Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን። ውስን የCSS ድጋፍ ያለው የአሳሽ ስሪት እየተጠቀሙ ነው። ለተሻለ ተሞክሮ፣ የዘመነ አሳሽ እንዲጠቀሙ እንመክራለን (ወይም በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር ውስጥ የተኳኋኝነት ሁነታን እንዲያሰናክሉ)። በተጨማሪም፣ ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ፣ ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናሳያለን።
በአንድ ጊዜ የሶስት ስላይዶችን መዘውር ያሳያል። በአንድ ጊዜ ሶስት ስላይዶችን ለማለፍ የቀዳሚ እና የቀጣይ አዝራሮችን ይጠቀሙ፣ ወይም በአንድ ጊዜ ሶስት ስላይዶችን ለማለፍ በመጨረሻው ላይ ያሉትን የተንሸራታች አዝራሮች ይጠቀሙ።
የደም-አንጎል እንቅፋት እና የደም-አንጎል እንቅፋት ባዮቴራፒዩቲክ ወኪሎች በማዕከላዊው የነርቭ ሥርዓት ውስጥ ግባቸውን እንዳያሳኩ ይከላከላሉ፣ በዚህም የነርቭ በሽታዎችን ውጤታማ ሕክምና እንቅፋት ሆኗል። አዳዲስ የአንጎል አጓጓዦችን በቪቮ ውስጥ ለማግኘት፣ የT7 ፋጅ ፔፕታይድ ቤተ-መጽሐፍትን አስተዋውቀናል እና በተከታታይ የተሰበሰበ ደም እና ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (CSF) በካንኑላይዝድ ንቃተ ህሊና ያለው ትልቅ ገንዳ ሞዴል አይጦችን በመጠቀም። የተወሰኑ የፋጅ ክሎኖች ከአራት ዙር ምርጫ በኋላ በCSF ውስጥ በጣም የበለፀጉ ነበሩ። የግለሰብ እጩ ፔፕታይዶች ምርመራ በCSF ውስጥ ከ1000 እጥፍ በላይ ማበልጸግ አሳይቷል። የፔፕታይድ-መካከለኛ አቅርቦት ወደ አንጎል የባዮአክቲቭነት የተረጋገጠው ከተለየው አዲስ ትራንዚት ፔፕታይድ ጋር የተገናኘ BACE1 ፔፕታይድ አጋች በመጠቀም በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ ያለውን የአሚሎይድ-β መጠን በ40% በመቀነስ ነው። እነዚህ ውጤቶች እንደሚያመለክቱት በቪቮ ፋጅ የምርጫ ዘዴዎች የሚለዩት ፔፕታይዶች ማክሮሞለኪውሎችን ወደ አንጎል በስርዓት ለማድረስ ጠቃሚ ተሽከርካሪዎች ሊሆኑ ይችላሉ፣ ይህም የሕክምና ውጤት አለው።
የማዕከላዊ የነርቭ ሥርዓት (CNS) የታለመ የሕክምና ምርምር በአብዛኛው ትኩረት ያደረገው በCNS ላይ ያነጣጠሩ የተመቻቹ መድኃኒቶችን እና ወኪሎችን በመለየት ላይ ሲሆን፣ ንቁ የመድኃኒት አቅርቦትን ወደ አንጎል የሚያመሩ ዘዴዎችን ለማግኘት ብዙም ጥረት አላደረጉም። ይህ አሁን መለወጥ እየጀመረ ነው ምክንያቱም የመድኃኒት አቅርቦት፣ በተለይም ትላልቅ ሞለኪውሎች፣ የዘመናዊ የነርቭ ሳይንስ መድኃኒት ልማት ዋና አካል ነው። የማዕከላዊው የነርቭ ሥርዓት አካባቢ በደም-አንጎል መከላከያ ስርዓት (BBB) ​​እና የደም-አንጎል መከላከያ (BCBB)1ን ባካተተው ሴሬብሮቫስኩላር መከላከያ ስርዓት በደንብ የተጠበቀ ሲሆን ይህም መድኃኒቶችን ወደ አንጎል ማድረስ ፈታኝ ያደርገዋል1,2። ሁሉም ማለት ይቻላል ትላልቅ ሞለኪውሎች መድኃኒቶች እና ከ98% በላይ የሚሆኑት ትናንሽ ሞለኪውሎች መድኃኒቶች ከአእምሮ ይወገዳሉ ተብሎ ይገመታል። ለዚህም ነው ውጤታማ እና ልዩ የሕክምና መድኃኒቶችን ወደ CNS 4,5 የሚያደርሱ አዳዲስ የአንጎል ትራንስፖርት ስርዓቶችን መለየት በጣም አስፈላጊ የሆነው። ሆኖም፣ BBB እና BCSFB በሰፊው የደም ሥር ውስጥ ዘልቀው በመግባት ወደ አንጎል ሁሉንም መዋቅሮች ስለሚገቡ ለመድኃኒት አቅርቦት በጣም ጥሩ አጋጣሚ ይሰጣሉ። ስለዚህ፣ ወደ አንጎል የማድረስ ወራሪ ያልሆኑ ዘዴዎችን ለመጠቀም የሚደረጉት የአሁኑ ጥረቶች በአብዛኛው የተመሰረቱት ኢንዶጀንታል BBB6 ተቀባይን በመጠቀም በተቀባይ-መካከለኛ ትራንስፖርት (PMT) ዘዴ ላይ ነው። በቅርብ ጊዜ የትራንስፈርሪን ተቀባይ መንገድ7,8ን በመጠቀም ቁልፍ እድገቶች ቢኖሩም፣ የተሻሻሉ ባህሪያት ያላቸው አዳዲስ የማድረስ ስርዓቶች ተጨማሪ ልማት ያስፈልጋል። ለዚህም ዓላማችን የሲኤስኤፍ ትራንስፖርትን ለማስታረቅ የሚችሉ ፔፕታይዶችን መለየት ነበር፣ ምክንያቱም በመርህ ደረጃ ማክሮሞለኪሎችን ወደ ሲኤንኤስ ለማድረስ ወይም አዳዲስ የተቀባዮች መንገዶችን ለመክፈት ሊያገለግሉ ይችላሉ። በተለይም፣ የተወሰኑ የሴሬብሮቫስኩላር ሲስተም (ቢቢቢ እና ቢኤስሲኤፍቢ) ተቀባዮች እና አጓጓዦች ለባዮቴራፒ መድኃኒቶች ንቁ እና ልዩ አቅርቦት ሊሆኑ የሚችሉ ኢላማዎች ሊሆኑ ይችላሉ። ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (ሲኤስኤፍ) የቾሮይድ ፕሌክስ (ሲኤስ) ሚስጥራዊ ምርት ሲሆን በሱባራችኖይድ ቦታ እና በአንጎል ventricular space4 በኩል ከአንጎል ኢንተርስቲቲየም ፈሳሽ ጋር በቀጥታ ይገናኛል። በቅርቡ የሱባራችኖይድ ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ወደ አንጎል ኢንተርስቲቲየም9 ከመጠን በላይ እንደሚሰራጭ ታይቷል። ይህንን የሱባራክኖይድ ኢንፍሉዌንዛ ትራክት በመጠቀም ወይም በቀጥታ በቢቢቢ በኩል የፓረንቺማል ቦታን ለመድረስ ተስፋ እናደርጋለን። ይህንን ለማሳካት፣ በእነዚህ ሁለት የተለያዩ መንገዶች የሚጓጓዙትን ፔፕታይዶችን በምርጥ ሁኔታ የሚለይ ጠንካራ የኢንቪቮ ፋጅ ምርጫ ስትራቴጂ ተግባራዊ አድርገናል።
አሁን ከፍተኛ የቤተ-መጻሕፍት ልዩነት ያላቸውን የመጀመሪያ የምርጫ ዙሮችን ለመከታተል የሲኤስኤፍ ናሙናን ከከፍተኛ የመተላለፊያ ቅደም ተከተል (HTS) ጋር በማጣመር ተከታታይ የሆነ የኢንቪቮ ፋጅ ማሳያ የማጣሪያ ዘዴን እንገልፃለን። የደም ብክለትን ለማስወገድ በቋሚነት የተተከለ ትልቅ ሲስተርና (CM) ካኑላ ባላቸው ንቃተ-ህሊና ያላቸው አይጦች ላይ ምርመራ ተካሂዷል። በአስፈላጊ ሁኔታ፣ ይህ አካሄድ የአንጎል ኢላማ ማድረግን እና በሴሬብሮቫስኩላር መከላከያ በኩል የትራንስፖርት እንቅስቃሴ ያላቸውን ፔፕታይዶችን ይመርጣል። በትንሽ መጠናቸው (~60 nm)10 ምክንያት T7 ፋጆችን ተጠቅመናል እና የኢንቲዶሊያ እና/ወይም የኤፒተልየል-ሜዱላ መከላከያን ትራንስሴሉላር እንዲሻገሩ የሚያስችሉ ቬሲክልዎችን ለማጓጓዝ ተስማሚ እንደሆኑ ጠቁመናል። ከአራት ዙር ፓኒንግ በኋላ፣ የፋጅ ህዝቦች ጠንካራ ኢንቪቮ CSF ​​ማበልጸጊያ እና የአንጎል ማይክሮቬሰል ትስስር አሳይተዋል። ከሁሉም በላይ፣ የተመረጡት እና በኬሚካል የተዋሃዱ ምርጥ እጩ ፔፕታይዶች የፕሮቲን ጭነትን ወደ ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ማጓጓዝ እንደሚችሉ በማሳየት ግኝቶቻችንን ማረጋገጥ ችለናል። በመጀመሪያ፣ የCNS ፋርማኮዳይናሚክ ውጤቶች የተቋቋሙት ግንባር ቀደም የመጓጓዣ ፔፕታይድ ከBACE1 ፔፕታይድ አጋቾች ጋር በማጣመር ነው። በቪቮ ውስጥ ተግባራዊ የማጣሪያ ስልቶች አዳዲስ የአንጎል ትራንስፖርት ፔፕታይዶችን እንደ ውጤታማ የፕሮቲን ጭነት ተሸካሚዎች መለየት እንደሚችሉ ከማሳየታችን በተጨማሪ፣ ተመሳሳይ ተግባራዊ የምርጫ አቀራረቦች አዳዲስ የአንጎል ትራንስፖርት መንገዶችን በመለየት ረገድም አስፈላጊ እንደሚሆኑ እንጠብቃለን።
በፕላክ-ፎርሚንግ አሃዶች (PFU) ላይ በመመስረት፣ ከፋጅ ማሸጊያ ደረጃ በኋላ፣ በግምት 109 የሚሆኑ የተለያዩ የዘፈቀደ 12-ሜር መስመራዊ T7 ፋጅ ፔፕታይዶች ቤተ-መጽሐፍት የተነደፈ እና የተፈጠረ ነው (ቁሳቁሶችን እና ዘዴዎችን ይመልከቱ)። ይህንን ቤተ-መጽሐፍት ከኢንቪቮ ፓንኒንግ በፊት በጥንቃቄ መተንተን እንዳለብን ልብ ማለት ያስፈልጋል። በቀጥታ ለኤችቲኤስ (ኤችቲኤስ) የሚተገበሩ የተሻሻሉ ፕሪመሮችን በመጠቀም የፋጅ ቤተ-መጽሐፍት ናሙናዎችን PCR ማጉላት (ተጨማሪ ምስል 1a)። ሀ) የኤችቲኤስ11 ቅደም ተከተል ስህተቶች፣ ለ) በፕሪመሮች ጥራት ላይ ባለው ተጽእኖ (NNK)1-12፣ እና ሐ) በተጠባባቂ ቤተ-መጽሐፍት ውስጥ የዱር-አይነት (wt) ፋጅ (የአጽም ማስገቢያዎች) መኖር፣ የተረጋገጡ የቅደም ተከተል መረጃዎችን ብቻ ለማውጣት የቅደም ተከተል ማጣሪያ ሂደት ተተግብሯል (ተጨማሪ ምስል 1ለ)። እነዚህ የማጣሪያ ደረጃዎች ለሁሉም የኤችቲኤስ ቅደም ተከተል ቤተ-መጽሐፍት ተፈጻሚ ይሆናሉ። ለመደበኛ ቤተ-መጽሐፍት፣ በአጠቃላይ 233,868 ንባቦች ተገኝተዋል፣ ከእነዚህም ውስጥ 39% የማጣሪያ መስፈርቱን አልፈዋል እና ለቀጣይ ዙሮች ለቤተ-መጽሐፍት ትንተና እና ምርጫ ጥቅም ላይ ውለዋል (ተጨማሪ ምስል 1c–e)። ንባቦቹ በዋናነት 3 የመሠረት ጥንዶች ርዝመት ያላቸው ሲሆን ከፍተኛው 36 ኑክሊዮታይዶች ነበሩ (ተጨማሪ ምስል 1c)፣ ይህም የቤተ-መጽሐፍት ዲዛይን (NNK) 1-12ን ያረጋግጣል። በተለይም፣ በግምት 11% የሚሆኑት የቤተ-መጽሐፍት አባላት 12-ልኬት የዱር-አይነት (wt) የጀርባ አጥንት PAGISRELVDKL ማስገቢያ ይይዛሉ፣ እና ከቅደም ተከተሎቹ ውስጥ ግማሽ ያህሉ (49%) ማስገቢያዎችን ወይም ስረዛዎችን ይይዛሉ። የቤተ-መጽሐፍት ቤተ-መጽሐፍት HTS በቤተ-መጽሐፍት ውስጥ ከፍተኛ የፔፕታይዶች