Nature.com غا كىرگىنىڭىزگە رەھمەت. سىز چەكلىك CSS قوللىشى بار تور كۆرگۈچ نۇسخىسىنى ئىشلىتىۋاتىسىز. ئەڭ ياخشى تەجرىبە ئۈچۈن، يېڭىلانغان تور كۆرگۈچنى ئىشلىتىشىڭىزنى (ياكى Internet Explorer دا ماسلىشىشچانلىق ھالىتىنى چەكلىشىڭىزنى) تەۋسىيە قىلىمىز. بۇنىڭدىن باشقا، داۋاملىق قوللاشنى كاپالەتلەندۈرۈش ئۈچۈن، بىز تور بېكەتنى ئۇسلۇبسىز ۋە JavaScriptسىز كۆرسىتىمىز.
بىرلا ۋاقىتتا ئۈچ سىيرىلما رەسىم توپلىمىنى كۆرسىتىدۇ. بىرلا ۋاقىتتا ئۈچ سىيرىلما رەسىم ئارىسىدا يۆتكىلىش ئۈچۈن «ئالدىنقى» ۋە «كېيىنكى» كۇنۇپكىلىرىنى ئىشلىتىڭ، ياكى بىرلا ۋاقىتتا ئۈچ سىيرىلما رەسىم ئارىسىدا يۆتكىلىش ئۈچۈن ئاخىرىدىكى سىيرىلما كۇنۇپكىلىرىنى ئىشلىتىڭ.
قان-مېڭە توسۇقى ۋە قان-مېڭە توسۇقى بىئوتېراپىيەلىك دورىلارنىڭ مەركىزىي نېرۋا سىستېمىسىدىكى نىشانلىرىغا يېتىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ، شۇنىڭ بىلەن نېرۋا كېسەللىكلىرىنى ئۈنۈملۈك داۋالاشقا توسقۇنلۇق قىلىدۇ. تىرىك جانلىقلاردا يېڭى مېڭە توشۇغۇچىلىرىنى بايقاش ئۈچۈن، بىز T7 فاگ پېپتىد كۈتۈپخانىسىنى كىرگۈزۈپ، كاللارنىڭ قاناللاشتۇرۇلغان ئاڭلىق چوڭ كۆلچەك مودېلى ئارقىلىق قان ۋە مېڭە ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىنى (CSF) توپلىدۇق. تۆت قېتىملىق تاللاشتىن كېيىن، ئالاھىدە فاگ كىلونلىرى CSF غا يۇقىرى دەرىجىدە بايىتىلدى. يەككە نامزات پېپتىدلارنى سىناق قىلىش ئارقىلىق CSF نىڭ 1000 ھەسسىدىن ئارتۇق بايىتىلغانلىقى بايقالدى. پېپتىد ئارقىلىق مېڭىگە يەتكۈزۈلۈشنىڭ بىئوئاكتىپلىقى، بايقالغان يېڭى ئۆتكۈنچى پېپتىد بىلەن مۇناسىۋەتلىك BACE1 پېپتىد چەكلىگۈچىسى ئىشلىتىلگەندە، مېڭە ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىدىكى ئامىلوئىد-β سەۋىيەسىنىڭ %40 تۆۋەنلىشى بىلەن جەزملەشتۈرۈلدى. بۇ نەتىجىلەر تىرىك جانلىقلاردا فاگ تاللاش ئۇسۇلى ئارقىلىق بايقالغان پېپتىدلارنىڭ ماكرومولېكۇلالارنى مېڭىگە سىستېمىلىق يەتكۈزۈشتە داۋالاش ئۈنۈمىگە ئىگە پايدىلىق ۋاسىتىلەر بولۇشى مۇمكىنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ.
مەركىزىي نېرۋا سىستېمىسى (CNS) نىشانلىق داۋالاش تەتقىقاتى ئاساسلىقى CNS نى نىشانلىق خۇسۇسىيەتكە ئىگە ئەلالاشتۇرۇلغان دورىلار ۋە ۋاكالەتچىلەرنى ئېنىقلاشقا مەركەزلەشكەن بولۇپ، مېڭىگە ئاكتىپ دورا يەتكۈزۈش مېخانىزمىنى بايقاشقا ئازراق كۈچ سەرپ قىلىنغان. دورا يەتكۈزۈش، بولۇپمۇ چوڭ مولېكۇلا، زامانىۋى نېرۋا ئىلمى دورىلىرى تەرەققىياتىنىڭ ئايرىلماس بىر قىسمى بولغاچقا، بۇ ئەھۋال ھازىر ئۆزگىرىشكە باشلىدى. مەركىزىي نېرۋا سىستېمىسىنىڭ مۇھىتى قان-مېڭە توسۇقى (BBB) ​​ۋە قان-مېڭە توسۇقى (BCBB) دىن تەركىب تاپقان مېڭە قان تومۇر توسۇقى سىستېمىسى تەرىپىدىن ياخشى قوغدىلىدۇ1،2، بۇ دورىلارنى مېڭىگە يەتكۈزۈشنى قىيىنلاشتۇرىدۇ1،2. چوڭ مولېكۇلالىق دورىلارنىڭ دېگۈدەك ھەممىسى ۋە كىچىك مولېكۇلالىق دورىلارنىڭ %98 تىن كۆپرەكىنىڭ مېڭىدىن چىقىرىۋېتىلىدىغانلىقى مۆلچەرلەنمەكتە3. شۇڭلاشقا، داۋالاش دورىلىرىنى CNS غا ئۈنۈملۈك ۋە ئالاھىدە يەتكۈزۈشنى تەمىنلەيدىغان يېڭى مېڭە توشۇش سىستېمىلىرىنى ئېنىقلاش ناھايىتى مۇھىم4،5. قانداقلا بولمىسۇن، BBB ۋە BCSFB يەنە دورىلارنى يەتكۈزۈش ئۈچۈن ئېسىل پۇرسەت يارىتىپ بېرىدۇ، چۈنكى ئۇلار مېڭىنىڭ كەڭ قان تومۇرلىرى ئارقىلىق مېڭىنىڭ بارلىق قۇرۇلمىلىرىغا سىڭىپ كىرىدۇ. شۇڭا، مېڭىگە يەتكۈزۈشنىڭ تاجاۋۇزسىز ئۇسۇللىرىنى قوللىنىشقا قارىتىلغان ھازىرقى تىرىشچانلىقلار ئاساسلىقى ئىچكى BBB6 رېتسېپتورى ئارقىلىق رېتسېپتور ئارقىلىق يەتكۈزۈش (PMT) مېخانىزمىغا ئاساسلىنىدۇ. يېقىندا ترانسفېررىن رېتسېپتورى يولىنى ئىشلىتىشتە مۇھىم ئىلگىرىلەشلەر قولغا كەلتۈرۈلگەن بولسىمۇ،7،8 ياخشىلانغان خۇسۇسىيەتكە ئىگە يېڭى يەتكۈزۈش سىستېمىلىرىنى تېخىمۇ تەرەققىي قىلدۇرۇش تەلەپ قىلىنىدۇ. بۇنىڭ ئۈچۈن، بىزنىڭ مەقسىتىمىز CSF توشۇشىغا ۋاسىتىچىلىك قىلالايدىغان پېپتىدلارنى بايقاش ئىدى، چۈنكى ئۇلار پىرىنسىپ جەھەتتىن مەركىزىي نېرۋا سىستېمىسىغا ماكرومولېكۇلا يەتكۈزۈش ياكى يېڭى رېتسېپتور يوللىرىنى ئېچىش ئۈچۈن ئىشلىتىلىشى مۇمكىن. بولۇپمۇ مېڭە قان تومۇر سىستېمىسىنىڭ ئالاھىدە رېتسېپتورلىرى ۋە توشۇغۇچىلىرى (BBB ۋە BSCFB) بىئوتېراپىيە دورىلىرىنى ئاكتىپ ۋە ئالاھىدە يەتكۈزۈشنىڭ نىشانلىرى بولالايدۇ. مېڭە ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقى (CSF) خوروئىد پىلېكسۇسىنىڭ (CS) ئاجرىلىپ چىقىرىش مەھسۇلاتى بولۇپ، مېڭە ئارىلىق سۇيۇقلۇقى بىلەن سۇباراھنوئىد بوشلۇقى ۋە قورساق بوشلۇقى ئارقىلىق بىۋاسىتە ئالاقىلىشىدۇ4. يېقىندا، سۇباراھنوئىد مېڭە ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىنىڭ مېڭە ئارىلىق سۇيۇقلۇقىغا ئارتۇقچە تارقىلىدىغانلىقى ئىسپاتلاندى9. بىز بۇ سۇباراخنوئىد كىرىش يولى ئارقىلىق ياكى بىۋاسىتە BBB ئارقىلىق پارېنشىما بوشلۇقىغا كىرىشنى ئۈمىد قىلىمىز. بۇنى ئەمەلگە ئاشۇرۇش ئۈچۈن، بىز بۇ ئىككى ئايرىم يولنىڭ بىرى ئارقىلىق توشۇلىدىغان پېپتىدلارنى ئەڭ ياخشى پەرقلەندۈرىدىغان كۈچلۈك تىرىك جانلىقلار فاگ تاللاش ئىستراتېگىيىسىنى يولغا قويدۇق.
بىز ھازىر ئەڭ يۇقىرى كۈتۈپخانا كۆپ خىللىقى بىلەن دەسلەپكى تاللاش ئايلانمىلىرىنى نازارەت قىلىش ئۈچۈن، CSF ئەۋرىشكىسى ئېلىش ۋە يۇقىرى ئۆتكۈزۈشچانلىق تەرتىپلەش (HTS) ئارقىلىق بىرلەشتۈرۈلگەن ئارقا-ئارقىدىن تىرىك جانلىقلاردا فاگ كۆرسىتىش تەكشۈرۈش ئۇسۇلىنى تەسۋىرلەيمىز. تەكشۈرۈش قان بۇلغىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن مەڭگۈلۈك ئورۇنلاشتۇرۇلغان چوڭ سىستېرنا (CM) كانۇلاسى بار ئاڭلىق كاللارغا ئېلىپ بېرىلدى. مۇھىمى، بۇ ئۇسۇل مېڭە نىشانلىق ۋە مېڭە قان تومۇر توسۇقى ئارقىلىق توشۇش پائالىيىتىگە ئىگە پېپتىدلارنى تاللايدۇ. بىز T7 فاگلىرىنى كىچىك (~60 nm)10 سەۋەبىدىن ئىشلەتتۇق ۋە ئۇلارنىڭ ئېندوتېلىي ۋە/ياكى ئېپىتېلىيە-مېدۇللا توسۇقىنىڭ ھۈجەيرە ئارقىلىق ئۆتۈشىگە يول قويىدىغان كۆپۈكچىلەرنى توشۇشقا ماس كېلىدىغانلىقىنى ئوتتۇرىغا قويدۇق. تۆت قېتىملىق تەكشۈرۈشتىن كېيىن، فاگ توپلىرى ئايرىپ ئېلىندى، كۈچلۈك تىرىك جانلىقلاردا CSF موللۇقى ۋە مېڭە مىكرو تومۇرلىرى بىلەن بولغان مۇناسىۋىتى كۆرسىتىلدى. مۇھىمى، بىز ئەڭ ياخشى كاندىدات پېپتىدلارنىڭ ئاقسىل يۈكىنى مېڭە ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىغا توشۇيالايدىغانلىقىنى كۆرسىتىش ئارقىلىق بايقاشلىرىمىزنى جەزملەشتۈرەلىدۇق. ئالدى بىلەن، مەركىزىي نېرۋا سىستېمىسىنىڭ فارماكودىنامىك تەسىرى ئالدىنقى قاتاردىكى ئۆتۈشمە پېپتىد بىلەن BACE1 پېپتىدىنىڭ چەكلىگۈچىسىنى بىرلەشتۈرۈش ئارقىلىق بېكىتىلدى. تىرىك جانلىقلاردا فۇنكسىيەلىك تەكشۈرۈش ئىستراتېگىيىلىرىنىڭ يېڭى مېڭە توشۇش پېپتىدلىرىنى ئۈنۈملۈك ئاقسىل يۈك توشۇغۇچىسى سۈپىتىدە ئېنىقلىيالايدىغانلىقىنى كۆرسىتىشتىن باشقا، بىز ئوخشاش فۇنكسىيەلىك تاللاش ئۇسۇللىرىنىڭ يېڭى مېڭە توشۇش يوللىرىنى ئېنىقلاشتا مۇھىم رول ئوينايدىغانلىقىنى ئۈمىد قىلىمىز.
