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La barrière hémato-encéphalique et la barrière hémato-encéphalique empêchent les agents biothérapeutiques d'atteindre leurs cibles dans le système nerveux central, entravant ainsi le traitement efficace des maladies neurologiques. Pour découvrir de nouveaux transporteurs cérébraux in vivo, nous avons introduit une bibliothèque de peptides de phages T7 et prélevé en série du sang et du liquide céphalorachidien (LCR) à l'aide d'un modèle de grand pool de rats conscients canulés. Des clones de phages spécifiques étaient fortement enrichis dans le LCR après quatre cycles de sélection. Les tests de peptides candidats individuels ont révélé un enrichissement de plus de 1 000 fois dans le LCR. La bioactivité de l'administration au cerveau par le peptide a été confirmée par une réduction de 40 % du taux de bêta-amyloïde dans le LCR grâce à un inhibiteur peptidique de BACE1 lié au nouveau peptide de transit identifié. Ces résultats suggèrent que les peptides identifiés par des méthodes de sélection de phages in vivo pourraient être des véhicules utiles pour l'administration systémique de macromolécules au cerveau avec un effet thérapeutique.
La recherche sur les thérapies ciblées sur le système nerveux central (SNC) s'est principalement concentrée sur l'identification de médicaments et d'agents optimisés présentant des propriétés de ciblage du SNC, accordant moins d'attention à la découverte des mécanismes qui régissent l'administration active des médicaments au cerveau. Cette situation commence à changer, car l'administration de médicaments, en particulier de grosses molécules, fait partie intégrante du développement moderne de médicaments en neurosciences. L'environnement du système nerveux central est bien protégé par le système de barrière cérébrovasculaire, composé de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et de la barrière hémato-encéphalique (BCBB)1, ce qui complique l'administration de médicaments au cerveau1,2. On estime que la quasi-totalité des médicaments à grosses molécules et plus de 98 % des médicaments à petites molécules sont éliminés du cerveau3. C'est pourquoi il est essentiel d'identifier de nouveaux systèmes de transport cérébral permettant une administration efficace et spécifique des médicaments thérapeutiques au SNC4,5. Cependant, la BHE et la BCSFB offrent également d'excellentes opportunités pour l'administration de médicaments, car elles pénètrent et pénètrent dans toutes les structures du cerveau par son important réseau vasculaire. Français Ainsi, les efforts actuels pour utiliser des méthodes non invasives d'administration au cerveau reposent en grande partie sur le mécanisme de transport médié par récepteur (PMT) utilisant le récepteur endogène BBB6. Malgré les récentes avancées clés utilisant la voie du récepteur de la transferrine7,8, le développement de nouveaux systèmes d'administration aux propriétés améliorées est nécessaire. À cette fin, notre objectif était d'identifier des peptides capables de médier le transport du LCR, car ils pourraient en principe être utilisés pour délivrer des macromolécules au SNC ou pour ouvrir de nouvelles voies de réception. En particulier, des récepteurs et transporteurs spécifiques du système cérébrovasculaire (BHE et BSCFB) peuvent servir de cibles potentielles pour l'administration active et spécifique de médicaments biothérapeutiques. Le liquide céphalorachidien (LCR) est un produit sécrétoire du plexus choroïde (CS) et est en contact direct avec le liquide interstitiel du cerveau par l'espace sous-arachnoïdien et l'espace ventriculaire4. Il a récemment été démontré que le liquide céphalorachidien sous-arachnoïdien diffuse excessivement dans l'interstitium cérébral9. Nous espérons accéder à l'espace parenchymateux par cette voie d'entrée sous-arachnoïdienne ou directement par la BHE. Pour y parvenir, nous avons mis en œuvre une stratégie robuste de sélection de phages in vivo qui identifie idéalement les peptides transportés par l'une ou l'autre de ces deux voies distinctes.
Nous décrivons maintenant une méthode de criblage séquentiel in vivo par phage display avec échantillonnage du LCR couplé à un séquençage à haut débit (HTS) pour surveiller les cycles de sélection initiaux présentant la plus grande diversité de bibliothèques. Le criblage a été effectué sur des rats conscients avec une canule à grande citerne (CM) implantée en permanence pour éviter la contamination sanguine. Il est important de noter que cette approche sélectionne à la fois les peptides ciblant le cerveau et les peptides ayant une activité de transport à travers la barrière cérébrovasculaire. Nous avons utilisé des phages T7 en raison de leur petite taille (~ 60 nm)10 et avons suggéré qu'ils sont adaptés au transport de vésicules permettant le franchissement transcellulaire de la barrière endothéliale et/ou épithélio-médullaire. Après quatre cycles de panning, des populations de phages ont été isolées, montrant un fort enrichissement du LCR in vivo et une association avec les microvaisseaux cérébraux. Il est important de noter que nous avons pu confirmer nos résultats en démontrant que les peptides candidats préférés et synthétisés chimiquement sont capables de transporter une cargaison protéique dans le liquide céphalo-rachidien. Premièrement, les effets pharmacodynamiques sur le SNC ont été établis en combinant un peptide de transit majeur avec un inhibiteur du peptide BACE1. Outre la démonstration que les stratégies de criblage fonctionnel in vivo permettent d'identifier de nouveaux peptides de transport cérébral comme transporteurs efficaces de protéines, nous pensons que des approches de sélection fonctionnelle similaires joueront également un rôle important dans l'identification de nouvelles voies de transport cérébral.
Sur la base des unités formant des plages (PFU), après l'étape d'encapsidation des phages, une bibliothèque de peptides aléatoires de phages T7 linéaires 12-mer avec une diversité d'environ 109 a été conçue et créée (voir Matériels et méthodes). Il est important de noter que nous avons soigneusement analysé cette bibliothèque avant le panning in vivo. L'amplification par PCR d'échantillons de bibliothèque de phages à l'aide d'amorces modifiées a généré des amplicons directement applicables au HTS (Fig. 1a supplémentaire). En raison a) d'erreurs de séquençage HTS11, b) de l'impact sur la qualité des amorces (NNK)1-12 et c) de la présence de phages de type sauvage (wt) (inserts de squelette) dans la bibliothèque de secours, une procédure de filtrage de séquence a été mise en œuvre pour extraire uniquement les informations de séquence vérifiées (Fig. 1b supplémentaire). Ces étapes de filtrage s'appliquent à toutes les bibliothèques de séquençage HTS. Français Pour la bibliothèque standard, un total de 233 868 lectures ont été obtenues, dont 39 % ont passé les critères de filtrage et ont été utilisées pour l'analyse de la bibliothèque et la sélection pour les tours suivants (Figure supplémentaire 1c–e). Les lectures étaient principalement des multiples de 3 paires de bases de longueur avec un pic à 36 nucléotides (Fig. supplémentaire 1c), confirmant la conception de la bibliothèque (NNK) 1-12. Notamment, environ 11 % des membres de la bibliothèque contenaient un insert PAGISRELVDKL de type sauvage (wt) à 12 dimensions, et près de la moitié des séquences (49 %) contenaient des insertions ou des délétions. Le HTS de la bibliothèque a confirmé la grande diversité des peptides dans la bibliothèque : plus de 81 % des séquences peptidiques n'ont été trouvées qu'une seule fois et seulement 1,5 % se sont produites en ≥ 4 copies (Fig. supplémentaire 2a). Français Les fréquences des acides aminés (aa) aux 12 positions du répertoire étaient bien corrélées avec les fréquences attendues pour le nombre de codons générés par le répertoire NKK dégénéré (Fig. supplémentaire 2b). La fréquence observée des résidus aa codés par ces inserts était bien corrélée avec la fréquence calculée (r = 0,893) (Fig. supplémentaire 2c). La préparation des banques de phages pour injection comprend les étapes d'amplification et d'élimination des endotoxines. Il a été précédemment démontré que cela réduisait potentiellement la diversité des banques de phages12,13. Par conséquent, nous avons séquencé une banque de phages amplifiée sur plaque ayant subi une élimination des endotoxines et l'avons comparée à la banque d'origine pour estimer la fréquence des AA. Une forte corrélation (r = 0,995) a été observée entre le pool d'origine et le pool amplifié et purifié (Fig. supplémentaire 2d), indiquant que la compétition entre les clones amplifiés sur plaques en utilisant le phage T7 n'a pas causé de biais majeur. Cette comparaison est basée sur la fréquence des motifs tripeptides dans chaque bibliothèque, car la diversité des bibliothèques (~109) ne peut être entièrement capturée même avec HTS. L'analyse de fréquence des aa à chaque position a révélé un léger biais dépendant de la position dans les trois dernières positions du répertoire saisi (Fig. 2e supplémentaire). En conclusion, nous avons conclu que la qualité et la diversité de la bibliothèque étaient acceptables et que seules des modifications mineures de la diversité ont été observées en raison de l'amplification et de la préparation des bibliothèques de phages entre plusieurs cycles de sélection.
Un échantillonnage en série du liquide céphalorachidien peut être réalisé par l'implantation chirurgicale d'une canule dans le muscle cérébro-spinal de rats conscients afin de faciliter l'identification du phage T7 injecté par voie intraveineuse (iv) via la BHE et/ou le BCSFB (Fig. 1a-b). Nous avons utilisé deux bras de sélection indépendants (bras A et B) lors des trois premiers cycles de sélection in vivo (Fig. 1c). Nous avons progressivement augmenté la rigueur de la sélection en diminuant la quantité totale de phages introduite lors des trois premiers cycles. Pour le quatrième cycle de sélection, nous avons combiné les échantillons des branches A et B et effectué trois sélections indépendantes supplémentaires. Pour étudier les propriétés in vivo des particules de phage T7 dans ce modèle, un phage sauvage (insert maître PAGISRELVDKL) a été injecté aux rats par la veine caudale. La récupération des phages dans le liquide céphalorachidien et le sang à différents moments a montré que les phages icosaédriques T7 relativement petits présentaient une phase initiale d'élimination rapide du compartiment sanguin (Fig. 3 supplémentaire). D'après les titres administrés et le volume sanguin des rats, nous avons calculé que seulement environ 1 % du poids total des phages de la dose administrée était détecté dans le sang 10 minutes après l'injection intraveineuse. Après cette diminution initiale rapide, une clairance primaire plus lente a été mesurée avec une demi-vie de 27,7 minutes. Il est important de noter que très peu de phages ont été récupérés du compartiment du LCR, ce qui indique un faible bruit de fond pour la migration des phages de type sauvage dans le compartiment du LCR (Fig. 3 supplémentaire). En moyenne, seulement environ 1 x 10-3 % des titres de phages T7 dans le sang et 4 x 10-8 % des phages initialement perfusés ont été détectés dans le liquide céphalorachidien sur toute la période d'échantillonnage (0-250 min). Il est à noter que la demi-vie (25,7 min) des phages de type sauvage dans le liquide céphalorachidien était similaire à celle observée dans le sang. Ces données démontrent que la barrière séparant le compartiment du LCR du sang est intacte chez les rats canulés par CM, ce qui permet la sélection in vivo de bibliothèques de phages pour identifier les clones qui sont facilement transportés du sang vers le compartiment du LCR.
(a) Mise en place d'une méthode de rééchantillonnage du liquide céphalorachidien (LCR) à partir d'un grand pool. (b) Diagramme montrant la localisation cellulaire de la barrière du système nerveux central (SNC) et la stratégie de sélection utilisée pour identifier les peptides qui traversent la barrière hémato-encéphalique (BHE) et la barrière hémato-encéphalique. (c) Organigramme de criblage par phage display in vivo. À chaque tour de sélection, les phages (identifiants animaux à l'intérieur des flèches) ont été injectés par voie intraveineuse. Deux branches alternatives indépendantes (A, B) sont conservées séparément jusqu'au 4e tour de sélection. Pour les tours de sélection 3 et 4, chaque clone de phage extrait du LCR a été séquencé manuellement. (d) Cinétique des phages isolés du sang (cercles rouges) et du liquide céphalorachidien (triangles verts) lors du premier tour de sélection chez deux rats canulés après injection intraveineuse de la banque de peptides T7 (2 x 1012 phages/animal). Français Les carrés bleus indiquent la concentration initiale moyenne de phage dans le sang, calculée à partir de la quantité de phage injectée, en tenant compte du volume sanguin total. Les carrés noirs indiquent le point d'intersection de la ligne y extrapolée à partir des concentrations de phages sanguins. (e,f) Présentent la fréquence relative et la distribution de tous les motifs tripeptides chevauchants possibles trouvés dans le peptide. Le nombre de motifs trouvés dans 1000 lectures est indiqué. Les motifs significativement (p < 0,001) enrichis sont marqués par des points rouges. (e) Nuage de points de corrélation comparant la fréquence relative du motif tripeptide de la bibliothèque injectée avec le phage dérivé du sang des animaux n° 1.1 et n° 1.2. (f) Nuage de points de corrélation comparant les fréquences relatives des motifs tripeptides de phage animal n° 1.1 et n° 1.2 isolés dans le sang et le liquide céphalo-rachidien. (g, h) Représentation de l'identifiant de séquence du phage enrichi dans le sang (g) par rapport aux banques injectées et du phage enrichi dans le LCR (h) par rapport au sang après une série de sélections in vivo chez les deux animaux. La taille du code à une lettre indique la fréquence d'apparition de cet acide aminé à cette position. Vert = polaire, violet = neutre, bleu = basique, rouge = acide et noir = acides aminés hydrophobes. Les figures 1a et b ont été conçues et produites par Eduard Urich.
Nous avons injecté une banque de peptides phagiques à deux rats instrumentés CM (clades A et B) et isolé les phages du liquide céphalorachidien et du sang (Figure 1d). La clairance initiale rapide de la banque était moins prononcée que celle du phage sauvage. La demi-vie moyenne de la banque injectée chez les deux animaux était de 24,8 minutes dans le sang, similaire à celle du phage sauvage, et de 38,5 minutes dans le LCR. Des échantillons de sang et de liquide céphalorachidien de chaque animal ont été soumis à un HTS et tous les peptides identifiés ont été analysés pour détecter la présence d'un court motif tripeptide. Les motifs tripeptides ont été choisis car ils fournissent une base minimale à la formation de structures et aux interactions peptide-protéine14,15. Nous avons constaté une bonne corrélation dans la distribution des motifs entre la banque de phages injectée et les clones extraits du sang des deux animaux (Fig. 1e). Les données indiquent que la composition de la banque n'est que marginalement enrichie dans le compartiment sanguin. Les fréquences des acides aminés et les séquences consensus ont été analysées plus en détail à chaque position à l'aide d'une adaptation du logiciel Weblogo16. Il est intéressant de noter que nous avons constaté un fort enrichissement en résidus de glycine sanguine (Fig. 1g). La comparaison du sang avec des clones sélectionnés dans le LCR a révélé une forte sélection et une certaine désélection de motifs (Fig. 1f), et certains acides aminés étaient préférentiellement présents à des positions prédéterminées dans le 12-membre (Fig. 1h). Il est à noter que les animaux individuels présentaient des différences significatives dans le liquide céphalo-rachidien, tandis qu'un enrichissement en glycine sanguine a été observé chez les deux animaux (Fig. 4a–j supplémentaires). Après un filtrage rigoureux des données de séquence dans le liquide céphalo-rachidien des animaux n° 1.1 et n° 1.2, un total de 964 et 420 peptides 12-mères uniques ont été obtenus (Fig. 1d–e supplémentaires). Les clones de phages isolés ont été amplifiés et soumis à une seconde phase de sélection in vivo. Les phages extraits du deuxième cycle de sélection ont été soumis au HTS chez chaque animal et tous les peptides identifiés ont été utilisés comme données d'entrée dans un programme de reconnaissance de motifs pour analyser l'occurrence des motifs tripeptidiques (Fig. 2a, b, ef). Comparativement au premier cycle de phage récupéré du LCR, nous avons observé une sélection et une désélection supplémentaires de nombreux motifs dans le LCR des branches A et B (Fig. 2). Un algorithme d'identification de réseau a été appliqué pour déterminer s'ils représentaient différents modèles de séquence cohérente. Une nette similarité a été observée entre les séquences à 12 dimensions récupérées par le LCR dans le clade alternatif A (Fig. 2c, d) et le clade B (Fig. 2g, h). L'analyse groupée dans chaque branche a révélé des profils de sélection différents pour les peptides 12-mer (Fig. 5c, d supplémentaires) et une augmentation du rapport LCR/titre sanguin au fil du temps pour les clones groupés après le deuxième cycle de sélection par rapport au premier cycle (Fig. 5e supplémentaires).