ልዩነት አረጋግጧል፡ ከ81% በላይ የሚሆኑት የፔፕታይድ ቅደም ተከተሎች አንድ ጊዜ ብቻ ተገኝተዋል እና 1.5% ብቻ በ≥4 ቅጂዎች ተከስተዋል (ተጨማሪ ምስል 2a)። በሪፖርቱ ውስጥ ባሉ 12ቱም ቦታዎች ላይ የሚገኙት የአሚኖ አሲዶች (aa) ድግግሞሽ በተበላሸው የNKK ሪፖርቱ የሚመነጩትን የኮዶኖች ብዛት ከሚጠበቀው ድግግሞሽ ጋር በጥሩ ሁኔታ ይዛመዳል (ተጨማሪ ምስል 2ለ)። በእነዚህ ማስገቢያዎች የተመዘገቡት የ aa ቅሪቶች ድግግሞሽ ከተሰላው ድግግሞሽ ጋር በጥሩ ሁኔታ ይዛመዳል (r = 0.893) (ተጨማሪ ምስል 2c)። የ phage ቤተ-መጻሕፍት ለመርፌ ማዘጋጀት የኢንዶቶክሲን ማጉላት እና ማስወገድ ደረጃዎችን ያካትታል። ይህ ቀደም ሲል የ phage ቤተ-መጻሕፍት ልዩነትን ሊቀንስ እንደሚችል ታይቷል12,13። ስለዚህ፣ የኢንዶቶክሲን መወገድ የተደረገበትን የፕላት-አምፕሊፋይድ ፋጅ ቤተ-መጻሕፍት ቅደም ተከተል አድርገን የኢንዶቶክሲን ድግግሞሽ ለመገመት ከመጀመሪያው ቤተ-መጻሕፍት ጋር አነጻጽረነዋል። በዋናው ገንዳ እና በተጨመረው እና በተጣራ ገንዳ መካከል ጠንካራ ትስስር (r = 0.995) ታይቷል (ተጨማሪ ምስል 2d)፣ ይህም T7 ፋጅን በመጠቀም በፕላቶች ላይ በተጨመሩ ክሎኖች መካከል ያለው ውድድር ከፍተኛ አድልዎ እንዳላመጣ ያሳያል። ይህ ንጽጽር በእያንዳንዱ ቤተ-መጽሐፍት ውስጥ ባለው የትሪፔፕታይድ ሞቲፎች ድግግሞሽ ላይ የተመሠረተ ነው፣ ምክንያቱም የቤተ-መጻሕፍት ልዩነት (~109) በኤችቲኤስ እንኳን ሙሉ በሙሉ ሊቀረጽ አይችልም። በእያንዳንዱ ቦታ ላይ የ aa ድግግሞሽ ትንተና በገባው ሪፖርተር የመጨረሻዎቹ ሶስት ቦታዎች ላይ አነስተኛ የአቀማመጥ ጥገኛ አድልዎ አሳይቷል (ተጨማሪ ምስል 2e)። በማጠቃለያ፣ የቤተ-መጻሕፍቱ ጥራት እና ልዩነት ተቀባይነት ያለው እና በበርካታ የምርጫ ዙሮች መካከል የፋጅ ቤተ-መጻሕፍት ማጉላት እና ዝግጅት ምክንያት በልዩነት ላይ ጥቃቅን ለውጦች ብቻ ታይተዋል ብለን ደምድመናል።
ተከታታይ የሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ናሙና በቢቢቢ እና/ወይም ቢሲኤስኤፍቢ በኩል በደም ሥር የተወጋውን የቲ7 ፋጅ ለመለየት (iv) ለማመቻቸት በንቃተ ህሊና አይጦች CM ውስጥ ካኑላ በቀዶ ጥገና በመትከል ሊከናወን ይችላል (ምስል 1a-b)። በመጀመሪያዎቹ ሶስት የኢንቪቮ ምርጫ ዙሮች ሁለት ገለልተኛ የምርጫ ክንዶች (ክንድ A እና B) ተጠቅመናል። በመጀመሪያዎቹ ሶስት የምርጫ ዙሮች ውስጥ የተዋወቀውን የፋጅ አጠቃላይ መጠን በመቀነስ የምርጫውን ጥብቅነት ቀስ በቀስ ጨምረናል። ለአራተኛው የፓንኒንግ ዙር፣ ከቅርንጫፎች A እና B የተገኙ ናሙናዎችን አጣምረን ሶስት ተጨማሪ ገለልተኛ ምርጫዎችን አድርገናል። በዚህ ሞዴል ውስጥ የT7 ፋጅ ቅንጣቶችን ኢንቪቮ ባህሪያትን ለማጥናት፣ የዱር አይነት ፋጅ (PAGISRELVDKL ዋና ማስገቢያ) በጅራት ጅማት በኩል በአይጦች ውስጥ ተወግቷል። በተለያዩ የጊዜ ነጥቦች ላይ ከሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ እና ደም የተገኙ ፋጆችን መልሶ ማግኘት በአንጻራዊ ሁኔታ ሲታይ አነስተኛ የT7 ኢኮሳሄድራል ፋጆች ከደም ክፍል ፈጣን የመጀመሪያ የማጽዳት ደረጃ እንዳላቸው ያሳያል (ተጨማሪ ምስል 3)። በተሰጣቸው የቲተር መጠን እና በአይጦቹ የደም መጠን ላይ በመመስረት፣ በደም ሥር ከተወጋ በኋላ ከ10 ደቂቃዎች በኋላ ከተሰጠ መጠን የተገኘው 1% wt. phage በደም ውስጥ እንደተገኘ አስልተናል። ከዚህ የመጀመሪያ ፈጣን መቀነስ በኋላ፣ ቀርፋፋ የመጀመሪያ ደረጃ ክሊራንስ በ27.7 ደቂቃዎች ግማሽ ህይወት ተለክቷል። በአስፈላጊ ሁኔታ፣ ከCSF ክፍል በጣም ጥቂት ፋጆች ብቻ ተገኝተዋል፣ ይህም ወደ CSF ክፍል የዱር ፋጅ ፍልሰት ዝቅተኛ ዳራ እንዳለው ያሳያል (ተጨማሪ ምስል 3)። በአማካይ፣ በደም ውስጥ 1 x 10-3% የT7 ፋጅ ቲተሮች እና 4 x 10-8% የመጀመሪያ የተዋጡ ፋጆች በሙሉ ናሙና ጊዜ (0-250 ደቂቃ) ውስጥ በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ ተገኝተዋል። በተለይም፣ በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ ያለው የዱር አይነት ፋጅ ግማሽ ህይወት (25.7 ደቂቃ) በደም ውስጥ ከሚታየው ጋር ተመሳሳይ ነበር። እነዚህ መረጃዎች እንደሚያሳዩት የሲኤስኤፍ ክፍልን ከደም የሚለየው መከላከያ በሲኤም-ካንኑሌትድ አይጦች ውስጥ ምንም ጉዳት እንደሌለው ያሳያል፣ ይህም ከደም ወደ ሲኤስኤፍ ክፍል በቀላሉ የሚጓጓዙ ክሎኖችን ለመለየት የፋጅ ቤተ-መጻሕፍትን በቪቮ እንዲመርጡ ያስችላል።
(ሀ) ከትልቅ ገንዳ ውስጥ ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (CSF) እንደገና ናሙና ለመውሰድ ዘዴ ማዘጋጀት። (ለ) የማዕከላዊው የነርቭ ሥርዓት (CNS) መከላከያ ሴሉላር ቦታ እና የደም-አንጎል መከላከያ (BBB) ​​​​እና የደም-አንጎል መከላከያን የሚያቋርጡ ፔፕታይዶችን ለመለየት የሚያገለግል የምርጫ ስትራቴጂ የሚያሳይ ዲያግራም። (ሐ) የኢንቪቮ ፋጅ ማሳያ የማጣሪያ ፍሰት ገበታ። በእያንዳንዱ የምርጫ ዙር፣ ፋጅ (በቀስቶቹ ውስጥ ያሉ የእንስሳት መለያ) በደም ሥር ተወጉ። ሁለት ገለልተኛ አማራጭ ቅርንጫፎች (A፣ B) እስከ 4ኛው የምርጫ ዙር ድረስ ለብቻቸው ይቀመጣሉ። ለምርጫ ዙሮች 3 እና 4፣ ከCSF የተወሰደ እያንዳንዱ የፋጅ ክሎን በእጅ ቅደም ተከተል ተዘርግቷል። (መ) የT7 ፔፕታይድ ቤተ-መጽሐፍት በደም ሥር ከተወገደ በኋላ በሁለት የታንሱ አይጦች ውስጥ ከደም (ቀይ ክቦች) እና ከሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (አረንጓዴ ትሪያንግሎች) የተነጠለ የፋጅ ኪኔቲክስ (2 x 1012 ፋጅስ/እንስሳት)። ሰማያዊ ካሬዎች በደም ውስጥ ያለውን የፋጅ አማካይ የመጀመሪያ ክምችት ያመለክታሉ፣ ይህም አጠቃላይ የደም መጠንን ግምት ውስጥ በማስገባት ከተወጋው ፋጅ መጠን ይሰላል። ጥቁር ካሬዎቹ ከደም ፋጅ ክምችት የተገኘውን የy መስመር መጋጠሚያ ነጥብ ያመለክታሉ። (e,f) በፔፕታይድ ውስጥ የሚገኙትን ሁሉንም ሊሆኑ የሚችሉ የተደራረቡ ትራይፔፕታይድ ቅጦች አንጻራዊ ድግግሞሽ እና ስርጭት ያቅርቡ። በ1000 ንባቦች ውስጥ የሚገኙት ሞቲፎች ብዛት ይታያል። ጉልህ በሆነ መልኩ (p < 0.001) የበለፀጉ ሞቲፎች በቀይ ነጥቦች ምልክት ተደርጎባቸዋል። (e) የተወጋው ቤተ-መጽሐፍት የትሪፔፕታይድ ሞቲፍ አንጻራዊ ድግግሞሽ ከእንስሳት #1.1 እና #1.2 ከደም የተገኘ ፋጅ ጋር በማነፃፀር የተዛመደ ስትራክቸርፕሎት። (f) የእንስሳት ፋጅ ትራይፔፕታይድ ሞቲፎችን አንጻራዊ ድግግሞሽ #1.1 እና #1.2 በደም እና በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ የተለዩትን አንጻራዊ ድግግሞሾችን በማነፃፀር የተዛመደ ስፓርቸርፕሎት። (g, h) በደም ውስጥ የበለፀገውን የፋጅ ቅደም ተከተል መታወቂያ ውክልና (g) ከተወጋው ቤተ-መጽሐፍት እና በሲኤስኤፍ (h) ከደም ጋር ሲነጻጸር በሁለቱም እንስሳት ውስጥ ከውስጣዊ ምርጫ ዙር በኋላ። የአንድ ፊደል ኮድ መጠን በዚያ ቦታ ላይ አሚኖ አሲድ ምን ያህል ጊዜ እንደሚከሰት ያሳያል። አረንጓዴ = ፖላር፣ ወይንጠጅ = ገለልተኛ፣ ሰማያዊ = መሰረታዊ፣ ቀይ = አሲዳማ እና ጥቁር = ሃይድሮፎቢክ አሚኖ አሲዶች። ምስል 1a፣ b የተነደፈው እና የተመረተው በኤድዋርድ ኡሪች ነው።
የፋጅ ፔፕታይድ ቤተ-መጽሐፍትን በሁለት የሲኤም የመሳሪያ አይጦች (ክላድስ ኤ እና ቢ) እና ከሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ እና ደም የተነጠለ ፋጅ (ምስል 1መ) ውስጥ ወስደናል። የቤተ-መጻሕፍቱ የመጀመሪያ ፈጣን ማጽዳት ከዱር ዓይነት ፋጅ ጋር ሲነጻጸር ብዙም ግልጽ አልነበረም። በሁለቱም እንስሳት ውስጥ የተወጋው ቤተ-መጽሐፍት አማካይ ግማሽ ሕይወት ከዱር ዓይነት ፋጅ ጋር ተመሳሳይ በሆነ ደም ውስጥ 24.8 ደቂቃዎች እና በሲኤስኤፍ ውስጥ 38.5 ደቂቃዎች ነበር። ከእያንዳንዱ እንስሳ የደም እና የሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ፋጅ ናሙናዎች ለኤችቲኤስ ተገዝተዋል እና ሁሉም የተለዩ ፔፕታይዶች አጭር ትራይፔፕታይድ ሞቲፍ መኖሩን ለማረጋገጥ ተተነተኑ። ትራይፔፕታይድ ሞቲፎች የተመረጡት ለመዋቅር ምስረታ እና ለፔፕታይድ-ፕሮቲን መስተጋብር አነስተኛ መሠረት ስለሚሰጡ ነው14,15። በተወጋው ፋጅ ቤተ-መጽሐፍት እና ከሁለቱም እንስሳት ደም የተወሰዱ ክሎኖች መካከል ባለው ሞቲፍ ስርጭት ውስጥ ጥሩ ትስስር አግኝተናል (ምስል 1ሠ)። መረጃው የቤተ-መጻሕፍቱ ስብጥር በደም ክፍል ውስጥ በትንሹ የበለፀገ መሆኑን ያሳያል። የአሚኖ አሲድ ድግግሞሾች እና የስምምነት ቅደም ተከተሎች በእያንዳንዱ ቦታ ላይ የዌብሎጎ16 ሶፍትዌርን