Nature.com saýtyna gireniňiz üçin sag boluň. Siz çäkli CSS goldawy bolan brauzer wersiýasyny ulanýarsyňyz. Iň gowy tejribe üçin täzelenen brauzer ulanmagyňyzy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gatnaşyklyk Režimini öçüriň). Mundan başga-da, yzygiderli goldawy üpjün etmek üçin saýty stillersiz we JavaScript-siz görkezýäris.
Birbada üç slaýdyň karuselini görkezýär. Birbada üç slaýdyň arasyndan geçmek üçin "Öňki" we "Indiki" düwmelerini ulanyň ýa-da birbada üç slaýdyň arasyndan geçmek üçin ahyryndaky sürgüç düwmelerini ulanyň.
Gan-beýni päsgelçilik we gan-beýni päsgelçilik bioterapewtiki agentleriň merkezi nerw ulgamyndaky maksatlaryna ýetmegine päsgel berýär, şeýlelik bilen newrologik keselleri netijeli bejermäge päsgel berýär. In vivo täze beýni daşaýjylaryny açmak üçin biz T7 fag peptid kitaphanasyny girizdik we syçanlaryň kanulýasiýa edilen aňly uly howuz modelini ulanyp, gan we beýni-oňurga suwuklygyny (BOS) yzygiderli ýygnadyk. Seçmegiň dört tapgyryndan soň fag klonlary BOS-da ýokary derejede baýlaşdyryldy. Aýry-aýry kandidat peptidleriň synagdan geçirilmegi BOS-da 1000 esseden gowrak baýlaşmany görkezdi. Peptid arkaly beýnä iberilmeginiň bioaktiwligi, anyklanan täze tranzit peptidi bilen baglanyşykly BACE1 peptid ingibitory ulanylyp, beýni-oňurga suwuklygynda amiloid-β derejesiniň 40% azalmagy bilen tassyklanyldy. Bu netijeler in vivo fag saýlama usullary bilen anyklanan peptidleriň makromolekulalary beýnä terapewtiki täsir bilen ulgamlaýyn ibermek üçin peýdaly serişdeler bolup biljekdigini görkezýär.
Merkezi nerw ulgamy (MNS) maksatly terapiýa barlaglary, esasan, MNS-i maksatly häsiýetleri görkezýän optimizirlenen dermanlary we agentleri kesgitlemäge gönükdirildi, beýnä işjeň derman eltmegini üpjün edýän mehanizmleri açmaga az tagalla edildi. Derman eltilmegi, esasanam uly molekulalar, häzirki zaman newrologiýa dermanlarynyň ösüşiniň aýrylmaz bölegi bolansoň, bu ýagdaý indi üýtgeýär. Merkezi nerw ulgamynyň gurşawy gan-beýni päsgelçiliklerinden (BBB) ​​we gan-beýni päsgelçiliklerinden (BCBB) ybarat bolan beýni-damar päsgelçilik ulgamy tarapyndan gowy goralýar1,2, bu bolsa dermanlary beýnä eltmegi kynlaşdyrýar1,2. Ähli uly molekulaly dermanlaryň diýen ýaly we kiçi molekulaly dermanlaryň 98% -den gowragynyň beýniden aýrylýandygy çaklanylýar3. Şonuň üçin MNS-e bejeriş dermanlarynyň netijeli we ýörite eltilmegini üpjün edýän täze beýni daşamak ulgamlaryny kesgitlemek örän möhümdir4,5. Şeýle-de bolsa, BBB we BCSFB hem derman eltilmegi üçin ajaýyp mümkinçilik döredýär, sebäbi olar beýniniň giň damar ulgamy arkaly onuň ähli gurluşlaryna aralaşyp we girýärler. Şeýlelik bilen, beýnä inwaziw däl eltme usullaryny ulanmak boýunça häzirki tagallalar, esasan, endogen BBB6 reseptoryny ulanyp, reseptor arkaly daşamagyň (PMT) mehanizmine esaslanýar. Transferrin reseptor ýoluny ulanmakda soňky möhüm ösüşlere garamazdan7,8, gowulandyrylan häsiýetlere eýe bolan täze eltme ulgamlaryny mundan beýläk-de ösdürmek zerurdyr. Şu maksat bilen, biziň maksadymyz MOS daşamagyny amala aşyrmaga ukyply peptidleri kesgitlemekdi, sebäbi olar prinsip boýunça MSS-e makromolekulalary eltmek ýa-da täze reseptor ýollaryny açmak üçin ulanylyp bilner. Hususan-da, beýni-damar ulgamynyň belli reseptorlary we daşaýjylary (BBB we BSCFB) bioterapewtiki dermanlaryň işjeň we belli bir eltilmegi üçin mümkin bolan nyşana bolup hyzmat edip bilerler. Beýni-omurga suwuklygy (BOS) horoid pleksusyň (KS) sekretor önümidir we subarahnoidal boşluk we garynjyk boşluk arkaly beýniniň interstisial suwuklygy bilen gönüden-göni aragatnaşykda bolýar4. Ýakynda subarahnoidal beýni-omurga suwuklygynyň beýniniň interstisial boşlugyna aşa köp diffuziýa edýändigi görkezildi9. Biz parenhimal boşluga şu subarahnoidal akym ýoluny ulanyp ýa-da gönüden-göni GBB arkaly girmegi umyt edýäris. Muňa ýetmek üçin, biz bu iki aýry ýoluň haýsy biri bilen daşalýan peptidleri ideal ýagdaýda kesgitleýän güýçli in vivo fag saýlama strategiýasyny ornaşdyrdyk.
Indi biz iň ýokary kitaphana dürlüligi bilen başlangyç saýlama tapgyrlaryny gözegçilik etmek üçin ýokary geçirijilikli yzygiderlilik (HTS) bilen birlikde CSF nusgalaryny almak bilen in vivo fag görkezme skrining usulyny beýan edýäris. Skrining gan hapalanmagynyň öňüni almak üçin hemişelik implantasiýa edilen uly sisterna (CM) kanýulasy bolan aňly syçanlarda geçirildi. Iň esasysy, bu çemeleşme beýni nyşana alýan we beýni-damar päsgelçiliklerinden daşamak işjeňligi bolan peptidleri saýlaýar. Biz kiçi ölçegli (~60 nm)10 sebäpli T7 faglaryny ulandyk we olaryň endotelial we/ýa-da epitelial-medulla päsgelçiliklerinden hüjreara geçmegine mümkinçilik berýän wezikulalary daşamak üçin amatlydygyny aýtdyk. Panning dört tapgyryndan soň, in vivo CSF-iň baýlaşmagyny we beýni mikrodamarlarynyň birleşmesini görkezýän fag populýasiýalary bölünip alyndy. Iň esasysy, iň gowy kandidat peptidleriň belok ýüklerini beýni-oňurga suwuklygyna daşamaga ukyplydygyny görkezmek arkaly netijelerimizi tassyklamagy başardyk. Ilki bilen, MNS-iň farmakodinamik täsirleri esasy tranzit peptidini BACE1 peptidiniň ingibitory bilen utgaşdyrmak arkaly kesgitlenildi. In vivo funksional barlag strategiýalarynyň täze beýni daşaýjy peptidleri netijeli belok ýük daşaýjylary hökmünde kesgitläp biljekdigini görkezmekden başga-da, şuňa meňzeş funksional saýlama çemeleşmeleriniň täze beýni daşaýjy ýollaryny kesgitlemekde hem möhüm ähmiýete eýe boljakdygyna garaşýarys.
