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혈액-뇌 장벽과 혈액-뇌 장벽은 생물학적 치료제가 중추신경계 표적에 도달하는 것을 방해하여 신경계 질환의 효과적인 치료를 방해합니다. 생체 내에서 새로운 뇌 수송체를 발견하기 위해, T7 파지 펩타이드 라이브러리를 도입하고, 캐뉼라를 삽입한 의식이 있는 쥐의 대규모 풀 모델을 이용하여 혈액과 뇌척수액(CSF)을 연속적으로 수집했습니다. 4차례의 선별 과정을 거친 후, 특정 파지 클론은 CSF에서 고농축되었습니다. 개별 후보 펩타이드에 대한 시험 결과, CSF에서 1,000배 이상 농축된 것으로 나타났습니다. 펩타이드를 매개로 한 뇌 전달의 생물학적 활성은 확인된 새로운 전달 펩타이드에 결합된 BACE1 펩타이드 억제제를 사용하여 뇌척수액 내 아밀로이드 베타 수치를 40% 감소시킴으로써 확인되었습니다. 이러한 결과는 생체 내 파지 선별법을 통해 확인된 펩타이드가 치료 효과를 가진 거대분자의 뇌 전신 전달을 위한 유용한 매개체일 수 있음을 시사합니다.
중추신경계(CNS) 표적 치료 연구는 주로 중추신경계 표적 특성을 나타내는 최적화된 약물 및 작용제를 찾는 데 집중되어 왔으며, 뇌로의 능동적인 약물 전달을 유도하는 메커니즘을 발견하는 데는 상대적으로 소홀했습니다. 하지만 약물 전달, 특히 거대 분자의 전달이 현대 신경과학 약물 개발의 필수적인 부분이 되면서 이러한 상황은 변화하기 시작했습니다. 중추신경계 환경은 혈액-뇌 장벽(BBB)과 혈액-뇌 장벽(BCBB)으로 구성된 뇌혈관 장벽 시스템에 의해 잘 보호되어 있어 약물을 뇌로 전달하는 것이 어렵습니다. 거의 모든 거대 분자 약물과 98% 이상의 소분자 약물이 뇌에서 제거되는 것으로 추정됩니다.3 그렇기 때문에 중추신경계에 치료 약물을 효율적이고 특이적으로 전달하는 새로운 뇌 수송 시스템을 찾는 것이 매우 중요합니다.4,5 그러나 BBB와 BCSFB는 광범위한 혈관계를 통해 뇌의 모든 구조로 침투하여 약물을 전달할 수 있는 훌륭한 기회를 제공합니다. 따라서, 뇌로의 비침습적 전달 방법을 사용하려는 현재의 노력은 주로 내인성 BBB6 수용체를 이용하는 수용체 매개 수송(PMT) 기전에 기반하고 있습니다. 최근 트랜스페린 수용체 경로를 이용한 주요 진전7,8에도 불구하고, 개선된 특성을 가진 새로운 전달 시스템의 추가 개발이 필요합니다. 이를 위해, 본 연구의 목표는 CSF 수송을 매개할 수 있는 펩타이드를 찾아내는 것이었습니다. 이러한 펩타이드는 원칙적으로 거대분자를 중추신경계로 전달하거나 새로운 수용체 경로를 여는 데 사용될 수 있기 때문입니다. 특히, 뇌혈관계의 특정 수용체와 수송체(BBB 및 BSCFB)는 생물치료제의 능동적이고 특이적인 전달을 위한 잠재적인 표적이 될 수 있습니다. 뇌척수액(CSF)은 맥락총(CS)의 분비물이며, 지주막하강과 뇌실강을 통해 뇌의 간질액과 직접 접촉합니다4. 최근 뇌척수액이 뇌 간질로 과도하게 확산되는 것으로 밝혀졌습니다.9 저희는 이 지주막하 유입로를 이용하거나 혈액 뇌관(BBB)을 통해 직접 실질 공간에 접근하고자 합니다. 이를 위해, 저희는 이 두 가지 경로 중 하나를 통해 운반되는 펩타이드를 이상적으로 식별하는 강력한 생체 내 파지 선택 전략을 구현했습니다.
본 연구에서는 뇌척수액(CSF) 샘플링과 고처리량 시퀀싱(HTS)을 병행하여 라이브러리 다양성이 가장 높은 초기 선별 라운드를 모니터링하는 순차적 생체 내 파지 디스플레이 스크리닝 방법을 제시한다. 혈액 오염을 방지하기 위해 대형 시스터나(CM) 캐뉼라를 영구적으로 이식한 의식이 있는 쥐를 대상으로 스크리닝을 수행하였다. 중요한 점은 이 접근법이 뇌를 표적으로 하는 펩타이드와 뇌혈관 장벽을 통과하는 수송 활성을 가진 펩타이드를 모두 선별한다는 것이다. 본 연구에서는 크기가 작은(~60nm) T7 파지를 사용하였으며,10 이 파지가 내피 및/또는 상피-수질 장벽의 세포간 이동을 가능하게 하는 소포 수송에 적합하다고 제안하였다. 4회의 패닝 후, 생체 내 뇌척수액의 강력한 농축 및 뇌 미세혈관과의 연관성을 보이는 파지 집단을 분리하였다. 중요한 점은, 화학적으로 합성된 최적의 후보 펩타이드가 단백질을 뇌척수액으로 수송할 수 있음을 보여줌으로써 본 연구 결과를 확인할 수 있었다는 것이다. 첫째, 중추신경계의 약력학적 효과는 주요 수송 펩타이드와 BACE1 펩타이드 억제제를 결합하여 확립되었습니다. 생체 내 기능 스크리닝 전략을 통해 효과적인 단백질 운반체로서 새로운 뇌 수송 펩타이드를 식별할 수 있음을 보여주는 것 외에도, 유사한 기능 선별 접근법이 새로운 뇌 수송 경로를 식별하는 데에도 중요해질 것으로 예상합니다.
플라크 형성 단위(PFU)를 기반으로 파지 패키징 단계 후, 약 109의 다양성을 갖는 무작위 12-머 선형 T7 파지 펩타이드 라이브러리가 설계 및 제작되었습니다(재료 및 방법 참조). 생체 내 패닝 전에 이 라이브러리를 신중하게 분석했다는 점에 유의해야 합니다. 변형된 프라이머를 사용하여 파지 라이브러리 샘플을 PCR 증폭하면 HTS에 직접 적용할 수 있는 앰플리콘이 생성되었습니다(보충 그림 1a). a) HTS11 시퀀싱 오류, b) 프라이머(NNK)1-12 품질에 미치는 영향, c) 대기 라이브러리에 야생형(wt) 파지(골격 삽입물)가 존재하기 때문에 검증된 시퀀스 정보만 추출하기 위해 시퀀스 필터링 절차를 구현했습니다(보충 그림 1b). 이러한 필터 단계는 모든 HTS 시퀀싱 라이브러리에 적용됩니다. 표준 라이브러리의 경우 총 233,868개의 리드를 얻었으며, 이 중 39%가 필터 기준을 통과하여 라이브러리 분석 및 후속 라운드의 선택에 사용되었습니다(보충 그림 1c–e). 리드는 주로 길이가 3개 염기쌍의 배수였으며 36개 뉴클레오티드에서 피크를 보였습니다(보충 그림 1c). 이는 라이브러리 설계(NNK) 1-12를 확인시켜 주었습니다. 특히, 라이브러리 구성원의 약 11%가 12차원 야생형(wt) 백본 PAGISRELVDKL 삽입을 포함했고, 거의 절반의 시퀀스(49%)가 삽입 또는 삭제를 포함했습니다. 라이브러리 라이브러리의 HTS는 라이브러리의 펩타이드의 높은 다양성을 확인시켜 주었습니다. 펩타이드 시퀀스의 81% 이상이 단 한 번만 발견되었고 1.5%만이 ≥4개 사본으로 발생했습니다(보충 그림 2a). 레퍼토리의 모든 12개 위치에서 아미노산(aa)의 빈도는 변성 NKK 레퍼토리에서 생성된 코돈 수에 대해 예상되는 빈도와 잘 상관관계가 있었습니다(보충 그림 2b). 이러한 삽입물에 의해 인코딩된 aa 잔류물의 관찰된 빈도는 계산된 빈도(r = 0.893)와 잘 상관관계가 있었습니다(보충 그림 2c). 주입을 위한 파지 라이브러리의 준비에는 증폭과 내독소 제거 단계가 포함됩니다. 이는 이전에 파지 라이브러리의 다양성을 잠재적으로 감소시키는 것으로 나타났습니다12,13. 따라서 내독소가 제거된 플레이트 증폭 파지 라이브러리를 시퀀싱하고 원래 라이브러리와 비교하여 AA의 빈도를 추정했습니다. 원래 풀과 증폭 및 정제된 풀 간에 강한 상관관계(r = 0.995)가 관찰되었는데(보충 그림 2d), 이는 T7 파지를 사용하여 플레이트에서 증폭된 클론 간의 경쟁이 주요 편향을 일으키지 않았음을 나타냅니다. 이 비교는 각 라이브러리의 트리펩타이드 모티프 빈도를 기반으로 하는데, HTS로도 라이브러리의 다양성(약 10^9)을 완전히 포착할 수 없기 때문입니다. 각 위치의 아미노산 빈도 분석 결과, 입력된 레퍼토리의 마지막 세 위치에서 약간의 위치 의존적 편향이 나타났습니다(보충 그림 2e). 결론적으로, 라이브러리의 품질과 다양성은 수용 가능한 수준이며, 여러 차례의 선별 과정 사이에 파지 라이브러리의 증폭 및 제조로 인해 다양성에 미미한 변화만 관찰되었다고 결론지었습니다.
