از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم.شما از یک نسخه مرورگر با پشتیبانی محدود CSS استفاده می کنید.برای بهترین تجربه، توصیه می کنیم از یک مرورگر به روز شده استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در اینترنت اکسپلورر غیرفعال کنید).علاوه بر این، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت نشان می‌دهیم.
چرخ فلکی از سه اسلاید را همزمان نمایش می دهد.از دکمه های قبلی و بعدی برای حرکت در سه اسلاید در یک زمان استفاده کنید یا از دکمه های لغزنده در پایان برای حرکت در سه اسلاید در یک زمان استفاده کنید.
سد خونی مغزی و سد خونی مغزی مانع از رسیدن عوامل بیوتراپی به اهداف خود در سیستم عصبی مرکزی می شود و در نتیجه مانع از درمان موثر بیماری های عصبی می شود.برای کشف ناقل‌های مغزی جدید در داخل بدن، ما یک کتابخانه پپتید فاژ T7 را معرفی کردیم و خون و مایع مغزی نخاعی (CSF) را با استفاده از یک مدل موش‌های بزرگ کانوله‌شده آگاهانه جمع‌آوری کردیم.کلون های فاژی خاص پس از چهار دور انتخاب در CSF بسیار غنی شدند.آزمایش پپتیدهای کاندید منفرد غنی سازی بیش از 1000 برابری در CSF را نشان داد.زیست فعالی تحویل با واسطه پپتید به مغز با کاهش 40 درصدی سطح آمیلوئید-β در مایع مغزی نخاعی با استفاده از یک مهارکننده پپتید BACE1 مرتبط با پپتید ترانزیت جدید شناسایی شده تأیید شد.این نتایج نشان می دهد که پپتیدهای شناسایی شده با روش های انتخاب فاژ در داخل بدن ممکن است وسایل نقلیه مفیدی برای تحویل سیستمیک ماکرومولکول ها به مغز با یک اثر درمانی باشند.
تحقیقات درمانی هدفمند سیستم عصبی مرکزی (CNS) تا حد زیادی بر شناسایی داروها و عوامل بهینه‌سازی شده‌ای متمرکز شده است که ویژگی‌های هدف‌گیری CNS را نشان می‌دهند، با تلاش کمتری برای کشف مکانیسم‌هایی که انتقال فعال دارو به مغز را هدایت می‌کنند.این در حال حاضر شروع به تغییر کرده است، زیرا تحویل دارو، به ویژه مولکول های بزرگ، بخشی جدایی ناپذیر از توسعه داروهای علوم اعصاب مدرن است.محیط سیستم عصبی مرکزی به خوبی توسط سیستم سد عروقی مغزی، متشکل از سد خونی مغزی (BBB) ​​و سد خونی مغزی (BCBB)1 محافظت می‌شود و ارسال دارو به مغز را به چالش می‌کشد.تخمین زده می شود که تقریباً تمام داروهای مولکولی بزرگ و بیش از 98 درصد داروهای مولکولی کوچک از مغز حذف می شوند.به همین دلیل است که شناسایی سیستم‌های انتقال مغز جدید که تحویل کارآمد و خاص داروهای درمانی را به CNS 4،5 ارائه می‌کنند بسیار مهم است.با این حال، BBB و BCSFB همچنین فرصتی عالی برای تحویل دارو ارائه می‌دهند، زیرا از طریق عروق گسترده آن به تمام ساختارهای مغز نفوذ کرده و وارد آن می‌شوند.بنابراین، تلاش‌های کنونی برای استفاده از روش‌های غیرتهاجمی تحویل به مغز عمدتاً مبتنی بر مکانیسم انتقال با واسطه گیرنده (PMT) با استفاده از گیرنده درون‌زا BBB6 است.علیرغم پیشرفت های کلیدی اخیر با استفاده از مسیر گیرنده ترانسفرین 7،8، توسعه بیشتر سیستم های تحویل جدید با خواص بهبود یافته مورد نیاز است.برای این منظور، هدف ما شناسایی پپتیدهایی بود که قادر به انتقال CSF هستند، زیرا در اصل می‌توان از آنها برای رساندن ماکرومولکول‌ها به CNS یا باز کردن مسیرهای گیرنده جدید استفاده کرد.به طور خاص، گیرنده ها و ناقلان خاص سیستم عروق مغزی (BBB و BSCFB) می توانند به عنوان اهداف بالقوه برای تحویل فعال و اختصاصی داروهای بیوتراپی عمل کنند.مایع مغزی نخاعی (CSF) محصول ترشحی شبکه مشیمیه (CS) است و از طریق فضای زیر عنکبوتیه و فضای بطنی در تماس مستقیم با مایع بینابینی مغز است.اخیراً نشان داده شده است که مایع مغزی نخاعی تحت عنکبوتیه بیش از حد به داخل بینابینی مغز منتشر می شود.امیدواریم با استفاده از این مجرای ورودی زیر عنکبوتیه یا مستقیماً از طریق BBB به فضای پارانشیمی دسترسی داشته باشیم.برای دستیابی به این هدف، ما یک استراتژی قوی انتخاب فاژ در داخل بدن را اجرا کردیم که به طور ایده آل پپتیدهای منتقل شده توسط هر یک از این دو مسیر مجزا را شناسایی می کند.
ما اکنون یک روش متوالی غربالگری نمایش فاژ در داخل بدن را با نمونه برداری CSF همراه با توالی یابی با توان بالا (HTS) برای نظارت بر دورهای انتخاب اولیه با بالاترین تنوع کتابخانه توصیف می کنیم.برای جلوگیری از آلودگی خون، غربالگری روی موش‌های هوشیار با یک کانول سیسترنا بزرگ (CM) کاشته شده دائمی انجام شد.نکته مهم این است که این رویکرد هم هدف گیری مغز و هم پپتیدهایی را با فعالیت حمل و نقل در سراسر سد عروق مغزی انتخاب می کند.ما از فاژهای T7 به دلیل اندازه کوچک آنها (~60 نانومتر) 10 استفاده کردیم و پیشنهاد کردیم که آنها برای حمل و نقل وزیکول هایی مناسب هستند که اجازه عبور سلولی از سد اندوتلیال و/یا اپیتلیال-مدولا را می دهند.پس از چهار دور پاننگ، جمعیت فاژ جداسازی شد که غنی‌سازی CSF در داخل بدن و ارتباط ریزرگ‌های مغزی را نشان می‌داد.مهمتر از همه، ما توانستیم یافته های خود را با نشان دادن اینکه بهترین پپتیدهای کاندید ترجیحی و سنتز شده شیمیایی می توانند محموله پروتئین را به مایع مغزی نخاعی منتقل کنند تأیید کنیم.اول، اثرات فارماکودینامیک CNS با ترکیب یک پپتید ترانزیت پیشرو با یک مهارکننده پپتید BACE1 ایجاد شد.علاوه بر نشان دادن اینکه استراتژی‌های غربالگری عملکردی in vivo می‌توانند پپتیدهای جدید انتقال مغز را به عنوان حامل‌های پروتئینی مؤثر شناسایی کنند، انتظار داریم رویکردهای انتخاب عملکردی مشابه نیز در شناسایی مسیرهای جدید حمل و نقل مغز مهم شوند.
بر اساس واحدهای تشکیل پلاک (PFU)، پس از مرحله بسته‌بندی فاژ، کتابخانه‌ای از پپتیدهای فاژ T7 خطی 12 متری تصادفی با تنوع تقریباً 109 طراحی و ایجاد شد (مواد و روش‌ها را ببینید).توجه به این نکته مهم است که ما قبل از پاننگ در داخل بدن به دقت این کتابخانه را تجزیه و تحلیل کردیم.تکثیر PCR نمونه های کتابخانه فاژ با استفاده از پرایمرهای اصلاح شده آمپلیکون هایی تولید کرد که مستقیماً برای HTS قابل استفاده بودند (شکل تکمیلی 1a).به دلیل الف) خطاهای توالی یابی HTS11، ب) تأثیر بر کیفیت پرایمرها (NNK) 1-12، و ج) وجود فاژ نوع وحشی (wt) (درج های اسکلت) در کتابخانه آماده به کار، یک روش فیلترینگ توالی برای استخراج فقط اطلاعات توالی تأیید شده اجرا شد (شکل تکمیلی 1b).این مراحل فیلتر برای تمام کتابخانه های توالی HTS اعمال می شود.برای کتابخانه استاندارد، در مجموع 233868 مطالعه به دست آمد که 39٪ آنها معیارهای فیلتر را پاس کردند و برای تجزیه و تحلیل کتابخانه و انتخاب برای دورهای بعدی استفاده شدند (شکل تکمیلی 1c-e).قرائت ها عمدتاً مضرب 3 جفت باز در طول با حداکثر 36 نوکلئوتید بودند (شکل تکمیلی 1c)، که طرح کتابخانه (NNK) 1-12 را تأیید می کند.قابل ذکر است، تقریباً 11٪ از اعضای کتابخانه حاوی یک درج PAGISRELVDKL از نوع وحشی (wt) 12 بعدی بودند و تقریباً نیمی از دنباله ها (49٪) حاوی درج یا حذف بودند.HTS کتابخانه کتابخانه تنوع بالای پپتیدها را در کتابخانه تأیید کرد: بیش از 81 درصد از توالی های پپتیدی فقط یک بار یافت شد و تنها 1.5 درصد در بیش از 4 نسخه رخ داد (شکل تکمیلی 2a).فرکانس اسیدهای آمینه (aa) در تمام 12 موقعیت موجود در مجموعه به خوبی با فرکانس های مورد انتظار برای تعداد کدون های تولید شده توسط مخزن NKK منحط همبستگی دارد (شکل تکمیلی 2b).فرکانس مشاهده شده باقیمانده‌های aa کدگذاری شده توسط این درج‌ها به خوبی با فرکانس محاسبه‌شده (r = 0.893) همبستگی دارد (شکل تکمیلی 2c).آماده سازی کتابخانه های فاژ برای تزریق شامل مراحل تکثیر و حذف اندوتوکسین می باشد.قبلا نشان داده شده بود که این به طور بالقوه تنوع کتابخانه های فاژ را کاهش می دهد 12،13.بنابراین، ما یک کتابخانه فاژ تقویت شده با صفحه که تحت حذف اندوتوکسین قرار گرفته بود، توالی یابی کردیم و آن را با کتابخانه اصلی برای تخمین فراوانی AA مقایسه کردیم.یک همبستگی قوی (r = 0.995) بین مخزن اصلی و استخر تقویت شده و خالص شده مشاهده شد (تصویر تکمیلی 2d)، که نشان می دهد رقابت بین کلون های تقویت شده روی صفحات با استفاده از فاژ T7 باعث سوگیری عمده نمی شود.این مقایسه بر اساس فراوانی موتیف‌های تری پپتیدی در هر کتابخانه است، زیرا تنوع کتابخانه‌ها (~ 109) حتی با HTS نمی‌تواند به طور کامل ثبت شود.تجزیه و تحلیل فرکانس aa در هر موقعیت یک سوگیری کوچک وابسته به موقعیت را در سه موقعیت آخر فهرست وارد شده نشان داد (شکل تکمیلی 2e).در نتیجه، به این نتیجه رسیدیم که کیفیت و تنوع کتابخانه قابل قبول است و تنها تغییرات جزئی در تنوع به دلیل تقویت و آماده سازی کتابخانه های فاژ بین چندین دور انتخاب مشاهده شد.