Plak emele getirýän birliklere (PFU) esaslanyp, fag gaplama ädiminden soň, takmynan 109 dürliligi bolan tötänleýin 12-mer çyzykly T7 fag peptidleriniň kitaphanasy döredildi we döredildi (Materiallar we usullar bölümine serediň). In vivo panningden öň bu kitaphanany üns bilen seljerendigimizi bellemek möhümdir. Üýtgedilen praýmerleri ulanyp fag kitaphanasynyň nusgalarynyň PZR güýçlendirilmegi HTS-e gönüden-göni degişli bolan amplikonlary döretdi (Goşmaça surat 1a). a) HTS11 yzygiderlilik ýalňyşlyklary, b) praýmerleriň (NNK)1-12 hiline täsiri we c) garaşylýan kitaphanada ýabany görnüşli (wt) faglaryň (skelet goýujylarynyň) bolmagy sebäpli, diňe tassyklanan yzygiderlilik maglumatlaryny çykarmak üçin yzygiderlilik süzgüçleme prosedurasy ornaşdyryldy (Goşmaça surat 1b). Bu süzgüç ädimleri ähli HTS yzygiderlilik kitaphanalaryna degişlidir. Standart kitaphana üçin jemi 233,868 okalma alyndy, olaryň 39% -i süzgüç kriteriýalaryndan geçdi we kitaphana seljermesi we indiki tapgyrlar üçin saýlama üçin ulanyldy (Goşmaça 1c-e surat). Okalmalar, esasan, 36 nukleotidde depesi bolan 3 esas jübütiniň köp sanlysydy (Goşmaça 1c surat), bu bolsa kitaphana dizaýnyny (NNK) 1-12 tassyklaýar. Belli bir zat, kitaphana agzalarynyň takmynan 11% -inde 12 ölçegli ýabany görnüşli (wt) esasy PAGISRELVDKL goýmasy bardy we yzygiderlikleriň tas ýarysynda (49%) goýmalar ýa-da pozmalar bardy. Kitaphana kitaphanasynyň HTS-i kitaphanadaky peptidleriň ýokary dürlüligini tassyklady: peptid yzygiderlikleriniň 81% -den gowragy diňe bir gezek tapyldy we diňe 1,5% -i ≥4 nusgada boldy (Goşmaça 2a surat). Repertuardaky ähli 12 pozisiýadaky aminokislotalaryň (aa) ýygylyklary degenerasiýa edilen NKK repertuary tarapyndan döredilen kodonlaryň sany üçin garaşylýan ýygylyklar bilen gowy baglanyşyklydy (Goşmaça surat 2b). Bu goýmalar tarapyndan kodlanan aa galyndylarynyň synlanan ýygylygy hasaplanan ýygylyk bilen gowy baglanyşyklydy (r = 0.893) (Goşmaça surat 2c). Fag kitaphanalaryny inýeksiýa üçin taýýarlamak endotoksini güýçlendirmek we aýyrmak ädimlerini öz içine alýar. Munuň öň fag kitaphanalarynyň dürlüligini azaltmagy mümkindigi görkezildi12,13. Şonuň üçin, endotoksini aýyran plastinka güýçlendirilen fag kitaphanasyny yzygiderlikledik we AA ýygylygyny kesgitlemek üçin ony asyl kitaphana bilen deňeşdirdik. Asyl howuz bilen güýçlendirilen we arassalanan howuz arasynda güýçli korrelasiýa (r = 0.995) syn edildi (Goşmaça surat 2d), bu bolsa T7 fagyny ulanyp plastinkalarda güýçlendirilen klonlaryň arasyndaky bäsdeşligiň uly üýtgeşiklige sebäp bolmandygyny görkezýär. Bu deňeşdirme her kitaphanadaky tripeptid motiwleriniň ýygylygyna esaslanýar, sebäbi kitaphanalaryň dürlüligini (~109) hatda HTS bilen hem doly derejede beýan edip bolmaýar. Her pozisiýadaky aa-nyň ýygylyk analizi girizilen repertuaryň soňky üç pozisiýasynda pozisiýa bagly kiçi bir üýtgeşikligi ýüze çykardy (Goşmaça surat 2e). Netijede, kitaphananyň hiliniň we dürlüliginiň kabul ederliklidigini we birnäçe saýlama tapgyrlarynyň arasynda fag kitaphanalarynyň güýçlendirilmegi we taýýarlanmagy sebäpli dürlüligiň diňe kiçi üýtgeşmeleriniň syn edilendigini netijä geldik.
Seriýal beýni-omurga suwuklygynyň nusgasyny almak, BBB we/ýa-da BCSFB arkaly damardan inýeksiýa edilen T7 fagyny (iv) anyklamak üçin huşly syçanlaryň CM-ne kanýulany hirurgiki ýol bilen implantasiýa etmek arkaly amala aşyrylyp bilner (1a-b surat). In vivo saýlamagyň ilkinji üç tapgyrynda iki sany garaşsyz saýlama goluny (A we B gollary) ulandyk (1c surat). Saýlamagyň ilkinji üç tapgyrynda girizilen fagyň umumy mukdaryny azaltmak arkaly saýlamanyň berkligini kem-kemden ýokarlandyrdyk. Panningiň dördünji tapgyry üçin A we B şahalaryndan nusgalary birleşdirdik we goşmaça üç sany garaşsyz saýlama geçirdik. Bu modelde T7 fag bölejikleriniň in vivo häsiýetlerini öwrenmek üçin, guýruk damary arkaly syçanlara ýabany görnüşli fag (PAGISRELVDKL esasy goýujy) inýeksiýa edildi. Faglaryň dürli wagt nokatlarynda beýni-omurga suwuklygyndan we gandan alynmagy, deňeşdirme boýunça kiçi T7 ikosahedral faglaryň gan bölüminden çalt başlangyç arassalaýyş tapgyryna eýe bolandygyny görkezdi (Goşmaça surat 3). Syçanlaryň berlen titrlerine we gan göwrümine esaslanyp, damardan inýeksiýa edilenden 10 minut soň, berlen dozadan diňe takmynan 1% agram fagynyň gan içinde tapylandygyny hasapladyk. Bu başlangyç çalt pese gaçyşdan soň, ýarym ömri 27,7 minut bolan ilkinji arassalaýyşyň haýal ölçenendigi anyklandy. Iň esasysy, CSF bölüminden diňe örän az fag alyndy, bu bolsa ýabany faglaryň CSF bölümine göçmeginiň pes fonuny görkezýär (Goşmaça surat 3). Ortaça hasap bilen, tutuş nusga alyş döwründe (0-250 min) mikoz-beýni suwuklygynda gandaky T7 fagynyň diňe 1 x 10-3% titri we başlangyç infuziýa edilen faglaryň 4 x 10-8% anyklandy. Belli bir zat, mikoz-beýni suwuklygynda ýabany fagyň ýarym ömri (25,7 min) gandaky syn edilenlere meňzeşdi. Bu maglumatlar CSF bölümini gandan bölýän päsgelçilikiň CM-kanulýasiýa edilen syçanlarda abat galandygyny görkezýär, bu bolsa gandan CSF bölümine aňsatlyk bilen daşalýan klonlary anyklamak üçin fag kitaphanalaryny in vivo saýlamaga mümkinçilik berýär.
(a) Uly howuzdan beýni-omurga suwuklygyny (MSS) gaýtadan nusga almak üçin usul döretmek. (b) Merkezi nerw ulgamynyň (MSS) böwetiniň öýjük ýerleşýän ýerini we gan-beýni böwetini (GBB) we gan-beýni böwetini kesip geçýän peptidleri kesgitlemek üçin ulanylýan saýlama strategiýasyny görkezýän diagramma. (c) In vivo fag displeý skrining akym diagrammasy. Saýlamanyň her tapgyrynda faglar (oklaryň içinde haýwan identifikatorlary) damardan sanjyldy. Saýlamanyň 4-nji tapgyryna çenli iki garaşsyz alternatiw şaha (A, B) aýratyn saklanýar. Saýlamanyň 3-nji we 4-nji tapgyrlary üçin MSS-den çykarylan her bir fag klony el bilen yzygiderliklendi. (d) T7 peptid kitaphanasynyň (2 x 1012 fag/haýwan) damardan sanjylandan soň iki kanulaly syçanda saýlamanyň birinji tapgyrynda gandan (gyzyl tegelekler) we beýni-omurga suwuklygyndan (ýaşyl üçburçluklar) bölünip alnan fagyň kinetikasy. Gök kwadratlar gandaky fagyň ortaça başlangyç konsentrasiýasyny görkezýär, ol sanjym edilen fagyň mukdaryndan hasaplanýar we umumy gan möçberini göz öňünde tutýar. Gara kwadratlar gandaky fagyň konsentrasiýalaryndan ekstrapolýasiýa edilen y çyzygynyň kesişme nokadyny görkezýär. (e,f) Peptidde tapylan ähli mümkin bolan üst-üste düşýän tripeptid motiwleriniň deňeşdirme ýygylygyny we paýlanyşyny görkeziň. 1000 okalyşda tapylan motiwleriň sany görkezilen. Esasy derejede (p < 0,001) baýlaşdyrylan motiwler gyzyl nokatlar bilen bellenen. (e) Sanjym edilen kitaphananyň tripeptid motiwiniň deňeşdirme ýygylygyny #1.1 we #1.2 haýwanlardan gandan alynýan fag bilen deňeşdirýän korrelýasiýa saçylma çyzgysy. (f) Gan we beýni-oňurga suwuklygynda bölünip alnan #1.1 we #1.2 haýwan fagynyň tripeptid motiwleriniň deňeşdirme ýygylygyny deňeşdirýän korrelýasiýa saçylma çyzgysy. (g, h) Iki haýwanda hem in vivo saýlama tapgyryndan soň gan bilen baýlaşdyrylan fagyň (g) inýeksiýa edilen kitaphanalara we CSF bilen baýlaşdyrylan fagyň (h) gana garşy yzygiderlik ID görkezilişi. Bir harply kodyň ululygy şol aminokislotanyň şol ýerde näçe gezek duş gelýändigini görkezýär. Ýaşyl = polýar, gyrmyzy = neýtral, gök = esasy, gyzyl = kislotaly we gara = gidrofob aminokislotalar. 1a, b suratlary Eduard Uriç tarapyndan dizaýn edildi we öndürildi.
