نشكرك على زيارة موقع Nature.com. أنت تستخدم متصفحًا يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). بالإضافة إلى ذلك، ولضمان استمرار الدعم، نعرض الموقع بدون أنماط CSS وجافا سكريبت.
يعرض شريطًا دائريًا من ثلاث شرائح في وقت واحد. استخدم زري "السابق" و"التالي" للتنقل بين الشرائح الثلاث في كل مرة، أو استخدم أزرار التمرير في النهاية للتنقل بين الشرائح الثلاث في كل مرة.
يمنع الحاجز الدموي الدماغي وصول العوامل العلاجية الحيوية إلى أهدافها في الجهاز العصبي المركزي، مما يعيق العلاج الفعال للأمراض العصبية. لاكتشاف نواقل دماغية جديدة في الجسم الحي، استخدمنا مكتبة ببتيدات عاثية T7، وجمعنا عينات متسلسلة من الدم والسائل النخاعي الشوكي باستخدام نموذج الفئران الواعية ذات الحوض الكبير المزود بقنية. وقد لوحظ إثراء عالٍ لسلالات عاثية محددة في السائل النخاعي الشوكي بعد أربع جولات من الانتقاء. وكشف اختبار الببتيدات المرشحة الفردية عن زيادة في تركيزها في السائل النخاعي الشوكي بأكثر من 1000 ضعف. تم تأكيد الفعالية الحيوية لتوصيل الببتيدات إلى الدماغ من خلال انخفاض بنسبة 40% في مستوى بروتين بيتا النشواني في السائل النخاعي الشوكي باستخدام مثبط ببتيدي لإنزيم BACE1 مرتبط بالببتيد الناقل الجديد الذي تم تحديده. تشير هذه النتائج إلى أن الببتيدات التي تم تحديدها بواسطة طرق انتقاء العاثيات في الجسم الحي قد تكون نواقل مفيدة للتوصيل الجهازي للجزيئات الكبيرة إلى الدماغ بتأثير علاجي.
ركزت أبحاث العلاج الموجه للجهاز العصبي المركزي بشكل كبير على تحديد الأدوية والعوامل المُحسّنة التي تُظهر خصائص استهداف الجهاز العصبي المركزي، مع بذل جهد أقل في اكتشاف الآليات التي تُحفز توصيل الأدوية الفعال إلى الدماغ. بدأ هذا الوضع بالتغير الآن، حيث أصبح توصيل الأدوية، وخاصة الجزيئات الكبيرة، جزءًا لا يتجزأ من تطوير أدوية علم الأعصاب الحديثة. يُحمي الجهاز العصبي المركزي بشكل جيد بواسطة نظام الحاجز الوعائي الدماغي، الذي يتكون من الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ​​والحاجز الدموي الدماغي السائل (BCBB)¹، مما يجعل توصيل الأدوية إلى الدماغ أمرًا صعبًا^1،2. تشير التقديرات إلى أن جميع الأدوية ذات الجزيئات الكبيرة تقريبًا وأكثر من 98% من الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة تُزال من الدماغ³. لذلك، من المهم جدًا تحديد أنظمة نقل دماغية جديدة تُوفر توصيلًا فعالًا ومحددًا للأدوية العلاجية إلى الجهاز العصبي المركزي^4،5. ومع ذلك، يُمثل الحاجز الدموي الدماغي والحاجز الدموي الدماغي السائل أيضًا فرصة ممتازة لتوصيل الأدوية، حيث يخترقان جميع تراكيب الدماغ ويدخلانها عبر شبكته الوعائية الواسعة. لذا، تعتمد الجهود الحالية لاستخدام طرق غير جراحية لإيصال الأدوية إلى الدماغ بشكل كبير على آلية النقل بوساطة المستقبلات (PMT) باستخدام مستقبل BBB6 الداخلي. وعلى الرغم من التطورات الرئيسية الأخيرة باستخدام مسار مستقبل الترانسفيرين^7،8، إلا أن هناك حاجة إلى مزيد من تطوير أنظمة إيصال جديدة ذات خصائص محسّنة. ولتحقيق هذه الغاية، كان هدفنا هو تحديد الببتيدات القادرة على نقل الأدوية إلى السائل النخاعي، حيث يمكن من حيث المبدأ استخدامها لإيصال الجزيئات الكبيرة إلى الجهاز العصبي المركزي أو لفتح مسارات مستقبلات جديدة. وعلى وجه الخصوص، يمكن أن تكون مستقبلات ونواقل محددة في الجهاز الوعائي الدماغي (BBB وBSCFB) بمثابة أهداف محتملة للإيصال النشط والمحدد للأدوية البيولوجية. يُعد السائل النخاعي نتاجًا إفرازيًا للضفيرة المشيمية، وهو على اتصال مباشر بالسائل الخلالي للدماغ عبر الحيز تحت العنكبوتية والحيز البطيني⁴. أظهرت الدراسات الحديثة أن السائل النخاعي الشوكي تحت العنكبوتية ينتشر بشكل مفرط في النسيج الخلالي للدماغ.⁹ ونأمل في الوصول إلى الحيز الدماغي باستخدام مسار التدفق تحت العنكبوتية هذا أو مباشرةً عبر الحاجز الدموي الدماغي. ولتحقيق ذلك، طبقنا استراتيجية فعالة لاختيار العاثيات في الجسم الحي، والتي تُحدد بشكل مثالي الببتيدات المنقولة عبر أي من هذين المسارين المتميزين.
نصف الآن طريقة فحص متسلسلة لعرض العاثيات في الجسم الحي، مع أخذ عينات من السائل النخاعي الشوكي، مقترنة بتقنية التسلسل عالي الإنتاجية (HTS) لمراقبة جولات الاختيار الأولية ذات التنوع الأعلى في المكتبة. أُجري الفحص على فئران واعية مزودة بقنية صهريجية كبيرة مزروعة بشكل دائم لتجنب تلوث الدم. ومن المهم أن هذه الطريقة تختار كلاً من الببتيدات التي تستهدف الدماغ والببتيدات ذات النشاط النقل عبر الحاجز الوعائي الدماغي. استخدمنا عاثيات T7 نظرًا لصغر حجمها (حوالي 60 نانومترًا)¹⁰، واقترحنا أنها مناسبة لنقل الحويصلات التي تسمح بالعبور الخلوي للحاجز البطاني و/أو الحاجز الظهاري النخاعي. بعد أربع جولات من الفرز، تم عزل مجموعات من العاثيات التي أظهرت إثراءً قويًا في السائل النخاعي الشوكي في الجسم الحي وارتباطًا بالأوعية الدموية الدقيقة الدماغية. الأهم من ذلك، تمكّنا من تأكيد نتائجنا من خلال إثبات قدرة أفضل الببتيدات المرشحة، المُصنّعة كيميائيًا، على نقل البروتينات إلى السائل النخاعي. في البداية، تمّ تحديد التأثيرات الدوائية للجهاز العصبي المركزي من خلال دمج ببتيد عبور رائد مع مُثبّط لببتيد BACE1. إضافةً إلى إثبات قدرة استراتيجيات الفحص الوظيفي الحيوي على تحديد ببتيدات نقل دماغية جديدة كناقلات فعّالة للبروتينات، نتوقع أن تُصبح مناهج الاختيار الوظيفي المماثلة ذات أهمية في تحديد مسارات نقل دماغية جديدة.
استنادًا إلى وحدات تكوين اللويحات (PFU)، وبعد خطوة تغليف العاثيات، تم تصميم وإنشاء مكتبة من ببتيدات عاثيات T7 خطية عشوائية مكونة من 12 حمضًا أمينيًا، بتنوع يقارب 109 (انظر قسم المواد والطرائق). تجدر الإشارة إلى أننا قمنا بتحليل هذه المكتبة بدقة قبل عملية الفرز الحيوي. أدى تضخيم عينات مكتبة العاثيات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام بادئات معدلة إلى إنتاج نواتج تضخيم قابلة للتطبيق مباشرة على تقنية التسلسل عالي الإنتاجية (HTS) (الشكل التكميلي 1أ). نظرًا لـ: أ) أخطاء التسلسل في HTS11، ب) تأثير ذلك على جودة البادئات (NNK)1-12، ج) وجود عاثيات من النوع البري (wt) (إدخالات هيكلية) في المكتبة الاحتياطية، تم تطبيق إجراء ترشيح للتسلسل لاستخراج معلومات التسلسل المُتحقق منها فقط (الشكل التكميلي 1ب). تنطبق خطوات الترشيح هذه على جميع مكتبات تسلسل HTS. بالنسبة للمكتبة القياسية، تم الحصول على 233,868 قراءة، اجتاز 39% منها معايير الترشيح واستُخدمت لتحليل المكتبة واختيار القراءات للجولات اللاحقة (الشكل التكميلي 1ج-هـ). كانت معظم القراءات مضاعفات لثلاثة أزواج قاعدية، مع ذروة عند 36 نيوكليوتيدًا (الشكل التكميلي 1ج)، مما يؤكد تصميم المكتبة (NNK) 1-12. والجدير بالذكر أن حوالي 11% من عناصر المكتبة احتوت على إدخال PAGISRELVDKL ذي 12 بُعدًا من النوع البري (wt)، واحتوى ما يقرب من نصف التسلسلات (49%) على إضافات أو حذف. أكد فحص التسلسل عالي الإنتاجية (HTS) للمكتبة التنوع الكبير للببتيدات فيها: فقد وُجد أكثر من 81% من تسلسلات الببتيد مرة واحدة فقط، بينما وُجد 1.5% فقط في 4 نسخ أو أكثر (الشكل التكميلي 2أ). تطابقت ترددات الأحماض الأمينية في جميع المواقع الاثني عشر في المجموعة بشكل جيد مع الترددات المتوقعة لعدد الكودونات الناتجة عن مجموعة NKK المتدهورة (الشكل التكميلي 2ب). كما تطابق التردد الملاحظ لبقايا الأحماض الأمينية المشفرة بواسطة هذه الإضافات بشكل جيد مع التردد المحسوب (r = 0.893) (الشكل التكميلي 2ج). يتضمن تحضير مكتبات العاثيات للحقن خطوات التضخيم وإزالة السموم الداخلية. وقد ثبت سابقًا أن هذا قد يقلل من تنوع مكتبات العاثيات^12،13. لذلك، قمنا بتسلسل مكتبة عاثيات مُضخمة على صفيحة بعد إزالة السموم الداخلية، وقارناها بالمكتبة الأصلية لتقدير تردد الأحماض الأمينية. لوحظ ارتباط قوي (r = 0.995) بين المجموعة الأصلية والمجموعة المُضخّمة والمُنقّاة (الشكل التكميلي 2د)، مما يشير إلى أن التنافس بين المستنسخات المُضخّمة على الأطباق باستخدام عاثيات T7 لم يُسبب تحيزًا كبيرًا. تستند هذه المقارنة إلى تردد أنماط الببتيد الثلاثي في ​​كل مكتبة، نظرًا لأن تنوع المكتبات (~109) لا يمكن رصده بالكامل حتى مع تقنية التسلسل عالي الإنتاجية. كشف تحليل تردد الأحماض الأمينية في كل موقع عن تحيز طفيف يعتمد على الموقع في المواقع الثلاثة الأخيرة من المجموعة المُدخلة (الشكل التكميلي 2هـ). في الختام، خلصنا إلى أن جودة المكتبة وتنوعها كانا مقبولين، ولم تُلاحظ سوى تغييرات طفيفة في التنوع نتيجة لتضخيم وإعداد مكتبات العاثيات بين جولات الانتقاء المتعددة.
