad från CSF från föregående selektionsrunda, och efterföljande skördar utfördes vid 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min respektive 240 min i CSF- och blodprover. Totalt fyra omgångar av in vivo-vaskning genomfördes där de två selekterade grenarna lagrades separat och analyserades under de tre första selektionsrundorna. Alla faginsatser extraherade från CSF från de två första selektionsrundorna utsattes för 454/Roche-pyrosekvensering, medan alla kloner extraherade från CSF från de två sista selektionsrundorna sekvenserades manuellt. Alla blodfager från den första selektionsrundan utsattes också för 454/Roche-pyrosekvensering. För injektion av fagkloner amplifierades selekterade fager i E. coli (BL5615) på 500 cm2-plattor vid 37°C i 4 timmar. Individuellt selekterade och manuellt sekvenserade kloner propagerades i TB-medium. Efter fagextraktion, rening och avlägsnande av endotoxin (enligt beskrivningen ovan) injicerades 2×1010 fager/djur i 300 μl intravenöst i en svansven.
Förbehandling och kvalitativ filtrering av sekvensdata. Rå 454/Roche-data konverterades från ett binärt standardströmmappformat (sff) till ett Pearson-läsbart format (fasta) med hjälp av leverantörsprogramvara. Vidare bearbetning av nukleotidsekvensen utfördes med hjälp av proprietära C-program och skript (ej släppt programvarupaket) enligt beskrivningen nedan. Analysen av primärdata inkluderar strikta flerstegsfiltreringsprocedurer. För att filtrera bort avläsningar som inte innehöll en giltig 12mer-insert-DNA-sekvens, justerades avläsningarna sekventiellt till startmärkning (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stoppmärkning (TAAGCTTGGGCCGCACTCGAGTA) och bakgrundsinsert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) med hjälp av det globala Needleman-Wunsch-testet. Inriktning som tillåter upp till 2 inkonsekvenser per inriktning31. Därför togs avläsningar utan start- och stopptaggar och avläsningar som innehåller bakgrundsinsatser, dvs. inriktningar som överskrider det tillåtna antalet felmatchningar, bort från biblioteket. När det gäller de återstående avläsningarna skars N-mer-DNA-sekvensen som sträcker sig från startmarkeringen och slutar före stoppmarkeringen ut från den ursprungliga avläsningssekvensen och bearbetades vidare (nedan kallad "insert"). Efter translation av insertet avlägsnades delen efter det första stoppkodonet vid 5'-änden av primern från insertet. Dessutom avlägsnades även nukleotider som leder till ofullständiga kodoner vid 3'-änden av primern. För att exkludera insert som endast innehåller bakgrundssekvenser avlägsnades även translaterade insert som börjar med aminosyramönstret "PAG". Peptider med en posttranslationslängd på mindre än 3 aminosyror avlägsnades från biblioteket. Slutligen avlägsnades redundans i insertpoolen och frekvensen för varje unikt insert bestämdes. Resultaten av denna analys inkluderade en lista över nukleotidsekvenser (inserts) och deras (avläsnings)frekvenser (kompletterande figurer 1c och 2).
Gruppera N-mer DNA-insert efter sekvenslikhet: För att eliminera 454/Roche-specifika sekvenseringsfel (såsom problem med sekvensering av homopolymerförlängningar) och ta bort mindre viktiga redundanser, sorteras tidigare filtrerade N-mer DNA-sekvensinsert (insert) efter likhet. Insertioner (upp till 2 icke-matchande baser tillåtna) med hjälp av en iterativ algoritm definierad enligt följande: insertioner sorteras först efter deras frekvens (högst till lägst), och om de är desamma, efter deras sekundära sortering efter längd (längst till kortast). Således definierar de mest frekventa och längsta insertionerna den första "gruppen". Gruppfrekvensen sätts till nyckelfrekvensen. Därefter försökte man lägga till varje insert som återstod i den sorterade listan till gruppen genom parvis Needleman-Wunsch-justering. Om antalet felmatchningar, insertioner eller deletioner i en justering inte överstiger ett tröskelvärde på 2, läggs en insertion till i gruppen, och den totala gruppfrekvensen ökas med hur ofta insertionen lades till. Insertioner som läggs till i en grupp markeras som använda och exkluderas från vidare bearbetning. Om insertsekvensen inte kan läggas till i en redan befintlig grupp, används insertsekvensen för att skapa en ny grupp med lämplig insertfrekvens och markeras som använd. Iterationen avslutas när varje insertsekvens antingen har använts för att bilda en ny grupp eller kan inkluderas i en redan befintlig grupp. Grupperade insert bestående av nukleotider översätts trots allt så småningom till peptidsekvenser (peptidbibliotek). Resultatet av denna analys är en uppsättning insertioner och deras motsvarande frekvenser som utgör antalet konsekutiva läsningar (kompletterande figur 2).