በማስተካከል የበለጠ ተተነተኑ። የሚገርመው ነገር፣ በደም ግሊሲን ቅሪቶች ውስጥ ጠንካራ ማበልጸጊያ አግኝተናል (ምስል 1ግ)። ደም ከCSF ከተመረጡ ክሎኖች ጋር ሲወዳደር፣ ጠንካራ ምርጫ እና አንዳንድ የሞቲፍ አለመምረጥ ታይቷል (ምስል 1ፍ)፣ እና የተወሰኑ አሚኖ አሲዶች በ12-አባል ውስጥ አስቀድሞ በተወሰነ ቦታ ላይ ይገኛሉ (ምስል 1ሰ)። በተለይም፣ የግለሰብ እንስሳት በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ ይለያያሉ፣ የደም ግሊሲን ማበልጸጊያ ደግሞ በሁለቱም እንስሳት ውስጥ ታይቷል (ተጨማሪ ምስል 4a–j)። በእንስሳት ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ ጥብቅ የሆነ የቅደም ተከተል መረጃ ከተጣራ በኋላ፣ በድምሩ 964 እና 420 ልዩ 12-ሜር ፔፕታይዶች ተገኝተዋል (ተጨማሪ ምስል 1d–e)። የተለዩት የፌጅ ክሎኖች ተጨምረው ለሁለተኛ ዙር የውስጥ-አካል ምርጫ ተዳርገዋል። ከሁለተኛው የምርጫ ዙር የተወሰደው ፋጅ በእያንዳንዱ እንስሳ ውስጥ ለኤችቲኤስ ተገዝቶ ነበር፣ እና ሁሉም የተለዩ ፔፕታይዶች የሶስትፔፕታይድ ሞቲፎችን ክስተት ለመተንተን ለሞቲፍ ማወቂያ ፕሮግራም እንደ ግብዓት ጥቅም ላይ ውለዋል (ምስል 2a፣ b፣ ef)። ከሲኤስኤፍ የተገኘው የፋጅ የመጀመሪያ ዑደት ጋር ሲነጻጸር፣ በሲኤስኤፍ ቅርንጫፎች A እና B ውስጥ ብዙ ሞቲፎችን ተጨማሪ ምርጫ እና አለመምረጥ ተመልክተናል (ምስል 2)። የተለያዩ ወጥነት ያላቸው ቅደም ተከተሎችን ይወክሉ እንደሆነ ለማወቅ የአውታረ መረብ መለያ ስልተ ቀመር ተተግብሯል። በአማራጭ ክላድ A (ምስል 2c፣ d) እና ክላድ B (ምስል 2g፣ h) በሲኤስኤፍ የተገኙት 12-ልኬት ቅደም ተከተሎች መካከል ግልጽ የሆነ ተመሳሳይነት ታይቷል። በእያንዳንዱ ቅርንጫፍ ውስጥ የተጣመረው ትንተና ለ12-ሜር ፔፕታይዶች የተለያዩ የምርጫ መገለጫዎችን አሳይቷል (ተጨማሪ ምስል 5c፣d) እና ከሁለተኛው የምርጫ ዙር በኋላ ለተጣመሩ ክሎኖች በጊዜ ሂደት የCSF/ደም ቲተር ጥምርታ መጨመርን አሳይቷል (ተጨማሪ ምስል 5e)።)
በሁለት ተከታታይ ዙር ኢንቪቮ ተግባራዊ የፋጅ ማሳያ ምርጫ አማካኝነት በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ ሞቲፎችን እና ፔፕታይዶችን ማበልጸግ።
ከእያንዳንዱ እንስሳ የመጀመሪያ ዙር (እንስሳት #1.1 እና #1.2) የተገኙት ሁሉም የሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ፋጂዎች ተሰባስበው፣ ተጨምረዋል፣ በHT ቅደም ተከተል ተወስደዋል እና እንደገና ተቀላቅለዋል (2 x 1010 ፋጂዎች/እንስሳት) 2 SM የታሸጉ አይጦች (#1.1 → #)። 2.1 እና 2.2፣ 1.2 → 2.3 እና 2.4)። (a,b,e,f) በመጀመሪያው እና በሁለተኛው የምርጫ ዙሮች ውስጥ ያሉትን ሁሉንም የCSF-የተገኙ ፋጂዎች የትሪፔፕታይድ ሞቲፎች አንጻራዊ ድግግሞሽን የሚያወዳድር የትስስርት ፕሌቶች። በሁለቱም አቅጣጫዎች በፔፕታይዶች ውስጥ የሚገኙትን ሁሉንም ሊሆኑ የሚችሉ ተደራራቢ ትሪፔፕቶችን የሚወክሉ ሞቲፎች አንጻራዊ ድግግሞሽ እና ስርጭት። በ1000 ንባቦች ውስጥ የተገኙ ሞቲፎች ብዛት ይታያል። በተነፃፀሩት ቤተ-መጻሕፍት ውስጥ በአንዱ በከፍተኛ ሁኔታ የተመረጡ ወይም የተገለሉ ሞቲፎች በቀይ ነጥቦች ጎልተው ይታያሉ። (c፣ d፣ g፣ h) በinvivo ምርጫ ዙር 2 እና 1 ላይ በመመስረት የሁሉም CSF-ሀብታም 12 አሚኖ አሲድ ረጅም ቅደም ተከተሎች የተከታታይ አርማ ውክልና። የአንድ-ፊደል ኮድ መጠን በዚያ ቦታ ላይ ያ አሚኖ አሲድ ምን ያህል ጊዜ እንደሚከሰት ያሳያል። አርማውን ለመወከል፣ በሁለት የምርጫ ዙሮች መካከል ከግለሰብ እንስሳት የተወሰዱ የCSF ቅደም ተከተሎች ድግግሞሽ ይነጻጸራል እና በሁለተኛው ዙር የበለፀጉ ቅደም ተከተሎች ይታያሉ፡ (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 እና (h) #1.2–#2.4። በእንስሳት ቁጥር 2.3 እና ቁጥር 2.4 ውስጥ በተሰጠው ቦታ ላይ በጣም የበለፀጉ አሚኖ አሲዶች በቀለም ይታያሉ። አረንጓዴ = ፖላር፣ ወይንጠጅ = ገለልተኛ፣ ሰማያዊ = መሰረታዊ፣ ቀይ = አሲዳማ እና ጥቁር = ሃይድሮፎቢክ አሚኖ አሲዶች።
ከሶስተኛው ዙር ምርጫ በኋላ፣ ከሁለት እንስሳት የተለዩ 332 CSF-reconstituted phage clones 124 ልዩ የፔፕታይድ ቅደም ተከተሎችን (#3.1 እና #3.2) ለይተናል (ተጨማሪ ምስል 6a)። የLGSVS ቅደም ተከተል (18.7%) ከፍተኛውን አንጻራዊ መጠን ያለው ሲሆን በመቀጠልም የዱር አይነት ማስገቢያዎች PAGISRELVDKL (8.2%)፣ MRWFFSHASQGR (3%)፣ DVAKVS (3%)፣ TWLFSLG (2.2%) እና SARGSWREIVSLS (2.2%) ነበሩ። በመጨረሻው አራተኛ ዙር፣ ከሶስት የተለያዩ እንስሳት ሁለት በተናጥል የተመረጡ ቅርንጫፎችን ሰብስበናል (ምስል 1ሐ)። ከCSF የተገኙት 925 ተከታታይ የphage ክሎኖች ውስጥ፣ በአራተኛው ዙር 64 ልዩ የፔፕታይድ ቅደም ተከተሎችን አግኝተናል (ተጨማሪ ምስል 6ለ)፣ ከእነዚህም ውስጥ የዱር አይነት phage አንጻራዊ መጠን ወደ 0.8% ቀንሷል። በአራተኛው ዙር በጣም የተለመዱት የCSF ክሎኖች LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%)፣ LGSVS (17%)፣ GFVRFRLSNTR (14%)፣ KVAWRVFSLFWK (7%)፣ SVHGV (5%)፣ GRPQKINGARVC (3.6%) እና RLSSVDSDLSGC (3, 2%) ነበሩ። የተመረጡት ፔፕታይዶች የርዝመት ክልል የሚከሰተው ለ NNK ቤተ-መጽሐፍት ዲዛይን የተበላሹ ኮዶኖችን ሲጠቀሙ በቤተ-መጽሐፍት ፕሪመሮች ውስጥ ኑክሊዮታይድ ማስገቢያዎች/ስረዛዎች ወይም ያለጊዜው የማቆሚያ ኮዶኖች በመኖራቸው ነው። ያለጊዜው የማቆሚያ ኮዶኖች አጠር ያሉ ፔፕታይዶችን ያመነጫሉ እና የሚመረጡት ምቹ የሆነውን የ aa ሞቲፍ ስለያዙ ነው። ረጅም ፔፕታይዶች በሰው ሰራሽ ቤተ-መጽሐፍት ፕሪመሮች ውስጥ ከተጨመሩ/ስረዛዎች ሊመጡ ይችላሉ። ይህ የተነደፈውን የማቆሚያ ኮዶን ከፍሬሙ ውጭ ያስቀምጣል እና አዲስ የማቆሚያ ኮዶን ከታች እስኪታይ ድረስ ያነበዋል። በአጠቃላይ፣ የግብዓት ውሂቡን ከናሙና የውጤት መረጃ ጋር በማነፃፀር ለአራቱም የምርጫ ዙሮች የማበልጸጊያ ሁኔታዎችን አስልተናል። ለመጀመሪያው የማጣሪያ ዙር፣ የዱር አይነት ፋጅ ቲተሮችን እንደ ልዩ ያልሆነ የጀርባ ማጣቀሻ ተጠቅመናል። የሚገርመው፣ አሉታዊ ፋጅ ምርጫ በመጀመሪያው የCSF ዑደት ውስጥ በጣም ጠንካራ ነበር፣ ነገር ግን በደም ውስጥ አይደለም (ምስል 3a)፣ ይህም ሊሆን የሚችለው አብዛኛዎቹ የፔፕታይድ ቤተ-መጽሐፍት አባላት ወደ CSF ክፍል ወይም አንጻራዊ ፋጆች ከባክቴሪያዮፋጅስ ይልቅ በብቃት የሚያዙ ወይም ከደም ውስጥ የሚወገዱ በመሆናቸው ሊሆን ይችላል። ሆኖም፣ በሁለተኛው የፓንኒንግ ዙር፣ በሁለቱም ክላዶች ውስጥ በCSF ውስጥ ጠንካራ የፋጅ ምርጫዎች ታይተዋል፣ ይህም የቀደመው ዙር የCSF ቅበላን የሚያበረታቱ ፔፕታይዶችን በሚያሳዩ ፋጅዎች የበለፀገ መሆኑን ይጠቁማል (ምስል 3a)። እንደገና፣ ጉልህ የሆነ የደም ማበልጸጊያ ሳይኖር። እንዲሁም በሦስተኛው እና በአራተኛው ዙር፣ የፋጅ ክሎኖች በCSF ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ የበለፀጉ ነበሩ። ባለፉት ሁለት የምርጫ ዙሮች መካከል የእያንዳንዱ ልዩ የፔፕታይድ ቅደም ተከተል አንጻራዊ ድግግሞሽን በማነፃፀር፣ ተከታታዮቹ በአራተኛው የምርጫ ዙር የበለጠ የበለፀጉ መሆናቸውን አግኝተናል (ምስል 3ለ)። በአጠቃላይ 931 የትሪፔፕታይድ ሞቲፎች ከ64ቱ ልዩ የፔፕታይድ ቅደም ተከተሎች ሁለቱንም የፔፕታይድ አቅጣጫዎችን በመጠቀም ተወስደዋል። በአራተኛው ዙር ውስጥ በጣም የበለፀጉ ሞቲፎች በሁሉም ዙሮች ውስጥ ከተወጋው ቤተ-መጽሐፍት ጋር ሲነፃፀሩ የማበልጸጊያ መገለጫዎቻቸውን በቅርበት ተፈትሸዋል (የመቁረጥ፡ 10% ማበልጸጊያ) (ተጨማሪ ምስል 6ሐ)። አጠቃላይ የምርጫ ቅጦች እንደሚያሳዩት አብዛኛዎቹ የተጠኑት ምክንያቶች በሁለቱም የምርጫ ቅርንጫፎች ቀደም ባሉት ዙሮች የበለፀጉ ናቸው። ሆኖም፣ አንዳንድ ሞቲፎች (ለምሳሌ SGL፣ ​​VSG፣ LGS GSV) በዋናነት ከተለዋጭ ክላድ A የተገኙ ሲሆኑ ሌሎቹ (ለምሳሌ FGW፣ RTN፣ WGF፣ NTR) ደግሞ በተለዋጭ ክላድ B የበለፀጉ ናቸው።
ከስትሬፕታቪዲን ጭነት ጋር የተዋሃዱ የሲኤስኤፍ-የበለፀጉ ፋጅ-ማሳያ ፔፕታይዶች እና ባዮቲኒላይትድ ሊደር ፔፕታይዶች የሲኤስኤፍ ማጓጓዝን ማረጋገጥ።
