Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz cheklangan CSS qo'llab-quvvatlashiga ega brauzer versiyasidan foydalanmoqdasiz. Eng yaxshi tajriba uchun sizga yangilangan brauzerdan foydalanishingizni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'ying). Bundan tashqari, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublarsiz va JavaScriptsiz ko'rsatamiz.
Bir vaqtning o'zida uchta slayddan iborat karuselini ko'rsatadi. Bir vaqtning o'zida uchta slayd bo'ylab harakatlanish uchun "Oldingi" va "Keyingi" tugmalaridan foydalaning yoki bir vaqtning o'zida uchta slayd bo'ylab harakatlanish uchun oxiridagi slayder tugmalaridan foydalaning.
Qon-miya to'sig'i va qon-miya to'sig'i bioterapevtik vositalarning markaziy asab tizimidagi maqsadlariga erishishiga to'sqinlik qiladi va shu bilan nevrologik kasalliklarni samarali davolashga to'sqinlik qiladi. In vivo sharoitida yangi miya tashuvchilarini kashf etish uchun biz T7 fag peptid kutubxonasini kiritdik va kalamushlarning kanüllangan ongli katta hovuz modeli yordamida qon va orqa miya suyuqligini (BMS) ketma-ket to'pladik. To'rt bosqichli tanlovdan so'ng ma'lum fag klonlari BMSga yuqori darajada boyitildi. Alohida nomzod peptidlarni sinovdan o'tkazish BMSda 1000 baravardan ortiq boyitishni aniqladi. Peptid vositachiligida miyaga yetkazib berishning bioaktivligi aniqlangan yangi tranzit peptidi bilan bog'langan BACE1 peptid inhibitori yordamida orqa miya suyuqligidagi amiloid-β darajasining 40% ga pasayishi bilan tasdiqlandi. Bu natijalar in vivo fag tanlash usullari bilan aniqlangan peptidlar makromolekulalarni miyaga terapevtik ta'sir ko'rsatadigan tizimli yetkazib berish uchun foydali vositalar bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi.
Markaziy asab tizimi (MNS) maqsadli terapiya tadqiqotlari asosan MNSga yo'naltirilgan xususiyatlarga ega optimallashtirilgan dorilar va agentlarni aniqlashga qaratilgan bo'lib, miyaga faol dori yetkazib berish mexanizmlarini kashf etishga kamroq kuch sarflanadi. Bu hozirda o'zgarishni boshlamoqda, chunki dori yetkazib berish, ayniqsa katta molekulalar, zamonaviy nevrologiya dori vositalarini ishlab chiqishning ajralmas qismi hisoblanadi. Markaziy asab tizimining muhiti qon-miya to'sig'i (BBB) ​​va qon-miya to'sig'idan (BCBB) iborat miya-qon tomir to'sig'i tizimi tomonidan yaxshi himoyalangan1,2, bu esa dorilarni miyaga yetkazib berishni qiyinlashtiradi1,2. Deyarli barcha katta molekulali dorilar va kichik molekulali dorilarning 98% dan ortig'i miyadan chiqarib yuborilishi taxmin qilinmoqda3. Shuning uchun MNSga terapevtik dorilarni samarali va o'ziga xos yetkazib berishni ta'minlaydigan yangi miya transport tizimlarini aniqlash juda muhimdir4,5. Biroq, BBB va BCSFB ham dori yetkazib berish uchun ajoyib imkoniyat yaratadi, chunki ular miyaning barcha tuzilmalariga uning keng qon tomirlari orqali kirib boradi. Shunday qilib, miyaga invaziv bo'lmagan yetkazib berish usullarini qo'llash bo'yicha hozirgi sa'y-harakatlar asosan endogen BBB6 retseptorlari yordamida retseptorlar vositasida transport (PMT) mexanizmiga asoslangan. Transferrin retseptorlari yo'lidan foydalanishda so'nggi paytlarda erishilgan muhim yutuqlarga qaramay7,8, yaxshilangan xususiyatlarga ega yangi yetkazib berish tizimlarini yanada rivojlantirish talab etiladi. Shu maqsadda bizning maqsadimiz CSF transportini vositachilik qila oladigan peptidlarni aniqlash edi, chunki ular printsipial jihatdan MNSga makromolekulalarni yetkazib berish yoki yangi retseptor yo'llarini ochish uchun ishlatilishi mumkin. Xususan, miya qon-tomir tizimining o'ziga xos retseptorlari va tashuvchilari (BBB va BSCFB) bioterapevtik dorilarni faol va o'ziga xos yetkazib berish uchun potentsial nishon bo'lib xizmat qilishi mumkin. Orqa miya suyuqligi (CSF) xoroid pleksusining (CS) sekretor mahsulotidir va subaraknoid bo'shliq va qorincha bo'shlig'i orqali miyaning interstitsial suyuqligi bilan bevosita aloqada bo'ladi4. Yaqinda subaraknoid miya orqa miya suyuqligi miyaning interstitsial bo'shlig'iga ortiqcha tarqalishi ko'rsatildi9. Biz parenxima bo'shlig'iga ushbu subaraknoid oqim yo'li orqali yoki to'g'ridan-to'g'ri BBB orqali kirishga umid qilamiz. Bunga erishish uchun biz ushbu ikki xil yo'lning biri orqali tashiladigan peptidlarni ideal tarzda aniqlaydigan kuchli in vivo fag tanlash strategiyasini qo'lladik.
Endi biz eng yuqori kutubxona xilma-xilligi bilan dastlabki tanlov raundlarini kuzatish uchun yuqori o'tkazuvchanlik ketma-ketligi (HTS) bilan birgalikda CSF namunalarini olish bilan ketma-ket in vivo fag displey skrining usulini tasvirlaymiz. Skrining qon ifloslanishining oldini olish uchun doimiy ravishda implantatsiya qilingan katta sisterna (CM) kanulasi bo'lgan ongli kalamushlarda o'tkazildi. Muhimi, bu yondashuv miyani nishonga olishni va miya-qon tomir to'sig'i orqali transport faolligiga ega peptidlarni tanlaydi. Biz kichik o'lchamlari (~60 nm)10 tufayli T7 faglaridan foydalandik va ular endotelial va/yoki epitelial-medulla to'sig'ini hujayralararo kesib o'tishga imkon beradigan pufakchalarni tashish uchun mos ekanligini taklif qildik. To'rt raund panningdan so'ng, kuchli in vivo CSF ​​boyitilishi va miya mikrotomirlari assotsiatsiyasini ko'rsatuvchi fag populyatsiyalari ajratib olindi. Muhimi, biz afzal ko'rilgan va kimyoviy sintezlangan eng yaxshi nomzod peptidlar oqsil yukini miya omurilik suyuqligiga tashishga qodirligini namoyish etish orqali topilmalarimizni tasdiqlay oldik. Birinchidan, markaziy asab tizimining farmakodinamik ta'siri yetakchi tranzit peptidini BACE1 peptidining inhibitori bilan birlashtirish orqali aniqlandi. In vivo funktsional skrining strategiyalari yangi miya transporti peptidlarini samarali oqsil yuk tashuvchilar sifatida aniqlashi mumkinligini namoyish etishdan tashqari, biz shunga o'xshash funktsional tanlov yondashuvlari yangi miya transporti yo'llarini aniqlashda ham muhim ahamiyat kasb etishini kutmoqdamiz.
Blyashka hosil qiluvchi birliklar (PFU) asosida, fag qadoqlash bosqichidan so'ng, taxminan 109 xilma-xillikka ega tasodifiy 12-mer chiziqli T7 fag peptidlari kutubxonasi ishlab chiqildi va yaratildi (Materiallar va usullarga qarang). Shuni ta'kidlash kerakki, biz in vivo panningdan oldin ushbu kutubxonani sinchkovlik bilan tahlil qildik. Modifikatsiyalangan primerlar yordamida fag kutubxonasi namunalarini PZR amplifikatsiyasi HTSga bevosita tegishli bo'lgan amplikonlarni yaratdi (Qo'shimcha 1a-rasm). a) HTS11 ketma-ketlik xatolari, b) primerlar (NNK)1-12 sifatiga ta'siri va c) kutish kutubxonasida yovvoyi tipdagi (wt) fag (skelet qo'shimchalari) mavjudligi sababli, faqat tasdiqlangan ketma-ketlik ma'lumotlarini olish uchun ketma-ketlikni filtrlash protsedurasi amalga oshirildi (Qo'shimcha 1b-rasm). Ushbu filtrlash bosqichlari barcha HTS ketma-ketlik kutubxonalariga qo'llaniladi. Standart kutubxona uchun jami 233 868 ta o'qish olindi, ulardan 39% filtr mezonlaridan o'tdi va keyingi turlar uchun kutubxona tahlili va tanlovi uchun ishlatildi (1c-e qo'shimcha rasm). O'qishlar asosan 3 ta asos juftligining uzunligiga ko'paytirildi, cho'qqisi 36 nukleotidda edi (1c-qo'shimcha rasm), bu kutubxona dizaynini (NNK) 1-12 tasdiqlaydi. Shunisi e'tiborga loyiqki, kutubxona a'zolarining taxminan 11% 12 o'lchovli yovvoyi tipdagi (wt) asosiy PAGISRELVDKL qo'shimchasini o'z ichiga olgan va ketma-ketliklarning deyarli yarmi (49%) qo'shimchalar yoki o'chirishlarni o'z ichiga olgan. Kutubxona kutubxonasining HTS kutubxonadagi peptidlarning yuqori xilma-xilligini tasdiqladi: peptid ketma-ketliklarining 81% dan ortig'i faqat bir marta topilgan va atigi 1,5% ≥4 nusxada uchraydi (2a qo'shimcha rasm). Repertuardagi barcha 12 pozitsiyadagi aminokislotalarning (aa) chastotalari degeneratlangan NKK repertuari tomonidan hosil qilingan kodonlar soni uchun kutilgan chastotalar bilan yaxshi bog'liq edi (2b-qo'shimcha rasm). Ushbu qo'shimchalar tomonidan kodlangan aa qoldiqlarining kuzatilgan chastotasi hisoblangan chastota bilan yaxshi bog'liq edi (r = 0.893) (2c-qo'shimcha rasm). Fag kutubxonalarini in'ektsiya uchun tayyorlash endotoksinni kuchaytirish va olib tashlash bosqichlarini o'z ichiga oladi. Bu ilgari fag kutubxonalarining xilma-xilligini kamaytirishi mumkinligi ko'rsatilgan edi12,13. Shuning uchun biz endotoksinni olib tashlashdan o'tgan plastinka bilan kuchaytirilgan fag kutubxonasini ketma-ketlashtirdik va AA chastotasini baholash uchun uni asl kutubxona bilan taqqosladik. Asl hovuz va kuchaytirilgan va tozalangan hovuz o'rtasida kuchli korrelyatsiya (r = 0.995) kuzatildi (2d-qo'shimcha rasm), bu T7 fagi yordamida plastinkalarda kuchaytirilgan klonlar o'rtasidagi raqobat katta tarafkashlikka olib kelmasligini ko'rsatadi. Bu taqqoslash har bir kutubxonadagi tripeptid motiflarining chastotasiga asoslangan, chunki kutubxonalarning xilma-xilligini (~109) hatto HTS bilan ham to'liq qamrab olish mumkin emas. Har bir pozitsiyada aa ning chastota tahlili kiritilgan repertuarning oxirgi uchta pozitsiyasida pozitsiyaga bog'liq kichik tarafkashlikni aniqladi (2e-qo'shimcha rasm). Xulosa qilib aytganda, biz kutubxonaning sifati va xilma-xilligi maqbul ekanligi va bir necha bosqichli tanlovlar oralig'ida fag kutubxonalarini kuchaytirish va tayyorlash tufayli xilma-xillikda faqat kichik o'zgarishlar kuzatilgan degan xulosaga keldik.