تاختا شەكىللەندۈرۈش بىرلىكلىرى (PFU) غا ئاساسەن، فاگ ئورالمىسى باسقۇچىدىن كېيىن، تەخمىنەن 109 خىل كۆپ خىللىققا ئىگە تاسادىپىي 12-مېر سىزىقلىق T7 فاگ پېپتىدلىرى كۇتۇپخانىسى لايىھەلەنگەن ۋە يارىتىلغان (ماتېرىياللار ۋە ئۇسۇللارغا قاراڭ). شۇنى ئەسكەرتىش كېرەككى، بىز تىرىك جانلىقلارنى تەكشۈرۈشتىن بۇرۇن بۇ كۇتۇپخانىنى ئەستايىدىل تەھلىل قىلدۇق. ئۆزگەرتىلگەن باشلىغۇچىلارنى ئىشلىتىپ فاگ كۇتۇپخانىسى ئەۋرىشكىلىرىنى PCR ئارقىلىق كۈچەيتىش HTS غا بىۋاسىتە قوللىنىلىدىغان ئامپلىكونلارنى ھاسىل قىلدى (قوشۇمچە رەسىم 1a). a) HTS11 تەرتىپلەش خاتالىقى، b) باشلىغۇچىلارنىڭ (NNK)1-12 سۈپىتىگە تەسىر كۆرسىتىشى ۋە c) كۈتۈپخانىدا ياۋا تىپتىكى (wt) فاگ (سكېلېت قىستۇرمىسى) نىڭ بولۇشى سەۋەبىدىن، پەقەت دەلىللەنگەن تەرتىپ ئۇچۇرلىرىنى چىقىرىش ئۈچۈن تەرتىپ سۈزۈش تەرتىپى يولغا قويۇلدى (قوشۇمچە رەسىم 1b). بۇ سۈزۈش باسقۇچلىرى بارلىق HTS تەرتىپلەش كۇتۇپخانىلىرىغا ماس كېلىدۇ. ئۆلچەملىك كۈتۈپخانا ئۈچۈن، جەمئىي 233,868 ئوقۇش نەتىجىسى قولغا كەلتۈرۈلدى، بۇنىڭ ئىچىدە %39 فىلتىرلاش ئۆلچىمىدىن ئۆتۈپ، كېيىنكى باسقۇچلار ئۈچۈن كۈتۈپخانا تەھلىلى ۋە تاللاش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى (قوشۇمچە رەسىم 1c–e). ئوقۇش نەتىجىسى ئاساسلىقى 3 ئاساس جۈپلىرىنىڭ ئۇزۇنلۇقى ۋە چوققا نۇقتىسى 36 نۇكلېئوتىدتىن تەركىب تاپقان (قوشۇمچە رەسىم 1c) بولۇپ، كۈتۈپخانا لايىھىسى (NNK) 1-12 نى جەزملەشتۈردى. دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدىغىنى شۇكى، كۈتۈپخانا ئەزالىرىنىڭ تەخمىنەن %11 ى 12 ئۆلچەملىك ياۋا تىپلىق (wt) ئاساسىي PAGISRELVDKL قىستۇرمىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان، تىزىملىكلەرنىڭ دېگۈدەك يېرىمى (%49) قىستۇرما ياكى ئۆچۈرۈلۈشنى ئۆز ئىچىگە ئالغان. كۈتۈپخانا كۈتۈپخانىسىنىڭ HTS سانلىق مەلۇماتلىرى كۈتۈپخانىدىكى پېپتىدلارنىڭ كۆپ خىللىقىنى جەزملەشتۈردى: پېپتىد تىزىملىكلىرىنىڭ %81 تىن كۆپرەكى پەقەت بىر قېتىم بايقالغان، پەقەت %1.5 ى ≥4 نۇسخىدا كۆرۈلگەن (قوشۇمچە رەسىم 2a). ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ (aa) رېپېرتوراندىكى 12 ئورۇننىڭ ھەممىسىدىكى چاستوتا، چېكىنىپ چىققان NKK رېپېرتورانىنىڭ ھاسىل قىلغان كودون سانىنىڭ مۆلچەرلەنگەن چاستوتىسى بىلەن ياخشى مۇناسىۋەتلىك بولدى (قوشۇمچە رەسىم 2b). بۇ قىستۇرمىلار ئارقىلىق كودلانغان aa قالدۇقلىرىنىڭ كۆزىتىلگەن چاستوتىسى ھېسابلىغان چاستوتا بىلەن ياخشى مۇناسىۋەتلىك بولدى (r = 0.893) (قوشۇمچە رەسىم 2c). ئوكۇل قىلىشقا فاگ كۈتۈپخانىلىرىنى تەييارلاش ئېندوتوكسىننى كۈچەيتىش ۋە چىقىرىۋېتىش باسقۇچلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. بۇنىڭ ئىلگىرى فاگ كۈتۈپخانىلىرىنىڭ كۆپ خىللىقىنى ئازايتىشى مۇمكىنلىكى ئىسپاتلانغان12،13. شۇڭا، بىز ئېندوتوكسىننى چىقىرىۋەتكەن تاختا كۈچەيتىلگەن فاگ كۈتۈپخانىسىنى تەرتىپلەپ، ئۇنى ئەسلى كۈتۈپخانا بىلەن سېلىشتۇرۇپ، AA نىڭ چاستوتىسىنى مۆلچەرلىدۇق. ئەسلى توپ بىلەن كۈچەيتىلگەن ۋە تازىلانغان توپ ئوتتۇرىسىدا كۈچلۈك مۇناسىۋەت (r = 0.995) كۆزىتىلدى (قوشۇمچە رەسىم 2d)، بۇ T7 فاگ ئىشلىتىپ تاختىلاردا كۈچەيتىلگەن كىلونلار ئوتتۇرىسىدىكى رىقابەتنىڭ چوڭ بىر تەرەپلىمىلىكنى كەلتۈرۈپ چىقارمىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. بۇ سېلىشتۇرۇش ھەر بىر كۇتۇپخانىدىكى ئۈچ پېپتىدلىق موتىفلارنىڭ قېتىم سانىغا ئاساسلانغان، چۈنكى كۇتۇپخانىلارنىڭ كۆپ خىللىقىنى (~109) HTS ئارقىلىقمۇ تولۇق ئىپادىلىگىلى بولمايدۇ. ھەر بىر ئورۇندىكى aa نىڭ چاستوتا ئانالىزى كىرگۈزۈلگەن تىزىملىكنىڭ ئاخىرقى ئۈچ ئورنىدا ئورۇنغا باغلىق كىچىك بىر خىل ئېغىشچانلىقنى ئاشكارىلىدى (قوشۇمچە رەسىم 2e). خۇلاسە قىلىپ ئېيتقاندا، بىز كۇتۇپخانىنىڭ سۈپىتى ۋە كۆپ خىللىقىنىڭ قوبۇل قىلغىلى بولىدىغانلىقىنى ۋە بىر قانچە قېتىملىق تاللاش ئارىلىقىدا فاگ كۇتۇپخانىلىرىنى كۆپەيتىش ۋە تەييارلاش سەۋەبىدىن كۆپ خىللىقتا پەقەت كىچىك ئۆزگىرىشلەر كۆزىتىلگەنلىكىنى يەكۈنگە كەلدۇق.
ھوشسىز كاللارنىڭ CM غا ئوپېراتسىيە ئارقىلىق بىر كانۇلا كۆچۈرۈش ئارقىلىق ئارقا-ئارقىدىن مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقى ئەۋرىشكىسى ئېلىش ئېلىپ بېرىلىدۇ، بۇ ئارقىلىق BBB ۋە/ياكى BCSFB ئارقىلىق تومۇرغا ئوكۇل قىلىنغان T7 فاگنى (iv) ئېنىقلاش ئاسانلىشىدۇ (1a-b-رەسىم). بىز تىرىك جانلىقلارنى تاللاشنىڭ دەسلەپكى ئۈچ باسقۇچىدا ئىككى مۇستەقىل تاللاش قولىنى (A ۋە B قوللىرى) ئىشلەتتۇق (1c-رەسىم). بىز دەسلەپكى ئۈچ باسقۇچتا كىرگۈزۈلگەن فاگنىڭ ئومۇمىي مىقدارىنى ئازايتىش ئارقىلىق تاللاشنىڭ قاتتىقلىقىنى ئاستا-ئاستا ئاشۇردۇق. تۆتىنچى باسقۇچلۇق پانلاش ئۈچۈن، بىز A ۋە B تارماقلىرىدىن ئەۋرىشكىلەرنى بىرلەشتۈرۈپ، ئۈچ قوشۇمچە مۇستەقىل تاللاش ئېلىپ باردۇق. بۇ مودېلدىكى T7 فاگ زەررىچىلىرىنىڭ تىرىك جانلىقلارنىڭ خۇسۇسىيىتىنى تەتقىق قىلىش ئۈچۈن، قۇيرۇق ۋېناسى ئارقىلىق كاللارغا ياۋا تىپتىكى فاگ (PAGISRELVDKL ئاساسلىق قىستۇرمىسى) ئوكۇل قىلىندى. ھەر خىل ۋاقىت نۇقتىلىرىدا مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقى ۋە قاندىن فاگلارنىڭ ئەسلىگە كېلىشى، نىسبەتەن كىچىك T7 ئىكوساھېدرال فاگلارنىڭ قان بۆلۈمىدىن تېز سۈرئەتتە دەسلەپكى تازىلاش باسقۇچىغا ئىگە ئىكەنلىكىنى كۆرسەتتى (قوشۇمچە رەسىم 3). چاشقانلارنىڭ تىترى ۋە قان مىقدارىغا ئاساسەن، بىز تومۇرغا ئوكۇل قىلىنغاندىن 10 مىنۇت كېيىن قاندىكى بېرىلگەن مىقداردىكى پەقەت تەخمىنەن %1 ئېغىرلىقتىكى فاگ بايقالغانلىقىنى ھېسابلىدۇق. بۇ دەسلەپكى تېز تۆۋەنلەشتىن كېيىن، دەسلەپكى تازىلاش سۈرئىتى ئاستىلاپ، يېرىم پارچىلىنىش ۋاقتى 27.7 مىنۇت بولدى. مۇھىمى، پەقەت ئاز ساندىكى فاگلارلا CSF بۆلۈمىدىن ئېلىندى، بۇ ياۋا تىپتىكى فاگلارنىڭ CSF بۆلۈمىگە كۆچۈشىنىڭ تۆۋەن ئارقا كۆرۈنۈشىنى كۆرسىتىدۇ (قوشۇمچە رەسىم 3). ئوتتۇرىچە ھېساب بىلەن، پۈتۈن ئەۋرىشكە ئېلىش مەزگىلىدە (0-250 مىنۇت) مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىدا پەقەت قاندىكى تەخمىنەن %10-3 تىترلىق T7 فاگ ۋە دەسلەپكى قۇيۇلغان فاگلارنىڭ %4 10-8 تىترى بايقالغان. دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدىغىنى، مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىدىكى ياۋا تىپتىكى فاگنىڭ يېرىم پارچىلىنىش ۋاقتى (25.7 مىنۇت) قاندىكىگە ئوخشايدۇ. بۇ سانلىق مەلۇماتلار CM-كانۇليالىق كاللاردا CSF بۆلۈمىنى قاندىن ئايرىيدىغان توسۇقنىڭ پۈتۈن ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ، بۇ بولسا قاندىن CSF بۆلۈمىگە ئاسانلا يۆتكىلىدىغان كىلونلارنى ئېنىقلاش ئۈچۈن جانلىقلاردا فاگ كۈتۈپخانىلىرىنى تاللاشقا يول قويىدۇ.
(a) چوڭ بىر كۆلچەكتىن مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقى (CSF) نى قايتا ئەۋرىشكە ئېلىش ئۇسۇلىنى تەڭشەش. (b) مەركىزىي نېرۋا سىستېمىسى (CNS) توسۇقىنىڭ ھۈجەيرە ئورنىنى ۋە قان-مېڭە توسۇقى (BBB) ​​ۋە قان-مېڭە توسۇقىدىن ئۆتىدىغان پېپتىدلارنى ئېنىقلاش ئۈچۈن ئىشلىتىلىدىغان تاللاش ئىستراتېگىيىسىنى كۆرسىتىدىغان دىئاگرامما. (c) تىرىك جانلىقلاردا فاگ كۆرسىتىش تەكشۈرۈش ئېقىم جەدۋىلى. ھەر بىر تاللاش باسقۇچىدا، فاگلار (ئوقلارنىڭ ئىچىدىكى ھايۋانلارنىڭ ئېنىقلىغۇچلىرى) تومۇرغا ئوكۇل قىلىندى. ئىككى مۇستەقىل ئالماشتۇرۇش تارمىقى (A، B) 4-قېتىملىق تاللاش باسقۇچىغىچە ئايرىم ساقلاندى. 3- ۋە 4-قېتىملىق تاللاش باسقۇچلىرىدا، CSF دىن ئېلىنغان ھەر بىر فاگ كىلونى قولدا تەرتىپلەندى. (d) T7 پېپتىد كۈتۈپخانىسى (ھايۋانغا 2 x 1012 فاگ) تومۇرغا ئوكۇل قىلىنغاندىن كېيىن، ئىككى كانۇلا قىلىنغان كاللىدا تۇنجى تاللاش باسقۇچىدا قان (قىزىل چەمبەرلەر) ۋە مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىدىن (يېشىل ئۈچبۇلۇڭ) ئايرىۋېلىنغان فاگنىڭ كىنېتىكىسى. كۆك رەڭلىك كۋادراتلار قاندىكى فاگنىڭ ئوتتۇرىچە دەسلەپكى قويۇقلۇقىنى كۆرسىتىدۇ، ئۇ ئوكۇل قىلىنغان فاگنىڭ مىقدارىدىن ھېسابلىنىدۇ، ئومۇمىي قان مىقدارىنى ئويلىشىپ ھېسابلىنىدۇ. قارا رەڭلىك كۋادراتلار قاندىكى فاگنىڭ قويۇقلۇقىدىن ئېكىستراپولاتسىيە قىلىنغان y سىزىقىنىڭ كېسىشكەن نۇقتىسىنى كۆرسىتىدۇ. (e,f) پېپتىدتا بايقالغان بارلىق مۇمكىن بولغان ئۈچ پېپتىدلىق موتىفلارنىڭ نىسپىي چاستوتىسى ۋە تارقىلىشىنى كۆرسىتىڭ. 1000 قېتىملىق ئوقۇشتا بايقالغان موتىفلارنىڭ سانى كۆرسىتىلدى. مۇھىم دەرىجىدە (p < 0.001) مول موتىفلار قىزىل نۇقتىلار بىلەن بەلگىلەنگەن. (e) ئوكۇل قىلىنغان كۈتۈپخانىنىڭ ئۈچ پېپتىدلىق موتىفنىڭ نىسپىي چاستوتىسىنى 1.1 ۋە 1.2-نومۇرلۇق ھايۋانلاردىن قان ئارقىلىق ئېلىنغان فاگ بىلەن سېلىشتۇرىدىغان كوررېلياتسىيە تارقاقلىق دىئاگراممىسى. (f) قان ۋە مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىدىن ئايرىۋېلىنغان 1.1 ۋە 1.2-نومۇرلۇق ھايۋان فاگ ئۈچ پېپتىدلىق موتىفلىرىنىڭ نىسپىي چاستوتىسىنى سېلىشتۇرىدىغان كوررېلياتسىيە تارقاقلىق دىئاگراممىسى. (g, h) ئىككى ھايۋاندا بىر قېتىملىق تىرىك جانلىق تاللاشتىن كېيىن قانغا باي فاگ (g) بىلەن ئوكۇل قىلىنغان كۈتۈپخانىلار ۋە CSF بىلەن باي فاگ (h) بىلەن قانغا باي فاگنىڭ تەرتىپ نومۇرى كۆرسىتىلىشى. بىر ھەرپلىك كودنىڭ چوڭلۇقى بۇ ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ بۇ ئورۇندا قانچىلىك كۆپ ئۇچرايدىغانلىقىنى كۆرسىتىدۇ. يېشىل = قۇتۇپ، بىنەپشە = نېيترال، كۆك = ئاساسىي، قىزىل = كىسلاتالىق ۋە قارا = سۇغا چۆكۈش ئامىنو كىسلاتالىرى. 1a، b رەسىمنى ئېدۋارد ئۇرىچ لايىھەلىگەن ۋە ئىشلەپچىقارغان.
