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La barrière hémato-encéphalique empêche les agents biothérapeutiques d'atteindre leurs cibles dans le système nerveux central, ce qui entrave le traitement efficace des maladies neurologiques. Afin de découvrir de nouveaux transporteurs cérébraux in vivo, nous avons introduit une banque de peptides de phage T7 et collecté de manière sérielle du sang et du liquide céphalo-rachidien (LCR) chez des rats conscients canulés. Des clones de phages spécifiques ont été fortement enrichis dans le LCR après quatre cycles de sélection. Le test de peptides candidats individuels a révélé un enrichissement de plus de 1000 fois dans le LCR. La bioactivité de l'administration cérébrale médiée par les peptides a été confirmée par une réduction de 40 % du taux d'amyloïde-β dans le LCR, grâce à l'utilisation d'un inhibiteur peptidique de la BACE1 lié au nouveau peptide de transit identifié. Ces résultats suggèrent que les peptides identifiés par des méthodes de sélection de phages in vivo pourraient constituer des vecteurs efficaces pour l'administration systémique de macromolécules au cerveau, avec un effet thérapeutique.
La recherche sur les thérapies ciblées du système nerveux central (SNC) s'est longtemps concentrée sur l'identification de médicaments et d'agents optimisés présentant des propriétés de ciblage du SNC, délaissant au profit de la découverte des mécanismes qui régissent l'acheminement actif des médicaments vers le cerveau. Cette situation évolue, l'administration de médicaments, notamment de grosses molécules, étant devenue une composante essentielle du développement moderne de médicaments en neurosciences. L'environnement du système nerveux central est bien protégé par le système de barrières cérébrovasculaires, composé de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et de la barrière hémato-encéphalique (BHE-B)¹, ce qui rend l'administration de médicaments au cerveau complexe¹,². On estime que la quasi-totalité des médicaments à grosses molécules et plus de 98 % des médicaments à petites molécules sont éliminés du cerveau³. C'est pourquoi il est crucial d'identifier de nouveaux systèmes de transport cérébral permettant une administration efficace et spécifique des médicaments thérapeutiques au SNC⁴,⁵. Cependant, la BHE et la BHE-B présentent également une excellente opportunité d'administration de médicaments, car elles pénètrent dans toutes les structures cérébrales grâce à leur vaste vascularisation. Ainsi, les efforts actuels visant à utiliser des méthodes non invasives d'administration au cerveau reposent en grande partie sur le mécanisme de transport médié par récepteur (TMR) utilisant le récepteur endogène BBB6. Malgré des avancées majeures récentes grâce à la voie du récepteur de la transferrine7,8, le développement de nouveaux systèmes d'administration aux propriétés améliorées reste nécessaire. À cette fin, notre objectif était d'identifier des peptides capables de moduler le transport du liquide céphalo-rachidien (LCR), car ils pourraient en principe être utilisés pour acheminer des macromolécules vers le système nerveux central (SNC) ou pour activer de nouvelles voies de signalisation. En particulier, les récepteurs et transporteurs spécifiques du système cérébrovasculaire (BHE et BSCFB) peuvent constituer des cibles potentielles pour l'administration active et ciblée de médicaments biothérapeutiques. Le liquide céphalo-rachidien (LCR) est un produit de sécrétion des plexus choroïdes (PC) et est en contact direct avec le liquide interstitiel cérébral via l'espace sous-arachnoïdien et l'espace ventriculaire4. Il a été récemment démontré que le liquide céphalo-rachidien sous-arachnoïdien diffuse excessivement dans l'interstitium cérébral⁹. Nous espérons accéder à l'espace parenchymateux soit par cette voie d'afflux sous-arachnoïdienne, soit directement à travers la barrière hémato-encéphalique. Pour ce faire, nous avons mis en œuvre une stratégie robuste de sélection de phages in vivo, permettant d'identifier les peptides transportés par l'une ou l'autre de ces deux voies distinctes.
Nous décrivons ici une méthode de criblage séquentiel in vivo par phage display, avec prélèvement de LCR et séquençage à haut débit (HTS) pour le suivi des cycles de sélection initiaux présentant la plus grande diversité de la bibliothèque. Le criblage a été réalisé chez des rats conscients porteurs d'une canule implantée de façon permanente dans la grande citerne (CM) afin d'éviter toute contamination sanguine. Cette approche permet de sélectionner à la fois des peptides ciblant le cerveau et des peptides capables de traverser la barrière hémato-encéphalique. Nous avons utilisé des phages T7 en raison de leur petite taille (~60 nm)¹⁰ et de leur aptitude supposée au transport de vésicules permettant le franchissement transcellulaire des barrières endothéliale et/ou épithélio-médullaire. Après quatre cycles de sélection, des populations de phages ont été isolées, présentant un fort enrichissement in vivo dans le LCR et une association avec les microvaisseaux cérébraux. De manière significative, nous avons pu confirmer nos résultats en démontrant que les peptides candidats les plus performants, synthétisés chimiquement, sont capables de transporter des protéines dans le liquide céphalo-rachidien. Dans un premier temps, les effets pharmacodynamiques sur le SNC ont été établis en combinant un peptide de transit de référence avec un inhibiteur du peptide BACE1. Outre la démonstration que les stratégies de criblage fonctionnel in vivo permettent d'identifier de nouveaux peptides de transport cérébral efficaces pour le transport de protéines, nous prévoyons que des approches de sélection fonctionnelle similaires deviendront également importantes pour l'identification de nouvelles voies de transport cérébral.
Après l'étape d'encapsidation des phages, une banque de peptides linéaires aléatoires de 12 nucléotides issus du phage T7, présentant une diversité d'environ 10⁹, a été conçue et créée à partir des unités formant des plages (UFP) (voir Matériels et Méthodes). Il est important de noter que cette banque a été soigneusement analysée avant le criblage in vivo. L'amplification par PCR d'échantillons de la banque de phages à l'aide d'amorces modifiées a généré des amplicons directement utilisables pour le séquençage à haut débit (HTS) (Figure supplémentaire 1a). En raison a) d'erreurs de séquençage lors du HTS11, b) de l'impact sur la qualité des amorces (NNK)1-12 et c) de la présence de phages de type sauvage (inserts de squelette) dans la banque de réserve, une procédure de filtrage des séquences a été mise en œuvre afin de ne conserver que les séquences validées (Figure supplémentaire 1b). Ces étapes de filtrage s'appliquent à toutes les banques de séquençage HTS. Pour la bibliothèque standard, un total de 233 868 lectures ont été obtenues, dont 39 % ont satisfait aux critères de filtrage et ont été utilisées pour l’analyse et la sélection de la bibliothèque pour les cycles suivants (Figure supplémentaire 1c–e). Les lectures étaient majoritairement des multiples de 3 paires de bases, avec un pic à 36 nucléotides (Figure supplémentaire 1c), confirmant ainsi la conception de la bibliothèque (NNK) 1-12. Notamment, environ 11 % des membres de la bibliothèque contenaient un insert PAGISRELVDKL de type sauvage (wt) à 12 dimensions, et près de la moitié des séquences (49 %) présentaient des insertions ou des délétions. Le séquençage à haut débit (HTS) de la bibliothèque a confirmé la grande diversité des peptides : plus de 81 % des séquences peptidiques n’ont été trouvées qu’une seule fois et seulement 1,5 % étaient présentes en ≥ 4 copies (Figure supplémentaire 2a). Les fréquences des acides aminés (aa) aux 12 positions du répertoire étaient fortement corrélées aux fréquences attendues pour le nombre de codons générés par le répertoire NKK dégénéré (Fig. S2b). La fréquence observée des résidus aa codés par ces inserts était fortement corrélée à la fréquence calculée (r = 0,893) (Fig. S2c). La préparation des banques de phages pour l'injection comprend les étapes d'amplification et d'élimination des endotoxines. Il a été précédemment démontré que cette étape pouvait potentiellement réduire la diversité des banques de phages^12,13. Par conséquent, nous avons séquencé une banque de phages amplifiée sur plaque et ayant subi une élimination des endotoxines, puis nous l'avons comparée à la banque originale afin d'estimer la fréquence des acides aminés. Une forte corrélation (r = 0,995) a été observée entre la banque originale et la banque amplifiée et purifiée (Fig. S2d), indiquant que la compétition entre les clones amplifiés sur plaques à l'aide du phage T7 n'a pas induit de biais majeur. Cette comparaison repose sur la fréquence des motifs tripeptidiques dans chaque banque, car la diversité des banques (~10⁹) ne peut être entièrement appréhendée, même par séquençage à haut débit (HTS). L'analyse de fréquence des acides aminés à chaque position a révélé un léger biais positionnel pour les trois dernières positions du répertoire initial (Figure supplémentaire 2e). En conclusion, la qualité et la diversité de la banque étaient acceptables et seules des variations mineures de diversité ont été observées suite à l'amplification et à la préparation des banques de phages entre les différents cycles de sélection.