Orqa miya suyuqligidan ketma-ket namunalar olish, ongli kalamushlarning CM ga jarrohlik yo'li bilan kanula implantatsiyasi orqali amalga oshirilishi mumkin, bu esa BBB va/yoki BCSFB orqali vena ichiga yuborilgan T7 fagini (iv) aniqlashni osonlashtiradi (1a-b-rasm). Biz in vivo tanlashning dastlabki uchta bosqichida ikkita mustaqil tanlash qo'lidan (A va B qo'llari) foydalandik (1c-rasm). Biz tanlashning dastlabki uchta bosqichida kiritilgan fagning umumiy miqdorini kamaytirish orqali tanlashning qat'iyligini asta-sekin oshirdik. Panning to'rtinchi bosqichi uchun biz A va B shoxlaridan namunalarni birlashtirdik va uchta qo'shimcha mustaqil tanlashni amalga oshirdik. Ushbu modeldagi T7 fag zarralarining in vivo xususiyatlarini o'rganish uchun kalamushlarga dum venasi orqali yovvoyi tipdagi fag (PAGISRELVDKL master insert) yuborildi. Turli vaqt nuqtalarida faglarning orqa miya suyuqligi va qondan chiqarilishi nisbatan kichik T7 ikosahedral faglarning qon bo'linmasidan tez dastlabki tozalash bosqichiga ega ekanligini ko'rsatdi (3-qo'shimcha rasm). Kalamushlarning titrlari va qon hajmiga asoslanib, biz vena ichiga yuborilganidan 10 daqiqa o'tgach, qonda yuborilgan dozadan taxminan 1% og'irlikdagi fag aniqlanganini hisobladik. Ushbu dastlabki tez pasayishdan so'ng, yarim yemirilish davri 27,7 daqiqa bo'lgan sekinroq birlamchi klirens o'lchandi. Muhimi, CSF bo'limidan juda oz sonli faglar olindi, bu esa yovvoyi tipdagi faglarning CSF bo'limiga migratsiyasi uchun past fonni ko'rsatadi (3-qo'shimcha rasm). O'rtacha, butun namuna olish davrida (0-250 daqiqa) miya orqa miya suyuqligida qonda T7 fagning atigi 1 x 10-3% titri va dastlab infuziya qilingan faglarning 4 x 10-8% aniqlandi. Shunisi e'tiborga loyiqki, miya orqa miya suyuqligidagi yovvoyi tipdagi fagning yarim yemirilish davri (25,7 daqiqa) qonda kuzatilganiga o'xshash edi. Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, CM-kanüllangan kalamushlarda CSF bo'limini qondan ajratib turuvchi to'siq butunligicha qoladi, bu esa qondan CSF bo'limiga osongina ko'chiriladigan klonlarni aniqlash uchun fag kutubxonalarini in vivo tanlash imkonini beradi.
(a) Katta hovuzdan orqa miya suyuqligi (MSS) ni qayta namunalash usulini yaratish. (b) Markaziy asab tizimi (MSS) to'sig'ining hujayra joylashuvini va qon-miya to'sig'ini (QMB) va qon-miya to'sig'ini kesib o'tuvchi peptidlarni aniqlash uchun ishlatiladigan tanlov strategiyasini ko'rsatuvchi diagramma. (c) In vivo fag displey skrining oqim sxemasi. Tanlovning har bir bosqichida faglar (strelkalar ichidagi hayvon identifikatorlari) vena ichiga yuborildi. Tanlovning 4-bosqichigacha ikkita mustaqil muqobil shoxchalar (A, B) alohida saqlanadi. Tanlovning 3 va 4-bosqichlari uchun MSS dan olingan har bir fag kloni qo'lda ketma-ketlashtirildi. (d) T7 peptid kutubxonasini (2 x 1012 fag/hayvon) vena ichiga yuborgandan so'ng, ikkita kanüllangan kalamushda tanlovning birinchi bosqichida qondan (qizil doiralar) va orqa miya suyuqligidan (yashil uchburchaklar) ajratilgan fagning kinetikasi. Moviy kvadratlar qondagi fagning o'rtacha boshlang'ich konsentratsiyasini ko'rsatadi, bu qonning umumiy hajmini hisobga olgan holda yuborilgan fag miqdoridan hisoblanadi. Qora kvadratlar qondagi fag konsentratsiyasidan ekstrapolyatsiya qilingan y chizig'ining kesishish nuqtasini ko'rsatadi. (e,f) Peptidda topilgan barcha mumkin bo'lgan bir-biriga mos keladigan tripeptid motiflarining nisbiy chastotasi va taqsimotini taqdim eting. 1000 ta o'qishda topilgan motiflar soni ko'rsatilgan. Muhim darajada (p < 0,001) boyitilgan motiflar qizil nuqtalar bilan belgilangan. (e) AOK qilingan kutubxonaning tripeptid motifining nisbiy chastotasini #1.1 va #1.2 hayvonlardan olingan qondan olingan fag bilan taqqoslaydigan korrelyatsiya sochilish grafigi. (f) Qonda va orqa miya suyuqligida ajratilgan #1.1 va #1.2 hayvonlar fag tripeptid motiflarining nisbiy chastotalarini taqqoslaydigan korrelyatsiya sochilish grafigi. (g, h) Ikkala hayvonda ham in vivo selektsiyadan so'ng qon bilan boyitilgan fagning (g) in'ektsiya qilingan kutubxonalarga va CSF bilan boyitilgan fagning (h) qonga nisbatan ketma-ketlik identifikatori tasviri. Bir harfli kodning kattaligi ushbu aminokislotaning o'sha holatda qanchalik tez-tez paydo bo'lishini ko'rsatadi. Yashil = qutb, binafsha = neytral, ko'k = asosiy, qizil = kislotali va qora = hidrofob aminokislotalar. 1a, b-rasmlar Eduard Urich tomonidan ishlab chiqilgan va ishlab chiqarilgan.