بىز ئىككى CM ئەسۋابلىق كالىغا (A ۋە B كلادېتلىرى) بىر فاگ پېپتىد كۇتۇپخانىسىنى ئوكۇل قىلدۇق ۋە مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقى ۋە قاندىن بىر فاگنى ئايرىۋالدۇق (1d-رەسىم). كۇتۇپخانىنىڭ دەسلەپكى تېز تازىلىنىشى ياۋا تىپتىكى فاگقا سېلىشتۇرغاندا ئانچە كۆرۈنەرلىك ئەمەس ئىدى. ھەر ئىككى ھايۋاندا ئوكۇل قىلىنغان كۇتۇپخانىنىڭ ئوتتۇرىچە يېرىم پارچىلىنىش ۋاقتى قاندىكى 24.8 مىنۇت بولۇپ، ياۋا تىپتىكى فاگقا ئوخشايدۇ، CSF دا 38.5 مىنۇت ئىدى. ھەر بىر ھايۋاننىڭ قان ۋە مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقى فاگ ئەۋرىشكىلىرى HTS غا ئۇچراتتى ۋە بايقالغان بارلىق پېپتىدلار قىسقا ئۈچ پېپتىدلىق موتىفنىڭ بار-يوقلۇقى ئانالىز قىلىندى. ئۈچ پېپتىدلىق موتىفلار قۇرۇلما شەكىللىنىشى ۋە پېپتىد-ئاقسىل ئۆزئارا تەسىرى ئۈچۈن ئەڭ تۆۋەن ئاساس بىلەن تەمىنلەيدىغانلىقى ئۈچۈن تاللاندى14،15. بىز ئوكۇل قىلىنغان فاگ كۇتۇپخانىسى بىلەن ئىككى ھايۋاننىڭ قېنىدىن ئېلىنغان كىلونلار ئوتتۇرىسىدىكى موتىفلارنىڭ تارقىلىشىدا ياخشى مۇناسىۋەتنى بايقىدۇق (1e-رەسىم). سانلىق مەلۇماتلار كۇتۇپخانىنىڭ تەركىبىنىڭ قان بۆلۈمىدە پەقەت ئاز مىقداردا مول ئىكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ چاستوتىسى ۋە ئورتاق قاراش تەرتىپى Weblogo16 يۇمشاق دېتالىنىڭ ماسلىشىشى ئارقىلىق ھەر بىر ئورۇندا تېخىمۇ چوڭقۇر تەھلىل قىلىندى. قىزىقارلىقى شۇكى، بىز قان گلىتسىن قالدۇقلىرىنىڭ كۈچلۈك موللۇقىنى بايقىدۇق (1g-رەسىم). قاننى CSF دىن تاللانغان كىلونلار بىلەن سېلىشتۇرغاندا، كۈچلۈك تاللاش ۋە بەزى موتىپلارنىڭ تاللىنىشىنى يوقىتىش كۆزىتىلدى (1f-رەسىم)، ھەمدە بەزى ئامىنو كىسلاتالىرى 12 ئەزالىق ماددىدا بەلگىلەنگەن ئورۇنلاردا ئەۋزەل مەۋجۇت بولدى (1h-رەسىم). دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدىغىنى، ئايرىم ھايۋانلارنىڭ مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىدا كۆرۈنەرلىك پەرق بار، ھالبۇكى ھەر ئىككى ھايۋاندا قان گلىتسىن موللۇقى كۆزىتىلدى (قوشۇمچە رەسىم 4a–j). 1.1- ۋە 1.2- ھايۋانلارنىڭ مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىدىكى تەرتىپ سانلىق مەلۇماتلىرىنى قاتتىق سۈزگەندىن كېيىن، جەمئىي 964 ۋە 420 دانە ئۆزگىچە 12-مېر پېپتىد قولغا كەلتۈرۈلدى (قوشۇمچە رەسىم 1d–e). ئايرىۋېتىلگەن فاگ كىلونلىرى كۈچەيتىلدى ۋە ئىككىنچى قېتىملىق تىرىك جانلىق تاللاشقا ئۇچرىدى. ئىككىنچى قېتىملىق تاللاشتىن ئېلىنغان فاگلار ھەر بىر ھايۋاندا HTS سىنىقىغا ئۇچرايدىغان بولۇپ، بايقالغان بارلىق پېپتىدلار ئۈچ پېپتىدلىق موتىفلارنىڭ پەيدا بولۇشىنى تەھلىل قىلىش ئۈچۈن موتىف تونۇش پروگراممىسىغا كىرگۈزۈلگەن (2a، b، ef-رەسىم). CSF دىن قايتۇرۇۋېلىنغان فاگنىڭ تۇنجى دەۋرى بىلەن سېلىشتۇرغاندا، بىز A ۋە B تارماقلىرىدىكى CSF دىكى نۇرغۇن موتىفلارنىڭ تېخىمۇ كۆپ تاللىنىشى ۋە تاللانمىغانلىقىنى كۆزەتتۇق (2-رەسىم). ئۇلارنىڭ ئوخشاش تەرتىپنىڭ ئوخشىمايدىغان ئەندىزىسىنى ئىپادىلەيدىغان-ئەكىس ئەتتۈرمەيدىغانلىقىنى بېكىتىش ئۈچۈن تور پەرقلەندۈرۈش ئالگورىزىمى قوللىنىلدى. CSF تەرىپىدىن ئالماشتۇرۇلىدىغان A كلادى (2c، d-رەسىم) ۋە B كلادى (2g، h-رەسىم) دا ئېنىق ئوخشاشلىق كۆزىتىلدى. ھەر بىر تارماقتىكى بىرلەشتۈرۈلگەن ئانالىز 12-مېر پېپتىدلارنىڭ ئوخشىمىغان تاللاش ئارخىپلىرىنى (قوشۇمچە رەسىم 5c، d) ۋە ئىككىنچى قېتىملىق تاللاشتىن كېيىن بىرلەشتۈرۈلگەن كىلونلارنىڭ بىرىنچى قېتىملىق تاللاشقا سېلىشتۇرغاندا ۋاقىتنىڭ ئۆتۈشىگە ئەگىشىپ CSF/قان تىترى نىسبىتىنىڭ ئاشقانلىقىنى ئاشكارىلىدى (قوشۇمچە رەسىم 5e).
ئىككى قېتىملىق ئارقا-ئارقىدىن ئېلىپ بېرىلغان تىرىك جانلىقلاردا فۇنكسىيەلىك فاگ كۆرسىتىش تاللىشى ئارقىلىق مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىدىكى موتىف ۋە پېپتىدلارنى بېيىتىش.
ھەر بىر ھايۋاننىڭ (1.1 ۋە 1.2-ھايۋانلار) بىرىنچى قېتىملىق تەكشۈرۈشىدىن ئېلىنغان بارلىق مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقى فاگلىرى بىرلەشتۈرۈلۈپ، كۈچەيتىلىپ، HT تەرتىپلىك تەكشۈرۈلۈپ، قايتا ئوكۇل قىلىندى (2 x 1010 فاگ/ھايۋان). 2 SM كانىلىلانغان كاللا (1.1 → #). 2.1 ۋە 2.2، 1.2 → 2.3 ۋە 2.4). (a,b,e,f) بىرىنچى ۋە ئىككىنچى قېتىملىق تاللاش تەكشۈرۈشىدىن ئۆتكەن بارلىق CSF دىن ئېلىنغان فاگلارنىڭ ئۈچ پېپتىدلىق موتىفلىرىنىڭ نىسپىي چاستوتىسىنى سېلىشتۇرىدىغان كوررېلياتسىيە تارقاقلىق دىئاگراممىسى. ھەر ئىككى يۆنىلىشتىكى پېپتىدلاردا بايقالغان بارلىق ئۈچ پېپتىدلارنىڭ نىسپىي چاستوتىسى ۋە تارقىلىشىنى ئىپادىلەيدىغان موتىفلارنىڭ نىسپىي چاستوتىسى ۋە تارقىلىشى. 1000 قېتىملىق تەكشۈرۈشتىن تېپىلغان موتىفلارنىڭ سانى كۆرسىتىلدى. سېلىشتۇرۇلغان كۈتۈپخانىلارنىڭ بىرىدە مۇھىم دەرىجىدە تاللانغان ياكى چىقىرىۋېتىلگەن موتىفلار (p < 0.001) قىزىل نۇقتىلار بىلەن بەلگىلەندى. (c, d, g, h) تىرىك جانلىقلارنى تاللاشنىڭ 2- ۋە 1- ئايلانمىلىرىغا ئاساسەن، بارلىق CSF مول 12 ئامىنو كىسلاتالىق ئۇزۇن تىزمىلارنىڭ تىزمىلىق بەلگىسى. بىر ھەرپلىك كودنىڭ چوڭلۇقى بۇ ئامىنو كىسلاتانىڭ بۇ ئورۇندا قانچىلىك كۆپ ئۇچرايدىغانلىقىنى كۆرسىتىدۇ. بەلگىسىنى ئىپادىلەش ئۈچۈن، ئىككى تاللاش ئايلانمىسى ئارىسىدا ئايرىم ھايۋانلاردىن ئېلىنغان CSF تىزمىلىرىنىڭ چاستوتىسى سېلىشتۇرۇلىدۇ ۋە ئىككىنچى ئايلانمىدىكى موللاشتۇرۇلغان تىزمىلار كۆرسىتىلىدۇ: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ۋە (h) #1.2–#2.4. (c, d) 2.1 ۋە 2.2- نومۇرلۇق ھايۋانلارنىڭ ياكى (g, ​​h) 2.3 ۋە 2.4- نومۇرلۇق ھايۋانلارنىڭ مەلۇم ئورنىدىكى ئەڭ مول ئامىنو كىسلاتالىرى رەڭدە كۆرسىتىلىدۇ. يېشىل = قۇتۇپ، بىنەپشە = نېيترال، كۆك = ئاساسىي، قىزىل = كىسلاتالىق ۋە قارا = سۇغا چىداملىق ئامىنو كىسلاتالار.
ئۈچىنچى قېتىملىق تاللاشتىن كېيىن، بىز ئىككى ھايۋاندىن ئايرىۋېلىنغان 332 CSF قايتا قۇرۇلغان فاگ كىلونلىرىدىن 124 خىل ئۆزگىچە پېپتىد تىزىملىكىنى (#3.1 ۋە #3.2) بايقىدۇق (قوشۇمچە رەسىم 6a). LGSVS تىزىملىكى (%18.7) ئەڭ يۇقىرى نىسبەتكە ئىگە بولۇپ، ئۇنىڭدىن قالسا ياۋا تىپتىكى قىستۇرمىلار PAGISRELVDKL (%8.2)، MRWFFSHASQGR (%3)، DVAKVS (%3)، TWLFSLG (%2.2) ۋە SARGSWREIVSLS (%2.2) نى ئىگىلىگەن. ئاخىرقى تۆتىنچى قېتىملىق تاللاشتا، بىز ئۈچ ئايرىم ھايۋاندىن مۇستەقىل تاللانغان ئىككى تارماقنى بىرلەشتۈردۇق (رەسىم 1c). CSF دىن قايتۇرۇۋېلىنغان 925 خىل تەرتىپلىك فاگ كىلونلىرى ئىچىدە، تۆتىنچى قېتىملىق تاللاشتا بىز 64 خىل ئۆزگىچە پېپتىد تىزىملىكىنى بايقىدۇق (قوشۇمچە رەسىم 6b)، بۇلارنىڭ ئىچىدە ياۋا تىپتىكى فاگنىڭ نىسبىي نىسبىتى %0.8 كە چۈشكەن. تۆتىنچى ئايلانمىدا ئەڭ كۆپ ئۇچرايدىغان CSF كىلونلىرى LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%)، LGSVS (17%)، GFVRFRLLSNTR (14%)، KVAWRVFSLFWK (7%)، SVHGV (5%)، GRPQKINGARVC (3.6%) ۋە RLSSVDSDLSGC (3.2%). %)). تاللانغان پېپتىدلارنىڭ ئۇزۇنلۇق دائىرىسى NNK كۇتۇپخانىسى لايىھىسى ئۈچۈن چېكىنىش كودونلىرىنى ئىشلەتكەندە كۇتۇپخانا باشلانغۇچلىرىدىكى نۇكلېئوتىد قىستۇرۇش/ئۆچۈرۈش ياكى ۋاقتىدىن بۇرۇن توختاپ قېلىش كودونلىرى سەۋەبىدىن كېلىپ چىقىدۇ. ۋاقتىدىن بۇرۇن توختاپ قېلىش كودونلىرى قىسقا پېپتىدلارنى ھاسىل قىلىدۇ ۋە ئۇلار پايدىلىق aa موتىفىنى ئۆز ئىچىگە ئالغانلىقى ئۈچۈن تاللىنىدۇ. ئۇزۇن پېپتىدلار سۈنئىي كۇتۇپخانىلارنىڭ باشلانغۇچلىرىدىكى قىستۇرۇش/ئۆچۈرۈشتىن كېلىپ چىقىشى مۇمكىن. بۇ لايىھەلەنگەن توختاپ قېلىش كودونىنى رامكىنىڭ سىرتىغا قويۇپ، يېڭى توختاپ قېلىش كودونى پەيدا بولغۇچە ئوقۇيدۇ. ئادەتتە، بىز كىرگۈزۈش سانلىق مەلۇماتلىرىنى ئۈلگە چىقىرىش سانلىق مەلۇماتلىرى بىلەن سېلىشتۇرۇش ئارقىلىق تۆت تاللاش ئايلانمىسىنىڭ ھەممىسى ئۈچۈن بايىتىش ئامىللىرىنى ھېسابلىدۇق. بىرىنچى قېتىملىق تەكشۈرۈشتە، بىز ياۋا تىپتىكى فاگ تىترىنى ئالاھىدە بولمىغان ئارقا كۆرۈنۈش پايدىلىنىش ماتېرىيالى سۈپىتىدە ئىشلەتتۇق. قىزىقارلىقى شۇكى، بىرىنچى قېتىملىق CSF دەۋرىدە مەنپىي فاگ تاللاش ناھايىتى كۈچلۈك بولدى، ئەمما قاندىكى ئۇنداق ئەمەس (3a-رەسىم)، بۇ پېپتىد كۈتۈپخانىسىنىڭ كۆپ قىسىم ئەزالىرىنىڭ CSF بۆلۈمىگە پاسسىپ تارقىلىش ئېھتىماللىقىنىڭ تۆۋەن بولۇشى ياكى نىسپىي فاگلارنىڭ قان ئايلىنىشىدا باكتېرىيوفاگلارغا قارىغاندا ئۈنۈملۈك ساقلىنىشى ياكى چىقىرىۋېتىلىشى بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولۇشى مۇمكىن. قانداقلا بولمىسۇن، ئىككىنچى قېتىملىق تەكشۈرۈشتە، ھەر ئىككى كلادتا CSF دىكى فاگلارنىڭ كۈچلۈك تاللىنىشى كۆزىتىلدى، بۇ ئالدىنقى باسقۇچتا CSF نىڭ سۈمۈرۈلۈشىنى ئىلگىرى سۈرىدىغان پېپتىدلارنى كۆرسىتىدىغان فاگلارغا باي بولغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ (3a-رەسىم). يەنە بىر قېتىم، قاننىڭ موللىشىشى كۆرۈنەرلىك بولمىدى. ئۈچىنچى ۋە تۆتىنچى باسقۇچلاردا، فاگ كىلونلىرى CSF غا كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە باي بولدى. ئەڭ ئاخىرقى ئىككى قېتىملىق تاللاش ئارىسىدىكى ھەر بىر ئۆزگىچە پېپتىد تىزىملىكىنىڭ نىسپىي چاستوتىسىنى سېلىشتۇرغاندا، بىز تۆتىنچى قېتىملىق تاللاشتا تىزىملىكلەرنىڭ تېخىمۇ مول ئىكەنلىكىنى بايقىدۇق (3b-رەسىم). پېپتىد يۆنىلىشى ئارقىلىق 64 خىل ئۆزگىچە پېپتىد تىزىملىكىدىن جەمئىي 931 دانە ئۈچ پېپتىدلىق موتىف ئېلىندى. تۆتىنچى ئايلانمىدىكى ئەڭ مول موتىفلار، كىرگۈزۈلگەن كۇتۇپخانىغا سېلىشتۇرغاندا، بارلىق ئايلانمىلاردىكى موللاشتۇرۇش پروفىللىرى ئۈچۈن تېخىمۇ يېقىندىن تەكشۈرۈلدى (چەكلىمە: %10 موللاشتۇرۇش) (قوشۇمچە رەسىم 6c). تاللاشنىڭ ئادەتتىكى ئەندىزىسى شۇنى كۆرسەتتىكى، تەتقىق قىلىنغان موتىفلارنىڭ كۆپىنچىسى ئىككى تاللاش تارمىقىنىڭ ئالدىنقى بارلىق ئايلانمىلىرىدا موللاشتۇرۇلغان. قانداقلا بولمىسۇن، بەزى موتىفلار (مەسىلەن، SGL، VSG، LGS GSV) ئاساسلىقى ئالماشتۇرۇش كلادى A دىن كەلگەن، يەنە بەزىلىرى (مەسىلەن، FGW، RTN، WGF، NTR) ئالماشتۇرۇش كلادى B دىن موللاشتۇرۇلغان.
سترېپتاۋىدىننىڭ يۈكىگە قوشۇلغان CSF بىلەن بېيىتىلگەن فاگ كۆرسىتىلگەن پېپتىدلار ۋە بىئوتىنلانغان باشلامچى پېپتىدلارنىڭ CSF ئارقىلىق توشۇلىشىنى جەزملەشتۈرۈش.