Des prélèvements sériés de liquide céphalo-rachidien peuvent être réalisés par implantation chirurgicale d'une canule dans le corps caverneux de rats conscients afin de faciliter l'identification du phage T7 injecté par voie intraveineuse (iv) via la barrière hémato-encéphalique (BHE) et/ou la barrière hémato-cérébrospinale (BHCS) (Fig. 1a-b). Nous avons utilisé deux bras de sélection indépendants (bras A et B) lors des trois premiers cycles de sélection in vivo (Fig. 1c). Nous avons progressivement augmenté la sélectivité de la sélection en diminuant la quantité totale de phage introduite lors de ces trois premiers cycles. Pour le quatrième cycle de sélection, nous avons combiné les échantillons des bras A et B et effectué trois sélections indépendantes supplémentaires. Afin d'étudier les propriétés in vivo des particules de phage T7 dans ce modèle, le phage de type sauvage (insert maître PAGISRELVDKL) a été injecté aux rats par voie intraveineuse caudale. La récupération des phages dans le liquide céphalo-rachidien et le sang à différents moments a montré que les phages icosaédriques T7, relativement petits, présentaient une phase d'élimination initiale rapide du compartiment sanguin (Fig. S3). En fonction des titres administrés et du volume sanguin des rats, nous avons calculé qu'environ 1 % seulement du poids des phages de la dose administrée était détecté dans le sang 10 minutes après l'injection intraveineuse. Après cette diminution initiale rapide, une clairance primaire plus lente a été mesurée, avec une demi-vie de 27,7 minutes. Il est important de noter que très peu de phages ont été retrouvés dans le LCR, ce qui indique une faible migration des phages de type sauvage vers ce compartiment (Figure supplémentaire 3). En moyenne, seulement 1 × 10⁻³ % des titres de phages T7 dans le sang et 4 × 10⁻⁸ % des phages initialement perfusés ont été détectés dans le liquide céphalo-rachidien sur toute la durée de l'échantillonnage (0-250 min). Notamment, la demi-vie (25,7 min) des phages de type sauvage dans le liquide céphalo-rachidien était similaire à celle observée dans le sang. Ces données démontrent que la barrière séparant le compartiment du LCR du sang est intacte chez les rats canulés par CM, permettant la sélection in vivo de banques de phages pour identifier les clones qui sont facilement transportés du sang vers le compartiment du LCR.
(a) Mise en place d'une méthode de rééchantillonnage du liquide céphalo-rachidien (LCR) à partir d'un grand pool. (b) Schéma illustrant la localisation cellulaire de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et la stratégie de sélection utilisée pour identifier les peptides capables de traverser la BHE. (c) Organigramme du criblage par phage display in vivo. À chaque cycle de sélection, les phages (identifiés par les flèches) ont été injectés par voie intraveineuse. Deux lignées alternatives indépendantes (A et B) ont été conservées séparément jusqu'au 4e cycle de sélection. Pour les 3e et 4e cycles de sélection, chaque clone de phage extrait du LCR a été séquencé manuellement. (d) Cinétique des phages isolés du sang (cercles rouges) et du liquide céphalo-rachidien (triangles verts) lors du premier cycle de sélection chez deux rats canulés après injection intraveineuse de la banque de peptides T7 (2 x 10¹² phages/animal). Les carrés bleus indiquent la concentration initiale moyenne de phages dans le sang, calculée à partir de la quantité de phages injectée, en tenant compte du volume sanguin total. Les carrés noirs indiquent le point d'intersection de la droite y extrapolée à partir des concentrations de phages sanguins. (e, f) Présentent la fréquence relative et la distribution de tous les motifs tripeptidiques chevauchants possibles présents dans le peptide. Le nombre de motifs trouvés sur 1 000 lectures est indiqué. Les motifs significativement enrichis (p < 0,001) sont marqués par des points rouges. (e) Diagramme de corrélation comparant la fréquence relative du motif tripeptidique de la bibliothèque injectée avec celle des phages sanguins des animaux n° 1.1 et n° 1.2. (f) Diagramme de corrélation comparant les fréquences relatives des motifs tripeptidiques des phages animaux n° 1.1 et n° 1.2 isolés dans le sang et le liquide céphalo-rachidien. (g, h) Représentation des séquences d'identification des phages enrichis dans le sang (g) par rapport aux banques injectées, et des phages enrichis dans le LCR (h) par rapport au sang après une sélection in vivo chez les deux animaux. La taille du code à une lettre indique la fréquence d'apparition de l'acide aminé à cette position. Vert = polaire, violet = neutre, bleu = basique, rouge = acide et noir = hydrophobe. Les figures 1a et 1b ont été conçues et réalisées par Eduard Urich.
Nous avons injecté une banque de peptides phagiques à deux rats CM instrumentés (clades A et B) et isolé les phages du liquide céphalo-rachidien et du sang (Figure 1d). L'élimination initiale rapide de la banque était moins marquée que celle du phage sauvage. La demi-vie moyenne de la banque injectée chez les deux animaux était de 24,8 minutes dans le sang, similaire à celle du phage sauvage, et de 38,5 minutes dans le LCR. Les échantillons de phages sanguins et de LCR de chaque animal ont été soumis à un séquençage à haut débit (HTS) et tous les peptides identifiés ont été analysés afin de détecter la présence d'un court motif tripeptidique. Les motifs tripeptidiques ont été choisis car ils constituent une base minimale pour la formation de structures et les interactions peptide-protéine^14,15. Nous avons observé une bonne corrélation dans la distribution des motifs entre la banque de phages injectée et les clones extraits du sang des deux animaux (Fig. 1e). Ces données indiquent que la composition de la banque est faiblement enrichie dans le compartiment sanguin. Les fréquences des acides aminés et les séquences consensus ont été analysées à chaque position à l'aide d'une adaptation du logiciel Weblogo16. Nous avons observé un fort enrichissement en résidus de glycine dans le sang (Fig. 1g). La comparaison des clones sanguins avec ceux sélectionnés à partir du LCR a révélé une forte sélection et une certaine désélection de motifs (Fig. 1f), ainsi que la présence préférentielle de certains acides aminés à des positions prédéterminées dans le peptide de 12 acides aminés (Fig. 1h). Il est à noter que des différences significatives ont été observées entre les individus au niveau du liquide céphalo-rachidien, tandis qu'un enrichissement en glycine sanguine a été observé chez les deux animaux (Fig. S4a–j). Après un filtrage rigoureux des données de séquences dans le liquide céphalo-rachidien des animaux n° 1.1 et n° 1.2, 964 et 420 peptides uniques de 12 acides aminés ont été obtenus, respectivement (Fig. S1d–e). Les clones de phages isolés ont été amplifiés et soumis à une seconde sélection in vivo. Les phages extraits du second cycle de sélection ont été soumis à un séquençage à haut débit (HTS) chez chaque animal, et tous les peptides identifiés ont servi d'entrée à un programme de reconnaissance de motifs afin d'analyser la présence de motifs tripeptidiques (Fig. 2a, b, ef). Comparé au premier cycle des phages récupérés du LCR, nous avons observé une sélection et une désélection supplémentaires de nombreux motifs dans le LCR des branches A et B (Fig. 2). Un algorithme d'identification de réseau a été appliqué pour déterminer s'ils représentaient différents motifs de séquences cohérentes. Une nette similarité a été observée entre les séquences à 12 dimensions récupérées par le LCR dans le clade alternatif A (Fig. 2c, d) et le clade B (Fig. 2g, h). L'analyse groupée dans chaque branche a révélé des profils de sélection différents pour les peptides de 12 acides aminés (Fig. S5c, d) et une augmentation du rapport titre LCR/sang au cours du temps pour les clones groupés après le second cycle de sélection par rapport au premier cycle (Fig. S5e).
