Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Използвате версия на браузъра с ограничена поддръжка на CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Освен това, за да осигурим постоянна поддръжка, показваме сайта без стилове и JavaScript.
Показва карусел от три слайда едновременно. Използвайте бутоните „Предишна“ и „Следваща“, за да се придвижвате през три слайда едновременно, или използвайте плъзгачите в края, за да се придвижвате през три слайда едновременно.
Кръвно-мозъчната бариера и кръвно-мозъчната бариера пречат на биотерапевтичните агенти да достигнат своите цели в централната нервна система, като по този начин възпрепятстват ефективното лечение на неврологични заболявания. За да открием нови мозъчни транспортери in vivo, въведохме библиотека от T7 фагови пептиди и серийно събрахме кръв и цереброспинална течност (CSF), използвайки канюлиран модел на голям пул от плъхове в съзнание. Специфични фагови клонове бяха силно обогатени в CSF след четири кръга на селекция. Тестването на отделни кандидат пептиди разкри повече от 1000-кратно обогатяване в CSF. Биоактивността на пептидно-медиираното доставяне до мозъка беше потвърдена с 40% намаление на нивото на амилоид-β в цереброспиналната течност, използвайки BACE1 пептиден инхибитор, свързан с идентифицирания нов транзитен пептид. Тези резултати показват, че пептидите, идентифицирани чрез in vivo методи за фагова селекция, могат да бъдат полезни носители за системно доставяне на макромолекули до мозъка с терапевтичен ефект.
Изследванията в областта на терапията, насочена към централната нервна система (ЦНС), са фокусирани до голяма степен върху идентифицирането на оптимизирани лекарства и агенти, които проявяват свойства, насочени към ЦНС, с по-малко усилия за откриване на механизмите, които задвижват активното доставяне на лекарства до мозъка. Това започва да се променя сега, тъй като доставянето на лекарства, особено на големи молекули, е неразделна част от съвременното разработване на лекарства в невронауката. Средата на централната нервна система е добре защитена от цереброваскуларната бариерна система, състояща се от кръвно-мозъчната бариера (КМБ) и кръвно-мозъчната бариера (КМБ)1, което затруднява доставянето на лекарства до мозъка1,2. Смята се, че почти всички лекарства с големи молекули и повече от 98% от лекарствата с малки молекули се елиминират от мозъка3. Ето защо е много важно да се идентифицират нови транспортни системи за мозъка, които осигуряват ефективно и специфично доставяне на терапевтични лекарства до ЦНС4,5. КМБ и КМБС обаче също така представляват отлична възможност за доставяне на лекарства, тъй като те проникват и навлизат във всички структури на мозъка през обширната му васкулатура. Следователно, настоящите усилия за използване на неинвазивни методи за доставяне до мозъка до голяма степен се основават на механизма на рецептор-медииран транспорт (PMT), използващ ендогенния BBB6 рецептор. Въпреки последните ключови постижения в използването на пътя на трансфериновия рецептор7,8, е необходимо по-нататъшно разработване на нови системи за доставяне с подобрени свойства. За тази цел, нашата цел беше да идентифицираме пептиди, способни да медиират транспорта в цереброспиналната течност (CSF), тъй като те по принцип биха могли да се използват за доставяне на макромолекули до ЦНС или за отваряне на нови рецепторни пътища. По-специално, специфични рецептори и транспортери на цереброваскуларната система (BBB и BSCFB) могат да служат като потенциални мишени за активното и специфично доставяне на биотерапевтични лекарства. Цереброспиналната течност (CSF) е секреторен продукт на хороидния плексус (CS) и е в директен контакт с интерстициалната течност на мозъка през субарахноидалното пространство и камерното пространство4. Наскоро беше показано, че субарахноидалната цереброспинална течност дифундира прекомерно в интерстициума на мозъка9. Надяваме се да достигнем до паренхимното пространство, използвайки този субарахноидален входящ тракт или директно през кръвно-мозъчната бариера (КМБ). За да постигнем това, внедрихме стабилна in vivo стратегия за селекция на фаги, която в идеалния случай идентифицира пептидите, транспортирани по един от тези два различни пътя.
Сега описваме метод за последователен in vivo скрининг на фагов дисплей с вземане на проби от цереброспиналната течност (CSF), съчетано с високопроизводително секвениране (HTS), за наблюдение на началните кръгове на селекция с най-високо разнообразие от библиотеки. Скринингът е извършен върху съзнателни плъхове с постоянно имплантирана канюла с голяма цистерна (CM), за да се избегне замърсяване на кръвта. Важно е, че този подход селектира както мозъчно насочени, така и пептиди с транспортна активност през цереброваскуларната бариера. Използвахме T7 фаги поради малкия им размер (~60 nm)10 и предположихме, че те са подходящи за транспорт на везикули, които позволяват трансклетъчно преминаване през ендотелната и/или епително-медуларната бариера. След четири кръга на панинг, бяха изолирани фагови популации, показващи силно in vivo обогатяване на CSF и асоциация с церебрални микросъдове. Важно е, че успяхме да потвърдим нашите открития, като демонстрирахме, че предпочитаните и химически синтезирани най-добри кандидат пептиди са способни да транспортират протеинов товар в цереброспиналната течност. Първо, фармакодинамичните ефекти на ЦНС бяха установени чрез комбиниране на водещ транзитен пептид с инхибитор на BACE1 пептида. В допълнение към демонстрирането, че in vivo стратегиите за функционален скрининг могат да идентифицират нови пептиди за мозъчен транспорт като ефективни носители на протеинови товари, очакваме подобни подходи за функционален подбор също да станат важни при идентифицирането на нови пътища за мозъчен транспорт.
Въз основа на плакообразуващи единици (PFU), след стъпката на фагово опаковане, беше проектирана и създадена библиотека от произволни 12-мерни линейни T7 фагови пептиди с разнообразие от приблизително 109 (вижте Материали и методи). Важно е да се отбележи, че внимателно анализирахме тази библиотека преди in vivo панинг. PCR амплификацията на проби от фагови библиотеки, използвайки модифицирани праймери, генерира ампликони, които бяха директно приложими към HTS (Допълнителна фигура 1a). Поради а) грешки в секвенирането на HTS11, б) влияние върху качеството на праймерите (NNK)1-12 и в) наличието на фаг от див тип (wt) (скелетни вложки) в резервната библиотека, беше внедрена процедура за филтриране на последователности, за да се извлече само проверена информация за последователността (Допълнителна фигура 1b). Тези стъпки на филтриране се отнасят за всички HTS секвениращи библиотеки. За стандартната библиотека бяха получени общо 233 868 прочитания, от които 39% преминаха критериите за филтриране и бяха използвани за анализ и селекция на библиотеката за следващите кръгове (Допълнителна фигура 1c-e). Прочетените данни бяха предимно кратни на 3 базови двойки по дължина с пик при 36 нуклеотида (Допълнителна фигура 1в), потвърждавайки дизайна на библиотеката (NNK) 1-12. Забележително е, че приблизително 11% от членовете на библиотеката съдържаха 12-измерен див тип (wt) гръбнак PAGISRELVDKL инсерт, а почти половината от последователностите (49%) съдържаха инсерции или делеции. HTS на библиотечната библиотека потвърди голямото разнообразие от пептиди в библиотеката: повече от 81% от пептидните последователности бяха открити само веднъж и само 1,5% се появиха в ≥4 копия (Допълнителна фигура 2а). Честотите на аминокиселините (АК) във всичките 12 позиции в репертоара корелират добре с очакваните честоти за броя на кодоните, генерирани от дегенерирания NKK репертоар (Допълнителна фигура 2б). Наблюдаваната честота на АК остатъци, кодирани от тези инсерти, корелира добре с изчислената честота (r = 0,893) (Допълнителна фигура 2в). Подготовката на фагови библиотеки за инжектиране включва стъпките на амплификация и отстраняване на ендотоксин. По-рано е доказано, че това потенциално намалява разнообразието на фаговите библиотеки12,13. Следователно, ние секвенирахме фагова библиотека, амплифицирана в плака, която е претърпяла отстраняване на ендотоксин, и я сравнихме с оригиналната библиотека, за да оценим честотата на аминокиселини (AA). Наблюдавана е силна корелация (r = 0.995) между оригиналния пул и амплифицирания и пречистен пул (Допълнителна фигура 2d), което показва, че конкуренцията между клонове, амплифицирани в плаки, използващи T7 фаг, не е причинила значително отклонение. Това сравнение се основава на честотата на трипептидните мотиви във всяка библиотека, тъй като разнообразието от библиотеки (~109) не може да бъде напълно обхванато дори с HTS. Честотният анализ на аминокиселини на всяка позиция разкри малко зависимо от позицията отклонение в последните три позиции на въведения репертоар (Допълнителна фигура 2e). В заключение, стигнахме до заключението, че качеството и разнообразието на библиотеката са приемливи и са наблюдавани само незначителни промени в разнообразието поради амплификацията и подготовката на фагови библиотеки между няколко кръга на селекция.