Enrichissement de motifs et de peptides dans le liquide céphalo-rachidien par deux cycles successifs de sélection de phages fonctionnels in vivo.
Français Tous les phages du liquide céphalorachidien récupérés lors du premier tour de chaque animal (animaux n° 1.1 et n° 1.2) ont été regroupés, amplifiés, séquencés par HT et réinjectés ensemble (2 x 1010 phages/animal) 2 rats canulés SM (n° 1.1 → #). 2.1 et 2.2, 1.2 → 2.3 et 2.4). (a, b, e, f) Diagrammes de dispersion de corrélation comparant la fréquence relative des motifs tripeptidiques de tous les phages dérivés du LCR lors des premier et deuxième tours de sélection. Fréquence relative et distribution des motifs représentant tous les tripeptides chevauchants possibles trouvés dans les peptides dans les deux orientations. Le nombre de motifs trouvés dans 1000 lectures est indiqué. Les motifs qui ont été significativement (p < 0,001) sélectionnés ou exclus dans l'une des bibliothèques comparées sont mis en évidence par des points rouges. (c, d, g, h) Représentation du logo de séquence de toutes les séquences de 12 acides aminés riches en LCR basées sur les tours 2 et 1 de la sélection in vivo. La taille du code à une lettre indique la fréquence à laquelle cet acide aminé apparaît à cette position. Pour représenter le logo, la fréquence des séquences de LCR extraites d'animaux individuels entre deux tours de sélection est comparée et les séquences enrichies au deuxième tour sont affichées : (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 et (h) #1.2–#2.4. Les acides aminés les plus enrichis à une position donnée chez les animaux (c, d) n° 2.1 et n° 2.2 ou (g, h) chez les animaux n° 2.3 et n° 2.4 sont indiqués en couleur. Vert = polaire, violet = neutre, bleu = basique, rouge = acide et noir = acides aminés hydrophobes.
Français Après le troisième tour de sélection, nous avons identifié 124 séquences peptidiques uniques (#3.1 et #3.2) à partir de 332 clones de phages reconstitués dans le LCR, isolés de deux animaux (Fig. supplémentaire 6a). La séquence LGSVS (18,7 %) avait la proportion relative la plus élevée, suivie des inserts de type sauvage PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) et SARGSWREIVSLS (2,2 %). Lors du quatrième tour final, nous avons regroupé deux branches sélectionnées indépendamment à partir de trois animaux distincts (Fig. 1c). Sur les 925 clones de phages séquencés récupérés dans le LCR, lors du quatrième tour, nous avons trouvé 64 séquences peptidiques uniques (Fig. supplémentaire 6b), parmi lesquelles la proportion relative de phages de type sauvage est tombée à 0,8 %. Français Les clones de LCR les plus courants au quatrième tour étaient LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) et RLSSVDSDLSGC (3,2 %). %)). La plage de longueur des peptides sélectionnés est due à des insertions/délétions de nucléotides ou à des codons stop prématurés dans les amorces de la bibliothèque lors de l'utilisation de codons dégénérés pour la conception de la bibliothèque NNK. Les codons stop prématurés génèrent des peptides plus courts et sont sélectionnés car ils contiennent le motif aa favorable. Des peptides plus longs peuvent résulter d'insertions/délétions dans les amorces des bibliothèques synthétiques. Cela positionne le codon stop conçu en dehors du cadre et le lit jusqu'à ce qu'un nouveau codon stop apparaisse en aval. En général, nous avons calculé les facteurs d'enrichissement pour les quatre tours de sélection en comparant les données d'entrée avec les données de sortie de l'échantillon. Pour la première série de criblages, nous avons utilisé les titres de phages sauvages comme référence de référence non spécifique. Il est intéressant de noter que la sélection négative des phages était très forte lors du premier cycle de LCR, mais pas dans le sang (Fig. 3a), ce qui pourrait s'expliquer par la faible probabilité de diffusion passive de la plupart des membres de la bibliothèque de peptides dans le compartiment du LCR, ou par le fait que les phages apparentés ont tendance à être plus efficacement retenus ou éliminés de la circulation sanguine que les bactériophages. Cependant, lors de la deuxième série de criblages, une forte sélection de phages dans le LCR a été observée dans les deux clades, suggérant que la série précédente était enrichie en phages présentant des peptides favorisant l'absorption du LCR (Fig. 3a). Là encore, sans enrichissement sanguin significatif. De même, lors des troisième et quatrième séries, les clones de phages étaient significativement enrichis dans le LCR. En comparant la fréquence relative de chaque séquence peptidique unique entre les deux dernières séries de sélection, nous avons constaté que les séquences étaient encore plus enrichies lors de la quatrième série (Fig. 3b). Au total, 931 motifs tripeptides ont été extraits des 64 séquences peptidiques uniques utilisant les deux orientations peptidiques. Les motifs les plus enrichis lors du quatrième tour ont été examinés plus attentivement pour leurs profils d'enrichissement à tous les tours par rapport à la bibliothèque injectée (seuil : enrichissement de 10 %) (Fig. 6c supplémentaire). Les schémas généraux de sélection ont montré que la plupart des motifs étudiés étaient enrichis lors de tous les tours précédents des deux branches de sélection. Cependant, certains motifs (par exemple, SGL, VSG, LGS GSV) provenaient principalement du clade alternatif A, tandis que d'autres (par exemple, FGW, RTN, WGF, NTR) étaient enrichis dans le clade alternatif B.
Validation du transport dans le LCR de peptides enrichis en LCR et de peptides leaders biotinylés conjugués à des charges utiles de streptavidine.
