شكرًا لزيارتكم موقع Nature.com. أنتم تستخدمون إصدار متصفح يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في إنترنت إكسبلورر). ولضمان استمرارية الدعم، نعرض الموقع بدون أنماط أو جافا سكريبت.
يعرض عرضًا دائريًا لثلاث شرائح دفعةً واحدة. استخدم زري "السابق" و"التالي" للتنقل بين ثلاث شرائح في آنٍ واحد، أو استخدم أزرار التمرير في النهاية للتنقل بين ثلاث شرائح في آنٍ واحد.
يمنع الحاجز الدموي الدماغي والحاجز الدموي الدماغي العوامل العلاجية الحيوية من الوصول إلى أهدافها في الجهاز العصبي المركزي، مما يعيق فعالية العلاج للأمراض العصبية. لاكتشاف ناقلات دماغية جديدة في الجسم الحي، استخدمنا مكتبة ببتيدات فاج T7 وجمعنا عينات دم وسائل دماغي نخاعي (CSF) بشكل متسلسل باستخدام نموذج مجمع كبير واعي مُقَنّى للفئران. تم إثراء مستنسخات فاج محددة بشكل كبير في السائل الدماغي النخاعي بعد أربع جولات من الاختيار. كشف اختبار الببتيدات المرشحة الفردية عن إثراء في السائل الدماغي النخاعي بأكثر من 1000 ضعف. تم تأكيد النشاط الحيوي لتوصيل الببتيد إلى الدماغ من خلال انخفاض بنسبة 40% في مستوى بيتا أميلويد في السائل الدماغي النخاعي باستخدام مثبط ببتيد BACE1 مرتبط بببتيد النقل الجديد المحدد. تشير هذه النتائج إلى أن الببتيدات المحددة من خلال طرق اختيار فاج في الجسم الحي قد تكون وسائل مفيدة لتوصيل الجزيئات الكبيرة إلى الدماغ جهازيًا بتأثير علاجي.
ركزت أبحاث العلاج المُوَجَّه للجهاز العصبي المركزي (CNS) بشكل كبير على تحديد الأدوية والعوامل المُحسَّنة التي تُظهر خصائص مُوَجَّهة للجهاز العصبي المركزي، مع بذل جهود أقل لاكتشاف الآليات التي تُحفِّز توصيل الدواء النشط إلى الدماغ. بدأ هذا الأمر يتغير الآن، حيث أصبح توصيل الأدوية، وخاصةً الجزيئات الكبيرة، جزءًا لا يتجزأ من تطوير أدوية علم الأعصاب الحديث. بيئة الجهاز العصبي المركزي محمية جيدًا بواسطة نظام الحاجز الوعائي الدماغي، المُكوَّن من الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ​​والحاجز الدموي الدماغي (BCBB)1، مما يُصعِّب توصيل الأدوية إلى الدماغ1،2. تُشير التقديرات إلى أن جميع الأدوية ذات الجزيئات الكبيرة تقريبًا، وأكثر من 98% من الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة، تُزال من الدماغ3. لذلك، من المهم جدًا تحديد أنظمة نقل دماغية جديدة تُوفِّر توصيلًا فعالًا ومُحدَّدًا للأدوية العلاجية إلى الجهاز العصبي المركزي4،5. ومع ذلك، يُمثِّل الحاجز الدموي الدماغي والحاجز الدموي الدماغي فرصةً ممتازةً لتوصيل الأدوية، حيث يخترقان ويدخلان جميع هياكل الدماغ عبر أوعيته الدموية الواسعة. وبالتالي، فإن الجهود الحالية لاستخدام طرق غير جراحية لتوصيل الأدوية إلى الدماغ تعتمد بشكل كبير على آلية النقل بوساطة المستقبلات (PMT) باستخدام مستقبل BBB6 الداخلي. وعلى الرغم من التطورات الرئيسية الحديثة في استخدام مسار مستقبلات الترانسفيرين7،8، إلا أن هناك حاجة إلى مزيد من التطوير لأنظمة توصيل جديدة ذات خصائص مُحسّنة. ولتحقيق هذه الغاية، كان هدفنا تحديد الببتيدات القادرة على التوسط في نقل السائل الدماغي الشوكي، حيث يمكن استخدامها مبدئيًا لتوصيل الجزيئات الكبيرة إلى الجهاز العصبي المركزي أو لفتح مسارات مستقبلات جديدة. وعلى وجه الخصوص، يمكن لمستقبلات وناقلات محددة في الجهاز الوعائي الدماغي (BBB وBSCFB) أن تكون أهدافًا محتملة للتوصيل النشط والمحدد للأدوية العلاجية الحيوية. السائل الدماغي الشوكي (CSF) هو منتج إفرازي من الضفيرة المشيمية (CS)، وهو على تماس مباشر مع السائل الخلالي للدماغ عبر الحيز تحت العنكبوتية والحيز البطيني4. تبيّن مؤخرًا أن السائل الدماغي الشوكي تحت العنكبوتية ينتشر بشكل مفرط في النسيج الخلالي للدماغ.9 ونأمل في الوصول إلى الحيز النسيجي باستخدام مسار التدفق تحت العنكبوتية أو مباشرةً عبر الحاجز الدموي الدماغي. ولتحقيق ذلك، طبّقنا استراتيجيةً فعّالة لاختيار العاثيات داخل الجسم الحي، تُحدّد الببتيدات المنقولة عبر أيٍّ من هذين المسارين المتمايزين.
نصف الآن طريقة فحص متسلسلة لعرض العاثيات داخل الجسم الحي، مع أخذ عينات من السائل الدماغي الشوكي (CSF) مع تسلسل عالي الإنتاجية (HTS) لمراقبة جولات الاختيار الأولية ذات أعلى تنوع في المكتبة. أُجري الفحص على فئران واعية باستخدام قنية صهريجية كبيرة مزروعة بشكل دائم لتجنب تلوث الدم. والأهم من ذلك، أن هذه الطريقة تختار كلاً من استهداف الدماغ والببتيدات ذات نشاط النقل عبر الحاجز الدماغي الوعائي. استخدمنا عاثيات T7 نظرًا لصغر حجمها (حوالي 60 نانومتر)10، واقترحنا أنها مناسبة لنقل الحويصلات التي تسمح بعبور الحاجز البطاني و/أو حاجز الظهارة النخاعية عبر الخلايا. بعد أربع جولات من الفحص، عُزلت مجموعات من العاثيات أظهرت إثراءً قويًا للسائل الدماغي الشوكي داخل الجسم الحي وارتباطًا بالأوعية الدموية الدقيقة الدماغية. الأهم من ذلك، أننا تمكنا من تأكيد نتائجنا بإثبات أن الببتيدات المرشحة المُفضّلة والمُصنّعة كيميائيًا قادرة على نقل حمولة البروتين إلى السائل النخاعي. أولًا، تم إثبات التأثيرات الدوائية الديناميكية للجهاز العصبي المركزي من خلال الجمع بين ببتيد نقل رئيسي ومثبط لببتيد BACE1. بالإضافة إلى إثبات أن استراتيجيات الفحص الوظيفي الحيوي قادرة على تحديد ببتيدات نقل دماغية جديدة كناقلات فعالة لحمولة البروتين، نتوقع أن تُصبح أساليب اختيار وظيفي مماثلة مهمة أيضًا في تحديد مسارات نقل دماغية جديدة.
بناءً على وحدات تكوين اللويحات (PFU)، وبعد خطوة تعبئة العاثيات، صُممت وأُنشئت مكتبة من ببتيدات عاثيات T7 الخطية العشوائية المكونة من 12 وحدة نمطية بتنوع يقارب 109 (انظر المواد والطرق). تجدر الإشارة إلى أننا حللنا هذه المكتبة بعناية قبل التحليل الحيوي. أدى تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لعينات مكتبة العاثيات باستخدام بادئات معدلة إلى توليد أمبليكونات قابلة للتطبيق مباشرةً على HTS (الشكل التكميلي 1أ). نظرًا لأخطاء تسلسل HTS11، وتأثيرها على جودة البادئات (NNK)1-12، ووجود عاثيات من النوع البري (wt) (إدراجات هيكلية) في المكتبة الاحتياطية، طُبق إجراء ترشيح تسلسل لاستخراج معلومات التسلسل المُتحقق منها فقط (الشكل التكميلي 1ب). تنطبق خطوات الترشيح هذه على جميع مكتبات تسلسل HTS. بالنسبة للمكتبة القياسية، تم الحصول على ما مجموعه 233,868 قراءة، اجتازت 39% منها معايير التصفية، واستُخدمت لتحليل المكتبة واختيارها للجولات اللاحقة (الشكل التكميلي 1ج-هـ). كانت القراءات في الغالب مضاعفات لثلاثة أزواج قواعد في الطول، مع ذروة عند 36 نيوكليوتيدًا (الشكل التكميلي 1ج)، مما يؤكد تصميم المكتبة (NNK) 1-12. والجدير بالذكر أن حوالي 11% من أعضاء المكتبة احتوت على إدراج PAGISRELVDKL من النوع البري (wt) ذي 12 بُعدًا، وأن ما يقرب من نصف التسلسلات (49%) احتوت على إدراجات أو حذف. أكد تحليل HTS لمكتبة المكتبة التنوع الكبير للببتيدات فيها: تم العثور على أكثر من 81% من تسلسلات الببتيد مرة واحدة فقط، و1.5% فقط منها وُجدت في 4 نسخ أو أكثر (الشكل التكميلي 2أ). ارتبطت ترددات الأحماض الأمينية (aa) في جميع المواضع الاثني عشر في المجموعة ارتباطًا جيدًا بالترددات المتوقعة لعدد الكودونات الناتجة عن مجموعة NKK المتحللة (الشكل التكميلي 2ب). ارتبط التردد المرصود لبقايا aa المشفرة بهذه الإضافات ارتباطًا جيدًا بالتردد المحسوب (r = 0.893) (الشكل التكميلي 2ج). يتضمن تحضير مكتبات العاثيات للحقن خطوات تضخيم وإزالة الذيفان الداخلي. وقد ثبت سابقًا أن هذا قد يقلل من تنوع مكتبات العاثيات12،13. لذلك، قمنا بتسلسل مكتبة عاثيات مُضخّمة بالصفائح، والتي خضعت لإزالة الذيفان الداخلي، وقارناها بالمكتبة الأصلية لتقدير تردد AA. لوحظ ارتباط قوي (r = 0.995) بين المجموعة الأصلية والمجموعة المُضخّمة والمُنقّاة (الشكل التكميلي 2د)، مما يُشير إلى أن التنافس بين المُستنسخات المُضخّمة على الصفائح باستخدام فاج T7 لم يُسبب تحيزًا كبيرًا. تستند هذه المقارنة إلى تواتر أنماط الببتيد الثلاثي في ​​كل مكتبة، نظرًا لأنه لا يُمكن رصد تنوع المكتبات (حوالي 109) بالكامل حتى باستخدام HTS. كشف تحليل تردد aa في كل موضع عن تحيز طفيف يعتمد على الموضع في المواضع الثلاثة الأخيرة من المجموعة المُدخلة (الشكل التكميلي 2هـ). في الختام، خلصنا إلى أن جودة وتنوع المكتبة كانا مقبولين، ولم تُلاحظ سوى تغييرات طفيفة في التنوع نتيجةً لتضخيم وإعداد مكتبات الفاج بين عدة جولات من الاختيار.