연속적인 뇌척수액 샘플링은 의식이 있는 쥐의 CM에 수술적으로 캐뉼라를 이식하여 BBB 및/또는 BCSFB를 통해 정맥(iv)으로 주입된 T7 파지를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다(그림 1a-b). 우리는 생체 내 선택의 처음 세 라운드에서 두 개의 독립적인 선택 팔(팔 A와 B)을 사용했습니다(그림 1c). 우리는 처음 세 라운드의 선택에서 도입된 파지의 총량을 줄임으로써 선택의 엄격성을 점차 높였습니다. 네 번째 라운드의 패닝을 위해 우리는 가지 A와 B의 샘플을 결합하고 세 가지 추가 독립적 선택을 수행했습니다. 이 모델에서 T7 파지 입자의 생체 내 특성을 연구하기 위해 야생형 파지(PAGISRELVDKL 마스터 인서트)를 꼬리 정맥을 통해 쥐에 주입했습니다. 다른 시점에서 뇌척수액과 혈액에서 파지를 회수한 결과, 비교적 작은 T7 이십면체 파지는 혈액 구획에서 빠른 초기 청소 단계를 가짐을 보여주었습니다(보충 그림 3). 투여된 역가와 쥐의 혈액량을 기준으로, 정맥 주사 후 10분에 투여량의 약 1% wt. 파지만이 혈액에서 검출되었다고 계산했습니다. 이 초기의 빠른 감소 후, 반감기가 27.7분인 더 느린 1차 청소가 측정되었습니다. 중요한 점은 CSF 구획에서 매우 적은 파지만이 회수되었다는 것입니다. 이는 야생형 파지가 CSF 구획으로 이동할 때 배경이 낮음을 나타냅니다(보충 그림 3). 평균적으로 전체 샘플링 기간(0-250분) 동안 혈액에서 T7 파지의 약 1 x 10-3% 역가와 초기 주입된 파지의 4 x 10-8%만이 뇌척수액에서 검출되었습니다. 특히, 뇌척수액에서 야생형 파지의 반감기(25.7분)는 혈액에서 관찰된 것과 유사했습니다. 이러한 데이터는 CM 캐뉼라를 삽입한 쥐에서 뇌척수액 구획과 혈액을 분리하는 장벽이 손상되지 않았음을 보여주며, 이를 통해 혈액에서 뇌척수액 구획으로 쉽게 운반되는 클론을 식별하기 위한 생체 내 파지 라이브러리 선택이 가능함을 보여줍니다.
(a) 대규모 풀에서 뇌척수액(CSF)을 재채취하는 방법 설정. (b) 중추신경계(CNS) 장벽의 세포 위치와 혈액-뇌 장벽(BBB) ​​및 혈액-뇌 장벽을 통과하는 펩타이드를 식별하는 데 사용되는 선택 전략을 보여주는 다이어그램. (c) 생체 내 파지 디스플레이 스크리닝 흐름도. 각 선택 라운드에서 파지(화살표 안의 동물 식별자)를 정맥 주사했습니다. 두 개의 독립적인 대체 분기(A, B)는 4번째 선택 라운드까지 별도로 보관합니다. 3번째 및 4번째 선택 라운드에서 CSF에서 추출한 각 파지 클론을 수동으로 시퀀싱했습니다. (d) T7 펩타이드 라이브러리(2 x 1012 파지/동물)를 정맥 주사한 후 두 마리의 캐뉼라 삽입 쥐에서 첫 번째 선택 라운드 동안 혈액(빨간색 원)과 뇌척수액(녹색 삼각형)에서 분리된 파지의 동역학. 파란색 사각형은 총 혈액량을 고려하여 주입된 파지 양으로부터 계산된 혈액 내 파지의 평균 초기 농도를 나타냅니다. 검은색 사각형은 혈액 파지 농도에서 외삽한 y 선의 교차점을 나타냅니다. (e, f) 펩타이드에서 발견된 모든 가능한 중복 트리펩타이드 모티프의 상대 빈도와 분포를 나타냅니다. 1000개 판독에서 발견된 모티프의 수가 표시됩니다. 유의하게(p < 0.001) 풍부한 모티프는 빨간색 점으로 표시했습니다. (e) 주입된 라이브러리의 트리펩타이드 모티프와 동물 #1.1 및 #1.2의 혈액 유래 파지의 상대 빈도를 비교하는 상관 산점도입니다. (f) 혈액과 뇌척수액에서 분리된 동물 파지 트리펩타이드 모티프 #1.1 및 #1.2의 상대 빈도를 비교하는 상관 산점도입니다. (g, h) 두 동물에서 생체 내 선별 과정을 거친 후, 혈액에 풍부한 파지(g)와 주입된 라이브러리, 그리고 뇌척수액에 풍부한 파지(h)의 서열 ID를 나타낸 것입니다. 한 글자 코드의 크기는 해당 아미노산이 해당 위치에 얼마나 자주 나타나는지를 나타냅니다. 녹색 = 극성, 보라색 = 중성, 파란색 = 염기성, 빨간색 = 산성, 검은색 = 소수성 아미노산. 그림 1a, b는 Eduard Urich가 설계 및 제작했습니다.
두 마리의 CM 기구 쥐(클레이드 A와 B)에 파지 펩타이드 라이브러리를 주입하고 뇌척수액과 혈액에서 파지를 분리했습니다(그림 1d). 라이브러리의 초기 빠른 청소율은 야생형 파지에 비해 덜 두드러졌습니다. 두 동물 모두에서 주입된 라이브러리의 평균 반감기는 혈액에서 24.8분으로 야생형 파지와 유사했고, 뇌척수액에서는 38.5분이었습니다. 각 동물의 혈액 및 뇌척수액 파지 샘플을 HTS(고온 열처리)에 노출시키고, 확인된 모든 펩타이드에 대해 짧은 트리펩타이드 모티프의 존재 여부를 분석했습니다. 트리펩타이드 모티프는 구조 형성 및 펩타이드-단백질 상호작용에 대한 최소한의 기반을 제공하기 때문에 선택되었습니다. 주입된 파지 라이브러리와 두 동물의 혈액에서 추출한 클론 간의 모티프 분포에서 좋은 상관관계를 발견했습니다(그림 1e). 데이터는 라이브러리 구성이 혈액 구획에서 미미하게만 풍부함을 나타냅니다. Weblogo16 소프트웨어를 변형하여 각 위치에서 아미노산 빈도와 공통 서열을 추가로 분석했습니다. 흥미롭게도, 혈액 글리신 잔기가 강하게 농축된 것을 발견했습니다(그림 1g). 혈액을 뇌척수액에서 선별된 클론과 비교했을 때, 모티프의 강한 선별과 일부 비선별이 관찰되었으며(그림 1f), 특정 아미노산은 12-멤버의 미리 정해진 위치에 우선적으로 존재했습니다(그림 1h). 특히, 뇌척수액에서 개별 동물의 차이가 유의미한 반면, 두 동물 모두에서 혈액 글리신 농축이 관찰되었습니다(보충 그림 4a-j). 동물 #1.1과 #1.2의 뇌척수액에서 서열 데이터를 엄격하게 필터링한 후, 총 964개와 420개의 고유한 12-머 펩타이드를 얻었습니다(보충 그림 1d-e). 분리된 파지 클론을 증폭하고 두 번째 생체 내 선별을 수행했습니다. 2차 선택 라운드에서 추출한 파지는 각 동물에서 HTS를 거쳤고, 식별된 모든 펩타이드는 트리펩타이드 모티프의 발생을 분석하기 위한 모티프 인식 프로그램의 입력으로 사용되었습니다(그림 2a, b, ef).CSF에서 회수한 파지의 첫 번째 사이클과 비교하여, 우리는 A 및 B 분기에서 CSF의 많은 모티프의 추가 선택 및 선택 해제를 관찰했습니다(그림 2).네트워크 식별 알고리즘을 적용하여 일관된 서열의 다른 패턴을 나타내는지 확인했습니다.대체 클레이드 A(그림 2c, d)와 클레이드 B(그림 2g, h)에서 CSF에 의해 회수된 12차원 서열 사이에 명확한 유사성이 관찰되었습니다.각 분기에서 풀링한 분석은 12-머 펩타이드에 대한 다른 선택 프로필(보충 그림 5c, d)과 1차 선택 라운드에 비해 2차 선택 후 풀링된 클론의 CSF/혈액 역가 비율이 시간에 따라 증가했음을 보여주었습니다(보충 그림 5e).