يمكن إجراء أخذ عينات متسلسلة من السائل النخاعي الشوكي عن طريق زرع قنية جراحيًا في مركز الدماغ لدى الفئران الواعية لتسهيل تحديد عاثيات T7 المحقونة وريديًا عبر الحاجز الدموي الدماغي و/أو الحاجز الدموي النخاعي الشوكي (الشكل 1أ-ب). استخدمنا مسارين مستقلين للاختيار (المساران أ و ب) في الجولات الثلاث الأولى من الاختيار الحيوي (الشكل 1ج). زدنا تدريجيًا من دقة الاختيار عن طريق تقليل الكمية الإجمالية للعاثيات المُدخلة في الجولات الثلاث الأولى. في الجولة الرابعة من الفرز، جمعنا عينات من المسارين أ و ب وأجرينا ثلاث عمليات اختيار مستقلة إضافية. لدراسة خصائص جزيئات عاثيات T7 في هذا النموذج الحيوي، حُقنت عاثيات من النوع البري (PAGISRELVDKL master insert) في الفئران عبر الوريد الذنبي. أظهر استخلاص العاثيات من السائل النخاعي والدم في أوقات مختلفة أن عاثيات T7 ذات الشكل العشرين سطحي الصغيرة نسبيًا تتميز بمرحلة تصفية أولية سريعة من حجرة الدم (الشكل التكميلي 3). بناءً على العيارات المُعطاة وحجم دم الفئران، حسبنا أنه تم الكشف عن حوالي 1% فقط من وزن العاثيات من الجرعة المُعطاة في الدم بعد 10 دقائق من الحقن الوريدي. بعد هذا الانخفاض الأولي السريع، تم قياس تصفية أولية أبطأ بنصف عمر يبلغ 27.7 دقيقة. من المهم ذكره أنه تم استخلاص عدد قليل جدًا من العاثيات من حجرة السائل النخاعي، مما يشير إلى انخفاض مستوى هجرة العاثيات من النوع البري إلى حجرة السائل النخاعي (الشكل التكميلي 3). في المتوسط، تم الكشف عن حوالي 1 × 10⁻³% فقط من عيارات عاثيات T7 في الدم و4 × 10⁻⁸% من العاثيات المحقونة في البداية في السائل النخاعي خلال فترة أخذ العينات بأكملها (0-250 دقيقة). تجدر الإشارة إلى أن نصف عمر العاثية البرية (25.7 دقيقة) في السائل النخاعي كان مماثلاً لما لوحظ في الدم. تُظهر هذه البيانات أن الحاجز الفاصل بين حيز السائل النخاعي والدم سليم في الفئران المُزودة بقنية في السائل النخاعي، مما يسمح بالاختيار الحيوي لمكتبات العاثيات لتحديد السلالات التي تنتقل بسهولة من الدم إلى حيز السائل النخاعي.
(أ) إعداد طريقة لإعادة أخذ عينات من السائل النخاعي الشوكي من مجموعة كبيرة. (ب) رسم تخطيطي يوضح الموقع الخلوي لحاجز الجهاز العصبي المركزي واستراتيجية الاختيار المستخدمة لتحديد الببتيدات التي تعبر الحاجز الدموي الدماغي. (ج) مخطط انسيابي لفحص عرض العاثيات في الجسم الحي. في كل جولة من جولات الاختيار، تم حقن العاثيات (معرفات الحيوانات داخل الأسهم) وريديًا. تم الاحتفاظ بفرعين بديلين مستقلين (أ، ب) بشكل منفصل حتى الجولة الرابعة من الاختيار. بالنسبة لجولتي الاختيار الثالثة والرابعة، تم تسلسل كل مستنسخ عاثي مستخلص من السائل النخاعي الشوكي يدويًا. (د) حركية العاثيات المعزولة من الدم (الدوائر الحمراء) والسائل النخاعي الشوكي (المثلثات الخضراء) خلال الجولة الأولى من الاختيار في فأرين مزودين بقنية بعد الحقن الوريدي لمكتبة ببتيدات T7 (2 × 10¹² عاثية/حيوان). تشير المربعات الزرقاء إلى متوسط ​​التركيز الأولي للفيروسات في الدم، محسوبًا من كمية الفيروسات المحقونة، مع مراعاة حجم الدم الكلي. وتشير المربعات السوداء إلى نقطة تقاطع الخط الصادي المستنبط من تركيزات الفيروسات في الدم. (هـ، و) يعرضان التردد النسبي وتوزيع جميع أنماط الببتيد الثلاثي المتداخلة الممكنة الموجودة في الببتيد. ويظهر عدد الأنماط الموجودة في 1000 قراءة. وتُحدد الأنماط المُثرية بشكل ملحوظ (قيمة الاحتمال < 0.001) بنقاط حمراء. (هـ) مخطط التشتت الارتباطي الذي يقارن التردد النسبي لنمط الببتيد الثلاثي للمكتبة المحقونة مع الفيروسات المشتقة من دم الحيوانات رقم 1.1 و1.2. (و) مخطط التشتت الارتباطي الذي يقارن الترددات النسبية لأنماط الببتيد الثلاثي للفيروسات الحيوانية رقم 1.1 و1.2 المعزولة في الدم والسائل النخاعي. (g، h) تمثيل تسلسل الحمض النووي للفيروسات المُخصبة في الدم (g) مقابل المكتبات المحقونة، والفيروسات المُخصبة في السائل النخاعي الشوكي (h) مقابل الدم بعد جولة من الانتقاء الحيوي في كلا الحيوانين. يشير طول الرمز المكون من حرف واحد إلى مدى تكرار الحمض الأميني في ذلك الموضع. الأخضر = أحماض أمينية قطبية، البنفسجي = أحماض أمينية متعادلة، الأزرق = أحماض أمينية قاعدية، الأحمر = أحماض أمينية حمضية، والأسود = أحماض أمينية كارهة للماء. صُمم الشكلان 1أ و1ب وأُنتجا بواسطة إدوارد أوريش.
حقنّا مكتبة ببتيدات العاثيات في فأرين من سلالة CM (المجموعتين A وB)، وعزلنا العاثيات من السائل النخاعي والدم (الشكل 1د). كان التخلص السريع الأولي من المكتبة أقل وضوحًا مقارنةً بالعاثيات البرية. بلغ متوسط ​​عمر النصف للمكتبة المحقونة في كلا الحيوانين 24.8 دقيقة في الدم، وهو مشابه للعاثيات البرية، و38.5 دقيقة في السائل النخاعي. خضعت عينات العاثيات من الدم والسائل النخاعي لكل حيوان لتحليل التسلسل عالي الإنتاجية، وتم تحليل جميع الببتيدات المُحددة للكشف عن وجود وحدة ثلاثية الببتيد قصيرة. تم اختيار وحدات ثلاثية الببتيد لأنها تُوفر أساسًا بسيطًا لتكوين البنية وتفاعلات الببتيد مع البروتين^14،15. وجدنا ارتباطًا جيدًا في توزيع الوحدات بين مكتبة العاثيات المحقونة والمستنسخات المستخلصة من دم كلا الحيوانين (الشكل 1هـ). تشير البيانات إلى أن تركيب المكتبة مُخصب بشكل طفيف فقط في حجرة الدم. تم تحليل ترددات الأحماض الأمينية وتسلسلات التوافق بشكل إضافي في كل موقع باستخدام نسخة معدلة من برنامج Weblogo16. ومن المثير للاهتمام، أننا وجدنا إثراءً قويًا في بقايا الجليسين في الدم (الشكل 1g). عند مقارنة الدم مع المستنسخات المختارة من السائل النخاعي، لوحظ اختيار قوي وبعض الاستبعاد للزخارف (الشكل 1f)، وكانت بعض الأحماض الأمينية موجودة بشكل تفضيلي في مواقع محددة مسبقًا في الببتيد المكون من 12 حمضًا أمينيًا (الشكل 1h). والجدير بالذكر أن الحيوانات الفردية اختلفت بشكل كبير في السائل النخاعي، بينما لوحظ إثراء الجليسين في الدم لدى كلا الحيوانين (الشكل التكميلي 4a-j). بعد ترشيح دقيق لبيانات التسلسل في السائل النخاعي للحيوانين رقم 1.1 ورقم 1.2، تم الحصول على ما مجموعه 964 و420 ببتيدًا فريدًا مكونًا من 12 حمضًا أمينيًا (الشكل التكميلي 1d-e). تم تضخيم مستنسخات العاثيات المعزولة وإخضاعها لجولة ثانية من الانتقاء الحيوي. خضعت العاثيات المستخلصة من الجولة الثانية من الانتقاء لفحص التسلسل عالي الإنتاجية (HTS) في كل حيوان، واستُخدمت جميع الببتيدات المُحددة كمدخلات لبرنامج التعرف على الأنماط لتحليل تكرار أنماط ثلاثي الببتيد (الشكل 2أ، ب، هـ و). بالمقارنة مع الدورة الأولى للعاثيات المستخلصة من السائل النخاعي الشوكي، لاحظنا المزيد من الانتقاء وإلغاء الانتقاء للعديد من الأنماط في السائل النخاعي الشوكي في الفرعين أ و ب (الشكل 2). طُبقت خوارزمية تحديد الشبكة لتحديد ما إذا كانت تمثل أنماطًا مختلفة من التسلسل المتسق. لوحظ تشابه واضح بين التسلسلات ذات الأبعاد الاثني عشر المستخلصة من السائل النخاعي الشوكي في الفرع البديل أ (الشكل 2ج، د) والفرع ب (الشكل 2ز، ح). كشف التحليل المجمع في كل فرع عن ملامح اختيار مختلفة للببتيدات المكونة من 12 حمض أميني (الشكل التكميلي 5 ج، د) وزيادة في نسبة عيار السائل النخاعي/الدم بمرور الوقت للاستنساخات المجمعة بعد الجولة الثانية من الاختيار مقارنة بالجولة الأولى من الاختيار (الشكل التكميلي 5 هـ).