Motivgenerering: Baserat på en lista över unika peptider skapades ett bibliotek innehållande alla möjliga aminosyramönster (aa) enligt nedan. Varje möjligt mönster med längd 3 extraherades från peptiden och dess inversa mönster lades till tillsammans med ett gemensamt motivbibliotek innehållande alla mönster (tripeptider). Bibliotek med mycket repetitiva motiv sekvenserades och redundans togs bort. Sedan kontrollerade vi för varje tripeptid i motivbiblioteket dess närvaro i biblioteket med hjälp av beräkningsverktyg. I detta fall läggs frekvensen av peptiden som innehåller den funna motivtripeptiden till och tilldelas motivet i motivbiblioteket ("antal motiv"). Resultatet av motivgenereringen är en tvådimensionell matris som innehåller alla förekomster av tripeptider (motiv) och deras respektive värden, vilket är antalet sekvenseringsläsningar som resulterar i motsvarande motiv när läsningarna filtreras, grupperas och översätts. Mätvärden som beskrivs i detalj ovan.
Normalisering av antalet motiv och motsvarande spridningsdiagram: Antalet motiv för varje prov normaliserades med hjälp av
där ni är antalet läsningar som innehåller ämne i. Således representerar vi den procentuella frekvensen av läsningar (eller peptider) som innehåller motiv i i urvalet. P-värden för det icke-normaliserade antalet motiv beräknades med hjälp av Fishers exakta test. Beträffande korrelogram av antalet motiv beräknades Spearmans korrelationer med hjälp av det normaliserade antalet motiv med R.
För att visualisera innehållet av aminosyror vid varje position i peptidbiblioteket skapades webblogogram 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Först lagras innehållet av aminosyror vid varje position av 12-merpeptiden i en 20×12-matris. Därefter genereras en uppsättning av 1000 peptider innehållande samma relativa aminosyrainnehåll vid varje position i fasta-sekvensformat och tillhandahålls som indata till webblogo 3, vilket genererar en grafisk representation av det relativa aminosyrainnehållet vid varje position för ett givet peptidbibliotek. För att visualisera flerdimensionella datamängder skapades värmekartor med hjälp av ett internt utvecklat verktyg i R (biosHeatmap, ett ännu inte släppt R-paket). De dendrogrammen som presenterades i värmekartorna beräknades med hjälp av Wards hierarkiska klustermetod med den euklidiska avståndsmätningen. För statistisk analys av motivpoängdata beräknades P-värden för onormaliserad poängsättning med hjälp av Fishers exakta test. P-värden för andra datamängder beräknades i R med hjälp av Student's t-test eller ANOVA.
Utvalda fagkloner och fager utan insert injicerades intravenöst via svansvenen (2×1010 fager/djur i 300 μl PBS). Tio minuter före perfusion och efterföljande fixering injicerades samma djur intravenöst med 100 μl DyLight594-märkt lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minuter efter faginjektion perfunderades råttorna genom hjärtat med 50 ml PBS följt av 50 ml 4% PFA/PBS. Hjärnprover fixerades dessutom över natten i 4% PFA/PBS och blötlades i 30% sackaros över natten vid 4°C. Proverna snabbfryses i OCT-blandningen. Immunhistokemisk analys av frysta prover utfördes vid rumstemperatur på 30 μm kryosektioner blockerade med 1% BSA och inkuberades med polyklonala FITC-märkta antikroppar mot T7-fag (Novus NB 600-376A) vid 4°C. Inkubera över natten. Slutligen tvättades snitten 3 gånger med PBS och undersöktes med ett konfokalt lasermikroskop (Leica TCS SP5).