Enrichissement en motifs et peptides du liquide céphalo-rachidien par deux cycles successifs de sélection par affichage de phages fonctionnels in vivo.
Tous les phages du liquide céphalo-rachidien récupérés lors du premier cycle de sélection pour chaque animal (animaux n° 1.1 et n° 1.2) ont été regroupés, amplifiés, séquencés par HT et réinjectés simultanément (2 x 10¹⁰ phages/animal) à deux rats canulés au niveau du canal semi-circulaire supérieur (n° 1.1 → n° 2.1 et 2.2, 1.2 → n° 2.3 et 2.4). (a, b, e, f) Diagrammes de corrélation comparant la fréquence relative des motifs tripeptidiques de tous les phages dérivés du LCR lors des premier et deuxième cycles de sélection. Fréquence relative et distribution des motifs représentant tous les tripeptides chevauchants possibles présents dans les peptides, quelle que soit leur orientation. Le nombre de motifs trouvés pour 1 000 lectures est indiqué. Les motifs significativement sélectionnés ou exclus (p < 0,001) dans l’une des banques comparées sont mis en évidence par des points rouges. (c, d, g, h) Représentation graphique des séquences de 12 acides aminés riches en CSF, issues des cycles 1 et 2 de sélection in vivo. La taille du code à une lettre indique la fréquence d'apparition de l'acide aminé à cette position. Pour générer ce logo, la fréquence des séquences CSF extraites d'animaux individuels entre les deux cycles de sélection est comparée, et les séquences enrichies lors du second cycle sont indiquées : (c) n° 1.1–2.1, (d) n° 1.1–2.2, (g) n° 1.2–2.3 et (h) n° 1.2–2.4. Les acides aminés les plus enrichis à une position donnée chez les animaux n° 2.1 et 2.2 (c, d) ou n° 2.3 et 2.4 (g, h) sont colorés. Vert = polaire, violet = neutre, bleu = basique, rouge = acide et noir = hydrophobe.
Après le troisième cycle de sélection, nous avons identifié 124 séquences peptidiques uniques (n° 3.1 et n° 3.2) parmi 332 clones de phages reconstitués à partir de LCR et isolés de deux animaux (Fig. S6a). La séquence LGSVS (18,7 %) présentait la proportion relative la plus élevée, suivie des inserts de type sauvage PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) et SARGSWREIVSLS (2,2 %). Lors du quatrième et dernier cycle, nous avons combiné deux branches sélectionnées indépendamment à partir de trois animaux différents (Fig. 1c). Parmi les 925 clones de phages séquencés récupérés à partir du LCR, nous avons identifié 64 séquences peptidiques uniques lors de ce quatrième cycle (Fig. S6b), la proportion relative de phages de type sauvage ayant chuté à 0,8 %. Les clones de LCR les plus fréquents au quatrième cycle étaient LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) et RLSSVDSDLSGC (3,2 %). La gamme de longueurs des peptides sélectionnés est due à des insertions/délétions de nucléotides ou à des codons stop prématurés dans les amorces de la bibliothèque lors de l'utilisation de codons dégénérés pour la conception de la bibliothèque NNK. Les codons stop prématurés génèrent des peptides plus courts et sont sélectionnés car ils contiennent le motif d'acides aminés favorable. Des peptides plus longs peuvent résulter d'insertions/délétions dans les amorces des bibliothèques synthétiques. Cela positionne le codon stop conçu en dehors du cadre de lecture et il est lu jusqu'à ce qu'un nouveau codon stop apparaisse en aval. En général, nous avons calculé les facteurs d'enrichissement pour les quatre cycles de sélection en comparant les données d'entrée aux données de sortie des échantillons. Pour le premier cycle de criblage, nous avons utilisé les titres de phages sauvages comme référence non spécifique. Il est intéressant de noter que la sélection négative des phages était très forte lors du premier cycle dans le LCR, mais pas dans le sang (Fig. 3a). Ceci pourrait être dû à la faible probabilité de diffusion passive de la plupart des membres de la banque de peptides dans le compartiment du LCR, ou au fait que les phages apparentés ont tendance à être retenus ou éliminés de la circulation sanguine plus efficacement que les bactériophages. Cependant, lors du deuxième cycle de sélection, une forte sélection de phages dans le LCR a été observée dans les deux clades, suggérant que le cycle précédent avait enrichi les phages présentant des peptides favorisant l'absorption par le LCR (Fig. 3a). Là encore, aucun enrichissement significatif n'a été observé dans le sang. De même, lors des troisième et quatrième cycles, les clones de phages étaient significativement enrichis dans le LCR. En comparant la fréquence relative de chaque séquence peptidique unique entre les deux derniers cycles de sélection, nous avons constaté que les séquences étaient encore plus enrichies lors du quatrième cycle (Fig. 3b). Au total, 931 motifs tripeptidiques ont été extraits des 64 séquences peptidiques uniques, en utilisant les deux orientations peptidiques. Les motifs les plus enrichis au quatrième cycle ont fait l'objet d'une analyse plus approfondie de leurs profils d'enrichissement sur l'ensemble des cycles, comparativement à la bibliothèque injectée (seuil : 10 % d'enrichissement) (Figure supplémentaire 6c). Les tendances générales de sélection ont montré que la plupart des motifs étudiés étaient enrichis lors de tous les cycles précédents des deux branches de sélection. Cependant, certains motifs (par exemple, SGL, VSG, LGS et GSV) provenaient majoritairement du clade alternatif A, tandis que d'autres (par exemple, FGW, RTN, WGF et NTR) étaient enrichis dans le clade alternatif B.
Validation du transport par le LCR de peptides présentés par des phages enrichis en LCR et de peptides leaders biotinylés conjugués à des charges utiles de streptavidine.