نمونه‌برداری سریالی مایع مغزی نخاعی را می‌توان با کاشت یک کانول در CM موش‌های هوشیار برای تسهیل شناسایی فاژ T7 که به صورت داخل وریدی (IV) از طریق BBB و/یا BCSFB تزریق می‌شود، انجام داد (شکل 1a-b).ما از دو بازوی انتخاب مستقل (بازوهای A و B) در سه دور اول انتخاب in vivo استفاده کردیم (شکل 1c).ما به تدریج شدت انتخاب را با کاهش مقدار کل فاژ معرفی شده در سه دور اول انتخاب افزایش دادیم.برای دور چهارم پانینگ، نمونه‌هایی از شاخه‌های A و B را با هم ترکیب کردیم و سه انتخاب مستقل دیگر انجام دادیم.برای مطالعه خواص درون تنی ذرات فاژ T7 در این مدل، فاژ نوع وحشی (PAGISRELVDKL master insert) از طریق ورید دم به موش‌ها تزریق شد.بازیابی فاژها از مایع مغزی نخاعی و خون در مقاطع زمانی مختلف نشان داد که فاژهای ایکوساهدرال T7 نسبتاً کوچک فاز پاکسازی اولیه سریع از محفظه خون داشتند (شکل تکمیلی 3).بر اساس تیترهای تجویز شده و حجم خون موش ها، ما محاسبه کردیم که تنها حدود 1٪ وزنی است.فاژ از دوز تجویز شده در خون 10 دقیقه پس از تزریق داخل وریدی تشخیص داده شد.پس از این کاهش سریع اولیه، کلیرانس اولیه کندتر با نیمه عمر 27.7 دقیقه اندازه گیری شد.نکته مهم این است که فقط تعداد بسیار کمی از فاژها از محفظه CSF بازیابی شدند که نشان دهنده پس زمینه کم مهاجرت فاژهای نوع وحشی به داخل محفظه CSF است (شکل تکمیلی 3).به طور متوسط، تنها حدود 1 × 10-3 درصد از فاژ T7 در خون و 4 × 10-8 درصد از فاژهای تزریق شده اولیه در مایع مغزی نخاعی در کل دوره نمونه برداری (0-250 دقیقه) شناسایی شد.قابل ذکر است، نیمه عمر (25.7 دقیقه) فاژ نوع وحشی در مایع مغزی نخاعی مشابه با خون مشاهده شده بود.این داده‌ها نشان می‌دهند که سد جداکننده محفظه CSF از خون در موش‌های کانوله‌شده با CM دست‌نخورده است و به انتخاب کتابخانه‌های فاژ در داخل بدن اجازه می‌دهد تا کلون‌هایی را که به آسانی از خون به داخل محفظه CSF منتقل می‌شوند، شناسایی کنند.
(الف) راه اندازی روشی برای نمونه برداری مجدد مایع مغزی نخاعی (CSF) از یک استخر بزرگ.(ب) نمودار مکان سلولی سد سیستم عصبی مرکزی (CNS) و استراتژی انتخاب مورد استفاده برای شناسایی پپتیدهایی که از سد خونی مغزی (BBB) ​​و سد خونی مغزی عبور می کنند را نشان می دهد.(ج) نمودار جریان غربالگری فاژ در داخل بدن.در هر دور انتخاب، فاژها (شناسه های حیوانات در داخل فلش ها) به صورت داخل وریدی تزریق شد.دو شاخه جایگزین مستقل (A, B) تا دور چهارم انتخاب به طور جداگانه نگهداری می شوند.برای دورهای انتخابی 3 و 4، هر کلون فاژ استخراج شده از CSF به صورت دستی توالی یابی شد.(د) سینتیک فاژ جدا شده از خون (دایره های قرمز) و مایع مغزی نخاعی (مثلث سبز) در طول اولین دور انتخاب در دو موش صحرایی کانول شده پس از تزریق داخل وریدی کتابخانه پپتید T7 (2 × 1012 فاژ/حیوان).مربع های آبی نشان دهنده میانگین غلظت اولیه فاژ در خون است که از روی مقدار فاژ تزریق شده با در نظر گرفتن حجم کل خون محاسبه می شود.مربع های سیاه نشان دهنده نقطه تقاطع خط y برون یابی شده از غلظت فاژ خون است.(ه، و) فرکانس و توزیع نسبی همه نقوش سه پپتیدی با هم همپوشانی احتمالی موجود در پپتید را ارائه دهید.تعداد نقوش یافت شده در 1000 قرائت نشان داده شده است.به طور قابل توجهی (p <0.001) نقوش غنی شده با نقاط قرمز مشخص شده اند.(ه) نمودار پراکندگی همبستگی که فراوانی نسبی موتیف سه پپتیدی کتابخانه تزریق شده را با فاژهای مشتق شده از خون حیوانات #1.1 و #1.2 مقایسه می کند.(f) نمودار پراکندگی همبستگی که بسامدهای نسبی موتیف های تری پپتیدی فاژ حیوانی #1.1 و #1.2 جدا شده در خون و مایع مغزی نخاعی را مقایسه می کند.(g، h) نمایش شناسه توالی فاژ غنی شده در خون (g) در مقابل کتابخانه های تزریقی و فاژ غنی شده در CSF (h) در مقابل خون پس از یک دور انتخاب در داخل بدن در هر دو حیوان.اندازه کد یک حرفی نشان می دهد که هر چند وقت یکبار آن اسید آمینه در آن موقعیت رخ می دهد.سبز = قطبی، بنفش = خنثی، آبی = بازی، قرمز = اسیدی و سیاه = اسیدهای آمینه آبگریز.شکل 1a,b توسط Eduard Urich طراحی و تولید شده است.
