ຂອບໃຈທີ່ທ່ານເຂົ້າມາຢ້ຽມຊົມ Nature.com. ທ່ານກຳລັງໃຊ້ໂປຣແກຣມທ່ອງເວັບລຸ້ນທີ່ມີການຮອງຮັບ CSS ທີ່ຈຳກັດ. ເພື່ອປະສົບການທີ່ດີທີ່ສຸດ, ພວກເຮົາແນະນຳໃຫ້ທ່ານໃຊ້ໂປຣແກຣມທ່ອງເວັບທີ່ອັບເດດແລ້ວ (ຫຼືປິດໂໝດຄວາມເຂົ້າກັນໄດ້ໃນ Internet Explorer). ນອກຈາກນັ້ນ, ເພື່ອຮັບປະກັນການຮອງຮັບຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ພວກເຮົາສະແດງເວັບໄຊທ໌ໂດຍບໍ່ມີຮູບແບບ ແລະ JavaScript.
ສະແດງຮູບໝູນໝູນຂອງສາມສະໄລ້ພ້ອມກັນ. ໃຊ້ປຸ່ມກ່ອນໜ້າ ແລະ ຕໍ່ໄປເພື່ອເລື່ອນຜ່ານສາມສະໄລ້ໃນເວລາດຽວກັນ, ຫຼືໃຊ້ປຸ່ມຕົວເລື່ອນຢູ່ທ້າຍເພື່ອເລື່ອນຜ່ານສາມສະໄລ້ໃນເວລາດຽວກັນ.
ສິ່ງກີດຂວາງລະຫວ່າງເລືອດ-ສະໝອງ ແລະ ສິ່ງກີດຂວາງລະຫວ່າງເລືອດ-ສະໝອງປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ຕົວແທນການປິ່ນປົວທາງຊີວະພາບໄປຮອດເປົ້າໝາຍຂອງພວກມັນໃນລະບົບປະສາດສ່ວນກາງ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງເປັນອຸປະສັກຕໍ່ການປິ່ນປົວພະຍາດທາງລະບົບປະສາດຢ່າງມີປະສິດທິພາບ. ເພື່ອຄົ້ນພົບຕົວຂົນສົ່ງສະໝອງແບບໃໝ່ໃນຮ່າງກາຍ, ພວກເຮົາໄດ້ນຳສະເໜີຫ້ອງສະໝຸດເພບໄທດ໌ຟາຈ T7 ແລະ ເກັບກຳເລືອດ ແລະ ນ້ຳໃນສະໝອງ (CSF) ເປັນລຳດັບໂດຍໃຊ້ຕົວແບບກຸ່ມໜູທີ່ມີສະຕິສຳນຶກໃນທໍ່ສົ່ງນ້ຳຂະໜາດໃຫຍ່. ໂຄນຟາຈສະເພາະໄດ້ຮັບການເສີມສ້າງໃນນ້ຳໃນສະໝອງສູງຫຼັງຈາກການຄັດເລືອກສີ່ຮອບ. ການທົດສອບເພບໄທດ໌ແຕ່ລະຕົວໄດ້ເປີດເຜີຍການເສີມສ້າງໃນນ້ຳໃນສະໝອງຫຼາຍກວ່າ 1000 ເທົ່າ. ກິດຈະກຳທາງຊີວະພາບຂອງການຈັດສົ່ງເພບໄທດ໌ໄປສູ່ສະໝອງໄດ້ຮັບການຢືນຢັນໂດຍການຫຼຸດລົງ 40% ຂອງລະດັບ amyloid-β ໃນນ້ຳໃນສະໝອງໂດຍໃຊ້ຕົວຍັບຍັ້ງເພບໄທດ໌ BACE1 ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບເພບໄທດ໌ການຂົນສົ່ງແບບໃໝ່ທີ່ກຳນົດໄວ້. ຜົນໄດ້ຮັບເຫຼົ່ານີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າເພບໄທດ໌ທີ່ກຳນົດໂດຍວິທີການຄັດເລືອກເຟບໃນຮ່າງກາຍອາດຈະເປັນພາຫະນະທີ່ເປັນປະໂຫຍດສຳລັບການຈັດສົ່ງໂມເລກຸນໃຫຍ່ໄປສູ່ສະໝອງຢ່າງເປັນລະບົບດ້ວຍຜົນກະທົບທາງການປິ່ນປົວ.
ການຄົ້ນຄວ້າການປິ່ນປົວແບບເປົ້າໝາຍລະບົບປະສາດສ່ວນກາງ (CNS) ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນສຸມໃສ່ການກໍານົດຢາ ແລະ ຕົວແທນທີ່ດີທີ່ສຸດທີ່ສະແດງຄຸນສົມບັດການເປົ້າໝາຍ CNS, ໂດຍມີຄວາມພະຍາຍາມໜ້ອຍລົງໃນການຄົ້ນພົບກົນໄກທີ່ຂັບເຄື່ອນການສົ່ງຢາໄປສູ່ສະໝອງ. ສິ່ງນີ້ເລີ່ມມີການປ່ຽນແປງໃນປັດຈຸບັນຍ້ອນວ່າການສົ່ງຢາ, ໂດຍສະເພາະແມ່ນໂມເລກຸນຂະໜາດໃຫຍ່, ແມ່ນສ່ວນໜຶ່ງທີ່ສຳຄັນຂອງການພັດທະນາຢາວິທະຍາສາດປະສາດທີ່ທັນສະໄໝ. ສະພາບແວດລ້ອມຂອງລະບົບປະສາດສ່ວນກາງໄດ້ຮັບການປົກປ້ອງເປັນຢ່າງດີໂດຍລະບົບສິ່ງກີດຂວາງເສັ້ນເລືອດສະໝອງ, ປະກອບດ້ວຍສິ່ງກີດຂວາງເລືອດ-ສະໝອງ (BBB) ​​​​ແລະ ສິ່ງກີດຂວາງເລືອດ-ສະໝອງ (BCBB)1, ເຮັດໃຫ້ມັນເປັນສິ່ງທ້າທາຍໃນການສົ່ງຢາໄປຫາສະໝອງ1,2. ມີການຄາດຄະເນວ່າຢາໂມເລກຸນຂະໜາດໃຫຍ່ເກືອບທັງໝົດ ແລະ ຢາໂມເລກຸນຂະໜາດນ້ອຍຫຼາຍກວ່າ 98% ຖືກກຳຈັດອອກຈາກສະໝອງ3. ນັ້ນແມ່ນເຫດຜົນທີ່ວ່າມັນມີຄວາມສຳຄັນຫຼາຍທີ່ຈະກໍານົດລະບົບການຂົນສົ່ງສະໝອງໃໝ່ທີ່ໃຫ້ການຈັດສົ່ງຢາປິ່ນປົວທີ່ມີປະສິດທິພາບ ແລະ ສະເພາະເຈາະຈົງໄປຍັງ CNS 4,5. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, BBB ແລະ BCSFB ຍັງສະເໜີໂອກາດທີ່ດີເລີດສຳລັບການສົ່ງຢາຍ້ອນວ່າພວກມັນເຈາະ ແລະ ເຂົ້າໄປໃນໂຄງສ້າງທັງໝົດຂອງສະໝອງຜ່ານເສັ້ນເລືອດທີ່ກວ້າງຂວາງຂອງມັນ. ດັ່ງນັ້ນ, ຄວາມພະຍາຍາມໃນປະຈຸບັນໃນການໃຊ້ວິທີການສົ່ງສານໄປຫາສະໝອງແບບບໍ່ຮຸກຮານສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນອີງໃສ່ກົນໄກຂອງການຂົນສົ່ງທີ່ໄກ່ເກ່ຍກັບຕົວຮັບ (PMT) ໂດຍໃຊ້ຕົວຮັບ BBB6 ພາຍໃນຮ່າງກາຍ. ເຖິງວ່າຈະມີຄວາມກ້າວໜ້າທີ່ສຳຄັນໃນໄລຍະມໍ່ໆມານີ້ໂດຍໃຊ້ເສັ້ນທາງຕົວຮັບ transferrin7,8, ຕ້ອງມີການພັດທະນາຕື່ມອີກຂອງລະບົບການສົ່ງສານໃໝ່ທີ່ມີຄຸນສົມບັດທີ່ດີຂຶ້ນ. ເພື່ອຈຸດປະສົງນີ້, ເປົ້າໝາຍຂອງພວກເຮົາແມ່ນເພື່ອກຳນົດ peptides ທີ່ມີຄວາມສາມາດໃນການໄກ່ເກ່ຍການຂົນສົ່ງ CSF, ຍ້ອນວ່າໃນຫຼັກການແລ້ວພວກມັນສາມາດຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອສົ່ງ macromolecules ໄປຫາ CNS ຫຼືເພື່ອເປີດເສັ້ນທາງຕົວຮັບໃໝ່. ໂດຍສະເພາະ, ຕົວຮັບ ແລະ ຕົວຂົນສົ່ງສະເພາະຂອງລະບົບ cerebrovascular (BBB ແລະ BSCFB) ສາມາດເປັນເປົ້າໝາຍທີ່ມີທ່າແຮງສຳລັບການສົ່ງຢາຊີວະພາບທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວ ແລະ ສະເພາະເຈາະຈົງ. ນ້ຳไขสันหลัง (CSF) ແມ່ນຜະລິດຕະພັນຂອງການຫຼั่งຂອງ choroid plexus (CS) ແລະຕິດຕໍ່ໂດຍກົງກັບນ້ຳ interstitial ຂອງສະໝອງຜ່ານຊ່ອງ subarachnoid ແລະຊ່ອງ ventricular4. ເມື່ອບໍ່ດົນມານີ້, ມັນໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່ານ້ຳ cerebrospinal subarachnoid ແຜ່ກະຈາຍເຂົ້າໄປໃນ interstitium ຂອງສະໝອງຫຼາຍເກີນໄປ9. ພວກເຮົາຫວັງວ່າຈະເຂົ້າເຖິງຊ່ອງ parenchymal ໂດຍໃຊ້ເສັ້ນທາງໄຫຼເຂົ້າ subarachnoid ນີ້ ຫຼື ໂດຍກົງຜ່ານ BBB. ເພື່ອບັນລຸເປົ້າໝາຍນີ້, ພວກເຮົາໄດ້ຈັດຕັ້ງປະຕິບັດກົນລະຍຸດການຄັດເລືອກ phage ໃນຮ່າງກາຍທີ່ເຂັ້ມແຂງ ເຊິ່ງສາມາດລະບຸ peptides ທີ່ຂົນສົ່ງໂດຍເສັ້ນທາງທີ່ແຕກຕ່າງກັນສອງເສັ້ນທາງນີ້.
ປະຈຸບັນພວກເຮົາອະທິບາຍວິທີການກວດຄັດກອງ phage ຕາມລຳດັບໃນຮ່າງກາຍດ້ວຍການເກັບຕົວຢ່າງ CSF ພ້ອມກັບການຈັດລຳດັບ throughput ສູງ (HTS) ເພື່ອຕິດຕາມຮອບການຄັດເລືອກເບື້ອງຕົ້ນທີ່ມີຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຫ້ອງສະໝຸດສູງສຸດ. ການກວດຄັດກອງໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນໜູທີ່ມີສະຕິທີ່ມີທໍ່ cannula ຂະໜາດໃຫຍ່ (CM) ທີ່ຝັງຢູ່ຢ່າງຖາວອນເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການປົນເປື້ອນຂອງເລືອດ. ສິ່ງສຳຄັນ, ວິທີການນີ້ເລືອກທັງ peptides ທີ່ແນໃສ່ສະໝອງ ແລະ peptides ທີ່ມີກິດຈະກຳການຂົນສົ່ງຜ່ານອຸປະສັກຂອງເສັ້ນເລືອດສະໝອງ. ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ phages T7 ເນື່ອງຈາກຂະໜາດນ້ອຍຂອງມັນ (~60 nm)10 ແລະແນະນຳວ່າພວກມັນເໝາະສົມສຳລັບການຂົນສົ່ງຂອງ vesicles ທີ່ອະນຸຍາດໃຫ້ຂ້າມຜ່ານຈຸລັງຂອງອຸປະສັກ endothelial ແລະ/ຫຼື epithelial-medulla. ຫຼັງຈາກສີ່ຮອບຂອງ panning, ປະຊາກອນ phage ໄດ້ຖືກແຍກອອກໂດຍສະແດງໃຫ້ເຫັນຄວາມເຂັ້ມແຂງຂອງ CSF ​​ໃນຮ່າງກາຍ ແລະ ການພົວພັນຂອງ microvessel ສະໝອງ. ສິ່ງສຳຄັນ, ພວກເຮົາສາມາດຢືນຢັນການຄົ້ນພົບຂອງພວກເຮົາໂດຍການສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ peptides ທີ່ດີທີ່ສຸດທີ່ຕ້ອງການ ແລະ ສັງເຄາະທາງເຄມີສາມາດຂົນສົ່ງສິນຄ້າໂປຣຕີນເຂົ້າໄປໃນນ້ຳไขสันหลัง. ຫນ້າທໍາອິດ, ຜົນກະທົບທາງດ້ານຢາຂອງລະບົບປະສາດສ່ວນກາງໄດ້ຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນໂດຍການລວມ peptide ການຂົນສົ່ງຊັ້ນນໍາກັບຕົວຍັບຍັ້ງຂອງ peptide BACE1. ນອກເໜືອໄປຈາກການສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຍຸດທະສາດການກວດສອບຫນ້າທີ່ໃນຮ່າງກາຍສາມາດກໍານົດ peptides ການຂົນສົ່ງສະຫມອງໃຫມ່ເປັນຕົວນໍາການຂົນສົ່ງໂປຣຕີນທີ່ມີປະສິດທິພາບ, ພວກເຮົາຄາດຫວັງວ່າວິທີການຄັດເລືອກຫນ້າທີ່ທີ່ຄ້າຍຄືກັນນີ້ຈະກາຍເປັນສິ່ງສໍາຄັນໃນການກໍານົດເສັ້ນທາງການຂົນສົ່ງສະຫມອງໃຫມ່.
