Takk for at du besøker Nature.com. Du bruker en nettleserversjon med begrenset CSS-støtte. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I tillegg, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Viser en karusell med tre lysbilder samtidig. Bruk Forrige- og Neste-knappene for å gå gjennom tre lysbilder om gangen, eller bruk glidebryterknappene på slutten for å gå gjennom tre lysbilder om gangen.
Blod-hjerne-barrieren og blod-hjerne-barrieren hindrer bioterapeutiske midler i å nå sine mål i sentralnervesystemet, og hindrer dermed effektiv behandling av nevrologiske sykdommer. For å oppdage nye hjernetransportører in vivo, introduserte vi et T7-fagpeptidbibliotek og serieinnsamlet blod og cerebrospinalvæske (CSF) ved hjelp av en kanylert, bevisst stor poolmodell av rotter. Spesifikke fagkloner ble høyt anriket i CSF etter fire runder med seleksjon. Testing av individuelle kandidatpeptider avdekket mer enn 1000 ganger anriking i CSF. Bioaktiviteten til den peptidmedierte tilførselen til hjernen ble bekreftet av en 40 % reduksjon i nivået av amyloid-β i cerebrospinalvæsken ved bruk av en BACE1-peptidhemmer koblet til det identifiserte nye transittpeptidet. Disse resultatene antyder at peptidene identifisert ved in vivo fagseleksjonsmetoder kan være nyttige vehikler for systemisk tilførsel av makromolekyler til hjernen med en terapeutisk effekt.
Forskning på målrettet terapi i sentralnervesystemet (CNS) har i stor grad fokusert på å identifisere optimaliserte legemidler og midler som viser CNS-målrettede egenskaper, med mindre innsats på å oppdage mekanismene som driver aktiv medikamentlevering til hjernen. Dette begynner å endre seg nå ettersom medikamentlevering, spesielt store molekyler, er en integrert del av moderne nevrovitenskapelig legemiddelutvikling. Miljøet i sentralnervesystemet er godt beskyttet av det cerebrovaskulære barrieresystemet, som består av blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​og blod-hjerne-barrieren (BCBB)1, noe som gjør det utfordrende å levere legemidler til hjernen1,2. Det er anslått at nesten alle store molekylære legemidler og mer enn 98 % av små molekylære legemidler elimineres fra hjernen3. Derfor er det svært viktig å identifisere nye hjernetransportsystemer som gir effektiv og spesifikk levering av terapeutiske legemidler til CNS4,5. Imidlertid gir BBB og BCSFB også en utmerket mulighet for medikamentlevering ettersom de trenger inn i og kommer inn i alle strukturer i hjernen gjennom dens omfattende vaskulatur. Dermed er de nåværende forsøkene på å bruke ikke-invasive metoder for levering til hjernen i stor grad basert på mekanismen for reseptormediert transport (PMT) ved bruk av den endogene BBB6-reseptoren. Til tross for nylige viktige fremskritt ved bruk av transferrinreseptorveien7,8, er videreutvikling av nye leveringssystemer med forbedrede egenskaper nødvendig. For dette formålet var målet vårt å identifisere peptider som er i stand til å mediere CSF-transport, da de i prinsippet kan brukes til å levere makromolekyler til CNS eller til å åpne nye reseptorveier. Spesielt kan spesifikke reseptorer og transportører i det cerebrovaskulære systemet (BBB og BSCFB) tjene som potensielle mål for aktiv og spesifikk levering av bioterapeutiske legemidler. Cerebrospinalvæske (CSF) er et sekretorisk produkt av choroid plexus (CS) og er i direkte kontakt med hjernens interstitielle væske gjennom subaraknoidalrommet og ventrikulærrommet4. Nylig har det blitt vist at subaraknoidal cerebrospinalvæske diffunderer i overdreven grad inn i hjernens interstitium9. Vi håper å få tilgang til det parenkymale rommet ved å bruke denne subaraknoideale innstrømningskanalen eller direkte gjennom BBB. For å oppnå dette implementerte vi en robust in vivo fagseleksjonsstrategi som ideelt sett identifiserer peptider transportert via en av disse to distinkte veiene.
Vi beskriver nå en sekvensiell in vivo-metode for fagdisplayscreening med CSF-prøvetaking kombinert med høykapasitetssekvensering (HTS) for å overvåke innledende seleksjonsrunder med høyest bibliotekdiversitet. Screening ble utført på bevisste rotter med en permanent implantert stor cisterna (CM)-kanyle for å unngå blodkontaminering. Det er viktig at denne tilnærmingen selekterer både hjernerettet peptider og peptider med transportaktivitet over den cerebrovaskulære barrieren. Vi brukte T7-fager på grunn av deres lille størrelse (~60 nm)10 og antydet at de er egnet for transport av vesikler som tillater transcellulær kryssing av endotel- og/eller epitel-medulla-barrieren. Etter fire runder med panorering ble fagpopulasjoner isolert som viste sterk in vivo CSF-anriking og cerebral mikrokarassosiasjon. Det er viktig at vi kunne bekrefte funnene våre ved å demonstrere at de foretrukne og kjemisk syntetiserte beste kandidatpeptidene er i stand til å transportere proteinlast inn i cerebrospinalvæsken. Først ble de farmakodynamiske effektene av sentralnervesystemet etablert ved å kombinere et ledende transittpeptid med en hemmer av BACE1-peptidet. I tillegg til å demonstrere at funksjonelle screeningstrategier in vivo kan identifisere nye hjernetransportpeptider som effektive proteintransportører, forventer vi at lignende funksjonelle seleksjonsmetoder også vil bli viktige for å identifisere nye hjernetransportveier.
Basert på plakkdannende enheter (PFU) ble et bibliotek med tilfeldige 12-mer lineære T7-fagpeptider med en diversitet på omtrent 109 designet og laget etter fagpakkingstrinnet (se Materialer og metoder). Det er viktig å merke seg at vi nøye analyserte dette biblioteket før in vivo-panning. PCR-amplifisering av fagbibliotekprøver ved bruk av modifiserte primere genererte amplikoner som var direkte anvendelige på HTS (tilleggsfigur 1a). På grunn av a) HTS11-sekvenseringsfeil, b) påvirkning på kvaliteten på primerne (NNK)1-12, og c) tilstedeværelsen av villtype (wt) fag (skjelettinnsatser) i standby-biblioteket, ble en sekvensfiltreringsprosedyre implementert for å trekke ut kun verifisert sekvensinformasjon (tilleggsfigur 1b). Disse filtertrinnene gjelder for alle HTS-sekvenseringsbiblioteker. For standardbiblioteket ble det oppnådd totalt 233 868 avlesninger, hvorav 39 % besto filterkriteriene og ble brukt til bibliotekanalyse og utvalg for påfølgende runder (tilleggsfigur 1c–e). Avlesningene var hovedsakelig multipler av 3 basepar i lengde med en topp på 36 nukleotider (tilleggsfigur 1c), noe som bekreftet bibliotekdesignet (NNK) 1-12. Det er verdt å merke seg at omtrent 11 % av bibliotekmedlemmene inneholdt et 12-dimensjonalt villtype (wt) ryggrads-PAGISRELVDKL-innskudd, og nesten halvparten av sekvensene (49 %) inneholdt innsettinger eller delesjoner. HTS-analysen av bibliotekbiblioteket bekreftet det høye mangfoldet av peptider i biblioteket: mer enn 81 % av peptidsekvensene ble funnet bare én gang, og bare 1,5 % forekom i ≥4 kopier (tilleggsfigur 2a). Frekvensene av aminosyrer (aa) på alle 12 posisjoner i repertoaret korrelerte godt med frekvensene som forventes for antall kodoner generert av det degenererte NKK-repertoaret (tilleggsfigur 2b). Den observerte frekvensen av aa-rester kodet av disse innsettingene korrelerte godt med den beregnede frekvensen (r = 0,893) (tilleggsfigur 2c). Forberedelsen av fagbiblioteker for injeksjon inkluderer trinnene amplifisering og fjerning av endotoksin. Dette har tidligere vist seg potensielt å redusere mangfoldet av fagbiblioteker 12,13. Derfor sekvenserte vi et plateamplifisert fagbibliotek som hadde gjennomgått endotoksinfjerning og sammenlignet det med det opprinnelige biblioteket for å estimere frekvensen av AA. En sterk korrelasjon (r = 0,995) ble observert mellom den opprinnelige poolen og den amplifiserte og rensede poolen (tilleggsfigur 2d), noe som indikerer at konkurranse mellom kloner amplifisert på plater ved bruk av T7-fag ikke forårsaket større skjevhet. Denne sammenligningen er basert på frekvensen av tripeptidmotiver i hvert bibliotek, siden mangfoldet av biblioteker (~109) ikke kan fanges opp fullt ut selv med HTS. Frekvensanalyse av aa i hver posisjon avdekket en liten posisjonsavhengig skjevhet i de tre siste posisjonene i det inntastede repertoaret (tilleggsfigur 2e). Avslutningsvis konkluderte vi med at kvaliteten og mangfoldet i biblioteket var akseptabelt, og bare mindre endringer i mangfold ble observert på grunn av amplifisering og forberedelse av fagbiblioteker mellom flere seleksjonsrunder.
