Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን።የተወሰነ የሲኤስኤስ ድጋፍ ያለው የአሳሽ ስሪት እየተጠቀሙ ነው።ለበለጠ ልምድ፣ የዘመነ አሳሽ እንድትጠቀም እንመክርሃለን (ወይም የተኳኋኝነት ሁነታን በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር አሰናክል)።በተጨማሪም, ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ, ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናሳያለን.
በአንድ ጊዜ የሶስት ስላይዶችን ካርሶል ያሳያል።በአንድ ጊዜ በሶስት ስላይዶች ለመንቀሳቀስ የቀደመውን እና ቀጣይ ቁልፎችን ይጠቀሙ ወይም በመጨረሻው ላይ ያሉትን ተንሸራታቾች በአንድ ጊዜ በሶስት ስላይዶች ለማለፍ ይጠቀሙ።
የደም-አንጎል እንቅፋት እና የደም-አንጎል እንቅፋት የባዮቴራፕቲክ ወኪሎች በማዕከላዊው የነርቭ ሥርዓት ውስጥ ወደ ዒላማቸው እንዳይደርሱ ይከላከላሉ, በዚህም የነርቭ በሽታዎችን ውጤታማ ህክምና ያግዳሉ.አዲስ የአእምሮ ማጓጓዣዎችን በ Vivo ውስጥ ለማግኘት፣ የቲ 7 ፋጅ ፔፕታይድ ቤተመፃህፍት እና በተከታታይ የተሰበሰበ ደም እና ሴሬብሮስፒናል ፈሳሹን (ሲኤስኤፍ) አስተዋውቀናል የታሸገ የአይጦችን ትልቅ ገንዳ ሞዴል በመጠቀም።ከአራት ዙር ምርጫ በኋላ የተወሰኑ የፋጅ ክሎኖች በሲኤስኤፍ በጣም የበለፀጉ ነበሩ።የግለሰብ እጩ peptides መሞከር በCSF ውስጥ ከ1000 እጥፍ በላይ ብልጽግና አሳይቷል።የፔፕታይድ-መካከለኛ ወደ አንጎል የማድረስ ባዮአክቲቪቲ በ 40% በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ የሚገኘው የአሚሎይድ-β መጠን በመቀነስ የተረጋገጠው BACE1 peptide inhibitor ከታወቀ ልቦለድ ትራንዚት peptide ጋር የተያያዘ ነው።እነዚህ ውጤቶች እንደሚጠቁሙት በ Vivo phage መምረጫ ዘዴዎች ተለይተው የሚታወቁት peptides የማክሮ ሞለኪውሎችን በስርዓት ወደ አንጎል ለማድረስ ጠቃሚ ተሽከርካሪዎች ሊሆኑ ይችላሉ ።
የማዕከላዊው የነርቭ ሥርዓት (CNS) የታለመ ሕክምና ምርምር በአብዛኛው ያተኮረው የተመቻቹ መድኃኒቶችን እና የ CNS ዒላማ ባህሪያትን የሚያሳዩ ወኪሎችን በመለየት ላይ ያተኮረ ሲሆን ይህም ወደ አንጎል ንቁ የመድኃኒት አቅርቦትን የሚወስዱ ዘዴዎችን በማግኘት ላይ ነው።የመድኃኒት አቅርቦት በተለይም ትላልቅ ሞለኪውሎች የዘመናዊው የኒውሮሳይንስ መድሐኒት ልማት ዋና አካል በመሆኑ ይህ አሁን መለወጥ ጀምሯል።የማዕከላዊው የነርቭ ሥርዓት አካባቢ በደም-አንጎል እንቅፋት (ቢቢቢ) እና የደም-አንጎል እንቅፋት (BCBB) 1 ባካተተ ሴሬብሮቫስኩላር ባሪየር ሲስተም በደንብ የተጠበቀ ነው፣ ይህም መድሃኒቶችን ወደ አንጎል ለማድረስ ፈታኝ ያደርገዋል።ከሞላ ጎደል ሁሉም ትላልቅ ሞለኪውል መድሃኒቶች እና ከ98% በላይ የሚሆኑ ትናንሽ ሞለኪውሎች መድሃኒቶች ከአንጎል ውስጥ እንደሚወገዱ ይገመታል3.ለዚህም ነው ውጤታማ እና ልዩ የሕክምና መድሃኒቶችን ወደ CNS 4,5 የሚያቀርቡ አዳዲስ የአንጎል ትራንስፖርት ስርዓቶችን መለየት በጣም አስፈላጊ የሆነው.ይሁን እንጂ BBB እና BCSFB ወደ ሁሉም የአንጎል መዋቅሮች ውስጥ ዘልቀው በሚገቡበት ሰፊ የደም ሥር (vasculature) አማካኝነት አደንዛዥ ዕፅን ለማድረስ ጥሩ እድል ይሰጣሉ።ስለዚህ አሁን ያለው ጥረቶች ወራሪ ያልሆኑትን ወደ አንጎል የማድረስ ዘዴዎችን በአብዛኛው የተመሰረተው ውስጣዊውን የ BBB6 መቀበያ በመጠቀም ተቀባይ መካከለኛ መጓጓዣ (PMT) ዘዴ ነው.የ Transferrin receptor pathway7,8 በመጠቀም የቅርብ ጊዜ ቁልፍ እድገቶች ቢኖሩም, የተሻሻሉ ባህሪያት ያላቸው አዲስ የአቅርቦት ስርዓቶች ተጨማሪ እድገት ያስፈልጋል.ለዚህም፣ ግባችን የሲኤስኤፍ ትራንስፖርትን ለማስታረቅ የሚችሉ peptidesን መለየት ነበር፣ ምክንያቱም በመርህ ደረጃ ማክሮ ሞለኪውሎችን ወደ CNS ለማድረስ ወይም አዲስ ተቀባይ መንገዶችን ለመክፈት ይጠቅማሉ።በተለይም ሴሬብሮቫስኩላር ሲስተም (ቢቢቢ እና ቢኤስሲኤፍቢ) ልዩ ተቀባይ እና አጓጓዦች የባዮቴራፕቲክ መድኃኒቶችን ንቁ ​​እና ልዩ ማድረስ የሚችሉ ኢላማዎች ሆነው ሊያገለግሉ ይችላሉ።ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (CSF) የ choroid plexus (CS) ሚስጥራዊ ምርት ነው እና ከአዕምሮው የመሃል ፈሳሽ ጋር በቀጥታ ግንኙነት ያለው በሱባራክኖይድ ክፍተት እና በ ventricular space4 በኩል ነው.በቅርብ ጊዜ ታይቷል subarachnoid cerebrospinal fluid ከመጠን በላይ ወደ አንጎል ኢንተርስቴት ውስጥ ይሰራጫል.ይህንን የሱባራክኖይድ ፍሰት ትራክት በመጠቀም ወይም በቀጥታ በBBB በኩል ወደ ፓረንቺማል ቦታ እንደምናገኝ ተስፋ እናደርጋለን።ይህን ለማግኘት፣ በእነዚህ ሁለት የተለያዩ መንገዶች የሚጓጓዙ peptides በትክክል የሚለይ በ Vivo phage ምርጫ ስትራቴጂ ተግባራዊ አድርገናል።
አሁን ከፍተኛ የቤተ-መጽሐፍት ልዩነት ያላቸውን የመጀመሪያ ምርጫ ዙሮች ለመከታተል ከሲኤስኤፍ ናሙና ጋር ከከፍተኛ የፍተሻ ቅደም ተከተል (HTS) ጋር ተከታታይነት ያለው በ vivo phage ማሳያ የማጣሪያ ዘዴን እንገልፃለን።የደም መበከልን ለማስወገድ በንቃት በሚያውቁ አይጦች ላይ በቋሚነት በተተከለ ትልቅ የውሃ ማጠራቀሚያ (CM) cannula ተከናውኗል።በአስፈላጊ ሁኔታ, ይህ አካሄድ ሴሬብሮቫስኩላር ግርዶሽ ላይ የመጓጓዣ እንቅስቃሴ ጋር ሁለቱም አንጎል-ማነጣጠር እና peptides ይመርጣል.በትንሽ መጠናቸው (~ 60 nm) 10 የተጠቀምንበት T7 phages እና የ endothelial እና/ወይም epithelial-medulla barrier ትራንስሴሉላር መሻገርን የሚፈቅዱ vesicles ለማጓጓዝ ተስማሚ መሆናቸውን ጠቁመናል።ከአራት ዙሮች ፓኒንግ በኋላ፣ የፋጌ ህዝብ በቪቮ ሲኤስኤፍ ማበልፀግ እና ሴሬብራል ማይክሮዌልሴል ማህበር ውስጥ ጠንካራ እያሳዩ ነበሩ።በአስፈላጊ ሁኔታ, ተመራጭ እና በኬሚካል የተዋሃዱ ምርጥ እጩ peptides የፕሮቲን ጭነት ወደ ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ማጓጓዝ እንደሚችሉ በማሳየት ግኝቶቻችንን ማረጋገጥ ችለናል.በመጀመሪያ ፣ የ CNS ፋርማኮዳይናሚክ ተፅእኖዎች የሚመሩት መሪ ትራንዚት peptide ከ BACE1 peptide ተከላካይ ጋር በማጣመር ነው።በ Vivo ተግባራዊ የማጣሪያ ስልቶች ልብ ወለድ የአንጎል ትራንስፖርት peptides እንደ ውጤታማ የፕሮቲን ጭነት ተሸካሚዎች መለየት እንደሚችሉ ከማሳየት በተጨማሪ፣ ተመሳሳይ ተግባራዊ ምርጫ አቀራረቦችም ልብ ወለድ የአንጎል ትራንስፖርት መንገዶችን በመለየት አስፈላጊ ይሆናሉ ብለን እንጠብቃለን።
በፕላክ ፎርሚንግ አሃዶች (PFU) ላይ በመመስረት ከፋጌ ማሸግ ደረጃ በኋላ፣ በግምት 109 ልዩነት ያለው የዘፈቀደ 12-ሜር መስመራዊ T7 phage peptides ቤተ-መጽሐፍት ተዘጋጅቶ ተፈጠረ (ቁሳቁሶች እና ዘዴዎችን ይመልከቱ)።ይህንን ቤተ-መጽሐፍት በጥንቃቄ የተተነተነው በ Vivo panning በፊት መሆኑን ልብ ሊባል የሚገባው ጉዳይ ነው።PCR የphage ቤተመፃህፍት ናሙናዎችን ማጉላት የተሻሻሉ ፕሪመርቶችን በመጠቀም ለኤችቲኤስ በቀጥታ ተፈፃሚ የሆኑ አምፖሎችን ፈጥረዋል (ተጨማሪ ምስል 1 ሀ)።በ) የ HTS11 ቅደም ተከተል ስህተቶች ፣ ለ) በፕሪመርስ ጥራት (NNK) 1-12 እና ሐ) የዱር-አይነት (wt) ፋጅ (አጽም ማስገቢያዎች) በተጠባባቂ ቤተ-መጽሐፍት ውስጥ መገኘቱ ፣ የተረጋገጠ ቅደም ተከተል መረጃን ብቻ ለማውጣት ተከታታይ የማጣራት ሂደት ተተግብሯል (ተጨማሪ ምስል 1 ለ)።እነዚህ የማጣሪያ ደረጃዎች በሁሉም የHTS ተከታታይ ቤተ-መጻሕፍት ላይ ተፈጻሚ ይሆናሉ።ለመደበኛው ቤተ-መጽሐፍት በድምሩ 233,868 ንባቦች የተገኙ ሲሆን ከእነዚህ ውስጥ 39% የሚሆኑት የማጣሪያ መስፈርቶችን በማለፍ ለቤተ-መጻህፍት ትንተና እና ለቀጣይ ዙሮች ምርጫ ጥቅም ላይ ውለዋል (ተጨማሪ ምስል 1c-e)።ንባቦቹ በዋነኛነት የ 3 ቤዝ ጥንዶች ብዜቶች ርዝመታቸው 36 ኑክሊዮታይድ (ተጨማሪ ምስል 1 ሐ) ሲሆን ይህም የላይብረሪውን ዲዛይን (NNK) 1-12 ያረጋግጣል።በተለይም፣ 11% የሚሆኑት የቤተ መፃህፍቱ አባላት ባለ 12-ልኬት የዱር አይነት (wt) የጀርባ አጥንት PAGISRELVDKL ያስገባሉ፣ እና ከተከታታዩ ውስጥ ግማሽ ያህሉ (49%) ማስገባት ወይም ስረዛዎችን ይይዛሉ።የቤተ መፃህፍቱ HTS በቤተ-መጽሐፍት ውስጥ ከፍተኛ የ peptides ልዩነት አረጋግጧል: ከ 81% በላይ የፔፕታይድ ቅደም ተከተሎች አንድ ጊዜ ብቻ ተገኝተዋል እና 1.5% ብቻ የተከሰቱት በ ≥4 ቅጂዎች (ተጨማሪ ምስል 2 ሀ).በአሚኖ አሲዶች (AA) በሁሉም 12 ቦታዎች ላይ ያለው ድግግሞሽ በተበላሸ NKK ሪፐርቶር (ተጨማሪ ምስል 2 ለ) ከሚመነጩት ኮዶች ብዛት ከሚጠበቀው ድግግሞሾች ጋር በጥሩ ሁኔታ ይዛመዳል።በእነዚህ ማስገቢያዎች የተመዘገቡት የ aa ተረፈ ድግግሞሾች ከተሰላው ድግግሞሽ (r = 0.893) (ተጨማሪ ምስል 2 ሐ) ጋር በጥሩ ሁኔታ ይዛመዳሉ።የphage ቤተ-ፍርግሞችን ለመወጋት ዝግጅት የማጉላት እና የ endotoxin መወገድን ያካትታል።ይህ ቀደም ሲል የፋጌ ቤተ-መጻሕፍትን ልዩነት ሊቀንስ እንደሚችል ታይቷል12,13.ስለዚህ፣ የኢንዶቶክሲን መወገድ የተደረገበትን ፕላስቲን-አምፕሊፋይድ ፋጅ ቤተ-መጽሐፍትን በቅደም ተከተል አስቀመጥን እና የAA ድግግሞሽን ለመገመት ከመጀመሪያው ቤተ-መጽሐፍት ጋር አነጻጽርን።ጠንካራ ግንኙነት (r = 0.995) በዋናው ገንዳ እና በተጨመረው እና በተጣራ ገንዳ (ተጨማሪ ምስል 2 መ) መካከል ታይቷል፣ ይህ የሚያሳየው T7 phageን በመጠቀም በሰሌዳዎች ላይ በተጨመሩ ክሎኖች መካከል ያለው ፉክክር ትልቅ አድልዎ እንዳልፈጠረ ያሳያል።ይህ ንጽጽር በእያንዳንዱ ቤተ-መጽሐፍት ውስጥ ባለው የ tripeptide motif ድግግሞሽ ላይ የተመሰረተ ነው፣ ምክንያቱም የቤተ-መጻህፍት ልዩነት (~109) በHTS እንኳን ሙሉ በሙሉ ሊቀረጽ አይችልም።በእያንዳንዱ ቦታ ላይ ያለው የድግግሞሽ ትንተና በገቡት የመጨረሻዎቹ ሶስት ቦታዎች ላይ ትንሽ አቀማመጥ ላይ የተመሰረተ አድልዎ አሳይቷል (ተጨማሪ ምስል 2e).በማጠቃለያው ፣የላይብረሪውን ጥራት እና ልዩነት ተቀባይነት ያለው እና በበርካታ ዙር ምርጫዎች መካከል በፋጌ ቤተ-መጻህፍት በማጉላት እና በመዘጋጀቱ ምክንያት በብዝሃነት ላይ መጠነኛ ለውጦች ተስተውለዋል ብለን ደመደምን።