생체 내 기능적 파지 디스플레이 선택을 두 차례 연속으로 실시하여 뇌척수액의 모티프와 펩타이드를 풍부하게 함.
각 동물의 첫 번째 라운드에서 회수된 모든 뇌척수액 파지(동물 #1.1 및 #1.2)를 모아 증폭하고, HT 시퀀싱한 후, SM 캐뉼라가 삽입된 쥐 2마리(#1.1 → #). 2.1 및 2.2, 1.2 → 2.3 및 2.4)에 함께 재주입했습니다(2 x 1010 파지/동물). (a, b, e, f) 첫 번째 및 두 번째 선택 라운드에서 모든 뇌척수액 유래 파지의 트리펩타이드 모티프의 상대 빈도를 비교하는 상관관계 산점도. 양쪽 방향의 펩타이드에서 발견된 모든 가능한 중복 트리펩타이드를 나타내는 모티프의 상대 빈도 및 분포. 1000개의 판독에서 발견된 모티프의 수가 표시되어 있습니다. 비교된 라이브러리 중 하나에서 유의하게(p < 0.001) 선택되거나 제외된 모티프는 빨간색 점으로 강조 표시되어 있습니다. (c, d, g, h) 생체 내 선택의 라운드 2와 1을 기반으로 한 모든 CSF가 풍부한 12개 아미노산 길이의 시퀀스의 시퀀스 로고 표현. 한 글자 코드의 크기는 해당 아미노산이 해당 위치에서 얼마나 자주 발생하는지를 나타냅니다. 로고를 표현하기 위해 두 선택 라운드 사이에 개별 동물에서 추출한 CSF 시퀀스의 빈도를 비교하고 두 번째 라운드에서 풍부한 시퀀스를 표시합니다. (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 및 (h) #1.2–#2.4. (c, d) 동물 2.1과 2.2 또는 (g, h) 동물 2.3과 2.4에서 주어진 위치에서 가장 풍부한 아미노산을 컬러로 표시합니다. 녹색 = 극성, 보라색 = 중성, 파란색 = 염기성, 빨간색 = 산성, 검은색 = 소수성 아미노산.
세 번째 라운드의 선택 후, 우리는 두 마리의 동물로부터 분리된 332개의 CSF-재구성 파지 클론으로부터 124개의 고유한 펩타이드 서열(#3.1 및 #3.2)을 식별했습니다(보충 그림 6a). 서열 LGSVS(18.7%)는 가장 높은 상대적 비율을 보였고, 그 다음으로 야생형 삽입물 PAGISRELVDKL(8.2%), MRWFFSHASQGR(3%), DVAKVS(3%), TWLFSLG(2.2%), SARGSWREIVSLS(2.2%)였습니다. 마지막 네 번째 라운드에서, 우리는 세 마리의 다른 동물로부터 독립적으로 선택된 두 개의 분지를 모았습니다(그림 1c). CSF에서 회수된 925개의 시퀀싱된 파지 클론 중 네 번째 라운드에서 우리는 64개의 고유한 펩타이드 서열을 발견했습니다(보충 그림 6b). 그 중 야생형 파지의 상대적 비율은 0.8%로 떨어졌습니다. 네 번째 라운드에서 가장 흔한 CSF 클론은 LYVLHSRGLWGFKLAAALE(18%), LGSVS(17%), GFVRFRLSNTR(14%), KVAWRVFSLFWK(7%), SVHGV(5%), GRPQKINGARVC(3.6%) 및 RLSSVDSDLSGC(3, 2%)였습니다.). 선택된 펩타이드의 길이 범위는 NNK 라이브러리 설계에 변성 코돈을 사용할 때 라이브러리 프라이머의 뉴클레오타이드 삽입/삭제 또는 조기 종료 코돈으로 인해 발생합니다. 조기 종료 코돈은 더 짧은 펩타이드를 생성하며 유리한 aa 모티프를 포함하기 때문에 선택됩니다. 더 긴 펩타이드는 합성 라이브러리의 프라이머의 삽입/삭제로 인해 발생할 수 있습니다. 이는 설계된 종료 코돈을 프레임 외부에 위치시키고 하류에 새로운 종료 코돈이 나타날 때까지 이를 읽습니다. 일반적으로 입력 데이터와 샘플 출력 데이터를 비교하여 네 가지 선택 라운드 모두에 대한 농축 계수를 계산했습니다. 첫 번째 스크리닝 라운드에서는 야생형 파지 역가를 비특이적 배경 기준으로 사용했습니다. 흥미롭게도, 음성 파지 선택은 첫 번째 뇌척수액 순환에서 매우 강했지만 혈액에서는 그렇지 않았습니다(그림 3a). 이는 펩타이드 라이브러리의 대부분 구성원이 뇌척수액 구획으로 수동 확산될 확률이 낮거나, 상대적으로 파지가 박테리오파지보다 혈류에서 더 효율적으로 유지되거나 제거되는 경향이 있기 때문일 수 있습니다. 그러나 두 번째 패닝 라운드에서는 두 분기군 모두에서 뇌척수액에서 파지가 강하게 선택되었는데, 이는 이전 라운드에서 뇌척수액 흡수를 촉진하는 펩타이드를 나타내는 파지가 풍부했음을 시사합니다(그림 3a). 이 경우에도 혈액에서 유의미한 풍부화는 없었습니다. 또한 세 번째와 네 번째 라운드에서도 파지 클론은 뇌척수액에서 유의미하게 풍부했습니다. 마지막 두 라운드의 선택에서 각 고유 펩타이드 서열의 상대 빈도를 비교한 결과, 네 번째 라운드의 선택에서 서열이 훨씬 더 풍부함을 발견했습니다(그림 3b). 64개의 고유한 펩타이드 서열 모두에서 두 가지 펩타이드 방향을 모두 사용하여 총 931개의 트리펩타이드 모티프를 추출했습니다. 네 번째 라운드에서 가장 풍부해진 모티프는 주입된 라이브러리(10% 농축 기준)와 비교하여 모든 라운드에 걸쳐 농축 프로파일을 더욱 면밀히 검토했습니다(보충 그림 6c). 일반적인 선택 패턴은 연구된 모티프 대부분이 두 가지 선택 분기의 이전 모든 라운드에서 풍부해졌음을 보여주었습니다. 그러나 일부 모티프(예: SGL, VSG, LGS GSV)는 주로 대체 클레이드 A에서 유래한 반면, 다른 모티프(예: FGW, RTN, WGF, NTR)는 대체 클레이드 B에서 풍부했습니다.
스트렙타비딘 페이로드에 접합된 CSF가 풍부한 파지 디스플레이 펩타이드와 바이오틴화된 리더 펩타이드의 CSF 수송 검증.