Biz ikkita CM asbob kalamushlariga (A va B kladalari) fag peptid kutubxonasini yubordik va fagni orqa miya suyuqligi va qondan ajratib oldik (1d-rasm). Kutubxonaning dastlabki tez tozalanishi yovvoyi tipdagi fagga nisbatan kamroq sezildi. Ikkala hayvonda ham yuborilgan kutubxonaning o'rtacha yarim yemirilish davri qonda 24,8 daqiqani tashkil etdi, bu yovvoyi tipdagi fagga o'xshash va CSFda 38,5 daqiqani tashkil etdi. Har bir hayvondan olingan qon va orqa miya suyuqligi fag namunalari HTSga duchor qilindi va barcha aniqlangan peptidlar qisqa tripeptid motivining mavjudligi uchun tahlil qilindi. Tripeptid motivlari tanlangan, chunki ular struktura hosil bo'lishi va peptid-oqsil o'zaro ta'siri uchun minimal asos yaratadi14,15. Biz yuborilgan fag kutubxonasi va ikkala hayvonning qonidan olingan klonlar o'rtasidagi motivlarning taqsimlanishida yaxshi korrelyatsiyani topdik (1e-rasm). Ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, kutubxona tarkibi qon bo'limida ozgina boyitilgan. Aminokislota chastotalari va konsensus ketma-ketliklari Weblogo16 dasturining moslashuvi yordamida har bir pozitsiyada qo'shimcha tahlil qilindi. Qizig'i shundaki, biz qon glitsin qoldiqlarida kuchli boyitishni aniqladik (1g-rasm). Qon CSFdan tanlangan klonlar bilan taqqoslaganda, kuchli tanlanish va motiflarning ba'zi bir tanlanmaganligi kuzatildi (1f-rasm) va ba'zi aminokislotalar 12 a'zoli joyda oldindan belgilangan pozitsiyalarda afzallik bilan mavjud edi (1h-rasm). Shunisi e'tiborga loyiqki, individual hayvonlar orqa miya suyuqligida sezilarli darajada farq qilar edi, qon glitsin bilan boyitilishi esa ikkala hayvonda ham kuzatildi (Qo'shimcha 4a-j-rasm). 1.1 va 1.2-sonli hayvonlarning orqa miya suyuqligidagi ketma-ketlik ma'lumotlarini qat'iy filtrlashdan so'ng, jami 964 va 420 ta noyob 12-mer peptidlari olindi (Qo'shimcha 1d-e-rasm). Izolyatsiya qilingan fag klonlari kuchaytirildi va in vivo tanlab olishning ikkinchi bosqichiga o'tkazildi. Selektsiyaning ikkinchi bosqichidan ajratib olingan faglar har bir hayvonda HTSga duchor qilindi va barcha aniqlangan peptidlar tripeptid motiflarining paydo bo'lishini tahlil qilish uchun motifni aniqlash dasturiga kirish sifatida ishlatildi (2a, b, ef). CSFdan olingan fagning birinchi sikli bilan taqqoslaganda, biz A va B shoxlarida CSFdagi ko'plab motiflarning keyingi tanlanishi va tanlanmaganligini kuzatdik (2-rasm). Ularning izchil ketma-ketlikning turli naqshlarini ifodalashini aniqlash uchun tarmoq identifikatsiyasi algoritmi qo'llanildi. Muqobil A kladasida (2c, d-rasm) va B kladasida (2g, h-rasm) CSF tomonidan tiklangan 12 o'lchovli ketma-ketliklar o'rtasida aniq o'xshashlik kuzatildi. Har bir shoxdagi birlashtirilgan tahlil 12-mer peptidlari uchun turli xil selektsiya profillarini (5c, d-rasm qo'shimcha) va ikkinchi bosqichdan keyin birlashtirilgan klonlar uchun birinchi bosqichga nisbatan vaqt o'tishi bilan CSF/qon titri nisbatining oshishini aniqladi (5e-rasm qo'shimcha).
In vivo funktsional fag displeyini tanlashning ketma-ket ikki bosqichi orqali miya omurilik suyuqligidagi motiflar va peptidlarni boyitish.
Har bir hayvonning birinchi bosqichidan olingan barcha miya omurilik suyuqligi faglari (#1.1 va #1.2 hayvonlar) birlashtirildi, kuchaytirildi, HT ketma-ketligi aniqlandi va birgalikda qayta yuborildi (2 x 1010 fag/hayvon) 2 ta SM kanüllangan kalamush (#1.1 → #). 2.1 va 2.2, 1.2 → 2.3 va 2.4). (a,b,e,f) Birinchi va ikkinchi tanlov bosqichlarida barcha CSF dan olingan faglarning tripeptid motiflarining nisbiy chastotasini taqqoslaydigan korrelyatsiya tarqoqlik diagrammalari. Ikkala yo'nalishda ham peptidlarda topilgan barcha mumkin bo'lgan bir-biriga mos keladigan tripeptidlarni ifodalovchi motiflarning nisbiy chastotasi va taqsimoti. 1000 ta o'qishda topilgan motiflar soni ko'rsatilgan. Taqqoslangan kutubxonalardan birida sezilarli darajada tanlangan yoki chiqarib tashlangan motiflar (p < 0.001) qizil nuqtalar bilan belgilangan. (c, d, g, h) In vivo selektsiyaning 2 va 1-raundlariga asoslangan barcha CSFga boy 12 ta aminokislota uzun ketma-ketliklarining ketma-ketlik logotipi tasviri. Bir harfli kodning kattaligi ushbu aminokislotaning o'sha holatda qanchalik tez-tez paydo bo'lishini ko'rsatadi. Logotipni ifodalash uchun ikkita selektsiya raundi orasidagi alohida hayvonlardan ajratib olingan CSF ketma-ketliklarining chastotasi taqqoslanadi va ikkinchi raunddagi boyitilgan ketma-ketliklar ko'rsatiladi: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 va (h) #1.2–#2.4. (c, d) hayvonlarning 2.1 va 2.2-raqamlarida yoki (g, h) hayvonlarning 2.3 va 2.4-raqamlarida berilgan pozitsiyada eng ko'p boyitilgan aminokislotalar rangda ko'rsatilgan. Yashil = qutb, binafsha = neytral, ko'k = asos, qizil = kislotali va qora = hidrofob aminokislotalar.
Tanlovning uchinchi bosqichidan so'ng, biz ikkita hayvondan ajratilgan 332 ta CSF bilan tiklangan fag klonlaridan 124 ta noyob peptid ketma-ketligini (#3.1 va #3.2) aniqladik (Qo'shimcha 6a-rasm). LGSVS ketma-ketligi (18.7%) eng yuqori nisbiy nisbatga ega edi, undan keyin PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) va SARGSWREIVSLS (2.2%) yovvoyi tipdagi qo'shimchalar keldi. Oxirgi to'rtinchi bosqichda biz uchta alohida hayvondan mustaqil ravishda tanlangan ikkita shoxni birlashtirdik (1c-rasm). CSFdan olingan 925 ta ketma-ket fag klonlaridan to'rtinchi bosqichda biz 64 ta noyob peptid ketma-ketligini topdik (Qo'shimcha 6b-rasm), ular orasida yovvoyi tipdagi fagning nisbiy nisbati 0.8% gacha tushdi. To'rtinchi raundda eng keng tarqalgan CSF klonlari LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSLNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) va RLSSVDSDLSGC (3, 2%) edi. %)). Tanlangan peptidlarning uzunlik diapazoni NNK kutubxonasini loyihalash uchun degenerat kodonlardan foydalanilganda kutubxona primerlarida nukleotid qo'shilishi/o'chirilishi yoki muddatidan oldin to'xtash kodonlari bilan bog'liq. Erta to'xtash kodonlari qisqaroq peptidlarni hosil qiladi va ular qulay AA motivini o'z ichiga olganligi sababli tanlanadi. Uzunroq peptidlar sintetik kutubxonalar primerlarida qo'shilish/o'chirilish natijasida paydo bo'lishi mumkin. Bu mo'ljallangan to'xtash kodonini ramkadan tashqariga joylashtiradi va uni yangi to'xtash kodoni paydo bo'lguncha o'qiydi. Umuman olganda, biz kirish ma'lumotlarini namunaviy chiqish ma'lumotlari bilan taqqoslash orqali barcha to'rtta tanlov raundi uchun boyitish koeffitsientlarini hisobladik. Skriningning birinchi bosqichida biz noaniq fon ma'lumotnomasi sifatida yovvoyi tipdagi fag titrlaridan foydalandik. Qizig'i shundaki, birinchi CSF siklida fagning salbiy tanlanishi juda kuchli edi, ammo qonda emas edi (3a-rasm), bu peptid kutubxonasining aksariyat a'zolarining CSF bo'limiga passiv diffuziya ehtimoli pastligi yoki nisbiy faglar bakteriofaglarga qaraganda qon oqimidan samaraliroq saqlanishi yoki olib tashlanishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Biroq, panning ikkinchi bosqichida ikkala kladada ham CSFda faglarning kuchli tanlanishi kuzatildi, bu oldingi bosqich CSFni qabul qilishni rag'batlantiruvchi peptidlarni ko'rsatuvchi faglar bilan boyitilganligini ko'rsatadi (3a-rasm). Yana, qonni sezilarli darajada boyitmasdan. Shuningdek, uchinchi va to'rtinchi bosqichlarda fag klonlari CSFda sezilarli darajada boyitilgan. Tanlovning oxirgi ikki bosqichi orasidagi har bir noyob peptid ketma-ketligining nisbiy chastotasini taqqoslab, biz ketma-ketliklar tanlovning to'rtinchi bosqichida yanada boyitilganligini aniqladik (3b-rasm). Ikkala peptid yo'nalishidan foydalangan holda barcha 64 ta noyob peptid ketma-ketligidan jami 931 ta tripeptid motivi ajratib olindi. To'rtinchi bosqichda eng boyitilgan motivlar kiritilgan kutubxonaga nisbatan barcha bosqichlarda boyitish profillari uchun batafsilroq o'rganildi (cheklov: 10% boyitish) (Qo'shimcha 6c-rasm). Tanlovning umumiy naqshlari shuni ko'rsatdiki, o'rganilgan motivlarning aksariyati ikkala tanlov shoxobchasining oldingi barcha bosqichlarida boyitilgan. Biroq, ba'zi motivlar (masalan, SGL, VSG, LGS GSV) asosan muqobil A kladasidan, boshqalari (masalan, FGW, RTN, WGF, NTR) esa muqobil B kladasida boyitilgan.
Streptavidin yuklamalariga konjugatsiyalangan CSF bilan boyitilgan fag bilan ko'rsatilgan peptidlar va biotinlangan yetakchi peptidlarning CSF orqali tashilishini tasdiqlash.