Серийно вземане на проби от цереброспинална течност може да се извърши чрез хирургично имплантиране на канюла в кошарата на съзнателни плъхове, за да се улесни идентифицирането на Т7 фаг, инжектиран интравенозно (iv) през кръвно-мозъчната бариера (КМБ) и/или BCSFB (Фиг. 1a-b). Използвахме две независими селекционни рамена (рамена А и Б) в първите три кръга на in vivo селекция (Фиг. 1в). Постепенно увеличихме строгостта на селекцията, като намалихме общото количество фаг, въведен в първите три кръга на селекция. За четвъртия кръг на панинг комбинирахме проби от клонове А и Б и извършихме три допълнителни независими селекции. За да изследваме in vivo свойствата на Т7 фаговите частици в този модел, фаг от див тип (PAGISRELVDKL master insert) беше инжектиран в плъхове през опашната вена. Възстановяването на фаги от цереброспинална течност и кръв в различни времеви точки показа, че относително малки Т7 икосаедрични фаги имат бърза начална фаза на клирънс от кръвното отделение (Допълнителна Фиг. 3). Въз основа на приложените титри и кръвния обем на плъховете, изчислихме, че само приблизително 1% тегловни фаги от приложената доза са открити в кръвта 10 минути след интравенозно инжектиране. След този първоначален бърз спад е измерен по-бавен първичен клирънс с период на полуразпад от 27,7 минути. Важно е да се отбележи, че само много малко фаги са извлечени от компартмента на цереброспиналната течност, което показва нисък фон за миграция на фаги от див тип в компартмента на цереброспиналната течност (Допълнителна фигура 3). Средно само около 1 x 10-3% титри на T7 фаг в кръвта и 4 x 10-8% от първоначално инфузираните фаги са открити в цереброспиналната течност през целия период на вземане на проби (0-250 мин). Забележително е, че периодът на полуразпад (25,7 мин) на фаг от див тип в цереброспиналната течност е подобен на този, наблюдаван в кръвта. Тези данни показват, че бариерата, отделяща CSF компартмента от кръвта, е непокътната при плъхове с канюлиран CM, което позволява in vivo селекция на фагови библиотеки за идентифициране на клонинги, които лесно се транспортират от кръвта в CSF компартмента.
(а) Разработване на метод за повторно вземане на проба от цереброспинална течност (CSF) от голям басейн. (б) Диаграма, показваща клетъчното местоположение на бариерата на централната нервна система (ЦНС) и стратегията за селекция, използвана за идентифициране на пептиди, които преминават кръвно-мозъчната бариера (КМБ) ​​и кръвно-мозъчната бариера. (в) Блок-схема на in vivo фагов скрининг. Във всеки кръг на селекция, фагите (идентификатори на животни вътре в стрелките) са инжектирани интравенозно. Два независими алтернативни клона (A, B) се съхраняват отделно до 4-ия кръг на селекция. За кръгове на селекция 3 и 4, всеки фагов клон, екстрахиран от CSF, е секвениран ръчно. (г) Кинетика на фаг, изолиран от кръв (червени кръгове) и цереброспинална течност (зелени триъгълници) по време на първия кръг на селекция при два канулирани плъха след интравенозно инжектиране на T7 пептидната библиотека (2 x 1012 фаги/животно). Сините квадрати показват средната начална концентрация на фаг в кръвта, изчислена от количеството инжектиран фаг, като се вземе предвид общият обем на кръвта. Черните квадрати показват точката на пресичане на y линията, екстраполирана от концентрациите на кръвни фаги. (e,f) Представете относителната честота и разпределението на всички възможни припокриващи се трипептидни мотиви, открити в пептида. Показан е броят на мотивите, открити в 1000 отчитания. Значително (p < 0,001) обогатени мотиви са маркирани с червени точки. (e) Корелационна диаграма на разсейване, сравняваща относителната честота на трипептидния мотив на инжектираната библиотека с фаг, получен от кръв от животни #1.1 и #1.2. (f) Корелационна диаграма на разсейване, сравняваща относителните честоти на трипептидни мотиви #1.1 и #1.2 на животински фаги, изолирани в кръв и цереброспинална течност. (g, h) Представяне на идентификационния номер на последователността на фаг, обогатен с кръв (g), спрямо инжектирани библиотеки и фаг, обогатен с цереброспинална течност (h), спрямо кръв след цикъл на in vivo селекция и при двете животни. Размерът на еднобуквения код показва колко често тази аминокиселина се среща на тази позиция. Зелено = полярно, лилаво = неутрално, синьо = основно, червено = киселинно и черно = хидрофобни аминокиселини. Фигура 1a, b е проектирана и произведена от Едуард Урих.