Biz iki sany CM gural syçanlaryna (A we B kladalary) fag peptid kitaphanasyny sanjym etdik we fagy beýni-omurga suwuklygyndan we gandan bölüp aldyk (1d surat). Kitaphananyň başlangyç çalt arassalanmagy ýabany görnüşli faga garanda has az duýuldy. Sanjym edilen kitaphananyň iki haýwanda hem ortaça ýarym ömri gandaky ýabany görnüşli faga meňzeş 24,8 minut, beýni-omurga suwuklygynda bolsa 38,5 minut boldy. Her haýwandan alnan gan we beýni-omurga suwuklygyndaky fag nusgalary HTS-e sezewar edildi we anyklanan ähli peptidler gysga tripeptid motiwiniň bardygy üçin seljerildi. Tripeptid motiwleri saýlanyldy, sebäbi olar gurluşyň emele gelmegi we peptid-belok özara täsirleri üçin minimal esas döredýär14,15. Sanjym edilen fag kitaphanasy bilen iki haýwanyň ganyndan çykarylan klonlaryň arasyndaky motiwleriň paýlanyşynda gowy arabaglanyşyk tapdyk (1e surat). Maglumatlar kitaphananyň düzüminiň gan bölüminde diňe az baýlaşdyrylandygyny görkezýär. Aminokislota ýygylyklary we konsensus yzygiderlikleri her bir pozisiýada Weblogo16 programma üpjünçiliginiň uýgunlaşdyrylmagy arkaly has giňişleýin seljerildi. Gyzykly tarapy, biz gan glisin galyndylarynda güýçli baýlaşmany tapdyk (1g surat). Gan CSF-den saýlanan klonlar bilen deňeşdirilende, güýçli saýlama we motifleriň käbir saýlamasynyň aýrylmagy syn edildi (1f surat) we käbir aminokislotalar 12 agzaly ýerde öňünden kesgitlenen ýerlerde artykmaçlyk bilen bardy (1h surat). Aýratyn hem, aýry-aýry haýwanlar omurga-beýni suwuklygynda düýpli tapawutlanýardy, şol bir wagtyň özünde iki haýwanda hem gan glisiniň baýlaşmasy syn edildi (Goşmaça surat 4a–j). 1.1 we 1.2 haýwanlaryň omurga-beýni suwuklygyndaky yzygiderlik maglumatlaryny berk süzgüçden geçirenden soň, jemi 964 we 420 sany özboluşly 12-mer peptidleri alyndy (Goşmaça surat 1d–e). Aýrylan fag klonlary güýçlendirildi we in vivo saýlamanyň ikinji tapgyryna sezewar edildi. Ikinji tapgyrdan saýlanan faglar her bir haýwanda HTS-e sezewar edildi we anyklanan ähli peptidler tripeptid motifleriniň ýüze çykmagyny seljermek üçin motif tanamak maksatnamasyna giriş hökmünde ulanyldy (2a, b, ef surat). CSF-den alnan fagyň birinji sikli bilen deňeşdirilende, A we B şahalarynda CSF-de köp motifleriň mundan beýläk saýlanandygyny we saýlanmadygyny synladyk (2-nji surat). Olaryň yzygiderli yzygiderliligiň dürli nusgalaryny görkezýändigini ýa-da görkezmeýändigini kesgitlemek üçin tor identifikasiýa algoritmi ulanyldy. Alternatiw A kladynda (2c, d surat) we B kladynda (2g, h surat) CSF tarapyndan dikeldilen 12 ölçegli tapgyrlaryň arasynda aýdyň meňzeşlik syn edildi. Her şahadaky umumy analiz 12-mer peptidleri üçin dürli saýlama profillerini (Goşmaça surat 5c, d) we birinji tapgyr bilen deňeşdirilende ikinji tapgyrdan soň umumylaşdyrylan klonlar üçin wagtyň geçmegi bilen CSF/gan titer gatnaşygynyň ýokarlanandygyny görkezdi (Goşmaça surat 5e).
In vivo funksional fag displeýiniň iki yzygiderli tapgyry arkaly beýni-omurga suwuklygyndaky motifleriň we peptidleriň baýlaşdyrylmagy.
Her bir haýwanyň (1.1 we 1.2 haýwanlar) birinji tapgyryndan alnan ähli beýni-oňurga suwuklygynyň faglary birleşdirildi, güýçlendirildi, HT-yzyna goýuldy we bilelikde gaýtadan inýeksiýa edildi (2 x 1010 fag/haýwan) 2 SM kanüllenen syçan (1.1 → #). 2.1 we 2.2, 1.2 → 2.3 we 2.4). (a,b,e,f) Birinji we ikinji saýlama tapgyrlarynda ähli CSF-den alynýan faglaryň tripeptid motiwleriniň deňeşdirilýän ýygylygyny deňeşdirýän korrelasiýa saçylma diagrammalary. Iki ugurda hem peptidlerde tapylan ähli mümkin bolan üst-üste düşýän tripeptidleri görkezýän motiwleriň deňeşdirilýän ýygylygy we paýlanyşy. 1000 okalyşda tapylan motiwleriň sany görkezilýär. Deňeşdirilen kitaphanalaryň birinde ep-esli saýlanan ýa-da çykarylan motiwler gyzyl nokatlar bilen bellendi. (c, d, g, h) In vivo saýlamanyň 2-nji we 1-nji tapgyrlaryna esaslanýan ähli CSF-e baý 12 aminokislota uzyn yzygiderlikleriniň yzygiderlik logotipiniň görkezilişi. Bir harply kodyň ululygy şol aminokislotanyň şol ýerde näçe gezek duş gelýändigini görkezýär. Logotipi görkezmek üçin, iki saýlama tapgyrynyň arasynda aýry-aýry haýwanlardan alynýan CSF yzygiderlikleriniň ýygylygy deňeşdirilýär we ikinji tapgyrdaky baýlaşdyrylan yzygiderlikler görkezilýär: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 we (h) #1.2–#2.4. (c, d) 2.1 we 2.2 belgili haýwanlarda ýa-da (g, h) 2.3 we 2.4 belgili haýwanlarda berlen ýerde iň baýlaşdyrylan aminokislotalar reňkde görkezilýär. Ýaşyl = polýar, gyrmyzy = neýtral, gök = esas, gyzyl = kislotaly we gara = gidrofob aminokislotalar.
Üçünji tapgyrdan soň, iki haýwandan bölünip alnan 332 sany CSF-de dikeldilen fag klonlaryndan 124 sany özboluşly peptid yzygiderliligini (#3.1 we #3.2) anykladyk (Goşmaça surat 6a). LGSVS yzygiderliligi (18.7%) iň ýokary deňeşdirme paýyna eýe boldy, ondan soň ýabany görnüşli PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) we SARGSWREIVSLS (2.2%) geldi. Soňky dördünji tapgyrda üç aýry haýwandan garaşsyz saýlanan iki şahany birleşdirdik (1c surat). CSF-den dikeldilen 925 yzygiderli fag klonundan dördünji tapgyrda 64 sany özboluşly peptid yzygiderliligini tapdyk (Goşmaça surat 6b), olaryň arasynda ýabany görnüşli fagyň deňeşdirme paýy 0.8% -e düşdi. Dördünji tapgyrda iň köp duş gelýän CSF klonlary LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) we RLSSVDSDLSGC (3, 2%) boldy. %)). Saýlanan peptidleriň uzynlyk diapazony NNK kitaphana dizaýny üçin degenerat kodonlar ulanylanda kitaphana praýmerlerinde nukleotidleriň goşulmagy/öçürilmegi ýa-da wagtyndan öň stop kodonlary sebäpli bolýar. Wagtyndan öň stop kodonlar has gysga peptidleri döredýär we amatly aa motiwini öz içine alýandygy üçin saýlanýar. Sintetiki kitaphanalaryň praýmerlerinde goşulmagy/öçürilmegi netijesinde has uzyn peptidler ýüze çykyp biler. Bu dizaýn edilen stop kodonyny çarçuwanyň daşynda ýerleşdirýär we aşakda täze stop kodon peýda bolýança okaýar. Umuman, giriş maglumatlaryny nusga çykyş maglumatlary bilen deňeşdirip, dört saýlama tapgyrynyň hemmesi üçin baýlaşdyrma faktorlaryny hasapladyk. Skriningiň birinji tapgyry üçin biz belli bolmadyk fon görkezijisi hökmünde ýabany görnüşli fag titrlerini ulandyk. Gyzykly tarapy, birinji CSF siklinde negatiw fag saýlamasy örän güýçli boldy, ýöne ganda däldi (3a-njy surat), bu peptid kitaphanasynyň köp agzalarynyň CSF bölümine passiw diffuziýasynyň pes ähtimallygy bilen baglanyşykly bolup biler ýa-da deňeşdirilen faglar bakteriofaglara garanyňda gan akymyndan has netijeli saklanýar ýa-da aýrylýar. Şeýle-de bolsa, panningiň ikinji tapgyrynda iki kladada hem CSF-de faglaryň güýçli saýlamasy syn edildi, bu bolsa öňki tapgyryň CSF-iň siňdirilişini höweslendirýän peptidleri görkezýän faglar bilen baýlaşdyrylandygyny görkezýär (3a-njy surat). Gaýtadan, ganyň düýpli baýlaşdyrylmagy bolmazdan. Üçünji we dördünji tapgyrlarda hem fag klonlary CSF-de ep-esli baýlaşdyryldy. Saýlamanyň soňky iki tapgyrynyň arasyndaky her bir özboluşly peptid yzygiderliliginiň deňeşdirilen ýygylygyny deňeşdirip, tapgyrlaryň saýlamanyň dördünji tapgyrynda has-da baýlaşdyrylandygyny anykladyk (3b-nji surat). Peptid ugurlary boýunça iki usul ulanylyp, 64 sany özboluşly peptid yzygiderliginden jemi 931 sany tripeptid motiwi çykaryldy. Dördünji tapgyrda iň baýlaşdyrylan motiwler, inýeksiýa edilen kitaphana bilen deňeşdirilende, ähli tapgyrlar boýunça baýlaşdyrma profilleri üçin has ýakyndan öwrenildi (kesiş nokady: 10% baýlaşdyrma) (Goşmaça surat 6c). Seçmegiň umumy nusgalary öwrenilen motiwleriň köpüsiniň iki seçme şahasynyň öňki tapgyrlarynyň hemmesinde baýlaşdyrylandygyny görkezdi. Şeýle-de bolsa, käbir motiwler (meselem, SGL, VSG, LGS GSV) esasan alternatiw A kladasyndan, beýlekileri bolsa (meselem, FGW, RTN, WGF, NTR) alternatiw B kladasynda baýlaşdyryldy.
Streptawidin ýüklerine konýugasiýa edilen CSF bilen baýlaşdyrylan fag görkezilen peptidleriň we biotinleşdirilen lider peptidleriň CSF daşamagynyň tassyklanmasy.
