Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt được cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Ngoài ra, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Hiển thị đồng thời ba slide dạng băng chuyền. Sử dụng các nút Trước và Tiếp theo để chuyển qua ba slide một lúc, hoặc sử dụng các nút trượt ở cuối để chuyển qua ba slide một lúc.
Hàng rào máu não ngăn cản các tác nhân sinh học tiếp cận mục tiêu của chúng trong hệ thần kinh trung ương, do đó cản trở việc điều trị hiệu quả các bệnh thần kinh. Để khám phá các chất vận chuyển não mới trong cơ thể sống, chúng tôi đã sử dụng thư viện peptide phage T7 và thu thập máu và dịch não tủy (CSF) liên tục bằng mô hình chuột tỉnh táo có đặt ống thông và truyền dịch. Các dòng phage cụ thể được làm giàu đáng kể trong CSF sau bốn vòng chọn lọc. Thử nghiệm các peptide ứng cử viên riêng lẻ cho thấy sự làm giàu hơn 1000 lần trong CSF. Hoạt tính sinh học của việc vận chuyển peptide đến não đã được xác nhận bằng cách giảm 40% mức độ amyloid-β trong dịch não tủy khi sử dụng chất ức chế peptide BACE1 liên kết với peptide vận chuyển mới được xác định. Những kết quả này cho thấy các peptide được xác định bằng phương pháp chọn lọc phage trong cơ thể sống có thể là phương tiện hữu ích để vận chuyển các đại phân tử đến não một cách có hệ thống với hiệu quả điều trị.
Nghiên cứu về liệu pháp nhắm mục tiêu vào hệ thần kinh trung ương (CNS) chủ yếu tập trung vào việc xác định các loại thuốc và tác nhân tối ưu có đặc tính nhắm mục tiêu vào CNS, ít chú trọng đến việc khám phá các cơ chế thúc đẩy việc vận chuyển thuốc chủ động đến não. Điều này đang bắt đầu thay đổi hiện nay khi việc vận chuyển thuốc, đặc biệt là các phân tử lớn, là một phần không thể thiếu trong phát triển thuốc thần kinh học hiện đại. Môi trường của hệ thần kinh trung ương được bảo vệ tốt bởi hệ thống hàng rào mạch máu não, bao gồm hàng rào máu não (BBB) ​​và hàng rào máu não (BCBB)1, khiến việc vận chuyển thuốc đến não trở nên khó khăn1,2. Người ta ước tính rằng gần như tất cả các loại thuốc phân tử lớn và hơn 98% thuốc phân tử nhỏ bị loại bỏ khỏi não3. Đó là lý do tại sao việc xác định các hệ thống vận chuyển não mới cung cấp khả năng vận chuyển thuốc điều trị hiệu quả và đặc hiệu đến CNS là rất quan trọng4,5. Tuy nhiên, BBB và BCSFB cũng mang lại cơ hội tuyệt vời cho việc vận chuyển thuốc vì chúng có thể xuyên qua và đi vào tất cả các cấu trúc của não thông qua hệ thống mạch máu rộng lớn của nó. Do đó, những nỗ lực hiện tại nhằm sử dụng các phương pháp đưa thuốc không xâm lấn vào não chủ yếu dựa trên cơ chế vận chuyển qua trung gian thụ thể (PMT) sử dụng thụ thể BBB6 nội sinh. Mặc dù đã có những tiến bộ quan trọng gần đây khi sử dụng con đường thụ thể transferrin7,8, việc phát triển thêm các hệ thống vận chuyển mới với các đặc tính được cải thiện vẫn là cần thiết. Vì vậy, mục tiêu của chúng tôi là xác định các peptide có khả năng làm trung gian vận chuyển dịch não tủy, vì về nguyên tắc chúng có thể được sử dụng để đưa các đại phân tử đến hệ thần kinh trung ương hoặc mở ra các con đường thụ thể mới. Đặc biệt, các thụ thể và chất vận chuyển cụ thể của hệ thống mạch máu não (BBB và BSCFB) có thể đóng vai trò là mục tiêu tiềm năng cho việc vận chuyển chủ động và đặc hiệu các thuốc sinh học. Dịch não tủy (CSF) là sản phẩm tiết ra của đám rối màng mạch (CS) và tiếp xúc trực tiếp với dịch kẽ của não thông qua khoang dưới màng nhện và khoang não thất4. Gần đây, người ta đã chứng minh rằng dịch não tủy dưới màng nhện khuếch tán quá mức vào dịch kẽ của não9. Chúng tôi hy vọng có thể tiếp cận không gian nhu mô bằng cách sử dụng đường dẫn vào khoang dưới màng cứng hoặc trực tiếp qua hàng rào máu não. Để đạt được điều này, chúng tôi đã triển khai một chiến lược chọn lọc phage mạnh mẽ trên cơ thể sống, lý tưởng nhất là xác định các peptide được vận chuyển bởi một trong hai con đường khác nhau này.
Chúng tôi mô tả phương pháp sàng lọc hiển thị phage tuần tự in vivo với lấy mẫu dịch não tủy (CSF) kết hợp với giải trình tự thông lượng cao (HTS) để theo dõi các vòng chọn lọc ban đầu với sự đa dạng thư viện cao nhất. Quá trình sàng lọc được thực hiện trên chuột tỉnh táo với ống thông bể não lớn (CM) được cấy ghép vĩnh viễn để tránh nhiễm bẩn máu. Điều quan trọng là, phương pháp này chọn lọc cả các peptide nhắm mục tiêu vào não và các peptide có hoạt tính vận chuyển qua hàng rào mạch máu não. Chúng tôi đã sử dụng phage T7 do kích thước nhỏ của chúng (~60 nm)10 và cho rằng chúng phù hợp cho việc vận chuyển các túi cho phép vượt qua hàng rào nội mô và/hoặc biểu mô-tủy xương. Sau bốn vòng sàng lọc, các quần thể phage đã được phân lập cho thấy sự làm giàu mạnh mẽ trong CSF in vivo và liên kết với vi mạch não. Quan trọng là, chúng tôi đã có thể xác nhận các phát hiện của mình bằng cách chứng minh rằng các peptide ứng cử viên tốt nhất được tổng hợp hóa học và được ưu tiên có khả năng vận chuyển protein vào dịch não tủy. Đầu tiên, các tác dụng dược động học của hệ thần kinh trung ương đã được thiết lập bằng cách kết hợp một peptide vận chuyển hàng đầu với một chất ức chế peptide BACE1. Ngoài việc chứng minh rằng các chiến lược sàng lọc chức năng in vivo có thể xác định các peptide vận chuyển não mới như những chất mang protein hiệu quả, chúng tôi kỳ vọng các phương pháp lựa chọn chức năng tương tự cũng sẽ trở nên quan trọng trong việc xác định các con đường vận chuyển não mới.