Seriell prøvetaking av cerebrospinalvæske kan utføres ved kirurgisk å implantere en kanyle i cerebrospinalvæsken (CM) hos våkne rotter for å lette identifiseringen av T7-fag injisert intravenøst ​​(iv) via BBB og/eller BCSFB (fig. 1a-b). Vi brukte to uavhengige seleksjonsarmer (armer A og B) i de tre første rundene med in vivo-seleksjon (fig. 1c). Vi økte gradvis stringensen i seleksjonen ved å redusere den totale mengden fag introdusert i de tre første seleksjonsrundene. For den fjerde runden med panorering kombinerte vi prøver fra gren A og B og utførte tre ytterligere uavhengige seleksjoner. For å studere in vivo-egenskapene til T7-fagpartikler i denne modellen ble villtype-fag (PAGISRELVDKL master insert) injisert i rotter via halevenen. Gjenvinning av fager fra cerebrospinalvæske og blod på forskjellige tidspunkter viste at relativt små T7 ikosaedriske fager hadde en rask initial clearancefase fra blodkammeret (tilleggsfigur 3). Basert på de administrerte titrene og blodvolumet til rottene, beregnet vi at bare omtrent 1 vekt% fag fra den administrerte dosen ble påvist i blodet 10 minutter etter intravenøs injeksjon. Etter denne innledende raske nedgangen ble en langsommere primær clearance målt med en halveringstid på 27,7 minutter. Det er viktig å merke seg at bare svært få fager ble hentet fra CSF-rommet, noe som indikerer en lav bakgrunn for migrasjon av villtype fager inn i CSF-rommet (tilleggsfigur 3). I gjennomsnitt ble bare omtrent 1 x 10⁻³ % titere av T7-fag i blodet og 4 x 10⁻³ % av initialt infunderte fager påvist i cerebrospinalvæsken over hele prøvetakingsperioden (0–250 min). Det er verdt å merke seg at halveringstiden (25,7 min) for villtype fag i cerebrospinalvæske var lik den som ble observert i blod. Disse dataene viser at barrieren som skiller CSF-rommet fra blodet er intakt i CM-kanulerte rotter, noe som tillater in vivo-seleksjon av fagbiblioteker for å identifisere kloner som lett transporteres fra blodet inn i CSF-rommet.
(a) Oppsett av en metode for ny prøvetaking av cerebrospinalvæske (CSF) fra et stort basseng. (b) Diagram som viser den cellulære plasseringen av sentralnervesystemets (CNS) barriere og seleksjonsstrategien som brukes for å identifisere peptider som krysser blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​og blod-hjerne-barrieren. (c) Flytskjema for in vivo fagdisplayscreening. I hver seleksjonsrunde ble fager (dyreidentifikatorer innenfor pilene) injisert intravenøst. To uavhengige alternative grener (A, B) holdes separat frem til 4. seleksjonsrunde. For seleksjonsrunde 3 og 4 ble hver fagklon ekstrahert fra CSF manuelt sekvensert. (d) Kinetikken til fag isolert fra blod (røde sirkler) og cerebrospinalvæske (grønne trekanter) under den første seleksjonsrunden i to kanulerte rotter etter intravenøs injeksjon av T7-peptidbiblioteket (2 x 1012 fager/dyr). Blå firkanter indikerer den gjennomsnittlige initiale konsentrasjonen av fag i blodet, beregnet ut fra mengden injisert fag, tatt i betraktning det totale blodvolumet. De svarte firkantene indikerer skjæringspunktet for y-linjen ekstrapolert fra blodfagkonsentrasjoner. (e, f) Presenterer den relative frekvensen og fordelingen av alle mulige overlappende tripeptidmotiver funnet i peptidet. Antall motiver funnet i 1000 avlesninger vises. Signifikant (p < 0,001) er berikede motiver markert med røde prikker. (e) Korrelasjonsspredningsplott som sammenligner den relative frekvensen av tripeptidmotivet i det injiserte biblioteket med blodavledet fag fra dyr #1.1 og #1.2. (f) Korrelasjonsspredningsplott som sammenligner de relative frekvensene av dyrefag-tripeptidmotivene #1.1 og #1.2 isolert i blod og cerebrospinalvæske. (g, h) Sekvens-ID-representasjon av fag beriket i blod (g) versus injiserte biblioteker og fag beriket i CSF (h) versus blod etter en runde med in vivo-seleksjon hos begge dyrene. Størrelsen på den enbokstavskoden indikerer hvor ofte den aminosyren forekommer i den posisjonen. Grønn = polar, lilla = nøytral, blå = basisk, rød = sur og svart = hydrofobe aminosyrer. Figur 1a, b ble designet og produsert av Eduard Urich.