(a) Taux d'enrichissement calculés pour les quatre cycles (R1-R4) à partir des titres de phages injectés (entrée = I) (PFU) et des titres de phages mesurés dans le LCR (sortie = O). Les facteurs d'enrichissement des trois derniers cycles (R2-R4) ont été calculés par comparaison avec le cycle précédent et le premier cycle (R1) à partir des données de poids. Les barres blanches représentent le liquide céphalo-rachidien, les barres grisées le plasma. (***p < 0,001, test t de Student). (b) Liste des peptides phagiques les plus abondants, classés selon leur proportion relative par rapport à l'ensemble des phages collectés dans le LCR après le 4e cycle de sélection. Les six clones phagiques les plus fréquents sont mis en évidence par une couleur, numérotés, et leurs facteurs d'enrichissement entre les cycles 3 et 4 de sélection sont indiqués (encarts). (c, d) Les six clones phagiques les plus enrichis, ainsi que les banques de peptides de phages vides et parentaux du 4e cycle, ont été analysés individuellement dans un modèle d'échantillonnage du LCR. Des échantillons de LCR et de sang ont été prélevés aux temps indiqués. (c) Des quantités égales de 6 clones de phages candidats (2 x 10¹⁰ phages/animaux), de phages vides (#1779) (2 x 10¹⁰ phages/animaux) et de banques de peptides de phages (2 x 10¹² phages/animaux) ont été injectées. Au moins 3 mL de CM ont été administrés séparément à l'animal canulé par voie intraveineuse caudale. La pharmacocinétique dans le LCR de chaque clone de phage et banque de peptides de phages injectés est présentée au cours du temps. (d) Le rapport LCR/sang moyen pour tous les phages récupérés/mL au cours de la période d'échantillonnage est présenté. (e) Quatre peptides leaders synthétiques et un peptide contrôle aléatoire ont été liés à la streptavidine par biotine via leur extrémité N-terminale (présentation tétramère), puis injectés (veine caudale, 10 mg de streptavidine/kg). Au moins trois rats intubés (N = 3) ont été utilisés. Des échantillons de LCR ont été prélevés aux temps indiqués et les concentrations de streptavidine ont été mesurées par ELISA anti-streptavidine dans le LCR (nd = non détecté). (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, d'après un test ANOVA). (f) Comparaison de la séquence d'acides aminés du clone peptidique phagique le plus enrichi, le clone n° 2002 (violet), avec d'autres clones peptidiques phagiques sélectionnés lors du 4e cycle de sélection. Les fragments d'acides aminés identiques et similaires sont colorés.
Parmi tous les phages enrichis lors du quatrième cycle (Fig. 3b), six clones candidats ont été sélectionnés pour une analyse individuelle plus approfondie dans le modèle d'échantillonnage du LCR. Des quantités égales de ces six phages candidats, de phages vides (sans insert) et de banques de peptides prophage ont été injectées à trois animaux CM canulés, et leur pharmacocinétique a été déterminée dans le LCR (Fig. 3c) et le sang (Fig. S7). Tous les clones de phages testés ont ciblé le compartiment du LCR à un niveau 10 à 1 000 fois supérieur à celui du phage de contrôle vide (n° 1779). Par exemple, les clones n° 2020 et n° 2077 présentaient des titres dans le LCR environ 1 000 fois supérieurs à ceux du phage de contrôle. Le profil pharmacocinétique de chaque peptide sélectionné est différent, mais tous présentent une forte affinité pour le LCR. Nous avons observé une diminution constante au cours du temps pour les clones n° 1903 et n° 2011, tandis que pour les clones n° 2077, n° 2002 et n° 2009, une augmentation durant les 10 premières minutes pourrait indiquer un transport actif, mais cela reste à confirmer. Les clones n° 2020, n° 2002 et n° 2077 se sont stabilisés à des niveaux élevés, tandis que la concentration du clone n° 2009 dans le LCR a diminué lentement après l’augmentation initiale. Nous avons ensuite comparé la fréquence relative de chaque candidat dans le LCR à sa concentration sanguine (Fig. 3d). La corrélation entre le titre moyen de chaque candidat dans le LCR et son titre sanguin à tous les temps de prélèvement a montré que trois des six candidats étaient significativement enrichis dans le LCR sanguin. Fait intéressant, le clone n° 2077 a présenté une stabilité sanguine plus élevée (Figure supplémentaire 7). Afin de confirmer que les peptides sont capables de transporter activement des molécules autres que des particules phagiques dans le compartiment du LCR, nous avons synthétisé quatre peptides de tête fonctionnalisés par la biotine à leur extrémité N-terminale, au niveau de leur site de fixation à la particule phagique. Les peptides biotinylés (n° 2002, 2009, 2020 et 2077) ont été conjugués à la streptavidine (SA) pour obtenir des formes multimériques mimant partiellement la géométrie des phages. Ce format nous a également permis de mesurer l'exposition à la SA dans le sang et le liquide céphalo-rachidien, en tant que peptides transportant des molécules. De manière significative, les données obtenues avec les phages ont souvent pu être reproduites lors de l'administration de peptides synthétiques conjugués à la SA (Fig. 3e). Les peptides désordonnés ont présenté une exposition initiale plus faible et une clairance plus rapide dans le LCR, avec des niveaux indétectables en 48 heures. Afin de mieux comprendre les voies de délivrance de ces clones de phages peptidiques dans le LCR, nous avons analysé la localisation de chaque peptide ciblé par immunohistochimie (IHC) pour détecter directement les particules phagiques une heure après injection intraveineuse in vivo. Notamment, les clones n° 2002, n° 2077 et n° 2009 ont été détectés par un marquage intense dans les capillaires cérébraux, tandis que le phage contrôle (n° 1779) et le clone n° 2020 n’ont pas été détectés (Figure supplémentaire 8). Ceci suggère que ces peptides contribuent à l’effet sur le cerveau précisément en traversant la barrière hémato-encéphalique (BHE). Une analyse plus approfondie est nécessaire pour tester cette hypothèse, car la voie BSCFB pourrait également être impliquée. En comparant la séquence d’acides aminés du clone le plus enrichi (n° 2002) avec d’autres peptides sélectionnés, nous avons observé que certains d’entre eux présentent des extensions d’acides aminés similaires, ce qui pourrait indiquer un mécanisme de transport similaire (Fig. 3f).
En raison de son profil plasmatique unique et de l'augmentation significative de sa concentration dans le LCR au fil du temps, le clone de phage display n° 2077 a été étudié plus en détail sur une période de 48 heures. Il a permis de reproduire l'augmentation rapide de la concentration dans le LCR observée en association avec des concentrations soutenues d'acide salicylique (SA) (Fig. 4a). Parmi les autres clones de phage identifiés, le n° 2077 a présenté une forte coloration des capillaires cérébraux et une colocalisation significative avec la lectine, marqueur capillaire, à haute résolution, ainsi qu'une possible coloration dans l'espace parenchymateux (Fig. 4b). Afin d'étudier la possibilité d'obtenir des effets pharmacologiques induits par le peptide dans le SNC, nous avons réalisé une expérience dans laquelle des versions biotinylées i) du peptide de transit du n° 2077 et ii) du peptide inhibiteur de la BACE1 ont été mélangées à de l'acide salicylique (SA) selon deux ratios différents. Dans un premier cas, seul le peptide inhibiteur de la BACE1 a été utilisé, et dans le second, un ratio de 1:3 entre le peptide inhibiteur de la BACE1 et le peptide n° 2077. Les deux échantillons ont été administrés par voie intraveineuse et les concentrations de peptide bêta-amyloïde 40 (Aβ40) dans le sang et le liquide céphalo-rachidien ont été mesurées au cours du temps. Le dosage d'Aβ40 dans le LCR reflète l'inhibition de la BACE1 dans le parenchyme cérébral. Conformément aux attentes, les deux complexes ont significativement réduit les concentrations sanguines d'Aβ40 (Fig. 4c, d). Cependant, seuls les échantillons contenant un mélange du peptide n° 2077 et d'un inhibiteur du peptide BACE1 conjugué à l'acide salicylique (SA) ont induit une diminution significative d'Aβ40 dans le liquide céphalo-rachidien (Fig. 4c). Ces résultats montrent que le peptide n° 2077 est capable de transporter la protéine SA de 60 kDa dans le SNC et induit également des effets pharmacologiques avec les inhibiteurs du peptide BACE1 conjugués à la SA.