Dựa trên đơn vị tạo mảng (PFU), sau bước đóng gói phage, một thư viện peptide phage T7 tuyến tính 12-mer ngẫu nhiên với độ đa dạng khoảng 109 đã được thiết kế và tạo ra (xem Phần Vật liệu và Phương pháp). Điều quan trọng cần lưu ý là chúng tôi đã phân tích cẩn thận thư viện này trước khi sàng lọc in vivo. Khuếch đại PCR các mẫu thư viện phage bằng cách sử dụng các mồi đã được sửa đổi tạo ra các sản phẩm khuếch đại có thể áp dụng trực tiếp cho HTS (Hình bổ sung 1a). Do a) lỗi trình tự HTS11, b) ảnh hưởng đến chất lượng của các mồi (NNK)1-12, và c) sự hiện diện của phage kiểu hoang dã (wt) (chèn khung) trong thư viện dự phòng, một quy trình lọc trình tự đã được thực hiện để chỉ trích xuất thông tin trình tự đã được xác minh (Hình bổ sung 1b). Các bước lọc này áp dụng cho tất cả các thư viện trình tự HTS. Đối với thư viện chuẩn, tổng cộng 233.868 lượt đọc đã được thu được, trong đó 39% vượt qua các tiêu chí lọc và được sử dụng để phân tích thư viện và lựa chọn cho các vòng tiếp theo (Hình bổ sung 1c–e). Các trình tự đọc chủ yếu là bội số của 3 cặp bazơ với đỉnh điểm ở 36 nucleotide (Hình bổ sung 1c), xác nhận thiết kế thư viện (NNK) 1-12. Đáng chú ý, khoảng 11% thành viên thư viện chứa đoạn chèn PAGISRELVDKL dạng hoang dã (wt) 12 chiều, và gần một nửa số trình tự (49%) chứa các đoạn chèn hoặc xóa. Phân tích HTS của thư viện đã xác nhận tính đa dạng cao của các peptide trong thư viện: hơn 81% trình tự peptide chỉ được tìm thấy một lần và chỉ 1,5% xuất hiện ≥4 bản sao (Hình bổ sung 2a). Tần suất của các axit amin (aa) ở tất cả 12 vị trí trong tập hợp tương quan tốt với tần suất dự kiến ​​cho số lượng codon được tạo ra bởi tập hợp NKK thoái hóa (Hình bổ sung 2b). Tần suất quan sát được của các gốc aa được mã hóa bởi các đoạn chèn này tương quan tốt với tần suất được tính toán (r = 0,893) (Hình bổ sung 2c). Việc chuẩn bị thư viện phage để tiêm bao gồm các bước khuếch đại và loại bỏ nội độc tố. Điều này trước đây đã được chứng minh là có khả năng làm giảm tính đa dạng của thư viện phage12,13. Do đó, chúng tôi đã giải trình tự một thư viện phage được khuếch đại trên đĩa đã trải qua quá trình loại bỏ nội độc tố và so sánh nó với thư viện gốc để ước tính tần suất của các axit amin. Một mối tương quan mạnh (r = 0,995) đã được quan sát giữa nhóm gốc và nhóm được khuếch đại và tinh chế (Hình bổ sung 2d), cho thấy sự cạnh tranh giữa các dòng vô tính được khuếch đại trên đĩa bằng phage T7 không gây ra sai lệch lớn. So sánh này dựa trên tần suất của các motif tripeptide trong mỗi thư viện, vì tính đa dạng của các thư viện (~109) không thể được nắm bắt đầy đủ ngay cả với HTS. Phân tích tần suất của các axit amin ở mỗi vị trí cho thấy một sai lệch nhỏ phụ thuộc vào vị trí ở ba vị trí cuối cùng của tập hợp được đưa vào (Hình bổ sung 2e). Tóm lại, chúng tôi kết luận rằng chất lượng và tính đa dạng của thư viện là chấp nhận được và chỉ có những thay đổi nhỏ về tính đa dạng được quan sát do quá trình khuếch đại và chuẩn bị thư viện phage giữa một số vòng chọn lọc.