(a) Boyitish nisbatlari to'rtta turda ham (R1-R4) in'ektsiya qilingan (kirish = I) fag (PFU) titrlari va aniqlangan CSF fag titrlari (chiqish = O) asosida hisoblangan. Oxirgi uchta tur uchun boyitish koeffitsientlari (R2-R4) oldingi tur va birinchi tur (R1) bilan vazn ma'lumotlari bilan taqqoslash orqali hisoblab chiqilgan. Ochiq ustunlar orqa miya suyuqligi, soyali ustunlar plazma. (***p<0.001, Studentning t-testiga asoslangan). (b) Tanlovning 4-turidan keyin CSFda to'plangan barcha faglarga nisbatan nisbiy ulushiga ko'ra tartiblangan eng ko'p uchraydigan fag peptidlari ro'yxati. Tanlovning 3 va 4-turlari orasidagi eng keng tarqalgan oltita fag klonlari rang bilan belgilangan, raqamlangan va ularning boyitish koeffitsientlari ko'rsatilgan (qo'shimchalar). (c, d) 4-turdan eng boyitilgan oltita fag klonlari, bo'sh fag va ota-ona fag peptid kutubxonalari CSF namunalarini olish modelida alohida tahlil qilindi. Ko'rsatilgan vaqt nuqtalarida miya suyuqligi va qon namunalari to'plandi. (c) 6 ta nomzod fag klonlari (2 x 1010 fag/hayvon), bo'sh faglar (#1779) (2 x 1010 fag/hayvon) va zaxira fag peptid kutubxonalari (2 x 1012 fag/hayvon) teng miqdorda. Kanullangan hayvonga kamida 3 CM alohida ravishda dum venasiga yuboriladi. Har bir yuborilgan fag kloni va fag peptid kutubxonasining vaqt o'tishi bilan miya suyuqligi farmakokinetikasi ko'rsatilgan. (d) namuna olish vaqtida barcha tiklangan faglar/ml uchun o'rtacha miya suyuqligi/qon nisbatini ko'rsatadi. (e) To'rtta sintetik yetakchi peptid va bitta aralashtirilgan nazorat biotin bilan streptavidinga ularning N-terminali (tetramer displeyi) orqali bog'langan, so'ngra in'ektsiya qilingan (dum venasiga, 10 mg streptavidin/kg). Kamida uchta intubatsiya qilingan kalamush (N = 3). Miya suyuqligi namunalari ko'rsatilgan vaqt nuqtalarida to'plandi va streptavidin konsentratsiyasi Miya suyuqligi anti-streptavidin ELISA yordamida o'lchandi (nd = aniqlanmadi). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA testiga asoslangan). (f) Eng boyitilgan fag peptid kloni #2002 (binafsha) ning aminokislotalar ketma-ketligini 4-turdagi boshqa tanlangan fag peptid klonlari bilan taqqoslash. Bir xil va o'xshash aminokislota fragmentlari rang bilan kodlangan.
To'rtinchi raunddagi barcha boyitilgan faglardan (3b-rasm), CSF namunalarini olish modelida qo'shimcha individual tahlil qilish uchun oltita nomzod klon tanlab olindi. Uchta kanüllangan CM hayvonlariga teng miqdorda oltita nomzod fag, bo'sh fag (qo'shimchasiz) va profag peptid kutubxonalari kiritildi va farmakokinetika CSF (3c-rasm) va qon (qo'shimcha 7-rasm) tahlillarida aniqlandi. Sinovdan o'tgan barcha fag klonlari CSF bo'limini bo'sh nazorat fagiga (#1779) nisbatan 10-1000 baravar yuqori darajada nishonga oldi. Masalan, #2020 va #2077 klonlari nazorat fagiga qaraganda CSF titrlariga taxminan 1000 baravar yuqori edi. Tanlangan har bir peptidning farmakokinetik profili har xil, ammo ularning barchasi yuqori CSF homing qobiliyatiga ega. Biz #1903 va #2011 klonlari uchun vaqt o'tishi bilan doimiy pasayishni kuzatdik, #2077, #2002 va #2009 klonlari uchun esa dastlabki 10 daqiqada o'sish faol transportni ko'rsatishi mumkin, ammo buni tekshirish kerak. #2020, #2002 va #2077 klonlari yuqori darajada barqarorlashdi, #2009 klonining CSF konsentratsiyasi esa dastlabki o'sishdan keyin asta-sekin pasaydi. Keyin biz har bir CSF nomzodining nisbiy chastotasini uning qon konsentratsiyasi bilan taqqosladik (3d-rasm). Barcha namunalar olish vaqtlarida har bir CSF nomzodining o'rtacha titrining qon titri bilan o'zaro bog'liqligi oltita nomzoddan uchtasi qon CSF bilan sezilarli darajada boyitilganligini ko'rsatdi. Qizig'i shundaki, #2077 kloni qonning yuqori barqarorligini ko'rsatdi (7-qo'shimcha rasm). Peptidlarning o'zlari CSF bo'limiga fag zarralaridan tashqari boshqa yuklarni faol ravishda tashishga qodirligini tasdiqlash uchun biz peptidlar fag zarrachasiga birikadigan N-terminalda biotin bilan hosil qilingan to'rtta yetakchi peptidlarni sintez qildik. Biotinlangan peptidlar (2002, 2009, 2020 va 2077-sonlar) streptavidin (SA) bilan konjugatsiyalanib, fag geometriyasini biroz taqlid qiluvchi multimerik shakllarni oldi. Ushbu format bizga qon va orqa miya suyuqligidagi SA ta'sirini yuk tashuvchi oqsil peptidlari sifatida o'lchash imkonini berdi. Muhimi, fag ma'lumotlarini ko'pincha sintetik peptidlar ushbu SA bilan konjugatsiyalangan formatda yuborilganda qayta tiklash mumkin edi (3e-rasm). Aralashtirilgan peptidlar boshlang'ich ta'sirini kamroq va CSF klirensini tezroq, 48 soat ichida aniqlanmaydigan darajalarga ega bo'ldi. Ushbu peptid fag klonlarining CSF bo'shlig'iga yetkazib berish yo'llarini tushunish uchun biz in vivo vena ichiga yuborilgandan 1 soat o'tgach, fag zarralarini to'g'ridan-to'g'ri aniqlash uchun immunohistokimyo (IHC) yordamida individual fag peptid ta'sirlarining lokalizatsiyasini tahlil qildik. Shunisi e'tiborga loyiqki, #2002, #2077 va #2009 klonlari miya kapillyarlarida kuchli bo'yash orqali aniqlanishi mumkin edi, nazorat fagi (#1779) va #2020 kloni esa aniqlanmagan (8-qo'shimcha rasm). Bu shuni ko'rsatadiki, bu peptidlar miyaga ta'sirini aniq BBB orqali o'tish orqali amalga oshiradi. Ushbu gipotezani tekshirish uchun batafsil tahlil talab etiladi, chunki BSCFB yo'li ham ishtirok etishi mumkin. Eng boyitilgan klonning (#2002) aminokislotalar ketma-ketligini boshqa tanlangan peptidlar bilan taqqoslaganda, ularning ba'zilari o'xshash aminokislota kengaytmalariga ega ekanligi qayd etildi, bu esa o'xshash transport mexanizmini ko'rsatishi mumkin (3f-rasm).
Noyob plazma profili va vaqt o'tishi bilan CSFning sezilarli darajada oshishi tufayli, fag displey kloni #2077 uzoqroq 48 soatlik davr davomida batafsil o'rganildi va SA darajalarining barqarorligi bilan bog'liq holda kuzatilgan CSFning tez o'sishini qayta tiklashga muvaffaq bo'ldi (4a-rasm). Aniqlangan boshqa fag klonlariga kelsak, #2077 miya kapillyarlari uchun kuchli bo'yalgan va yuqori aniqlikda ko'rilganda kapillyar marker lektin bilan sezilarli kolokalizatsiyani va parenximal bo'shliqda bo'yashni ko'rsatgan (4b-rasm). Markaziy asab tizimida peptid vositasida farmakologik ta'sirlarni olish mumkinligini tekshirish uchun biz i) #2077 tranzit peptidi va ii) BACE1 inhibitori peptidining biotinlangan versiyalari SA bilan ikki xil nisbatda aralashtirilgan tajriba o'tkazdik. Bir kombinatsiya uchun biz faqat BACE1 peptid inhibitoridan, ikkinchisi uchun esa BACE1 peptid inhibitori va #2077 peptidining 1:3 nisbatidan foydalandik. Ikkala namuna ham vena ichiga yuborildi va vaqt o'tishi bilan qon va orqa miya suyuqligidagi beta-amiloid peptid 40 (Abeta40) darajasi o'lchandi. Abeta40 miya parenximasida BACE1 inhibisyonini aks ettirgani uchun CSFda o'lchandi. Kutilganidek, ikkala kompleks ham Abeta40 qon darajasini sezilarli darajada kamaytirdi (4c-rasm, d). Biroq, faqat 2077-sonli peptid va SA ga konjuge qilingan BACE1 peptidining ingibitor aralashmasini o'z ichiga olgan namunalar orqa miya suyuqligida Abeta40 ning sezilarli darajada pasayishiga olib keldi (4c-rasm). Ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, 2077-sonli peptid 60 kDa SA oqsilini MNSga tashishga qodir va shuningdek, BACE1 peptidining SA bilan konjuge qilingan ingibitorlari bilan farmakologik ta'sir ko'rsatadi.
