از بازدید شما از Nature.com متشکریم. شما از نسخه مرورگری با پشتیبانی محدود از CSS استفاده می‌کنید. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). علاوه بر این، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت نمایش می‌دهیم.
یک چرخ و فلک از سه اسلاید را به طور همزمان نمایش می‌دهد. از دکمه‌های قبلی و بعدی برای حرکت بین سه اسلاید به طور همزمان استفاده کنید، یا از دکمه‌های کشویی در انتها برای حرکت بین سه اسلاید به طور همزمان استفاده کنید.
سد خونی-مغزی و سد خونی-مغزی مانع از رسیدن عوامل زیست‌درمانی به اهدافشان در سیستم عصبی مرکزی می‌شوند و در نتیجه درمان مؤثر بیماری‌های عصبی را مختل می‌کنند. برای کشف ناقل‌های جدید مغز در داخل بدن (in vivo)، ما یک کتابخانه پپتید فاژ T7 را معرفی کردیم و خون و مایع مغزی نخاعی (CSF) را به صورت سریالی با استفاده از یک مدل مخزن بزرگ و آگاهانه کانول‌گذاری شده از موش‌ها جمع‌آوری کردیم. کلون‌های فاژ خاص پس از چهار دور انتخاب، در CSF بسیار غنی شدند. آزمایش پپتیدهای کاندید منفرد، غنی‌سازی بیش از 1000 برابری را در CSF نشان داد. فعالیت زیستی تحویل با واسطه پپتید به مغز با کاهش 40 درصدی سطح آمیلوئید-β در مایع مغزی نخاعی با استفاده از یک مهارکننده پپتید BACE1 مرتبط با پپتید انتقالی جدید شناسایی شده تأیید شد. این نتایج نشان می‌دهد که پپتیدهای شناسایی شده توسط روش‌های انتخاب فاژ در داخل بدن (in vivo) ممکن است حامل‌های مفیدی برای تحویل سیستمیک ماکرومولکول‌ها به مغز با اثر درمانی باشند.
تحقیقات درمان هدفمند سیستم عصبی مرکزی (CNS) تا حد زیادی بر شناسایی داروها و عوامل بهینه‌ای که خواص هدف‌گیری CNS را نشان می‌دهند، متمرکز بوده است و تلاش کمتری برای کشف مکانیسم‌هایی که دارورسانی فعال به مغز را هدایت می‌کنند، صورت گرفته است. این وضعیت اکنون در حال تغییر است زیرا دارورسانی، به ویژه مولکول‌های بزرگ، بخش جدایی‌ناپذیری از توسعه داروهای علوم اعصاب مدرن است. محیط سیستم عصبی مرکزی به خوبی توسط سیستم سد عروقی مغزی، متشکل از سد خونی-مغزی (BBB) ​​و سد خونی-مغزی (BCBB)1 محافظت می‌شود، که رساندن دارو به مغز را چالش‌برانگیز می‌کند1،2. تخمین زده می‌شود که تقریباً تمام داروهای مولکول بزرگ و بیش از 98٪ از داروهای مولکول کوچک از مغز حذف می‌شوند3. به همین دلیل شناسایی سیستم‌های جدید انتقال مغز که تحویل کارآمد و اختصاصی داروهای درمانی به CNS را فراهم می‌کنند، بسیار مهم است4،5. با این حال، BBB و BCSFB همچنین فرصت بسیار خوبی برای دارورسانی ارائه می‌دهند زیرا از طریق عروق گسترده مغز به تمام ساختارهای آن نفوذ کرده و وارد می‌شوند. بنابراین، تلاش‌های فعلی برای استفاده از روش‌های غیرتهاجمی انتقال به مغز تا حد زیادی مبتنی بر مکانیسم انتقال با واسطه گیرنده (PMT) با استفاده از گیرنده درون‌زا BBB6 است. با وجود پیشرفت‌های کلیدی اخیر با استفاده از مسیر گیرنده ترانسفرین7،8، توسعه بیشتر سیستم‌های انتقال جدید با خواص بهبود یافته مورد نیاز است. برای این منظور، هدف ما شناسایی پپتیدهایی بود که قادر به واسطه‌گری انتقال CSF باشند، زیرا در اصل می‌توانند برای انتقال ماکرومولکول‌ها به CNS یا باز کردن مسیرهای گیرنده جدید استفاده شوند. به طور خاص، گیرنده‌ها و انتقال‌دهنده‌های خاص سیستم عروقی مغزی (BBB و BSCFB) می‌توانند به عنوان اهداف بالقوه برای انتقال فعال و اختصاصی داروهای زیست‌درمانی عمل کنند. مایع مغزی نخاعی (CSF) یک محصول ترشحی از شبکه کوروئید (CS) است و از طریق فضای زیر عنکبوتیه و فضای بطنی در تماس مستقیم با مایع بینابینی مغز است4. اخیراً نشان داده شده است که مایع مغزی نخاعی زیر عنکبوتیه به طور بیش از حد به داخل فضای بینابینی مغز پخش می‌شود9. ما امیدواریم که با استفاده از این مجرای ورودی زیر عنکبوتیه یا مستقیماً از طریق سد خونی مغزی به فضای پارانشیمی دسترسی پیدا کنیم. برای دستیابی به این هدف، ما یک استراتژی قوی انتخاب فاژ در داخل بدن (in vivo) را پیاده‌سازی کردیم که در حالت ایده‌آل پپتیدهای منتقل شده توسط هر یک از این دو مسیر مجزا را شناسایی می‌کند.
اکنون ما یک روش غربالگری نمایش فاژ متوالی در داخل بدن (in vivo) را با نمونه‌برداری CSF همراه با توالی‌یابی با توان عملیاتی بالا (HTS) برای نظارت بر دورهای انتخاب اولیه با بالاترین تنوع کتابخانه‌ای شرح می‌دهیم. غربالگری بر روی موش‌های هوشیار با یک کانول سیسترنای بزرگ (CM) کاشته شده دائمی برای جلوگیری از آلودگی خون انجام شد. نکته مهم این است که این رویکرد هم پپتیدهای هدف‌گیری کننده مغز و هم پپتیدهایی با فعالیت انتقال از سد عروقی مغزی را انتخاب می‌کند. ما از فاژهای T7 به دلیل اندازه کوچکشان (حدود 60 نانومتر)10 استفاده کردیم و پیشنهاد کردیم که آنها برای انتقال وزیکول‌هایی که امکان عبور بین سلولی از سد اندوتلیال و/یا اپیتلیال-مغز را فراهم می‌کنند، مناسب هستند. پس از چهار دور بررسی، جمعیت‌های فاژ جدا شدند که غنی‌سازی قوی CSF در داخل بدن و ارتباط ریزرگ‌های مغزی را نشان دادند. نکته مهم این است که ما توانستیم یافته‌های خود را با نشان دادن اینکه بهترین پپتیدهای کاندید ترجیحی و سنتز شده شیمیایی قادر به انتقال محموله پروتئین به مایع مغزی نخاعی هستند، تأیید کنیم. ابتدا، اثرات فارماکودینامیک سیستم عصبی مرکزی (CNS) با ترکیب یک پپتید انتقالی پیشرو با یک مهارکننده پپتید BACE1 مشخص شد. علاوه بر نشان دادن اینکه استراتژی‌های غربالگری عملکردی درون تنی می‌توانند پپتیدهای انتقالی جدید مغز را به عنوان حامل‌های مؤثر محموله پروتئینی شناسایی کنند، انتظار داریم رویکردهای انتخاب عملکردی مشابه نیز در شناسایی مسیرهای انتقالی جدید مغز اهمیت پیدا کنند.
بر اساس واحدهای تشکیل‌دهنده پلاک (PFU)، پس از مرحله بسته‌بندی فاژ، کتابخانه‌ای از پپتیدهای فاژ خطی T7 با طول 12-mer تصادفی با تنوع تقریبی 109 طراحی و ایجاد شد (به مواد و روش‌ها مراجعه کنید). لازم به ذکر است که ما این کتابخانه را قبل از بررسی درون‌تنی (in vivo) به دقت تجزیه و تحلیل کردیم. تکثیر PCR نمونه‌های کتابخانه فاژ با استفاده از پرایمرهای اصلاح‌شده، آمپلیکون‌هایی تولید کرد که مستقیماً برای HTS قابل استفاده بودند (شکل تکمیلی 1a). به دلیل الف) خطاهای توالی‌یابی HTS11، ب) تأثیر بر کیفیت پرایمرها (NNK)1-12، و ج) وجود فاژ نوع وحشی (wt) (درج‌های اسکلتی) در کتابخانه آماده به کار، یک روش فیلترینگ توالی برای استخراج فقط اطلاعات توالی تأیید شده اجرا شد (شکل تکمیلی 1b). این مراحل فیلتر برای همه کتابخانه‌های توالی‌یابی HTS اعمال می‌شود. برای کتابخانه استاندارد، در مجموع 233868 خوانش به دست آمد که 39٪ از آنها معیارهای فیلتر را پشت سر گذاشتند و برای تجزیه و تحلیل کتابخانه و انتخاب برای دورهای بعدی استفاده شدند (شکل تکمیلی 1c-e). خوانش‌ها عمدتاً مضربی از 3 جفت باز با پیک در 36 نوکلئوتید بودند (شکل تکمیلی 1c)، که طراحی کتابخانه (NNK) 1-12 را تأیید می‌کند. نکته قابل توجه این است که تقریباً 11٪ از اعضای کتابخانه حاوی یک درج PAGISRELVDKL ستون فقرات 12 بعدی (wt) بودند و تقریباً نیمی از توالی‌ها (49٪) حاوی درج یا حذف بودند. HTS کتابخانه کتابخانه، تنوع بالای پپتیدها در کتابخانه را تأیید کرد: بیش از 81٪ از توالی‌های پپتیدی فقط یک بار یافت شدند و تنها 1.5٪ در ≥4 کپی رخ دادند (شکل تکمیلی 2a). فراوانی اسیدهای آمینه (aa) در هر 12 موقعیت در مجموعه، همبستگی خوبی با فراوانی‌های مورد انتظار برای تعداد کدون‌های تولید شده توسط مجموعه NKK منحط داشت (شکل تکمیلی 2b). فراوانی مشاهده شده از باقیمانده‌های aa که توسط این الحاقات کدگذاری شده بودند، همبستگی خوبی با فراوانی محاسبه شده (r = 0.893) داشت (شکل تکمیلی 2c). آماده‌سازی کتابخانه‌های فاژ برای تزریق شامل مراحل تکثیر و حذف اندوتوکسین است. قبلاً نشان داده شده است که این امر به طور بالقوه تنوع کتابخانه‌های فاژ را کاهش می‌دهد12،13. بنابراین، ما یک کتابخانه فاژ تکثیر شده در صفحه که تحت حذف اندوتوکسین قرار گرفته بود را توالی‌یابی کردیم و آن را با کتابخانه اصلی مقایسه کردیم تا فراوانی AA را تخمین بزنیم. همبستگی قوی (r = 0.995) بین مجموعه اصلی و مجموعه تکثیر شده و خالص‌سازی شده مشاهده شد (شکل تکمیلی 2d)، که نشان می‌دهد رقابت بین کلون‌های تکثیر شده در صفحات با استفاده از فاژ T7 باعث سوگیری عمده نشده است. این مقایسه بر اساس فراوانی موتیف‌های سه‌پپتیدی در هر کتابخانه انجام شده است، زیرا تنوع کتابخانه‌ها (~109) حتی با HTS نیز به طور کامل قابل ثبت نیست. تجزیه و تحلیل فراوانی aa در هر موقعیت، یک بایاس وابسته به موقعیت کوچک را در سه موقعیت آخر رپرتوار وارد شده نشان داد (شکل تکمیلی 2e). در نتیجه، به این نتیجه رسیدیم که کیفیت و تنوع کتابخانه قابل قبول بوده و تنها تغییرات جزئی در تنوع به دلیل تکثیر و آماده‌سازی کتابخانه‌های فاژ بین چندین دور انتخاب مشاهده شده است.