يمكن إجراء أخذ عينات متسلسلة من السائل النخاعي عن طريق زرع قنية جراحيًا في CM للفئران الواعية لتسهيل التعرف على عاثية T7 المحقونة وريديًا (iv) عبر BBB و/أو BCSFB (الشكل 1أ-ب). استخدمنا ذراعي اختيار مستقلين (الذراعان A وB) في الجولات الثلاث الأولى من الاختيار داخل الجسم الحي (الشكل 1ج). زدنا تدريجيًا من صرامة الاختيار عن طريق تقليل الكمية الإجمالية للعاثية المُدخلة في الجولات الثلاث الأولى من الاختيار. بالنسبة للجولة الرابعة من الفرز، جمعنا عينات من الفرعين A وB وأجرينا ثلاثة اختيارات مستقلة إضافية. لدراسة خصائص جزيئات عاثية T7 داخل الجسم الحي في هذا النموذج، تم حقن عاثية من النوع البري (PAGISRELVDKL master insert) في الفئران عبر وريد الذيل. أظهر استرداد العاثيات من السائل النخاعي والدم في نقاط زمنية مختلفة أن عاثيات T7 العشرينية الصغيرة نسبيًا كان لها مرحلة تصفية أولية سريعة من حجرة الدم (الشكل التكميلي 3). بناءً على العيارات المُعطاة وحجم دم الفئران، حسبنا أنه تم الكشف عن حوالي 1٪ فقط من العاثيات بالوزن من الجرعة المُعطاة في الدم بعد 10 دقائق من الحقن الوريدي. بعد هذا الانخفاض السريع الأولي، تم قياس تصفية أولية أبطأ بنصف عمر 27.7 دقيقة. والأهم من ذلك، تم استرداد عدد قليل جدًا من العاثيات من حجرة السائل النخاعي، مما يشير إلى خلفية منخفضة لهجرة العاثيات من النوع البري إلى حجرة السائل النخاعي (الشكل التكميلي 3). في المتوسط، تم الكشف عن حوالي 1 × 10-3٪ فقط من عاثيات T7 في الدم و 4 × 10-8٪ من العاثيات التي تم حقنها في البداية في السائل النخاعي على مدار فترة أخذ العينات بأكملها (0-250 دقيقة). تجدر الإشارة إلى أن عمر النصف (25.7 دقيقة) للعاثيات البرية في السائل الدماغي الشوكي كان مشابهًا لعمر النصف المُلاحظ في الدم. تُظهر هذه البيانات أن الحاجز الفاصل بين حجرة السائل الدماغي الشوكي والدم سليم في الفئران المُعالجة بقسطرة CM، مما يسمح باختيار مجموعات العاثيات داخل الجسم لتحديد النسخ التي تنتقل بسهولة من الدم إلى حجرة السائل الدماغي الشوكي.
(أ) إعداد طريقة لإعادة أخذ عينات من السائل النخاعي (CSF) من مجموعة كبيرة. (ب) رسم تخطيطي يوضح الموقع الخلوي لحاجز الجهاز العصبي المركزي (CNS) واستراتيجية الاختيار المستخدمة لتحديد الببتيدات التي تعبر حاجز الدم الدماغي (BBB) ​​وحاجز الدم الدماغي. (ج) مخطط انسيابي لفحص عرض العاثيات داخل الجسم الحي. في كل جولة اختيار، حُقنت العاثيات (معرّفات الحيوانات داخل الأسهم) عن طريق الوريد. يُحتفظ بفرعين بديلين مستقلين (أ، ب) بشكل منفصل حتى الجولة الرابعة من الاختيار. في جولتي الاختيار الثالثة والرابعة، حُدد تسلسل كل استنساخ عاثي مُستخرج من السائل النخاعي يدويًا. (د) حركية العاثيات المعزولة من الدم (دوائر حمراء) والسائل النخاعي (مثلثات خضراء) خلال الجولة الأولى من الاختيار في جرذين مُقنَّعين بعد الحقن الوريدي لمكتبة ببتيد T7 (2 × 1012 عاثية/حيوان). تشير المربعات الزرقاء إلى متوسط ​​التركيز الأولي للعاثيات في الدم، محسوبًا من كمية العاثيات المحقونة، مع مراعاة حجم الدم الكلي. تشير المربعات السوداء إلى نقطة تقاطع خط y المُستقاة من تركيزات عاثيات الدم. (هـ، و) اعرض التردد والتوزيع النسبي لجميع أنماط الببتيد الثلاثي المتداخلة المحتملة الموجودة في الببتيد. يُوضح عدد الأنماط الموجودة في 1000 قراءة. الأنماط المُثراة بشكل ملحوظ (p < 0.001) مُعلَّمة بنقاط حمراء. (هـ) مخطط تشتت الارتباط الذي يقارن التردد النسبي لنمط الببتيد الثلاثي في ​​المكتبة المحقونة مع العاثيات المشتقة من الدم من الحيوانات رقم 1.1 و1.2. (و) مخطط تشتت الارتباط الذي يقارن الترددات النسبية لنمطي الببتيد الثلاثي في ​​العاثيات الحيوانية رقم 1.1 و1.2 المعزولين في الدم والسائل الدماغي الشوكي. (ز، ح) تمثيل مُعرِّف التسلسل للعاثيات المُخصَّبة في الدم (ز) مقابل المكتبات المحقونة والعاثيات المُخصَّبة في السائل الدماغي الشوكي (ح) مقابل الدم بعد جولة اختيار داخل الجسم الحي في كلا الحيوانين. يشير حجم الرمز المكون من حرف واحد إلى مدى تكرار ظهور هذا الحمض الأميني في هذا الموضع. الأخضر = قطبي، البنفسجي = محايد، الأزرق = قاعدي، الأحمر = حمضي، والأسود = أحماض أمينية كارهة للماء. صُمِّم وأُنتج الشكل 1أ، ب بواسطة إدوارد يوريش.
حقننا مكتبة ببتيدات عاثية في جرذين من فئران التجارب (السلالتان A وB) باستخدام أداة CM، وعزلنا العاثية من السائل النخاعي الشوكي والدم (الشكل 1د). كانت سرعة التصفية الأولية للمكتبة أقل وضوحًا مقارنةً بالعاثية من النوع البري. بلغ متوسط ​​عمر النصف للمكتبة المحقونة في كلا الحيوانين 24.8 دقيقة في الدم، وهو ما يُشابه العاثية من النوع البري، و38.5 دقيقة في السائل الدماغي الشوكي. خضعت عينات الدم والسائل النخاعي من كل حيوان لتقنية HTS، وحُللت جميع الببتيدات المحددة بحثًا عن وجود نمط ثلاثي الببتيد قصير. اختيرت أنماط الببتيد الثلاثي لأنها تُوفر أساسًا ضئيلًا لتكوين البنية وتفاعلات الببتيد والبروتين14،15. وجدنا ارتباطًا جيدًا في توزيع الأنماط بين مكتبة العاثية المحقونة والنسخ المستخرجة من دم كلا الحيوانين (الشكل 1هـ). تشير البيانات إلى أن تكوين المكتبة غني بشكل طفيف فقط في حجرة الدم. تم تحليل ترددات الأحماض الأمينية وتسلسلات الإجماع بشكل أكبر في كل موضع باستخدام تعديل لبرنامج Weblogo16. ومن المثير للاهتمام أننا وجدنا إثراء قويًا في بقايا جلايسين الدم (الشكل 1 ز). عند مقارنة الدم مع المستنسخات المختارة من السائل الدماغي الشوكي، لوحظ انتقاء قوي وبعض إلغاء اختيار الزخارف (الشكل 1 و)، وكانت بعض الأحماض الأمينية موجودة بشكل تفضيلي في مواضع محددة مسبقًا في العضو المكون من 12 عضوًا (الشكل 1 ح). والجدير بالذكر أن الحيوانات الفردية اختلفت بشكل كبير في السائل النخاعي، بينما لوحظ إثراء جلايسين الدم في كلا الحيوانين (الشكل التكميلي 4 أ-ي). بعد الترشيح الدقيق لبيانات التسلسل في السائل النخاعي للحيوانات رقم 1.1 ورقم 1.2، تم الحصول على ما مجموعه 964 و420 ببتيدًا فريدًا مكونًا من 12 وحدة (الشكل التكميلي 1 د-هـ). تم تضخيم مستنسخات العاثيات المعزولة وإخضاعها لجولة ثانية من الانتقاء داخل الجسم الحي. خضعت العاثيات المستخرجة من الجولة الثانية من الانتقاء لعملية HTS في كل حيوان، واستُخدمت جميع الببتيدات المحددة كمدخلات لبرنامج التعرف على الأنماط لتحليل ظهور أنماط الببتيد الثلاثي (الشكل 2أ، ب، هـ). بالمقارنة مع الدورة الأولى للعاثية المسترجعة من السائل الدماغي الشوكي، لاحظنا المزيد من الانتقاء وإلغاء الانتقاء للعديد من الأنماط في السائل الدماغي الشوكي في الفرعين أ و ب (الشكل 2). طُبقت خوارزمية تحديد الشبكة لتحديد ما إذا كانت تُمثل أنماطًا مختلفة من التسلسل المتسق. لوحظ تشابه واضح بين التسلسلات ذات الاثني عشر بُعدًا المسترجعة بواسطة السائل الدماغي الشوكي في الفرع البديل أ (الشكل 2ج، د) والفرع ب (الشكل 2ز، ح). كشف التحليل المجمع في كل فرع عن أنماط اختيار مختلفة لببتيدات 12-mer (الشكل التكميلي 5c،d) وزيادة في نسبة عيار CSF/الدم بمرور الوقت للاستنساخ المجمع بعد الجولة الثانية من الاختيار مقارنة بالجولة الأولى من الاختيار (الشكل التكميلي 5e).