(a) Dört tapgyryň hemmesinde (R1-R4) inýeksiýa edilen (giriş = I) fag (PFU) titrlerine we kesgitlenen CSF fag titrlerine (çykyş = O) esaslanyp hasaplanan baýlaşdyrma gatnaşyklary. Soňky üç tapgyr üçin baýlaşdyrma faktorlary (R2-R4) agram maglumatlary bilen öňki tapgyr we birinji tapgyr (R1) bilen deňeşdirmek arkaly hasaplandy. Açyk sütunlar beýni-omurga suwuklygy, kölegeli sütunlar plazma. (***p<0.001, Studentiň t-testine esaslanýar). (b) Saýlamanyň 4-nji tapgyryndan soň CSF-de ýygnalan ähli faglara bolan deňeşdirme paýyna görä reýtinglenen iň köp duş gelýän fag peptidleriniň sanawy. Saýlamanyň 3-nji we 4-nji tapgyrlarynyň arasyndaky iň köp duş gelýän alty fag klony reňkde, belgilerde we baýlaşdyrma faktorlarynda görkezilýär (goşmalar). (c, d) 4-nji tapgyrdan iň köp baýlaşdyrylan alty fag klony, boş fag we ene-ata fag peptid kitaphanalary CSF nusga alyş modelinde aýratynlykda seljerildi. Beýni suwuklygy we gan nusgalary görkezilen wagt nokatlarynda ýygnaldy. (c) 6 sany dalaşgär fag klonynyň (2 x 1010 fag/haýwan), boş faglaryň (#1779) (2 x 1010 fag/haýwan) we zawod fag peptid kitaphanalarynyň (2 x 1012 fag/haýwan) deň mukdary. Guýruk damary arkaly kanüllenen haýwana azyndan 3 CM inýeksiýa edilýär. Her bir inýeksiýa edilen fag klonynyň we fag peptid kitaphanasynyň wagtyň geçmegi bilen Beýni suwuklygy farmakokinetikasy görkezilýär. (d) nusga alnan ähli faglar/ml üçin ortaça Beýni suwuklygy/gan gatnaşygyny görkezýär. (e) Dört sintetiki lider peptid we bir garyşdyrylan gözegçilik biotin bilen streptawidiniň N-termini (tetramer görkezilişi) arkaly baglanyşyklydy, soňra bolsa inýeksiýa edildi (guýruk damaryna damardan, 10 mg streptawidin/kg). Iň azyndan üç intubasiýa edilen syçan (N = 3). Beýni suwunyň nusgalary görkezilen wagt nokatlarynda ýygnaldy we streptawidin konsentrasiýalary Beýni suwunyň anti-streptawidin ELISA usuly bilen ölçeldi (nd = anyklanmady). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA synagyna esaslanýar). (f) Iň baýlaşdyrylan 2002-nji fag peptid klonunyň (benewşe) aminokislota yzygiderliliginiň 4-nji tapgyrdaky saýlanan beýleki fag peptid klonlary bilen deňeşdirilmegi. Birmeňzeş we meňzeş aminokislota bölekleri reňk bilen kodlanýar.
Dördünji tapgyrdaky baýlaşdyrylan faglaryň hemmesinden (3b-nji surat), CSF nusga alyş modelinde goşmaça aýratyn seljerme üçin alty kandidat klon saýlanyldy. Üç sany kanülleşdirilen CM haýwanyna alty kandidat fag, boş fag (goşulmadyk) we profag peptid kitaphanalarynyň deň mukdary sançyldy we farmakokinetika CSF (3c-nji surat) we gan (Goşmaça surat 7) synaglarynda kesgitlenildi. Synag edilen ähli fag klonlary CSF bölümini boş gözegçilik fagynyň (#1779) derejesinden 10-1000 esse ýokary derejede nyşana aldy. Mysal üçin, #2020 we #2077 klonlary gözegçilik fagynyňkydan takmynan 1000 esse ýokary CSF titrlerine eýe boldy. Saýlanan her peptidiň farmakokinetiki profili dürli-dürli, ýöne olaryň hemmesiniň CSF-ni ýokary derejede özleşdirmek ukyby bar. Biz #1903 we #2011 klonlary üçin wagtyň geçmegi bilen yzygiderli azalma synladyk, #2077, #2002 we #2009 klonlary üçin bolsa ilkinji 10 minutda artmak işjeň daşamagy görkezip biler, ýöne ony barlamak gerek. #2020, #2002 we #2077 klonlary ýokary derejede durnuklaşdy, #2009 klonynyň CSF konsentrasiýasy bolsa başlangyç artyşdan soň haýal-haýal azaldy. Soňra biz her bir CSF dalaşgäriniň deňeşdirme ýygylygyny onuň gan konsentrasiýasy bilen deňeşdirdik (3d surat). Her bir CSF dalaşgäriniň ortaça titriniň ähli nusga alyş wagtlarynda onuň gan titri bilen özara baglanyşygy alty dalaşgäriň üçüsiniň gan CSF-ine ep-esli baýdygyny görkezdi. Gyzykly tarapy, #2077 klony has ýokary gan durnuklylygyny görkezdi (Goşmaça surat 7). Peptidleriň özleriniň CSF bölümine fag bölejiklerinden başga ýükleri işjeň daşamaga ukyplydygyny tassyklamak üçin, peptidleriň fag bölejiklerine birikýän N-terminalynda biotin bilen türedilen dört lider peptidini sintezledik. Biotinleşdirilen peptidler (2002, 2009, 2020 we 2077 belgili) fag geometriýasyna meňzeş multimerik görnüşleri almak üçin streptawidin (SA) bilen birleşdirildi. Bu format bize ganyň we beýni-oňurga suwuklygyndaky SA täsirini ýük daşaýan belok peptidleri hökmünde ölçemäge mümkinçilik berdi. Iň esasysy, sintetiki peptidler bu SA bilen birleşdirilen formatda berlende fag maglumatlaryny köplenç gaýtalap bolýardy (3e surat). Garyşdyrylan peptidleriň başlangyç täsiri az we 48 sagadyň içinde anyklanyp bilinmeýän derejeleri bilen CSF-den has çalt arassalanýardy. Bu peptid fag klonlarynyň CSF giňişligine eltme ýollaryny öwrenmek üçin, in vivo damardan inýeksiýa edilenden 1 sagat soň fag bölejiklerini gönüden-göni anyklamak üçin immunogistohimiýa (IHC) ulanyp, aýratyn fag peptidleriniň täsirleriniň ýerleşişini seljerdik. Belli bir zat, #2002, #2077 we #2009 klonlary beýni kapilýarlarynda güýçli reňklemek arkaly anyklanyp bilnerdi, gözegçilik fagy (#1779) we #2020 klony bolsa anyklanmady (Goşmaça surat 8). Bu bolsa, bu peptidleriň BBB-den geçmek arkaly beýnä täsir edýändigini görkezýär. Bu gipotezany barlamak üçin has jikme-jik seljerme gerek, sebäbi BSCFB ýoly hem gatnaşyp biler. Iň baýlaşdyrylan klonyň (#2002) aminokislota yzygiderligini beýleki saýlanan peptidler bilen deňeşdirende, olaryň käbiriniň meňzeş aminokislota giňelmeleriniň bardygy bellenildi, bu bolsa meňzeş daşama mehanizmini görkezip biler (3f-nji surat).
Plazmadaky özboluşly profili we wagtyň geçmegi bilen CSF-iň ep-esli artmagy sebäpli, #2077 fag displeý klony has uzak 48 sagatlyk döwürde has giňişleýin öwrenildi we SA derejeleriniň dowamlylygy bilen baglanyşykly CSF-iň çalt artmagyny gaýtalap bildi (4a-njy surat). Başga anyklanan fag klonlaryna gelende, #2077 beýni kapilýarlary üçin güýçli boýaldy we ýokary çözgütde seredilende kapilýar marker lektin bilen ep-esli kolokalizasiýany we parenhimal boşlukda käbir boýalmagy görkezdi (4b-nji surat). Peptid arkaly farmakologik täsirleriň MNS-de alnyp bilinjekdigini ýa-da alynmaýandygyny öwrenmek üçin, biz i) #2077 tranzit peptidiniň we ii) BACE1 ingibitor peptidiniň biotinleşdirilen görnüşleriniň SA bilen iki dürli gatnaşykda garyşdyrylan synag geçirdik. Bir kombinasiýa üçin biz diňe BACE1 peptid ingibitoryny ulandyk, beýlekisi üçin bolsa BACE1 peptid ingibitorynyň #2077 peptide 1:3 gatnaşygyny ulandyk. Iki nusga hem damardan berildi we wagtyň geçmegi bilen gan we beta-amiloid peptid 40-yň (Abeta40) gan we beýni-oňurga suwuklygyndaky derejesi ölçeldi. Abeta40 beýni parenhimasyndaky BACE1-iň basylyp saklanmagyny görkezýänligi üçin CSF-de ölçeldi. Garaşylyşy ýaly, iki toplum hem Abeta40-yň gan derejesini ep-esli peseltdi (4c, d surat). Şeýle-de bolsa, diňe 2077-nji peptid we SA bilen birleşdirilen BACE1 peptidiniň ingibitorynyň garyndysyny öz içine alýan nusgalar beýni-oňurga suwuklygynda Abeta40-yň ep-esli peselmegine sebäp boldy (4c surat). Maglumatlar 2077-nji peptidiň 60 kDa SA belogyny MNS-e daşamaga ukyplydygyny we şeýle hem BACE1 peptidiniň SA bilen birleşdirilen ingibitorlary bilen farmakologik täsirleri döredýändigini görkezýär.