Việc lấy mẫu dịch não tủy theo chuỗi có thể được thực hiện bằng cách cấy ghép ống thông vào não giữa của chuột tỉnh táo để tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định phage T7 được tiêm tĩnh mạch (iv) qua hàng rào máu não (BBB) ​​và/hoặc hàng rào dịch não tủy (BCSFB) (Hình 1a-b). Chúng tôi đã sử dụng hai nhánh chọn lọc độc lập (nhánh A và B) trong ba vòng chọn lọc in vivo đầu tiên (Hình 1c). Chúng tôi dần dần tăng độ nghiêm ngặt của quá trình chọn lọc bằng cách giảm tổng lượng phage được đưa vào trong ba vòng chọn lọc đầu tiên. Đối với vòng sàng lọc thứ tư, chúng tôi đã kết hợp các mẫu từ nhánh A và B và thực hiện thêm ba lần chọn lọc độc lập. Để nghiên cứu các đặc tính in vivo của các hạt phage T7 trong mô hình này, phage kiểu hoang dã (PAGISRELVDKL master insert) đã được tiêm vào chuột qua tĩnh mạch đuôi. Sự phục hồi của phage từ dịch não tủy và máu ở các thời điểm khác nhau cho thấy rằng các phage hình khối đa diện T7 tương đối nhỏ có giai đoạn thanh thải ban đầu nhanh chóng khỏi khoang máu (Hình bổ sung 3). Dựa trên nồng độ phage được tiêm và thể tích máu của chuột, chúng tôi tính toán rằng chỉ khoảng 1% phage trọng lượng từ liều tiêm được phát hiện trong máu 10 phút sau khi tiêm tĩnh mạch. Sau sự suy giảm nhanh chóng ban đầu này, tốc độ thanh thải ban đầu chậm hơn được đo với thời gian bán hủy là 27,7 phút. Điều quan trọng là, chỉ có rất ít phage được thu hồi từ khoang dịch não tủy, cho thấy nền tảng thấp cho sự di chuyển của phage kiểu hoang dã vào khoang dịch não tủy (Hình bổ sung 3). Trung bình, chỉ khoảng 1 x 10-3% nồng độ phage T7 trong máu và 4 x 10-8% phage được truyền ban đầu được phát hiện trong dịch não tủy trong toàn bộ thời gian lấy mẫu (0-250 phút). Đáng chú ý, thời gian bán hủy (25,7 phút) của phage kiểu hoang dã trong dịch não tủy tương tự như thời gian bán hủy quan sát được trong máu. Những dữ liệu này chứng minh rằng hàng rào ngăn cách khoang dịch não tủy với máu vẫn còn nguyên vẹn ở chuột được đặt ống thông CM, cho phép chọn lọc in vivo các thư viện phage để xác định các dòng vô tính dễ dàng được vận chuyển từ máu vào khoang dịch não tủy.
(a) Thiết lập phương pháp lấy mẫu lại dịch não tủy (CSF) từ một lượng lớn mẫu. (b) Sơ đồ thể hiện vị trí tế bào của hàng rào hệ thần kinh trung ương (CNS) và chiến lược lựa chọn được sử dụng để xác định các peptide vượt qua hàng rào máu não (BBB). (c) Sơ đồ quy trình sàng lọc hiển thị phage in vivo. Trong mỗi vòng lựa chọn, phage (mã định danh động vật bên trong mũi tên) được tiêm tĩnh mạch. Hai nhánh thay thế độc lập (A, B) được giữ riêng biệt cho đến vòng lựa chọn thứ 4. Đối với vòng lựa chọn 3 và 4, mỗi dòng phage được chiết xuất từ ​​CSF được giải trình tự thủ công. (d) Động học của phage được phân lập từ máu (vòng tròn màu đỏ) và dịch não tủy (tam giác màu xanh lá cây) trong vòng lựa chọn đầu tiên ở hai con chuột được đặt ống thông sau khi tiêm tĩnh mạch thư viện peptide T7 (2 x 1012 phage/động vật). Các ô vuông màu xanh lam biểu thị nồng độ ban đầu trung bình của phage trong máu, được tính toán từ lượng phage được tiêm, có tính đến tổng thể tích máu. Các ô vuông màu đen biểu thị điểm giao nhau của đường y được ngoại suy từ nồng độ phage trong máu. (e,f) Trình bày tần suất tương đối và sự phân bố của tất cả các mô típ tripeptide chồng chéo có thể có trong peptide. Số lượng mô típ được tìm thấy trong 1000 lần đọc được hiển thị. Các mô típ được làm giàu đáng kể (p < 0,001) được đánh dấu bằng các chấm đỏ. (e) Biểu đồ phân tán tương quan so sánh tần suất tương đối của mô típ tripeptide của thư viện được tiêm với phage có nguồn gốc từ máu của động vật #1.1 và #1.2. (f) Biểu đồ phân tán tương quan so sánh tần suất tương đối của các mô típ tripeptide phage động vật #1.1 và #1.2 được phân lập trong máu và dịch não tủy. (g, h) Biểu diễn ID trình tự của phage được làm giàu trong máu (g) ​​so với thư viện được tiêm và phage được làm giàu trong dịch não tủy (h) so với máu sau một vòng chọn lọc in vivo ở cả hai động vật. Kích thước của mã một chữ cái cho biết tần suất xuất hiện của axit amin đó tại vị trí đó. Màu xanh lá cây = phân cực, màu tím = trung tính, màu xanh lam = kiềm, màu đỏ = axit và màu đen = axit amin kỵ nước. Hình 1a, b được thiết kế và sản xuất bởi Eduard Urich.