(a) ئوكۇل قىلىنغان (كىرىش = I) فاگ (PFU) تىترى ۋە بېكىتىلگەن CSF فاگ تىترى (چىقىش = O) ئاساسىدا تۆت ئايلانمىنىڭ ھەممىسىدە (R1-R4) ھېسابلىنىدىغان بېيىتىش نىسبىتى. ئەڭ ئاخىرقى ئۈچ ئايلانمىنىڭ (R2-R4) بېيىتىش ئامىللىرى ئالدىنقى ئايلانما ۋە تۇنجى ئايلانما (R1) بىلەن ئېغىرلىقى سانلىق مەلۇماتلىرى بىلەن سېلىشتۇرۇش ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ. ئوچۇق بالداقلار مېڭە ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقى، سايە بالداقلار پلازما. (***p<0.001، ستۇدېنتنىڭ t-سىناق نەتىجىسىگە ئاساسەن). (b) ئەڭ كۆپ ئۇچرايدىغان فاگ پېپتىدلىرىنىڭ تىزىملىكى، ئۇلارنىڭ 4-ئايلانمىدىن كېيىن CSF دا توپلانغان بارلىق فاگلارغا بولغان نىسبىي نىسبىتىگە ئاساسەن رەتكە تىزىلغان. ئەڭ كۆپ ئۇچرايدىغان ئالتە فاگ كىلونلىرى رەڭ بىلەن بەلگە قويۇلغان، نومۇرلانغان ۋە 3- ۋە 4-ئايلانمىلار ئارىلىقىدا ئۇلارنىڭ بېيىتىش ئامىللىرى كۆرسىتىلگەن (قوشۇمچە رەسىملەر). (c,d) 4-ئايلانمىدىكى ئەڭ كۆپ بېيىتىلغان ئالتە فاگ كىلون، بوش فاگ ۋە ئاتا-ئانا فاگ پېپتىد كۈتۈپخانىلىرى CSF ئەۋرىشكە ئېلىش مودېلىدا ئايرىم-ئايرىم تەھلىل قىلىندى. بەلگىلەنگەن ۋاقىت نۇقتىلىرىدا CSF ۋە قان ئەۋرىشكىلىرى توپلاندى. (c) تەڭ مىقداردا 6 كاندىدات فاگ كىلون (2 x 1010 فاگ/ھايۋان)، بوش فاگ (#1779) (2 x 1010 فاگ/ھايۋان) ۋە زاپاس فاگ پېپتىد كۈتۈپخانىلىرى (2 x 1012 فاگ/ھايۋان) قۇيرۇق تومۇرى ئارقىلىق ئايرىم-ئايرىم ھالدا قاناللىق ھايۋانغا كەم دېگەندە 3 CM ئوكۇل قىلىنىدۇ. ھەر بىر ئوكۇل قىلىنغان فاگ كىلون ۋە فاگ پېپتىد كۈتۈپخانىسىنىڭ ۋاقىتقا ئەگىشىپ CSF فارماكوكىنېتىكىسى كۆرسىتىلدى. (d) ئەۋرىشكە ئېلىش ۋاقتىدىكى بارلىق قايتۇرۇۋېلىنغان فاگ/mL نىڭ ئوتتۇرىچە CSF/قان نىسبىتى كۆرسىتىلدى. (e) تۆت سۈنئىي باشلامچى پېپتىد ۋە بىر ئارىلاشتۇرۇلغان كونترول بىئوتىن بىلەن سترېپتاۋىدىننىڭ N-ئۇچى (تېترامېر كۆرسىتىش) ئارقىلىق باغلىنىپ، ئاندىن ئوكۇل قىلىندى (قۇيرۇق تومۇرىغا 10 مىللىگرام سترېپتاۋىدىن/كىلوگرام). كەم دېگەندە ئۈچ ئىنتۇباتسىيە قىلىنغان كال (N = 3). كۆرسىتىلگەن ۋاقىت نۇقتىلىرىدا CSF ئەۋرىشكىلىرى توپلاندى ۋە سترېپتاۋىدىننىڭ قويۇقلۇقى CSF نىڭ سترېپتاۋىدىنغا قارشى ELISA ئارقىلىق ئۆلچەندى (nd = بايقالمىدى). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA سىنىقىغا ئاساسەن). (f) ئەڭ مول فاگ پېپتىد كىلونى #2002 (بىنەپشە رەڭلىك) نىڭ ئامىنو كىسلاتا تەرتىپىنى 4-نۆۋەتلىك تاللاشتىن ئېلىنغان باشقا تاللانغان فاگ پېپتىد كىلونلىرى بىلەن سېلىشتۇرۇش. ئوخشاش ۋە ئوخشاش ئامىنو كىسلاتا پارچىلىرى رەڭ كودلانغان.
تۆتىنچى ئايلانما باسقۇچتىكى بارلىق موللاشتۇرۇلغان فاگلار ئىچىدىن (3b-رەسىم)، CSF ئەۋرىشكە مودېلىدا تېخىمۇ كۆپ يەككە ئانالىز قىلىش ئۈچۈن ئالتە كاندىدات كىلون تاللاندى. ئۈچ دانە كاندىدات فاگ، بوش فاگ (قوشۇمچە ئەمەس) ۋە پروفاگ پېپتىد كۈتۈپخانىسى تەڭ مىقداردا ئۈچ دانە CM ھايۋانغا ئوكۇل قىلىندى، ھەمدە فارماكوكىنېتىكىسى CSF (3c-رەسىم) ۋە قان (قوشۇمچە 7-رەسىم) سىناقلىرىدا بېكىتىلدى. سىناق قىلىنغان بارلىق فاگ كىلونلىرى CSF بۆلۈمىنى نىشان قىلىپ، بوش كونترول فاگ (#1779) دىن 10-1000 ھەسسە يۇقىرى سەۋىيىدە تۇردى. مەسىلەن، #2020 ۋە #2077 كىلونلىرىنىڭ CSF تىترى كونترول فاگقا قارىغاندا تەخمىنەن 1000 ھەسسە يۇقىرى ئىدى. تاللانغان ھەر بىر پېپتىدنىڭ فارماكوكىنېتىكىلىق پروفىلى ئوخشىمايدۇ، ئەمما ئۇلارنىڭ ھەممىسىنىڭ CSF نى ئۆز ئىچىگە ئېلىش ئىقتىدارى يۇقىرى. بىز 1903- ۋە 2011-نومۇرلۇق كىلونلارنىڭ ۋاقىتنىڭ ئۆتۈشىگە ئەگىشىپ ئۈزلۈكسىز تۆۋەنلىشىنى كۆزەتتۇق، 2077-، 2002- ۋە 2009-نومۇرلۇق كىلونلارنىڭ دەسلەپكى 10 مىنۇت ئىچىدە ئېشىشى ئاكتىپ توشۇشنى كۆرسىتىشى مۇمكىن، ئەمما بۇنى تەكشۈرۈش كېرەك. 2020-، 2002- ۋە 2077-نومۇرلۇق كىلونلار يۇقىرى سەۋىيىدە مۇقىملاشتى، 2009-نومۇرلۇق كىلوننىڭ CSF قويۇقلۇقى دەسلەپكى ئېشىشتىن كېيىن ئاستا-ئاستا تۆۋەنلىدى. ئاندىن بىز ھەر بىر CSF نامزاتىنىڭ نىسپىي چاستوتىسىنى ئۇنىڭ قان قويۇقلۇقى بىلەن سېلىشتۇردۇق (3d-رەسىم). ھەر بىر CSF نامزاتىنىڭ ئوتتۇرىچە تىتىرىنىڭ بارلىق ئەۋرىشكە ئېلىش ۋاقىتلىرىدىكى قان تىتىرى بىلەن بولغان مۇناسىۋىتى ئالتە نامزاتنىڭ ئۈچىدە قان CSF دا كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە مول ئىكەنلىكىنى كۆرسەتتى. قىزىقارلىقى شۇكى، 2077-نومۇرلۇق كىلوننىڭ قان مۇقىملىقى يۇقىرى بولدى (قوشۇمچە رەسىم 7). پېپتىدلارنىڭ ئۆزلىرىنىڭ CSF بۆلۈمىگە فاگ زەررىچىلىرىدىن باشقا يۈكلەرنى ئاكتىپ توشۇيالايدىغانلىقىنى جەزملەشتۈرۈش ئۈچۈن، بىز پېپتىدلارنىڭ فاگ زەررىچىسىگە چاپلىشىدىغان N-ئۇچىدا بىئوتىن بىلەن ھاسىل قىلىنغان تۆت باشلامچى پېپتىدنى سىنتېزلىدۇق. بىئوتىنلانغان پېپتىدلار (2002، 2009، 2020 ۋە 2077-نومۇرلۇق) سترېپتاۋىدىن (SA) بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ، فاگ گېئومېتىرىيەسىگە ئوخشايدىغان كۆپ خىل شەكىللەرگە ئېرىشتى. بۇ فورمات بىزگە يەنە قان ۋە مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىدىكى SA نىڭ يۈك توشۇغۇچى ئاقسىل پېپتىدلىرى سۈپىتىدە تەسىرىنى ئۆلچەشكە يول قويدى. مۇھىمى، بۇ SA بىلەن بىرلەشتۈرۈلگەن فورماتتا سۈنئىي پېپتىدلار بېرىلگەندە، فاگ سانلىق مەلۇماتلىرىنى كۆپىنچە قايتا ئىشلەتكىلى بولاتتى (3e-رەسىم). ئارىلاشتۇرۇلغان پېپتىدلارنىڭ دەسلەپكى تەسىرى ئازراق، CSF دىن تېز تازىلىنىشى 48 سائەت ئىچىدە سېزىلمىدى. بۇ پېپتىدلىق فاگ كىلونلىرىنىڭ CSF بوشلۇقىغا يەتكۈزۈلۈش يوللىرىنى چۈشىنىش ئۈچۈن، بىز ئىنۋىۋو ۋېنا ئارقىلىق ئوكۇل قىلىنغاندىن 1 سائەت كېيىن فاگ زەررىچىلىرىنى بىۋاسىتە بايقاش ئۈچۈن ئىممۇنوگىستوخىمىيە (IHC) ئارقىلىق يەككە فاگ پېپتىدلىرىنىڭ تەسىرىنىڭ ئورنىنى تەھلىل قىلدۇق. دىققەت قىلىشقا ئەرزىيدىغىنى شۇكى، #2002، #2077 ۋە #2009 كىلونلىرىنى مېڭە كاپىللانېرلىرىدىكى كۈچلۈك رەڭلەر ئارقىلىق بايقىغىلى بولىدۇ، كونترول فاگ (#1779) ۋە #2020 كىلونلىرى بايقالمىغان (قوشۇمچە رەسىم 8). بۇ، بۇ پېپتىدلارنىڭ مېڭە قان تومۇرلىرىنى كېسىپ ئۆتۈش ئارقىلىق مېڭىگە تەسىر كۆرسىتىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. بۇ پەرەزنى سىناق قىلىش ئۈچۈن تېخىمۇ تەپسىلىي تەھلىل قىلىش كېرەك، چۈنكى BSCFB يولىمۇ قاتنىشىشى مۇمكىن. ئەڭ مول كىلوننىڭ (#2002) ئامىنو كىسلاتا تەرتىپىنى باشقا تاللانغان پېپتىدلار بىلەن سېلىشتۇرغاندا، ئۇلارنىڭ بەزىلىرىنىڭ ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ كېڭىيىشى ئوخشاش ئىكەنلىكى، بۇنىڭ ئوخشاش توشۇش مېخانىزمىنى كۆرسىتىشى مۇمكىنلىكى بايقالدى (رەسىم 3f).
ئۆزىنىڭ ئۆزگىچە پلازما پروفىلى ۋە ۋاقىتنىڭ ئۆتۈشىگە ئەگىشىپ CSF نىڭ كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئېشىشى سەۋەبىدىن، #2077 فاگ كۆرسىتىش كىلونى 48 سائەتلىك ئۇزۇنراق ۋاقىت ئىچىدە تېخىمۇ چوڭقۇر تەتقىق قىلىندى ۋە SA سەۋىيەسىنىڭ داۋاملىق ئېشىشى بىلەن مۇناسىۋەتلىك ھالدا كۆزىتىلگەن CSF نىڭ تېز سۈرئەتتە ئېشىشىنى قايتا ھاسىل قىلالىدى (4a-رەسىم). باشقا بايقالغان فاگ كىلونلىرىغا كەلسەك، #2077 مېڭە كاپىللاللىرى ئۈچۈن كۈچلۈك بوялغان ۋە يۇقىرى ئېنىقلىقتا كۆرۈلگەندە كاپىللا بەلگىسى لېكتىن بىلەن كۆرۈنەرلىك بىرلىشىشنى كۆرسەتكەن ھەمدە پارېنشىمال بوشلۇقىدا بەزى بويالغان بولۇشى مۇمكىن (4b-رەسىم). پېپتىد ئارقىلىق مەركىزىي نېرۋا سىستېمىسىدا فارماكولوگىيىلىك ئۈنۈمگە ئېرىشكىلى بولىدىغان-بولمايدىغانلىقىنى تەكشۈرۈش ئۈچۈن، بىز بىر تەجرىبە ئېلىپ باردۇق، بۇ تەجرىبە جەريانىدا i) #2077 ئۆتۈش پېپتىدى ۋە ii) BACE1 چەكلىگۈچى پېپتىدنىڭ بىئوتىنلانغان نۇسخىلىرى SA بىلەن ئىككى خىل نىسبەتتە ئارىلاشتۇرۇلغان. بىر بىرىكمە ئۈچۈن بىز پەقەت BACE1 پېپتىد چەكلىگۈچىسىنى ئىشلەتتۇق، يەنە بىرى ئۈچۈن BACE1 پېپتىد چەكلىگۈچىسى بىلەن #2077 پېپتىدىنىڭ 1:3 نىسبىتىنى ئىشلەتتۇق. ئىككى ئەۋرىشكە تومۇرغا كىرگۈزۈلدى، قان ۋە مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىدىكى بېتا-ئامىلوئىد پېپتىد 40 (Abeta40) نىڭ مىقدارى ۋاقىتنىڭ ئۆتۈشىگە ئەگىشىپ ئۆلچەندى. Abeta40 مېڭە سۇيۇقلۇقىدا ئۆلچەندى، چۈنكى ئۇ مېڭە پارېنخىمىسىدىكى BACE1 نىڭ چەكلىنىشىنى ئەكىس ئەتتۈرىدۇ. كۈتكىنىدەك، ھەر ئىككى مۇرەككەپ ماددا Abeta40 نىڭ قان سەۋىيەسىنى كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە تۆۋەنلىتىۋەتتى (4c-رەسىم، d). قانداقلا بولمىسۇن، پەقەت 2077-نومۇرلۇق پېپتىد ۋە SA غا قوشۇلغان BACE1 پېپتىدنىڭ چەكلىگۈچىسى ئارىلاشمىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئەۋرىشكىلەرلا مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىدىكى Abeta40 نىڭ كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە تۆۋەنلىشىنى كەلتۈرۈپ چىقاردى (4c-رەسىم). سانلىق مەلۇماتلاردىن كۆرۈۋېلىشقا بولىدۇكى، 2077-نومۇرلۇق پېپتىد 60 kDa SA ئاقسىلىنى مەركىزىي نېرۋا سىستېمىسىغا توشۇيالايدۇ، شۇنداقلا BACE1 پېپتىدنىڭ SA بىلەن تۇتاشتۇرۇلغان چەكلىگۈچىلىرى بىلەن فارماكولوگىيىلىك ئۈنۈم پەيدا قىلىدۇ.