ما یک کتابخانه پپتیدی فاژ را به دو موش صحرایی ابزار CM (کلاد A و B) تزریق کردیم و فاژ را از مایع مغزی نخاعی و خون جدا کردیم (شکل 1d).پاکسازی سریع اولیه کتابخانه در مقایسه با فاژ نوع وحشی کمتر مشخص بود.میانگین نیمه عمر کتابخانه تزریق شده در هر دو حیوان 24.8 دقیقه در خون، مشابه فاژ نوع وحشی، و 38.5 دقیقه در CSF بود.خون و نمونه فاژ مایع مغزی نخاعی از هر حیوان تحت HTS قرار گرفتند و تمام پپتیدهای شناسایی شده برای حضور یک موتیف تری پپتیدی کوتاه مورد بررسی قرار گرفتند.نقوش تری پپتیدی به این دلیل انتخاب شدند که پایه حداقلی را برای تشکیل ساختار و برهمکنش‌های پپتید-پروتئین فراهم می‌کنند14،15.ما ارتباط خوبی در توزیع نقوش بین کتابخانه فاژ تزریق شده و کلون های استخراج شده از خون هر دو حیوان پیدا کردیم (شکل 1e).داده‌ها نشان می‌دهند که ترکیب کتابخانه فقط به مقدار اندکی در محفظه خون غنی شده است.فرکانس اسید آمینه و توالی اجماع بیشتر در هر موقعیت با استفاده از اقتباس از نرم افزار Weblogo16 تجزیه و تحلیل شد.جالب توجه است که ما یک غنی سازی قوی در باقی مانده های گلیسین خون پیدا کردیم (شکل 1g).هنگامی که خون با کلون های انتخاب شده از CSF مقایسه شد، انتخاب قوی و برخی از حذف موتیف ها مشاهده شد (شکل 1f)، و اسیدهای آمینه خاصی ترجیحاً در موقعیت های از پیش تعیین شده در 12 عضو وجود داشتند (شکل 1h).به طور قابل‌توجهی، تک تک حیوانات به طور قابل توجهی در مایع مغزی نخاعی تفاوت داشتند، در حالی که غنی‌سازی گلیسین خون در هر دو حیوان مشاهده شد (شکل تکمیلی 4a-j).پس از فیلتر کردن دقیق داده های توالی در مایع مغزی نخاعی حیوانات #1.1 و #1.2، در مجموع 964 و 420 پپتید 12 مریی منحصر به فرد به دست آمد (شکل تکمیلی 1d-e).کلون های فاژ جدا شده تکثیر شدند و در معرض دور دوم انتخاب درون تنی قرار گرفتند.فاژهای استخراج شده از دور دوم انتخاب در هر حیوان در معرض HTS قرار گرفتند و همه پپتیدهای شناسایی شده به عنوان ورودی برنامه شناسایی موتیف برای تجزیه و تحلیل وقوع نقوش سه پپتیدی مورد استفاده قرار گرفتند (شکل 2a, b, ef).در مقایسه با اولین چرخه فاژ بازیابی شده از CSF، ما انتخاب بیشتر و عدم انتخاب بسیاری از موتیف ها در CSF را در شاخه های A و B مشاهده کردیم (شکل 2).یک الگوریتم شناسایی شبکه برای تعیین اینکه آیا آنها الگوهای مختلف توالی ثابت را نشان می‌دهند یا خیر، استفاده شد.شباهت واضحی بین توالی های 12 بعدی بازیابی شده توسط CSF در کلاد جایگزین A (شکل 2c، d) و کلاد B (شکل 2g، h) مشاهده شد.تجزیه و تحلیل ادغام شده در هر شاخه نمایه های انتخاب متفاوتی را برای پپتیدهای 12-mer نشان داد (شکل تکمیلی 5c,d) و افزایش نسبت CSF به تیتر خون در طول زمان برای کلون های ادغام شده پس از دور دوم انتخاب در مقایسه با دور اول انتخاب (شکل تکمیلی 5e).).
غنی سازی موتیف ها و پپتیدها در مایع مغزی نخاعی با دو دور متوالی انتخاب نمایش فاژ عملکردی in vivo.
تمام فاژهای مایع مغزی نخاعی بازیابی شده از دور اول هر حیوان (حیوانات #1.1 و #1.2) ادغام شدند، تکثیر شدند، توالی HT تعیین شدند و با هم (2 × 1010 فاژ / حیوان) 2 موش کانوله شده SM (# 1.1 → #).2.1 و 2.2، 1.2 → 2.3 و 2.4).(a,b,e,f) نمودارهای پراکنده همبستگی که بسامد نسبی موتیف های تری پپتیدی همه فاژهای مشتق شده از CSF را در دور انتخاب اول و دوم مقایسه می کند.فرکانس نسبی و توزیع نقوش نشان دهنده تمام سه پپتیدهای همپوشانی احتمالی موجود در پپتیدها در هر دو جهت است.تعداد نقوش یافت شده در 1000 قرائت نشان داده شده است.نقوشی که به طور قابل توجهی (001/0p<) انتخاب یا حذف شدند در یکی از کتابخانه های مقایسه شده با نقاط قرمز برجسته می شوند.(c، d، g، h) نشان‌دهنده توالی تمام توالی‌های طولانی 12 اسید آمینه غنی از CSF بر اساس دورهای 2 و 1 انتخاب in vivo.اندازه کد یک حرفی نشان می دهد که هر چند وقت یکبار آن اسید آمینه در آن موقعیت رخ می دهد.برای نشان دادن آرم، فراوانی توالی‌های CSF استخراج‌شده از حیوانات منفرد بین دو دور انتخاب مقایسه می‌شود و توالی‌های غنی‌شده در دور دوم نشان داده می‌شوند: (ج) #1.1–#2.1 (د) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 و (h) #1.2–#2.4.غنی‌ترین اسیدهای آمینه در یک موقعیت معین در حیوانات (c,d)2.1 و شماره2.2 یا (g، h) در حیوانات شماره.2.3 و شماره2.4 به صورت رنگی نشان داده شده است.سبز = قطبی، بنفش = خنثی، آبی = بازی، قرمز = اسیدی و سیاه = اسیدهای آمینه آبگریز.
پس از دور سوم انتخاب، ما 124 توالی پپتیدی منحصر به فرد (#3.1 و #3.2) را از 332 کلون فاژ بازسازی شده با CSF جدا شده از دو حیوان شناسایی کردیم (شکل تکمیلی 6a).دنباله LGSVS (18.7%) دارای بالاترین نسبت نسبی بود و پس از آن درج‌های نوع وحشی PAGISRELVDKL (8.2%)، MRWFFSHASQGR (3%)، DVAKVS (3%)، TWLFSLG (2.2%) و SARGSWREIVSLS (2.2%) قرار گرفتند.در دور چهارم نهایی، دو شاخه انتخاب شده مستقل از سه حیوان جداگانه را با هم ترکیب کردیم (شکل 1c).از 925 کلون فاژ توالی‌یابی شده از CSF، در دور چهارم، 64 توالی پپتیدی منحصربه‌فرد پیدا کردیم (شکل 6 ب تکمیلی)، که در میان آنها نسبت نسبی فاژ نوع وحشی به 0.8 درصد کاهش یافت.شایع ترین کلون های CSF در دور چهارم عبارت بودند از LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%)، LGSVS (17%)، GFVRFRLSNTR (14%)، KVAWRVFSLFWK (7%)، SVHGV (5%)، GRPQKINGARVC (3.6%) (3.6%) و 3.6%).%)).محدوده طول پپتیدهای انتخاب شده به دلیل درج/حذف نوکلئوتیدی یا کدون های توقف زودرس در پرایمرهای کتابخانه هنگام استفاده از کدون های منحط برای طراحی کتابخانه NNK است.کدون های توقف زودرس پپتیدهای کوتاه تری تولید می کنند و به این دلیل انتخاب می شوند که حاوی موتیف aa مطلوب هستند.پپتیدهای طولانی تر ممکن است از درج/حذف شدن در آغازگرهای کتابخانه های مصنوعی ایجاد شوند.این کدون توقف طراحی شده را در خارج از کادر قرار می دهد و آن را می خواند تا زمانی که یک کدون توقف جدید در پایین دست ظاهر شود.به طور کلی، ما فاکتورهای غنی‌سازی را برای هر چهار دور انتخابی با مقایسه داده‌های ورودی با داده‌های خروجی نمونه محاسبه کردیم.برای دور اول غربالگری، از تیترهای فاژ نوع وحشی به عنوان مرجع پس زمینه غیر اختصاصی استفاده کردیم.جالب توجه است، انتخاب فاژ منفی در اولین چرخه CSF بسیار قوی بود، اما نه در خون (شکل 3a)، که ممکن است به دلیل احتمال کم انتشار غیرفعال اکثر اعضای کتابخانه پپتیدی در محفظه CSF یا فاژهای نسبی نسبت به باکتریوفاژها به طور موثرتری از جریان خون نگهداری یا حذف شوند.با این حال، در دور دوم پاننگ، انتخاب قوی فاژها در CSF در هر دو کلاد مشاهده شد، که نشان می‌دهد دور قبلی در فاژهایی غنی شده بود که پپتیدهایی را نشان می‌دادند که جذب CSF را افزایش می‌دادند (شکل 3a).باز هم بدون غنی سازی قابل توجه خون.همچنین در دور سوم و چهارم، کلون فاژ به طور قابل توجهی در CSF غنی شد.با مقایسه فراوانی نسبی هر توالی پپتیدی منحصر به فرد بین دو دور آخر انتخاب، متوجه شدیم که توالی ها در دور چهارم انتخاب غنی تر شدند (شکل 3b).در مجموع 931 نقوش سه پپتیدی از تمام 64 توالی پپتیدی منحصر به فرد با استفاده از هر دو جهت پپتیدی استخراج شد.غنی‌ترین نقوش در دور چهارم برای نمایه‌های غنی‌سازی آن‌ها در تمام دورها در مقایسه با کتابخانه تزریق‌شده (قطع: 10٪ غنی‌سازی) دقیق‌تر مورد بررسی قرار گرفتند (شکل تکمیلی 6c).الگوهای کلی انتخاب نشان داد که بیشتر انگیزه های مورد مطالعه در تمامی دورهای قبلی هر دو شاخه گزینش غنی شده است.با این حال، برخی از نقوش (مانند SGL، VSG، LGS GSV) عمدتاً از کلاد جایگزین A بودند، در حالی که برخی دیگر (مانند FGW، RTN، WGF، NTR) در کلاد جایگزین B غنی شدند.
اعتبار سنجی انتقال CSF از پپتیدهای نمایش داده شده با فاژ غنی شده با CSF و پپتیدهای رهبر بیوتینیله کونژوگه به ​​محموله های استرپتاویدین.
