Kea leboha ha le etetse Nature.com. O sebedisa mofuta wa sebatli o nang le tshehetso e fokolang ya CSS. Bakeng sa boiphihlelo bo botle ka ho fetisisa, re kgothaletsa hore o sebedise sebatli se ntjhafaditsweng (kapa o tima Mokgwa wa ho Kopana ho Internet Explorer). Ho feta moo, ho netefatsa tshehetso e tswelang pele, re bontsha sebaka sena sa marang-rang ntle le mekgwa le JavaScript.
E bonts'a carousel ea li-slide tse tharo ka nako e le 'ngoe. Sebelisa likonopo tsa E fetileng le tse Latelang ho tsamaea ka har'a li-slide tse tharo ka nako, kapa sebelisa likonopo tsa li-slider qetellong ho tsamaea ka har'a li-slide tse tharo ka nako.
Thibelo ea mali le boko le thibelo ea mali le boko li thibela metsoako ea phekolo ea lintho tse phelang ho fihlela lipheo tsa tsona tsamaisong ea methapo e bohareng, ka hona li sitisa kalafo e sebetsang ea mafu a methapo. Ho sibolla li-transporter tse ncha tsa boko ka har'a 'mele, re hlahisitse laeborari ea peptide ea T7 phage le mali a bokelletsoeng ka tatellano le mokelikeli oa cerebrospinal (CSF) re sebelisa mohlala oa likhoto tse kholo tse nang le cannulated. Li-clone tse khethehileng tsa phage li ile tsa ruisoa haholo ho CSF ​​kamora likhetho tse 'ne. Liteko tsa li-peptide tse khethiloeng ka bomong li senotse ntlafatso e fetang makhetlo a 1000 ho CSF. Mosebetsi oa bioactive oa ho tlisoa ha peptide bokong o tiisitsoe ke phokotso ea 40% boemong ba amyloid-β mokelikeling oa cerebrospinal ho sebelisoa inhibitor ea peptide ea BACE1 e hokahantsoeng le peptide e ncha ea transit e khethiloeng. Liphetho tsena li bontša hore li-peptide tse khethiloeng ke mekhoa ea khetho ea phage ka har'a 'mele e ka ba likoloi tse molemo bakeng sa ho isa li-macromolecule bokong ka mokhoa o hlophisitsoeng ka phello ea phekolo.
Patlisiso ea phekolo e shebaneng le tsamaiso ea methapo ea bohareng (CNS) e shebane haholo le ho khetholla meriana le li-agent tse ntlafalitsoeng tse bontšang thepa e shebaneng le CNS, ka boiteko bo fokolang ba ho sibolla mekhoa e susumetsang ho tlisoa ha meriana e sebetsang bokong. Sena se qala ho fetoha hona joale kaha ho tlisoa ha meriana, haholo-holo limolek'hule tse kholo, ke karolo ea bohlokoa ea nts'etsopele ea meriana ea methapo ea kutlo ea sejoale-joale. Tikoloho ea tsamaiso ea methapo ea bohareng e sirelelitsoe hantle ke tsamaiso ea thibelo ea methapo ea kutlo, e nang le thibelo ea mali-bokong (BBB) ​​​​le thibelo ea mali-bokong (BCBB)1, e leng se etsang hore ho be thata ho isa lithethefatsi bokong1,2. Ho hakanngoa hore hoo e ka bang meriana eohle e meholo ea limolek'hule le meriana e fetang 98% ea limolek'hule tse nyane li tlosoa bokong3. Ke ka lebaka leo ho leng bohlokoa haholo ho khetholla litsamaiso tse ncha tsa ho tsamaisa boko tse fanang ka phepelo e sebetsang le e tobileng ea meriana ea phekolo ho CNS 4,5. Leha ho le joalo, BBB le BCSFB le tsona li fana ka monyetla o motle oa ho fanoa ha meriana ha li ntse li kenella le ho kena meahong eohle ea boko ka methapo ea mali e pharaletseng. Kahoo, boiteko ba hona joale ba ho sebelisa mekhoa e sa keneleng bokong bo ipapisitse haholo le mokhoa oa ho tsamaisa li-receptor (PMT) ho sebelisoa receptor ea BBB6 ea tlhaho. Ho sa tsotellehe tsoelo-pele ea bohlokoa ea morao tjena ho sebelisoa tsela ea transferrin receptor7,8, ho hlokahala nts'etsopele e eketsehileng ea litsamaiso tse ncha tsa ho tsamaisa tse nang le thepa e ntlafalitsoeng. Ho fihlela sena, sepheo sa rona e ne e le ho khetholla li-peptide tse khonang ho tsamaisa li-CSF, kaha ka molao-motheo li ka sebelisoa ho isa li-macromolecule ho CNS kapa ho bula litsela tse ncha tsa li-receptor. Haholo-holo, li-receptor tse itseng le li-transporter tsa sistimi ea cerebrovascular (BBB le BSCFB) li ka sebetsa e le lipheo tse ka bang teng bakeng sa ho fana ka meriana ea biotherapeutic e sebetsang le e khethehileng. Mokelikeli oa cerebrospinal (CSF) ke sehlahisoa sa cretory sa choroid plexus (CS) 'me se kopana ka ho toba le mokelikeli oa interstitial oa boko ka sebaka sa subarachnoid le sebaka sa ventricular4. Haufinyane ho bontšitsoe hore mokelikeli oa subarachnoid cerebrospinal o hasane haholo ka har'a interstitium ea boko9. Re tšepa ho fihlella sebaka sa parenchymal re sebelisa tsela ena ea subarachnoid e kenang kapa ka kotloloho ka BBB. Ho fihlela sena, re kentse tšebetsong leano le matla la khetho ea phage ea in vivo le khethollang ka ho khetheha li-peptide tse tsamaisoang ke e 'ngoe ea litsela tsena tse peli tse fapaneng.
Jwale re hlalosa mokgwa wa tlhahlobo ya pontsho ya phage ka tatellano ka ho nka disampole tsa CSF hammoho le ho latellana ha ho feta (HTS) ho lekola dikotwana tsa kgetho tsa pele ka mefuta e mengata ya laeborari. Tlhahlobo e entswe ho dikotwana tse tsebang ka cannula e kgolo ya cisterna (CM) e kentsweng ka ho sa feleng ho qoba tšilafalo ya madi. Habohlokoa, mokgwa ona o kgetha ho shebana le boko le dipeptide tse nang le ts'ebetso ya ho tsamaisa ho pholletsa le mokoallo wa methapo ya boko. Re sebedisitse diphage tsa T7 ka lebaka la boholo ba tsona bo bonyenyane (~60 nm)10 mme ra fana ka maikutlo a hore di loketse ho tsamaisa di-vesicles tse dumellang ho tshela mokoallo wa endothelial le/kapa epithelial-medulla. Kamora dikotwana tse nne tsa ho panning, dihlopha tsa diphage di ile tsa arolwa di bontsha matla a ho rua CSF ka hara mmele le kamano e matla ya dikotwana tse nyane tsa boko. Habohlokoa, re ile ra kgona ho netefatsa diphihlello tsa rona ka ho bontsha hore di-peptide tse ntle ka ho fetisisa tse kgethilweng le tse entsweng ka dikhemikhale di kgona ho tsamaisa thepa ya protheine ho ya mokelikeling wa boko. Taba ea pele, litlamorao tsa pharmacodynamic tsa CNS li thehiloe ka ho kopanya peptide e etellang pele ea transit le thibelo ea peptide ea BACE1. Ntle le ho bontša hore maano a tlhahlobo ea ts'ebetso ea in vivo a ka khetholla li-peptide tse ncha tsa transport ea boko e le lijari tse sebetsang tsa thepa ea protheine, re lebeletse hore mekhoa e ts'oanang ea khetho ea ts'ebetso le eona e be ea bohlokoa ho khethoeng litsela tse ncha tsa transport ea boko.
Ho latela diyuniti tse etsang plaque (PFU), kamora mohato wa ho paka phage, laeborari ya di-peptide tsa phage tsa T7 tse sa reroang tse 12-mer tse nang le mefuta e fapaneng ya tse ka bang 109 e ile ya etswa le ho etswa (sheba Disebediswa le Mekgwa). Ho bohlokwa ho hlokomela hore re ile ra sekaseka laeborari ena ka hloko pele ho panning ya in vivo. Ho atoloswa ha PCR ha disampole tsa laeborari ya phage ho sebediswa di-primer tse fetotsweng ho ile ha hlahisa di-amplicons tse neng di sebetsa ka ho toba ho HTS (Setshwantsho se Tlatsetsang sa 1a). Ka lebaka la a) diphoso tsa ho latellana ha HTS11, b) tshusumetso boleng ba di-primer (NNK)1-12, le c) boteng ba di-phage tsa mofuta wa wild-type (wt) (di-skeleton inserts) laeboraring e emetseng, mokgwa wa ho sefa tatellano o ile wa kenngwa tshebetsong ho ntsha tlhahisoleseding e netefaditsweng ya tatellano feela (Setshwantsho se Tlatsetsang sa 1b). Mehato ena ya sefa e sebetsa ho dilaeborari tsohle tsa ho latellana ha HTS. Bakeng sa laeborari e tloaelehileng, ho fumanoe kakaretso ea libali tse 233,868, tseo ho tsona 39% li fetisitseng litekanyetso tsa sefa 'me li sebelisitsoe bakeng sa tlhahlobo ea laeborari le khetho bakeng sa lipotoloho tse latelang (Setšoantšo se Tlatsetsang 1c–e). Libali tse neng li baloa e ne e le li-multiples tsa lipara tse 3 tsa motheo ka bolelele tse nang le tlhoro ea li-nucleotide tse 36 (Setšoantšo se Tlatsetsang 1c), tse tiisang moralo oa laeborari (NNK) 1-12. Haholo-holo, hoo e ka bang 11% ea litho tsa laeborari li ne li e-na le mokokotlo oa PAGISRELVDKL oa mofuta oa 12-dimensional wild-type (wt), 'me hoo e ka bang halofo ea li-tatelano (49%) li ne li e-na le li-insertion kapa li-deletion. HTS ea laeborari ea laeborari e tiisitse mefuta e mengata ea li-peptide laeboraring: ho feta 81% ea li-tatelano tsa peptide li fumanoe hanngoe feela 'me ke 1.5% feela e etsahetseng likoping tse ≥4 (Setšoantšo se Tlatsetsang 2a). Maqhubu a li-amino acid (aa) maemong 'ohle a 12 ho repertoire a ne a amana hantle le maqhubu a lebeletsoeng bakeng sa palo ea li-codon tse hlahisoang ke repertoire ea NKK e senyehileng (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 2b). Maqhubu a bonoang a masala a aa a kentsoeng ke li-insert tsena a amana hantle le maqhubu a baliloeng (r = 0.893) (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 2c). Ho lokisoa ha lilaebrari tsa phage bakeng sa ente ho kenyelletsa mehato ea ho eketsa le ho tlosa endotoxin. Sena se se se bontšitsoe pele hore se ka fokotsa mefuta-futa ea lilaebrari tsa phage12,13. Ka hona, re ile ra hlophisa laebrari ea phage e atolositsoeng ka poleiti e neng e tlositsoe endotoxin 'me ra e bapisa le laebrari ea pele ho hakanya maqhubu a AA. Kamano e matla (r = 0.995) e ile ea bonoa pakeng tsa letamo la pele le letamo le atolositsoeng le le hloekisitsoeng (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 2d), se bontšang hore tlholisano pakeng tsa li-clone tse atolositsoeng lipoleiting tse sebelisang phage ea T7 ha ea ka ea baka leeme le leholo. Papiso ena e ipapisitse le makhetlo a di-motif tsa tripeptide laeboraring ka nngwe, kaha mefutafuta ya dilaeborari (~109) e ke ke ya hapuwa ka botlalo esita le ka HTS. Tlhahlobo ya makgetlo a aa sebakeng ka seng e senotse leeme le lenyenyane le itshetlehileng ka boemo maemong a mararo a ho qetela a repertoire e kentsweng (Setshwantsho se Tlatsetsang sa 2e). Ha re phethela, re fihletse qeto ya hore boleng le mefutafuta ya laeborari di ne di amoheleha mme ke diphetoho tse nyane feela mefutafuta tse bontshitsweng ka lebaka la ho atoloswa le ho lokiswa ha dilaeborari tsa phage pakeng tsa mekhahlelo e mmalwa ya kgetho.