(a) 주입된(입력 = I) 파지(PFU) 역가와 결정된 뇌척수액 파지 역가(출력 = O)를 기반으로 4라운드(R1-R4) 모두에서 계산된 농축 비율. 마지막 3라운드(R2-R4)의 농축 계수는 이전 라운드 및 첫 번째 라운드(R1)와 체중 데이터를 비교하여 계산했습니다. 빈 막대는 뇌척수액이고 음영 처리된 막대는 혈장입니다. (***p<0.001, 학생 t 검정 기반). (b) 4라운드 선택 후 뇌척수액에서 수집된 모든 파지에 대한 상대적 비율에 따라 순위를 매긴 가장 풍부한 파지 펩타이드 목록. 가장 흔한 6개의 파지 클론은 색상으로 강조 표시되고 번호가 매겨져 있으며, 3라운드와 4라운드 선택 사이의 농축 계수가 표시되어 있습니다(삽입 그림). (c, d) 라운드 4에서 가장 농축된 6개의 파지 클론, 빈 파지 및 부모 파지 펩타이드 라이브러리를 CSF 샘플링 모델에서 개별적으로 분석했습니다. CSF 및 혈액 샘플은 지정된 시점에서 수집되었습니다. (c) 6개의 후보 파지 클론(2 x 1010 파지/동물), 빈 파지(#1779)(2 x 1010 파지/동물) 및 스톡 파지 펩타이드 라이브러리(2 x 1012 파지/동물)를 동일한 양으로 주입합니다. 최소 3개의 CM을 카뉼라가 삽입된 동물에게 꼬리 정맥을 통해 별도로 투여합니다. 주입된 각 파지 클론과 파지 펩타이드 라이브러리의 시간 경과에 따른 CSF 약동학이 표시됩니다. (d)는 샘플링 시간 동안 회수된 모든 파지/mL에 대한 평균 CSF/혈액 비율을 보여줍니다. (e) 네 가지 합성 리더 펩타이드와 한 가지 스크램블 대조군을 N-말단을 통해 바이오틴으로 스트렙타비딘에 연결(사량체 표시)한 후 주입(꼬리 정맥 정맥, 스트렙타비딘 10mg/kg)했습니다. 최소 3마리의 삽관된 쥐(N = 3). 지정된 시점에 뇌척수액 샘플을 채취하고 뇌척수액 항-스트렙타비딘 ELISA(nd = 검출되지 않음)로 스트렙타비딘 농도를 측정했습니다. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA 검정 기반). (f) 4차 선별에서 선택된 다른 파지 펩타이드 클론과 가장 풍부한 파지 펩타이드 클론 #2002(보라색)의 아미노산 서열 비교. 동일하거나 유사한 아미노산 단편은 색상으로 표시했습니다.
네 번째 라운드(그림 3b)에서 모든 농축 파지 중에서 6개의 후보 클론을 선택하여 CSF 샘플링 모델에서 개별 분석을 추가로 수행했습니다. 후보 파지 6개, 빈 파지(삽입물 없음), 프로파지 펩타이드 라이브러리를 동일한 양으로 3마리의 캐뉼라 삽입 CM 동물에 주입하고 CSF(그림 3c) 및 혈액(보충 그림 7) 분석에서 약동학을 결정했습니다. 테스트된 모든 파지 클론은 빈 대조 파지(#1779)보다 10~1000배 높은 수준으로 CSF 구획을 표적으로 삼았습니다. 예를 들어, 클론 #2020과 #2077은 대조 파지보다 약 1000배 높은 CSF 역가를 가졌습니다. 선택된 각 펩타이드의 약동학적 프로파일은 다르지만 모두 높은 CSF 귀소 능력을 가지고 있습니다. 클론 #1903과 #2011은 시간이 지남에 따라 일정한 감소를 관찰했지만, 클론 #2077, #2002, #2009는 처음 10분 동안 증가하여 활성 수송을 나타낼 수 있지만 검증이 필요합니다.클론 #2020, #2002, #2077은 높은 수준에서 안정화되었지만, 클론 #2009의 CSF 농도는 초기 증가 후 천천히 감소했습니다.그런 다음 각 CSF 후보의 상대 빈도를 혈액 농도와 비교했습니다(그림 3d).모든 샘플링 시간에서 각 CSF 후보의 평균 역가와 혈액 역가의 상관관계는 6개 후보 중 3개가 혈액 CSF에서 상당히 풍부하다는 것을 보여주었습니다.흥미롭게도, 클론 #2077은 더 높은 혈액 안정성을 보였습니다(보충 그림 7). 펩타이드 자체가 파지 입자 이외의 다른 화물을 뇌척수액 구획으로 능동적으로 운반할 수 있는지 확인하기 위해, 파지 입자에 부착되는 N-말단에 바이오틴을 첨가하여 유도체화된 네 가지 선도 펩타이드를 합성했습니다. 바이오틴화된 펩타이드(번호 2002, 2009, 2020, 2077)를 스트렙타비딘(SA)과 접합하여 파지 구조를 어느 정도 모방하는 다중체 형태를 얻었습니다. 이 방식을 통해 화물 운반 단백질 펩타이드로서 혈액 및 뇌척수액에서 SA 노출을 측정할 수 있었습니다. 중요한 점은 합성 펩타이드를 이러한 SA 접합 방식으로 투여했을 때 파지 데이터를 재현할 수 있다는 것입니다(그림 3e). 스크램블된 펩타이드는 초기 노출량이 적었고 뇌척수액 청소 속도가 빠르며 48시간 이내에 검출되지 않는 수준으로 나타났습니다. 이러한 펩타이드 파지 클론의 뇌척수액 공간으로의 전달 경로에 대한 통찰력을 얻기 위해, 면역조직화학(IHC)을 사용하여 개별 파지 펩타이드 히트의 위치를 ​​분석하여 정맥 주사 1시간 후 생체 내 파지 입자를 직접 검출했습니다. 특히 클론 #2002, #2077, #2009는 뇌 모세혈관에서 강한 염색으로 검출되었지만, 대조군 파지(#1779)와 클론 #2020은 검출되지 않았습니다(보충 그림 8). 이는 이러한 펩타이드가 BBB를 통과하여 뇌에 미치는 영향에 정확하게 기여함을 시사합니다. BSCFB 경로도 관여할 수 있으므로 이 가설을 검증하려면 추가적인 세부 분석이 필요합니다. 가장 풍부한 클론(#2002)의 아미노산 서열을 다른 선택된 펩타이드와 비교했을 때, 일부 펩타이드는 유사한 아미노산 확장을 가지고 있는 것으로 나타났으며, 이는 유사한 수송 메커니즘을 나타낼 수 있습니다(그림 3f).
독특한 혈장 프로파일과 시간 경과에 따른 뇌척수액(CSF)의 유의미한 증가로 인해, 파지 디스플레이 클론 #2077을 48시간 동안 더 자세히 분석한 결과, 지속적인 SA 수치와 관련하여 관찰된 뇌척수액의 빠른 증가를 재현할 수 있었습니다(그림 4a). 다른 확인된 파지 클론들과 관련하여, #2077은 뇌 모세혈관에서 강하게 염색되었고, 고해상도에서 관찰했을 때 모세혈관 마커인 렉틴과 유의미한 공동국재화를 보였으며, 실질 공간에서 일부 염색되었을 가능성이 있습니다(그림 4b). 중추신경계에서 펩타이드 매개 약리 효과를 얻을 수 있는지 알아보기 위해, i) #2077 이동 펩타이드와 ii) BACE1 억제제 펩타이드의 바이오틴화된 버전을 두 가지 다른 비율로 SA와 혼합하는 실험을 수행했습니다. 한 조합에서는 BACE1 펩타이드 억제제만 사용했고, 다른 조합에서는 BACE1 펩타이드 억제제와 #2077 펩타이드를 1:3의 비율로 사용했습니다. 두 샘플 모두 정맥 투여 후 혈액 및 뇌척수액에서 베타-아밀로이드 펩타이드 40(Abeta40)의 농도를 시간 경과에 따라 측정했습니다. Abeta40은 뇌 실질에서 BACE1 억제를 반영하기 때문에 뇌척수액에서 측정했습니다. 예상대로 두 복합체 모두 Abeta40의 혈중 농도를 유의하게 감소시켰습니다(그림 4c, d). 그러나 펩타이드 번호 2077과 BACE1 펩타이드 억제제를 SA에 결합시킨 혼합물을 함유한 샘플에서만 뇌척수액에서 Abeta40의 유의미한 감소가 나타났습니다(그림 4c). 이 데이터는 펩타이드 번호 2077이 60 kDa SA 단백질을 중추신경계로 운반할 수 있으며, SA에 결합된 BACE1 펩타이드 억제제와 함께 사용 시 약리학적 효과를 유도함을 보여줍니다.