Chúng tôi đã tiêm thư viện peptide phage vào hai con chuột CM (nhóm A và B) và phân lập phage từ dịch não tủy và máu (Hình 1d). Sự đào thải nhanh chóng ban đầu của thư viện ít rõ rệt hơn so với phage kiểu hoang dã. Thời gian bán hủy trung bình của thư viện được tiêm vào cả hai con vật là 24,8 phút trong máu, tương tự như phage kiểu hoang dã, và 38,5 phút trong dịch não tủy. Các mẫu phage trong máu và dịch não tủy của mỗi con vật được tiến hành sàng lọc tốc độ cao (HTS) và tất cả các peptide được xác định đều được phân tích sự hiện diện của một motif tripeptide ngắn. Các motif tripeptide được chọn vì chúng cung cấp cơ sở tối thiểu cho sự hình thành cấu trúc và tương tác peptide-protein14,15. Chúng tôi nhận thấy mối tương quan tốt trong sự phân bố các motif giữa thư viện phage được tiêm và các bản sao được chiết xuất từ ​​máu của cả hai con vật (Hình 1e). Dữ liệu cho thấy thành phần của thư viện chỉ được làm giàu một cách không đáng kể trong ngăn máu. Tần suất axit amin và trình tự đồng thuận được phân tích thêm ở mỗi vị trí bằng cách sử dụng một phiên bản thích ứng của phần mềm Weblogo16. Điều thú vị là, chúng tôi nhận thấy sự làm giàu mạnh mẽ các gốc glycine trong máu (Hình 1g). Khi so sánh máu với các dòng vô tính được chọn từ dịch não tủy, người ta quan sát thấy sự chọn lọc mạnh mẽ và một số sự loại bỏ các mô típ (Hình 1f), và một số axit amin xuất hiện ưu tiên ở các vị trí được xác định trước trong chuỗi 12 thành phần (Hình 1h). Đáng chú ý, các cá thể động vật khác nhau có sự khác biệt đáng kể về dịch não tủy, trong khi sự làm giàu glycine trong máu được quan sát thấy ở cả hai con vật (Hình bổ sung 4a–j). Sau khi lọc nghiêm ngặt dữ liệu trình tự trong dịch não tủy của động vật #1.1 và #1.2, tổng cộng 964 và 420 peptide 12-mer duy nhất đã được thu được (Hình bổ sung 1d–e). Các dòng vô tính phage được phân lập đã được khuếch đại và trải qua vòng chọn lọc in vivo thứ hai. Phage được chiết xuất từ ​​vòng chọn lọc thứ hai đã được tiến hành sàng lọc tốc độ cao (HTS) ở mỗi con vật và tất cả các peptide được xác định đã được sử dụng làm đầu vào cho chương trình nhận dạng mô típ để phân tích sự xuất hiện của các mô típ tripeptide (Hình 2a, b, ef). So với chu kỳ đầu tiên của phage được phân lập từ dịch não tủy (CSF), chúng tôi quan sát thấy sự chọn lọc và loại bỏ thêm nhiều motif trong CSF ở nhánh A và B (Hình 2). Thuật toán nhận dạng mạng lưới đã được áp dụng để xác định xem chúng có đại diện cho các mẫu trình tự nhất quán khác nhau hay không. Một sự tương đồng rõ ràng đã được quan sát thấy giữa các trình tự 12 chiều được phân lập từ CSF trong nhánh A (Hình 2c, d) và nhánh B (Hình 2g, h). Phân tích tổng hợp trong mỗi nhánh cho thấy các cấu hình chọn lọc khác nhau đối với các peptide 12-mer (Hình bổ sung 5c,d) và sự gia tăng tỷ lệ hiệu giá CSF/máu theo thời gian đối với các dòng vô tính được tổng hợp sau vòng chọn lọc thứ hai so với vòng chọn lọc đầu tiên (Hình bổ sung 5e).
Làm giàu các mô típ và peptit trong dịch não tủy bằng hai vòng chọn lọc hiển thị phage chức năng in vivo liên tiếp.
Tất cả các phage dịch não tủy thu được từ vòng đầu tiên của mỗi con vật (động vật #1.1 và #1.2) được gộp lại, khuếch đại, giải trình tự HT và tiêm lại cùng nhau (2 x 1010 phage/động vật) cho 2 con chuột được đặt ống thông SM (#1.1 → #2.1 và 2.2, 1.2 → 2.3 và 2.4). (a,b,e,f) Biểu đồ phân tán tương quan so sánh tần suất tương đối của các motif tripeptide của tất cả các phage có nguồn gốc từ dịch não tủy trong vòng chọn lọc đầu tiên và thứ hai. Tần suất tương đối và sự phân bố của các motif đại diện cho tất cả các tripeptide chồng chéo có thể có được tìm thấy trong các peptide ở cả hai hướng. Số lượng motif được tìm thấy trong 1000 lần đọc được hiển thị. Các motif được chọn hoặc loại trừ đáng kể (p < 0,001) trong một trong các thư viện được so sánh được đánh dấu bằng các chấm đỏ. (c, d, g, h) Biểu diễn logo trình tự của tất cả các chuỗi dài 12 axit amin giàu CSF dựa trên vòng 2 và vòng 1 của quá trình chọn lọc in vivo. Kích thước của mã một chữ cái cho biết tần suất xuất hiện của axit amin đó tại vị trí đó. Để biểu diễn logo, tần suất của các chuỗi CSF được chiết xuất từ ​​từng cá thể động vật giữa hai vòng chọn lọc được so sánh và các chuỗi được làm giàu trong vòng thứ hai được hiển thị: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 và (h) #1.2–#2.4. Các axit amin được làm giàu nhiều nhất tại một vị trí nhất định ở (c, d) động vật số 2.1 và số 2.2 hoặc (g, h) ở động vật số 2.3 và số 2.4 được hiển thị bằng màu sắc. Xanh lá cây = phân cực, tím = trung tính, xanh lam = kiềm, đỏ = axit và đen = kỵ nước.