نمونه‌برداری سریالی از مایع مغزی نخاعی می‌تواند با کاشت جراحی یک کانول در CM موش‌های هوشیار انجام شود تا شناسایی فاژ T7 که به صورت داخل وریدی (iv) از طریق BBB و/یا BCSFB تزریق شده است، تسهیل شود (شکل 1a-b). ما در سه دور اول انتخاب درون‌تنی (in vivo) از دو بازوی انتخاب مستقل (بازوهای A و B) استفاده کردیم (شکل 1c). ما به تدریج با کاهش مقدار کل فاژ معرفی شده در سه دور اول انتخاب، دقت انتخاب را افزایش دادیم. برای دور چهارم panning، نمونه‌ها را از شاخه‌های A و B ترکیب کردیم و سه انتخاب مستقل دیگر انجام دادیم. برای مطالعه خواص درون‌تنی ذرات فاژ T7 در این مدل، فاژ نوع وحشی (PAGISRELVDKL master insert) از طریق ورید دم به موش‌ها تزریق شد. بازیابی فاژها از مایع مغزی نخاعی و خون در نقاط زمانی مختلف نشان داد که فاژهای بیست‌وجهی T7 نسبتاً کوچک، فاز پاکسازی اولیه سریعی از محفظه خون دارند (شکل تکمیلی 3). بر اساس تیترهای تجویز شده و حجم خون موش‌ها، محاسبه کردیم که تنها تقریباً 1٪ وزنی فاژ از دوز تجویز شده، 10 دقیقه پس از تزریق داخل وریدی در خون شناسایی شد. پس از این کاهش سریع اولیه، پاکسازی اولیه کندتری با نیمه عمر 27.7 دقیقه اندازه‌گیری شد. نکته مهم این است که تنها تعداد بسیار کمی فاژ از بخش CSF بازیابی شدند که نشان‌دهنده زمینه کم مهاجرت فاژ نوع وحشی به بخش CSF است (شکل تکمیلی 3). به طور متوسط، تنها حدود 1 × 10-3٪ تیتر فاژ T7 در خون و 4 × 10-8٪ از فاژهای تزریق شده اولیه در مایع مغزی نخاعی در کل دوره نمونه‌برداری (0-250 دقیقه) شناسایی شدند. نکته قابل توجه این است که نیمه عمر (25.7 دقیقه) فاژ نوع وحشی در مایع مغزی نخاعی مشابه نیمه عمر مشاهده شده در خون بود. این داده‌ها نشان می‌دهند که سد جداکننده‌ی بخش CSF از خون در موش‌های کانول‌گذاری‌شده با CM دست‌نخورده باقی می‌ماند و امکان انتخاب درون‌تنی کتابخانه‌های فاژ برای شناسایی کلون‌هایی که به راحتی از خون به بخش CSF منتقل می‌شوند را فراهم می‌کند.
(الف) ایجاد روشی برای نمونه‌برداری مجدد از مایع مغزی نخاعی (CSF) از یک مخزن بزرگ. (ب) نموداری که موقعیت سلولی سد سیستم عصبی مرکزی (CNS) و استراتژی انتخاب مورد استفاده برای شناسایی پپتیدهایی که از سد خونی-مغزی (BBB) ​​و سد خونی-مغزی عبور می‌کنند را نشان می‌دهد. (ج) نمودار جریان غربالگری نمایش فاژ در داخل بدن. در هر دور انتخاب، فاژها (شناساگرهای حیوانی داخل فلش‌ها) به صورت داخل وریدی تزریق شدند. دو شاخه جایگزین مستقل (A، B) تا دور چهارم انتخاب به طور جداگانه نگهداری می‌شوند. برای دورهای انتخاب 3 و 4، هر کلون فاژ استخراج شده از CSF به صورت دستی توالی‌یابی شد. (د) سینتیک فاژ جدا شده از خون (دایره‌های قرمز) و مایع مغزی نخاعی (مثلث‌های سبز) در طول دور اول انتخاب در دو موش کانول‌گذاری شده پس از تزریق داخل وریدی کتابخانه پپتیدی T7 (2 x 1012 فاژ/حیوان). مربع‌های آبی میانگین غلظت اولیه فاژ در خون را نشان می‌دهند که از مقدار فاژ تزریق‌شده با در نظر گرفتن حجم کل خون محاسبه می‌شود. مربع‌های سیاه نقطه تقاطع خط y برون‌یابی‌شده از غلظت فاژ خون را نشان می‌دهند. (e,f) فراوانی نسبی و توزیع تمام موتیف‌های تری‌پپتیدی همپوشانی‌دار ممکن یافت‌شده در پپتید را ارائه دهید. تعداد موتیف‌های یافت‌شده در 1000 خوانش نشان داده شده است. موتیف‌های غنی‌شده به‌طور قابل‌توجهی (p < 0.001) با نقاط قرمز مشخص شده‌اند. (e) نمودار پراکندگی همبستگی که فراوانی نسبی موتیف تری‌پپتیدی کتابخانه تزریق‌شده را با فاژ مشتق‌شده از خون از حیوانات شماره 1.1 و 1.2 مقایسه می‌کند. (f) نمودار پراکندگی همبستگی که فراوانی نسبی موتیف‌های تری‌پپتیدی فاژ حیوانی شماره 1.1 و 1.2 جدا شده در خون و مایع مغزی نخاعی را مقایسه می‌کند. (g، h) نمایش شناسه توالی فاژ غنی‌شده در خون (g) در مقابل کتابخانه‌های تزریق‌شده و فاژ غنی‌شده در CSF (h) در مقابل خون پس از یک دور انتخاب درون‌تنی در هر دو حیوان. اندازه کد تک‌حرفی نشان می‌دهد که آن اسید آمینه چند بار در آن موقعیت قرار می‌گیرد. سبز = قطبی، بنفش = خنثی، آبی = بازی، قرمز = اسیدی و سیاه = اسیدهای آمینه آبگریز. شکل 1a، b توسط ادوارد اوریچ طراحی و تولید شده است.