ອີງຕາມຫົວໜ່ວຍສ້າງແຜ່ນ (PFU), ຫຼັງຈາກຂັ້ນຕອນການຫຸ້ມຫໍ່ phage, ຫ້ອງສະໝຸດຂອງ peptides phage T7 ເສັ້ນຊື່ແບບສຸ່ມ 12-mer ທີ່ມີຄວາມຫຼາກຫຼາຍປະມານ 109 ໄດ້ຖືກອອກແບບ ແລະ ສ້າງຂຶ້ນ (ເບິ່ງວັດສະດຸ ແລະ ວິທີການ). ມັນເປັນສິ່ງສຳຄັນທີ່ຄວນສັງເກດວ່າພວກເຮົາໄດ້ວິເຄາະຫ້ອງສະໝຸດນີ້ຢ່າງລະມັດລະວັງກ່ອນການ panning ໃນຮ່າງກາຍ. ການຂະຫຍາຍ PCR ຂອງຕົວຢ່າງຫ້ອງສະໝຸດ phage ໂດຍໃຊ້ primers ທີ່ຖືກດັດແປງໄດ້ສ້າງ amplicons ທີ່ນຳໃຊ້ໂດຍກົງກັບ HTS (ຮູບເສີມ 1a). ເນື່ອງຈາກ a) ຄວາມຜິດພາດຂອງການຈັດລຳດັບ HTS11, b) ຜົນກະທົບຕໍ່ຄຸນນະພາບຂອງ primers (NNK)1-12, ແລະ c) ການມີຢູ່ຂອງ phage ປະເພດ wt (wt) (ໂຄງກະດູກໃສ່) ໃນຫ້ອງສະໝຸດສະແຕນບາຍ, ຂັ້ນຕອນການກັ່ນຕອງລຳດັບໄດ້ຖືກປະຕິບັດເພື່ອສະກັດເອົາຂໍ້ມູນລຳດັບທີ່ຖືກກວດສອບແລ້ວເທົ່ານັ້ນ (ຮູບເສີມ 1b). ຂັ້ນຕອນການກັ່ນຕອງເຫຼົ່ານີ້ໃຊ້ກັບຫ້ອງສະໝຸດການຈັດລຳດັບ HTS ທັງໝົດ. ສຳລັບຫໍສະໝຸດມາດຕະຖານ, ໄດ້ຮັບການອ່ານທັງໝົດ 233,868 ຄັ້ງ, ໃນນັ້ນ 39% ໄດ້ຜ່ານເກນການກັ່ນຕອງ ແລະ ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການວິເຄາະຫໍສະໝຸດ ແລະ ການຄັດເລືອກສໍາລັບຮອບຕໍ່ໆໄປ (ຮູບເສີມ 1c–e). ການອ່ານສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນຕົວຄູນຂອງ 3 ຄູ່ເບສທີ່ມີຄວາມຍາວດ້ວຍຈຸດສູງສຸດທີ່ 36 ນິວຄລີໂອໄທ (ຮູບເສີມ 1c), ເຊິ່ງຢືນຢັນການອອກແບບຫໍສະໝຸດ (NNK) 1-12. ສິ່ງທີ່ໜ້າສັງເກດແມ່ນປະມານ 11% ຂອງສະມາຊິກຫໍສະໝຸດມີ PAGISRELVDKL ແບບ wild-type (wt) 12 ມິຕິ, ແລະ ເກືອບເຄິ່ງໜຶ່ງຂອງລໍາດັບ (49%) ມີການໃສ່ ຫຼື ການລຶບ. HTS ຂອງຫໍສະໝຸດຫໍສະໝຸດຢືນຢັນຄວາມຫຼາກຫຼາຍສູງຂອງ peptides ໃນຫໍສະໝຸດ: ຫຼາຍກວ່າ 81% ຂອງລໍາດັບ peptide ຖືກພົບເຫັນພຽງແຕ່ຄັ້ງດຽວ ແລະ ມີພຽງ 1.5% ເກີດຂຶ້ນໃນ ≥4 ສໍາເນົາ (ຮູບເສີມ 2a). ຄວາມຖີ່ຂອງກົດອະມິໂນ (aa) ຢູ່ໃນທຸກໆ 12 ຕຳແໜ່ງໃນບັນຊີລາຍຊື່ມີຄວາມສຳພັນກັນດີກັບຄວາມຖີ່ທີ່ຄາດໄວ້ສຳລັບຈຳນວນໂຄດອນທີ່ສ້າງຂຶ້ນໂດຍບັນຊີລາຍຊື່ NKK ທີ່ເສື່ອມໂຊມ (ຮູບເສີມ 2b). ຄວາມຖີ່ທີ່ສັງເກດເຫັນຂອງສານຕົກຄ້າງ aa ທີ່ຖືກເຂົ້າລະຫັດໂດຍການໃສ່ເຫຼົ່ານີ້ມີຄວາມສຳພັນກັນດີກັບຄວາມຖີ່ທີ່ຄິດໄລ່ໄດ້ (r = 0.893) (ຮູບເສີມ 2c). ການກະກຽມຫ້ອງສະໝຸດຟາຈສຳລັບການສັກປະກອບມີຂັ້ນຕອນຂອງການຂະຫຍາຍແລະການກຳຈັດສານເອນໂດທອກຊິນ. ສິ່ງນີ້ເຄີຍສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າມີທ່າແຮງທີ່ຈະຫຼຸດຜ່ອນຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຫ້ອງສະໝຸດຟາຈ12,13. ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ຈັດລຳດັບຫ້ອງສະໝຸດຟາຈທີ່ຖືກຂະຫຍາຍແຜ່ນທີ່ໄດ້ຜ່ານການກຳຈັດສານເອນໂດທອກຊິນແລະປຽບທຽບມັນກັບຫ້ອງສະໝຸດຕົ້ນສະບັບເພື່ອປະເມີນຄວາມຖີ່ຂອງ AA. ມີຄວາມສຳພັນທີ່ເຂັ້ມແຂງ (r = 0.995) ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນລະຫວ່າງສະລອຍນ້ຳຕົ້ນສະບັບແລະສະລອຍນ້ຳທີ່ຖືກຂະຫຍາຍແລະບໍລິສຸດ (ຮູບເສີມ 2d), ຊີ້ບອກວ່າການແຂ່ງຂັນລະຫວ່າງໂຄນທີ່ຖືກຂະຫຍາຍໃນແຜ່ນໂດຍໃຊ້ຟາຈ T7 ບໍ່ໄດ້ເຮັດໃຫ້ເກີດອະຄະຕິທີ່ສຳຄັນ. ການປຽບທຽບນີ້ແມ່ນອີງໃສ່ຄວາມຖີ່ຂອງຮູບແບບ tripeptide ໃນແຕ່ລະຫ້ອງສະໝຸດ, ເນື່ອງຈາກຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຫ້ອງສະໝຸດ (~109) ບໍ່ສາມາດຈັບໄດ້ຢ່າງເຕັມທີ່ເຖິງແມ່ນວ່າຈະມີ HTS. ການວິເຄາະຄວາມຖີ່ຂອງ aa ໃນແຕ່ລະຕຳແໜ່ງໄດ້ເປີດເຜີຍຄວາມລຳອຽງທີ່ຂຶ້ນກັບຕຳແໜ່ງເລັກນ້ອຍໃນສາມຕຳແໜ່ງສຸດທ້າຍຂອງລາຍການທີ່ປ້ອນເຂົ້າ (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 2e). ສະຫຼຸບແລ້ວ, ພວກເຮົາໄດ້ສະຫຼຸບວ່າຄຸນນະພາບ ແລະ ຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຫ້ອງສະໝຸດແມ່ນຍອມຮັບໄດ້ ແລະ ມີພຽງແຕ່ການປ່ຽນແປງເລັກນ້ອຍໃນຄວາມຫຼາກຫຼາຍເທົ່ານັ້ນທີ່ສັງເກດເຫັນໄດ້ເນື່ອງຈາກການຂະຫຍາຍ ແລະ ການກະກຽມຫ້ອງສະໝຸດ phage ລະຫວ່າງການຄັດເລືອກຫຼາຍຮອບ.
ການເກັບຕົວຢ່າງນໍ້າໃນສະໝອງຕໍ່ເນື່ອງສາມາດປະຕິບັດໄດ້ໂດຍການຜ່າຕັດຝັງທໍ່ cannula ເຂົ້າໄປໃນ CM ຂອງໜູທີ່ມີສະຕິເພື່ອອໍານວຍຄວາມສະດວກໃນການລະບຸ phage T7 ທີ່ຖືກສັກເຂົ້າເສັ້ນເລືອດ (iv) ຜ່ານ BBB ແລະ/ຫຼື BCSFB (ຮູບທີ 1a-b). ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ສອງແຂນຄັດເລືອກເອກະລາດ (ແຂນ A ແລະ B) ໃນສາມຮອບທໍາອິດຂອງການຄັດເລືອກໃນຮ່າງກາຍ (ຮູບທີ 1c). ພວກເຮົາຄ່ອຍໆເພີ່ມຄວາມເຂັ້ມງວດຂອງການຄັດເລືອກໂດຍການຫຼຸດປະລິມານທັງໝົດຂອງ phage ທີ່ແນະນໍາໃນສາມຮອບທໍາອິດຂອງການຄັດເລືອກ. ສໍາລັບຮອບທີສີ່ຂອງການຄັດເລືອກ, ພວກເຮົາໄດ້ລວມຕົວຢ່າງຈາກສາຂາ A ແລະ B ແລະດໍາເນີນການຄັດເລືອກເອກະລາດເພີ່ມເຕີມສາມຄັ້ງ. ເພື່ອສຶກສາຄຸນສົມບັດໃນຮ່າງກາຍຂອງອະນຸພາກ phage T7 ໃນຮູບແບບນີ້, phage ປະເພດທໍາມະຊາດ (PAGISRELVDKL master insert) ໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າໄປໃນໜູຜ່ານເສັ້ນເລືອດຫາງ. ການຟື້ນຕົວຂອງ phage ຈາກນໍ້າໃນສະໝອງ ແລະ ເລືອດໃນຈຸດເວລາທີ່ແຕກຕ່າງກັນສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ phage icosahedral T7 ທີ່ມີຂະໜາດນ້ອຍມີໄລຍະການເກັບກູ້ເບື້ອງຕົ້ນຢ່າງໄວວາຈາກຊ່ອງເລືອດ (ຮູບທີ 3 ເພີ່ມເຕີມ). ອີງຕາມລະດັບນໍ້າໜັກທີ່ໃຫ້ ແລະ ປະລິມານເລືອດຂອງໜູ, ພວກເຮົາຄິດໄລ່ວ່າມີພຽງປະມານ 1% ຂອງນໍ້າໜັກຟາຈຈາກປະລິມານຢາທີ່ໃຫ້ເທົ່ານັ້ນທີ່ຖືກກວດພົບໃນເລືອດ 10 ນາທີຫຼັງຈາກການສັກເຂົ້າເສັ້ນເລືອດ. ຫຼັງຈາກການຫຼຸດລົງຢ່າງໄວວາໃນເບື້ອງຕົ້ນນີ້, ການກວດລ້າງຂັ້ນຕົ້ນທີ່ຊ້າລົງໄດ້ຖືກວັດແທກດ້ວຍໄລຍະເຄິ່ງຊີວິດ 27.7 ນາທີ. ສິ່ງສຳຄັນ, ມີພຽງແຕ່ຟາຈຈຳນວນໜ້ອຍເທົ່ານັ້ນທີ່ຖືກດຶງອອກຈາກຊ່ອງນໍ້າไขสันหลัง, ເຊິ່ງຊີ້ບອກເຖິງພື້ນຖານຕໍ່າສຳລັບການເຄື່ອນຍ້າຍຂອງຟາຈປະເພດທຳມະຊາດເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງນໍ້າไขสันหลัง (ຮູບທີ 3 ເພີ່ມເຕີມ). ໂດຍສະເລ່ຍແລ້ວ, ມີພຽງປະມານ 1 x 10-3% ຂອງຟາຈ T7 ໃນເລືອດ ແລະ 4 x 10-8% ຂອງຟາຈທີ່ຖືກສັກໃນເບື້ອງຕົ້ນເທົ່ານັ້ນທີ່ຖືກກວດພົບໃນນໍ້າไขสันหลังຕະຫຼອດໄລຍະເວລາການເກັບຕົວຢ່າງທັງໝົດ (0-250 ນາທີ). ສິ່ງທີ່ໜ້າສັງເກດແມ່ນໄລຍະເຄິ່ງຊີວິດ (25.7 ນາທີ) ຂອງຟາຈປະເພດທຳມະຊາດໃນນໍ້າไขสันหลังແມ່ນຄ້າຍຄືກັນກັບທີ່ສັງເກດເຫັນໃນເລືອດ. ຂໍ້ມູນເຫຼົ່ານີ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າສິ່ງກີດຂວາງທີ່ແຍກຊ່ອງ CSF ອອກຈາກເລືອດຍັງຄົງຢູ່ໃນໜູທີ່ມີທໍ່ CM, ເຊິ່ງຊ່ວຍໃຫ້ການເລືອກຫ້ອງສະໝຸດ phage ໃນຮ່າງກາຍສາມາດລະບຸໂຄນທີ່ຖືກຂົນສົ່ງຈາກເລືອດເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງ CSF ໄດ້ຢ່າງງ່າຍດາຍ.
(ກ) ການຕັ້ງຄ່າວິທີການສຳລັບການເກັບຕົວຢ່າງນ້ຳໃນສະໝອງ (CSF) ຄືນໃໝ່ຈາກສະລອຍນ້ຳຂະໜາດໃຫຍ່. (ຂ) ແຜນວາດສະແດງທີ່ຕັ້ງຂອງເຊວຂອງສິ່ງກີດຂວາງລະບົບປະສາດສ່ວນກາງ (CNS) ແລະຍຸດທະສາດການຄັດເລືອກທີ່ໃຊ້ເພື່ອລະບຸ peptides ທີ່ຂ້າມສິ່ງກີດຂວາງເລືອດ-ສະໝອງ (BBB) ​​​​ແລະສິ່ງກີດຂວາງເລືອດ-ສະໝອງ. (ຄ) ແຜນວາດການໄຫຼຂອງການກວດວິເຄາະ phage ໃນຮ່າງກາຍ. ໃນແຕ່ລະຮອບຂອງການຄັດເລືອກ, phages (ຕົວລະບຸສັດພາຍໃນລູກສອນ) ໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າເສັ້ນເລືອດ. ສອງສາຂາທາງເລືອກເອກະລາດ (A, B) ຖືກເກັບໄວ້ແຍກຕ່າງຫາກຈົນກ່ວາຮອບທີ 4 ຂອງການຄັດເລືອກ. ສຳລັບຮອບການຄັດເລືອກທີ 3 ແລະ 4, ແຕ່ລະ clone phage ທີ່ສະກັດຈາກ CSF ໄດ້ຖືກຈັດລຳດັບດ້ວຍມື. (ງ) ການເຄື່ອນໄຫວຂອງ phage ທີ່ແຍກອອກຈາກເລືອດ (ວົງມົນສີແດງ) ແລະນ້ຳໃນສະໝອງ (ສາມຫຼ່ຽມສີຂຽວ) ໃນລະຫວ່າງຮອບທຳອິດຂອງການຄັດເລືອກໃນໜູສອງໂຕທີ່ຖືກໃສ່ cannulated ຫຼັງຈາກການສັກເຂົ້າເສັ້ນເລືອດຂອງຫ້ອງສະໝຸດ peptide T7 (2 x 1012 phages/ສັດ). ຮູບສີ່ຫຼ່ຽມມົນສີຟ້າສະແດງເຖິງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນເບື້ອງຕົ້ນສະເລ່ຍຂອງຟາຈໃນເລືອດ, ເຊິ່ງຄິດໄລ່ຈາກປະລິມານຂອງຟາຈທີ່ຖືກສັກເຂົ້າ, ໂດຍຄຳນຶງເຖິງປະລິມານເລືອດທັງໝົດ. ຮູບສີ່ຫຼ່ຽມມົນສີດຳສະແດງເຖິງຈຸດຕັດກັນຂອງເສັ້ນ y ທີ່ຄາດຄະເນຈາກຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງຟາຈໃນເລືອດ. (e,f) ນຳສະເໜີຄວາມຖີ່ທຽບເທົ່າ ແລະ ການແຈກຢາຍຂອງຮູບແບບ tripeptide ທີ່ຊ້ອນກັນທັງໝົດທີ່ເປັນໄປໄດ້ທີ່ພົບໃນ peptide. ຈຳນວນຮູບແບບທີ່ພົບໃນການອ່ານ 1000 ຄັ້ງແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ. ຮູບແບບທີ່ອຸດົມສົມບູນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (p < 0.001) ແມ່ນໝາຍດ້ວຍຈຸດສີແດງ. (e) ແຜນວາດກະແຈກກະຈາຍສະຫະສຳພັນທີ່ປຽບທຽບຄວາມຖີ່ທຽບເທົ່າຂອງຮູບແບບ tripeptide ຂອງຫ້ອງສະໝຸດທີ່ຖືກສັກເຂົ້າກັບຟາຈທີ່ໄດ້ມາຈາກເລືອດຈາກສັດ #1.1 ແລະ #1.2. (f) ແຜນວາດກະແຈກກະຈາຍສະຫະສຳພັນທີ່ປຽບທຽບຄວາມຖີ່ທຽບເທົ່າຂອງຮູບແບບ tripeptide ຂອງຟາຈສັດ #1.1 ແລະ #1.2 ທີ່ໂດດດ່ຽວໃນເລືອດ ແລະ ນ້ຳໃນສະໝອງ. (g, h) ຕົວແທນ ID ລຳດັບຂອງຟາຈທີ່ອຸດົມສົມບູນດ້ວຍເລືອດ (g) ທຽບກັບຫ້ອງສະໝຸດທີ່ຖືກສັກເຂົ້າ ແລະ ຟາຈທີ່ອຸດົມສົມບູນດ້ວຍ CSF (h) ທຽບກັບເລືອດຫຼັງຈາກຮອບຂອງການຄັດເລືອກໃນຮ່າງກາຍໃນສັດທັງສອງຊະນິດ. ຂະໜາດຂອງລະຫັດຕົວອັກສອນດຽວຊີ້ບອກເຖິງຄວາມຖີ່ຂອງກົດອະມິໂນນັ້ນທີ່ປາກົດຢູ່ໃນຕຳແໜ່ງນັ້ນ. ສີຂຽວ = ຂົ້ວ, ສີມ່ວງ = ເປັນກາງ, ສີຟ້າ = ພື້ນຖານ, ສີແດງ = ເປັນກົດ ແລະ ສີດຳ = ກົດອະມິໂນທີ່ບໍ່ລະລາຍນ້ຳ. ຮູບທີ 1a, b ຖືກອອກແບບ ແລະ ຜະລິດໂດຍ Eduard Urich.