(ሀ) በአራቱም ዙሮች (R1-R4) የተሰሉ የማበልጸጊያ ሬሾዎች በመርፌ (ግብዓት = I) ፋጅ (PFU) titers እና በተወሰኑ የCSF ፋጅ titers (ውጤት = O) ላይ ተመስርተው። ባለፉት ሶስት ዙሮች (R2-R4) የማበልጸጊያ ምክንያቶች የተሰሉት ከቀዳሚው ዙር እና ከመጀመሪያው ዙር (R1) ጋር በክብደት መረጃ በማነፃፀር ነው። ክፍት አሞሌዎች ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ናቸው፣ የተሸለሙ አሞሌዎች ፕላዝማ ናቸው። (***p<0.001፣ በተማሪው ቲ-ሙከራ ላይ የተመሠረተ)። (ለ) በጣም በብዛት የሚገኙት የፋጅ ፔፕታይዶች ዝርዝር፣ ከተመረጠው ዙር 4 በኋላ በCSF ውስጥ ከተሰበሰቡት ሁሉም ፋጆች ጋር ባለው አንጻራዊ መጠን ደረጃ የተመደቡ ናቸው። ስድስቱ በጣም የተለመዱ የፋጅ ክሎኖች በቀለም፣ በተቆጠሩ እና በምርጫ ዙሮች 3 እና 4 መካከል በማበልጸጊያ ሁኔታዎቻቸው ጎልተው ይታያሉ (ኢንሴቶች)። (ሐ፣መ) ከዙር 4 የተገኙት ስድስቱ በጣም የበለፀጉ የፋጅ ክሎኖች፣ ባዶ ፋጅ እና የወላጅ ፋጅ ፔፕታይድ ቤተ-መጻሕፍት በCSF ናሙና ሞዴል ውስጥ በተናጠል ተተነተኑ። CSF እና የደም ናሙናዎች በተጠቀሰው የጊዜ ነጥቦች ተሰብስበው ነበር። (ሐ) እኩል መጠን ያላቸው 6 እጩ የፋጅ ክሎኖች (2 x 1010 ፋጅ/እንስሳት)፣ ባዶ ፋጅዎች (#1779) (2 x 1010 ፋጅ/እንስሳት) እና የስቶክ ፋጅ ፔፕታይድ ቤተ-መጻሕፍት (2 x 1012 ፋጅ/እንስሳት) መርፌ ቢያንስ 3 ሴ.ሜ መርፌ ለተቀባው እንስሳ በጅራት ጅማት በኩል ለብቻው ይሰጣል። የእያንዳንዱ የተወጋ የፋጅ ክሎን እና የፋጅ ፔፕታይድ ቤተ-መጻሕፍት የCSF ፋርማኮኪኔቲክስ በጊዜ ሂደት ይታያል። (መ) በናሙና ጊዜ ውስጥ ለሁሉም የተመለሱ ፋጅ/ሚሊኤል አማካይ የCSF/የደም ጥምርታ ያሳያል። (ሠ) አራት ሰው ሰራሽ መሪ ፔፕታይዶች እና አንድ የተዘበራረቀ ቁጥጥር ከባዮቲን ጋር ከስትሬፕታቪዲን ጋር በኤን-ተርሚነስ (ቴትራመር ማሳያ) በኩል ተገናኝተዋል ከዚያም መርፌ (የጅራት ጅማት iv፣ 10 mg ስትሬፕታቪዲን/ኪ.ግ)። ቢያንስ ሦስት የተወጋ አይጦች (N = 3)።) የሲኤስኤፍ ናሙናዎች በተጠቀሱት የጊዜ ነጥቦች ላይ የተሰበሰቡ ሲሆን የስፕሬታቪዲን ክምችት በሲኤስኤፍ ፀረ-ስትሬፕታቪዲን ELISA (nd = አልተገኘም) ተለክቷል። (*p<0.05፣ **p<0.01፣ ***p<0.001፣ በANOVA ምርመራ ላይ የተመሠረተ)። (ረ) በጣም የበለፀገው የፋጅ ፔፕታይድ ክሎን #2002 (ወይን ጠጅ) የአሚኖ አሲድ ቅደም ተከተል ከአራተኛው የምርጫ ዙር ከተመረጡ ሌሎች የፋጅ ፔፕታይድ ክሎኖች ጋር ማወዳደር። ተመሳሳይ እና ተመሳሳይ የአሚኖ አሲድ ቁርጥራጮች በቀለም የተለጠፉ ናቸው።
በአራተኛው ዙር (ምስል 3ለ) ውስጥ ከተካተቱት ሁሉም የበለጸጉ ፋጆች ውስጥ ስድስት የእጩ ክሎኖች በCSF ናሙና ሞዴል ውስጥ ለተጨማሪ የግል ትንተና ተመርጠዋል። እኩል መጠን ያላቸው ስድስት የእጩ ፋጅ፣ ባዶ ፋጅ (ያለ ማስገቢያ) እና የፕሮፋጅ ፔፕታይድ ቤተ-መጻሕፍት በሦስት የታሸጉ የCM እንስሳት ውስጥ ተወግተዋል፣ እና ፋርማኮኪኔቲክስ በCSF (ምስል 3ሐ) እና በደም (ተጨማሪ ምስል 7) ምርመራዎች ተወስኗል። የተፈተኑ ሁሉም የፋጅ ክሎኖች የCSF ክፍልን ከባዶ መቆጣጠሪያ ፋጅ (#1779) በ10-1000 እጥፍ ከፍ ባለ ደረጃ ላይ ያነጣጠሩ ናቸው። ለምሳሌ፣ ክሎኖች #2020 እና #2077 ከቁጥጥር ፋጅ በ1000 እጥፍ የሚበልጥ የCSF ቲተሮች ነበሯቸው። የእያንዳንዱ የተመረጠው ፔፕታይድ ፋርማኮኪኔቲክ መገለጫ የተለየ ነው፣ ነገር ግን ሁሉም ከፍተኛ የCSF ሆሚንግ ችሎታ አላቸው። በጊዜ ሂደት ለክሎኖች #1903 እና #2011 የማያቋርጥ ቅናሽ አስተውለናል፣ ለክሎኖች #2077፣ #2002 እና #2009 በመጀመሪያዎቹ 10 ደቂቃዎች ውስጥ ጭማሪው ንቁ መጓጓዣን ሊያመለክት ይችላል ነገር ግን መረጋገጥ አለበት። ክሎኖች #2020፣ #2002 እና #2077 በከፍተኛ ደረጃ ተረጋግተዋል፣ የክሎኖች #2009 የCSF ክምችት ደግሞ ከመጀመሪያው ጭማሪ በኋላ ቀስ በቀስ ቀንሷል። ከዚያም የእያንዳንዱን የCSF እጩ አንጻራዊ ድግግሞሽ ከደም ክምችት ጋር አነጻጽረናል (ምስል 3d)። በእያንዳንዱ የናሙና ጊዜ የእያንዳንዱ የCSF እጩ አማካይ ቲተር ከደም ቲተር ጋር ያለው ትስስር ከስድስቱ እጩዎች ሦስቱ በደም CSF በከፍተኛ ሁኔታ የበለፀጉ መሆናቸውን ያሳያል። የሚገርመው፣ ክሎን #2077 ከፍተኛ የደም መረጋጋት አሳይቷል (ተጨማሪ ምስል 7)። ፔፕታይዶች እራሳቸው ከፌጅ ቅንጣቶች ውጭ ጭነትን ወደ CSF ክፍል በንቃት የማጓጓዝ ችሎታ እንዳላቸው ለማረጋገጥ፣ ፔፕታይዶች ከፌጅ ቅንጣቶች ጋር በሚገናኙበት በN-ተርሚነስ ላይ ከባዮቲን የተወሰዱ አራት መሪ ፔፕታይዶችን አቀናጅተናል። ባዮቲኒላይትድ ፔፕታይዶች (ቁጥሮች 2002፣ 2009፣ 2020 እና 2077) ከስትሬፕታቪዲን (SA) ጋር ተጣምረው የፋጅ ጂኦሜትሪን በተወሰነ መልኩ የሚመስሉ ባለብዙ ሜሪክ ቅርጾችን ለማግኘት ተችለዋል። ይህ ቅርጸት በደም እና በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ የSA ተጋላጭነትን እንደ ጭነት ማጓጓዣ ፕሮቲን ፔፕታይዶች ለመለካት አስችሎናል። በአስፈላጊ ሁኔታ፣ ሰው ሰራሽ ፔፕታይዶች በዚህ SA-conjugated ቅርጸት ሲሰጡ የፋጅ መረጃ ብዙውን ጊዜ ሊባዛ ይችላል (ምስል 3e)። የተጨማደቁት ፔፕታይዶች በ48 ሰዓታት ውስጥ ሊታወቁ በማይችሉ ደረጃዎች አነስተኛ የመጀመሪያ ተጋላጭነት እና ፈጣን የCSF ማጽዳት ነበራቸው። የእነዚህን የፔፕታይድ ፋጅ ክሎኖች ወደ CSF ቦታ የማድረሻ መንገዶችን ለመረዳት፣ በቪቮ ውስጥ በደም ሥር መርፌ ከገባ ከ1 ሰዓት በኋላ የፋጅ ቅንጣቶችን በቀጥታ ለመለየት የኢሚውኖሂስቶኬሚስትሪ (IHC) በመጠቀም የግለሰብ ፋጅ ፔፕታይድ መምታትን ተንትነናል። በተለይም፣ ክሎኖች #2002፣ #2077 እና #2009 በአንጎል ካፒላሪዎች ውስጥ ጠንካራ እድፍ ሊገኙ ይችላሉ፣ የቁጥጥር ፋጅ (#1779) እና ክሎን #2020 ግን አልተገኙም (ተጨማሪ ምስል 8)። ይህ የሚያመለክተው እነዚህ ፔፕታይዶች BBBን በማለፍ በአንጎል ላይ በትክክል እንዲያሳድሩ አስተዋጽኦ ያደርጋሉ። ይህንን መላምት ለመፈተሽ ተጨማሪ ዝርዝር ትንተና ያስፈልጋል፣ ምክንያቱም የBSCFB መንገድም ሊሳተፍ ይችላል። በጣም የበለፀገውን ክሎን (#2002) የአሚኖ አሲድ ቅደም ተከተል ከሌሎች የተመረጡ ፔፕታይዶች ጋር ሲያወዳድሩ፣ አንዳንዶቹ ተመሳሳይ የአሚኖ አሲድ ማራዘሚያዎች እንዳላቸው ተስተውሏል፣ ይህም ተመሳሳይ የትራንስፖርት ዘዴን ሊያመለክት ይችላል (ምስል 3f)።
በልዩ የፕላዝማ መገለጫው እና በጊዜ ሂደት በCSF ላይ ከፍተኛ ጭማሪ በመኖሩ፣ የፋጅ ማሳያ ክሎን #2077 ረዘም ላለ ጊዜ በ48 ሰዓት ጊዜ ውስጥ ተጨማሪ ጥናት ተደርጎበታል እና ከቀጣይ የSA ደረጃዎች ጋር ተያይዞ የሚታየውን የCSF ፈጣን ጭማሪ እንደገና ማባዛት ችሏል (ምስል 4a)። ሌሎች የተለዩ የፋጅ ክሎኖችን በተመለከተ፣ #2077 ለአእምሮ ካፒላሪዎች በጣም የተቀባ እና በከፍተኛ ጥራት ሲታይ እና ምናልባትም በፓረንቺማል ቦታ ላይ የተወሰነ ቀለም ሲኖር ከካፒላሪ ማርከር ሌክቲን ጋር ጉልህ የሆነ ኮሎኬሽን አሳይቷል (ምስል 4ለ)። በCNS ውስጥ የፔፕታይድ-መካከለኛ ፋርማኮሎጂካል ተፅእኖዎች ሊገኙ ይችሉ እንደሆነ ለመመርመር፣ በሁለት የተለያዩ ሬሾዎች የባዮቲኒላይትድ ስሪቶች i) #2077 ትራንዚት ፔፕታይድ እና ii) BACE1 አጋቾች ፔፕታይድ ከSA ጋር የተቀላቀሉበትን ሙከራ አድርገናል። ለአንድ ጥምረት የBACE1 ፔፕታይድ አጋቾችን ብቻ ተጠቅመን ለሌላኛው ጥምረት የBACE1 ፔፕታይድ አጋቾችን ከ#2077 ፔፕታይድ ጋር 1:3 ጥምርታ ተጠቅመንበታል። ሁለቱም ናሙናዎች በደም ሥር የተሰጡ ሲሆን የቤታ-አሚሎይድ ፔፕታይድ 40 (አቤታ40) የደም እና የሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ መጠን በጊዜ ሂደት ተለክቷል። አቤታ40 በሲኤስኤፍ የተለካው በአንጎል ፓሬንቺማ ውስጥ የBACE1 መከልከልን ስለሚያንፀባርቅ ነው። እንደተጠበቀው፣ ሁለቱም ውስብስብ ነገሮች የአቤታ40ን የደም መጠን በእጅጉ ቀንሰዋል (ምስል 4c፣ መ)። ሆኖም፣ የፔፕታይድ ቁጥር 2077 እና ከኤስኤ ጋር የተጣመረውን የBACE1 ፔፕታይድ መከልከል የያዙ ናሙናዎች ብቻ በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ በአቤታ40 ላይ ከፍተኛ ቅነሳ አስከትለዋል (ምስል 4c)። መረጃው እንደሚያሳየው ፔፕታይድ ቁጥር 2077 60 kDa SA ፕሮቲንን ወደ ሲኤንኤስ ማጓጓዝ የሚችል ሲሆን እንዲሁም በኤስኤ-የተጣመሩ የBACE1 ፔፕታይድ አጋቾች አማካኝነት የፋርማኮሎጂካል ተፅእኖዎችን ያስከትላል።