إثراء الأنماط والببتيدات في السائل النخاعي الشوكي من خلال جولتين متتاليتين من اختيار عرض العاثيات الوظيفي في الجسم الحي.
تم تجميع جميع العاثيات المستخلصة من السائل النخاعي الشوكي من الجولة الأولى لكل حيوان (الحيوانان رقم 1.1 و1.2)، وتضخيمها، وتسلسلها بتقنية التسلسل عالي الإنتاجية، ثم إعادة حقنها معًا (2 × 10¹⁰ عاثية/حيوان) في جرذين مزودين بقنية تحت الجلد (من 1.1 إلى 2.1 و2.2، ومن 1.2 إلى 2.3 و2.4). (أ، ب، هـ، و) مخططات التشتت الارتباطية التي تقارن التردد النسبي لأنماط ثلاثي الببتيد لجميع العاثيات المستخلصة من السائل النخاعي الشوكي في جولتي الاختيار الأولى والثانية. التردد النسبي وتوزيع الأنماط التي تمثل جميع ثلاثيات الببتيد المتداخلة الممكنة الموجودة في الببتيدات في كلا الاتجاهين. يظهر عدد الأنماط الموجودة في 1000 قراءة. تم تمييز الأنماط التي تم اختيارها أو استبعادها بشكل ملحوظ (قيمة p < 0.001) في إحدى المكتبات المقارنة بنقاط حمراء. (ج، د، ز، ح) تمثيل شعار التسلسل لجميع التسلسلات الغنية بـ 12 حمضًا أمينيًا في السائل النخاعي الشوكي، استنادًا إلى الجولتين 2 و1 من الانتقاء الحيوي. يشير حجم الرمز المكون من حرف واحد إلى مدى تكرار هذا الحمض الأميني في ذلك الموضع. لتمثيل الشعار، تتم مقارنة تردد تسلسلات السائل النخاعي الشوكي المستخرجة من الحيوانات الفردية بين جولتي انتقاء، وتُعرض التسلسلات المُثرية في الجولة الثانية: (ج) #1.1–#2.1، (د) #1.1–#2.2، (ز) #1.2–#2.3، و(ح) #1.2–#2.4. تُعرض الأحماض الأمينية الأكثر إثراءً في موضع معين في (ج، د) الحيوانين رقم 2.1 ورقم 2.2 أو (ز، ح) الحيوانين رقم 2.3 ورقم 2.4 بالألوان. الأخضر = قطبي، البنفسجي = متعادل، الأزرق = قاعدي، الأحمر = حمضي، والأسود = كاره للماء.
بعد الجولة الثالثة من الانتقاء، حددنا 124 تسلسلًا ببتيديًا فريدًا (#3.1 و#3.2) من بين 332 مستنسخًا من العاثيات المُعاد تكوينها من السائل النخاعي الشوكي، والتي عُزلت من حيوانين (الشكل التكميلي 6أ). كان التسلسل LGSVS (18.7%) هو الأعلى نسبةً، يليه التسلسلات الأصلية PAGISRELVDKL (8.2%)، وMRWFFSHASQGR (3%)، وDVAKVS (3%)، وTWLFSLG (2.2%)، وSARGSWREIVSLS (2.2%). في الجولة الرابعة والأخيرة، جمعنا فرعين تم اختيارهما بشكل مستقل من ثلاثة حيوانات منفصلة (الشكل 1ج). من بين 925 مستنسخًا من العاثيات المُتسلسلة والمُستخلصة من السائل النخاعي الشوكي، وجدنا في الجولة الرابعة 64 تسلسلًا ببتيديًا فريدًا (الشكل التكميلي 6ب)، انخفضت فيها النسبة النسبية للعاثيات الأصلية إلى 0.8%. كانت أكثر مستنسخات CSF شيوعًا في الجولة الرابعة هي LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%)، وLGSVS (17%)، وGFVRFRLSNTR (14%)، وKVAWRVFSLFWK (7%)، وSVHGV (5%)، وGRPQKINGARVC (3.6%)، وRLSSVDSDLSGC (3.2%). ويعود نطاق طول الببتيدات المختارة إلى إدخالات/حذف النيوكليوتيدات أو كودونات التوقف المبكرة في بادئات المكتبة عند استخدام الكودونات المتغيرة لتصميم مكتبة NNK. تُنتج كودونات التوقف المبكرة ببتيدات أقصر، ويتم اختيارها لاحتوائها على النمط الحمضي الأميني المفضل. قد تنتج الببتيدات الأطول عن إدخالات/حذف في بادئات المكتبات الاصطناعية. يؤدي ذلك إلى وضع كودون التوقف المصمم خارج الإطار، ويتم قراءته حتى يظهر كودون توقف جديد في اتجاه المصب. بشكل عام، قمنا بحساب عوامل الإثراء لجميع جولات الاختيار الأربع بمقارنة بيانات الإدخال مع بيانات مخرجات العينة. في الجولة الأولى من الفرز، استخدمنا عيارات العاثيات من النوع البري كمرجع خلفية غير محدد. ومن المثير للاهتمام أن اختيار العاثيات السلبية كان قويًا جدًا في دورة السائل النخاعي الشوكي الأولى، ولكن ليس في الدم (الشكل 3أ)، وهو ما قد يُعزى إلى انخفاض احتمالية الانتشار السلبي لمعظم أعضاء مكتبة الببتيدات إلى حجرة السائل النخاعي الشوكي، أو إلى ميل العاثيات النسبية إلى أن تُحتفظ بها أو تُزال من مجرى الدم بكفاءة أكبر من العاثيات البكتيرية. مع ذلك، في الجولة الثانية من الفرز، لوحظ اختيار قوي للعاثيات في السائل النخاعي الشوكي في كلا المجموعتين، مما يشير إلى أن الجولة السابقة كانت غنية بالعاثيات التي تعرض ببتيدات تُعزز امتصاصها في السائل النخاعي الشوكي (الشكل 3أ). مرة أخرى، دون إثراء ملحوظ في الدم. كذلك في الجولتين الثالثة والرابعة، كانت مستنسخات العاثيات غنية بشكل ملحوظ في السائل النخاعي الشوكي. بمقارنة التردد النسبي لكل تسلسل ببتيدي فريد بين الجولتين الأخيرتين من عملية الاختيار، وجدنا أن التسلسلات كانت أكثر وفرة في الجولة الرابعة (الشكل 3ب). تم استخلاص 931 نمطًا ثلاثي الببتيد من جميع التسلسلات الببتيدية الفريدة البالغ عددها 64 باستخدام كلا اتجاهي الببتيد. خضعت الأنماط الأكثر وفرة في الجولة الرابعة لفحص دقيق لملامح وفرتها عبر جميع الجولات مقارنةً بالمكتبة المُدخلة (الحد الأدنى: 10% وفرة) (الشكل التكميلي 6ج). أظهرت الأنماط العامة للاختيار أن معظم الأنماط المدروسة كانت أكثر وفرة في جميع الجولات السابقة لكلا فرعي الاختيار. مع ذلك، كانت بعض الأنماط (مثل SGL وVSG وLGS وGSV) تنتمي في الغالب إلى الفرع البديل A، بينما كانت أنماط أخرى (مثل FGW وRTN وWGF وNTR) أكثر وفرة في الفرع البديل B.
التحقق من صحة نقل الببتيدات المعروضة على العاثيات الغنية بالسائل النخاعي والببتيدات الرائدة المؤتلفة بالبيوتين والمقترنة بحمولات الستربتافيدين.