ما یک کتابخانه پپتید فاژ را به دو موش صحرایی ابزار CM (کلادهای A و B) تزریق کردیم و فاژ را از مایع مغزی نخاعی و خون جدا کردیم (شکل 1d). پاکسازی سریع اولیه کتابخانه در مقایسه با فاژ نوع وحشی کمتر بود. میانگین نیمه عمر کتابخانه تزریق شده در هر دو حیوان 24.8 دقیقه در خون، مشابه فاژ نوع وحشی، و 38.5 دقیقه در CSF بود. نمونه‌های فاژ خون و مایع مغزی نخاعی از هر حیوان تحت HTS قرار گرفتند و همه پپتیدهای شناسایی شده برای وجود یک موتیف کوتاه تری پپتیدی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. موتیف‌های تری پپتیدی انتخاب شدند زیرا پایه حداقلی را برای تشکیل ساختار و برهمکنش‌های پپتید-پروتئین فراهم می‌کنند14،15. ما همبستگی خوبی در توزیع موتیف‌ها بین کتابخانه فاژ تزریق شده و کلون‌های استخراج شده از خون هر دو حیوان یافتیم (شکل 1e). داده‌ها نشان می‌دهند که ترکیب کتابخانه فقط به طور جزئی در محفظه خون غنی شده است. فراوانی اسیدهای آمینه و توالی‌های اجماعی در هر موقعیت با استفاده از اقتباسی از نرم‌افزار Weblogo16 بیشتر مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. جالب توجه است که ما غنی‌سازی قوی در باقیمانده‌های گلیسین خون را مشاهده کردیم (شکل 1g). هنگامی که خون با کلون‌های انتخاب شده از CSF مقایسه شد، انتخاب قوی و برخی از عدم انتخاب موتیف‌ها مشاهده شد (شکل 1f) و برخی از اسیدهای آمینه ترجیحاً در موقعیت‌های از پیش تعیین شده در 12 عضو وجود داشتند (شکل 1h). نکته قابل توجه این است که حیوانات به طور قابل توجهی در مایع مغزی نخاعی متفاوت بودند، در حالی که غنی‌سازی گلیسین خون در هر دو حیوان مشاهده شد (شکل تکمیلی 4a-j). پس از فیلتر دقیق داده‌های توالی در مایع مغزی نخاعی حیوانات شماره 1.1 و شماره 1.2، در مجموع 964 و 420 پپتید 12 مر منحصر به فرد به دست آمد (شکل تکمیلی 1d-e). کلون‌های فاژ جدا شده تکثیر شده و تحت دور دوم انتخاب درون تنی قرار گرفتند. فاژ استخراج‌شده از دور دوم انتخاب، در هر حیوان تحت HTS قرار گرفت و تمام پپتیدهای شناسایی‌شده به عنوان ورودی به یک برنامه تشخیص موتیف برای تجزیه و تحلیل وقوع موتیف‌های سه‌پپتیدی استفاده شدند (شکل 2a، b، ef). در مقایسه با چرخه اول فاژ بازیابی‌شده از CSF، انتخاب و حذف بیشتر موتیف‌های بسیاری را در CSF در شاخه‌های A و B مشاهده کردیم (شکل 2). یک الگوریتم شناسایی شبکه برای تعیین اینکه آیا آنها الگوهای متفاوتی از توالی سازگار را نشان می‌دهند یا خیر، اعمال شد. شباهت واضحی بین توالی‌های 12 بعدی بازیابی‌شده توسط CSF در کلاد جایگزین A (شکل 2c، d) و کلاد B (شکل 2g، h) مشاهده شد. تجزیه و تحلیل تجمیعی در هر شاخه، پروفایل‌های انتخاب متفاوتی را برای پپتیدهای 12 مره (شکل تکمیلی 5c، d) و افزایش نسبت تیتر CSF/خون را در طول زمان برای کلون‌های تجمیعی پس از دور دوم انتخاب در مقایسه با دور اول انتخاب (شکل تکمیلی 5e) نشان داد.
غنی‌سازی موتیف‌ها و پپتیدها در مایع مغزی نخاعی با دو دور متوالی انتخاب نمایش فاژ عملکردی در داخل بدن.
تمام فاژهای مایع مغزی نخاعی بازیابی شده از دور اول هر حیوان (حیوانات شماره ۱.۱ و ۱.۲) جمع‌آوری، تکثیر، توالی‌یابی HT و دوباره به هم تزریق شدند (۲ x ۱۰۱۰ فاژ/حیوان). ۲ موش کانول‌گذاری شده با SM (#۱.۱ → #). ۲.۱ و ۲.۲، ۱.۲ → ۲.۳ و ۲.۴). (a,b,e,f) نمودارهای پراکندگی همبستگی که فراوانی نسبی موتیف‌های تری‌پپتیدی تمام فاژهای مشتق شده از CSF را در دورهای انتخاب اول و دوم مقایسه می‌کنند. فراوانی نسبی و توزیع موتیف‌ها که نشان دهنده تمام تری‌پپتیدهای همپوشانی ممکن است که در پپتیدها در هر دو جهت یافت می‌شوند. تعداد موتیف‌های یافت شده در ۱۰۰۰ خوانش نشان داده شده است. موتیف‌هایی که به طور قابل توجهی (p < ۰.۰۰۱) در یکی از کتابخانه‌های مقایسه شده انتخاب یا حذف شده‌اند، با نقاط قرمز برجسته شده‌اند. (c، d، g، h) نمایش لوگوی توالی از تمام توالی‌های 12 اسید آمینه‌ای غنی از CSF بر اساس دورهای 2 و 1 انتخاب درون‌تنی. اندازه کد تک‌حرفی نشان می‌دهد که آن اسید آمینه چند بار در آن موقعیت قرار می‌گیرد. برای نمایش لوگو، فراوانی توالی‌های CSF استخراج‌شده از حیوانات منفرد بین دو دور انتخاب مقایسه شده و توالی‌های غنی‌شده در دور دوم نشان داده شده‌اند: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 و (h) #1.2–#2.4. غنی‌ترین اسیدهای آمینه در یک موقعیت معین در (c، d) حیوانات شماره 2.1 و شماره 2.2 یا (g، h) در حیوانات شماره 2.3 و شماره 2.4 به صورت رنگی نشان داده شده‌اند. سبز = قطبی، بنفش = خنثی، آبی = بازی، قرمز = اسیدی و سیاه = اسیدهای آمینه آبگریز.
پس از دور سوم انتخاب، ما 124 توالی پپتیدی منحصر به فرد (شماره 3.1 و شماره 3.2) را از 332 کلون فاژ بازسازی شده با CSF جدا شده از دو حیوان شناسایی کردیم (شکل تکمیلی 6a). توالی LGSVS (18.7٪) بالاترین نسبت نسبی را داشت و پس از آن درج‌های نوع وحشی PAGISRELVDKL (8.2٪)، MRWFFSHASQGR (3٪)، DVAKVS (3٪)، TWLFSLG (2.2٪) و SARGSWREIVSLS (2.2٪) قرار داشتند. در دور چهارم نهایی، دو شاخه مستقل انتخاب شده از سه حیوان جداگانه را با هم ترکیب کردیم (شکل 1c). از 925 کلون فاژ توالی‌یابی شده بازیابی شده از CSF، در دور چهارم 64 توالی پپتیدی منحصر به فرد پیدا کردیم (شکل تکمیلی 6b)، که در میان آنها نسبت نسبی فاژ نوع وحشی به 0.8٪ کاهش یافت. رایج‌ترین کلون‌های CSF در دور چهارم LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%)، LGSVS (17%)، GFVRFRLSNTR (14%)، KVAWRVFSLFWK (7%)، SVHGV (5%)، GRPQKINGARVC (3.6%) و RLSSVDSDLSGC (3, 2%) بودند. %). محدوده طول پپتیدهای انتخاب شده به دلیل درج/حذف نوکلئوتیدی یا کدون‌های پایان زودرس در آغازگرهای کتابخانه هنگام استفاده از کدون‌های منحط برای طراحی کتابخانه NNK است. کدون‌های پایان زودرس پپتیدهای کوتاه‌تری تولید می‌کنند و به دلیل داشتن موتیف aa مطلوب انتخاب می‌شوند. پپتیدهای طولانی‌تر ممکن است ناشی از درج/حذف در آغازگرهای کتابخانه‌های مصنوعی باشند. این کار کدون پایان طراحی شده را در خارج از قاب قرار می‌دهد و آن را می‌خواند تا زمانی که یک کدون پایان جدید در پایین دست ظاهر شود. به طور کلی، ما فاکتورهای غنی‌سازی را برای هر چهار دور انتخاب با مقایسه داده‌های ورودی با داده‌های خروجی نمونه محاسبه کردیم. برای دور اول غربالگری، از تیترهای فاژ وحشی به عنوان مرجع پس‌زمینه غیر اختصاصی استفاده کردیم. جالب توجه است که انتخاب فاژ منفی در اولین چرخه CSF بسیار قوی بود، اما در خون اینطور نبود (شکل 3a)، که ممکن است به دلیل احتمال کم انتشار غیرفعال اکثر اعضای کتابخانه پپتید به محفظه CSF باشد یا اینکه فاژهای نسبی تمایل دارند که نسبت به باکتریوفاژها، به طور مؤثرتری از جریان خون حفظ یا حذف شوند. با این حال، در دور دوم غربالگری، انتخاب قوی فاژها در CSF در هر دو کلاد مشاهده شد، که نشان می‌دهد دور قبلی در فاژهایی که پپتیدهایی را نشان می‌دهند که جذب CSF را افزایش می‌دهند، غنی شده بود (شکل 3a). باز هم، بدون غنی‌سازی قابل توجه خون. همچنین در دور سوم و چهارم، کلون‌های فاژ به طور قابل توجهی در CSF غنی شدند. با مقایسه فراوانی نسبی هر توالی پپتیدی منحصر به فرد بین دو دور آخر انتخاب، متوجه شدیم که توالی‌ها در دور چهارم انتخاب حتی غنی‌تر شده‌اند (شکل 3b). در مجموع ۹۳۱ موتیف سه پپتیدی از هر ۶۴ توالی پپتیدی منحصر به فرد با استفاده از هر دو جهت‌گیری پپتیدی استخراج شد. موتیف‌های غنی‌شده در دور چهارم، در مقایسه با کتابخانه تزریق‌شده (حد آستانه: ۱۰٪ غنی‌سازی) با دقت بیشتری برای پروفایل‌های غنی‌سازی‌شان در تمام دورها بررسی شدند (شکل تکمیلی ۶c). الگوهای کلی انتخاب نشان داد که بیشتر موتیف‌های مورد مطالعه در تمام دورهای قبلی هر دو شاخه انتخاب غنی‌شده بودند. با این حال، برخی از موتیف‌ها (مانند SGL، VSG، LGS GSV) عمدتاً از کلاد جایگزین A بودند، در حالی که برخی دیگر (مانند FGW، RTN، WGF، NTR) در کلاد جایگزین B غنی‌شده بودند.
اعتبارسنجی انتقال پپتیدهای نمایش داده شده توسط فاژ غنی شده با CSF و پپتیدهای رهبر بیوتینیله شده متصل به محموله‌های استرپتاویدین به CSF.