(a) Kamida uchta CM-intubatsiya qilingan kalamushda CSF peptidi #2077 (RLSSVDSDLSGC) va in'ektsiya qilinmagan nazorat fagining (#1779) uzoq muddatli farmakokinetik profillarini ko'rsatuvchi T7 fagining klonal in'ektsiyasi (2 × 10 fag/hayvon). (b) Fag in'ektsiya qilingan kalamushlarda (2 × 10 10 fag/hayvon) vakillik qiluvchi kortikal mikrotomirlarning konfokal mikroskopik tasviri #2077 peptidi va tomirlarining (lektin) kontr-bo'yalishini ko'rsatadi. Ushbu fag klonlari 3 ta kalamushga yuborildi va perfuziyadan oldin 1 soat davomida qon aylanishiga ruxsat berildi. Miyalar kesildi va T7 fag kapsidiga qarshi poliklonal FITC bilan belgilangan antikorlar bilan bo'yaldi. Perfuziya va keyingi fiksatsiyadan o'n daqiqa oldin DyLight594 bilan belgilangan lektin vena ichiga yuborildi. Kapillyarlar va perivaskulyar miya to'qimalari bo'shlig'ida mikrotomirlar va faglarning lümen tomonining (yashil) lektin bo'yalishini (qizil) ko'rsatadigan lyuminestsent tasvirlar. Masshtab chizig'i 10 µm ga to'g'ri keladi. (c, d) Biotinlangan BACE1 inhibitiv peptidi yakka o'zi yoki biotinlangan tranzit peptidi #2077 bilan birgalikda streptavidinga biriktirildi, so'ngra kamida uchta kanüllangan CM kalamushiga (10 mg streptavidin/kg) vena ichiga yuborildi. BACE1 peptid inhibitori vositachiligida Aβ40 ning kamayishi ko'rsatilgan vaqt nuqtalarida qonda (qizil) va orqa miya suyuqligida (to'q sariq) Aβ1-40 ELISA yordamida o'lchandi. Aniqroq bo'lishi uchun grafikda 100% masshtabda nuqta chiziq chizilgan. (c) Streptavidin bilan davolangan kalamushlarda qonda (qizil uchburchaklar) va orqa miya suyuqligida (to'q sariq uchburchaklar) Aβ40 ning foizda kamayishi, tranzit peptid #2077 va BACE1 ingibitor peptidiga 3:1 nisbatda konjugatsiyalangan. (d) Faqat BACE1 ingibitor peptidiga bog'langan streptavidin bilan davolangan kalamushlarda qonda Aβ40 (qizil doiralar) va orqa miya suyuqligida (to'q sariq doiralar) foizda kamayishi. Nazorat guruhidagi Aβ konsentratsiyasi 420 pg/ml ni tashkil etdi (standart og'ish = 101 pg/ml).
Fag displeyi biotibbiy tadqiqotlarning bir qancha sohalarida muvaffaqiyatli qo'llanilgan17. Ushbu usul in vivo qon tomirlari xilma-xilligini o'rganishda18,19, shuningdek, miya tomirlarini nishonga olgan tadqiqotlarda20,21,22,23,24,25,26 qo'llanilgan. Ushbu tadqiqotda biz ushbu tanlov usulini nafaqat miya tomirlarini nishonga olgan peptidlarni to'g'ridan-to'g'ri aniqlashga, balki qon-miya to'sig'ini kesib o'tish uchun faol transport xususiyatlariga ega nomzodlarni kashf etishga ham kengaytirdik. Endi biz CM intubatsiyalangan kalamushlarda in vivo tanlov protsedurasining ishlab chiqilishini tasvirlaymiz va uning CSF homing xususiyatlariga ega peptidlarni aniqlash potentsialini namoyish etamiz. 12-mer tasodifiy peptidlar kutubxonasini namoyish etuvchi T7 fagidan foydalanib, biz T7 fagining qon-miya to'sig'iga moslashish uchun etarlicha kichik (taxminan 60 nm diametrli)10 ekanligini va shu bilan qon-miya to'sig'i yoki xoroid pleksusini to'g'ridan-to'g'ri kesib o'tishini ko'rsata oldik. Biz kanüllangan CM kalamushlaridan miya suyuqligini yig'ish in vivo funktsional skrining usuli yaxshi nazorat qilinganligini va ajratib olingan fag nafaqat qon tomir tizimiga bog'lanibgina qolmay, balki qon-miya to'sig'i orqali tashuvchi vazifasini ham bajarganligini kuzatdik. Bundan tashqari, bir vaqtning o'zida qon yig'ish va miya suyuqligiga va qondan olingan faglarga HTS qo'llash orqali biz miya suyuqligini tanlashimizga qonning boyitilishi yoki selektsiya raundlari orasidagi kengayishga yaroqlilik ta'sir qilmaganligini tasdiqladik. Biroq, qon bo'limi selektsiya protsedurasining bir qismidir, chunki miya suyuqligi bo'limiga yetib bora oladigan faglar miyada boyitish uchun qon oqimida yetarlicha uzoq vaqt davomida yashashi va aylanishi kerak. Xom HTS ma'lumotlaridan ishonchli ketma-ketlik ma'lumotlarini olish uchun biz tahlil ish jarayonida platformaga xos ketma-ketlik xatolariga moslashtirilgan filtrlarni qo'lladik. Skrining usuliga kinetik parametrlarni kiritish orqali biz yovvoyi turdagi T7 faglarining qondagi tezkor farmakokinetikasini (t½ ~ 28 daqiqa) tasdiqladik24, 27, 28 va shuningdek, ularning miya omurilik suyuqligidagi yarim umrini (t½ ~ 26 daqiqa) daqiqada aniqladik. Qon va CSFdagi o'xshash farmakokinetik profillarga qaramay, CSFda fagning qon konsentratsiyasining atigi 0,001% aniqlanishi mumkin, bu esa yovvoyi turdagi T7 fagning qon-miya to'sig'i orqali past fon harakatchanligini ko'rsatadi. Ushbu ish in vivo panning strategiyalaridan foydalanganda, ayniqsa qon aylanishidan tezda tozalanadigan fag tizimlari uchun birinchi raund tanlovining muhimligini ta'kidlaydi, chunki kam sonli klonlar CNS bo'limiga yetib bora oladi. Shunday qilib, birinchi raundda kutubxona xilma-xilligining pasayishi juda katta edi, chunki bu juda qat'iy CSF modelida oxir-oqibat cheklangan miqdordagi klonlar to'plandi. Ushbu in vivo panning strategiyasi CSF bo'limida faol to'planish, qon bo'limida klonning omon qolishi va dastlabki 10 daqiqada qondan T7 fag klonlarini tezda olib tashlash kabi bir nechta tanlov bosqichlarini o'z ichiga oldi (1d-rasm va 4M qo'shimcha rasm). Shunday qilib, birinchi raunddan so'ng, CSFda turli xil fag klonlari aniqlandi, garchi alohida hayvonlar uchun bir xil boshlang'ich pul ishlatilgan bo'lsa ham. Bu shuni ko'rsatadiki, kutubxona a'zolari soni ko'p bo'lgan manba kutubxonalari uchun bir nechta qat'iy tanlov bosqichlari xilma-xillikning sezilarli darajada pasayishiga olib keladi. Shuning uchun tasodifiy hodisalar dastlabki tanlov jarayonining ajralmas qismiga aylanadi va natijaga katta ta'sir ko'rsatadi. Asl kutubxonadagi ko'plab klonlar juda o'xshash CSFni boyitishga moyillikka ega bo'lgan bo'lishi mumkin. Biroq, hatto bir xil eksperimental sharoitlarda ham, dastlabki hovuzdagi har bir aniq klonning oz soni tufayli tanlov natijalari farq qilishi mumkin.
Miya suyuqligi bilan boyitilgan motivlar qondagi motivlardan farq qiladi. Qizig'i shundaki, biz individual hayvonlarning qonida glitsinga boy peptidlarga birinchi o'tishni qayd etdik. (1g-rasm, Qo'shimcha 4e, 4f-rasmlar). Glitsin peptidlarini o'z ichiga olgan faglar barqarorroq bo'lishi va qon aylanishidan chiqarib yuborilish ehtimoli kamroq bo'lishi mumkin. Biroq, bu glitsinga boy peptidlar miya omurilik suyuqligi namunalarida aniqlanmadi, bu esa tanlangan kutubxonalar ikki xil tanlov bosqichidan o'tganligini ko'rsatadi: biri qonda, ikkinchisi esa miya omurilik suyuqligida to'planishiga imkon berdi. To'rtinchi bosqich tanlovi natijasida olingan Miya suyuqligi bilan boyitilgan klonlar keng qamrovli sinovdan o'tkazildi. Alohida sinovdan o'tgan deyarli barcha klonlar bo'sh nazorat fagiga nisbatan Miya suyuqligi bilan boyitilganligi tasdiqlandi. Bitta peptid zarbasi (#2077) batafsilroq tekshirildi. Boshqa xitlarga nisbatan plazma yarim yemirilish davri uzoqroq bo'lgan (3d-rasm va 7-qo'shimcha rasm) va qiziq tomoni shundaki, bu peptid C-terminalida sistein qoldig'ini o'z ichiga olgan. Yaqinda peptidlarga sistein qo'shilishi ularning farmakokinetik xususiyatlarini albumin 29 ga bog'lanish orqali yaxshilashi mumkinligi ko'rsatildi. Bu hozirda #2077 peptid uchun noma'lum va qo'shimcha tadqiqotlarni talab qiladi. Ba'zi peptidlar CSF boyitishda valentlikka bog'liqlikni ko'rsatdi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan), bu T7 kapsidining ko'rsatilgan sirt geometriyasi bilan bog'liq bo'lishi mumkin. Biz foydalangan T7 tizimi har bir fag zarrachasida har bir peptidning 5-15 nusxasini ko'rsatdi. IHC kalamushlarning miya yarim korteksiga vena ichiga yuborilgan nomzod qo'rg'oshin fag klonlarida amalga oshirildi (8-qo'shimcha rasm). Ma'lumotlar shuni ko'rsatdiki, kamida uchta klon (№ 2002, № 2009 va № 2077) BBB bilan o'zaro ta'sir qiladi. Ushbu BBB o'zaro ta'siri miya suyuqligining to'planishiga yoki bu klonlarning to'g'ridan-to'g'ri BCSFBga harakatlanishiga olib keladimi yoki yo'qmi, hali aniqlanmagan. Muhimi, biz tanlangan peptidlar sintez qilinganda va oqsil yukiga bog'langanda miya suyuqligining tashish qobiliyatini saqlab qolishini ko'rsatamiz. N-terminal biotinlangan peptidlarning SA ga bog'lanishi asosan qon va orqa miya suyuqligidagi ularning tegishli fag klonlari bilan olingan natijalarni takrorlaydi (3e-rasm). Va nihoyat, biz qo'rg'oshin peptidi #2077 SA ga konjugatsiyalangan BACE1 biotinlangan peptid inhibitori miya ta'sirini kuchaytirishi va miya suyuqligidagi Abeta40 darajasini sezilarli darajada kamaytirish orqali markaziy asab tizimida aniq farmakodinamik ta'sirga olib kelishini ko'rsatamiz (4-rasm). Barcha xitlarni peptid ketma-ketligi gomologiyasi bo'yicha qidirish orqali ma'lumotlar bazasida biron bir gomologni aniqlay olmadik. Shuni ta'kidlash kerakki, T7 kutubxonasining hajmi taxminan 109 ni tashkil qiladi, 12-merlar uchun nazariy kutubxona hajmi esa 4 x 1015 ni tashkil qiladi. Shuning uchun biz 12-mer peptid kutubxonasining xilma-xillik maydonining faqat kichik bir qismini tanladik, bu aniqlangan xitlarning qo'shni ketma-ketlik maydonini baholash orqali optimallashtirilgan peptidlarni aniqlash mumkinligini anglatishi mumkin. Gipotetik jihatdan, biz ushbu peptidlarning biron bir tabiiy gomologini topmaganligimizning sabablaridan biri evolyutsiya paytida miyaga ma'lum peptid motiflarining nazoratsiz kirishining oldini olish uchun tanlanmagan bo'lishi mumkin.