(الف) نسبت های غنی سازی در هر چهار دور محاسبه می شود (R1-R4) بر اساس تیترهای فاژ تزریقی (ورودی = I) (PFU) و تیتر فاژ CSF تعیین شده (خروجی = O).فاکتورهای غنی‌سازی برای سه راند آخر (R2-R4) با مقایسه با دور قبلی و دور اول (R1) با داده‌های وزنی محاسبه شد.نوارهای باز مایع مغزی نخاعی هستند، نوارهای سایه دار پلاسما هستند.(***p<0.001، بر اساس آزمون t استودنت).(ب) فهرست فراوان‌ترین پپتیدهای فاژ، که بر اساس نسبت نسبی آنها به تمام فاژهای جمع‌آوری‌شده در CSF پس از دور چهارم انتخاب رتبه‌بندی شده‌اند.شش کلون فاژ رایج‌تر با رنگ، شماره و فاکتورهای غنی‌سازی آن‌ها بین دورهای 3 و 4 انتخاب (inset) مشخص می‌شوند.(ج، د) شش کلون فاژ غنی شده، فاژ خالی و کتابخانه های پپتید فاژ والدین از دور 4 به صورت جداگانه در یک مدل نمونه برداری CSF تجزیه و تحلیل شدند.نمونه‌های CSF و خون در زمان‌های مشخص شده جمع‌آوری شد.(ج) مقادیر مساوی از 6 کلون فاژ کاندید (2 در 1010 فاژ/حیوان)، فاژهای خالی (#1779) (2 در 1010 فاژ/حیوان) و کتابخانه پپتید فاژ موجود (2 در 1012 فاژ/حیوان).فارماکوکینتیک CSF هر کلون فاژ تزریق شده و کتابخانه پپتید فاژ در طول زمان نشان داده شده است.(د) میانگین نسبت CSF/خون را برای همه فاژهای بازیابی شده در میلی لیتر در طول زمان نمونه برداری نشان می دهد.(ه) چهار پپتید پیشرو مصنوعی و یک کنترل درهم از طریق انتهای N (نمایش تترامر) با بیوتین به استرپتاویدین و سپس تزریق (ورید دم IV، 10 میلی گرم استرپتاویدین بر کیلوگرم) مرتبط شدند.حداقل سه موش انتوبه شده (N = 3).).نمونه‌های CSF در زمان‌های مشخص شده جمع‌آوری شد و غلظت استرپتاویدین با روش ELISA ضد استرپتاویدین CSF اندازه‌گیری شد (nd = تشخیص داده نشد).(*p<0.05، **p<0.01، ***p<0.001، بر اساس آزمون ANOVA).(و) مقایسه توالی اسید آمینه غنی‌ترین کلون پپتید فاژ #2002 (بنفش) با سایر کلون‌های پپتید فاژ انتخاب شده از دور چهارم انتخاب.قطعات آمینو اسید یکسان و مشابه دارای کد رنگی هستند.
از بین تمام فاژهای غنی شده در دور چهارم (شکل 3b)، شش کلون کاندید برای تجزیه و تحلیل فردی بیشتر در مدل نمونه برداری CSF انتخاب شدند.مقادیر مساوی از شش فاژ کاندید، فاژ خالی (بدون درج) و کتابخانه پپتید پروفاژ به سه حیوان CM کانول شده تزریق شد، و فارماکوکینتیک در سنجش CSF (شکل 3c) و خون (تکمیلی شکل 7) تعیین شد.تمام کلون های فاژ آزمایش شده، محفظه CSF را در سطحی 10-1000 برابر بالاتر از سطح فاژ شاهد خالی مورد هدف قرار دادند (#1779).به عنوان مثال، کلون های #2020 و #2077 حدود 1000 برابر بیشتر از فاژ کنترل CSF تیتر داشتند.مشخصات فارماکوکینتیک هر پپتید انتخابی متفاوت است، اما همه آنها توانایی بالایی در CSF دارند.ما کاهش ثابتی را در طول زمان برای کلون‌های #1903 و #2011 مشاهده کردیم، در حالی که برای کلون #2077، #2002 و #2009 افزایش در طول 10 دقیقه اول ممکن است نشان‌دهنده انتقال فعال باشد، اما باید تأیید شود.کلون های #2020، #2002 و #2077 در سطوح بالا تثبیت شدند، در حالی که غلظت CSF کلون #2009 به آرامی پس از افزایش اولیه کاهش یافت.سپس فرکانس نسبی هر کاندید CSF را با غلظت خون آن مقایسه کردیم (شکل 3d).همبستگی میانگین تیتر هر کاندید CSF با تیتر خون آن در تمام زمان‌های نمونه‌برداری نشان داد که سه نفر از شش کاندید به طور قابل‌توجهی در CSF خون غنی شده بودند.جالب توجه است که کلون #2077 پایداری خون بالاتری را نشان داد (شکل تکمیلی 7).برای تأیید اینکه خود پپتیدها قادر به انتقال فعال محموله‌های غیر از ذرات فاژ به داخل محفظه CSF هستند، ما چهار پپتید رهبر مشتق‌شده با بیوتین را در انتهای N که پپتیدها به ذره فاژ متصل می‌شوند، سنتز کردیم.پپتیدهای بیوتینیله (شماره‌های 2002، 2009، 2020 و 2077) با استرپتاویدین (SA) کونژوگه شدند تا شکل‌های چندمری به دست آورند که تا حدودی از هندسه فاژ تقلید می‌کنند.این فرمت همچنین به ما اجازه می‌دهد قرار گرفتن در معرض SA در خون و مایع مغزی نخاعی را به عنوان پپتیدهای پروتئینی حامل محموله اندازه‌گیری کنیم.نکته مهم، هنگامی که پپتیدهای مصنوعی در این فرمت کونژوگه با SA تجویز می‌شوند، اغلب می‌توان داده‌های فاژ را بازتولید کرد (شکل 3e).پپتیدهای درهم قرار گرفتن در معرض اولیه کمتر و پاکسازی CSF سریعتر با سطوح غیرقابل شناسایی در عرض 48 ساعت داشتند.برای به دست آوردن بینش در مورد مسیرهای تحویل این کلون های فاژ پپتیدی به فضای CSF، ما محلی سازی بازدیدهای پپتید فاژ فردی را با استفاده از ایمونوهیستوشیمی (IHC) برای شناسایی مستقیم ذرات فاژ 1 ساعت پس از تزریق داخل وریدی در داخل بدن تجزیه و تحلیل کردیم.قابل ذکر است که کلون های #2002، #2077 و #2009 را می توان با رنگ آمیزی قوی در مویرگ های مغز تشخیص داد، در حالی که فاژ کنترل (#1779) و کلون #2020 شناسایی نشدند (شکل تکمیلی 8).این نشان می دهد که این پپتیدها دقیقاً با عبور از BBB به تأثیر روی مغز کمک می کنند.تجزیه و تحلیل دقیق بیشتری برای آزمایش این فرضیه مورد نیاز است، زیرا ممکن است مسیر BSCFB نیز درگیر باشد.هنگام مقایسه توالی اسید آمینه غنی‌شده‌ترین کلون (#2002) با سایر پپتیدهای انتخاب شده، مشخص شد که برخی از آنها دارای پسوندهای اسید آمینه مشابهی هستند که ممکن است مکانیسم انتقال مشابهی را نشان دهد (شکل 3f).
با توجه به مشخصات پلاسمایی منحصر به فرد و افزایش قابل توجه CSF در طول زمان، کلون نمایش فاژ شماره 2077 در یک دوره 48 ساعته بیشتر مورد بررسی قرار گرفت و توانست افزایش سریع CSF مشاهده شده در ارتباط با سطوح SA پایدار را بازتولید کند (شکل 4a).با توجه به سایر کلون های فاژ شناسایی شده، #2077 به شدت برای مویرگ های مغز رنگ آمیزی شد و زمانی که با وضوح بالاتر و احتمالاً مقداری رنگ آمیزی در فضای پارانشیمی مشاهده شد، کلوکالیزاسیون قابل توجهی با لکتین مارکر مویرگی نشان داد (شکل 4b).برای بررسی اینکه آیا می‌توان اثرات دارویی با واسطه پپتید را در CNS به دست آورد، آزمایشی را انجام دادیم که در آن نسخه‌های بیوتینیله i) پپتید ترانزیت #2077 و ii) پپتید بازدارنده BACE1 با SA در دو نسبت مختلف مخلوط شدند.برای یک ترکیب فقط از بازدارنده پپتید BACE1 و برای دیگری از نسبت 1:3 بازدارنده پپتید BACE1 به پپتید 2077 # استفاده کردیم.هر دو نمونه به صورت داخل وریدی تجویز شدند و سطح خون و مایع مغزی نخاعی پپتید بتا آمیلوئید 40 (Abeta40) در طول زمان اندازه‌گیری شد.Abeta40 در CSF اندازه گیری شد زیرا بازتاب مهار BACE1 در پارانشیم مغز است.همانطور که انتظار می رفت، هر دو کمپلکس به طور قابل توجهی سطوح خونی Abeta40 را کاهش دادند (شکل 4c، d).با این حال، فقط نمونه هایی حاوی مخلوطی از پپتید شماره.2077 و یک مهارکننده پپتید BACE1 کونژوگه به ​​SA باعث کاهش قابل توجه Abeta40 در مایع مغزی نخاعی شد (شکل 4c).داده ها نشان می دهد که پپتید شماره.2077 قادر است پروتئین 60 کیلو دالتون SA را به CNS منتقل کند و همچنین اثرات دارویی را با مهارکننده های کونژوگه SA پپتید BACE1 ایجاد می کند.