(أ) نسب الإثراء المحسوبة في الجولات الأربع (R1-R4) بناءً على عيارات العاثيات المحقونة (المدخلات = I) وعيارات العاثيات المحددة في السائل النخاعي الشوكي (المخرجات = O). حُسبت عوامل الإثراء للجولات الثلاث الأخيرة (R2-R4) بالمقارنة مع الجولة السابقة والجولة الأولى (R1) باستخدام بيانات الوزن. الأعمدة المفتوحة تمثل السائل النخاعي الشوكي، والأعمدة المظللة تمثل البلازما. (***p<0.001، بناءً على اختبار t للطالب). (ب) قائمة بببتيدات العاثيات الأكثر وفرة، مرتبة وفقًا لنسبتها النسبية إلى جميع العاثيات التي جُمعت في السائل النخاعي الشوكي بعد الجولة الرابعة من الانتقاء. تم تمييز أكثر ستة مستنسخات عاثية شيوعًا بالألوان والأرقام وعوامل إثرائها بين الجولتين الثالثة والرابعة من الانتقاء (الإطارات الداخلية). (ج، د) تم تحليل ستة من أكثر مستنسخات العاثيات إثراءً، بالإضافة إلى العاثيات الفارغة ومكتبات ببتيدات العاثيات الأصلية من الجولة الرابعة، بشكل فردي في نموذج أخذ عينات من السائل النخاعي. جُمعت عينات السائل النخاعي والدم في الأوقات المحددة. (ج) تم حقن كميات متساوية من 6 مستنسخات عاثيات مرشحة (2 × 10¹⁰ عاثية/حيوان)، وعاثيات فارغة (#1779) (2 × 10¹⁰ عاثية/حيوان)، ومكتبات ببتيدات العاثيات المخزنة (2 × 10¹² عاثية/حيوان). تم حقن 3 وحدات على الأقل من وسط الاستنبات (CM) في الحيوان المُقنّى بشكل منفصل عبر الوريد الذنبي. يوضح الشكل الحركية الدوائية في السائل النخاعي لكل مستنسخ عاثيات ومكتبة ببتيدات عاثيات محقونة مع مرور الوقت. (د) يوضح متوسط ​​نسبة السائل النخاعي/الدم لجميع العاثيات المستردة/مل خلال فترة أخذ العينات. (هـ) تم ربط أربعة ببتيدات قائدة اصطناعية وعنصر تحكم عشوائي واحد بالبيوتين إلى الستربتافيدين عبر طرفها الأميني (عرض رباعي) متبوعًا بالحقن (وريديًا في الوريد الذنبي، 10 ملغ ستربتافيدين/كغ). تم استخدام ثلاثة فئران على الأقل تم إدخال أنبوب تنفس لها (ن = 3). تم جمع عينات من السائل النخاعي الشوكي في النقاط الزمنية المحددة، وتم قياس تركيزات الستربتافيدين بواسطة مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للستربتافيدين في السائل النخاعي الشوكي (غير قابل للكشف = nd). (*p<0.05، **p<0.01، ***p<0.001، بناءً على اختبار تحليل التباين). (و) مقارنة تسلسل الأحماض الأمينية لأكثر مستنسخات ببتيد العاثية إثراءً رقم 2002 (بنفسجي) مع مستنسخات ببتيد العاثية الأخرى المختارة من الجولة الرابعة للاختيار. تم ترميز أجزاء الأحماض الأمينية المتطابقة والمتشابهة بالألوان.
من بين جميع العاثيات المُثرية في الجولة الرابعة (الشكل 3ب)، تم اختيار ستة مستنسخات مرشحة لمزيد من التحليل الفردي في نموذج أخذ عينات السائل النخاعي. حُقنت كميات متساوية من مكتبات ببتيدات العاثيات المرشحة الست، والعاثيات الفارغة (بدون إدخال)، والطليعة العاثية في ثلاثة حيوانات مصابة بداء التصلب المتعدد مزودة بقنية، وتم تحديد الحركية الدوائية في السائل النخاعي (الشكل 3ج) والدم (الشكل التكميلي 7). استهدفت جميع مستنسخات العاثيات المختبرة حيز السائل النخاعي بمستوى أعلى بمقدار 10 إلى 1000 مرة من مستوى العاثية الضابطة الفارغة (#1779). على سبيل المثال، كان لدى المستنسخين #2020 و#2077 تركيزات في السائل النخاعي أعلى بحوالي 1000 مرة من العاثية الضابطة. يختلف الملف الحركي الدوائي لكل ببتيد مُختار، ولكن جميعها تتمتع بقدرة عالية على استهداف السائل النخاعي. لاحظنا انخفاضًا مطردًا بمرور الوقت في المستنسخين رقم 1903 و2011، بينما قد يشير ارتفاع تركيز المستنسخات رقم 2077 و2002 و2009 خلال الدقائق العشر الأولى إلى النقل النشط، لكن هذا الأمر يحتاج إلى تأكيد. استقرت المستنسخات رقم 2020 و2002 و2077 عند مستويات عالية، بينما انخفض تركيز المستنسخ رقم 2009 في السائل النخاعي الشوكي ببطء بعد الارتفاع الأولي. ثم قارنا التردد النسبي لكل مستنسخ مرشح في السائل النخاعي الشوكي مع تركيزه في الدم (الشكل 3د). أظهر ارتباط متوسط ​​تركيز كل مستنسخ مرشح في السائل النخاعي الشوكي مع تركيزه في الدم في جميع أوقات أخذ العينات أن ثلاثة من المستنسخات الستة كانت موجودة بكثرة في السائل النخاعي الشوكي في الدم. ومن المثير للاهتمام أن المستنسخ رقم 2077 أظهر استقرارًا أعلى في الدم (الشكل التكميلي 7). للتأكد من قدرة الببتيدات نفسها على نقل مواد أخرى غير جسيمات العاثيات إلى حيز السائل النخاعي الشوكي، قمنا بتصنيع أربعة ببتيدات رائدة مُشتقة بالبيوتين عند الطرف الأميني (N-terminus) حيث ترتبط الببتيدات بجسيم العاثية. تم ربط الببتيدات المُبيوتينية (أرقام 2002، 2009، 2020، و2077) بالستربتافيدين (SA) للحصول على أشكال متعددة الوحدات تُحاكي إلى حد ما هندسة العاثية. سمح لنا هذا الشكل أيضًا بقياس مستوى الستربتافيدين في الدم والسائل النخاعي الشوكي كببتيدات بروتينية ناقلة للمواد. ومن المهم ذكره، أنه غالبًا ما أمكن إعادة إنتاج بيانات العاثيات عند إعطاء الببتيدات المصنعة بهذا الشكل المرتبط بالستربتافيدين (الشكل 3هـ). أظهرت الببتيدات المُشوشة مستوى تعرض أوليًا أقل وتصفية أسرع من السائل النخاعي الشوكي، حيث لم يتم الكشف عن مستوياتها خلال 48 ساعة. لفهم مسارات توصيل هذه الببتيدات الفيروسية إلى السائل النخاعي، قمنا بتحليل تموضع كل ببتيد فيروسي على حدة باستخدام تقنية التلوين المناعي النسيجي (IHC) للكشف المباشر عن جزيئات الفيروس بعد ساعة واحدة من الحقن الوريدي في الجسم الحي. ومن الجدير بالذكر أنه أمكن الكشف عن الببتيدات #2002 و#2077 و#2009 من خلال التلوين القوي في الشعيرات الدموية الدماغية، بينما لم يتم الكشف عن الفيروس الضابط (#1779) والببتيد #2020 (الشكل التكميلي 8). يشير هذا إلى أن هذه الببتيدات تساهم في التأثير على الدماغ تحديدًا عن طريق عبور الحاجز الدموي الدماغي. ويلزم إجراء تحليل مفصل إضافي لاختبار هذه الفرضية، حيث قد يكون مسار الحاجز الدموي الدماغي الوعائي (BSCFB) متورطًا أيضًا. عند مقارنة تسلسل الأحماض الأمينية للببتيد الأكثر وفرة (#2002) مع ببتيدات أخرى مختارة، لوحظ أن بعضها يمتلك امتدادات متشابهة للأحماض الأمينية، مما قد يشير إلى آلية نقل مماثلة (الشكل 3f).
نظراً لخصائصه البلازمية الفريدة والزيادة الملحوظة في السائل النخاعي الشوكي مع مرور الوقت، خضع مستنسخ عرض العاثيات رقم 2077 لمزيد من الدراسة على مدى 48 ساعة، وتمكن من محاكاة الزيادة السريعة في السائل النخاعي الشوكي التي لوحظت بالتزامن مع مستويات حمض الساليسيليك المستدامة (الشكل 4أ). وبالنسبة لمستنسخات العاثيات الأخرى التي تم تحديدها، أظهر المستنسخ رقم 2077 تلويناً قوياً للشعيرات الدموية الدماغية، وتوضعاً مشتركاً ملحوظاً مع الليكتين، وهو مؤشر للشعيرات الدموية، عند فحصه بدقة أعلى، وربما بعض التلوين في الحيز النسيجي (الشكل 4ب). وللتحقق مما إذا كان من الممكن الحصول على تأثيرات دوائية بوساطة الببتيدات في الجهاز العصبي المركزي، أجرينا تجربةً تم فيها مزج نسخ مُؤشَّرة بالبيوتين من: (1) ببتيد العبور رقم 2077، و(2) ببتيد مثبط BACE1 مع حمض الساليسيليك بنسبتين مختلفتين. في إحدى التركيبتين، استخدمنا ببتيد مثبط BACE1 فقط، وفي الأخرى استخدمنا نسبة 1:3 من ببتيد مثبط BACE1 إلى ببتيد رقم 2077. تم حقن كلتا العينتين وريديًا، وقُيست مستويات ببتيد بيتا-أميلويد 40 (Aβ40) في الدم والسائل النخاعي الشوكي بمرور الوقت. وقد تم قياس Aβ40 في السائل النخاعي الشوكي لأنه يعكس تثبيط إنزيم BACE1 في نسيج الدماغ. وكما هو متوقع، أدى كلا المركبين إلى انخفاض ملحوظ في مستويات Aβ40 في الدم (الشكل 4ج، د). ومع ذلك، فإن العينات التي تحتوي على مزيج من الببتيد رقم 2077 ومثبط ببتيد BACE1 المرتبط بـ SA فقط هي التي تسببت في انخفاض ملحوظ في Aβ40 في السائل النخاعي الشوكي (الشكل 4ج). تُظهر البيانات أن الببتيد رقم 2077 قادر على نقل بروتين SA بوزن 60 كيلو دالتون إلى الجهاز العصبي المركزي، كما أنه يُحدث تأثيرات دوائية عند استخدامه مع مثبطات ببتيد BACE1 المرتبطة بـ SA.