Vi injiserte et fagpeptidbibliotek i to CM-instrumentrotter (klader A og B) og isolerte fagen fra cerebrospinalvæske og blod (figur 1d). Den innledende raske clearance av biblioteket var mindre uttalt sammenlignet med villtypefagen. Gjennomsnittlig halveringstid for det injiserte biblioteket i begge dyrene var 24,8 minutter i blod, tilsvarende villtypefagen, og 38,5 minutter i CSF. Blod- og cerebrospinalvæskefagprøver fra hvert dyr ble utsatt for HTS, og alle identifiserte peptider ble analysert for tilstedeværelse av et kort tripeptidmotiv. Tripeptidmotiver ble valgt fordi de gir et minimalt grunnlag for strukturdannelse og peptid-protein-interaksjoner14,15. Vi fant en god korrelasjon i fordelingen av motiver mellom det injiserte fagbiblioteket og kloner ekstrahert fra blodet til begge dyrene (figur 1e). Dataene indikerer at bibliotekets sammensetning bare er marginalt anriket i blodrommet. Aminosyrefrekvenser og konsensussekvenser ble videre analysert på hver posisjon ved hjelp av en tilpasning av Weblogo16-programvaren. Interessant nok fant vi en sterk anrikning av blodglysinrester (fig. 1g). Da blod ble sammenlignet med kloner valgt fra CSF, ble det observert sterk seleksjon og noe deseleksjon av motiver (fig. 1f), og visse aminosyrer var fortrinnsvis tilstede på forhåndsbestemte posisjoner i 12-medlemmet (fig. 1h). Det er verdt å merke seg at individuelle dyr skilte seg betydelig i cerebrospinalvæsken, mens blodglysinanrikning ble observert hos begge dyrene (tilleggsfig. 4a–j). Etter streng filtrering av sekvensdata i cerebrospinalvæsken fra dyr #1.1 og #1.2, ble det oppnådd totalt 964 og 420 unike 12-mer peptider (tilleggsfig. 1d–e). De isolerte fagklonene ble amplifisert og utsatt for en andre runde med in vivo-seleksjon. Fag ekstrahert fra den andre seleksjonsrunden ble utsatt for HTS i hvert dyr, og alle identifiserte peptider ble brukt som input til et motivgjenkjenningsprogram for å analysere forekomsten av tripeptidmotiver (fig. 2a, b, ef). Sammenlignet med den første syklusen av fagen som ble utvunnet fra CSF, observerte vi ytterligere seleksjon og deseleksjon av mange motiver i CSF i grenene A og B (fig. 2). En nettverksidentifikasjonsalgoritme ble brukt for å bestemme om de representerte forskjellige mønstre av konsistent sekvens. En klar likhet ble observert mellom de 12-dimensjonale sekvensene som ble utvunnet av CSF i alternativ klade A (fig. 2c, d) og klade B (fig. 2g, h). Den samlede analysen i hver gren avdekket forskjellige seleksjonsprofiler for 12-mer-peptider (tilleggsfig. 5c, d) og en økning i CSF/blod-titerforholdet over tid for samlede kloner etter den andre seleksjonsrunden sammenlignet med den første seleksjonsrunden (tilleggsfig. 5e).
Berikelse av motiver og peptider i cerebrospinalvæske ved to påfølgende runder med in vivo funksjonell fagdisplayseleksjon.
Alle cerebrospinalvæskefager som ble utvunnet fra første runde av hvert dyr (dyr nr. 1.1 og nr. 1.2) ble samlet, amplifisert, HT-sekvensert og reinjisert sammen (2 x 1010 fager/dyr) 2 SM-kanulerte rotter (nr. 1.1 → #). 2.1 og 2.2, 1.2 → 2.3 og 2.4). (a, b, e, f) Korrelasjonsspredningsplott som sammenligner den relative frekvensen av tripeptidmotiver for alle CSF-avledede fager i første og andre seleksjonsrunde. Relativ frekvens og fordeling av motiver som representerer alle mulige overlappende tripeptider funnet i peptider i begge orienteringer. Antall motiver funnet i 1000 avlesninger vises. Motiver som ble signifikant (p < 0,001) valgt eller ekskludert i et av de sammenlignede bibliotekene er uthevet med røde prikker. (c, d, g, h) Sekvenslogo-representasjon av alle CSF-rike sekvenser på 12 aminosyrer basert på runde 2 og 1 med in vivo-seleksjon. Størrelsen på den enbokstavskoden indikerer hvor ofte den aminosyren forekommer i den posisjonen. For å representere logoen sammenlignes frekvensen av CSF-sekvenser ekstrahert fra individuelle dyr mellom to seleksjonsrunder, og de berikede sekvensene i den andre runden vises: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 og (h) #1.2–#2.4. De mest berikede aminosyrene i en gitt posisjon i (c, d) dyr nr. 2.1 og nr. 2.2 eller (g, h) i dyr nr. 2.3 og nr. 2.4 vises i farger. Grønn = polar, lilla = nøytral, blå = basisk, rød = sur og svart = hydrofobe aminosyrer.
Etter den tredje seleksjonsrunden identifiserte vi 124 unike peptidsekvenser (#3.1 og #3.2) fra 332 CSF-rekonstituerte fagkloner isolert fra to dyr (tilleggsfigur 6a). Sekvensen LGSVS (18,7 %) hadde den høyeste relative andelen, etterfulgt av villtypeinnsatsene PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) og SARGSWREIVSLS (2,2 %). I den siste fjerde runden samlet vi to uavhengig selekterte grener fra tre separate dyr (figur 1c). Av de 925 sekvenserte fagklonene som ble gjenvunnet fra CSF, fant vi 64 unike peptidsekvenser i den fjerde runden (tilleggsfigur 6b), hvorav den relative andelen av villtypefager falt til 0,8 %. De vanligste CSF-klonene i fjerde runde var LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) og RLSSVDSDLSGC (3, 2 %). Lengdeområdet for de valgte peptidene skyldes nukleotidinnsettinger/delesjoner eller premature stoppkodoner i bibliotekprimerne når degenererte kodoner brukes for NNK-bibliotekdesign. Premature stoppkodoner genererer kortere peptider og velges fordi de inneholder det gunstige aa-motivet. Lengre peptider kan være et resultat av innsettinger/delesjoner i primerne til de syntetiske bibliotekene. Dette plasserer det designede stoppkodonet utenfor rammen og leser det til et nytt stoppkodon dukker opp nedstrøms. Generelt beregnet vi anrikningsfaktorer for alle fire seleksjonsrundene ved å sammenligne inngangsdataene med prøveutdataene. For første screeningsrunde brukte vi villtype-fagtitere som en uspesifikk bakgrunnsreferanse. Interessant nok var negativ fagseleksjon veldig sterk i den første CSF-syklusen, men ikke i blod (fig. 3a), noe som kan skyldes den lave sannsynligheten for passiv diffusjon av de fleste medlemmene av peptidbiblioteket inn i CSF-rommet, eller relative fager har en tendens til å bli mer effektivt beholdt eller fjernet fra blodet enn bakteriofager. I den andre runden med panorering ble det imidlertid observert sterk seleksjon av fager i CSF i begge klader, noe som tyder på at den forrige runden var beriket med fager som viste peptider som fremmer CSF-opptak (fig. 3a). Igjen, uten betydelig blodberikelse. Også i tredje og fjerde runde var fagklonene betydelig beriket med CSF. Ved å sammenligne den relative frekvensen av hver unike peptidsekvens mellom de to siste seleksjonsrundene, fant vi at sekvensene var enda mer beriket i den fjerde seleksjonsrunden (fig. 3b). Totalt 931 tripeptidmotiver ble ekstrahert fra alle 64 unike peptidsekvenser ved bruk av begge peptidorienteringer. De mest berikede motivene i fjerde runde ble nærmere undersøkt for sine berikelsesprofiler på tvers av alle runder sammenlignet med det injiserte biblioteket (grenseverdi: 10 % berikelse) (tilleggsfigur 6c). Generelle seleksjonsmønstre viste at de fleste av de studerte motivene var beriket i alle tidligere runder av begge seleksjonsgrenene. Imidlertid var noen motiver (f.eks. SGL, VSG, LGS GSV) hovedsakelig fra alternativ klade A, mens andre (f.eks. FGW, RTN, WGF, NTR) var beriket i alternativ klade B.
Validering av CSF-transport av CSF-anrikede fag-viste peptider og biotinylerte lederpeptider konjugert til streptavidin-nyttelaster.