(الف) تزریق کلونال (2×10 فاژ/حیوان) فاژ T7 که نمایه‌های فارماکوکینتیک طولانی‌مدت پپتید CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) و فاژ کنترل تزریق نشده (#1779) را در حداقل سه موش صحرایی انتوبه‌شده با CM نشان می‌دهد.(ب) تصویر میکروسکوپی کانفوکال از ریزرگ‌های قشری نماینده در موش‌های تزریق‌شده با فاژ (2×1010 فاژ/حیوان) که رنگ‌آمیزی متقابل پپتید #2077 و عروق (لکتین) را نشان می‌دهد.این کلون فاژ به 3 موش داده شد و اجازه داده شد تا به مدت 1 ساعت قبل از پرفیوژن در گردش باشند.مغزها برش داده شدند و با آنتی بادی های پلی کلونال نشاندار شده با FITC علیه کپسید فاژ T7 رنگ آمیزی شدند.ده دقیقه قبل از پرفیوژن و فیکساسیون بعدی، لکتین نشاندار شده با DyLight594 به صورت داخل وریدی تجویز شد.تصاویر فلورسنت که رنگ آمیزی لکتین (قرمز) سمت مجرای عروق کوچک و فاژها (سبز) را در لومن مویرگ ها و بافت اطراف عروقی مغز نشان می دهد.نوار مقیاس مربوط به 10 میکرومتر است.(ج، د) پپتید مهاری BACE1 بیوتینیله شده به تنهایی یا در ترکیب با پپتید ترانزیت بیوتینیله #2077 با استرپتاویدین همراه شد و به دنبال آن حداقل سه موش CM کانوله شده (10 میلی گرم استرپتاویدین بر کیلوگرم) به صورت داخل وریدی تزریق شد.کاهش با واسطه مهارکننده پپتید BACE1 در Aβ40 توسط ELISA Aβ1-40 در خون (قرمز) و مایع مغزی نخاعی (نارنجی) در نقاط زمانی مشخص شده اندازه‌گیری شد.برای وضوح بهتر، یک خط نقطه چین بر روی نمودار در مقیاس 100٪ رسم می شود.(ج) درصد کاهش در Aβ40 در خون (مثلث قرمز) و مایع مغزی نخاعی (مثلث های نارنجی) در موش های تحت درمان با استرپتاویدین کونژوگه به ​​پپتید ترانزیت #2077 و پپتید مهاری BACE1 در نسبت 3:1.(د) درصد کاهش در خون Aβ40 (دایره های قرمز) و مایع مغزی نخاعی (دایره های نارنجی) موش های تحت درمان با استرپتاویدین همراه با یک پپتید مهاری BACE1.غلظت Aβ در کنترل pg/ml 420 بود (انحراف استاندارد = 101 pg/ml).
نمایش فاژ با موفقیت در چندین زمینه از تحقیقات زیست پزشکی استفاده شده است.این روش برای مطالعات تنوع عروقی in vivo 18،19 و همچنین مطالعاتی که عروق مغزی را هدف قرار می دهد، استفاده شده است 20،21،22،23،24،25،26.در این مطالعه، ما استفاده از این روش انتخاب را نه تنها برای شناسایی مستقیم پپتیدهایی که عروق مغزی را هدف قرار می‌دهند، بلکه برای کشف نامزدهایی با خواص انتقال فعال برای عبور از سد خونی مغزی نیز گسترش دادیم.ما اکنون توسعه یک روش انتخاب درون تنی را در موش‌های انتوبه‌شده با CM توصیف می‌کنیم و پتانسیل آن را برای شناسایی پپتیدهایی با خواص خانه‌سازی CSF نشان می‌دهیم.با استفاده از فاژ T7 که کتابخانه‌ای از پپتیدهای تصادفی 12 مری را نمایش می‌دهد، توانستیم نشان دهیم که فاژ T7 به اندازه‌ای کوچک است (تقریباً 60 نانومتر قطر) 10 تا بتواند با سد خونی مغزی سازگار شود و در نتیجه مستقیماً از سد خونی مغزی یا شبکه مشیمیه عبور کند.ما مشاهده کردیم که برداشت CSF از موش‌های CM کانوله‌شده یک روش غربالگری عملکردی در داخل بدن به خوبی کنترل شده بود، و فاژ استخراج‌شده نه تنها به عروق متصل می‌شود، بلکه به عنوان یک ناقل در سراسر سد خونی مغزی عمل می‌کند.علاوه بر این، با جمع‌آوری همزمان خون و اعمال HTS به CSF و فاژهای مشتق از خون، تأیید کردیم که انتخاب ما از CSF تحت تأثیر غنی‌سازی خون یا تناسب برای گسترش بین دورهای انتخابی قرار نگرفته است.با این حال، محفظه خون بخشی از روش انتخاب است، زیرا فاژهایی که قادر به رسیدن به محفظه CSF هستند باید به اندازه کافی زنده بمانند و در جریان خون گردش کنند تا خود را در مغز غنی کنند.به منظور استخراج اطلاعات توالی قابل اعتماد از داده های خام HTS، فیلترهایی را که با خطاهای توالی پلتفرم خاص در گردش کار تجزیه و تحلیل سازگار شده اند، پیاده سازی کردیم.با گنجاندن پارامترهای جنبشی در روش غربالگری، ما فارماکوکینتیک سریع فاژهای T7 نوع وحشی (t½ ~ 28 دقیقه) را در blood24، 27، 28 تأیید کردیم و همچنین نیمه عمر آنها را در مایع مغزی نخاعی (t½ ~ 26 دقیقه) در دقیقه تعیین کردیم.با وجود پروفایل های فارماکوکینتیک مشابه در خون و CSF، تنها 0.001٪ از غلظت خونی فاژ را می توان در CSF تشخیص داد، که نشان دهنده تحرک پس زمینه کم فاژ T7 نوع وحشی در سراسر سد خونی مغزی است.این کار اهمیت دور اول انتخاب را هنگام استفاده از استراتژی‌های پاننگ درون تنی، به ویژه برای سیستم‌های فاژی که به سرعت از گردش خون پاک می‌شوند، نشان می‌دهد، زیرا تعداد کمی از کلون‌ها قادر به رسیدن به محفظه CNS هستند.بنابراین، در دور اول، کاهش تنوع کتابخانه بسیار زیاد بود، زیرا در نهایت تعداد محدودی از کلون ها در این مدل CSF بسیار سخت جمع آوری شد.این استراتژی پانینگ in vivo شامل چندین مرحله انتخاب مانند تجمع فعال در محفظه CSF، بقای کلون در محفظه خون، و حذف سریع کلون های فاژ T7 از خون در 10 دقیقه اول بود (شکل 1d و شکل تکمیلی 4M).).بنابراین، پس از دور اول، کلون های فاژی مختلف در CSF شناسایی شدند، اگرچه از همان مخزن اولیه برای حیوانات منفرد استفاده شد.این نشان می دهد که چندین مرحله انتخاب دقیق برای کتابخانه های منبع با تعداد زیادی از اعضای کتابخانه منجر به کاهش قابل توجهی در تنوع می شود.بنابراین، رویدادهای تصادفی به بخشی جدایی ناپذیر از فرآیند انتخاب اولیه تبدیل می‌شوند و بر نتیجه تأثیر زیادی می‌گذارند.این احتمال وجود دارد که بسیاری از کلون های موجود در کتابخانه اصلی تمایل بسیار مشابهی به غنی سازی CSF داشته باشند.با این حال، حتی در شرایط آزمایشی یکسان، نتایج انتخاب ممکن است به دلیل تعداد کم هر کلون خاص در استخر اولیه متفاوت باشد.