Инжектирахме фагова пептидна библиотека в два плъха с инструментална микрофлора (клонове А и В) и изолирахме фага от цереброспинална течност и кръв (Фигура 1d). Първоначалното бързо елиминиране на библиотеката беше по-слабо изразено в сравнение с фага от див тип. Средният полуживот на инжектираната библиотека и при двете животни беше 24,8 минути в кръвта, подобно на фага от див тип, и 38,5 минути в цереброспиналната течност. Проби от фаги в кръвта и цереброспиналната течност от всяко животно бяха подложени на HTS и всички идентифицирани пептиди бяха анализирани за наличие на къс трипептиден мотив. Трипептидните мотиви бяха избрани, защото осигуряват минимална основа за образуване на структура и пептид-протеинови взаимодействия14,15. Установихме добра корелация в разпределението на мотивите между инжектираната фагова библиотека и клонингите, извлечени от кръвта на двете животни (Фиг. 1e). Данните показват, че съставът на библиотеката е само незначително обогатен в кръвния компартмент. Честотите на аминокиселините и консенсусните последователности бяха допълнително анализирани на всяка позиция, използвайки адаптация на софтуера Weblogo16. Интересно е, че открихме силно обогатяване на глицинови остатъци в кръвта (фиг. 1g). Когато кръвта беше сравнена с клонинги, селектирани от цереброспиналната течност (CSF), се наблюдаваше силна селекция и известна деселекция на мотиви (фиг. 1f), като някои аминокиселини бяха преференциално присъстващи на предварително определени позиции в 12-членния (фиг. 1h). Забележително е, че отделните животни се различаваха значително в цереброспиналната течност, докато обогатяване на кръвта с глицин се наблюдаваше и при двете животни (допълнителна фигура 4a-j). След стриктно филтриране на данните за последователността в цереброспиналната течност на животни #1.1 и #1.2, бяха получени общо 964 и 420 уникални 12-мерни пептида (допълнителна фигура 1d-e). Изолираните фагови клонинги бяха амплифицирани и подложени на втори кръг на in vivo селекция. Фагите, екстрахирани от втория кръг на селекция, бяха подложени на HTS във всяко животно и всички идентифицирани пептиди бяха използвани като входни данни за програма за разпознаване на мотиви, за да се анализира наличието на трипептидни мотиви (фиг. 2a, b, ef). В сравнение с първия цикъл на фага, възстановен от CSF, наблюдавахме по-нататъшна селекция и деселекция на много мотиви в CSF в клонове A и B (фиг. 2). Приложен е алгоритъм за мрежова идентификация, за да се определи дали те представляват различни модели на консистентна последователност. Наблюдава се ясно сходство между 12-мерните последователности, възстановени от CSF в алтернативен клад A (фиг. 2c, d) и клад B (фиг. 2g, h). Обединеният анализ във всеки клон разкри различни профили на селекция за 12-мерни пептиди (допълнителна фиг. 5c, d) и увеличение на съотношението титър CSF/кръв с течение на времето за обединените клонове след втория кръг на селекция в сравнение с първия кръг на селекция (допълнителна фиг. 5e).
Обогатяване на мотиви и пептиди в цереброспиналната течност чрез два последователни кръга на in vivo селекция на функционален фагов дисплей.
Всички фаги от цереброспиналната течност, възстановени от първия кръг на всяко животно (животни #1.1 и #1.2), бяха обединени, амплифицирани, HT-секвенирани и повторно инжектирани заедно (2 x 1010 фаги/животно) в 2 SM канулирани плъха (#1.1 → #). 2.1 и 2.2, 1.2 → 2.3 и 2.4). (a,b,e,f) Корелационни диаграми на разсейване, сравняващи относителната честота на трипептидните мотиви на всички фаги, получени от цереброспиналната течност, в първия и втория кръг на селекция. Относителна честота и разпределение на мотивите, представляващи всички възможни припокриващи се трипептиди, открити в пептидите и в двете ориентации. Показан е броят на мотивите, открити в 1000 отчитания. Мотивите, които бяха значително (p < 0,001) селектирани или изключени в една от сравнените библиотеки, са маркирани с червени точки. (c, d, g, h) Лого на последователността, представящо всички богати на CSF последователности с дължина 12 аминокиселини, базирани на кръгове 2 и 1 на in vivo селекция. Размерът на еднобуквения код показва колко често тази аминокиселина се среща на тази позиция. За да се представи логото, честотата на CSF последователностите, извлечени от отделни животни между два кръга на селекция, се сравнява и са показани обогатените последователности във втория кръг: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 и (h) #1.2–#2.4. Най-обогатените аминокиселини на дадена позиция в (c, d) животни № 2.1 и № 2.2 или (g, h) в животни № 2.3 и № 2.4 са показани в цвят. Зелено = полярни, лилаво = неутрални, синьо = основни, червено = киселинни и черно = хидрофобни аминокиселини.
След третия кръг на селекция, идентифицирахме 124 уникални пептидни последователности (#3.1 и #3.2) от 332 фагови клона, реконституирани от CSF, изолирани от две животни (Допълнителна фигура 6a). Последователността LGSVS (18.7%) имаше най-висок относителен дял, следвана от инсертите от див тип PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) и SARGSWREIVSLS (2.2%). В последния четвърти кръг, обединихме два независимо селектирани клона от три отделни животни (Фиг. 1c). От 925 секвенирани фагови клона, възстановени от CSF, в четвъртия кръг открихме 64 уникални пептидни последователности (Допълнителна фигура 6b), сред които относителният дял на фага от див тип спадна до 0.8%. Най-често срещаните CSF клонинги в четвъртия кръг бяха LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) и RLSSVDSDLSGC (3,2%). Диапазонът на дължините на избраните пептиди се дължи на нуклеотидни инсерции/делеции или преждевременни стоп кодони в праймерите на библиотеката, когато се използват дегенерирани кодони за проектиране на NNK библиотеки. Преждевременните стоп кодони генерират по-къси пептиди и са избрани, защото съдържат благоприятния α-аминокиселинен мотив. По-дългите пептиди могат да са резултат от инсерции/делеции в праймерите на синтетичните библиотеки. Това позиционира проектирания стоп кодон извън рамката и го чете, докато не се появи нов стоп кодон надолу по веригата. Като цяло, ние изчислихме коефициентите на обогатяване за всичките четири кръга на селекция, като сравнихме входните данни с изходните данни на пробата. За първия кръг на скрининг използвахме титри на фаги от див тип като неспецифична фонова референция. Интересното е, че негативната фагова селекция е била много силна в първия цикъл на CSF, но не и в кръвта (фиг. 3а), което може да се дължи на ниската вероятност за пасивна дифузия на повечето членове на пептидната библиотека в CSF компартмента или относителните фаги са склонни да се задържат или отстраняват по-ефективно от кръвния поток, отколкото бактериофагите. Въпреки това, във втория кръг на панинг, е наблюдавана силна селекция на фаги в CSF и в двата клада, което предполага, че предишният кръг е бил обогатен с фаги, показващи пептиди, които насърчават усвояването на CSF (фиг. 3а). Отново, без значително обогатяване на кръвта. Също така в третия и четвъртия кръг, фаговите клонове са значително обогатени в CSF. Сравнявайки относителната честота на всяка уникална пептидна последователност между последните два кръга на селекция, установихме, че последователностите са още по-обогатени в четвъртия кръг на селекция (фиг. 3б). Общо 931 трипептидни мотива са извлечени от всички 64 уникални пептидни последователности, използвайки и двете пептидни ориентации. Най-обогатените мотиви в четвъртия кръг бяха по-внимателно изследвани за техните профили на обогатяване във всички кръгове в сравнение с инжектираната библиотека (гранична стойност: 10% обогатяване) (Допълнителна фигура 6в). Общите модели на селекция показаха, че повечето от изследваните мотиви са били обогатени във всички предишни кръгове и на двата клона на селекцията. Някои мотиви (напр. SGL, VSG, LGS GSV) обаче бяха предимно от алтернативен клад А, докато други (напр. FGW, RTN, WGF, NTR) бяха обогатени с алтернативен клад Б.
Валидиране на транспорта в цереброспиналната течност (CSF) на фагово-дисплеирани пептиди, обогатени с CSF, и биотинилирани лидерни пептиди, конюгирани с полезни товари на стрептавидин.