(الف) نسبت‌های غنی‌سازی محاسبه‌شده در هر چهار دور (R1-R4) بر اساس تیترهای فاژ (PFU) تزریق‌شده (ورودی = I) و تیترهای فاژ CSF تعیین‌شده (خروجی = O). فاکتورهای غنی‌سازی برای سه دور آخر (R2-R4) با مقایسه با دور قبلی و دور اول (R1) با داده‌های وزنی محاسبه شدند. میله‌های باز مایع مغزی نخاعی و میله‌های سایه‌دار پلاسما هستند. (***p<0.001، بر اساس آزمون t-student). (ب) فهرست فراوان‌ترین پپتیدهای فاژ، که بر اساس نسبت نسبی آنها به تمام فاژهای جمع‌آوری‌شده در CSF پس از دور چهارم انتخاب رتبه‌بندی شده‌اند. شش کلون فاژ رایج با رنگ، شماره‌گذاری و فاکتورهای غنی‌سازی آنها بین دورهای 3 و 4 انتخاب (درج‌ها) برجسته شده‌اند. (ج، د) شش کلون فاژ غنی‌شده، فاژ خالی و کتابخانه‌های پپتید فاژ والدین از دور چهارم به صورت جداگانه در یک مدل نمونه‌برداری CSF مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نمونه‌های مایع مغزی نخاعی (CSF) و خون در زمان‌های مشخص شده جمع‌آوری شدند. (ج) مقادیر مساوی از 6 کلون فاژ کاندید (2 x 1010 فاژ/حیوان)، فاژهای خالی (#1779) (2 x 1010 فاژ/حیوان) و کتابخانه‌های پپتید فاژ ذخیره (2 x 1012 فاژ/حیوان). حداقل 3 CM از طریق ورید دم به حیوان کانول‌گذاری شده به طور جداگانه تزریق می‌شود. فارماکوکینتیک CSF هر کلون فاژ تزریق شده و کتابخانه پپتید فاژ در طول زمان نشان داده شده است. (د) میانگین نسبت CSF/خون را برای همه فاژهای بازیابی شده در میلی‌لیتر در طول زمان نمونه‌برداری نشان می‌دهد. (ه) چهار پپتید رهبر مصنوعی و یک کنترل درهم‌ریخته شده با بیوتین از طریق انتهای N خود به استرپتاویدین متصل شدند (نمایش تترامر) و سپس تزریق (وریدی ورید دم، 10 میلی‌گرم استرپتاویدین/کیلوگرم). حداقل سه موش اینتوبه شده (N = 3). نمونه‌های CSF در زمان‌های مشخص شده جمع‌آوری شدند و غلظت استرپتاویدین با استفاده از روش الایزای ضد استرپتاویدین CSF اندازه‌گیری شد (nd = شناسایی نشد). (*p<0.05، **p<0.01، ***p<0.001، بر اساس آزمون ANOVA). (و) مقایسه توالی اسید آمینه غنی‌ترین کلون پپتید فاژ شماره 2002 (بنفش) با سایر کلون‌های پپتید فاژ انتخاب شده از دور چهارم انتخاب. قطعات اسید آمینه یکسان و مشابه با رنگ کدگذاری شده‌اند.
از بین تمام فاژهای غنی‌شده در دور چهارم (شکل 3b)، شش کلون کاندید برای تجزیه و تحلیل بیشتر انفرادی در مدل نمونه‌برداری CSF انتخاب شدند. مقادیر مساوی از شش فاژ کاندید، فاژ خالی (بدون ورودی) و کتابخانه‌های پپتیدی پروفاژ به سه حیوان CM کانول‌گذاری شده تزریق شد و فارماکوکینتیک در سنجش‌های CSF (شکل 3c) و خون (شکل تکمیلی 7) تعیین شد. تمام کلون‌های فاژ آزمایش‌شده، بخش CSF را در سطحی 10 تا 1000 برابر بیشتر از فاژ کنترل خالی (#1779) هدف قرار دادند. به عنوان مثال، کلون‌های #2020 و #2077 حدود 1000 برابر تیتر CSF بالاتری نسبت به فاژ کنترل داشتند. مشخصات فارماکوکینتیک هر پپتید انتخاب‌شده متفاوت است، اما همه آنها توانایی بالایی در لانه‌گزینی CSF دارند. ما کاهش مداومی را در طول زمان برای کلون‌های شماره ۱۹۰۳ و ۲۰۱۱ مشاهده کردیم، در حالی که برای کلون‌های شماره ۲۰۷۷، ۲۰۰۲ و ۲۰۰۹ افزایش در طول ۱۰ دقیقه اول ممکن است نشان دهنده انتقال فعال باشد اما نیاز به تأیید دارد. کلون‌های شماره ۲۰۲۰، ۲۰۰۲ و ۲۰۷۷ در سطوح بالا تثبیت شدند، در حالی که غلظت CSF کلون شماره ۲۰۰۹ پس از افزایش اولیه به آرامی کاهش یافت. سپس فراوانی نسبی هر کاندید CSF را با غلظت خون آن مقایسه کردیم (شکل ۳d). همبستگی میانگین تیتر هر کاندید CSF با تیتر خون آن در تمام زمان‌های نمونه‌برداری نشان داد که سه مورد از شش کاندید به طور قابل توجهی در CSF خون غنی شده بودند. جالب توجه است که کلون شماره ۲۰۷۷ پایداری خونی بالاتری را نشان داد (شکل تکمیلی ۷). برای تأیید اینکه خود پپتیدها قادر به انتقال فعال محموله‌هایی غیر از ذرات فاژ به داخل محفظه CSF هستند، ما چهار پپتید پیشرو را که با بیوتین در انتهای N، جایی که پپتیدها به ذره فاژ متصل می‌شوند، مشتق شده‌اند، سنتز کردیم. پپتیدهای بیوتینیله شده (شماره‌های 2002، 2009، 2020 و 2077) با استرپتاویدین (SA) کونژوگه شدند تا فرم‌های چندمری که تا حدودی هندسه فاژ را تقلید می‌کنند، به دست آیند. این فرمت همچنین به ما اجازه داد تا میزان مواجهه با SA در خون و مایع مغزی نخاعی را به عنوان پپتیدهای پروتئینی حامل محموله اندازه‌گیری کنیم. نکته مهم این است که داده‌های فاژ اغلب زمانی قابل بازتولید بودند که پپتیدهای مصنوعی در این فرمت کونژوگه شده با SA تجویز می‌شدند (شکل 3e). پپتیدهای درهم‌ریخته شده، مواجهه اولیه کمتری داشتند و پاکسازی CSF سریع‌تری با سطوح غیرقابل تشخیص در عرض 48 ساعت داشتند. برای درک بهتر مسیرهای انتقال این کلون‌های فاژ پپتیدی به فضای CSF، ما با استفاده از ایمونوهیستوشیمی (IHC) محل برخورد پپتیدهای فاژ منفرد را تجزیه و تحلیل کردیم تا ذرات فاژ را 1 ساعت پس از تزریق داخل وریدی در داخل بدن (in vivo) مستقیماً شناسایی کنیم. نکته قابل توجه این است که کلون‌های شماره 2002، 2077 و 2009 را می‌توان با رنگ‌آمیزی قوی در مویرگ‌های مغز شناسایی کرد، در حالی که فاژ کنترل (1779) و کلون شماره 2020 شناسایی نشدند (شکل تکمیلی 8). این نشان می‌دهد که این پپتیدها دقیقاً با عبور از سد خونی مغزی (BBB) ​​در تأثیر بر مغز نقش دارند. برای آزمایش این فرضیه، تجزیه و تحلیل دقیق‌تری مورد نیاز است، زیرا مسیر BSCFB نیز ممکن است دخیل باشد. هنگام مقایسه توالی اسید آمینه غنی‌ترین کلون (2002) با سایر پپتیدهای انتخاب شده، مشاهده شد که برخی از آنها دارای پسوندهای اسید آمینه مشابهی هستند که ممکن است نشان‌دهنده مکانیسم انتقال مشابه باشد (شکل 3f).
با توجه به مشخصات منحصر به فرد پلاسما و افزایش قابل توجه در CSF در طول زمان، کلون نمایش فاژ شماره 2077 در یک دوره 48 ساعته طولانی‌تر مورد بررسی بیشتر قرار گرفت و توانست افزایش سریع CSF مشاهده شده در ارتباط با سطوح پایدار SA را بازتولید کند (شکل 4a). در مورد سایر کلون‌های فاژ شناسایی شده، #2077 به شدت برای مویرگ‌های مغز رنگ‌آمیزی شد و در هنگام مشاهده با وضوح بالاتر، هم‌مکانی قابل توجهی با لکتین نشانگر مویرگی و احتمالاً مقداری رنگ‌آمیزی در فضای پارانشیمی نشان داد (شکل 4b). برای بررسی اینکه آیا اثرات دارویی با واسطه پپتید می‌تواند در CNS به دست آید، آزمایشی انجام دادیم که در آن نسخه‌های بیوتینیله شده i) پپتید انتقالی #2077 و ii) پپتید مهارکننده BACE1 با SA با دو نسبت مختلف مخلوط شدند. برای یک ترکیب، فقط از مهارکننده پپتید BACE1 و برای ترکیب دیگر از نسبت 1:3 مهارکننده پپتید BACE1 به پپتید #2077 استفاده کردیم. هر دو نمونه به صورت داخل وریدی تجویز شدند و سطح پپتید بتا آمیلوئید ۴۰ (Abeta40) در خون و مایع مغزی نخاعی در طول زمان اندازه‌گیری شد. Abeta40 در CSF اندازه‌گیری شد زیرا نشان دهنده مهار BACE1 در پارانشیم مغز است. همانطور که انتظار می‌رفت، هر دو کمپلکس به طور قابل توجهی سطح خونی Abeta40 را کاهش دادند (شکل 4c، d). با این حال، تنها نمونه‌های حاوی مخلوطی از پپتید شماره 2077 و یک مهارکننده پپتید BACE1 متصل به SA باعث کاهش قابل توجه Abeta40 در مایع مغزی نخاعی شدند (شکل 4c). داده‌ها نشان می‌دهند که پپتید شماره 2077 قادر به انتقال پروتئین 60 کیلو دالتونی SA به سیستم عصبی مرکزی است و همچنین اثرات دارویی را با مهارکننده‌های پپتید BACE1 متصل به SA القا می‌کند.