(a) Ratios d'enrichissement calculés dans les quatre tours (R1-R4) sur la base des titres de phages injectés (entrée = I) (PFU) et des titres de phages déterminés dans le LCR (sortie = O). Les facteurs d'enrichissement pour les trois derniers tours (R2-R4) ont été calculés par comparaison avec le tour précédent et le premier tour (R1) avec les données de poids. Les barres ouvertes représentent le liquide céphalo-rachidien, les barres ombrées représentent le plasma. (***p<0,001, basé sur le test t de Student). (b) Liste des peptides de phages les plus abondants, classés selon leur proportion relative par rapport à tous les phages collectés dans le LCR après le tour 4 de sélection. Les six clones de phages les plus courants sont surlignés en couleur, numérotés et leurs facteurs d'enrichissement entre les tours 3 et 4 de sélection (encarts). (c, d) Les six clones de phages les plus enrichis, les banques de phages vides et de peptides de phages parentaux du tour 4 ont été analysés individuellement dans un modèle d'échantillonnage du LCR. Des échantillons de LCR et de sang ont été prélevés aux moments indiqués. (c) Des quantités égales de 6 clones de phages candidats (2 x 1010 phages/animaux), de phages vides (n° 1779) (2 x 1010 phages/animaux) et de banques de peptides de phages de stock (2 x 1012 phages/animaux). Injecter au moins 3 CM est administré à l'animal canulé séparément par la veine de la queue. La pharmacocinétique du LCR de chaque clone de phage injecté et de chaque banque de peptides de phages au fil du temps est présentée. (d) montre le rapport LCR/sang moyen pour tous les phages récupérés/mL pendant la période d'échantillonnage. (e) Quatre peptides leaders synthétiques et un témoin brouillé ont été liés à la biotine à la streptavidine par leur extrémité N-terminale (présentation tétramère), puis injectés (veine de la queue iv, 10 mg de streptavidine/kg). Au moins trois rats intubés (N = 3). ). Français Des échantillons de LCR ont été prélevés aux moments indiqués et les concentrations de streptavidine ont été mesurées par ELISA anti-streptavidine dans le LCR (nd = non détecté). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, basé sur le test ANOVA). (f) Comparaison de la séquence d'acides aminés du clone de peptide de phage le plus enrichi #2002 (violet) avec d'autres clones de peptides de phage sélectionnés lors du 4e tour de sélection. Les fragments d'acides aminés identiques et similaires sont codés par couleur.
Parmi tous les phages enrichis lors du quatrième cycle (Fig. 3b), six clones candidats ont été sélectionnés pour une analyse individuelle plus approfondie dans le modèle d'échantillonnage du LCR. Des quantités égales de six banques de peptides de phages candidats, de phages vides (sans insert) et de prophages ont été injectées à trois animaux CM canulés, et la pharmacocinétique a été déterminée dans le LCR (Fig. 3c) et le sang (Fig. 7 supplémentaire). Tous les clones de phages testés ciblaient le compartiment du LCR à un niveau 10 à 1 000 fois supérieur à celui du phage témoin vide (n° 1779). Par exemple, les clones n° 2020 et n° 2077 présentaient des titres dans le LCR environ 1 000 fois supérieurs à ceux du phage témoin. Le profil pharmacocinétique de chaque peptide sélectionné est différent, mais tous présentent une forte capacité de localisation dans le LCR. Nous avons observé une diminution constante au fil du temps pour les clones n° 1903 et n° 2011, tandis que pour les clones n° 2077, n° 2002 et n° 2009, une augmentation au cours des 10 premières minutes pourrait indiquer un transport actif, mais doit être vérifiée. Les clones n° 2020, n° 2002 et n° 2077 se sont stabilisés à des niveaux élevés, tandis que la concentration dans le LCR du clone n° 2009 a lentement diminué après l'augmentation initiale. Nous avons ensuite comparé la fréquence relative de chaque candidat LCR avec sa concentration sanguine (Fig. 3d). La corrélation du titre moyen de chaque candidat LCR avec son titre sanguin à tous les temps d'échantillonnage a montré que trois des six candidats étaient significativement enrichis en LCR sanguin. Il est intéressant de noter que le clone n° 2077 a montré une stabilité sanguine plus élevée (Figure supplémentaire 7). Pour confirmer que les peptides eux-mêmes sont capables de transporter activement des charges autres que les particules de phage dans le compartiment du LCR, nous avons synthétisé quatre peptides leaders dérivés de la biotine à l'extrémité N-terminale, où les peptides se fixent à la particule de phage. Les peptides biotinylés (n° 2002, 2009, 2020 et 2077) ont été conjugués à la streptavidine (SA) pour obtenir des formes multimériques imitant quelque peu la géométrie du phage. Ce format nous a également permis de mesurer l'exposition à la SA dans le sang et le liquide céphalorachidien sous forme de peptides protéiques transporteurs de charges. Il est important de noter que les données sur les phages étaient souvent reproductibles lorsque les peptides synthétiques étaient administrés dans ce format conjugué à la SA (Fig. 3e). Les peptides brouillés présentaient une exposition initiale moindre et une clairance du LCR plus rapide, avec des niveaux indétectables en 48 heures. Afin de mieux comprendre les voies de transport de ces clones de phages peptidiques dans le LCR, nous avons analysé la localisation de chaque peptide phage par immunohistochimie (IHC) afin de détecter directement les particules de phage une heure après injection intraveineuse in vivo. Notamment, les clones n° 2002, n° 2077 et n° 2009 ont pu être détectés par une forte coloration dans les capillaires cérébraux, tandis que le phage témoin (n° 1779) et le clone n° 2020 n'ont pas été détectés (Figure supplémentaire 8). Ceci suggère que ces peptides contribuent à l'effet sur le cerveau précisément en traversant la BHE. Une analyse plus détaillée est nécessaire pour tester cette hypothèse, car la voie BSCFB pourrait également être impliquée. En comparant la séquence d'acides aminés du clone le plus enrichi (n° 2002) avec d'autres peptides sélectionnés, il a été constaté que certains d'entre eux présentent des extensions d'acides aminés similaires, ce qui pourrait indiquer un mécanisme de transport similaire (Fig. 3f).
Français En raison de son profil plasmatique unique et de l'augmentation significative du LCR au fil du temps, le clone de phage display #2077 a été exploré plus en détail sur une période plus longue de 48 heures et a pu reproduire l'augmentation rapide du LCR observée en association avec des niveaux soutenus de SA (Fig. 4a). Concernant les autres clones de phage identifiés, #2077 a fortement marqué les capillaires cérébraux et a montré une colocalisation significative avec la lectine marqueur capillaire lorsqu'il était observé à plus haute résolution et éventuellement une certaine coloration dans l'espace parenchymateux (Figure 4b). Afin de déterminer si des effets pharmacologiques médiés par des peptides pouvaient être obtenus dans le SNC, nous avons réalisé une expérience dans laquelle des versions biotinylées i) du peptide de transit #2077 et ii) du peptide inhibiteur de BACE1 ont été mélangées à SA selon deux ratios différents. Pour une combinaison, nous avons utilisé uniquement le peptide inhibiteur de BACE1 et pour l'autre, nous avons utilisé un ratio 1:3 d'inhibiteur de peptide BACE1 pour le peptide #2077. Les deux échantillons ont été administrés par voie intraveineuse et les concentrations sanguines et vasculaires du peptide bêta-amyloïde 40 (Abeta40) ont été mesurées au fil du temps. L'Abeta40 a été dosé dans le LCR car il reflète l'inhibition de BACE1 dans le parenchyme cérébral. Comme prévu, les deux complexes ont significativement réduit les concentrations sanguines d'Abeta40 (Fig. 4c, d). Cependant, seuls les échantillons contenant un mélange de peptide n° 2077 et d'un inhibiteur du peptide BACE1 conjugué à SA ont entraîné une diminution significative de l'Abeta40 dans le liquide céphalorachidien (Fig. 4c). Les données montrent que le peptide n° 2077 est capable de transporter la protéine SA de 60 kDa dans le SNC et induit également des effets pharmacologiques avec les inhibiteurs du peptide BACE1 conjugués à SA.