ተከታታይ ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ናሙና በቀዶ ሕክምና ካንኑላ ወደ CM አይጦች በመትከል በደም ሥር የሚወጋውን T7 phage በ BBB እና/ወይም BCSFB (ምስል 1a-b) መለየት ለማመቻቸት ያስችላል።በ vivo ምርጫ የመጀመሪያዎቹ ሶስት ዙሮች ውስጥ ሁለት ገለልተኛ የመምረጫ ክንዶችን (ክንዶች A እና B) ተጠቀምን (ምስል 1 ሐ)።በመጀመሪያዎቹ ሶስት ዙሮች ምርጫ ላይ የገባውን አጠቃላይ የፋጅ መጠን በመቀነስ የምርጫውን ጥብቅነት ቀስ በቀስ ጨምረናል።ለአራተኛው ዙር ፓኒንግ ከቅርንጫፎች A እና B ናሙናዎችን በማጣመር ሶስት ተጨማሪ ገለልተኛ ምርጫዎችን አደረግን.በዚህ ሞዴል ውስጥ የT7 phage ቅንጣቶችን በ vivo ባህሪያት ለማጥናት የዱር-አይነት ፋጅ (PAGISRELVDKL ዋና አስገባ) በጅራት ጅማት ወደ አይጦች ተወጉ።ከሴሬብሮስፒናል ፈሳሾች እና ደም በተለያየ ጊዜ ማገገም እንደሚያሳየው በአንጻራዊ ሁኔታ አነስተኛ T7 icosahedral phages ከደም ክፍል ውስጥ ፈጣን የመነሻ ደረጃ ነበራቸው (ተጨማሪ ምስል 3)።በሚተዳደረው titers እና በአይጦች የደም መጠን ላይ በመመስረት፣ በግምት 1% wt ብቻ አስልተናል።በደም ውስጥ ከ 10 ደቂቃዎች በኋላ በደም ውስጥ ከሚሰጠው መርፌ phage ተገኝቷል.ከዚህ የመጀመሪያ ፈጣን ማሽቆልቆል በኋላ፣ ቀርፋፋ የመጀመሪያ ደረጃ ክሊራንስ በ27.7 ደቂቃ ግማሽ ህይወት ተለካ።በአስፈላጊ ሁኔታ፣ ከሲኤስኤፍ ክፍል የተገኙት በጣም ጥቂት ፋጃጆች ብቻ ናቸው፣ ይህም ለዱር ፋጅ ወደ CSF ክፍል ፍልሰት ዝቅተኛ መሆኑን ያሳያል (ተጨማሪ ምስል 3)።በአማካይ፣ በጠቅላላው የናሙና ጊዜ (0-250 ደቂቃ) ውስጥ በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ ከ1 x 10-3% የቲ 7 ፋጅ በደም ውስጥ እና 4 x 10-8% መጀመሪያ ላይ ከተመረቱት ፋጌዎች ብቻ ተገኝተዋል።በተለይም በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ ያለው የዱር ፋጅ ግማሽ ህይወት (25.7 ደቂቃ) በደም ውስጥ ከሚታየው ጋር ተመሳሳይ ነው.እነዚህ መረጃዎች እንደሚያሳዩት የሲኤስኤፍ ክፍልን ከደም የሚለየው እንቅፋት በCM-cannulated አይጥ ውስጥ እንዳለ፣ ይህም በ Vivo ውስጥ የፋጌ ቤተ-መጻሕፍት ከደም ወደ CSF ክፍል በቀላሉ የሚወሰዱ ክሎኖችን ለመለየት ያስችላል።
(ሀ) ሴሬብሮስፒናል ፈሳሹን (CSF) ከትልቅ ገንዳ እንደገና ናሙና ለማውጣት ዘዴ ማዘጋጀት።(ለ) የማዕከላዊው የነርቭ ሥርዓት ሴሉላር አካባቢን የሚያሳይ ሥዕላዊ መግለጫ እና የደም-አንጎል እንቅፋት (ቢቢቢ) እና የደም-አንጎል እንቅፋቶችን የሚያቋርጡ peptides ለመለየት ጥቅም ላይ የዋለውን የመምረጫ ዘዴ ያሳያል።(ሐ) Vivo phage ማሳያ የፍተሻ ገበታ።በእያንዳንዱ ምርጫ ዙር ፋጃጆች (በቀስቶች ውስጥ ያሉ የእንስሳት መለያዎች) በደም ሥር ገብተዋል።ሁለት ገለልተኛ ተለዋጭ ቅርንጫፎች (A, B) እስከ አራተኛው ዙር ምርጫ ድረስ ተለይተው ይቀመጣሉ.ለ 3 እና 4 ዙሮች፣ ከሲኤስኤፍ የወጣው እያንዳንዱ የፋጌ ክሎሎን በእጅ በቅደም ተከተል ቀርቧል።(መ) ከደም (ቀይ ክበቦች) እና ሴሬብሮስፒናል ፈሳሾች (አረንጓዴ ትሪያንግሎች) የተነጠለ ኪኔቲክስ በመጀመሪያ ዙር ምርጫ በሁለት የታሸጉ አይጦች T7 peptide Library (2 x 1012 phages/እንስሳ) በደም ውስጥ ከገባ በኋላ።ሰማያዊ ካሬዎች አጠቃላይ የደም መጠንን ከግምት ውስጥ በማስገባት በደም ውስጥ ያለው የፋጅ አማካይ የመነሻ ትኩረትን ያመለክታሉ።ጥቁሩ ካሬዎች ከደም ፋጅ ክምችት የወጣውን የ y መስመር መገናኛ ነጥብ ያመለክታሉ።(e,f) በፔፕታይድ ውስጥ የሚገኙትን ሁሉንም ሊሆኑ የሚችሉ ተደራራቢ ትሪፕፕታይድ ዘይቤዎችን አንጻራዊ ድግግሞሽ እና ስርጭት ያቅርቡ።በ 1000 ንባቦች ውስጥ የተገኙት ዘይቤዎች ብዛት ይታያል.ጉልህ በሆነ መልኩ (p <0.001) የበለጸጉ ዘይቤዎች በቀይ ነጠብጣቦች ምልክት ተደርጎባቸዋል።(ሠ) የተረጨውን ቤተ-መጽሐፍት የትሪፕታይድ ሞቲፍ አንጻራዊ ድግግሞሽ ከእንስሳት ደም ከሚገኝ ፋጌ ጋር በማነጻጸር የግንኙነት መበታተን #1.1 እና #1.2።(ረ) የደም እና ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ ተለይተው የእንስሳት phage tripeptide motifs #1.1 እና #1.2 ያለውን አንጻራዊ ድግግሞሾችን በማነጻጸር የዝምድና ስርጭት።(ሰ፣ ሰ) በደም የበለፀገ የፋጌን ተከታታይ መታወቂያ ውክልና (ሰ) በተከተቡ ቤተ-መጻሕፍት እና በ CSF (h) ከደም ጋር የበለፀጉ ፋጌ በሁለቱም እንስሳት ውስጥ ከተመረጡ በኋላ።የአንድ ፊደል ኮድ መጠን አሚኖ አሲድ በዚያ ቦታ ምን ያህል ጊዜ እንደሚከሰት ያሳያል።አረንጓዴ = ዋልታ, ሐምራዊ = ገለልተኛ, ሰማያዊ = መሠረታዊ, ቀይ = አሲዳማ እና ጥቁር = hydrophobic አሚኖ አሲዶች.ምስል 1 ሀ፣ ለ የተነደፈው እና የተሰራው በEduard Urich ነው።
የፋጌ ፔፕታይድ ቤተመፃህፍትን ወደ ሁለት የሲኤም መሳሪያ አይጦች (ክላድስ A እና B) እና ከሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ እና ከደም የተገለለ ፋጌን በመርጨት (ምስል 1d) ውስጥ ገባን።የላይብረሪውን የመጀመሪያ ፈጣን ማጽዳት ከዱር-አይነት ፋጅ ጋር ሲወዳደር ጎልቶ የሚታይ አልነበረም።በሁለቱም እንስሳት ውስጥ የተወጋው ቤተ-መጽሐፍት አማካይ ግማሽ ህይወት በደም ውስጥ 24.8 ደቂቃዎች, ልክ እንደ ዱር-አይነት ፋጅ እና በ CSF ውስጥ 38.5 ደቂቃዎች ነበር.ከእያንዳንዱ እንስሳ የደም እና ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ፋጅ ናሙናዎች ለኤች ቲ ኤስ ተሰጥተዋል እና ሁሉም ተለይተው የታወቁ peptides ለአጭር ትሪፕታይድ ሞቲፍ መገኘት ተተነተነ።Tripeptide motifs የተመረጡት ለመዋቅር ምስረታ እና ለፔፕታይድ-ፕሮቲን መስተጋብር አነስተኛ መሰረት ስለሚሰጡ ነው14,15.በመርፌ ፋጅ ቤተ-መጽሐፍት እና ከሁለቱም እንስሳት ደም በተወሰዱ ክሎኖች መካከል የጭብጦች ስርጭት ላይ ጥሩ ግንኙነት አግኝተናል (ምስል 1e).መረጃው እንደሚያመለክተው የቤተ መፃህፍቱ ስብጥር በደም ክፍል ውስጥ በትንሹ የበለፀገ ነው።የአሚኖ አሲድ ድግግሞሾች እና የስምምነት ቅደም ተከተሎች በየቦታው የWeblogo16 ሶፍትዌር ማላመድን በመጠቀም የበለጠ ተንትነዋል።የሚገርመው ነገር በደም ግሊሲን ቅሪቶች (ምስል 1 ግ) ውስጥ ጠንካራ ማበልጸጊያ አግኝተናል።ደም ከሲኤስኤፍ ከተመረጡት ክሎኖች ጋር ሲወዳደር, ጠንካራ ምርጫ እና አንዳንድ ዘይቤዎች አለመምረጥ ተስተውሏል (ምስል 1 ረ) እና የተወሰኑ አሚኖ አሲዶች በ 12-አባላት (ምስል 1 ሸ) ውስጥ አስቀድሞ በተቀመጡት ቦታዎች ላይ ይመረጣል.በተለይም በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ የግለሰብ እንስሳት በከፍተኛ ሁኔታ ይለያያሉ, ነገር ግን የደም ግሊሲን ማበልጸግ በሁለቱም እንስሳት ላይ ታይቷል (ተጨማሪ ምስል 4a-j).በእንስሳት ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ #1.1 እና #1.2 ውስጥ ተከታታይ መረጃዎችን በጥብቅ ከተጣራ በኋላ በአጠቃላይ 964 እና 420 ልዩ 12-ሜር peptides ተገኝተዋል (ተጨማሪ ምስል 1d-e)።የነጠላው የፋጌ ክሎኖች ተጨምረዋል እና ለሁለተኛ ዙር በቪቮ ምርጫ ተዳርገዋል።ከሁለተኛው ዙር ምርጫ የተወሰደው ደረጃ በእያንዳንዱ እንስሳ ውስጥ HTS ተይዟል እና ሁሉም ተለይተው የታወቁ peptides ለሞቲፍ ማወቂያ መርሃ ግብር ግብአት ሆነው ትሪፕፕታይድ ጭብጦች መከሰታቸውን ለመተንተን (ምስል 2a, b, ef).ከሲኤስኤፍ ከተመለሰው የፋጌው የመጀመሪያ ዑደት ጋር ሲነጻጸር፣ በ CSF ውስጥ በ A እና B ቅርንጫፎች ውስጥ ተጨማሪ ምርጫ እና ምርጫን ተመልክተናል (ምስል 2)።የአውታረ መረብ መለያ ስልተ ቀመር የተለያዩ ተከታታይነት ያላቸው ተከታታይ ንድፎችን ይወክላሉ ወይ የሚለውን ለመወሰን ተተግብሯል።በተለዋጭ clade A (ምስል 2c, d) እና clade B (ምስል 2g, h) በ CSF በተመለሱት ባለ 12-ልኬት ቅደም ተከተሎች መካከል ግልጽ የሆነ ተመሳሳይነት ተስተውሏል.በእያንዳንዱ ቅርንጫፍ ውስጥ የተጠቃለለ ትንታኔ ለ 12-mer peptides (ተጨማሪ ምስል 5c,d) እና ከሁለተኛው ዙር ምርጫ በኋላ ለተጠራቀሙ ክሎኖች በጊዜ ሂደት የ CSF / የደም ቲተር ጥምርታ መጨመር የተለያዩ የመምረጫ መገለጫዎችን አሳይቷል (ተጨማሪ ምስል 5e).).
በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ ያሉ ዘይቤዎችን እና peptidesን በሁለት ተከታታይ ዙር በ Vivo ተግባራዊ ፋጌ ማሳያ ምርጫ ማበልጸግ።
ከእያንዳንዱ እንስሳ የመጀመሪያ ዙር የተመለሱት ሁሉም ሴሬብሮስፒናል ፈሳሾች (እንስሳት #1.1 እና #1.2) በአንድ ላይ ተጣምረው፣ ተጨምነው፣ ኤችቲቲ-ተከታታይ እና በድጋሚ አንድ ላይ ተወጉ (2 x 1010 phages/እንስሳ) 2 SM የታሸጉ አይጦች (#1.1 → #)።2.1 እና 2.2, 1.2 → 2.3 እና 2.4).(a,b,e,f) የሁሉም የሲኤስኤፍ-የተገኙ ፋጃጆች ትራይፕፕታይድ ጭብጦችን አንጻራዊ ድግግሞሽን በማነጻጸር የግንኙነት መበታተን በመጀመሪያው እና በሁለተኛው ምርጫ ዙር።በሁለቱም አቅጣጫዎች በፔፕቲድ ውስጥ የሚገኙትን ሁሉንም ሊሆኑ የሚችሉ ተደራራቢ ትሪፕታይዶችን የሚወክሉ አንጻራዊ ድግግሞሽ እና የስርጭት ዘይቤዎች።በ 1000 ንባቦች ውስጥ የተገኙት ዘይቤዎች ብዛት ይታያል.ከንጽጽር ቤተ-መጻሕፍት በአንዱ ውስጥ ጉልህ በሆነ መልኩ (p <0.001) የተመረጡ ወይም የተገለሉ ምስሎች በቀይ ነጥቦች ተደምቀዋል።(c፣ d፣ g፣ h) የሁሉም የሲኤስኤፍ የበለፀጉ 12 አሚኖ አሲድ ረጃጅም ቅደም ተከተሎች ተከታታይ አርማ ውክልና በ2 እና 1 የ In vivo ምርጫ።የአንድ ፊደል ኮድ መጠን አሚኖ አሲድ በዚያ ቦታ ምን ያህል ጊዜ እንደሚከሰት ያሳያል።አርማውን ለመወከል፣ ከእንስሳት የተወሰዱት የሲኤስኤፍ ቅደም ተከተሎች ድግግሞሽ በሁለት የምርጫ ዙሮች መካከል ሲወዳደር እና በሁለተኛው ዙር የበለፀጉ ቅደም ተከተሎች ይታያሉ፡ (ሐ) #1.1–#2.1 (መ) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 እና (h) #1.2–#2.4።በጣም የበለጸጉ አሚኖ አሲዶች በተሰጠው ቦታ (c፣ d) እንስሳት ቁ.2.1 እና ቁ.2.2 ወይም (g, h) በእንስሳት ቁ.2.3 እና ቁ.2.4 በቀለም ይታያሉ.አረንጓዴ = ዋልታ, ሐምራዊ = ገለልተኛ, ሰማያዊ = መሠረታዊ, ቀይ = አሲዳማ እና ጥቁር = hydrophobic አሚኖ አሲዶች.
ከሦስተኛው ዙር ምርጫ በኋላ፣ ከሁለት እንስሳት ተለይተው 124 ልዩ የፔፕታይድ ቅደም ተከተሎችን (#3.1 እና #3.2) ከ332 CSF-reconstituted phage clones ለይተናል (ተጨማሪ ምስል 6 ሀ)።የ LGSVS (18.7%) ከፍተኛው አንጻራዊ መጠን ነበረው፣ ከዚያም የዱር-አይነት ማስገቢያዎች PAGISRELVDKL (8.2%)፣ MRWFFSHASQGR (3%)፣ DVAKVS (3%)፣ TWLFSLG (2.2%) እና SARGSWREIVSLS (2.2%)።በመጨረሻው አራተኛ ዙር ከሦስት የተለያዩ እንስሳት (ምስል 1 ሐ) በገለልተኛ የተመረጡ ሁለት ቅርንጫፎችን ሰብስበናል።ከሲኤስኤፍ ከተመለሱት 925 ተከታታይ የፋጌ ክሎኖች ውስጥ፣ በአራተኛው ዙር 64 ልዩ የፔፕታይድ ቅደም ተከተሎችን አግኝተናል (ተጨማሪ ምስል 6 ለ)፣ ከእነዚህም መካከል የዱር-አይነት ፋጅ አንጻራዊ ድርሻ ወደ 0.8% ወርዷል።በአራተኛው ዙር በጣም የተለመዱት የሲኤስኤፍ ክሎኖች LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%)፣ LGSVS (17%)፣ GFVRFRLSNTR (14%)፣ KVAWRVFSLFWK (7%)፣ SVHGV (5%)፣ GRPQKINGARVC (3.6%) እና RLSSVDSDLSGC%) (3፣%))።የተመረጡት የፔፕቲዶች ርዝመት ለኤንኤንኬ ቤተ መፃህፍት ዲዛይን የተበላሹ ኮዶችን ሲጠቀሙ በቤተ መፃህፍት ፕሪመርሮች ውስጥ በኑክሊዮታይድ ማስገቢያ/ስረዛዎች ወይም ያለጊዜው የማቆሚያ ኮዶች ምክንያት ነው።ያለጊዜው የማቆሚያ ኮዶኖች አጠር ያሉ peptides ያመነጫሉ እና የሚመረጡት ምቹ የሆነ aa motif ስላላቸው ነው።ረዣዥም peptides በሰው ሰራሽ ቤተ-መጻሕፍት ፕሪመርስ ውስጥ በመክተት/ስረዛ ሊመጣ ይችላል።ይህ የተነደፈውን የማቆሚያ ኮድ ከክፈፉ ውጭ ያስቀምጠዋል እና አዲስ የማቆሚያ ኮድ ወደ ታች እስኪታይ ድረስ ያነባዋል።በአጠቃላይ የግቤት ውሂቡን ከናሙና የውጤት መረጃ ጋር በማነፃፀር ለአራቱም የምርጫ ዙሮች የማበልፀጊያ ሁኔታዎችን አስልተናል።ለመጀመሪያው የማጣሪያ ዙር፣ የዱር-አይነት ፋጌ ቲተሮችን እንደ ልዩ ያልሆነ የጀርባ ማጣቀሻ ተጠቀምን።የሚገርመው ነገር፣ በመጀመሪያው የ CSF ዑደት ውስጥ አሉታዊ የፋጅ ምርጫ በጣም ጠንካራ ነበር፣ ነገር ግን በደም ውስጥ አይደለም (ምስል 3 ሀ)፣ ይህ ሊሆን የቻለው አብዛኛዎቹ የፔፕታይድ ቤተመፃህፍት አባላት ወደ CSF ክፍል ወይም አንጻራዊ ፋጅስ ከባክቴሪዮፋጅ ይልቅ በብቃት የመቆየት ወይም ከደም ውስጥ የማስወገድ እድሉ ዝቅተኛ ሊሆን ይችላል።ነገር ግን፣ በሁለተኛው ዙር ፓኒንግ፣ በሲኤስኤፍ ውስጥ ጠንካራ የፋጌጅ ምርጫ በሁለቱም ክላዶች ታይቷል፣ ይህም ያለፈው ዙር የሲኤስኤፍ መውሰድን የሚያበረታቱ peptides በሚያሳዩ ፋጌዎች የበለፀገ ነበር (ምስል 3 ሀ)።እንደገና, ጉልህ የሆነ የደም ማበልጸግ ሳይኖር.እንዲሁም በሶስተኛው እና በአራተኛው ዙሮች, የፋጌ ክሎኖች በሲኤስኤፍ ውስጥ በከፍተኛ ሁኔታ የበለፀጉ ናቸው.በመጨረሻዎቹ ሁለት ዙሮች መካከል የእያንዳንዱን ልዩ የፔፕታይድ ቅደም ተከተል አንጻራዊ ድግግሞሽን በማነፃፀር፣ በአራተኛው ዙር ምርጫ (ምስል 3 ለ) ቅደም ተከተሎቹ የበለጠ የበለፀጉ መሆናቸውን ተገንዝበናል።ሁለቱንም የፔፕታይድ አቅጣጫዎችን በመጠቀም ከ64ቱ ልዩ የፔፕታይድ ቅደም ተከተሎች በአጠቃላይ 931 ትሪፕፕታይድ ዘይቤዎች ተወስደዋል።በአራተኛው ዙር በጣም የበለጸጉት ጭብጦች በሁሉም ዙርያ ከተወጋው ቤተመጻሕፍት (የተቆረጠ፡ 10% ማበልጸጊያ) (ተጨማሪ ምስል 6 ሐ) ጋር ሲነጻጸሩ የበለጸጉ መገለጫዎቻቸውን ለማግኘት በቅርበት ተፈትሸዋል።አጠቃላይ የምርጫ ቅጦች እንደሚያሳዩት አብዛኞቹ የተጠኑ ምክንያቶች በሁለቱም የምርጫ ቅርንጫፎች ቀደም ባሉት ዙሮች ሁሉ የበለፀጉ ነበሩ።ሆኖም፣ አንዳንድ ዘይቤዎች (ለምሳሌ SGL፣ ​​VSG፣ LGS GSV) በብዛት ከአማራጭ clade A ሲሆኑ ሌሎች (ለምሳሌ FGW፣ RTN፣ WGF፣ NTR) በአማራጭ clade B የበለፀጉ ነበሩ።
በሲኤስኤፍ የበለጸጉ ፋጌ-የታዩ peptides እና ባዮቲንላይትድ መሪ peptides ከስትሬፕታቪዲን ጋር የተጣመሩ የ CSF መጓጓዣን ማረጋገጥ።
(ሀ) በአራቱም ዙሮች (R1-R4) በመርፌ (ግቤት = I) phage (PFU) ቲተር እና በተወሰነ የ CSF phage titers (ውፅዓት = O) ላይ በመመስረት የተሰላ የማበልጸጊያ ሬሾ።ላለፉት ሶስት ዙሮች (R2-R4) የማበልፀጊያ ምክንያቶች ከቀዳሚው ዙር እና ከመጀመሪያው ዙር (R1) ከክብደት መረጃ ጋር በማነፃፀር ይሰላሉ።ክፍት አሞሌዎች cerebrospinal ፈሳሽ ናቸው, ጥላ አሞሌዎች ፕላዝማ ናቸው.(***p<0.001፣በተማሪ ቲ-ሙከራ ላይ የተመሰረተ)።(ለ) ከ 4 ኛ ዙር ምርጫ በኋላ በ CSF ውስጥ ከተሰበሰቡት ሁሉም ፋጆች ጋር በተመጣጣኝ መጠን የተቀመጡ በጣም የበለፀጉ ፋጌ peptides ዝርዝር።ስድስቱ በጣም የተለመዱት የፋጌ ክሎኖች በቀለም ፣ በቁጥር እና በምርጫ 3 እና 4 ዙሮች መካከል የበለፀጉ ምክንያቶች ተደምቀዋል (ኢንሴቶች)።(c,d) ስድስት በጣም የበለጸጉ የፋጌ ክሎኖች፣ ባዶ ፋጌ እና የወላጅ ፋጅ peptide ቤተ-መጻሕፍት ከዙር 4 ለየብቻ በCSF ናሙና ሞዴል ተተነተኑ።CSF እና የደም ናሙናዎች በተጠቀሱት የጊዜ ነጥቦች ላይ ተሰብስበዋል.(ሐ) እኩል መጠን ያላቸው 6 እጩ ፋጌ ክሎኖች (2 x 1010 ፋጅ/እንስሳት)፣ ባዶ ፋጆች (#1779) (2 x 1010 ፋጅስ/እንስሳት) እና የአክሲዮን ፋጅ ፔፕታይድ ቤተ መጻሕፍት (2 x 1012 ፋጅ/እንስሳት) ቢያንስ 3 ሴ.ሜ በእንስሳቱ ውስጥ ለብቻው ይተላለፋል።የእያንዳንዱ የተወጋ phage clone እና phage peptide ቤተመፃህፍት በጊዜ ሂደት የሲኤስኤፍ ፋርማሲኬቲክስ ታይቷል።(መ) በናሙና ጊዜ ውስጥ ለተመለሱት ሁሉም ፋጆች/ሚሊሎች አማካኝ CSF/ደም ሬሾን ያሳያል።(ሠ) አራት ሰው ሠራሽ መሪ peptides እና አንድ የተዘበራረቀ መቆጣጠሪያ ከባዮቲን ጋር ከስትሬፕታቪዲን ጋር በN-terminus (ቴትራመር ማሳያ) ተያይዘዋል ከዚያም መርፌ (ጅራት ደም መላሽ iv፣ 10 mg streptavidin/kg)።ቢያንስ ሶስት የገቡ አይጦች (N = 3)።).የCSF ናሙናዎች በተጠቀሱት የጊዜ ነጥቦች የተሰበሰቡ ሲሆን የስትሬፕታቪዲን መጠን በ CSF ፀረ-ስትሬፕታቪዲን ELISA (nd = አልተገኘም) ይለካሉ።(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, በ ANOVA ሙከራ ላይ የተመሰረተ).(ረ) በጣም የበለጸገውን የፋጌ ፔፕታይድ ክሎሎን #2002 (ሐምራዊ) የአሚኖ አሲድ ቅደም ተከተል ከ 4 ኛ ዙር ምርጫ ከተመረጡት ሌሎች የፋጌ ፔፕታይድ ክሎኖች ጋር ማወዳደር።ተመሳሳይ እና ተመሳሳይ የአሚኖ አሲድ ቁርጥራጮች በቀለም የተቀመጡ ናቸው.