(a) T7 fagynyň klonal inýeksiýasy (2 × 10 fag/haýwan), azyndan üç CM-intubasiýa edilen syçanda CSF peptid #2077 (RLSSVDSDLSGC) we inýeksiýa edilmedik gözegçilik fagynyň (#1779) uzak möhletli farmakokinetik profillerini görkezýär. (b) Fag inýeksiýa edilen syçanlarda (2 × 10 10 fag/haýwan) wekilçilikli kortikal mikrodamarlaryň konfokal mikroskopiki suraty, #2077 peptidiniň we damarlarynyň (lektin) garşy boýalmagyny görkezýär. Bu fag klonlary 3 syçana berildi we perfuziondan öň 1 sagatlap aýlanmagyna rugsat berildi. Beýniler kesildi we T7 fag kapsidine garşy poliklonal FITC belgili antitela bilen boýaldy. Perfuziondan we soňraky fiksasiýadan on minut öň, DyLight594 belgili lektin damardan berildi. Kapillýarlaryň we perivaskulýar beýni dokumasynyň boşlugynda mikrodamarlaryň we faglaryň (ýaşyl) lüminal tarapynyň lektin boýagyny (gyzyl) görkezýän flýuoressent suratlar. Şkala çyzygy 10 µm-e deňdir. (c, d) Biotinleşdirilen BACE1 inhibitory peptidi ýeke özi ýa-da biotinleşdirilen tranzit peptidi #2077 bilen bilelikde streptawidin bilen birikdirildi, soňra azyndan üç sany kanüllenen CM syçanlaryna (10 mg streptawidin/kg) damardan inýeksiýa edildi. BACE1 peptidi inhibitory arkaly Aβ40-yň azalmagy görkezilen wagt nokatlarynda gandaky (gyzyl) we beýni-oňurga suwuklygynda (mämişi) Aβ1-40 ELISA arkaly ölçeldi. Has aýdyňlyk üçin, grafikde 100% ölçegde nokatly çyzyk çekilýär. (c) 3:1 gatnaşykda tranzit peptid #2077 we BACE1 inhibitory peptid bilen konýugirlenen streptawidin bilen bejerilen syçanlarda gandaky (gyzyl üçburçluklar) we beýni-omurga suwuklygynda (mämişi üçburçluklar) Aβ40 göteriminiň azalmagy. (d) Diňe BACE1 inhibitory peptid bilen baglanyşykly streptawidin bilen bejerilen syçanlarda gandaky Aβ40 (gyzyl tegelekler) we beýni-omurga suwuklygynda (mämişi tegelekler) göteriminiň azalmagy. Gözegçilik toparynda Aβ konsentrasiýasy 420 pg/ml boldy (standart çykgynsyzlyk = 101 pg/ml).
Fag görkezilişi biolukmançylyk barlaglarynyň birnäçe ugurlarynda üstünlikli ulanyldy17. Bu usul in vivo damar dürlüligi barlaglary18,19, şeýle hem beýni damarlaryna gönükdirilen barlaglar20,21,22,23,24,25,26 üçin ulanyldy. Bu barlagda biz bu saýlama usulynyň ulanylyşyny diňe beýni damarlaryna gönükdirilen peptidleri gönüden-göni anyklamak üçin däl, eýsem gan-beýni böwetinden geçmek üçin işjeň daşaýjy häsiýetleri bolan kandidatlary açmak üçin hem giňeltdik. Indi biz CM intubasiýa edilen syçanlarda in vivo saýlama prosedurasynyň işlenip düzülmegini beýan edýäris we onuň CSF-iň öý aýratynlyklary bolan peptidleri anyklamak mümkinçiligini görkezýäris. 12-mer tötänleýin peptidleriň kitaphanasyny görkezýän T7 fagyny ulanyp, biz T7 fagynyň gan-beýni böwetine uýgunlaşmak üçin ýeterlik derejede kiçidigini (diametri takmynan 60 nm)10, şeýlelik bilen gan-beýni böwetinden ýa-da horoid pleksusyndan gönüden-göni geçýändigini görkezip bildik. Biz kanülleşdirilen CM syçanlaryndan CSF ýygnamagyň in vivo funksional barlag usulynyň gowy gözegçilik edilýändigini we çykarylan fagyň diňe damar ulgamyna baglanmak bilen çäklenmän, eýsem gan-beýni böwetinden daşaýjy hökmünde hem işländigini gördük. Mundan başga-da, gan ýygnamak we CSF-e we gandan alynýan faglara HTS ulanmak bilen, CSF-i saýlamagymyzyň ganyň baýlaşdyrylmagyna ýa-da saýlama tapgyrlarynyň arasynda giňelmäge ýaramlylygyna täsir etmeýändigini tassykladyk. Şeýle-de bolsa, gan bölümi saýlama prosedurasynyň bir bölegidir, sebäbi CSF bölümine ýetip bilýän faglar beýnide baýlaşmak üçin gan aýlanyşygynda ýeterlik wagtlap ýaşamaly we aýlanmalydyr. Çig HTS maglumatlaryndan ygtybarly yzygiderlilik maglumatlaryny almak üçin, analiz iş akymynda platforma üçin ýörite yzygiderlilik ýalňyşlyklaryna uýgunlaşdyrylan süzgüçleri ornaşdyrdyk. Skrining usulyna kinetiki parametrleri goşmak bilen, biz ýabany görnüşli T7 faglarynyň gandaky çalt farmakokinetikasyny (t½ ~ 28 min) tassykladyk24, 27, 28, şeýle hem olaryň beýni-omurga suwuklygyndaky ýarym ömrüni (t½ ~ 26 min) minutda kesgitledik). Gandaky we beýni suwuklygyndaky meňzeş farmakokinetik profillere garamazdan, fagyň gan konsentrasiýasynyň diňe 0,001% -i beýni suwuklygynda ýüze çykarylyp bilner, bu bolsa ýabany görnüşli T7 fagyň gan-beýni böwetinden pes fon hereketliligini görkezýär. Bu iş, esasanam, gan aýlanyşyndan çalt arassalanan fag ulgamlary üçin in vivo panning strategiýalaryny ulananda birinji tapgyr saýlamagyň möhümdigini görkezýär, sebäbi az sanly klonlar MSS bölümine ýetip bilýär. Şeýlelik bilen, birinji tapgyrda kitaphana dürlüliginiň azalmagy örän uly boldy, sebäbi bu örän berk BSS modelinde diňe çäkli sanly klonlar ýygnaldy. Bu in vivo panning strategiýasy BSS bölüminde işjeň toplanmak, gan bölüminde klonyň ýaşamagy we ilkinji 10 minutda gandan T7 fag klonlarynyň çalt aýrylmagy ýaly birnäçe saýlama ädimlerini öz içine aldy (1d surat we Goşmaça surat 4M). Şeýlelik bilen, birinji tapgyrdan soň, BSS-de dürli fag klonlary anyklandy, ýöne aýry-aýry haýwanlar üçin şol bir başlangyç howdan ulanyldy. Bu, kitaphana agzalarynyň sany köp bolan çeşme kitaphanalary üçin köp sanly berk saýlama ädimleriniň dürlüligiň ep-esli azalmagyna getirýändigini görkezýär. Şonuň üçin tötänleýin wakalar başlangyç saýlama prosesiniň aýrylmaz bölegine öwrüler we netijä uly täsir eder. Asyl kitaphanadaky klonlaryň köpüsiniň CSF baýlaşdyrmaga meýli örän meňzeş bolmagy mümkin. Şeýle-de bolsa, şol bir synag şertlerinde hem, başlangyç howuzdaky her bir aýratyn klonyň sanynyň az bolmagy sebäpli saýlama netijeleri tapawutlanyp biler.