(ሀ) ቢያንስ በሦስት የሲኤም-ኢንቱቤድ አይጦች ውስጥ የሲኤስኤፍ ፔፕታይድ #2077 (RLSSVDSDLSGC) እና ያልተወጋ የቁጥጥር ፋጅ (#1779) የረጅም ጊዜ የፋርማኮኪኔቲክ መገለጫዎችን የሚያሳይ የT7 ፋጅ ክሎናል መርፌ (2 × 10 ፋጅስ/እንስሳት)። (ለ) በፋጅ-ኢንሱሌሽን አይጦች (2 × 10 10 ፋጅስ/እንስሳት) ውስጥ የፔፕታይድ #2077 እና የደም ሥሮች (ሌክቲን) ተቃራኒ ቀለም የሚያሳይ ተወካይ ኮርቲካል ማይክሮቬል ምስል። እነዚህ የፋጅ ክሎኖች ለ3 አይጦች ተሰጥተው ከመፍሰሳቸው በፊት ለ1 ሰዓት እንዲዘዋወሩ ተፈቅዶላቸዋል። አንጎል በT7 ፋጅ ካፕሲድ ላይ በፖሊክሎናል FITC-labeled ፀረ እንግዳ አካላት ተከፋፍሎ ተቀባ። ከመፍሰሱ እና ከዚያ በኋላ ከመስተካከል አስር ደቂቃዎች በፊት፣ DyLight594-labeled lectin በደም ሥር ተሰጥቷል። በካፒላሪዎች እና በፔሪቫስኩላር የአንጎል ቲሹ ውስጥ ባለው ማይክሮቬልሶች እና ፋጆች (አረንጓዴ) የብርሃን ጎን ላይ የሌክቲን ቀለም (ቀይ) የሚያሳዩ የፍሎረሰንት ምስሎች። የመለኪያ አሞሌው ከ10 µm ጋር ይዛመዳል። (c፣ d) ባዮቲኒላይትድ BACE1 ኢንhibitory peptide ብቻውን ወይም ከባዮቲኒላይትድ ትራንዚት ፔፕታይድ #2077 ጋር በማጣመር ከስትሬፕታቪዲን ጋር ተጣምሮ ቢያንስ ሶስት የተነከሩ የCM አይጦች (10 mg streptavidin/kg) በደም ስር መርፌ ተሰጥቷል። በAβ40 ውስጥ BACE1 peptide inhibitory-mediated ቅነሳ በተጠቀሰው የጊዜ ነጥብ ላይ በደም (ቀይ) እና ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (ብርቱካናማ) ውስጥ በAβ1-40 ELISA ተለክቷል። ለተሻለ ግልጽነት፣ በግራፍ ላይ በ100% ሚዛን ላይ የነጥብ መስመር ተሳሏል። (ሐ) በ3፡1 ጥምርታ ውስጥ ከትራንስ ፔፕታይድ #2077 እና BACE1 ኢንሂቢክቲብ ፔፕታይድ ጋር በተዋሃዱ ትሬፕታቪዲን በተያዙ አይጦች ውስጥ በደም (ቀይ ትሪያንግሎች) እና በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (ብርቱካናማ ትሪያንግሎች) ውስጥ የAβ40 መቶኛ ቅነሳ። (መ) በስትሬፕታቪዲን ከBACE1 ኢንሂቢክቲብ ፔፕታይድ ጋር ብቻ በተጣመረ ትሬፕታቪዲን የታከሙ አይጦች የደም Aβ40 (ቀይ ክቦች) እና ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (ብርቱካናማ ክቦች) መቶኛ ቅነሳ። በቁጥጥር ስር ያለው የAβ ክምችት 420 pg/ml (መደበኛ መዛባት = 101 pg/ml) ነበር።
የፋጅ ማሳያ በተለያዩ የባዮሜዲካል ምርምር ዘርፎች በተሳካ ሁኔታ ተተግብሯል።17. ይህ ዘዴ ለኢንቪቮ የደም ሥር ልዩነት ጥናቶች18,19 እንዲሁም የአንጎል መርከቦችን ዒላማ ላደረጉ ጥናቶች20,21,22,23,24,25,26 ጥቅም ላይ ውሏል። በዚህ ጥናት፣ የዚህን የምርጫ ዘዴ አተገባበር የአንጎል መርከቦችን የሚያነጣጥሩ ፔፕታይዶችን በቀጥታ ለመለየት ብቻ ሳይሆን የደም-አንጎል እንቅፋትን የሚያቋርጡ ንቁ የትራንስፖርት ባህሪያት ያላቸውን እጩዎች ለማግኘትም ጭምር አራዝመናል። አሁን በሲኤም ኢንቱቤድድ አይጦች ውስጥ የኢንቪቮ የምርጫ ሂደት እድገትን እንገልፃለን እና የሲኤስኤፍ ሆሚንግ ባህሪያት ያላቸውን ፔፕታይዶች የመለየት አቅሙን እናሳያለን። የ12-ሜር የዘፈቀደ ፔፕታይዶች ቤተ-መጽሐፍትን የሚያሳይ የቲ7 ፋጅን በመጠቀም፣ የቲ7 ፋጅ በቂ ትንሽ (በግምት 60 nm ዲያሜትር)10 ከደም-አንጎል እንቅፋት ጋር እንዲስማማ፣ በዚህም በቀጥታ የደም-አንጎል እንቅፋትን ወይም የቾሮይድ ፕሌክስን እንደሚያቋርጥ ማሳየት ችለናል። ከተቆረጡ የCM አይጦች የሲኤስኤፍ መሰብሰብ በጥሩ ሁኔታ ቁጥጥር የሚደረግበት ኢን ቪቮ ተግባራዊ የማጣሪያ ዘዴ መሆኑን እና የተወጣው ፋጅ ከደም ስሮች ጋር የተያያዘ ብቻ ሳይሆን በደም-አንጎል እንቅፋት ውስጥ እንደ ማጓጓዣም ሆኖ አገልግሏል። በተጨማሪም፣ ደምን በአንድ ጊዜ በመሰብሰብ እና HTSን ወደ CSF እና ከደም የተገኙ ፋጆች በመተግበር፣ የCSF ምርጫችን በደም ማበልጸግ ወይም በምርጫ ዙሮች መካከል ለማስፋፋት ባለው ብቃት ላይ ተጽዕኖ እንዳያሳድር አረጋግጠናል። ሆኖም፣ የደም ክፍሉ የምርጫ ሂደቱ አካል ነው፣ ምክንያቱም ወደ CSF ክፍል መድረስ የሚችሉ ፋጆች በአንጎል ውስጥ እራሳቸውን ለማበልጸግ በቂ የደም ዝውውር ውስጥ መኖር እና መዘዋወር አለባቸው። ከጥሬ HTS መረጃ አስተማማኝ የቅደም ተከተል መረጃን ለማውጣት፣ በመተንተን የስራ ፍሰት ውስጥ ለፕላትፎርም-ተኮር የቅደም ተከተል ስህተቶች የተስተካከሉ ማጣሪያዎችን ተግባራዊ አድርገናል። የኪነቲክ መለኪያዎችን በማጣሪያ ዘዴው ውስጥ በማካተት፣ በደም24፣ 27፣ 28 ውስጥ የዱር አይነት T7 ፋጆች (t½ ~ 28 ደቂቃ) ፈጣን ፋርማኮኪኔቲክስን አረጋግጠናል እንዲሁም በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (t½ ~ 26 ደቂቃ) በደቂቃ ወስነናል። በደም እና በሲኤስኤፍ ውስጥ ተመሳሳይ የፋርማኮኪኔቲክ መገለጫዎች ቢኖሩም፣ በሲኤስኤፍ ውስጥ የፋጅ የደም ክምችት 0.001% ብቻ ተገኝቷል፣ ይህም በደም-አንጎል እንቅፋት ላይ የዱር ዓይነት T7 ፋጅ ዝቅተኛ የጀርባ ተንቀሳቃሽነት ያሳያል። ይህ ሥራ በቪቮ ፓንኒንግ ስልቶችን ሲጠቀሙ የመጀመሪያው ዙር የምርጫ አስፈላጊነትን ያጎላል፣ በተለይም ከደም ዝውውር በፍጥነት ለሚጸዱ የፋጅ ስርዓቶች፣ ጥቂት ክሎኖች ወደ CNS ክፍል መድረስ ስለሚችሉ። ስለዚህ፣ በመጀመሪያው ዙር፣ በዚህ በጣም ጥብቅ የሲኤስኤፍ ሞዴል ውስጥ የተወሰነ ቁጥር ያላቸው ክሎኖች ብቻ ስለተሰበሰቡ የቤተ-መጻሕፍት ልዩነት መቀነስ በጣም ትልቅ ነበር። ይህ በቪቮ ፓንኒንግ ስትራቴጂ እንደ በሲኤስኤፍ ክፍል ውስጥ ንቁ ክምችት፣ በደም ክፍል ውስጥ የክሎን መትረፍ እና በመጀመሪያዎቹ 10 ደቂቃዎች ውስጥ ከደም ውስጥ የቲ7 ፋጅ ክሎኖችን በፍጥነት ማስወገድ ያሉ በርካታ የምርጫ ደረጃዎችን ያካትታል (ምስል 1d እና ተጨማሪ ምስል 4M)። ስለዚህ፣ ከመጀመሪያው ዙር በኋላ፣ በሲኤስኤፍ ውስጥ የተለያዩ የፋጅ ክሎኖች ተለይተዋል፣ ምንም እንኳን ተመሳሳይ የመጀመሪያ ገንዳ ለግለሰብ እንስሳት ጥቅም ላይ ቢውልም። ይህ የሚያሳየው ብዙ ቁጥር ያላቸው የቤተ-መጻሕፍት አባላት ላሏቸው የምንጭ ቤተ-መጻሕፍት በርካታ ጥብቅ የምርጫ ደረጃዎች የብዝሃነት መጠን በከፍተኛ ሁኔታ እንደሚቀንስ ነው። ስለዚህ፣ የዘፈቀደ ክስተቶች የመጀመሪያው የምርጫ ሂደት ዋና አካል ይሆናሉ፣ ይህም ውጤቱን በእጅጉ ይነካል። በመጀመሪያው ቤተ-መጻሕፍት ውስጥ ያሉት ብዙዎቹ ክሎኖች በጣም ተመሳሳይ የሆነ የCSF ማበልጸጊያ ዝንባሌ ነበራቸው። ሆኖም፣ በተመሳሳይ የሙከራ ሁኔታዎች ውስጥ እንኳን፣ በመጀመሪያው ገንዳ ውስጥ ባለው የእያንዳንዱ የተወሰነ ክሎን አነስተኛ ቁጥር ምክንያት የምርጫ ውጤቶች ሊለያዩ ይችላሉ።
በሲኤስኤፍ የበለፀጉ ዘይቤዎች ከደም ውስጥ ካሉት ይለያሉ። የሚገርመው፣ በግለሰብ እንስሳት ደም ውስጥ ወደ ግሊሲን የበለፀጉ ፔፕታይዶች የመጀመሪያውን ሽግግር አስተውለናል። (ምስል 1ግ፣ ተጨማሪ ምስል 4e፣ 4f)። ግሊሲን ፔፕታይዶችን የያዙ ፋጅ የበለጠ የተረጋጉ እና ከደም ዝውውር የመውጣት ዕድላቸው አነስተኛ ሊሆን ይችላል። ሆኖም፣ እነዚህ ግሊሲን የበለፀጉ ፔፕታይዶች በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ናሙናዎች ውስጥ አልተገኙም፣ ይህም የተመረቱ ቤተ-መጻሕፍት ሁለት የተለያዩ የምርጫ ደረጃዎችን እንዳለፉ ይጠቁማል፡ አንዱ በደም ውስጥ እና ሌላኛው በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ እንዲከማች ተፈቅዶለታል። ከአራተኛው የምርጫ ዙር የተገኙት በሲኤስኤፍ የበለፀጉ ክሎኖች በስፋት ተፈትነዋል። ሁሉም ማለት ይቻላል በግለሰብ ደረጃ የተፈተኑ ክሎኖች ከባዶ መቆጣጠሪያ ፋጅ ጋር ሲነፃፀሩ በሲኤስኤፍ የበለፀጉ መሆናቸው ተረጋግጧል። አንድ የፔፕታይድ መምታት (#2077) በዝርዝር ተመርምሯል። ከሌሎች ምቶች ጋር ሲነጻጸር ረዘም ያለ የፕላዝማ ግማሽ ህይወት አሳይቷል (ምስል 3d እና ተጨማሪ ምስል 7)፣ እና የሚገርመው፣ ይህ ፔፕታይድ በሲ-ተርሚነስ ላይ የሳይስቴይን ቅሪት ይዟል። በቅርቡ ሲስተንን ወደ ፔፕታይዶች መጨመር ከአልቡሚን 29 ጋር በማያያዝ የፋርማኮኪኔቲክ ባህሪያቸውን ሊያሻሽል እንደሚችል ታይቷል። ይህ በአሁኑ ጊዜ ለፔፕታይድ #2077 የማይታወቅ ሲሆን ተጨማሪ ጥናት ያስፈልገዋል። አንዳንድ ፔፕታይዶች በሲኤስኤፍ ማበልጸጊያ (መረጃው አልታየም) ውስጥ የቫለንሲ-ጥገኝነት አሳይተዋል፣ ይህም ከቲ7 ካፕሲድ የገጽታ ጂኦሜትሪ ጋር የተያያዘ ሊሆን ይችላል። የተጠቀምንበት የቲ7 ስርዓት በእያንዳንዱ ፋጅ ቅንጣት 5-15 ቅጂዎችን አሳይቷል። IHC የተከናወነው በደም ሥር ወደ አይጦች ሴሬብራል ኮርቴክስ ውስጥ በመርፌ በተወሰዱ እጩ የእርሳስ ፋጅ ክሎኖች ላይ ነው (ተጨማሪ ምስል 8)። መረጃው እንደሚያሳየው ቢያንስ ሶስት ክሎኖች (ቁጥር 2002፣ ቁጥር 2009 እና ቁጥር 2077) ከቢቢቢ ጋር መስተጋብር ፈጥረዋል። ይህ የቢቢቢ መስተጋብር የCSF ክምችት ወይም የእነዚህ ክሎኖች እንቅስቃሴ በቀጥታ ወደ BCSFB ያስከትላል ወይ የሚለው መወሰን አሁንም ይቀራል። በአስፈላጊ ሁኔታ፣ የተመረጡት ፔፕታይዶች ሲዋሃዱ እና ከፕሮቲን ጭነት ጋር ሲታሰሩ የCSF የማጓጓዣ አቅማቸውን እንደያዙ እናሳያለን። የኤን-ተርሚናል ባዮቲኒላይድ ፔፕታይዶችን ከኤስኤ ጋር ማያያዝ በመሠረቱ በደም እና በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ ከሚገኙት የፋጅ ክሎኖች ጋር የተገኙ ውጤቶችን ይደግማል (ምስል 3e)። በመጨረሻም፣ የሊድ ፔፕታይድ #2077 ከኤስኤ ጋር የተጣመረውን የባዮቲኒላይድ ፔፕታይድ አጋች የቢኤሲ1 የአንጎል እንቅስቃሴን ማበረታታት እንደሚችል እናሳያለን፣ ይህም በሲኤስኤፍ ውስጥ የአቤታ40 ደረጃዎችን በከፍተኛ ሁኔታ በመቀነስ በሲኤንኤስ ውስጥ ግልጽ የሆኑ የፋርማኮዳይናሚክ ተፅእኖዎችን ያስከትላል (ምስል 4)። ሁሉንም የፔፕታይድ ቅደም ተከተል ተመሳሳይነት ፍለጋ በማድረግ በመረጃ ቋቱ ውስጥ ምንም አይነት ተመሳሳይነት ያላቸውን መለየት አልቻልንም። የቲ7 ቤተ-መጽሐፍት መጠን በግምት 109 መሆኑን ልብ ማለት አስፈላጊ ነው፣ ለ12-ሜርስ የቲዎሬቲካል ቤተ-መጽሐፍት መጠን ደግሞ 4 x 1015 ነው። ስለዚህ፣ የ12-ሜር ፔፕታይድ ቤተ-መጽሐፍት የብዝሃነት ቦታ ትንሽ ክፍል ብቻ መርጠናል፣ ይህም ማለት የበለጠ የተመቻቹ ፔፕታይዶች የእነዚህን የተለዩ ምቶች አጎራባች ቅደም ተከተል ቦታ በመገምገም ሊለዩ ይችላሉ ማለት ነው። በሐሳብ ደረጃ፣ የእነዚህን ፔፕታይዶች ተፈጥሯዊ ተመሳሳይነት ያላገኘንበት አንዱ ምክንያት የተወሰኑ የፔፕታይድ ዘይቤዎች ወደ አንጎል እንዳይገቡ ለመከላከል በዝግመተ ለውጥ ወቅት አለመመረጥ ሊሆን ይችላል።
አንድ ላይ ተዳምሮ፣ ውጤቶቻችን በቪቮ ውስጥ ያለውን የሴሬብሮቫስኩላር እንቅፋት የትራንስፖርት ስርዓቶችን በዝርዝር ለመለየት እና ለመለየት ለወደፊቱ ሥራ መሠረት ይሰጣሉ። የዚህ ዘዴ መሠረታዊ ማዋቀር የተመሠረተው በተግባራዊ የምርጫ ስትራቴጂ ላይ ሲሆን ይህም የአንጎል የደም ሥር ትስስር ባህሪያት ያላቸውን ክሎኖች ብቻ ሳይሆን ስኬታማ ክሎኖች በቪቮ ውስጥ ወደ CNS ክፍል ባዮሎጂያዊ እንቅፋቶችን ለማቋረጥ ውስጣዊ እንቅስቃሴ ያላቸው ወሳኝ እርምጃን ያካትታል። የእነዚህን ፔፕታይዶች የማጓጓዣ ዘዴ እና ከአንጎል ክልል ጋር ለተያያዘው ማይክሮቫስኩላር የመተሳሰር ምርጫቸውን ግልጽ ማድረግ ነው። ይህ ለ BBB እና ለተቀባዮች ለማጓጓዝ አዳዲስ መንገዶችን ሊያመጣ ይችላል። የተለዩት ፔፕታይዶች በቀጥታ ከሴሬብሮቫስኩላር ተቀባዮች ወይም በ BBB ወይም BCSFB በኩል ከሚጓጓዙት የደም ሥር ሊጋንድ ጋር ሊገናኙ እንደሚችሉ እንጠብቃለን። በዚህ ሥራ ውስጥ የተገኙት የ CSF ትራንስፖርት እንቅስቃሴ ያላቸው የፔፕታይድ ቬክተሮች የበለጠ ምርመራ ይደረግባቸዋል። በአሁኑ ጊዜ የእነዚህን ፔፕታይዶች BBB እና/ወይም BCSFB የማቋረጥ ችሎታቸውን በተመለከተ የአንጎል ልዩነትን እየመረመርን ነው። እነዚህ አዳዲስ ፔፕታይዶች አዳዲስ ተቀባዮችን ወይም መንገዶችን ለማግኘት እና እንደ ባዮሎጂክስ ያሉ ማክሮሞለኪውሎችን ወደ አንጎል ለማድረስ አዳዲስ በጣም ቀልጣፋ መድረኮችን ለማዘጋጀት እጅግ በጣም ጠቃሚ መሳሪያዎች ይሆናሉ።
ቀደም ሲል የተገለጸውን ዘዴ በመጠቀም ትልቁን ሲስተርና (ሲኤም) በካንሱ ይቅሉት። ማደንዘዣ የተደረገባቸው የዊስታር አይጦች (200-350 ግራም) በስቲሪቶታክሲክ መሳሪያ ላይ ተጭነዋል እና የራስ ቅሉን ለማጋለጥ በተላጨው እና በሴፕቲክ በተዘጋጀው የራስ ቆዳ ላይ መካከለኛ ቀዶ ጥገና ተደርጓል። በላይኛው ሳሽ አካባቢ ሁለት ቀዳዳዎችን ይከርፉ እና በቀዳዳዎቹ ውስጥ ያሉትን የማስተካከያ ዊንጮችን ያስሩ። ከማይዝግ ብረት ካኑላ ወደ ሲኤም ውስጥ ስቴሪዮታቲክ መመሪያ ለማግኘት በጎን ኦሲፒታል ክሬስት ላይ ተጨማሪ ቀዳዳ ተቆፍሯል። የጥርስ ሲሚንቶን በካንኑላ ዙሪያ ይተግብሩ እና በዊንጮች ያስጠብቁ። ፎቶ-ማከም እና የሲሚንቶ ማጠንከሪያ ከተደረገ በኋላ የቆዳ ቁስሉ በ4/0 ሱፕራሚድ ስፌት ተዘግቷል። የካኑላ ትክክለኛ አቀማመጥ በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (CSF) ድንገተኛ መፍሰስ ይረጋገጣል። አይጡን ከስቲሪቶታክሲክ መሳሪያው ያስወግዱት፣ ተገቢውን የድህረ ቀዶ ጥገና እንክብካቤ እና የህመም ማስታገሻ ያግኙ፣ እና በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ የደም ምልክቶች እስኪታዩ ድረስ ቢያንስ ለአንድ ሳምንት እንዲያገግም ይፍቀዱለት። የዊስታር አይጦች (Crl:WI/Han) የተገኙት ከቻርለስ ሪቨር (ፈረንሳይ) ነው። ሁሉም አይጦች በተወሰኑ በሽታ አምጪ ተህዋሲያን ነፃ በሆኑ ሁኔታዎች ውስጥ ተጠብቀዋል። ሁሉም የእንስሳት ሙከራዎች በስዊዘርላንድ ባዝል ከተማ የእንስሳት ህክምና ቢሮ ጸድቀዋል፣ እና በእንስሳት ፈቃድ ቁጥር 2474 (በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ እና በአይጥ አንጎል ውስጥ የሕክምና እጩዎችን ደረጃ በመለካት የንቁ የአንጎል ትራንስፖርት ግምገማ) መሠረት ተካሂደዋል።
አይጡን በሲኤም ካኑላ በእጁ ይዞ ቀስ ብለው ንቃተ ህሊናውን ይጠብቁ። ​​ዳቱራን ከካኑላ ውስጥ ያስወግዱት እና 10 µl ድንገተኛ የሚፈስ ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ይሰብስቡ። የካኑላ የመንቀሳቀስ ችሎታ በመጨረሻ ስለተበላሸ፣ በዚህ ጥናት ውስጥ የደም ብክለት ወይም የቀለም ለውጥ ምንም አይነት ማስረጃ የሌላቸው ግልጽ የሆኑ ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ናሙናዎች ብቻ ተካተዋል። በተመሳሳይ ጊዜ፣ በግምት ከ10-20 μl ደም ከጅራቱ ጫፍ ላይ ካለ ትንሽ ቀዶ ጥገና ወደ ሄፓሪን (ሲግማ-አልድሪች) ቱቦዎች ተወስዷል። የቲ7 ፋጅ በደም ሥር ከተወጋ በኋላ CSF እና ደም በተለያዩ ጊዜያት ተሰብስበዋል። እያንዳንዱ የሲኤስኤፍ ናሙና ከመሰብሰቡ በፊት በግምት 5-10 μl ፈሳሽ ተጥሏል፣ ይህም ከካቴተሩ የሞተ መጠን ጋር ይዛመዳል።
ቤተ-መጻሕፍት የተፈጠሩት በT7Select ስርዓት መመሪያ (ኖቫገን፣ ሮዘንበርግ እና ሌሎች፣ InNovations 6፣ 1-6፣ 1996) ላይ እንደተገለጸው T7Select 10-3b ቬክተርን በመጠቀም ነው። ባጭሩ፣ የዘፈቀደ 12-ሜር ዲኤንኤ ማስገቢያ በሚከተለው ቅርጸት ተሰብስቧል፡
የNNK ኮዶን በመግቢያው ውስጥ ድርብ ማቆሚያ ኮዶኖችን እና ከመጠን በላይ አሚኖ አሲድ እንዳይፈጠር ለመከላከል ጥቅም ላይ ውሏል። N የእያንዳንዱ ኑክሊዮታይድ በእጅ የተቀላቀለ ኢኩሞላር ጥምርታ ሲሆን K ደግሞ የአዴኒን እና የሳይቶሲን ኑክሊዮታይዶች በእጅ የተቀላቀለ ኢኩሞላር ጥምርታ ነው። ነጠላ የተዘጉ ክልሎች በ37°ሴ በKlenow buffer (ኒው ኢንግላንድ ባዮላብስ) ውስጥ በdNTP (ኖቫገን) እና በክሌኖው ኢንዛይም (ኒው ኢንግላንድ ባዮላብስ) ተጨማሪ ኢንኩቤሽን በማድረግ ወደ ድርብ የተዘጉ ዲ ኤን ኤ ተለውጠዋል። ከግብረመልሱ በኋላ፣ ድርብ የተዘረጉ ዲ ኤን ኤ በEtOH ዝናብ ተገኝቷል። የተገኘው ዲ ኤን ኤ በገደብ ኢንዛይሞች EcoRI እና HindIII (ሁለቱም ከሮቼ) ተፈጭቷል። የተሰነጠቀው እና የተጣራው (QIAquick፣ Qiagen) ማስገቢያ (T4 ligase፣ ኒው ኢንግላንድ ባዮላብስ) ከዚያም በፍሬም ውስጥ ወደ ቀድሞ የተሰነጠቀ T7 ቬክተር ከ10ቢ ካፕሲድ ጂን አሚኖ አሲድ 348 በኋላ ተያይዟል። የሊጌሽን ግብረመልሶች በ16°ሴ. በብልቃጥ ማሸጊያው ላይ ከመድረሳቸው በፊት ለ18 ሰዓታት ተጨምረዋል። የፋጅ ማሸጊያ ኢን ቪትሮ ከT7Select 10-3b ክሎኒንግ ኪት (ኖቫገን) ጋር በተሰጠው መመሪያ መሠረት ተከናውኗል፣ የማሸጊያው መፍትሄ ደግሞ ኤሼሪቺያ ኮላይ (BLT5615፣ ኖቫገን) በመጠቀም አንድ ጊዜ ወደ ሊሲስ ተሻሽሏል። ሊሳቶቹ በ -80° ሴ. ሴንትሪፉጅ፣ ቲትሬትድ እና እንደ ግሊሰሮል ክምችት መፍትሄ ተደርገዋል።
በብቸኝነት በተያዙ 454/Roche-amplicon fusion primers በመጠቀም በሾርባ ወይም በፕላት ውስጥ የተጨመሩ የፋጅ ተለዋዋጭ ክልሎች ቀጥተኛ PCR ማጉላት። የፊት ፊውዥን ፕራይመር ተለዋዋጭ ክልል (NNK) 12 (አብነት-ተኮር)፣ GS FLX ቲታኒየም አዳፕተር A እና ባለአራት-ቤዝ ቤተ-መጽሐፍት ቁልፍ ቅደም ተከተል (TCAG) የሚያካትቱ ቅደም ተከተሎችን ይዟል (ተጨማሪ ምስል 1a)፡
የተገላቢጦሽ ውህደት ፕሪመር ከመቅረጫ ዶቃዎች ጋር የተያያዘ ባዮቲን እና በኢምሉሽን PCR ወቅት ለክሎናል ማጉላት የሚያስፈልገውን የGS FLX ቲታኒየም አዳፕተር B ይዟል፡
ከዚያም አምፒኮኖቹ በ454 GS-FLX ቲታኒየም ፕሮቶኮል መሠረት ለ454/Roche pyrosequencing ተዳርገዋል። በእጅ ለሚሰራው የሳንገር ቅደም ተከተል (አፕሊድ ባዮሲስተምስ ሂታቺ 3730 xl ዲኤንኤ አናሊዘር)፣ የT7 ፋጅ ዲኤንኤ በPCR ተሻሽሎ በሚከተሉት ፕሪመር ጥንዶች ተቀርጿል፡
ከተናጠል ፕላከሮች የተገኙ ማስገቢያዎች የሮቼ ፈጣን ጅምር ዲኤንኤ ፖሊሜሬዝ ኪትን (እንደ አምራቹ መመሪያ) በመጠቀም ለPCR ማጉላት ተደርገዋል። ትኩስ ጅምር (10 ደቂቃ በ95°ሴ) እና 35 የማበረታቻ ዑደቶችን (50 ሰከንድ በ95°ሴ፣ 1 ደቂቃ በ50°ሴ እና 1 ደቂቃ በ72°ሴ) ያካሂዱ።