Sau vòng chọn lọc thứ ba, chúng tôi đã xác định được 124 chuỗi peptide độc ​​nhất (#3.1 và #3.2) từ 332 dòng phage tái tạo từ dịch não tủy được phân lập từ hai con vật (Hình bổ sung 6a). Chuỗi LGSVS (18,7%) có tỷ lệ tương đối cao nhất, tiếp theo là các đoạn chèn kiểu hoang dã PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) và SARGSWREIVSLS (2,2%). Trong vòng thứ tư cuối cùng, chúng tôi đã gộp hai nhánh được chọn độc lập từ ba con vật riêng biệt (Hình 1c). Trong số 925 dòng phage được giải trình tự thu được từ dịch não tủy, ở vòng thứ tư, chúng tôi đã tìm thấy 64 chuỗi peptide độc ​​nhất (Hình bổ sung 6b), trong đó tỷ lệ tương đối của phage kiểu hoang dã giảm xuống còn 0,8%. Các dòng tế bào CSF ​​phổ biến nhất trong vòng thứ tư là LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) và RLSSVDSDLSGC (3,2%). Phạm vi chiều dài của các peptide được chọn là do sự chèn/xóa nucleotide hoặc mã dừng sớm trong các mồi thư viện khi sử dụng mã thoái hóa để thiết kế thư viện NNK. Mã dừng sớm tạo ra các peptide ngắn hơn và được chọn vì chúng chứa mô típ axit amin thuận lợi. Các peptide dài hơn có thể là kết quả của sự chèn/xóa trong các mồi của thư viện tổng hợp. Điều này định vị mã dừng được thiết kế nằm ngoài khung và đọc nó cho đến khi một mã dừng mới xuất hiện ở phía hạ lưu. Nhìn chung, chúng tôi đã tính toán các hệ số làm giàu cho cả bốn vòng chọn lọc bằng cách so sánh dữ liệu đầu vào với dữ liệu đầu ra của mẫu. Trong vòng sàng lọc đầu tiên, chúng tôi đã sử dụng hiệu giá phage kiểu hoang dã làm tham chiếu nền không đặc hiệu. Điều thú vị là, quá trình chọn lọc phage âm tính diễn ra rất mạnh trong chu kỳ dịch não tủy đầu tiên, nhưng không phải trong máu (Hình 3a), điều này có thể là do xác suất khuếch tán thụ động thấp của hầu hết các thành viên trong thư viện peptide vào khoang dịch não tủy hoặc các phage tương đối có xu hướng được giữ lại hoặc loại bỏ khỏi máu hiệu quả hơn so với vi khuẩn thể. Tuy nhiên, trong vòng sàng lọc thứ hai, quá trình chọn lọc mạnh mẽ các phage trong dịch não tủy đã được quan sát thấy ở cả hai nhánh, cho thấy vòng trước đó đã được làm giàu các phage hiển thị các peptide thúc đẩy sự hấp thụ vào dịch não tủy (Hình 3a). Một lần nữa, không có sự làm giàu đáng kể trong máu. Cũng trong vòng thứ ba và thứ tư, các dòng phage đã được làm giàu đáng kể trong dịch não tủy. So sánh tần suất tương đối của mỗi chuỗi peptide duy nhất giữa hai vòng chọn lọc cuối cùng, chúng tôi nhận thấy rằng các chuỗi này thậm chí còn được làm giàu nhiều hơn trong vòng chọn lọc thứ tư (Hình 3b). Tổng cộng 931 motif tripeptide đã được trích xuất từ ​​tất cả 64 chuỗi peptide duy nhất bằng cách sử dụng cả hai hướng peptide. Các mô típ được làm giàu nhiều nhất trong vòng thứ tư đã được kiểm tra kỹ lưỡng hơn về hồ sơ làm giàu của chúng trên tất cả các vòng so với thư viện được đưa vào (ngưỡng: làm giàu 10%) (Hình bổ sung 6c). Các mô hình chọn lọc chung cho thấy hầu hết các mô típ được nghiên cứu đều được làm giàu trong tất cả các vòng trước đó của cả hai nhánh chọn lọc. Tuy nhiên, một số mô típ (ví dụ: SGL, VSG, LGS GSV) chủ yếu đến từ nhánh thay thế A, trong khi những mô típ khác (ví dụ: FGW, RTN, WGF, NTR) được làm giàu trong nhánh thay thế B.
Xác nhận khả năng vận chuyển qua dịch não tủy của các peptide được hiển thị trên phage và các peptide dẫn đầu được biotin hóa liên hợp với các chất mang streptavidin.
(a) Tỷ lệ làm giàu được tính toán trong cả bốn vòng (R1-R4) dựa trên nồng độ phage (PFU) được tiêm (đầu vào = I) và nồng độ phage trong dịch não tủy được xác định (đầu ra = O). Hệ số làm giàu cho ba vòng cuối (R2-R4) được tính toán bằng cách so sánh với vòng trước và vòng đầu tiên (R1) với dữ liệu trọng lượng. Các cột mở là dịch não tủy, các cột tô bóng là huyết tương. (***p<0,001, dựa trên kiểm định t của Student). (b) Danh sách các peptide phage phong phú nhất, được xếp hạng theo tỷ lệ tương đối của chúng so với tất cả các phage được thu thập trong dịch não tủy sau vòng chọn lọc thứ 4. Sáu dòng phage phổ biến nhất được tô màu nổi bật, đánh số và hệ số làm giàu của chúng giữa vòng chọn lọc thứ 3 và thứ 4 (hình nhỏ). (c,d) Sáu dòng phage được làm giàu nhất, thư viện peptide phage rỗng và phage gốc từ vòng 4 được phân tích riêng lẻ trong mô hình lấy mẫu dịch não tủy. Mẫu dịch não tủy và máu được thu thập tại các thời điểm được chỉ định. (c) Lượng bằng nhau của 6 dòng phage ứng cử viên (2 x 1010 phage/động vật), phage rỗng (#1779) (2 x 1010 phage/động vật) và thư viện peptide phage gốc (2 x 1012 phage/động vật). Tiêm ít nhất 3 CM vào động vật được đặt ống thông riêng biệt qua tĩnh mạch đuôi. Dược động học dịch não tủy của mỗi dòng phage và thư viện peptide phage được tiêm theo thời gian được thể hiện. (d) cho thấy tỷ lệ dịch não tủy/máu trung bình cho tất cả các phage thu hồi được/mL trong suốt thời gian lấy mẫu. (e) Bốn peptide dẫn đầu tổng hợp và một peptide kiểm soát ngẫu nhiên được liên kết với biotin vào streptavidin thông qua đầu N của chúng (hiển thị tetramer) sau đó được tiêm (tĩnh mạch đuôi, 10 mg streptavidin/kg). Ít nhất ba con chuột được đặt ống thông (N = 3). Các mẫu dịch não tủy được thu thập tại các thời điểm được chỉ định và nồng độ streptavidin được đo bằng phương pháp ELISA kháng streptavidin trong dịch não tủy (nd = không phát hiện). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, dựa trên phép thử ANOVA). (f) So sánh trình tự axit amin của dòng peptide phage được làm giàu nhất #2002 (màu tím) với các dòng peptide phage được chọn khác từ vòng chọn lọc thứ 4. Các đoạn axit amin giống hệt nhau và tương tự được mã hóa bằng màu sắc.