ພວກເຮົາໄດ້ສັກຫ້ອງສະໝຸດເພບໄທດ໌ຂອງຟາຈເຂົ້າໄປໃນໜູເຄື່ອງມື CM ສອງໂຕ (ກຸ່ມ A ແລະ B) ແລະ ຟາຈທີ່ແຍກອອກຈາກນ້ຳໃນສະໝອງ ແລະ ເລືອດ (ຮູບທີ 1d). ການກຳຈັດຫ້ອງສະໝຸດຢ່າງໄວວາໃນເບື້ອງຕົ້ນແມ່ນໜ້ອຍກວ່າເມື່ອທຽບກັບຟາຈປະເພດທຳມະຊາດ. ໄລຍະເວລາເຄິ່ງຊີວິດສະເລ່ຍຂອງຫ້ອງສະໝຸດທີ່ຖືກສັກໃນສັດທັງສອງໂຕແມ່ນ 24.8 ນາທີໃນເລືອດ, ຄ້າຍຄືກັບຟາຈປະເພດທຳມະຊາດ, ແລະ 38.5 ນາທີໃນນ້ຳไขสันหลัง. ຕົວຢ່າງຟາຈໃນເລືອດ ແລະ ນ້ຳໃນສະໝອງຈາກສັດແຕ່ລະໂຕໄດ້ຮັບ HTS ແລະ ເພບໄທດ໌ທີ່ກຳນົດໄວ້ທັງໝົດໄດ້ຖືກວິເຄາະເພື່ອຫາຮູບແບບໄຕເປບໄທດ໌ທີ່ສັ້ນ. ຮູບແບບໄຕເປບໄທດ໌ໄດ້ຖືກເລືອກເພາະວ່າມັນໃຫ້ພື້ນຖານໜ້ອຍທີ່ສຸດສຳລັບການສ້າງໂຄງສ້າງ ແລະ ການພົວພັນລະຫວ່າງເພບໄທດ໌ກັບໂປຣຕີນ14,15. ພວກເຮົາພົບຄວາມສຳພັນທີ່ດີໃນການແຈກຢາຍຮູບແບບລະຫວ່າງຫ້ອງສະໝຸດຟາຈທີ່ຖືກສັກ ແລະ ໂຄນທີ່ສະກັດຈາກເລືອດຂອງສັດທັງສອງໂຕ (ຮູບທີ 1e). ຂໍ້ມູນຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າສ່ວນປະກອບຂອງຫ້ອງສະໝຸດມີຄວາມອຸດົມສົມບູນພຽງແຕ່ເລັກນ້ອຍໃນຊ່ອງເລືອດ. ຄວາມຖີ່ຂອງກົດອະມິໂນ ແລະ ລຳດັບຄວາມເຫັນດີເຫັນພ້ອມໄດ້ຖືກວິເຄາະຕື່ມອີກໃນແຕ່ລະຕຳແໜ່ງໂດຍໃຊ້ການດັດແປງຊອບແວ Weblogo16. ສິ່ງທີ່ໜ້າສົນໃຈແມ່ນພວກເຮົາພົບເຫັນການເສີມສ້າງທີ່ແຂງແຮງໃນສານ glycine ໃນເລືອດ (ຮູບທີ 1g). ເມື່ອປຽບທຽບເລືອດກັບໂຄນທີ່ເລືອກຈາກ CSF, ການຄັດເລືອກທີ່ເຂັ້ມແຂງ ແລະ ການບໍ່ເລືອກຮູບແບບບາງຢ່າງໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນ (ຮູບທີ 1f), ແລະ ກົດອະມິໂນບາງຊະນິດມີຢູ່ຢ່າງມັກໃນຕຳແໜ່ງທີ່ກຳນົດໄວ້ລ່ວງໜ້າໃນ 12 ສະມາຊິກ (ຮູບທີ 1h). ສິ່ງທີ່ໜ້າສັງເກດແມ່ນສັດແຕ່ລະໂຕມີຄວາມແຕກຕ່າງກັນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນນ້ຳไขสันหลัง, ໃນຂະນະທີ່ການເສີມສ້າງ glycine ໃນເລືອດໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໃນສັດທັງສອງຊະນິດ (ຮູບເສີມ 4a–j). ຫຼັງຈາກການກັ່ນຕອງຂໍ້ມູນລຳດັບຢ່າງເຂັ້ມງວດໃນນ້ຳไขสันหลังຂອງສັດ #1.1 ແລະ #1.2, ໄດ້ຮັບ peptides 12-mer ທີ່ເປັນເອກະລັກທັງໝົດ 964 ແລະ 420 ຊະນິດ (ຮູບເສີມ 1d–e). ໂຄນ phage ທີ່ໂດດດ່ຽວໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍ ແລະ ໄດ້ຮັບການຄັດເລືອກໃນຮອບທີສອງໃນຮ່າງກາຍ. ຟາຈທີ່ສະກັດຈາກຮອບທີສອງຂອງການຄັດເລືອກໄດ້ຖືກນຳໄປໃຊ້ HTS ໃນສັດແຕ່ລະໂຕ ແລະ ເພບໄທດ໌ທັງໝົດທີ່ຖືກກຳນົດໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ເປັນຂໍ້ມູນປ້ອນເຂົ້າໃນໂປຣແກຣມຮັບຮູ້ຮູບແບບເພື່ອວິເຄາະການເກີດຂຶ້ນຂອງຮູບແບບ tripeptide (ຮູບທີ 2a, b, ef). ເມື່ອປຽບທຽບກັບວົງຈອນທຳອິດຂອງຟາຈທີ່ກູ້ຄືນມາຈາກ CSF, ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນການຄັດເລືອກ ແລະ ການຍົກເລີກການເລືອກຮູບແບບຕ່າງໆຕື່ມອີກໃນ CSF ໃນສາຂາ A ແລະ B (ຮູບທີ 2). ອັລກໍຣິທຶມການລະບຸເຄືອຂ່າຍໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ເພື່ອກຳນົດວ່າພວກມັນເປັນຕົວແທນຂອງຮູບແບບທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງລຳດັບທີ່ສອດຄ່ອງກັນຫຼືບໍ່. ຄວາມຄ້າຍຄືກັນທີ່ຊັດເຈນໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນລະຫວ່າງລຳດັບ 12 ມິຕິທີ່ກູ້ຄືນໂດຍ CSF ໃນ clade ທາງເລືອກ A (ຮູບທີ 2c, d) ແລະ clade B (ຮູບທີ 2g, h). ການວິເຄາະລວມກັນໃນແຕ່ລະສາຂາໄດ້ເປີດເຜີຍໂປຣໄຟລ໌ການຄັດເລືອກທີ່ແຕກຕ່າງກັນສຳລັບເພບໄທດ໌ 12-mer (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 5c, d) ແລະ ການເພີ່ມຂຶ້ນຂອງອັດຕາສ່ວນ titer CSF/ເລືອດໃນໄລຍະເວລາສຳລັບໂຄນທີ່ລວມກັນຫຼັງຈາກຮອບທີສອງຂອງການຄັດເລືອກເມື່ອທຽບກັບຮອບທຳອິດຂອງການຄັດເລືອກ (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 5e).
ການເສີມສ້າງຮູບແບບ ແລະ ເພບໄທດ໌ໃນນ້ຳไขสันหลังໂດຍການຄັດເລືອກການສະແດງຂອງຟາຈທີ່ເຮັດວຽກໃນຮ່າງກາຍສອງຮອບຕິດຕໍ່ກັນ.
ຟາຈນ້ຳໃນສະໝອງທັງໝົດທີ່ກູ້ຄືນມາຈາກຮອບທຳອິດຂອງສັດແຕ່ລະໂຕ (ສັດ #1.1 ແລະ #1.2) ໄດ້ຖືກລວມເຂົ້າກັນ, ຂະຫຍາຍ, ຈັດລຳດັບ HT ແລະ ສັກເຂົ້າກັນໃໝ່ (2 x 1010 ຟາຈ/ສັດ) ໜູ SM 2 ໂຕທີ່ຖືກໃສ່ທໍ່ (#1.1 → #). 2.1 ແລະ 2.2, 1.2 → 2.3 ແລະ 2.4). (a,b,e,f) ແຜນຜັງການກະແຈກກະຈາຍສະຫະສຳພັນທີ່ປຽບທຽບຄວາມຖີ່ທຽບເທົ່າຂອງຮູບແບບ tripeptide ຂອງຟາຈທີ່ໄດ້ມາຈາກ CSF ທັງໝົດໃນຮອບການຄັດເລືອກຄັ້ງທຳອິດ ແລະ ຮອບທີສອງ. ຄວາມຖີ່ທຽບເທົ່າ ແລະ ການແຈກຢາຍຂອງຮູບແບບທີ່ເປັນຕົວແທນຂອງ tripeptides ທີ່ຊ້ອນກັນທັງໝົດທີ່ເປັນໄປໄດ້ທີ່ພົບໃນ peptides ໃນທັງສອງທິດທາງ. ຈຳນວນຮູບແບບທີ່ພົບໃນການອ່ານ 1000 ຄັ້ງແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ. ຮູບແບບທີ່ຖືກເລືອກ ຫຼື ຖືກຍົກເວັ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (p < 0.001) ໃນໜຶ່ງໃນຫ້ອງສະໝຸດທີ່ປຽບທຽບແມ່ນເນັ້ນໃສ່ດ້ວຍຈຸດສີແດງ. (c, d, g, h) ການສະແດງໂລໂກ້ລຳດັບຂອງລຳດັບຍາວຂອງກົດອະມິໂນ 12 ຊະນິດທີ່ອຸດົມດ້ວຍ CSF ທັງໝົດໂດຍອີງໃສ່ຮອບທີ 2 ແລະ 1 ຂອງການຄັດເລືອກໃນຮ່າງກາຍ. ຂະໜາດຂອງລະຫັດຕົວອັກສອນດຽວຊີ້ບອກວ່າກົດອະມິໂນນັ້ນເກີດຂຶ້ນເລື້ອຍໆເທົ່າໃດໃນຕຳແໜ່ງນັ້ນ. ເພື່ອເປັນຕົວແທນຂອງໂລໂກ້, ຄວາມຖີ່ຂອງລຳດັບ CSF ທີ່ສະກັດຈາກສັດແຕ່ລະໂຕລະຫວ່າງສອງຮອບການຄັດເລືອກແມ່ນຖືກປຽບທຽບ ແລະ ລຳດັບທີ່ອຸດົມສົມບູນໃນຮອບທີສອງແມ່ນສະແດງໃຫ້ເຫັນ: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ແລະ (h) #1.2–#2.4. ກົດອະມິໂນທີ່ອຸດົມສົມບູນທີ່ສຸດໃນຕຳແໜ່ງທີ່ກຳນົດໃຫ້ໃນ (c, d) ສັດເລກທີ 2.1 ແລະ ເລກທີ 2.2 ຫຼື (g, h) ໃນສັດເລກທີ 2.3 ແລະ ເລກທີ 2.4 ແມ່ນສະແດງເປັນສີ. ສີຂຽວ = ມີຂົ້ວ, ສີມ່ວງ = ເປັນກາງ, ສີຟ້າ = ພື້ນຖານ, ສີແດງ = ເປັນກົດ ແລະ ສີດຳ = ກົດອະມິໂນທີ່ບໍ່ລະລາຍນ້ຳ.
ຫຼັງຈາກຮອບທີສາມຂອງການຄັດເລືອກ, ພວກເຮົາໄດ້ລະບຸລຳດັບ peptide ທີ່ເປັນເອກະລັກ 124 ລຳດັບ (#3.1 ແລະ #3.2) ຈາກ 332 clones phage ທີ່ສ້າງຂຶ້ນໃໝ່ໃນ CSF ທີ່ແຍກອອກມາຈາກສັດສອງໂຕ (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 6a). ລຳດັບ LGSVS (18.7%) ມີສັດສ່ວນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງສູງສຸດ, ຕາມດ້ວຍ inserts ປະເພດ wild-type PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ແລະ SARGSWREIVSLS (2.2%). ໃນຮອບທີສີ່ສຸດທ້າຍ, ພວກເຮົາໄດ້ລວມສອງສາຂາທີ່ເລືອກຢ່າງເປັນອິດສະຫຼະຈາກສັດສາມໂຕແຍກຕ່າງຫາກ (ຮູບທີ 1c). ໃນຈຳນວນ 925 clones phage ທີ່ຖືກລຳດັບຄືນມາຈາກ CSF, ໃນຮອບທີສີ່ ພວກເຮົາພົບລຳດັບ peptide ທີ່ເປັນເອກະລັກ 64 ລຳດັບ (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 6b), ໃນນັ້ນສັດສ່ວນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງຂອງ phage ປະເພດ wild-type ຫຼຸດລົງເປັນ 0.8%. ໂຄນ CSF ທີ່ພົບເລື້ອຍທີ່ສຸດໃນຮອບທີສີ່ແມ່ນ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KWAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ແລະ RLSSVDSDLSGC (3, 2%). ຊ່ວງຄວາມຍາວຂອງ peptides ທີ່ເລືອກແມ່ນຍ້ອນການໃສ່/ລຶບ nucleotide ຫຼື codons ຢຸດກ່ອນໄວອັນຄວນໃນ primers ຂອງຫ້ອງສະໝຸດເມື່ອໃຊ້ codons ທີ່ເສື່ອມໂຊມສຳລັບການອອກແບບຫ້ອງສະໝຸດ NNK. codons ຢຸດກ່ອນໄວອັນຄວນສ້າງ peptides ທີ່ສັ້ນກວ່າ ແລະ ຖືກເລືອກເພາະວ່າມັນມີ motif aa ທີ່ເອື້ອອຳນວຍ. peptides ທີ່ຍາວກວ່າອາດເກີດຈາກການໃສ່/ລຶບໃນ primers ຂອງຫ້ອງສະໝຸດສັງເຄາະ. ນີ້ວາງ codon ຢຸດທີ່ອອກແບບໄວ້ຢູ່ນອກເຟຣມ ແລະ ອ່ານມັນຈົນກວ່າ codon ຢຸດໃໝ່ຈະປາກົດຢູ່ທາງລຸ່ມ. ໂດຍທົ່ວໄປ, ພວກເຮົາໄດ້ຄິດໄລ່ປັດໄຈເສີມສຳລັບທັງສີ່ຮອບການຄັດເລືອກໂດຍການປຽບທຽບຂໍ້ມູນປ້ອນເຂົ້າກັບຂໍ້ມູນຜົນຜະລິດຕົວຢ່າງ. ສຳລັບການກວດຄັດຮອບທຳອິດ, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ຕົວວັດແທກ phage ປະເພດທຳມະຊາດເປັນເອກະສານອ້າງອີງພື້ນຖານທີ່ບໍ່ເຈາະຈົງ. ສິ່ງທີ່ໜ້າສົນໃຈແມ່ນການເລືອກ phage ລົບແມ່ນເຂັ້ມແຂງຫຼາຍໃນວົງຈອນ CSF ທຳອິດ, ແຕ່ບໍ່ແມ່ນໃນເລືອດ (ຮູບທີ 3a), ເຊິ່ງອາດຈະເປັນຍ້ອນຄວາມເປັນໄປໄດ້ຕ່ຳຂອງການແຜ່ກະຈາຍແບບ passive ຂອງສະມາຊິກສ່ວນໃຫຍ່ຂອງຫ້ອງສະໝຸດ peptide ເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງ CSF ຫຼື phage ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງມີແນວໂນ້ມທີ່ຈະຮັກສາ ຫຼື ກຳຈັດອອກຈາກກະແສເລືອດໄດ້ຢ່າງມີປະສິດທິພາບຫຼາຍກວ່າ bacteriophages. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ໃນຮອບທີສອງຂອງ panning, ການເລືອກ phage ທີ່ເຂັ້ມແຂງໃນ CSF ໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນໃນທັງສອງ clades, ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າຮອບທີ່ຜ່ານມາໄດ້ອຸດົມສົມບູນດ້ວຍ phages ທີ່ສະແດງ peptides ທີ່ສົ່ງເສີມການດູດຊຶມ CSF (ຮູບທີ 3a). ອີກເທື່ອໜຶ່ງ, ໂດຍບໍ່ມີການອຸດົມສົມບູນຂອງເລືອດຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. ນອກຈາກນີ້ໃນຮອບທີສາມ ແລະ ທີສີ່, clones phage ໄດ້ອຸດົມສົມບູນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ CSF. ການປຽບທຽບຄວາມຖີ່ທຽບເທົ່າຂອງແຕ່ລະລຳດັບ peptide ທີ່ເປັນເອກະລັກລະຫວ່າງສອງຮອບສຸດທ້າຍຂອງການຄັດເລືອກ, ພວກເຮົາພົບວ່າລຳດັບໄດ້ອຸດົມສົມບູນຫຼາຍຂຶ້ນໃນຮອບທີສີ່ຂອງການຄັດເລືອກ (ຮູບທີ 3b). ຮູບແບບ tripeptide ທັງໝົດ 931 ຮູບແບບໄດ້ຖືກສະກັດອອກຈາກລໍາດັບ peptide ທີ່ເປັນເອກະລັກທັງໝົດ 64 ໂດຍໃຊ້ທິດທາງ peptide ທັງສອງ. ຮູບແບບທີ່ອຸດົມສົມບູນທີ່ສຸດໃນຮອບທີສີ່ໄດ້ຖືກກວດສອບຢ່າງໃກ້ຊິດສໍາລັບໂປຣໄຟລ໌ການອຸດົມສົມບູນຂອງມັນໃນທຸກຮອບເມື່ອທຽບກັບຫ້ອງສະຫມຸດທີ່ຖືກສັກ (ຈຸດຕັດ: ການອຸດົມສົມບູນ 10%) (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 6c). ຮູບແບບທົ່ວໄປຂອງການຄັດເລືອກສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າແຮງຈູງໃຈທີ່ໄດ້ສຶກສາສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນໄດ້ຮັບການອຸດົມສົມບູນໃນທຸກຮອບທີ່ຜ່ານມາຂອງສາຂາການຄັດເລືອກທັງສອງ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຮູບແບບບາງຢ່າງ (ເຊັ່ນ SGL, VSG, LGS GSV) ສ່ວນໃຫຍ່ແມ່ນມາຈາກ clade ທາງເລືອກ A, ໃນຂະນະທີ່ຮູບແບບອື່ນໆ (ເຊັ່ນ FGW, RTN, WGF, NTR) ໄດ້ຖືກອຸດົມສົມບູນໃນ clade ທາງເລືອກ B.
ການຢືນຢັນການຂົນສົ່ງ CSF ຂອງ peptides ທີ່ສະແດງດ້ວຍ phage ທີ່ເສີມດ້ວຍ CSF ແລະ peptides ຜູ້ນຳ biotinylated ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບ payloads streptavidin.