نقوش غنی شده در CSF با نقوش موجود در خون متفاوت است.جالب توجه است، ما به اولین تغییر به سمت پپتیدهای غنی از گلیسین در خون حیوانات فردی اشاره کردیم.(شکل 1g، شکل های تکمیلی 4e، 4f).فاژهای حاوی پپتیدهای گلیسین ممکن است پایدارتر باشند و کمتر از گردش خون خارج شوند.با این حال، این پپتیدهای غنی از گلیسین در نمونه‌های مایع مغزی نخاعی شناسایی نشدند، و نشان می‌دهد که کتابخانه‌های انتخاب‌شده دو مرحله انتخاب متفاوت را طی کردند: یکی در خون و دیگری اجازه تجمع در مایع مغزی نخاعی.کلون های غنی شده با CSF حاصل از دور چهارم انتخاب به طور گسترده مورد آزمایش قرار گرفته اند.تقریباً تمام کلون‌های آزمایش‌شده به‌صورت جداگانه تأیید شد که در CSF در مقایسه با فاژ شاهد خالی غنی شده‌اند.یک ضربه پپتید (#2077) با جزئیات بیشتری مورد بررسی قرار گرفت.این پپتید نیمه عمر پلاسما طولانی تری را در مقایسه با سایر ضربه ها نشان داد (شکل 3d و شکل تکمیلی 7) و جالب اینکه این پپتید حاوی یک باقیمانده سیستئین در انتهای C بود.اخیراً نشان داده شده است که افزودن سیستئین به پپتیدها می تواند خواص فارماکوکینتیک آنها را با اتصال به آلبومین 29 بهبود بخشد.این در حال حاضر برای پپتید #2077 ناشناخته است و نیاز به مطالعه بیشتر دارد.برخی از پپتیدها وابستگی ظرفیتی را در غنی‌سازی CSF نشان دادند (داده‌ها نشان داده نمی‌شوند)، که ممکن است به هندسه سطح نمایش داده شده کپسید T7 مربوط باشد.سیستم T7 که ما استفاده کردیم 5-15 کپی از هر پپتید در هر ذره فاژ را نشان داد.IHC بر روی کلون های فاژ سرب کاندید تزریق شده به صورت داخل وریدی در قشر مغز موش ها انجام شد (شکل تکمیلی 8).داده ها نشان داد که حداقل سه کلون (شماره 2002، شماره 2009 و شماره 2077) با BBB تعامل داشتند.باید مشخص شود که آیا این تعامل BBB منجر به تجمع CSF می شود یا حرکت این کلون ها به طور مستقیم به BCSFB.نکته مهم، ما نشان می‌دهیم که پپتیدهای انتخاب شده ظرفیت حمل و نقل CSF خود را هنگام سنتز و اتصال به محموله پروتئین حفظ می‌کنند.اتصال پپتیدهای بیوتینیله N ترمینال به SA اساساً نتایج به دست آمده با کلون های فاژ مربوطه آنها را در خون و مایع مغزی نخاعی تکرار می کند (شکل 3e).در نهایت، ما نشان می‌دهیم که پپتید سرب #2077 می‌تواند عملکرد مغزی یک مهارکننده پپتید بیوتینیله BACE1 کونژوگه با SA را تقویت کند و با کاهش قابل‌توجه سطح Abeta40 در CSF باعث اثرات فارماکودینامیکی برجسته در CNS شود (شکل 4).با انجام جستجوی همسانی توالی پپتید در همه بازدیدها، نتوانستیم هیچ همولوگ را در پایگاه داده شناسایی کنیم.توجه به این نکته مهم است که اندازه کتابخانه T7 تقریباً 109 است، در حالی که اندازه کتابخانه نظری برای 12-mers 4 x 1015 است. بنابراین، ما فقط بخش کوچکی از فضای تنوع کتابخانه پپتید 12 مریی را انتخاب کردیم، که ممکن است به این معنی باشد که پپتیدهای بهینه‌تر را می‌توان با توجه به فضای ejavalu شناسایی کرد.به طور فرضی، یکی از دلایلی که چرا ما هیچ همولوگ طبیعی این پپتیدها را پیدا نکرده‌ایم، ممکن است عدم انتخاب در طول تکامل برای جلوگیری از ورود کنترل‌نشده برخی موتیف‌های پپتید به مغز باشد.
در مجموع، نتایج ما مبنایی برای کار آینده برای شناسایی و توصیف سیستم‌های حمل و نقل مانع عروق مغزی در داخل بدن با جزئیات بیشتر فراهم می‌کند.راه‌اندازی اولیه این روش مبتنی بر یک استراتژی انتخاب عملکردی است که نه تنها کلون‌هایی را با ویژگی‌های اتصال عروقی مغز شناسایی می‌کند، بلکه شامل یک مرحله حیاتی است که در آن کلون‌های موفق فعالیت ذاتی برای عبور از موانع بیولوژیکی در داخل بدن به محفظه CNS دارند.این است که مکانیسم انتقال این پپتیدها و ترجیح آنها برای اتصال به عروق ریز مخصوص ناحیه مغز را روشن کند.این ممکن است منجر به کشف مسیرهای جدیدی برای انتقال BBB و گیرنده ها شود.ما انتظار داریم که پپتیدهای شناسایی شده بتوانند مستقیماً به گیرنده های عروق مغزی یا لیگاندهای در گردشی که از طریق BBB یا BCSFB منتقل می شوند، متصل شوند.وکتورهای پپتیدی با فعالیت انتقال CSF کشف شده در این کار بیشتر مورد بررسی قرار خواهند گرفت.ما در حال حاضر در حال بررسی ویژگی مغز این پپتیدها برای توانایی آنها در عبور از BBB و/یا BCSFB هستیم.این پپتیدهای جدید ابزارهای بسیار ارزشمندی برای کشف بالقوه گیرنده ها یا مسیرهای جدید و توسعه پلتفرم های جدید بسیار کارآمد برای تحویل درشت مولکول ها، مانند مواد بیولوژیک، به مغز خواهند بود.
مخزن بزرگ (CM) را با استفاده از روشی که قبلا توضیح داده شد، کانول کنید.موش های بیهوش شده ویستار (200-350 گرم) بر روی دستگاه استریوتاکسیک سوار شدند و یک برش میانی روی پوست سر تراشیده شده و آماده شده به صورت آسپتیک برای آشکار شدن جمجمه ایجاد شد.در ناحیه ارسی بالایی دو سوراخ دریل کنید و پیچ های ثابت را در سوراخ ها ببندید.یک سوراخ اضافی در تاج اکسیپیتال جانبی برای هدایت استریوتاکتیک یک کانول فولاد ضد زنگ به داخل CM حفر شد.سیمان دندانی را در اطراف کانول بمالید و با پیچ محکم کنید.پس از فتوکورینگ و سخت شدن سیمان، زخم پوست با بخیه سوپرامید 4/0 بسته شد.قرار دادن مناسب کانولا با نشت خود به خود مایع مغزی نخاعی (CSF) تایید می شود.موش را از دستگاه استریوتاکسیک خارج کنید، مراقبت های مناسب پس از عمل و مدیریت درد را دریافت کنید و اجازه دهید حداقل یک هفته بهبود یابد تا زمانی که علائم خون در مایع مغزی نخاعی مشاهده شود.موش های ویستار (Crl:WI/Han) از رودخانه چارلز (فرانسه) به دست آمد.همه موش‌ها تحت شرایط خاص عاری از بیماری‌زا نگهداری شدند.تمام آزمایشات حیوانی توسط اداره دامپزشکی شهر بازل سوئیس تایید شده و مطابق با مجوز حیوانی شماره 2474 (ارزیابی انتقال فعال مغز با اندازه گیری سطوح داوطلبان درمانی در مایع مغزی نخاعی و مغز موش صحرایی) انجام شد.
به آرامی موش را با کانول CM در دست نگه دارید.داتورا را از کانولا خارج کرده و 10 میکرولیتر مایع مغزی نخاعی که خود به خود جریان دارد جمع آوری کنید.از آنجایی که در نهایت باز بودن کانولا به خطر افتاده بود، تنها نمونه‌های شفاف مایع مغزی نخاعی بدون شواهدی از آلودگی خون یا تغییر رنگ در این مطالعه وارد شدند.به موازات آن، تقریباً 20-10 میکرولیتر خون از یک برش کوچک در نوک دم به لوله‌هایی با هپارین (سیگما-آلدریچ) گرفته شد.CSF و خون در مقاطع زمانی مختلف پس از تزریق داخل وریدی فاژ T7 جمع آوری شد.تقریباً 5-10 میکرولیتر مایع قبل از جمع‌آوری هر نمونه CSF دور ریخته شد که مربوط به حجم مرده کاتتر است.
کتابخانه ها با استفاده از بردار T7Select 10-3b همانطور که در کتابچه راهنمای سیستم T7Select توضیح داده شده است (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) تولید شدند.به طور خلاصه، یک درج DNA تصادفی 12 mer در قالب زیر سنتز شد:
کدون NNK برای جلوگیری از کدون توقف مضاعف و بیان بیش از حد اسید آمینه در درج استفاده شد.N یک نسبت هممولار مخلوط دستی از هر نوکلئوتید است و K یک نسبت هممولار مخلوط دستی از نوکلئوتیدهای آدنین و سیتوزین است.مناطق تک رشته ای با انکوباسیون بیشتر با dNTP (Novagen) و آنزیم Klenow (New England Biolabs) در بافر Klenow (New England Biolabs) به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد به DNA دو رشته ای تبدیل شدند.پس از واکنش، DNA دو رشته ای با رسوب EtOH بازیابی شد.DNA حاصل با آنزیم های محدود کننده EcoRI و HindIII (هر دو از Roche) هضم شد.درج جدا شده و خالص شده (QIAquick، Qiagen) (T4 لیگاز، New England Biolabs) پس از اسید آمینه 348 از ژن کپسید 10B، درون قاب به وکتور T7 از پیش شکافته شده متصل شد.واکنش های بستن در دمای 16 درجه سانتی گراد به مدت 18 ساعت قبل از بسته بندی آزمایشگاهی انکوبه شدند.بسته بندی فاژ در شرایط آزمایشگاهی مطابق دستورالعمل ارائه شده با کیت کلونینگ T7Select 10-3b (Novagen) انجام شد و محلول بسته بندی یک بار برای لیز با استفاده از اشریشیا کلی (BLT5615، Novagen) تکثیر شد.لیزات سانتریفیوژ، تیتر و در دمای 80- درجه سانتی گراد به عنوان محلول ذخیره گلیسرول منجمد شدند.
تکثیر مستقیم PCR نواحی متغیر فاژ تکثیر شده در براث یا پلیت با استفاده از پرایمرهای فیوژن اختصاصی 454/Roche-amplicon.پرایمر همجوشی رو به جلو حاوی توالی‌هایی است که در کنار ناحیه متغیر (NNK) 12 (مخصوص الگو)، آداپتور تیتانیوم GS FLX A، و یک دنباله کلید کتابخانه‌ای چهار پایه (TCAG) قرار دارند (شکل تکمیلی 1a):
پرایمر همجوشی معکوس همچنین حاوی بیوتین متصل به مهره‌ها و آداپتور تیتانیوم GS FLX B است که برای تقویت کلونال در طول امولسیون PCR لازم است:
سپس آمپلیکون ها طبق پروتکل 454 GS-FLX Titanium تحت پیروزه یابی 454/Roche قرار گرفتند.برای توالی یابی دستی Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer)، DNA فاژ T7 با PCR تکثیر شد و با جفت های آغازگر زیر توالی یابی شد:
درج‌های پلاک‌های منفرد با استفاده از کیت DNA پلیمراز Fast Start Roche (طبق دستورالعمل سازنده) تحت تکثیر PCR قرار گرفتند.شروع گرم (10 دقیقه در 95 درجه سانتیگراد) و 35 چرخه تقویت (50 ثانیه در دمای 95 درجه سانتیگراد، 1 دقیقه در 50 درجه سانتیگراد و 1 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد) انجام دهید.