(a) Коефициенти на обогатяване, изчислени във всичките четири кръга (R1-R4) въз основа на инжектираните (вход = I) фагови (PFU) титри и определени фагови титри в цереброспиналната течност (изход = O). Коефициентите на обогатяване за последните три кръга (R2-R4) бяха изчислени чрез сравнение с предишния кръг и първия кръг (R1) с данни за теглото. Отворените ленти представляват цереброспинална течност, защрихованите ленти са плазма. (***p<0,001, базирано на t-тест на Стюдънт). (b) Списък на най-разпространените фагови пептиди, класирани според относителния им дял спрямо всички фаги, събрани в цереброспиналната течност след кръг 4 на селекция. Шестте най-често срещани фагови клона са маркирани с цвят, номерирани, а техните коефициенти на обогатяване между кръг 3 и 4 на селекция (вложки). (c,d) Шестте най-обогатени фагови клона, празни фагови и родителски фагови пептидни библиотеки от кръг 4 бяха анализирани поотделно в модел за вземане на проби от цереброспиналната течност. Проби от цереброспиналната течност и кръвни проби бяха събрани в посочените времеви точки. (в) Равни количества от 6 кандидат-фагови клона (2 x 1010 фаги/животни), празни фаги (#1779) (2 x 1010 фаги/животни) и запасни фагови пептидни библиотеки (2 x 1012 фаги/животни). Инжектирайте поне 3 CM, прилагани поотделно на канюлираното животно през опашната вена. Показана е фармакокинетиката на цереброспиналната течност (CSF) на всеки инжектиран фагов клон и фагова пептидна библиотека с течение на времето. (г) показва средното съотношение CSF/кръв за всички възстановени фаги/mL за времето на вземане на проби. (д) Четири синтетични лидерни пептида и един разбъркан контролен пептид бяха свързани с биотин към стрептавидин чрез техния N-терминус (тетрамерен дисплей), последвано от инжектиране (опашна вена iv, 10 mg стрептавидин/kg). Най-малко три интубирани плъха (N = 3). Проби от цереброспинална течност (CSF) бяха събрани в посочените времеви точки и концентрациите на стрептавидин бяха измерени чрез CSF анти-стрептавидин ELISA (nd = не е открит). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, базирано на ANOVA тест). (f) Сравнение на аминокиселинната последователност на най-обогатения фагов пептиден клон #2002 (лилав) с други селектирани фагови пептидни клонове от 4-ия кръг на селекция. Идентични и подобни аминокиселинни фрагменти са цветово кодирани.
От всички обогатени фаги в четвъртия кръг (фиг. 3б), шест кандидат-клона бяха избрани за по-нататъшен индивидуален анализ в модела за вземане на проби от цереброспинална течност (CSF). Равни количества от шест кандидат-фагови, празни фагови (без вложка) и профагови пептидни библиотеки бяха инжектирани в три канулирани животни с кондиломи (CM), а фармакокинетиката беше определена в CSF (фиг. 3в) и кръвни (допълнителна фиг. 7) анализи. Всички тествани фагови клонове бяха насочени към CSF компартмента на ниво 10-1000 пъти по-високо от това на празния контролен фаг (#1779). Например, клонове #2020 и #2077 имаха около 1000 пъти по-високи CSF титри от контролния фаг. Фармакокинетичният профил на всеки избран пептид е различен, но всички те имат висока способност за хоминг в CSF. Наблюдавахме постоянно намаление с течение на времето за клонове #1903 и #2011, докато за клонове #2077, #2002 и #2009 увеличението през първите 10 минути може да показва активен транспорт, но трябва да бъде потвърдено. Клонове #2020, #2002 и #2077 се стабилизираха на високи нива, докато концентрацията в цереброспиналната течност (CSF) на клон #2009 бавно намаля след първоначалното увеличение. След това сравнихме относителната честота на всеки кандидат в CSF с неговата концентрация в кръвта (фиг. 3d). Корелацията на средния титър на всеки кандидат в CSF с неговия титър в кръвта при всички времена на вземане на проби показа, че три от шестте кандидата са значително обогатени в CSF в кръвта. Интересното е, че клон #2077 показа по-висока стабилност в кръвта (допълнителна фигура 7). За да потвърдим, че самите пептиди са способни активно да транспортират товар, различен от фагови частици, в компартмента на CSF, синтезирахме четири лидерни пептида, дериватизирани с биотин в N-края, където пептидите се прикрепят към фаговата частица. Биотинилираните пептиди (№ 2002, 2009, 2020 и 2077) бяха конюгирани със стрептавидин (SA), за да се получат мултимерни форми, донякъде имитиращи фаговата геометрия. Този формат ни позволи също да измерим експозицията на SA в кръвта и цереброспиналната течност като товарно-транспортиращи протеинови пептиди. Важно е, че данните за фагите често можеха да бъдат възпроизведени, когато синтетичните пептиди бяха приложени в този SA-конюгиран формат (фиг. 3д). Разбърканите пептиди имаха по-малка начална експозиция и по-бързо клирънсиране в цереброспиналната течност с неоткриваеми нива в рамките на 48 часа. За да получим представа за пътищата на доставяне на тези пептидни фагови клонове в цереброспиналното пространство, анализирахме локализацията на отделни фагови пептидни удари, използвайки имунохистохимия (IHC), за да открием директно фагови частици 1 час след интравенозно инжектиране in vivo. Забележително е, че клонинги #2002, #2077 и #2009 могат да бъдат открити чрез силно оцветяване в мозъчните капиляри, докато контролният фаг (#1779) и клонинг #2020 не бяха открити (Допълнителна фигура 8). Това предполага, че тези пептиди допринасят за ефекта върху мозъка именно чрез преминаване през КМБ. Необходим е по-нататъшен подробен анализ, за ​​да се тества тази хипотеза, тъй като може да участва и BSCFB пътят. При сравняване на аминокиселинната последователност на най-обогатения клонинг (#2002) с други избрани пептиди беше отбелязано, че някои от тях имат подобни аминокиселинни разширения, което може да показва подобен транспортен механизъм (фиг. 3f).
Поради уникалния си плазмен профил и значителното увеличение на цереброспиналната течност (CSF) с течение на времето, фаговият дисплей клон #2077 беше допълнително изследван за по-дълъг 48-часов период и успя да възпроизведе бързото увеличение на CSF, наблюдавано във връзка с устойчиви нива на SA (Фиг. 4а). Що се отнася до други идентифицирани фагови клонове, #2077 се оцвети силно за мозъчни капиляри и показа значителна колокализация с капилярен маркер лектин, когато се наблюдава с по-висока резолюция, и евентуално известно оцветяване в паренхимното пространство (Фигура 4б). За да изследваме дали пептидно-медиирани фармакологични ефекти могат да бъдат получени в ЦНС, проведохме експеримент, в който биотинилирани версии на i) транзитния пептид #2077 и ii) инхибиторния пептид BACE1 бяха смесени със SA в две различни съотношения. За едната комбинация използвахме само инхибитора на пептида BACE1, а за другата използвахме съотношение 1:3 на инхибитор на пептида BACE1 към пептид #2077. И двете проби бяха приложени интравенозно и нивата на бета-амилоиден пептид 40 (Abeta40) в кръвта и цереброспиналната течност бяха измерени с течение на времето. Abeta40 беше измерен в цереброспиналната течност (CSF), тъй като отразява инхибирането на BACE1 в мозъчния паренхим. Както се очакваше, и двата комплекса значително намалиха кръвните нива на Abeta40 (фиг. 4c, d). Въпреки това, само проби, съдържащи смес от пептид № 2077 и инхибитор на BACE1 пептида, конюгиран със SA, причиниха значително намаляване на Abeta40 в цереброспиналната течност (фиг. 4c). Данните показват, че пептид № 2077 е способен да транспортира 60 kDa SA протеина в ЦНС и също така индуцира фармакологични ефекти с SA-конюгирани инхибитори на BACE1 пептида.