ከቤተ-መጻሕፍት የተገኘ ፋጅ፣ የዱር አይነት ፋጅ፣ ከሲኤስኤፍ እና ከደም የተረፈ ፋጅ ወይም የግለሰብ ክሎኖች በኤስቼሪቺያ ኮላይ BL5615 በቲቢ መረቅ (ሲግማ አልድሪክ) ወይም በ500 ሴ.ሜ 2 ምግቦች (ቴርሞ ሳይንቲፊክ) ለ4 ሰዓታት በ37°ሴ ተጨምረዋል። ​​ፋጅ ከሳህኖቹ የተወሰደው ሳህኖቹን በትሪስ-ኢዲቲኤ ቋት (ፍሉካ አናሊቲካል) በማጠብ ወይም ፕላከሮቹን በጸዳ የፒፔት ጫፎች በመሰብሰብ ነው። ፋጅ ከባህል ሱፐርናታንት ወይም ከኤክስትራክሽን ቋት በአንድ ዙር ፖሊ polyethylene glycol (PEG 8000) ዝናብ (ፕሮሜጋ) ተለይቶ በትሪስ-ኢዲቲኤ ቋት እንደገና ተዘግቷል።
የተጨመረው ፋጅ በደም ሥር (IV) መርፌ ከመውሰዱ በፊት የኢንዶቶክሲን ማስወገጃ ዶቃዎችን (ሚልቴንዪ ባዮቴክ) በመጠቀም 2-3 የኢንዶቶክሲን ማስወገጃ ዶቃዎችን (ሚልቴንዪ ባዮቴክ) በመጠቀም 2-3 ዙር የኢንዶቶክሲን ማስወገጃ ተደርገዋል። በመጀመሪያው ዙር 2×1012 ፋጆች አስተዋውቀዋል፤ በሁለተኛው ውስጥ 2×1010 ፋጆች፤ በሦስተኛው እና በአራተኛው የምርጫ ዙር፣ በእንስሳት ውስጥ 2×109 ፋጆች። በCSF እና በተጠቀሰው የጊዜ ነጥብ የተሰበሰቡ የደም ናሙናዎች ውስጥ ያለው የፋጅ ይዘት የሚወሰነው በአምራቹ መመሪያ መሠረት በፕላክ ቆጠራ ነው (T7Select system manual)። የፋጅ ምርጫ የተጣሩ ቤተ-መጻሕፍትን ወደ ጅራት ጅማት በደም ሥር በመርፌ በመወጋት ወይም ከቀዳሚው የምርጫ ዙር ከCSF የተወሰደውን ፋጅ እንደገና በመርፌ በመወጋት የተከናወነ ሲሆን ቀጣይ ምርቶች በቅደም ተከተል በ10 ደቂቃ፣ በ30 ደቂቃ፣ በ60 ደቂቃ፣ በ90 ደቂቃ፣ በ120 ደቂቃ፣ በ180 ደቂቃ እና በ240 ደቂቃ በCSF እና በደም ናሙናዎች ተካሂደዋል። በአጠቃላይ አራት ዙር ኢንቪቮ ፓኒንግ ተካሂዷል፤ በዚህም ሁለት የተመረጡ ቅርንጫፎች በመጀመሪያዎቹ ሶስት ዙር የምርጫ ዙሮች ተለይተው ተተነተኑ። ከመጀመሪያዎቹ ሁለት ዙር የምርጫ ዙሮች ከCSF የተወሰዱ ሁሉም የፋጅ ማስገቢያዎች ለ454/Roche pyrosequencing ተዳርገዋል፣ ከመጨረሻዎቹ ሁለት ዙር የምርጫ ዙሮች ከCSF የተወሰዱ ሁሉም ክሎኖች በእጅ ቅደም ተከተል ተደርገዋል። ከመጀመሪያው ዙር የምርጫ ዙሮች የተገኙ ሁሉም የደም ፋጆች ለ454/Roche pyrosequencing ተዳርገዋል። የፋጅ ክሎኖችን ለመወጋት፣ የተመረጡ ፋጆች በ37°ሴ በ500 ሴ.ሜ 2 ሳህኖች ላይ ለ4 ሰዓታት በኢ. ኮላይ (BL5615) ውስጥ ተጨምረዋል። ​​በተናጥል የተመረጡ እና በእጅ የተደረደሩ ክሎኖች በቲቢ መካከለኛ ውስጥ ተሰራጭተዋል። የፋጅ ማውጣት፣ የማጥራት እና የኢንዶቶክሲን ማስወገድ (ከላይ እንደተገለጸው)፣ በ300 μl ውስጥ 2×1010 ፋጆች/እንስሳት በደም ሥር ወደ አንድ የጅራት ደም ሥር ተወስደዋል።
የቅደም ተከተል ውሂብ ቅድመ-ሂደት እና ጥራት ያለው ማጣሪያ። ጥሬ 454/Roche ውሂብ ከአቅራቢ ሶፍትዌር በመጠቀም ከሁለትዮሽ መደበኛ የዥረት ካርታ ቅርጸት (sff) ወደ ፒርሰን የሰው ሊነበብ የሚችል ቅርጸት (fasta) ተቀይሯል። የኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተል ተጨማሪ ሂደት ከዚህ በታች እንደተገለጸው በባለቤትነት የቀረቡ የC ፕሮግራሞችን እና ስክሪፕቶችን (ያልተለቀቀ የሶፍትዌር ጥቅል) በመጠቀም ተከናውኗል። የዋና መረጃ ትንተና ጥብቅ ባለብዙ ደረጃ የማጣሪያ ሂደቶችን ያካትታል። ትክክለኛ የ12mer ማስገቢያ የዲኤንኤ ቅደም ተከተል የሌላቸውን ንባቦች ለማጣራት፣ ንባቦች በቅደም ተከተል ከጅምር መለያ (GTGATGTCGGGATCGAATTCT)፣ የማቆሚያ መለያ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) እና ከዳራ ማስገቢያ (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) ጋር ተሰልፈዋል። አሰላለፍ በአንድ አሰላለፍ31 እስከ 2 አለመጣጣሞችን ያስችላል። ስለዚህ፣ ያለ ጅምር እና የማቆሚያ መለያዎች እና የጀርባ ማስገቢያዎችን የያዙ ንባቦች፣ ማለትም፣ ከሚፈቀደው አለመጣጣም ብዛት በላይ የሆኑ አሰላለፎች፣ ከቤተ-መጽሐፍቱ ተወግደዋል። የተቀሩትን ንባቦች በተመለከተ፣ ከመጀመሪያው ምልክት የሚወጣው እና ከማቆሚያው ምልክት በፊት የሚያበቃው የN-mer ዲኤንኤ ቅደም ተከተል ከመጀመሪያው የንባብ ቅደም ተከተል ተወግዶ ተጨማሪ ሂደት ተደርጎበታል (ከዚህ በኋላ "አስገባ" ይባላል)። የገባው ከተተረጎመ በኋላ፣ በፕሪመር 5′ ጫፍ ላይ ያለው የመጀመሪያው የማቆሚያ ኮዶን በኋላ ያለው ክፍል ከገባው ይወገዳል። በተጨማሪም፣ በፕሪመር 3′ ጫፍ ላይ ያልተሟሉ ኮዶኖችን የሚያመጡ ኑክሊዮታይዶችም ተወግደዋል። የጀርባ ቅደም ተከተሎችን ብቻ የያዙ ማስገቢያዎችን ለማስወገድ፣ በአሚኖ አሲድ ንድፍ "PAG" የሚጀምሩ የተተረጎሙ ማስገቢያዎችም ተወግደዋል። ከ3 አሚኖ አሲዶች በታች የሆነ የድህረ-ትርጉም ርዝመት ያላቸው ፔፕታይዶች ከቤተ-መጽሐፍቱ ተወግደዋል። በመጨረሻም፣ በማስገቢያ ገንዳ ውስጥ ያለውን ድግግሞሽ ያስወግዱ እና የእያንዳንዱን ልዩ ማስገቢያ ድግግሞሽ ይወስኑ። የዚህ ትንተና ውጤቶች የኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተሎችን (ማስገቢያዎች) እና የእነሱን (የንባብ) ድግግሞሾች ዝርዝር ያካትታሉ (ተጨማሪ ምስሎች 1c እና 2)።
የቡድን N-mer የዲኤንኤ ማስገቢያዎች በቅደም ተከተል ተመሳሳይነት፡- 454/Roche-ተኮር የቅደም ተከተል ስህተቶችን (እንደ የቅደም ተከተል ሆሞፖሊመር ቅጥያዎች ያሉ ችግሮች) ለማስወገድ እና ብዙም አስፈላጊ ያልሆኑ ድግግሞሽዎችን ለማስወገድ፣ ቀደም ሲል የተጣሩ የN-mer ዲኤንኤ ቅደም ተከተል ማስገቢያዎች (አስገባዎች) በተመሳሳይነት ይደረደራሉ። ማስገቢያዎች (እስከ 2 የማይዛመዱ መሠረቶች ይፈቀዳሉ) እንደሚከተለው በተገለጸው ተደጋጋሚ ስልተ ቀመር በመጠቀም፡ ማስገቢያዎች መጀመሪያ በድግግሞሻቸው (ከከፍተኛው እስከ ዝቅተኛው) ይደረደራሉ፣ እና ተመሳሳይ ከሆኑ በሁለተኛ ደረጃ ምደባቸው በርዝመት (ከረዥም እስከ አጭር) ይገለፃሉ። ስለዚህ፣ በጣም ተደጋጋሚ እና ረጅሙ ማስገቢያዎች የመጀመሪያውን “ቡድን” ይገልጻሉ። የቡድን ድግግሞሽ ወደ ቁልፍ ድግግሞሽ ይቀናበራል። ከዚያም፣ በተደረደረው ዝርዝር ውስጥ የቀረው እያንዳንዱ ማስገባት በኒድልማን-ዉንሽ አሰላለፍ ወደ ቡድኑ ለመደመር ተሞክሯል። በአሰላለፍ ውስጥ ያሉ አለመጣጣሞች፣ ማስገቢያዎች ወይም ስረዛዎች ብዛት ከ2 ገደብ ካላለፈ፣ ማስገባት ወደ ቡድኑ ይታከላል፣ እና አጠቃላይ የቡድን ድግግሞሽ ማስገቢያው በምን ያህል ጊዜ እንደተጨመረ ይጨምራል። ወደ ቡድን የተጨመሩ ማስገቢያዎች ጥቅም ላይ እንደዋሉ ምልክት ይደረግባቸዋል እና ከተጨማሪ ሂደት ይገለላሉ። የማስገቢያ ቅደም ተከተል ወደ ቀድሞው ነባር ቡድን ሊታከል የማይችል ከሆነ፣ የማስገቢያ ቅደም ተከተል ተገቢውን የማስገቢያ ድግግሞሽ ያለው እና ጥቅም ላይ እንደዋለ ምልክት የተደረገበት አዲስ ቡድን ለመፍጠር ይጠቅማል። እያንዳንዱ የማስገቢያ ቅደም ተከተል አዲስ ቡድን ለመፍጠር ጥቅም ላይ ሲውል ወይም አስቀድሞ ባለ ነባር ቡድን ውስጥ ሊካተት ሲችል ድግግሞሹ ያበቃል። ከሁሉም በላይ፣ ኑክሊዮታይዶችን የያዙ የተቧደኑ ማስገቢያዎች በመጨረሻ ወደ ፔፕታይድ ቅደም ተከተሎች (የፔፕታይድ ቤተ-መጻሕፍት) ይተረጉማሉ። የዚህ ትንተና ውጤት የማስገቢያዎች ስብስብ እና የተከታታይ ንባቦችን ብዛት የሚያካትቱ ተጓዳኝ ድግግሞሾቻቸው ናቸው (ተጨማሪ ምስል 2)።
የሞቲፍ ማመንጫ፡- በልዩ የፔፕታይዶች ዝርዝር ላይ በመመስረት፣ ከዚህ በታች እንደሚታየው ሁሉንም ሊሆኑ የሚችሉ የአሚኖ አሲድ ቅጦችን (aa) የያዘ ቤተ-መጽሐፍት ተፈጠረ። እያንዳንዱ የርዝመት 3 ንድፍ ከፔፕታይዱ ተወጣ እና የተገላቢጦሽ ንድፉ ሁሉንም ቅጦች (ትሪፔፕታይዶች) የያዘ የጋራ የሞቲፍ ቤተ-መጽሐፍት ጋር ተጨምሯል። በጣም ተደጋጋሚ ሞቲፎች ቤተ-መጻሕፍት በቅደም ተከተል ተደርገዋል እና ድግግሞሽ ተወግደዋል። ከዚያም፣ በሞቲፍ ቤተ-መጻሕፍት ውስጥ ላለው እያንዳንዱ ትራይፔፕታይድ፣ በኮምፒውተር መሳሪያዎች በመጠቀም በቤተ-መጻሕፍት ውስጥ መኖሩን አረጋግጠናል። በዚህ ሁኔታ፣ የተገኘውን ሞቲፍ ትራይፔፕታይድ የያዘው ፔፕታይድ ድግግሞሽ በሞቲፍ ቤተ-መጻሕፍት ውስጥ ባለው ሞቲፍ ተጨምሮ ("የሞቲፎች ብዛት") ይመደባል። የሞቲፍ ማመንጨት ውጤት ሁሉንም የትሪፔፕታይዶች (ሞቲፎች) እና የየራሳቸውን እሴቶችን የያዘ ባለ ሁለት ገጽታ ድርድር ሲሆን፣ እነዚህም ንባቦች ሲጣሩ፣ ሲቦደኑ እና ሲተረጎሙ ተጓዳኝ ሞቲፍን የሚያስከትሉ የቅደም ተከተል ንባቦች ብዛት ናቸው። ከላይ በዝርዝር እንደተገለፀው መለኪያዎች።
የሞቲፎች ብዛት እና ተዛማጅ ስትራክትፕሎቶች መደበኛነት፡- የእያንዳንዱ ናሙና የሞቲፎች ብዛት መደበኛ የተደረገው በ