إثراء العناصر والببتيدات في السائل الدماغي الشوكي من خلال جولتين متتاليتين من اختيار العرض الوظيفي للبكتيريا في الجسم الحي.
تم تجميع جميع عاثيات السائل النخاعي المستردة من الجولة الأولى لكل حيوان (الحيوانات رقم 1.1 ورقم 1.2) وتضخيمها وتسلسلها باستخدام تقنية HT وإعادة حقنها معًا (2 × 1010 عاثية/حيوان) 2 جرذان مقننة SM (رقم 1.1 → #). 2.1 و2.2، 1.2 → 2.3 و2.4). (أ، ب، هـ، و) مخططات تشتت الارتباط التي تقارن التردد النسبي لعناصر الببتيد الثلاثي لجميع العاثيات المشتقة من السائل النخاعي في جولتي الاختيار الأولى والثانية. التردد النسبي وتوزيع العناصر التي تمثل جميع عناصر الببتيد الثلاثي المتداخلة المحتملة الموجودة في الببتيدات في كلا الاتجاهين. يظهر عدد العناصر الموجودة في 1000 قراءة. يتم تمييز العناصر التي تم اختيارها أو استبعادها بشكل كبير (p < 0.001) في إحدى المكتبات المقارنة بنقاط حمراء. (ج، د، ز، ح) تمثيل شعار التسلسل لجميع تسلسلات الأحماض الأمينية الطويلة الغنية بـ 12 حمضًا أمينيًا بناءً على الجولتين 2 و1 من الاختيار داخل الجسم الحي. يشير حجم الرمز المكون من حرف واحد إلى مدى تكرار حدوث هذا الحمض الأميني في هذا الموضع. لتمثيل الشعار، تتم مقارنة تردد تسلسلات السائل الدماغي الشوكي المستخرجة من الحيوانات الفردية بين جولتي الاختيار ويتم عرض التسلسلات المخصبة في الجولة الثانية: (ج) #1.1–#2.1 (د) #1.1–#2.2 (ز) #1.2–#2.3 و (ح) #1.2–#2.4. تظهر الأحماض الأمينية الأكثر إثراءً في موضع معين في (ج، د) الحيوانات رقم 2.1 ورقم 2.2 أو (ز، ح) في الحيوانات رقم 2.3 ورقم 2.4 بالألوان. الأخضر = قطبي، أرجواني = محايد، أزرق = قاعدي، أحمر = حمضي، وأسود = أحماض أمينية كارهة للماء.
بعد الجولة الثالثة من الاختيار، حددنا 124 تسلسل ببتيد فريد (#3.1 و#3.2) من 332 مستنسخًا من البكتيريا العاثية المعاد تكوينها في السائل الدماغي الشوكي المعزولة من حيوانين (الشكل التكميلي 6أ). كان للتسلسل LGSVS (18.7%) أعلى نسبة نسبية، تليها الإدخالات البرية PAGISRELVDKL (8.2%) وMRWFFSHASQGR (3%) وDVAKVS (3%) وTWLFSLG (2.2%) وSARGSWREIVSLS (2.2%). في الجولة الرابعة الأخيرة، جمعنا فرعين تم اختيارهما بشكل مستقل من ثلاثة حيوانات منفصلة (الشكل 1ج). من بين 925 مستنسخًا من البكتيريا العاثية المتسلسلة المستردة من السائل الدماغي الشوكي، وجدنا في الجولة الرابعة 64 تسلسلًا فريدًا من الببتيد (الشكل التكميلي 6ب)، انخفضت النسبة النسبية للبكتيريا العاثية من النوع البري إلى 0.8%. كانت أكثر مستنسخات السائل الدماغي الشوكي شيوعًا في الجولة الرابعة هي LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%) وLGSVS (17%) وGFVRFRLSNTR (14%) وKVAWRVFSLFWK (7%) وSVHGV (5%) وGRPQKINGARVC (3.6%) وRLSSVDSDLSGC (3.2%). ). يرجع نطاق طول الببتيدات المختارة إلى إدخالات/حذف النوكليوتيدات أو كودونات التوقف المبكرة في بادئات المكتبة عند استخدام الكودونات المتحللة لتصميم مكتبة NNK. تُنتج كودونات التوقف المبكرة ببتيدات أقصر ويتم اختيارها لاحتوائها على نمط aa الملائم. قد تنتج ببتيدات أطول من إدخالات/حذف في بادئات المكتبات الاصطناعية. يؤدي هذا إلى وضع كودون التوقف المصمم خارج الإطار وقراءته حتى يظهر كودون توقف جديد في اتجاه مجرى النهر. بشكل عام، حسبنا عوامل الإثراء لجميع جولات الاختيار الأربع بمقارنة بيانات الإدخال ببيانات إخراج العينة. بالنسبة للجولة الأولى من الفحص، استخدمنا عيارات العاثيات من النوع البري كمرجع خلفي غير محدد. ومن المثير للاهتمام أن انتقاء العاثيات السلبي كان قويًا جدًا في دورة السائل الدماغي الشوكي الأولى، ولكن ليس في الدم (الشكل 3أ)، والذي قد يكون بسبب انخفاض احتمالية الانتشار السلبي لمعظم أعضاء مكتبة الببتيد في حجرة السائل الدماغي الشوكي أو أن العاثيات النسبية تميل إلى الاحتفاظ بها أو إزالتها من مجرى الدم بكفاءة أكبر من العاثيات البكتيرية. ومع ذلك، في الجولة الثانية من الفرز، لوحظ انتقاء قوي للعاثيات في السائل الدماغي الشوكي في كلا الفرعين، مما يشير إلى أن الجولة السابقة كانت غنية بالعاثيات التي تعرض الببتيدات التي تعزز امتصاص السائل الدماغي الشوكي (الشكل 3أ). مرة أخرى، دون إثراء كبير في الدم. أيضًا في الجولتين الثالثة والرابعة، كانت مستنسخات العاثيات غنية بشكل كبير في السائل الدماغي الشوكي. بمقارنة التردد النسبي لكل تسلسل ببتيد فريد بين الجولتين الأخيرتين من الاختيار، وجدنا أن التسلسلات كانت أكثر إثراءً في الجولة الرابعة من الاختيار (الشكل 3ب). تم استخراج ما مجموعه 931 من الزخارف ثلاثية الببتيد من جميع تسلسلات الببتيد الفريدة البالغ عددها 64 باستخدام كلا اتجاهي الببتيد. تم فحص الزخارف الأكثر إثراءً في الجولة الرابعة عن كثب لمعرفة ملفات تعريف الإثراء الخاصة بها في جميع الجولات مقارنةً بالمكتبة المحقونة (الحد الأدنى: إثراء بنسبة 10٪) (الشكل التكميلي 6ج). أظهرت الأنماط العامة للاختيار أن معظم الزخارف المدروسة كانت غنية في جميع الجولات السابقة لكلا فرعي الاختيار. ومع ذلك، كانت بعض الزخارف (مثل SGL و VSG و LGS GSV) في الغالب من الفرع البديل A، بينما تم إثراء البعض الآخر (مثل FGW و RTN و WGF و NTR) في الفرع البديل B.
التحقق من صحة نقل السائل الدماغي الشوكي للببتيدات المخصبة بالسائل الدماغي الشوكي والمعروضة بالعاثيات والببتيدات القيادية البيوتينية المقترنة بحمولات الستربتافيدين.