Ho etsa sampole ea mokelikeli oa boko o otlolohileng ho ka etsoa ka ho kenya cannula ka opereishene ho CM ea litoeba tse tsebang ho nolofatsa ho tseba phage ea T7 e kenngoeng ka har'a methapo (iv) ka BBB le/kapa BCSFB (Setšoantšo sa 1a-b). Re sebelisitse matsoho a mabeli a ikemetseng a khetho (matsoho A le B) lipotolohong tse tharo tsa pele tsa khetho ea in vivo (Setšoantšo sa 1c). Re ile ra eketsa butle-butle ho thatafala ha khetho ka ho fokotsa kakaretso ea phage e hlahisitsoeng lipotolohong tse tharo tsa pele tsa khetho. Bakeng sa potoloho ea bone ea ho kenya, re kopantse lisampole ho tsoa makaleng a A le B mme ra etsa likhetho tse ling tse tharo tse ikemetseng. Ho ithuta thepa ea in vivo ea likaroloana tsa phage tsa T7 mohlaleng ona, phage ea mofuta oa wild-type (PAGISRELVDKL master insert) e ile ea kenngoa litoebeng ka mothapo oa mohatla. Ho hlaphoheloa ha phage ho tsoa mokelikeling oa boko le maling ka linako tse fapaneng ho bontšitse hore phage ea T7 icosahedral e nyane e ne e e-na le mohato oa pele oa ho tlosoa ka potlako ho tloha karolong ea mali (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 3). Ho latela di-titer tse fanweng le bophahamo ba madi a ditoeba, re badile hore ke phage e ka bang 1% feela ya wt. phage ho tswa tekanyong e fanweng e ileng ya fumanwa mading metsotso e 10 kamora ho entelwa ka methapo. Kamora ho theoha hona ha pele ka potlako, ho ile ha lekanngwa ho tlosa ha karolo ya pele butle ka halofo ya bophelo ba metsotso e 27.7. Habohlokoa, ke di-phage tse mmalwa feela tse ileng tsa nkuwa karolong ya CSF, e leng se bontshang bokamorao bo tlase ba ho falla ha phage ya mofuta wa hlaha ho ya karolong ya CSF (Setshwantsho se Tlatsetsang sa 3). Ka karolelano, ke di-titer tse ka bang 1 x 10-3% feela tsa phage ya T7 mading le 4 x 10-8% ya di-phage tse kentsweng qalong tse ileng tsa fumanwa mokelikeling wa cerebrospinal nakong yohle ya ho nka sampole (metsotso e 0-250). Haholoholo, halofo ya bophelo (metsotso e 25.7) ya phage ya mofuta wa hlaha mokelikeling wa cerebrospinal e ne e tshwana le e bonweng mading. Lintlha tsena li bontša hore mokoallo o arolang karolo ea CSF ho mali o ntse o le teng ho likhoto tse nang le CM-cannulated, e leng se lumellang khetho ea lilaebrari tsa phage ka har'a 'mele ho khetholla li-clone tse tsamaisoang habonolo ho tloha maling ho ea karolong ea CSF.
(a) Ho theha mokhoa oa ho nka sampole hape mokelikeli oa boko (CSF) ho tsoa letamong le leholo. (b) Setšoantšo se bontšang sebaka sa sele sa thibelo ea tsamaiso ea methapo ea bohareng (CNS) le leano la khetho le sebelisoang ho khetholla li-peptide tse tšelang thibelo ea mali le boko (BBB) ​​​​le thibelo ea mali le boko. (c) Chate ea phallo ea pontšo ea phage ea in vivo. Potolohong ka 'ngoe ea khetho, li-phage (li-identifier tsa liphoofolo tse ka hare ho metsu) li ile tsa kenngoa ka methapo. Makala a mabeli a ikemetseng a mang (A, B) a bolokoa ka thoko ho fihlela potolohong ea 4 ea khetho. Bakeng sa potoloho ea khetho ea 3 le ea 4, clone e 'ngoe le e 'ngoe ea phage e ntšitsoeng ho CSF ​​e ile ea hlophisoa ka letsoho. (d) Kinetics ea phage e arotsoeng maling (li-circles tse khubelu) le mokelikeli oa boko (likhutlotharo tse tala) nakong ea potoloho ea pele ea khetho ho likhoto tse peli tse nang le cannulated kamora ho kenngoa ka methapo laeboraring ea peptide ea T7 (2 x 1012 phages/phoofolo). Lisekwere tse putsoa li bontša karolelano ea karolelano ea pele ea phage maling, e baloang ho tloha ho bongata ba phage e kenngoeng, ho nahanoa ka bongata ba mali kaofela. Lisekwere tse ntšo li bontša ntlha ea ho kopana ha mola oa y o nkiloeng ho tsoa ho bongata ba phage ea mali. (e,f) Hlahisa makhetlo a amanang le kabo ea li-motif tsohle tse ka bang teng tsa tripeptide tse kopaneng tse fumanoang ho peptide. Palo ea li-motif tse fumanoeng lipalo tse 1000 e bontšitsoe. Habohlokoa (p < 0.001) li-motif tse ntlafalitsoeng li tšoailoe ka matheba a khubelu. (e) Sekhahla sa khokahano se bapisang makhetlo a amanang a motif ea tripeptide ea laeborari e kenngoeng le phage e nkiloeng maling ho tsoa liphoofolong #1.1 le #1.2. (f) Sekhahla sa khokahano se bapisang makhetlo a amanang a li-motif tsa phage ea liphoofolo #1.1 le #1.2 tse arotsoeng maling le mokelikeling oa cerebrospinal. (g, h) Sequence ID e emeloang ke phage e ruileng maling (g) khahlanong le lilaeborari tse kenngoeng le phage e ruileng ho CSF ​​(h) khahlanong le mali kamora ho khethoa ha in vivo liphoofolong ka bobeli. Boholo ba khoutu ea tlhaku e le 'ngoe bo bontša hore na amino acid eo e hlaha hangata hakae sebakeng seo. Botala = polar, pherese = neutral, blue = basic, red = acidic le black = hydrophobic amino acids. Setšoantšo sa 1a, b se entsoe le ho hlahisoa ke Eduard Urich.