እዚህ ላይ ni ርዕስ i የያዙ የንባቦች ብዛት ነው። ስለዚህ፣ vi በናሙናው ውስጥ ሞቲፍ i የያዙ የንባቦች (ወይም ፔፕታይዶች) መቶኛ ድግግሞሽን ይወክላል። መደበኛ ያልሆኑ የሞቲፍ ብዛት P-እሴቶች የተሰሉት የፊሸርን ትክክለኛ ሙከራ በመጠቀም ነው። የሞቲፍ ብዛት ኮሬሎግራሞችን በተመለከተ፣ የስፓርማን ትስስሮች የተሰሉት ከR ጋር በተስተካከለው የሞቲፍ ብዛት በመጠቀም ነው።
በፔፕታይድ ቤተ-መጽሐፍት ውስጥ በእያንዳንዱ ቦታ ላይ የአሚኖ አሲዶችን ይዘት በዓይነ ሕሊናችን ለማየት፣ የድር አርማዎች 32፣ 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ተፈጥረዋል። በመጀመሪያ፣ በ12-ሜር ፔፕታይድ በእያንዳንዱ ቦታ ላይ የአሚኖ አሲዶች ይዘት በ20×12 ማትሪክስ ውስጥ ይቀመጣል። ከዚያም፣ በእያንዳንዱ ቦታ ላይ ተመሳሳይ አንጻራዊ አሚኖ አሲድ ይዘት የያዙ 1000 ፔፕታይዶች ስብስብ በፈጣን ቅደም ተከተል ቅርጸት ይፈጠራል እና ለድር አርማ 3 እንደ ግብዓት ይቀርባል፣ ይህም ለተሰጠ የፔፕታይድ ቤተ-መጽሐፍት በእያንዳንዱ ቦታ ላይ ያለውን አንጻራዊ አሚኖ አሲድ ይዘት በግራፊክ ውክልና ይፈጥራል። ባለብዙ-ልኬት የውሂብ ስብስቦችን በዓይነ ሕሊናችን ለማየት፣ የሙቀት ካርታዎች የተፈጠሩት በR ውስጥ በውስጥ የዳበረ መሳሪያ በመጠቀም ነው (ባዮስሄትማፕ፣ ገና ያልተለቀቀ የR ጥቅል)። በሙቀት ካርታዎች ውስጥ የቀረቡት ዴንድሮግራሞች የተሰሉት በዋርድ ተዋረዳዊ ክላስተር ዘዴ ከዩክሊዲያን ርቀት መለኪያ ጋር ነው። የሞቲፍ ውጤት መረጃ ስታቲስቲካዊ ትንተና፣ መደበኛ ያልሆነ ውጤት ለማግኘት የP እሴቶች የተሰሉት የፊሸርን ትክክለኛ ሙከራ በመጠቀም ነው። የሌሎች የውሂብ ስብስቦች የP-እሴቶች በR ውስጥ የተማሪውን የቲ-ሙከራ ወይም ANOVA በመጠቀም ተሰልተዋል።
የተመረጡ የፋጅ ክሎኖች እና ፋጆች ያለ ማስገቢያ በጅራት ጅማት በኩል በደም ሥር (2×1010 ፋጆች/እንስሳት በ300 μl PBS) ተወስደዋል። ደም ከመፍሰሱ እና ከዚያ በኋላ ከመስተካከል አስር ደቂቃዎች በፊት፣ ተመሳሳይ እንስሳት በደም ሥር 100 μl የDyLight594 መለያ ያለው ሌክቲን (Vector Laboratories Inc., DL-1177) ተወስደዋል። ፋጅ ከተወጋ ከ60 ደቂቃዎች በኋላ አይጦች በልብ ውስጥ በ50 ሚሊ ሊትር PBS ከዚያም በ50 ሚሊ ሊትር 4% PFA/PBS ተወስደዋል። የአንጎል ናሙናዎች በተጨማሪ በአንድ ሌሊት በ4% PFA/PBS ውስጥ ተስተካክለው በአንድ ሌሊት በ4°ሴ በ30% ሱክሮስ ውስጥ ተነክረዋል። ናሙናዎቹ በኦቲቲ ድብልቅ ውስጥ በቅጽበት ይቀዘቅዛሉ። የቀዘቀዙ ናሙናዎችን የኢሚውኖሂስቶኬሚካል ትንተና በክፍል ሙቀት ውስጥ በ1% BSA የታገዱ 30 µm ክሪዮሴክሽን እና በ4°ሴ በፖሊክሎናል FITC-labeled ፀረ እንግዳ አካላት ታጥቧል። በመጨረሻም፣ ክፍሎቹ በPBS 3 ጊዜ ታጥበው በኮንፎካል ሌዘር ማይክሮስኮፕ (Leica TCS SP5) ተመርምረዋል።
ቢያንስ 98% ንፁህ የሆኑ ሁሉም ፔፕታይዶች በጄንስክሪት ዩኤስኤ የተዋሃዱ፣ ባዮቲኒሌድ እና ሊዮፊሊዝድ የተደረጉ ናቸው። ባዮቲን በኤን-ተርሚነስ ላይ ተጨማሪ ባለ ሶስት እጥፍ ግሊሲን ስፔሰር በኩል ታስሯል። ሁሉንም ፔፕታይዶች በጅምላ ስፔክትሮሜትሪ ይፈትሹ።
ስትሬፕታቪዲን (ሲግማ S0677) ከባዮቲኒሌትድ ፔፕታይድ፣ ባዮቲኒሌትድ BACE1 ኢንኪቢተሪ ፔፕታይድ ወይም በ5-10% DMSO/በPBS ውስጥ በተተከለው ባዮቲኒሌትድ BACE1 ኢንኪቢተሪ ፔፕታይድ እና BACE1 ኢንኪቢተሪ ፔፕታይድ ጥምረት (3:1 ጥምርታ) ጋር ተቀላቅሏል። መርፌ ከመውሰዱ በፊት ለ1 ሰዓት በክፍል ሙቀት። ስትሬፕታቪዲን-ኮንጁጌትድ ፔፕታይዶች በ10 ሚ.ግ/ኪ.ግ መጠን በደም ሥር ወደ የአንጎል ቀዳዳ ባለው የአይጦች የጅራት ደም ሥር በአንዱ ውስጥ ተወስደዋል።
የስትሪፕታቪዲን-ፔፕታይድ ውህዶች ክምችት በELISA ተገምግሟል። የኑንክ ማክሲሶርፕ ማይክሮቲተር ሳህኖች (ሲግማ) በአንድ ሌሊት በ4°ሴ በ1.5 μg/ml የአይጥ ፀረ-ስትሬፕታቪዲን ፀረ እንግዳ አካል (ቴርሞ፣ MA1-20011) ተሸፍነዋል። ከታገዱ በኋላ (የማገጃ ቋት፡ 140 nM NaCL፣ 5 mM EDTA፣ 0.05% NP40፣ 0.25% ጄላቲን፣ 1% BSA) በክፍል ሙቀት ለ2 ሰዓታት፣ ሳህኑን በ0.05% Tween-20/PBS (wash buffer) ለ3 ሰከንድ ያጠቡ፣ CSF እና የፕላዝማ ናሙናዎች በብሎክ ቋት (ፕላዝማ 1:10,000፣ CSF 1:115) በተበረዙ ጉድጓዶች ውስጥ ተጨምረዋል። ​​ከዚያም ሳህኑ በ4°ሴ በዲቴክቲቭ አንቲቦዲ (1 μg/ml፣ ፀረ-ስትሬፕታቪዲን-HRP፣ Novus NB120-7239) ሌሊቱን ሙሉ ታፍኗል። ከሶስት የማጠቢያ ደረጃዎች በኋላ፣ ስትሬፕታቪዲን በቲኤምቢ ንጣፎች መፍትሄ (ሮቼ) ውስጥ እስከ 20 ደቂቃ ድረስ በማቆየት ተገኝቷል። የቀለም እድገትን በ1M H2SO4 ካቆሙ በኋላ የመምጠጥ አቅሙን በ450 nm ይለኩ።
የስትሬፕታቪዲን-ፔፕታይድ-BACE1 አጋቾች ውስብስብ ተግባር በአምራቹ ፕሮቶኮል (ዋኮ፣ 294-64701) መሠረት በAβ(1-40) ELISA ተገምግሟል። ባጭሩ፣ የCSF ናሙናዎች በመደበኛ ዲሉየንት (1:23) ተበርዘው በBNT77 መያዣ ፀረ እንግዳ አካል በተሸፈኑ 96-ጉድጓድ ሳህኖች ውስጥ በ4°ሴ በአንድ ሌሊት እንዲቀቡ ተደርጓል። ከአምስት የመታጠቢያ ደረጃዎች በኋላ፣ HRP-conjugated BA27 antibody ተጨምሮ ለ2 ሰዓታት በ4°ሴ እንዲቀበር ተደርጓል፣ ከዚያም አምስት የመታጠቢያ ደረጃዎች ተከተሉት። Aβ(1–40) በቲኤምቢ መፍትሄ ውስጥ ለ30 ደቂቃዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ በማቆየት ተገኝቷል። የቀለም እድገት በማቆሚያ መፍትሄ ከተቆመ በኋላ፣ የመምጠጥ አቅሙን በ450 nm ይለኩ። የፕላዝማ ናሙናዎች ከAβ(1–40) ELISA በፊት ለጠጣር ደረጃ ማውጣት ተደርገዋል። ፕላዝማ በ96-ጉድጓድ ሳህኖች ውስጥ ወደ 0.2% DEA (ሲግማ) ተጨምሮ በክፍል ሙቀት ለ30 ደቂቃዎች እንዲቀበር ተደርጓል። የSPE ሳህኖችን (Oasis, 186000679) በተከታታይ በውሃ እና 100% ሜታኖል ካጠቡ በኋላ፣ የፕላዝማ ናሙናዎች ወደ SPE ሳህኖች ተጨምረው ሁሉም ፈሳሽ ተወግዷል። ናሙናዎቹ (በመጀመሪያ በ5% ሜታኖል ከዚያም በ30% ሜታኖል) ታጥበው በ2% NH4OH/90% ሜታኖል ተወስደዋል። ኤሉቴቱን በ55°ሴ ለ99 ደቂቃዎች በቋሚ N2 ጅረት ካደረቁ በኋላ፣ ናሙናዎቹ በመደበኛ ማሟያዎች ቀንሰዋል እና Aβ(1–40) ከላይ እንደተገለፀው ተለኩ።
ይህንን ጽሑፍ እንዴት መጥቀስ ይቻላል፡ ኡሪች፣ ኢ. እና ሌሎችም። በቪቮ ውስጥ ተለይተው የሚታወቁ የትራንስ ፔፕታይዶችን በመጠቀም ወደ አንጎል የጭነት አቅርቦት። ሳይንስ። 5፣ 14104፤ doi:10.1038/srep14104 (2015)።
ሊኮታ ጄ.፣ ስክጆሪንጅ ቲ.፣ ቶምሰን ኤልቢ እና ሙስ ቲ. የማክሮሞለኪውላር መድኃኒቶችን ወደ አንጎል በዒላማ የተደረገ ሕክምና ማድረስ። የኒውሮኬሚስትሪ ጆርናል 113፣ 1–13፣ 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)።
ብራስንጄቪች፣ አይ.፣ ስቴይንቡሽ፣ ኤችደብሊው፣ ሽሚትዝ፣ ሲ.፣ እና ማርቲኔዝ-ማርቲኔዝ፣ ፒ. በደም-አንጎል እንቅፋት በኩል የፔፕታይድ እና የፕሮቲን መድኃኒቶችን ማቅረብ። ፕሮግ ኒውሮባዮል 87፣ 212–251፣ 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009)።
ፓድሪጅ፣ ደብሊውኤም የደም-አንጎል እንቅፋት፡- በአንጎል የመድኃኒት እድገት ውስጥ ያለ ማነቆ። NeuroRx 2፣ 3–14፣ 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005)።
ጆሃንሰን፣ ኬኢ፣ ዱንካን፣ ጄኤ፣ ስቶፓ፣ ኢጂ፣ እና ባይርድ፣ ኤ. የተሻሻለ የመድኃኒት አቅርቦት እና በኮሮይድ ፕሌክስ-ሲኤስኤፍ መንገድ በኩል ወደ አንጎል ኢላማ ማድረግ ተስፋዎች። የመድኃኒት ምርምር 22፣ 1011–1037፣ 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005)።
ፓድሪጅ፣ ደብሊውኤም ለአእምሮ አቅርቦት ከሞለኪውላር ትሮጃን ፈረሶች ጋር የባዮፋርማሱቲካልስ ዘመናዊነት። ባዮኮንጁግ ኬም 19፣ 1327–1338፣ 10.1021/bc800148t (2008)።
ፓድሪጅ፣ ደብሊውኤም ሪሴፕተር-ሚዲያተር ፔፕታይድ በደም-አንጎል እንቅፋት ውስጥ። ኢንዶክር ሪቭ. 7፣ 314–330 (1986)።
ኒዎህነር፣ ጄ. እና ሌሎችም። ሞኖቫለንት ሞለኪውላር ሹትሎችን በመጠቀም የአንጎል ዘልቆ መግባት እና የሕክምና ፀረ እንግዳ አካላት ውጤታማነትን ይጨምሩ። ኒውሮን 81፣ 49–60፣ 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)።
ቢን-ሊ፣ ኤን. እና ሌሎችም። የትራንስሪን ተቀባይ (TfR) ትራንስፖርት የTfR ፀረ እንግዳ አካላትን የአፊኒቲ ልዩነቶች የአንጎልን ቅበላ ይወስናል። J Exp Med 211፣ 233–244፣ 10.1084/jem.20131660 (2014)።