(a) Injection clonale (2 × 10 phages/animal) de phage T7 montrant les profils pharmacocinétiques à long terme du peptide n° 2077 du LCR (RLSSVDSDLSGC) et du phage témoin non injecté (n° 1779) chez au moins trois rats intubés par CM. (b) Image microscopique confocale de microvaisseaux corticaux représentatifs chez des rats ayant reçu une injection de phage (2 × 10 10 phages/animal) montrant une contre-coloration du peptide n° 2077 et des vaisseaux (lectine). Ces clones de phages ont été administrés à 3 rats et mis en circulation pendant 1 heure avant la perfusion. Les cerveaux ont été sectionnés et colorés avec des anticorps polyclonaux marqués au FITC contre la capside du phage T7. Dix minutes avant la perfusion et la fixation ultérieure, une lectine marquée au DyLight594 a été administrée par voie intraveineuse. Images fluorescentes montrant une coloration à la lectine (rouge) du côté luminal des microvaisseaux et des phages (vert) dans la lumière des capillaires et du tissu cérébral périvasculaire. L'échelle correspond à 10 µm. (c, d) Le peptide inhibiteur de BACE1 biotinylé, seul ou en association avec le peptide de transit biotinylé n° 2077, a été couplé à la streptavidine, puis injecté par voie intraveineuse à au moins trois rats CM canulés (10 mg de streptavidine/kg). La réduction de l'Aβ40 induite par l'inhibiteur du peptide BACE1 a été mesurée par ELISA Aβ1-40 dans le sang (rouge) et le liquide céphalorachidien (orange) aux temps indiqués. Pour plus de clarté, une ligne pointillée est tracée sur le graphique à une échelle de 100 %. (c) Pourcentage de réduction de l'Aβ40 dans le sang (triangles rouges) et le liquide céphalorachidien (triangles orange) chez les rats traités avec de la streptavidine conjuguée au peptide de transit n° 2077 et au peptide inhibiteur de BACE1 dans un rapport de 3:1. (d) Pourcentage de réduction de l'Aβ40 dans le sang (cercles rouges) et le liquide céphalorachidien (cercles orange) chez les rats traités avec de la streptavidine couplée à un peptide inhibiteur de BACE1 uniquement. La concentration d'Aβ dans le groupe témoin était de 420 pg/ml (écart type = 101 pg/ml).
Français La présentation de phages a été appliquée avec succès dans plusieurs domaines de la recherche biomédicale17. Cette méthode a été utilisée pour des études in vivo de diversité vasculaire18,19 ainsi que pour des études ciblant les vaisseaux cérébraux20,21,22,23,24,25,26. Dans cette étude, nous avons étendu l'application de cette méthode de sélection non seulement à l'identification directe de peptides ciblant les vaisseaux cérébraux, mais aussi à la découverte de candidats possédant des propriétés de transport actif pour traverser la barrière hémato-encéphalique. Nous décrivons maintenant le développement d'une procédure de sélection in vivo chez des rats intubés CM et démontrons son potentiel pour identifier des peptides possédant des propriétés de homing dans le LCR. En utilisant le phage T7 présentant une bibliothèque de peptides aléatoires 12-mer, nous avons pu démontrer que le phage T7 est suffisamment petit (environ 60 nm de diamètre)10 pour s'adapter à la barrière hémato-encéphalique, traversant ainsi directement la barrière hémato-encéphalique ou le plexus choroïde. Nous avons observé que la collecte de LCR à partir de rats CM canulés était une méthode de criblage fonctionnel in vivo bien contrôlée, et que le phage extrait se liait non seulement au système vasculaire, mais servait également de transporteur à travers la barrière hémato-encéphalique. De plus, en collectant simultanément du sang et en appliquant le HTS au LCR et aux phages dérivés du sang, nous avons confirmé que notre choix de LCR n'était pas influencé par l'enrichissement sanguin ou l'aptitude à l'expansion entre les cycles de sélection. Cependant, le compartiment sanguin fait partie intégrante de la procédure de sélection, car les phages capables d'atteindre le compartiment LCR doivent survivre et circuler dans la circulation sanguine suffisamment longtemps pour s'enrichir dans le cerveau. Afin d'extraire des informations de séquence fiables à partir des données HTS brutes, nous avons implémenté des filtres adaptés aux erreurs de séquençage spécifiques à la plateforme dans le flux de travail d'analyse. Français En incorporant des paramètres cinétiques dans la méthode de criblage, nous avons confirmé la pharmacocinétique rapide des phages T7 de type sauvage (t½ ~ 28 min) dans le sang24, 27, 28 et avons également déterminé leur demi-vie dans le liquide céphalorachidien (t½ ~ 26 min) par minute). Malgré des profils pharmacocinétiques similaires dans le sang et le LCR, seulement 0,001 % de la concentration sanguine de phages a pu être détectée dans le LCR, indiquant une faible mobilité de fond du phage T7 de type sauvage à travers la barrière hémato-encéphalique. Ce travail souligne l'importance du premier tour de sélection lors de l'utilisation de stratégies de panning in vivo, en particulier pour les systèmes de phages qui sont rapidement éliminés de la circulation, car peu de clones sont capables d'atteindre le compartiment du SNC. Ainsi, au premier tour, la réduction de la diversité de la bibliothèque a été très importante, car seul un nombre limité de clones ont finalement été collectés dans ce modèle de LCR très strict. Cette stratégie de panning in vivo comprenait plusieurs étapes de sélection telles que l'accumulation active dans le compartiment LCR, la survie des clones dans le compartiment sanguin et l'élimination rapide des clones de phages T7 du sang dans les 10 premières minutes (Fig. 1d et Fig. 4M supplémentaire). ). Ainsi, après le premier tour, différents clones de phages ont été identifiés dans le LCR, bien que le même pool initial ait été utilisé pour chaque animal. Cela suggère que plusieurs étapes de sélection stricte pour les bibliothèques sources avec un grand nombre de membres de la bibliothèque entraînent une réduction significative de la diversité. Par conséquent, les événements aléatoires feront partie intégrante du processus de sélection initial, influençant grandement le résultat. Il est probable que de nombreux clones de la bibliothèque d'origine avaient une propension à l'enrichissement du LCR très similaire. Cependant, même dans les mêmes conditions expérimentales, les résultats de la sélection peuvent différer en raison du faible nombre de chaque clone particulier dans le pool initial.
