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혈뇌 장벽은 생물학적 치료제가 중추신경계의 표적에 도달하는 것을 막아 신경 질환의 효과적인 치료를 저해합니다. 생체 내에서 새로운 뇌 수송체를 발굴하기 위해, T7 파지 펩타이드 라이브러리를 도입하고 캐뉼라를 삽입한 쥐의 대규모 집단 모델을 이용하여 혈액과 뇌척수액(CSF)을 연속적으로 채취했습니다. 4차례의 선별 과정을 거쳐 특정 파지 클론들이 뇌척수액에서 고농축되었습니다. 개별 후보 펩타이드에 대한 검사 결과, 뇌척수액에서 1000배 이상 농축된 것을 확인했습니다. 확인된 새로운 수송 펩타이드에 결합된 BACE1 펩타이드 억제제를 사용하여 뇌척수액 내 아밀로이드-β 수치가 40% 감소하는 것을 관찰함으로써, 펩타이드를 매개로 한 뇌 전달의 생물학적 활성을 확인했습니다. 이러한 결과는 생체 내 파지 선별 방법을 통해 발굴된 펩타이드들이 치료 효과를 가진 거대 분자를 뇌로 전신 전달하는 유용한 운반체로 활용될 수 있음을 시사합니다.
중추신경계(CNS) 표적 치료 연구는 주로 CNS 표적 특성을 나타내는 최적화된 약물 및 제제를 발굴하는 데 집중되어 왔으며, 뇌로의 능동적인 약물 전달 메커니즘을 규명하는 데는 상대적으로 노력이 부족했습니다. 그러나 최근 약물 전달, 특히 대분자 약물 전달이 현대 신경과학 약물 개발의 핵심 요소로 부상하면서 이러한 상황이 변화하고 있습니다. 중추신경계는 혈뇌장벽(BBB)과 혈뇌장벽(BCBB)으로 구성된 뇌혈관 장벽 시스템에 의해 철저하게 보호되어 있어 약물 전달이 매우 어렵습니다.^1,2 거의 모든 대분자 약물과 98% 이상의 소분자 약물이 뇌에서 제거되는 것으로 추정됩니다.³ 따라서 치료 약물을 CNS에 효율적이고 특이적으로 전달할 수 있는 새로운 뇌 수송 시스템을 개발하는 것이 매우 중요합니다.^4,5 하지만 BBB와 BCBB는 약물이 뇌의 광범위한 혈관망을 통해 뇌의 모든 구조로 침투할 수 있다는 점에서 약물 전달에 있어 탁월한 가능성을 제시합니다. 따라서 현재 뇌에 비침습적인 약물 전달 방법을 사용하려는 노력은 주로 내인성 BBB6 수용체를 이용한 수용체 매개 수송(PMT) 메커니즘에 기반하고 있습니다. 트랜스페린 수용체 경로를 이용한 최근의 중요한 발전에도 불구하고7,8, 개선된 특성을 가진 새로운 전달 시스템의 추가 개발이 필요합니다. 이러한 맥락에서, 본 연구의 목표는 뇌척수액(CSF) 수송을 매개할 수 있는 펩타이드를 발굴하는 것이었습니다. 이러한 펩타이드는 원칙적으로 중추신경계(CNS)에 거대 분자를 전달하거나 새로운 수용체 경로를 개방하는 데 사용될 수 있기 때문입니다. 특히, 뇌혈관계(BBB 및 BSCFB)의 특정 수용체 ​​및 수송체는 생물학적 치료제의 능동적이고 특이적인 전달을 위한 잠재적인 표적이 될 수 있습니다. 뇌척수액(CSF)은 맥락막총(CS)의 분비물이며, 지주막하 공간과 뇌실 공간을 통해 뇌의 간질액과 직접 접촉합니다4. 최근 연구에 따르면 지주막하 뇌척수액이 뇌의 간질 조직으로 과도하게 확산되는 것으로 나타났습니다.9 우리는 이러한 지주막하 유입 경로를 이용하거나 혈뇌장벽(BBB)을 직접 통과하여 실질 공간에 접근하고자 합니다. 이를 위해, 두 가지 경로 중 하나를 통해 운반되는 펩타이드를 이상적으로 식별할 수 있는 강력한 생체 내 파지 선택 전략을 구현했습니다.
본 연구에서는 생체 내 파지 디스플레이 스크리닝 방법을 순차적으로 수행하고, 뇌척수액(CSF) 샘플링과 고처리량 시퀀싱(HTS)을 결합하여 라이브러리 다양성이 가장 높은 초기 선별 단계를 모니터링했습니다. 혈액 오염을 방지하기 위해 대형 뇌척수액관(CM) 캐뉼라를 영구적으로 이식한 의식이 있는 쥐를 대상으로 스크리닝을 진행했습니다. 이 접근법은 뇌 표적화 펩타이드와 뇌혈관 장벽을 통과하는 수송 활성을 가진 펩타이드를 모두 선별할 수 있다는 점에서 의미가 있습니다. T7 파지는 크기가 작아(~60 nm) 내피세포 및/또는 상피-수질 장벽을 통과하는 세포간 수송에 적합하다고 알려져 있어 사용했습니다. 4차례의 패닝 후, 생체 내 CSF 농축 및 뇌 미세혈관과의 높은 연관성을 보이는 파지 집단을 분리했습니다. 특히, 선별된 최적 후보 펩타이드(화학적으로 합성)가 단백질 운반체를 뇌척수액으로 수송할 수 있음을 확인하여 연구 결과를 검증했습니다. 먼저, 주요 수송 펩타이드와 BACE1 펩타이드 억제제를 병용하여 중추신경계에서의 약동학적 효과를 규명했습니다. 생체 내 기능적 스크리닝 전략을 통해 새로운 뇌 수송 펩타이드를 효과적인 단백질 운반체로 발굴할 수 있음을 입증했을 뿐만 아니라, 유사한 기능적 선별 접근법이 새로운 뇌 수송 경로를 규명하는 데에도 중요한 역할을 할 것으로 기대합니다.
플라크 형성 단위(PFU)를 기반으로, 파지 패키징 단계 후 약 10⁹개의 다양성을 갖는 무작위 12-mer 선형 T7 파지 펩타이드 라이브러리를 설계 및 제작했습니다(재료 및 방법 참조). 생체 내 패닝 전에 이 라이브러리를 신중하게 분석했음을 강조합니다. 변형된 프라이머를 사용하여 파지 라이브러리 샘플을 PCR 증폭하여 HTS에 직접 적용 가능한 증폭 산물을 생성했습니다(보충 그림 1a). a) HTS11 시퀀싱 오류, b) 프라이머(NNK)1-12의 품질에 미치는 영향, c) 대기 라이브러리에 야생형(wt) 파지(골격 삽입물)가 존재하기 때문에 검증된 시퀀스 정보만 추출하기 위한 시퀀스 필터링 절차를 구현했습니다(보충 그림 1b). 이러한 필터링 단계는 모든 HTS 시퀀싱 라이브러리에 적용됩니다. 표준 라이브러리의 경우 총 233,868개의 리드가 얻어졌으며, 이 중 39%가 필터 기준을 통과하여 라이브러리 분석 및 후속 라운드를 위한 선택에 사용되었습니다(보충 그림 1c–e). 리드는 주로 3 염기쌍의 배수 길이였으며 36 뉴클레오티드에서 피크를 보였습니다(보충 그림 1c). 이는 라이브러리 설계(NNK) 1-12를 확인시켜 줍니다. 특히, 라이브러리 구성원의 약 11%는 12차원 야생형(wt) 백본 PAGISRELVDKL 삽입물을 포함하고 있었고, 거의 절반(49%)의 서열에는 삽입 또는 결실이 포함되어 있었습니다. 라이브러리의 HTS 분석 결과, 라이브러리 내 펩타이드의 높은 다양성이 확인되었습니다. 펩타이드 서열의 81% 이상이 한 번만 발견되었고, 1.5%만이 4회 이상 발견되었습니다(보충 그림 2a). 레퍼토리의 12개 위치 모두에서 아미노산(aa) 빈도는 퇴화된 NKK 레퍼토리에서 생성된 코돈 수에 대해 예상되는 빈도와 높은 상관관계를 보였습니다(보충 그림 2b). 이러한 삽입물에 의해 인코딩된 아미노산 잔기의 관찰된 빈도는 계산된 빈도와 높은 상관관계(r = 0.893)를 나타냈습니다(보충 그림 2c). 주입을 위한 파지 라이브러리 준비에는 증폭 및 내독소 제거 단계가 포함됩니다. 이는 이전에 파지 라이브러리의 다양성을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났습니다.12,13 따라서, 우리는 내독소 제거를 거친 플레이트 증폭 파지 라이브러리의 염기서열을 분석하고 이를 원래 라이브러리와 비교하여 아미노산 빈도를 추정했습니다. 원래 풀과 증폭 및 정제된 풀 사이에는 높은 상관관계(r = 0.995)가 관찰되었으며(보충 그림 2d), 이는 T7 파지를 사용하여 플레이트에서 증폭된 클론 간의 경쟁이 큰 편향을 유발하지 않았음을 나타냅니다. 이 비교는 각 라이브러리에서 트리펩타이드 모티프의 빈도를 기반으로 합니다. 라이브러리의 다양성(~109개)은 HTS를 사용하더라도 완전히 파악할 수 없기 때문입니다. 각 위치에서의 아미노산 빈도 분석 결과, 입력된 레퍼토리의 마지막 세 위치에서 위치에 따른 작은 편향이 나타났습니다(보충 그림 2e). 결론적으로, 라이브러리의 품질과 다양성은 허용 가능한 수준이었으며, 여러 차례의 선별 과정 사이에 파지 라이브러리를 증폭 및 준비하는 과정에서 다양성에 미미한 변화만 관찰되었습니다.