(a) Berikelsesforhold beregnet i alle fire runder (R1-R4) basert på injiserte (input = I) fag (PFU) titere og bestemte CSF-fagtitere (output = O). Berikelsesfaktorer for de tre siste rundene (R2-R4) ble beregnet ved sammenligning med forrige runde og første runde (R1) med vektdata. Åpne søyler er cerebrospinalvæske, skyggelagte søyler er plasma. (***p < 0,001, basert på Students t-test). (b) Liste over de mest tallrike fagpeptidene, rangert etter deres relative andel til alle fager samlet i CSF etter runde 4 av seleksjon. De seks vanligste fagklonene er uthevet i farge, nummerert og deres anrikningsfaktorer mellom runde 3 og 4 av seleksjon (innsett). (c, d) De seks mest berikede fagklonene, tomme fag- og foreldrefagpeptidbibliotekene fra runde 4 ble analysert individuelt i en CSF-prøvetakingsmodell. CSF- og blodprøver ble samlet inn på de angitte tidspunktene. (c) Like mengder av 6 kandidatfagkloner (2 x 1010 fager/dyr), tomme fager (#1779) (2 x 1010 fager/dyr) og stamfagpeptidbiblioteker (2 x 1012 fager/dyr). Injiser minst 3 CM administreres til det kanulerte dyret separat via halevenen. CSF-farmakokinetikken til hver injiserte fagklon og fagpeptidbibliotek over tid er vist. (d) viser gjennomsnittlig CSF/blod-forhold for alle gjenvunnede fager/ml over prøvetakingstiden. (e) Fire syntetiske lederpeptider og én kryptert kontroll ble koblet med biotin til streptavidin gjennom deres N-terminal (tetramer-display) etterfulgt av injeksjon (halevene iv, 10 mg streptavidin/kg). Minst tre intuberte rotter (N = 3). CSF-prøver ble samlet inn på de angitte tidspunktene, og streptavidinkonsentrasjonene ble målt ved CSF anti-streptavidin ELISA (nd = ikke påvist). (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, basert på ANOVA-test). (f) Sammenligning av aminosyresekvensen til den mest berikede fagpeptidklonen #2002 (lilla) med andre utvalgte fagpeptidkloner fra 4. seleksjonsrunde. Identiske og lignende aminosyrefragmenter er fargekodet.
Av alle anrikede fager i fjerde runde (fig. 3b) ble seks kandidatkloner valgt ut for videre individuell analyse i CSF-prøvetakingsmodellen. Like mengder av seks kandidatfag-, tomme fag- (uten innsetting) og profagpeptidbiblioteker ble injisert i tre kanulerte CM-dyr, og farmakokinetikken ble bestemt i CSF- (fig. 3c) og blod- (tilleggsfig. 7) analyser. Alle testede fagkloner målrettet CSF-kompartmentet på et nivå 10–1000 ganger høyere enn for den tomme kontrollfagen (#1779). For eksempel hadde klonene #2020 og #2077 omtrent 1000 ganger høyere CSF-titere enn kontrollfagen. Den farmakokinetiske profilen til hvert valgte peptid er forskjellig, men alle har en høy CSF-målsøkende evne. Vi observerte en konstant nedgang over tid for klonene #1903 og #2011, mens for klonene #2077, #2002 og #2009 kan en økning i løpet av de første 10 minuttene indikere aktiv transport, men dette må verifiseres. Klonene #2020, #2002 og #2077 stabiliserte seg på høye nivåer, mens CSF-konsentrasjonen av klon #2009 sakte sank etter den første økningen. Vi sammenlignet deretter den relative frekvensen av hver CSF-kandidat med blodkonsentrasjonen (fig. 3d). Korrelasjonen mellom gjennomsnittstiteren til hver CSF-kandidat og blodtiteren ved alle prøvetakingstidspunkter viste at tre av de seks kandidatene var betydelig anriket i blod-CSF. Interessant nok viste klon #2077 høyere blodstabilitet (tilleggsfigur 7). For å bekrefte at peptidene i seg selv er i stand til aktivt å transportere annen last enn fagpartikler inn i CSF-rommet, syntetiserte vi fire lederpeptider derivatisert med biotin ved N-terminalen der peptidene fester seg til fagpartikkelen. Biotinylerte peptider (nr. 2002, 2009, 2020 og 2077) ble konjugert med streptavidin (SA) for å oppnå multimere former som til en viss grad etterlignet faggeometrien. Dette formatet tillot oss også å måle SA-eksponering i blod og cerebrospinalvæske som lasttransporterende proteinpeptider. Det er viktig å merke seg at fagdata ofte kunne reproduseres når syntetiske peptider ble administrert i dette SA-konjugerte formatet (fig. 3e). De krypterte peptidene hadde mindre initial eksponering og raskere CSF-clearance med ikke-detekterbare nivåer innen 48 timer. For å få innsikt i leveringsveiene til disse peptidfagklonene inn i CSF-rommet, analyserte vi lokaliseringen av individuelle fagpeptidtreff ved hjelp av immunhistokjemi (IHC) for å direkte detektere fagpartikler 1 time etter intravenøs injeksjon in vivo. Det er verdt å merke seg at klonene #2002, #2077 og #2009 kunne påvises ved sterk farging i hjernekapillærer, mens kontrollfag (#1779) og klon #2020 ikke ble påvist (tilleggsfigur 8). Dette tyder på at disse peptidene bidrar til effekten på hjernen nettopp ved å krysse BBB. Ytterligere detaljert analyse er nødvendig for å teste denne hypotesen, da BSCFB-ruten også kan være involvert. Når man sammenligner aminosyresekvensen til den mest berikede klonen (#2002) med andre utvalgte peptider, ble det bemerket at noen av dem har lignende aminosyreutvidelser, noe som kan indikere en lignende transportmekanisme (fig. 3f).
På grunn av sin unike plasmaprofil og signifikante økning i CSF over tid, ble fagdisplayklon #2077 videre utforsket over en lengre periode på 48 timer og var i stand til å reprodusere den raske økningen i CSF observert i forbindelse med vedvarende SA-nivåer (fig. 4a). Når det gjelder andre identifiserte fagkloner, farget #2077 sterkt for hjernekapillærer og viste signifikant kolokalisering med kapillærmarkørlektin sett på i høyere oppløsning og muligens noe farging i parenkymale rom (figur 4b). For å undersøke om peptidmedierte farmakologiske effekter kunne oppnås i CNS, utførte vi et eksperiment der biotinylerte versjoner av i) #2077 transitpeptidet og ii) BACE1-hemmerpeptidet ble blandet med SA i to forskjellige forhold. For den ene kombinasjonen brukte vi bare BACE1-peptidhemmeren, og for den andre brukte vi et 1:3-forhold av BACE1-peptidhemmer til #2077-peptid. Begge prøvene ble administrert intravenøst, og nivåene av beta-amyloidpeptid 40 (Abeta40) i blod og cerebrospinalvæske ble målt over tid. Abeta40 ble målt i CSF, da det reflekterer BACE1-hemming i hjerneparenkymet. Som forventet reduserte begge kompleksene blodnivåene av Abeta40 betydelig (fig. 4c, d). Imidlertid forårsaket bare prøver som inneholdt en blanding av peptid nr. 2077 og en hemmer av BACE1-peptidet konjugert til SA en signifikant reduksjon i Abeta40 i cerebrospinalvæsken (fig. 4c). Dataene viser at peptid nr. 2077 er i stand til å transportere 60 kDa SA-proteinet inn i CNS og også induserer farmakologiske effekter med SA-konjugerte hemmere av BACE1-peptidet.