(a) Injection clonale (2 × 10⁶ phages/animal) du phage T7, montrant les profils pharmacocinétiques à long terme du peptide n° 2077 (RLSSVDSDLSGC) du LCR et du phage contrôle non injecté (n° 1779), chez au moins trois rats intubés au CM. (b) Image de microscopie confocale de microvaisseaux corticaux représentatifs chez des rats ayant reçu une injection de phages (2 × 10⁶ phages/animal), montrant la contre-coloration du peptide n° 2077 et des vaisseaux (lectine). Ces clones de phages ont été administrés à 3 rats et laissés en circulation pendant 1 heure avant la perfusion. Les cerveaux ont été sectionnés et colorés avec des anticorps polyclonaux marqués au FITC dirigés contre la capside du phage T7. Dix minutes avant la perfusion et la fixation subséquente, la lectine marquée au DyLight594 a été administrée par voie intraveineuse. Images de fluorescence montrant le marquage à la lectine (rouge) de la face luminale des microvaisseaux et les phages (vert) dans la lumière des capillaires et du tissu cérébral périvasculaire. L'échelle correspond à 10 µm. (c, d) Le peptide inhibiteur de BACE1 biotinylé, seul ou en combinaison avec le peptide de transit biotinylé n° 2077, a été couplé à la streptavidine, puis injecté par voie intraveineuse à au moins trois rats CM canulés (10 mg de streptavidine/kg). La réduction de l'Aβ40 induite par l'inhibiteur peptidique de BACE1 a été mesurée par dosage ELISA de l'Aβ1-40 dans le sang (rouge) et le liquide céphalo-rachidien (orange) aux temps indiqués. Pour plus de clarté, une ligne pointillée est tracée sur le graphique à l'échelle de 100 %. (c) Réduction en pourcentage de l'Aβ40 dans le sang (triangles rouges) et le liquide céphalo-rachidien (triangles orange) chez des rats traités avec de la streptavidine conjuguée au peptide de transit n° 2077 et à un peptide inhibiteur de la BACE1 dans un rapport 3:1. (d) Réduction en pourcentage de l'Aβ40 dans le sang (cercles rouges) et le liquide céphalo-rachidien (cercles orange) de rats traités avec de la streptavidine couplée uniquement à un peptide inhibiteur de la BACE1. La concentration d'Aβ dans le groupe témoin était de 420 pg/ml (écart-type = 101 pg/ml).
La technique du phage display a été appliquée avec succès dans plusieurs domaines de la recherche biomédicale¹⁷. Cette méthode a été utilisée pour des études de diversité vasculaire in vivo^18,19 ainsi que pour des études ciblant les vaisseaux cérébraux^{20,21,22,23,24,25,26}. Dans cette étude, nous avons étendu l'application de cette méthode de sélection non seulement à l'identification directe de peptides ciblant les vaisseaux cérébraux, mais aussi à la découverte de candidats possédant des propriétés de transport actif pour traverser la barrière hémato-encéphalique. Nous décrivons ici le développement d'une procédure de sélection in vivo chez des rats intubés avec du milieu conditionné (CM) et démontrons son potentiel pour identifier des peptides ayant des propriétés de ciblage du liquide céphalo-rachidien (LCR). En utilisant le phage T7 présentant une banque de peptides aléatoires de 12 acides aminés, nous avons pu démontrer que le phage T7 est suffisamment petit (environ 60 nm de diamètre)¹⁰ pour s'adapter à la barrière hémato-encéphalique, et ainsi la traverser directement, ainsi que les plexus choroïdes. Nous avons observé que le prélèvement de LCR chez des rats CM canulés constituait une méthode de criblage fonctionnel in vivo bien contrôlée, et que les phages extraits se liaient non seulement au système vasculaire, mais agissaient également comme transporteurs à travers la barrière hémato-encéphalique. De plus, en prélevant simultanément du sang et en appliquant un séquençage à haut débit (HTS) aux phages dérivés du LCR et du sang, nous avons confirmé que notre choix de LCR n'était pas influencé par l'enrichissement sanguin ni par la capacité d'expansion entre les cycles de sélection. Cependant, le compartiment sanguin fait partie intégrante de la procédure de sélection, car les phages capables d'atteindre le compartiment LCR doivent survivre et circuler dans le flux sanguin suffisamment longtemps pour s'enrichir dans le cerveau. Afin d'extraire des informations de séquence fiables à partir des données brutes de HTS, nous avons implémenté des filtres adaptés aux erreurs de séquençage spécifiques à la plateforme dans le flux de travail d'analyse. En intégrant des paramètres cinétiques à la méthode de criblage, nous avons confirmé la pharmacocinétique rapide des phages T7 de type sauvage (t½ ~ 28 min) dans le sang^{24, 27, 28} et déterminé leur demi-vie dans le liquide céphalo-rachidien (t½ ~ 26 min). Malgré des profils pharmacocinétiques similaires dans le sang et le LCR, seulement 0,001 % de la concentration sanguine de phage a été détectée dans le LCR, indiquant une faible mobilité des phages T7 de type sauvage à travers la barrière hémato-encéphalique. Ce travail souligne l'importance de la première étape de sélection lors de l'utilisation de stratégies de criblage in vivo, en particulier pour les systèmes phagiques rapidement éliminés de la circulation, car peu de clones parviennent à atteindre le système nerveux central. Ainsi, lors de la première étape, la réduction de la diversité de la banque a été très importante, car seul un nombre limité de clones a finalement été collecté dans ce modèle de LCR très restrictif. Cette stratégie de sélection in vivo comprenait plusieurs étapes, telles que l'accumulation active dans le LCR, la survie des clones dans le sang et l'élimination rapide des clones de phage T7 du sang dans les 10 premières minutes (Fig. 1d et Fig. suppl. 4M). Ainsi, après le premier cycle, différents clones de phage ont été identifiés dans le LCR, bien que le même pool initial ait été utilisé pour chaque animal. Ceci suggère que des étapes de sélection rigoureuses et répétées pour des banques sources contenant un grand nombre de clones entraînent une réduction significative de la diversité. Par conséquent, des événements aléatoires deviennent partie intégrante du processus de sélection initial, influençant fortement le résultat. Il est probable que de nombreux clones de la banque d'origine présentaient une propension à l'enrichissement dans le LCR très similaire. Cependant, même dans des conditions expérimentales identiques, les résultats de la sélection peuvent différer en raison du faible nombre de chaque clone dans le pool initial.