의식이 있는 쥐의 뇌척수액(CM)에 외과적으로 캐뉼라를 삽입하여 연속적인 뇌척수액 샘플링을 수행함으로써 혈뇌장벽(BBB) ​​및/또는 뇌척수액-뇌척수액 장벽(BCSFB)을 통해 정맥 주사(iv)된 T7 파지를 식별할 수 있습니다(그림 1a-b). 생체 내 선별의 첫 세 단계에서는 두 개의 독립적인 선별 경로(A 및 B)를 사용했습니다(그림 1c). 첫 세 단계의 선별 과정에서 주입되는 파지의 총량을 점차 줄여 선별의 엄격도를 높였습니다. 네 번째 선별 단계에서는 A와 B 경로의 샘플을 합쳐 세 번의 추가적인 독립적인 선별을 수행했습니다. 이 모델에서 T7 파지 입자의 생체 내 특성을 연구하기 위해 야생형 파지(PAGISRELVDKL 마스터 인서트)를 꼬리 정맥을 통해 쥐에 주입했습니다. 다양한 시점에서 뇌척수액과 혈액으로부터 파지를 회수한 결과, 비교적 작은 T7 정이십면체 파지는 혈액에서 초기에 빠르게 제거되는 것을 보여주었습니다(보충 그림 3). 투여된 파지 농도와 쥐의 혈액량을 기준으로 계산한 결과, 정맥 주사 후 10분 만에 혈액에서 검출된 파지 농도는 투여량의 약 1%에 불과했습니다. 이러한 초기 급격한 감소 이후, 27.7분의 반감기를 갖는 느린 1차 제거가 측정되었습니다. 중요한 것은 뇌척수액(CSF)에서 검출된 파지 수가 매우 적었다는 점이며, 이는 야생형 파지가 뇌척수액으로 이동하는 배경 농도가 낮음을 나타냅니다(보충 그림 3). 평균적으로 혈액에서는 T7 파지 농도가 약 1 x 10⁻³%, 뇌척수액에서는 초기 주입량의 4 x 10⁻⁸% 정도만 전체 샘플링 기간(0~250분) 동안 검출되었습니다. 특히, 뇌척수액에서 야생형 파지의 반감기(25.7분)는 혈액에서 관찰된 반감기와 유사했습니다. 이러한 데이터는 CM 캐뉼라를 삽입한 쥐에서 뇌척수액 구획과 혈액을 분리하는 장벽이 온전하게 유지되어 있음을 보여주며, 이를 통해 생체 내에서 파지 라이브러리를 선택하여 혈액에서 뇌척수액 구획으로 쉽게 이동하는 클론을 식별할 수 있습니다.
(a) 대량의 뇌척수액(CSF) 풀에서 재시료 추출 방법을 설정하는 과정. (b) 중추신경계(CNS) 장벽의 세포 위치와 혈뇌장벽(BBB) ​​및 혈뇌장벽을 통과하는 펩타이드를 식별하는 데 사용된 선택 전략을 보여주는 도표. (c) 생체 내 파지 디스플레이 스크리닝 흐름도. 각 선택 단계에서 파지(화살표 안의 동물 식별자)를 정맥 주사했다. 두 개의 독립적인 대안 분기(A, B)는 4차 선택 단계까지 별도로 유지된다. 3차 및 4차 선택 단계에서는 CSF에서 추출한 각 파지 클론을 수동으로 시퀀싱했다. (d) T7 펩타이드 라이브러리(동물당 2 x 10¹² 파지)를 정맥 주사한 후, 캐뉼라를 삽입한 두 마리 쥐에서 1차 선택 단계 동안 혈액(빨간색 원)과 뇌척수액(녹색 삼각형)에서 분리된 파지의 동역학. 파란색 사각형은 주입된 파지 양과 총 혈액량을 고려하여 계산한 혈액 내 파지의 평균 초기 농도를 나타냅니다. 검은색 사각형은 혈액 내 파지 농도에서 외삽한 y선의 교점을 나타냅니다. (e,f) 펩타이드에서 발견된 모든 가능한 중복 트리펩타이드 모티프의 상대 빈도와 분포를 나타냅니다. 1000회 측정에서 발견된 모티프의 수를 보여줍니다. 유의미하게(p < 0.001) 풍부하게 나타난 모티프는 빨간색 점으로 표시됩니다. (e) 주입된 라이브러리의 트리펩타이드 모티프의 상대 빈도와 동물 #1.1 및 #1.2의 혈액 유래 파지의 상대 빈도를 비교하는 상관 산점도입니다. (f) 혈액과 뇌척수액에서 분리된 동물 파지 #1.1 및 #1.2의 트리펩타이드 모티프의 상대 빈도를 비교하는 상관 산점도입니다. (g, h) 혈액에서 농축된 파지(g)와 주입된 라이브러리, 그리고 뇌척수액에서 농축된 파지(h)와 혈액에서 농축된 파지의 서열 식별(SEID)을 동물의 생체 내 선택 과정 후 나타낸 그림입니다. 한 글자로 된 코드의 크기는 해당 위치에서 해당 아미노산이 나타나는 빈도를 나타냅니다. 녹색은 극성, 보라색은 중성, 파란색은 염기성, 빨간색은 산성, 검은색은 소수성 아미노산을 의미합니다. 그림 1a, b는 Eduard Urich가 디자인하고 제작했습니다.
우리는 CM 기기 쥐 두 마리(A 및 B 계통)에 파지 펩타이드 라이브러리를 주입하고 뇌척수액과 혈액에서 파지를 분리했습니다(그림 1d). 라이브러리의 초기 빠른 제거는 야생형 파지에 비해 덜 두드러졌습니다. 두 동물 모두에서 주입된 라이브러리의 평균 반감기는 혈액에서 24.8분으로 야생형 파지와 유사했고, 뇌척수액에서는 38.5분이었습니다. 각 동물의 혈액 및 뇌척수액 파지 샘플을 HTS에 적용하고 확인된 모든 펩타이드에 대해 짧은 트리펩타이드 모티프의 존재 여부를 분석했습니다. 트리펩타이드 모티프는 구조 형성 및 펩타이드-단백질 상호작용의 최소 기반을 제공하기 때문에 선택되었습니다.14,15 주입된 파지 라이브러리와 두 동물의 혈액에서 추출한 클론 간의 모티프 분포에서 좋은 상관관계를 발견했습니다(그림 1e). 이 데이터는 라이브러리 구성이 혈액 구획에서 약간만 농축되어 있음을 나타냅니다. 각 위치에서 아미노산 빈도와 컨센서스 서열을 Weblogo16 소프트웨어의 변형을 사용하여 추가적으로 분석했습니다. 흥미롭게도 혈액에서 글리신 잔기가 강하게 농축된 것을 발견했습니다(그림 1g). 혈액과 뇌척수액에서 선별된 클론을 비교했을 때, 모티프의 강한 선택과 일부 탈선택이 관찰되었으며(그림 1f), 특정 아미노산이 12개 아미노산 서열의 미리 정해진 위치에 우선적으로 존재했습니다(그림 1h). 특히, 개별 동물의 뇌척수액에서는 유의미한 차이가 나타났지만, 혈액에서는 두 동물 모두에서 글리신 농축이 관찰되었습니다(보충 그림 4a–j). 동물 #1.1과 #1.2의 뇌척수액 서열 데이터를 엄격하게 필터링한 후, 각각 964개와 420개의 고유한 12개 아미노산 서열을 얻었습니다(보충 그림 1d–e). 분리된 파지 클론을 증폭하고 2차 생체 내 선별 과정을 거쳤습니다. 2차 선별에서 추출한 파지를 각 동물에서 HTS(고처리량 스크리닝)에 적용하고, 확인된 모든 펩타이드를 모티프 인식 프로그램의 입력으로 사용하여 트리펩타이드 모티프의 발생 빈도를 분석했습니다(그림 2a, b, ef). 뇌척수액에서 회수한 파지의 1차 선별 주기와 비교했을 때, A 및 B 분기에서 뇌척수액 내 여러 모티프의 추가적인 선별 및 탈선택이 관찰되었습니다(그림 2). 네트워크 식별 알고리즘을 적용하여 이러한 모티프들이 일관된 서열의 서로 다른 패턴을 나타내는지 확인했습니다. 대안적 클레이드 A(그림 2c, d)와 클레이드 B(그림 2g, h)에서 뇌척수액으로부터 회수한 12차원 서열 간에 명확한 유사성이 관찰되었습니다. 각 분기의 통합 분석 결과, 12-mer 펩타이드에 대해 서로 다른 선별 프로파일이 나타났으며(보충 그림 5c,d), 2차 선별 후 통합 클론의 뇌척수액/혈액 역가 비율이 1차 선별에 비해 시간에 따라 증가하는 것을 확인했습니다(보충 그림 5e).