فاژ از کتابخانه ها، فاژ نوع وحشی، فاژ نجات یافته از CSF و خون، یا کلون های فردی در Escherichia coli BL5615 در براث TB (Sigma Aldrich) یا در ظروف 500 cm2 (Thermo Scientific) به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد تکثیر شدند.فاژها با شستشوی پلیت ها با بافر Tris-EDTA (Fluka Analytical) یا با جمع آوری پلاک ها با نوک پیپت استریل از پلیت ها استخراج شدند.فاژها از رویی کشت یا بافر استخراج با یک دور رسوب پلی اتیلن گلیکول (PEG 8000) (Promega) جدا و در بافر Tris-EDTA معلق شدند.
فاژ تقویت شده با استفاده از دانه های حذف اندوتوکسین (Miltenyi Biotec) قبل از تزریق داخل وریدی (IV) (500 میکرولیتر در حیوان) تحت 2-3 دور حذف اندوتوکسین قرار گرفت.در دور اول، 2×1012 فاژ معرفی شد.در دوم، 2×1010 فاژ.در دورهای انتخابی سوم و چهارم، 2×109 فاژ در هر حیوان.محتوای فاژ در CSF و نمونه‌های خون جمع‌آوری‌شده در زمان‌های مشخص شده با شمارش پلاک طبق دستورالعمل سازنده (راهنمای سیستم T7Select) تعیین شد.انتخاب فاژ با تزریق داخل وریدی کتابخانه های خالص شده در ورید دم یا با تزریق مجدد فاژ استخراج شده از CSF از دور انتخاب قبلی انجام شد، و برداشت های بعدی به ترتیب در 10 دقیقه، 30 دقیقه، 60 دقیقه، 90 دقیقه، 120 دقیقه، 180 دقیقه و 240 دقیقه نمونه خون انجام شد.در مجموع چهار دور پانینگ در داخل بدن انجام شد که در آن دو شاخه انتخاب شده به طور جداگانه ذخیره و در طول سه دور اول انتخاب مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.تمام درج‌های فاژ استخراج‌شده از CSF از دو دور اول انتخاب، در معرض pyrosequencing 454/Roche قرار گرفتند، در حالی که تمام کلون‌های استخراج‌شده از CSF از دو دور آخر انتخاب به‌صورت دستی توالی‌یابی شدند.تمام فاژهای خون از دور اول انتخاب نیز تحت pyrosequencing 454/Roche قرار گرفتند.برای تزریق کلون های فاژ، فاژهای انتخاب شده در E. coli (BL5615) روی صفحات 500 سانتی متر مربع در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 4 ساعت تکثیر شدند.کلون های انتخاب شده و توالی یابی دستی در محیط کشت سل تکثیر شدند.پس از استخراج فاژ، خالص سازی و حذف اندوتوکسین (همانطور که در بالا توضیح داده شد)، 2×1010 فاژ / حیوان در 300 میکرولیتر به صورت داخل وریدی به یک ورید دم تزریق شد.
پیش پردازش و فیلتر کیفی داده های توالی.داده‌های خام 454/Roche با استفاده از نرم‌افزار فروشنده از قالب نقشه جریان استاندارد باینری (sff) به قالب قابل خواندن توسط انسان پیرسون (fasta) تبدیل شدند.پردازش بیشتر توالی نوکلئوتیدی با استفاده از برنامه‌ها و اسکریپت‌های اختصاصی C (بسته نرم‌افزار منتشرنشده) به شرح زیر انجام شد.تجزیه و تحلیل داده های اولیه شامل روش های سخت فیلتر چند مرحله ای است.برای فیلتر کردن قرائت‌هایی که حاوی یک توالی DNA درج 12mer معتبر نیستند، خوانده‌ها به‌طور متوالی با برچسب شروع (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT)، برچسب توقف (TAAGCTTGCGGGCCGCACTCGAGTA) و درج پس‌زمینه (CCCTGCAGGGATATCCCGTCGGAATTCT) با استفاده از آزمون جهانی (CCCTGCAGGGATATCGTCGGAACWTC) تراز شدند.تراز اجازه می دهد تا 2 ناهماهنگی در هر تراز31.بنابراین، خواندن بدون برچسب شروع و توقف و خواندن حاوی درج پس زمینه، یعنی ترازهایی که بیش از تعداد مجاز عدم تطابق هستند، از کتابخانه حذف شدند.همانطور که برای خواندن باقی مانده، دنباله DNA N-mer که از علامت شروع گسترش می یابد و قبل از علامت توقف از توالی خواندن اصلی جدا می شود و بیشتر پردازش می شود (از این پس به عنوان "درج" نامیده می شود).پس از ترجمه اینسرت، قسمت بعد از اولین کدون توقف در انتهای 5' پرایمر از درج خارج می شود.علاوه بر این، نوکلئوتیدهای منتهی به کدون های ناقص در انتهای 3' پرایمر نیز حذف شدند.برای حذف درج‌هایی که فقط حاوی دنباله‌های پس‌زمینه هستند، درج‌های ترجمه‌شده با الگوی اسید آمینه «PAG» نیز حذف شدند.پپتیدهایی با طول پس از ترجمه کمتر از 3 اسید آمینه از کتابخانه حذف شدند.در نهایت، افزونگی را در insert pool حذف کنید و فرکانس هر درج منحصر به فرد را تعیین کنید.نتایج این تجزیه و تحلیل شامل فهرستی از توالی های نوکلئوتیدی (درج) و فرکانس (خواندن) آنها (شکل های تکمیلی 1c و 2) بود.
درج‌های DNA N-mer گروهی بر اساس شباهت توالی: برای حذف خطاهای توالی یابی خاص 454/Roche (مانند مشکلات مربوط به توالی‌یابی پسوندهای هموپلیمر) و حذف افزونگی‌های کمتر مهم، درج‌های توالی DNA N-mer فیلتر شده قبلی (درج‌ها) بر اساس شباهت مرتب می‌شوند.درج‌ها (حداکثر 2 پایه غیر منطبق مجاز) با استفاده از یک الگوریتم تکراری که به شرح زیر تعریف شده است: درج‌ها ابتدا بر اساس فراوانی (بالاترین به کمترین) و اگر یکسان هستند، بر اساس مرتب‌سازی ثانویه بر اساس طول (طولانی‌ترین به کوتاه‌ترین) مرتب‌سازی می‌شوند.بنابراین، متداول ترین و طولانی ترین درج ها اولین "گروه" را تعریف می کنند.فرکانس گروه روی فرکانس کلیدی تنظیم شده است.سپس، هر درج باقی مانده در لیست مرتب شده سعی شد تا با ترازهای دوتایی Needleman-Wunsch به گروه اضافه شود.اگر تعداد عدم تطابق، درج‌ها یا حذف‌ها در یک تراز از آستانه 2 تجاوز نکند، یک درج به گروه اضافه می‌شود و فرکانس کلی گروه با تعداد دفعات اضافه شدن درج افزایش می‌یابد.درج های اضافه شده به یک گروه به عنوان استفاده شده علامت گذاری می شوند و از پردازش بیشتر حذف می شوند.اگر دنباله درج را نتوان به یک گروه موجود اضافه کرد، دنباله درج برای ایجاد یک گروه جدید با فرکانس درج مناسب استفاده می شود و به عنوان مورد استفاده علامت گذاری می شود.تکرار زمانی به پایان می رسد که هر دنباله درج یا برای تشکیل یک گروه جدید استفاده شده باشد یا بتوان آن را در یک گروه موجود گنجاند.از این گذشته، درج های گروه بندی شده متشکل از نوکلئوتیدها در نهایت به دنباله های پپتیدی (کتابخانه های پپتیدی) ترجمه می شوند.نتیجه این تحلیل مجموعه‌ای از درج‌ها و فرکانس‌های متناظر آن‌ها است که تعداد خواندن‌های متوالی را تشکیل می‌دهند (شکل تکمیلی 2).
تولید موتیف: بر اساس فهرستی از پپتیدهای منحصر به فرد، کتابخانه ای ایجاد شد که شامل تمام الگوهای اسید آمینه ممکن (aa) مطابق شکل زیر است.هر الگوی ممکن به طول 3 از پپتید استخراج شد و الگوی معکوس آن به همراه یک کتابخانه موتیف مشترک حاوی تمام الگوها (تری پپتیدها) اضافه شد.کتابخانه‌های موتیف‌های بسیار تکراری توالی‌بندی شدند و افزونگی حذف شد.سپس برای هر تری پپتید در کتابخانه موتیف، وجود آن را در کتابخانه با استفاده از ابزارهای محاسباتی بررسی کردیم.در این مورد، فرکانس پپتید حاوی تری پپتید موتیف یافت شده اضافه شده و به موتیف موجود در کتابخانه موتیف ("تعداد نقوش") اختصاص داده می شود.نتیجه تولید موتیف یک آرایه دوبعدی است که شامل تمام رخدادهای تری پپتیدها (نقوش) و مقادیر مربوط به آنهاست، که تعداد دفعات خواندن توالی است که در هنگام فیلتر کردن، گروه بندی و ترجمه قرائت ها به موتیف مربوطه منجر می شود.معیارها همانطور که در بالا توضیح داده شد.