(a) كەم دېگەندە ئۈچ CM بىلەن ئىنتۇباتسىيە قىلىنغان كاللىدا CSF پېپتىد #2077 (RLSSVDSDLSGC) ۋە ئوكۇل قىلىنمىغان كونترول فاگ (#1779) نىڭ ئۇزۇن مۇددەتلىك فارماكوكىنېتىك ئارخىپىنى كۆرسىتىدىغان T7 فاگنىڭ كىلون ئوكۇلى (2 × 10 فاگ/ھايۋان). (b) فاگ ئوكۇل قىلىنغان كاللىلاردا (2 × 10 10 فاگ/ھايۋان) ۋەكىللىك قاپاق مىكرو تومۇرلىرىنىڭ كونفوكال مىكروسكوپ سۈرىتىدە 2077 پېپتىد ۋە تومۇرلارنىڭ (لېكتىن) تەتۈر بويالغانلىقى كۆرسىتىلدى. بۇ فاگ كىلونلىرى 3 كاللىغا بېرىلىپ، قان قۇيۇشتىن بۇرۇن 1 سائەت قان ئايلىنىشىغا يول قويۇلدى. مېڭىلەر پارچىلىنىپ، T7 فاگ كاپسىدىغا قارشى پولىكلونال FITC بەلگە قويۇلغان ئانتىتېلا بىلەن بوялدى. قان قۇيۇشتىن ۋە كېيىنكى بېكىتىشتىن ئون مىنۇت بۇرۇن، DyLight594 بەلگە قويۇلغان لېكتىن تومۇرغا بېرىلدى. كاپىللا ۋە قان تومۇر ئەتراپىدىكى مېڭە توقۇلمىلىرىدىكى مىكرو قان تومۇرلىرى ۋە فاگلارنىڭ (يېشىل) لېكتىن رەڭگىنى (قىزىل) كۆرسىتىپ بېرىدىغان فلۇئورېسسېنسىيەلىك رەسىملەر. كۆلەم بالداق 10 µm غا ماس كېلىدۇ. (c, d) بىئوتىنلانغان BACE1 چەكلىگۈچى پېپتىد يالغۇز ياكى بىئوتىنلانغان ئۆتۈش پېپتىد #2077 بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ، سترېپتاۋىدىن بىلەن بىرلەشتۈرۈلۈپ، ئاندىن كەم دېگەندە ئۈچ دانە CM كالىسىغا (10 مىللىگرام سترېپتاۋىدىن/كىلوگرام) تومۇرغا ئوكۇل قىلىندى. BACE1 پېپتىد چەكلىگۈچىسى ئارقىلىق Aβ40 نىڭ ئازىيىشى كۆرسىتىلگەن ۋاقىت نۇقتىلىرىدا قان (قىزىل) ۋە مېڭە ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقى (قىزىل رەڭلىك) دىكى Aβ1-40 ELISA ئارقىلىق ئۆلچەندى. ئېنىقراق ​​بولۇش ئۈچۈن، گىرافىكتا %100 كۆلەمدە نۇقتا سىزىق سىزىلدى. (c) 2077-نومۇرلۇق ئۆتكۈنچى پېپتىد ۋە BACE1 نى توسىدىغان پېپتىد بىلەن بىرلەشتۈرۈلگەن سترېپتاۋىدىن بىلەن داۋالانغان كاللارنىڭ قان (قىزىل ئۈچبۇلۇڭ) ۋە مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقى (قىزىل ئۈچبۇلۇڭ) دىكى Aβ40 نىڭ نىسبىتىنىڭ 3:1 نىسبەتتە تۆۋەنلىشى. (d) پەقەت BACE1 نى توسىدىغان پېپتىد بىلەن بىرلەشتۈرۈلگەن سترېپتاۋىدىن بىلەن داۋالانغان كاللارنىڭ قان Aβ40 (قىزىل چەمبەر) ۋە مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقى (قىزىل چەمبەر) نىڭ نىسبىتىنىڭ تۆۋەنلىشى. كونترول گۇرۇپپىسىدىكى Aβ قويۇقلۇقى 420 pg/ml (ئۆلچەملىك چەتنىش = 101 pg/ml) بولدى.
فاگ كۆرسىتىش بىئومېدىتسىنا تەتقىقاتىنىڭ بىر قانچە ساھەسىدە مۇۋەپپەقىيەتلىك قوللىنىلدى17. بۇ ئۇسۇل تىرىك جانلىقلاردا قان تومۇرلىرىنىڭ كۆپ خىللىقى تەتقىقاتى18،19 شۇنداقلا مېڭە قان تومۇرلىرىغا قارىتىلغان تەتقىقاتلار20،21،22،23،24،25،26 ئۈچۈن ئىشلىتىلگەن. بۇ تەتقىقاتتا، بىز بۇ تاللاش ئۇسۇلىنى پەقەت مېڭە قان تومۇرلىرىغا قارىتىلغان پېپتىدلارنى بىۋاسىتە ئېنىقلاشقىلا ئەمەس، بەلكى قان-مېڭە توسۇقىنى كېسىپ ئۆتىدىغان ئاكتىپ توشۇش خۇسۇسىيىتىگە ئىگە كاندىداتلارنى بايقاشقا كېڭەيتتۇق. بىز ھازىر CM ئىنتۇباتسىيە قىلىنغان كاللاردا تىرىك جانلىقلاردا تاللاش جەريانىنىڭ تەرەققىياتىنى بايان قىلىپ، ئۇنىڭ CSF نى ئۆز ئىچىگە ئالغان خۇسۇسىيەتكە ئىگە پېپتىدلارنى ئېنىقلاش ئىقتىدارىنى نامايان قىلدۇق. 12-مېر تاسادىپىي پېپتىدلار كۇتۇپخانىسىنى كۆرسىتىدىغان T7 فاگنى ئىشلىتىپ، بىز T7 فاگنىڭ قان-مېڭە توسۇقىغا ماسلىشىشقا يېتەرلىك كىچىك (دىئامېتىرى تەخمىنەن 60 نانومېتىر)10 ئىكەنلىكىنى، شۇنىڭ بىلەن بىۋاسىتە قان-مېڭە توسۇقى ياكى خوروئىد پىلېكۇسىدىن ئۆتىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرەلىدۇق. بىز قاناللىق CM كالاچلىرىدىن CSF يىغىۋېلىشنىڭ جانلىقلاردا ياخشى كونترول قىلىنىدىغان فۇنكسىيەلىك تەكشۈرۈش ئۇسۇلى ئىكەنلىكىنى، ھەمدە ئېلىنغان فاگنىڭ پەقەت قان تومۇرلىرىغا باغلىنىپلا قالماي، يەنە قان-مېڭە توسۇقىدىن ئۆتۈش رولىنى ئوينايدىغانلىقىنى كۆزەتتۇق. بۇنىڭدىن باشقا، قان توپلاش ۋە CSF ۋە قاندىن ئېلىنغان فاگلارغا HTS نى بىرلا ۋاقىتتا قوللىنىش ئارقىلىق، بىز CSF نى تاللىشىمىزغا قاننىڭ موللىشىشى ياكى تاللاش ئايلانمىلىرى ئارىسىدا كېڭىيىشكە ماس كېلىشى تەسىر كۆرسەتمىگەنلىكىنى جەزملەشتۈردۇق. قانداقلا بولمىسۇن، قان بۆلۈمى تاللاش جەريانىنىڭ بىر قىسمى، چۈنكى CSF بۆلۈمىگە يېتەلەيدىغان فاگلار مېڭىدە موللىشىش ئۈچۈن قان ئايلىنىشى ۋە يېتەرلىك ۋاقىت ئىچىدە ياشىشى كېرەك. خام HTS سانلىق مەلۇماتلىرىدىن ئىشەنچلىك تەرتىپ ئۇچۇرىنى ئېلىش ئۈچۈن، بىز ئانالىز خىزمەت ئېقىمىدىكى سۇپا خاس تەرتىپ خاتالىقلىرىغا ماسلاشتۇرۇلغان سۈزگۈچلەرنى يولغا قويدۇق. تەكشۈرۈش ئۇسۇلىغا كىنېتىكىلىق پارامېتىرلارنى كىرگۈزۈش ئارقىلىق، بىز قاندىكى ياۋا تىپتىكى T7 فاگلىرىنىڭ تېز فارماكوكىنېتىكىسىنى (t½ ~ 28 مىنۇت) جەزملەشتۈردۇق24، 27، 28 ۋە ئۇلارنىڭ مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىدىكى يېرىم پارچىلىنىش ئۆمرىنى (t½ ~ 26 مىنۇت) بەلگىلىدۇق. قان ۋە CSF دىكى ئوخشاش فارماكوكىنېتىك ئارخىپلارغا قارىماي، CSF دا فاگنىڭ قان قويۇقلۇقىنىڭ پەقەت %0.001 ى بايقالغان، بۇ ياۋا تىپتىكى T7 فاگنىڭ قان-مېڭە توسۇقىدىن ئۆتۈپ كېتىش ئارقا كۆرۈنۈشىنىڭ تۆۋەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. بۇ ئەسەر تىرىك جانلىقلاردا قانات يايدۇرۇش ئىستراتېگىيىسىنى ئىشلەتكەندە، بولۇپمۇ قان ئايلىنىش سىستېمىسىدىن تېز سۈرئەتتە تازىلانغان فاگ سىستېمىلىرى ئۈچۈن بىرىنچى باسقۇچلۇق تاللاشنىڭ مۇھىملىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ، چۈنكى ئاز ساندىكى كىلونلار مەركىزىي نېرۋا سىستېمىسى بۆلۈمىگە يېتەلەيدۇ. شۇڭا، بىرىنچى باسقۇچتا، كۈتۈپخانا كۆپ خىللىقىنىڭ ئازىيىشى ناھايىتى چوڭ بولدى، چۈنكى بۇ ئىنتايىن قاتتىق CSF مودېلىدا ئاخىرىدا پەقەت چەكلىك ساندا كىلونلار توپلاندى. بۇ تىرىك جانلىقلاردا قانات يايدۇرۇش ئىستراتېگىيىسى CSF بۆلۈمىدە ئاكتىپ توپلىنىش، قان بۆلۈمىدە كىلوننىڭ ياشىشى ۋە دەسلەپكى 10 مىنۇت ئىچىدە قاندىكى T7 فاگ كىلونلىرىنى تېز چىقىرىۋېتىش قاتارلىق بىر قانچە تاللاش باسقۇچلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ (1d-رەسىم ۋە قوشۇمچە 4M-رەسىم). شۇڭا، بىرىنچى باسقۇچتىن كېيىن، CSF دا ئوخشىمايدىغان فاگ كىلونلىرى بايقالغان، گەرچە ئايرىم ھايۋانلار ئۈچۈن ئوخشاش دەسلەپكى توپ ئىشلىتىلگەن بولسىمۇ. بۇ، كۇتۇپخانا ئەزالىرى كۆپ بولغان مەنبە كۇتۇپخانىلىرى ئۈچۈن كۆپ خىل قاتتىق تاللاش باسقۇچلىرىنىڭ كۆپ خىللىقنىڭ كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە ئازىيىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ. شۇڭلاشقا، تاسادىپىي ۋەقەلەر دەسلەپكى تاللاش جەريانىنىڭ ئايرىلماس بىر قىسمىغا ئايلىنىپ، نەتىجىگە زور تەسىر كۆرسىتىدۇ. ئەسلى كۇتۇپخانىدىكى نۇرغۇن كىلونلارنىڭ CSF نى بايىتىش مايىللىقى ئىنتايىن ئوخشاش بولۇشى مۇمكىن. قانداقلا بولمىسۇن، ئوخشاش تەجرىبە شارائىتى ئاستىدا بولسىمۇ، دەسلەپكى توپتىكى ھەر بىر ئالاھىدە كىلوننىڭ سانى ئاز بولغاچقا، تاللاش نەتىجىلىرى پەرقلىق بولۇشى مۇمكىن.