(أ) حقن مستنسخ (2 × 10 عاثيات/حيوان) من عاثية T7 يُظهر خصائص حركية دوائية طويلة الأمد للببتيد #2077 في السائل النخاعي (RLSSVDSDLSGC) وعاثية تحكم غير محقونة (#1779) في ثلاثة فئران على الأقل تم إدخال أنبوب تنفس لها باستخدام مادة CM. (ب) صورة مجهرية بؤرية لأوعية دموية دقيقة نموذجية في قشر الدماغ لدى فئران محقونة بالعاثيات (2 × 10 عاثيات/حيوان) تُظهر التلوين المضاد للببتيد #2077 والأوعية (الليكتين). تم حقن هذه المستنسخات من العاثيات في 3 فئران وتُركت لتنتشر في الدماغ لمدة ساعة واحدة قبل الإرواء. تم تقطيع أدمغة الفئران وتلوينها بأجسام مضادة متعددة النسائل موسومة بـ FITC ضد غلاف عاثية T7. قبل عشر دقائق من الإرواء والتثبيت اللاحق، تم حقن الليكتين الموسوم بـ DyLight594 وريديًا. صور فلورية تُظهر تلوين الليكتين (باللون الأحمر) للجانب اللمعي للأوعية الدموية الدقيقة، والبلعميات (باللون الأخضر) في تجويف الشعيرات الدموية وأنسجة الدماغ المحيطة بالأوعية. يُمثل شريط المقياس 10 ميكرومتر. (ج، د) تم ربط ببتيد BACE1 المثبط المُؤشَّر بالبيوتين، منفردًا أو مُدمجًا مع ببتيد العبور المُؤشَّر بالبيوتين رقم 2077، بالستربتافيدين، ثم حُقن وريديًا في ثلاثة فئران مصابة بداء المشوكات الدماغية (CM) على الأقل (10 ملغ ستربتافيدين/كغ). تم قياس انخفاض Aβ40 الناتج عن مثبط ببتيد BACE1 بواسطة اختبار ELISA لـ Aβ1-40 في الدم (باللون الأحمر) والسائل النخاعي (باللون البرتقالي) عند النقاط الزمنية المُحددة. ولتوضيح الصورة بشكل أفضل، تم رسم خط منقط على الرسم البياني بمقياس 100%. (ج) النسبة المئوية لانخفاض مستوى Aβ40 في الدم (المثلثات الحمراء) والسائل النخاعي (المثلثات البرتقالية) لدى الفئران المعالجة بالستربتافيدين المرتبط بببتيد العبور رقم 2077 وببتيد مثبط لـ BACE1 بنسبة 3:1. (د) النسبة المئوية لانخفاض مستوى Aβ40 في الدم (الدوائر الحمراء) والسائل النخاعي (الدوائر البرتقالية) لدى الفئران المعالجة بالستربتافيدين المرتبط بببتيد مثبط لـ BACE1 فقط. كان تركيز Aβ في المجموعة الضابطة 420 بيكوغرام/مل (الانحراف المعياري = 101 بيكوغرام/مل).
لقد طُبقت تقنية عرض العاثيات بنجاح في العديد من مجالات البحوث الطبية الحيوية¹⁷. استُخدمت هذه الطريقة في دراسات التنوع الوعائي في الجسم الحي^18،19، بالإضافة إلى دراسات تستهدف الأوعية الدماغية^{20،21،22،23،24،25،26}. في هذه الدراسة، وسّعنا نطاق تطبيق طريقة الاختيار هذه ليشمل ليس فقط التحديد المباشر للببتيدات التي تستهدف الأوعية الدماغية، بل أيضًا اكتشاف المرشحين ذوي خصائص النقل النشط لعبور الحاجز الدموي الدماغي. نصف الآن تطوير إجراء اختيار في الجسم الحي في فئران مُنَوَّمة بسائل دماغي شوكي، ونُبيّن إمكانية استخدامه لتحديد الببتيدات ذات خصائص التوجيه إلى السائل الدماغي الشوكي. باستخدام عاثية T7 التي تعرض مكتبة من الببتيدات العشوائية المكونة من 12 حمضًا أمينيًا، تمكّنا من إثبات أن عاثية T7 صغيرة بما يكفي (قطرها حوالي 60 نانومترًا)¹⁰ للتكيف مع الحاجز الدموي الدماغي، وبالتالي عبوره مباشرةً أو عبور الضفيرة المشيمية. لاحظنا أن جمع السائل النخاعي من فئران مصابة بداء شاغاس الدماغي (CM) مزودة بقنية يُعدّ طريقة فحص وظيفية دقيقة ومضبوطة في الجسم الحي، وأن العاثيات المستخلصة لا ترتبط بالأوعية الدموية فحسب، بل تعمل أيضًا كناقل عبر الحاجز الدموي الدماغي. علاوة على ذلك، ومن خلال جمع الدم في الوقت نفسه وتطبيق تقنية الفحص عالي الإنتاجية (HTS) على العاثيات المستخلصة من السائل النخاعي والدم، تأكدنا من أن اختيارنا للسائل النخاعي لم يتأثر بتخصيب الدم أو قدرة العاثيات على التكاثر بين جولات الانتقاء. مع ذلك، يُعدّ حيز الدم جزءًا من عملية الانتقاء، إذ يجب أن تبقى العاثيات القادرة على الوصول إلى حيز السائل النخاعي حية وتدور في مجرى الدم لفترة كافية لتكوين تجمعات في الدماغ. لاستخلاص معلومات تسلسلية موثوقة من بيانات الفحص عالي الإنتاجية الخام، قمنا بتطبيق مرشحات مُكيّفة مع أخطاء التسلسل الخاصة بكل منصة في سير عمل التحليل. من خلال دمج المعايير الحركية في طريقة الفرز، أكدنا الحركية الدوائية السريعة لفيروسات T7 البرية (نصف العمر ~ 28 دقيقة) في الدم^{24، 27، 28}، وحددنا أيضًا نصف عمرها في السائل النخاعي (نصف العمر ~ 26 دقيقة). على الرغم من تشابه خصائص الحركية الدوائية في الدم والسائل النخاعي، لم يُرصد سوى 0.001% من تركيز الفيروس في الدم في السائل النخاعي، مما يشير إلى انخفاض حركة فيروسات T7 البرية عبر الحاجز الدموي الدماغي. يُبرز هذا العمل أهمية الجولة الأولى من الانتقاء عند استخدام استراتيجيات الفرز الحيوي، خاصةً لأنظمة الفيروسات التي تُزال بسرعة من الدورة الدموية، حيث لا يصل سوى عدد قليل من المستنسخات إلى الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي، في الجولة الأولى، كان انخفاض تنوع المكتبة كبيرًا جدًا، إذ لم يُجمع في النهاية سوى عدد محدود من المستنسخات في هذا النموذج الدقيق للسائل النخاعي. تضمنت استراتيجية الفرز الحيوي هذه عدة خطوات انتقاء، مثل التراكم النشط في السائل النخاعي، وبقاء المستنسخات في الدم، والإزالة السريعة لمستنسخات عاثية T7 من الدم خلال الدقائق العشر الأولى (الشكل 1د والشكل التكميلي 4م). وبالتالي، بعد الجولة الأولى، تم تحديد مستنسخات عاثية مختلفة في السائل النخاعي، على الرغم من استخدام نفس المجموعة الأولية لكل حيوان. يشير هذا إلى أن خطوات الانتقاء الصارمة المتعددة لمكتبات المصدر ذات الأعداد الكبيرة من أعضاء المكتبة تؤدي إلى انخفاض كبير في التنوع. لذلك، ستصبح الأحداث العشوائية جزءًا لا يتجزأ من عملية الانتقاء الأولية، مما يؤثر بشكل كبير على النتيجة. من المحتمل أن العديد من المستنسخات في المكتبة الأصلية كانت لها قابلية إثراء متشابهة جدًا في السائل النخاعي. ومع ذلك، حتى في ظل نفس الظروف التجريبية، قد تختلف نتائج الانتقاء بسبب العدد القليل لكل مستنسخ معين في المجموعة الأولية.
تختلف الأنماط المُثرية في السائل النخاعي الشوكي عن تلك الموجودة في الدم. ومن المثير للاهتمام أننا لاحظنا أول تحول نحو الببتيدات الغنية بالجليسين في دم الحيوانات الفردية (الشكل 1g، الأشكال التكميلية 4e، 4f). قد تكون العاثيات الحاملة لببتيدات الجليسين أكثر استقرارًا وأقل عرضة للخروج من الدورة الدموية. ومع ذلك، لم يتم الكشف عن هذه الببتيدات الغنية بالجليسين في عينات السائل النخاعي الشوكي، مما يشير إلى أن المكتبات المُنسقة خضعت لمرحلتي اختيار مختلفتين: إحداهما في الدم والأخرى سُمح لها بالتراكم في السائل النخاعي الشوكي. تم اختبار المستنسخات المُثرية في السائل النخاعي الشوكي والناتجة عن الجولة الرابعة من الاختيار على نطاق واسع. وقد تأكد أن جميع المستنسخات التي تم اختبارها بشكل فردي تقريبًا مُثرية في السائل النخاعي الشوكي مقارنةً بعاثيات التحكم الفارغة. تم فحص أحد الببتيدات (#2077) بمزيد من التفصيل. أظهر هذا الببتيد عمر نصف أطول في البلازما مقارنةً بالنتائج الأخرى (الشكل 3د والشكل التكميلي 7)، ومن المثير للاهتمام أنه يحتوي على بقايا سيستين في الطرف الكربوكسيلي. وقد ثبت مؤخرًا أن إضافة السيستين إلى الببتيدات يمكن أن تُحسّن خصائصها الحركية الدوائية عن طريق الارتباط بالألبومين 29. هذا الأمر غير معروف حاليًا بالنسبة للببتيد رقم 2077 ويتطلب مزيدًا من الدراسة. أظهرت بعض الببتيدات اعتمادًا على التكافؤ في إثراء السائل النخاعي (البيانات غير معروضة)، وهو ما قد يكون مرتبطًا بالهندسة السطحية الظاهرة لغلاف T7. أظهر نظام T7 الذي استخدمناه وجود 5-15 نسخة من كل ببتيد لكل جسيم عاثية. أُجريَ التلوين المناعي النسيجي على مستنسخات العاثيات المرشحة الرائدة التي حُقنت وريديًا في قشرة دماغ الفئران (الشكل التكميلي 8). أظهرت البيانات أن ثلاثة مستنسخات على الأقل (رقم 2002، ورقم 2009، ورقم 2077) تفاعلت مع الحاجز الدموي الدماغي. ولا يزال من غير المعروف ما إذا كان هذا التفاعل يؤدي إلى تراكم السائل النخاعي الشوكي أو إلى انتقال هذه المستنسخات مباشرةً إلى الحاجز الدموي الدماغي السائل. ومن المهم، أننا أظهرنا أن الببتيدات المختارة تحتفظ بقدرتها على نقل السائل النخاعي الشوكي عند تصنيعها وارتباطها بالبروتين الناقل. ويؤكد ارتباط الببتيدات المؤتلفة بالبيوتين في الطرف الأميني مع حمض الساليسيليك النتائج التي تم الحصول عليها مع مستنسخات العاثيات الخاصة بها في الدم والسائل النخاعي الشوكي (الشكل 3هـ). وأخيرًا، أظهرنا أن الببتيد الرائد رقم 2077 قادر على تعزيز تأثير مثبط ببتيدي مؤتلف بالبيوتين لإنزيم BACE1 المرتبط بحمض الساليسيليك على الدماغ، مما يُحدث تأثيرات دوائية ملحوظة في الجهاز العصبي المركزي عن طريق خفض مستويات بروتين بيتا النشواني 40 في السائل النخاعي الشوكي بشكل كبير (الشكل 4). لم نتمكن من تحديد أي متماثلات في قاعدة البيانات بإجراء بحث عن تماثل تسلسل الببتيدات لجميع النتائج. تجدر الإشارة إلى أن حجم مكتبة T7 يبلغ حوالي 109، بينما يبلغ الحجم النظري لمكتبة الببتيدات المكونة من 12 حمضًا أمينيًا 4 × 10¹⁵. لذلك، لم نختر سوى جزء صغير من نطاق تنوع مكتبة الببتيدات المكونة من 12 حمضًا أمينيًا، مما قد يعني إمكانية تحديد المزيد من الببتيدات المُحسَّنة من خلال تقييم نطاق التسلسل المجاور لهذه النتائج المحددة. من الناحية النظرية، قد يكون أحد أسباب عدم عثورنا على أي متماثلات طبيعية لهذه الببتيدات هو عملية الاستبعاد الانتقائي أثناء التطور لمنع دخول أنماط ببتيدية معينة إلى الدماغ بشكل غير مُنضبط.