(a) 최소 3마리의 CM-삽관된 쥐에서 T7 파지의 클론 주입(2 × 10 파지/동물)은 뇌척수액 펩타이드 #2077(RLSSVDSDLSGC)과 주입하지 않은 대조군 파지(#1779)의 장기 약동학적 프로파일을 보여줍니다. (b) 파지 주입(2 × 10 파지/동물) 쥐의 대표적인 피질 미세혈관의 공초점 현미경 이미지로, 펩타이드 #2077과 혈관(렉틴)의 대조 염색을 보여줍니다. 이 파지 클론들을 3마리의 쥐에게 투여하고 관류 전 1시간 동안 순환시켰습니다. 뇌를 절편화하고 T7 파지 캡시드에 대한 다클론성 FITC 표지 항체로 염색했습니다. 관류 및 고정 10분 전에 DyLight594 표지 렉틴을 정맥 투여했습니다. 모세혈관 및 혈관주위 뇌 조직의 내강 내 미세혈관과 파지(녹색)의 내강 측 렉틴 염색(적색)을 보여주는 형광 이미지. 스케일 바는 10 µm에 해당합니다. (c, d) 바이오틴화된 BACE1 억제 펩타이드 단독 또는 바이오틴화된 이동 펩타이드 #2077과 함께 스트렙타비딘과 결합시킨 후, 최소 3마리의 CM 랫트(10 mg 스트렙타비딘/kg)에 정맥 주사했습니다. BACE1 펩타이드 억제제에 의한 Aβ40 감소는 지정된 시점에서 혈액(적색)과 뇌척수액(주황색)에서 Aβ1-40 ELISA를 통해 측정했습니다. 더 명확한 이해를 위해 그래프에 100% 배율로 점선을 그었습니다. (c) 스트렙타비딘과 BACE1 억제 펩타이드를 3:1 비율로 결합시킨 전이 펩타이드 #2077을 투여한 쥐의 혈액(빨간색 삼각형)과 뇌척수액(주황색 삼각형)에서 Aβ40의 감소율. (d) 스트렙타비딘과 BACE1 억제 펩타이드를 단독으로 투여한 쥐의 혈액 Aβ40(빨간색 원)과 뇌척수액(주황색 원)에서 Aβ40의 감소율. 대조군의 Aβ 농도는 420 pg/ml(표준편차 = 101 pg/ml)이었다.
파지 디스플레이는 여러 생의학 연구 분야에 성공적으로 적용되어 왔습니다.17 이 방법은 생체 내 혈관 다양성 연구18,19와 뇌혈관을 표적으로 하는 연구20,21,22,23,24,25,26에도 사용되었습니다. 본 연구에서는 이 선택 방법의 적용을 뇌혈관을 표적으로 하는 펩타이드의 직접적인 식별뿐만 아니라 혈액-뇌 장벽을 통과하는 능동 수송 특성을 가진 후보 물질의 발견으로까지 확장했습니다. 본 연구에서는 CM 삽관 쥐에서 개발된 생체 내 선택 절차에 대해 설명하고 뇌척수액 귀소 특성을 가진 펩타이드를 식별할 수 있는 잠재력을 보여줍니다. 12-mer 무작위 펩타이드 라이브러리를 표시하는 T7 파지를 사용하여, T7 파지가 혈액-뇌 장벽에 적응할 수 있을 만큼 충분히 작다는 것을(직경 약 60nm)10 입증하여 혈액-뇌 장벽이나 맥락총을 직접 통과할 수 있음을 보였습니다. 캐뉼라를 삽입한 CM 쥐에서 뇌척수액을 채취하는 것이 생체 내 기능 스크리닝 방법으로 잘 제어되었으며, 추출된 파지는 혈관에 결합할 뿐만 아니라 혈액-뇌 장벽을 통과하는 수송체 역할을 한다는 것을 관찰했습니다. 또한, 혈액을 채취하고 동시에 뇌척수액과 혈액 유래 파지에 HTS를 적용함으로써, 뇌척수액 선택이 혈액 농축이나 선택 단계 사이의 확장 적합성에 영향을 받지 않음을 확인했습니다. 그러나 혈액 구획은 선택 과정의 일부입니다. 뇌척수액 구획에 도달할 수 있는 파지는 뇌에서 스스로 농축될 때까지 충분히 오랫동안 혈류에서 생존하고 순환해야 하기 때문입니다. 원시 HTS 데이터에서 신뢰할 수 있는 서열 정보를 추출하기 위해, 분석 워크플로우에서 플랫폼별 시퀀싱 오류에 맞춰 조정된 필터를 구현했습니다. 스크리닝 방법에 동역학 매개변수를 통합함으로써, 혈액에서 야생형 T7 파지의 빠른 약동학(t½ ~ 28분)을 확인하였고, 또한 뇌척수액에서의 반감기(t½ ~ 26분/분)를 측정하였다. 혈액 및 뇌척수액에서 유사한 약동학 프로파일에도 불구하고, 뇌척수액에서 파지의 혈중 농도의 0.001%만 검출될 수 있었으며, 이는 혈액-뇌 장벽을 통한 야생형 T7 파지의 배경 이동성이 낮음을 나타낸다. 이 연구는 특히 순환계에서 빠르게 제거되는 파지 시스템의 경우, 중추신경계 구획에 도달할 수 있는 클론이 적기 때문에 생체 내 패닝 전략을 사용할 때 첫 번째 라운드 선택의 중요성을 강조한다. 따라서 첫 번째 라운드에서 라이브러리 다양성의 감소는 매우 컸는데, 이 매우 엄격한 뇌척수액 모델에서 최종적으로 수집된 클론의 수가 제한적이기 때문이다. 이 생체 내 패닝 전략에는 CSF 구획에서의 활성 축적, 혈액 구획에서의 클론 생존, 처음 10분 이내에 혈액에서 T7 파지 클론의 빠른 제거와 같은 여러 선택 단계가 포함되었습니다(그림 1d 및 보충 그림 4M). 따라서 첫 번째 라운드 후 CSF에서 다른 파지 클론이 확인되었지만 개별 동물에 대해 동일한 초기 풀이 사용되었습니다. 이는 라이브러리 멤버가 많은 소스 라이브러리에 대한 여러 가지 엄격한 선택 단계가 다양성의 상당한 감소로 이어짐을 시사합니다. 따라서 무작위 이벤트는 초기 선택 프로세스의 필수적인 부분이 되어 결과에 큰 영향을 미칩니다. 원래 라이브러리의 많은 클론이 매우 유사한 CSF 농축 경향을 가졌을 가능성이 높습니다. 그러나 동일한 실험 조건에서도 초기 풀의 각 특정 클론 수가 적기 때문에 선택 결과가 다를 수 있습니다.