CSF بىلەن موللاشتۇرۇلغان موتىپلار قاندىكى موتىپلاردىن پەرقلىنىدۇ. قىزىقارلىقى شۇكى، بىز ئايرىم ھايۋانلارنىڭ قېنىدا گلىتسىنغا باي پېپتىدلارغا قاراپ تۇنجى قېتىم ئۆزگىرىشنى بايقىدۇق. (1g-رەسىم، قوشۇمچە رەسىملەر 4e، 4f). گلىتسىن پېپتىدلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان فاگ تېخىمۇ مۇقىم بولۇشى ۋە قان ئايلىنىشتىن چىقىرىۋېتىلىش ئېھتىماللىقى تۆۋەن بولۇشى مۇمكىن. قانداقلا بولمىسۇن، بۇ گلىتسىنغا باي پېپتىدلار مېڭە ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقى ئەۋرىشكىلىرىدە بايقالمىغان، بۇ تاللانغان كۈتۈپخانىلارنىڭ ئىككى خىل تاللاش باسقۇچىدىن ئۆتكەنلىكىنى كۆرسىتىپ بېرىدۇ: بىرى قاندىكى، يەنە بىرى مېڭە ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىدا توپلىنىشىغا يول قويۇلغان. تۆتىنچى قېتىملىق تاللاشتىن كېلىپ چىققان CSF بىلەن موللاشتۇرۇلغان كىلونلار كەڭ كۆلەمدە سىناق قىلىندى. يەككە سىناق قىلىنغان كىلونلارنىڭ دېگۈدەك ھەممىسى بوش كونترول فاگقا سېلىشتۇرغاندا CSF بىلەن مول ئىكەنلىكى جەزملەشتۈرۈلدى. بىر قېتىملىق پېپتىد (#2077) تېخىمۇ تەپسىلىي تەكشۈرۈلدى. ئۇنىڭ پلازما يېرىم پارچىلىنىش ئۆمرى باشقا تەسىرلەرگە سېلىشتۇرغاندا ئۇزۇنراق بولدى (3d-رەسىم ۋە قوشۇمچە 7-رەسىم)، قىزىقارلىقى شۇكى، بۇ پېپتىد C ئۇچىدا سىستېئىن قالدۇقىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. يېقىندا پېپتىدلارغا سىستېئىن قوشۇش ئارقىلىق ئۇلارنىڭ ئالبۇمىن 29 بىلەن باغلىنىش ئارقىلىق فارماكوكىنېتىك خۇسۇسىيىتىنى ياخشىلىيالايدىغانلىقى كۆرسىتىلدى. بۇ ھازىرچە 2077-نومۇرلۇق پېپتىد ئۈچۈن نامەلۇم بولۇپ، تېخىمۇ چوڭقۇر تەتقىق قىلىشنى تەلەپ قىلىدۇ. بەزى پېپتىدلار CSF نىڭ موللىشىشىدا ۋالېنسقا باغلىق ئىكەنلىكىنى كۆرسەتتى (سانلىق مەلۇمات كۆرسىتىلمىدى)، بۇ T7 كاپسىدىنىڭ كۆرسىتىلگەن يۈزەكى گېئومېتىرىيەسى بىلەن مۇناسىۋەتلىك بولۇشى مۇمكىن. بىز ئىشلەتكەن T7 سىستېمىسى ھەر بىر فاگ زەررىچىسىدە ھەر بىر پېپتىدنىڭ 5-15 نۇسخىسىنى كۆرسەتتى. IHC كاللارنىڭ مېڭە پوستلۇقىغا تومۇر ئارقىلىق ئوكۇل قىلىنغان كاندىدات قوغۇشۇن فاگ كىلونلىرىغا ئېلىپ بېرىلدى (قوشۇمچە 8-رەسىم). سانلىق مەلۇماتلاردا كەم دېگەندە ئۈچ كىلوننىڭ (2002-نومۇر، 2009-نومۇر ۋە 2077-نومۇر) BBB بىلەن ئۆز-ئارا تەسىر كۆرسىتىدىغانلىقى كۆرسىتىلدى. بۇ BBB ئۆز-ئارا تەسىرىنىڭ CSF نىڭ توپلىنىشىغا ياكى بۇ كىلونلارنىڭ بىۋاسىتە BCSFB غا يۆتكىلىشىگە سەۋەب بولىدىغان-بولمايدىغانلىقىنى تېخى ئېنىقلىغىلى بولمايدۇ. مۇھىمى، بىز تاللانغان پېپتىدلارنىڭ سىنتېزلىنىپ ئاقسىل يۈكىگە باغلىنىش جەريانىدا CSF توشۇش ئىقتىدارىنى ساقلاپ قالىدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بەردۇق. N-تېرمىناللىق بىئوتىنلانغان پېپتىدلارنىڭ SA غا باغلىنىشى ئاساسەن قان ۋە مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىدىكى ئايرىم-ئايرىم فاگ كىلونلىرى بىلەن ئېرىشكەن نەتىجىلەرنى تەكرارلايدۇ (3e-رەسىم). ئاخىرىدا، بىز قوغۇشۇن پېپتىد #2077 نىڭ SA غا بىرىكتۈرۈلگەن BACE1 بىئوتىنلانغان پېپتىد چەكلىگۈچىسىنىڭ مېڭە ھەرىكىتىنى ئىلگىرى سۈرۈپ، CSF دىكى Abeta40 سەۋىيەسىنى كۆرۈنەرلىك دەرىجىدە تۆۋەنلىتىش ئارقىلىق مەركىزىي نېرۋا سىستېمىسىدا روشەن فارماكودىنامىكىلىق ئۈنۈم پەيدا قىلالايدىغانلىقىنى كۆرسىتىپ بەردۇق (4-رەسىم). بارلىق ئۇچرايدىغان ماددىلارنىڭ پېپتىد تەرتىپى گومولوگىيەسىنى ئىزدەش ئارقىلىق سانلىق مەلۇمات ئامبىرىدىكى ھېچقانداق گومولوگىيەنى بايقىيالمىدۇق. شۇنىڭغا دىققەت قىلىش كېرەككى، T7 كۈتۈپخانىسىنىڭ چوڭلۇقى تەخمىنەن 109، 12-مېرنىڭ نەزەرىيىۋى كۈتۈپخانىسىنىڭ چوڭلۇقى بولسا 4 x 1015. شۇڭا، بىز پەقەت 12-مېر پېپتىد كۈتۈپخانىسىنىڭ كۆپ خىللىق بوشلۇقىنىڭ كىچىك بىر قىسمىنى تاللىدۇق، بۇ ئېنىقلانغان بۇ تەسىرلەرنىڭ قوشنا تەرتىپ بوشلۇقىنى باھالاش ئارقىلىق تېخىمۇ ئەلالاشتۇرۇلغان پېپتىدلارنى ئېنىقلىغىلى بولىدىغانلىقىدىن دېرەك بېرىشى مۇمكىن. پەرەز قىلىپ ئېيتقاندا، بۇ پېپتىدلارنىڭ تەبىئىي گومولوگلىرىنى تاپالمىغانلىقىمىزنىڭ سەۋەبلىرىنىڭ بىرى، بەزى پېپتىد موتىفلىرىنىڭ مېڭىگە كونترولسىز كىرىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن تەرەققىيات جەريانىدا تاللاشنى بىكار قىلىش بولۇشى مۇمكىن.
بىزنىڭ نەتىجىلىرىمىز بىرلىكتە، تىرىك جانلىقلاردا مېڭە قان تومۇر توسىقىنىڭ توشۇش سىستېمىسىنى تېخىمۇ تەپسىلىي ئېنىقلاش ۋە خاراكتېرلەندۈرۈش ئۈچۈن كەلگۈسىدىكى خىزمەتلەر ئۈچۈن ئاساس يارىتىپ بېرىدۇ. بۇ ئۇسۇلنىڭ ئاساسىي قۇرۇلمىسى پەقەت مېڭە قان تومۇر باغلىنىش خۇسۇسىيىتىگە ئىگە كىلونلارنى ئېنىقلاپلا قالماي، يەنە مۇۋەپپەقىيەت قازانغان كىلونلارنىڭ تىرىك جانلىقلاردا بىئولوگىيىلىك توسۇقلاردىن ئۆتۈپ مەركىزىي نېرۋا سىستېمىسىغا كىرىش ئۈچۈن ئىچكى پائالىيەتكە ئىگە بولۇشىنىڭ مۇھىم بىر قەدىمىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان فۇنكسىيەلىك تاللاش ئىستراتېگىيەسىگە ئاساسلانغان. بۇ پېپتىدلارنىڭ توشۇش مېخانىزمى ۋە ئۇلارنىڭ مېڭە رايونىغا خاس مىكرو قان تومۇرلىرىغا باغلىنىش مايىللىقىنى ئېنىقلاش. بۇ BBB ۋە رېتسېپتورلارنىڭ توشۇشىنىڭ يېڭى يوللىرىنى بايقاشقا ئېلىپ كېلىشى مۇمكىن. بىز ئېنىقلانغان پېپتىدلارنىڭ بىۋاسىتە مېڭە قان تومۇر رېتسېپتورلىرىغا ياكى BBB ياكى BCSFB ئارقىلىق توشۇلىدىغان ئايلىنىۋاتقان لىگاندلارغا باغلىنىشىنى ئۈمىد قىلىمىز. بۇ ئەسەردە بايقالغان CSF توشۇش پائالىيىتىگە ئىگە پېپتىد ۋېكتورلىرى تېخىمۇ چوڭقۇر تەكشۈرۈلىدۇ. بىز ھازىر بۇ پېپتىدلارنىڭ BBB ۋە/ياكى BCSFB دىن ئۆتۈش ئىقتىدارىنىڭ مېڭە ئالاھىدىلىكىنى تەكشۈرۈۋاتىمىز. بۇ يېڭى پېپتىدلار يېڭى رېتسېپتورلار ياكى يوللارنى بايقاش ۋە بىئولوگىيىلىك ماددىلار قاتارلىق ماكرومولېكۇلالارنى مېڭىگە يەتكۈزۈش ئۈچۈن يېڭى يۇقىرى ئۈنۈملۈك سۇپىلارنى تەرەققىي قىلدۇرۇشتا ئىنتايىن قىممەتلىك قورال بولۇپ قالىدۇ.
ئىلگىرى تەسۋىرلەنگەن ئۇسۇلنىڭ ئۆزگەرتىلگەن نۇسخىسى ئارقىلىق چوڭ سۇ ئامبىرى (CM) نى كانۇلا قىلىڭ. بىخۇش قىلىنغان ۋىستار كاللىسى (200-350 گرام) ستېرېئوتاكسىك ئۈسكۈنىگە ئورنىتىلىپ، قىرىلغان ۋە ئاسېپتىك تەييارلىق قىلىنغان باش تېرىسى ئۈستىدە ئوتتۇرا كېسىش قىلىنىپ، كاللىسى ئاشكارىلاندى. ئۈستۈنكى بەلۋاغ رايونىغا ئىككى تۆشۈك تېشىپ، تۆشۈكلەرگە ئورنىتىش ۋىنتىلىرىنى چىڭىتىڭ. CM غا داتلاشماس پولات كانۇلانى ستېرېئوتاكسىك يېتەكلەش ئۈچۈن يان تەرەپتىكى ئوكسىپىتال چوققا قوشۇمچە تۆشۈك تېشىلدى. كانۇلا ئەتراپىغا چىش سېمونتىنى سۈرۈپ، ۋىنتىلار بىلەن چىڭىتىڭ. سۈرەتكە تارتىش ۋە سېمونت قاتتىقلاشقاندىن كېيىن، تېرە يارىسى 4/0 سۇپرامىد تىكىش ئارقىلىق تاقىلدى. كانۇلانىڭ توغرا ئورنىتىلغانلىقى مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىنىڭ (CSF) ئۆزلۈكىدىن ئېقىپ كېتىشى بىلەن جەزملەشتۈرۈلدى. كاللىنى ستېرېئوتاكسىك ئۈسكۈنىدىن چىقىرىڭ، ئوپېراتسىيەدىن كېيىنكى مۇۋاپىق داۋالاش ۋە ئاغرىقنى كونترول قىلىڭ، ھەمدە مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىدا قان ئالامەتلىرى كۆرۈلگۈچە كەم دېگەندە بىر ھەپتە ساقىيىشىغا يول قويۇڭ. ۋىستار كالا (Crl:WI/Han) چارلىز دەرياسىدىن (فىرانسىيە) ئېلىندى. بارلىق كالا ئالاھىدە كېسەللىك قوزغاتقۇچىسىز شارائىتتا ساقلاندى. بارلىق ھايۋانلار تەجرىبىلىرى شىۋىتسارىيەنىڭ باسېل شەھىرىنىڭ ۋېتېرىنارلىق ئىدارىسى تەرىپىدىن تەستىقلاندى ۋە 2474-نومۇرلۇق ھايۋانات ئىجازەتنامىسىگە (كالانىڭ مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقى ۋە مېڭىسىدىكى داۋالاش نەتىجىلىرىنىڭ سەۋىيەسىنى ئۆلچەش ئارقىلىق مېڭە ئاكتىپ توشۇشنى باھالاش) ئاساسەن ئېلىپ بېرىلدى.
قولىڭىزدا CM كانۇلاسى بىلەن چاشقاننىڭ ھوشىنى ساقلاڭ. Datura نى كانۇلادىن ئېلىۋېتىپ، ئۆزلۈكىدىن ئېقىۋاتقان 10 µl مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقىنى يىغىڭ. كانۇلانىڭ ئۆتكۈزۈشچانلىقى ئاخىرىدا بۇزۇلغانلىقتىن، بۇ تەتقىقاتقا پەقەت قان بۇلغىنىشى ياكى رەڭگىنىڭ ئۆزگىرىشى بولمىغان سۈزۈك مېڭە-ئومۇرتقا سۇيۇقلۇقى ئەۋرىشكىلىرىلا كىرگۈزۈلگەن. شۇنىڭ بىلەن بىر ۋاقىتتا، قۇيرۇق ئۇچىدىكى كىچىك بىر كېسىشتىن تەخمىنەن 10-20 µl قان گېپارىن (Sigma-Aldrich) قوشۇلغان تۇرۇبىغا ئېلىنغان. T7 فاگېنىنى تومۇرغا ئوكۇل قىلغاندىن كېيىن، ھەر خىل ۋاقىت نۇقتىلىرىدا مېڭە سۇيۇقلۇقى ۋە قان توپلانغان. ھەر بىر مېڭە سۇيۇقلۇقى ئەۋرىشكىسى يىغىۋېلىنغاندىن بۇرۇن تەخمىنەن 5-10 µl سۇيۇقلۇق تاشلانغان، بۇ كاتېتېرنىڭ ئۆلۈك ھەجىمىگە ماس كېلىدۇ.
كۇتۇپخانىلار T7Select سىستېما قوللانمىسىدا تەسۋىرلەنگەندەك (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) T7Select 10-3b ۋېكتورى ئارقىلىق ھاسىل قىلىندى. قىسقىسى، تاسادىپىي 12-مېرلىق DNA قىستۇرمىسى تۆۋەندىكى فورماتتا سىنتېز قىلىندى:
NNK كودونى قوش توختاش كودونلىرى ۋە ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ ئارتۇقچە ئىپادىلىنىشىنىڭ ئالدىنى ئېلىش ئۈچۈن ئىشلىتىلدى. N ھەر بىر نۇكلېئوتىدنىڭ قولدا ئارىلاشتۇرۇلغان ئېكۋىمولار نىسبىتى، K بولسا ئادېنىن ۋە سىتوزىن نۇكلېئوتىدلىرىنىڭ قولدا ئارىلاشتۇرۇلغان ئېكۋىمولار نىسبىتى. يەككە زەنجىرلىك رايونلار dNTP (Novagen) ۋە Klenow ئېنزىم (New England Biolabs) بىلەن Klenow بۇفېرىدا (New England Biolabs) 37 سېلسىيە گرادۇستا 3 سائەت داۋاملىق ئىنكۇباتسىيە قىلىش ئارقىلىق قوش زەنجىرلىك DNA غا ئايلاندۇرۇلدى. رېئاكسىيەدىن كېيىن، قوش زەنجىرلىك DNA EtOH چۆكمىسى ئارقىلىق قايتۇرۇۋېلىندى. نەتىجىدە ھاسىل بولغان DNA EcoRI ۋە HindIII چەكلىمە ئېنزىملىرى (ئىككىسى Roche دىن) بىلەن ھەزىم قىلىندى. پارچىلىنىپ تازىلانغان (QIAquick, Qiagen) قىستۇرما (T4 لىگازا، New England Biolabs) ئاندىن 10B كاپسىد گېنىنىڭ 348 ئامىنو كىسلاتاسىدىن كېيىن ئالدىن پارچىلانغان T7 ۋېكتورىغا رامكا ئىچىدە باغلاندى. سىناق نەيچىسىدە ئوراپ قاچىلاشتىن بۇرۇن باغلاش رېئاكسىيەسى 16 سېلسىيە گرادۇستا 18 سائەت ئىنكۇباتسىيە قىلىندى. سىناق نەيچىسىدە فاگ ئوراپ قاچىلاش T7Select 10-3b كىلونلاش ئۈسكۈنىسى (Novagen) بىلەن بىللە بېرىلگەن كۆرسەتمىلەرگە ئاساسەن ئېلىپ بېرىلدى ۋە ئوراپ قاچىلاش ئېرىتمىسى Escherichia coli (BLT5615, Novagen) ئارقىلىق ئېرىتىش ئۈچۈن بىر قېتىم كۈچەيتىلدى. لىزاتلار مەركەزدىن قاچۇرۇلۇپ، تىترلىنىپ، -80 سېلسىيە گرادۇستا گلىتسېرىننىڭ زاپاس ئېرىتمىسى سۈپىتىدە توڭلىتىلدى.