(а) Клонално инжектиране (2 × 10 фага/животно) на T7 фаг, показващо дългосрочни фармакокинетични профили на CSF пептид #2077 (RLSSVDSDLSGC) и неинжектиран контролен фаг (#1779) в поне три CM-интубирани плъха. (б) Конфокално микроскопско изображение на представителни кортикални микросъдове в плъхове, инжектирани с фаги (2 × 10 10 фага/животно), показващо контраоцветяване на пептид #2077 и съдове (лектин). Тези фагови клонове са приложени на 3 плъха и са оставени да циркулират 1 час преди перфузия. Мозъците са срязани и оцветени с поликлонални FITC-маркирани антитела срещу капсида на T7 фага. Десет минути преди перфузията и последващата фиксация, DyLight594-маркиран лектин е приложен интравенозно. Флуоресцентни изображения, показващи оцветяване с лектин (червено) на луминалната страна на микросъдовете и фагите (зелено) в лумена на капилярите и периваскуларната мозъчна тъкан. Скалата съответства на 10 µm. (c, d) Биотинилиран BACE1 инхибиторен пептид самостоятелно или в комбинация с биотинилиран транзитен пептид #2077 е свързан със стрептавидин, последвано от интравенозно инжектиране на поне три канулирани CM плъха (10 mg стрептавидин/kg). Намаляването на Aβ40, медиирано от BACE1 пептидния инхибитор, е измерено чрез Aβ1-40 ELISA в кръв (червено) и цереброспинална течност (оранжево) в посочените времеви точки. За по-добра яснота, пунктирана линия е начертана на графиката в мащаб от 100%. (c) Процентно намаление на Aβ40 в кръвта (червени триъгълници) и цереброспиналната течност (оранжеви триъгълници) при плъхове, третирани със стрептавидин, конюгиран с транзитен пептид #2077 и BACE1 инхибиторен пептид в съотношение 3:1. (d) Процентно намаление на Aβ40 в кръвта (червени кръгове) и цереброспиналната течност (оранжеви кръгове) на плъхове, третирани само със стрептавидин, свързан с BACE1 инхибиторен пептид. Концентрацията на Aβ в контролата беше 420 pg/ml (стандартно отклонение = 101 pg/ml).
Фаговият дисплей е успешно приложен в няколко области на биомедицинските изследвания17. Този метод е използван за in vivo изследвания на съдовото разнообразие18,19, както и за изследвания, насочени към мозъчните съдове20,21,22,23,24,25,26. В това проучване разширихме приложението на този метод за селекция не само до директно идентифициране на пептиди, насочени към мозъчните съдове, но и до откриването на кандидати с активни транспортни свойства за преминаване през кръвно-мозъчната бариера. Сега описваме разработването на in vivo процедура за селекция при интубирани плъхове с CM и демонстрираме нейния потенциал за идентифициране на пептиди със свойства за хоминг в цереброспиналната течност (CSF). Използвайки T7 фага, показващ библиотека от 12-мерни случайни пептиди, успяхме да демонстрираме, че T7 фагът е достатъчно малък (приблизително 60 nm в диаметър)10, за да се адаптира към кръвно-мозъчната бариера, като по този начин директно преминава през кръвно-мозъчната бариера или хороидния плексус. Наблюдавахме, че събирането на CSF от канулирани CM плъхове е добре контролиран in vivo метод за функционален скрининг и че екстрахираният фаг не само се свързва с васкулатурата, но и функционира като транспортер през кръвно-мозъчната бариера. Освен това, чрез едновременно събиране на кръв и прилагане на HTS към CSF и фаги, получени от кръв, потвърдихме, че изборът ни на CSF не е повлиян от обогатяването на кръвта или годността за разширяване между кръговете на селекция. Кръвното отделение обаче е част от процедурата за селекция, тъй като фагите, способни да достигнат до CSF отделението, трябва да оцелеят и да циркулират в кръвния поток достатъчно дълго, за да се обогатят в мозъка. За да извлечем надеждна информация за последователността от суровите HTS данни, внедрихме филтри, адаптирани към специфични за платформата грешки в секвенирането в работния процес на анализ. Чрез включване на кинетични параметри в метода на скрининг, потвърдихме бързата фармакокинетика на фагите от див тип T7 (t½ ~ 28 минути) в кръвта24, 27, 28 и също така определихме техния полуживот в цереброспиналната течност (t½ ~ 26 минути) в минута). Въпреки сходните фармакокинетични профили в кръвта и цереброспиналната течност (CSF), само 0,001% от кръвната концентрация на фаг може да бъде открита в CSF, което показва ниска фонова мобилност на див тип T7 фаг през кръвно-мозъчната бариера. Тази работа подчертава значението на първия кръг на селекция при използване на in vivo стратегии за панинг, особено за фагови системи, които бързо се отстраняват от кръвообращението, тъй като малко клонинги са в състояние да достигнат до компартмента на ЦНС. По този начин, в първия кръг, намаляването на разнообразието в библиотеките е много голямо, тъй като в този много строг CSF модел в крайна сметка са събрани само ограничен брой клонинги. Тази in vivo стратегия за панинг включва няколко стъпки на селекция, като активно натрупване в компартмента на CSF, оцеляване на клонингите в кръвния компартмент и бързо отстраняване на T7 фагови клонинги от кръвта в рамките на първите 10 минути (Фиг. 1d и Допълнителна Фиг. 4M). По този начин, след първия кръг, в CSF са идентифицирани различни фагови клонинги, въпреки че за отделните животни е използван един и същ начален пул. Това предполага, че множество строги стъпки на селекция за изходни библиотеки с голям брой членове на библиотеката водят до значително намаляване на разнообразието. Следователно, случайните събития ще станат неразделна част от първоначалния процес на селекция, оказвайки голямо влияние върху резултата. Вероятно много от клонингите в оригиналната библиотека са имали много сходна склонност към обогатяване на CSF. Въпреки това, дори при едни и същи експериментални условия, резултатите от селекцията може да се различават поради малкия брой на всеки отделен клон в първоначалния пул.