(أ) نسب الإثراء المحسوبة في جميع الجولات الأربع (R1-R4) بناءً على عيارات العاثيات المحقونة (المدخلات = I) (PFU) وعيارات العاثيات المحددة في السائل الدماغي الشوكي (المخرجات = O). حُسبت عوامل الإثراء للجولات الثلاث الأخيرة (R2-R4) بالمقارنة مع الجولة السابقة والجولة الأولى (R1) باستخدام بيانات الوزن. الأشرطة المفتوحة هي السائل الدماغي الشوكي، والأشرطة المظللة هي البلازما. (***p<0.001، بناءً على اختبار t للطلاب). (ب) قائمة بأكثر ببتيدات العاثيات وفرةً، مُرتبةً حسب نسبتها النسبية إلى جميع العاثيات المُجمعة في السائل الدماغي الشوكي بعد الجولة الرابعة من الاختيار. تم تمييز أكثر ستة مستنسخات عاثية شيوعًا بالألوان، وترقيمها، وعوامل إثرائها بين الجولتين الثالثة والرابعة من الاختيار (مُلحقات). (ج، د) حُللت ستة مستنسخات من العاثيات الأكثر إثراءً، بالإضافة إلى العاثيات الفارغة ومكتبات ببتيدات العاثيات الأصلية من الجولة الرابعة، بشكل فردي باستخدام نموذج أخذ عينات من السائل الدماغي الشوكي. جُمعت عينات من السائل الدماغي الشوكي والدم في الأوقات المحددة. (ج) كميات متساوية من ستة مستنسخات من العاثيات المرشحة (2 × 1010 عاثية/حيوان)، وعاثيات فارغة (رقم 1779) (2 × 1010 عاثية/حيوان)، ومكتبات ببتيدات العاثيات الأصلية (2 × 1012 عاثية/حيوان). يُحقن الحيوان المُقنَّع بما لا يقل عن 3 سم مكعب بشكل منفصل عبر وريد الذيل. يُظهر الشكل الحرائك الدوائية لسائل الدماغ الدماغي الشوكي لكل مستنسخ من العاثيات المحقونة ومكتبة ببتيدات العاثيات مع مرور الوقت. (د) يُظهر متوسط ​​نسبة السائل الدماغي الشوكي إلى الدم لجميع العاثيات المستعادة/مل خلال فترة أخذ العينات. (هـ) رُبطت أربعة ببتيدات قائدة اصطناعية وعنصر تحكم مُشَوَّش واحد بالبيوتين مع الستربتافيدين من خلال الطرف الأميني (عرض رباعي الأجزاء)، تلا ذلك حقن (وريد الذيل الوريدي، 10 ملغ ستربتافيدين/كغ). ثلاثة فئران على الأقل مُنبَّبة (ن = 3). جُمعت عينات من السائل الدماغي الشوكي في النقاط الزمنية المحددة، وقيست تركيزات الستربتافيدين بواسطة اختبار الإليزا المضاد للستربتافيدين في السائل الدماغي الشوكي (لم يُكتشف). (*p<0.05، **p<0.01، ***p<0.001، بناءً على اختبار تحليل التباين). (و) مقارنة تسلسل الأحماض الأمينية لنسخة الببتيد العاثية الأكثر إثراءً رقم 2002 (اللون الأرجواني) مع نسخ أخرى مختارة من الببتيد العاثي من الجولة الرابعة من الاختيار. شظايا الأحماض الأمينية المتطابقة والمتشابهة مُرمَّزة بالألوان.
من بين جميع العاثيات المُخصَّبة في الجولة الرابعة (الشكل 3ب)، اختيرت ستة مستنسخات مرشحة لمزيد من التحليل الفردي في نموذج أخذ عينات السائل الدماغي الشوكي. حُقِنت كميات متساوية من ستة مكتبات ببتيدات للعاثيات المرشحة، والعاثيات الفارغة (بدون إدخال)، والبروفيولوجية في ثلاثة حيوانات CM مُقنَّعة، وحُدِّدت حركيتها الدوائية في اختبارات السائل الدماغي الشوكي (الشكل 3ج) والدم (الشكل التكميلي 7). استهدفت جميع مستنسخات العاثيات المختبرة حجرة السائل الدماغي الشوكي بمستوى أعلى من مستوى العاثية الفارغة (رقم 1779) بما يتراوح بين 10 و1000 مرة. على سبيل المثال، احتوت المستنسختان رقم 2020 ورقم 2077 على عيارات سائل الدماغ الدماغي الشوكي أعلى بحوالي 1000 مرة من العاثية الفارغة. يختلف ملف الحرائك الدوائية لكل ببتيد مُختار، لكن جميعها تتمتع بقدرة عالية على توجيه السائل الدماغي الشوكي. لاحظنا انخفاضًا ثابتًا بمرور الوقت في المستنسخات رقم 1903 و2011، بينما في المستنسخات رقم 2077 و2002 و2009، قد تشير الزيادة خلال الدقائق العشر الأولى إلى النقل النشط، ولكن يجب التحقق منها. استقرت المستنسخات رقم 2020 و2002 و2077 عند مستويات عالية، بينما انخفض تركيز السائل الدماغي الشوكي للمستنسخ رقم 2009 ببطء بعد الزيادة الأولية. ثم قارنا التردد النسبي لكل مستنسخ مرشح للسائل الدماغي الشوكي بتركيزه في الدم (الشكل 3د). أظهر ارتباط متوسط ​​تركيز السائل الدماغي الشوكي بمعياره في الدم في جميع أوقات أخذ العينات أن ثلاثة من المستنسخات الستة كانت غنية بشكل ملحوظ في السائل الدماغي الشوكي في الدم. ومن المثير للاهتمام أن المستنسخ رقم 2077 أظهر استقرارًا أعلى في الدم (الشكل التكميلي 7). للتأكد من قدرة الببتيدات نفسها على نقل حمولات أخرى غير جسيمات العاثيات بنشاط إلى حيز السائل الدماغي الشوكي، قمنا بتصنيع أربعة ببتيدات رئيسية مُشتقة من البيوتين عند الطرف الأميني حيث ترتبط الببتيدات بجسيم العاثية. تم ربط الببتيدات البيوتينية (أرقام 2002، 2009، 2020 و2077) مع ستربتافيدين (SA) للحصول على أشكال متعددة الوحدات تُحاكي إلى حد ما هندسة العاثيات. سمح لنا هذا الشكل أيضًا بقياس تعرض SA في الدم والسائل الدماغي الشوكي كببتيدات بروتينية ناقلة للحمولات. والأهم من ذلك، أنه غالبًا ما يمكن إعادة إنتاج بيانات العاثيات عند إعطاء الببتيدات المُصنعة بهذه الصيغة المُقترنة بـ SA (الشكل 3هـ). كان للببتيدات المُشَوَّشة تعرض أولي أقل وتصفية أسرع في السائل الدماغي الشوكي بمستويات غير قابلة للكشف خلال 48 ساعة. للحصول على فهم أعمق لمسارات توصيل هذه الببتيدات الببتيدية إلى حيز السائل الدماغي الشوكي، قمنا بتحليل موقع ضربات ببتيدات الببتيد الفردية باستخدام الكيمياء المناعية (IHC) للكشف المباشر عن جسيمات الببتيد بعد ساعة واحدة من الحقن الوريدي في الجسم الحي. والجدير بالذكر أنه يمكن الكشف عن الببتيدات #2002 و #2077 و #2009 عن طريق التلوين القوي في الشعيرات الدموية الدماغية، بينما لم يتم الكشف عن الببتيد #1779 والنسخة #2020 (الشكل التكميلي 8). يشير هذا إلى أن هذه الببتيدات تساهم في التأثير على الدماغ بدقة عن طريق عبور الحاجز الدموي الدماغي. يلزم إجراء تحليل أكثر تفصيلاً لاختبار هذه الفرضية، حيث قد يكون مسار BSCFB متورطًا أيضًا. عند مقارنة تسلسل الأحماض الأمينية للنسخة الأكثر إثراء (#2002) مع ببتيدات مختارة أخرى، لوحظ أن بعضها يحتوي على امتدادات أحماض أمينية مماثلة، مما قد يشير إلى آلية نقل مماثلة (الشكل 3و).
نظرًا لملفها البلازمي الفريد والزيادة الكبيرة في السائل الدماغي الشوكي بمرور الوقت، تم استكشاف نسخة عرض البكتيريا العاثية رقم 2077 بشكل أكبر على مدى فترة أطول تبلغ 48 ساعة، وتمكنت من إعادة إنتاج الزيادة السريعة في السائل الدماغي الشوكي التي لوحظت بالتزامن مع مستويات SA المستدامة (الشكل 4أ). فيما يتعلق بنسخ البكتيريا العاثية الأخرى التي تم تحديدها، فقد اكتسبت نسخة رقم 2077 لونًا قويًا لشعيرات الدماغ، وأظهرت تموضعًا مشتركًا مهمًا مع الليكتين، وهو علامة شعرية، عند النظر إليها بدقة أعلى، وربما بعض الصبغة في الحيز الحشوي (الشكل 4ب). للتحقق من إمكانية الحصول على تأثيرات دوائية بوساطة الببتيد في الجهاز العصبي المركزي، أجرينا تجربة تم فيها خلط نسخ بيوتينية من i) ببتيد العبور #2077 وii) ببتيد مثبط BACE1 مع SA بنسبتين مختلفتين. بالنسبة لتركيبة واحدة، استخدمنا مثبط ببتيد BACE1 فقط، وبالنسبة للتركيبة الأخرى، استخدمنا نسبة 1:3 من مثبط ببتيد BACE1 إلى ببتيد #2077. أُعطيت كلتا العينتين عن طريق الوريد، وقيست مستويات ببتيد بيتا أميلويد 40 (Abeta40) في الدم والسائل الدماغي الشوكي مع مرور الوقت. قُيس Abeta40 في السائل الدماغي الشوكي لأنه يعكس تثبيط BACE1 في أنسجة الدماغ. وكما هو متوقع، أدى كلا المركبين إلى انخفاض ملحوظ في مستويات Abeta40 في الدم (الشكل 4ج، د). ومع ذلك، فإن العينات التي تحتوي على مزيج من الببتيد رقم 2077 ومثبط لببتيد BACE1 المقترن بـ SA فقط هي التي تسببت في انخفاض ملحوظ في Abeta40 في السائل الدماغي الشوكي (الشكل 4ج). تُظهر البيانات أن الببتيد رقم 2077 قادر على نقل بروتين SA ذي الوزن الجزيئي 60 كيلو دالتون إلى الجهاز العصبي المركزي، كما يُحدث تأثيرات دوائية مع مثبطات ببتيد BACE1 المقترنة بـ SA.