خاس 454/Roche-amplicon بىرىكتۈرۈش باشلىغۇچىلىرى ئارقىلىق شورپا ياكى تەخسىدە كۈچەيتىلگەن فاگ ئۆزگەرگۈچى رايونلىرىنىڭ بىۋاسىتە PCR كۈچەيتىلىشى. ئالدى تەرەپتىكى بىرىكتۈرۈش باشلىغۇچىسى ئۆزگەرگۈچى رايون (NNK) 12 (شەبلونغا خاس)، GS FLX تىتان ماسلاشتۇرغۇچ A ۋە تۆت ئاساسلىق كۈتۈپخانا ئاچقۇچ تەرتىپى (TCAG) نى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ (قوشۇمچە رەسىم 1a):
تەتۈر بىرىكتۈرۈش باشلانغۇچ تەركىبىدە يەنە تۇتۇش مارجانلىرىغا ئۇلانغان بىئوتىن ۋە ئېمۇلسىيە PCR جەريانىدا كىلون كۈچەيتىش ئۈچۈن لازىم بولغان GS FLX تىتان ماسلاشتۇرغۇچ B بار:
ئاندىن ئامپلىكونلار 454 GS-FLX تىتان كېلىشىمىگە ئاساسەن 454/Roche پىروزېكۋېنسىيەسىگە ئۇچرىتىلدى. قولدا سانگېر تەرتىپلەش ئۈچۈن (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA ئانالىزاتورى)، T7 فاگ DNAسى PCR ئارقىلىق كۈچەيتىلدى ۋە تۆۋەندىكى باشلانغۇچ جۈپلەر بىلەن تەرتىپلەندى:
يەككە تاختىلاردىن ئېلىنغان قىستۇرمىلار Roche تېز باشلاش DNA پولىمېرازا زاپچاسلىرى ئارقىلىق PCR كۈچەيتىلدى (ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ كۆرسەتمىسىگە ئاساسەن). قىزىق قوزغىتىش (95 سېلسىيە گرادۇستا 10 مىنۇت) ۋە 35 قېتىم كۈچەيتىش دەۋرىيلىكىنى (95 سېلسىيە گرادۇستا 50 سېكۇنت، 50 سېلسىيە گرادۇستا 1 مىنۇت ۋە 72 سېلسىيە گرادۇستا 1 مىنۇت) ئىجرا قىلىڭ.
كۇتۇپخانىلاردىن ئېلىنغان فاگ، ياۋا تىپتىكى فاگ، CSF ۋە قاندىن قۇتقۇزۇۋېلىنغان فاگ ياكى يەككە كىلونلار Escherichia coli BL5615 نىڭ TB شورپىسىدا (Sigma Aldrich) ياكى 500 cm2 قاچىدا (Thermo Scientific) 37 سېلسىيە گرادۇستا 4 سائەت كۆپەيتىلدى. فاگلار تاختىلاردىن Tris-EDTA بۇفېر (Fluka Analytical) بىلەن چايقاش ياكى ستېرىللىق پىپېتكا ئۇچى بىلەن تاختىلارنى يىغىش ئارقىلىق ئېلىندى. فاگلار مەدەنىيەت ئۈستۈنكى سۇيۇقلۇقىدىن ياكى بىر قېتىملىق پولىئېتىلېن گلىكول (PEG 8000) چۆكمىسى (Promega) بىلەن چىقىرىلىپ، Tris-EDTA بۇفېردا قايتا ئېرىتىلدى.
كۈچەيتىلگەن فاگ ۋېناغا (IV) ئوكۇل قىلىشتىن بۇرۇن (500 μl/ھايۋانغا) 2-3 قېتىم ئېندوتوكسىننى چىقىرىۋېتىش ئۈچۈن ئېندوتوكسىننى چىقىرىۋېتىش مارجانلىرى (Miltenyi Biotec) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى. بىرىنچى باسقۇچتا، 2×1012 فاگ كىرگۈزۈلدى؛ ئىككىنچى باسقۇچتا، 2×1010 فاگ؛ ئۈچىنچى ۋە تۆتىنچى تاللاش باسقۇچلىرىدا، ھەر بىر ھايۋانغا 2×109 فاگ كىرگۈزۈلدى. بەلگىلەنگەن ۋاقىت نۇقتىلىرىدا توپلانغان CSF ۋە قان ئەۋرىشكىلىرىدىكى فاگ مىقدارى ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ كۆرسەتمىسىگە ئاساسەن تاختا ساناش ئارقىلىق بېكىتىلدى (T7Select سىستېما قوللانمىسى). فاگ تاللاش قۇيرۇق ۋېناسىغا تازىلانغان كۈتۈپخانىلارنى ۋېناغا ئوكۇل قىلىش ياكى ئالدىنقى تاللاش باسقۇچىدىن CSF دىن ئېلىنغان فاگنى قايتا ئوكۇل قىلىش ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى، كېيىنكى يىغىۋېلىشلار ئايرىم-ئايرىم ھالدا CSF ۋە قان ئەۋرىشكىلىرىنى 10 مىنۇت، 30 مىنۇت، 60 مىنۇت، 90 مىنۇت، 120 مىنۇت، 180 مىنۇت ۋە 240 مىنۇتتا ئېلىپ بېرىلدى. جەمئىي تۆت قېتىملىق تىرىك جانلىقلارنى تەكشۈرۈش ئېلىپ بېرىلدى، بۇ تەكشۈرۈشتە تاللانغان ئىككى تارماق ئايرىم ساقلاندى ۋە دەسلەپكى ئۈچ قېتىملىق تاللاش جەريانىدا تەھلىل قىلىندى. دەسلەپكى ئىككى قېتىملىق تاللاشتىن CSF دىن ئېلىنغان بارلىق فاگ قىستۇرمىلىرى 454/Roche پىروزېكۋېنسىيەسىگە ئۇچرىدى، ئەڭ ئاخىرقى ئىككى قېتىملىق تاللاشتىن CSF دىن ئېلىنغان بارلىق كىلونلار قولدا تەرتىپلەندى. تۇنجى قېتىملىق تاللاشتىن ئېلىنغان بارلىق قان فاگلىرىمۇ 454/Roche پىروزېكۋېنسىيەسىگە ئۇچرىدى. فاگ كىلونلىرىنى ئوكۇل قىلىش ئۈچۈن، تاللانغان فاگلار E. coli (BL5615) دا 500 cm2 تاختا ئۈستىدە 37 سېلسىيە گرادۇستا 4 سائەت كۆپەيتىلدى. ئايرىم تاللانغان ۋە قولدا تەرتىپلەنگەن كىلونلار TB مۇھىتىدا كۆپەيتىلدى. فاگ ئايرىۋېلىنغاندىن كېيىن، تازىلانغان ۋە ئېندوتوكسىننى چىقىرىۋەتكەندىن كېيىن (يۇقىرىدا بايان قىلىنغاندەك)، 300 μl دىكى 2×1010 فاگ/ھايۋان بىر قۇيرۇق ۋېناسىغا تومۇردىن ئوكۇل قىلىندى.
تەرتىپ سانلىق مەلۇماتلىرىنى ئالدىن بىر تەرەپ قىلىش ۋە سۈپەتلىك سۈزۈش. خام 454/Roche سانلىق مەلۇماتلىرى ئىككىلىك ئۆلچەملىك ئېقىم خەرىتىسى فورماتىدىن (sff) Pearson ئىنسانلار ئوقۇيدىغان فورماتىغا (fasta) ئايلاندۇرۇلدى، بۇ فورمات تۆۋەندە بايان قىلىنغاندەك خاس C پروگراممىلىرى ۋە سىكرىپتلىرى (ئېلان قىلىنمىغان يۇمشاق دېتال بولىقى) ئارقىلىق ئېلىپ بېرىلدى. دەسلەپكى سانلىق مەلۇماتلارنى تەھلىل قىلىش قاتتىق كۆپ باسقۇچلۇق سۈزۈش تەرتىپلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ. كۈچكە ئىگە 12 مېرلىق قىستۇرما DNA تەرتىپىنى ئۆز ئىچىگە ئالمىغان ئوقۇشلارنى سۈزۈش ئۈچۈن، ئوقۇشلار دۇنياۋى Needleman-Wunsch سىنىقى ئارقىلىق باشلاش بەلگىسى (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT)، توختىتىش بەلگىسى (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ۋە ئارقا كۆرۈنۈش قىستۇرمىسى (CCCTGCAGGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) غا تەرتىپلىك ماسلاشتۇرۇلدى. ھەر بىر ماسلاشتۇرۇشتا 2 گىچە ماس كەلمەسلىككە يول قويۇش31. شۇڭا، باشلاش ۋە توختىتىش بەلگىسى يوق ئوقۇشلار ۋە ئارقا كۆرۈنۈش قىستۇرمىسى بار ئوقۇشلار، يەنى رۇخسەت قىلىنغان ماس كەلمەسلىك سانىدىن ئېشىپ كەتكەن ماسلاشتۇرۇشلار كۈتۈپخانىدىن ئۆچۈرۈلدى. قالغان ئوقۇشلارغا كەلسەك، باشلىنىش بەلگىسىدىن باشلاپ توختاپ قېلىش بەلگىسى دەسلەپكى ئوقۇش تەرتىپىدىن چىقىرىۋېتىلىپ، تېخىمۇ پىششىقلاپ ئىشلەنگەنگە قەدەر ئاخىرلىشىدىغان N-mer DNA تەرتىپى (بۇنىڭدىن كېيىن «كىرىش» دەپ ئاتىلىدۇ). قىستۇرما تەرجىمە قىلىنغاندىن كېيىن، باشلانغۇچنىڭ 5' ئۇچىدىكى تۇنجى توختاپ قېلىش كودونىدىن كېيىنكى قىسىم قىستۇرما سىرتىدا چىقىرىۋېتىلىدۇ. بۇنىڭدىن باشقا، باشلانغۇچنىڭ 3' ئۇچىدىكى تولۇقسىز كودونلارغا ئېلىپ بارىدىغان نۇكلېئوتىدلارمۇ چىقىرىۋېتىلدى. پەقەت ئارقا كۆرۈنۈش تەرتىپىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان قىستۇرمىلارنى چىقىرىۋېتىش ئۈچۈن، ئامىنو كىسلاتاسى شەكلى «PAG» بىلەن باشلانغان تەرجىمە قىلىنغان قىستۇرمىلارمۇ چىقىرىۋېتىلدى. كۆچۈرمىدىن كېيىنكى ئۇزۇنلۇقى 3 ئامىنو كىسلاتاسىدىن تۆۋەن بولغان پېپتىدلار كۈتۈپخانىدىن چىقىرىۋېتىلدى. ئاخىرىدا، قىستۇرما كۆلچىكىدىكى ئارتۇقچىلىقنى چىقىرىۋېتىپ، ھەر بىر ئۆزگىچە قىستۇرمىنىڭ چاستوتىسىنى بېكىتىڭ. بۇ ئانالىزنىڭ نەتىجىسى نۇكلېئوتىد تەرتىپى (كىرىش) ۋە ئۇلارنىڭ (ئوقۇش) چاستوتىسىنىڭ تىزىملىكىنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ (قوشۇمچە رەسىملەر 1c ۋە 2).
N-mer گۇرۇپپىسىدىكى DNA قىستۇرمىلىرى تەرتىپ ئوخشاشلىقى بويىچە: 454/Roche غا خاس تەرتىپ خاتالىقلىرىنى (مەسىلەن، تەرتىپلىك گوموپولىمېر كېڭەيتىلمىلىرىدىكى مەسىلىلەر) يوقىتىش ۋە ئانچە مۇھىم بولمىغان ئارتۇقچىلىقلارنى يوقىتىش ئۈچۈن، ئىلگىرى سۈزۈلگەن N-mer DNA تەرتىپ قىستۇرمىلىرى (قوشۇمچىلار) ئوخشاشلىق بويىچە تۈرگە ئايرىلىدۇ. قىستۇرمىلار (2 گىچە ماس كەلمەيدىغان ئاساسقا يول قويۇلىدۇ) تۆۋەندىكىدەك ئېنىقلانغان تەكرارلىنىش ئالگورىزىم ئارقىلىق: قىستۇرمىلار ئالدى بىلەن چاستوتىسى (ئەڭ يۇقىرىسىدىن ئەڭ تۆۋەنگىچە) بويىچە تۈرگە ئايرىلىدۇ، ئەگەر ئۇلار ئوخشاش بولسا، ئۇزۇنلۇقى بويىچە ئىككىنچى دەرىجىلىك تۈرگە ئايرىلىدۇ (ئەڭ ئۇزۇنىدىن ئەڭ قىسقاسىغا)). شۇڭا، ئەڭ كۆپ ۋە ئەڭ ئۇزۇن قىستۇرمىلار بىرىنچى «گۇرۇپپا» نى بەلگىلەيدۇ. گۇرۇپپا چاستوتىسى ئاچقۇچ چاستوتىسى قىلىپ تەڭشىلىنىدۇ. ئاندىن، تۈرگە ئايرىلغان تىزىملىكتە قالغان ھەر بىر قىستۇرما جۈپ-جۈپ Needleman-Wunsch تەڭشەش ئارقىلىق گۇرۇپپىغا قوشۇلۇشقا ئۇرۇنۇلدى. ئەگەر تەڭشەشتىكى ماس كەلمەسلىك، كىرگۈزۈش ياكى ئۆچۈرۈش سانى 2 دىن ئېشىپ كەتمىسە، گۇرۇپپىغا بىر قىستۇرما قوشۇلىدۇ، ۋە ئومۇمىي گۇرۇپپا چاستوتىسى قوشۇش قېتىم سانىغا ئاساسەن ئاشۇرۇلىدۇ. بىر گۇرۇپپىغا قوشۇلغان قىستۇرمىلار ئىشلىتىلگەن دەپ بەلگىلىنىدۇ ۋە كېيىنكى بىر تەرەپ قىلىشتىن چىقىرىۋېتىلىدۇ. ئەگەر قىستۇرۇش تەرتىپىنى مەۋجۇت بولغان گۇرۇپپىغا قوشۇشقا بولمىسا، قىستۇرۇش تەرتىپى ماس كېلىدىغان قىستۇرۇش چاستوتىسى بىلەن يېڭى گۇرۇپپا قۇرۇشقا ئىشلىتىلىدۇ ۋە ئىشلىتىلگەن دەپ بەلگىلىنىدۇ. ھەر بىر قىستۇرۇش تەرتىپى يېڭى گۇرۇپپا قۇرۇشقا ئىشلىتىلگەندە ياكى مەۋجۇت بولغان گۇرۇپپىغا كىرگۈزۈلگەندە، بۇ تەكرارلاش ئاخىرلىشىدۇ. ئاخىرىدا، نۇكلېئوتىدلاردىن تەركىب تاپقان گۇرۇپپىلانغان قىستۇرۇشلار ئاخىرىدا پېپتىد تىزىملىكىگە (پېپتىد كۈتۈپخانىسى) ئايلاندۇرۇلىدۇ. بۇ ئانالىزنىڭ نەتىجىسى بىر يۈرۈش قىستۇرۇشلار ۋە ئۇلارغا ماس كېلىدىغان چاستوتىلار بولۇپ، ئۇلار ئارقا-ئارقىدىن ئوقۇش سانىنى تەشكىل قىلىدۇ (قوشۇمچە رەسىم 2).