Umumiy holda, bizning natijalarimiz in vivo sharoitida miya qon tomir to'sig'ining transport tizimlarini batafsilroq aniqlash va tavsiflash bo'yicha kelajakdagi ishlar uchun asos yaratadi. Ushbu usulning asosiy tuzilishi nafaqat miya qon tomirlarini bog'lash xususiyatlariga ega klonlarni aniqlaydigan, balki muvaffaqiyatli klonlarning in vivo sharoitida MNS bo'limiga biologik to'siqlarni kesib o'tish uchun ichki faollikka ega bo'lgan muhim bosqichni ham o'z ichiga olgan funktsional tanlov strategiyasiga asoslangan. Bu peptidlarning tashish mexanizmini va ularning miya mintaqasiga xos bo'lgan mikrovaskulyarizatsiyaga bog'lanish afzalligini aniqlashdir. Bu BBB va retseptorlarni tashish uchun yangi yo'llarni kashf etishga olib kelishi mumkin. Biz aniqlangan peptidlar to'g'ridan-to'g'ri miya qon tomir retseptorlariga yoki BBB yoki BCSFB orqali tashiladigan aylanib yuruvchi ligandlarga bog'lanishi mumkinligini kutmoqdamiz. Ushbu ishda topilgan CSF tashish faolligiga ega peptid vektorlari qo'shimcha o'rganiladi. Hozirda biz ushbu peptidlarning BBB va/yoki BCSFB dan o'tish qobiliyatiga oid miya o'ziga xosligini o'rganmoqdamiz. Ushbu yangi peptidlar yangi retseptorlar yoki yo'llarni kashf etish va miyaga biologik preparatlar kabi makromolekulalarni yetkazib berish uchun yangi yuqori samarali platformalarni ishlab chiqish uchun juda qimmatli vositalar bo'ladi.
Katta sisternani (KS) avval tasvirlangan usulning modifikatsiyasi yordamida kanüllang. Anesteziya qilingan Wistar kalamushlari (200-350 g) stereotaksik apparatga o'rnatildi va bosh suyagini ochish uchun qirilgan va aseptik tarzda tayyorlangan bosh terisi ustiga o'rta kesma qilindi. Yuqori kamar sohasida ikkita teshik oching va teshiklardagi mahkamlash vintlarini mahkamlang. Zanglamaydigan po'latdan yasalgan kanülni KSga stereotaktik yo'naltirish uchun lateral oksipital qobiqda qo'shimcha teshik ochildi. Kanül atrofiga tish tsementini surting va vintlar bilan mahkamlang. Fotosuratlash va tsement qattiqlashgandan so'ng, teri yarasi 4/0 supramid chok bilan yopildi. Kanülning to'g'ri joylashishi orqa miya suyuqligining (BMS) o'z-o'zidan oqib chiqishi bilan tasdiqlanadi. Kalamushni stereotaksik apparatdan chiqarib oling, operatsiyadan keyingi tegishli parvarish va og'riqni boshqarishni oling va orqa miya suyuqligida qon belgilari kuzatilguncha kamida bir hafta davomida tiklanishiga ruxsat bering. Wistar kalamushlari (Crl:WI/Han) Charles River (Fransiya) dan olingan. Barcha kalamushlar patogenlardan xoli bo'lgan maxsus sharoitlarda saqlangan. Barcha hayvonlar ustida o'tkazilgan tajribalar Shveytsariyaning Bazel shahri veterinariya idorasi tomonidan tasdiqlangan va 2474-sonli Hayvonlar litsenziyasiga (Sichqonning orqa miya suyuqligi va miyasida terapevtik nomzodlar darajasini o'lchash orqali faol miya transportini baholash) muvofiq amalga oshirilgan.
Qo'lida CM kanül bilan kalamushni hushyor holda ushlang. Daturani kanüldan chiqarib oling va 10 mkl o'z-o'zidan oqayotgan miya orqa miya suyuqligini to'plang. Kanülning o'tkazuvchanligi oxir-oqibat buzilganligi sababli, ushbu tadqiqotga faqat qonning ifloslanishi yoki rangi o'zgarishi belgilari bo'lmagan shaffof miya orqa miya suyuqligi namunalari kiritildi. Bunga parallel ravishda, dum uchidagi kichik kesmadan taxminan 10-20 mkl qon geparin (Sigma-Aldrich) bilan naychalarga olindi. T7 fagini vena ichiga yuborilgandan so'ng, miya suyuqligi va qon turli vaqt nuqtalarida to'plandi. Har bir miya suyuqligi namunasi to'planishidan oldin taxminan 5-10 mkl suyuqlik tashlandi, bu kateterning o'lik hajmiga to'g'ri keladi.
Kutubxonalar T7Select tizim qo'llanmasida tasvirlanganidek (Novagen, Rosenberg va boshqalar, InNovations 6, 1-6, 1996) T7Select 10-3b vektori yordamida yaratildi. Qisqacha aytganda, tasodifiy 12-mer DNK qo'shimchasi quyidagi formatda sintez qilindi:
Qo'shimchada qo'shaloq stop kodonlari va aminokislotalarning haddan tashqari ifodalanishining oldini olish uchun NNK kodoni ishlatilgan. N har bir nukleotidning qo'lda aralashtirilgan ekvimolyar nisbati, K esa adenin va sitozin nukleotidlarining qo'lda aralashtirilgan ekvimolyar nisbati. Bir qatorli mintaqalar dNTP (Novagen) va Klenow fermenti (New England Biolabs) bilan Klenow buferida (New England Biolabs) 37°C da 3 soat davomida qo'shimcha inkubatsiya qilish orqali ikki qatorli DNKga aylantirildi. Reaksiyadan so'ng, ikki qatorli DNK EtOH cho'ktirish orqali tiklandi. Olingan DNK EcoRI va HindIII (ikkalasi ham Rochedan) restriksiya fermentlari bilan hazm qilindi. Keyin bo'lingan va tozalangan (QIAquick, Qiagen) qo'shimcha (T4 ligaza, New England Biolabs) 10B kapsid genining 348 aminokislotasidan keyin oldindan bo'lingan T7 vektoriga ramka ichida bog'landi. Bog'lash reaksiyalari in vitro qadoqlashdan oldin 16°C da 18 soat davomida inkubatsiya qilindi. In vitro fag qadoqlash T7Select 10-3b klonlash to'plami (Novagen) bilan birga berilgan ko'rsatmalarga muvofiq amalga oshirildi va qadoqlash eritmasi Escherichia coli (BLT5615, Novagen) yordamida lizisga bir marta kuchaytirildi. Lizatlar santrifugaga solindi, titrlandi va -80°C da glitserinning zahira eritmasi sifatida muzlatildi.
454/Roche-amplicon termoyadroviy primerlari yordamida bulonda yoki plastinkada kuchaytirilgan fag o'zgaruvchan mintaqalarining to'g'ridan-to'g'ri PCR kuchaytirilishi. Oldinga termoyadroviy primer o'zgaruvchan mintaqaning yon tomonlarida joylashgan ketma-ketliklarni (NNK) 12 (shablonga xos), GS FLX Titanium Adapter A va to'rtta asosli kutubxona kalit ketma-ketligini (TCAG) o'z ichiga oladi (1a-qo'shimcha rasm):
Teskari termoyadroviy primer shuningdek, ushlovchi boncuklarga biriktirilgan biotin va emulsiya PZR paytida klonal kuchaytirish uchun zarur bo'lgan GS FLX Titanium Adapter B ni o'z ichiga oladi:
Keyin amplikonlar 454 GS-FLX Titanium protokoliga muvofiq 454/Roche pirosekvensiyasiga uchratildi. Qo'lda Sanger sekvensiyasi uchun (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNK Analyzer) T7 fag DNKsi PCR yordamida kuchaytirildi va quyidagi primer juftliklari bilan sekvensiya qilindi:
Alohida blyashkalardan olingan qo'shimchalar Roche Fast Start DNK Polimeraza Kit yordamida (ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq) PCR amplifikatsiyasiga uchratildi. Issiq start (95 °C da 10 daqiqa) va 35 ta kuchaytirish sikllarini (95 °C da 50 soniya, 50 °C da 1 daqiqa va 72 °C da 1 daqiqa) bajaring.