MYS-de baýlaşdyrylan motifler gandaky motiflerden tapawutlanýar. Gyzykly tarapy, biz aýry-aýry haýwanlaryň ganynda glisine baý peptidlere tarap ilkinji geçişi belledik. (1g surat, Goşmaça suratlar 4e, 4f). Glisine baý fag has durnukly bolup biler we gan aýlanyşyndan çykarylmagy ähtimallygy az bolup biler. Şeýle-de bolsa, bu glisine baý peptidler mys-oňurga suwuklygynyň nusgalarynda ýüze çykarylmady, bu bolsa saýlanan kitaphanalaryň iki dürli saýlama tapgyryndan geçendigini görkezýär: biri ganda, beýlekisi bolsa mys-oňurga suwuklygynda toplanmaga rugsat berildi. Saýlamanyň dördünji tapgyry netijesinde dörän MYS bilen baýlaşdyrylan klonlar giňişleýin synagdan geçirildi. Aýratyn synagdan geçirilen klonlaryň tas ählisiniň boş gözegçilik fagy bilen deňeşdirilende MYS-de baýlaşdyrylandygy tassyklanyldy. Bir peptid urgy (#2077) has jikme-jik öwrenildi. Beýleki täsirlere garanyňda, ol plazmanyň ýarym ömri has uzak boldy (3d surat we 7-nji goşmaça surat) we gyzykly tarapy, bu peptidde C-terminusda sistein galyndysy bardy. Ýakynda peptidlere sisteiniň goşulmagynyň albumin 29 bilen baglanyşmak arkaly olaryň farmakokinetik häsiýetlerini gowulandyryp biljekdigi görkezildi. Bu häzirki wagtda #2077 peptid üçin belli däl we goşmaça öwrenmegi talap edýär. Käbir peptidler CSF-iň baýlaşdyrylmagynda walentlige baglylygy görkezdi (maglumatlar görkezilmedi), bu bolsa T7 kapsidiniň görkezilen ýüz geometriýasy bilen baglanyşykly bolup biler. Ulanylan T7 ulgamy her bir fag bölejiginde her peptidden 5-15 nusga görkezdi. IHC syçanlaryň beýni korteksine damardan sanjylan dalaşgär gurşun fag klonlarynda geçirildi (8-nji goşmaça surat). Maglumatlar azyndan üç klonuň (№ 2002, № 2009 we № 2077) BBB bilen özara täsirleşýändigini görkezdi. Bu BBB özara täsiriniň CSF-iň toplanmagyna ýa-da bu klonlaryň gönüden-göni BCSFB-e hereket etmegine getirýändigini anyklamak gerek. Iň esasysy, saýlanan peptidleriň sintezlenende we belok ýüküne baglananda CSF daşamak ukybyny saklaýandygyny görkezýäris. N-terminal biotinlenen peptidleriň SA-a baglanmagy, esasan, gandaky we beýni-oňurga suwuklygyndaky degişli fag klonlary bilen alnan netijeleri gaýtalaýar (3e surat). Ahyrsoňy, biz #2077 gurşun peptidiniň SA-a konýugirlenen BACE1 biotinlenen peptid ingibitorynyň beýni täsirini güýçlendirip bilýändigini we CSF-de Abeta40 derejesini ep-esli azaltmak arkaly MSS-de aýdyň farmakodinamik täsirleri döredip bilýändigini görkezýäris (4-nji surat). Ähli täsirleriň peptid yzygiderliliginiň gomologiýasyny gözlemek arkaly maglumatlar bazasyndaky hiç bir gomology anyklap bilmedik. T7 kitaphanasynyň ululygynyň takmynan 109 bolandygyny, 12-mers üçin nazary kitaphananyň ululygynyň bolsa 4 x 1015 bolandygyny bellemek möhümdir. Şonuň üçin biz 12-mers peptid kitaphanasynyň dürlülik giňişliginiň diňe kiçi bir bölegini saýladyk, bu bolsa bu anyklanan zarbalaryň goňşy yzygiderlilik giňişligini bahalandyrmak arkaly has optimizirlenen peptidleri anyklap boljakdygyny aňladyp biler. Gipotetiki taýdan, bu peptidleriň tebigy gomologlaryny tapmandygymyzyň sebäpleriniň biri, belli bir peptid motiwleriniň beýnä gözegçiliksiz girmeginiň öňüni almak üçin ewolýusiýa döwründe saýlamanyň aýrylmagy bolup biler.
Umumylykda, netijelerimiz in vivo serebrovaskulýar böwetiň ulag ulgamlaryny has jikme-jik kesgitlemek we häsiýetlendirmek boýunça geljekki işler üçin esas döredýär. Bu usulyň esasy gurluşy diňe bir serebrovaskulýar böwetleriň baglanyş häsiýetlerine eýe bolan klonlary kesgitleýän däl, eýsem üstünlikli klonlaryň in vivo biologik böwetleri Merkezi nerw ulgamyna geçmek üçin içki işjeňlige eýe bolan möhüm ädimi hem öz içine alýan funksional saýlama strategiýasyna esaslanýar. Bu peptidleriň ulag mehanizmini we olaryň beýni sebitine mahsus mikrodamar ulgamyna baglanmak üçin artykmaçlyklaryny düşündirmekdir. Bu bolsa, BBB we reseptorlaryň ulagy üçin täze ýollaryň açylmagyna getirip biler. Biz anyklanan peptidleriň gönüden-göni beýni-damar reseptorlaryna ýa-da BBB ýa-da BCSFB arkaly daşalýan aýlanýan ligandlara baglanyp biljekdigine garaşýarys. Bu işde tapylan CSF ulag işjeňligi bolan peptid wektorlary has giňişleýin öwreniler. Häzirki wagtda biz bu peptidleriň BBB we/ýa-da BCSFB-den geçmek ukyby üçin beýni aýratynlyklaryny öwrenýäris. Bu täze peptidler täze reseptorlaryň ýa-da ýollaryň açylmagy we makromolekulalaryň, mysal üçin, biologiki serişdeleriň beýnä eltilmegi üçin täze ýokary netijeli platformalaryň işlenip düzülmegi üçin örän gymmatly gurallar bolar.
Öň beýan edilen usulyň modifikasiýasyny ulanyp, uly sisternany (US) kanulalaň. Anesteziýa edilen Wistar syçanlary (200-350 g) stereotaksik enjama oturdyldy we kelle süňküni açmak üçin gyrylan we aseptik taýdan taýýarlanan kelle süňküniň üstünde orta kesik edildi. Ýokarky guşak zolagynda iki deşik açyň we deşiklerdäki berkidiji wintleri berkidiň. Dat almaýan polat kanüliň US-e stereotaktik gönükdirilmegi üçin gapdal ense gyrasynda goşmaça deşik açyldy. Kanüliň daşyna diş sementini çalyň we wintler bilen berkidiň. Fotogalereýa we sement gatylaşandan soň, deri ýarasy 4/0 supramid tikiş bilen ýapyldy. Kanüliň dogry ýerleşdirilmegi beýni-omurga suwuklygynyň (BOS) öz-özünden syzmagy bilen tassyklanýar. Syçany stereotaksik enjamdan çykaryň, operasiýadan soňky degişli bejergi we agyryny bejerişden geçiriň we beýni-omurga suwuklygynda gan alamatlary görünýänçä, onuň azyndan bir hepde sagalmagyna rugsat beriň. Wistar syçanlary (Crl:WI/Han) Çarlz derýasyndan (Fransiýa) alyndy. Ähli syçanlaryň kesel döredijilerden azat bolan belli bir şertlerde saklandy. Haýwanlar bilen geçirilen ähli tejribeler Şweýsariýanyň Bazel şäheriniň Weterinariýa edarasy tarapyndan tassyklanyldy we 2474 belgili Haýwan ygtyýarnamasyna (syçanlaryň oňurga-melek suwuklygynda we beýnisinde bejeriş üçin dalaşgärleriň derejesini ölçemek arkaly beýnisiniň işjeň daşalmagynyň bahalandyrylmagy) laýyklykda geçirildi.
Elinizde CM kanýulasy bilen syçanyň huşuny ýuwaşlyk bilen saklaň. Daturany kanýuladan çykaryň we öz-özünden akýan 10 µl beýni-omurga suwuklygyny ýygnaň. Kanýulanyň açyklygy ahyrsoňy bozulanlygy sebäpli, bu barlaga diňe ganyň hapalanandygy ýa-da reňkiniň üýtgemegi alamatlary bolmadyk arassa beýni-omurga suwuklygynyň nusgalary goşuldy. Şeýle hem, guýrugyň ujundaky kiçijik kesikden geparin (Sigma-Aldrich) bilen turbalara takmynan 10–20 µl gan alyndy. T7 fagynyň damardan inýeksiýasyndan soň dürli wagt nokatlarynda beýni-omurga suwuklygy we gan ýygnaldy. Her bir beýni-omurga suwuklygynyň nusgasy ýygnalmazdan öň takmynan 5–10 µl suwuklyk taşlandy, bu bolsa kateteriň ölü göwrümine gabat gelýär.
Kitaphanalar T7Select ulgamynyň gollanmasynda beýan edilişi ýaly (Novagen, Rosenberg we beýlekiler, InNovations 6, 1-6, 1996) T7Select 10-3b wektoryny ulanyp döredildi. Gysgaça aýdylanda, tötänleýin 12-mer DNK goşulmasy aşakdaky formatda sintez edildi:
NNK kodony goşa stop kodonlarynyň we aminokislotalaryň artykmaç ekspresiýasynyň öňüni almak üçin ulanyldy. N her bir nukleotidiň el bilen garyşdyrylan ekwimolýar gatnaşygydyr, K bolsa adenin we sitozin nukleotidleriniň el bilen garyşdyrylan ekwimolýar gatnaşygydyr. Bir zynjyrly sebitler 37°C-de 3 sagatlap Klenow buferinde (New England Biolabs) dNTP (Novagen) we Klenow fermenti (New England Biolabs) bilen has köp inkubasiýa arkaly goşa zynjyrly DNK-a öwrüldi. Reaksiýadan soň, iki zynjyrly DNK EtOH çökündisi arkaly dikeldildi. Netijede dörän DNK EcoRI we HindIII restriction fermentleri (ikisi hem Roche-den) bilen siňdirildi. Bölünen we arassalanan (QIAquick, Qiagen) zynjyr (T4 ligaza, New England Biolabs) soňra 10B kapsid geniniň 348 aminokislotasyndan soň öňünden bölünen T7 wektoryna çarçuwada baglandy. Baglama reaksiýalary in vitro gaplamadan öň 16° C-de 18 sagatlap inkubasiýa edildi. In vitro fag gaplamasy T7Select 10-3b klonlaşdyrma toplumy (Novagen) bilen berlen görkezmelere laýyklykda ýerine ýetirildi we gaplama ergini Escherichia coli (BLT5615, Novagen) ulanyp lizis üçin bir gezek güýçlendirildi. Lizatlar gliseriniň esasy ergini hökmünde santrifuga edildi, titrlendi we -80° C-de doňduryldy.