Мотивите, обогатени в цереброспиналната течност (CSF), се различават от тези в кръвта. Интересно е, че отбелязахме първото изместване към богати на глицин пептиди в кръвта на отделни животни (фиг. 1g, допълнителни фигури 4e, 4f). Фагите, съдържащи глицинови пептиди, може да са по-стабилни и по-малко вероятно да бъдат извадени от кръвообращението. Тези богати на глицин пептиди обаче не бяха открити в пробите от цереброспиналната течност, което предполага, че курираните библиотеки са преминали през два различни етапа на селекция: един в кръвта, а друг, оставен да се натрупа в цереброспиналната течност. Клоновете, обогатени с CSF, получени в резултат на четвъртия кръг на селекция, са били обстойно тествани. Почти всички индивидуално тествани клонове са потвърдени като обогатени с CSF в сравнение с контролния фаг с празна проба. Един пептиден хит (#2077) беше изследван по-подробно. Той показа по-дълъг плазмен полуживот в сравнение с други хитове (фигура 3d и допълнителна фигура 7) и интересно е, че този пептид съдържа цистеинов остатък в C-края. Наскоро беше показано, че добавянето на цистеин към пептидите може да подобри техните фармакокинетични свойства чрез свързване с албумин 29. Това понастоящем е неизвестно за пептид #2077 и изисква по-нататъшно проучване. Някои пептиди показаха валентна зависимост в обогатяването на цереброспиналната течност (CSF) (данните не са показани), което може да е свързано с показаната повърхностна геометрия на T7 капсида. Използваната от нас T7 система показа 5-15 копия на всеки пептид на фагова частица. IHC беше проведена върху кандидат-водещи фагови клонове, инжектирани интравенозно в мозъчната кора на плъхове (Допълнителна фигура 8). Данните показаха, че поне три клона (№ 2002, № 2009 и № 2077) взаимодействат с BBB. Остава да се определи дали това BBB взаимодействие води до натрупване на CSF или до движение на тези клонове директно към BCSFB. Важно е, че показваме, че избраните пептиди запазват своя CSF транспортен капацитет, когато са синтезирани и свързани с протеиновия товар. Свързването на N-терминални биотинилирани пептиди със SA по същество повтаря резултатите, получени със съответните им фагови клонове в кръвта и цереброспиналната течност (фиг. 3д). Накрая, ние показваме, че водещият пептид #2077 е способен да стимулира мозъчното действие на биотинилиран пептиден инхибитор на BACE1, конюгиран със SA, причинявайки изразени фармакодинамични ефекти в ЦНС чрез значително намаляване на нивата на Abeta40 в цереброспиналната течност (фиг. 4). Не успяхме да идентифицираме никакви хомолози в базата данни, като извършихме търсене на хомология на пептидна последователност на всички попадения. Важно е да се отбележи, че размерът на T7 библиотеката е приблизително 109, докато теоретичният размер на библиотеката за 12-мерите е 4 x 1015. Следователно, ние избрахме само малка част от пространството на разнообразие на 12-мерната пептидна библиотека, което може да означава, че по-оптимизирани пептиди могат да бъдат идентифицирани чрез оценка на съседното пространство на последователностите на тези идентифицирани попадения. Хипотетично, една от причините, поради които не сме открили естествени хомолози на тези пептиди, може да е деселекцията по време на еволюцията, за да се предотврати неконтролираното навлизане на определени пептидни мотиви в мозъка.
Взети заедно, нашите резултати предоставят основа за бъдеща работа за идентифициране и характеризиране на транспортните системи на цереброваскуларната бариера in vivo по-подробно. Основната настройка на този метод се основава на стратегия за функционална селекция, която не само идентифицира клонинги със свойства на свързване с мозъчните съдове, но също така включва критична стъпка, при която успешните клонинги имат присъща активност за преминаване през биологични бариери in vivo в компартмента на ЦНС. е да се изясни механизмът на транспорт на тези пептиди и тяхното предпочитание за свързване с микросъдовата система, специфична за мозъчната област. Това може да доведе до откриването на нови пътища за транспорт на кръвно-мозъчната бариера (КМБ) и рецепторите. Очакваме, че идентифицираните пептиди могат директно да се свързват с мозъчно-съдови рецептори или с циркулиращи лиганди, транспортирани през КМБ или BCSFB. Пептидните вектори с транспортна активност в цереброваскуларната бариера, открити в тази работа, ще бъдат допълнително изследвани. В момента изследваме мозъчната специфичност на тези пептиди по отношение на способността им да преминават през КМБ и/или BCSFB. Тези нови пептиди ще бъдат изключително ценни инструменти за потенциалното откриване на нови рецептори или пътища и за разработването на нови високоефективни платформи за доставяне на макромолекули, като биологични препарати, до мозъка.
Канулирайте голямата цистерна (ГЦ), използвайки модификация на описания по-рано метод. Анестезирани плъхове Wistar (200-350 g) бяха монтирани на стереотаксичен апарат и беше направен среден разрез върху обръснатия и асептично подготвен скалп, за да се разкрие черепът. Пробийте два отвора в областта на горната част на главата и затегнете фиксиращите винтове в отворите. Допълнителен отвор беше пробит в страничния окципитален гребен за стереотактично насочване на канюла от неръждаема стомана в ГЦ. Поставете дентален цимент около канюлата и закрепете с винтове. След фотополимеризация и втвърдяване на цимента, кожната рана беше затворена с 4/0 супрамиден шев. Правилното поставяне на канюлата се потвърждава от спонтанно изтичане на цереброспинална течност (ЦСТ). Извадете плъха от стереотаксичния апарат, получете подходящи следоперативни грижи и лечение на болката и го оставете да се възстанови поне една седмица, докато се наблюдават признаци на кръв в цереброспиналната течност. Плъховете Wistar (Crl:WI/Han) бяха получени от Charles River (Франция). Всички плъхове са били отглеждани при специфични условия, свободни от патогени. Всички експерименти с животни са били одобрени от Ветеринарната служба на град Базел, Швейцария, и са били проведени в съответствие с Лиценз за животни № 2474 (Оценка на активния мозъчен транспорт чрез измерване на нивата на терапевтични кандидати в цереброспиналната течност и мозъка на плъх).
Внимателно дръжте плъха в съзнание с канюлата за цереброспинална течност (ЦСТ) в ръка. Извадете татула от канюлата и съберете 10 µl спонтанно течаща цереброспинална течност. Тъй като проходимостта на канюлата в крайна сметка беше нарушена, в това проучване бяха включени само проби от бистра цереброспинална течност без данни за замърсяване с кръв или промяна на цвета. Успоредно с това, приблизително 10–20 μl кръв бяха взети от малък разрез на върха на опашката в епруветки с хепарин (Sigma-Aldrich). Цереброспинална течност (CSF) и кръв бяха събрани в различни времеви точки след интравенозно инжектиране на фаг T7. Приблизително 5–10 μl течност бяха изхвърлени преди събиране на всяка проба от ЦСТ, което съответства на мъртвия обем на катетъра.
Библиотеките бяха генерирани с помощта на вектора T7Select 10-3b, както е описано в ръководството за системата T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Накратко, произволна 12-мерна ДНК вложка беше синтезирана в следния формат:
Кодонът NNK беше използван, за да се избегнат двойни стоп кодони и свръхекспресия на аминокиселини във вложката. N е ръчно смесено еквимоларно съотношение на всеки нуклеотид, а K е ръчно смесено еквимоларно съотношение на аденинови и цитозинови нуклеотиди. Едноверижните региони бяха превърнати в двуверижна ДНК чрез по-нататъшна инкубация с dNTP (Novagen) и ензим Klenow (New England Biolabs) в буфер Klenow (New England Biolabs) в продължение на 3 часа при 37°C. След реакцията, двуверижната ДНК беше възстановена чрез утаяване с EtOH. Получената ДНК беше смляна с рестрикционни ензими EcoRI и HindIII (и двата от Roche). Разцепената и пречистена (QIAquick, Qiagen) вложка (T4 лигаза, New England Biolabs) след това беше лигирана в рамката в предварително разцепен T7 вектор след аминокиселина 348 от капсидния ген 10B. Лигиращите реакции бяха инкубирани при 16°C в продължение на 18 часа преди in vitro опаковане. Опаковането на фаги in vitro беше извършено съгласно инструкциите, предоставени с комплекта за клониране T7Select 10-3b (Novagen), и разтворът за опаковане беше амплифициран еднократно до лизиране с помощта на Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Лизатите бяха центрофугирани, титрувани и замразени при -80°C като основен разтвор на глицерол.