Re kentse laeborari ea phage peptide ka har'a likhoto tse peli tsa CM (clades A le B) le phage e arohaneng ho tsoa mokelikeling oa cerebrospinal le maling (Setšoantšo sa 1d). Ho tlosoa ha laeborari ka potlako ho ne ho sa bonahale haholo ha ho bapisoa le phage ea mofuta oa wild-type. Bophelo bo tloaelehileng ba halofo ea laeborari e kenngoeng liphoofolong ka bobeli e ne e le metsotso e 24.8 maling, e tšoanang le phage ea mofuta oa wild-type, le metsotso e 38.5 ho CSF. Lisampole tsa phage ea mokelikeli oa mali le oa cerebrospinal ho tsoa phoofolong ka 'ngoe li ile tsa etsoa HTS 'me li-peptide tsohle tse khethiloeng li ile tsa hlahlojoa bakeng sa boteng ba motif e khutšoanyane ea tripeptide. Li-motif tsa Tripeptide li khethiloe hobane li fana ka motheo o fokolang oa ho thehoa ha sebopeho le likamano tsa peptide-protein14,15. Re fumane kamano e ntle kabong ea li-motif pakeng tsa laeborari ea phage e kenngoeng le li-clone tse ntšitsoeng maling a liphoofolo ka bobeli (Setšoantšo sa 1e). Lintlha li bontša hore sebopeho sa laeborari se ruisitsoe hanyane feela karolong ea mali. Maqhubu a amino acid le tatellano ea tumellano li ile tsa hlahlojoa hape sebakeng se seng le se seng ho sebelisoa phetoho ea software ea Weblogo16. Hoa thahasellisa hore re fumane keketseho e matla masala a glycine maling (Setšoantšo sa 1g). Ha mali a bapisoa le li-clone tse khethiloeng ho tsoa ho CSF, ho ile ha bonoa khetho e matla le ho tlosoa ha motifs (Setšoantšo sa 1f), 'me li-amino acid tse itseng li ne li le teng ka mokhoa o khethehileng maemong a reriloeng esale pele lithong tse 12 (Setšoantšo sa 1h). Haholo-holo, liphoofolo ka bomong li ne li fapane haholo mokelikeling oa cerebrospinal, athe keketseho ea glycine maling e ile ea bonoa liphoofolong ka bobeli (Setšoantšo sa Tlatsetso sa 4a-j). Kamora ho sefa ka thata lintlha tsa tatellano mokelikeling oa cerebrospinal oa liphoofolo #1.1 le #1.2, ho ile ha fumanoa li-peptide tse ikhethang tse 964 le 420 tse 12-mer (Setšoantšo sa Tlatsetso sa 1d-e). Li-clone tsa phage tse arohaneng li ile tsa atolosoa 'me tsa kenngoa potolohong ea bobeli ea khetho ea in vivo. Phage e ntšitsoeng potolohong ea bobeli ea khetho e ile ea kenngoa HTS phoofolong e 'ngoe le e 'ngoe 'me li-peptide tsohle tse khethiloeng li ile tsa sebelisoa e le kenyelletso lenaneong la ho lemoha motif ho sekaseka ho hlaha ha li-motif tsa tripeptide (Setšoantšo sa 2a, b, ef). Ha ho bapisoa le potoloho ea pele ea phage e fumanoeng ho CSF, re bone khetho e eketsehileng le ho tlosoa ha li-motif tse ngata ho CSF ​​makaleng a A le B (Setšoantšo sa 2). Algorithm ea boitsebiso ba marang-rang e sebelisitsoe ho fumana hore na li emela mekhoa e fapaneng ea tatellano e tsitsitseng. Ho tšoana ho hlakileng ho ile ha bonoa pakeng tsa tatellano ea litekanyo tse 12 tse fumanoeng ke CSF ho clade e 'ngoe ea A (Setšoantšo sa 2c, d) le clade B (Setšoantšo sa 2g, h). Tlhahlobo e kopantsoeng lekaleng ka leng e senotse liprofaele tse fapaneng tsa khetho bakeng sa li-peptide tse 12-mer (Setšoantšo sa Tlatsetso sa 5c, d) le keketseho ea karolelano ea CSF/titer ea mali ha nako e ntse e ea bakeng sa li-clone tse kopantsoeng kamora potoloho ea bobeli ea khetho ha ho bapisoa le potoloho ea pele ea khetho (Setšoantšo sa Tlatsetso sa 5e).).
Ho ntlafala ha di-motif le di-peptide ka hara mokelikeli wa boko ka di-round tse pedi tse latellanang tsa kgetho ya pontsho ya phage e sebetsang ka hare ho vivo.
Li-phage tsohle tsa mokelikeli oa boko tse fumanoeng potolohong ea pele ea phoofolo ka 'ngoe (liphoofolo #1.1 le #1.2) li ile tsa kopanngoa, tsa atolosoa, tsa aroloa ka HT 'me tsa kenngoa hape hammoho (li-phage tse 2 x 1010/phoofolo) Likhoto tse 2 tsa SM tse nang le makotikoti (#1.1 → #). 2.1 le 2.2, 1.2 → 2.3 le 2.4). (a,b,e,f) Li-scatterplot tsa kamano tse bapisang makhetlo a amanang a li-motif tsa tripeptide tsa li-phage tsohle tse nkiloeng ho CSF ​​potolohong ea pele le ea bobeli ea khetho. Makhetlo a amanang le kabo ea li-motif tse emelang li-tripeptide tsohle tse ka bang teng tse fumanehang li-peptide ka bobeli. Palo ea li-motif tse fumanoeng lipalo tse 1000 e bontšoa. Li-motif tse neng li khethiloe haholo (p < 0.001) kapa li sa kenyelletsoa ho e 'ngoe ea lilaebrari tse bapisoang li totobatsoa ka matheba a khubelu. (c, d, g, h) Setshwantsho sa letshwao la tatellano ya di-amino acid tse 12 tse ruileng ka CSF tse thehilweng hodima di-circle 2 le 1 tsa kgetho ya in vivo. Boholo ba khoutu ya tlhaku e le nngwe bo bontsha hore na amino acid eo e hlaha hangata hakae sebakeng seo. Ho emela letshwao, kgafetsa ya di-CSF tse ntshitsweng diphoofolong ka bomong pakeng tsa di-circle tse pedi tsa kgetho e a bapiswa mme di-direction tse ruilweng potolohong ya bobedi di a bontshwa: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 le (h) #1.2–#2.4. Di-amino acid tse ruilweng ka ho fetisisa sebakeng se itseng ho diphoofolo tsa (c, d) nomoro ya 2.1 le nomoro ya 2.2 kapa (g, h) ho diphoofolo tsa nomoro ya 2.3 le nomoro ya 2.4 di bontshwa ka mmala. Botala = polar, pherese = neutral, blue = basic, red = acidic le black = hydrophobic amino acid.
Kamora potoloho ea boraro ea khetho, re hlwaile tatellano ea li-peptide tse ikhethang tse 124 (#3.1 le #3.2) ho tsoa ho li-clone tsa phage tse 332 tse entsoeng bocha tsa CSF tse arotsoeng ho liphoofolo tse peli (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 6a). Tatellano ea LGSVS (18.7%) e ne e e-na le karolo e phahameng ka ho fetisisa e amanang, e lateloa ke li-inserts tsa mofuta oa tlhaho PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), le SARGSWREIVSLS (2.2%). Potolohong ea ho qetela ea bone, re ile ra kopanya makala a mabeli a khethiloeng ka boikemelo ho tsoa liphoofolong tse tharo tse arohaneng (Setšoantšo sa 1c). Ho li-clone tsa phage tse 925 tse latellanang tse fumanoeng ho CSF, potolohong ea bone re fumane tatellano ea li-peptide tse 64 tse ikhethang (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 6b), tseo har'a tsona karolo e amanang ea phage ea mofuta oa tlhaho e theohetseng ho 0.8%. Di-clone tse tlwaelehileng haholo tsa CSF mothating wa bone e ne e le LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) le RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %). Bolelele ba di-peptide tse kgethilweng bo bakwa ke ho kenngwa/ho hlakolwa ha di-nucleotide kapa di-codon tsa ho emisa pele ho nako di-primer tsa laeborari ha ho sebediswa di-codon tse senyehileng bakeng sa moralo wa laeborari ya NNK. Di-codon tsa ho emisa pele ho nako di hlahisa di-peptide tse kgutshwane mme di kgethwa hobane di na le motif e ntle ya aa. Di-peptide tse telele di ka bakwa ke ho kenngwa/ho hlakolwa ha di-primer tsa dilaeborari tsa maiketsetso. Sena se beha codon ya ho emisa e entsweng ka ntle ho foreimi mme se e bala ho fihlela codon e ntjha ya ho emisa e hlaha tlase. Ka kakaretso, re badile dintlha tsa ntlafatso bakeng sa dipotoloho tsohle tse nne tsa kgetho ka ho bapisa data ya ho kenya le data ya tlhahiso ya sampole. Bakeng sa potoloho ea pele ea tlhahlobo, re sebelisitse li-titer tsa phage tsa mofuta oa wild-type e le sesupo sa nalane e sa tobang. Hoa thahasellisa hore khetho ea phage e mpe e ne e le matla haholo potolohong ea pele ea CSF, empa eseng maling (Setšoantšo sa 3a), e ka 'nang ea bakoa ke monyetla o tlase oa ho hasana ho sa sebetseng ha litho tse ngata tsa laeborari ea peptide karolong ea CSF kapa li-phage tse amanang li atisa ho bolokoa kapa ho tlosoa maling ka katleho ho feta bacteriophages. Leha ho le joalo, potolohong ea bobeli ea ho panning, khetho e matla ea li-phage ho CSF ​​e ile ea bonoa lihlopheng ka bobeli, e leng se bontšang hore potoloho e fetileng e ne e ruisitsoe ka li-phage tse bontšang li-peptide tse khothalletsang ho nkuoa ha CSF (Setšoantšo sa 3a). Hape, ntle le ho ruisoa ho hoholo ha mali. Hape potolohong ea boraro le ea bone, li-clone tsa phage li ne li ruisitsoe haholo ho CSF. Ha re bapisa makhetlo a amanang a tatellano e 'ngoe le e 'ngoe e ikhethang ea peptide pakeng tsa potoloho tse peli tsa ho qetela tsa khetho, re fumane hore tatellano e ne e ruisitsoe le ho feta potolohong ea bone ea khetho (Setšoantšo sa 3b). Kakaretso ea li-motif tse 931 tsa tripeptide li ntšoa ho tsoa ho li-sequence tsohle tse 64 tse ikhethang tsa peptide ho sebelisoa li-orientation tsa peptide ka bobeli. Li-motif tse ntlafalitsoeng ka ho fetisisa potolohong ea bone li hlahlobiloe ka hloko bakeng sa li-profile tsa tsona tsa ntlafatso ho pholletsa le lipotoloho tsohle ha li bapisoa le laeborari e kenngoeng (sekheo: ntlafatso ea 10%) (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 6c). Mekhoa e akaretsang ea khetho e bontšitse hore boholo ba mabaka a ithutiloeng a ruisitsoe lipotolohong tsohle tse fetileng tsa makala ka bobeli a khetho. Leha ho le joalo, li-motif tse ling (mohlala, SGL, VSG, LGS GSV) li ne li tsoa haholo-holo ho clade e 'ngoe A, ha tse ling (mohlala, FGW, RTN, WGF, NTR) li ruisitsoe ho clade e 'ngoe B.
Netefatso ea ho tsamaisoa ha CSF ha li-peptide tse bontšitsoeng ka phage tse ntlafalitsoeng ke CSF le li-peptide tse etellang pele tse nang le biotinylated tse kopantsoeng le streptavidin payloads.