Les motifs enrichis dans le LCR diffèrent de ceux présents dans le sang. Fait intéressant, nous avons observé une prédominance de peptides riches en glycine dans le sang de certains animaux (Fig. 1g, Fig. suppl. 4e et 4f). Les phages contenant des peptides de glycine pourraient être plus stables et moins susceptibles de quitter la circulation sanguine. Cependant, ces peptides riches en glycine n'ont pas été détectés dans les échantillons de liquide céphalo-rachidien, ce qui suggère que les banques de phages ont subi deux étapes de sélection distinctes : une dans le sang et une autre permettant leur accumulation dans le liquide céphalo-rachidien. Les clones enrichis dans le LCR, issus du quatrième cycle de sélection, ont été testés de manière approfondie. Presque tous les clones testés individuellement se sont révélés enrichis dans le LCR par rapport au phage témoin. Un peptide (n° 2077) a fait l'objet d'une analyse plus détaillée. Ce peptide présentait une demi-vie plasmatique plus longue que les autres peptides actifs (Figure 3d et Figure supplémentaire 7) et, fait intéressant, contenait un résidu de cystéine en position C-terminale. Il a été récemment démontré que l'ajout de cystéine aux peptides pouvait améliorer leurs propriétés pharmacocinétiques par liaison à l'albumine²⁹. Ce mécanisme est actuellement inconnu pour le peptide n° 2077 et nécessite des études complémentaires. Certains peptides ont montré une dépendance de leur enrichissement dans le LCR à leur valence (données non présentées), ce qui pourrait être lié à la géométrie de surface de la capside T7. Le système T7 utilisé a permis d'obtenir 5 à 15 copies de chaque peptide par particule phagique. Une analyse immunohistochimique (IHC) a été réalisée sur des clones de phages candidats, injectés par voie intraveineuse dans le cortex cérébral de rats (Figure supplémentaire 8). Les résultats ont montré qu'au moins trois clones (n° 2002, n° 2009 et n° 2077) interagissaient avec la barrière hémato-encéphalique (BHE). Il reste à déterminer si cette interaction avec la barrière hémato-encéphalique (BHE) entraîne une accumulation de liquide céphalo-rachidien (LCR) ou le passage direct de ces clones vers la barrière hémato-encéphalique (BHE). Il est important de noter que nous montrons que les peptides sélectionnés conservent leur capacité de transport vers le LCR une fois synthétisés et liés à la protéine cible. La liaison de peptides biotinylés en N-terminal à l'acide salicylique (SA) reproduit essentiellement les résultats obtenus avec leurs clones de phages respectifs dans le sang et le liquide céphalo-rachidien (Fig. 3e). Enfin, nous montrons que le peptide principal n° 2077 est capable de potentialiser l'action cérébrale d'un inhibiteur peptidique biotinylé de la BACE1 conjugué à l'acide salicylique, induisant des effets pharmacodynamiques marqués dans le système nerveux central (SNC) par une réduction significative des concentrations d'Aβ40 dans le LCR (Fig. 4). Nous n'avons identifié aucun homologue dans la base de données en effectuant une recherche d'homologie de séquence peptidique sur l'ensemble des résultats. Il est important de noter que la taille de la bibliothèque T7 est d'environ 10⁹, tandis que la taille théorique d'une bibliothèque de 12-mers est de 4 x 10¹⁵. Par conséquent, nous n'avons sélectionné qu'une petite fraction de l'espace de diversité de la bibliothèque de peptides de 12-mers, ce qui pourrait signifier que des peptides plus optimisés pourraient être identifiés en explorant l'espace de séquences adjacentes à ces peptides. L'une des raisons pour lesquelles nous n'avons trouvé aucun homologue naturel de ces peptides pourrait être une désélection au cours de l'évolution, visant à empêcher l'intégration incontrôlée de certains motifs peptidiques dans le cerveau.
L'ensemble de nos résultats constitue une base pour de futurs travaux visant à identifier et caractériser plus précisément les systèmes de transport de la barrière hémato-encéphalique in vivo. Cette méthode repose sur une stratégie de sélection fonctionnelle qui identifie non seulement les clones présentant des propriétés de liaison aux vaisseaux cérébraux, mais comprend également une étape cruciale : les clones sélectionnés possèdent une activité intrinsèque leur permettant de franchir les barrières biologiques in vivo et d'atteindre le compartiment du SNC. L'objectif est d'élucider le mécanisme de transport de ces peptides et leur affinité pour la microvascularisation spécifique à la région cérébrale. Ceci pourrait mener à la découverte de nouvelles voies de transport à travers la BHE et ses récepteurs. Nous supposons que les peptides identifiés peuvent se lier directement aux récepteurs cérébrovasculaires ou à des ligands circulants transportés à travers la BHE ou la barrière hémato-cérébrovasculaire. Les vecteurs peptidiques présentant une activité de transport du LCR, découverts dans ce travail, feront l'objet d'études complémentaires. Nous étudions actuellement la spécificité cérébrale de ces peptides, notamment leur capacité à traverser la BHE et/ou la barrière hémato-cérébrovasculaire. Ces nouveaux peptides seront des outils extrêmement précieux pour la découverte potentielle de nouveaux récepteurs ou voies de signalisation et pour le développement de nouvelles plateformes très efficaces pour l'administration de macromolécules, telles que des produits biologiques, au cerveau.
Canuler la grande citerne (CM) selon une modification de la méthode précédemment décrite. Des rats Wistar anesthésiés (200-350 g) sont placés sur un appareil stéréotaxique. Une incision médiane est pratiquée sur le cuir chevelu rasé et préparé aseptiquement afin d'exposer le crâne. Deux trous sont percés dans la région de la crête iliaque supérieure et des vis de fixation y sont insérées. Un trou supplémentaire est percé dans la crête occipitale latérale pour le guidage stéréotaxique d'une canule en acier inoxydable dans la CM. Du ciment dentaire est appliqué autour de la canule et celle-ci est fixée par des vis. Après photopolymérisation et durcissement du ciment, la plaie cutanée est fermée par une suture supramide 4/0. Le bon positionnement de la canule est confirmé par l'écoulement spontané de liquide céphalo-rachidien (LCR). Le rat est retiré de l'appareil stéréotaxique, reçoit les soins postopératoires et la prise en charge de la douleur appropriés, et on le laisse récupérer pendant au moins une semaine, jusqu'à l'apparition de sang dans le LCR. Des rats Wistar (Crl:WI/Han) ont été obtenus auprès de Charles River (France). Tous les rats ont été maintenus en conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques. Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Service vétérinaire de la ville de Bâle (Suisse) et réalisées conformément à l'autorisation d'expérimentation animale n° 2474 (Évaluation du transport actif cérébral par la mesure des concentrations de candidats thérapeutiques dans le liquide céphalo-rachidien et le cerveau du rat).
Maintenez délicatement le rat conscient en tenant la canule CM. Retirez le datura de la canule et prélevez 10 µl de liquide céphalo-rachidien (LCR) s'écoulant spontanément. La perméabilité de la canule étant finalement compromise, seuls les échantillons de LCR clairs, sans trace de contamination sanguine ni de coloration anormale, ont été inclus dans cette étude. Parallèlement, environ 10 à 20 µl de sang ont été prélevés par une petite incision à l'extrémité de la queue dans des tubes contenant de l'héparine (Sigma-Aldrich). Le LCR et le sang ont été prélevés à différents moments après l'injection intraveineuse du phage T7. Environ 5 à 10 µl de liquide ont été éliminés avant chaque prélèvement de LCR, ce qui correspond au volume mort du cathéter.
Les banques ont été générées à l'aide du vecteur T7Select 10-3b, comme décrit dans le manuel du système T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Brièvement, un insert d'ADN aléatoire de 12 nucléotides a été synthétisé selon le format suivant :
Le codon NNK a été utilisé pour éviter les codons stop doubles et la surexpression d'acides aminés dans l'insert. N représente un mélange équimolaire manuel de chaque nucléotide, et K un mélange équimolaire manuel de nucléotides adénine et cytosine. Les régions simple brin ont été converties en ADN double brin par incubation avec des dNTP (Novagen) et l'enzyme Klenow (New England Biolabs) dans un tampon Klenow (New England Biolabs) pendant 3 heures à 37 °C. Après la réaction, l'ADN double brin a été récupéré par précipitation à l'éthanol. L'ADN obtenu a été digéré par les enzymes de restriction EcoRI et HindIII (Roche). L'insert clivé et purifié (QIAquick, Qiagen) (ligase T4, New England Biolabs) a ensuite été ligaturé en phase dans un vecteur T7 pré-clivé après l'acide aminé 348 du gène de la capside 10B. Les réactions de ligation ont été incubées à 16 °C pendant 18 heures avant l'encapsidation in vitro. L'encapsidation des phages in vitro a été réalisée selon les instructions fournies avec le kit de clonage T7Select 10-3b (Novagen). La solution d'encapsidation a été amplifiée une fois par lyse à l'aide d'Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Les lysats ont été centrifugés, titrés et congelés à -80 °C sous forme de solution mère dans du glycérol.