موتىف ھاسىل قىلىش: ئۆزگىچە پېپتىدلار تىزىملىكىگە ئاساسەن، تۆۋەندە كۆرسىتىلگەندەك، بارلىق مۇمكىن بولغان ئامىنو كىسلاتا شەكىللىرىنى (aa) ئۆز ئىچىگە ئالغان بىر كۈتۈپخانا قۇرۇلدى. 3 ئۇزۇنلۇقتىكى ھەر بىر مۇمكىن بولغان شەكىل پېپتىدتىن ئېلىندى ۋە ئۇنىڭ تەتۈر شەكلى بارلىق شەكىللەرنى (ترىپېپتىدلارنى) ئۆز ئىچىگە ئالغان ئورتاق موتىف كۈتۈپخانىسى بىلەن بىللە قوشۇلدى. تەكرارلىنىدىغان موتىفلارنىڭ كۈتۈپخانىلىرى تەرتىپلەندى ۋە ئارتۇقچىلىق چىقىرىۋېتىلدى. ئاندىن، موتىف كۈتۈپخانىسىدىكى ھەر بىر ترىپېپتىد ئۈچۈن، بىز ھېسابلاش قوراللىرى ئارقىلىق كۈتۈپخانىدا بار-يوقلۇقىنى تەكشۈردۇق. بۇ ئەھۋالدا، تېپىلغان موتىف ترىپېپتىدنى ئۆز ئىچىگە ئالغان پېپتىدنىڭ چاستوتىسى قوشۇلىدۇ ۋە موتىف كۈتۈپخانىسىدىكى موتىفقا («موتىف سانى») بېرىلىدۇ. موتىف ھاسىل قىلىشنىڭ نەتىجىسى ترىپېپتىدلارنىڭ (موتىفلارنىڭ) بارلىق كۆرۈنۈشلىرىنى ۋە ئۇلارنىڭ ئايرىم قىممەتلىرىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئىككى ئۆلچەملىك قاتار بولۇپ، بۇ ئوقۇشلار سۈزۈلگەن، گۇرۇپپىلانغان ۋە تەرجىمە قىلىنغاندا ماس كېلىدىغان موتىفنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدىغان تەرتىپلىك ئوقۇش سانى. يۇقىرىدا تەپسىلىي بايان قىلىنغان ئۆلچەملەر.
موتىف سانى ۋە ئۇنىڭغا ماس كېلىدىغان تارقاقلىق سىزىقلىرىنى نورماللاشتۇرۇش: ھەر بىر ئەۋرىشكە ئۈچۈن موتىف سانى تۆۋەندىكى ئۇسۇل ئارقىلىق نورماللاشتۇرۇلدى
بۇ يەردە ni بولسا i تېمىسىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئوقۇش سانى. شۇڭا، vi ئۈلگە ئىچىدىكى i موتىفىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان ئوقۇش (ياكى پېپتىد) نىڭ پىرسەنتلىك قېتىم سانىنى كۆرسىتىدۇ. نورماللاشتۇرۇلمىغان موتىف سانىنىڭ P قىممىتى فىشېرنىڭ ئېنىق سىنىقى ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ. موتىف سانىنىڭ كوررېلوگرافىيەسىگە كەلسەك، سپېرماننىڭ باغلىنىشى R بىلەن نورماللاشتۇرۇلغان موتىف سانى ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ.
پېپتىد كۈتۈپخانىسىدىكى ھەر بىر ئورۇندىكى ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ مىقدارىنى كۆرسىتىش ئۈچۈن، 32، 33-تور بەلگىسى (http://weblogo.threeplusone.com) ياسالدى. ئالدى بىلەن، 12-مېر پېپتىدنىڭ ھەر بىر ئورنىدىكى ئامىنو كىسلاتاسىنىڭ مىقدارى 20×12 ماترىتسىسىغا ساقلىنىدۇ. ئاندىن، ھەر بىر ئورۇندا ئوخشاش نىسپىي ئامىنو كىسلاتاسى مىقدارىنى ئۆز ئىچىگە ئالغان 1000 پېپتىد توپلىمى fasta-sequence فورماتىدا ھاسىل قىلىنىپ، تور بەلگىسى 3 گە كىرگۈزۈلىدۇ، بۇ تور بەلگىسى 3 گە كىرگۈزۈلىدۇ، بۇ بېرىلگەن پېپتىد كۈتۈپخانىسى ئۈچۈن ھەر بىر ئورۇندىكى نىسپىي ئامىنو كىسلاتاسى مىقدارىنىڭ گرافىك ئىپادىسىنى ھاسىل قىلىدۇ. كۆپ ئۆلچەملىك سانلىق مەلۇماتلار توپلىمىنى كۆرسىتىش ئۈچۈن، R دىكى ئىچكى جەھەتتىن تەرەققىي قىلدۇرۇلغان قورال (biosHeatmap، ھازىرغىچە تارقىتىلمىغان R بولىقى) ئارقىلىق ئىسسىقلىق خەرىتىلىرى ياسالدى. ئىسسىقلىق خەرىتىلىرىدە كۆرسىتىلگەن دېندروگراممىلار ۋاردنىڭ ئىئېۋكلىد ئارىلىق ئۆلچىمى بىلەن ئىئېۋكلىد ئارىلىقى مېترىكىسى ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ. موتىپ نومۇرلاش سانلىق مەلۇماتلىرىنىڭ ستاتىستىكىلىق ئانالىزى ئۈچۈن، نورمالسىز نومۇرلاش ئۈچۈن P قىممىتى فىشېرنىڭ ئېنىق سىنىقى ئارقىلىق ھېسابلىنىدۇ. باشقا سانلىق مەلۇماتلار توپلىمىنىڭ P قىممىتى ئوقۇغۇچىلارنىڭ t-سىناق سىنىقى ياكى ANOVA ئارقىلىق R دا ھېسابلىنىدۇ.
تاللانغان فاگ كىلونلىرى ۋە قىستۇرۇلمىغان فاگلار قۇيرۇق ۋېناسى ئارقىلىق تومۇرغا ئوكۇل قىلىندى (300 μl PBS دا ھەر بىر ھايۋانغا 2×1010 فاگ). قان بىلەن تەمىنلەش ۋە كېيىنكى بېكىتىشتىن ئون مىنۇت بۇرۇن، ئوخشاش ھايۋانلارغا 100 μl DyLight594 بەلگىسى بار لېكتىن (Vector Laboratories Inc., DL-1177) تومۇرغا ئوكۇل قىلىندى. فاگ ئوكۇل قىلىنغاندىن 60 مىنۇت كېيىن، كاللارغا 50 مىللىلىتىر PBS بىلەن يۈرەك ئارقىلىق قان بىلەن تەمىنلەش ئېلىپ بېرىلدى، ئاندىن 50 مىللىلىتىر 4% PFA/PBS قوشۇلدى. مېڭە ئەۋرىشكىلىرى قوشۇمچە 4% PFA/PBS دا بىر كېچە تۇرغۇزۇلدى ۋە 4 سېلسىيە گرادۇستا 30% ساخاروزاغا بىر كېچە چىلاندى. ئەۋرىشكىلەر OCT ئارىلاشمىسىدا توڭلىتىلدى. توڭلىتىلغان ئەۋرىشكىلەرنىڭ ئىممۇنوگىستوخىمىيىلىك ئانالىزى ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 30 µm كرىيوسېكسىيە ئۈستىدە %1 BSA بىلەن توسۇلۇپ، 4 سېلسىيە گرادۇستا T7 فاگىغا (Novus NB 600-376A) قارشى پولىكلونال FITC بەلگىسى قويۇلغان ئانتىتېلا بىلەن ئىنكۇباتسىيە قىلىندى. بىر كېچە ئىنكۇباتسىيە قىلىندى. ئاخىرىدا، بۇ پارچىلار PBS بىلەن 3 قېتىم يۇيۇلۇپ، كونفوكال لازېرلىق مىكروسكوپ (Leica TCS SP5) بىلەن تەكشۈرۈلدى.
ئەڭ تۆۋەن ساپلىقى %98 بولغان بارلىق پېپتىدلار GenScript USA تەرىپىدىن بىرىكتۈرۈلۈپ، بىئوتىنلىنىپ ۋە لىئوفىللاشتۇرۇلۇپ ياسالغان. بىئوتىن N ئۇچىدىكى قوشۇمچە ئۈچ گلىتسىن ئارىلىقى ئارقىلىق باغلىنىدۇ. ماسسا سپېكترومېتىرىيەسى ئارقىلىق بارلىق پېپتىدلارنى تەكشۈرۈڭ.
سترېپتاۋىدىن (Sigma S0677) بىئوتىنلانغان پېپتىدنىڭ 5 ھەسسىلىك ئېكۋىمولار ئارتۇق مىقدارى، بىئوتىنلانغان BACE1 چەكلىگۈچى پېپتىد ياكى بىئوتىنلانغان BACE1 چەكلىگۈچى پېپتىد ۋە BACE1 چەكلىگۈچى پېپتىدنىڭ بىرىكمىسى (3:1 نىسبەت) بىلەن 5-10% DMSO دا ئارىلاشتۇرۇلۇپ، PBS دا ئىنكۇباتسىيە قىلىندى. ئوكۇل قىلىشتىن 1 سائەت بۇرۇن ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا تۇرغۇزۇلدى. سترېپتاۋىدىن بىلەن بىرىككەن پېپتىدلار مېڭە بوشلۇقى بار كاللارنىڭ قۇيرۇق تومۇرلىرىنىڭ بىرىگە 10 مىللىگرام/كىلوگرام مىقداردا تومۇرغا ئوكۇل قىلىندى.
سترېپتاۋىدىن-پېپتىد بىرىكمىلىرىنىڭ قويۇقلۇقى ELISA ئارقىلىق باھالانغان. Nunc Maxisorp مىكروتىتر تاختىلىرى (Sigma) 4 سېلسىيە گرادۇستا بىر كېچە 1.5 μg/ml چاشقاننىڭ سترېپتاۋىدىنغا قارشى ئانتىتېلاسى (Thermo, MA1-20011) بىلەن قاپلانغان. توسۇش (توسۇقلاش بۇفېرى: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% جېلاتىن, 1% BSA) ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 2 سائەت ساقلانغاندىن كېيىن، تاختىنى 0.05% Tween-20/PBS (يۇيۇش بۇفېرى) بىلەن 3 سېكۇنت يۇيۇڭ، CSF ۋە پلازما ئەۋرىشكىلىرى توسۇش بۇفېرى (پلازما 1:10,000, CSF 1:115) بىلەن سۇيۇلدۇرۇلغان قۇدۇقلارغا قوشۇلدى. ئاندىن تاختىنى بايقاش ئانتىتېلاسى (1 μg/ml, سترېپتاۋىدىنغا قارشى HRP, Novus NB120-7239) بىلەن 4 سېلسىيە گرادۇستا بىر كېچە قويۇپ قويدۇق. ئۈچ قېتىملىق يۇيۇش باسقۇچىدىن كېيىن، سترېپتاۋىدىن TMB سۇبسترات ئېرىتمىسى (Roche) دا 20 مىنۇتقىچە تۇرغۇزۇش ئارقىلىق بايقالغان. 1M H2SO4 بىلەن رەڭ ئۆزگىرىشىنى توختاتقاندىن كېيىن، 450 نانومېتىردىكى سۈمۈرگۈچلۈكنى ئۆلچەڭ.
سترېپتاۋىدىن-پېپتىد-BACE1 چەكلىگۈچى مۇرەككەپ ماددىسىنىڭ فۇنكسىيەسى ئىشلەپچىقارغۇچىنىڭ قائىدىسىگە (Wako, 294-64701) ئاساسەن Aβ(1-40) ELISA ئارقىلىق باھالانغان. قىسقىسى، CSF ئەۋرىشكىلىرى ئۆلچەملىك سۇيۇقلۇقتا (1:23) سۇيۇلدۇرۇلۇپ، BNT77 تۇتۇش ئانتىتېلاسى بىلەن قاپلانغان 96 قۇدۇقلۇق تاختىلاردا 4 سېلسىيە گرادۇستا بىر كېچە تۇرغۇزۇلغان. بەش قېتىملىق يۇيۇش باسقۇچىدىن كېيىن، HRP بىلەن بىرلەشتۈرۈلگەن BA27 ئانتىتېلاسى قوشۇلۇپ، 4 سېلسىيە گرادۇستا 2 سائەت تۇرغۇزۇلغان، ئاندىن بەش قېتىملىق يۇيۇش باسقۇچى قىلىنغان. Aβ(1–40) ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 30 مىنۇت TMB ئېرىتمىسىدە تۇرغۇزۇش ئارقىلىق بايقالغان. رەڭ تەرەققىياتى توختىتىش ئېرىتمىسى بىلەن توختىتىلغاندىن كېيىن، 450 nm دا سۈمۈرۈلۈشىنى ئۆلچەڭ. پلازما ئەۋرىشكىلىرى Aβ(1–40) ELISA دىن بۇرۇن قاتتىق باسقۇچلۇق ئايرىشقا ئۇچرىغان. پلازما 96 قۇدۇقلۇق تاختىلاردا %0.2 DEA (Sigma) غا قوشۇلۇپ، ئۆي تېمپېراتۇرىسىدا 30 مىنۇت تۇرغۇزۇلغان. SPE تاختىلىرىنى (Oasis, 186000679) سۇ ۋە %100 مېتانول بىلەن ئارقا-ئارقىدىن يۇيغاندىن كېيىن، پلازما ئەۋرىشكىلىرى SPE تاختىلىرىغا قوشۇلدى ۋە بارلىق سۇيۇقلۇق چىقىرىۋېتىلدى. ئەۋرىشكىلەر يۇيۇلۇپ (ئالدى بىلەن %5 مېتانول، ئاندىن %30 مېتانول بىلەن)، ئاندىن %2 NH4OH/%90 مېتانول بىلەن ئېلىيۇت قىلىندى. ئېلىيۇاتنى 55 سېلسىيە گرادۇستا 99 مىنۇت مۇقىم N2 توكىدا قۇرۇتقاندىن كېيىن، ئەۋرىشكىلەر ئۆلچەملىك ئېرىتكۈچىلەردە ئازايتىلدى ۋە Aβ(1–40) يۇقىرىدا دېيىلگەندەك ئۆلچەندى.
بۇ ماقالىنى قانداق نەقىل كەلتۈرۈش كېرەك: ئۇرىچ، ئې. قاتارلىقلار. تىرىك جانلىقلاردا بايقالغان ئۆتكۈنچى پېپتىدلار ئارقىلىق مېڭىگە يۈك يەتكۈزۈش. پەن. 5، 14104؛ doi:10.1038/srep14104 (2015).
لىخوتا ج.، سكجوررىنگې ت.، تومسېن LB ۋە موس ت. نىشانلىق داۋالاش ئۇسۇلى ئارقىلىق مېڭىگە ماكرومولېكۇلا دورىلىرىنى يەتكۈزۈش. نېرۋا خىمىيەسى ژۇرنىلى 113، 1–13، 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., ۋە Martinez-Martinez, P. قان-مېڭە توسۇقى ئارقىلىق پېپتىد ۋە ئاقسىل دورىلىرىنى يەتكۈزۈش. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
پاردرىج، WM قان-مېڭە توسۇقى: مېڭە دورىلىرىنى تەرەققىي قىلدۇرۇشتىكى توسالغۇ. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, ۋە Byrd, A. دورا يەتكۈزۈشنى ياخشىلاش ۋە خوروئىد پىلېكسۇس-CSF يولى ئارقىلىق مېڭىگە نىشانلىق يەتكۈزۈشنىڭ ئىستىقبالى. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
پاردرىج، WM مېڭە يەتكۈزۈش ئۈچۈن مولېكۇلا ترويا ئاتلىرى بىلەن بىئو دورىلارنى زامانىۋىلاشتۇرۇش. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
پاردرىج، WM رېتسېپتورى ئارقىلىق قان-مېڭە توسۇقى ئارقىلىق پېپتىد توشۇش. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. قاتارلىقلار. مونوۋالېنتلىق مولېكۇلالىق سىملار ئارقىلىق مېڭە سىڭىپ كىرىشىنى ۋە داۋالاش ئانتىتېلاسىنىڭ ئۈنۈمىنى ئاشۇرۇش. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
بىئېن-لى، ن. قاتارلىقلار. ترانسفېررىن رېتسېپتورى (TfR) نىڭ توشۇلىشى TfR ئانتىتېلاسىنىڭ يېقىنلىشىش ۋارىيانتلىرىنىڭ مېڭىگە قوبۇل قىلىنىشىنى بەلگىلەيدۇ. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).