(a) Klonal injeksjon (2 × 10 fager/dyr) av T7-fag som viser langsiktige farmakokinetiske profiler av CSF-peptid #2077 (RLSSVDSDLSGC) og uinjisert kontrollfag (#1779) i minst tre CM-intuberte rotter. (b) Konfokalmikroskopisk bilde av representative kortikale mikrokar i faginjiserte rotter (2 × 10 10 fager/dyr) som viser motfarging av peptid #2077 og kar (lektin). Disse fagklonene ble administrert til 3 rotter og fikk sirkulere i 1 time før perfusjon. Hjerner ble seksjonert og farget med polyklonale FITC-merkede antistoffer mot T7-fagkapsidet. Ti minutter før perfusjon og påfølgende fiksering ble DyLight594-merket lektin administrert intravenøst. Fluorescerende bilder som viser lektinfarging (rød) av den luminale siden av mikrokar og fager (grønn) i lumen av kapillærer og perivaskulært hjernevev. Skalalinjen tilsvarer 10 µm. (c, d) Biotinylert BACE1-hemmende peptid alene eller i kombinasjon med biotinylert transittpeptid #2077 ble koblet til streptavidin, etterfulgt av intravenøs injeksjon av minst tre kanulerte CM-rotter (10 mg streptavidin/kg). BACE1-peptidhemmermediert reduksjon i Aβ40 ble målt ved Aβ1-40 ELISA i blod (rødt) og cerebrospinalvæske (oransje) på de angitte tidspunktene. For bedre klarhet er det tegnet en stiplet linje på grafen i en skala fra 100 %. (c) Prosentvis reduksjon i Aβ40 i blod (røde trekanter) og cerebrospinalvæske (oransje trekanter) hos rotter behandlet med streptavidin konjugert til transittpeptid #2077 og BACE1-hemmende peptid i et 3:1-forhold. (d) Prosentvis reduksjon i blod Aβ40 (røde sirkler) og cerebrospinalvæske (oransje sirkler) hos rotter behandlet med kun streptavidin koblet til et BACE1-hemmende peptid. Aβ-konsentrasjonen i kontrollen var 420 pg/ml (standardavvik = 101 pg/ml).
Fagdisplay har blitt brukt med hell innen flere områder innen biomedisinsk forskning17. Denne metoden har blitt brukt til in vivo-studier av vaskulær diversitet18,19, så vel som studier rettet mot hjernekar20,21,22,23,24,25,26. I denne studien utvidet vi anvendelsen av denne seleksjonsmetoden ikke bare til direkte identifisering av peptider rettet mot hjernekar, men også til oppdagelsen av kandidater med aktive transportegenskaper for å krysse blod-hjerne-barrieren. Vi beskriver nå utviklingen av en in vivo-seleksjonsprosedyre i CM-intuberte rotter og demonstrerer dens potensial til å identifisere peptider med CSF-homingegenskaper. Ved å bruke T7-fagen som viser et bibliotek av 12-mer tilfeldige peptider, kunne vi demonstrere at T7-fagen er liten nok (omtrent 60 nm i diameter)10 til å tilpasses blod-hjerne-barrieren, og dermed krysse blod-hjerne-barrieren eller choroid plexus direkte. Vi observerte at CSF-høsting fra kanulerte CM-rotter var en velkontrollert in vivo funksjonell screeningsmetode, og at den ekstraherte fagen ikke bare bandt seg til vaskulaturen, men også fungerte som en transportør over blod-hjerne-barrieren. Ved å samtidig samle blod og påføre HTS på CSF og blodavledede fager, bekreftet vi videre at vårt valg av CSF ikke var påvirket av blodberikelse eller egnethet for ekspansjon mellom seleksjonsrunder. Blodkammeret er imidlertid en del av seleksjonsprosedyren, siden fager som er i stand til å nå CSF-kammeret må overleve og sirkulere i blodet lenge nok til å berike seg selv i hjernen. For å trekke ut pålitelig sekvensinformasjon fra rå HTS-data implementerte vi filtre tilpasset plattformspesifikke sekvenseringsfeil i analysearbeidsflyten. Ved å innlemme kinetiske parametere i screeningmetoden bekreftet vi den raske farmakokinetikken til villtype T7-fager (t½ ~ 28 min) i blod24, 27, 28 og bestemte også halveringstiden deres i cerebrospinalvæske (t½ ~ 26 min) per minutt. Til tross for lignende farmakokinetiske profiler i blod og cerebrospinalvæske (CSF), kunne bare 0,001 % av blodkonsentrasjonen av fag påvises i CSF, noe som indikerer lav bakgrunnsmobilitet av villtype T7-fag over blod-hjerne-barrieren. Dette arbeidet fremhever viktigheten av den første seleksjonsrunden når man bruker in vivo-panoreringsstrategier, spesielt for fagsystemer som raskt fjernes fra sirkulasjonen, ettersom få kloner er i stand til å nå CNS-kompartmentet. I den første runden var dermed reduksjonen i biblioteksmangfold svært stor, ettersom bare et begrenset antall kloner til slutt ble samlet inn i denne svært strenge CSF-modellen. Denne in vivo-panoreringsstrategien inkluderte flere seleksjonstrinn, som aktiv akkumulering i CSF-kompartmentet, klonoverlevelse i blodkompartmentet og rask fjerning av T7-fagkloner fra blodet i løpet av de første 10 minuttene (fig. 1d og tilleggsfig. 4M). Etter den første runden ble dermed forskjellige fagkloner identifisert i CSF, selv om den samme initiale poolen ble brukt for individuelle dyr. Dette tyder på at flere strenge seleksjonstrinn for kildebiblioteker med et stort antall bibliotekmedlemmer resulterer i en betydelig reduksjon i mangfold. Derfor vil tilfeldige hendelser bli en integrert del av den første seleksjonsprosessen, noe som i stor grad påvirker resultatet. Det er sannsynlig at mange av klonene i det opprinnelige biblioteket hadde en veldig lik CSF-anrikningstilbøyelighet. Selv under de samme eksperimentelle forholdene kan imidlertid seleksjonsresultatene variere på grunn av det lille antallet av hver enkelt klon i den første poolen.