(ກ) ອັດຕາສ່ວນການເສີມທີ່ຄິດໄລ່ໃນທັງສີ່ຮອບ (R1-R4) ໂດຍອີງໃສ່ຕົວວັດແທກ phage (PFU) ທີ່ຖືກສັກ (input = I) ແລະຕົວວັດແທກ phage CSF ທີ່ກຳນົດໄວ້ (output = O). ປັດໄຈການເສີມສຳລັບສາມຮອບສຸດທ້າຍ (R2-R4) ໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍການປຽບທຽບກັບຮອບທີ່ຜ່ານມາ ແລະ ຮອບທຳອິດ (R1) ດ້ວຍຂໍ້ມູນນ້ຳໜັກ. ແຖບເປີດແມ່ນນ້ຳໃນສະໝອງ, ແຖບທີ່ມີຮົ່ມແມ່ນ plasma. (***p<0.001, ອີງຕາມການທົດສອບ t ຂອງນັກຮຽນ). (ຂ) ບັນຊີລາຍຊື່ຂອງ peptides phage ທີ່ມີຫຼາຍທີ່ສຸດ, ຈັດອັນດັບຕາມສັດສ່ວນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບ phages ທັງໝົດທີ່ເກັບກຳໃນ CSF ຫຼັງຈາກຮອບທີ 4 ຂອງການຄັດເລືອກ. clones phage ທີ່ພົບເລື້ອຍທີ່ສຸດຫົກອັນແມ່ນເນັ້ນໃສ່ສີ, ມີເລກໝາຍ ແລະ ປັດໄຈການເສີມລະຫວ່າງຮອບທີ 3 ແລະ 4 ຂອງການຄັດເລືອກ (insets). (ຄ,ງ) clones phage ທີ່ເສີມຫຼາຍທີ່ສຸດຫົກອັນ, phage ທີ່ບໍ່ມີ ແລະ ຫ້ອງສະໝຸດ peptide phage ຂອງພໍ່ແມ່ຈາກຮອບທີ 4 ໄດ້ຖືກວິເຄາະແຍກຕ່າງຫາກໃນຮູບແບບການເກັບຕົວຢ່າງ CSF. CSF ແລະ ຕົວຢ່າງເລືອດໄດ້ຖືກເກັບກຳໃນຈຸດເວລາທີ່ລະບຸໄວ້. (c) ປະລິມານທີ່ເທົ່າທຽມກັນຂອງໂຄນຟາຈ 6 ຕົວທີ່ຖືກຄັດເລືອກ (2 x 1010 ຟາຈ/ສັດ), ຟາຈຫວ່າງເປົ່າ (#1779) (2 x 1010 ຟາຈ/ສັດ) ແລະຫ້ອງສະໝຸດເພບໄທດ໌ຟາຈສະຕັອກ (2 x 1012 ຟາຈ/ສັດ) ສັກຢ່າງໜ້ອຍ 3 CM ໃສ່ສັດທີ່ຖືກສອດທໍ່ແຍກຕ່າງຫາກຜ່ານທາງເສັ້ນເລືອດຫາງ. ການສະແດງຄຸນນະທຳຂອງນ້ຳໃນສະໝອງຂອງໂຄນຟາຈ ແລະຫ້ອງສະໝຸດເພບໄທດ໌ຟາຈແຕ່ລະຕົວໃນໄລຍະເວລາ. (d) ສະແດງໃຫ້ເຫັນອັດຕາສ່ວນນ້ຳໃນສະໝອງ/ເລືອດສະເລ່ຍສຳລັບຟາຈ/ມລທັງໝົດທີ່ຟື້ນຕົວໄດ້ໃນໄລຍະເວລາການເກັບຕົວຢ່າງ. (e) ເພບໄທດ໌ຜູ້ນຳສັງເຄາະສີ່ຕົວ ແລະກຸ່ມຄວບຄຸມທີ່ຖືກປະສົມເຂົ້າກັນໜຶ່ງຕົວໄດ້ຖືກເຊື່ອມໂຍງກັບໄບໂອຕິນກັບສະຕຣີບຕາວິດິນຜ່ານປາຍ N-terminus ຂອງພວກມັນ (ການສະແດງເທທຣາເມີ) ຕາມດ້ວຍການສັກ (ເສັ້ນເລືອດຫາງທາງເສັ້ນເລືອດ, ສະຕຣີບຕາວິດິນ 10 ມກ/ກກ). ຢ່າງໜ້ອຍໜູສາມໂຕທີ່ໃສ່ທໍ່ຊ່ວຍຫາຍໃຈ (N = 3). ຕົວຢ່າງ CSF ໄດ້ຖືກເກັບກຳຢູ່ຈຸດເວລາທີ່ລະບຸໄວ້ ແລະ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ streptavidin ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍ CSF anti-streptavidin ELISA (nd = ບໍ່ພົບ). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ອີງຕາມການທົດສອບ ANOVA). (f) ການປຽບທຽບລຳດັບກົດອະມິໂນຂອງໂຄລນເພບໄທດ໌ phage ທີ່ອຸດົມໄປດ້ວຍຫຼາຍທີ່ສຸດ #2002 (ສີມ່ວງ) ກັບໂຄລນເພບໄທດ໌ phage ອື່ນໆທີ່ເລືອກຈາກຮອບທີ 4 ຂອງການຄັດເລືອກ. ຊິ້ນສ່ວນກົດອະມິໂນທີ່ຄືກັນ ແລະ ຄ້າຍຄືກັນແມ່ນມີລະຫັດສີ.
ໃນບັນດາຟາຈທີ່ເສີມທັງໝົດໃນຮອບທີສີ່ (ຮູບທີ 3b), ໂຄລນທີ່ມີຕົວເລືອກຫົກຕົວໄດ້ຖືກຄັດເລືອກສຳລັບການວິເຄາະສ່ວນບຸກຄົນຕື່ມອີກໃນຮູບແບບການເກັບຕົວຢ່າງ CSF. ປະລິມານທີ່ເທົ່າທຽມກັນຂອງຟາຈ, ຟາຈຫວ່າງເປົ່າ (ບໍ່ມີການໃສ່) ແລະຫ້ອງສະໝຸດເພບໄທດ໌ໂປຣຟາຈໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າໄປໃນສັດ CM ສາມໂຕທີ່ຖືກໃສ່ທໍ່, ແລະຢາໄດ້ຖືກກຳນົດໃນການວິເຄາະ CSF (ຮູບທີ 3c) ແລະເລືອດ (ຮູບເສີມ 7). ໂຄລນຟາຈທັງໝົດທີ່ທົດສອບແມ່ນແນໃສ່ຊ່ອງ CSF ໃນລະດັບສູງກວ່າຟາຈຄວບຄຸມຫວ່າງເປົ່າ 10-1000 ເທົ່າ (#1779). ຕົວຢ່າງ, ໂຄລນ #2020 ແລະ #2077 ມີລະດັບ CSF ສູງກວ່າຟາຈຄວບຄຸມປະມານ 1000 ເທົ່າ. ໂປຣໄຟລ໌ຢາຂອງເພບໄທດ໌ທີ່ເລືອກແຕ່ລະຕົວແມ່ນແຕກຕ່າງກັນ, ແຕ່ທັງໝົດມີຄວາມສາມາດໃນການໂຮມ CSF ສູງ. ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນການຫຼຸດລົງຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງຕາມການເວລາສຳລັບໂຄນ #1903 ແລະ #2011, ໃນຂະນະທີ່ສຳລັບໂຄນ #2077, #2002 ແລະ #2009 ການເພີ່ມຂຶ້ນໃນໄລຍະ 10 ນາທີທຳອິດອາດຈະຊີ້ບອກເຖິງການຂົນສົ່ງທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວແຕ່ຕ້ອງໄດ້ຮັບການຢັ້ງຢືນ. ໂຄນ #2020, #2002, ແລະ #2077 ມີຄວາມໝັ້ນຄົງໃນລະດັບສູງ, ໃນຂະນະທີ່ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງນ້ຳไขสันหลังຂອງໂຄນ #2009 ຄ່ອຍໆຫຼຸດລົງຫຼັງຈາກການເພີ່ມຂຶ້ນໃນເບື້ອງຕົ້ນ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ພວກເຮົາໄດ້ປຽບທຽບຄວາມຖີ່ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງຂອງຜູ້ສະໝັກ CSF ແຕ່ລະຄົນກັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງເລືອດຂອງມັນ (ຮູບທີ 3d). ການພົວພັນຂອງ titer ສະເລ່ຍຂອງຜູ້ສະໝັກ CSF ແຕ່ລະຄົນກັບ titer ເລືອດຂອງມັນໃນເວລາເກັບຕົວຢ່າງທັງໝົດສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າສາມໃນຫົກຜູ້ສະໝັກມີ CSF ໃນເລືອດທີ່ອຸດົມສົມບູນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. ໜ້າສົນໃຈ, ໂຄນ #2077 ສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມໝັ້ນຄົງຂອງເລືອດທີ່ສູງຂຶ້ນ (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 7). ເພື່ອຢືນຢັນວ່າ peptides ເອງມີຄວາມສາມາດໃນການຂົນສົ່ງສິນຄ້ານອກເໜືອຈາກອະນຸພາກ phage ເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງ CSF, ພວກເຮົາໄດ້ສັງເຄາະ peptides ຜູ້ນຳສີ່ຊະນິດທີ່ອະນຸພັນດ້ວຍ biotin ຢູ່ທີ່ N-terminus ບ່ອນທີ່ peptides ຕິດກັບອະນຸພາກ phage. peptides ທີ່ມີໄບໂອຕິນ (ໝາຍເລກ 2002, 2009, 2020 ແລະ 2077) ໄດ້ຖືກເຊື່ອມຕໍ່ກັບ streptavidin (SA) ເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຮູບແບບ multimeric ທີ່ຄ້າຍຄືກັບຮູບຮ່າງຂອງ phage. ຮູບແບບນີ້ຍັງຊ່ວຍໃຫ້ພວກເຮົາສາມາດວັດແທກການສຳຜັດກັບ SA ໃນເລືອດ ແລະ ນ້ຳไขสันหลังເປັນ peptides ໂປຣຕີນຂົນສົ່ງສິນຄ້າ. ສິ່ງສຳຄັນ, ຂໍ້ມູນ phage ມັກຈະຖືກສ້າງຄືນໃໝ່ເມື່ອ peptides ສັງເຄາະຖືກນຳໃຊ້ໃນຮູບແບບ SA-conjugated ນີ້ (ຮູບທີ 3e). peptides ທີ່ຖືກປະສົມມີການສຳຜັດເບື້ອງຕົ້ນໜ້ອຍລົງ ແລະ ມີການກຳຈັດ CSF ໄວຂຶ້ນດ້ວຍລະດັບທີ່ບໍ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ພາຍໃນ 48 ຊົ່ວໂມງ. ເພື່ອໃຫ້ເຂົ້າໃຈເຖິງເສັ້ນທາງການສົ່ງຂອງ clones phage peptide ເຫຼົ່ານີ້ເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງ CSF, ພວກເຮົາໄດ້ວິເຄາະການຕັ້ງຖິ່ນຖານຂອງການຕີ peptide phage ແຕ່ລະອັນໂດຍໃຊ້ immunohistochemistry (IHC) ເພື່ອກວດຫາອະນຸພາກ phage ໂດຍກົງ 1 ຊົ່ວໂມງຫຼັງຈາກການສັກເຂົ້າເສັ້ນເລືອດໃນຮ່າງກາຍ. ສິ່ງທີ່ໜ້າສັງເກດຄື ໂຄນ #2002, #2077, ແລະ #2009 ສາມາດກວດພົບໄດ້ໂດຍການຍ້ອມສີທີ່ເຂັ້ມຂຸ້ນໃນເສັ້ນເລືອດຝອຍໃນສະໝອງ, ໃນຂະນະທີ່ຟາຈຄວບຄຸມ (#1779) ແລະ ໂຄນ #2020 ບໍ່ໄດ້ຖືກກວດພົບ (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 8). ນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າ peptides ເຫຼົ່ານີ້ປະກອບສ່ວນເຂົ້າໃນຜົນກະທົບຕໍ່ສະໝອງຢ່າງຊັດເຈນໂດຍການຂ້າມ BBB. ຕ້ອງມີການວິເຄາະລາຍລະອຽດເພີ່ມເຕີມເພື່ອທົດສອບສົມມຸດຕິຖານນີ້, ຍ້ອນວ່າເສັ້ນທາງ BSCFB ອາດຈະກ່ຽວຂ້ອງ. ເມື່ອປຽບທຽບລຳດັບກົດອະມິໂນຂອງໂຄນທີ່ອຸດົມສົມບູນທີ່ສຸດ (#2002) ກັບ peptides ອື່ນໆທີ່ເລືອກ, ມັນໄດ້ຖືກສັງເກດເຫັນວ່າບາງອັນມີການຂະຫຍາຍກົດອະມິໂນທີ່ຄ້າຍຄືກັນ, ເຊິ່ງອາດຈະຊີ້ບອກເຖິງກົນໄກການຂົນສົ່ງທີ່ຄ້າຍຄືກັນ (ຮູບທີ 3f).
ເນື່ອງຈາກໂປຣໄຟລ໌ plasma ທີ່ເປັນເອກະລັກ ແລະ ການເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນ CSF ຕາມການເວລາ, clone ສະແດງ phage #2077 ໄດ້ຖືກສຳຫຼວດຕື່ມອີກໃນໄລຍະເວລາ 48 ຊົ່ວໂມງ ແລະ ສາມາດສ້າງການເພີ່ມຂຶ້ນຢ່າງໄວວາຂອງ CSF ທີ່ສັງເກດເຫັນໃນສ່ວນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັບລະດັບ SA ທີ່ຍືນຍົງ (ຮູບທີ 4a). ກ່ຽວກັບ clones phage ອື່ນໆທີ່ລະບຸ, #2077 ໄດ້ຍ້ອມສີຢ່າງແຂງແຮງສຳລັບເສັ້ນເລືອດຝອຍໃນສະໝອງ ແລະ ສະແດງໃຫ້ເຫັນການຢູ່ຮ່ວມກັນທີ່ສຳຄັນກັບ capillary marker lectin ເມື່ອເບິ່ງໃນຄວາມລະອຽດສູງກວ່າ ແລະ ອາດຈະມີການຍ້ອມສີບາງຢ່າງໃນພື້ນທີ່ parenchymal (ຮູບທີ 4b). ເພື່ອສືບສວນວ່າຜົນກະທົບທາງດ້ານການຢາທີ່ໄກ່ເກ່ຍກັບ peptide ສາມາດໄດ້ຮັບໃນ CNS ຫຼືບໍ່, ພວກເຮົາໄດ້ດຳເນີນການທົດລອງທີ່ biotinylated versions ຂອງ i) #2077 transit peptide ແລະ ii) BACE1 inhibitor peptide ໄດ້ຖືກປະສົມກັບ SA ໃນສອງອັດຕາສ່ວນທີ່ແຕກຕ່າງກັນ. ສຳລັບການປະສົມປະສານໜຶ່ງ, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ພຽງແຕ່ຕົວຍັບຍັ້ງ peptide BACE1 ແລະ ສຳລັບອີກອັນໜຶ່ງ, ພວກເຮົາໄດ້ໃຊ້ອັດຕາສ່ວນ 1:3 ຂອງຕົວຍັບຍັ້ງ peptide BACE1 ຕໍ່ກັບ #2077 peptide. ຕົວຢ່າງທັງສອງໄດ້ຖືກໃຫ້ທາງເສັ້ນເລືອດດຳ ແລະ ລະດັບເລືອດ ແລະ ນ້ຳไขสันหลังຂອງ peptide beta-amyloid 40 (Abeta40) ໄດ້ຖືກວັດແທກຕາມການເວລາ. Abeta40 ໄດ້ຖືກວັດແທກໃນ CSF ຍ້ອນວ່າມັນສະທ້ອນເຖິງການຍັບຍັ້ງ BACE1 ໃນເນື້ອເຍື່ອສະໝອງ. ຕາມທີ່ຄາດໄວ້, ສະລັບສັບຊ້ອນທັງສອງໄດ້ຫຼຸດລະດັບເລືອດຂອງ Abeta40 ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຮູບທີ 4c, d). ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ມີພຽງແຕ່ຕົວຢ່າງທີ່ມີສ່ວນປະສົມຂອງ peptide ເລກທີ 2077 ແລະ ຕົວຍັບຍັ້ງຂອງ peptide BACE1 ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບ SA ເທົ່ານັ້ນທີ່ເຮັດໃຫ້ Abeta40 ຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍໃນນ້ຳไขสันหลัง (ຮູບທີ 4c). ຂໍ້ມູນສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ peptide ເລກທີ 2077 ສາມາດຂົນສົ່ງໂປຣຕີນ SA 60 kDa ເຂົ້າໄປໃນ CNS ແລະ ຍັງເຮັດໃຫ້ເກີດຜົນກະທົບທາງດ້ານການຢາກັບຕົວຍັບຍັ້ງ SA ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ຂອງ peptide BACE1.