(الف) تزریق کلونال (2 × 10 فاژ/حیوان) فاژ T7 که پروفایل فارماکوکینتیک طولانی‌مدت پپتید CSF شماره 2077 (RLSSVDSDLSGC) و فاژ کنترل تزریق نشده (#1779) را در حداقل سه موش صحرایی لوله‌گذاری شده با CM نشان می‌دهد. (ب) تصویر میکروسکوپی کانفوکال از ریزرگ‌های قشر مغز در موش‌های صحرایی تزریق‌شده با فاژ (2 × 10 فاژ/حیوان) که رنگ‌آمیزی متقابل پپتید شماره 2077 و رگ‌ها (لکتین) را نشان می‌دهد. این کلون‌های فاژ به 3 موش صحرایی تزریق شدند و قبل از پرفیوژن به مدت 1 ساعت در گردش خون قرار گرفتند. مغزها برش داده شده و با آنتی‌بادی‌های پلی‌کلونال نشاندار شده با FITC علیه کپسید فاژ T7 رنگ‌آمیزی شدند. ده دقیقه قبل از پرفیوژن و تثبیت بعدی، لکتین نشاندار شده با DyLight594 به صورت داخل وریدی تجویز شد. تصاویر فلورسنت، رنگ‌آمیزی لکتین (قرمز) در سمت لومینال ریزرگ‌ها و فاژها (سبز) در لومن مویرگ‌ها و بافت اطراف عروقی مغز را نشان می‌دهند. نوار مقیاس مربوط به 10 میکرومتر است. (ج، د) پپتید مهارکننده BACE1 بیوتینیله شده به تنهایی یا در ترکیب با پپتید انتقالی بیوتینیله شده شماره 2077 به استرپتاویدین متصل شد و به دنبال آن تزریق داخل وریدی حداقل سه موش CM کانول‌گذاری شده (10 میلی‌گرم استرپتاویدین بر کیلوگرم) انجام شد. کاهش Aβ40 با واسطه مهارکننده پپتید BACE1 با استفاده از روش الایزای Aβ1-40 در خون (قرمز) و مایع مغزی نخاعی (نارنجی) در نقاط زمانی مشخص شده اندازه‌گیری شد. برای وضوح بهتر، یک خط نقطه‌چین روی نمودار در مقیاس 100٪ رسم شده است. (ج) درصد کاهش Aβ40 در خون (مثلث‌های قرمز) و مایع مغزی نخاعی (مثلث‌های نارنجی) در موش‌های تحت درمان با استرپتاویدین متصل به پپتید ترانزیت شماره 2077 و پپتید مهارکننده BACE1 با نسبت 3:1. (د) درصد کاهش در Aβ40 خون (دایره‌های قرمز) و مایع مغزی نخاعی (دایره‌های نارنجی) موش‌های تحت درمان با استرپتاویدین متصل به یک پپتید مهارکننده BACE1. غلظت Aβ در گروه کنترل 420 پیکوگرم در میلی‌لیتر بود (انحراف معیار = 101 پیکوگرم در میلی‌لیتر).
نمایش فاژ با موفقیت در چندین حوزه از تحقیقات زیست‌پزشکی به کار گرفته شده است17. این روش برای مطالعات تنوع عروقی درون‌تنی18،19 و همچنین مطالعاتی که عروق مغزی را هدف قرار می‌دهند20،21،22،23،24،25،26 استفاده شده است. در این مطالعه، ما کاربرد این روش انتخاب را نه تنها به شناسایی مستقیم پپتیدهای هدف قرار دهنده عروق مغزی، بلکه به کشف کاندیداهایی با خواص انتقال فعال برای عبور از سد خونی-مغزی نیز گسترش دادیم. اکنون توسعه یک روش انتخاب درون‌تنی در موش‌های لوله‌گذاری شده با CM را شرح می‌دهیم و پتانسیل آن را برای شناسایی پپتیدهایی با خواص لانه‌گزینی CSF نشان می‌دهیم. با استفاده از فاژ T7 که کتابخانه‌ای از پپتیدهای تصادفی 12 مر را نشان می‌دهد، توانستیم نشان دهیم که فاژ T7 به اندازه کافی کوچک (تقریباً 60 نانومتر قطر)10 است تا با سد خونی-مغزی سازگار شود و در نتیجه مستقیماً از سد خونی-مغزی یا شبکه کوروئید عبور کند. ما مشاهده کردیم که برداشت CSF از موش‌های CM کانول‌گذاری شده، یک روش غربالگری عملکردی درون‌تنی (in vivo) با کنترل خوب بود و فاژ استخراج‌شده نه تنها به عروق متصل می‌شود، بلکه به عنوان یک ناقل از سد خونی-مغزی نیز عمل می‌کند. علاوه بر این، با جمع‌آوری همزمان خون و اعمال HTS به CSF و فاژهای مشتق از خون، تأیید کردیم که انتخاب CSF ما تحت تأثیر غنی‌سازی خون یا تناسب برای گسترش بین دورهای انتخاب قرار نمی‌گیرد. با این حال، بخش خون بخشی از روش انتخاب است، زیرا فاژهایی که قادر به رسیدن به بخش CSF هستند باید به اندازه کافی زنده بمانند و در جریان خون گردش کنند تا خود را در مغز غنی کنند. به منظور استخراج اطلاعات توالی قابل اعتماد از داده‌های خام HTS، فیلترهایی را در گردش کار تجزیه و تحلیل، متناسب با خطاهای توالی‌یابی مختص پلتفرم، پیاده‌سازی کردیم. با گنجاندن پارامترهای سینتیکی در روش غربالگری، ما فارماکوکینتیک سریع فاژهای T7 نوع وحشی (t½ ~ 28 دقیقه) در خون24، 27، 28 را تأیید کردیم و همچنین نیمه عمر آنها را در مایع مغزی نخاعی (t½ ~ 26 دقیقه) در دقیقه تعیین کردیم. با وجود پروفایل‌های فارماکوکینتیک مشابه در خون و CSF، تنها 0.001٪ از غلظت فاژ در خون را می‌توان در CSF تشخیص داد، که نشان دهنده تحرک پس‌زمینه کم فاژ T7 نوع وحشی در عبور از سد خونی-مغزی است. این کار اهمیت دور اول انتخاب را هنگام استفاده از استراتژی‌های پیمایش درون تنی، به ویژه برای سیستم‌های فاژ که به سرعت از گردش خون پاک می‌شوند، برجسته می‌کند، زیرا تعداد کمی از کلون‌ها قادر به رسیدن به محفظه CNS هستند. بنابراین، در دور اول، کاهش تنوع کتابخانه بسیار زیاد بود، زیرا در نهایت تنها تعداد محدودی از کلون‌ها در این مدل CSF بسیار دقیق جمع‌آوری شدند. این استراتژی پیمایش درون‌تنی شامل چندین مرحله انتخاب مانند تجمع فعال در بخش CSF، بقای کلون در بخش خون و حذف سریع کلون‌های فاژ T7 از خون در 10 دقیقه اول بود (شکل 1d و شکل تکمیلی 4M). بنابراین، پس از دور اول، کلون‌های فاژ مختلفی در CSF شناسایی شدند، اگرچه از همان مخزن اولیه برای حیوانات منفرد استفاده شد. این نشان می‌دهد که مراحل انتخاب دقیق متعدد برای کتابخانه‌های منبع با تعداد زیادی از اعضای کتابخانه منجر به کاهش قابل توجه تنوع می‌شود. بنابراین، رویدادهای تصادفی به بخش جدایی‌ناپذیر فرآیند انتخاب اولیه تبدیل می‌شوند و تأثیر زیادی بر نتیجه می‌گذارند. احتمالاً بسیاری از کلون‌های موجود در کتابخانه اصلی تمایل غنی‌سازی CSF بسیار مشابهی داشته‌اند. با این حال، حتی تحت شرایط آزمایشگاهی یکسان، نتایج انتخاب ممکن است به دلیل تعداد کم هر کلون خاص در مخزن اولیه متفاوت باشد.
موتیف‌های غنی‌شده در CSF با موتیف‌های موجود در خون متفاوت هستند. جالب اینجاست که ما اولین تغییر به سمت پپتیدهای غنی از گلیسین را در خون حیوانات مشاهده کردیم. (شکل 1g، شکل‌های تکمیلی 4e، 4f). فاژهای حاوی پپتیدهای گلیسین ممکن است پایدارتر باشند و احتمال کمتری دارد که از گردش خون خارج شوند. با این حال، این پپتیدهای غنی از گلیسین در نمونه‌های مایع مغزی نخاعی شناسایی نشدند، که نشان می‌دهد کتابخانه‌های انتخاب‌شده دو مرحله انتخاب متفاوت را طی کرده‌اند: یکی در خون و دیگری اجازه داده شده تا در مایع مغزی نخاعی تجمع یابد. کلون‌های غنی‌شده با CSF حاصل از دور چهارم انتخاب به طور گسترده آزمایش شده‌اند. تقریباً تمام کلون‌های آزمایش‌شده به صورت جداگانه در مقایسه با فاژ کنترل خالی، غنی‌شده با CSF تأیید شدند. یک پپتید برخوردی (#2077) با جزئیات بیشتری بررسی شد. این پپتید در مقایسه با سایر پپتیدها نیمه عمر پلاسمایی طولانی‌تری نشان داد (شکل 3d و شکل تکمیلی 7) و جالب اینجاست که این پپتید حاوی یک باقیمانده سیستئین در انتهای C بود. اخیراً نشان داده شده است که افزودن سیستئین به پپتیدها می‌تواند با اتصال به آلبومین 29، خواص فارماکوکینتیک آنها را بهبود بخشد. این موضوع در حال حاضر برای پپتید شماره 2077 ناشناخته است و نیاز به مطالعه بیشتر دارد. برخی از پپتیدها وابستگی ظرفیتی در غنی‌سازی CSF نشان دادند (داده‌ها نشان داده نشده‌اند) که ممکن است مربوط به هندسه سطح نمایش داده شده کپسید T7 باشد. سیستم T7 که ما استفاده کردیم 5 تا 15 نسخه از هر پپتید را در هر ذره فاژ نشان داد. IHC بر روی کلون‌های فاژ سرب کاندید که به صورت داخل وریدی به قشر مغز موش‌ها تزریق شده بودند، انجام شد (شکل تکمیلی 8). داده‌ها نشان داد که حداقل سه کلون (شماره 2002، شماره 2009 و شماره 2077) با سد خونی مغزی (BBB) ​​تعامل داشتند. هنوز مشخص نیست که آیا این برهمکنش BBB منجر به تجمع CSF یا حرکت این کلون‌ها مستقیماً به BCSFB می‌شود یا خیر. نکته مهم این است که ما نشان می‌دهیم پپتیدهای انتخاب‌شده ظرفیت انتقال CSF خود را هنگام سنتز و اتصال به محموله پروتئینی حفظ می‌کنند. اتصال پپتیدهای بیوتینیله N-ترمینال به SA اساساً نتایج به‌دست‌آمده با کلون‌های فاژ مربوطه در خون و مایع مغزی نخاعی را تکرار می‌کند (شکل 3e). در نهایت، ما نشان می‌دهیم که پپتید سرب شماره 2077 قادر است عملکرد مغزی یک مهارکننده پپتید بیوتینیله BACE1 متصل به SA را تقویت کند و با کاهش قابل توجه سطح Abeta40 در CSF، اثرات فارماکودینامیکی قابل توجهی را در CNS ایجاد کند (شکل 4). ما با انجام جستجوی همولوژی توالی پپتیدی در تمام موارد مشاهده‌شده، نتوانستیم هیچ همولوگ را در پایگاه داده شناسایی کنیم. لازم به ذکر است که اندازه کتابخانه T7 تقریباً 109 است، در حالی که اندازه تئوری کتابخانه برای 12-mer برابر با 4 x 1015 است. بنابراین، ما فقط بخش کوچکی از فضای تنوع کتابخانه پپتید 12-mer را انتخاب کردیم، که ممکن است به این معنی باشد که پپتیدهای بهینه‌تر را می‌توان با ارزیابی فضای توالی مجاور این توالی‌های شناسایی شده شناسایی کرد. به صورت فرضی، یکی از دلایلی که ما هیچ همولوگ طبیعی از این پپتیدها پیدا نکرده‌ایم، ممکن است حذف انتخاب در طول تکامل برای جلوگیری از ورود کنترل نشده برخی از موتیف‌های پپتیدی به مغز باشد.