454/Roche-amplicon füziýa praýmerlerini ulanyp, bulonda ýa-da tarelkada güýçlendirilen fag üýtgeýän sebitleriniň gönüden-göni PZR güýçlendirmesi. Öňe füziýa praýmeri üýtgeýän sebitiň gapdalyndaky yzygiderlikleri (NNK) 12 (şablona mahsus), GS FLX Titanium Adapter A we dört esasly kitaphana açar yzygiderligini (TCAG) öz içine alýar (Goşmaça 1a surat):
Ters garyşyk praýmeri şeýle hem tutujy munçuklara birikdirilen biotin we emulsiýa PZR wagtynda klonal güýçlendirme üçin zerur bolan GS FLX Titanium Adapter B-ni öz içine alýar:
Soňra amplikonlar 454 GS-FLX Titanium protokolyna laýyklykda 454/Roche pirosekwensiýasyna sezewar edildi. Sangeriň el bilen yzygiderliligi üçin (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNK Analizatory), T7 fag DNK-sy PCR arkaly güýçlendirildi we aşakdaky praýmer jübütleri bilen yzygiderlileşdirildi:
Aýry-aýry plakalardan goýlan zatlar Roche Fast Start DNA Polimeraza Kit ulanyp (önümlendirijiniň görkezmelerine laýyklykda) PCR güýçlendirilmegine sezewar edildi. Gyzgyn başlangyç (95 °C-da 10 minut) we 35 güýçlendirme sikllerini (95 °C-da 50 sekunt, 50 °C-da 1 minut we 72 °C-da 1 minut) ýerine ýetiriň.
Kitaphanalardan alnan faglar, ýabany görnüşli faglar, beýni suwundan we gandan halas edilen faglar ýa-da aýry-aýry klonlar Escherichia coli BL5615-de TB şorbasynda (Sigma Aldrich) ýa-da 500 sm2 gaplarda (Thermo Scientific) 37°C-de 4 sagatlap güýçlendirildi. Faglar plastinalardan Tris-EDTA buferi (Fluka Analytical) bilen ýuwulyp ýa-da steril pipetka uçlary bilen plitalar ýygnalyp alyndy. Faglar medeniýetiň üstki gatlagyndan ýa-da ekstraksiýa buferinden bir tapgyr polietilen glikol (PEG 8000) çökündisi (Promega) bilen bölünip alyndy we Tris-EDTA buferinde gaýtadan suspenziýa edildi.
Güýçlendirilen fag damardan (IV) inýeksiýadan (500 μl/haýwan) öň endotoksin aýyrmak üçin 2-3 tapgyr endotoksin aýyrmak tapgyryna (Miltenyi Biotec) sezewar edildi. Birinji tapgyrda 2×1012 fag; ikinji tapgyrda 2×1010 fag; üçünji we dördünji saýlama tapgyrlarynda her haýwan üçin 2×109 fag girizildi. Görkezilen wagt nokatlarynda ýygnalan beýni suwuklygyndaky we gan nusgalaryndaky fagyň mukdary öndürijiň görkezmelerine (T7Select ulgam gollanmasy) laýyklykda plitalary sanamak arkaly kesgitlenildi. Fag saýlamagy arassalanan kitaphanalary guýruk damaryna damardan inýeksiýa etmek ýa-da öňki saýlama tapgyryndan beýni suwuklygyndan çykarylan fagy gaýtadan inýeksiýa etmek arkaly amala aşyryldy we soňraky ýygnamalar degişlilikde beýni suwuklygyndaky we gan nusgalarynda 10 minut, 30 minut, 60 minut, 90 minut, 120 minut, 180 minut we 240 minutda beýni suwuklygyndaky we gan nusgalarynda geçirildi. Seçme tapgyrynda saýlanan iki şaha aýratyn saklandy we ilkinji üç tapgyrda seljerildi, jemi dört tapgyr in vivo panning geçirildi. Seçme tapgyrynda ilkinji iki tapgyrdan CSF-den çykarylan ähli fag goşulmalary 454/Roche pirosekwensiýasyna sezewar edildi, soňky iki tapgyrdan CSF-den çykarylan ähli klonlar bolsa el bilen yzygiderlileşdirildi. Seçme tapgyryndan alnan ähli gan faglary hem 454/Roche pirosekwensiýasyna sezewar edildi. Fag klonlaryny inýeksiýa etmek üçin saýlanan faglar 500 sm2 plastinkalarda E. coli (BL5615)-de 37°C-de 4 sagatlap güýçlendirildi. Aýratyn saýlanan we el bilen yzygiderlileşdirilen klonlar TB gurşawynda köpeldildi. Fag ekstraksiýasyndan, arassalanmagyndan we endotoksin aýrylmagyndan soň (ýokarda beýan edilişi ýaly), 300 μl-de 2×1010 fag/haýwan bir guýruk damaryna damardan sanjyldy.
Yzygiderlilik maglumatlarynyň öňünden işlenilmegi we hil taýdan süzgüçlenmegi. Çig 454/Roche maglumatlary satyjy programma üpjünçiligini ulanyp, ikilik standart akym kartasy formatyndan (sff) Pearson adam okaýan formatyna (fasta) öwrüldi. Nukleotid yzygiderliliginiň mundan beýläk işlenilmegi aşakda beýan edilişi ýaly hususy C programmalary we skriptleri (çykarylmadyk programma üpjünçiligi) ulanylyp amala aşyryldy. Esasy maglumatlaryň seljermesi berk köp tapgyrly süzgüçleme amallaryny öz içine alýar. Dogry 12mer goşulan DNK yzygiderliligini öz içine almaýan okamalary süzgüçden geçirmek üçin, okamalar global Needleman-Wunsch synagyny ulanyp başlangyç belligi (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), durma belligi (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) we fon goşulmasy (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) boýunça yzygiderli deňleşdirildi. deňleşdirme her deňleşdirmede 2 sany deňleşdirmege çenli mümkinçilik berýär31. Şonuň üçin başlangyç we durma tegleri bolmadyk okamalar we fon goşulmalaryny öz içine alýan okamalar, ýagny rugsat berlen deňleşdirmeleriň sanyndan geçýän deňleşdirmeler kitaphanadan aýryldy. Galan okalyşlara gelende bolsa, başlangyç belgiden başlap, stop belgisi asyl okalyş tertibinden aýrylyp, has-da işlenilmezden öň gutarýan N-mer DNK yzygiderliligi (mundan beýläk "goşmaça" diýlip atlandyrylýar). Goýma terjime edilenden soň, praýmeriň 5' ujundaky ilkinji stop kodonyndan soňky bölek goýmadan aýrylýar. Mundan başga-da, praýmeriň 3' ujundaky doly däl kodonlara getirýän nukleotidler hem aýryldy. Diňe fon yzygiderliklerini öz içine alýan goýmalary aýyrmak üçin, "PAG" aminokislota nusgasy bilen başlaýan terjime edilen goýmalar hem aýryldy. Kitaphanadan terjimeden soňky uzynlygy 3 aminokislotadan az bolan peptidler aýryldy. Ahyrsoňy, goýma howuzundaky artykmaçlygy aýyryň we her bir özboluşly goýmanyň ýygylygyny kesgitläň. Bu seljermäniň netijeleri nukleotid yzygiderlikleriniň (goşmaçalaryň) sanawyny we olaryň (okalýan) ýygylyklaryny öz içine aldy (Goşmaça 1c we 2-nji suratlar).
Toparyň N-mer DNK goşulmalary yzygiderlik meňzeşligi boýunça: 454/Roşuň aýratyn yzygiderlik ýalňyşlyklaryny (meselem, gomopolimer giňeltmelerini yzygiderliklemek bilen baglanyşykly meseleler) aradan aýyrmak we has az möhüm artykmaçlyklary aýyrmak üçin, öň süzülen N-mer DNK yzygiderlik goşulmalary (goşmalar) meňzeşlik boýunça tertiplenýär. goşulmalar (2-ä çenli gabat gelmeýän esaslara rugsat berilýär) aşakdaky ýaly kesgitlenen gaýtalanýan algoritm arkaly tertiplenýär: goşulmalar ilki ýygylygy boýunça (iň ýokarysyndan iň pesine), eger olar birmeňzeş bolsa, uzynlygy boýunça ikinji derejeli tertiplemek boýunça (iň uzynyndan iň gysgasyna) tertiplenýär. Şeýlelik bilen, iň ýygy we iň uzyn goşulmalar birinji "topary" kesgitleýär. Toparyň ýygylygy açar ýygylygyna kesgitlenýär. Soňra tertiplenen sanawda galan her bir goşulma jübütleýin Needleman-Wunsch deňleşdirmesi arkaly topara goşulmaga synanyşyldy. Eger deňleşdirmede gabat gelmeýänlikleriň, goşulmalaryň ýa-da pozmalaryň sany 2-den geçmese, topara goşulma goşulýar we toparyň umumy ýygylygy goşulmanyň näçe gezek goşulandygyna görä artdyrylýar. Topara goşulan goşulmalar ulanylan diýlip bellenilýär we mundan beýläk işlenilmeýär. Eger goýuş yzygiderligini eýýäm bar bolan topara goşup bolmasa, goýuş yzygiderligi degişli goýuş ýygylygy bilen täze topar döretmek üçin ulanylýar we ulanylan diýlip bellenilýär. Her goýuş yzygiderligi täze topar döretmek üçin ulanylanda ýa-da eýýäm bar bolan topara goşulyp bilinende, gaýtalama tamamlanýar. Netijede, nukleotidlerden ybarat bolan toparlanan goýuşlar ahyrsoňy peptid yzygiderliklerine (peptid kitaphanalaryna) öwrülýär. Bu analiziň netijesi yzygiderli okalýanlaryň sanyny düzýän goýuşlaryň we olaryň degişli ýygylyklarynyň toplumydyr (Goşmaça surat 2).