Amplification PCR directe des régions variables de phages amplifiées en bouillon ou sur plaque à l'aide d'amorces de fusion propriétaires 454/Roche-amplicon. L'amorce de fusion directe contient des séquences flanquant la région variable (NNK) 12 (spécifiques à la matrice), l'adaptateur GS FLX Titanium A et une séquence clé de bibliothèque de quatre bases (TCAG) (Figure supplémentaire 1a) :
L'amorce de fusion inverse contient également de la biotine fixée à des billes de capture et l'adaptateur GS FLX Titanium B nécessaire à l'amplification clonale lors de la PCR en émulsion :
Les produits d'amplification ont ensuite été soumis à un pyroséquençage 454/Roche selon le protocole 454 GS-FLX Titanium. Pour le séquençage manuel de Sanger (analyseur d'ADN Applied Biosystems Hitachi 3730 xl), l'ADN du phage T7 a été amplifié par PCR et séquencé avec les paires d'amorces suivantes :
Les inserts provenant de chaque plaque ont été soumis à une amplification par PCR à l'aide du kit Roche Fast Start DNA Polymerase (conformément aux instructions du fabricant). Effectuer une étape de dénaturation initiale (10 min à 95 °C) et 35 cycles d'amplification (50 s à 95 °C, 1 min à 50 °C et 1 min à 72 °C).
Les phages issus de banques, les phages sauvages, les phages récupérés du LCR et du sang, ou des clones individuels ont été amplifiés dans Escherichia coli BL5615 en bouillon TB (Sigma Aldrich) ou dans des boîtes de Petri de 500 cm² (Thermo Scientific) pendant 4 h à 37 °C. Les phages ont été extraits des boîtes par rinçage avec un tampon Tris-EDTA (Fluka Analytical) ou par prélèvement des plages de lyse à l'aide d'embouts de pipettes stériles. Les phages ont été isolés du surnageant de culture ou du tampon d'extraction par une précipitation au polyéthylène glycol (PEG 8000) (Promega) et remis en suspension dans un tampon Tris-EDTA.
Le phage amplifié a été soumis à 2 ou 3 cycles d'élimination des endotoxines à l'aide de billes d'élimination d'endotoxines (Miltenyi Biotec) avant injection intraveineuse (IV) (500 μl/animal). Lors du premier cycle, 2 × 10¹² phages ont été introduits ; lors du deuxième, 2 × 10¹⁰ phages ; et lors des troisième et quatrième cycles de sélection, 2 × 10⁹ phages par animal. La concentration de phages dans les échantillons de LCR et de sang prélevés aux temps indiqués a été déterminée par comptage des plages de lyse, conformément aux instructions du fabricant (manuel du système T7Select). La sélection des phages a été réalisée par injection intraveineuse de banques purifiées dans la veine caudale ou par réinjection de phages extraits du LCR du cycle de sélection précédent. Les prélèvements suivants ont été effectués à 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min et 240 min, respectivement pour les échantillons de LCR et de sang. Un total de quatre cycles de sélection in vivo ont été réalisés. Les deux lignées sélectionnées ont été conservées et analysées séparément lors des trois premiers cycles. Tous les inserts phagiques extraits du LCR des deux premiers cycles ont été soumis à un pyroséquençage 454/Roche, tandis que tous les clones extraits du LCR des deux derniers cycles ont été séquencés manuellement. Tous les phages sanguins du premier cycle ont également été soumis à un pyroséquençage 454/Roche. Pour l'injection des clones phagiques, les phages sélectionnés ont été amplifiés dans E. coli (BL5615) sur des plaques de 500 cm² à 37 °C pendant 4 heures. Les clones sélectionnés individuellement et séquencés manuellement ont été propagés dans un milieu TB. Après extraction, purification et élimination des endotoxines (comme décrit précédemment), 2 × 10¹⁰ phages/animal dans 300 µl ont été injectés par voie intraveineuse dans une veine caudale.
Prétraitement et filtrage qualitatif des données de séquençage. Les données brutes 454/Roche ont été converties du format binaire SFF (Standard Stream Map) au format FASTA (Pearson Human Readable) à l'aide du logiciel du fournisseur. Le traitement ultérieur de la séquence nucléotidique a été réalisé avec des programmes et scripts C propriétaires (logiciel non publié), comme décrit ci-dessous. L'analyse des données primaires comprend des procédures de filtrage rigoureuses en plusieurs étapes. Afin d'éliminer les lectures ne contenant pas d'insert d'ADN valide de 12 nucléotides, ces lectures ont été alignées séquentiellement sur le marqueur de début (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), le marqueur de fin (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) et l'insert de fond (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) à l'aide du test global de Needleman-Wunsch, autorisant jusqu'à deux incohérences par alignement³¹. Par conséquent, les lectures sans marqueurs de début et de fin, ainsi que celles contenant des inserts de fond (c'est-à-dire les alignements dépassant le nombre d'erreurs autorisé), ont été supprimées de la bibliothèque. Concernant les lectures restantes, la séquence d'ADN N-mer s'étendant du codon d'initiation jusqu'au codon stop a été excisée de la séquence de lecture originale et traitée ultérieurement (ci-après dénommée « insert »). Après traduction de l'insert, la portion suivant le premier codon stop à l'extrémité 5′ de l'amorce a été supprimée. De plus, les nucléotides conduisant à des codons incomplets à l'extrémité 3′ de l'amorce ont également été éliminés. Afin d'exclure les inserts ne contenant que des séquences de fond, les inserts traduits commençant par le motif d'acides aminés « PAG » ont également été supprimés. Les peptides dont la longueur post-traductionnelle est inférieure à 3 acides aminés ont été éliminés de la bibliothèque. Enfin, la redondance dans le pool d'inserts a été éliminée et la fréquence de chaque insert unique a été déterminée. Les résultats de cette analyse comprennent une liste des séquences nucléotidiques (inserts) et leurs fréquences (lectures) (Figures supplémentaires 1c et 2).
Regroupement des insertions d'ADN N-mer par similarité de séquence : Afin d'éliminer les erreurs de séquençage spécifiques à la technologie 454/Roche (telles que les problèmes liés au séquençage des extensions homopolymères) et de supprimer les redondances mineures, les insertions d'ADN N-mer préalablement filtrées sont triées par similarité (jusqu'à deux bases non appariées autorisées) à l'aide d'un algorithme itératif défini comme suit : les insertions sont d'abord triées par fréquence (de la plus élevée à la plus basse), puis, en cas d'égalité, par longueur (de la plus longue à la plus courte). Ainsi, les insertions les plus fréquentes et les plus longues constituent le premier « groupe ». La fréquence du groupe est fixée à la fréquence de référence. Ensuite, chaque insertion restante dans la liste triée est ajoutée au groupe par alignement de Needleman-Wunsch par paires. Si le nombre d'erreurs d'appariement, d'insertions ou de délétions dans un alignement ne dépasse pas un seuil de 2, une insertion est ajoutée au groupe et la fréquence globale du groupe est incrémentée du nombre d'insertions. Les insertions ajoutées à un groupe sont marquées comme utilisées et exclues du traitement ultérieur. Si la séquence d'insertion ne peut être ajoutée à un groupe existant, elle sert à créer un nouveau groupe avec la fréquence d'insertion appropriée et est également marquée comme utilisée. L'itération se termine lorsque chaque séquence d'insertion a été utilisée pour former un nouveau groupe ou peut être incluse dans un groupe existant. Enfin, les insertions groupées, composées de nucléotides, sont traduites en séquences peptidiques (bibliothèques de peptides). Le résultat de cette analyse est un ensemble d'insertions et leurs fréquences respectives, qui constituent le nombre de lectures consécutives (Figure supplémentaire 2).