Les motifs enrichis dans le LCR diffèrent de ceux du sang. Il est intéressant de noter que nous avons observé une première évolution vers des peptides riches en glycine dans le sang de certains animaux (Fig. 1g, Fig. 4e, 4f supplémentaires). Les phages contenant des peptides riches en glycine pourraient être plus stables et moins susceptibles d'être retirés de la circulation. Cependant, ces peptides riches en glycine n'ont pas été détectés dans les échantillons de liquide céphalorachidien, ce qui suggère que les banques sélectionnées ont subi deux étapes de sélection différentes : une dans le sang et une autre dans le liquide céphalorachidien. Les clones enrichis en LCR issus de la quatrième série de sélection ont été largement testés. La quasi-totalité des clones testés individuellement se sont avérés enrichis en LCR par rapport au phage témoin vierge. Un peptide positif (n° 2077) a été examiné plus en détail. Français Il a montré une demi-vie plasmatique plus longue par rapport aux autres hits (Figure 3d et Figure supplémentaire 7), et il est intéressant de noter que ce peptide contenait un résidu de cystéine à l'extrémité C-terminale. Il a été récemment démontré que l'ajout de cystéine aux peptides peut améliorer leurs propriétés pharmacocinétiques en se liant à l'albumine 29 . Ceci est actuellement inconnu pour le peptide #2077 et nécessite des études plus approfondies. Certains peptides ont montré une dépendance à la valence dans l'enrichissement du LCR (données non présentées), ce qui peut être lié à la géométrie de surface affichée de la capside T7. Le système T7 que nous avons utilisé a montré 5 à 15 copies de chaque peptide par particule de phage. L'IHC a été réalisée sur des clones de phages principaux candidats injectés par voie intraveineuse dans le cortex cérébral de rats (Fig. supplémentaire 8). Les données ont montré qu'au moins trois clones (n° 2002, n° 2009 et n° 2077) interagissaient avec la BHE. Il reste à déterminer si cette interaction avec la BHE entraîne l'accumulation de LCR ou le déplacement direct de ces clones vers le BCSFB. Il est important de noter que nous montrons que les peptides sélectionnés conservent leur capacité de transport dans le LCR une fois synthétisés et liés à la protéine cargo. La liaison des peptides biotinylés N-terminaux à SA reproduit essentiellement les résultats obtenus avec leurs clones phagiques respectifs dans le sang et le liquide céphalorachidien (Fig. 3e). Enfin, nous montrons que le peptide principal n° 2077 est capable de favoriser l'action cérébrale d'un peptide biotinylé inhibiteur de BACE1 conjugué à SA, provoquant des effets pharmacodynamiques prononcés dans le SNC en réduisant significativement les taux d'Abeta40 dans le LCR (Fig. 4). Nous n'avons pu identifier aucun homologue dans la base de données en effectuant une recherche d'homologie de séquence peptidique sur tous les résultats. Il est important de noter que la taille de la bibliothèque T7 est d'environ 109, tandis que la taille théorique de la bibliothèque pour les 12-mères est de 4 x 1015. Par conséquent, nous n'avons sélectionné qu'une petite fraction de l'espace de diversité de la bibliothèque de peptides 12-mères, ce qui pourrait signifier que des peptides plus optimisés peuvent être identifiés en évaluant l'espace de séquence adjacent de ces peptides identifiés. Hypothétiquement, l'une des raisons pour lesquelles nous n'avons trouvé aucun homologue naturel de ces peptides pourrait être la désélection au cours de l'évolution visant à empêcher l'entrée incontrôlée de certains motifs peptidiques dans le cerveau.
L'ensemble de nos résultats constitue une base pour de futurs travaux visant à identifier et caractériser plus en détail les systèmes de transport de la barrière vasculaire cérébrale in vivo. Cette méthode repose sur une stratégie de sélection fonctionnelle qui non seulement identifie les clones possédant des propriétés de liaison vasculaire cérébrale, mais inclut également une étape critique au cours de laquelle les clones performants possèdent une activité intrinsèque leur permettant de franchir les barrières biologiques in vivo pour pénétrer dans le compartiment du SNC. L'objectif est d'élucider le mécanisme de transport de ces peptides et leur préférence pour la liaison à la microvascularisation spécifique de la région cérébrale. Cela pourrait conduire à la découverte de nouvelles voies de transport de la BHE et des récepteurs. Nous pensons que les peptides identifiés peuvent se lier directement aux récepteurs cérébrovasculaires ou aux ligands circulants transportés par la BHE ou le BCSFB. Les vecteurs peptidiques possédant une activité de transport dans le LCR découverts dans ce travail seront étudiés plus en détail. Nous étudions actuellement la spécificité cérébrale de ces peptides quant à leur capacité à traverser la BHE et/ou le BCSFB. Ces nouveaux peptides seront des outils extrêmement précieux pour la découverte potentielle de nouveaux récepteurs ou voies et pour le développement de nouvelles plateformes hautement efficaces pour l’administration de macromolécules, telles que des produits biologiques, au cerveau.
Canuler la grande citerne (GC) en utilisant une modification de la méthode décrite précédemment. Des rats Wistar anesthésiés (200-350 g) ont été montés sur un appareil stéréotaxique et une incision médiane a été pratiquée sur le cuir chevelu rasé et préparé aseptiquement pour exposer le crâne. Deux trous ont été percés au niveau de la ceinture supérieure et y ont été vissés. Un trou supplémentaire a été percé dans la crête occipitale latérale pour le guidage stéréotaxique d'une canule en acier inoxydable dans la GC. Appliquer du ciment dentaire autour de la canule et la fixer avec des vis. Après photopolymérisation et durcissement du ciment, la plaie cutanée a été fermée par un fil supramid 4/0. Le bon positionnement de la canule est confirmé par une fuite spontanée de liquide céphalorachidien (LCR). Retirer le rat de l'appareil stéréotaxique, lui prodiguer les soins postopératoires appropriés et une prise en charge de la douleur, et le laisser récupérer pendant au moins une semaine jusqu'à l'apparition de traces de sang dans le LCR. Des rats Wistar (Crl:WI/Han) ont été obtenus auprès de Charles River (France). Tous les rats ont été maintenus dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes. Toutes les expériences animales ont été approuvées par l'Office vétérinaire de la ville de Bâle, en Suisse, et ont été réalisées conformément à la licence animale n° 2474 (Évaluation du transport cérébral actif par mesure des concentrations de candidats thérapeutiques dans le liquide céphalo-rachidien et le cerveau du rat).
Maintenir délicatement le rat conscient, la canule CM en main. Retirer le Datura de la canule et prélever 10 µl de liquide céphalorachidien s'écoulant spontanément. La perméabilité de la canule ayant finalement été compromise, seuls des échantillons de liquide céphalorachidien clair, sans trace de contamination sanguine ni de décoloration, ont été inclus dans cette étude. Parallèlement, environ 10 à 20 µl de sang ont été prélevés par une petite incision à l'extrémité de la queue dans des tubes contenant de l'héparine (Sigma-Aldrich). Le LCR et le sang ont été prélevés à différents moments après l'injection intraveineuse de phage T7. Environ 5 à 10 µl de liquide ont été éliminés avant chaque prélèvement de LCR, ce qui correspond au volume mort du cathéter.
Les bibliothèques ont été générées à l'aide du vecteur T7Select 10-3b, comme décrit dans le manuel du système T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). En bref, un insert d'ADN 12-mer aléatoire a été synthétisé selon le format suivant :
Le codon NNK a été utilisé pour éviter les codons double-stop et la surexpression des acides aminés dans l'insert. N est un rapport équimolaire mélangé manuellement de chaque nucléotide, et K est un rapport équimolaire mélangé manuellement de nucléotides d'adénine et de cytosine. Les régions simple brin ont été converties en ADN double brin par une incubation supplémentaire avec du dNTP (Novagen) et de l'enzyme Klenow (New England Biolabs) dans un tampon Klenow (New England Biolabs) pendant 3 heures à 37 °C. Après la réaction, l'ADN double brin a été récupéré par précipitation à l'EtOH. L'ADN résultant a été digéré par les enzymes de restriction EcoRI et HindIII (toutes deux de Roche). L'insert clivé et purifié (QIAquick, Qiagen) (ligase T4, New England Biolabs) a ensuite été ligaturé en phase dans un vecteur T7 pré-clivé après l'acide aminé 348 du gène de capside 10B. Les réactions de ligature ont été incubées à 16 °C pendant 18 heures avant l'encapsidation in vitro. L'encapsidation in vitro des phages a été réalisée conformément aux instructions fournies avec le kit de clonage T7Select 10-3b (Novagen) et la solution d'encapsidation a été amplifiée une fois jusqu'à la lyse par Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Les lysats ont été centrifugés, titrés et congelés à -80 °C sous forme de solution mère de glycérol.