Директна PCR амплификация на фагови вариабилни региони, амплифицирани в бульон или плака, използвайки патентовани 454/Roche-amplicon фузионни праймери. Праймерът за директно фузионно съединение съдържа последователности, фланкиращи вариабилния регион (NNK) 12 (специфичен за шаблона), GS FLX Titanium Adapter A и ключова последователност от четири бази от библиотеката (TCAG) (Допълнителна фигура 1а):
Праймерът за обратно сливане съдържа също биотин, прикрепен към улавящи перли, и GS FLX Titanium Adapter B, необходим за клонална амплификация по време на емулсионна PCR:
Ампликоните след това бяха подложени на пиросеквениране с 454/Roche съгласно протокола 454 GS-FLX Titanium. За ръчно секвениране по Сангер (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ДНК на фаг T7 беше амплифицирана чрез PCR и секвенирана със следните двойки праймери:
Вложки от отделни плаки бяха подложени на PCR амплификация, използвайки Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (съгласно инструкциите на производителя). Извършени са горещ старт (10 минути при 95 °C) и 35 цикъла на усилване (50 секунди при 95 °C, 1 минута при 50 °C и 1 минута при 72 °C).
Фаги от библиотеки, фаги от див тип, фаги, извлечени от цереброспинална течност и кръв, или отделни клонинги бяха амплифицирани в Escherichia coli BL5615 в TB бульон (Sigma Aldrich) или в 500 cm2 блюда (Thermo Scientific) в продължение на 4 часа при 37°C. Фагите бяха екстрахирани от плаките чрез изплакване на плаките с Tris-EDTA буфер (Fluka Analytical) или чрез събиране на плаките със стерилни накрайници на пипети. Фагите бяха изолирани от културалната супернатанта или екстракционния буфер с един цикъл утаяване с полиетиленгликол (PEG 8000) (Promega) и ресуспендирани в Tris-EDTA буфер.
Амплифицираният фаг беше подложен на 2-3 кръга отстраняване на ендотоксини, използвайки перли за отстраняване на ендотоксини (Miltenyi Biotec) преди интравенозно (IV) инжектиране (500 μl/животно). В първия кръг бяха въведени 2×1012 фага; във втория - 2×1010 фага; в третия и четвъртия кръг на селекция - 2×109 фага на животно. Съдържанието на фаги в CSF и кръвни проби, събрани в посочените времеви точки, беше определено чрез броене на плаки съгласно инструкциите на производителя (ръководство за системата T7Select). Селекцията на фаги беше извършена чрез интравенозно инжектиране на пречистени библиотеки в опашната вена или чрез повторно инжектиране на фаг, екстрахиран от CSF от предишния кръг на селекция, а последващите събирания бяха извършени съответно на 10 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 180 мин и 240 мин за CSF и кръвни проби. Проведени са общо четири кръга на in vivo панинг, при които двата избрани клона са съхранявани и анализирани отделно по време на първите три кръга на селекция. Всички фагови вложки, екстрахирани от CSF от първите два кръга на селекция, са подложени на пиросеквениране 454/Roche, докато всички клонове, екстрахирани от CSF от последните два кръга на селекция, са секвенирани ръчно. Всички кръвни фаги от първия кръг на селекция също са подложени на пиросеквениране 454/Roche. За инжектиране на фагови клонове, избраните фаги са амплифицирани в E. coli (BL5615) върху 500 cm2 плаки при 37°C в продължение на 4 часа. Индивидуално селектираните и ръчно секвенирани клонове са размножени в TB среда. След екстракция на фаги, пречистване и отстраняване на ендотоксин (както е описано по-горе), 2×1010 фаги/животно в 300 μl са инжектирани интравенозно в едната опашна вена.
Предварителна обработка и качествено филтриране на данни за последователности. Суровите 454/Roche данни бяха конвертирани от двоичен стандартен формат на stream map (sff) в Pearson, четим за човек формат (fasta), използвайки софтуер на доставчика. По-нататъшната обработка на нуклеотидната последователност беше извършена с помощта на собствени C програми и скриптове (неиздаван софтуерен пакет), както е описано по-долу. Анализът на първичните данни включва строги многоетапни процедури за филтриране. За да се филтрират прочитания, които не съдържат валидна 12-мерна вложка ДНК последователност, прочитанията бяха последователно подравнени към стартов етикет (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), стоп етикет (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) и фонов вложък (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC), използвайки глобалния тест на Needleman-Wunsch. подравняване, позволяващо до 2 несъответствия на подравняване31. Следователно, прочитания без стартови и стоп етикети и прочитания, съдържащи фонови вложки, т.е. подравнявания, които надвишават разрешения брой несъответствия, бяха премахнати от библиотеката. Що се отнася до останалите прочетени фрагменти, N-мерната ДНК последователност, простираща се от началния маркер и завършваща преди стоп маркера, беше изрязана от оригиналната прочетена последователност и допълнително обработена (наричана по-долу „вмъкване“). След транслацията на вмъкването, частта след първия стоп кодон в 5′ края на праймера се отстранява от вмъкването. Освен това, нуклеотидите, водещи до непълни кодони в 3′ края на праймера, също бяха премахнати. За да се изключат вмъквания, съдържащи само фонови последователности, транслираните вмъквания, започващи с аминокиселинния модел „PAG“, също бяха премахнати. Пептиди с посттранслационна дължина по-малка от 3 аминокиселини бяха премахнати от библиотеката. Накрая, излишъкът в пула от вмъквания беше премахнат и честотата на всяко уникално вмъкване беше определена. Резултатите от този анализ включваха списък с нуклеотидни последователности (вмъквания) и техните (прочетени) честоти (допълнителни фигури 1в и 2).
Групиране на N-mer ДНК вложки по сходство в последователността: За да се елиминират специфични за 454/Roche грешки в секвенирането (като проблеми със секвенирането на хомополимерни удължения) и да се премахнат по-малко важните излишества, предварително филтрираните N-mer ДНК вложки (вложки) се сортират по сходство. Вложките (вложките) се сортират първо по честота (от най-висока към най-ниска) и ако са еднакви, по вторично сортиране по дължина (от най-дълга към най-къса). По този начин, най-честите и най-дълги вложки определят първата „група“. Честотата на групата се задава на ключовата честота. След това, всяка вложка, останала в сортирания списък, се опитва да бъде добавена към групата чрез двойни Needleman-Wunsch подравняване. Ако броят на несъответствията, вложките или делециите в подравняването не надвишава праг от 2, към групата се добавя вложка и общата честота на групата се увеличава с честотата на добавяне на вложката. Вложките, добавени към група, се маркират като използвани и се изключват от по-нататъшна обработка. Ако вмъкнатата последователност не може да бъде добавена към вече съществуваща група, тя се използва за създаване на нова група с подходяща честота на вмъкване и се маркира като използвана. Итерацията приключва, когато всяка вмъкната последователност е била използвана за формиране на нова група или може да бъде включена във вече съществуваща група. В крайна сметка, групираните вмъквания, състоящи се от нуклеотиди, в крайна сметка се транслират в пептидни последователности (пептидни библиотеки). Резултатът от този анализ е набор от вмъквания и съответните им честоти, които съставляват броя на последователните четения (Допълнителна фигура 2).
Генериране на мотиви: Въз основа на списък с уникални пептиди е създадена библиотека, съдържаща всички възможни аминокиселинни модели (АК), както е показано по-долу. Всеки възможен модел с дължина 3 е извлечен от пептида и е добавен неговият обратен модел, заедно с обща библиотека с мотиви, съдържаща всички модели (трипептиди). Библиотеките с силно повтарящи се мотиви са секвенирани и излишествата са премахнати. След това, за всеки трипептид в библиотеката с мотиви, ние проверихме за неговото наличие в библиотеката, използвайки изчислителни инструменти. В този случай честотата на пептида, съдържащ намерения мотив трипептид, се добавя и се присвоява на мотива в библиотеката с мотиви („брой мотиви“). Резултатът от генерирането на мотиви е двуизмерен масив, съдържащ всички появявания на трипептиди (мотиви) и техните съответни стойности, които са броят на секвениращите прочитания, които водят до съответния мотив, когато прочитанията са филтрирани, групирани и транслирани. Метриките са описани подробно по-горе.