نرمال سازی تعداد نقوش و نمودارهای پراکندگی مربوطه: تعداد نقوش برای هر نمونه با استفاده از نرمال سازی شد.
که در آن ni تعداد خوانده شده حاوی مبحث i است.بنابراین، vi نشان دهنده درصد فرکانس خواندن (یا پپتیدها) حاوی موتیف i در نمونه است.مقادیر P برای تعداد غیر عادی نقوش با استفاده از آزمون دقیق فیشر محاسبه شد.با توجه به همبستگی تعداد انگیزه ها، همبستگی های اسپیرمن با استفاده از تعداد نرمال شده انگیزه ها با R محاسبه شد.
برای تجسم محتوای اسیدهای آمینه در هر موقعیت در کتابخانه پپتید، لوگوگرام های وب 32، 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ایجاد شد.ابتدا، محتوای اسیدهای آمینه در هر موقعیت از پپتید 12-mer در یک ماتریس 20×12 ذخیره می شود.سپس، مجموعه‌ای از 1000 پپتید حاوی محتوای اسید آمینه نسبی یکسان در هر موقعیت در قالب توالی سریع تولید می‌شود و به عنوان ورودی به وب آرم 3 ارائه می‌شود که نمایش گرافیکی محتوای اسید آمینه نسبی را در هر موقعیت ایجاد می‌کند.برای یک کتابخانه پپتید معینبرای تجسم مجموعه داده‌های چند بعدی، نقشه‌های حرارتی با استفاده از یک ابزار داخلی توسعه‌یافته در R (biosHeatmap، یک بسته R هنوز منتشر نشده) ایجاد شدند.دندروگرام های ارائه شده در نقشه های حرارتی با استفاده از روش خوشه بندی سلسله مراتبی وارد با متریک فاصله اقلیدسی محاسبه شد.برای تجزیه و تحلیل آماری داده‌های امتیازدهی موتیف، مقادیر P برای امتیازدهی غیر عادی با استفاده از آزمون دقیق فیشر محاسبه شد.مقادیر P برای سایر مجموعه‌های داده در R با استفاده از آزمون t-test یا ANOVA محاسبه شد.
کلون های فاژ انتخاب شده و فاژهای بدون درج به صورت داخل وریدی از طریق ورید دم (2×1010 فاژ / حیوان در 300 میکرولیتر PBS) تزریق شدند.ده دقیقه قبل از پرفیوژن و تثبیت بعدی، به همان حیوانات 100 میکرولیتر لکتین نشاندار شده با DyLight594 به صورت داخل وریدی تزریق شد (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 دقیقه پس از تزریق فاژ، موش‌ها با 50 میلی‌لیتر PBS و سپس 50 میلی‌لیتر PFA/PBS 4 درصد از طریق قلب پرفیوژن شدند.نمونه‌های مغز علاوه بر این، یک شبه در 4% PFA/PBS تثبیت شدند و در 4 درجه سانتیگراد در 30% ساکارز خیس شدند.نمونه ها در مخلوط OCT منجمد می شوند.آنالیز ایمونوهیستوشیمی نمونه‌های منجمد در دمای اتاق بر روی انجماد 30 میکرومتری مسدود شده با BSA 1% و انکوبه با آنتی‌بادی‌های پلی کلونال نشاندار شده با FITC علیه فاژ T7 (Novus NB 600-376A) در دمای 4 درجه سانتی‌گراد انجام شد.یک شبه جوجه کشی کنید.در نهایت، مقاطع 3 بار با PBS شسته و با میکروسکوپ لیزر کانفوکال (Leica TCS SP5) بررسی شدند.
تمام پپتیدها با حداقل خلوص 98٪ توسط GenScript USA سنتز، بیوتینیله و لیوفیلیز شدند.بیوتین از طریق یک اسپیسر گلیسین سه گانه اضافی در انتهای N متصل می شود.تمام پپتیدها را با استفاده از طیف سنجی جرمی بررسی کنید.
استرپتاویدین (S0677 سیگما) با 5 برابر مقدار اضافی هممولار پپتید بیوتینیله، پپتید مهارکننده BACE1 بیوتینیله، یا ترکیبی (نسبت 3:1) از پپتید بازدارنده BACE1 بیوتینیله و پپتید مهاری BACE1 در DM5-100% مهارکننده BACE1 مخلوط شد.1 ساعت قبل از تزریق در دمای اتاق.پپتیدهای کونژوگه با استرپتاویدین به صورت داخل وریدی با دوز 10 میلی گرم بر کیلوگرم به یکی از وریدهای دم موش های صحرایی با حفره مغزی تزریق شد.
غلظت کمپلکس های استرپتاویدین-پپتید با روش الایزا ارزیابی شد.صفحات میکروتیتر Nunc Maxisorp (سیگما) یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد با 1.5 میکروگرم در میلی لیتر آنتی بادی ضد استرپتاویدین موش پوشانده شدند (Thermo, MA1-20011).پس از مسدود کردن (بافر مسدود کننده: 140 نانومولار NaCL، 5 میلی‌مولار EDTA، 0.05% NP40، 0.25% ژلاتین، 1% BSA) در دمای اتاق به مدت 2 ساعت، صفحه را با 0.05% Tween-20/PBS (بافر شستشو) به مدت 3 ثانیه بشویید (بافر پلاسمایی شستشو) به مدت 3 ثانیه، بافر پلاسما به چاه اضافه شد. 0000، CSF 1:115).سپس پلیت یک شبه در دمای 4 درجه سانتی گراد با آنتی بادی تشخیص (1 میکروگرم در میلی لیتر، ضد استرپتاویدین-HRP، Novus NB120-7239) انکوبه شد.پس از سه مرحله شستشو، استرپتاویدین با انکوباسیون در محلول بستر TMB (روش) تا 20 دقیقه شناسایی شد.پس از توقف توسعه رنگ با 1M H2SO4، جذب را در 450 نانومتر اندازه گیری کنید.
عملکرد کمپلکس مهارکننده استرپتاویدین-پپتید-BACE1 با Aβ(1-40) ELISA مطابق پروتکل سازنده (Wako, 294-64701) ارزیابی شد.به طور خلاصه، نمونه‌های CSF در رقیق‌کننده استاندارد (1:23) رقیق شدند و یک شبه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در صفحات 96 چاهی پوشش‌داده‌شده با آنتی‌بادی جذب BNT77 انکوبه شدند.پس از پنج مرحله شستشو، آنتی بادی BA27 کونژوگه با HRP اضافه شد و به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شد و سپس پنج مرحله شستشو انجام شد.Aβ (1-40) با انکوباسیون در محلول TMB به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق تشخیص داده شد.پس از اینکه توسعه رنگ با محلول توقف متوقف شد، جذب را در 450 نانومتر اندازه گیری کنید.نمونه‌های پلاسما قبل از الایزا Aβ(1-40) تحت استخراج فاز جامد قرار گرفتند.پلاسما به 0.2% DEA (سیگما) در صفحات 96 چاهی اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.پس از شستشوی متوالی صفحات SPE (Oasis، 186000679) با آب و متانول 100٪، نمونه های پلاسما به صفحات SPE اضافه شد و تمام مایع خارج شد.نمونه ها شسته شدند (ابتدا با متانول 5% سپس متانول 30%) و با 2% NH4OH/90% متانول شستشو داده شدند.پس از خشک کردن محلول در دمای 55 درجه سانتی گراد به مدت 99 دقیقه در جریان ثابت N2، نمونه ها در رقیق کننده های استاندارد کاهش یافتند و Aβ(1-40) همانطور که در بالا توضیح داده شد اندازه گیری شد.
نحوه استناد به این مقاله: Urich, E. et al.تحویل محموله به مغز با استفاده از پپتیدهای ترانزیت شناسایی شده در داخل بدن.علم.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J.، Skjorringe T.، Thomsen LB و Moos T. تحویل داروهای ماکرومولکولی به مغز با استفاده از درمان هدفمند.Journal of Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic، I.، Steinbusch، HW، Schmitz، C.، و Martinez-Martinez، P. تحویل داروهای پپتیدی و پروتئینی در سراسر سد خونی مغزی.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge، WM سد خونی مغزی: گلوگاهی در توسعه داروهای مغزی.NeuroRx 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson، KE، Duncan، JA، Stopa، EG، و Byrd، A. چشم انداز بهبود انتقال دارو و هدف قرار دادن مغز از طریق مسیر شبکه کوروئید-CSF.Pharmaceutical Research 22, 1011-1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge، WM نوسازی بیوداروها با اسب های تروجان مولکولی برای تحویل مغز.Bioconjug Chem 19، 1327-1338، 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge، انتقال پپتید با واسطه گیرنده WM از طریق سد خونی مغزی.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.افزایش نفوذ مغز و اثر بخشی آنتی بادی های درمانی با استفاده از شاتل های مولکولی تک ظرفیتی.Neuron 81, 49-60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
بین لی، ان و همکاران.انتقال گیرنده ترانسفرین (TfR) جذب مغز انواع میل آنتی بادی های TfR را تعیین می کند.J Exp Med 211, 233-244, 10.1084/jem.20131660 (2014).