(أ) حقن مستنسخ (2 × 10 عاثيات/حيوان) من عاثية T7 يُظهر أنماطًا حركية دوائية طويلة المدى لببتيد السائل الدماغي الشوكي رقم 2077 (RLSSVDSDLSGC) وعاثية التحكم غير المحقونة (رقم 1779) في ثلاثة فئران على الأقل مُنْبَبَة بتقنية CM. (ب) صورة مجهرية متحدة البؤر لأوعية دموية دقيقة تمثيلية في فئران مُحَقَنَة بالعاثية (2 × 10 10 عاثيات/حيوان) تُظهر تلوينًا مضادًا للببتيد رقم 2077 والأوعية (الليكتين). أُعطيت هذه النسخ المستنسخة من العاثية لثلاثة فئران، وسُمح لها بالدوران لمدة ساعة قبل التروية. قُطِّعت الأدمغة وصُبغت بأجسام مضادة متعددة النسائل مُعَلَّمة بـ FITC ضد غلاف عاثية T7. قبل عشر دقائق من التروية والتثبيت اللاحق، أُعطي الليكتين المُعَلَّم بـ DyLight594 عن طريق الوريد. صور فلورية تُظهر تلطيخ الليكتين (أحمر) للجانب اللمعي للأوعية الدموية الدقيقة والعاثيات (أخضر) في تجويف الشعيرات الدموية وأنسجة الدماغ المحيطة بالأوعية الدموية. يُعادل شريط المقياس 10 ميكرومتر. (ج، د) تم ربط ببتيد مثبط لإنزيم BACE1 البيوتيني، بمفرده أو مع ببتيد العبور البيوتيني رقم 2077، بالستربتافيدين، ثم حقن وريديًا لثلاثة فئران CM مُقنَّعة على الأقل (10 ملغ ستربتافيدين/كغ). تم قياس الانخفاض في بروتين Aβ40 بوساطة مثبط ببتيد BACE1 باستخدام اختبار ELISA لـ Aβ1-40 في الدم (أحمر) والسائل النخاعي (برتقالي) في النقاط الزمنية المشار إليها. لمزيد من الوضوح، رُسم خط منقط على الرسم البياني بمقياس 100%. (ج) نسبة الانخفاض في تركيز بيتا اميلويد 40 في الدم (مثلثات حمراء) والسائل الدماغي الشوكي (مثلثات برتقالية) لدى الفئران المعالجة بالستربتافيدين المقترن بببتيد العبور رقم 2077 وببتيد مثبط لـ BACE1 بنسبة 3:1. (د) نسبة الانخفاض في تركيز بيتا اميلويد 40 في الدم (دوائر حمراء) والسائل الدماغي الشوكي (دوائر برتقالية) لدى الفئران المعالجة بالستربتافيدين المقترن بببتيد مثبط لـ BACE1 فقط. بلغ تركيز بيتا اميلويد في المجموعة الضابطة 420 بيكوغرام/مل (الانحراف المعياري = 101 بيكوغرام/مل).
طُبِّقت تقنية عرض البكتيريا العاثية بنجاح في العديد من مجالات البحث الطبي الحيوي.17. استُخدمت هذه الطريقة في دراسات التنوع الوعائي داخل الجسم الحي.18،19 بالإضافة إلى دراسات تستهدف الأوعية الدماغية.20،21،22،23،24،25،26. في هذه الدراسة، وسّعنا نطاق تطبيق طريقة الاختيار هذه ليس فقط للتحديد المباشر للببتيدات التي تستهدف الأوعية الدماغية، بل لاكتشاف مرشحين يتمتعون بخصائص النقل النشط لعبور حاجز الدم الدماغي. نصف الآن تطوير إجراء اختيار داخل الجسم الحي في فئران CM المُنَبَّبة، ونُبرهن على قدرتها على تحديد الببتيدات ذات خصائص التوجيه إلى السائل الدماغي الشوكي. باستخدام البكتيريا العاثية T7 التي تعرض مكتبة من الببتيدات العشوائية المكونة من 12 وحدة، تمكنا من إثبات أن البكتيريا العاثية T7 صغيرة بما يكفي (قطرها حوالي 60 نانومتر)10 لتتكيف مع حاجز الدم الدماغي، وبالتالي تعبر حاجز الدم الدماغي أو الضفيرة المشيمية مباشرةً. لاحظنا أن استخلاص السائل الدماغي الشوكي من فئران CM المُقنَّعة كان طريقة فحص وظيفية مُتحكَّم فيها جيدًا داخل الجسم الحي، وأن العاثية المُستخلصة لم ترتبط بالأوعية الدموية فحسب، بل عملت أيضًا كناقل عبر الحاجز الدموي الدماغي. علاوة على ذلك، من خلال جمع الدم وتطبيق HTS على السائل الدماغي الشوكي والعاثيات المُشتقة من الدم في آنٍ واحد، تأكدنا من أن اختيارنا للسائل الدماغي الشوكي لم يتأثر بإثراء الدم أو ملاءمته للتمدد بين جولات الاختيار. ومع ذلك، فإن حجرة الدم جزء من عملية الاختيار، حيث يجب أن تبقى العاثيات القادرة على الوصول إلى حجرة السائل الدماغي الشوكي وتدور في مجرى الدم لفترة كافية لتثري نفسها في الدماغ. ولاستخراج معلومات تسلسل موثوقة من بيانات HTS الخام، استخدمنا مُرشِّحات مُكيَّفة لأخطاء التسلسل الخاصة بالمنصة في سير عمل التحليل. من خلال دمج المعلمات الحركية في طريقة الفحص، أكدنا الحركية الدوائية السريعة للعاثيات T7 من النوع البري (t½ ~ 28 دقيقة) في الدم24، 27، 28 وحددنا أيضًا عمر النصف لها في السائل النخاعي (t½ ~ 26 دقيقة) في الدقيقة). وعلى الرغم من وجود ملفات تعريف حركية دوائية مماثلة في الدم والسائل الدماغي الشوكي، إلا أنه لم يمكن اكتشاف سوى 0.001٪ من تركيز العاثية في الدم في السائل الدماغي الشوكي، مما يشير إلى انخفاض الحركة الخلفية للعاثية T7 من النوع البري عبر حاجز الدم الدماغي. يسلط هذا العمل الضوء على أهمية الجولة الأولى من الاختيار عند استخدام استراتيجيات التنقيب في الجسم الحي، وخاصة بالنسبة لأنظمة العاثيات التي يتم تطهيرها بسرعة من الدورة الدموية، حيث لا يتمكن سوى عدد قليل من المستنسخات من الوصول إلى حجرة الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي، في الجولة الأولى، كان الانخفاض في تنوع المكتبة كبيرًا جدًا، حيث تم جمع عدد محدود فقط من المستنسخات في النهاية في نموذج السائل الدماغي الشوكي الصارم للغاية هذا. تضمنت استراتيجية التنقيح هذه داخل الجسم الحي عدة خطوات اختيار مثل التراكم النشط في حجرة السائل الدماغي الشوكي، وبقاء الاستنساخ في حجرة الدم، والإزالة السريعة لاستنساخات البكتيريا العاثية T7 من الدم خلال أول 10 دقائق (الشكل 1د والشكل التكميلي 4م). وبالتالي، بعد الجولة الأولى، تم تحديد استنساخات مختلفة من البكتيريا العاثية في السائل الدماغي الشوكي، على الرغم من استخدام نفس المجموعة الأولية للحيوانات الفردية. ويشير هذا إلى أن خطوات الاختيار الصارمة المتعددة لمكتبات المصادر التي تحتوي على أعداد كبيرة من أعضاء المكتبة تؤدي إلى انخفاض كبير في التنوع. وبالتالي، ستصبح الأحداث العشوائية جزءًا لا يتجزأ من عملية الاختيار الأولية، مما يؤثر بشكل كبير على النتيجة. ومن المرجح أن العديد من الاستنساخات في المكتبة الأصلية كان لها ميل مماثل جدًا لإثراء السائل الدماغي الشوكي. ومع ذلك، حتى في ظل نفس الظروف التجريبية، قد تختلف نتائج الاختيار بسبب العدد الصغير لكل استنساخ معين في المجموعة الأولية.
تختلف الزخارف المخصبة في السائل الدماغي الشوكي عن تلك الموجودة في الدم. ومن المثير للاهتمام أننا لاحظنا أول تحول نحو الببتيدات الغنية بالجلايسين في دم الحيوانات الفردية. (الشكل 1 ز، الأشكال التكميلية 4 هـ، 4 و). قد تكون البكتيريا العاثية التي تحتوي على ببتيدات الجلايسين أكثر استقرارًا وأقل عرضة للإزالة من الدورة الدموية. ومع ذلك، لم يتم الكشف عن هذه الببتيدات الغنية بالجلايسين في عينات السائل الدماغي الشوكي، مما يشير إلى أن المكتبات المنسقة مرت بخطوتي اختيار مختلفتين: واحدة في الدم وأخرى سُمح لها بالتراكم في السائل الدماغي الشوكي. تم اختبار المستنسخات المخصبة في السائل الدماغي الشوكي الناتجة عن الجولة الرابعة من الاختيار على نطاق واسع. تم التأكد من أن جميع المستنسخات التي تم اختبارها بشكل فردي تقريبًا مخصبة في السائل الدماغي الشوكي مقارنةً ببكتيريا التحكم الفارغة. تم فحص أحد الببتيدات (رقم 2077) بمزيد من التفصيل. وقد أظهرت عمر نصف بلازما أطول مقارنة بالضربات الأخرى (الشكل 3د والشكل التكميلي 7)، ومن المثير للاهتمام أن هذا الببتيد يحتوي على بقايا سيستين في الطرف الطرفي C. وقد ثبت مؤخرًا أن إضافة السيستين إلى الببتيدات يمكن أن يحسن خصائصها الدوائية الحركية عن طريق الارتباط بالألبومين 29. وهذا غير معروف حاليًا للببتيد رقم 2077 ويتطلب مزيدًا من الدراسة. أظهرت بعض الببتيدات اعتمادًا على التكافؤ في إثراء السائل الدماغي الشوكي (البيانات غير معروضة)، والتي قد تكون مرتبطة بالهندسة السطحية المعروضة لقفيصة T7. أظهر نظام T7 الذي استخدمناه 5-15 نسخة من كل ببتيد لكل جسيم فاج. تم إجراء IHC على مستنسخات فاج الرصاص المرشحة التي تم حقنها عن طريق الوريد في القشرة الدماغية للفئران (الشكل التكميلي 8). أظهرت البيانات أن ثلاثة مستنسخات على الأقل (رقم 2002 ورقم 2009 ورقم 2077) تفاعلت مع الحاجز الدموي الدماغي. ويبقى تحديد ما إذا كان تفاعل الحاجز الدموي الدماغي هذا يؤدي إلى تراكم السائل الدماغي الشوكي أو انتقال هذه المستنسخات مباشرة إلى الحاجز الدموي الدماغي. والأهم من ذلك، أننا نظهر أن الببتيدات المختارة تحتفظ بقدرتها على نقل السائل الدماغي الشوكي عند تصنيعها وارتباطها بحمولة البروتين. إن ارتباط الببتيدات البيوتينية الطرفية الأمينية بـ SA يكرر بشكل أساسي النتائج التي تم الحصول عليها مع مستنسخات البكتيريا العاثية الخاصة بها في الدم والسائل الدماغي الشوكي (الشكل 3هـ). وأخيرًا، نظهر أن الببتيد الرئيسي رقم 2077 قادر على تعزيز عمل الدماغ لمثبط الببتيد البيوتيني لـ BACE1 المقترن بـ SA، مما يسبب تأثيرات دوائية ديناميكية واضحة في الجهاز العصبي المركزي عن طريق تقليل مستويات Abeta40 بشكل كبير في السائل الدماغي الشوكي (الشكل 4). لم نتمكن من تحديد أي متماثلات في قاعدة البيانات بإجراء بحث متماثل في تسلسل الببتيد لجميع النتائج. من المهم ملاحظة أن حجم مكتبة T7 يبلغ حوالي 109، بينما يبلغ الحجم النظري للمكتبة المكونة من 12-mers 4 × 1015. لذلك، اخترنا جزءًا صغيرًا فقط من مساحة التنوع لمكتبة الببتيد المكونة من 12-mer، مما قد يعني إمكانية تحديد ببتيدات أكثر تحسينًا من خلال تقييم مساحة التسلسل المجاورة لهذه النتائج المحددة. نظريًا، قد يكون أحد أسباب عدم عثورنا على أي متماثلات طبيعية لهذه الببتيدات هو إلغاء الانتقاء أثناء التطور لمنع الدخول غير المنضبط لبعض عناصر الببتيد إلى الدماغ.