روی هم رفته، نتایج ما مبنایی برای کارهای آینده جهت شناسایی و توصیف دقیق‌تر سیستم‌های انتقال سد مغزی-عروقی در داخل بدن فراهم می‌کند. ساختار اساسی این روش مبتنی بر یک استراتژی انتخاب عملکردی است که نه تنها کلون‌هایی با خواص اتصال عروقی مغزی را شناسایی می‌کند، بلکه شامل یک مرحله حیاتی است که در آن کلون‌های موفق فعالیت ذاتی برای عبور از موانع بیولوژیکی در داخل بدن به داخل محفظه CNS دارند. هدف، روشن کردن مکانیسم انتقال این پپتیدها و ترجیح آنها برای اتصال به ریز عروق خاص ناحیه مغز است. این امر ممکن است منجر به کشف مسیرهای جدیدی برای انتقال BBB و گیرنده‌ها شود. ما انتظار داریم که پپتیدهای شناسایی شده بتوانند مستقیماً به گیرنده‌های عروقی مغزی یا به لیگاندهای در گردش منتقل شده از طریق BBB یا BCSFB متصل شوند. ناقل‌های پپتیدی با فعالیت انتقال CSF که در این کار کشف شده‌اند، بیشتر مورد بررسی قرار خواهند گرفت. ما در حال حاضر در حال بررسی اختصاصی بودن مغزی این پپتیدها برای توانایی آنها در عبور از BBB و/یا BCSF هستیم. این پپتیدهای جدید ابزارهای بسیار ارزشمندی برای کشف بالقوه گیرنده‌ها یا مسیرهای جدید و توسعه پلتفرم‌های بسیار کارآمد جدید برای رساندن ماکرومولکول‌ها، مانند مواد بیولوژیکی، به مغز خواهند بود.
سیسترنای بزرگ (CM) را با استفاده از اصلاح روش قبلی که توضیح داده شد، کانوله کنید. موش‌های ویستار بیهوش شده (200-350 گرم) روی دستگاه استریوتاکسی قرار داده شدند و یک برش میانی روی پوست سر تراشیده و آماده شده به صورت استریل ایجاد شد تا جمجمه نمایان شود. دو سوراخ در ناحیه نوار بالایی ایجاد کنید و پیچ‌های ثابت کننده را در سوراخ‌ها ببندید. یک سوراخ اضافی در تاج جانبی پس سری برای هدایت استریوتاکسی یک کانول فولادی ضد زنگ به داخل CM ایجاد شد. سیمان دندانپزشکی را در اطراف کانول قرار دهید و با پیچ محکم کنید. پس از پخت نوری و سفت شدن سیمان، زخم پوست با بخیه سوپرامید 4/0 بسته شد. قرارگیری صحیح کانول با نشت خود به خودی مایع مغزی نخاعی (CSF) تأیید می‌شود. موش را از دستگاه استریوتاکسی خارج کنید، مراقبت‌های پس از عمل و مدیریت درد مناسب را دریافت کنید و اجازه دهید حداقل یک هفته بهبود یابد تا علائم خون در مایع مغزی نخاعی مشاهده شود. موش‌های صحرایی نژاد ویستار (Crl:WI/Han) از چارلز ریور (فرانسه) تهیه شدند. همه موش‌ها تحت شرایط خاص عاری از عوامل بیماری‌زا نگهداری شدند. همه آزمایش‌های حیوانی توسط اداره دامپزشکی شهر بازل سوئیس تأیید شده و مطابق با مجوز حیوانی شماره ۲۴۷۴ (ارزیابی انتقال فعال مغز با اندازه‌گیری سطوح کاندیدهای درمانی در مایع مغزی نخاعی و مغز موش صحرایی) انجام شد.
به آرامی موش را با کانول CM در دست، هوشیار نگه دارید. داتورا را از کانول خارج کرده و 10 میکرولیتر مایع مغزی نخاعی که خود به خود جریان داشت را جمع‌آوری کنید. از آنجایی که در نهایت، باز بودن کانول به خطر افتاد، فقط نمونه‌های مایع مغزی نخاعی شفاف بدون هیچ نشانه‌ای از آلودگی خون یا تغییر رنگ در این مطالعه گنجانده شدند. به طور موازی، تقریباً 10 تا 20 میکرولیتر خون از یک برش کوچک در نوک دم در لوله‌های حاوی هپارین (سیگما-آلدریچ) گرفته شد. مایع مغزی نخاعی و خون در زمان‌های مختلف پس از تزریق داخل وریدی فاژ T7 جمع‌آوری شدند. تقریباً 5 تا 10 میکرولیتر مایع قبل از جمع‌آوری هر نمونه CSF دور ریخته شد که مربوط به حجم مرده کاتتر است.
کتابخانه‌ها با استفاده از وکتور T7Select 10-3b همانطور که در راهنمای سیستم T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) شرح داده شده است، تولید شدند. به طور خلاصه، یک DNA 12-mer تصادفی به شکل زیر سنتز شد:
کدون NNK برای جلوگیری از کدون‌های انتهایی دوگانه و بیان بیش از حد اسید آمینه در قطعه الحاقی استفاده شد. N نسبت هم مولی مخلوط دستی هر نوکلئوتید است و K نسبت هم مولی مخلوط دستی نوکلئوتیدهای آدنین و سیتوزین است. نواحی تک رشته‌ای با انکوباسیون بیشتر با dNTP (Novagen) و آنزیم Klenow (New England Biolabs) در بافر Klenow (New England Biolabs) به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد به DNA دو رشته‌ای تبدیل شدند. پس از واکنش، DNA دو رشته‌ای با رسوب EtOH بازیابی شد. DNA حاصل با آنزیم‌های محدودکننده EcoRI و HindIII (هر دو از Roche) هضم شد. قطعه الحاقی برش داده شده و خالص شده (QIAquick، Qiagen) (لیگاز T4، New England Biolabs) سپس پس از اسید آمینه 348 ژن کپسید 10B، به صورت درون قاب به یک وکتور T7 از پیش برش داده شده متصل شد. واکنش‌های اتصال قبل از بسته‌بندی آزمایشگاهی (in vitro) به مدت ۱۸ ساعت در دمای ۱۶ درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. بسته‌بندی فاژ در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) طبق دستورالعمل‌های ارائه شده با کیت کلونینگ T7Select 10-3b (Novagen) انجام شد و محلول بسته‌بندی یک بار با استفاده از Escherichia coli (BLT5615، Novagen) تا مرحله لیز تکثیر شد. لیزات‌ها سانتریفیوژ، تیتراسیون و در دمای ۸۰- درجه سانتی‌گراد به عنوان محلول ذخیره گلیسرول منجمد شدند.
تکثیر مستقیم PCR از نواحی متغیر فاژ تکثیر شده در محیط کشت مایع یا پلیت با استفاده از آغازگرهای فیوژن اختصاصی 454/Roche-amplicon. آغازگر فیوژن رو به جلو شامل توالی‌هایی است که ناحیه متغیر (NNK) 12 (ویژه الگو)، آداپتور تیتانیوم GS FLX A و یک توالی کلیدی کتابخانه چهار بازی (TCAG) را احاطه کرده‌اند (شکل تکمیلی 1a):
پرایمر فیوژن معکوس همچنین حاوی بیوتین متصل به دانه‌های گیرنده و آداپتور تیتانیومی GS FLX B مورد نیاز برای تکثیر کلونال در طول PCR امولسیونی است:
سپس آمپلیکون‌ها طبق پروتکل 454 GS-FLX Titanium تحت پیروسکوئنسینگ 454/Roche قرار گرفتند. برای توالی‌یابی دستی Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer)، DNA فاژ T7 با PCR تکثیر و با جفت آغازگرهای زیر توالی‌یابی شد:
قطعاتی از پلاک‌های منفرد با استفاده از کیت پلیمراز DNA Fast Start شرکت Roche (طبق دستورالعمل سازنده) تحت تکثیر PCR قرار گرفتند. یک شروع داغ (10 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد) و 35 چرخه تقویت (50 ثانیه در دمای 95 درجه سانتیگراد، 1 دقیقه در دمای 50 درجه سانتیگراد و 1 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد) انجام دهید.