생체 내 기능성 파지 디스플레이 선별을 두 차례 연속 수행하여 뇌척수액 내 모티프 및 펩타이드를 농축시켰습니다.
각 동물(동물 #1.1 및 #1.2)의 첫 번째 선별 과정에서 회수한 모든 뇌척수액 파지를 모아서 증폭하고, HT 시퀀싱한 후, SM 캐뉼라가 삽입된 2마리의 쥐(동물 #1.1 → #2.1 및 #2.2, #1.2 → #2.3 및 #2.4)에 함께 재주입했습니다(동물당 2 x 10¹⁰ 파지). (a, b, e, f) 첫 번째 및 두 번째 선별 과정에서 얻은 모든 뇌척수액 유래 파지의 트리펩타이드 모티프의 상대 빈도를 비교하는 상관 산점도. 양방향 펩타이드에서 발견된 모든 가능한 중복 트리펩타이드를 나타내는 모티프의 상대 빈도 및 분포. 1000회 판독에서 발견된 모티프 수를 나타냅니다. 비교된 라이브러리 중 하나에서 유의미하게(p < 0.001) 선택되거나 제외된 모티프는 빨간색 점으로 강조 표시됩니다. (c, d, g, h) 생체 내 선별 2차 및 1차 라운드를 기반으로 한 모든 CSF 풍부 12개 아미노산 길이 서열의 서열 로고 표현. 한 글자 코드의 크기는 해당 위치에서 해당 아미노산이 나타나는 빈도를 나타냅니다. 로고를 나타내기 위해 두 선별 라운드 사이에 개별 동물에서 추출한 CSF 서열의 빈도를 비교하고 2차 라운드에서 풍부하게 나타난 서열을 표시합니다. (c) #1.1–#2.1, (d) #1.1–#2.2, (g) #1.2–#2.3, (h) #1.2–#2.4. (c, d) 동물 번호 2.1과 2.2 또는 (g, h) 동물 번호 2.3과 2.4에서 특정 위치에서 가장 풍부하게 나타난 아미노산을 색상으로 표시합니다. 녹색 = 극성, 보라색 = 중성, 파란색 = 염기성, 빨간색 = 산성, 검은색 = 소수성 아미노산.
세 번째 선별 단계 후, 두 마리 동물에서 분리한 332개의 뇌척수액 재구성 파지 클론으로부터 124개의 고유한 펩타이드 서열(#3.1 및 #3.2)을 확인했습니다(보충 그림 6a). 서열 LGSVS(18.7%)가 가장 높은 상대적 비율을 차지했으며, 그 다음으로 야생형 삽입 서열인 PAGISRELVDKL(8.2%), MRWFFSHASQGR(3%), DVAKVS(3%), TWLFSLG(2.2%), SARGSWREIVSLS(2.2%) 순이었습니다. 마지막 네 번째 단계에서는 세 마리 동물에서 독립적으로 선별된 두 개의 분기를 통합했습니다(그림 1c). 뇌척수액에서 회수한 925개의 시퀀싱된 파지 클론 중 네 번째 단계에서 64개의 고유한 펩타이드 서열을 발견했으며(보충 그림 6b), 이 중 야생형 파지의 상대적 비율은 0.8%로 감소했습니다. 4차 선별에서 가장 흔하게 나타난 CSF 클론은 LYVLHSRGLWGFKLAAALE(18%), LGSVS(17%), GFVRFRLSNTR(14%), KVAWRVFSLFWK(7%), SVHGV(5%), GRPQKINGARVC(3.6%), RLSSVDSDLSGC(3.2%)였습니다. 선택된 펩타이드의 길이 범위는 NNK 라이브러리 설계에 퇴화 코돈을 사용할 때 라이브러리 프라이머에 뉴클레오티드 삽입/삭제 또는 조기 종결 코돈이 발생하기 때문입니다. 조기 종결 코돈은 더 짧은 펩타이드를 생성하며, 바람직한 아미노산 모티프를 포함하고 있기 때문에 선택됩니다. 더 긴 펩타이드는 합성 라이브러리 프라이머의 삽입/삭제로 인해 생성될 수 있습니다. 이로 인해 설계된 종결 코돈이 프레임 밖으로 벗어나게 되고, 하류에 새로운 종결 코돈이 나타날 때까지 읽히게 됩니다. 일반적으로, 우리는 입력 데이터와 샘플 출력 데이터를 비교하여 4단계 선별 과정 모두에 대한 농축 계수를 계산했습니다. 첫 번째 선별 단계에서는 야생형 파지 역가를 비특이적 배경 참조로 사용했습니다. 흥미롭게도, 첫 번째 뇌척수액(CSF) 주기에서는 음성 파지 선택이 매우 강했지만 혈액에서는 그렇지 않았습니다(그림 3a). 이는 펩타이드 라이브러리 구성원 대부분이 뇌척수액으로 수동 확산될 확률이 낮거나, 파지가 박테리오파지보다 혈류에서 더 효율적으로 유지되거나 제거되는 경향이 있기 때문일 수 있습니다. 그러나 두 번째 패닝 단계에서는 두 클레이드 모두에서 뇌척수액에서 파지 선택이 강하게 나타났는데, 이는 이전 단계에서 뇌척수액 흡수를 촉진하는 펩타이드를 발현하는 파지가 농축되었음을 시사합니다(그림 3a). 혈액에서는 유의미한 농축이 관찰되지 않았습니다. 세 번째와 네 번째 단계에서도 파지 클론은 뇌척수액에서 유의미하게 농축되었습니다. 마지막 두 단계의 선택 과정에서 각 고유 펩타이드 서열의 상대적 빈도를 비교한 결과, 네 번째 단계에서 해당 서열이 더욱 농축된 것을 확인했습니다(그림 3b). 두 가지 펩타이드 방향을 모두 사용하여 64개의 고유한 펩타이드 서열에서 총 931개의 트리펩타이드 모티프를 추출했습니다. 4차 라운드에서 가장 풍부하게 나타난 모티프들을 주입된 라이브러리와 비교하여 모든 라운드에 걸친 풍부도 프로파일을 자세히 분석했습니다(컷오프: 10% 풍부도)(보충 그림 6c). 일반적인 선택 패턴을 보면 연구된 대부분의 모티프가 두 선택 분기의 이전 모든 라운드에서 풍부하게 나타났습니다. 그러나 일부 모티프(예: SGL, VSG, LGS, GSV)는 주로 대안 클레이드 A에서 유래한 반면, 다른 모티프(예: FGW, RTN, WGF, NTR)는 대안 클레이드 B에서 풍부하게 나타났습니다.
뇌척수액에 농축된 파지 발현 펩타이드 및 스트렙타비딘 페이로드에 접합된 비오틴화 리더 펩타이드의 뇌척수액 수송 검증.