በአራተኛው ዙር (ምስል 3 ለ) ውስጥ ካሉት የበለጸጉ ደረጃዎች ውስጥ ስድስት እጩ ክሎኖች ለበለጠ የግለሰብ ትንተና በCSF ናሙና ሞዴል ተመርጠዋል።እኩል መጠን ያለው ስድስት እጩ ፋጌ፣ ባዶ ፋጌ (ምንም ማስገባት የለም) እና ፕሮፋጅ ፔፕታይድ ቤተ-መጻሕፍት ወደ ሶስት የታሸጉ የሲኤም እንስሳት ውስጥ ገብተዋል፣ እና ፋርማሲኬቲክስ በሲኤስኤፍ (ምስል 3c) እና በደም (ተጨማሪ ምስል 7) ምርመራዎች ተወስነዋል።ሁሉም የፋጌ ክሎኖች የተሞከሩት የCSF ክፍልን ከባዶ መቆጣጠሪያ ፋጅ (#1779) ከ10-1000 ጊዜ ከፍ ያለ ደረጃ ላይ ያነጣጠሩ ናቸው።ለምሳሌ፣ ክሎኖች #2020 እና #2077 ከቁጥጥር ፋጅ 1000 ጊዜ ያህል ከፍ ያለ የCSF ቲተሮች ነበሯቸው።የእያንዳንዱ የተመረጠው የፔፕታይድ ፋርማሲኬቲክ ፕሮፋይል የተለየ ነው, ነገር ግን ሁሉም ከፍተኛ የሲኤስኤፍ ሆሚንግ ችሎታ አላቸው.ለክሎኖች #1903 እና #2011 ከጊዜ ወደ ጊዜ እየቀነሰ ሲሄድ ለክሎኖች #2077፣ #2002 እና #2009 በመጀመሪያዎቹ 10 ደቂቃዎች መጨመር ንቁ መጓጓዣን ሊያመለክት ይችላል ነገር ግን መረጋገጥ አለበት።ክሎኖች #2020፣ #2002 እና #2077 በከፍተኛ ደረጃ የተረጋጉ ሲሆኑ የ CSF የክሎን #2009 መጠን ከመጀመሪያው ጭማሪ በኋላ ቀስ በቀስ ቀንሷል።ከዚያም የእያንዳንዱን የሲኤስኤፍ እጩ አንጻራዊ ድግግሞሽ ከደም ትኩረቱ (ምስል 3d) ጋር አነጻጽረን።የእያንዳንዱ የሲኤስኤፍ እጩ አማካኝ ቲተር በሁሉም የናሙና ጊዜዎች ከደም መለኪያው ጋር ያለው ትስስር እንደሚያሳየው ከስድስቱ እጩዎች ሦስቱ በደም CSF የበለፀጉ ናቸው።የሚገርመው, ክሎኔ #2077 ከፍ ያለ የደም መረጋጋት አሳይቷል (ተጨማሪ ምስል 7).peptides ራሳቸው ከፋጌ ቅንጣቶች በስተቀር ሌሎች ጭነቶችን ወደ ሲኤስኤፍ ክፍል ማጓጓዝ እንደሚችሉ ለማረጋገጥ፣ peptides ከፋጌ ቅንጣቢው ጋር በሚጣበቁበት N-terminus ላይ አራት መሪ peptides ከባዮቲን ጋር አቀናጅተናል።ባዮቲንላይድድ ፔፕቲዶች (ቁጥር 2002፣ 2009፣ 2020 እና 2077) ከስትሬፕታቪዲን (ኤስኤ) ጋር ተቀናጅተው የፋጅ ጂኦሜትሪ የሚመስሉ መልቲሜሪክ ቅርጾችን ለማግኘት።ይህ ፎርማት እንዲሁ በደም ውስጥ ያለውን የኤስኤ ተጋላጭነት እና ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽን እንደ ጭነት ማጓጓዣ ፕሮቲን peptides እንድንለካ አስችሎናል።በአስፈላጊ ሁኔታ, በዚህ SA-conjugated ቅርጸት (ምስል 3e) ውስጥ ሠራሽ peptides ሲሰጥ phage ውሂብ ብዙውን ጊዜ ሊባዛ ይችላል.የተዘበራረቁት peptides በ 48 ሰአታት ውስጥ ሊታወቅ በማይቻል ደረጃ የመጀመሪያ ተጋላጭነት እና ፈጣን የሲኤስኤፍ ማጽጃ ነበራቸው።እነዚህ የፔፕታይድ ፋጅ ክሎኖች ወደ ሲኤስኤፍ ቦታ የሚወስዱትን የመላኪያ መንገዶች ግንዛቤ ለማግኘት፣ በቫይቮ ውስጥ በደም ውስጥ ከገባ ከ1 ሰአት በኋላ የphage ቅንጣቶችን በቀጥታ ለመለየት ኢሚውኖሂስቶኬሚስትሪ (IHC) በመጠቀም የግለሰብ phage peptide hitsን አካባቢያዊነት ተንትነናል።በተለይም ክሎኖች #2002፣ #2077 እና #2009 በኣንጎል ካፊላሪዎች ላይ በጠንካራ ነጠብጣብ ሊገኙ ይችላሉ፣ የቁጥጥር ፋጅ (#1779) እና ክሎን #2020 ግን አልተገኙም (ተጨማሪ ምስል 8)።ይህ የሚያመለክተው እነዚህ peptides BBB በማቋረጥ በአንጎል ላይ ያለውን ተጽእኖ በትክክል እንደሚያበረክቱ ነው.ይህንን መላምት ለመፈተሽ ተጨማሪ ዝርዝር ትንታኔ ያስፈልጋል፣ የBSCFB መንገድም ሊሳተፍ ይችላል።በጣም የበለጸገውን ክሎኔን (#2002) የአሚኖ አሲድ ቅደም ተከተል ከሌሎች ከተመረጡት peptides ጋር ሲያወዳድሩ አንዳንዶቹ ተመሳሳይ የአሚኖ አሲድ ማራዘሚያዎች እንዳላቸው ታውቋል, ይህም ተመሳሳይ የመጓጓዣ ዘዴን ሊያመለክት ይችላል (ምስል 3f).
ልዩ በሆነው የፕላዝማ ፕሮፋይሉ እና በሲኤስኤፍ ውስጥ ከፍተኛ ጭማሪ በመኖሩ፣ phage display clone #2077 በረዥም የ48 ሰአታት ጊዜ ውስጥ ተጨማሪ ዳሰሳ የተደረገበት እና ፈጣን የ CSF እድገትን ከቀጣይ የኤስኤ ደረጃዎች (ምስል 4a) ጋር እንደገና ማባዛት ችሏል።ሌሎች ተለይተው የታወቁ የፋጅ ክሎኖችን በተመለከተ፣ #2077 ለአንጎል ካፊላሪዎች በጠንካራ ሁኔታ የተበከለ እና በከፍተኛ ጥራት ሲታይ እና ምናልባትም በፓረንቻይማል ቦታ ላይ የተወሰነ ቀለም (ምስል 4 ለ) ከካፒታል ማርክ ሌክቲን ጋር ጉልህ የሆነ ኮሌክሽን አሳይቷል።በ CNS ውስጥ በፔፕታይድ መካከለኛ ፋርማኮሎጂካል ተጽእኖዎች ሊገኝ ይችል እንደሆነ ለመመርመር ባዮቲንላይድ ስሪቶች i) #2077 ትራንዚት peptide እና ii) BACE1 inhibitor peptide በሁለት የተለያዩ ሬሾዎች ከ SA ጋር ተቀላቅሏል.ለአንድ ቅንጅት BACE1 peptide inhibitor ብቻ የተጠቀምን ሲሆን ለሌላኛው ደግሞ 1፡3 ጥምርታ BACE1 peptide inhibitor እና #2077 peptide ተጠቀምን።ሁለቱም ናሙናዎች በደም ሥር የተሰጡ ሲሆኑ የደም እና ሴሬብሊፒናል ፈሳሾች የቤታ-አሚሎይድ peptide 40 (Abeta40) በጊዜ ሂደት ይለካሉ.Abeta40 የሚለካው በ CSF ውስጥ ነው ምክንያቱም BACE1 በአንጎል ፓረንቺማ ውስጥ መከልከልን ያሳያል።እንደተጠበቀው፣ ሁለቱም ውስብስቦች የአቤታ40ን የደም መጠን በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሰዋል (ምስል 4 ሐ፣ መ)።ሆኖም ግን, የፔፕታይድ ኖ ቅልቅል የያዙ ናሙናዎች ብቻ ናቸው.2077 እና የ BACE1 peptide conjugated SA inhibitor በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ በአቤታ40 ላይ ከፍተኛ ቅናሽ አስከትሏል (ምስል 4 ሐ)።መረጃው እንደሚያሳየው peptide No.2077 የ 60 kDa SA ፕሮቲን ወደ CNS ማጓጓዝ ይችላል እና እንዲሁም ከ SA-conjugated inhibitors ከ BACE1 peptide ጋር ፋርማኮሎጂካል ተጽእኖዎችን ያመጣል.