Trong số tất cả các phage được làm giàu ở vòng thứ tư (Hình 3b), sáu dòng ứng cử viên đã được chọn để phân tích riêng lẻ thêm trong mô hình lấy mẫu dịch não tủy. Một lượng bằng nhau của sáu phage ứng cử viên, phage rỗng (không có đoạn chèn) và thư viện peptide prophage đã được tiêm vào ba con vật CM được đặt ống thông, và dược động học được xác định trong các xét nghiệm dịch não tủy (Hình 3c) và máu (Hình bổ sung 7). Tất cả các dòng phage được thử nghiệm đều nhắm mục tiêu vào khoang dịch não tủy ở mức cao hơn 10-1000 lần so với phage kiểm soát rỗng (#1779). Ví dụ, các dòng #2020 và #2077 có nồng độ trong dịch não tủy cao hơn khoảng 1000 lần so với phage kiểm soát. Hồ sơ dược động học của mỗi peptide được chọn là khác nhau, nhưng tất cả chúng đều có khả năng định vị trong dịch não tủy cao. Chúng tôi quan sát thấy sự giảm dần đều theo thời gian đối với các dòng vô tính #1903 và #2011, trong khi đối với các dòng vô tính #2077, #2002 và #2009, sự gia tăng trong 10 phút đầu tiên có thể cho thấy sự vận chuyển tích cực nhưng cần được xác minh. Các dòng vô tính #2020, #2002 và #2077 ổn định ở mức cao, trong khi nồng độ CSF của dòng vô tính #2009 giảm dần sau khi tăng ban đầu. Sau đó, chúng tôi so sánh tần suất tương đối của mỗi ứng viên CSF với nồng độ trong máu của nó (Hình 3d). Mối tương quan giữa hiệu giá trung bình của mỗi ứng viên CSF với hiệu giá trong máu của nó ở tất cả các thời điểm lấy mẫu cho thấy ba trong số sáu ứng viên được làm giàu đáng kể trong CSF máu. Điều thú vị là, dòng vô tính #2077 cho thấy độ ổn định trong máu cao hơn (Hình bổ sung 7). Để xác nhận rằng bản thân các peptide có khả năng vận chuyển tích cực các chất khác ngoài các hạt phage vào khoang CSF, chúng tôi đã tổng hợp bốn peptide dẫn đầu được dẫn xuất bằng biotin ở đầu N, nơi các peptide gắn vào hạt phage. Các peptide được biotin hóa (số 2002, 2009, 2020 và 2077) được liên hợp với streptavidin (SA) để thu được các dạng đa phân tử phần nào mô phỏng hình dạng của phage. Định dạng này cũng cho phép chúng tôi đo lường sự phơi nhiễm SA trong máu và dịch não tủy dưới dạng các peptide protein vận chuyển hàng hóa. Quan trọng hơn, dữ liệu về phage thường có thể được tái tạo khi các peptide tổng hợp được sử dụng ở dạng liên hợp SA này (Hình 3e). Các peptide bị xáo trộn có mức độ phơi nhiễm ban đầu thấp hơn và được thanh thải khỏi dịch não tủy nhanh hơn, với nồng độ không thể phát hiện được trong vòng 48 giờ. Để hiểu rõ hơn về các con đường vận chuyển của các dòng phage peptide này vào không gian dịch não tủy, chúng tôi đã phân tích vị trí của từng peptide phage riêng lẻ bằng phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC) để phát hiện trực tiếp các hạt phage 1 giờ sau khi tiêm tĩnh mạch in vivo. Đáng chú ý, các bản sao #2002, #2077 và #2009 có thể được phát hiện bằng cách nhuộm màu mạnh trong các mao mạch não, trong khi phage đối chứng (#1779) và bản sao #2020 không được phát hiện (Hình bổ sung 8). Điều này cho thấy rằng các peptide này góp phần tạo ra tác động lên não chính xác bằng cách vượt qua hàng rào máu não (BBB). Cần phân tích chi tiết hơn để kiểm tra giả thuyết này, vì con đường BSCFB cũng có thể liên quan. Khi so sánh trình tự axit amin của bản sao được làm giàu nhiều nhất (#2002) với các peptide được chọn khác, người ta nhận thấy rằng một số trong chúng có phần mở rộng axit amin tương tự, điều này có thể cho thấy một cơ chế vận chuyển tương tự (Hình 3f).
Do đặc điểm huyết tương độc đáo và sự gia tăng đáng kể nồng độ CSF theo thời gian, dòng phage hiển thị #2077 đã được nghiên cứu sâu hơn trong khoảng thời gian 48 giờ và có thể tái tạo sự gia tăng nhanh chóng nồng độ CSF quan sát được khi duy trì nồng độ SA (Hình 4a). Đối với các dòng phage khác được xác định, #2077 nhuộm màu mạnh các mao mạch não và cho thấy sự đồng định vị đáng kể với lectin đánh dấu mao mạch khi quan sát ở độ phân giải cao hơn và có thể có một số vết nhuộm trong không gian nhu mô (Hình 4b). Để điều tra xem liệu các tác dụng dược lý trung gian bởi peptide có thể đạt được trong hệ thần kinh trung ương hay không, chúng tôi đã thực hiện một thí nghiệm trong đó các phiên bản biotin hóa của i) peptide vận chuyển #2077 và ii) peptide ức chế BACE1 được trộn với SA theo hai tỷ lệ khác nhau. Đối với một sự kết hợp, chúng tôi chỉ sử dụng peptide ức chế BACE1 và đối với sự kết hợp khác, chúng tôi sử dụng tỷ lệ 1:3 giữa peptide ức chế BACE1 và peptide #2077. Cả hai mẫu đều được tiêm tĩnh mạch và nồng độ peptide beta-amyloid 40 (Abeta40) trong máu và dịch não tủy được đo theo thời gian. Abeta40 được đo trong dịch não tủy vì nó phản ánh sự ức chế BACE1 trong nhu mô não. Đúng như dự đoán, cả hai phức hợp đều làm giảm đáng kể nồng độ Abeta40 trong máu (Hình 4c, d). Tuy nhiên, chỉ các mẫu chứa hỗn hợp peptide số 2077 và chất ức chế peptide BACE1 liên hợp với SA mới gây ra sự giảm đáng kể Abeta40 trong dịch não tủy (Hình 4c). Dữ liệu cho thấy peptide số 2077 có khả năng vận chuyển protein SA 60 kDa vào hệ thần kinh trung ương và cũng gây ra các tác dụng dược lý với các chất ức chế peptide BACE1 liên hợp với SA.