تُشكل نتائجنا مجتمعةً أساسًا لأعمال مستقبلية لتحديد وتوصيف أنظمة نقل الحاجز الدماغي الوعائي في الجسم الحي بمزيد من التفصيل. يعتمد الإعداد الأساسي لهذه الطريقة على استراتيجية اختيار وظيفي لا تقتصر على تحديد النسائل ذات خصائص ربط الأوعية الدموية الدماغية فحسب، بل تتضمن أيضًا خطوة حاسمة تتمثل في أن النسائل الناجحة تتمتع بنشاط جوهري لعبور الحواجز البيولوجية في الجسم الحي إلى حجرة الجهاز العصبي المركزي. يتمثل الهدف الرئيسي في توضيح آلية نقل هذه الببتيدات وتفضيلها للارتباط بالأوعية الدموية الدقيقة الخاصة بمنطقة الدماغ. قد يؤدي هذا إلى اكتشاف مسارات جديدة لنقل الحاجز الدماغي الوعائي والمستقبلات. نتوقع أن ترتبط الببتيدات المحددة مباشرةً بالمستقبلات الدماغية الوعائية أو بالربيطات الدائرية المنقولة عبر الحاجز الدماغي الوعائي أو حاجز السائل الدماغي الوعائي. سيتم إجراء المزيد من الدراسات على نواقل الببتيد ذات نشاط نقل السائل الدماغي الوعائي المكتشفة في هذا العمل. ندرس حاليًا خصوصية الدماغ لهذه الببتيدات من حيث قدرتها على عبور الحاجز الدموي الدماغي و/أو حاجز الأوعية الدموية المحيطي (BCSFB). ستكون هذه الببتيدات الجديدة أدوات قيّمة للغاية لاكتشاف مستقبلات أو مسارات جديدة، ولتطوير منصات جديدة عالية الكفاءة لتوصيل الجزيئات الكبيرة، مثل المواد البيولوجية، إلى الدماغ.
تم إدخال قنية في الصهريج الكبير (CM) باستخدام تعديل للطريقة الموصوفة سابقًا. تم تثبيت فئران ويستار المخدرة (200-350 جم) على جهاز تجسيمي وتم إجراء شق متوسط ​​فوق فروة الرأس المحلوقة والمُجهزة معقمًا لكشف الجمجمة. تم حفر فتحتين في منطقة الوشاح العلوي وربط مسامير التثبيت في الفتحات. تم حفر فتحة إضافية في الحافة القذالية الجانبية للتوجيه التجسيمي لقنية من الفولاذ المقاوم للصدأ في الصهريج الكبير. ضع أسمنت الأسنان حول القنية وثبتها بالبراغي. بعد المعالجة الضوئية وتصلب الأسمنت، تم إغلاق جرح الجلد بخياطة سوبراميد 4/0. يتم التأكد من الوضع الصحيح للقنية من خلال التسرب التلقائي للسائل النخاعي (CSF). أُخرج الفأر من جهاز التجسيم، وتلقَّ الرعاية المناسبة بعد الجراحة وتسكين الألم، واتركه يتعافى لمدة أسبوع على الأقل حتى تظهر علامات الدم في السائل النخاعي. تم الحصول على فئران ويستار (Crl:WI/Han) من نهر تشارلز (فرنسا). حُفظت جميع الفئران في ظروف خاصة خالية من مسببات الأمراض. حصلت جميع التجارب على الحيوانات على موافقة المكتب البيطري لمدينة بازل، سويسرا، وأُجريت وفقًا لرخصة الحيوان رقم 2474 (تقييم النقل الدماغي النشط عن طريق قياس مستويات المرشحين العلاجيين في السائل النخاعي ودماغ الفأر).
أبقِ الفأر واعيًا برفق مع إبقاء قنية CM في متناول اليد. أزل الداتورة من القنية واجمع 10 ميكرولترات من السائل النخاعي الذي يتدفق تلقائيًا. نظرًا لضعف سالكية القنية في النهاية، لم تُدرج في هذه الدراسة سوى عينات سائل نخاعي صافٍ لا يوجد بها أي دليل على تلوث الدم أو تغير لونه. بالتوازي مع ذلك، أُخذ ما يقارب 10-20 ميكرولترًا من الدم من شق صغير عند طرف الذيل في أنابيب تحتوي على الهيبارين (Sigma-Aldrich). جُمعت عينات من السائل النخاعي الشوكي والدم في أوقات مختلفة بعد الحقن الوريدي ببكتيريا T7. تم التخلص من ما يقارب 5-10 ميكرولترات من السائل قبل جمع كل عينة من السائل النخاعي الشوكي، وهو ما يُعادل الحجم الميت للقسطرة.
تم إنشاء المكتبات باستخدام متجه T7Select 10-3b كما هو موضح في دليل نظام T7Select (Novagen، Rosenberg وآخرون، InNovations 6، 1-6، 1996). باختصار، تم تصنيع إدخال عشوائي للحمض النووي مكون من 12 وحدة نمطية بالتنسيق التالي:
استُخدم كودون NNK لتجنب كودونات التوقف المزدوجة والإفراط في التعبير عن الأحماض الأمينية في الملحق. N هي نسبة مولية متساوية الخلط يدويًا لكل نيوكليوتيد، وK هي نسبة مولية متساوية الخلط يدويًا لنيوكليوتيدات الأدينين والسيتوزين. حُوِّلت المناطق أحادية السلسلة إلى DNA مزدوج السلسلة عن طريق مزيد من الحضانة مع dNTP (Novagen) وإنزيم Klenow (New England Biolabs) في محلول Klenow (New England Biolabs) لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد التفاعل، استُعيد الحمض النووي مزدوج السلسلة عن طريق ترسيب الإيثانول. هُضم الحمض النووي الناتج باستخدام إنزيمات القيد EcoRI وHindIII (كلاهما من Roche). ثم رُبط الملحق المشقوق والمُنقى (QIAquick، Qiagen) (T4 ligase، New England Biolabs) داخل الإطار في ناقل T7 مشقوق مسبقًا بعد الحمض الأميني 348 من جين القفيصة 10B. حُضنت تفاعلات الربط عند درجة حرارة ١٦ درجة مئوية لمدة ١٨ ساعة قبل التعبئة في المختبر. أُجريت تعبئة البكتيريا العاثية في المختبر وفقًا للتعليمات المرفقة مع مجموعة استنساخ T7Select 10-3b (نوفاجين)، وجرى تضخيم محلول التعبئة مرة واحدة حتى التحلل باستخدام الإشريكية القولونية (BLT5615، نوفاجين). طُردت المحاليل بالطرد المركزي، وعايرت، وجُمدت عند درجة حرارة -٨٠ درجة مئوية كمحلول احتياطي من الجلسرين.
تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر للمناطق المتغيرة للعاثيات المُضخّمة في المرق أو الطبق باستخدام بادئات اندماج 454/روش-أمبليكون الملكية. يحتوي بادئ الاندماج الأمامي على تسلسلات تُحيط بالمنطقة المتغيرة (NNK) 12 (خاصة بالقالب)، ومحول التيتانيوم GS FLX A، وتسلسل مفتاح مكتبة رباعي القواعد (TCAG) (الشكل التكميلي 1أ).
يحتوي برايمر الاندماج العكسي أيضًا على البيوتين المرتبط بخرز الالتقاط ومحول التيتانيوم GS FLX B المطلوب لتضخيم الاستنساخ أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل المستحلب:
خضعت الأمبليكونات بعد ذلك لتسلسل بايرو 454/روش وفقًا لبروتوكول 454 GS-FLX Titanium. لإجراء تسلسل سانجر اليدوي (جهاز تحليل الحمض النووي Applied Biosystems Hitachi 3730 xl)، تم تضخيم الحمض النووي لبكتيريا T7 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتسلسله باستخدام أزواج البادئات التالية:
خضعت عينات من لويحات فردية لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام مجموعة روش فاست ستارت لبوليميراز الحمض النووي (وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة). تم إجراء بدء تشغيل ساخن (10 دقائق عند 95 درجة مئوية) و35 دورة تعزيز (50 ثانية عند 95 درجة مئوية، ودقيقة واحدة عند 50 درجة مئوية، ودقيقة واحدة عند 72 درجة مئوية).