(ກ) ການສັກໂຄລນ (2 × 10 phages/ສັດ) ຂອງຟາຈ T7 ສະແດງໃຫ້ເຫັນໂປຣໄຟລ໌ການຢາໄລຍະຍາວຂອງເພບໄທດ໌ CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) ແລະຟາຈຄວບຄຸມທີ່ບໍ່ໄດ້ສັກ (#1779) ໃນໜູຢ່າງໜ້ອຍສາມໂຕທີ່ຖືກໃສ່ທໍ່ຊ່ວຍຫາຍໃຈ CM. (ຂ) ຮູບພາບກ້ອງຈຸລະທັດ Confocal ຂອງ microvessels ທີ່ເປັນຕົວແທນຂອງ cortical ໃນໜູທີ່ຖືກສັກດ້ວຍຟາຈ (2 × 10 10 phages/ສັດ) ສະແດງໃຫ້ເຫັນການຕ້ານການຍ້ອມສີຂອງເພບໄທດ໌ #2077 ແລະເສັ້ນເລືອດ (lectin). ໂຄລນຟາຈເຫຼົ່ານີ້ໄດ້ຖືກສັກໃຫ້ກັບໜູ 3 ໂຕ ແລະປ່ອຍໃຫ້ໄຫຼວຽນເປັນເວລາ 1 ຊົ່ວໂມງກ່ອນການໄຫຼວຽນຂອງເລືອດ. ສະໝອງໄດ້ຖືກຕັດ ແລະຍ້ອມສີດ້ວຍພູມຕ້ານທານທີ່ມີປ້າຍ FITC ຕໍ່ຕ້ານ capsid ຟາຈ T7. ສິບນາທີກ່ອນການໄຫຼວຽນຂອງເລືອດ ແລະການແກ້ໄຂຕໍ່ມາ, ເລັກຕິນທີ່ມີປ້າຍ DyLight594 ໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າເສັ້ນເລືອດ. ຮູບພາບທີ່ສະທ້ອນແສງສະແດງໃຫ້ເຫັນການຍ້ອມສີເລັກຕິນ (ສີແດງ) ຂອງດ້ານ luminal ຂອງ microvasels ແລະ phages (ສີຂຽວ) ໃນ lumen ຂອງ capillaries ແລະເນື້ອເຍື່ອສະໝອງ perivascular. ແຖບຂະໜາດສອດຄ່ອງກັບ 10 µm. (c, d) peptide ຍັບຍັ້ງ BACE1 Biotinylated ຢ່າງດຽວ ຫຼື ຮ່ວມກັບ peptide transit biotinylated #2077 ໄດ້ຖືກເຊື່ອມຕໍ່ກັບ streptavidin ຕາມດ້ວຍການສັກເຂົ້າເສັ້ນເລືອດຂອງໜູ CM ທີ່ຖືກໃສ່ cannulated ຢ່າງໜ້ອຍສາມໂຕ (10 mg streptavidin/kg). ການຫຼຸດຜ່ອນ Aβ40 ທີ່ເກີດຈາກຕົວຍັບຍັ້ງ peptide BACE1 ໄດ້ຖືກວັດແທກໂດຍ Aβ1-40 ELISA ໃນເລືອດ (ສີແດງ) ແລະນ້ຳไขสันหลัง (ສີສົ້ມ) ໃນຈຸດເວລາທີ່ລະບຸໄວ້. ເພື່ອຄວາມຊັດເຈນທີ່ດີກວ່າ, ເສັ້ນປະຖືກແຕ້ມຢູ່ເທິງກຣາຟໃນລະດັບ 100%. (ຄ) ເປີເຊັນການຫຼຸດລົງຂອງ Aβ40 ໃນເລືອດ (ຮູບສາມຫຼ່ຽມສີແດງ) ແລະ ນ້ຳໃນສະໝອງ (ຮູບສາມຫຼ່ຽມສີສົ້ມ) ໃນໜູທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ streptavidin ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບ transit peptide #2077 ແລະ peptide ຍັບຍັ້ງ BACE1 ໃນອັດຕາສ່ວນ 3:1. (ງ) ເປີເຊັນການຫຼຸດລົງຂອງ Aβ40 ໃນເລືອດ (ວົງມົນສີແດງ) ແລະ ນ້ຳໃນສະໝອງ (ວົງມົນສີສົ້ມ) ຂອງໜູທີ່ໄດ້ຮັບການປິ່ນປົວດ້ວຍ streptavidin ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບ peptide ຍັບຍັ້ງ BACE1 ເທົ່ານັ້ນ. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ Aβ ໃນກຸ່ມຄວບຄຸມແມ່ນ 420 pg/ml (ຄ່າຜັນປ່ຽນມາດຕະຖານ = 101 pg/ml).
ການສະແດງຂອງຟາຈໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ຢ່າງສຳເລັດຜົນໃນຫຼາຍຂົງເຂດຂອງການຄົ້ນຄວ້າທາງການແພດ17. ວິທີການນີ້ໄດ້ຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການສຶກສາຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງເສັ້ນເລືອດໃນຮ່າງກາຍ18,19 ເຊັ່ນດຽວກັນກັບການສຶກສາທີ່ແນໃສ່ເສັ້ນເລືອດໃນສະໝອງ20,21,22,23,24,25,26. ໃນການສຶກສານີ້, ພວກເຮົາໄດ້ຂະຫຍາຍການນໍາໃຊ້ວິທີການຄັດເລືອກນີ້ບໍ່ພຽງແຕ່ໃນການລະບຸໂດຍກົງຂອງເພບໄທດ໌ທີ່ແນໃສ່ເສັ້ນເລືອດໃນສະໝອງເທົ່ານັ້ນ, ແຕ່ຍັງລວມທັງການຄົ້ນພົບຜູ້ສະໝັກທີ່ມີຄຸນສົມບັດການຂົນສົ່ງທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວເພື່ອຂ້າມຜ່ານອຸປະສັກເລືອດ-ສະໝອງ. ປະຈຸບັນພວກເຮົາອະທິບາຍການພັດທະນາຂັ້ນຕອນການຄັດເລືອກໃນຮ່າງກາຍໃນໜູທີ່ໃສ່ທໍ່ຊ່ວຍຫາຍໃຈ CM ແລະສະແດງໃຫ້ເຫັນທ່າແຮງຂອງມັນໃນການລະບຸເພບໄທດ໌ທີ່ມີຄຸນສົມບັດການເປັນບ້ານຂອງນໍ້າສະໝອງ. ໂດຍໃຊ້ຟາຈ T7 ທີ່ສະແດງຫ້ອງສະໝຸດຂອງເພບໄທດ໌ແບບສຸ່ມ 12-mer, ພວກເຮົາສາມາດສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຟາຈ T7 ມີຂະໜາດນ້ອຍພໍ (ປະມານ 60 nm ໃນເສັ້ນຜ່າສູນກາງ)10 ທີ່ຈະປັບຕົວເຂົ້າກັບອຸປະສັກເລືອດ-ສະໝອງ, ດັ່ງນັ້ນຈຶ່ງຂ້າມຜ່ານອຸປະສັກເລືອດ-ສະໝອງ ຫຼື choroid plexus ໂດຍກົງ. ພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນວ່າການເກັບກ່ຽວ CSF ຈາກໜູ CM ທີ່ຖືກໃສ່ທໍ່ແມ່ນວິທີການກວດວິເຄາະໜ້າທີ່ໃນຮ່າງກາຍທີ່ຄວບຄຸມໄດ້ດີ, ແລະ phage ທີ່ສະກັດອອກມາບໍ່ພຽງແຕ່ຜູກມັດກັບເສັ້ນເລືອດເທົ່ານັ້ນ ແຕ່ຍັງເຮັດໜ້າທີ່ເປັນຜູ້ຂົນສົ່ງຂ້າມອຸປະສັກລະຫວ່າງເລືອດ ແລະ ສະໝອງ. ນອກຈາກນັ້ນ, ໂດຍການເກັບເລືອດ ແລະ ການນຳໃຊ້ HTS ກັບ CSF ແລະ phage ທີ່ມາຈາກເລືອດພ້ອມໆກັນ, ພວກເຮົາໄດ້ຢືນຢັນວ່າການເລືອກ CSF ຂອງພວກເຮົາບໍ່ໄດ້ຮັບອິດທິພົນຈາກການເສີມສ້າງເລືອດ ຫຼື ຄວາມເໝາະສົມສຳລັບການຂະຫຍາຍຕົວລະຫວ່າງຮອບຂອງການຄັດເລືອກ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ຊ່ອງເລືອດແມ່ນສ່ວນໜຶ່ງຂອງຂັ້ນຕອນການຄັດເລືອກ, ເນື່ອງຈາກ phage ທີ່ສາມາດເຂົ້າເຖິງຊ່ອງ CSF ຕ້ອງຢູ່ລອດ ແລະ ໄຫຼວຽນຢູ່ໃນກະແສເລືອດດົນພໍທີ່ຈະເສີມສ້າງຕົວເອງໃນສະໝອງ. ເພື່ອສະກັດເອົາຂໍ້ມູນລຳດັບທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ຈາກຂໍ້ມູນ HTS ດິບ, ພວກເຮົາໄດ້ປະຕິບັດຕົວກອງທີ່ປັບຕົວເຂົ້າກັບຄວາມຜິດພາດຂອງລຳດັບສະເພາະແພລດຟອມໃນຂະບວນການວິເຄາະ. ໂດຍການລວມເອົາພາລາມິເຕີ kinetic ເຂົ້າໃນວິທີການກວດວິເຄາະ, ພວກເຮົາໄດ້ຢືນຢັນການຢາຢ່າງໄວວາຂອງ phage T7 ປະເພດທຳມະຊາດ (t½ ~ 28 ນາທີ) ໃນເລືອດ 24, 27, 28 ແລະ ຍັງໄດ້ກຳນົດເຄິ່ງຊີວິດຂອງມັນໃນນ້ຳไขสันหลัง (t½ ~ 26 ນາທີ) ຕໍ່ນາທີ). ເຖິງວ່າຈະມີໂປຣໄຟລ໌ການຢາທີ່ຄ້າຍຄືກັນໃນເລືອດ ແລະ ນ້ຳไขสันหลัง, ແຕ່ສາມາດກວດພົບພຽງແຕ່ 0.001% ຂອງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງເລືອດຂອງຟາຈໃນນ້ຳไขสันหลังໄດ້ໃນນ້ຳไขสันหลัง, ເຊິ່ງຊີ້ບອກເຖິງການເຄື່ອນທີ່ພື້ນຖານຕໍ່າຂອງຟາຈ T7 ປະເພດທຳມະຊາດຜ່ານອຸປະສັກສະໝອງເລືອດ. ວຽກງານນີ້ເນັ້ນໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມສຳຄັນຂອງຮອບທຳອິດຂອງການຄັດເລືອກເມື່ອນຳໃຊ້ຍຸດທະສາດການແຍກຈຸລັງໃນຮ່າງກາຍ, ໂດຍສະເພາະສຳລັບລະບົບຟາຈທີ່ຖືກກຳຈັດອອກຈາກການໄຫຼວຽນຢ່າງໄວວາ, ຍ້ອນວ່າມີໂຄນໜ້ອຍໂຕທີ່ສາມາດເຂົ້າເຖິງຊ່ອງ CNS ໄດ້. ດັ່ງນັ້ນ, ໃນຮອບທຳອິດ, ການຫຼຸດຜ່ອນຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຫ້ອງສະໝຸດແມ່ນມີຂະໜາດໃຫຍ່ຫຼາຍ, ຍ້ອນວ່າມີພຽງໂຄນຈຳນວນຈຳກັດເທົ່ານັ້ນທີ່ຖືກເກັບກຳໃນທີ່ສຸດໃນຮູບແບບນ້ຳไขสันหลังທີ່ເຂັ້ມງວດຫຼາຍນີ້. ຍຸດທະສາດການແຍກຈຸລັງໃນຮ່າງກາຍນີ້ລວມມີຂັ້ນຕອນການຄັດເລືອກຫຼາຍຢ່າງເຊັ່ນ: ການສະສົມຢ່າງຫ້າວຫັນໃນຊ່ອງ CSF, ການຢູ່ລອດຂອງໂຄນໃນຊ່ອງເລືອດ, ແລະການກຳຈັດໂຄນຟາຈ T7 ຢ່າງໄວວາອອກຈາກເລືອດພາຍໃນ 10 ນາທີທຳອິດ (ຮູບທີ 1d ແລະຮູບທີ 4M ເພີ່ມເຕີມ). ດັ່ງນັ້ນ, ຫຼັງຈາກຮອບທຳອິດ, ໂຄນຟາຈທີ່ແຕກຕ່າງກັນໄດ້ຖືກລະບຸໃນນ້ຳไขสันหลัง, ເຖິງແມ່ນວ່າກຸ່ມເບື້ອງຕົ້ນດຽວກັນຖືກນຳໃຊ້ສຳລັບສັດແຕ່ລະໂຕ. ນີ້ຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າຂັ້ນຕອນການຄັດເລືອກທີ່ເຂັ້ມງວດຫຼາຍຂັ້ນຕອນສຳລັບຫໍສະໝຸດແຫຼ່ງຂໍ້ມູນທີ່ມີສະມາຊິກຫໍສະໝຸດຈຳນວນຫຼວງຫຼາຍເຮັດໃຫ້ຄວາມຫຼາກຫຼາຍຫຼຸດລົງຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ. ດັ່ງນັ້ນ, ເຫດການແບບສຸ່ມຈະກາຍເປັນສ່ວນໜຶ່ງທີ່ສຳຄັນຂອງຂະບວນການຄັດເລືອກໃນເບື້ອງຕົ້ນ, ເຊິ່ງມີອິດທິພົນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຕໍ່ຜົນໄດ້ຮັບ. ມັນເປັນໄປໄດ້ວ່າໂຄນຫຼາຍໂຕໃນຫໍສະໝຸດຕົ້ນສະບັບມີແນວໂນ້ມທີ່ຈະເພີ່ມປະລິມານ CSF ທີ່ຄ້າຍຄືກັນຫຼາຍ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, ເຖິງແມ່ນວ່າພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂການທົດລອງດຽວກັນ, ຜົນການຄັດເລືອກອາດຈະແຕກຕ່າງກັນຍ້ອນຈຳນວນໂຄນແຕ່ລະໂຕສະເພາະໜ້ອຍໃນກຸ່ມເບື້ອງຕົ້ນ.