(a) Tiêm chủng nhân bản (2 × 10 phage/động vật) phage T7 cho thấy hồ sơ dược động học dài hạn của peptide CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) và phage đối chứng không tiêm (#1779) ở ít nhất ba con chuột được đặt nội khí quản CM. (b) Hình ảnh hiển vi confocal của các vi mạch vỏ não tiêu biểu ở chuột được tiêm phage (2 × 10 10 phage/động vật) cho thấy sự nhuộm màu đối chứng của peptide #2077 và các mạch máu (lectin). Các dòng phage này được tiêm cho 3 con chuột và cho phép lưu thông trong 1 giờ trước khi tưới máu. Não được cắt lát và nhuộm bằng kháng thể đa dòng được gắn nhãn FITC chống lại vỏ capsid của phage T7. Mười phút trước khi tưới máu và cố định sau đó, lectin được gắn nhãn DyLight594 được tiêm tĩnh mạch. Hình ảnh huỳnh quang cho thấy sự nhuộm màu lectin (màu đỏ) ở mặt trong của các vi mạch và phage (màu xanh lá cây) trong lòng mao mạch và mô não quanh mạch máu. Thanh tỷ lệ tương ứng với 10 µm. (c, d) Peptide ức chế BACE1 được biotin hóa, dùng riêng lẻ hoặc kết hợp với peptide vận chuyển được biotin hóa #2077, được gắn vào streptavidin, sau đó tiêm tĩnh mạch cho ít nhất ba con chuột CM được đặt ống thông (10 mg streptavidin/kg). Sự giảm Aβ40 do chất ức chế peptide BACE1 gây ra được đo bằng ELISA Aβ1-40 trong máu (màu đỏ) và dịch não tủy (màu cam) tại các thời điểm được chỉ định. Để dễ hình dung hơn, một đường chấm chấm được vẽ trên biểu đồ ở tỷ lệ 100%. (c) Phần trăm giảm Aβ40 trong máu (tam giác đỏ) và dịch não tủy (tam giác cam) ở chuột được điều trị bằng streptavidin liên hợp với peptide vận chuyển #2077 và peptide ức chế BACE1 theo tỷ lệ 3:1. (d) Phần trăm giảm Aβ40 trong máu (vòng tròn đỏ) và dịch não tủy (vòng tròn cam) của chuột được điều trị chỉ bằng streptavidin liên hợp với peptide ức chế BACE1. Nồng độ Aβ trong nhóm đối chứng là 420 pg/ml (độ lệch chuẩn = 101 pg/ml).
Phương pháp hiển thị phage đã được ứng dụng thành công trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu y sinh học17. Phương pháp này đã được sử dụng cho các nghiên cứu về sự đa dạng mạch máu in vivo18,19 cũng như các nghiên cứu nhắm mục tiêu vào các mạch máu não20,21,22,23,24,25,26. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã mở rộng ứng dụng của phương pháp chọn lọc này không chỉ để xác định trực tiếp các peptide nhắm mục tiêu vào các mạch máu não, mà còn để phát hiện các ứng viên có đặc tính vận chuyển chủ động để vượt qua hàng rào máu não. Giờ đây, chúng tôi mô tả sự phát triển của một quy trình chọn lọc in vivo trên chuột được đặt nội khí quản CM và chứng minh tiềm năng của nó trong việc xác định các peptide có đặc tính hướng về dịch não tủy. Sử dụng phage T7 hiển thị thư viện các peptide ngẫu nhiên 12-mer, chúng tôi đã có thể chứng minh rằng phage T7 đủ nhỏ (đường kính khoảng 60 nm)10 để thích nghi với hàng rào máu não, do đó trực tiếp vượt qua hàng rào máu não hoặc đám rối màng mạch. Chúng tôi nhận thấy rằng việc thu thập dịch não tủy (CSF) từ chuột CM được đặt ống thông là một phương pháp sàng lọc chức năng in vivo được kiểm soát tốt, và phage được chiết xuất không chỉ liên kết với mạch máu mà còn hoạt động như một chất vận chuyển qua hàng rào máu não. Hơn nữa, bằng cách đồng thời thu thập máu và áp dụng HTS cho CSF ​​và phage có nguồn gốc từ máu, chúng tôi đã xác nhận rằng việc lựa chọn CSF của chúng tôi không bị ảnh hưởng bởi sự làm giàu máu hoặc khả năng mở rộng giữa các vòng chọn lọc. Tuy nhiên, ngăn máu là một phần của quy trình chọn lọc, vì phage có khả năng đến ngăn CSF phải tồn tại và lưu thông trong máu đủ lâu để tự làm giàu trong não. Để trích xuất thông tin trình tự đáng tin cậy từ dữ liệu HTS thô, chúng tôi đã triển khai các bộ lọc thích ứng với các lỗi trình tự cụ thể của nền tảng trong quy trình phân tích. Bằng cách kết hợp các thông số động học vào phương pháp sàng lọc, chúng tôi đã xác nhận dược động học nhanh của phage T7 kiểu hoang dã (t½ ~ 28 phút) trong máu24, 27, 28 và cũng xác định thời gian bán hủy của chúng trong dịch não tủy (t½ ~ 26 phút). Mặc dù có cấu hình dược động học tương tự trong máu và dịch não tủy, chỉ có 0,001% nồng độ phage trong máu được phát hiện trong dịch não tủy, cho thấy khả năng di chuyển nền thấp của phage T7 kiểu hoang dã qua hàng rào máu não. Nghiên cứu này nhấn mạnh tầm quan trọng của vòng chọn lọc đầu tiên khi sử dụng các chiến lược sàng lọc in vivo, đặc biệt đối với các hệ thống phage bị loại bỏ nhanh chóng khỏi hệ tuần hoàn, vì chỉ một số ít dòng vô tính có thể đến được khoang CNS. Do đó, trong vòng đầu tiên, sự giảm đa dạng thư viện là rất lớn, vì cuối cùng chỉ có một số lượng hạn chế các dòng vô tính được thu thập trong mô hình dịch não tủy rất nghiêm ngặt này. Chiến lược sàng lọc in vivo này bao gồm một số bước chọn lọc như tích lũy tích cực trong khoang dịch não tủy, sự sống sót của dòng vô tính trong khoang máu và loại bỏ nhanh chóng các dòng vô tính phage T7 khỏi máu trong vòng 10 phút đầu tiên (Hình 1d và Hình bổ sung 4M). Do đó, sau vòng đầu tiên, các dòng vô tính phage khác nhau đã được xác định trong dịch não tủy, mặc dù cùng một nhóm ban đầu đã được sử dụng cho từng con vật. Điều này cho thấy rằng nhiều bước chọn lọc nghiêm ngặt đối với các thư viện nguồn có số lượng thành viên lớn sẽ dẫn đến sự suy giảm đáng kể về tính đa dạng. Do đó, các sự kiện ngẫu nhiên sẽ trở thành một phần không thể thiếu của quá trình chọn lọc ban đầu, ảnh hưởng lớn đến kết quả. Có khả năng nhiều bản sao trong thư viện ban đầu có xu hướng làm giàu dịch não tủy rất giống nhau. Tuy nhiên, ngay cả trong cùng điều kiện thí nghiệm, kết quả chọn lọc vẫn có thể khác nhau do số lượng nhỏ của mỗi bản sao cụ thể trong nhóm ban đầu.