تم تضخيم البكتيريا العاثية من المكتبات، أو البكتيريا العاثية البرية، أو البكتيريا العاثية المُستعادة من السائل الدماغي الشوكي والدم، أو النسخ الفردية في مرق بكتيريا الإشريكية القولونية BL5615 (Sigma Aldrich) أو في أطباق بمساحة 500 سم2 (Thermo Scientific) لمدة 4 ساعات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. استُخلصت البكتيريا العاثية من الأطباق بغسلها بمحلول Tris-EDTA (Fluka Analytical) أو بجمع اللويحات باستخدام رؤوس ماصة معقمة. عُزلت البكتيريا العاثية من سائل الاستزراع العلوي أو محلول الاستخلاص باستخدام دورة واحدة من ترسيب البولي إيثيلين جلايكول (PEG 8000) (Promega)، وأُعيد تعليقها في محلول Tris-EDTA.
أُخضعت البكتيريا العاثية المُضخّمة لجولتين أو ثلاث دورات من إزالة السموم الداخلية باستخدام حبيبات إزالة السموم الداخلية (ميلتيني بيوتيك) قبل الحقن الوريدي (500 ميكرولتر/حيوان). في الجولة الأولى، أُدخلت 2×1012 من البكتيريا العاثية؛ وفي الثانية، 2×1010 من البكتيريا العاثية؛ وفي جولتي الاختيار الثالثة والرابعة، 2×109 من البكتيريا العاثية لكل حيوان. حُدد محتوى البكتيريا العاثية في عينات السائل الدماغي الشوكي والدم المأخوذة في الأوقات المحددة عن طريق عدّ اللويحات وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (دليل نظام T7Select). تم إجراء انتقاء البكتيريا عن طريق الحقن الوريدي للمكتبات النقية في الوريد الذيلي أو عن طريق إعادة حقن البكتيريا المستخرجة من السائل النخاعي من جولة الاختيار السابقة، وأُجريت عمليات الحصاد اللاحقة عند 10 دقائق و30 دقيقة و60 دقيقة و90 دقيقة و120 دقيقة و180 دقيقة و240 دقيقة على التوالي لعينات السائل النخاعي والدم. أُجريت أربع جولات من التنقية داخل الجسم الحي، حيث تم تخزين الفرعين المختارين وتحليلهما بشكل منفصل خلال الجولات الثلاث الأولى من الانتقاء. خضعت جميع إدخالات البكتيريا المستخرجة من السائل النخاعي من الجولتين الأوليين من الانتقاء لتسلسل البايرو 454/روش، بينما تم تسلسل جميع المستنسخات المستخرجة من السائل النخاعي من الجولتين الأخيرتين من الانتقاء يدويًا. كما خضعت جميع البكتيريا المستخرجة من الدم من الجولة الأولى من الانتقاء لتسلسل البايرو 454/روش. لحقن مستنسخات العاثيات، تم تضخيم مستنسخات مختارة في بكتيريا الإشريكية القولونية (BL5615) على أطباق بمساحة 500 سم2 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. تم إكثار المستنسخات المختارة والمتسلسلة يدويًا في وسط TB. بعد استخلاص العاثيات وتنقيتها وإزالة الذيفان الداخلي (كما هو موضح سابقًا)، تم حقن 2 × 1010 من العاثيات/حيوان في 300 ميكرولتر عن طريق الوريد في أحد أوردة الذيل.
المعالجة المسبقة والترشيح النوعي لبيانات التسلسل. حُوِّلت بيانات 454/Roche الخام من صيغة خريطة التدفق القياسية الثنائية (sff) إلى صيغة بيرسون سهلة القراءة (fasta) باستخدام برنامج من الشركة المُورِّدة. أُجريت معالجة إضافية لتسلسل النوكليوتيدات باستخدام برامج ونصوص C خاصة (حزمة برامج غير منشورة) كما هو موضح أدناه. يتضمن تحليل البيانات الأولية إجراءات ترشيح دقيقة متعددة المراحل. لتصفية القراءات التي لا تحتوي على تسلسل DNA صالح لإدراج 12 مر، تمت محاذاة القراءات تسلسليًا مع وسم البداية (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT)، وسم التوقف (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA)، وسم الخلفية (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) باستخدام اختبار نيدلمان-ونش العالمي. تسمح المحاذاة بحد أقصى تناقضين لكل محاذاة31. لذلك، تمت إزالة القراءات بدون علامات البداية والتوقف والقراءات التي تحتوي على إدراجات خلفية، أي المحاذاة التي تتجاوز العدد المسموح به من عدم التطابق، من المكتبة. أما بالنسبة للقراءات المتبقية، فقد تم استئصال تسلسل الحمض النووي N-mer الممتد من علامة البداية وينتهي قبل علامة التوقف من تسلسل القراءة الأصلي ومعالجته بشكل أكبر (يشار إليه فيما يلي باسم "الإدراج"). بعد ترجمة الإدراج، تتم إزالة الجزء بعد كودون التوقف الأول في الطرف 5' من البادئ من الإدراج. بالإضافة إلى ذلك، تمت إزالة النيوكليوتيدات المؤدية إلى كودونات غير مكتملة في الطرف 3' من البادئ أيضًا. لاستبعاد الإدراجات التي تحتوي فقط على تسلسلات الخلفية، تمت أيضًا إزالة الإدراجات المترجمة التي تبدأ بنمط الأحماض الأمينية "PAG". تمت إزالة الببتيدات ذات طول ما بعد الترجمة أقل من 3 أحماض أمينية من المكتبة. أخيرًا، قم بإزالة التكرار في مجموعة الإدراجات وحدد تردد كل إدراج فريد. وتضمنت نتائج هذا التحليل قائمة بتسلسلات النوكليوتيدات (الملحقات) وتردداتها (القراءة) (الأشكال التكميلية 1ج و2).
إدخالات مجموعة N-mer DNA حسب تشابه التسلسل: للتخلص من أخطاء التسلسل الخاصة بـ 454/Roche (مثل مشاكل امتدادات البوليمر المتجانس التسلسلي) وإزالة التكرارات الأقل أهمية، يتم فرز إدخالات تسلسل DNA N-mer التي تمت تصفيتها مسبقًا (الإدخالات) حسب التشابه. الإدخالات (يُسمح بما يصل إلى قاعدتين غير متطابقتين) باستخدام خوارزمية تكرارية محددة على النحو التالي: يتم فرز الإدخالات أولاً حسب ترددها (من الأعلى إلى الأدنى)، وإذا كانت متماثلة، حسب فرزها الثانوي حسب الطول (من الأطول إلى الأقصر). وبالتالي، فإن الإدخالات الأكثر تكرارًا والأطول تحدد "المجموعة" الأولى. يتم ضبط تردد المجموعة على التردد الرئيسي. بعد ذلك، تمت محاولة إضافة كل إدخال متبقٍ في القائمة المرتبة إلى المجموعة عن طريق محاذاة نيدلمان-ونش الزوجية. إذا لم يتجاوز عدد حالات عدم التطابق أو الإدخالات أو الحذف في محاذاة ما عتبة 2، تتم إضافة إدخال إلى المجموعة، ويزداد التردد الإجمالي للمجموعة بمقدار تكرار إضافة الإدخال. يتم وضع علامة على الإدخالات المضافة إلى مجموعة على أنها مستخدمة ويتم استبعادها من المعالجة الإضافية. إذا تعذر إضافة تسلسل الإدخال إلى مجموعة موجودة بالفعل، يتم استخدام تسلسل الإدخال لإنشاء مجموعة جديدة بتردد الإدخال المناسب ويتم وضع علامة على أنه مستخدم. تنتهي التكرار عندما يتم استخدام كل تسلسل إدخال لتكوين مجموعة جديدة أو يمكن تضمينه في مجموعة موجودة بالفعل. بعد كل شيء، يتم في النهاية ترجمة الإدخالات المجمعة المكونة من النيوكليوتيدات إلى تسلسلات ببتيد (مكتبات الببتيد). نتيجة هذا التحليل هي مجموعة من الإدخالات وتردداتها المقابلة التي تشكل عدد القراءات المتتالية (الشكل التكميلي 2).
توليد الأنماط: بناءً على قائمة ببتيدات فريدة، أُنشئت مكتبة تحتوي على جميع أنماط الأحماض الأمينية (aa) الممكنة كما هو موضح أدناه. استُخرج كل نمط ممكن بطول 3 من الببتيد، وأُضيف نمطه العكسي مع مكتبة أنماط مشتركة تحتوي على جميع الأنماط (ثلاثيات الببتيدات). تسلسلت مكتبات الأنماط المتكررة للغاية، وأُزيل التكرار. بعد ذلك، تحققنا من وجود كل ثلاثي ببتيد في مكتبة الأنماط باستخدام أدوات حاسوبية. في هذه الحالة، أُضيف تردد الببتيد الذي يحتوي على ثلاثي ببتيد النمط الموجود، وعُيّن للنمط في مكتبة الأنماط ("عدد الأنماط"). تكون نتيجة توليد الأنماط مصفوفة ثنائية الأبعاد تحتوي على جميع تكرارات ثلاثي الببتيدات (الأنماط) وقيمها المقابلة، وهي عدد قراءات التسلسل التي تُنتج النمط المقابل عند تصفية القراءات وتجميعها وترجمتها. المقاييس كما هو موضح بالتفصيل أعلاه.