تُشكّل نتائجنا مجتمعةً أساسًا لأبحاث مستقبلية تهدف إلى تحديد وتوصيف أنظمة النقل عبر الحاجز الوعائي الدماغي في الجسم الحي بمزيد من التفصيل. يعتمد الإعداد الأساسي لهذه الطريقة على استراتيجية اختيار وظيفية لا تقتصر على تحديد المستنسخات ذات خصائص الارتباط بالأوعية الدماغية فحسب، بل تتضمن أيضًا خطوة حاسمة تتمثل في امتلاك المستنسخات الناجحة قدرةً ذاتيةً على عبور الحواجز البيولوجية في الجسم الحي إلى الجهاز العصبي المركزي. يهدف هذا البحث إلى توضيح آلية نقل هذه الببتيدات وتفضيلها للارتباط بالأوعية الدموية الدقيقة الخاصة بمنطقة الدماغ. قد يُفضي ذلك إلى اكتشاف مسارات جديدة لنقل المواد عبر الحاجز الدموي الدماغي والمستقبلات. نتوقع أن ترتبط الببتيدات المُحددة مباشرةً بمستقبلات الأوعية الدماغية أو بالروابط الدوّارة المنقولة عبر الحاجز الدموي الدماغي أو الحاجز الدموي الدماغي السائل. سيتم إجراء المزيد من الدراسات على نواقل الببتيدات ذات نشاط النقل عبر السائل الدماغي الشوكي التي تم اكتشافها في هذا العمل. نجري حاليًا دراسةً حول خصوصية هذه الببتيدات للدماغ وقدرتها على عبور الحاجز الدموي الدماغي و/أو الحاجز الدموي الدماغي السائل. ستكون هذه الببتيدات الجديدة أدوات قيّمة للغاية لاكتشاف مستقبلات أو مسارات جديدة، ولتطوير منصات جديدة عالية الكفاءة لتوصيل الجزيئات الكبيرة، مثل المواد البيولوجية، إلى الدماغ.
يتم إدخال قنية في الصهريج الكبير (CM) باستخدام تعديل للطريقة الموصوفة سابقًا. تُثبّت فئران ويستار المخدرة (200-350 غرامًا) على جهاز التوجيه المجسم، ويُجرى شق وسطي فوق فروة الرأس المحلوقة والمعقمة لكشف الجمجمة. يُحفر ثقبان في منطقة الشق العلوي وتُربط براغي التثبيت فيهما. يُحفر ثقب إضافي في العرف القذالي الجانبي لتوجيه قنية من الفولاذ المقاوم للصدأ إلى الصهريج الكبير باستخدام التوجيه المجسم. يُوضع إسمنت الأسنان حول القنية ويُثبّت بالبراغي. بعد المعالجة الضوئية وتصلب الإسمنت، يُغلق جرح الجلد بخيوط جراحية من نوع سوبراميد 4/0. يُؤكد وضع القنية بشكل صحيح من خلال التسرب التلقائي للسائل النخاعي الشوكي (CSF). يُزال الفأر من جهاز التثبيت المجسم، ويُقدّم له الرعاية المناسبة بعد العملية الجراحية وتسكين الألم، ويُترك ليتعافى لمدة أسبوع على الأقل حتى تظهر علامات وجود دم في السائل النخاعي. تم الحصول على فئران ويستار (Crl:WI/Han) من شركة تشارلز ريفر (فرنسا). حُفظت جميع الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل المكتب البيطري لمدينة بازل، سويسرا، وأُجريت وفقًا لترخيص الحيوانات رقم 2474 (تقييم النقل النشط للدماغ عن طريق قياس مستويات المرشحين العلاجيين في السائل النخاعي ودماغ الفأر).
حافظ على وعي الفأر برفق مع إمساك قنية السائل النخاعي. أزل نبات الداتورة من القنية واجمع 10 ميكرولتر من السائل النخاعي المتدفق تلقائيًا. نظرًا لتأثر سالكية القنية في نهاية المطاف، فقد تم تضمين عينات السائل النخاعي الصافية فقط، الخالية من أي دليل على تلوث الدم أو تغير اللون، في هذه الدراسة. بالتوازي، تم سحب ما يقارب 10-20 ميكرولتر من الدم من شق صغير في طرف الذيل في أنابيب تحتوي على الهيبارين (سيجما-ألدريتش). تم جمع السائل النخاعي والدم في أوقات مختلفة بعد الحقن الوريدي لفيروس T7. تم التخلص من ما يقارب 5-10 ميكرولتر من السائل قبل جمع كل عينة من السائل النخاعي، وهو ما يعادل حجم السائل الميت للقسطرة.
تم إنشاء المكتبات باستخدام ناقل T7Select 10-3b كما هو موضح في دليل نظام T7Select (Novagen، Rosenberg et al.، InNovations 6، 1-6، 1996). باختصار، تم تصنيع قطعة DNA عشوائية مكونة من 12 نيوكليوتيدًا بالصيغة التالية:
استُخدم كودون NNK لتجنب كودونات التوقف المزدوجة والإفراط في التعبير عن الأحماض الأمينية في الجزء المُدخل. يُمثل N نسبة مولية متساوية من كل نيوكليوتيد مُحضّرة يدويًا، بينما يُمثل K نسبة مولية متساوية من نيوكليوتيدات الأدينين والسيتوزين مُحضّرة يدويًا. حُوّلت المناطق أحادية السلسلة إلى حمض نووي مزدوج السلسلة عن طريق حضانة إضافية مع dNTP (Novagen) وإنزيم Klenow (New England Biolabs) في محلول Klenow (New England Biolabs) لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد انتهاء التفاعل، استُخلص الحمض النووي مزدوج السلسلة بالترسيب باستخدام الإيثانول. هُضم الحمض النووي الناتج باستخدام إنزيمات التقييد EcoRI وHindIII (كلاهما من Roche). ثم رُبط الجزء المُدخل المُقسّم والمُنقّى (QIAquick، Qiagen) (T4 ligase، New England Biolabs) في إطار القراءة الصحيح في ناقل T7 مُقسّم مسبقًا بعد الحمض الأميني 348 من جين الغلاف 10B. حُضنت تفاعلات الربط عند درجة حرارة 16 درجة مئوية لمدة 18 ساعة قبل التعبئة في المختبر. أُجريت عملية تعبئة العاثيات في المختبر وفقًا للتعليمات المرفقة مع مجموعة استنساخ T7Select 10-3b (نوفاجين)، وتم تضخيم محلول التعبئة مرة واحدة حتى التحلل باستخدام بكتيريا الإشريكية القولونية (BLT5615، نوفاجين). خُضعت المستخلصات للطرد المركزي، ثم عُيرت، وجُمدت عند درجة حرارة -80 درجة مئوية كمحلول مخزون من الجلسرين.
تضخيم مباشر لمناطق متغيرة من العاثية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في المرق أو الطبق باستخدام بادئات اندماج 454/Roche-amplicon الخاصة. تحتوي بادئة الاندماج الأمامية على تسلسلات تحيط بالمنطقة المتغيرة (NNK) 12 (خاصة بالقالب)، ومحول GS FLX Titanium Adapter A، وتسلسل مفتاح مكتبة مكون من أربعة قواعد (TCAG) (الشكل التكميلي 1أ).
يحتوي البادئ العكسي للاندماج أيضًا على البيوتين المرتبط بخرزات الالتقاط ومحول GS FLX Titanium Adapter B المطلوب للتضخيم الاستنساخي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل في المستحلب:
ثم خضعت نواتج التضخيم للتسلسل الهرمي 454/Roche وفقًا لبروتوكول 454 GS-FLX Titanium. أما بالنسبة للتسلسل اليدوي بتقنية سانجر (باستخدام جهاز تحليل الحمض النووي Applied Biosystems Hitachi 3730 xl)، فقد تم تضخيم الحمض النووي لفيروس T7 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتسلسله باستخدام أزواج البادئات التالية:
تم إخضاع القطع المُدخلة من اللوحات الفردية لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام مجموعة Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة). قم بإجراء دورة بدء ساخنة (10 دقائق عند 95 درجة مئوية) و35 دورة تعزيز (50 ثانية عند 95 درجة مئوية، دقيقة واحدة عند 50 درجة مئوية، ودقيقة واحدة عند 72 درجة مئوية).