(a) 주입된 파지(PFU) 역가(입력 = I)와 측정된 뇌척수액 파지 역가(출력 = O)를 기반으로 4단계(R1-R4) 모두에서 계산된 농축 비율. 마지막 3단계(R2-R4)의 농축 계수는 이전 단계 및 첫 번째 단계(R1)의 중량 데이터와 비교하여 계산되었습니다. 빈 막대는 뇌척수액, 음영 막대는 혈장을 나타냅니다. (***p<0.001, Student's t-검정 기준). (b) 4단계 선별 후 뇌척수액에서 수집된 모든 파지에 대한 상대적 비율에 따라 순위를 매긴 가장 풍부한 파지 펩타이드 목록. 가장 흔한 6개의 파지 클론은 색으로 강조 표시되고 번호가 매겨져 있으며, 3단계와 4단계 선별 사이의 농축 계수가 표시되어 있습니다(삽입 그림). (c,d) 4단계에서 가장 농축된 6개의 파지 클론, 빈 파지 및 모 파지 펩타이드 라이브러리를 뇌척수액 샘플링 모델에서 개별적으로 분석했습니다. 표시된 시점에서 뇌척수액(CSF) 및 혈액 샘플을 채취했습니다. (c) 6개의 후보 파지 클론(2 x 10¹⁰ 파지/동물), 빈 파지(#1779)(2 x 10¹⁰ 파지/동물) 및 스톡 파지 펩타이드 라이브러리(2 x 10¹² 파지/동물)를 동일한 양으로 꼬리 정맥을 통해 캐뉼라 삽입된 동물에 각각 주입했습니다. 주입된 각 파지 클론과 파지 펩타이드 라이브러리의 시간에 따른 뇌척수액 약물동태학을 나타냈습니다. (d) 샘플링 시간 동안 회수된 모든 파지/mL의 평균 뇌척수액/혈액 비율을 보여줍니다. (e) 4개의 합성 리더 펩타이드와 1개의 스크램블된 대조군을 N-말단을 통해 비오틴으로 스트렙타비딘에 연결(테트라머 디스플레이)한 후 주입했습니다(꼬리 정맥 주사, 스트렙타비딘 10mg/kg). 최소 3마리의 삽관된 쥐(N=3). 지정된 시점에서 뇌척수액(CSF) 샘플을 채취하고 CSF 항스트렙타비딘 ELISA를 이용하여 스트렙타비딘 농도를 측정하였다(nd = 검출되지 않음). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA 검정 기준). (f) 4차 선별에서 가장 많이 검출된 파지 펩타이드 클론 #2002(보라색)의 아미노산 서열을 다른 파지 펩타이드 클론들과 비교하였다. 동일하거나 유사한 아미노산 단편은 색으로 표시하였다.
4차 라운드에서 농축된 모든 파지(그림 3b) 중에서 6개의 후보 클론을 CSF 샘플링 모델에서 추가적인 개별 분석을 위해 선택했습니다. 6개의 후보 파지, 빈 파지(삽입물 없음), 프로파지 펩타이드 라이브러리를 각각 동일한 양으로 세 마리의 캐뉼라 삽입 CM 동물에 주입하고, CSF(그림 3c) 및 혈액(보충 그림 7) 분석에서 약물동태학적 특성을 측정했습니다. 테스트된 모든 파지 클론은 빈 대조 파지(#1779)보다 10~1000배 높은 수준으로 CSF 구획을 표적으로 삼았습니다. 예를 들어, 클론 #2020과 #2077은 대조 파지보다 약 1000배 높은 CSF 역가를 보였습니다. 선택된 각 펩타이드의 약물동태학적 프로파일은 다르지만, 모두 높은 CSF 표적화 능력을 가지고 있습니다. 클론 #1903과 #2011의 경우 시간이 지남에 따라 지속적으로 감소하는 양상을 보였지만, 클론 #2077, #2002, #2009의 경우 처음 10분 동안 농도가 증가하는 현상이 관찰되었는데, 이는 능동 수송을 시사할 수 있으나 추가적인 검증이 필요합니다. 클론 #2020, #2002, #2077은 높은 농도에서 안정화된 반면, 클론 #2009의 뇌척수액 농도는 초기 증가 후 서서히 감소했습니다. 이후 각 뇌척수액 후보 물질의 상대적 빈도를 혈액 농도와 비교했습니다(그림 3d). 모든 샘플링 시점에서 각 뇌척수액 후보 물질의 평균 농도와 혈액 농도 간의 상관관계를 분석한 결과, 6개 후보 물질 중 3개가 혈액 뇌척수액에서 유의미하게 농축된 것으로 나타났습니다. 특히, 클론 #2077은 혈액에서 더 높은 안정성을 보였습니다(보충 그림 7). 펩타이드 자체가 파지 입자 이외의 다른 물질을 뇌척수액으로 능동적으로 운반할 수 있는지 확인하기 위해, 파지 입자에 결합하는 N-말단 부위에 비오틴을 도입한 4개의 리더 펩타이드를 합성했습니다. 비오틴화된 펩타이드(2002, 2009, 2020, 2077번)를 스트렙타비딘(SA)과 접합하여 파지의 기하학적 구조를 어느 정도 모방한 다중체 형태를 얻었습니다. 이 형태를 통해 혈액과 뇌척수액에서 SA 노출량을 물질 운반 단백질 펩타이드로서 측정할 수 있었습니다. 중요한 것은, 합성 펩타이드를 SA 접합 형태로 투여했을 때 파지 데이터가 종종 재현 가능했다는 점입니다(그림 3e). 무작위로 배열된 펩타이드는 초기 노출량이 적었고 뇌척수액에서 더 빨리 제거되어 48시간 이내에 검출되지 않았습니다. 이러한 펩타이드 파지 클론이 뇌척수액(CSF) 공간으로 전달되는 경로를 파악하기 위해, 정맥 주사 후 1시간 뒤 생체 내에서 파지 입자를 직접 검출하는 면역조직화학(IHC) 분석을 통해 개별 파지 펩타이드의 위치를 ​​분석했습니다. 특히, 클론 #2002, #2077, #2009는 뇌 모세혈관에서 강한 염색으로 검출된 반면, 대조군 파지(#1779)와 클론 #2020은 검출되지 않았습니다(보충 그림 8). 이는 이들 펩타이드가 혈뇌장벽(BBB)을 통과하여 뇌에 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 뇌-뇌-뇌 장벽(BSCFB) 경로 또한 관련될 수 있으므로, 이 가설을 검증하기 위해서는 추가적인 상세 분석이 필요합니다. 가장 많이 검출된 클론(#2002)의 아미노산 서열을 다른 선택된 펩타이드들과 비교했을 때, 일부 펩타이드들이 유사한 아미노산 연장 부분을 가지고 있는 것이 관찰되었으며, 이는 유사한 수송 메커니즘을 시사할 수 있습니다(그림 3f).
독특한 혈장 프로필과 시간에 따른 CSF의 현저한 증가로 인해, 파지 디스플레이 클론 #2077을 48시간 동안 더 자세히 조사한 결과, 지속적인 SA 수치와 관련된 CSF의 급격한 증가를 재현할 수 있었습니다(그림 4a). 다른 파지 클론들과 비교했을 때, #2077은 뇌 모세혈관에 강하게 염색되었고, 고해상도에서 관찰했을 때 모세혈관 표지자 렉틴과 상당한 공동 위치를 보였으며, 실질 공간에서도 일부 염색이 관찰되었습니다(그림 4b). 중추신경계에서 펩타이드 매개 약리학적 효과를 얻을 수 있는지 조사하기 위해, i) #2077 전이 펩타이드와 ii) BACE1 억제 펩타이드의 비오틴화 버전을 두 가지 다른 비율로 SA와 혼합하는 실험을 수행했습니다. 한 조합에서는 BACE1 펩타이드 억제제만 사용했고, 다른 조합에서는 BACE1 펩타이드 억제제와 #2077 펩타이드를 1:3 비율로 사용했습니다. 두 샘플 모두 정맥 주사로 투여되었으며, 혈액과 뇌척수액 내 베타-아밀로이드 펩타이드 40(Abeta40) 수치를 시간에 따라 측정하였다. Abeta40은 뇌 실질에서 BACE1 억제를 반영하기 때문에 뇌척수액에서 측정하였다. 예상대로 두 복합체 모두 혈중 Abeta40 수치를 유의하게 감소시켰다(그림 4c, d). 그러나 펩타이드 번호 2077과 BACE1 펩타이드 억제제가 SA에 접합된 혼합물을 함유한 샘플에서만 뇌척수액 내 Abeta40 수치가 유의하게 감소하였다(그림 4c). 이러한 결과는 펩타이드 번호 2077이 60 kDa SA 단백질을 중추신경계로 운반할 수 있으며, SA가 접합된 BACE1 펩타이드 억제제와 함께 약리학적 효과를 유도한다는 것을 보여준다.