Motivene som er beriket i CSF, skiller seg fra de i blodet. Interessant nok observerte vi det første skiftet mot glysinrike peptider i blodet til individuelle dyr. (Fig. 1g, tilleggsfigurer 4e, 4f). Fager som inneholder glysinpeptider kan være mer stabile og mindre sannsynlig å bli tatt ut av sirkulasjon. Imidlertid ble ikke disse glysinrike peptidene påvist i cerebrospinalvæskeprøvene, noe som tyder på at de kuraterte bibliotekene gikk gjennom to forskjellige seleksjonstrinn: ett i blodet og et annet som fikk akkumulere seg i cerebrospinalvæsken. CSF-berikede kloner som følge av den fjerde seleksjonsrunden har blitt grundig testet. Nesten alle de individuelt testede klonene ble bekreftet å være beriket i CSF sammenlignet med blank kontrollfag. Ett peptidtreff (#2077) ble undersøkt mer detaljert. Det viste en lengre plasmahalveringstid sammenlignet med andre treff (figur 3d og tilleggsfigur 7), og interessant nok inneholdt dette peptidet en cysteinrest ved C-terminalen. Det har nylig blitt vist at tilsetning av cystein til peptider kan forbedre deres farmakokinetiske egenskaper ved å binde seg til albumin 29. Dette er for øyeblikket ukjent for peptid #2077 og krever videre studier. Noen peptider viste en valensavhengighet i CSF-anrikning (data ikke vist), som kan være relatert til den viste overflategeometrien til T7-kapsidet. T7-systemet vi brukte viste 5–15 kopier av hvert peptid per fagpartikkel. IHC ble utført på kandidat-ledende fagkloner injisert intravenøst ​​i hjernebarken hos rotter (tilleggsfigur 8). Dataene viste at minst tre kloner (nr. 2002, nr. 2009 og nr. 2077) interagerte med BBB. Det gjenstår å avgjøre om denne BBB-interaksjonen resulterer i akkumulering av CSF eller bevegelse av disse klonene direkte til BCSFB. Viktigere er at vi viser at de utvalgte peptidene beholder sin CSF-transportkapasitet når de syntetiseres og bindes til proteinlasten. Binding av N-terminale biotinylerte peptider til SA gjentar i hovedsak resultatene oppnådd med deres respektive fagkloner i blod og cerebrospinalvæske (fig. 3e). Til slutt viser vi at hovedpeptid #2077 er i stand til å fremme hjerneaktiviteten til en biotinylert peptidhemmer av BACE1 konjugert til SA, noe som forårsaker uttalte farmakodynamiske effekter i CNS ved å redusere Abeta40-nivåene i CSF betydelig (fig. 4). Vi klarte ikke å identifisere noen homologer i databasen ved å utføre et peptidsekvenshomologisøk av alle treff. Det er viktig å merke seg at størrelsen på T7-biblioteket er omtrent 109, mens den teoretiske bibliotekstørrelsen for 12-merer er 4 x 1015. Derfor valgte vi bare en liten brøkdel av mangfoldsrommet til 12-mer-peptidbiblioteket, noe som kan bety at mer optimaliserte peptider kan identifiseres ved å evaluere det tilstøtende sekvensrommet til disse identifiserte treffene. Hypotetisk sett kan en av grunnene til at vi ikke har funnet noen naturlige homologer av disse peptidene være deseleksjon under evolusjonen for å forhindre ukontrollert inntreden av visse peptidmotiver i hjernen.
Samlet sett gir resultatene våre et grunnlag for fremtidig arbeid for å identifisere og karakterisere transportsystemene til den cerebrovaskulære barrieren in vivo mer detaljert. Det grunnleggende oppsettet for denne metoden er basert på en funksjonell seleksjonsstrategi som ikke bare identifiserer kloner med cerebrale vaskulære bindingsegenskaper, men som også inkluderer et kritisk trinn der vellykkede kloner har iboende aktivitet til å krysse biologiske barrierer in vivo inn i CNS-rommet. Målet er å belyse transportmekanismen for disse peptidene og deres preferanse for binding til mikrovaskulaturen spesifikk for hjerneområdet. Dette kan føre til oppdagelsen av nye veier for transport av BBB og reseptorer. Vi forventer at de identifiserte peptidene kan binde seg direkte til cerebrovaskulære reseptorer eller til sirkulerende ligander transportert gjennom BBB eller BCSFB. Peptidvektorene med CSF-transportaktivitet oppdaget i dette arbeidet vil bli videre undersøkt. Vi undersøker for tiden hjernespesifisiteten til disse peptidene for deres evne til å krysse BBB og/eller BCSFB. Disse nye peptidene vil være ekstremt verdifulle verktøy for potensiell oppdagelse av nye reseptorer eller signalveier og for utvikling av nye, svært effektive plattformer for levering av makromolekyler, som biologiske legemidler, til hjernen.
Kanuler den store cisterna (CM) ved hjelp av en modifikasjon av den tidligere beskrevne metoden. Bedøvede Wistar-rotter (200-350 g) ble montert på et stereotaksisk apparat, og et mediansnitt ble gjort over den barberte og aseptisk preparerte hodebunnen for å eksponere hodeskallen. Bor to hull i området rundt den øvre rammen og fest festeskruene i hullene. Et ekstra hull ble boret i den laterale occipitalkammen for stereotaktisk føring av en rustfri stålkanyle inn i CM. Påfør dental sement rundt kanylen og fest med skruer. Etter fotoherding og sementherding ble hudsåret lukket med 4/0 supramidsutur. Riktig plassering av kanylen bekreftes ved spontan lekkasje av cerebrospinalvæske (CSF). Fjern rotten fra det stereotaksiske apparatet, motta passende postoperativ behandling og smertebehandling, og la den komme seg i minst én uke til tegn på blod observeres i cerebrospinalvæsken. Wistar-rotter (Crl:WI/Han) ble hentet fra Charles River (Frankrike). Alle rottene ble holdt under spesifikke patogenfrie forhold. Alle dyreforsøkene ble godkjent av veterinærkontoret i byen Basel, Sveits, og ble utført i samsvar med dyrelisens nr. 2474 (vurdering av aktiv hjernetransport ved å måle nivåer av terapeutiske kandidater i cerebrospinalvæsken og hjernen til rotter).
Hold rotten forsiktig bevisst med CM-kanylen i hånden. Fjern Datura fra kanylen og samle 10 µl spontant rennende cerebrospinalvæske. Siden kanylens åpenhet til slutt ble kompromittert, ble kun klare cerebrospinalvæskeprøver uten tegn til blodforurensning eller misfarging inkludert i denne studien. Parallelt ble omtrent 10–20 µl blod tatt fra et lite snitt på halespissen og inn i rør med heparin (Sigma-Aldrich). CSF og blod ble samlet inn på forskjellige tidspunkter etter intravenøs injeksjon av T7-fag. Omtrent 5–10 µl væske ble kastet før hver CSF-prøve ble samlet inn, noe som tilsvarer kateterets dødvolum.
Biblioteker ble generert ved bruk av T7Select 10-3b-vektoren som beskrevet i T7Select-systemmanualen (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Kort fortalt ble et tilfeldig 12-mer DNA-innlegg syntetisert i følgende format:
NNK-kodonet ble brukt for å unngå dobbeltstoppkodoner og overekspresjon av aminosyrer i innsatsen. N er et manuelt blandet ekvimolart forhold mellom hvert nukleotid, og K er et manuelt blandet ekvimolart forhold mellom adenin- og cytosinnukleotider. Enkelttrådete regioner ble omdannet til dobbelttrådet DNA ved videre inkubasjon med dNTP (Novagen) og Klenow-enzym (New England Biolabs) i Klenow-buffer (New England Biolabs) i 3 timer ved 37 °C. Etter reaksjonen ble dobbelttrådet DNA gjenvunnet ved EtOH-utfelling. Det resulterende DNA-et ble spaltet med restriksjonsenzymene EcoRI og HindIII (begge fra Roche). Det spaltede og rensede (QIAquick, Qiagen) innsatsen (T4-ligase, New England Biolabs) ble deretter ligert in-frame inn i en forhåndsspaltet T7-vektor etter aminosyre 348 i 10B-kapsidgenet. Ligeringsreaksjoner ble inkubert ved 16 °C i 18 timer før in vitro-pakking. Fagpakking in vitro ble utført i henhold til instruksjonene som fulgte med T7Select 10-3b kloningssettet (Novagen), og pakkeløsningen ble amplifisert én gang til lysis ved bruk av Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lysatene ble sentrifugert, titrert og frosset ved -80 °C som en stamløsning av glyserol.
Direkte PCR-amplifisering av fagvariable regioner amplifisert i buljong eller plate ved bruk av proprietære 454/Roche-amplikon-fusjonsprimere. Fremoverfusjonsprimeren inneholder sekvenser som flankerer den variable regionen (NNK) 12 (malspesifikk), GS FLX Titanium Adapter A og en firebasebiblioteknøkkelsekvens (TCAG) (tilleggsfigur 1a):
Reversfusjonsprimeren inneholder også biotin festet til fangstkuler og GS FLX Titanium Adapter B som kreves for klonal amplifisering under emulsjons-PCR:
Amplikonene ble deretter utsatt for 454/Roche-pyrosekvensering i henhold til 454 GS-FLX Titanium-protokollen. For manuell Sanger-sekvensering (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) ble T7-fag-DNA amplifisert ved PCR og sekvensert med følgende primerpar:
Innsatser fra individuelle plakker ble utsatt for PCR-amplifisering ved bruk av Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (i henhold til produsentens instruksjoner). Utfør en varmstart (10 min ved 95 °C) og 35 boost-sykluser (50 s ved 95 °C, 1 min ved 50 °C og 1 min ved 72 °C).