ຮູບແບບທີ່ອຸດົມໄປດ້ວຍ CSF ແຕກຕ່າງຈາກຮູບແບບໃນເລືອດ. ສິ່ງທີ່ໜ້າສົນໃຈແມ່ນພວກເຮົາໄດ້ສັງເກດເຫັນການປ່ຽນແປງຄັ້ງທຳອິດໄປສູ່ peptides ທີ່ອຸດົມໄປດ້ວຍ glycine ໃນເລືອດຂອງສັດແຕ່ລະໂຕ. (ຮູບທີ 1g, ຮູບເສີມ 4e, 4f). peptides ທີ່ມີ phage glycine ອາດຈະມີຄວາມໝັ້ນຄົງຫຼາຍກວ່າ ແລະ ມີໂອກາດໜ້ອຍທີ່ຈະຖືກເອົາອອກຈາກການໄຫຼວຽນຂອງເລືອດ. ຢ່າງໃດກໍຕາມ, peptides ທີ່ອຸດົມໄປດ້ວຍ glycine ເຫຼົ່ານີ້ບໍ່ໄດ້ຖືກກວດພົບໃນຕົວຢ່າງນ້ຳไขสันหลัง, ເຊິ່ງຊີ້ໃຫ້ເຫັນວ່າຫ້ອງສະໝຸດທີ່ຄັດສັນມາໄດ້ຜ່ານຂັ້ນຕອນການຄັດເລືອກສອງຂັ້ນຕອນທີ່ແຕກຕ່າງກັນ: ໜຶ່ງໃນເລືອດ ແລະ ອີກອັນໜຶ່ງອະນຸຍາດໃຫ້ສະສົມຢູ່ໃນນ້ຳไขสันหลัง. clones ທີ່ອຸດົມໄປດ້ວຍ CSF ທີ່ເປັນຜົນມາຈາກຮອບທີສີ່ຂອງການຄັດເລືອກໄດ້ຮັບການທົດສອບຢ່າງກວ້າງຂວາງ. ເກືອບທັງໝົດຂອງ clones ທີ່ໄດ້ຮັບການທົດສອບສ່ວນບຸກຄົນໄດ້ຮັບການຢືນຢັນວ່າອຸດົມໄປດ້ວຍ CSF ເມື່ອທຽບກັບ phage ຄວບຄຸມທີ່ບໍ່ມີປະໂຫຍດ. peptide ໜຶ່ງທີ່ຖືກຕີ (#2077) ໄດ້ຖືກກວດສອບຢ່າງລະອຽດ. ມັນສະແດງໃຫ້ເຫັນເຄິ່ງຊີວິດໃນ plasma ທີ່ຍາວກວ່າເມື່ອທຽບກັບການຕີອື່ນໆ (ຮູບທີ 3d ແລະຮູບເສີມ 7), ແລະ ສິ່ງທີ່ໜ້າສົນໃຈແມ່ນ peptide ນີ້ມີ cysteine ​​​​residue ຢູ່ທີ່ C-terminus. ບໍ່ດົນມານີ້ໄດ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າການເພີ່ມຊີສເຕອີນໃສ່ເພບໄທດ໌ສາມາດປັບປຸງຄຸນສົມບັດການຢາຂອງມັນໄດ້ໂດຍການຜູກມັດກັບອາລະບູມິນ 29. ປະຈຸບັນນີ້ຍັງບໍ່ຮູ້ເທື່ອສຳລັບເພບໄທດ໌ #2077 ແລະຕ້ອງການການສຶກສາຕື່ມອີກ. ເພບໄທດ໌ບາງຊະນິດສະແດງໃຫ້ເຫັນເຖິງຄວາມເພິ່ງພາອາໄສຂອງວາເລນໃນການເສີມທາດນ້ຳໃນສະໝອງ (ຂໍ້ມູນບໍ່ໄດ້ສະແດງ), ເຊິ່ງອາດຈະກ່ຽວຂ້ອງກັບຮູບຮ່າງຂອງໜ້າດິນທີ່ສະແດງຂອງແຄບຊິດ T7. ລະບົບ T7 ທີ່ພວກເຮົາໃຊ້ສະແດງໃຫ້ເຫັນ 5-15 ສຳເນົາຂອງເພບໄທດ໌ແຕ່ລະອັນຕໍ່ອະນຸພາກຟາຈ. IHC ໄດ້ຖືກປະຕິບັດກ່ຽວກັບໂຄນຟາຈນຳທີ່ຖືກສັກເຂົ້າເສັ້ນເລືອດໃນສະໝອງຂອງໜູ (ຮູບເສີມທີ 8). ຂໍ້ມູນສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າຢ່າງໜ້ອຍສາມໂຄນ (ເລກທີ 2002, ເລກທີ 2009 ແລະ ເລກທີ 2077) ໄດ້ພົວພັນກັບ BBB. ມັນຍັງຕ້ອງໄດ້ກຳນົດວ່າການພົວພັນ BBB ນີ້ເຮັດໃຫ້ເກີດການສະສົມຂອງນ້ຳໃນສະໝອງ ຫຼື ການເຄື່ອນຍ້າຍຂອງໂຄນເຫຼົ່ານີ້ໂດຍກົງໄປຫາ BCSFB. ສິ່ງສຳຄັນ, ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າເພບໄທດ໌ທີ່ເລືອກໄວ້ຍັງຄົງຮັກສາຄວາມສາມາດໃນການຂົນສົ່ງນ້ຳໃນສະໝອງຂອງພວກມັນເມື່ອສັງເຄາະ ແລະ ຜູກມັດກັບສິນຄ້າໂປຣຕີນ. ການຜູກມັດຂອງ peptides biotinylated N-terminal ກັບ SA ໂດຍພື້ນຖານແລ້ວແມ່ນເຮັດຊ້ຳຜົນໄດ້ຮັບທີ່ໄດ້ຮັບກັບ clones phage ທີ່ກ່ຽວຂ້ອງໃນເລືອດ ແລະ ນ້ຳໃນສະໝອງ (ຮູບທີ 3e). ສຸດທ້າຍ, ພວກເຮົາສະແດງໃຫ້ເຫັນວ່າ peptide lead #2077 ສາມາດສົ່ງເສີມການກະທຳຂອງສະໝອງຂອງຕົວຍັບຍັ້ງ peptide biotinylated ຂອງ BACE1 ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັບ SA, ເຊິ່ງເຮັດໃຫ້ເກີດຜົນກະທົບທາງດ້ານ pharmacodynamic ທີ່ໂດດເດັ່ນໃນ CNS ໂດຍການຫຼຸດຜ່ອນລະດັບ Abeta40 ໃນ CSF ຢ່າງຫຼວງຫຼາຍ (ຮູບທີ 4). ພວກເຮົາບໍ່ສາມາດລະບຸ homologues ໃດໆໃນຖານຂໍ້ມູນໂດຍການຄົ້ນຫາຄວາມຄ້າຍຄືກັນຂອງລຳດັບ peptide ຂອງ hits ທັງໝົດ. ມັນເປັນສິ່ງສຳຄັນທີ່ຄວນສັງເກດວ່າຂະໜາດຂອງຫ້ອງສະໝຸດ T7 ແມ່ນປະມານ 109, ໃນຂະນະທີ່ຂະໜາດຫ້ອງສະໝຸດທາງທິດສະດີສຳລັບ 12-mers ແມ່ນ 4 x 1015. ດັ່ງນັ້ນ, ພວກເຮົາພຽງແຕ່ເລືອກສ່ວນນ້ອຍໆຂອງພື້ນທີ່ຄວາມຫຼາກຫຼາຍຂອງຫ້ອງສະໝຸດ peptide 12-mer, ເຊິ່ງອາດໝາຍຄວາມວ່າ peptides ທີ່ດີທີ່ສຸດສາມາດຖືກລະບຸໄດ້ໂດຍການປະເມີນພື້ນທີ່ລຳດັບທີ່ຢູ່ຕິດກັນຂອງ hits ທີ່ລະບຸໄວ້ເຫຼົ່ານີ້. ຕາມສົມມຸດຕິຖານ, ໜຶ່ງໃນເຫດຜົນທີ່ພວກເຮົາບໍ່ພົບຄວາມຄ້າຍຄືກັນທາງທຳມະຊາດຂອງ peptides ເຫຼົ່ານີ້ອາດຈະເປັນການບໍ່ເລືອກໃນລະຫວ່າງການວິວັດທະນາການເພື່ອປ້ອງກັນການເຂົ້າມາຂອງຮູບແບບ peptide ບາງຢ່າງເຂົ້າໄປໃນສະໝອງທີ່ບໍ່ສາມາດຄວບຄຸມໄດ້.
ເມື່ອພິຈາລະນາຮ່ວມກັນແລ້ວ, ຜົນໄດ້ຮັບຂອງພວກເຮົາຈະເປັນພື້ນຖານສຳລັບວຽກງານໃນອະນາຄົດເພື່ອກຳນົດ ແລະ ອະທິບາຍລັກສະນະລະບົບການຂົນສົ່ງຂອງສິ່ງກີດຂວາງເສັ້ນເລືອດສະໝອງໃນຮ່າງກາຍໃຫ້ລະອຽດກວ່າ. ການຕັ້ງຄ່າພື້ນຖານຂອງວິທີການນີ້ແມ່ນອີງໃສ່ຍຸດທະສາດການຄັດເລືອກທີ່ເປັນປະໂຫຍດທີ່ບໍ່ພຽງແຕ່ລະບຸໂຄນທີ່ມີຄຸນສົມບັດການຜູກມັດເສັ້ນເລືອດສະໝອງເທົ່ານັ້ນ, ແຕ່ຍັງປະກອບມີຂັ້ນຕອນທີ່ສຳຄັນທີ່ໂຄນທີ່ປະສົບຜົນສຳເລັດມີກິດຈະກຳພາຍໃນເພື່ອຂ້າມສິ່ງກີດຂວາງທາງຊີວະພາບໃນຮ່າງກາຍເຂົ້າໄປໃນຊ່ອງ CNS. ແມ່ນເພື່ອອະທິບາຍກົນໄກການຂົນສົ່ງຂອງເພບໄທດ໌ເຫຼົ່ານີ້ ແລະ ຄວາມມັກຂອງພວກມັນໃນການຜູກມັດກັບຈຸລະພາກຂອງເສັ້ນເລືອດສະໝອງສະເພາະກັບພາກພື້ນສະໝອງ. ນີ້ອາດຈະນຳໄປສູ່ການຄົ້ນພົບເສັ້ນທາງໃໝ່ສຳລັບການຂົນສົ່ງຂອງ BBB ແລະ ຕົວຮັບ. ພວກເຮົາຄາດວ່າເພບໄທດ໌ທີ່ກຳນົດໄວ້ສາມາດຜູກມັດໂດຍກົງກັບຕົວຮັບເສັ້ນເລືອດສະໝອງ ຫຼື ກັບລີກັນທີ່ໄຫຼວຽນທີ່ຂົນສົ່ງຜ່ານ BBB ຫຼື BCSFB. ເວັກເຕີເພບໄທດ໌ທີ່ມີກິດຈະກຳການຂົນສົ່ງ CSF ທີ່ຄົ້ນພົບໃນວຽກງານນີ້ຈະຖືກສືບສວນຕື່ມອີກ. ປະຈຸບັນພວກເຮົາກຳລັງສືບສວນຄວາມຈຳເພາະຂອງສະໝອງຂອງເພບໄທດ໌ເຫຼົ່ານີ້ສຳລັບຄວາມສາມາດຂອງພວກມັນໃນການຂ້າມ BBB ແລະ/ຫຼື BCSFB. ເພບໄທດ໌ໃໝ່ເຫຼົ່ານີ້ຈະເປັນເຄື່ອງມືທີ່ມີຄຸນຄ່າຫຼາຍສຳລັບການຄົ້ນພົບຕົວຮັບ ຫຼື ເສັ້ນທາງໃໝ່ທີ່ມີທ່າແຮງ ແລະ ສຳລັບການພັດທະນາເວທີທີ່ມີປະສິດທິພາບສູງໃໝ່ສຳລັບການສົ່ງໂມເລກຸນໃຫຍ່ ເຊັ່ນ: ສານຊີວະພາບ ໄປສູ່ສະໝອງ.
ສຽບທໍ່ໃສ່ຖັງນ້ຳຂະໜາດໃຫຍ່ (CM) ໂດຍໃຊ້ການດັດແປງວິທີການທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ກ່ອນໜ້ານີ້. ໜູ Wistar ທີ່ໄດ້ຮັບຢາສະລົບ (200-350 g) ໄດ້ຖືກຕິດຕັ້ງໃສ່ອຸປະກອນ stereotaxic ແລະ ມີການຜ່າຕັດກາງເທິງຫົວທີ່ຖືກໂກນ ແລະ ກຽມພ້ອມແບບບໍ່ມີເຊື້ອເພື່ອເປີດເຜີຍກະໂຫຼກຫົວ. ເຈາະສອງຮູໃນພື້ນທີ່ຂອງແຖບດ້ານເທິງ ແລະ ຕິດສະກູຕິດຕັ້ງໃສ່ຮູ. ເຈາະຮູເພີ່ມເຕີມຢູ່ໃນສັນຫຼັງດ້ານຂ້າງເພື່ອການນຳທາງແບບ stereotactic ຂອງທໍ່ສະແຕນເລດເຂົ້າໄປໃນ CM. ໃຊ້ຊີມັງແຂ້ວອ້ອມຮອບທໍ່ ແລະ ຮັດດ້ວຍສະກູ. ຫຼັງຈາກການແຂງຕົວດ້ວຍແສງ ແລະ ການແຂງຕົວຂອງຊີມັງ, ບາດແຜຜິວໜັງໄດ້ຖືກປິດດ້ວຍໄໝเย็บ supramid 4/0. ການວາງທໍ່ຢ່າງຖືກຕ້ອງໄດ້ຮັບການຢືນຢັນໂດຍການຮົ່ວໄຫຼຂອງນ້ຳໃນສະໝອງ (CSF) ໂດຍອັດຕະໂນມັດ. ເອົາໜູອອກຈາກອຸປະກອນ stereotaxic, ໄດ້ຮັບການດູແລຫຼັງການຜ່າຕັດ ແລະ ການຈັດການຄວາມເຈັບປວດທີ່ເໝາະສົມ, ແລະ ປ່ອຍໃຫ້ມັນຟື້ນຕົວຢ່າງໜ້ອຍໜຶ່ງອາທິດຈົນກວ່າຈະສັງເກດເຫັນອາການຂອງເລືອດໃນນ້ຳໃນສະໝອງ. ໜູ Wistar (Crl:WI/Han) ໄດ້ມາຈາກ Charles River (ປະເທດຝຣັ່ງ). ໜູທຸກໂຕໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາໄວ້ພາຍໃຕ້ເງື່ອນໄຂສະເພາະທີ່ບໍ່ມີເຊື້ອພະຍາດ. ການທົດລອງກັບສັດທັງໝົດໄດ້ຮັບການອະນຸມັດຈາກຫ້ອງການສັດຕະວະແພດຂອງເມືອງ Basel, ປະເທດສະວິດເຊີແລນ, ແລະ ໄດ້ປະຕິບັດຕາມໃບອະນຸຍາດສັດເລກທີ 2474 (ການປະເມີນການຂົນສົ່ງສະໝອງທີ່ມີການເຄື່ອນໄຫວໂດຍການວັດລະດັບຂອງຜູ້ສະໝັກການປິ່ນປົວໃນນ້ຳไขสันหลัง ແລະ ສະໝອງຂອງໜູ).
ຄ່ອຍໆຮັກສາໜູໃຫ້ຮູ້ສຶກຕົວດ້ວຍທໍ່ CM ຢູ່ໃນມື. ເອົາ Datura ອອກຈາກທໍ່ ແລະ ເກັບເອົານ້ຳໃນສະໝອງທີ່ໄຫຼອອກມາເອງ 10 µl. ເນື່ອງຈາກການເປີດຂອງທໍ່ໄດ້ຖືກທຳລາຍໃນທີ່ສຸດ, ຈຶ່ງມີພຽງຕົວຢ່າງນ້ຳໃນສະໝອງທີ່ຈະແຈ້ງໂດຍບໍ່ມີຫຼັກຖານການປົນເປື້ອນຂອງເລືອດ ຫຼື ການປ່ຽນສີເທົ່ານັ້ນທີ່ລວມຢູ່ໃນການສຶກສານີ້. ໃນເວລາດຽວກັນ, ເລືອດປະມານ 10–20 µl ໄດ້ຖືກເອົາມາຈາກຮອຍຜ່າຕັດນ້ອຍໆຢູ່ປາຍຫາງເຂົ້າໄປໃນທໍ່ທີ່ມີ heparin (Sigma-Aldrich). ນ້ຳໃນສະໝອງ ແລະ ເລືອດໄດ້ຖືກເກັບໃນຈຸດເວລາຕ່າງໆຫຼັງຈາກການສັກ phage T7 ທາງເສັ້ນເລືອດ. ນ້ຳປະມານ 5–10 µl ໄດ້ຖືກຖິ້ມກ່ອນທີ່ຕົວຢ່າງນ້ຳໃນສະໝອງແຕ່ລະຕົວຢ່າງຈະຖືກເກັບ, ເຊິ່ງສອດຄ່ອງກັບປະລິມານທີ່ຕາຍແລ້ວຂອງທໍ່ catheter.
ຫ້ອງສະໝຸດໄດ້ຖືກສ້າງຂຶ້ນໂດຍໃຊ້ເວັກເຕີ T7Select 10-3b ຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ໃນຄູ່ມືລະບົບ T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). ໂດຍຫຍໍ້, ການໃສ່ DNA ແບບສຸ່ມ 12-mer ໄດ້ຖືກສັງເຄາະໃນຮູບແບບຕໍ່ໄປນີ້:
ໂຄດອນ NNK ຖືກນໍາໃຊ້ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນໂຄດອນຢຸດສອງເທົ່າ ແລະ ການສະແດງອອກຂອງກົດອະມິໂນຫຼາຍເກີນໄປໃນແຜ່ນໃສ່. N ແມ່ນອັດຕາສ່ວນ equimolar ທີ່ປະສົມດ້ວຍມືຂອງນິວຄລີໂອໄທດ໌ແຕ່ລະອັນ, ແລະ K ແມ່ນອັດຕາສ່ວນ equimolar ທີ່ປະສົມດ້ວຍມືຂອງນິວຄລີໂອໄທດ໌ adenine ແລະ cytosine. ພາກພື້ນສາຍດ່ຽວໄດ້ຖືກປ່ຽນເປັນ DNA ສາຍຄູ່ໂດຍການບົ່ມຕື່ມອີກດ້ວຍ dNTP (Novagen) ແລະ ເອນໄຊມ໌ Klenow (New England Biolabs) ໃນບັຟເຟີ Klenow (New England Biolabs) ເປັນເວລາ 3 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37°C. ຫຼັງຈາກປະຕິກິລິຍາ, DNA ສາຍຄູ່ໄດ້ຖືກຟື້ນຟູໂດຍການຕົກຕະກອນ EtOH. DNA ທີ່ໄດ້ຮັບໄດ້ຖືກຍ່ອຍດ້ວຍເອນໄຊມ໌ຈຳກັດ EcoRI ແລະ HindIII (ທັງສອງຈາກ Roche). ແຜ່ນໃສ່ທີ່ຖືກຕັດ ແລະ ບໍລິສຸດ (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) ຫຼັງຈາກນັ້ນໄດ້ຖືກຜູກມັດໃນກອບເຂົ້າໄປໃນເວັກເຕີ T7 ທີ່ຖືກຕັດກ່ອນຫຼັງຈາກກົດອະມິໂນ 348 ຂອງ gene capsid 10B. ປະຕິກິລິຍາການຜູກມັດໄດ້ຖືກບົ່ມທີ່ 16°C ເປັນເວລາ 18 ຊົ່ວໂມງກ່ອນການຫຸ້ມຫໍ່ໃນຫຼອດທົດລອງ. ການຫຸ້ມຫໍ່ຟາຈໃນຫຼອດທົດລອງໄດ້ຖືກປະຕິບັດຕາມຄໍາແນະນໍາທີ່ມາພ້ອມກັບຊຸດໂຄນ T7Select 10-3b (Novagen) ແລະສານລະລາຍການຫຸ້ມຫໍ່ໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍຄັ້ງດຽວເພື່ອການແຍກໂດຍໃຊ້ Escherichia coli (BLT5615, Novagen). ໄລເຊດໄດ້ຖືກປั่นແຍກ, ໄຕເຕຣດ ແລະ ແຊ່ແຂງທີ່ -80°C ເປັນສານລະລາຍສະຕັອກຂອງກລີເຊີລໍ.