(ሀ) Clonal injection (2 × 10 phages/እንስሳ) የ T7 phage የረጅም ጊዜ የፋርማሲኬቲክ መገለጫዎች የ CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) እና ያልተከተተ መቆጣጠሪያ phage (#1779) ቢያንስ በሶስት CM-intubated አይጥ።(ለ) በ phage-injected አይጦች (2 × 10 10 ፋጅስ/እንስሳ) ውስጥ ያሉ ተወካይ ኮርቲካል ማይክሮዌሮች ኮንፎካል አጉሊ መነጽር ምስል የፔፕታይድ #2077 እና የመርከቦች (ሌክቲን) ንፅፅርን ያሳያል።እነዚህ የፋጌ ክሎኖች ለ 3 አይጦች ተሰጥተዋል እና ከመፍሰሱ በፊት ለ 1 ሰዓት እንዲዘዋወሩ ተፈቅዶላቸዋል.አንጎሎች የተከፋፈሉ እና በ polyclonal FITC ምልክት በተደረገባቸው ፀረ እንግዳ አካላት ከT7 phage capsid ጋር ተበክለዋል።ደም ከመፍሰሱ 10 ደቂቃዎች በፊት እና ከዚያ በኋላ ማስተካከል ፣ DyLight594 - ምልክት የተደረገበት ሌክቲን በደም ውስጥ ተተግብሯል።የፍሎረሰንት ምስሎች የሌክቲን ማቅለሚያ (ቀይ) የማይክሮ ቬሰልስ እና phages (አረንጓዴ) የብርሃን ጎን በካፒላሪ እና በፔሪቫስኩላር የአንጎል ቲሹ ብርሃን ውስጥ።የመለኪያ አሞሌ ከ10µm ጋር ይዛመዳል።(ሐ፣ መ) ባዮቲንላይድድ BACE1 inhibitory peptide ብቻውን ወይም ከባዮቲንላይትድ ትራንዚት peptide #2077 ጋር በማጣመር ከ streptavidin ጋር ተጣምሮ ቢያንስ ሶስት የታሸጉ የሲኤም አይጦችን (10 mg streptavidin/kg) በደም ወሳጅ መርፌ።BACE1 peptide inhibitor-mediated-mediated in Aβ40 የተቀነሰው በ Aβ1-40 ELISA በደም (ቀይ) እና ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (ብርቱካን) በተጠቀሱት የጊዜ ነጥቦች ላይ ነው.ለተሻለ ግልጽነት በ 100% መለኪያ በግራፉ ላይ ነጠብጣብ መስመር ይሳባል.(ሐ) በደም ውስጥ Aβ40 (ቀይ ትሪያንግሎች) እና ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (ብርቱካንማ ትሪያንግል) በ 3: 1 ጥምርታ ውስጥ በ 3: 1 ጥምርታ ውስጥ በ streptavidin conjugated to transit peptide #2077 እና BACE1 inhibitory peptide ጋር በሚታከሙ አይጦች ውስጥ የመቶኛ ቅነሳ።(መ) በደም Aβ40 (ቀይ ክበቦች) እና ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (ብርቱካንማ ክበቦች) በስትሮፕታቪዲን የታከሙ አይጦችን ከ BACE1 inhibitory peptide ጋር በማጣመር በመቶኛ መቀነስ።በመቆጣጠሪያው ውስጥ ያለው የ Aβ ክምችት 420 pg / ml (መደበኛ ልዩነት = 101 pg / ml).
የPage ማሳያ በተሳካ ሁኔታ በበርካታ የባዮሜዲካል ምርምር ዘርፎች ተተግብሯል17.ይህ ዘዴ በ Vivo vascular diversity studies18,19 እንዲሁም በሴሬብራል መርከቦች 20,21,22,23,24,25,26 ላይ ያነጣጠሩ ጥናቶች ጥቅም ላይ ውሏል.በዚህ ጥናት ውስጥ የዚህ ምርጫ ዘዴ አተገባበርን አራዝመናል ሴሬብራል መርከቦች ላይ ያነጣጠሩ peptides በቀጥታ ለመለየት ብቻ ሳይሆን የደም-አንጎል እንቅፋትን ለመሻገር ንቁ የመጓጓዣ ባህሪያት ያላቸው እጩዎችን ለማግኘትም ጭምር ነው.አሁን በሲኤም ኢንቱቡብ አይጦች ውስጥ የ In vivo ምርጫ ሂደትን እንገልፃለን እና peptides በ CSF ሆሚንግ ባህሪያት የመለየት አቅሙን እናሳያለን።የ12-ሜር የዘፈቀደ peptides ቤተ-መጻሕፍትን በT7 phage በመጠቀም፣ T7 phage በበቂ ሁኔታ ትንሽ (በግምት 60 nm በዲያሜትር)10 ከደም-አንጎል እንቅፋት ጋር ለመላመድ፣ በዚህም የደም-አንጎል እንቅፋቶችን ወይም የኮሮይድ plexusን በቀጥታ የሚያቋርጥ መሆኑን ማሳየት ችለናል።የሲኤስኤፍ መሰብሰብ ከተቀዘቀዙ የCM አይጦች በጥሩ ሁኔታ ቁጥጥር የሚደረግበት በ Vivo ተግባራዊ የማጣሪያ ዘዴ መሆኑን እና የወጣው ፋጅ ከቫስኩላር ጋር ብቻ የተያያዘ ሳይሆን በደም-አንጎል እንቅፋት ላይ እንደ ማጓጓዣ ሆኖ እንደሚሠራ ተመልክተናል።በተጨማሪም ፣ በተመሳሳይ ጊዜ ደም በመሰብሰብ እና ኤችቲኤስን ወደ CSF እና ከደም-የተገኙ phages በመተግበር ፣ የ CSF ምርጫችን በደም ማበልፀግ ወይም በምርጫ ዙር መካከል ለመስፋፋት የአካል ብቃት ተጽዕኖ እንዳልነበረው አረጋግጠናል ።ነገር ግን፣ ወደ ሲኤስኤፍ ክፍል መድረስ የሚችሉ ፋጆች በሕይወት መቆየት እና በደም ውስጥ መሰራጨት ስላለባቸው የደም ክፍል የምርጫው ሂደት አካል ነው።አስተማማኝ ቅደም ተከተል መረጃን ከጥሬው የኤችቲኤስ መረጃ ለማውጣት በመተንተን የስራ ሂደት ውስጥ ከመድረክ-ተኮር ቅደም ተከተል ስህተቶች ጋር የተጣጣሙ ማጣሪያዎችን ተግባራዊ እናደርጋለን.የኪነቲክ መለኪያዎችን በማጣራት ዘዴ ውስጥ በማካተት፣ ፈጣን የፋርማሲኬኔቲክስ የዱር አይነት T7 phages (t½ ~ 28 ደቂቃ) በደም 24፣ 27፣ 28 አረጋግጠናል እንዲሁም የግማሽ ህይወታቸውን በ cerebrospinal fluid (t½ ~ 26 ደቂቃ) በደቂቃ) ወስነናል።በደም እና በሲኤስኤፍ ውስጥ ተመሳሳይ የፋርማሲኬቲክ ፕሮፋይሎች ቢኖሩም፣ በCSF ውስጥ የphage ደም ትኩረት 0.001% ብቻ ሊታወቅ ይችላል፣ይህም የዱር-አይነት T7 ፋጅ በደም-አንጎል እንቅፋት ላይ ያለው ዝቅተኛ የጀርባ እንቅስቃሴ ያሳያል።ይህ ሥራ በ vivo panning ስልቶች ሲጠቀሙ የመጀመሪያውን ዙር ምርጫ አስፈላጊነት ያጎላል, በተለይም ከፋጅ ስርዓቶች በፍጥነት ከስርጭቱ ውስጥ ይጸዳሉ, ምክንያቱም ጥቂት ክሎኖች ወደ CNS ክፍል መድረስ ይችላሉ.ስለዚህ በመጀመሪያው ዙር የቤተ-መጻህፍት ልዩነት መቀነስ በጣም ትልቅ ነበር ምክንያቱም በመጨረሻ በዚህ በጣም ጥብቅ የሲኤስኤፍ ሞዴል የተወሰኑ ክሎኖች ብቻ ተሰብስበዋል.ይህ በ vivo ፓኒንግ ስትራቴጂ ውስጥ በሲኤስኤፍ ክፍል ውስጥ በንቃት መከማቸት፣ በደም ክፍል ውስጥ ያለው የክሎን መትረፍ እና T7 phage clones ከደም ውስጥ በመጀመሪያዎቹ 10 ደቂቃዎች ውስጥ ብዙ የመምረጫ እርምጃዎችን ያካትታል (ምስል 1d እና ተጨማሪ ምስል 4M)።).ስለዚህ, ከመጀመሪያው ዙር በኋላ, በ CSF ውስጥ የተለያዩ የፋጅ ክሎኖች ተለይተዋል, ምንም እንኳን ተመሳሳይ የመጀመሪያ ገንዳ ለግለሰብ እንስሳት ጥቅም ላይ ይውላል.ይህ የሚያሳየው ብዙ ቁጥር ያላቸው የቤተ-መጻህፍት አባላት ላሏቸው የምንጭ ቤተ-መጻሕፍት በርካታ ጥብቅ የመምረጫ እርምጃዎች የብዝሃነት ቅነሳን ያስከትላሉ።ስለዚህ, የዘፈቀደ ክስተቶች የመጀመርያው ምርጫ ሂደት ዋና አካል ይሆናሉ, በውጤቱ ላይ ከፍተኛ ተጽዕኖ ያሳድራሉ.በዋናው ቤተ-መጽሐፍት ውስጥ ያሉት ብዙዎቹ ክሎኖች በጣም ተመሳሳይ የCSF የማበልጸግ ዝንባሌ ነበራቸው።ሆኖም ግን, በተመሳሳይ የሙከራ ሁኔታዎች ውስጥ እንኳን, በመነሻ ገንዳ ውስጥ በእያንዳንዱ ልዩ ክሎኖች አነስተኛ ቁጥር ምክንያት የምርጫ ውጤቶች ሊለያዩ ይችላሉ.