Génération de motifs : À partir d’une liste de peptides uniques, une bibliothèque contenant tous les motifs d’acides aminés possibles (aa) a été créée, comme illustré ci-dessous. Chaque motif possible de longueur 3 a été extrait du peptide et son inverse a été ajouté, ainsi qu’une bibliothèque de motifs communs contenant tous les motifs (tripeptides). Les bibliothèques de motifs hautement répétitifs ont été séquencées et les redondances éliminées. Ensuite, pour chaque tripeptide de la bibliothèque de motifs, sa présence a été vérifiée à l’aide d’outils bioinformatiques. Dans ce cas, la fréquence du peptide contenant le tripeptide du motif trouvé est ajoutée et attribuée au motif dans la bibliothèque (« nombre de motifs »). Le résultat de la génération de motifs est un tableau bidimensionnel contenant toutes les occurrences de tripeptides (motifs) et leurs valeurs respectives, qui correspondent au nombre de lectures de séquençage aboutissant au motif correspondant après filtrage, regroupement et traduction des lectures. Les métriques sont décrites en détail ci-dessus.
Normalisation du nombre de motifs et des nuages ​​de points correspondants : Le nombre de motifs pour chaque échantillon a été normalisé à l’aide de
où ni représente le nombre de lectures contenant le sujet i. Ainsi, vi représente la fréquence en pourcentage des lectures (ou peptides) contenant le motif i dans l'échantillon. Les valeurs p pour le nombre non normalisé de motifs ont été calculées à l'aide du test exact de Fisher. Concernant les corrélogrammes du nombre de motifs, les corrélations de Spearman ont été calculées à partir du nombre normalisé de motifs avec R.
Pour visualiser la composition en acides aminés à chaque position de la bibliothèque peptidique, les logogrammes web 32 et 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ont été créés. La composition en acides aminés à chaque position du peptide dodécamérique est d'abord stockée dans une matrice 20×12. Ensuite, un ensemble de 1 000 peptides présentant la même composition relative en acides aminés à chaque position est généré au format FASTA et fourni comme entrée au logogramme web 3, qui génère une représentation graphique de la composition relative en acides aminés à chaque position pour la bibliothèque peptidique donnée. Pour visualiser les ensembles de données multidimensionnels, des cartes thermiques ont été créées à l'aide d'un outil développé en interne sous R (biosHeatmap, un package R non encore publié). Les dendrogrammes présentés dans les cartes thermiques ont été calculés à l'aide de la méthode de classification hiérarchique de Ward avec la distance euclidienne. Pour l'analyse statistique des données de score de motifs, les valeurs p pour le score non normalisé ont été calculées à l'aide du test exact de Fisher. Les valeurs p des autres ensembles de données ont été calculées dans R à l'aide du test t de Student ou de l'ANOVA.
Des clones de phages sélectionnés et des phages sans insert ont été injectés par voie intraveineuse dans la veine caudale (2 × 10¹⁰ phages/animal dans 300 µl de PBS). Dix minutes avant la perfusion et la fixation subséquente, les mêmes animaux ont reçu une injection intraveineuse de 100 µl de lectine marquée au DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Soixante minutes après l'injection des phages, les rats ont été perfusés par voie cardiaque avec 50 ml de PBS, puis avec 50 ml de PFA à 4 % dans du PBS. Les échantillons de cerveau ont ensuite été fixés pendant une nuit dans du PFA à 4 % dans du PBS, puis incubés dans une solution de saccharose à 30 % pendant une nuit à 4 °C. Les échantillons ont été congelés instantanément dans le mélange OCT. L'analyse immunohistochimique d'échantillons congelés a été réalisée à température ambiante sur des coupes cryogéniques de 30 µm bloquées avec 1 % de BSA et incubées avec des anticorps polyclonaux marqués au FITC dirigés contre le phage T7 (Novus NB 600-376A) à 4 °C. L'incubation a duré une nuit. Enfin, les coupes ont été lavées trois fois avec du PBS et examinées au microscope confocal à balayage laser (Leica TCS SP5).
Tous les peptides, d'une pureté minimale de 98 %, ont été synthétisés par GenScript USA, biotinylés et lyophilisés. La biotine est fixée par un triple espaceur de glycine supplémentaire en position N-terminale. Tous les peptides ont été analysés par spectrométrie de masse.
La streptavidine (Sigma S0677) a été mélangée à un excès équimolaire (5 fois) de peptide biotinylé, de peptide inhibiteur de BACE1 biotinylé, ou d'une combinaison (ratio 3:1) de peptide inhibiteur de BACE1 biotinylé et de peptide inhibiteur de BACE1 dans du DMSO à 5–10 % et incubée dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante avant l'injection. Les peptides conjugués à la streptavidine ont été injectés par voie intraveineuse à la dose de 10 mg/kg dans une veine caudale de rats ayant une cavité cérébrale.
La concentration des complexes streptavidine-peptide a été évaluée par ELISA. Des plaques de microtitration Nunc Maxisorp (Sigma) ont été incubées pendant une nuit à 4 °C avec 1,5 μg/ml d'anticorps anti-streptavidine de souris (Thermo, MA1-20011). Après blocage (tampon de blocage : NaCl 140 mM, EDTA 5 mM, NP40 0,05 %, gélatine 0,25 %, BSA 1 %) pendant 2 heures à température ambiante, la plaque a été lavée pendant 3 secondes avec une solution de Tween-20 à 0,05 % dans du PBS (tampon de lavage). Des échantillons de LCR et de plasma ont ensuite été ajoutés aux puits, dilués dans le tampon de blocage (plasma : 1/10 000 ; LCR : 1/115). La plaque a ensuite été incubée pendant une nuit à 4 °C avec l'anticorps de détection (anti-streptavidine-HRP, Novus NB120-7239, 1 μg/ml). Après trois lavages, la streptavidine a été détectée par incubation dans une solution de substrat TMB (Roche) pendant 20 minutes maximum. Après arrêt de la réaction avec du H2SO4 1M, l'absorbance a été mesurée à 450 nm.
La fonction du complexe streptavidine-peptide-inhibiteur de BACE1 a été évaluée par dosage ELISA de l'Aβ(1-40) selon le protocole du fabricant (Wako, 294-64701). Brièvement, les échantillons de LCR ont été dilués dans un diluant standard (1:23) et incubés une nuit à 4 °C dans des plaques 96 puits recouvertes d'anticorps de capture BNT77. Après cinq lavages, l'anticorps BA27 conjugué à la HRP a été ajouté et incubé pendant 2 heures à 4 °C, suivi de cinq nouveaux lavages. L'Aβ(1-40) a été détecté par incubation dans une solution de TMB pendant 30 minutes à température ambiante. Après arrêt de la réaction avec une solution d'arrêt, l'absorbance a été mesurée à 450 nm. Les échantillons de plasma ont subi une extraction en phase solide avant le dosage ELISA de l'Aβ(1-40). Le plasma a été ajouté à 0,2 % de DEA (Sigma) dans des plaques 96 puits et incubé à température ambiante pendant 30 minutes. Après lavages successifs des plaques SPE (Oasis, 186000679) à l'eau et au méthanol pur, les échantillons de plasma ont été déposés sur les plaques et tout le liquide a été éliminé. Les échantillons ont été lavés (d'abord avec du méthanol à 5 ​​%, puis à 30 %) et élués avec une solution de NH₄OH à 2 % dans du méthanol à 90 %. Après séchage de l'éluat à 55 °C pendant 99 min sous courant d'azote constant, les échantillons ont été réduits dans des diluants standards et la concentration d'Aβ(1–40) a été mesurée comme décrit précédemment.
Comment citer cet article : Urich, E. et al. Cargo delivery to the brain using transit peptides identified in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
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