(a) Likarolelano tsa ntlafatso tse baloang lipotolohong tsohle tse 'ne (R1-R4) ho latela li-titer tse kenngoeng (input = I) phage (PFU) le li-titer tsa phage tsa CSF tse khethiloeng (output = O). Lintlha tsa ntlafatso bakeng sa lipotoloho tse tharo tsa ho qetela (R2-R4) li baliloe ka ho bapisoa le potoloho e fetileng le potoloho ea pele (R1) ka data ea boima. Li-bar tse bulehileng ke mokelikeli oa cerebrospinal, li-bar tse nang le moriti ke plasma. (***p<0.001, ho latela teko ea t ea Seithuti). (b) Lethathamo la li-peptide tsa phage tse ngata ka ho fetisisa, li behiloe ho latela karolelano ea tsona e amanang le li-phage tsohle tse bokelletsoeng ho CSF ​​kamora potoloho ea 4 ea khetho. Li-clone tse tšeletseng tse tloaelehileng tsa phage li totobalitsoe ka 'mala, li baloa le lintlha tsa tsona tsa ntlafatso lipakeng tsa lipotoloho tsa 3 le 4 tsa khetho (li-insets). (c,d) Li-clone tse tšeletseng tsa phage tse ruileng ka ho fetisisa, lilaebrari tsa phage tse se nang letho le lilaebrari tsa phage tsa batsoali ho tsoa potolohong ea 4 li ile tsa hlahlojoa ka bonngoe mohlaleng oa ho nka sampole ea CSF. Li-sampuli tsa CSF le mali li ile tsa bokelloa ka linako tse bontšitsoeng. (c) Bongata bo lekanang ba di-clone tse 6 tsa phage tse ka bang teng (di-phage/diphoofolo tse 2 x 1010), di-phage tse se nang letho (#1779) (di-phage/diphoofolo tse 2 x 1010) le dilaeborari tsa peptide tsa phage tsa setoko (di-phage/diphoofolo tse 2 x 1012) Enta bonyane 3 CM e fanwa ho phoofolo e kentsweng ka thoko ka mothapo wa mohatla. Di-pharmacokinetics tsa CSF tsa laeborari ka nngwe ya phage e kentsweng le laeborari ya phage peptide ya phage ha nako e ntse e ya di bontshwa. (d) e bontsha karolelano ya CSF/madi bakeng sa di-phage/mL tsohle tse fumanweng nakong ya ho nka disampole. (e) Di-peptide tse nne tse etellang pele tsa maiketsetso le taolo e le nngwe e qhekelletsweng di ile tsa hokahanngwa le biotin ho streptavidin ka N-terminus ya tsona (tetramer pontsho) e latelwang ke ente (mothapo wa mohatla iv, 10 mg streptavidin/kg). Bonyane ditoeba tse tharo tse kentsweng ka hara tube (N = 3). ). Disampole tsa CSF di ile tsa bokellwa ka dinako tse bontshitsweng mme mahloriso a streptavidin a ile a lekanngwa ka CSF anti-streptavidin ELISA (nd = ha e a fumanwa). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ho itshetlehile ka teko ya ANOVA). (f) Papiso ya tatellano ya amino acid ya clone ya phage peptide e ruileng ka ho fetisisa #2002 (pherese) le di-clone tse ding tse kgethilweng tsa phage peptide ho tloha potolohong ya bone ya kgetho. Dikarolo tse tshwanang le tse tshwanang tsa amino acid di na le mebala.
Ho di-phage tsohle tse ruisitsweng potolohong ya bone (Setshwantsho sa 3b), di-clone tse tsheletseng tse ka bang teng di kgethilwe bakeng sa tlhahlobo e eketsehileng ya motho ka mong mohlaleng wa ho etsa disampole tsa CSF. Bongata bo lekanang ba di-phage tse tsheletseng tse ka bang teng, phage e se nang letho (e se nang sehokelo) le dilaeborari tsa peptide ya prophage di ile tsa kenngwa diphoofolong tse tharo tsa CM tse kentsweng ka makotikoting, mme pharmacokinetics e ile ya etswa ho CSF ​​(Setshwantsho sa 3c) le ditekong tsa madi (Setshwantsho sa Tlatsetso sa 7). Di-clone tsohle tsa phage tse lekilweng di ile tsa shebana le karolo ya CSF boemong bo phahameng ka makgetlo a 10-1000 ho feta ba phage e se nang letho (#1779). Mohlala, di-clone #2020 le #2077 di ne di na le di-titer tsa CSF tse ka bang 1000 ho feta phage ya taolo. Boemo ba pharmacokinetic ba peptide ka nngwe e kgethilweng bo fapane, empa kaofela ha tsona di na le bokgoni bo phahameng ba ho homa ha CSF. Re bone phokotseho e sa khaotseng ha nako e ntse e ea bakeng sa li-clone #1903 le #2011, ha bakeng sa li-clone #2077, #2002 le #2009 keketseho nakong ea metsotso e 10 ea pele e ka 'na ea bontša ho tsamaisoa ha batho ba mafolofolo empa e hloka ho netefatsoa. ​​Li-clone #2020, #2002, le #2077 li ile tsa tsitsa maemong a holimo, ha mahloriso a CSF a clone #2009 a ile a fokotseha butle-butle ka mor'a keketseho ea pele. Eaba re bapisa makhetlo a amanang a mokhethoa e mong le e mong oa CSF le mahloriso a hae a mali (Setšoantšo sa 3d). Kamano ea titer e tloaelehileng ea mokhethoa e mong le e mong oa CSF le titer ea hae ea mali linakong tsohle tsa ho nka lisampole e bontšitse hore bakhethoa ba bararo ho ba tšeletseng ba ne ba ruile haholo CSF ​​ea mali. Hoa thahasellisa hore clone #2077 e bontšitse botsitso bo phahameng ba mali (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 7). Ho netefatsa hore li-peptide ka botsona li khona ho tsamaisa thepa ka mafolofolo ntle le likaroloana tsa phage karolong ea CSF, re ile ra kopanya li-peptide tse 'ne tse etellang pele tse nkiloeng ka biotin N-terminus moo li-peptide li khomarelang karoloana ea phage. Li-peptide tse nang le biotinylated (nos. 2002, 2009, 2020 le 2077) li ile tsa kopanngoa le streptavidin (SA) ho fumana mefuta e mengata e etsisang geometry ea phage. Sebopeho sena se boetse se re lumelletse ho lekanya ho pepesehela SA maling le mokelikeling oa cerebrospinal e le li-peptide tsa protheine tse tsamaisang thepa. Habohlokoa, data ea phage e ne e ka hlahisoa hape ha li-peptide tsa maiketsetso li ne li fanoa ka mokhoa ona o kopantsoeng le SA (Setšoantšo sa 3e). Li-peptide tse qhekelletsoeng li ne li e-na le ho pepesehela hanyane qalong le ho pepesehela CSF ka potlako ka maemo a sa bonahaleng ka hare ho lihora tse 48. Ho fumana temohisiso ea litsela tsa ho tlisa li-clone tsena tsa phage tsa peptide sebakeng sa CSF, re hlahlobile sebaka sa li-peptide tsa phage ka bomong re sebelisa immunohistochemistry (IHC) ho lemoha ka ho toba likaroloana tsa phage hora e le 'ngoe kamora ho kenngoa ka har'a 'mele ka har'a vivo. Haholo-holo, di-clone #2002, #2077, le #2009 di ka lemohuwa ka ho daea ho matla ka hara methapo ya boko, ha phage ya taolo (#1779) le clone #2020 di sa ka tsa lemohuwa (Setshwantsho se Tlatsetsang sa 8). Sena se fana ka maikutlo a hore di-peptide tsena di kenya letsoho phellong bokong ka ho tshela BBB hantle. Tlhahlobo e batsi e hlokahalang ho leka kgopolo ena, kaha tsela ya BSCFB le yona e ka ameha. Ha ho bapiswa tatellano ya amino acid ya clone e ruileng ka ho fetisisa (#2002) le di-peptide tse ding tse kgethilweng, ho ile ha hlokomelwa hore tse ding tsa tsona di na le katoloso e tshwanang ya amino acid, e ka bontshang mokgwa o tshwanang wa ho tsamaisa (Setshwantsho sa 3f).
Ka lebaka la boemo ba eona bo ikhethang ba plasma le keketseho e kholo ea CSF ha nako e ntse e ea, phage display clone #2077 e ile ea hlahlojoa hape ka nako e telele ea lihora tse 48 'me ea khona ho hlahisa keketseho e potlakileng ea CSF e bonoang hammoho le maemo a tsitsitseng a SA (Setšoantšo sa 4a). Mabapi le li-clone tse ling tsa phage tse khethiloeng, #2077 e ile ea ba le matheba a maholo bakeng sa li-capillaries tsa boko 'me ea bontša colocalization e kholo ka lectin ea capillary marker ha e shejoa ka qeto e phahameng le mohlomong le matheba a mang sebakeng sa parenchymal (Setšoantšo sa 4b). Ho batlisisa hore na litlamorao tsa meriana tse tsamaisoang ke peptide li ka fumanoa ho CNS, re entse teko eo ho eona liphetolelo tsa biotinylated tsa i) transit peptide ea #2077 le ii) BACE1 inhibitor peptide li neng li kopantsoe le SA ka litekanyo tse peli tse fapaneng. Bakeng sa motsoako o mong re sebelisitse BACE1 peptide inhibitor feela 'me bakeng sa o mong re sebelisitse karolelano ea 1:3 ea BACE1 peptide inhibitor ho peptide ea #2077. Disampole ka bobedi di ile tsa fanwa ka methapo mme maemo a mokelikeli wa cerebrospinal wa madi le wa peptide ya beta-amyloid 40 (Abeta40) a ile a lekanngwa ha nako e ntse e ya. Abeta40 e ile ya lekanngwa ka CSF kaha e bontsha thibelo ya BACE1 bokong ba parenchyma. Jwalo ka ha ho ne ho lebelletswe, di-complex ka bobedi di ile tsa fokotsa maemo a madi a Abeta40 haholo (Setshwantsho sa 4c, d). Leha ho le jwalo, ke disampole feela tse nang le motswako wa peptide nomoro ya 2077 le thibelo ya peptide ya BACE1 e kopantsweng le SA tse bakileng phokotseho e kgolo ho Abeta40 mokelikeling wa cerebrospinal (Setshwantsho sa 4c). Dintlha di bontsha hore peptide nomoro ya 2077 e kgona ho tsamaisa protheine ya 60 kDa SA ho ya ho CNS mme e boetse e baka ditlamorao tsa meriana ka di-inhibitor tsa SA-conjugated tsa peptide ya BACE1.