በ CSF ውስጥ የበለፀጉ ዘይቤዎች በደም ውስጥ ካሉት ይለያያሉ.የሚገርመው፣ በግለሰብ እንስሳት ደም ውስጥ ወደ glycine-rich peptides የመጀመሪያውን ለውጥ አስተውለናል።(ምስል 1g, ተጨማሪ ምስል 4e, 4f).glycine peptides የያዘው ደረጃ የበለጠ የተረጋጋ እና ከስርጭት ውጭ የመወሰድ ዕድሉ አነስተኛ ሊሆን ይችላል።ይሁን እንጂ እነዚህ glycine-የበለጸጉ peptides በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ናሙናዎች ውስጥ አልተገኙም, ይህም የተሰበሰቡ ቤተ-መጻሕፍት በሁለት የተለያዩ የመምረጫ ደረጃዎች ውስጥ እንዳለፉ ይጠቁማሉ-አንደኛው በደም ውስጥ እና ሌላው በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ እንዲከማች ይፈቀድላቸዋል.በአራተኛው ዙር ምርጫ ምክንያት በሲኤስኤፍ የበለጸጉ ክሎኖች በስፋት ተፈትነዋል።ሁሉም ማለት ይቻላል በተናጥል የተሞከሩት ክሎኖች ከባዶ መቆጣጠሪያ ፋጅ ጋር ሲነፃፀሩ በሲኤስኤፍ የበለፀጉ መሆናቸው ተረጋግጧል።አንድ peptide hit (#2077) በበለጠ ዝርዝር ተመርምሯል።ከሌሎች ስኬቶች ጋር ሲነፃፀር ረዘም ያለ የፕላዝማ ግማሽ ህይወት አሳይቷል (ምስል 3d እና ተጨማሪ ምስል 7) እና የሚገርመው ይህ peptide በ C-terminus ላይ የሳይስቴይን ቅሪት ይዟል።በቅርብ ጊዜ የሳይስቴይን ወደ peptides መጨመር ከአልቡሚን 29 ጋር በማያያዝ የፋርማሲኬቲክ ባህሪያቸውን እንደሚያሻሽል ታይቷል.ይህ በአሁኑ ጊዜ ለ peptide #2077 የማይታወቅ እና ተጨማሪ ጥናት ያስፈልገዋል።አንዳንድ peptides በሲኤስኤፍ ማበልጸግ ላይ የቫሌንስ-ጥገኛነት አሳይተዋል (ውሂቡ አልታየም)፣ እሱም ከሚታየው የገጽታ ጂኦሜትሪ T7 capsid ጋር የተያያዘ ሊሆን ይችላል።የተጠቀምንበት የቲ 7 ስርዓት የእያንዳንዱን የፔፕታይድ በፋጅ ቅንጣት 5-15 ቅጂዎችን አሳይቷል።IHC የተካሄደው በእጩ እርሳስ ፋጅ ክሎኖች በደም ሥር ወደ አይጦች ሴሬብራል ኮርቴክስ በመርፌ ነው (ተጨማሪ ምስል 8)።መረጃው እንደሚያሳየው ቢያንስ ሶስት ክሎኖች (ቁጥር 2002, ቁጥር 2009 እና ቁጥር 2077) ከቢቢቢ ጋር መስተጋብር ፈጥረዋል.ይህ የቢቢቢ መስተጋብር የሲኤስኤፍ ክምችት ወይም የእነዚህ ክሎኖች በቀጥታ ወደ BCSFB መንቀሳቀስ ያስከተለ እንደሆነ ለመወሰን ይቀራል።በአስፈላጊ ሁኔታ, እኛ የተመረጡ peptides ሲዋሃዱ እና ፕሮቲን ጭነት ጋር ታስሮ ጊዜ CSF የማጓጓዝ አቅማቸውን እንደያዙ ያሳያል.የ N-terminal biotinylated peptides ከኤስኤ ጋር ማያያዝ በደም እና በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (ምስል 3e) ውስጥ በየራሳቸው ፋጅ ክሎኖች የተገኘውን ውጤት ይደግማል።በመጨረሻም ፣ እርሳስ peptide #2077 የ BACE1 ከ ‹SA› ጋር የተገናኘ ባዮቲንላይድድ ፔፕታይድ ኢንቢክተር የአንጎልን ተግባር ማራመድ እንደሚችል እናሳያለን ፣ይህም በ CNS ውስጥ የአቤታ40 ደረጃዎችን በከፍተኛ ሁኔታ በመቀነስ በ CNS ውስጥ ጉልህ የሆነ ፋርማኮዳይናሚክ ተፅእኖ ያስከትላል (ምስል 4)።ሁሉንም ስኬቶች የፔፕታይድ ቅደም ተከተል ግብረ-ሰዶማዊ ፍለጋን በማካሄድ በመረጃ ቋቱ ውስጥ ምንም አይነት ግብረ ሰዶማዊነት መለየት አልቻልንም።የ T7 ቤተመፃህፍት መጠን በግምት 109 እንደሆነ ልብ ሊባል የሚገባው ሲሆን ለ 12 ሜርስ የንድፈ ሃሳባዊ ቤተ-መጽሐፍት መጠን 4 x 1015 ነው. ስለዚህ, የ 12-mer peptide ቤተ-መጽሐፍት ልዩነት ቦታ ትንሽ ክፍልፋዮችን ብቻ መርጠናል, ይህም ማለት ተጨማሪ የተመቻቹ peptides ተለይተው የሚታወቁትን የቦታ ቅደም ተከተሎች በመገምገም ሊታወቁ ይችላሉ.በመላምታዊ መልኩ፣ የእነዚህ peptides ምንም አይነት ተፈጥሯዊ ግብረ ሰዶማዊነት እንዳላገኘን ከሚያደርጉት ምክንያቶች አንዱ በዝግመተ ለውጥ ወቅት አንዳንድ የፔፕታይድ ዘይቤዎች ቁጥጥር ካልተደረገበት ወደ አንጎል እንዳይገቡ መከላከል ነው።
አንድ ላይ ሲደመር, ውጤቶቻችን በ Vivo ውስጥ ያለውን የሴሬብሮቫስኩላር ግርዶሽ የትራንስፖርት ስርዓቶችን በበለጠ ዝርዝር ለመለየት እና ለመለየት ለወደፊት ስራ መሰረት ይሆናሉ.የዚህ ዘዴ መሰረታዊ አቀማመጥ በተግባራዊ ምርጫ ስልት ላይ የተመሰረተ ነው, ይህም ክሎኖችን ሴሬብራል ቫስኩላር ማያያዣ ባህሪያትን ለይቶ ማወቅ ብቻ ሳይሆን, ስኬታማ ክሎኖች በ CNS ክፍል ውስጥ ባዮሎጂያዊ እንቅፋቶችን ለማቋረጥ ውስጣዊ እንቅስቃሴ ያላቸውን ወሳኝ እርምጃ ያካትታል.የእነዚህን peptides የማጓጓዣ ዘዴን እና ለአንጎል ክልል ልዩ የሆነውን ማይክሮቫስኩላርን ለማያያዝ ያላቸውን ምርጫ ለማብራራት ነው.ይህ ለቢቢቢ እና ተቀባዮች ማጓጓዣ አዳዲስ መንገዶችን ወደመፈለግ ሊያመራ ይችላል።ተለይተው የታወቁት peptides በቀጥታ ወደ ሴሬብሮቫስኩላር ተቀባይ ተቀባይዎች ወይም በBBB ወይም BCSFB በኩል ከሚጓጓዙ የደም ዝውውሮች ጋር ሊተሳሰሩ እንደሚችሉ እንጠብቃለን።በዚህ ሥራ የተገኙት የሲኤስኤፍ ትራንስፖርት እንቅስቃሴ ያላቸው የፔፕታይድ ቬክተሮች ተጨማሪ ምርመራ ይደረግባቸዋል።በአሁኑ ጊዜ የእነዚህ peptides አእምሮአዊነት BBB እና/ወይም BCSFBን ለማቋረጥ ችሎታቸውን እየመረመርን ነው።እነዚህ አዳዲስ peptides አዳዲስ ተቀባይዎችን ወይም መንገዶችን ለማግኘት እና እንደ ባዮሎጂክስ ያሉ ማክሮ ሞለኪውሎችን ወደ አንጎል ለማድረስ አዳዲስ በጣም ቀልጣፋ መድረኮችን ለማዘጋጀት እጅግ በጣም ጠቃሚ መሳሪያዎች ይሆናሉ።
ቀደም ሲል የተገለጸውን ዘዴ ማሻሻያ በመጠቀም ትልቁን የውሃ ጉድጓድ (ሲኤምኤ) ያንሱ።ማደንዘዣ የዊስታር አይጦች (200-350 ግ) በስቲሪዮታክሲክ መሳሪያ ላይ ተጭነዋል እና በተላጨው እና በተዘጋጀው የራስ ቅሉ ላይ የሽምግልና ቀዶ ጥገና የራስ ቅሉን ለማጋለጥ ተደረገ።በላይኛው ሾጣጣ አካባቢ ላይ ሁለት ጉድጓዶችን ይከርፉ እና በቀዳዳዎቹ ውስጥ ያሉትን ጥገናዎች ያስተካክሉ.ከማይዝግ ብረት የተሰራ ቦይ ወደ ሲኤም ውስጥ ለሚያስገባው ስቴሪዮታክቲክ መመሪያ በጎን ኦሲፒታል ክሬስት ላይ ተጨማሪ ጉድጓድ ተቆፍሯል።የጥርስ ሲሚንቶ በካኑላ ዙሪያ ይተግብሩ እና በዊንዶዎች ይጠብቁ።ከፎቶ ማከም እና ከሲሚንቶ ማጠንከሪያ በኋላ, የቆዳ ቁስሉ በ 4/0 ሱፐራሚድ ስፌት ተዘግቷል.የካንኑላውን ትክክለኛ አቀማመጥ በራስ ተነሳሽነት የሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ (CSF) መፍሰስ ይረጋገጣል.አይጦቹን ከስቴሪዮታክሲክ አፓርተስ ውስጥ ያስወግዱ ፣ ከቀዶ ጥገና በኋላ ተገቢውን እንክብካቤ እና የህመም ማስታገሻ ያግኙ እና ቢያንስ ለአንድ ሳምንት በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ውስጥ የደም ምልክቶች እስኪታዩ ድረስ እንዲያገግም ይፍቀዱለት።የዊስታር አይጦች (Crl:WI/Han) የተገኙት ከቻርለስ ወንዝ (ፈረንሳይ) ነው።ሁሉም አይጦች በልዩ በሽታ አምጪ-አልባ ሁኔታዎች ውስጥ ተጠብቀዋል።ሁሉም የእንስሳት ሙከራዎች በባዝል ከተማ, ስዊዘርላንድ የእንስሳት ህክምና ቢሮ ጸድቀዋል, እና የተከናወኑት በእንስሳት ፍቃድ ቁጥር 2474 (በሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ እና አንጎል አይጥ ውስጥ ያሉ የሕክምና እጩዎችን ደረጃዎች በመለካት ንቁ የአንጎል ትራንስፖርት ግምገማ).
በእጁ ባለው የCM cannula አማካኝነት አይጡን በጥንቃቄ ያቆዩት።ዳቱራን ከካንኑላ ያስወግዱ እና 10 μl በድንገት የሚፈስ ሴሬብሮስፒናል ፈሳሽ ይሰብስቡ።የ cannula ንክኪነት በመጨረሻ የተበላሸ በመሆኑ፣ በዚህ ጥናት ውስጥ ምንም አይነት የደም መበከል እና ቀለም የመለየት ማስረጃ የሌላቸው ግልጽ ሴሬብሮስፒናል ፈሳሾች ናሙናዎች ብቻ ተካተዋል።በትይዩ ከ10-20 μl ደም በጅራቱ ጫፍ ላይ ከትንሽ መቆረጥ ተወስዷል ሄፓሪን (ሲግማ-አልድሪች) ያላቸው ቱቦዎች።CSF እና ደም በተለያዩ ጊዜያት የተሰበሰቡት በT7 phage ውስጥ በደም ውስጥ ከተከተቡ በኋላ ነው።እያንዳንዱ የሲኤስኤፍ ናሙና ከመሰብሰቡ በፊት በግምት 5-10 μl ፈሳሽ ተጥሏል, ይህም ከካቴተሩ የሞተ መጠን ጋር ይዛመዳል.
በT7Select የስርዓት መመሪያ (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) ላይ እንደተገለጸው የT7Select 10-3b ቬክተር በመጠቀም ቤተ-መጻሕፍት ተፈጠሩ።ባጭሩ፣ በዘፈቀደ የ12-ሜር ዲኤንኤ ማስገቢያ በሚከተለው ፎርማት ተሰራ።
የኤን.ኤን.ኬ ኮድን በእጥፍ ማቆሚያ ኮዶች እና በአሚኖ አሲድ ውስጥ ከመጠን በላይ መጨናነቅን ለማስወገድ ጥቅም ላይ ውሏል።N የእያንዳንዱ ኑክሊዮታይድ በእጅ የተደባለቀ ተመጣጣኝ ሬሾ ነው፣ እና K በእጅ የተደባለቀ የአድኒን እና የሳይቶሲን ኑክሊዮታይድ ሬሾ ነው።ነጠላ የተዘጉ ክልሎች በዲኤንቲፒ (ኖቫገን) እና ክሌኖው ኢንዛይም (ኒው ኢንግላንድ ባዮላብስ) በKlenow buffer (ኒው ኢንግላንድ ባዮላብስ) ለ 3 ሰአታት በ37°ሴ ተጨማሪ በመታቀፉ ​​ወደ ባለ ሁለት ገመድ ዲ ኤን ኤ ተለውጠዋል።ከምላሹ በኋላ፣ ባለ ሁለት ገመድ ዲ ኤን ኤ በኤትኦኤች ዝናብ ተገኝቷል።የተገኘው ዲ ኤን ኤ በገዳቢ ኢንዛይሞች EcoRI እና HindIII (ሁለቱም ከRoche) ተፈጭቷል።የተሰነጠቀው እና የተጣራው (QIAquick, Qiagen) አስገባ (T4 ligase, New England Biolabs) ከ 10B ካፕሲድ ጂን አሚኖ አሲድ 348 በኋላ በፍሬም ውስጥ ቀድሞ በተሰነጣጠለ T7 ቬክተር ውስጥ ተጣብቋል።በብልቃጥ እሽግ ከመደረጉ በፊት ለ 18 ሰአታት በ 16 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ውስጥ የሊቲንግ ምላሾች ተወስደዋል.የፋጅ ማሸጊያ በብልቃጥ ውስጥ የተካሄደው ከ T7Select 10-3b cloning kit (ኖቫገን) ጋር በተሰጠው መመሪያ መሰረት ነው እና የማሸጊያው መፍትሄ ኤሼሪሺያ ኮላይን (BLT5615, Novagen) በመጠቀም አንድ ጊዜ ለሊሲስ ተጨምሯል።ሊዛቶቹ በ -80 ዲግሪ ሴንቲግሬድ (-80 ° C) ላይ እንደ የ glycerol ክምችት ሴንትሪፉድ፣ ቲትሬትድ እና በረዶ ደርቀዋል።