تم تضخيم العاثيات من المكتبات، والعاثيات البرية، والعاثيات المستخلصة من السائل النخاعي الشوكي والدم، أو المستنسخات الفردية، في بكتيريا الإشريكية القولونية BL5615 في مرق TB (سيجما ألدريتش) أو في أطباق بتري مساحتها 500 سم² (ثيرمو ساينتيفيك) لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. استُخلصت العاثيات من الأطباق بغسلها بمحلول Tris-EDTA (فلوكا أناليتيكال) أو بجمع اللويحات باستخدام رؤوس ماصة معقمة. عُزلت العاثيات من سائل الاستنبات أو محلول الاستخلاص بترسيب واحد باستخدام بولي إيثيلين جلايكول (PEG 8000) (بروميج) وأُعيد تعليقها في محلول Tris-EDTA.
خضعت العاثيات المُضخّمة لجولتين أو ثلاث جولات من إزالة السموم الداخلية باستخدام خرزات إزالة السموم الداخلية (Miltenyi Biotec) قبل الحقن الوريدي (500 ميكرولتر/حيوان). في الجولة الأولى، تم إدخال 2×10¹² عاثية؛ وفي الثانية، 2×10¹⁰ عاثية؛ وفي الجولتين الثالثة والرابعة، 2×10⁹ عاثية لكل حيوان. تم تحديد محتوى العاثيات في عينات السائل النخاعي الشوكي والدم التي جُمعت في الأوقات المحددة عن طريق عدّ اللويحات وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة (دليل نظام T7Select). تم اختيار العاثيات عن طريق الحقن الوريدي للمكتبات المُنقّاة في وريد الذيل أو عن طريق إعادة حقن العاثيات المُستخلصة من السائل النخاعي الشوكي من جولة الاختيار السابقة، وتم إجراء عمليات الحصاد اللاحقة عند 10 دقائق، و30 دقيقة، و60 دقيقة، و90 دقيقة، و120 دقيقة، و180 دقيقة، و240 دقيقة على التوالي لعينات السائل النخاعي الشوكي والدم. أُجريت أربع جولات من الفرز الحيوي، حيث تم تخزين الفرعين المُختارين وتحليلهما بشكل منفصل خلال الجولات الثلاث الأولى. خضعت جميع مُدخلات العاثيات المُستخلصة من السائل النخاعي الشوكي في الجولتين الأوليين للتسلسل الهرمي 454/Roche، بينما خضعت جميع المستنسخات المُستخلصة من السائل النخاعي الشوكي في الجولتين الأخيرتين للتسلسل اليدوي. كما خضعت جميع عاثيات الدم من الجولة الأولى للتسلسل الهرمي 454/Roche. ولحقن مستنسخات العاثيات، تم تضخيم العاثيات المُختارة في بكتيريا الإشريكية القولونية (BL5615) على أطباق مساحتها 500 سم² عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. تم استنبات المستنسخات المُختارة والمُسلسلة يدويًا في وسط TB. بعد استخلاص العاثيات وتنقيتها وإزالة السموم الداخلية (كما هو موضح أعلاه)، تم حقن 2 × 1010 عاثية/حيوان في 300 ميكرولتر عن طريق الوريد في أحد أوردة الذيل.
المعالجة المسبقة والترشيح النوعي لبيانات التسلسل. تم تحويل بيانات 454/Roche الخام من تنسيق خريطة التدفق القياسي الثنائي (sff) إلى تنسيق Pearson القابل للقراءة البشرية (fasta) باستخدام برنامج الشركة المصنعة. أُجريت معالجة إضافية لتسلسل النيوكليوتيدات باستخدام برامج ونصوص C خاصة (حزمة برامج غير منشورة) كما هو موضح أدناه. يتضمن تحليل البيانات الأولية إجراءات ترشيح صارمة متعددة المراحل. لاستبعاد القراءات التي لا تحتوي على تسلسل DNA صالح مكون من 12 نيوكليوتيد، تمت محاذاة القراءات بشكل متسلسل إلى علامة البداية (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT)، وعلامة النهاية (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA)، وتسلسل الإدخال الخلفي (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) باستخدام اختبار Needleman-Wunsch العالمي. يُسمح بحد أقصى تناقضين لكل محاذاة. لذلك، أُزيلت من المكتبة القراءات التي لا تحتوي على علامات بدء وإيقاف، والقراءات التي تحتوي على إضافات خلفية، أي المحاذاة التي تتجاوز عدد حالات عدم التطابق المسموح به. أما بالنسبة للقراءات المتبقية، فقد تم استئصال تسلسل الحمض النووي N-mer الممتد من علامة البدء وينتهي قبل علامة الإيقاف من تسلسل القراءة الأصلي، ثم معالجته (ويُشار إليه فيما يلي بـ "الإضافة"). بعد ترجمة الإضافة، يُزال الجزء الذي يلي كودون الإيقاف الأول عند الطرف 5′ للبادئ. بالإضافة إلى ذلك، أُزيلت النيوكليوتيدات التي تؤدي إلى كودونات غير مكتملة عند الطرف 3′ للبادئ. لاستبعاد الإضافات التي تحتوي على تسلسلات خلفية فقط، أُزيلت أيضًا الإضافات المترجمة التي تبدأ بنمط الأحماض الأمينية "PAG". كما أُزيلت الببتيدات التي يقل طولها بعد الترجمة عن 3 أحماض أمينية من المكتبة. أخيرًا، أُزيل التكرار من مجموعة الإضافات، وحُدد تردد كل إضافة فريدة. تضمنت نتائج هذا التحليل قائمة بتسلسلات النيوكليوتيدات (الإدراجات) وتردداتها (القراءة) (الشكلان التكميليان 1 ج و 2).
تجميع إدخالات الحمض النووي N-mer حسب تشابه التسلسل: للتخلص من أخطاء التسلسل الخاصة بتقنية 454/Roche (مثل مشاكل تسلسل امتدادات البوليمر المتجانس) وإزالة التكرارات الأقل أهمية، يتم فرز إدخالات تسلسل الحمض النووي N-mer (الإدخالات) التي تمت تصفيتها مسبقًا حسب التشابه. يتم فرز الإدخالات (حتى قاعدتين غير متطابقتين) باستخدام خوارزمية تكرارية كما يلي: يتم فرز الإدخالات أولاً حسب تكرارها (من الأعلى إلى الأدنى)، وإذا كانت متطابقة، يتم فرزها ثانويًا حسب طولها (من الأطول إلى الأقصر). وبالتالي، تُحدد الإدخالات الأكثر تكرارًا والأطول "المجموعة" الأولى. يتم تعيين تكرار المجموعة إلى التكرار الرئيسي. بعد ذلك، تتم محاولة إضافة كل إدخال متبقٍ في القائمة المرتبة إلى المجموعة عن طريق محاذاة Needleman-Wunsch الثنائية. إذا لم يتجاوز عدد حالات عدم التطابق أو الإدخالات أو الحذوفات في المحاذاة عتبة 2، تتم إضافة إدخال إلى المجموعة، ويزداد تكرار المجموعة الإجمالي بمقدار تكرار إضافة الإدخال. تُعلّم الإدخالات المُضافة إلى مجموعة ما بأنها مُستخدمة وتُستبعد من المعالجة اللاحقة. إذا تعذّر إضافة تسلسل الإدخال إلى مجموعة موجودة، يُستخدم هذا التسلسل لإنشاء مجموعة جديدة بتردد الإدخال المناسب، ويُعلّم بأنه مُستخدم. تنتهي هذه العملية عندما يُستخدم كل تسلسل إدخال إما لتكوين مجموعة جديدة أو يُمكن تضمينه في مجموعة موجودة. في النهاية، تُترجم الإدخالات المُجمّعة، المُكوّنة من نيوكليوتيدات، إلى تسلسلات ببتيدية (مكتبات ببتيدية). نتيجة هذا التحليل هي مجموعة من الإدخالات وتردداتها المُقابلة، والتي تُشكّل عدد القراءات المُتتالية (الشكل التكميلي 2).
توليد الأنماط: استنادًا إلى قائمة من الببتيدات الفريدة، تم إنشاء مكتبة تحتوي على جميع أنماط الأحماض الأمينية الممكنة (aa) كما هو موضح أدناه. تم استخراج كل نمط ممكن بطول 3 من الببتيد، وأُضيف نمطه العكسي مع مكتبة أنماط مشتركة تحتوي على جميع الأنماط (ثلاثيات الببتيد). تم تسلسل مكتبات الأنماط عالية التكرار وإزالة التكرار. بعد ذلك، لكل ثلاثي ببتيد في مكتبة الأنماط، تم التحقق من وجوده في المكتبة باستخدام أدوات حسابية. في هذه الحالة، تتم إضافة تردد الببتيد الذي يحتوي على ثلاثي الببتيد الموجود وتعيينه للنمط في مكتبة الأنماط ("عدد الأنماط"). نتيجة توليد الأنماط هي مصفوفة ثنائية الأبعاد تحتوي على جميع حالات ظهور ثلاثيات الببتيد (الأنماط) وقيمها المقابلة، وهي عدد قراءات التسلسل التي ينتج عنها النمط المقابل عند ترشيح القراءات وتجميعها وترجمتها. المقاييس كما هو موضح بالتفصيل أعلاه.
توحيد عدد الأنماط ومخططات التشتت المقابلة: تم توحيد عدد الأنماط لكل عينة باستخدام
حيث يُمثل ni عدد القراءات التي تحتوي على الموضوع i. وبالتالي، يُمثل vi النسبة المئوية لتكرار القراءات (أو الببتيدات) التي تحتوي على النمط i في العينة. تم حساب قيم P لعدد الأنماط غير المُعَيَّر باستخدام اختبار فيشر الدقيق. أما بالنسبة لمخططات الارتباط لعدد الأنماط، فقد تم حساب معاملات ارتباط سبيرمان باستخدام عدد الأنماط المُعَيَّر بواسطة برنامج R.