(a) Ente ea Clonal (2 × 10 phages/phoofolo) ea phage ea T7 e bonts'ang liprofayili tsa nako e telele tsa pharmacokinetic tsa peptide ea CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) le phage ea taolo e sa kenngoang ka ente (#1779) bonyane ho likhoto tse tharo tse kenngoeng ka CM. (b) Setšoantšo sa microscopic sa confocal sa li-microvessels tse emelang likhoto tse kenngoeng ka phage (2 × 10 10 phages/phoofolo) se bonts'ang ho hanyetsa peptide #2077 le methapo ea mali (lectin). Li-clone tsena tsa phage li ile tsa fuoa likhoto tse 3 'me tsa lumelloa ho potoloha hora e le' ngoe pele ho phallo. Boko bo ile ba aroloa 'me ba silafatsoa ka li-antibodies tse nang le label ea polyclonal FITC khahlanong le T7 phage capsid. Metsotso e leshome pele ho phallo le ho lokisoa ka mor'a moo, lectin e nang le label ea DyLight594 e ile ea fuoa ka methapo. Litšoantšo tse phatsimang tse bonts'ang lectin e dailoeng (e khubelu) ea lehlakore la luminal la li-microvessels le li-phage (tse tala) ka har'a lumen ea li-capillary le lisele tsa boko tse ka hare ho methapo ea mali. Sekala se tsamaellana le 10 µm. (c, d) Peptide e thibelang BACE1 e entsoeng ka biotinylated e le 'ngoe kapa e kopantsoe le peptide ea transit ea biotinylated #2077 e ile ea kopanngoa le streptavidin e lateloa ke ente ea methapo ea bonyane likhoto tse tharo tsa CM tse nang le cannulated (10 mg streptavidin/kg). Phokotso e bakoang ke thibelo ea peptide ea BACE1 ho Aβ40 e lekantsoe ka Aβ1-40 ELISA maling (e khubelu) le mokelikeli oa cerebrospinal (lamunu) libakeng tse bontšitsoeng tsa nako. Bakeng sa ho hlaka haholoanyane, ho toroa mola o nang le matheba grafeng ka sekala sa 100%. (c) Phokotso ea liphesente ho Aβ40 maling (likhutlotharo tse khubelu) le mokelikeli oa boko (likhutlotharo tsa lamunu) ho likhoto tse phekoloang ka streptavidin e kopantsoeng le peptide ea transit #2077 le peptide ea thibelo ea BACE1 ka karolelano ea 3:1. (d) Phokotso ea liphesente maling a Aβ40 (likholoko tse khubelu) le mokelikeli oa boko (likholoko tsa lamunu) tsa likhoto tse phekoloang ka streptavidin li kopantsoe le peptide ea thibelo ea BACE1 feela. Khakanyo ea Aβ taolong e ne e le 420 pg/ml (phapang e tloaelehileng = 101 pg/ml).
Pontšo ea phage e sebelisitsoe ka katleho libakeng tse 'maloa tsa lipatlisiso tsa bongaka17. Mokhoa ona o sebelisitsoe bakeng sa lithuto tsa mefuta-futa ea methapo ea mali ea vivo18,19 hammoho le lithuto tse shebaneng le methapo ea mali ea boko20,21,22,23,24,25,26. Thutong ena, re atolositse ts'ebeliso ea mokhoa ona oa khetho eseng feela ho khethong e tobileng ea li-peptide tse shebaneng le methapo ea mali ea boko, empa hape le ho sibolloeng ha bakhethoa ba nang le thepa e sebetsang ea ho tsamaisa ho tšela mokoallo oa mali le boko. Joale re hlalosa nts'etsopele ea ts'ebetso ea khetho ea in vivo ho likhoto tse kenngoeng ka har'a CM 'me re bontša bokhoni ba eona ba ho khetholla li-peptide tse nang le thepa ea homing ea CSF. Re sebelisa phage ea T7 e bonts'ang laeborari ea li-peptide tse sa reroang tsa 12-mer, re khonne ho bontša hore phage ea T7 e nyane ka ho lekaneng (e ka bang bophara ba 60 nm)10 ho ikamahanya le mokoallo oa mali le boko, ka hona re tšela mokoallo oa mali le boko kapa choroid plexus ka kotloloho. Re hlokometse hore ho kotula CSF ho tsoa ho likhoto tsa CM tse kentsoeng ka makotikoti e ne e le mokhoa o laoloang hantle oa tlhahlobo ea in vivo, le hore phage e ntšitsoeng ha ea ka ea tlama feela methapong ea mali empa hape e ne e sebetsa e le transporter ho pholletsa le mokoallo oa mali le boko. Ho feta moo, ka ho bokella mali le ho sebelisa HTS ho CSF ​​​​le li-phage tse nkiloeng maling ka nako e le 'ngoe, re tiisitse hore khetho ea rona ea CSF ha ea ka ea susumetsoa ke ho matlafatsa mali kapa ho tšoaneleha bakeng sa katoloso lipakeng tsa mekhahlelo ea khetho. Leha ho le joalo, karolo ea mali ke karolo ea mokhoa oa khetho, kaha li-phage tse khonang ho fihla karolong ea CSF li tlameha ho phela le ho potoloha maling nako e telele ho lekana ho ithuisa bokong. E le ho ntša tlhahisoleseling e tšepahalang ea tatellano ho tsoa ho data e tala ea HTS, re kentse li-filter tse ikamahantseng le liphoso tsa tatellano tse ikhethileng sethaleng mosebetsing oa tlhahlobo. Ka ho kenyelletsa liparamente tsa kinetic mokhoeng oa tlhahlobo, re tiisitse pharmacokinetics e potlakileng ea li-phage tsa mofuta oa T7 tsa mofuta oa hlaha (t½ ~ 28 min) maling24, 27, 28 mme hape ra fumana halofo ea bophelo ba tsona mokelikeling oa cerebrospinal (t½ ~ 26 min) ka motsotso). Ho sa tsotellehe diprofaele tse tshwanang tsa pharmacokinetic mading le CSF, ke 0.001% feela ya bongata ba phage maling bo ka fumanwang ho CSF, e leng se bontshang motsamao o tlase wa mokokotlo wa phage ya mofuta wa T7 o hlaha hodima thibelo ya madi le boko. Mosebetsi ona o totobatsa bohlokwa ba potoloho ya pele ya kgetho ha ho sebediswa mawa a ho kenya diphaephe ka hara vivo, haholoholo bakeng sa ditsamaiso tsa phage tse tloswang ka potlako ho potoloha ha madi, kaha di-clone tse mmalwa di kgona ho fihla karolong ya CNS. Kahoo, karolong ya pele, phokotso ya mefutafuta ya laeborari e ne e le kgolo haholo, kaha ke palo e fokolang feela ya di-clone e ileng ya qetella e bokelletswe mohlaleng ona o thata haholo wa CSF. Leano lena la ho kenya diphaephe ka hara vivo le ne le kenyeletsa mehato e mmalwa ya kgetho jwalo ka ho bokellana ka mafolofolo karolong ya CSF, ho pholoha ha di-clone karolong ya madi, le ho tloswa ka potlako ha di-clone tsa phage tsa T7 mading metsotsong e 10 ya pele (Setshwantsho sa 1d le Setshwantsho se Tlatsetsang sa 4M). ). Kahoo, kamora potoloho ya pele, di-clone tse fapaneng tsa phage di ile tsa hlwauwa ho CSF, le hoja letamo le le leng la pele le ne le sebedisetswa diphoofolo ka bomong. Sena se fana ka maikutlo a hore mehato e mengata e thata ea khetho bakeng sa lilaebrari tsa mohloli tse nang le palo e kholo ea litho tsa laebrari e fella ka phokotso e kholo ea mefuta-futa. Ka hona, liketsahalo tse sa reroang e tla ba karolo ea bohlokoa ea ts'ebetso ea pele ea khetho, e susumetsang haholo sephetho. Ho ka etsahala hore ebe li-clone tse ngata laebraring ea pele li ne li e-na le tšekamelo e tšoanang ea ho ntlafatsa CSF. Leha ho le joalo, esita le tlas'a maemo a tšoanang a liteko, liphetho tsa khetho li ka fapana ka lebaka la palo e nyane ea clone ka 'ngoe e itseng letamong la pele.