(a) T7 파지 클론 주입(2 × 10¹⁰ 파지/동물)을 통해 최소 3마리의 CM 주입 쥐에서 뇌척수액 펩타이드 #2077(RLSSVDSDLSGC)과 주입하지 않은 대조군 파지(#1779)의 장기 약물동태학적 프로파일을 관찰하였다. (b) 파지 주입 쥐(2 × 10¹⁰ 파지/동물)의 대표적인 대뇌 피질 미세혈관을 공초점 현미경으로 관찰한 이미지로, 펩타이드 #2077과 혈관(렉틴)의 대조 염색을 보여준다. 이들 파지 클론은 3마리의 쥐에 투여하고 관류 전 1시간 동안 순환시켰다. 뇌를 절편하여 T7 파지 캡시드에 대한 FITC 표지 다클론 항체로 염색하였다. 관류 및 고정 10분 전에 DyLight594 표지 렉틴을 정맥 주사하였다. 미세혈관 내강면의 렉틴 염색(빨간색)과 모세혈관 및 혈관주위 뇌 조직 내강의 파지(녹색)를 보여주는 형광 이미지. 스케일 바는 10 µm에 해당합니다. (c, d) 비오틴화된 BACE1 억제 펩타이드를 단독으로 또는 비오틴화된 전이 펩타이드 #2077과 함께 스트렙타비딘에 접합시킨 후, 캐뉼라를 삽입한 CM 쥐 3마리 이상에 정맥 주사했습니다(스트렙타비딘 10 mg/kg). BACE1 펩타이드 억제제에 의한 Aβ40 감소는 표시된 시점에서 혈액(빨간색)과 뇌척수액(주황색)에서 Aβ1-40 ELISA로 측정했습니다. 가독성을 높이기 위해 그래프에 100% 스케일의 점선을 그었습니다. (c) 스트렙타비딘에 전이 펩타이드 #2077과 BACE1 억제 펩타이드를 3:1 비율로 접합시킨 후 처리한 쥐의 혈액(빨간색 삼각형)과 뇌척수액(주황색 삼각형)에서 Aβ40의 감소율. (d) 스트렙타비딘에 BACE1 억제 펩타이드만 접합시킨 후 처리한 쥐의 혈액(빨간색 원)과 뇌척수액(주황색 원)에서 Aβ40의 감소율. 대조군의 Aβ 농도는 420 pg/ml(표준편차 = 101 pg/ml)였다.
파지 디스플레이는 여러 생의학 연구 분야에서 성공적으로 적용되어 왔습니다.17 이 방법은 생체 내 혈관 다양성 연구18,19뿐만 아니라 뇌혈관을 표적으로 하는 연구20,21,22,23,24,25,26에도 사용되었습니다. 본 연구에서는 이 선택 방법을 뇌혈관을 표적으로 하는 펩타이드의 직접적인 식별뿐만 아니라 혈뇌장벽을 통과하는 능동 수송 특성을 가진 후보 물질의 발굴에도 적용했습니다. 본 연구에서는 CM을 주입한 쥐에서 생체 내 선택 절차를 개발하고, 이를 통해 뇌척수액(CSF) 표적 특성을 가진 펩타이드를 식별할 수 있는 가능성을 보여줍니다. 12-mer 무작위 펩타이드 라이브러리를 발현하는 T7 파지를 사용하여, T7 파지가 혈뇌장벽에 적응할 수 있을 만큼 충분히 작다는 것(직경 약 60nm)10을 입증했으며, 따라서 혈뇌장벽 또는 맥락막을 직접 통과할 수 있음을 보여주었습니다. 우리는 캐뉼라를 삽입한 CM 쥐에서 뇌척수액(CSF)을 채취하는 것이 생체 내에서 기능적 스크리닝을 위한 잘 제어된 방법임을 관찰했으며, 추출된 파지가 혈관에 결합할 뿐만 아니라 혈뇌장벽을 통과하는 운반체 역할도 한다는 것을 확인했습니다. 또한, 혈액을 동시에 채취하고 CSF 및 혈액 유래 파지에 대해 고처리량 스크리닝(HTS)을 적용함으로써, CSF 선택이 혈액 농축이나 선별 라운드 간 증식 적합성에 영향을 받지 않음을 확인했습니다. 그러나 혈액 구획은 선별 절차의 일부입니다. CSF 구획에 도달할 수 있는 파지는 뇌에서 농축될 만큼 충분히 오랫동안 혈류에서 생존하고 순환해야 하기 때문입니다. 원시 HTS 데이터에서 신뢰할 수 있는 서열 정보를 추출하기 위해 분석 워크플로우에 플랫폼별 시퀀싱 오류에 적합한 필터를 구현했습니다. 스크리닝 방법에 운동학적 매개변수를 통합함으로써, 우리는 야생형 T7 파지의 빠른 약물동태학적 특성(t½ ~ 28분)을 혈액에서 확인하였고24, 27, 28, 또한 뇌척수액에서의 반감기(t½ ~ 26분)도 측정하였다. 혈액과 뇌척수액에서 유사한 약물동태학적 프로파일을 보였음에도 불구하고, 혈중 파지 농도의 0.001%만이 뇌척수액에서 검출되었는데, 이는 야생형 T7 파지가 혈뇌장벽을 통과하는 이동성이 매우 낮음을 나타낸다. 본 연구는 생체 내 패닝 전략을 사용할 때, 특히 순환계에서 빠르게 제거되는 파지 시스템의 경우, 소수의 클론만이 중추신경계에 도달할 수 있기 때문에 1차 선별 단계의 중요성을 강조한다. 따라서, 이 매우 엄격한 뇌척수액 모델에서 최종적으로 수집된 클론의 수가 제한적이었기 때문에, 1차 선별 단계에서 라이브러리 다양성의 감소가 매우 컸다. 이 생체 내 패닝 전략에는 뇌척수액(CSF) 구획에서의 활발한 축적, 혈액 구획에서의 클론 생존, 그리고 처음 10분 이내에 혈액에서 T7 파지 클론을 신속하게 제거하는 것과 같은 여러 선택 단계가 포함되었습니다(그림 1d 및 보충 그림 4M). 따라서, 동일한 초기 풀을 개별 동물에 사용했음에도 불구하고, 첫 번째 라운드 후 뇌척수액에서 서로 다른 파지 클론이 확인되었습니다. 이는 라이브러리 구성원 수가 많은 소스 라이브러리에 대해 여러 단계의 엄격한 선택 과정을 거치면 다양성이 크게 감소함을 시사합니다. 따라서 무작위적인 사건은 초기 선택 과정의 필수적인 부분이 되어 결과에 큰 영향을 미칠 것입니다. 원래 라이브러리에 있는 많은 클론들이 뇌척수액 농축 경향이 매우 유사했을 가능성이 높습니다. 그러나 동일한 실험 조건에서도 초기 풀에 있는 각 특정 클론의 수가 적기 때문에 선택 결과가 다를 수 있습니다.