Fag fra biblioteker, villtype-fag, fag reddet fra CSF og blod, eller individuelle kloner ble amplifisert i Escherichia coli BL5615 i TB-buljong (Sigma Aldrich) eller i 500 cm2-skåler (Thermo Scientific) i 4 timer ved 37 °C. Fag ble ekstrahert fra platene ved å skylle platene med Tris-EDTA-buffer (Fluka Analytical) eller ved å samle plakkene med sterile pipettespisser. Fag ble isolert fra kultursupernatant eller ekstraksjonsbuffer med én runde polyetylenglykol (PEG 8000)-utfelling (Promega) og resuspendert i Tris-EDTA-buffer.
Den amplifiserte fagen ble utsatt for 2–3 runder med endotoksinfjerning ved bruk av endotoksinfjerningskuler (Miltenyi Biotec) før intravenøs (IV) injeksjon (500 μl/dyr). I den første runden ble 2×1012 fager introdusert; i den andre 2×1010 fager; i den tredje og fjerde seleksjonsrunden 2×109 fager per dyr. Faginnholdet i CSF- og blodprøver samlet inn på de angitte tidspunktene ble bestemt ved plakktelling i henhold til produsentens instruksjoner (T7Select-systemmanual). Fagseleksjon ble utført ved intravenøs injeksjon av rensede biblioteker i halevenen eller ved reinjeksjon av fag ekstrahert fra CSF fra forrige seleksjonsrunde, og påfølgende høstinger ble utført etter henholdsvis 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min og 240 min i CSF- og blodprøver. Totalt fire runder med in vivo-panning ble utført, der de to utvalgte grenene ble lagret og analysert separat i løpet av de tre første seleksjonsrundene. Alle faginnsatser ekstrahert fra CSF fra de to første seleksjonsrundene ble utsatt for 454/Roche-pyrosekvensering, mens alle kloner ekstrahert fra CSF fra de to siste seleksjonsrundene ble manuelt sekvensert. Alle blodfager fra den første seleksjonsrunden ble også utsatt for 454/Roche-pyrosekvensering. For injeksjon av fagkloner ble utvalgte fager amplifisert i E. coli (BL5615) på 500 cm2-plater ved 37 °C i 4 timer. Individuelt utvalgte og manuelt sekvenserte kloner ble formert i TB-medium. Etter fagekstraksjon, rensing og fjerning av endotoksin (som beskrevet ovenfor), ble 2 × 1010 fager/dyr i 300 μl injisert intravenøst ​​i en halevene.
Forbehandling og kvalitativ filtrering av sekvensdata. Rå 454/Roche-data ble konvertert fra et binært standard strømningskartformat (sff) til et Pearson human readable format (fasta) ved hjelp av leverandørprogramvare. Videre behandling av nukleotidsekvensen ble utført ved hjelp av proprietære C-programmer og skript (ikke utgitt programvarepakke) som beskrevet nedenfor. Analysen av primærdata inkluderer strenge flertrinns filtreringsprosedyrer. For å filtrere ut avlesninger som ikke inneholdt en gyldig 12mer-innsatt DNA-sekvens, ble avlesningene sekvensielt justert til startmerkelapp (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stoppmerkelapp (TAAGCTTGGGCCGCACTCGAGTA) og bakgrunnsinnsatt (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ved hjelp av den globale Needleman-Wunsch-testen. Justering som tillater opptil 2 inkonsekvenser per justering31. Derfor ble avlesninger uten start- og stoppkoder og avlesninger som inneholder bakgrunnsinnsett, dvs. justeringer som overskrider det tillatte antallet uoverensstemmelser, fjernet fra biblioteket. Når det gjelder de resterende avlesningene, ble N-mer DNA-sekvensen som strekker seg fra startmerket og slutter før stoppmerket, fjernet fra den opprinnelige avlesningssekvensen og videre bearbeidet (heretter referert til som «innsats»). Etter translasjon av innsatsen fjernes delen etter det første stoppkodonet ved 5'-enden av primeren fra innsatsen. I tillegg ble nukleotider som fører til ufullstendige kodoner ved 3'-enden av primeren også fjernet. For å ekskludere innsatser som kun inneholder bakgrunnssekvenser, ble translaterte innsatser som begynner med aminosyremønsteret «PAG» også fjernet. Peptider med en posttranslasjonslengde på mindre enn 3 aminosyrer ble fjernet fra biblioteket. Til slutt fjernes redundans i innsatspoolen og frekvensen til hvert unike innsats bestemmes. Resultatene av denne analysen inkluderte en liste over nukleotidsekvenser (innsatser) og deres (avlesnings)frekvenser (tilleggsfigur 1c og 2).
Grupper N-mer DNA-innsatser etter sekvenslikhet: For å eliminere 454/Roche-spesifikke sekvenseringsfeil (som problemer med sekvensering av homopolymerutvidelser) og fjerne mindre viktige redundanser, sorteres tidligere filtrerte N-mer DNA-sekvensinnsatser (innsatser) etter likhet. Innsatser (opptil 2 ikke-samsvarende baser tillatt) ved hjelp av en iterativ algoritme definert som følger: innsatser sorteres først etter frekvens (høyest til lavest), og hvis de er like, etter sekundær sortering etter lengde (lengst til kortest). Dermed definerer de hyppigste og lengste innsatsene den første "gruppen". Gruppefrekvensen settes til nøkkelfrekvensen. Deretter ble hvert innsats som var igjen i den sorterte listen forsøkt lagt til gruppen ved parvis Needleman-Wunsch-justering. Hvis antallet uoverensstemmelser, innsatser eller slettinger i en justering ikke overstiger en terskel på 2, legges et innsats til gruppen, og den totale gruppefrekvensen økes med hvor ofte innsatsen ble lagt til. Innsatser som legges til i en gruppe merkes som brukt og ekskluderes fra videre behandling. Hvis innsettingssekvensen ikke kan legges til en allerede eksisterende gruppe, brukes innsettingssekvensen til å opprette en ny gruppe med riktig innsettingsfrekvens og merkes som brukt. Iterasjonen avsluttes når hver innsettingssekvens enten har blitt brukt til å danne en ny gruppe eller kan inkluderes i en allerede eksisterende gruppe. Tross alt blir grupperte innsettinger bestående av nukleotider til slutt oversatt til peptidsekvenser (peptidbiblioteker). Resultatet av denne analysen er et sett med innsettinger og deres tilsvarende frekvenser som utgjør antallet påfølgende avlesninger (tilleggsfigur 2).