Li-motif tse ruisitsoeng ho CSF ​​li fapane le tse maling. Hoa thahasellisa hore re hlokometse phetoho ea pele ho ea ho li-peptide tse ruileng ka glycine maling a liphoofolo ka bomong. (Setšoantšo sa 1g, Litšobotsi tse Tlatsetsang. 4e, 4f). Li-peptide tsa glycine tse nang le phage li ka 'na tsa tsitsa haholoanyane 'me tsa se ke tsa ntšoa ka har'a potoloho ea mali. Leha ho le joalo, li-peptide tsena tse ruileng ka glycine ha lia ka tsa fumanoa lisampoleng tsa mokelikeli oa cerebrospinal, e leng se bontšang hore lilaebrari tse khethiloeng li fetile mehatong e 'meli e fapaneng ea khetho: e 'ngoe maling 'me e 'ngoe e lumelletsoe ho bokellana mokelikeling oa cerebrospinal. Li-clone tse ruisitsoeng ke CSF tse hlahang potolohong ea bone ea khetho li lekiloe haholo. Hoo e ka bang li-clone tsohle tse lekiloeng ka bonngoe li tiisitsoe hore li ruisitsoe ho CSF ​​ha li bapisoa le phage e se nang letho. Ho ile ha hlahlojoa peptide e le 'ngoe (#2077) ka botlalo. E bontšitse halofo ea bophelo e telele ea plasma ha e bapisoa le li-hits tse ling (Setšoantšo sa 3d le Setšoantšo se Tlatsetsang sa 7), 'me hoa thahasellisa hore peptide ena e ne e e-na le masala a cysteine ​​​​ho C-terminus. Ho sa tsoa bontšoa hore ho eketsoa ha cysteine ​​​​ho li-peptide ho ka ntlafatsa thepa ea tsona ea pharmacokinetic ka ho tlama ho albumin 29. Hona joale ha ho tsejoe ka peptide #2077 'me ho hloka phuputso e eketsehileng. Li-peptide tse ling li bontšitse ho itšetleha ka valence ho ntlafatso ea CSF (data ha e bontšoe), e ka 'nang ea amana le geometry ea bokaholimo bo bontšitsoeng ba capsid ea T7. Sistimi ea T7 eo re e sebelisitseng e bontšitse likopi tse 5-15 tsa peptide ka 'ngoe ka phaephe. ​​IHC e entsoe ho li-clone tsa lead phage tse khethiloeng tse kenngoeng ka har'a cortex ea boko ea likhoto (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 8). Lintlha li bontšitse hore bonyane li-clone tse tharo (No. 2002, No. 2009 le No. 2077) li sebelisane le BBB. Ho ntse ho tla fumanoa hore na tšebelisano ena ea BBB e fella ka ho bokellana ha CSF kapa ho tsamaea ha li-clone tsena ka kotloloho ho BCSFB. Habohlokoa, re bontša hore li-peptide tse khethiloeng li boloka bokhoni ba tsona ba ho tsamaisa CSF ha li etsoa le ho tlamahanngoa le thepa ea protheine. Ho tlamahana ha li-peptide tsa biotinylated tsa N-terminal ho SA ho pheta-pheta liphetho tse fumanoeng ka li-clone tsa tsona tsa phage maling le mokelikeling oa cerebrospinal (Setšoantšo sa 3e). Qetellong, re bontša hore peptide ea lead #2077 e khona ho khothaletsa ts'ebetso ea boko ea inhibitor ea peptide ea biotinylated ea BACE1 e kopantsoeng le SA, e bakang litlamorao tse hlahelletseng tsa pharmacodynamic ho CNS ka ho fokotsa haholo maemo a Abeta40 ho CSF ​​(Setšoantšo sa 4). Ha rea ​​​​ka ra khona ho khetholla li-homologue life kapa life polokelongtshedimosetsong ka ho etsa lipatlisiso tsa homology ea tatellano ea peptide ea li-hit tsohle. Ho bohlokoa ho hlokomela hore boholo ba laeborari ea T7 bo ka ba 109, ha boholo ba laeborari ea khopolo-taba bakeng sa 12-mers e le 4 x 1015. Ka hona, re khethile karolo e nyane feela ea sebaka sa mefuta-futa sa laeborari ea peptide ea 12-mer, e leng se ka bolelang hore li-peptide tse ntlafalitsoeng haholoanyane li ka khetholloa ka ho lekola sebaka sa tatellano se haufi sa li-hit tsena tse khethiloeng. Ka khopolo-taba, lebaka le leng leo ka lona re sa kang ra fumana li-homologue tsa tlhaho tsa li-peptide tsena e ka ba ho se khethoe nakong ea ho iphetola ha lintho ho thibela ho kena ho sa laoleheng ha li-peptide tse itseng bokong.
Ha re kopanya, liphetho tsa rona li fana ka motheo oa mosebetsi oa nakong e tlang oa ho khetholla le ho hlalosa litsamaiso tsa lipalangoang tsa mokoallo oa methapo ea mali ka har'a 'mele ka botlalo. Setha sa motheo sa mokhoa ona se thehiloe leano la khetho le sebetsang le sa khetholleng feela li-clone tse nang le thepa ea ho tlama methapo ea mali ea boko, empa hape le kenyelletsa mohato oa bohlokoa oo li-clone tse atlehileng li nang le ts'ebetso ea tsona ea ho tšela lithibelo tsa baeloji ka har'a 'mele ho ea karolong ea CNS. ke ho hlakisa mokhoa oa ho tsamaisa li-peptide tsena le khetho ea tsona ea ho tlama ho microvasculature e ikhethileng sebakeng sa boko. Sena se ka lebisa ho sibolloeng ha litsela tse ncha tsa ho tsamaisa BBB le li-receptor. Re lebeletse hore li-peptide tse khethiloeng li ka tlama ka kotloloho ho li-receptor tsa methapo ea mali kapa ho li-ligand tse potolohang tse tsamaisoang ka BBB kapa BCSFB. Li-vector tsa peptide tse nang le ts'ebetso ea ho tsamaisa CSF tse fumanoeng mosebetsing ona li tla hlahlojoa haholoanyane. Hona joale re ntse re batlisisa hore na li-peptide tsena li ikhetha hakae bokong bakeng sa bokhoni ba tsona ba ho tšela BBB le/kapa BCSFB. Li-peptide tsena tse ncha e tla ba lisebelisoa tsa bohlokoa haholo bakeng sa ho sibolloa ha li-receptor kapa litsela tse ncha le bakeng sa nts'etsopele ea li-platform tse ncha tse sebetsang hantle bakeng sa ho isa limolek'hule tse kholo, joalo ka baeloji, bokong.
Hlakola cisterna e kholo (CM) ka ho sebelisa phetoho ea mokhoa o hlalositsoeng pele. Likhoto tsa Wistar tse robalitsoeng (200-350 g) li ile tsa kenngoa holim'a sesebelisoa sa stereotaxic 'me ha etsoa sekheo se mahareng holim'a letlalo la hlooho le beotsoeng le le lokisitsoeng ka mokhoa o sa hloekang ho pepesa lehata. Cheka masoba a mabeli sebakeng sa sash e ka holimo 'me u tlame likurufu tsa ho lokisa masobeng. Lesoba le leng le ile la chekoa karolong e ka morao ea occipital crest bakeng sa tataiso ea stereotactic ea cannula ea tšepe e sa hloekang ka har'a CM. Tšela samente ea meno ho potoloha cannula 'me u e tiise ka likurufu. Kamora ho folisa ka foto le ho tiisa samente, leqeba la letlalo le ile la koaloa ka suture ea 4/0 supramid. Ho beoa hantle ha cannula ho tiisoa ke ho lutla ha mokelikeli oa cerebrospinal (CSF) ka tšohanyetso. Tlosa rat ho sesebelisoa sa stereotaxic, fumana tlhokomelo e nepahetseng ea kamora opereishene le taolo ea bohloko, 'me u e lumelle hore e fole bonyane beke e le' ngoe ho fihlela matšoao a mali a bonoa mokelikeling oa cerebrospinal. Likhoto tsa Wistar (Crl:WI/Han) li fumanoe ho Charles River (France). Likhoto tsohle li ne li bolokiloe tlas'a maemo a itseng a se nang likokoana-hloko. Liteko tsohle tsa liphoofolo li amohetsoe ke Ofisi ea Liphoofolo ea Motse oa Basel, Switzerland, 'me li entsoe ho latela Laesense ea Liphoofolo Nomoro ea 2474 (Tlhahlobo ea Tsamaiso ea Boko e Sebetsang ka ho Lekanya Maemo a Bakhethoa ba Phekolo Mokelikeling oa Cerebrospinal le Bokong ba Rat).
Boloka rat e falimehile ka bonolo ka cannula ea CM letsohong. Tlosa Datura ho cannula 'me u bokelle 10 µl ea mokelikeli oa cerebrospinal o phallang ka boiketsetso. Kaha patency ea cannula e ile ea qetella e senyehile, ke lisampole tse hlakileng feela tsa mokelikeli oa cerebrospinal tse se nang bopaki ba tšilafalo ea mali kapa ho fifala ha 'mala tse kenyellelitsoeng thutong ena. Ka nako e ts'oanang, hoo e ka bang 10-20 μl ea mali e ile ea ntšoa ho tsoa leqhetsoaneng le lenyenyane ntlheng ea mohatla ka har'a lipeipi tse nang le heparin (Sigma-Aldrich). CSF le mali li ile tsa bokelloa ka linako tse fapaneng kamora ho entoa ka har'a phage ea T7 ka methapo. Hoo e ka bang 5-10 μl ea mokelikeli e ile ea lahloa pele sampole e 'ngoe le e 'ngoe ea CSF e bokelloa, e tsamaellanang le bophahamo bo shoeleng ba catheter.
Lilaeborari li hlahisitsoe ho sebelisoa vekthara ea T7Select 10-3b joalo ka ha ho hlalositsoe bukeng ea litaelo ea sistimi ea T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Ka bokhutšoanyane, sehokelo sa DNA sa 12-mer se sa reroang se entsoe ka mokhoa o latelang:
Codon ea NNK e sebelisitsoe ho qoba li-codon tse emang habeli le ho eketseha ha amino acid ka har'a insert. N ke karolelano ea equimolar e kopantsoeng ka letsoho ea nucleotide ka 'ngoe, 'me K ke karolelano ea equimolar e kopantsoeng ka letsoho ea adenine le cytosine nucleotides. Libaka tse le 'ngoe tse koetsoeng li ile tsa fetoloa ho ba DNA e habeli e koetsoeng ka ho kenngoa hape ka dNTP (Novagen) le enzyme ea Klenow (New England Biolabs) ho Klenow buffer (New England Biolabs) ka lihora tse 3 mochesong oa 37°C. Kamora karabelo, DNA e nang le likhoele tse peli e ile ea fumanoa ke pula ea EtOH. DNA e hlahisitsoeng e ile ea siloa ka li-enzyme tse thibelang EcoRI le HindIII (ka bobeli li tsoa ho Roche). Insert e arohaneng le e hloekisitsoeng (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) e ile ea kenngoa ka har'a foreimi ho ea vector ea T7 e koetsoeng esale pele kamora amino acid 348 ea gene ea 10B capsid. Likarabo tsa likhoele li ile tsa kenngoa ka har'a 16°C. ka lihora tse 18 pele ho pakete ea in vitro. Ho paka ka phage ka hare ho vitro ho entswe ho ya ka ditaelo tse fanweng ka T7Select 10-3b cloning kit (Novagen) mme tharollo ya ho paka e ile ya eketswa hang ho lysis ho sebediswa Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Li-lysate di ile tsa centrifugetswa, tsa tjhesetswa mme tsa hoamiswa ho -80° C. e le tharollo ya glycerol e setseng.
Ho atolosoa ha PCR ka kotloloho ha libaka tse feto-fetohang tsa phage tse atolositsoeng ka moro kapa poleiting ho sebelisoa li-primer tsa fusion tsa 454/Roche-amplicon tse ikhethileng. Primer ea fusion ea pele e na le tatellano e pela sebaka se feto-fetohang (NNK) 12 (e ikhethileng ka template), GS FLX Titanium Adapter A, le tatellano ea senotlolo sa laeborari ea motheo o mene (TCAG) (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 1a):
Setha sa ho kopanya se ka morao se boetse se na le biotin e hoketsweng ho di-capture beads le GS FLX Titanium Adapter B e hlokahalang bakeng sa ho hodisa clonal nakong ya emulsion PCR:
Ka mora moo, di-amplicon di ile tsa fuwa 454/Roche pyrosequencing ho ya ka protocol ya 454 GS-FLX Titanium. Bakeng sa ho sequencing ka letsoho ya Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 phage DNA e ile ya hodiswa ka PCR mme ya sequencing ka dipara tse latelang tsa primer:
Li-insert tse tsoang li-plaque ka bonngoe li ile tsa etsoa amplification ea PCR ho sebelisoa Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (ho latela litaelo tsa moetsi). Etsa ho qala ho chesang (metsotso e 10 ho 95 °C) le lipotoloho tse 35 tsa boost (metsotso e 50 ho 95 °C, motsotso o 1 ho 50 °C, le motsotso o 1 ho 72 °C).