Amplification par PCR directe des régions variables des phages, en bouillon ou en plaque, à l'aide d'amorces de fusion exclusives 454/Roche-amplicon. L'amorce de fusion directe contient les séquences flanquant la région variable (NNK) 12 (spécifique à la matrice), l'adaptateur titane A GS FLX et une séquence clé de bibliothèque de quatre bases (TCAG) (figure supplémentaire 1a) :
L'amorce de fusion inverse contient également de la biotine attachée aux billes de capture et à l'adaptateur GS FLX Titanium B requis pour l'amplification clonale pendant la PCR en émulsion :
Les amplicons ont ensuite été soumis à un pyroséquençage 454/Roche selon le protocole 454 GS-FLX Titanium. Pour le séquençage Sanger manuel (analyseur d'ADN Hitachi 3730 xl d'Applied Biosystems), l'ADN du phage T7 a été amplifié par PCR et séquencé avec les paires d'amorces suivantes :
Les inserts des plaques individuelles ont été soumis à une amplification par PCR à l'aide du kit Roche Fast Start DNA Polymerase (conformément aux instructions du fabricant). Effectuer un démarrage à chaud (10 min à 95 °C) et 35 cycles de boost (50 s à 95 °C, 1 min à 50 °C et 1 min à 72 °C).
Des phages issus de banques, des phages sauvages, des phages récupérés du LCR et du sang, ou des clones individuels ont été amplifiés dans Escherichia coli BL5615 en bouillon TB (Sigma Aldrich) ou dans des boîtes de 500 cm² (Thermo Scientific) pendant 4 h à 37 °C. Les phages ont été extraits des plaques par rinçage avec un tampon Tris-EDTA (Fluka Analytical) ou en collectant les plaques avec des embouts de pipette stériles. Les phages ont été isolés du surnageant de culture ou du tampon d'extraction par une précipitation au polyéthylène glycol (PEG 8000) (Promega) et remis en suspension dans un tampon Tris-EDTA.
Français Le phage amplifié a été soumis à 2-3 cycles d'élimination des endotoxines à l'aide de billes d'élimination des endotoxines (Miltenyi Biotec) avant l'injection intraveineuse (IV) (500 μl/animal). Au premier cycle, 2 × 1012 phages ont été introduits ; au deuxième, 2 × 1010 phages ; aux troisième et quatrième cycles de sélection, 2 × 109 phages par animal. La teneur en phages dans les échantillons de LCR et de sang collectés aux moments indiqués a été déterminée par comptage des plaques selon les instructions du fabricant (manuel du système T7Select). La sélection des phages a été réalisée par injection intraveineuse de bibliothèques purifiées dans la veine de la queue ou par réinjection de phages extraits du LCR du cycle de sélection précédent, et les récoltes suivantes ont été effectuées à 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min et 240 min respectivement des échantillons de LCR et de sang. Au total, quatre cycles de panning in vivo ont été réalisés, au cours desquels les deux branches sélectionnées ont été stockées et analysées séparément pendant les trois premiers cycles de sélection. Tous les inserts de phages extraits du LCR lors des deux premiers cycles de sélection ont été soumis à un pyroséquençage 454/Roche, tandis que tous les clones extraits du LCR lors des deux derniers cycles de sélection ont été séquencés manuellement. Tous les phages sanguins du premier cycle de sélection ont également été soumis à un pyroséquençage 454/Roche. Pour l'injection des clones de phages, les phages sélectionnés ont été amplifiés dans E. coli (BL5615) sur des plaques de 500 cm² à 37 °C pendant 4 heures. Les clones sélectionnés individuellement et séquencés manuellement ont été propagés en milieu TB. Après extraction des phages, purification et élimination de l'endotoxine (comme décrit ci-dessus), 2 × 1010 phages/animal dans 300 μl ont été injectés par voie intraveineuse dans une veine de la queue.
Prétraitement et filtrage qualitatif des données de séquence. Les données brutes 454/Roche ont été converties d'un format binaire standard stream map (sff) à un format Pearson lisible par l'homme (fasta) à l'aide d'un logiciel fourni. Le traitement ultérieur de la séquence nucléotidique a été effectué à l'aide de programmes et de scripts C propriétaires (progiciel non publié), comme décrit ci-dessous. L'analyse des données primaires comprend des procédures de filtrage strictes en plusieurs étapes. Pour filtrer les lectures ne contenant pas de séquence d'ADN d'insertion 12-mère valide, les lectures ont été alignées séquentiellement sur l'étiquette de départ (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), l'étiquette d'arrêt (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) et l'insert d'arrière-plan (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) à l'aide du test global de Needleman-Wunsch. L'alignement autorisant jusqu'à deux incohérences par alignement31. Par conséquent, les lectures sans étiquettes de départ et d'arrêt et les lectures contenant des inserts d'arrière-plan, c'est-à-dire les alignements dépassant le nombre autorisé de mésappariements, ont été supprimées de la bibliothèque. Concernant les lectures restantes, la séquence d'ADN N-mer s'étendant de la marque de départ jusqu'à la marque d'arrêt a été excisée de la séquence de lecture originale et traitée ultérieurement (ci-après dénommée « insert »). Après traduction de l'insert, la portion située après le premier codon d'arrêt à l'extrémité 5' de l'amorce est retirée de l'insert. De plus, les nucléotides conduisant à des codons incomplets à l'extrémité 3' de l'amorce ont également été retirés. Afin d'exclure les inserts contenant uniquement des séquences de fond, les inserts traduits commençant par le motif d'acides aminés « PAG » ont également été retirés. Les peptides dont la longueur post-traductionnelle est inférieure à 3 acides aminés ont été retirés de la banque. Enfin, la redondance du pool d'inserts a été supprimée et la fréquence de chaque insert unique a été déterminée. Les résultats de cette analyse comprenaient une liste des séquences nucléotidiques (inserts) et de leurs fréquences (de lecture) (Figures supplémentaires 1c et 2).
Grouper les inserts d'ADN N-mer par similarité de séquence : Pour éliminer les erreurs de séquençage spécifiques à 454/Roche (telles que les problèmes de séquençage des extensions d'homopolymères) et supprimer les redondances moins importantes, les inserts de séquence d'ADN N-mer (inserts) préalablement filtrés sont triés par similarité. insertions (jusqu'à 2 bases non correspondantes autorisées) à l'aide d'un algorithme itératif défini comme suit : les insertions sont d'abord triées par leur fréquence (de la plus élevée à la plus basse), et si elles sont identiques, par leur tri secondaire par longueur (de la plus longue à la plus courte). Ainsi, les insertions les plus fréquentes et les plus longues définissent le premier « groupe ». La fréquence du groupe est fixée à la fréquence clé. Ensuite, chaque insertion restante dans la liste triée a été essayée pour être ajoutée au groupe par alignement Needleman-Wunsch par paires. Si le nombre de mésappariements, d'insertions ou de délétions dans un alignement ne dépasse pas un seuil de 2, une insertion est ajoutée au groupe, et la fréquence globale du groupe est augmentée du nombre de fois où elle a été ajoutée. Les inserts ajoutés à un groupe sont marqués comme utilisés et exclus du traitement ultérieur. Si la séquence d'insert ne peut être ajoutée à un groupe existant, elle est utilisée pour créer un nouveau groupe avec la fréquence d'insertion appropriée et marquée comme utilisée. L'itération se termine lorsque chaque séquence d'insertion a été utilisée pour former un nouveau groupe ou peut être incluse dans un groupe existant. Après tout, les inserts groupés, composés de nucléotides, sont finalement traduits en séquences peptidiques (bibliothèques de peptides). Le résultat de cette analyse est un ensemble d'insertions et leurs fréquences correspondantes, qui constituent le nombre de lectures consécutives (Fig. 2 supplémentaire).