ການຂະຫຍາຍ PCR ໂດຍກົງຂອງພາກພື້ນຕົວແປຂອງ phage ທີ່ຂະຫຍາຍໃນ broth ຫຼື plate ໂດຍໃຊ້ primers fusion 454/Roche-amplicon ທີ່ເປັນເຈົ້າຂອງ. primer fusion ທາງໜ້າປະກອບດ້ວຍລໍາດັບທີ່ຢູ່ຂ້າງພາກພື້ນຕົວແປ (NNK) 12 (ສະເພາະແມ່ແບບ), GS FLX Titanium Adapter A, ແລະລໍາດັບຄີຫ້ອງສະໝຸດສີ່ຖານ (TCAG) (ຮູບເສີມ 1a):
ໄພຣເມີຣ໌ຣີເຊວຟິວຊັນຍັງປະກອບດ້ວຍໄບໂອຕິນທີ່ຕິດກັບຕົວຈັບລູກປັດ ແລະ ອະແດບເຕີ GS FLX Titanium B ທີ່ຕ້ອງການສຳລັບການຂະຫຍາຍໂຄນໃນລະຫວ່າງ PCR ອິມມູລຽນ:
ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ເຄື່ອງຂະຫຍາຍສັນຍານໄດ້ຖືກນຳໄປໃຊ້ການວິເຄາະດ້ວຍວິທີ pyrosequencing 454/Roche ຕາມໂປໂຕຄອນ Titanium 454 GS-FLX. ສຳລັບການວິເຄາະດ້ວຍວິທີ Sanger (ເຄື່ອງວິເຄາະ DNA Applied Biosystems Hitachi 3730 xl), DNA phage T7 ໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍໂດຍ PCR ແລະ ຈັດລຳດັບດ້ວຍຄູ່ primer ຕໍ່ໄປນີ້:
ຊິ້ນສ່ວນທີ່ໃສ່ຈາກແຜ່ນແຕ່ລະແຜ່ນໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍ PCR ໂດຍໃຊ້ຊຸດ Roche Fast Start DNA Polymerase (ຕາມຄຳແນະນຳຂອງຜູ້ຜະລິດ). ປະຕິບັດການເລີ່ມຕົ້ນຮ້ອນ (10 ນາທີທີ່ 95 °C) ແລະ 35 ຮອບວຽນເພີ່ມຄວາມໄວ (50 ວິນາທີທີ່ 95 °C, 1 ນາທີທີ່ 50 °C, ແລະ 1 ນາທີທີ່ 72 °C).
ຟາຈຈາກຫ້ອງສະໝຸດ, ຟາຈແບບທຳມະຊາດ, ຟາຈທີ່ຖືກຊ່ວຍເຫຼືອຈາກນໍ້າไขสันหลัง ແລະ ເລືອດ, ຫຼື ໂຄລນສ່ວນບຸກຄົນໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍໃນ Escherichia coli BL5615 ໃນນໍ້າຕົ້ມ TB (Sigma Aldrich) ຫຼື ໃນຖ້ວຍ 500 cm2 (Thermo Scientific) ເປັນເວລາ 4 ຊົ່ວໂມງທີ່ 37°C. ຟາຈໄດ້ຖືກສະກັດອອກຈາກແຜ່ນໂດຍການລ້າງແຜ່ນດ້ວຍບັຟເຟີ Tris-EDTA (Fluka Analytical) ຫຼື ໂດຍການເກັບແຜ່ນດ້ວຍປາຍປິເປັດທີ່ເປັນໝັນ. ຟາຈໄດ້ຖືກແຍກອອກຈາກນໍ້າໃສຂອງເຊື້ອເຫັດ ຫຼື ບັຟເຟີສະກັດດ້ວຍນໍ້າຕົກຕາດ polyethylene glycol (PEG 8000) ໜຶ່ງຮອບ (Promega) ແລະ ລະລາຍຄືນໃໝ່ໃນບັຟເຟີ Tris-EDTA.
ຟາຈທີ່ຖືກຂະຫຍາຍພັນໄດ້ຖືກກຳຈັດສານພິດເອນໂດທອກຊິນ 2-3 ຮອບໂດຍໃຊ້ລູກປັດກຳຈັດສານພິດເອນໂດທອກຊິນ (Miltenyi Biotec) ກ່ອນການສັກເຂົ້າເສັ້ນເລືອດ (IV) (500 μl/ໂຕ). ໃນຮອບທຳອິດ, ຟາຈ 2 × 1012 ໂຕໄດ້ຖືກນຳສະເໜີ; ໃນຮອບທີສອງ, ຟາຈ 2 × 1010 ໂຕ; ໃນຮອບຄັດເລືອກຄັ້ງທີສາມ ແລະ ທີສີ່, ຟາຈ 2 × 109 ໂຕຕໍ່ໂຕ. ປະລິມານຟາຈໃນນ້ຳไขสันหลัง ແລະ ຕົວຢ່າງເລືອດທີ່ເກັບໄດ້ໃນຈຸດເວລາທີ່ລະບຸໄວ້ໄດ້ຖືກກຳນົດໂດຍການນັບແຜ່ນແຜກຕາມຄຳແນະນຳຂອງຜູ້ຜະລິດ (ຄູ່ມືລະບົບ T7Select). ການຄັດເລືອກຟາຈໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍການສັກເຂົ້າເສັ້ນເລືອດຂອງຫ້ອງສະໝຸດທີ່ບໍລິສຸດເຂົ້າໄປໃນເສັ້ນເລືອດຫາງ ຫຼື ໂດຍການສັກຟາຈທີ່ສະກັດຈາກນ້ຳไขสันหลังຄືນໃໝ່ຈາກຮອບຄັດເລືອກຄັ້ງກ່ອນ, ແລະ ການເກັບກ່ຽວຕໍ່ມາໄດ້ຖືກປະຕິບັດໃນເວລາ 10 ນາທີ, 30 ນາທີ, 60 ນາທີ, 90 ນາທີ, 120 ນາທີ, 180 ນາທີ, ແລະ 240 ນາທີຕາມລຳດັບ ສຳລັບນ້ຳไขสันหลัง ແລະ ຕົວຢ່າງເລືອດ. ໄດ້ມີການດຳເນີນການ panning ໃນຮ່າງກາຍ (in vivo panning) ທັງໝົດສີ່ຮອບ ເຊິ່ງສອງສາຂາທີ່ເລືອກໄດ້ຖືກເກັບຮັກສາ ແລະ ວິເຄາະແຍກຕ່າງຫາກໃນລະຫວ່າງສາມຮອບທຳອິດຂອງການຄັດເລືອກ. ເມັດ phage ທັງໝົດທີ່ສະກັດຈາກ CSF ຈາກສອງຮອບທຳອິດຂອງການຄັດເລືອກແມ່ນໄດ້ຮັບການທົດສອບ 454/Roche pyrosequencing, ໃນຂະນະທີ່ clones ທັງໝົດທີ່ສະກັດຈາກ CSF ຈາກສອງຮອບສຸດທ້າຍຂອງການຄັດເລືອກແມ່ນໄດ້ຮັບການຈັດລຳດັບດ້ວຍຕົນເອງ. phage ເລືອດທັງໝົດຈາກຮອບທຳອິດຂອງການຄັດເລືອກຍັງໄດ້ຮັບການທົດສອບ 454/Roche pyrosequencing. ສຳລັບການສັກ clones phage, phage ທີ່ເລືອກໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍໃນ E. coli (BL5615) ໃນແຜ່ນ 500 cm2 ທີ່ອຸນຫະພູມ 37°C ເປັນເວລາ 4 ຊົ່ວໂມງ. clones ທີ່ເລືອກເປັນສ່ວນບຸກຄົນ ແລະ ຈັດລຳດັບດ້ວຍຕົນເອງໄດ້ຖືກຂະຫຍາຍພັນໃນສື່ກາງ TB. ຫຼັງຈາກການສະກັດ phage, ການເຮັດໃຫ້ບໍລິສຸດ ແລະ ການກຳຈັດ endotoxin (ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ), phage 2 × 1010/ສັດໃນ 300 μl ໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າເສັ້ນເລືອດດຳເຂົ້າໄປໃນເສັ້ນເລືອດຫາງໜຶ່ງເສັ້ນ.
ການປະມວນຜົນກ່ອນ ແລະ ການກັ່ນຕອງຄຸນນະພາບຂອງຂໍ້ມູນລຳດັບ. ຂໍ້ມູນດິບ 454/Roche ໄດ້ຖືກປ່ຽນຈາກຮູບແບບແຜນທີ່ກະແສມາດຕະຖານໄບນາຣີ (sff) ໄປເປັນຮູບແບບທີ່ມະນຸດອ່ານໄດ້ Pearson (fasta) ໂດຍໃຊ້ຊອບແວຜູ້ຂາຍ. ການປະມວນຜົນຕື່ມອີກຂອງລຳດັບນິວຄລີໂອໄທດ໌ໄດ້ຖືກປະຕິບັດໂດຍໃຊ້ໂປຣແກຣມ ແລະ ສະຄຣິບ C ທີ່ເປັນເຈົ້າຂອງ (ຊຸດຊອບແວທີ່ຍັງບໍ່ໄດ້ປ່ອຍອອກມາ) ດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍໄວ້ຂ້າງລຸ່ມນີ້. ການວິເຄາະຂໍ້ມູນຫຼັກປະກອບມີຂັ້ນຕອນການກັ່ນຕອງຫຼາຍຂັ້ນຕອນທີ່ເຂັ້ມງວດ. ເພື່ອກັ່ນຕອງການອ່ານທີ່ບໍ່ມີລຳດັບ DNA ໃສ່ 12mer ທີ່ຖືກຕ້ອງ, ການອ່ານໄດ້ຖືກຈັດລຽງຕາມລຳດັບໄປຫາປ້າຍເລີ່ມຕົ້ນ (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), ປ້າຍຢຸດ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ແລະ ການໃສ່ພື້ນຫຼັງ (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGAC) ໂດຍໃຊ້ການທົດສອບ Needleman-Wunsch ທົ່ວໂລກ. ການຈັດລຽງທີ່ອະນຸຍາດໃຫ້ມີຄວາມບໍ່ສອດຄ່ອງສູງສຸດ 2 ຄັ້ງຕໍ່ການຈັດລຽງ31. ດັ່ງນັ້ນ, ການອ່ານທີ່ບໍ່ມີແທັກເລີ່ມຕົ້ນ ແລະ ຢຸດ ແລະ ການອ່ານທີ່ມີການໃສ່ພື້ນຫຼັງ, ເຊັ່ນ, ການຈັດລຽງທີ່ເກີນຈຳນວນທີ່ບໍ່ກົງກັນທີ່ອະນຸຍາດ, ໄດ້ຖືກລຶບອອກຈາກຫ້ອງສະໝຸດ. ສຳລັບການອ່ານທີ່ຍັງເຫຼືອ, ລຳດັບ DNA N-mer ທີ່ຂະຫຍາຍອອກຈາກເຄື່ອງໝາຍເລີ່ມຕົ້ນ ແລະ ສິ້ນສຸດກ່ອນເຄື່ອງໝາຍຢຸດໄດ້ຖືກຕັດອອກຈາກລຳດັບການອ່ານຕົ້ນສະບັບ ແລະ ປະມວນຜົນຕື່ມອີກ (ຕໍ່ໄປນີ້ເອີ້ນວ່າ "insert"). ຫຼັງຈາກການແປຂອງ insert, ສ່ວນຫຼັງຈາກ codon ຢຸດທຳອິດຢູ່ປາຍ 5′ ຂອງ primer ຈະຖືກເອົາອອກຈາກ insert. ນອກຈາກນັ້ນ, nucleotides ທີ່ນຳໄປສູ່ codon ທີ່ບໍ່ສົມບູນຢູ່ປາຍ 3′ ຂອງ primer ກໍ່ຖືກເອົາອອກເຊັ່ນກັນ. ເພື່ອຍົກເວັ້ນ insert ທີ່ມີພຽງລຳດັບພື້ນຫຼັງ, insert ທີ່ແປແລ້ວທີ່ເລີ່ມຕົ້ນດ້ວຍຮູບແບບກົດອະມິໂນ "PAG" ກໍ່ຖືກເອົາອອກເຊັ່ນກັນ. Peptides ທີ່ມີຄວາມຍາວຫຼັງການແປໜ້ອຍກວ່າ 3 ກົດອະມິໂນໄດ້ຖືກລຶບອອກຈາກຫ້ອງສະໝຸດ. ສຸດທ້າຍ, ລຶບຄວາມຊ້ຳຊ້ອນໃນ insert pool ແລະ ກຳນົດຄວາມຖີ່ຂອງແຕ່ລະ insert ທີ່ເປັນເອກະລັກ. ຜົນຂອງການວິເຄາະນີ້ລວມມີລາຍຊື່ລຳດັບ nucleotide (insert) ແລະ ຄວາມຖີ່ (ອ່ານ) ຂອງພວກມັນ (ຮູບເສີມ 1c ແລະ 2).
ການໃສ່ DNA ກຸ່ມ N-mer ຕາມຄວາມຄ້າຍຄືກັນຂອງລຳດັບ: ເພື່ອກຳຈັດຄວາມຜິດພາດໃນການຈັດລຳດັບສະເພາະ 454/Roche (ເຊັ່ນ: ບັນຫາກ່ຽວກັບການຂະຫຍາຍ homopolymer ໃນການຈັດລຳດັບ) ແລະ ກຳຈັດສິ່ງທີ່ບໍ່ສຳຄັນໜ້ອຍກວ່າ, ການໃສ່ລຳດັບ DNA N-mer ທີ່ຖືກກັ່ນຕອງກ່ອນໜ້ານີ້ (ການໃສ່) ຈະຖືກຈັດຮຽງຕາມຄວາມຄ້າຍຄືກັນ. ການໃສ່ (ອະນຸຍາດໃຫ້ໃຊ້ຖານທີ່ບໍ່ກົງກັນສູງສຸດ 2 ຖານ) ໂດຍໃຊ້ອັລກໍຣິທຶມແບບຊ້ຳໆທີ່ກຳນົດໄວ້ດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້: ການໃສ່ຈະຖືກຈັດຮຽງກ່ອນຕາມຄວາມຖີ່ຂອງມັນ (ສູງສຸດຫາຕໍ່າສຸດ), ແລະ ຖ້າພວກມັນຄືກັນ, ໂດຍການຈັດຮຽງຮອງຂອງພວກມັນຕາມຄວາມຍາວ (ຍາວທີ່ສຸດຫາສັ້ນທີ່ສຸດ)). ດັ່ງນັ້ນ, ການໃສ່ທີ່ພົບເລື້ອຍທີ່ສຸດ ແລະ ຍາວທີ່ສຸດຈະກຳນົດ "ກຸ່ມ" ທຳອິດ. ຄວາມຖີ່ຂອງກຸ່ມຖືກຕັ້ງເປັນຄວາມຖີ່ຫຼັກ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ການໃສ່ແຕ່ລະຄັ້ງທີ່ເຫຼືອຢູ່ໃນລາຍການທີ່ຈັດຮຽງແລ້ວໄດ້ຖືກພະຍາຍາມເພີ່ມເຂົ້າໃນກຸ່ມໂດຍການຈັດລຽງ Needleman-Wunsch ແບບຄູ່. ຖ້າຈຳນວນຄວາມບໍ່ກົງກັນ, ການໃສ່, ຫຼື ການລຶບໃນການຈັດລຽງບໍ່ເກີນຂອບເຂດ 2, ການໃສ່ຈະຖືກເພີ່ມເຂົ້າໃນກຸ່ມ, ແລະ ຄວາມຖີ່ຂອງກຸ່ມໂດຍລວມຈະເພີ່ມຂຶ້ນໂດຍຄວາມຖີ່ຂອງການໃສ່ທີ່ຖືກເພີ່ມ. ການໃສ່ທີ່ເພີ່ມເຂົ້າໃນກຸ່ມຈະຖືກໝາຍວ່າໃຊ້ແລ້ວ ແລະ ຖືກຍົກເວັ້ນຈາກການປະມວນຜົນຕໍ່ໄປ. ຖ້າບໍ່ສາມາດເພີ່ມລຳດັບການໃສ່ເຂົ້າໃນກຸ່ມທີ່ມີຢູ່ແລ້ວໄດ້, ລຳດັບການໃສ່ຈະຖືກໃຊ້ເພື່ອສ້າງກຸ່ມໃໝ່ທີ່ມີຄວາມຖີ່ຂອງການໃສ່ທີ່ເໝາະສົມ ແລະ ໝາຍວ່າໃຊ້ແລ້ວ. ການຊ້ຳຈະສິ້ນສຸດລົງເມື່ອລຳດັບການໃສ່ແຕ່ລະອັນໄດ້ຖືກນຳໃຊ້ເພື່ອສ້າງກຸ່ມໃໝ່ ຫຼື ສາມາດລວມເຂົ້າໃນກຸ່ມທີ່ມີຢູ່ແລ້ວໄດ້. ຫຼັງຈາກທີ່ທັງໝົດ, ການໃສ່ທີ່ຈັດກຸ່ມປະກອບດ້ວຍນິວຄລີໂອໄທດ໌ໃນທີ່ສຸດຈະຖືກແປເປັນລຳດັບເພບໄທດ໌ (ຫ້ອງສະໝຸດເພບໄທດ໌). ຜົນຂອງການວິເຄາະນີ້ແມ່ນຊຸດຂອງການໃສ່ ແລະ ຄວາມຖີ່ທີ່ສອດຄ້ອງກັນຂອງພວກມັນທີ່ປະກອບເປັນຈຳນວນການອ່ານຕິດຕໍ່ກັນ (ຮູບເພີ່ມເຕີມ 2).