Phage ho tsoa lilaeboraring, phage ea mofuta oa wild-type, phage e pholositsoeng ho CSF ​​le mali, kapa li-clone ka bomong li ile tsa eketsoa ho Escherichia coli BL5615 ka har'a moro oa TB (Sigma Aldrich) kapa lijaneng tsa 500 cm2 (Thermo Scientific) ka lihora tse 4 mochesong oa 37°C. Phage e ile ea ntšoa lipoleiting ka ho hlatsoa lipoleiti ka Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical) kapa ka ho bokella li-plaque ka lintlha tsa pipette tse sterile. Phage e ile ea aroloa ho tsoa ho supernatant ea setso kapa buffer ea ho ntša ka potoloho e le 'ngoe ea polyethylene glycol (PEG 8000) precipitation (Promega) 'me ea emisoa hape ho Tris-EDTA buffer.
Phage e amplified e ile ea etsoa ka makhetlo a 2-3 a ho tlosoa ha endotoxin ka ho sebelisa li-bead tsa ho tlosa endotoxin (Miltenyi Biotec) pele ho entoa ka methapo (IV) (500 μl/phoofolo). Mokhahlelong oa pele, ho ile ha kenngoa li-phage tsa 2×1012; mokhahlelong oa bobeli, li-phage tsa 2×1010; mokhahlelong oa boraro le oa bone oa khetho, li-phage tsa 2×109 ka phoofolo. Boleng ba phage ho CSF ​​le lisampoleng tsa mali tse bokelletsoeng ka nako e bontšitsoeng bo ile ba khethoa ka ho bala plaque ho latela litaelo tsa moetsi (buka ea tsamaiso ea T7Select). Khetho ea phage e entsoe ka ho entoa ka methapo ea lilaebrari tse hloekisitsoeng mothapong oa mohatla kapa ka ho entoa hape phage e ntšitsoeng ho CSF ​​ho tsoa mokhahlelong oa pele oa khetho, 'me likotulo tse latelang li ile tsa etsoa ka metsotso e 10, metsotso e 30, metsotso e 60, metsotso e 90, metsotso e 120, metsotso e 180, le metsotso e 240 ka ho latellana CSF le lisampoleng tsa mali. Ho ile ha etsoa li-round tse 'ne tsa ho kenya li-in vivo moo makala a mabeli a khethiloeng a ileng a bolokoa ka thoko le ho hlahlojoa nakong ea li-round tse tharo tsa pele tsa khetho. Li-insert tsohle tsa phage tse ntšitsoeng ho CSF ​​ho tsoa lipotolohong tse peli tsa pele tsa khetho li ile tsa etsoa ka 454/Roche pyrosequencing, ha li-clone tsohle tse ntšitsoeng ho CSF ​​ho tsoa lipotolohong tse peli tsa ho qetela tsa khetho li ile tsa etsoa ka tatellano ka letsoho. Li-phage tsohle tsa mali ho tsoa potolohong ea pele ea khetho le tsona li ile tsa etsoa ka 454/Roche pyrosequencing. Bakeng sa ente ea li-clone tsa phage, li-phage tse khethiloeng li ile tsa atolosoa ho E. coli (BL5615) lipoleiting tsa 500 cm2 ho 37°C ka lihora tse 4. Li-clone tse khethiloeng ka bomong le tse hlophisitsoeng ka letsoho li ile tsa ata sebakeng sa TB. Kamora ho ntšoa ha phage, ho hloekisoa le ho tlosoa ha endotoxin (joalokaha ho hlalositsoe kaholimo), li-phage tse 2×1010/phoofolo ka har'a 300 μl li ile tsa kenngoa ka methapo mothapong o le mong oa mohatla.
Ho seta data ya tatellano pele le boleng ba yona. Data e tala ya 454/Roche e fetotswe ho tloha sebopehong sa mmapa wa phallo o tloaelehileng wa binary (sff) ho ya sebopehong sa Pearson se ka balwang ke motho (fasta) ho sebediswa software ya morekisi. Ts'ebetso e tswelang pele ya tatellano ya nucleotide e entswe ho sebediswa mananeo a C le dingolwa tse ikemetseng (sephutheloana sa software se sa lokollwang) jwalo ka ha ho hlalositswe ka tlase. Tlhahlobo ya data ya mantlha e kenyeletsa mekgwa e thata ya ho seta ya mekhahlelo e mengata. Ho seta dingolwa tse neng di se na tatellano e nepahetseng ya DNA ya 12mer, dingolwa di ile tsa tsamaiswa ka tatellano ho ya ho leiboleng la ho qala (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), leiboleng la ho emisa (TAAGCTTGCGGGCGCACTCGAGTA) le ho kenya morao (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ho sebediswa teko ya Needleman-Wunsch ya lefatshe ka bophara. ho hokahanya ho dumella ho fihlela ho diphapang tse 2 ka tatellano31. Ka hona, dingolwa tse se nang di-tag tsa ho qala le ho emisa le dingolwa tse nang le dingolwa tsa morao, ke hore, di-alignment tse fetang palo e dumelletsweng ya diphoso, di ile tsa tloswa laeboraring. Ha e le dipalo tse setseng, tatellano ya DNA ya N-mer e tlohang letshwaong la qalo le ho fella pele letshwao la ho emisa le tloswa ho tatellano ya pele ya ho bala mme la sebetswa hape (ho tloha mona ho tla bitswa "kenya"). Kamora phetolelo ya sehokelo, karolo e kamora codon ya pele ya ho emisa pheletsong ya 5′ ya primer e tloswa ho sehokelo. Ho phaella moo, di-nucleotide tse lebisang ho di-codon tse sa fellang pheletsong ya 3′ ya primer le tsona di ile tsa tloswa. Ho qhelela ka thoko di-insert tse nang le dipalo tsa morao feela, di-insert tse fetoletsweng tse qalang ka paterone ya amino acid "PAG" le tsona di ile tsa tloswa. Di-peptide tse nang le bolelele ba kamora phetolelo ya ka tlase ho di-amino acid tse 3 di ile tsa tloswa laeboraring. Qetellong, tlosa ho kgutlela morao letamong la ho kenya mme o fumane maqhubu a sehokelo se seng le se seng se ikgethang. Diphetho tsa tlhahlobo ena di ne di kenyeletsa lethathamo la di-nucleotide dipalo (di-insert) le maqhubu a tsona (a ho bala) (Ditshwantsho tse Tlatsetsang 1c le 2).
Ho kenya DNA ea Sehlopha sa N-mer ka ho tšoana ha tatellano: Ho felisa liphoso tsa tatellano ea 454/Roche (joalo ka mathata a katoloso ea homopolymer ea tatellano) le ho tlosa li-redundancies tse sa reng letho, ho kenya tatellano ea DNA ea N-mer e neng e sefiloe pele (li-inserts) ho hlophisoa ka ho kenya ho tšoanang. (ho fihlela metheong e 2 e sa tsamaellaneng e lumelloa) ho sebelisoa algorithm e pheta-phetoang e hlalositsoeng ka tsela e latelang: ho kenya ho hlophisoa pele ka maqhubu a bona (ho tloha holimo ho ea tlase), 'me haeba ho tšoana, ka mofuta oa bona oa bobeli ka bolelele (ho tloha ho bokhutšoanyane ho ea ho bolelele)). Kahoo, ho kenya khafetsa le ho feta ka ho fetisisa ho hlalosa "sehlopha" sa pele. Maqhubu a sehlopha a behiloe ho maqhubu a senotlolo. Ebe, ho kenya ka 'ngoe e setseng lenaneng le hlophisitsoeng ho lekiloe ho eketsoa sehlopheng ka ho hokahanya Needleman-Wunsch ka bobeli. Haeba palo ea ho se lumellane, ho kenya, kapa ho hlakola ho hokelanong e sa fete moeli oa 2, ho kenngoa hoa eketsoa sehlopheng, 'me maqhubu a sehlopha ka kakaretso a eketsoa ka hore na ho kenngoa ho ekelitsoe hangata hakae. Ho kenya ho ekelitsoeng sehlopheng ho tšoauoa e le ho sebelisitsoeng 'me ho qheleloa ka thoko ts'ebetsong e tsoelang pele. Haeba tatellano ea ho kenya e ke ke ea eketsoa sehlopheng se seng se ntse se le teng, tatellano ea ho kenya e sebelisoa ho theha sehlopha se secha ka makhetlo a loketseng a ho kenya 'me e tšoailoe e le a sebelisitsoeng. Phetoho e fela ha tatellano e 'ngoe le e 'ngoe ea ho kenya e sebelisitsoe ho theha sehlopha se secha kapa e ka kenyelletsoa sehlopheng se seng se ntse se le teng. Etsoe, lihlopha tse kentsoeng tse nang le li-nucleotide qetellong li fetoleloa ho tatellano ea li-peptide (lilaeborari tsa peptide). Sephetho sa tlhahlobo ena ke sete ea li-insertion le maqhubu a tsona a tsamaellanang a etsang palo ea lipalo tse latellanang (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 2).