Alla peptider med en minsta renhet på 98 % syntetiserades av GenScript USA, biotinylerades och frystorkades. Biotin binds via en ytterligare trippel glycinspacer vid N-terminalen. Kontrollera alla peptider med masspektrometri.
Streptavidin (Sigma S0677) blandades med ett 5-faldigt ekvimolärt överskott av biotinylerad peptid, biotinylerad BACE1-hämmande peptid eller en kombination (3:1-förhållande) av biotinylerad BACE1-hämmande peptid och BACE1-hämmande peptid i 5–10 % DMSO/inkuberat i PBS, 1 timme vid rumstemperatur före injektion. Streptavidin-konjugerade peptider injicerades intravenöst i en dos av 10 mg/kg i en av svansvenerna hos råttor med hjärnhåla.
Koncentrationen av streptavidin-peptidkomplex bedömdes med ELISA. Nunc Maxisorp-mikrotiterplattor (Sigma) belades över natten vid 4 °C med 1,5 μg/ml mus-anti-streptavidin-antikropp (Thermo, MA1-20011). Efter blockering (blockeringsbuffert: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % gelatin, 1 % BSA) vid rumstemperatur i 2 timmar, tvättades plattan med 0,05 % Tween-20/PBS (tvättbuffert) i 3 sekunder. CSF- och plasmaprover tillsattes till brunnar utspädda med blockeringsbuffert (plasma 1:10 000, CSF 1:115). Plattan inkuberades sedan över natten vid 4 °C med detektionsantikropp (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Efter tre tvättsteg detekterades streptavidin genom inkubation i TMB-substratlösning (Roche) i upp till 20 minuter. Efter att färgframkallningen stoppats med 1 M H2SO4, mät absorbansen vid 450 nm.
Funktionen hos streptavidin-peptid-BACE1-hämmarkomplexet utvärderades med Aβ(1-40) ELISA enligt tillverkarens protokoll (Wako, 294-64701). Kortfattat späddes CSF-prover i standardutspädningsmedel (1:23) och inkuberades över natten vid 4 °C i 96-brunnsplattor belagda med BNT77-infångningsantikropp. Efter fem tvättsteg tillsattes HRP-konjugerad BA27-antikropp och inkuberades i 2 timmar vid 4 °C, följt av fem tvättsteg. Aβ(1–40) detekterades genom inkubation i TMB-lösning i 30 minuter vid rumstemperatur. Efter att färgutvecklingen har stoppats med stopplösning, mättes absorbansen vid 450 nm. Plasmaprover utsattes för fastfasextraktion före Aβ(1–40) ELISA. Plasma tillsattes till 0,2 % DEA (Sigma) i 96-brunnsplattor och inkuberades vid rumstemperatur i 30 minuter. Efter successiv tvättning av SPE-plattorna (Oasis, 186000679) med vatten och 100 % metanol tillsattes plasmaprover till SPE-plattorna och all vätska avlägsnades. Proverna tvättades (först med 5 % metanol och sedan 30 % metanol) och eluerades med 2 % NH4OH/90 % metanol. Efter torkning av eluatet vid 55 °C i 99 minuter vid konstant N2-ström reducerades proverna i standardutspädningsmedel och Aβ(1–40) mättes enligt beskrivningen ovan.
Hur man citerar den här artikeln: Urich, E. et al. Cargo delivery to the brain using transit peptides identified in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB och Moos T. Tillförsel av makromolekylära läkemedel till hjärnan med hjälp av riktad terapi. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., och Martinez-Martinez, P. Leverans av peptid- och proteinläkemedel över blod-hjärnbarriären. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Blod-hjärnbarriären: en flaskhals i utvecklingen av hjärnläkemedel. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, och Byrd, A. Möjligheter till förbättrad läkemedelsleverans och målinriktning till hjärnan via plexus choroideus-CSF-vägen. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisering av biofarmaceutiska läkemedel med molekylära trojanska hästar för hjärnleverans. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-receptormedierad peptidtransport över blod-hjärnbarriären. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Öka hjärnpenetrationen och effekten av terapeutiska antikroppar med hjälp av monovalenta molekylära skyttlar. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transferrinreceptor (TfR)-transport bestämmer hjärnans upptag av affinitetsvarianter av TfR-antikroppar. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).