Motif Generasiýa: Unikal peptidleriň sanawyna esaslanyp, aşakda görkezilişi ýaly, ähli mümkin bolan aminokislota nusgalaryny (aa) öz içine alýan kitaphana döredildi. 3 uzynlykdaky her mümkin bolan nusga peptidden çykaryldy we onuň ters nusgasy ähli nusgalary (tripeptidler) öz içine alýan umumy motif kitaphanasy bilen birlikde goşuldy. Köp gaýtalanýan motifleriň kitaphanalary yzygiderli düzüldi we artykmaçlyk aýryldy. Soňra motif kitaphanasyndaky her bir tripeptid üçin hasaplama gurallaryny ulanyp kitaphanada bardygyny barladyk. Bu ýagdaýda, tapylan motif tripeptidini öz içine alýan peptidiň ýygylygy goşulýar we motif kitaphanasyndaky motife ("motifleriň sany") berilýär. Motifiň döremeginiň netijesi tripeptidleriň (motifleriň) ähli duş gelýänlerini we olaryň degişli gymmatlyklaryny öz içine alýan iki ölçegli massiwdir, olar okalýanlar süzgüçden geçirilende, toparlananda we terjime edilende degişli motife getirýän yzygiderli okalýanlaryň sanydyr. Ýokarda jikme-jik beýan edilen ölçegler.
Motifleriň we degişli saçraýyş diagrammalarynyň sanynyň normallaşdyrylmagy: Her bir nusga üçin motifleriň sany ulanylyp normallaşdyryldy
bu ýerde ni i temasyny öz içine alýan okalmalaryň sanydyr. Şeýlelik bilen, vi nusgada i motiwini öz içine alýan okalmalaryň (ýa-da peptidleriň) göterim ýygylygyny görkezýär. Normallaşdyrylmadyk motiwleriň sany üçin P-bahalary Fişeriň takyk synagyny ulanmak arkaly hasaplandy. Motiwleriň sanynyň korrelogramlaryna gelende, Spirmanyň korrelasiýasy R bilen normallaşdyrylan motiwleriň sanyny ulanmak arkaly hasaplandy.
Peptid kitaphanasyndaky her bir pozisiýadaky aminokislotalaryň mazmunyny wizuallaşdyrmak üçin web logogrammalar 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) döredildi. Ilki bilen, 12-mer peptidiniň her bir pozisiýasyndaky aminokislotalaryň mazmuny 20×12 matrisada saklanýar. Soňra her bir pozisiýada şol bir deňeşdirilen aminokislota mazmunyny öz içine alýan 1000 peptid toplumy fasta-yzygiderlik formatynda döredilýär we web-logo 3-e giriş hökmünde berilýär, bu bolsa berlen peptid kitaphanasy üçin her bir pozisiýadaky deňeşdirilen aminokislotalaryň mazmunynyň grafiki görkezilişini döredýär. Köp ölçegli maglumat toplumlaryny wizuallaşdyrmak üçin, R-de içerki işlenip düzülen gural (biosHeatmap, heniz çykarylmadyk R bukjasy) ulanylyp, ýylylyk kartalary döredildi. Ýylylyk kartalarynda görkezilen dendrogramlar Wardyň iýerarhiki klasterleşdirme usuly arkaly Ýewklid aralyk metrikasy bilen hasaplanyldy. Motiw bal beriş maglumatlarynyň statistik seljermesi üçin, normallaşdyrylmadyk bal beriş üçin P gymmatlyklary Fişeriň takyk synagy arkaly hasaplanyldy. Beýleki maglumatlar toplumy üçin P-bahalary R-de Studentiň t-testi ýa-da ANOVA ulanylyp hasaplandy.
Saýlanan fag klonlary we goýmasyz faglar guýruk damary arkaly damara sanjyldy (2×1010 fag/haýwan 300 μl PBS-de). Perfuziýasiýadan we soňraky fiksasiýadan on minut öň, şol bir haýwanlara damara 100 μl DyLight594 bilen belgilenen lektin sanjyldy (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Fag sanjylandan 60 minut soň, syçanlara ýürek arkaly 50 ml PBS, soňra 50 ml 4% PFA/PBS sanjyldy. Beýni nusgalary goşmaça 4% PFA/PBS-de gijesine sanjyldy we 4°C-de gijesine 30% saharozada çümdürildi. Nusgalar OCT garyndysynda çalt doňdurylýar. Doňdurylan nusgalaryň immunohistokimiki analizi otagyň temperaturasynda 1% BSA bilen blokirlenen we 4 °C-de T7 fagyna (Novus NB 600-376A) garşy poliklonal FITC belgili antitela bilen inkubasiýa edilen 30 µm krioseksiýlerde geçirildi. Gije inkubasiýa ediň. Ahyrsoňy, bölekler PBS bilen 3 gezek ýuwuldy we konfokal lazer mikroskopy (Leica TCS SP5) bilen barlandy.
Iň az 98% arassalykdaky ähli peptidler GenScript USA tarapyndan sintez edildi, biotinleşdirildi we liofilizlendi. Biotin N-terminalynda goşmaça üçlü glisin aralygy arkaly baglanýar. Mass-spektrometriýa arkaly ähli peptidleri barlaň.
Streptawidin (Sigma S0677) biotinleşdirilen peptid, biotinleşdirilen BACE1 ingibitor peptidi ýa-da biotinleşdirilen BACE1 ingibitor peptidi we BACE1 ingibitor peptidiniň 5-10% DMSO-daky kombinasiýasy (3:1 gatnaşyk) bilen garyşdyryldy/PBS-de inkubasiýa edildi. Inýeksiýadan 1 sagat öň otagyň temperaturasynda. Streptawidin bilen birleşdirilen peptidler beýni boşlugy bolan syçanlaryň guýruk damarlarynyň birine 10 mg/kg dozada damardan sanjym edildi.
Streptawidin-peptid kompleksleriniň konsentrasiýasy ELISA arkaly bahalandyryldy. Nunc Maxisorp mikrotitr plastinkalary (Sigma) 4°C-da gijäniň dowamynda 1,5 μg/ml syçan antistreptawidin antitela (Thermo, MA1-20011) bilen örtüldi. Blokirlemeden soň (blokirleme buferi: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% jelatin, 1% BSA) otag temperaturasynda 2 sagatlap, plastinkany 0,05% Tween-20/PBS (ýuwujy bufer) bilen 3 sekuntlap ​​ýuwuň, CSF we plazma nusgalary blokirleme buferi (plazma 1:10,000, CSF 1:115) bilen suwuklandyrylan guýulara goşuldy. Soňra plastinka 4°C-da gijäniň dowamynda anyklaýyş antitela (1 μg/ml, anti-streptawidin-HRP, Novus NB120-7239) bilen inkubasiýa edildi. Üç gezek ýuwulýan ädimden soň, streptawidin TMB substrat ergininde (Roche) 20 minutlap inkubasiýa arkaly anyklandy. 1M H2SO4 bilen reňkiň ösüşini bes edenden soň, 450 nm-de absorbsiýany ölçeň.
Streptawidin-peptid-BACE1 ingibitor toplumynyň funksiýasy öndürijiň protokolyna (Wako, 294-64701) laýyklykda Aβ(1-40) ELISA arkaly bahalandyryldy. Gysgaça aýdylanda, CSF nusgalary standart eritijide (1:23) eredildi we BNT77 tutujy antitela bilen örtülen 96 guýulyk plastinkalarda 4°C-de gije inkubasiýa edildi. Bäş ýuwuş ädiminden soň, HRP bilen birleşdirilen BA27 antitela goşuldy we 4°C-de 2 sagat inkubasiýa edildi, soňra bäş ýuwuş ädimi ýerine ýetirildi. Aβ(1–40) TMB ergininde otag temperaturasynda 30 minut inkubasiýa arkaly anyklandy. Reňk ösüşi togtadylan ergin bilen togtadylandan soň, 450 nm-de absorbsiýany ölçeň. Plazma nusgalary Aβ(1–40) ELISA-dan öň gaty fazaly ekstraksiýa edildi. Plazma 96 guýulyk plastinkalarda 0,2% DEA (Sigma) goşuldy we otag temperaturasynda 30 minut inkubasiýa edildi. SPE plitalaryny (Oasis, 186000679) suw we 100% metanol bilen yzygiderli ýuwandan soň, plazma nusgalary SPE plitalaryna goşuldy we ähli suwuklyk aýryldy. Nusgalar ýuwuldy (ilki 5% metanol, soňra 30% metanol bilen) we 2% NH4OH/90% metanol bilen eluat edildi. Eluat 55°C-de 99 minutlap yzygiderli N2 togunda guradylandan soň, nusgalar standart eritijilerde azaldyldy we Aβ(1–40) ýokarda beýan edilişi ýaly ölçeldi.
Bu makalany nähili sitirlemeli: Urich, E. we başg. In vivo anyklanan tranzit peptidleri ulanyp, beýnä ýük daşamak. ylym. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB we Moos T. Makromolekulýar dermanlaryň maksatly terapiýa arkaly beýnä eltilmegi. Neýrohimiýa žurnaly 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., we Martinez-Martinez, P. Peptid we belok dermanlarynyň gan-beýni böwetinden geçirilmegi. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Gan-beýni päsgelçilikleri: beýni dermanlarynyň işlenip düzülmegindäki päsgelçilik. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG we Byrd, A. Horoid pleksus-CSF ýoly arkaly beýnä derman eltilmegini we nyşana alynmagyny gowulandyrmak üçin mümkinçilikler. Farmasewtiki barlaglar 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Beýni eltmegi üçin molekulýar troýan atlary bilen biofarmasewtikanyň döwrebaplaşdyrylmagy. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM reseptor arkaly peptid daşalmagy gan-beýni böwetinden geçýär. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. we beýlekiler. Bir walent molekulýar şalterleri ulanyp, beýnä siňmegini we terapewtiki antitelalaryň netijeliligini ýokarlandyryň. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Li, N. we beýlekiler. Transferrin reseptorynyň (TfR) daşalmagy TfR antitelalarynyň affinlik görnüşleriniň beýniniň özleşdirilmegini kesgitleýär. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).