뇌척수액(CSF)에 풍부한 모티프는 혈액에 풍부한 모티프와 다릅니다. 흥미롭게도, 개별 동물의 혈액에서 글리신이 풍부한 펩타이드로의 첫 번째 이동을 확인했습니다(그림 1g, 보충 그림 4e, 4f). 글리신 펩타이드를 함유하는 파지는 더 안정적이며 순환계에서 제거될 가능성이 더 낮을 수 있습니다. 그러나 이러한 글리신이 풍부한 펩타이드는 뇌척수액 샘플에서는 검출되지 않았는데, 이는 선별된 라이브러리가 두 가지 다른 선택 단계를 거쳤음을 시사합니다. 하나는 혈액에서, 다른 하나는 뇌척수액에 축적되도록 두는 것입니다. 네 번째 선택 단계에서 생성된 뇌척수액이 풍부한 클론은 광범위한 검사를 거쳤습니다. 개별적으로 검사된 거의 모든 클론이 블랭크 대조군 파지와 비교하여 뇌척수액이 풍부한 것으로 확인되었습니다. 한 펩타이드 히트(#2077)를 더 자세히 검사했습니다. 그것은 다른 히트(그림 3d 및 보충 그림 7)에 비해 더 긴 플라스마 반감기를 보였고, 흥미롭게도 이 펩타이드는 C-말단에 시스테인 잔기를 포함했습니다. 최근 펩타이드에 시스테인을 추가하면 알부민 29에 결합하여 약동학적 특성을 개선할 수 있다는 것이 밝혀졌습니다. 이것은 현재 펩타이드 #2077에 대해서는 알려지지 않았으며 추가 연구가 필요합니다. 일부 펩타이드는 CSF 농축에서 결합가 의존성을 보였는데(데이터 미표시), 이는 T7 캡시드의 표시된 표면 기하학과 관련이 있을 수 있습니다. 우리가 사용한 T7 시스템은 파지 입자당 각 펩타이드의 5~15개 사본을 보였습니다. IHC는 쥐의 대뇌 피질에 정맥 주사한 후보 리드 파지 클론에서 수행했습니다(보충 그림 8). 데이터는 최소 3개의 클론(2002, 2009 및 2077)이 BBB와 상호 작용한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 BBB 상호작용이 뇌척수액(CSF) 축적을 유발하는지, 아니면 이러한 클론이 BCSFB로 직접 이동하는지는 아직 밝혀지지 않았습니다. 중요한 것은, 선별된 펩타이드가 합성되어 단백질 카고에 결합된 후에도 CSF 수송 능력을 유지한다는 것입니다. N-말단 바이오틴화 펩타이드가 SA에 결합하면 혈액 및 뇌척수액에서 해당 파지 클론에서 얻은 결과가 본질적으로 반복됩니다(그림 3e). 마지막으로, 리드 펩타이드 #2077이 SA에 결합된 BACE1 바이오틴화 펩타이드 억제제의 뇌 작용을 촉진하여 뇌척수액의 Abeta40 수치를 유의미하게 감소시킴으로써 중추신경계에서 현저한 약력학적 효과를 유발함을 보여줍니다(그림 4). 모든 히트에 대한 펩타이드 서열 상동성 검색을 수행했지만, 데이터베이스에서 상동체를 찾을 수 없었습니다. T7 라이브러리의 크기는 약 10^9인 반면, 12-mer의 이론적인 라이브러리 크기는 4 x 10^15라는 점에 유의해야 합니다. 따라서 12-mer 펩타이드 라이브러리의 다양성 공간 중 극히 일부만을 선택했으며, 이는 확인된 펩타이드의 인접 서열 공간을 평가함으로써 더욱 최적화된 펩타이드를 식별할 수 있음을 의미합니다. 가설적으로, 이러한 펩타이드의 자연적 상동체를 발견하지 못한 이유 중 하나는 진화 과정에서 특정 펩타이드 모티프가 뇌로 무분별하게 유입되는 것을 방지하기 위한 선택 해제 때문일 수 있습니다.
종합적으로, 본 연구의 결과는 생체 내 뇌혈관 장벽의 수송 시스템을 더욱 자세히 규명하고 특성화하기 위한 향후 연구의 기반을 제공합니다. 이 방법의 기본 설정은 뇌혈관 결합 특성을 가진 클론을 식별할 뿐만 아니라, 성공적인 클론이 생체 내 생물학적 장벽을 통과하여 중추신경계로 이동하는 내재적 활성을 갖는 중요한 단계를 포함하는 기능적 선택 전략에 기반합니다. 본 연구의 핵심은 이러한 펩타이드의 수송 기전과 뇌 영역 특이적인 미세혈관 결합 선호도를 규명하는 것입니다. 이는 BBB 및 수용체 수송을 위한 새로운 경로의 발견으로 이어질 수 있습니다. 확인된 펩타이드는 뇌혈관 수용체 또는 BBB 또는 BCSFB를 통해 수송되는 순환 리간드에 직접 결합할 수 있을 것으로 예상됩니다. 본 연구에서 발견된 뇌척수액 수송 활성을 가진 펩타이드 벡터는 향후 추가 연구가 진행될 예정입니다. 현재 본 연구진은 BBB 및/또는 BCSFB 통과 능력에 대한 이러한 펩타이드의 뇌 특이성을 조사하고 있습니다. 이러한 새로운 펩타이드는 새로운 수용체나 경로를 발견하거나 생물학 제제와 같은 거대 분자를 뇌로 전달하기 위한 새로운 고효율 플랫폼을 개발하는 데 매우 귀중한 도구가 될 것입니다.
이전에 설명된 방법을 변형하여 큰 낭(CM)에 캐뉼라를 삽입합니다. 마취된 위스타 쥐(200-350g)를 정위 장치에 올리고, 면도하고 무균적으로 준비된 두피 위에 중앙 절개를 하여 두개골을 노출시킵니다. 상부 띠 부위에 두 개의 구멍을 뚫고 구멍에 고정 나사를 조입니다. 스테인리스 스틸 캐뉼라를 CM에 정위적으로 삽입하기 위해 외측 후두골 능선에 추가 구멍을 뚫습니다. 캐뉼라 주변에 치과용 시멘트를 바르고 나사로 고정합니다. 광경화 및 시멘트 경화 후, 피부 상처는 4/0 수프라미드 봉합사로 봉합합니다. 뇌척수액(CSF)의 자발적 누출을 통해 캐뉼라의 적절한 위치를 확인합니다. 쥐를 정위 장치에서 꺼내고, 적절한 수술 후 관리 및 통증 관리를 실시하고, 뇌척수액에서 혈액 징후가 관찰될 때까지 최소 1주일 동안 회복되도록 합니다. 위스타 랫(Crl:WI/Han)은 프랑스 샤를 리버(Charles River)에서 구입했습니다. 모든 랫은 특정 병원균이 없는 환경에서 사육되었습니다. 모든 동물 실험은 스위스 바젤 수의국의 승인을 받았으며, 동물 실험 허가 번호 2474(랫드의 뇌척수액 및 뇌 내 치료 후보 물질 농도 측정을 통한 활성 뇌 수송 평가)에 따라 수행되었습니다.
CM 캐뉼라를 손에 든 채 쥐의 의식을 유지하도록 조심스럽게 유지합니다. 캐뉼라에서 다투라를 제거하고 자발적으로 흐르는 뇌척수액 10 µl를 채취합니다. 캐뉼라의 개통성이 최종적으로 손상되었으므로, 혈액 오염이나 변색의 증거가 없는 투명한 뇌척수액 검체만 본 연구에 포함했습니다. 동시에, 꼬리 끝의 작은 절개 부위에서 약 10~20 µl의 혈액을 채취하여 헤파린(Sigma-Aldrich)이 담긴 튜브에 담았습니다. T7 파지를 정맥 주사한 후 다양한 시점에서 뇌척수액과 혈액을 채취했습니다. 각 뇌척수액 검체를 채취하기 전에 약 5~10 µl의 혈액을 버렸는데, 이는 카테터의 무용적(dead volume)에 해당합니다.
라이브러리는 T7Select 시스템 매뉴얼(Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996)에 설명된 대로 T7Select 10-3b 벡터를 사용하여 생성했습니다. 간략하게 설명하면, 무작위 12-mer DNA 삽입물을 다음 형식으로 합성했습니다.
NNK 코돈은 삽입물에서 이중 정지 코돈과 아미노산 과발현을 피하기 위해 사용되었습니다. N은 각 뉴클레오타이드의 수동 혼합 등몰 비율이며, K는 아데닌과 시토신 뉴클레오타이드의 수동 혼합 등몰 비율입니다. 단일 가닥 영역은 dNTP(Novagen)와 Klenow 효소(New England Biolabs)를 Klenow 완충액(New England Biolabs)에서 37°C에서 3시간 동안 추가로 배양하여 이중 가닥 DNA로 전환되었습니다. 반응 후, 이중 가닥 DNA를 에탄올 침전으로 회수했습니다. 생성된 DNA는 제한 효소 EcoRI과 HindIII(둘 다 Roche에서 구입)로 절단했습니다. 절단 및 정제된(QIAquick, Qiagen) 삽입물(T4 리가제, New England Biolabs)은 10B 캡시드 유전자의 348번 아미노산 뒤에 미리 절단된 T7 벡터에 프레임 내에서 연결되었습니다. 결찰 반응은 시험관 내 포장 전 16°C에서 18시간 동안 배양했습니다. 파지 시험관 내 포장은 T7Select 10-3b 클로닝 키트(Novagen)와 함께 제공된 설명서에 따라 수행했으며, 포장 용액은 대장균(BLT5615, Novagen)을 사용하여 1회 증폭하여 용해했습니다. 용해물은 원심분리, 적정 후 글리세롤 원액으로 -80°C에서 동결했습니다.