تطبيع عدد الزخارف ومخططات التشتت المقابلة: تم تطبيع عدد الزخارف لكل عينة باستخدام
حيث ni هو عدد القراءات التي تحتوي على الموضوع i. وبالتالي، يمثل vi النسبة المئوية لتكرار القراءات (أو الببتيدات) التي تحتوي على الدافع i في العينة. حُسبت القيم الاحتمالية لعدد الدوافع غير المُوَحَّد باستخدام اختبار فيشر الدقيق. أما بالنسبة لمخططات الارتباط لعدد الدوافع، فقد حُسبت معاملات ارتباط سبيرمان باستخدام عدد الدوافع المُوَحَّد مع R.
لتصور محتوى الأحماض الأمينية في كل موضع من مكتبة الببتيدات، أُنشئت مخططات الويب 32 و33 (http://weblogo.threeplusone.com). أولًا، خُزّن محتوى الأحماض الأمينية في كل موضع من الببتيد ذي الـ 12 وحدة في مصفوفة 20×12. بعد ذلك، وُلدّت مجموعة من 1000 ببتيد تحتوي على نفس محتوى الأحماض الأمينية النسبي في كل موضع بتنسيق fasta-sequence، وأُدخلت كمدخل إلى مخطط الويب 3، الذي يُنشئ تمثيلًا بيانيًا لمحتوى الأحماض الأمينية النسبي في كل موضع لمكتبة ببتيدات مُحددة. لتصور مجموعات البيانات متعددة الأبعاد، أُنشئت خرائط حرارية باستخدام أداة مُطوّرة داخليًا في R (biosHeatmap، وهي حزمة R لم تُصدر بعد). حُسبت المخططات الشجرية المُمثلة في الخرائط الحرارية باستخدام طريقة التجميع الهرمي لـ Ward مع مقياس المسافة الإقليدية. للتحليل الإحصائي لبيانات تقييم الزخارف، حُسبت قيم P للتقييم غير المُوَحَّد باستخدام اختبار فيشر الدقيق. حُسبت قيم P لمجموعات البيانات الأخرى في R باستخدام اختبار t للطلاب أو تحليل التباين ANOVA.
حُقنت مستنسخات عاثية مختارة، وعاثيات بدون إضافات، وريديًا عبر وريد الذيل (2 × 1010 عاثية/حيوان في 300 ميكرولتر من محلول الفوسفات المدعم بالفوسفات (PBS)). قبل عشر دقائق من عملية التروية والتثبيت اللاحق، حُقنت الحيوانات نفسها وريديًا بـ 100 ميكرولتر من الليكتين المُعَلَّم بـ DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). بعد 60 دقيقة من حقن العاثية، حُقنت الفئران عبر القلب بـ 50 مل من محلول الفوسفات المدعم بالفوسفات (PBS)، ثم بـ 50 مل من محلول فوسفات ثنائي فلورايد/فوسفات ثنائي فوسفات (PBS) بتركيز 4%. ثُبّتت عينات الدماغ أيضًا طوال الليل في محلول فوسفات ثنائي فلورايد/فوسفات ثنائي فوسفات (PBS) بتركيز 4%، ثم نقعت في محلول سكروز بتركيز 30% طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. جُمِّدت العينات بسرعة في خليط التصوير المقطعي البصري (OCT). أُجري تحليل مناعي كيميائي للعينات المجمدة في درجة حرارة الغرفة على مقاطع تجميدية بحجم 30 ميكرومترًا، محجوبة بـ 1% من بلازما الدم البقري، وحُضنت بأجسام مضادة متعددة النسائل مُعَلَّمة بـ FITC ضد بكتيريا T7 (Novus NB 600-376A) عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. حُضنت طوال الليل. أخيرًا، غُسلت المقاطع ثلاث مرات باستخدام محلول فوسفات الصوديوم (PBS)، وفُحصت بمجهر ليزري متحد البؤر (Leica TCS SP5).
تم تصنيع جميع الببتيدات ذات نقاء لا يقل عن 98% بواسطة شركة جين سكريبت الأمريكية، ثم تم بيوتينيلها وتجفيفها بالتجميد. يرتبط البيوتين عبر فاصل جليسين ثلاثي إضافي عند الطرف الأميني. افحص جميع الببتيدات باستخدام مطياف الكتلة.
خُلط ستربتافيدين (سيجما S0677) بكمية مولية متساوية خمسة أضعاف من الببتيد البيوتيني، أو الببتيد المثبط لإنزيم BACE1 البيوتيني، أو مزيج (بنسبة 3:1) من الببتيد المثبط لإنزيم BACE1 البيوتيني والببتيد المثبط لإنزيم BACE1 في محلول ثنائي ميثيل سلفوكسيد بتركيز 5-10%، وحُضّن في محلول فوسفات الصوديوم المدعم (PBS). قبل الحقن بساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. حُقنت الببتيدات المقترنة بالستربتافيدين عن طريق الوريد بجرعة 10 ملغ/كغ في أحد أوردة ذيل الفئران ذات التجويف الدماغي.
تم تقييم تركيز معقدات الستربتافيدين-الببتيد باستخدام اختبار ELISA. طُلِيَت ألواح Nunc Maxisorp microtiter (Sigma) طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بجسم مضاد للستربتافيدين الفأري بتركيز 1.5 ميكروغرام/مل (Thermo, MA1-20011). بعد الحجب (محلول عازل: 140 نانومولار كلوريد الصوديوم، 5 مليمولار EDTA، 0.05% NP40، 0.25% جيلاتين، 1% BSA) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين، ثم غسل الألواح بـ 0.05% Tween-20/PBS (محلول عازل) لمدة 3 ثوانٍ. أُضيفت عينات السائل الدماغي الشوكي والبلازما إلى آبار مُخففة بمحلول عازل (بلازما 1:10,000، سائل دماغي 1:115). حُضِّنت اللوحة بعد ذلك طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع جسم مضاد للكشف (1 ميكروغرام/مل، مضاد للستربتافيدين-HRP، نوفوس NB120-7239). بعد ثلاث خطوات غسل، كُشِفَ عن الستربتافيدين بالحضانة في محلول ركيزة TMB (روش) لمدة تصل إلى 20 دقيقة. بعد إيقاف ظهور اللون باستخدام 1 مول من محلول H2SO4، قِس الامتصاصية عند طول موجي 450 نانومتر.
تم تقييم وظيفة معقد مثبط الستربتافيدين-الببتيد-BACE1 باستخدام اختبار ELISA لـ Aβ(1-40) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (Wako, 294-64701). باختصار، خُفِّفت عينات السائل الدماغي الشوكي في مخفف قياسي (1:23) وحُضِّنت طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في أطباق ذات 96 بئرًا مطلية بجسم مضاد BNT77. بعد خمس خطوات غسل، أُضيف الجسم المضاد BA27 المقترن بـ HRP وحُضِّن لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، متبوعة بخمس خطوات غسل. تم الكشف عن Aβ(1-40) عن طريق الحضانة في محلول TMB لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إيقاف تطور اللون باستخدام محلول التوقف، قِس الامتصاصية عند طول موجي 450 نانومتر. خضعت عينات البلازما لاستخلاص الطور الصلب قبل اختبار ELISA لـ Aβ(1-40). أُضيفت البلازما إلى محلول 0.2% DEA (سيجما) في أطباق ذات 96 بئرًا، وحُضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد غسل أطباق SPE (Oasis، 186000679) بالماء وميثانول 100%، أُضيفت عينات البلازما إلى أطباق SPE وأُزيل السائل بالكامل. غُسلت العينات (أولًا بميثانول 5% ثم ميثانول 30%) واستُخرجت باستخدام 2% NH4OH/90% ميثانول. بعد تجفيف المُستَخلَص عند درجة حرارة 55 درجة مئوية لمدة 99 دقيقة مع تيار نيتروجين ثابت، خُفِّضت العينات في مخففات قياسية، وقيست Aβ(1–40) كما هو موضح أعلاه.
كيفية الاستشهاد بهذه المقالة: يوريش، إي. وآخرون. نقل الشحنات إلى الدماغ باستخدام ببتيدات النقل المُحددة في الجسم الحي. مجلة العلوم، المجلد 5، العدد 14104؛ doi:10.1038/srep14104 (2015).
ليخوتا ج.، سكيورينغ ت.، تومسن إل بي، وموس ت. إيصال الأدوية الجزيئية الكبيرة إلى الدماغ باستخدام العلاج الموجه. مجلة الكيمياء العصبية 113، 1-13، 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
براسنجيفيتش، آي.، شتاينبوش، إتش. دبليو.، شميتز، سي.، ومارتينيز-مارتينيز، بي. توصيل أدوية الببتيد والبروتين عبر الحاجز الدموي الدماغي. مجلة بروغ نيوروبيول 87، 212-251، 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
باردريج، دبليو إم. حاجز الدم الدماغي: عقبة في تطوير أدوية الدماغ. NeuroRx 2، 3-14، 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
جوهانسون، كيه إي، ودنكان، جيه إيه، وستوبا، إي جي، وبيرد، أ. آفاق تحسين توصيل الأدوية واستهدافها إلى الدماغ عبر مسار الضفيرة المشيمية-السائل الدماغي الشوكي. مجلة البحوث الصيدلانية 22، 1011-1037، 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
باردريج، دبليو إم. تحديث المستحضرات الصيدلانية الحيوية باستخدام أحصنة طروادة الجزيئية لتوصيل الدواء إلى الدماغ. مجلة الكيمياء الحيوية 19، 1327-1338، 10.1021/bc800148t (2008).
باردريج، نقل الببتيد بوساطة مستقبلات WM عبر الحاجز الدموي الدماغي. مراجعة الغدد الصماء 7، 314-330 (1986).
نيووهنر، ج. وآخرون. زيادة اختراق الدماغ وفعالية الأجسام المضادة العلاجية باستخدام مكوكات جزيئية أحادية التكافؤ. نيورون 81، 49-60، 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
بين-لي، ن. وآخرون. نقل مستقبلات الترانسفيرين (TfR) يُحدد امتصاص الدماغ لمتغيرات الألفة لأجسام مضادة لمستقبلات الترانسفيرين. مجلة الطب التجريبي 211، 233-244، 10.1084/jem.20131660 (2014).