የባለቤትነት 454/Roche-amplicon ፊውዥን ፕሪመርሮችን በመጠቀም በሾርባ ወይም በፕላስቲን ውስጥ የተጨመሩ የፋጅ ተለዋዋጭ ክልሎች ቀጥተኛ PCR ማጉላት።የፊት ውህደት ፕሪመር ከተለዋዋጭ ክልል (ኤን.ኤን.ኬ) 12 (አብነት-ተኮር)፣ GS FLX Titanium Adapter A፣ እና ባለአራት-ቤዝ ላይብረሪ ቁልፍ ቅደም ተከተል (TCAG) (ተጨማሪ ምስል 1 ሀ) የሚደግፉ ቅደም ተከተሎችን ይዟል።
የተገላቢጦሽ ውህደት ፕሪመር በተጨማሪም ዶቃዎችን ለመያዝ የተያያዘውን ባዮቲን እና የጂ.ኤስ.ኤፍኤልኤክስ ቲታኒየም አስማሚ ለ emulsion PCR ጊዜ ክሎናል ማጉላት ያስፈልጋል፡-
በ 454 GS-FLX Titanium ፕሮቶኮል መሰረት አምፖሎቹ ለ 454/Roche pyrosequencing ተደርገዋል።ለእጅ Sanger ቅደም ተከተል (ተግባራዊ ባዮሲስተም ሂታቺ 3730 xl ዲኤንኤ ተንታኝ)፣ T7 phage DNA በ PCR ተጨምሯል እና በሚከተሉት ፕሪመር ጥንዶች ቅደም ተከተል ተቀምጧል።
ከግለሰባዊ ንጣፎች ውስጥ የገቡት የRoche Fast Start DNA Polymerase Kit (በአምራቹ መመሪያ መሰረት) PCR ማጉላት ተደርገዋል።ትኩስ ጅምር (10 ደቂቃ በ95 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ) እና 35 የማበልጸጊያ ዑደቶች (50 ሴ በ95 ዲግሪ ሴንቲግሬድ፣ 1 ደቂቃ በ50 ዲግሪ ሴንቲግሬድ እና 1 ደቂቃ በ72 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ) ያድርጉ።
ደረጃ ከቤተ-መጻህፍት፣ ከዱር-አይነት ፋጅ፣ ከሲኤስኤፍ እና ከደም የዳነ ፋጌ፣ ወይም የግለሰብ ክሎኖች በ Escherichia coli BL5615 በቲቢ መረቅ (ሲግማ አልድሪች) ወይም በ 500 ሴ.ሜ 2 ምግቦች (ቴርሞ ሳይንቲፊክ) ለ 4 ሰዓታት በ 37 ዲግሪ ሴንቲ ግሬድ ተጨምረዋል።ሳህኖቹን በTris-EDTA ቋት (Fluka Analytical) በማጠብ ወይም ንጣፎችን በንፁህ የፔፕት ምክሮች በመሰብሰብ ከሳህኖቹ ላይ ፋጌ ወጡ።ደረጃ ከአንድ ዙር ፖሊ polyethylene glycol (PEG 8000) ዝናብ (Promega) ካለው ከባህል ሱፐርናታንት ወይም ከኤክስትራክሽን ቋት ተለይቷል እና በTris-EDTA ቋት ውስጥ እንደገና ታግዷል።
አምፕሊፋይድ ፋጅ ከ2-3 ዙር የኢንዶቶክሲን መወገድ የተደረገው የኢንዶቶክሲን ማስወገጃ ዶቃዎችን (Miltenyi Biotec) በመጠቀም ከደም ሥር (IV) መርፌ (500 μl/እንስሳ) በፊት ነው።በመጀመሪያው ዙር 2×1012 ፋጃጆች ቀርበዋል;በሁለተኛው ውስጥ, 2 × 1010 ፋጆች;በሦስተኛው እና በአራተኛው ምርጫ ዙሮች, 2 × 109 ፋጌዎች በእያንዳንዱ እንስሳ.በ CSF ውስጥ ያለው የደረጃ ይዘት እና በተጠቀሰው ጊዜ የሚሰበሰበው የደም ናሙና የሚወሰነው በአምራቹ መመሪያ (T7Select system manual) መሰረት በፕላዝ ቆጠራ ነው።የደረጃ ምርጫ የተካሄደው የተጣራ ቤተመፃህፍት በደም ሥር በመርፌ ወይም ካለፈው ምርጫ ዙር ከሲኤስኤፍ የወጣውን ፋጌን እንደገና በመርፌ ሲሆን በመቀጠልም በ10 ደቂቃ፣ 30 ደቂቃ፣ 60 ደቂቃ፣ 90 ደቂቃ፣ 120 ደቂቃ፣ 180 ደቂቃ እና 240 ደቂቃ የደም ናሙናዎች ተከናውኗል።በመጀመሪያዎቹ ሶስት ዙሮች በምርጫ ወቅት የተመረጡት ሁለቱ ቅርንጫፎች ተለይተው ተከማችተው ሲተነተኑ በአጠቃላይ አራት ዙር የኢንቪቮ ፓኒንግ ተካሂደዋል።ከሲኤስኤፍ የመጀመሪያዎቹ ሁለት ዙሮች የተመረጡ ሁሉም የፋጌ ማስገቢያዎች ለ 454/Roche pyrosequencing ተደርገዋል፣ ከ CSF የተወሰዱት ክሎኖች ካለፉት ሁለት ዙሮች ምርጫ ደግሞ በእጅ በቅደም ተከተል ቀርበዋል።ከመጀመሪያው ዙር ምርጫ ሁሉም የደም ፋጆች ለ 454/Roche pyrosequencing ተደርገዋል።ለፋጌ ክሎኖች መርፌ, የተመረጡ ፋጌዎች በ E. coli (BL5615) በ 500 ሴ.ሜ 2 ሳህኖች በ 37 ° ሴ ለ 4 ሰዓታት ተጨምረዋል.በተናጥል የተመረጡ እና በእጅ የተደረደሩ ክሎኖች በቲቢ መካከለኛ ተሰራጭተዋል.phage ማውጣት፣ ማጥራት እና ኢንዶቶክሲን (ከላይ እንደተገለፀው) 2×1010 phages/እንስሳ በ 300 μl ውስጥ በደም ሥር ወደ አንድ የጅራት ጅማት ገብተዋል።
የቅደም ተከተል ውሂብን በጥራት ማጣራት እና ማጣራት።የጥሬ 454/Roche መረጃ የአቅራቢ ሶፍትዌርን በመጠቀም ከሁለትዮሽ መደበኛ የዥረት ካርታ ቅርጸት (ኤስኤፍኤፍ) ወደ ፒርሰን የሰው ሊነበብ የሚችል ቅርጸት (ፋስታ) ተቀይሯል።ከዚህ በታች እንደተገለፀው የኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተል ተጨማሪ ሂደት በባለቤትነት የተያዙ C ፕሮግራሞችን እና ስክሪፕቶችን (ያልተለቀቀ የሶፍትዌር ጥቅል) በመጠቀም ተካሂዷል።የአንደኛ ደረጃ መረጃ ትንተና ጥብቅ ባለ ብዙ ደረጃ ማጣሪያ ሂደቶችን ያካትታል.ልክ የሆነ የ12ሜር ማስገቢያ ዲኤንኤ ተከታታይ ያልያዙ ንባቦችን ለማጣራት ንባቦቹ በቅደም ተከተል ወደ መጀመሪያ መሰየሚያ (GTGATGTCGGGGGATCCGAATTCT)፣ የማቆሚያ መለያ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) እና የጀርባ አስገባ (CCCTGCAGGATATCCCGeedGGAGCTCGTCGAC)ን አለምአቀፍ ኤንኤን-ኤን-ኤን-ኤንሽኬን በመጠቀም ተሰልፈዋል።አሰላለፍ በአንድ አሰላለፍ እስከ 2 የሚደርሱ አለመጣጣሞችን ይፈቅዳል31.ስለዚህ፣ ሳይጀመር ያነባል እና ያቁሙ መለያዎች እና የዳራ ማስገቢያዎችን የያዙ ንባቦች ማለትም ከተፈቀደው የተዛማጆች ብዛት የሚበልጡ አሰላለፍ ከቤተ-መጽሐፍት ተወግደዋል።የቀሩትን ንባብ በተመለከተ፣ የኤን-ሜር ዲኤንኤ ቅደም ተከተል ከመጀመሪያው ምልክት ጀምሮ የሚዘልቅ እና የማቆሚያ ምልክቱ ከመጀመሪያው የንባብ ቅደም ተከተል ከመውጣቱ እና የበለጠ ከመሰራቱ በፊት (ከዚህ በኋላ “ማስገባት” ተብሎ ይጠራል)።ማስገባቱ ከተተረጎመ በኋላ በፕሪመር 5′ ላይ ካለው የመጀመሪያው የማቆሚያ ኮድ በኋላ ያለው ክፍል ከመክተቻው ይወገዳል።በተጨማሪም በፕሪመር 3′ መጨረሻ ላይ ወደ ያልተሟሉ ኮዶች የሚመሩ ኑክሊዮታይዶችም ተወግደዋል።የጀርባ ቅደም ተከተሎችን ብቻ የያዙ ማስገባቶችን ለማስቀረት፣ በአሚኖ አሲድ ስርዓተ-ጥለት “PAG” የሚጀምሩ የተተረጎሙ ማስገቢያዎች እንዲሁ ተወግደዋል።ከ 3 አሚኖ አሲዶች የድህረ-ትርጉም ርዝማኔ ያላቸው Peptides ከቤተ-መጽሐፍት ተወግደዋል።በመጨረሻም በማስገቢያ ገንዳ ውስጥ ድጋሚነትን ያስወግዱ እና የእያንዳንዱን ልዩ ማስገቢያ ድግግሞሽ ይወስኑ።የዚህ ትንተና ውጤቶች የኑክሊዮታይድ ቅደም ተከተሎችን (ማስገባቶች) እና የእነሱ (የተነበቡ) ድግግሞሾችን (ተጨማሪ ምስሎች 1 ሐ እና 2) ያካትታል.
የቡድን N-mer ዲኤንኤ በቅደም ተከተል ተመሳሳይነት ያስገባል፡- 454/Roche-ተኮር ተከታታይ ስህተቶችን ለማስወገድ (እንደ ግብረ-ሰዶሞፖሊመር ኤክስቴንሽን ያሉ ችግሮችን) ለማስወገድ እና ብዙም አስፈላጊ ያልሆኑ ድግግሞሾችን ያስወግዳል፣ ቀደም ሲል የተጣሩ N-mer DNA ተከታታይ ማስገቢያዎች (ማስገቢያዎች) በተመሳሳይነት ይደረደራሉ።ማስገባቶች (እስከ 2 የማይዛመዱ መሠረቶች ይፈቀዳሉ) በሚከተለው መልኩ የተገለፀው መደጋገሚያ ስልተ-ቀመር በመጠቀም-ማስገቢያዎች በመጀመሪያ በድግግሞቻቸው (ከከፍተኛ እስከ ዝቅተኛ) ይደረደራሉ ፣ እና ተመሳሳይ ከሆኑ ፣ በሁለተኛ ደረጃ ርዝመታቸው (ከረጅም እስከ አጭር))።ስለዚህ, በጣም ተደጋጋሚ እና ረዥም ማስገቢያዎች የመጀመሪያውን "ቡድን" ይገልፃሉ.የቡድን ድግግሞሽ ወደ ቁልፍ ድግግሞሽ ተቀናብሯል.ከዚያም፣ በተደረደሩት ዝርዝር ውስጥ የቀረው እያንዳንዱ ማስገባት ጥንድ አቅጣጫ በ Needleman-Wunsch አሰላለፍ ወደ ቡድኑ ለመጨመር ተሞክሯል።በአሰላለፍ ውስጥ ያሉ አለመዛመጃዎች፣ ማስገባቶች ወይም ስረዛዎች ቁጥር ከ 2 ገደብ በላይ ካልሆነ፣ በቡድኑ ውስጥ ማስገባት ይጨመራል፣ እና የአጠቃላይ የቡድን ድግግሞሽ መጨመር በየስንት ጊዜው ይጨምራል።በቡድን ውስጥ የታከሉ ማስገባቶች ጥቅም ላይ እንደዋሉ ምልክት ተደርጎባቸዋል እና ከተጨማሪ ሂደት የተገለሉ ናቸው።የማስገቢያ ቅደም ተከተል ወደ ቀድሞው ቡድን መጨመር ካልተቻለ የማስገቢያ ቅደም ተከተል አዲስ ቡድን ለመፍጠር ጥቅም ላይ ይውላል ተገቢው የማስገቢያ ድግግሞሽ እና ጥቅም ላይ እንደዋለ ምልክት ተደርጎበታል።ድግግሞሹ የሚያበቃው እያንዳንዱ የማስገቢያ ቅደም ተከተል ወይ አዲስ ቡድን ለመመስረት ጥቅም ላይ ከዋለ ወይም ቀደም ሲል ባለው ቡድን ውስጥ መካተት ሲቻል ነው።ከሁሉም በኋላ, ኑክሊዮታይድ ያካተቱ በቡድን የተገጣጠሙ ማስገቢያዎች በመጨረሻ ወደ peptide ቅደም ተከተሎች (ፔፕታይድ ቤተ-መጻሕፍት) ይተረጎማሉ.የዚህ ትንተና ውጤት በተከታታይ የተነበቡ ቁጥርን የሚያካትት የማስገቢያ ስብስብ እና የእነሱ ተዛማጅ ድግግሞሾች ናቸው (ተጨማሪ ምስል 2)።
Motif Generation፡ በልዩ የፔፕቲዶች ዝርዝር መሰረት ከዚህ በታች እንደሚታየው ሁሉንም ሊሆኑ የሚችሉ የአሚኖ አሲድ ንድፎችን (aa) የያዘ ቤተ-መጽሐፍት ተፈጠረ።እያንዳንዱ ሊሆን የሚችል ርዝመት 3 ጥለት ከፔፕታይድ የወጣ ሲሆን የተገላቢጦሽ ንድፉ ሁሉንም ቅጦችን (ትሪፕታይድ) ከያዘው የጋራ ሞቲፍ ቤተ-መጽሐፍት ጋር ተጨምሯል።በከፍተኛ ደረጃ የሚደጋገሙ ሀሳቦች ቤተ-መጻሕፍት በቅደም ተከተል ተቀምጠዋል እና እንደገና መታደስ ተወግደዋል።ከዚያም በሞቲፍ ቤተ-መጽሐፍት ውስጥ ላለው እያንዳንዱ ትሪፕፕታይድ፣ በስሌት መሳሪያዎች በመጠቀም በቤተ መፃህፍት ውስጥ መኖሩን አረጋገጥን።በዚህ ሁኔታ የተገኘውን ሞቲፍ ትሪፕፕታይድ የያዘው የፔፕታይድ ድግግሞሽ ተጨምሯል እና በሞቲፍ ቤተ-መጽሐፍት ("የሞቲፍ ቁጥር") ውስጥ ለሞቲፍ ይመደባል.የሞቲፍ ማመንጨት ውጤት ሁሉንም የ tripeptides (motifs) እና የየራሳቸው እሴቶችን የያዘ ባለ ሁለት አቅጣጫዊ ድርድር ሲሆን እነዚህም ንባቦቹ ሲጣሩ፣ ሲቦደዱ እና ሲተረጎሙ የሚዛመደውን የንባብ ብዛት ነው።ከላይ በዝርዝር እንደተገለፀው መለኪያዎች.