Kutubxonalardan olingan faglar, yovvoyi tipdagi faglar, miya suyuqligi va qondan qutqarilgan faglar yoki alohida klonlar Escherichia coli BL5615 da TB bulonida (Sigma Aldrich) yoki 500 sm2 idishlarda (Thermo Scientific) 37°C da 4 soat davomida kuchaytirildi. Faglar plastinkalardan Tris-EDTA buferi (Fluka Analytical) bilan chayish yoki blyashkalarni steril pipetka uchlari bilan yig'ish orqali ajratib olindi. Faglar madaniyat ustki qatlamidan yoki ekstraksiya buferidan bir marta polietilen glikol (PEG 8000) cho'kmasi (Promega) bilan ajratib olindi va Tris-EDTA buferida qayta suspenziya qilindi.
Kuchaytirilgan fag vena ichiga (IV) yuborishdan oldin (500 mkl/hayvon) endotoksinni olib tashlash boncuklari (Miltenyi Biotec) yordamida 2-3 marta endotoksinni olib tashlash bosqichidan o'tkazildi. Birinchi bosqichda 2 × 1012 fag kiritildi; ikkinchi bosqichda 2 × 1010 fag; uchinchi va to'rtinchi tanlov bosqichlarida har bir hayvon uchun 2 × 109 fag. Belgilangan vaqt nuqtalarida to'plangan CSF va qon namunalaridagi fag miqdori ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga (T7Select tizim qo'llanmasi) muvofiq blyashka hisoblash yo'li bilan aniqlandi. Fagni tanlash tozalangan kutubxonalarni dum venasiga vena ichiga yuborish yoki oldingi tanlov bosqichidan CSFdan olingan fagni qayta yuborish orqali amalga oshirildi va keyingi yig'imlar mos ravishda CSF va qon namunalarida 10 daqiqa, 30 daqiqa, 60 daqiqa, 90 daqiqa, 120 daqiqa, 180 daqiqa va 240 daqiqada amalga oshirildi. Jami to'rtta in vivo panning bosqichi o'tkazildi, bunda tanlangan ikkita shoxcha alohida saqlandi va dastlabki uch bosqichda tahlil qilindi. Dastlabki ikki bosqichda CSFdan olingan barcha fag qo'shimchalari 454/Roche pirosekvensiyasiga uchratildi, oxirgi ikki bosqichda CSFdan olingan barcha klonlar esa qo'lda ketma-ketliklandi. Birinchi bosqichda olingan barcha qon faglari ham 454/Roche pirosekvensiyasiga uchratildi. Fag klonlarini in'ektsiya qilish uchun tanlangan faglar E. coli (BL5615) da 500 sm2 plastinkalarda 37°C da 4 soat davomida kuchaytirildi. Alohida tanlangan va qo'lda ketma-ketliklangan klonlar TB muhitida ko'paytirildi. Fag ekstraksiya qilingandan, tozalangandan va endotoksin olib tashlangandan so'ng (yuqorida tavsiflanganidek), 300 mkl da 2 × 1010 fag/hayvon bitta dum venasiga vena ichiga yuborildi.
Ketma-ketlik ma'lumotlarini oldindan qayta ishlash va sifatli filtrlash. Xom 454/Roche ma'lumotlari sotuvchi dasturi yordamida ikkilik standart oqim xaritasi formatidan (sff) Pearson inson o'qiydigan formatiga (fasta) o'zgartirildi. Nukleotid ketma-ketligini keyingi qayta ishlash quyida tavsiflanganidek, xususiy C dasturlari va skriptlari (nashr qilinmagan dasturiy ta'minot to'plami) yordamida amalga oshirildi. Birlamchi ma'lumotlarni tahlil qilish qat'iy ko'p bosqichli filtrlash protseduralarini o'z ichiga oladi. Yaroqli 12mer qo'shimcha DNK ketma-ketligini o'z ichiga olmagan o'qishlarni filtrlash uchun o'qishlar global Needleman-Wunsch testi yordamida boshlang'ich yorlig'i (GTGATGTCGGGGGATCCGAATTCT), to'xtash yorlig'i (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) va fon qo'shimchasi (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) ga ketma-ket hizalandi. hizalash har bir hizalanish uchun 2 tagacha nomuvofiqlikka yo'l qo'ydi31. Shuning uchun, boshlash va to'xtatish teglarisiz o'qishlar va fon qo'shimchalarini o'z ichiga olgan o'qishlar, ya'ni ruxsat etilgan nomuvofiqliklar sonidan oshib ketadigan hizalanishlar kutubxonadan olib tashlandi. Qolgan o'qishlarga kelsak, boshlang'ich belgisidan boshlab to'xtash belgisi asl o'qish ketma-ketligidan ajratib olinib, keyinchalik qayta ishlanishidan oldin tugaydigan N-mer DNK ketma-ketligi (bundan keyin "qo'shish" deb yuritiladi). Qo'shish translyatsiyasidan so'ng, primerning 5' uchidagi birinchi stop kodonidan keyingi qism qo'shishdan chiqariladi. Bundan tashqari, primerning 3' uchidagi to'liq bo'lmagan kodonlarga olib keladigan nukleotidlar ham olib tashlandi. Faqat fon ketma-ketliklarini o'z ichiga olgan qo'shishlarni chiqarib tashlash uchun "PAG" aminokislota naqshidan boshlanadigan tarjima qilingan qo'shishlar ham olib tashlandi. Kutubxonadan translyatsiyadan keyingi uzunligi 3 aminokislotadan kam bo'lgan peptidlar olib tashlandi. Nihoyat, qo'shish havzasidagi ortiqchalikni olib tashlang va har bir noyob qo'shishning chastotasini aniqlang. Ushbu tahlil natijalari nukleotid ketma-ketliklari (qo'shishlar) ro'yxatini va ularning (o'qish) chastotalarini o'z ichiga oldi (1c va 2-qo'shimcha rasmlar).
Ketma-ketlik o'xshashligi bo'yicha guruh N-mer DNK qo'shimchalari: 454/Roche-ga xos ketma-ketlik xatolarini (masalan, gomopolimer kengaytmalarini ketma-ketliklash bilan bog'liq muammolar) bartaraf etish va unchalik muhim bo'lmagan ortiqchaliklarni olib tashlash uchun avval filtrlangan N-mer DNK ketma-ketlik qo'shimchalari (qo'shimchalar) o'xshashlik bo'yicha saralanadi. qo'shimchalar (2 tagacha mos kelmaydigan asoslarga ruxsat beriladi) quyidagicha aniqlangan iterativ algoritm yordamida: qo'shimchalar avval chastotasi bo'yicha (eng yuqoridan eng pastgacha) va agar ular bir xil bo'lsa, uzunligi bo'yicha ikkilamchi saralash bo'yicha (eng uzundan eng qisqagacha) saralanadi. Shunday qilib, eng tez-tez va eng uzun qo'shimchalar birinchi "guruh"ni belgilaydi. Guruh chastotasi kalit chastotasiga o'rnatiladi. Keyin, saralangan ro'yxatda qolgan har bir qo'shimchani juftlik bo'yicha Needleman-Wunsch hizalanishi orqali guruhga qo'shishga harakat qilindi. Agar hizalanishdagi mos kelmasliklar, qo'shimchalar yoki o'chirishlar soni 2 chegarasidan oshmasa, guruhga qo'shimcha qo'shiladi va umumiy guruh chastotasi qo'shimchaning qanchalik tez-tez qo'shilishiga qarab oshiriladi. Guruhga qo'shilgan qo'shimchalar ishlatilgan deb belgilanadi va keyingi ishlov berishdan chiqariladi. Agar qo'shish ketma-ketligini allaqachon mavjud guruhga qo'shishning iloji bo'lmasa, qo'shish ketma-ketligi tegishli qo'shish chastotasiga ega yangi guruh yaratish uchun ishlatiladi va ishlatilgan deb belgilanadi. Iteratsiya har bir qo'shish ketma-ketligi yangi guruhni yaratish uchun ishlatilganda yoki allaqachon mavjud guruhga kiritilishi mumkin bo'lganda tugaydi. Axir, nukleotidlardan tashkil topgan guruhlangan qo'shimchalar oxir-oqibat peptid ketma-ketliklariga (peptid kutubxonalari) tarjima qilinadi. Ushbu tahlil natijasi ketma-ket o'qishlar sonini tashkil etuvchi qo'shishlar to'plami va ularga mos keladigan chastotalardir (2-qo'shimcha rasm).