Motivgenerering: Basert på en liste over unike peptider ble det opprettet et bibliotek som inneholder alle mulige aminosyremønstre (aa) som vist nedenfor. Hvert mulig mønster med lengde 3 ble ekstrahert fra peptidet, og dets inverse mønster ble lagt til sammen med et felles motivbibliotek som inneholder alle mønstre (tripeptider). Biblioteker med svært repeterende motiver ble sekvensert, og redundans ble fjernet. Deretter sjekket vi for hvert tripeptid i motivbiblioteket for dets tilstedeværelse i biblioteket ved hjelp av beregningsverktøy. I dette tilfellet legges frekvensen til peptidet som inneholder det funnet motivtripeptidet til og tilordnes motivet i motivbiblioteket («antall motiver»). Resultatet av motivgenereringen er en todimensjonal matrise som inneholder alle forekomster av tripeptider (motiver) og deres respektive verdier, som er antallet sekvenseringsavlesninger som resulterer i det tilsvarende motivet når avlesningene filtreres, grupperes og oversettes. Målinger som beskrevet i detalj ovenfor.
Normalisering av antall motiver og tilhørende spredningsplott: Antall motiver for hvert utvalg ble normalisert ved hjelp av
hvor ni er antall avlesninger som inneholder emne i. Dermed representerer vi prosentvis frekvens av avlesninger (eller peptider) som inneholder motiv i i utvalget. P-verdier for det ikke-normaliserte antallet motiver ble beregnet ved hjelp av Fishers eksakte test. Når det gjelder korrelogrammer av antall motiver, ble Spearmans korrelasjoner beregnet ved hjelp av det normaliserte antallet motiver med R.
For å visualisere innholdet av aminosyrer i hver posisjon i peptidbiblioteket ble weblogogrammer 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) opprettet. Først lagres innholdet av aminosyrer i hver posisjon av 12-mer-peptidet i en 20×12-matrise. Deretter genereres et sett med 1000 peptider som inneholder det samme relative aminosyreinnholdet i hver posisjon i fasta-sekvensformat og gis som input til weblogo 3, som genererer en grafisk fremstilling av det relative aminosyreinnholdet i hver posisjon for et gitt peptidbibliotek. For å visualisere flerdimensjonale datasett ble varmekart opprettet ved hjelp av et internt utviklet verktøy i R (biosHeatmap, en ennå ikke utgitt R-pakke). Dendrogrammene som presenteres i varmekartene ble beregnet ved hjelp av Wards hierarkiske klyngemetode med den euklidske avstandsmetrikken. For statistisk analyse av motivscoringsdata ble P-verdier for unormalisert scoring beregnet ved hjelp av Fishers eksakte test. P-verdier for andre datasett ble beregnet i R ved hjelp av Student's t-test eller ANOVA.
Utvalgte fagkloner og fager uten innsatser ble injisert intravenøst ​​via halevenen (2 × 1010 fager/dyr i 300 μl PBS). Ti minutter før perfusjon og påfølgende fiksering ble de samme dyrene intravenøst ​​injisert med 100 μl DyLight594-merket lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minutter etter faginjeksjon ble rottene perfusert gjennom hjertet med 50 ml PBS etterfulgt av 50 ml 4 % PFA/PBS. Hjerneprøver ble i tillegg fiksert over natten i 4 % PFA/PBS og bløtlagt i 30 % sukrose over natten ved 4 °C. Prøvene fryses raskt i OCT-blandingen. Immunhistokjemisk analyse av frosne prøver ble utført ved romtemperatur på 30 µm kryosnitt blokkert med 1 % BSA og inkubert med polyklonale FITC-merkede antistoffer mot T7-fag (Novus NB 600-376A) ved 4 °C. Inkuber over natten. Til slutt ble snittene vasket tre ganger med PBS og undersøkt med et konfokalt lasermikroskop (Leica TCS SP5).
Alle peptider med en minimumsrenhet på 98 % ble syntetisert av GenScript USA, biotinylert og frysetørket. Biotin er bundet via en ekstra trippel glycin-spacer ved N-terminalen. Sjekk alle peptider ved hjelp av massespektrometri.
Streptavidin (Sigma S0677) ble blandet med et 5 ganger ekvimolart overskudd av biotinylert peptid, biotinylert BACE1-hemmende peptid, eller en kombinasjon (forhold 3:1) av biotinylert BACE1-hemmende peptid og BACE1-hemmende peptid i 5–10 % DMSO/inkubert i PBS. 1 time ved romtemperatur før injeksjon. Streptavidin-konjugerte peptider ble injisert intravenøst ​​i en dose på 10 mg/kg i en av halevenene hos rotter med hjernehule.
Konsentrasjonen av streptavidin-peptidkomplekser ble vurdert ved hjelp av ELISA. Nunc Maxisorp mikrotiterplater (Sigma) ble belagt over natten ved 4 °C med 1,5 μg/ml mus-anti-streptavidin-antistoff (Thermo, MA1-20011). Etter blokkering (blokkeringsbuffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % gelatin, 1 % BSA) ved romtemperatur i 2 timer, vasket platen med 0,05 % Tween-20/PBS (vaskebuffer) i 3 sekunder. CSF- og plasmaprøver ble tilsatt brønner fortynnet med blokkeringsbuffer (plasma 1:10 000, CSF 1:115). Platen ble deretter inkubert over natten ved 4 °C med deteksjonsantistoff (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Etter tre vasketrinn ble streptavidin detektert ved inkubasjon i TMB-substratløsning (Roche) i opptil 20 minutter. Etter at fargeutviklingen ble stoppet med 1 M H2SO4, måles absorbansen ved 450 nm.
Funksjonen til streptavidin-peptid-BACE1-hemmerkomplekset ble vurdert ved Aβ(1-40) ELISA i henhold til produsentens protokoll (Wako, 294-64701). Kort fortalt ble CSF-prøver fortynnet i standardfortynningsmiddel (1:23) og inkubert over natten ved 4 °C i 96-brønnsplater belagt med BNT77-fangstantistoff. Etter fem vasketrinn ble HRP-konjugert BA27-antistoff tilsatt og inkubert i 2 timer ved 4 °C, etterfulgt av fem vasketrinn. Aβ(1–40) ble detektert ved inkubasjon i TMB-løsning i 30 minutter ved romtemperatur. Etter at fargeutviklingen er stoppet med stoppløsning, måles absorbansen ved 450 nm. Plasmaprøvene ble utsatt for fastfaseekstraksjon før Aβ(1–40) ELISA. Plasma ble tilsatt 0,2 % DEA (Sigma) i 96-brønnsplater og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Etter suksessiv vasking av SPE-platene (Oasis, 186000679) med vann og 100 % metanol, ble plasmaprøver tilsatt SPE-platene og all væske ble fjernet. Prøvene ble vasket (først med 5 % metanol, deretter 30 % metanol) og eluert med 2 % NH4OH/90 % metanol. Etter tørking av eluatet ved 55 °C i 99 minutter ved konstant N2-strøm, ble prøvene redusert i standardfortynningsmidler, og Aβ(1–40) ble målt som beskrevet ovenfor.
Slik siterer du denne artikkelen: Urich, E. et al. Lastlevering til hjernen ved bruk av transittpeptider identifisert in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB og Moos T. Tilførsel av makromolekylære legemidler til hjernen ved bruk av målrettet terapi. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., og Martinez-Martinez, P. Levering av peptid- og proteinlegemidler over blod-hjerne-barrieren. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Blod-hjerne-barrieren: en flaskehals i utviklingen av hjernelegemidler. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, og Byrd, A. Utsikter for forbedret medikamentlevering og målretting til hjernen via choroid plexus-CSF-banen. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisering av biofarmasøytiske produkter med molekylære trojanske hester for hjernelevering. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-reseptormediert peptidtransport over blod-hjerne-barrieren. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Øk hjernepenetrasjon og effekt av terapeutiske antistoffer ved bruk av monovalente molekylære skytteltransporter. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transferrinreseptor (TfR)-transport bestemmer hjernens opptak av affinitetsvarianter av TfR-antistoffer. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).