로슈(Roche)의 독점 454/앰플리콘 융합 프라이머를 사용하여 배지 또는 플레이트에서 증폭된 파지 가변 영역을 직접 PCR로 증폭합니다. 정방향 융합 프라이머는 가변 영역(NNK) 12(주형 특이적), GS FLX 티타늄 어댑터 A, 그리고 4염기 라이브러리 키 서열(TCAG)을 포함하는 서열을 포함합니다(보충 그림 1a).
역융합 프라이머에는 캡처 비드에 부착된 바이오틴과 에멀젼 PCR 중 클론 증폭에 필요한 GS FLX 티타늄 어댑터 B도 포함되어 있습니다.
앰플리콘은 454 GS-FLX Titanium 프로토콜에 따라 454/Roche 파이로시퀀싱을 거쳤습니다. 수동 Sanger 시퀀싱(Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer)의 경우, T7 파지 DNA를 PCR로 증폭하고 다음 프라이머 쌍을 사용하여 시퀀싱했습니다.
개별 플라크의 삽입물을 Roche Fast Start DNA Polymerase Kit(제조사의 지침에 따라)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 핫 스타트(95°C에서 10분)와 부스트 사이클 35회(95°C에서 50초, 50°C에서 1분, 72°C에서 1분)를 수행한다.
라이브러리 파지, 야생형 파지, 뇌척수액 및 혈액에서 회수한 파지, 또는 개별 클론을 대장균 BL5615 배지(Sigma Aldrich) 또는 500 cm² 접시(Thermo Scientific)에서 37°C에서 4시간 동안 증폭시켰다. 플레이트를 Tris-EDTA 완충액(Fluka Analytical)으로 헹구거나 멸균 피펫 팁으로 플라크를 채취하여 플레이트에서 파지를 추출하였다. 배양 상층액 또는 추출 완충액에서 폴리에틸렌 글리콜(PEG 8000) 침전(Promega)을 한 번 사용하여 파지를 분리하고 Tris-EDTA 완충액에 재현탁시켰다.
증폭된 파지는 정맥 주사(IV)(동물당 500 μl) 전에 내독소 제거 비드(Miltenyi Biotec)를 사용하여 2~3회 내독소 제거를 거쳤습니다. 첫 번째 라운드에서는 2×1012개의 파지가 도입되었고, 두 번째 라운드에서는 2×1010개의 파지가 도입되었습니다. 세 번째 및 네 번째 선택 라운드에서는 동물당 2×109개의 파지가 도입되었습니다. 지정된 시점에서 수집된 CSF 및 혈액 샘플의 파지 함량은 제조업체의 지침(T7Select 시스템 매뉴얼)에 따라 플라크 계수를 통해 결정되었습니다. 파지 선택은 정제된 라이브러리를 꼬리 정맥에 정맥 주사하거나 이전 선택 라운드에서 CSF에서 추출한 파지를 다시 주입하여 수행했으며, 이후 수확은 CSF 및 혈액 샘플에서 각각 10분, 30분, 60분, 90분, 120분, 180분 및 240분에 수행되었습니다. 총 4라운드의 생체 내 패닝을 수행하였으며, 선택된 두 가지 분지는 처음 3라운드의 선택 동안 별도로 보관하고 분석했습니다.선택의 처음 두 라운드에서 CSF에서 추출한 모든 파지 삽입물은 454/Roche 파이로시퀀싱을 거쳤고, 마지막 두 라운드의 선택에서 CSF에서 추출한 모든 클론은 수동으로 시퀀싱했습니다.선택의 첫 번째 라운드에서 얻은 모든 혈액 파지도 454/Roche 파이로시퀀싱을 거쳤습니다.파지 클론을 주입하기 위해, 선택된 파지는 500cm2 플레이트에서 37°C에서 4시간 동안 E. coli(BL5615)에서 증폭했습니다.개별적으로 선택하고 수동으로 시퀀싱한 클론은 TB 배지에서 증식했습니다.파지 추출, 정제 및 내독소 제거(위에서 설명한 대로) 후, 300μl의 2×1010 파지/동물을 한쪽 꼬리 정맥에 정맥 주사했습니다.
시퀀스 데이터의 전처리 및 정성적 필터링. 원시 454/Roche 데이터는 공급업체 소프트웨어를 사용하여 이진 표준 스트림 맵 형식(sff)에서 피어슨 사람이 읽을 수 있는 형식(fasta)으로 변환되었습니다. 뉴클레오티드 시퀀스의 추가 처리에는 아래에 설명된 대로 독점 C 프로그램 및 스크립트(미출시 소프트웨어 패키지)를 사용하여 수행되었습니다. 1차 데이터 분석에는 엄격한 다단계 필터링 절차가 포함됩니다. 유효한 12mer 삽입 DNA 서열을 포함하지 않는 리드를 필터링하기 위해, 리드를 글로벌 니들만-분쉬 검정을 사용하여 시작 라벨(GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), 종료 라벨(TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) 및 배경 삽입(CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC)에 순차적으로 정렬했습니다. 정렬당 최대 2개의 불일치를 허용합니다.31 따라서 시작 및 종료 태그가 없는 리드와 배경 삽입을 포함하는 리드, 즉 허용되는 불일치 수를 초과하는 정렬은 라이브러리에서 제거되었습니다. 나머지 리드의 경우, 시작 마크에서 시작하여 정지 마크 앞에서 끝나는 N-mer DNA 서열을 원래 리드 서열에서 잘라내어 추가 처리했습니다(이하 "삽입"이라고 함). 삽입물의 번역 후, 프라이머 5' 말단의 첫 번째 정지 코돈 이후 부분을 삽입물에서 제거했습니다. 또한, 프라이머 3' 말단의 불완전 코돈으로 이어지는 뉴클레오티드도 제거했습니다. 배경 서열만 포함하는 삽입물을 제외하기 위해 아미노산 패턴 "PAG"로 시작하는 번역된 삽입물도 제거했습니다. 번역 후 길이가 아미노산 3개 미만인 펩타이드는 라이브러리에서 제거했습니다. 마지막으로, 삽입물 풀에서 중복을 제거하고 각 고유 삽입물의 빈도를 확인했습니다. 이 분석 결과에는 뉴클레오티드 서열(삽입물)과 해당 (읽기) 빈도 목록이 포함되었습니다(보충 그림 1c 및 2).
서열 유사성에 따른 N-mer DNA 삽입물 그룹화: 454/Roche 특이적 시퀀싱 오류(예: 호모폴리머 연장 시퀀싱 문제)를 제거하고 덜 중요한 중복을 제거하기 위해, 이전에 필터링된 N-mer DNA 서열 삽입물(삽입물)을 유사성에 따라 정렬합니다. 삽입(최대 2개의 불일치 염기 허용)은 다음과 같이 정의된 반복 알고리즘을 사용하여 정렬합니다. 삽입은 먼저 빈도(높은 순서)를 기준으로 정렬하고, 동일한 경우 길이(가장 긴 순서)를 기준으로 두 번째 정렬합니다. 따라서 가장 빈번하고 가장 긴 삽입이 첫 번째 "그룹"을 정의합니다. 그룹 빈도는 주요 빈도로 설정됩니다. 그런 다음 정렬된 목록에 남아 있는 각 삽입을 쌍별 Needleman-Wunsch 정렬을 통해 그룹에 추가하려고 시도했습니다. 정렬에서 불일치, 삽입 또는 결실의 수가 임계값 2를 초과하지 않으면 삽입이 그룹에 추가되고, 전체 그룹 빈도는 삽입이 추가된 빈도만큼 증가합니다. 그룹에 추가된 삽입물은 사용됨으로 표시되고 추가 처리에서 제외됩니다. 삽입 시퀀스를 기존 그룹에 추가할 수 없는 경우, 해당 삽입 시퀀스를 사용하여 적절한 삽입 빈도를 갖는 새 그룹을 만들고 사용됨으로 표시합니다. 각 삽입 시퀀스가 ​​새 그룹을 형성하는 데 사용되었거나 기존 그룹에 포함될 수 있게 되면 반복이 종료됩니다. 결국, 뉴클레오타이드로 구성된 그룹화된 삽입물은 결국 펩타이드 서열(펩타이드 라이브러리)로 번역됩니다. 이 분석의 결과는 삽입 세트와 그에 해당하는 빈도이며, 이는 연속적인 판독 횟수를 구성합니다(보충 그림 2).