Motif Generatsiyasi: Noyob peptidlar ro'yxati asosida, quyida ko'rsatilgandek, barcha mumkin bo'lgan aminokislotalar naqshlarini (aa) o'z ichiga olgan kutubxona yaratildi. 3 uzunlikdagi har bir mumkin bo'lgan naqsh peptiddan ajratib olindi va uning teskari naqshi barcha naqshlarni (tripeptidlarni) o'z ichiga olgan umumiy motif kutubxonasi bilan birga qo'shildi. Juda takrorlanadigan motiflar kutubxonalari ketma-ketlashtirildi va ortiqchalik olib tashlandi. Keyin, motif kutubxonasidagi har bir tripeptid uchun biz hisoblash vositalari yordamida kutubxonada mavjudligini tekshirdik. Bu holda, topilgan motif tripeptidini o'z ichiga olgan peptidning chastotasi qo'shiladi va motif kutubxonasidagi motifga beriladi ("motiflar soni"). Motif generatsiyasi natijasi tripeptidlarning (motiflarning) barcha paydo bo'lishlarini va ularning tegishli qiymatlarini o'z ichiga olgan ikki o'lchovli massiv bo'lib, ular o'qishlar filtrlanganda, guruhlanganda va tarjima qilinganda mos keladigan motifga olib keladigan ketma-ketlik o'qishlari sonidir. Yuqorida batafsil tavsiflangan metrika.
Motivlar sonini va ularga mos keladigan tarqoq grafiklarni normallashtirish: Har bir namuna uchun motivlar soni quyidagi yordamida normallashtirildi
bu yerda ni - i mavzusini o'z ichiga olgan o'qishlar soni. Shunday qilib, vi namunadagi i motivini o'z ichiga olgan o'qishlar (yoki peptidlar) ning foiz chastotasini ifodalaydi. Normallashtirilmagan motivlar soni uchun P-qiymatlari Fisherning aniq testi yordamida hisoblab chiqilgan. Motivlar sonining korrelogramlariga kelsak, Spearman korrelyatsiyalari R bilan normallashtirilgan motivlar soni yordamida hisoblab chiqilgan.
Peptid kutubxonasidagi har bir pozitsiyadagi aminokislotalarning tarkibini vizualizatsiya qilish uchun 32, 33 veb-logogrammalari (http://weblogo.threeplusone.com) yaratildi. Birinchidan, 12-mer peptidning har bir pozitsiyasidagi aminokislotalarning tarkibi 20 × 12 matritsada saqlanadi. Keyin, har bir pozitsiyada bir xil nisbiy aminokislota miqdorini o'z ichiga olgan 1000 ta peptid to'plami fasta-ketma-ketma formatida yaratiladi va berilgan peptid kutubxonasi uchun har bir pozitsiyadagi nisbiy aminokislota miqdorining grafik ko'rinishini yaratadigan 3-veb-logoga kirish sifatida taqdim etiladi. Ko'p o'lchovli ma'lumotlar to'plamlarini vizualizatsiya qilish uchun R da ichki ishlab chiqilgan vosita (biosHeatmap, hali chiqarilmagan R to'plami) yordamida issiqlik xaritalari yaratildi. Issiqlik xaritalarida taqdim etilgan dendrogrammalar Evklid masofa metrikasi bilan Wardning ierarxik klasterlash usuli yordamida hisoblab chiqildi. Motif ballari ma'lumotlarini statistik tahlil qilish uchun normallashtirilmagan ballar uchun P qiymatlari Fisherning aniq testi yordamida hisoblab chiqildi. Boshqa ma'lumotlar to'plamlari uchun P-qiymatlari R da Studentning t-testi yoki ANOVA yordamida hisoblab chiqildi.
Tanlangan fag klonlari va qo'shimchalarsiz faglar dum venasiga vena ichiga yuborildi (2 × 1010 fag/hayvon 300 mkl PBS da). Perfuziya va keyingi fiksatsiyadan o'n daqiqa oldin, xuddi shu hayvonlarga vena ichiga 100 mkl DyLight594 bilan belgilangan lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177) yuborildi. Fag in'ektsiyasidan 60 daqiqa o'tgach, kalamushlarga yurak orqali 50 ml PBS, so'ngra 50 ml 4% PFA/PBS yuborildi. Miya namunalari qo'shimcha ravishda 4% PFA/PBS da bir kechada fiksatsiya qilindi va 4°C da 30% saxaroza ichida bir kechada namlandi. Namunalar OCT aralashmasida muzlatiladi. Muzlatilgan namunalarning immunohistokimyoviy tahlili xona haroratida 1% BSA bilan bloklangan va 4 °C da T7 fagiga (Novus NB 600-376A) qarshi poliklonal FITC bilan belgilangan antikorlar bilan inkubatsiya qilingan 30 µm krioseksiyalarda o'tkazildi. Bir kechada inkubatsiya qiling. Nihoyat, kesmalar PBS bilan 3 marta yuvildi va konfokal lazer mikroskopi (Leica TCS SP5) bilan tekshirildi.
Minimal tozaligi 98% bo'lgan barcha peptidlar GenScript USA tomonidan sintez qilindi, biotinlandi va liofilizatsiya qilindi. Biotin N-terminalda qo'shimcha uch karra glitsin spacer orqali bog'lanadi. Mass-spektrometriya yordamida barcha peptidlarni tekshiring.
Streptavidin (Sigma S0677) biotinlangan peptidning 5 barobar ekvimolyar ortiqcha miqdori, biotinlangan BACE1 inhibitiv peptidi yoki biotinlangan BACE1 inhibitiv peptidi va BACE1 inhibitiv peptidining 5–10% DMSO tarkibidagi kombinatsiyasi (3:1 nisbat) bilan aralashtirildi/PBSda inkubatsiya qilindi. Inyeksiyadan 1 soat oldin xona haroratida. Streptavidin bilan konjuge qilingan peptidlar miya bo'shlig'iga ega kalamushlarning dum venalaridan biriga 10 mg/kg dozada vena ichiga yuborildi.
Streptavidin-peptid komplekslarining konsentratsiyasi ELISA yordamida baholandi. Nunc Maxisorp mikrotitr plitalari (Sigma) 4°C da bir kechada 1,5 mkg/ml sichqoncha antistreptavidin antitelosi (Thermo, MA1-20011) bilan qoplandi. Blokirovka qilingandan so'ng (blokirovka buferi: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% jelatin, 1% BSA) xona haroratida 2 soat davomida, plastinka 0,05% Tween-20/PBS (yuvish buferi) bilan 3 soniya davomida yuvildi, CSF va plazma namunalari blokirovka buferi (plazma 1:10,000, CSF 1:115) bilan suyultirilgan quduqlarga qo'shildi. Keyin plastinka 4°C da bir kechada aniqlash antitelosi (1 mkg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) bilan inkubatsiya qilindi. Uch marta yuvish bosqichidan so'ng, streptavidin TMB substrat eritmasida (Roche) 20 daqiqagacha inkubatsiya qilish orqali aniqlandi. 1M H2SO4 bilan rang rivojlanishini to'xtatgandan so'ng, 450 nm da absorbsiyani o'lchang.
Streptavidin-peptid-BACE1 inhibitori kompleksining funktsiyasi ishlab chiqaruvchi protokoliga (Wako, 294-64701) muvofiq Aβ(1-40) ELISA yordamida baholandi. Qisqacha aytganda, CSF namunalari standart erituvchida (1:23) suyultirildi va BNT77 ushlovchi antikor bilan qoplangan 96 chuqurlikdagi plastinkalarda 4°C da bir kechada inkubatsiya qilindi. Besh yuvish bosqichidan so'ng, HRP bilan konjuge qilingan BA27 antikori qo'shildi va 4°C da 2 soat davomida inkubatsiya qilindi, so'ngra besh yuvish bosqichi amalga oshirildi. Aβ(1–40) xona haroratida 30 daqiqa davomida TMB eritmasida inkubatsiya qilish orqali aniqlandi. Rang rivojlanishi to'xtatuvchi eritma bilan to'xtatilgandan so'ng, 450 nm da absorbsiyani o'lchang. Plazma namunalari Aβ(1–40) ELISA dan oldin qattiq fazali ekstraksiyaga uchradi. Plazma 96 chuqurlikdagi plastinkalarda 0,2% DEA (Sigma) ga qo'shildi va xona haroratida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilindi. SPE plitalarini (Oasis, 186000679) ketma-ket suv va 100% metanol bilan yuvib bo'lgandan so'ng, plazma namunalari SPE plitalariga qo'shildi va barcha suyuqlik olib tashlandi. Namunalar yuvildi (avval 5% metanol, keyin 30% metanol bilan) va 2% NH4OH/90% metanol bilan elyut qilindi. Elyutni 55°C da doimiy N2 oqimida 99 daqiqa davomida quritgandan so'ng, namunalar standart erituvchilarda kamaytirildi va Aβ(1–40) yuqorida tavsiflanganidek o'lchandi.
Ushbu maqolani qanday iqtibos qilish mumkin: Urich, E. va boshqalar. In vivo sharoitida aniqlangan tranzit peptidlar yordamida miyaga yuklarni yetkazib berish. Science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB va Moos T. Makromolekulyar dorilarni maqsadli terapiya yordamida miyaga yetkazib berish. Neyrokimyo jurnali 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. va Martinez-Martinez, P. Qon-miya to'sig'i orqali peptid va oqsil preparatlarini yetkazib berish. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Qon-miya to'sig'i: miya dori vositalarini ishlab chiqishdagi to'siq. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG va Byrd, A. Xorioid pleksus-CSF yo'li orqali miyaga dori vositalarini yetkazib berishni va nishonga olishni yaxshilash istiqbollari. Farmatsevtika tadqiqotlari 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Miyaga yetkazib berish uchun molekulyar troyan otlari bilan biofarmatsevtika vositalarini modernizatsiya qilish. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM retseptorlari vositachiligida peptidlarni qon-miya to'sig'i orqali tashish. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. va boshqalar. Monovalentli molekulyar shlyuzlar yordamida miyaga kirishni va terapevtik antikorlarning samaradorligini oshirish. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. va boshqalar. Transferrin retseptorlari (TfR) transporti TfR antikorlarining affinlik variantlarini miya tomonidan qabul qilinishini aniqlaydi. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).