የጭብጦችን ብዛት እና ተጓዳኝ የተበታተኑ ቦታዎችን መደበኛ ማድረግ-የእያንዳንዱ ናሙና ዘይቤዎች ብዛት በመጠቀም መደበኛ ነበር
የት እኔ ርዕስ i የያዙ የንባብ ብዛት ነው.ስለዚህም vi በናሙናው ውስጥ motif iን የያዙ የንባብ ድግግሞሽ (ወይም peptides) መቶኛን ይወክላል።የP-እሴቶች መደበኛ ላልሆኑት የጭብጦች ብዛት የተሰሉት የፊሸር ትክክለኛ ፈተናን በመጠቀም ነው።የምክንያቶች ብዛት ኮርሪሎግራሞችን በተመለከተ፣ የስፔርማን ቁርኝት የተሰላው በተለመደው የምክንያቶች ብዛት ከ R ጋር ነው።
በፔፕታይድ ቤተ-መጽሐፍት ውስጥ በእያንዳንዱ ቦታ የአሚኖ አሲዶችን ይዘት በዓይነ ሕሊናህ ለማየት፣ የድር ሎጎግራም 32፣ 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ተፈጥረዋል።በመጀመሪያ, በእያንዳንዱ የ 12-mer peptide አቀማመጥ ላይ የአሚኖ አሲዶች ይዘት በ 20 × 12 ማትሪክስ ውስጥ ተከማችቷል.ከዚያም በእያንዳንዱ ቦታ ላይ ተመሳሳይ አንጻራዊ የአሚኖ አሲድ ይዘት ያለው 1000 peptides ስብስብ በ fasta-sequence ቅርጸት ይፈጠራል እና ለድር-ሎጎ 3 እንደ ግብአት ይቀርባል ይህም በእያንዳንዱ ቦታ ላይ ያለውን አንጻራዊ የአሚኖ አሲድ ይዘት በስዕላዊ መግለጫ ያመነጫል።ለተሰጠው peptide ቤተ-መጽሐፍት.ባለብዙ ገጽታ ዳታ ስብስቦችን በዓይነ ሕሊና ለማየት፣ የሙቀት ካርታዎች የተፈጠሩት በ R ውስጥ በውስጥ የዳበረ መሣሪያን በመጠቀም ነው (biosHeatmap፣ ገና ያልተለቀቀ የ R ጥቅል)።በሙቀት ካርታዎች ላይ የቀረቡት ዴንድሮግራሞች የተቆጠሩት የዎርድ ተዋረዳዊ ክላስተር ዘዴን ከዩክሊዲያን የርቀት መለኪያ ጋር በመጠቀም ነው።ለሞቲፍ የውጤት አወጣጥ መረጃ ስታቲስቲካዊ ትንተና፣ መደበኛ ላልሆነ የውጤት አሰጣጥ የፒ ዋጋዎች የተሰሉት የፊሸር ትክክለኛ ፈተናን በመጠቀም ነው።ለሌሎች የውሂብ ስብስቦች ፒ-እሴቶች የተማሪውን t-ሙከራ ወይም ANOVA በመጠቀም በ R ውስጥ ይሰላሉ።
የተመረጡ የፋጅ ክሎኖች እና ፋጌዎች ያለማስገባቶች በደም ሥር በጅራት ደም ወሳጅ መርፌ (2×1010 phages/እንስሳ በ300 μl PBS)።ደም ከመፍሰሱ 10 ደቂቃዎች በፊት እና በቀጣይ ማስተካከያ, ተመሳሳይ እንስሳት በ 100 μl DyLight594-labeled lectin (Vector Laboratories Inc., DL-1177) በደም ሥር ገብተዋል.ከፋጅ መርፌ ከ60 ደቂቃ በኋላ፣ አይጦች በ50 ሚሊር PBS እና 50 ml 4% PFA/PBS እና በመቀጠል በልብ ውስጥ ቀባ።የአንጎል ናሙናዎች በተጨማሪ በአንድ ሌሊት በ 4% PFA/PBS ተስተካክለዋል እና በ 30% sucrose ውስጥ በአንድ ሌሊት በ 4 ° ሴ.ናሙናዎች በOCT ድብልቅ ውስጥ ብልጭ ድርግም የሚሉ ናቸው።የቀዘቀዙ ናሙናዎች ኢሚውኖሂስቶኬሚካላዊ ትንተና በክፍል ሙቀት በ 30 μm ክሪሴሴክሽን በ 1% BSA የታገዱ እና በ polyclonal FITC በተሰየሙ ፀረ እንግዳ አካላት በ T7 phage (Novus NB 600-376A) በ 4 ° ሴ.በአንድ ሌሊት ማነሳሳት።በመጨረሻም ክፍሎቹ በፒቢኤስ 3 ጊዜ ታጥበው በኮንፎካል ሌዘር ማይክሮስኮፕ (ሌይካ TCS SP5) ተመርምረዋል።
ሁሉም peptides በትንሹ 98% ንፅህና በጄንስክሪፕት ዩኤስኤ ፣ ባዮቲኒላድ እና lyophilized ተዋህደዋል።ባዮቲን በN-terminus ላይ ባለው ተጨማሪ ባለሶስትዮሽ ግሊሲን ስፔሰር በኩል ታስሯል።የጅምላ ስፔክትሮሜትሪ በመጠቀም ሁሉንም peptides ይፈትሹ.
Streptavidin (Sigma S0677) በ 5-fold equimolar over biotinylated peptide, biotinylated BACE1 inhibitory peptide, ወይም ጥምር (3: 1 ሬሾ) ባዮቲንላይድ BACE1 inhibitory peptide እና BACE1 inhibitory peptide በ 5-10% DMSO/incumolar ጋር ተቀላቅሏል.መርፌ ከመውሰዱ በፊት 1 ሰዓት በቤት ሙቀት ውስጥ.Streptavidin-conjugated peptides በ 10 mg/kg መጠን በአንደኛው የአይጥ ጅራቶች ሴሬብራል አቅልጠው ወደ ውስጥ በመርፌ ገብተዋል።
የ streptavidin-peptide ውስብስቦች ትኩረት በ ELISA ተገምግሟል።Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) በአንድ ሌሊት በ 4 ዲግሪ ሴንቲግሬድ በ 1.5 μg / ml መዳፊት ፀረ-ስትሬፕታቪዲን ፀረ እንግዳ አካላት (ቴርሞ, ኤምኤ1-20011) ተሸፍነዋል.በክፍሉ የሙቀት መጠን ለ 2 ሰአታት ከታገዱ በኋላ (የማገድ ቋት: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) ለ 2 ሰዓታት ያህል, ሳህኑን በ 0.05% Tween-20/PBS (ማጠቢያ መያዣ) ለ 3 ሰከንድ, CSF እና የፕላዝማ ናሙናዎች 0 ተጨምረዋል. ኤስኤፍ 1፡115)።ከዚያም ሳህኑ በአንድ ሌሊት በ 4 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ በክትባት ፀረ እንግዳ አካላት (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).ከሶስት የመታጠቢያ ደረጃዎች በኋላ, ስቴፕታቪዲን በቲኤምቢ substrate መፍትሄ (Roche) ውስጥ እስከ 20 ደቂቃ ድረስ በመታቀፉ ​​ተገኝቷል.በ 1M H2SO4 የቀለም እድገትን ካቆሙ በኋላ, መምጠጥን በ 450 nm ይለኩ.
የ streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor ውስብስብ ተግባር በአምራቹ ፕሮቶኮል (Wako, 294-64701) በ Aβ (1-40) ELISA ተገምግሟል.በአጭሩ፣ የCSF ናሙናዎች በመደበኛ ማሟያ (1፡23) እና በአንድ ሌሊት በ4°ሴ በ96-ጉድጓድ ፕላስቲኮች በBNT77 የሚይዝ አንቲቦዲ ተሸፍነዋል።ከአምስት የማጠቢያ ደረጃዎች በኋላ HRP-conjugated BA27 ፀረ እንግዳ አካላት ተጨምረዋል እና ለ 2 ሰአታት በ 4° ሴ.Aβ (1-40) በቲኤምቢ መፍትሄ ለ 30 ደቂቃዎች በክፍል ሙቀት ውስጥ በመታቀፉ ​​ተገኝቷል.የቀለም እድገትን በማቆም መፍትሄ ከቆመ በኋላ በ 450 nm ውስጥ መምጠጥን ይለኩ.የፕላዝማ ናሙናዎች ከ Aβ (1-40) ELISA በፊት በጠንካራ ደረጃ ማውጣት ተደርገዋል.ፕላዝማ ወደ 0.2% DEA (ሲግማ) በ 96 ጉድጓድ ውስጥ ተጨምሮ በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ 30 ደቂቃዎች ተጨምሯል.በተከታታይ የ SPE ንጣፎችን (Oasis, 186000679) በውሃ እና 100% ሜታኖል ከታጠበ በኋላ, የፕላዝማ ናሙናዎች ወደ SPE ሳህኖች ተጨምረዋል እና ሁሉም ፈሳሽ ተወግዷል.ናሙናዎች ታጥበዋል (በመጀመሪያ በ 5% ሜታኖል ከዚያም 30% ሜታኖል) እና በ 2% NH4OH/90% ሜታኖል ተመርተዋል.በቋሚ N2 ጅረት ለ 99 ደቂቃዎች ኤሉቴትን በ 55 ዲግሪ ሴንቲግሬድ ውስጥ ካደረቀ በኋላ, ናሙናዎቹ በመደበኛ ዳይሬቶች ውስጥ ይቀንሳሉ እና Aβ (1-40) ከላይ እንደተገለፀው ይለካሉ.
ይህን ጽሑፍ እንዴት መጥቀስ ይቻላል፡ ዩሪክ፣ ኢ. እና ሌሎች።በአንጎል ውስጥ የተገለጹትን የመተላለፊያ peptides በመጠቀም ጭነት ወደ አንጎል ማድረስ።ሳይንስ ።5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015)
Likhota J., Skjoringe T., Thomsen LB እና Moos T. የታለመ ህክምናን በመጠቀም የማክሮ ሞለኪውላር መድሃኒቶችን ወደ አንጎል ማድረስ.ጆርናል ኦቭ ኒውሮኬሚስትሪ 113, 1-13, 10.1111 / j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., and Martinez-Martinez, P. በደም-አንጎል እንቅፋት ላይ የፔፕታይድ እና የፕሮቲን መድኃኒቶችን ማድረስ።ፕሮግ ኒውሮቢዮል 87, 212-251, 10.1016 / j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM የደም-አንጎል እንቅፋት፡ የአንጎል መድሃኒት እድገት ማነቆ።NeuroRx 2, 3-14, 10.1602 / neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, እና Byrd, A. የተሻሻለ የመድኃኒት አቅርቦት እና ወደ አንጎል በ choroid plexus-CSF መንገድ በኩል የማነጣጠር ተስፋዎች።የፋርማሲዩቲካል ምርምር 22, 1011-1037, 10.1007 / s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge፣ WM የባዮፋርማሱቲካል መድኃኒቶችን በሞለኪውል ትሮጃን ፈረሶች ለአእምሮ ማዳረሻ ማዘመን።Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
ፓርድሪጅ፣ WM ተቀባይ-አማላጅ የሆነ የፔፕታይድ ማጓጓዝ በደም-አንጎል እንቅፋት ላይ።ኢንዶክር ራእ. 7፣ 314–330 (1986)።
Niewoehner, J. et al.ሞኖቫለንት ሞለኪውላር መንኮራኩሮችን በመጠቀም የአንጎል ዘልቆ መግባት እና የሕክምና ፀረ እንግዳ አካላትን ውጤታማነት ይጨምሩ።ኒውሮን 81, 49-60, 10.1016 / j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.ትራንስፈርሪን ተቀባይ (TfR) ትራንስፖርት የTfR ፀረ እንግዳ አካላትን ተያያዥነት ያላቸውን ልዩነቶች አንጎል መውሰድን ይወስናል።ጄ ኤክስፕ ሜድ 211, 233-244, 10.1084 / jem.20131660 (2014).