فاژ از کتابخانه‌ها، فاژ وحشی، فاژ نجات‌یافته از CSF و خون، یا کلون‌های منفرد در Escherichia coli BL5615 در محیط کشت TB (سیگما آلدریچ) یا در ظروف 500 سانتی‌متر مربعی (ترمو ساینتیفیک) به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد تکثیر شدند. فاژها با شستشوی صفحات با بافر Tris-EDTA (Fluka Analytical) یا با جمع‌آوری پلاک‌ها با نوک پیپت استریل از صفحات استخراج شدند. فاژها از مایع رویی کشت یا بافر استخراج با یک دور رسوب پلی‌اتیلن گلیکول (PEG 8000) (Promega) جدا شده و در بافر Tris-EDTA دوباره به حالت تعلیق درآمدند.
فاژ تکثیر شده قبل از تزریق داخل وریدی (IV) (500 میکرولیتر به ازای هر حیوان)، تحت 2 تا 3 دور حذف اندوتوکسین با استفاده از دانه‌های حذف اندوتوکسین (Miltenyi Biotec) قرار گرفت. در دور اول، 2×1012 فاژ؛ در دور دوم، 2×1010 فاژ؛ در دورهای سوم و چهارم انتخاب، 2×109 فاژ به ازای هر حیوان معرفی شد. محتوای فاژ در نمونه‌های CSF و خون جمع‌آوری‌شده در زمان‌های مشخص‌شده با شمارش پلاک طبق دستورالعمل سازنده (راهنمای سیستم T7Select) تعیین شد. انتخاب فاژ با تزریق داخل وریدی کتابخانه‌های خالص‌شده به داخل ورید دم یا با تزریق مجدد فاژ استخراج‌شده از CSF از دور انتخاب قبلی انجام شد و برداشت‌های بعدی به ترتیب در 10 دقیقه، 30 دقیقه، 60 دقیقه، 90 دقیقه، 120 دقیقه، 180 دقیقه و 240 دقیقه از نمونه‌های CSF و خون انجام شد. در مجموع چهار دور بررسی درون‌تنی انجام شد که در آن دو شاخه انتخاب شده به طور جداگانه ذخیره و در طول سه دور اول انتخاب مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. تمام فاژهای وارد شده از CSF از دو دور اول انتخاب، تحت پیروسکوئنسینگ 454/Roche قرار گرفتند، در حالی که تمام کلون‌های استخراج شده از CSF از دو دور آخر انتخاب به صورت دستی توالی‌یابی شدند. تمام فاژهای خونی از دور اول انتخاب نیز تحت پیروسکوئنسینگ 454/Roche قرار گرفتند. برای تزریق کلون‌های فاژ، فاژهای انتخاب شده در E. coli (BL5615) در صفحات 500 سانتی‌متر مربعی در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 4 ساعت تکثیر شدند. کلون‌های انتخاب شده به صورت جداگانه و توالی‌یابی شده دستی در محیط کشت TB تکثیر شدند. پس از استخراج فاژ، خالص‌سازی و حذف اندوتوکسین (همانطور که در بالا توضیح داده شد)، 2×1010 فاژ/حیوان در 300 میکرولیتر به صورت داخل وریدی به یک ورید دم تزریق شد.
پیش‌پردازش و فیلتر کیفی داده‌های توالی. داده‌های خام 454/Roche با استفاده از نرم‌افزار فروشنده از فرمت نقشه جریان استاندارد دودویی (sff) به فرمت قابل خواندن توسط انسان پیرسون (fasta) تبدیل شدند. پردازش بیشتر توالی نوکلئوتیدی با استفاده از برنامه‌ها و اسکریپت‌های اختصاصی C (بسته نرم‌افزاری منتشر نشده) همانطور که در زیر توضیح داده شده است، انجام شد. تجزیه و تحلیل داده‌های اولیه شامل رویه‌های فیلترینگ چند مرحله‌ای دقیق است. برای فیلتر کردن خوانش‌هایی که حاوی توالی DNA درج 12 مری معتبر نبودند، خوانش‌ها به صورت متوالی با برچسب شروع (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT)، برچسب پایان (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) و درج پس‌زمینه (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) با استفاده از آزمون جهانی Needleman-Wunsch تراز شدند. ترازبندی اجازه می‌دهد تا 2 ناسازگاری در هر ترازبندی31 وجود داشته باشد. بنابراین، خوانش‌های بدون برچسب شروع و پایان و خوانش‌های حاوی درج‌های پس‌زمینه، یعنی ترازبندی‌هایی که از تعداد مجاز عدم تطابق‌ها تجاوز می‌کنند، از کتابخانه حذف شدند. در مورد خوانش‌های باقی‌مانده، توالی DNA N-mer که از علامت شروع تا قبل از علامت توقف امتداد دارد، از توالی خوانش اصلی جدا شده و بیشتر پردازش شد (از این پس به عنوان "insert" نامیده می‌شود). پس از ترجمه درج، بخش بعد از اولین کدون توقف در انتهای 5' پرایمر از درج حذف می‌شود. علاوه بر این، نوکلئوتیدهایی که به کدون‌های ناقص در انتهای 3' پرایمر منتهی می‌شوند نیز حذف شدند. برای حذف درج‌هایی که فقط حاوی توالی‌های پس‌زمینه هستند، درج‌های ترجمه شده که با الگوی اسید آمینه "PAG" شروع می‌شوند نیز حذف شدند. پپتیدهایی با طول پس از ترجمه کمتر از 3 اسید آمینه از کتابخانه حذف شدند. در نهایت، افزونگی را در مجموعه درج‌ها حذف کرده و فراوانی هر درج منحصر به فرد را تعیین کنید. نتایج این تجزیه و تحلیل شامل فهرستی از توالی‌های نوکلئوتیدی (درج‌ها) و فراوانی‌های (خوانده شده) آنها بود (شکل‌های تکمیلی 1c و 2).
درج‌های DNA N-mer گروه‌بندی شده بر اساس شباهت توالی: برای حذف خطاهای توالی‌یابی خاص 454/Roche (مانند مشکلات مربوط به توالی‌یابی پسوندهای هموپلیمر) و حذف افزونگی‌های کم‌اهمیت‌تر، درج‌های توالی DNA N-mer که قبلاً فیلتر شده‌اند (درج‌ها) بر اساس شباهت مرتب می‌شوند. درج‌ها (تا 2 باز غیر منطبق مجاز است) با استفاده از یک الگوریتم تکراری که به شرح زیر تعریف می‌شود: درج‌ها ابتدا بر اساس فراوانی‌شان (از بیشترین به کمترین) مرتب می‌شوند و اگر یکسان باشند، بر اساس مرتب‌سازی ثانویه‌شان بر اساس طول (از طولانی‌ترین به کوتاه‌ترین) مرتب می‌شوند. بنابراین، مکررترین و طولانی‌ترین درج‌ها، اولین "گروه" را تعریف می‌کنند. فراوانی گروه بر اساس فراوانی کلید تنظیم می‌شود. سپس، سعی شد هر درج باقی‌مانده در لیست مرتب شده با هم‌ترازی دو به دو Needleman-Wunsch به گروه اضافه شود. اگر تعداد عدم تطابق‌ها، درج‌ها یا حذف‌ها در یک هم‌ترازی از آستانه 2 تجاوز نکند، یک درج به گروه اضافه می‌شود و فراوانی کلی گروه با توجه به تعداد دفعات اضافه شدن درج افزایش می‌یابد. درج‌هایی که به یک گروه اضافه می‌شوند، به عنوان استفاده‌شده علامت‌گذاری شده و از پردازش بیشتر حذف می‌شوند. اگر توالی درج‌شده نتواند به یک گروه موجود اضافه شود، از توالی درج‌شده برای ایجاد یک گروه جدید با فرکانس درج مناسب استفاده شده و به عنوان استفاده‌شده علامت‌گذاری می‌شود. تکرار زمانی پایان می‌یابد که هر توالی درج‌شده یا برای تشکیل یک گروه جدید استفاده شده باشد یا بتواند در یک گروه موجود قرار گیرد. در نهایت، درج‌های گروه‌بندی‌شده متشکل از نوکلئوتیدها در نهایت به توالی‌های پپتیدی (کتابخانه‌های پپتیدی) ترجمه می‌شوند. نتیجه این تجزیه و تحلیل مجموعه‌ای از درج‌ها و فرکانس‌های مربوط به آنهاست که تعداد خوانش‌های متوالی را تشکیل می‌دهند (شکل تکمیلی 2).
تولید موتیف: بر اساس فهرستی از پپتیدهای منحصر به فرد، کتابخانه‌ای شامل تمام الگوهای اسید آمینه‌ای ممکن (aa) مطابق شکل زیر ایجاد شد. هر الگوی ممکن با طول ۳ از پپتید استخراج و الگوی معکوس آن به همراه یک کتابخانه موتیف مشترک شامل تمام الگوها (تری‌پپتیدها) اضافه شد. کتابخانه‌های موتیف‌های بسیار تکراری توالی‌یابی و افزونگی حذف شدند. سپس، برای هر تری‌پپتید در کتابخانه موتیف، با استفاده از ابزارهای محاسباتی، وجود آن را در کتابخانه بررسی کردیم. در این حالت، فراوانی پپتید حاوی تری‌پپتید موتیف یافت شده اضافه شده و به موتیف موجود در کتابخانه موتیف اختصاص داده می‌شود ("تعداد موتیف‌ها"). نتیجه تولید موتیف یک آرایه دو بعدی است که شامل تمام تکرارهای تری‌پپتیدها (موتیف‌ها) و مقادیر مربوطه آنها است که تعداد خوانش‌های توالی‌یابی است که منجر به موتیف مربوطه هنگام فیلتر کردن، گروه‌بندی و ترجمه خوانش‌ها می‌شود. معیارها همانطور که در بالا به تفصیل توضیح داده شد.