모티프 생성: 고유 펩타이드 목록을 기반으로 아래와 같이 가능한 모든 아미노산 패턴(aa)을 포함하는 라이브러리를 생성했습니다. 길이 3의 각 가능한 패턴을 펩타이드에서 추출하고, 그 역 패턴을 모든 패턴(트리펩타이드)을 포함하는 공통 모티프 라이브러리와 함께 추가했습니다. 반복 빈도가 높은 모티프 라이브러리를 시퀀싱하여 중복을 제거했습니다. 그런 다음, 모티프 라이브러리의 각 트리펩타이드에 대해 계산 도구를 사용하여 라이브러리에 존재하는지 확인했습니다. 이 경우, 발견된 모티프 트리펩타이드를 포함하는 펩타이드의 빈도를 더하여 모티프 라이브러리의 모티프에 할당했습니다("모티프 수"). 모티프 생성 결과는 모든 트리펩타이드(모티프) 발생 횟수와 각각의 값을 포함하는 2차원 배열입니다. 이 값은 리드를 필터링, 그룹화 및 번역했을 때 해당 모티프를 생성하는 시퀀싱 리드의 수입니다. 지표는 위에 자세히 설명되어 있습니다.
모티프 수와 해당 산점도의 정규화: 각 샘플의 모티프 수는 다음을 사용하여 정규화되었습니다.
여기서 ni는 주제 i를 포함하는 리드 수입니다. 따라서 vi는 샘플에서 모티프 i를 포함하는 리드(또는 펩타이드)의 백분율 빈도를 나타냅니다. 정규화되지 않은 모티프 수에 대한 p-값은 Fisher의 정확 검정을 사용하여 계산했습니다. 모티프 수의 상관도와 관련하여, 스피어만 상관관계는 R을 적용한 정규화된 모티프 수를 사용하여 계산했습니다.
펩타이드 라이브러리의 각 위치에서 아미노산 함량을 시각화하기 위해 웹 로그그램 32, 33(http://weblogo.threeplusone.com)을 생성했습니다. 먼저, 12-mer 펩타이드의 각 위치에서 아미노산 함량을 20×12 행렬에 저장합니다. 그런 다음 각 위치에서 동일한 상대 아미노산 함량을 포함하는 1000개의 펩타이드 세트를 fasta-sequence 형식으로 생성하여 웹 로그 3에 입력으로 제공합니다. 웹 로그 3은 주어진 펩타이드 라이브러리에 대해 각 위치에서 상대 아미노산 함량을 그래픽으로 표현합니다. 다차원 데이터 세트를 시각화하기 위해 R에서 자체 개발한 도구(아직 출시되지 않은 R 패키지인 biosHeatmap)를 사용하여 열 지도를 생성했습니다. 열 지도에 표시된 덴드로그램은 유클리드 거리 측정법을 사용하는 Ward의 계층적 클러스터링 방법을 사용하여 계산했습니다. 모티프 스코어링 데이터의 통계적 분석을 위해 Fisher의 정확 검정을 사용하여 비정규화 스코어링에 대한 P 값을 계산했습니다. 다른 데이터 세트의 p-값은 R에서 Student t-test 또는 ANOVA를 사용하여 계산되었습니다.
선택된 파지 클론과 삽입물이 없는 파지를 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사하였다(300 μl PBS에 동물당 2×1010개의 파지). 관류 및 후속 고정 10분 전에, 동일한 동물에게 DyLight594 표지 렉틴(Vector Laboratories Inc., DL-1177) 100 μl를 정맥 주사하였다. 파지 주사 60분 후, 랫드의 심장을 통해 50 ml PBS와 50 ml 4% PFA/PBS로 관류하였다. 뇌 샘플은 4% PFA/PBS에 하룻밤 고정하고, 30% 수크로스에 4°C에서 하룻밤 담갔다. 샘플은 OCT 혼합물에 급속 냉동하였다. 동결된 검체의 면역조직화학 분석은 1% BSA로 차단한 30 µm 동결절편을 이용하여 실온에서 수행되었으며, T7 파지(Novus NB 600-376A)에 대한 다클론성 FITC 표지 항체와 함께 4°C에서 배양하였다. 하룻밤 동안 배양하였다. 마지막으로, 절편을 PBS로 3회 세척하고 공초점 레이저 현미경(Leica TCS SP5)으로 관찰하였다.
순도 98% 이상의 모든 펩타이드는 GenScript USA에서 합성하여 바이오틴화 후 동결건조했습니다. 바이오틴은 N-말단에 추가적인 삼중 글리신 스페이서를 통해 결합되어 있습니다. 모든 펩타이드를 질량 분석법으로 확인하세요.
스트렙타비딘(Sigma S0677)을 5배 등몰 과량의 바이오틴화 펩타이드, 바이오틴화 BACE1 억제 펩타이드, 또는 바이오틴화 BACE1 억제 펩타이드와 BACE1 억제 펩타이드의 조합(3:1 비율)과 5~10% DMSO에 혼합하고 PBS에서 배양하였다. 주사 전 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 스트렙타비딘-접합 펩타이드를 뇌강이 있는 쥐의 한쪽 꼬리 정맥에 10mg/kg의 용량으로 정맥 주사하였다.
스트렙타비딘-펩타이드 복합체의 농도는 ELISA로 평가하였다. Nunc Maxisorp 마이크로타이터 플레이트(Sigma)를 1.5 μg/ml의 마우스 항스트렙타비딘 항체(Thermo, MA1-20011)로 4°C에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 블로킹(블로킹 완충액: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% 젤라틴, 1% BSA) 후, 실온에서 2시간 동안 블로킹하고, 0.05% Tween-20/PBS(세척 완충액)로 3초 동안 세척하였다. 뇌척수액과 혈장 샘플을 블로킹 완충액(혈장 1:10,000, 뇌척수액 1:115)으로 희석한 웰에 첨가하였다. 플레이트를 검출 항체(1 μg/ml, 항스트렙타비딘-HRP, Novus NB120-7239)로 4°C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 3단계 세척 후, TMB 기질 용액(Roche)에서 최대 20분 동안 배양하여 스트렙타비딘을 검출했습니다. 1M H₂SO₄로 발색을 멈춘 후, 450nm에서 흡광도를 측정했습니다.
스트렙타비딘-펩타이드-BACE1 억제제 복합체의 기능은 제조사 프로토콜(Wako, 294-64701)에 따라 Aβ(1-40) ELISA를 통해 평가했습니다. 간략하게 설명하면, 뇌척수액 샘플을 표준 희석액(1:23)에 희석하고 BNT77 포획 항체로 코팅된 96-웰 플레이트에서 4°C에서 하룻밤 동안 배양했습니다. 5단계 세척 후, HRP-결합 BA27 항체를 첨가하고 4°C에서 2시간 동안 배양한 후, 5단계 세척을 반복했습니다. Aβ(1-40)은 TMB 용액에서 실온에서 30분 동안 배양하여 검출했습니다. 발색 정지 용액으로 발색을 멈춘 후, 450 nm에서 흡광도를 측정했습니다. 혈장 샘플은 Aβ(1-40) ELISA 전에 고체상 추출했습니다. 96-웰 플레이트에 0.2% DEA(Sigma)를 첨가하고 실온에서 30분간 배양했습니다. SPE 플레이트(Oasis, 186000679)를 물과 100% 메탄올로 순차적으로 세척한 후, 혈장 샘플을 SPE 플레이트에 첨가하고 모든 액체를 제거했습니다. 샘플을 세척(먼저 5% 메탄올, 그 후 30% 메탄올)하고 2% NH4OH/90% 메탄올로 용출했습니다. 용출액을 55°C에서 99분 동안 일정한 질소 흐름 하에 건조시킨 후, 샘플을 표준 희석액으로 환원시키고 위에서 설명한 대로 Aβ(1–40)를 측정했습니다.
이 논문을 인용하는 방법: Urich, E. et al. 생체 내에서 확인된 이동 펩타이드를 이용한 뇌로의 화물 전달. 과학. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
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