ການສ້າງຮູບແບບ: ອີງຕາມລາຍຊື່ຂອງ peptides ທີ່ເປັນເອກະລັກ, ຫ້ອງສະໝຸດໄດ້ຖືກສ້າງຂຶ້ນໂດຍມີຮູບແບບກົດອະມິໂນທີ່ເປັນໄປໄດ້ທັງໝົດ (aa) ດັ່ງທີ່ສະແດງຢູ່ດ້ານລຸ່ມ. ຮູບແບບທີ່ເປັນໄປໄດ້ແຕ່ລະອັນທີ່ມີຄວາມຍາວ 3 ໄດ້ຖືກສະກັດອອກຈາກ peptide ແລະຮູບແບບປີ້ນກັບຂອງມັນໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າພ້ອມກັບຫ້ອງສະໝຸດຮູບແບບທົ່ວໄປທີ່ມີຮູບແບບທັງໝົດ (tripeptides). ຫ້ອງສະໝຸດຂອງຮູບແບບທີ່ຊໍ້າຊ້ອນຫຼາຍໄດ້ຖືກຈັດລຳດັບ ແລະ ລຶບຄວາມຊໍ້າຊ້ອນອອກ. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ສຳລັບ tripeptide ແຕ່ລະອັນໃນຫ້ອງສະໝຸດຮູບແບບ, ພວກເຮົາໄດ້ກວດສອບການມີຢູ່ຂອງມັນຢູ່ໃນຫ້ອງສະໝຸດໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງມືຄິດໄລ່. ໃນກໍລະນີນີ້, ຄວາມຖີ່ຂອງ peptide ທີ່ມີຮູບແບບ tripeptide ທີ່ພົບແມ່ນຖືກເພີ່ມ ແລະ ກຳນົດໃຫ້ກັບຮູບແບບໃນຫ້ອງສະໝຸດຮູບແບບ (“ຈຳນວນຮູບແບບ”). ຜົນຂອງການສ້າງຮູບແບບແມ່ນອາເຣສອງມິຕິທີ່ປະກອບດ້ວຍ tripeptides (ຮູບແບບ) ທັງໝົດ ແລະ ຄ່າທີ່ກ່ຽວຂ້ອງຂອງມັນ, ເຊິ່ງເປັນຈຳນວນການອ່ານລຳດັບທີ່ສົ່ງຜົນໃຫ້ຮູບແບບທີ່ສອດຄ້ອງກັນເມື່ອການອ່ານຖືກກັ່ນຕອງ, ຈັດກຸ່ມ, ແລະ ແປ. ຕົວຊີ້ວັດດັ່ງທີ່ໄດ້ອະທິບາຍລາຍລະອຽດຂ້າງເທິງ.
ການປັບຈຳນວນຮູບແບບ ແລະ ການກະແຈກກະຈາຍທີ່ສອດຄ້ອງກັນໃຫ້ເປັນມາດຕະຖານ: ຈຳນວນຮູບແບບສຳລັບແຕ່ລະຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກປັບໃຫ້ເປັນປົກກະຕິໂດຍໃຊ້
ບ່ອນທີ່ ni ແມ່ນຈຳນວນການອ່ານທີ່ມີຫົວຂໍ້ i. ດັ່ງນັ້ນ, vi ສະແດງເຖິງຄວາມຖີ່ເປີເຊັນຂອງການອ່ານ (ຫຼື peptides) ທີ່ມີ motif i ໃນຕົວຢ່າງ. ຄ່າ P ສຳລັບຈຳນວນ motifs ທີ່ບໍ່ໄດ້ມາດຕະຖານໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ການທົດສອບທີ່ແນ່ນອນຂອງ Fisher. ກ່ຽວກັບ correlograms ຂອງຈຳນວນ motifs, correlations ຂອງ Spearman ໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ຈຳນວນ motifs ທີ່ໄດ້ມາດຕະຖານກັບ R.
ເພື່ອເບິ່ງເຫັນເນື້ອໃນຂອງກົດອະມິໂນໃນແຕ່ລະຕຳແໜ່ງໃນຫ້ອງສະໝຸດ peptide, web logograms 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ໄດ້ຖືກສ້າງຂຶ້ນ. ກ່ອນອື່ນໝົດ, ເນື້ອໃນຂອງກົດອະມິໂນໃນແຕ່ລະຕຳແໜ່ງຂອງ peptide 12-mer ແມ່ນຖືກເກັບໄວ້ໃນ matrix 20×12. ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ຊຸດຂອງ peptides 1000 ທີ່ມີເນື້ອໃນກົດອະມິໂນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງກັນໃນແຕ່ລະຕຳແໜ່ງແມ່ນຖືກສ້າງຂຶ້ນໃນຮູບແບບ fasta-sequence ແລະສະໜອງໃຫ້ເປັນ input ໃຫ້ກັບ web-logo 3, ເຊິ່ງສ້າງຕົວແທນກຣາບຟິກຂອງເນື້ອໃນກົດອະມິໂນທີ່ກ່ຽວຂ້ອງໃນແຕ່ລະຕຳແໜ່ງ. ສຳລັບຫ້ອງສະໝຸດ peptide ທີ່ກຳນົດ. ເພື່ອເບິ່ງເຫັນຊຸດຂໍ້ມູນຫຼາຍມິຕິ, ແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນໄດ້ຖືກສ້າງຂຶ້ນໂດຍໃຊ້ເຄື່ອງມືທີ່ພັດທະນາພາຍໃນໃນ R (biosHeatmap, ຊຸດ R ທີ່ຍັງບໍ່ທັນໄດ້ປ່ອຍອອກມາ). dendrograms ທີ່ນຳສະເໜີໃນແຜນທີ່ຄວາມຮ້ອນໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ວິທີການຈັດກຸ່ມແບບລຳດັບຊັ້ນຂອງ Ward ດ້ວຍຕົວຊີ້ວັດໄລຍະທາງ Euclidean. ສຳລັບການວິເຄາະທາງສະຖິຕິຂອງຂໍ້ມູນການໃຫ້ຄະແນນ motif, ຄ່າ P ສຳລັບການໃຫ້ຄະແນນທີ່ບໍ່ປົກກະຕິໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໂດຍໃຊ້ການທົດສອບທີ່ແນ່ນອນຂອງ Fisher. ຄ່າ P ສຳລັບຊຸດຂໍ້ມູນອື່ນໆໄດ້ຖືກຄິດໄລ່ໃນ R ໂດຍໃຊ້ການທົດສອບ t ຂອງນັກຮຽນ ຫຼື ANOVA.
ໂຄນຟາຈ ແລະ ຟາຈທີ່ເລືອກໂດຍບໍ່ມີການແຊກໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າເສັ້ນເລືອດດຳຜ່ານທາງເສັ້ນເລືອດຫາງ (2 × 1010 ຟາຈ/ສັດໃນ 300 μl PBS). ສິບນາທີກ່ອນການສີດເລືອດ ແລະ ການຕິດຕໍ່ມາ, ສັດດຽວກັນໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າເສັ້ນເລືອດດຳດ້ວຍເລັກຕິນທີ່ມີປ້າຍ DyLight594 100 μl (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 ນາທີຫຼັງຈາກການສັກຟາຈ, ໜູໄດ້ຖືກສີດຜ່ານຫົວໃຈດ້ວຍ PBS 50 ml ຕາມດ້ວຍ PFA/PBS 4% 50 ml. ຕົວຢ່າງສະໝອງຍັງໄດ້ຖືກແຊ່ແຂງຄ້າງຄືນໃນ PFA/PBS 4% ແລະ ແຊ່ນ້ຳຕານຊູໂຄຣສ 30% ຄ້າງຄືນທີ່ອຸນຫະພູມ 4°C. ຕົວຢ່າງຖືກແຊ່ແຂງໃນສ່ວນປະສົມ OCT. ການວິເຄາະທາງພູມຕ້ານທານຂອງຕົວຢ່າງແຊ່ແຂງໄດ້ຖືກປະຕິບັດຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງໃນການຜ່າຕັດແຊ່ແຂງ 30 µm ທີ່ຖືກບລັອກດ້ວຍ 1% BSA ແລະ ບົ່ມເຊື້ອດ້ວຍພູມຕ້ານທານ FITC ທີ່ຕິດສະຫຼາກ polyclonal ຕໍ່ຕ້ານ phage T7 (Novus NB 600-376A) ທີ່ 4°C. ບົ່ມເຊື້ອຄ້າງຄືນ. ສຸດທ້າຍ, ພາກສ່ວນຕ່າງໆໄດ້ຖືກລ້າງ 3 ຄັ້ງດ້ວຍ PBS ແລະ ກວດສອບດ້ວຍກ້ອງຈຸລະທັດເລເຊີ confocal (Leica TCS SP5).
peptides ທັງໝົດທີ່ມີຄວາມບໍລິສຸດຢ່າງໜ້ອຍ 98% ໄດ້ຖືກສັງເຄາະໂດຍ GenScript USA, biotinylated ແລະ lyophilized. Biotin ຖືກຜູກມັດຜ່ານ triple glycine spacer ເພີ່ມເຕີມຢູ່ທີ່ N-terminus. ກວດສອບ peptides ທັງໝົດໂດຍໃຊ້ mass spectrometry.
ສະເຕຣບຕາວິດິນ (Sigma S0677) ໄດ້ຖືກປະສົມກັບເພບໄທດ໌ biotinylated ທີ່ມີຄວາມສົມດຸນຫຼາຍກວ່າ 5 ເທົ່າ, ເພບໄທດ໌ຍັບຍັ້ງ BACE1 ທີ່ biotinylated, ຫຼື ການປະສົມປະສານ (ອັດຕາສ່ວນ 3:1) ຂອງເພບໄທດ໌ຍັບຍັ້ງ BACE1 ທີ່ biotinylated ແລະ ເພບໄທດ໌ຍັບຍັ້ງ BACE1 ໃນ DMSO 5–10%/ບົ່ມໃນ PBS. 1 ຊົ່ວໂມງທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງກ່ອນການສັກຢາ. ເພບໄທດ໌ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ກັນກັບສະເຕຣບຕາວິດິນໄດ້ຖືກສັກເຂົ້າເສັ້ນເລືອດໃນປະລິມານ 10 ມກ/ກກ ເຂົ້າໄປໃນເສັ້ນເລືອດຫາງຂອງໜູທີ່ມີຊ່ອງໃນສະໝອງ.
ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງສະລັບສັບຊ້ອນ streptavidin-peptide ໄດ້ຖືກປະເມີນໂດຍ ELISA. ແຜ່ນ microtiter Nunc Maxisorp (Sigma) ໄດ້ຖືກເຄືອບຄ້າງຄືນທີ່ 4°C ດ້ວຍພູມຕ້ານທານຕ້ານ streptavidin ໜູ 1.5 μg/ml (Thermo, MA1-20011). ຫຼັງຈາກການສະກັດກັ້ນ (ບັຟເຟີການສະກັດກັ້ນ: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງ, ລ້າງແຜ່ນດ້ວຍ 0.05% Tween-20/PBS (ບັຟເຟີການລ້າງ) ເປັນເວລາ 3 ວິນາທີ, ຕົວຢ່າງ CSF ແລະ plasma ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໄປໃນບໍ່ທີ່ເຈືອຈາງດ້ວຍບັຟເຟີການສະກັດກັ້ນ (plasma 1:10,000, CSF 1:115). ຫຼັງຈາກນັ້ນ, ແຜ່ນດັ່ງກ່າວໄດ້ຖືກບົ່ມໄວ້ຄ້າງຄືນທີ່ 4°C ດ້ວຍພູມຕ້ານທານກວດຈັບ (1 μg/ml, ຕ້ານ streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). ຫຼັງຈາກລ້າງສາມຂັ້ນຕອນ, streptavidin ໄດ້ຖືກກວດພົບໂດຍການຟັກໃນນໍ້າຢາ TMB substrate (Roche) ເປັນເວລາເຖິງ 20 ນາທີ. ຫຼັງຈາກຢຸດການພັດທະນາສີດ້ວຍ 1M H2SO4, ໃຫ້ວັດແທກການດູດຊຶມທີ່ 450 nm.
ໜ້າທີ່ຂອງສະລັບສັບຊ້ອນຕົວຍັບຍັ້ງ streptavidin-peptide-BACE1 ໄດ້ຖືກປະເມີນໂດຍ Aβ(1-40) ELISA ຕາມໂປໂຕຄອນຂອງຜູ້ຜະລິດ (Wako, 294-64701). ໂດຍຫຍໍ້, ຕົວຢ່າງ CSF ໄດ້ຖືກເຈືອຈາງໃນສານລະລາຍມາດຕະຖານ (1:23) ແລະ ບົ່ມໄວ້ຄ້າງຄືນທີ່ 4°C ໃນແຜ່ນ 96-well ທີ່ເຄືອບດ້ວຍພູມຕ້ານທານຈັບ BNT77. ຫຼັງຈາກຫ້າຂັ້ນຕອນການລ້າງ, ພູມຕ້ານທານ BA27 ທີ່ເຊື່ອມຕໍ່ HRP ໄດ້ຖືກເພີ່ມ ແລະ ບົ່ມໄວ້ເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງທີ່ 4°C, ຕາມດ້ວຍຫ້າຂັ້ນຕອນການລ້າງ. Aβ(1–40) ໄດ້ຖືກກວດພົບໂດຍການບົ່ມໃນສານລະລາຍ TMB ເປັນເວລາ 30 ນາທີທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ. ຫຼັງຈາກການພັດທະນາສີໄດ້ຖືກຢຸດດ້ວຍສານລະລາຍຢຸດ, ໃຫ້ວັດແທກການດູດຊຶມທີ່ 450 nm. ຕົວຢ່າງ Plasma ໄດ້ຖືກສະກັດເອົາໄລຍະແຂງກ່ອນ Aβ(1–40) ELISA. Plasma ໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ 0.2% DEA (Sigma) ໃນແຜ່ນ 96-well ແລະ ບົ່ມໄວ້ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງເປັນເວລາ 30 ນາທີ. ຫຼັງຈາກລ້າງແຜ່ນ SPE (Oasis, 186000679) ດ້ວຍນ້ຳ ແລະ ເມທານອນ 100% ຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ, ຕົວຢ່າງພລາສມາໄດ້ຖືກເພີ່ມໃສ່ແຜ່ນ SPE ແລະ ນ້ຳທັງໝົດໄດ້ຖືກເອົາອອກ. ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກລ້າງ (ກ່ອນອື່ນໝົດດ້ວຍເມທານອນ 5% ຈາກນັ້ນເມທານອນ 30%) ແລະ ລ້າງດ້ວຍ NH4OH/ເມທານອນ 2% 90%. ຫຼັງຈາກເຮັດໃຫ້ນ້ຳທີ່ລະລາຍແຫ້ງທີ່ອຸນຫະພູມ 55°C ເປັນເວລາ 99 ນາທີ ດ້ວຍກະແສ N2 ຄົງທີ່, ຕົວຢ່າງໄດ້ຖືກຫຼຸດລົງໃນສານລະລາຍມາດຕະຖານ ແລະ Aβ(1–40) ໄດ້ຖືກວັດແທກຕາມທີ່ໄດ້ອະທິບາຍຂ້າງເທິງ.
ວິທີການອ້າງອີງບົດຄວາມນີ້: Urich, E. ແລະ ອື່ນໆ. ການຂົນສົ່ງສິນຄ້າໄປສູ່ສະໝອງໂດຍໃຊ້ peptides ການຂົນສົ່ງທີ່ລະບຸໃນຮ່າງກາຍ. ວິທະຍາສາດ. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ແລະ Moos T. ການສົ່ງຢາໂມເລກຸນໃຫຍ່ໄປຫາສະໝອງໂດຍໃຊ້ການປິ່ນປົວແບບເປົ້າໝາຍ. ວາລະສານ Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., ແລະ Martinez-Martinez, P. ການສົ່ງຢາ peptide ແລະໂປຣຕີນຂ້າມຜ່ານກຳແພງເລືອດ-ສະໝອງ. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM ສິ່ງກີດຂວາງລະຫວ່າງເລືອດແລະສະໝອງ: ເປັນສິ່ງກີດຂວາງໃນການພັດທະນາຢາໃນສະໝອງ. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, ແລະ Byrd, A. ຄວາມຄາດຫວັງສຳລັບການປັບປຸງການຈັດສົ່ງຢາ ແລະ ການກຳນົດເປົ້າໝາຍໄປສູ່ສະໝອງຜ່ານເສັ້ນທາງ choroid plexus-CSF. ການຄົ້ນຄວ້າດ້ານຢາ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM ການທັນສະໄໝຂອງຢາຊີວະພາບດ້ວຍມ້າໂທຣຈັນໂມເລກຸນສຳລັບການສົ່ງສະໝອງ. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, ການຂົນສົ່ງ peptide ທີ່ໄກ່ເກ່ຍໂດຍຕົວຮັບ WM ຂ້າມອຸປະສັກເລືອດ-ສະໝອງ. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. ແລະ ອື່ນໆ. ເພີ່ມການເຈາະເຂົ້າໄປໃນສະໝອງ ແລະ ປະສິດທິພາບຂອງພູມຕ້ານທານທາງການປິ່ນປົວໂດຍໃຊ້ລະບົບໂມເລກຸນໂມໂນວາເລນ. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. ແລະ ອື່ນໆ. ການຂົນສົ່ງຕົວຮັບ Transferrin (TfR) ກຳນົດການດູດຊຶມສະໝອງຂອງຕົວແປຄວາມສຳພັນຂອງພູມຕ້ານທານ TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).