뇌척수액에서 풍부하게 나타나는 모티프는 혈액에서 나타나는 모티프와 다릅니다. 흥미롭게도, 개별 동물의 혈액에서 글리신이 풍부한 펩타이드로의 첫 번째 변화가 관찰되었습니다(그림 1g, 보충 그림 4e, 4f). 글리신 펩타이드를 포함하는 파지는 더 안정적이며 혈액 순환계에서 제거될 가능성이 더 낮을 수 있습니다. 그러나 이러한 글리신이 풍부한 펩타이드는 뇌척수액 샘플에서는 검출되지 않았는데, 이는 선별된 라이브러리가 혈액에서의 선별과 뇌척수액에서의 축적이라는 두 가지 다른 선별 단계를 거쳤음을 시사합니다. 네 번째 선별 단계에서 얻은 뇌척수액 농축 클론에 대해 광범위한 테스트를 수행했습니다. 개별적으로 테스트한 거의 모든 클론은 대조군 파지에 비해 뇌척수액에서 농축된 것으로 확인되었습니다. 하나의 펩타이드 히트(#2077)에 대해서는 더 자세히 분석했습니다. 다른 후보 물질들에 비해 혈장 반감기가 더 길었으며(그림 3d 및 보충 그림 7), 흥미롭게도 이 펩타이드는 C-말단에 시스테인 잔기를 포함하고 있었습니다. 최근 연구에 따르면 펩타이드에 시스테인을 첨가하면 알부민에 결합하여 약물동태학적 특성을 향상시킬 수 있는 것으로 나타났습니다.29 펩타이드 #2077의 경우 이러한 특성은 아직 알려지지 않았으며 추가 연구가 필요합니다. 일부 펩타이드는 뇌척수액 농축에서 원자가 의존성을 보였는데(데이터는 제시되지 않음), 이는 T7 캡시드의 표면 구조와 관련이 있을 수 있습니다. 우리가 사용한 T7 시스템은 파지 입자당 각 펩타이드가 5~15개 존재함을 보여주었습니다. 후보 선도 파지 클론을 쥐의 대뇌 피질에 정맥 주사한 후 IHC 분석을 수행했습니다(보충 그림 8). 분석 결과, 적어도 세 개의 클론(2002번, 2009번, 2077번)이 혈뇌장벽(BBB)과 상호작용하는 것으로 나타났습니다. 이 BBB 상호작용이 CSF 축적을 유발하는지 또는 이러한 클론이 BCSFB로 직접 이동하는지는 아직 밝혀지지 않았습니다. 중요한 것은, 선택된 펩타이드들이 합성되어 단백질 화물에 결합된 상태에서도 CSF 수송 능력을 유지한다는 것을 보여준다는 점입니다. N-말단에 비오틴화된 펩타이드가 SA에 결합하는 것은 혈액과 뇌척수액에서 각각의 파지 클론을 사용했을 때 얻은 결과와 본질적으로 동일합니다(그림 3e). 마지막으로, 선도 펩타이드 #2077이 SA에 접합된 비오틴화된 BACE1 억제제 펩타이드의 뇌 작용을 촉진하여 CSF 내 Aβ40 수치를 유의하게 감소시킴으로써 중추신경계에서 뚜렷한 약동학적 효과를 나타낸다는 것을 보여줍니다(그림 4). 모든 검색 결과를 대상으로 펩타이드 서열 상동성 검색을 수행했지만 데이터베이스에서 동족체를 찾을 수 없었습니다. T7 라이브러리의 크기가 약 10⁹개인 반면, 12-mer 펩타이드의 이론적인 라이브러리 크기는 4 x 10¹⁵개라는 점에 유의해야 합니다. 따라서 우리는 12-mer 펩타이드 라이브러리의 다양성 공간 중 극히 일부만을 선택했으며, 이는 식별된 히트들의 인접 서열 공간을 평가함으로써 더욱 최적화된 펩타이드를 찾아낼 수 있음을 의미합니다. 가설적으로, 우리가 이러한 펩타이드의 자연적 상동체를 발견하지 못한 이유 중 하나는 특정 펩타이드 모티프가 뇌에 무분별하게 유입되는 것을 막기 위해 진화 과정에서 선택압이 작용했을 가능성입니다.
종합적으로, 본 연구 결과는 향후 생체 내 뇌혈관 장벽의 수송 시스템을 보다 상세하게 규명하고 특성화하는 연구의 토대를 제공합니다. 본 방법의 기본 구성은 기능적 선택 전략에 기반하며, 이는 뇌혈관 결합 특성을 가진 클론을 식별할 뿐만 아니라, 성공적인 클론이 생체 내에서 생물학적 장벽을 통과하여 중추신경계(CNS) 구획으로 이동하는 고유한 활성을 갖도록 하는 중요한 단계를 포함합니다. 본 연구의 목표는 이러한 펩타이드의 수송 메커니즘과 뇌 영역 특이적인 미세혈관 결합 선호도를 규명하는 것입니다. 이는 혈뇌장벽(BBB) ​​및 수용체 수송에 대한 새로운 경로를 발견하는 데 기여할 수 있습니다. 본 연구에서 확인된 펩타이드는 뇌혈관 수용체 또는 BBB나 뇌-뇌척수액 장벽(BCSFB)을 통해 수송되는 순환 리간드에 직접 결합할 수 있을 것으로 예상됩니다. 본 연구에서 발견된 뇌척수액 수송 활성을 가진 펩타이드 벡터는 추가 연구를 통해 검증될 것입니다. 현재, 본 연구에서는 이러한 펩타이드가 BBB 및/또는 BCSFB를 통과하는 능력에 대한 뇌 특이성을 조사하고 있습니다. 이러한 새로운 펩타이드는 새로운 수용체 또는 경로를 발견하고 생물학적 제제와 같은 거대 분자를 뇌에 전달하는 고효율 플랫폼을 개발하는 데 매우 유용한 도구가 될 것입니다.
기존에 기술된 방법을 변형하여 대뇌수조(CM)에 캐뉼라를 삽입합니다. 마취된 위스타 쥐(200-350g)를 정위 고정 장치에 고정하고, 면도 및 무균 처리된 두피에 정중 절개를 하여 두개골을 노출시킵니다. 상악동 부위에 두 개의 구멍을 뚫고 고정 나사를 조입니다. 스테인리스 스틸 캐뉼라를 대뇌수조로 정위 유도하기 위해 후두골 외측 능선에 추가로 구멍을 뚫습니다. 캐뉼라 주변에 치과용 시멘트를 바르고 나사로 고정합니다. 광경화 및 시멘트 경화 후, 4/0 수프라미드 봉합사로 피부 절개 부위를 봉합합니다. 캐뉼라의 정확한 위치는 뇌척수액(CSF)의 자발적인 누출로 확인합니다. 쥐를 정위 고정 장치에서 분리하고 적절한 수술 후 관리 및 통증 관리를 시행한 후, 뇌척수액에서 혈액이 관찰될 때까지 최소 1주일 동안 회복시킵니다. 위스타 쥐(Crl:WI/Han)는 프랑스 Charles River사에서 공급받았습니다. 모든 쥐는 특정 병원균이 없는 환경에서 사육되었습니다. 모든 동물 실험은 스위스 바젤시 수의국의 승인을 받았으며, 동물 실험 허가 번호 2474(쥐의 뇌척수액 및 뇌에서 치료 후보 물질 농도 측정을 통한 능동적 뇌 수송 평가)에 따라 수행되었습니다.
CM 캐뉼라를 손에 쥔 채 쥐가 의식을 유지하도록 조심스럽게 자세를 취하게 합니다. 캐뉼라에서 다투라를 제거하고 자연적으로 흐르는 뇌척수액 10 µl를 채취합니다. 캐뉼라의 개통성이 최종적으로 손상되었으므로 혈액 오염이나 변색의 흔적이 없는 투명한 뇌척수액 샘플만 본 연구에 포함시켰습니다. 동시에 꼬리 끝부분에 작은 절개를 하여 헤파린(Sigma-Aldrich)이 들어 있는 튜브에 혈액 약 10~20 μl를 채취했습니다. 뇌척수액과 혈액은 T7 파지를 정맥 주사한 후 다양한 시점에서 채취했습니다. 각 뇌척수액 샘플을 채취하기 전에 카테터의 데드 볼륨에 해당하는 약 5~10 μl의 체액을 버렸습니다.
라이브러리는 T7Select 시스템 매뉴얼(Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996)에 설명된 대로 T7Select 10-3b 벡터를 사용하여 생성되었습니다. 간단히 말하면, 다음과 같은 형식으로 무작위 12-mer DNA 삽입물이 합성되었습니다.
NNK 코돈은 삽입된 DNA 단편에서 이중 종결 코돈과 아미노산 과발현을 방지하기 위해 사용되었습니다. N은 각 뉴클레오티드의 등몰비로 수동으로 혼합한 것이고, K는 아데닌과 시토신 뉴클레오티드의 등몰비로 수동으로 혼합한 것입니다. 단일 가닥 DNA는 dNTP(Novagen)와 클레노우 효소(New England Biolabs)를 클레노우 완충액(New England Biolabs)에 넣고 37°C에서 3시간 동안 추가 배양하여 이중 가닥 DNA로 전환했습니다. 반응 후, 이중 가닥 DNA는 에탄올 침전법으로 회수했습니다. 회수한 DNA는 제한 효소 EcoRI와 HindIII(모두 Roche 제품)로 절단했습니다. 절단 및 정제된(QIAquick, Qiagen) 삽입 DNA(T4 리가아제, New England Biolabs)는 10B 캡시드 유전자의 348번째 아미노산 이후에 미리 절단된 T7 벡터에 프레임 내에서 연결했습니다. 라이게이션 반응은 시험관 내 패키징 전에 16°C에서 18시간 동안 배양했습니다. 시험관 내 파지 패키징은 T7Select 10-3b 클로닝 키트(Novagen)에 제공된 지침에 따라 수행했으며, 패키징 용액은 대장균(BLT5615, Novagen)을 사용하여 한 번 증폭하여 용해시켰습니다. 용해액은 원심분리하고 적정 후 글리세롤 스톡 용액으로 -80°C에서 냉동 보관했습니다.