Génération de motifs : À partir d'une liste de peptides uniques, une bibliothèque contenant tous les motifs d'acides aminés possibles (aa) a été créée, comme illustré ci-dessous. Chaque motif possible de longueur 3 a été extrait du peptide et son motif inverse a été ajouté, ainsi qu'une bibliothèque de motifs commune contenant tous les motifs (tripeptides). Les bibliothèques de motifs hautement répétitifs ont été séquencées et les redondances supprimées. Ensuite, pour chaque tripeptide de la bibliothèque de motifs, nous avons vérifié sa présence à l'aide d'outils informatiques. Dans ce cas, la fréquence du peptide contenant le tripeptide à motif trouvé est ajoutée et attribuée au motif dans la bibliothèque (« nombre de motifs »). Le résultat de la génération de motifs est un tableau bidimensionnel contenant toutes les occurrences de tripeptides (motifs) et leurs valeurs respectives, qui correspondent au nombre de lectures de séquençage produisant le motif correspondant après filtrage, regroupement et traduction des lectures. Les métriques sont décrites en détail ci-dessus.
Normalisation du nombre de motifs et des nuages ​​de points correspondants : Le nombre de motifs pour chaque échantillon a été normalisé à l'aide de
Où ni est le nombre de lectures contenant le thème i. Ainsi, vi représente la fréquence en pourcentage des lectures (ou peptides) contenant le motif i dans l'échantillon. Les valeurs de p pour le nombre non normalisé de motifs ont été calculées à l'aide du test exact de Fisher. Concernant les corrélogrammes du nombre de motifs, les corrélations de Spearman ont été calculées à l'aide du nombre normalisé de motifs avec R.
Pour visualiser le contenu en acides aminés à chaque position de la bibliothèque de peptides, les logogrammes Web 32 et 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ont été créés. Tout d'abord, le contenu en acides aminés à chaque position du peptide 12-mer est stocké dans une matrice 20×12. Ensuite, un ensemble de 1 000 peptides contenant le même contenu relatif en acides aminés à chaque position est généré au format fasta-sequence et fourni en entrée à web-logo 3, qui génère une représentation graphique du contenu relatif en acides aminés à chaque position pour une bibliothèque de peptides donnée. Pour visualiser les ensembles de données multidimensionnels, des cartes thermiques ont été créées à l'aide d'un outil développé en interne dans R (biosHeatmap, un package R non encore publié). Les dendrogrammes présentés dans les cartes thermiques ont été calculés à l'aide de la méthode de clustering hiérarchique de Ward avec la métrique de distance euclidienne. Pour l'analyse statistique des données de notation des motifs, les valeurs de p pour la notation non normalisée ont été calculées à l'aide du test exact de Fisher. Les valeurs de p pour d'autres ensembles de données ont été calculées dans R à l'aide du test t de Student ou de l'ANOVA.
Des clones de phages sélectionnés et des phages sans inserts ont été injectés par voie intraveineuse via la veine caudale (2 × 1010 phages/animal dans 300 μl de PBS). Dix minutes avant la perfusion et la fixation ultérieure, les mêmes animaux ont reçu une injection intraveineuse de 100 μl de lectine marquée au DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Soixante minutes après l'injection des phages, les rats ont été perfusés par voie cardiaque avec 50 ml de PBS, puis 50 ml de PFA/PBS à 4 %. Des échantillons cérébraux ont également été fixés pendant la nuit dans du PFA/PBS à 4 % et trempés dans du saccharose à 30 % pendant la nuit à 4 °C. Les échantillons sont congelés instantanément dans le mélange OCT. L'analyse immunohistochimique des échantillons congelés a été réalisée à température ambiante sur des cryosections de 30 µm bloquées avec 1 % de BSA et incubées à 4 °C avec des anticorps polyclonaux marqués au FITC dirigés contre le phage T7 (Novus NB 600-376A). L'incubation a duré toute la nuit. Enfin, les coupes ont été lavées trois fois avec du PBS et examinées au microscope laser confocal (Leica TCS SP5).
Tous les peptides d'une pureté minimale de 98 % ont été synthétisés par GenScript USA, biotinylés et lyophilisés. La biotine est liée à l'extrémité N-terminale par un espaceur triple glycine supplémentaire. Tous les peptides sont analysés par spectrométrie de masse.
La streptavidine (Sigma S0677) a été mélangée à un excès équimolaire de 5 fois de peptide biotinylé, de peptide inhibiteur de BACE1 biotinylé ou d'une combinaison (ratio 3:1) de peptide inhibiteur de BACE1 biotinylé et de peptide inhibiteur de BACE1 dans 5 à 10 % de DMSO/incubée dans du PBS. 1 heure à température ambiante avant l'injection. Les peptides conjugués à la streptavidine ont été injectés par voie intraveineuse à une dose de 10 mg/kg dans l'une des veines de la queue de rats présentant une cavité cérébrale.
Français La concentration des complexes streptavidine-peptide a été évaluée par ELISA. Des plaques de microtitration Nunc Maxisorp (Sigma) ont été recouvertes pendant la nuit à 4 °C avec 1,5 μg/ml d'anticorps anti-streptavidine de souris (Thermo, MA1-20011). Après blocage (tampon de blocage : 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % gélatine, 1 % BSA) à température ambiante pendant 2 heures, la plaque a été lavée avec 0,05 % Tween-20/PBS (tampon de lavage) pendant 3 secondes, des échantillons de LCR et de plasma ont été ajoutés aux puits dilués avec le tampon de blocage (plasma 1:10 000, LCR 1:115). La plaque a ensuite été incubée pendant la nuit à 4 °C avec un anticorps de détection (1 μg/ml, anti-streptavidine-HRP, Novus NB120-7239). Après trois lavages, la streptavidine a été détectée par incubation dans une solution de substrat TMB (Roche) pendant 20 minutes maximum. Après avoir arrêté le développement de la couleur avec 1 M de H2SO4, mesurer l'absorbance à 450 nm.
La fonction du complexe streptavidine-peptide-inhibiteur de BACE1 a été évaluée par ELISA Aβ(1-40) selon le protocole du fabricant (Wako, 294-64701). En bref, les échantillons de LCR ont été dilués dans un diluant standard (1:23) et incubés toute la nuit à 4 °C dans des plaques à 96 puits recouvertes d'anticorps de capture BNT77. Après cinq lavages, l'anticorps BA27 conjugué à la HRP a été ajouté et incubé pendant 2 heures à 4 °C, suivi de cinq lavages. L'Aβ(1-40) a été détecté par incubation dans une solution de TMB pendant 30 minutes à température ambiante. Après l'arrêt du développement de la couleur avec la solution d'arrêt, mesurer l'absorbance à 450 nm. Les échantillons de plasma ont été soumis à une extraction en phase solide avant l'ELISA Aβ(1-40). Le plasma a été ajouté à 0,2 % de DEA (Sigma) dans des plaques à 96 puits et incubé à température ambiante pendant 30 minutes. Après lavage successif des plaques SPE (Oasis, 186000679) avec de l'eau et du méthanol à 100 %, des échantillons de plasma ont été ajoutés aux plaques SPE et tout le liquide a été éliminé. Les échantillons ont été lavés (d'abord avec 5 % de méthanol, puis avec 30 % de méthanol) et élués avec 2 % de NH4OH/90 % de méthanol. Après séchage de l'éluat à 55 °C pendant 99 min sous un courant de N2 constant, les échantillons ont été réduits dans des diluants standards et la concentration en Aβ(1–40) a été mesurée comme décrit ci-dessus.
Comment citer cet article : Urich, E. et al. Livraison de cargaison au cerveau à l'aide de peptides de transit identifiés in vivo. la science. 5, 14104 ; doi:10.1038/srep14104 (2015).
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