Tlhahiso ea Motif: Ho latela lethathamo la li-peptide tse ikhethang, laeborari e ile ea thehoa e nang le lipaterone tsohle tse ka bang teng tsa amino acid (aa) joalo ka ha ho bontšitsoe ka tlase. Paterone e 'ngoe le e 'ngoe e ka bang teng ea bolelele ba 3 e ile ea ntšoa ho peptide 'me paterone ea eona e fapaneng e ile ea eketsoa hammoho le laeborari e tloaelehileng ea motif e nang le lipaterone tsohle (li-tripeptide). Lilaeborari tsa li-motif tse pheta-phetoang haholo li ile tsa hlophisoa 'me tsa tlosoa ho se sebetse hantle. Eaba, bakeng sa tripeptide e 'ngoe le e 'ngoe laeboraring ea motif, re hlahloba boteng ba eona laeboraring re sebelisa lisebelisoa tsa k'homphieutha. Tabeng ena, makhetlo a peptide e nang le tripeptide ea motif e fumanoeng a eketsoa 'me a abeloa motif laeboraring ea motif ("palo ea li-motif"). Sephetho sa tlhahiso ea motif ke sehlopha sa mahlakore a mabeli se nang le liketsahalo tsohle tsa li-tripeptide (li-motif) le boleng ba tsona bo fapaneng, e leng palo ea lipalo tsa tatellano tse hlahisang motif o tsamaellanang ha lipalo li sefshoa, li hlophisoa, 'me li fetoleloa. Litekanyo joalo ka ha li hlalositsoe ka botlalo kaholimo.
Ho etsa hore palo ea li-motif le li-scatterplot tse tsamaellanang li be boemong bo tloaelehileng: Palo ea li-motif bakeng sa sampole ka 'ngoe e ile ea etsoa hore e be boemong bo tloaelehileng ho sebelisoa
moo ni e leng palo ea lipalo tse nang le sehlooho sa i. Kahoo, vi e emela makhetlo a peresente a lipalo (kapa li-peptide) tse nang le motif i sampole. Boleng ba P bakeng sa palo e sa tloaelehang ea motifs bo baliloe ho sebelisoa teko e nepahetseng ea Fisher. Mabapi le li-correlogram tsa palo ea mabaka, likamano tsa Spearman li baliloe ho sebelisoa palo e tloaelehileng ea mabaka ka R.
Ho bona dikahare tsa amino acid sebakeng se seng le se seng laeboraring ya peptide, ho ile ha etswa di-logogram tsa webo 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Taba ya pele, dikahare tsa amino acid sebakeng se seng le se seng sa peptide ya 12-mer di bolokwa ka hara matrix ya 20×12. Yaba, sete ya di-peptide tse 1000 tse nang le dikahare tse lekanang tsa amino acid sebakeng se seng le se seng di hlahiswa ka sebopeho sa fasta-sequence mme di fanwa e le tlhahiso ho web-logo 3, e hlahisang setshwantsho sa dikahare tsa amino acid sebakeng se seng le se seng. bakeng sa laeborari e fanweng ya peptide. Ho bona disete tsa data tsa dimension tse ngata, dimmapa tsa mocheso di ile tsa etswa ho sebediswa sesebediswa se ntshetsweng pele ka hare ho R (biosHeatmap, sephutheloana sa R ​​se so lokollwe). Di-dendrogram tse hlahisitsweng dimmapeng tsa mocheso di ile tsa balwa ho sebediswa mokgwa wa Ward wa ho bokellana ka tatellano ka metric ya sebaka sa Euclidean. Bakeng sa tlhahlobo ya dipalopalo ya data ya ho fumana dintlha tsa motif, boleng ba P bakeng sa ho fumana dintlha tse sa tlwaelehang bo ile ba balwa ho sebediswa teko e nepahetseng ya Fisher. Boleng ba P bakeng sa li-dataset tse ling bo baliloe ho R ho sebelisoa teko ea t kapa ANOVA ea Seithuti.
Di-clone tse kgethilweng tsa phage le di-phage tse se nang di-insert di ile tsa entwa ka methapo ya mohatla (di-phage tse 2 × 1010/phoofolo ka 300 μl PBS). Metsotso e leshome pele ho phallo ya madi le ho lokiswa ka mora moo, diphoofolo tse tshwanang di ile tsa entwa ka methapo ya 100 μl ya lectin e ngotsweng ka DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Metsotso e 60 kamora ente ya phage, ditoeba di ile tsa entwa ka methapo ya pelo ka 50 ml PBS e latelwa ke 50 ml 4% PFA/PBS. Disampole tsa boko di ile tsa lokiswa bosiu bohle ka 4% PFA/PBS mme tsa kolobiswa ka 30% sucrose bosiu bohle ka 4°C. Disampole di hatsetswa ka hara motswako wa OCT. Tlhahlobo ea immunohistochemical ea lisampole tse hoamisitsoeng e entsoe mochesong oa kamore holim'a li-cryosection tsa 30 µm tse koetsoeng ka 1% BSA 'me ea kenngoa ka li-antibodies tse nang le label ea polyclonal FITC khahlanong le T7 phage (Novus NB 600-376A) ho 4 °C. E futhumale bosiu bohle. Qetellong, likarolo li ile tsa hlatsuoa ka makhetlo a 3 ka PBS 'me tsa hlahlojoa ka microscope ea confocal laser (Leica TCS SP5).
Li-peptide tsohle tse nang le bonyane bohloeki ba 98% li entsoe ke GenScript USA, tsa etsoa biotinylated le lyophilized. Biotin e tlamiloe ka triple glycine spacer e eketsehileng ho N-terminus. Hlahloba li-peptide tsohle u sebelisa mass spectrometry.
Streptavidin (Sigma S0677) e ne e kopantswe le peptide e thibelang BACE1 e nang le equimolar e ngata ka makhetlo a 5, peptide e thibelang BACE1 e nang le equimolated, kapa motsoako (karolelano ea 3:1) oa peptide e thibelang BACE1 e nang le equimolated le peptide e thibelang BACE1 ho 5–10% DMSO/e kentsoeng ho PBS. Hora e le 1 mochesong oa kamore pele ho ente. Li-peptide tse kopantsoeng le Streptavidin li ile tsa kenngoa ka methapo ka tekanyo ea 10 mg/kg ho e 'ngoe ea methapo ea mohatla ea likhoto tse nang le cavity ea boko.
Bongata ba metsoako ea streptavidin-peptide bo ile ba hlahlojoa ke ELISA. Lipoleiti tsa Nunc Maxisorp microtiter (Sigma) li ile tsa koaheloa bosiu bohle ho 4°C ka antibody ea mouse ea 1.5 μg/ml (Thermo, MA1-20011). Kamora ho thibela (blocking buffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) mochesong oa kamore ka lihora tse 2, hlatsoa poleiti ka 0.05% Tween-20/PBS (wash buffer) bakeng sa 3 Metsotsoana, lisampole tsa CSF le plasma li ile tsa eketsoa lilibeng tse hlapolotsoeng ka blocking buffer (plasma 1:10,000, CSF 1:115). Ka mor'a moo poleiti e ile ea kenngoa ka har'a 4°C bosiu bohle ka antibody ea detection (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Kamora mehato e meraro ea ho hlatsoa, ​​streptavidin e ile ea fumanoa ka ho kenngoa ka har'a tharollo ea substrate ea TMB (Roche) ho fihlela metsotso e 20. Kamora ho emisa nts'etsopele ea 'mala ka 1M H2SO4, lekanya ho monya ha metsi ho 450 nm.
Mosebetsi oa motsoako oa streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor o ile oa hlahlojoa ke Aβ(1-40) ELISA ho latela protocol ea moetsi (Wako, 294-64701). Ka bokhutšoanyane, lisampole tsa CSF li ile tsa hlapolloa ka har'a motsoako o tloaelehileng (1:23) 'me tsa kenngoa ka har'a li-incuent bosiu bohle ho 4°C ka har'a lipoleiti tsa liliba tse 96 tse koahetsoeng ka antibody ea BNT77 capture. Kamora mehato e mehlano ea ho hlatsoa, ​​antibody ea BA27 e kopantsoeng le HRP e ile ea eketsoa 'me ea kenngoa ka har'a li-incubator lihora tse 2 ho 4°C., e lateloa ke mehato e mehlano ea ho hlatsoa. ​​Aβ(1–40) e ile ea fumanoa ka ho kenngoa ka har'a tharollo ea TMB metsotso e 30 mochesong oa kamore. Kamora hore nts'etsopele ea 'mala e emisoe ka tharollo ea ho emisa, lekanya ho monya ha 450 nm. Lisampole tsa plasma li ile tsa kenngoa ka mokhoa o tiileng oa ho ntša pele ho Aβ(1–40) ELISA. Plasma e ile ea eketsoa ho 0.2% DEA (Sigma) ka har'a lipoleiti tsa liliba tse 96 'me ea kenngoa ka har'a mocheso oa kamore metsotso e 30. Kamora ho hlatsoa lipoleiti tsa SPE (Oasis, 186000679) ka ho latellana ka metsi le 100% methanol, disampole tsa plasma li ile tsa eketsoa lipoleiting tsa SPE 'me mokelikeli oohle oa tlosoa. Lisampole li ile tsa hlatsuoa (pele ka 5% methanol eaba 30% methanol) 'me tsa hlatsuoa ka 2% NH4OH/90% methanol. Kamora ho omisa eluate ho 55°C metsotso e 99 ka motlakase o sa fetoheng oa N2, lisampole li ile tsa fokotsoa ka metsoako e tloaelehileng 'me Aβ(1–40) ea lekanngoa joalo ka ha ho hlalositsoe kaholimo.
Mokhoa oa ho qotsa sengoloa sena: Urich, E. et al. Ho isa thepa bokong ho sebelisoa li-peptide tsa transit tse khethiloeng ka har'a vivo. saense. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB le Moos T. Ho isa meriana ea macromolecular bokong ho sebelisoa phekolo e reretsoeng. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., le Martinez-Martinez, P. Ho fana ka meriana ea peptide le protheine ho pholletsa le mokoallo oa mali le boko. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Thibelo ea mali le boko: bothata ba nts'etsopele ea lithethefatsi tsa boko. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, le Byrd, A. Litebello tsa ho ntlafala ha phepelo ea lithethefatsi le ho lebisa bokong ka tsela ea choroid plexus-CSF. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Ntlafatso ea meriana ea biopharmaceuticals ka lipere tsa Trojan tsa molecular bakeng sa ho fana ka boko. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
PARDGARD, phetisetso ea peptide e tsamaisoang ke li-receptor tsa WM ho pholletsa le mokoallo oa mali le boko. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Eketsa ho kenella bokong le katleho ea li-antibodies tsa kalafo ho sebelisoa li-monovalent molecular shuttles. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transferrin receptor (TfR) transport e etsa qeto ea ho monya ha mefuta e fapaneng ea li-antibodies tsa TfR bokong. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).