Нормализиране на броя на мотивите и съответните диаграми на разсейване: Броят на мотивите за всяка проба беше нормализиран с помощта на
където ni е броят на прочитанията, съдържащи тема i. По този начин, vi представлява процентната честота на прочитанията (или пептидите), съдържащи мотив i в извадката. P-стойностите за ненормализирания брой мотиви бяха изчислени с помощта на точния тест на Фишър. По отношение на корелограмите на броя на мотивите, корелациите на Спиърман бяха изчислени с помощта на нормализирания брой мотиви с R.
За визуализиране на съдържанието на аминокиселини във всяка позиция в пептидната библиотека бяха създадени уеб логограми 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Първо, съдържанието на аминокиселини във всяка позиция на 12-мерния пептид се съхранява в матрица 20×12. След това, набор от 1000 пептида, съдържащи същото относително съдържание на аминокиселини във всяка позиция, се генерира във fasta-sequence формат и се предоставя като вход към web-logo 3, който генерира графично представяне на относителното съдържание на аминокиселини във всяка позиция за дадена пептидна библиотека. За визуализиране на многомерни набори от данни бяха създадени топлинни карти с помощта на вътрешно разработен инструмент в R (biosHeatmap, все още предстоящ R пакет). Дендрограмите, представени в топлинните карти, бяха изчислени с помощта на йерархичния метод на клъстериране на Ward с метриката на евклидовото разстояние. За статистически анализ на данните за оценяване на мотиви, P стойностите за ненормализирано оценяване бяха изчислени с помощта на точния тест на Fisher. P-стойностите за други набори от данни бяха изчислени в R, използвайки t-тест на Стюдънт или ANOVA.
Избрани фагови клонове и фаги без инсерти бяха инжектирани интравенозно през опашната вена (2×1010 фаги/животно в 300 μl PBS). Десет минути преди перфузията и последващата фиксация, същите животни бяха инжектирани интравенозно със 100 μl DyLight594-маркиран лектин (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 минути след инжектирането на фаги, плъховете бяха перфузирани през сърцето с 50 ml PBS, последвано от 50 ml 4% PFA/PBS. Мозъчните проби бяха допълнително фиксирани за една нощ в 4% PFA/PBS и накиснати в 30% захароза за една нощ при 4°C. Пробите бяха замразени бързо в OCT сместа. Имунохистохимичният анализ на замразени проби беше извършен при стайна температура върху 30 µm криосрези, блокирани с 1% BSA и инкубирани с поликлонални FITC-маркирани антитела срещу T7 фаг (Novus NB 600-376A) при 4°C. Инкубирайте за една нощ. Накрая, срезите бяха промити 3 пъти с PBS и изследвани с конфокален лазерен микроскоп (Leica TCS SP5).
Всички пептиди с минимална чистота от 98% са синтезирани от GenScript USA, биотинилирани и лиофилизирани. Биотинът е свързан чрез допълнителен троен глицинов спейсър в N-края. Проверете всички пептиди с помощта на масспектрометрия.
Стрептавидин (Sigma S0677) е смесен с 5-кратен еквимоларен излишък от биотинилиран пептид, биотинилиран BACE1 инхибиторен пептид или комбинация (съотношение 3:1) от биотинилиран BACE1 инхибиторен пептид и BACE1 инхибиторен пептид в 5–10% DMSO/инкубиран в PBS. 1 час при стайна температура преди инжектиране. Стрептавидин-конюгирани пептиди са инжектирани интравенозно в доза от 10 mg/kg в една от опашните вени на плъхове с мозъчна кухина.
Концентрацията на стрептавидин-пептидните комплекси беше оценена чрез ELISA. Микротитърните плаки Nunc Maxisorp (Sigma) бяха покрити за една нощ при 4°C с 1.5 μg/ml мише анти-стрептавидин антитяло (Thermo, MA1-20011). След блокиране (блокиращ буфер: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% желатин, 1% BSA) при стайна температура в продължение на 2 часа, плаката беше промита с 0.05% Tween-20/PBS (промивен буфер) за 3 секунди. Проби от цереброспинална течност и плазма бяха добавени към ямките, разредени с блокиращ буфер (плазма 1:10 000, цереброспинална течност 1:115). След това плаката беше инкубирана за една нощ при 4°C с детекционно антитяло (1 μg/ml, анти-стрептавидин-HRP, Novus NB120-7239). След три стъпки на промиване, стрептавидинът беше открит чрез инкубация в разтвор на TMB субстрат (Roche) в продължение на до 20 минути. След спиране на развитието на цвета с 1M H2SO4, се измерва абсорбцията при 450 nm.
Функцията на комплекса стрептавидин-пептид-BACE1 инхибитор беше оценена чрез Aβ(1-40) ELISA съгласно протокола на производителя (Wako, 294-64701). Накратко, пробите от цереброспиналната течност (CSF) бяха разредени в стандартен разредител (1:23) и инкубирани за една нощ при 4°C в 96-ямкови плаки, покрити с BNT77 улавящо антитяло. След пет стъпки на промиване беше добавено HRP-конюгирано BA27 антитяло и инкубирано за 2 часа при 4°C, последвано от пет стъпки на промиване. Aβ(1–40) беше открит чрез инкубация в TMB разтвор за 30 минути при стайна температура. След като развитието на цвета беше спряно със стоп разтвор, се измери абсорбцията при 450 nm. Плазмените проби бяха подложени на твърдофазна екстракция преди Aβ(1–40) ELISA. Плазмата беше добавена към 0.2% DEA (Sigma) в 96-ямкови плаки и инкубирана при стайна температура за 30 минути. След последователно промиване на SPE плаките (Oasis, 186000679) с вода и 100% метанол, плазмени проби бяха добавени към SPE плаките и цялата течност беше отстранена. Пробите бяха промити (първо с 5% метанол, след това с 30% метанол) и елуирани с 2% NH4OH/90% метанол. След изсушаване на елуата при 55°C в продължение на 99 минути при постоянен N2 ток, пробите бяха редуцирани в стандартни разредители и Aβ(1–40) беше измерен, както е описано по-горе.
Как да цитирате тази статия: Урих, Е. и др. Доставка на товар до мозъка с помощта на транзитни пептиди, идентифицирани in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Лихота Й., Скьоринге Т., Томсен Л.Б. и Мус Т. Доставка на макромолекулни лекарства до мозъка чрез таргетна терапия. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Брасневич, И., Щайнбуш, Х.В., Шмитц, К. и Мартинес-Мартинес, П. Доставка на пептидни и протеинови лекарства през кръвно-мозъчната бариера. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардридж, УМ Кръвно-мозъчната бариера: пречка в разработването на лекарства за мозъка. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Йохансон, К.Е., Дънкан, Дж.А., Стопа, Е.Г. и Бърд, А. Перспективи за подобрено доставяне на лекарства и насочване към мозъка чрез пътя хороидеален плексус-ликвор. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардридж, УМ Модернизация на биофармацевтиците с молекулярни троянски коне за доставка до мозъка. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардридж, WM рецептор-медииран пептиден транспорт през кръвно-мозъчната бариера. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Увеличаване на проникването в мозъка и ефикасността на терапевтичните антитела с помощта на моновалентни молекулярни совалки. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Транспортът на трансфериновия рецептор (TfR) определя усвояването на афинитетни варианти на TfR антитела в мозъка. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).