لعرض محتوى الأحماض الأمينية في كل موقع من مكتبة الببتيدات، تم إنشاء مخططات الويب 32 و33 (http://weblogo.threeplusone.com). في البداية، يُخزَّن محتوى الأحماض الأمينية في كل موقع من مواقع الببتيد المكون من 12 حمضًا أمينيًا في مصفوفة 20×12. بعد ذلك، تُولَّد مجموعة من 1000 ببتيد تحتوي على نفس النسبة النسبية من الأحماض الأمينية في كل موقع بصيغة تسلسل فاستا، وتُقدَّم كمدخلات إلى مخطط الويب 3، الذي يُنشئ تمثيلًا بيانيًا للنسبة النسبية من الأحماض الأمينية في كل موقع لمكتبة ببتيدات معينة. لعرض مجموعات البيانات متعددة الأبعاد، تم إنشاء خرائط حرارية باستخدام أداة مطورة داخليًا في لغة البرمجة R (biosHeatmap، وهي حزمة R قيد الإصدار). حُسبت المخططات الشجرية المعروضة في الخرائط الحرارية باستخدام طريقة التجميع الهرمي لوارد مع مقياس المسافة الإقليدية. لتحليل بيانات تقييم الأنماط إحصائياً، حُسبت قيم P للتقييم غير المُعَيَّر باستخدام اختبار فيشر الدقيق. أما قيم P لمجموعات البيانات الأخرى، فقد حُسبت في برنامج R باستخدام اختبار t للطالب أو تحليل التباين (ANOVA).
تم حقن سلالات مختارة من العاثيات، بالإضافة إلى عاثيات خالية من الإضافات، وريديًا عبر وريد الذيل (2×10¹⁰ عاثية/حيوان في 300 ميكرولتر من محلول الفوسفات الملحي). قبل عشر دقائق من الإرواء والتثبيت اللاحق، حُقنت الحيوانات نفسها وريديًا بـ 100 ميكرولتر من الليكتين الموسوم بـ DyLight594 (شركة Vector Laboratories Inc.، DL-1177). بعد 60 دقيقة من حقن العاثيات، تم إرواء الفئران عبر القلب بـ 50 مل من محلول الفوسفات الملحي، ثم بـ 50 مل من محلول بارافورمالدهيد 4% في محلول الفوسفات الملحي. ثُبِّتت عينات الدماغ طوال الليل في محلول بارافورمالدهيد 4% في محلول الفوسفات الملحي، ثم نُقعت في محلول سكروز 30% طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. جُمِّدت العينات تجميدًا سريعًا في خليط OCT. أُجري تحليل مناعي نسيجي كيميائي لعينات مجمدة في درجة حرارة الغرفة على مقاطع نسيجية مجمدة بسمك 30 ميكرومتر، تم حجبها بمحلول BSA بنسبة 1%، ثم حُضنت مع أجسام مضادة متعددة النسائل موسومة بـ FITC ضد عاثية T7 (Novus NB 600-376A) عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. حُضنت العينات طوال الليل. بعد ذلك، غُسلت المقاطع ثلاث مرات بمحلول PBS وفُحصت باستخدام مجهر ليزري متحد البؤر (Leica TCS SP5).
تم تصنيع جميع الببتيدات بنقاوة لا تقل عن 98% بواسطة شركة GenScript USA، ثم تم ربطها بالبيوتين وتجفيفها بالتجميد. يرتبط البيوتين عبر فاصل ثلاثي من الجليسين عند الطرف الأميني. تم فحص جميع الببتيدات باستخدام مطياف الكتلة.
تم مزج الستربتافيدين (Sigma S0677) مع فائض مولاري مكافئ بمقدار 5 أضعاف من الببتيد المُؤَشَّر بالبيوتين، أو الببتيد المُثبِّط لإنزيم BACE1 المُؤَشَّر بالبيوتين، أو مزيج (بنسبة 3:1) من الببتيد المُثبِّط لإنزيم BACE1 المُؤَشَّر بالبيوتين والببتيد المُثبِّط لإنزيم BACE1 في محلول DMSO بنسبة 5-10%، ثم حُضِّن المزيج في محلول PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل الحقن. حُقنت الببتيدات المُقترنة بالستربتافيدين وريديًا بجرعة 10 ملغم/كغم في أحد أوردة ذيل الفئران التي تحتوي على تجويف دماغي.
تم تقييم تركيز معقدات الستربتافيدين-الببتيد باستخدام اختبار ELISA. طُليت صفائح Nunc Maxisorp الدقيقة (Sigma) طوال الليل عند درجة حرارة 4 مئوية باستخدام 1.5 ميكروغرام/مل من الأجسام المضادة للفأر ضد الستربتافيدين (Thermo، MA1-20011). بعد عملية الحجب (محلول الحجب: 140 نانومولار كلوريد الصوديوم، 5 مليمولار EDTA، 0.05% NP40، 0.25% جيلاتين، 1% BSA) عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين، غُسلت الصفيحة بمحلول Tween-20/PBS بتركيز 0.05% (محلول الغسل) لمدة 3 ثوانٍ. ثم أُضيفت عينات السائل النخاعي الشوكي والبلازما إلى الآبار المخففة بمحلول الحجب (البلازما 1:10000، السائل النخاعي الشوكي 1:115). ثم حُضنت الصفيحة طوال الليل عند درجة حرارة 4 مئوية مع جسم مضاد للكشف (1 ميكروغرام/مل، مضاد الستربتافيدين المرتبط بإنزيم بيروكسيداز الفجل، نوفوس NB120-7239). بعد ثلاث خطوات غسل، تم الكشف عن الستربتافيدين عن طريق التحضين في محلول ركيزة TMB (روش) لمدة تصل إلى 20 دقيقة. بعد إيقاف تطور اللون باستخدام حمض الكبريتيك بتركيز 1 مولار، تم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر.
تم تقييم وظيفة مُركّب ستربتأفيدين-ببتيد-مثبط BACE1 باستخدام اختبار ELISA لبروتين Aβ(1-40) وفقًا لبروتوكول الشركة المُصنّعة (Wako، 294-64701). باختصار، تم تخفيف عينات السائل النخاعي الشوكي في مُخفّف قياسي (1:23) وحُضنت طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في صفائح ذات 96 بئرًا مُغطاة بجسم مضاد BNT77. بعد خمس خطوات غسل، أُضيف الجسم المضاد BA27 المُقترن بإنزيم بيروكسيداز الفجل (HRP) وحُضنت لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، تلتها خمس خطوات غسل أخرى. تم الكشف عن بروتين Aβ(1-40) عن طريق التحضين في محلول TMB لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إيقاف ظهور اللون باستخدام محلول الإيقاف، تم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر. خضعت عينات البلازما لاستخلاص الطور الصلب قبل إجراء اختبار ELISA لبروتين Aβ(1-40). أُضيف البلازما إلى محلول ثنائي إيثيل أمين (DEA) بتركيز 0.2% (من شركة سيجما) في صفائح ذات 96 بئرًا، وحُضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد غسل صفائح الاستخلاص الطوري الصلب (SPE) (من شركة أواسيس، رقم 186000679) بالماء ثم بالميثانول النقي، أُضيفت عينات البلازما إلى الصفائح، ثم أُزيل السائل بالكامل. غُسلت العينات (أولًا بالميثانول بتركيز 5% ثم بتركيز 30%)، ثم فُصلت باستخدام محلول هيدروكسيد الأمونيوم بتركيز 2% في ميثانول بتركيز 90%. بعد تجفيف المستخلص عند درجة حرارة 55 درجة مئوية لمدة 99 دقيقة مع تيار نيتروجين ثابت، خُفضت العينات في مخففات قياسية، وقُيس مستوى بروتين بيتا النشواني (Aβ(1–40)) كما هو موضح سابقًا.
كيفية الاستشهاد بهذه المقالة: أوريتش، إي. وآخرون. توصيل الحمولة إلى الدماغ باستخدام ببتيدات العبور المحددة في الجسم الحي. العلوم. 5، 14104؛ doi:10.1038/srep14104 (2015).
ليخوتا ج.، سكجورينج ت.، تومسن إل بي وموس ت. توصيل الأدوية الجزيئية الكبيرة إلى الدماغ باستخدام العلاج الموجه. مجلة الكيمياء العصبية 113، 1-13، 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
براسنيفيتش، آي.، شتاينبوش، إتش دبليو، شميتز، سي.، ومارتينيز-مارتينيز، بي. توصيل الأدوية الببتيدية والبروتينية عبر الحاجز الدموي الدماغي. بروغ نيوروبيول 87، 212-251، 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
باردريدج، دبليو إم. الحاجز الدموي الدماغي: عقبة في تطوير أدوية الدماغ. NeuroRx 2، 3-14، 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
جوهانسون، ك. إي.، دنكان، ج. أ.، ستوبا، إ. ج.، وبيرد، أ. آفاق تحسين توصيل الأدوية واستهدافها للدماغ عبر مسار الضفيرة المشيمية-السائل النخاعي. البحوث الصيدلانية 22، 1011-1037، 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
باردريدج، دبليو إم. تحديث المستحضرات الصيدلانية الحيوية باستخدام أحصنة طروادة جزيئية لتوصيلها إلى الدماغ. كيمياء الاقتران الحيوي 19، 1327-1338، 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM نقل الببتيد عبر الحاجز الدموي الدماغي بوساطة المستقبلات. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
نيوهنر، ج. وآخرون. زيادة اختراق الدماغ وفعالية الأجسام المضادة العلاجية باستخدام ناقلات جزيئية أحادية التكافؤ. نيرون 81، 49-60، 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
بيان-لي، ن. وآخرون. نقل مستقبل الترانسفيرين (TfR) يحدد امتصاص الدماغ لمتغيرات الألفة من الأجسام المضادة لمستقبل الترانسفيرين. مجلة الطب التجريبي 211، 233-244، 10.1084/jem.20131660 (2014).