자체 개발한 454/Roche-amplicon 융합 프라이머를 사용하여 배양액 또는 플레이트에서 증폭된 파지 가변 영역의 직접 PCR 증폭. 전방 융합 프라이머는 가변 영역을 둘러싸는 서열(NNK) 12(템플릿 특이적), GS FLX 티타늄 어댑터 A 및 4개 염기 라이브러리 키 서열(TCAG)을 포함한다(보충 그림 1a).
역융합 프라이머에는 포획 비드에 부착된 비오틴과 에멀젼 PCR 중 클론 증폭에 필요한 GS FLX 티타늄 어댑터 B가 포함되어 있습니다.
증폭된 DNA 단편은 454 GS-FLX Titanium 프로토콜에 따라 454/Roche 파이로시퀀싱을 거쳤습니다. 수동 Sanger 시퀀싱(Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer)의 경우, T7 파지 DNA는 PCR로 증폭한 후 다음 프라이머 쌍을 사용하여 시퀀싱했습니다.
개별 플라크에서 추출한 DNA 단편을 Roche Fast Start DNA Polymerase Kit(제조사 지침에 따름)를 사용하여 PCR 증폭했습니다. 핫 스타트(95°C에서 10분) 및 부스트 사이클 35회(95°C에서 50초, 50°C에서 1분, 72°C에서 1분)를 수행했습니다.
라이브러리에서 얻은 파지, 야생형 파지, 뇌척수액 및 혈액에서 분리한 파지, 또는 개별 클론을 TB 배지(Sigma Aldrich) 또는 500cm² 배양 접시(Thermo Scientific)에서 37°C에서 4시간 동안 Escherichia coli BL5615 균주를 이용하여 증폭시켰다. 배양 접시를 Tris-EDTA 완충액(Fluka Analytical)으로 헹구거나 멸균 피펫 팁으로 플라크를 채취하여 파지를 추출하였다. 배양 상등액 또는 추출 완충액에서 폴리에틸렌 글리콜(PEG 8000, Promega) 침전법을 한 차례 사용하여 파지를 분리하고 Tris-EDTA 완충액에 재현탁시켰다.
증폭된 파지는 정맥 주사(500 μl/동물) 전에 내독소 제거 비드(Miltenyi Biotec)를 사용하여 2~3회 내독소 제거 과정을 거쳤습니다. 1차 주사에는 2×10¹²개의 파지를, 2차 주사에는 2×10¹⁰개의 파지를, 3차 및 4차 선택 주사에는 동물당 2×10⁹개의 파지를 주입했습니다. 지정된 시점에 채취한 뇌척수액(CSF) 및 혈액 샘플의 파지 함량은 제조사 지침(T7Select 시스템 매뉴얼)에 따라 플라크 계수법으로 측정했습니다. 파지 선택은 정제된 라이브러리를 꼬리 정맥에 정맥 주사하거나 이전 선택 단계에서 얻은 뇌척수액에서 추출한 파지를 재주입하는 방식으로 수행했으며, 이후 10분, 30분, 60분, 90분, 120분, 180분, 240분 간격으로 뇌척수액과 혈액 샘플을 채취했습니다. 총 4회의 생체 내 패닝(in vivo panning)을 수행했으며, 처음 3회 선별 과정에서는 선택된 두 가지 분기를 별도로 보관하고 분석했습니다. 처음 2회 선별 과정에서 뇌척수액(CSF)으로부터 추출한 모든 파지 삽입물은 454/Roche 파이로시퀀싱을 실시했고, 마지막 2회 선별 과정에서 뇌척수액으로부터 추출한 모든 클론은 수동으로 시퀀싱했습니다. 첫 번째 선별 과정에서 얻은 모든 혈액 파지 또한 454/Roche 파이로시퀀싱을 실시했습니다. 파지 클론 주입을 위해, 선택된 파지는 500cm² 플레이트에서 37°C, 4시간 동안 E. coli(BL5615)에서 증폭했습니다. 개별적으로 선택되고 수동으로 시퀀싱된 클론은 TB 배지에서 배양했습니다. 파지 추출, 정제 및 내독소 제거(상기 설명된 바와 같이) 후, 2×10¹⁰ 파지를 300μl에 담아 동물의 꼬리 정맥에 정맥 주사했습니다.
시퀀스 데이터의 전처리 및 정성적 필터링. 원시 454/Roche 데이터는 공급업체 소프트웨어를 사용하여 바이너리 표준 스트림 맵 형식(sff)에서 Pearson 사람이 읽을 수 있는 형식(fasta)으로 변환되었습니다. 뉴클레오티드 시퀀스의 추가 처리는 아래에 설명된 대로 자체 개발 C 프로그램 및 스크립트(미공개 소프트웨어 패키지)를 사용하여 수행되었습니다. 기본 데이터 분석에는 엄격한 다단계 필터링 절차가 포함됩니다. 유효한 12mer 삽입 DNA 시퀀스를 포함하지 않는 리드를 필터링하기 위해, 리드는 시작 레이블(GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), 정지 레이블(TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) 및 배경 삽입(CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC)에 대해 전역 Needleman-Wunsch 테스트를 사용하여 순차적으로 정렬되었습니다. 이 정렬은 정렬당 최대 2개의 불일치를 허용합니다.31 따라서 시작 및 정지 태그가 없는 리드와 배경 삽입을 포함하는 리드, 즉 허용된 불일치 수를 초과하는 정렬은 라이브러리에서 제거되었습니다. 나머지 리드에 대해서는 시작 표시부터 정지 표시 이전까지의 N-mer DNA 서열을 원래 리드 서열에서 잘라내어 추가 처리했습니다(이하 "인서트"라 함). 인서트를 번역한 후, 프라이머의 5' 말단에 있는 첫 번째 정지 코돈 이후 부분을 인서트에서 제거했습니다. 또한, 프라이머의 3' 말단에서 불완전한 코돈을 유발하는 뉴클레오티드도 제거했습니다. 배경 서열만 포함하는 인서트를 제외하기 위해, 아미노산 패턴 "PAG"로 시작하는 번역된 인서트도 제거했습니다. 번역 후 길이가 3개 미만의 아미노산인 펩타이드는 라이브러리에서 제거했습니다. 마지막으로, 인서트 풀에서 중복을 제거하고 각 고유 인서트의 빈도를 결정했습니다. 이 분석 결과에는 뉴클레오티드 서열(인서트) 목록과 해당 (리드) 빈도가 포함되었습니다(보충 그림 1c 및 2).
N-mer DNA 삽입 서열을 유사도에 따라 그룹화합니다. 454/Roche 시퀀싱 오류(예: 동종 중합체 확장 서열 문제)를 제거하고 중요도가 낮은 중복을 없애기 위해, 이전에 필터링된 N-mer DNA 서열 삽입물(inserts)을 유사도에 따라 정렬합니다. 삽입물(최대 2개의 불일치 염기 허용)은 다음과 같이 정의된 반복 알고리즘을 사용하여 정렬됩니다. 삽입물은 먼저 빈도(가장 높은 것부터 가장 낮은 것까지)에 따라 정렬되고, 동일한 경우 길이(가장 긴 것부터 가장 짧은 것까지)에 따라 2차 정렬됩니다. 따라서 가장 빈도가 높고 길이가 긴 삽입물이 첫 번째 "그룹"을 정의합니다. 그룹의 빈도는 핵심 빈도로 설정됩니다. 그런 다음 정렬된 목록에 남아 있는 각 삽입물을 쌍별 Needleman-Wunsch 정렬을 통해 그룹에 추가하려고 시도합니다. 정렬에서 불일치, 삽입 또는 삭제 횟수가 임계값 2를 초과하지 않으면 삽입물이 그룹에 추가되고 전체 그룹 빈도는 삽입물이 추가된 횟수만큼 증가합니다. 그룹에 추가된 삽입 서열은 사용된 것으로 표시되고 추가 처리에서 제외됩니다. 삽입 서열을 이미 존재하는 그룹에 추가할 수 없는 경우, 해당 삽입 서열은 적절한 삽입 빈도로 새로운 그룹을 생성하는 데 사용되고 사용된 것으로 표시됩니다. 각 삽입 서열이 새로운 그룹을 형성하는 데 사용되거나 이미 존재하는 그룹에 포함될 수 있게 되면 반복이 종료됩니다. 최종적으로, 뉴클레오티드로 구성된 그룹화된 삽입 서열은 펩타이드 서열(펩타이드 라이브러리)로 변환됩니다. 이 분석의 결과는 연속적인 읽기 횟수를 구성하는 삽입 서열과 해당 빈도의 집합입니다(보충 그림 2).