نرمال‌سازی تعداد موتیف‌ها و نمودارهای پراکندگی مربوطه: تعداد موتیف‌ها برای هر نمونه با استفاده از
که در آن ni تعداد خوانش‌های حاوی موضوع i است. بنابراین، vi نشان دهنده درصد فراوانی خوانش‌ها (یا پپتیدها) حاوی موتیف i در نمونه است. مقادیر P برای تعداد غیر نرمال‌شده موتیف‌ها با استفاده از آزمون دقیق فیشر محاسبه شدند. در مورد همبستگی‌های تعداد انگیزه‌ها، همبستگی‌های اسپیرمن با استفاده از تعداد نرمال‌شده انگیزه‌ها با R محاسبه شدند.
برای تجسم محتوای اسیدهای آمینه در هر موقعیت در کتابخانه پپتید، لوگوگرام‌های وب ۳۲ و ۳۳ (http://weblogo.threeplusone.com) ایجاد شدند. ابتدا، محتوای اسیدهای آمینه در هر موقعیت از پپتید ۱۲-mer در یک ماتریس ۲۰×۱۲ ذخیره می‌شود. سپس، مجموعه‌ای از ۱۰۰۰ پپتید حاوی محتوای نسبی اسید آمینه یکسان در هر موقعیت در قالب fasta-sequence تولید شده و به عنوان ورودی به web-logo 3 ارائه می‌شود که یک نمایش گرافیکی از محتوای نسبی اسید آمینه در هر موقعیت را برای یک کتابخانه پپتیدی مشخص تولید می‌کند. برای تجسم مجموعه داده‌های چندبعدی، نقشه‌های حرارتی با استفاده از یک ابزار توسعه‌یافته داخلی در R (biosHeatmap، یک بسته R که هنوز منتشر نشده است) ایجاد شدند. دندروگرام‌های ارائه شده در نقشه‌های حرارتی با استفاده از روش خوشه‌بندی سلسله مراتبی Ward با معیار فاصله اقلیدسی محاسبه شدند. برای تجزیه و تحلیل آماری داده‌های امتیازدهی موتیف، مقادیر P برای امتیازدهی غیر نرمال با استفاده از آزمون دقیق فیشر محاسبه شدند. مقادیر P برای سایر مجموعه داده‌ها با استفاده از آزمون t استیودنت یا ANOVA در R محاسبه شدند.
کلون‌های فاژ انتخاب‌شده و فاژهای بدون درج، از طریق ورید دمی (2×1010 فاژ/حیوان در 300 میکرولیتر PBS) به صورت داخل وریدی تزریق شدند. ده دقیقه قبل از پرفیوژن و تثبیت بعدی، به همان حیوانات 100 میکرولیتر لکتین نشاندار شده با DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177) به صورت داخل وریدی تزریق شد. 60 دقیقه پس از تزریق فاژ، موش‌ها از طریق قلب با 50 میلی‌لیتر PBS و به دنبال آن 50 میلی‌لیتر PFA/PBS 4% پرفیوژن شدند. نمونه‌های مغز علاوه بر این، یک شب در PFA/PBS 4% تثبیت شده و در دمای 4 درجه سانتیگراد در محلول 30% ساکارز خیسانده شدند. نمونه‌ها در مخلوط OCT به سرعت منجمد می‌شوند. آنالیز ایمونوهیستوشیمی نمونه‌های منجمد در دمای اتاق روی برش‌های کرایوسی 30 میکرومتری مسدود شده با 1٪ BSA انجام شد و با آنتی‌بادی‌های پلی‌کلونال نشاندار شده با FITC علیه فاژ T7 (Novus NB 600-376A) در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. یک شب انکوبه شدند. در نهایت، برش‌ها 3 بار با PBS شسته شده و با میکروسکوپ لیزری کانفوکال (Leica TCS SP5) بررسی شدند.
تمام پپتیدها با حداقل خلوص ۹۸٪ توسط شرکت GenScript USA سنتز، بیوتینیله و لیوفیلیزه شدند. بیوتین از طریق یک فاصله دهنده سه گانه گلیسین اضافی در انتهای N متصل می‌شود. تمام پپتیدها را با استفاده از طیف سنجی جرمی بررسی کنید.
استرپتاویدین (سیگما S0677) با 5 برابر مقدار اضافی معادل پپتید بیوتینیله شده، پپتید مهارکننده BACE1 بیوتینیله شده، یا ترکیبی (نسبت 3:1) از پپتید مهارکننده BACE1 بیوتینیله شده و پپتید مهارکننده BACE1 در 5-10٪ DMSO مخلوط شد/در PBS به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد. پپتیدهای کونژوگه شده با استرپتاویدین به صورت داخل وریدی با دوز 10 میلی گرم بر کیلوگرم به یکی از وریدهای دم موش‌های دارای حفره مغزی تزریق شدند.
غلظت کمپلکس‌های پپتید-استرپتاویدین با روش ELISA ارزیابی شد. پلیت‌های میکروتیتر Nunc Maxisorp (سیگما) به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با 1.5 میکروگرم در میلی‌لیتر آنتی‌بادی ضد استرپتاویدین موشی (Thermo، MA1-20011) پوشش داده شدند. پس از بلوک کردن (بافر بلوک کننده: 140 نانومولار NaCL، 5 میلی‌مولار EDTA، 0.05٪ NP40، 0.25٪ ژلاتین، 1٪ BSA) در دمای اتاق به مدت 2 ساعت، پلیت را به مدت 3 ثانیه با 0.05٪ Tween-20/PBS (بافر شستشو) بشویید. نمونه‌های CSF و پلاسما به چاهک‌های رقیق شده با بافر بلوک کننده اضافه شدند (پلاسما 1:10000، CSF 1:115). سپس پلیت به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با آنتی‌بادی تشخیصی (1 میکروگرم در میلی‌لیتر، ضد استرپتاویدین-HRP، Novus NB120-7239) انکوبه شد. پس از سه مرحله شستشو، استرپتاویدین با انکوباسیون در محلول سوبسترای TMB (Roche) به مدت 20 دقیقه شناسایی شد. پس از متوقف کردن ایجاد رنگ با 1M H2SO4، جذب را در 450 نانومتر اندازه‌گیری کنید.
عملکرد کمپلکس مهارکننده استرپتاویدین-پپتید-BACE1 با استفاده از روش الایزای Aβ(1-40) طبق پروتکل سازنده (Wako, 294-64701) ارزیابی شد. به طور خلاصه، نمونه‌های CSF در رقیق‌کننده استاندارد (1:23) رقیق شده و به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد در پلیت‌های 96 خانه‌ای پوشیده شده با آنتی‌بادی گیرنده BNT77 انکوبه شدند. پس از پنج مرحله شستشو، آنتی‌بادی BA27 کونژوگه شده با HRP اضافه شد و به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شد و پس از آن پنج مرحله شستشو انجام شد. Aβ(1-40) با انکوباسیون در محلول TMB به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق شناسایی شد. پس از متوقف شدن توسعه رنگ با محلول متوقف کننده، جذب را در طول موج 450 نانومتر اندازه‌گیری کنید. نمونه‌های پلاسما قبل از الایزای Aβ(1-40) تحت استخراج فاز جامد قرار گرفتند. پلاسما به 0.2% DEA (سیگما) در پلیت‌های 96 چاهکی اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. پس از شستشوی متوالی پلیت‌های SPE (Oasis, 186000679) با آب و متانول 100%، نمونه‌های پلاسما به پلیت‌های SPE اضافه شدند و تمام مایع خارج شد. نمونه‌ها (ابتدا با 5% متانول و سپس 30% متانول) شسته شده و با 2% NH4OH/90% متانول شسته شدند. پس از خشک کردن محلول حاصل در دمای 55 درجه سانتیگراد به مدت 99 دقیقه با جریان ثابت N2، نمونه‌ها در رقیق‌کننده‌های استاندارد احیا شدند و Aβ(1-40) همانطور که در بالا توضیح داده شد، اندازه‌گیری شد.
نحوه استناد به این مقاله: Urich, E. et al. تحویل محموله به مغز با استفاده از پپتیدهای ترانزیتی شناسایی شده در داخل بدن. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
لیخوتا جی.، اسکیورینگ تی.، تامسن ال بی و موس تی. رساندن داروهای ماکرومولکولی به مغز با استفاده از درمان هدفمند. مجله نوروشیمی 113، 1-13، 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
براسنجویک، آی.، استاینبوش، اچ. دبلیو، اشمیتز، سی.، و مارتینز-مارتینز، پی. انتقال داروهای پپتیدی و پروتئینی از سد خونی-مغزی. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
پاردریج، دبلیو.ام. سد خونی-مغزی: تنگنایی در توسعه داروهای مغزی. NeuroRx 2، 3-14، 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
جوهانسون، کی‌ای، دانکن، جی‌ای، استوپا، ای‌جی، و برد، ای. چشم‌اندازهایی برای بهبود دارورسانی و هدف‌گیری مغز از طریق مسیر شبکه کوروئید-سی‌اس‌اف. تحقیقات دارویی 22، 1011–1037، 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
پاردریج، دبلیو.ام. نوسازی زیست‌داروها با اسب‌های تروجان مولکولی برای انتقال به مغز. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
پاردریج، انتقال پپتید با واسطه گیرنده WM از سد خونی-مغزی. Endocr Rev. 7، 314–330 (1986).
نیووهنر، جی. و همکاران. افزایش نفوذ به مغز و اثربخشی آنتی‌بادی‌های درمانی با استفاده از شاتل‌های مولکولی تک ظرفیتی. Neuron 81، 49-60، 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
بین-لی، ن. و همکاران. انتقال گیرنده ترانسفرین (TfR) جذب مغزی انواع میل ترکیبی آنتی‌بادی‌های TfR را تعیین می‌کند. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).