모티프 생성: 고유한 펩타이드 목록을 기반으로, 아래와 같이 가능한 모든 아미노산 패턴(aa)을 포함하는 라이브러리를 생성했습니다. 각 펩타이드에서 길이 3의 가능한 패턴을 추출하고, 해당 패턴의 역패턴을 모든 패턴을 포함하는 공통 모티프 라이브러리(트리펩타이드)에 추가했습니다. 반복성이 높은 모티프 라이브러리를 시퀀싱하고 중복을 제거했습니다. 그런 다음, 모티프 라이브러리의 각 트리펩타이드에 대해 계산 도구를 사용하여 라이브러리 내 존재 여부를 확인했습니다. 이 경우, 발견된 모티프 트리펩타이드를 포함하는 펩타이드의 빈도를 더하고 모티프 라이브러리의 해당 모티프에 할당했습니다("모티프 개수"). 모티프 생성 결과는 모든 트리펩타이드(모티프)의 발생 위치와 해당 값을 포함하는 2차원 배열입니다. 여기서 값은 시퀀싱 리드를 필터링, 그룹화 및 변환했을 때 해당 모티프를 생성하는 시퀀싱 리드의 수입니다. 측정 지표는 위에서 자세히 설명했습니다.
모티프 개수의 정규화 및 해당 산점도: 각 샘플의 모티프 개수는 다음 공식을 사용하여 정규화되었습니다.
여기서 ni는 토픽 i를 포함하는 리드의 수입니다. 따라서 vi는 샘플에서 모티프 i를 포함하는 리드(또는 펩타이드)의 백분율 빈도를 나타냅니다. 정규화되지 않은 모티프 수에 대한 p값은 Fisher의 정확 검정을 사용하여 계산했습니다. 모티프 수의 상관도에 대해서는 R을 사용하여 정규화된 모티프 수로 Spearman 상관관계를 계산했습니다.
펩타이드 라이브러리의 각 위치에서 아미노산 함량을 시각화하기 위해 웹 로고그램 32, 33(http://weblogo.threeplusone.com)을 제작했습니다. 먼저, 12-mer 펩타이드의 각 위치에서 아미노산 함량을 20×12 행렬에 저장합니다. 그런 다음, 각 위치에서 상대적인 아미노산 함량이 동일한 1000개의 펩타이드 세트를 fasta-sequence 형식으로 생성하여 웹 로고그램 3에 입력으로 제공합니다. 웹 로고그램 3은 주어진 펩타이드 라이브러리의 각 위치에서 상대적인 아미노산 함량을 그래프로 표현합니다. 다차원 데이터 세트를 시각화하기 위해 자체 개발한 R 도구(biosHeatmap, 아직 출시되지 않은 R 패키지)를 사용하여 히트맵을 생성했습니다. 히트맵에 표시된 덴드로그램은 유클리드 거리 측정법을 사용한 Ward의 계층적 클러스터링 방법을 통해 계산되었습니다. 모티프 스코어링 데이터의 통계 분석을 위해 정규화되지 않은 스코어링에 대한 P값은 Fisher의 정확 검정을 사용하여 계산했습니다. 다른 데이터 세트에 대한 p값은 R에서 스튜던트 t-검정 또는 ANOVA를 사용하여 계산되었습니다.
선별된 파지 클론과 삽입물이 없는 파지를 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사했습니다(동물당 2×10¹⁰ 파지, 300 μl PBS). 관류 및 고정 10분 전에 동일한 동물에 DyLight594로 표지된 렉틴(Vector Laboratories Inc., DL-1177) 100 μl를 정맥 주사했습니다. 파지 주사 60분 후, 쥐의 심장을 통해 PBS 50 ml로 관류한 후 4% PFA/PBS 50 ml로 관류했습니다. 뇌 샘플은 추가로 4% PFA/PBS에 하룻밤 동안 고정하고 4°C에서 30% 수크로오스 용액에 하룻밤 동안 담갔습니다. 샘플은 OCT 혼합물에 넣어 급속 냉동했습니다. 냉동 시료의 면역조직화학 분석은 실온에서 30 µm 두께의 냉동 절편을 제작하여 수행하였다. 절편은 1% BSA로 블록킹 처리한 후, T7 파지에 대한 FITC 표지 다클론 항체(Novus NB 600-376A)와 함께 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 마지막으로, 절편을 PBS로 3회 세척한 후 공초점 레이저 현미경(Leica TCS SP5)으로 관찰하였다.
모든 펩타이드는 순도 98% 이상으로 GenScript USA에서 합성되었으며, 비오틴화 및 동결건조되었습니다. 비오틴은 N-말단에 있는 추가적인 3중 글리신 스페이서를 통해 결합됩니다. 모든 펩타이드는 질량 분석법으로 확인되었습니다.
스트렙타비딘(Sigma S0677)을 비오틴화 펩타이드, 비오틴화 BACE1 억제 펩타이드, 또는 비오틴화 BACE1 억제 펩타이드와 BACE1 억제 펩타이드의 혼합물(3:1 비율)과 5배 등몰량으로 혼합하고, 5–10% DMSO/PBS 용액에서 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 주사하였다. 스트렙타비딘 접합 펩타이드를 뇌실이 있는 쥐의 꼬리 정맥 중 하나에 10 mg/kg 용량으로 정맥 주사하였다.
스트렙타비딘-펩타이드 복합체의 농도는 ELISA를 이용하여 측정하였다. Nunc Maxisorp 마이크로플레이트(Sigma)에 1.5 μg/ml 농도의 마우스 항스트렙타비딘 항체(Thermo, MA1-20011)를 첨가하여 4°C에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 실온에서 2시간 동안 블로킹 완충액(140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% 젤라틴, 1% BSA)으로 블로킹한 후, 0.05% Tween-20/PBS 용액(세척 완충액)으로 3초간 세척하였다. 블로킹 완충액으로 희석한 뇌척수액 및 혈장 샘플을 각 웰에 첨가하였다(혈장 1:10,000, 뇌척수액 1:115). 이후 검출 항체(1 μg/ml, 항스트렙타비딘-HRP, Novus NB120-7239)를 첨가하여 4°C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 3단계 세척 후, 스트렙타비딘은 TMB 기질 용액(Roche)에서 최대 20분 동안 배양하여 검출하였다. 1M H2SO4로 발색 반응을 중단시킨 후, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
스트렙타비딘-펩타이드-BACE1 억제제 복합체의 기능은 제조사 프로토콜(Wako, 294-64701)에 따라 Aβ(1-40) ELISA를 이용하여 평가하였다. 간단히 설명하면, 뇌척수액(CSF) 샘플을 표준 희석액(1:23)에 희석하고 BNT77 포획 항체가 코팅된 96웰 플레이트에서 4°C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 5회 세척 후, HRP 접합 BA27 항체를 첨가하고 4°C에서 2시간 동안 배양한 후 다시 5회 세척하였다. Aβ(1-40)는 TMB 용액에서 실온에서 30분 동안 배양하여 검출하였다. 발색 반응을 정지 용액으로 중단시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 혈장 샘플은 Aβ(1-40) ELISA 전에 고체상 추출을 시행하였다. 혈장을 96웰 플레이트에 0.2% DEA(Sigma)와 함께 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하였다. SPE 플레이트(Oasis, 186000679)를 물과 100% 메탄올로 순차적으로 세척한 후, 혈장 시료를 SPE 플레이트에 첨가하고 모든 액체를 제거했습니다. 시료를 세척(먼저 5% 메탄올, 그 다음 30% 메탄올)하고 2% NH4OH/90% 메탄올로 용출했습니다. 용출액을 55°C에서 99분 동안 일정한 N2 전류 하에 건조시킨 후, 표준 희석액으로 환원시키고 앞서 설명한 방법으로 Aβ(1–40)를 측정했습니다.
이 논문을 인용하는 방법: Urich, E. et al. 생체 내에서 확인된 전이 펩타이드를 이용한 뇌로의 화물 전달. 과학. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
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