Các motif được làm giàu trong dịch não tủy khác với các motif trong máu. Điều thú vị là, chúng tôi nhận thấy sự dịch chuyển đầu tiên hướng tới các peptide giàu glycine trong máu của từng con vật (Hình 1g, Hình bổ sung 4e, 4f). Phage chứa peptide glycine có thể ổn định hơn và ít có khả năng bị loại khỏi hệ tuần hoàn. Tuy nhiên, các peptide giàu glycine này không được phát hiện trong các mẫu dịch não tủy, cho thấy rằng các thư viện được chọn lọc đã trải qua hai bước chọn lọc khác nhau: một trong máu và một bước khác cho phép tích lũy trong dịch não tủy. Các dòng vô tính được làm giàu trong dịch não tủy thu được từ vòng chọn lọc thứ tư đã được thử nghiệm rộng rãi. Gần như tất cả các dòng vô tính được thử nghiệm riêng lẻ đều được xác nhận là được làm giàu trong dịch não tủy so với phage đối chứng trống. Một peptide (#2077) đã được kiểm tra chi tiết hơn. Nó cho thấy thời gian bán hủy trong huyết tương dài hơn so với các peptide khác (Hình 3d và Hình bổ sung 7), và điều thú vị là, peptide này chứa một gốc cysteine ​​ở đầu C. Gần đây, người ta đã chứng minh rằng việc bổ sung cysteine ​​vào peptide có thể cải thiện các đặc tính dược động học của chúng bằng cách liên kết với albumin 29. Điều này hiện chưa được biết đối với peptide #2077 và cần nghiên cứu thêm. Một số peptide cho thấy sự phụ thuộc vào hóa trị trong quá trình làm giàu CSF (dữ liệu không được hiển thị), điều này có thể liên quan đến hình dạng bề mặt được hiển thị của vỏ capsid T7. Hệ thống T7 mà chúng tôi sử dụng cho thấy 5-15 bản sao của mỗi peptide trên mỗi hạt phage. IHC đã được thực hiện trên các dòng phage dẫn đầu tiềm năng được tiêm tĩnh mạch vào vỏ não của chuột (Hình bổ sung 8). Dữ liệu cho thấy ít nhất ba dòng (số 2002, số 2009 và số 2077) tương tác với hàng rào máu não (BBB). Vẫn cần xác định xem sự tương tác BBB này dẫn đến sự tích tụ CSF hay sự di chuyển của các dòng này trực tiếp đến hàng rào dịch não tủy (BCSFB). Quan trọng hơn, chúng tôi cho thấy rằng các peptide được chọn vẫn giữ được khả năng vận chuyển CSF khi được tổng hợp và liên kết với protein đích. Sự liên kết của các peptide biotin hóa đầu N với SA về cơ bản lặp lại các kết quả thu được với các dòng phage tương ứng của chúng trong máu và dịch não tủy (Hình 3e). Cuối cùng, chúng tôi cho thấy peptide dẫn đầu #2077 có khả năng thúc đẩy hoạt động của não bộ của chất ức chế peptide biotin hóa BACE1 liên hợp với SA, gây ra các tác dụng dược động học rõ rệt trong hệ thần kinh trung ương bằng cách giảm đáng kể mức Abeta40 trong dịch não tủy (Hình 4). Chúng tôi không thể xác định bất kỳ chất tương đồng nào trong cơ sở dữ liệu bằng cách thực hiện tìm kiếm tương đồng trình tự peptide của tất cả các kết quả tìm thấy. Điều quan trọng cần lưu ý là kích thước của thư viện T7 xấp xỉ 109, trong khi kích thước thư viện lý thuyết cho 12-mer là 4 x 1015. Do đó, chúng tôi chỉ chọn một phần nhỏ không gian đa dạng của thư viện peptide 12-mer, điều này có thể có nghĩa là có thể xác định được nhiều peptide tối ưu hơn bằng cách đánh giá không gian trình tự liền kề của các kết quả tìm thấy này. Theo giả thuyết, một trong những lý do tại sao chúng ta chưa tìm thấy bất kỳ chất tương đồng tự nhiên nào của các peptit này có thể là do quá trình chọn lọc trong quá trình tiến hóa nhằm ngăn chặn sự xâm nhập không kiểm soát của một số motif peptit nhất định vào não.
Tóm lại, kết quả của chúng tôi cung cấp cơ sở cho các nghiên cứu trong tương lai nhằm xác định và mô tả chi tiết hơn các hệ thống vận chuyển của hàng rào mạch máu não trong cơ thể sống. Cấu trúc cơ bản của phương pháp này dựa trên chiến lược chọn lọc chức năng, không chỉ xác định các dòng tế bào có đặc tính liên kết với mạch máu não, mà còn bao gồm một bước quan trọng trong đó các dòng tế bào thành công phải có hoạt tính nội tại để vượt qua các rào cản sinh học trong cơ thể sống vào khoang CNS. Mục tiêu là làm sáng tỏ cơ chế vận chuyển của các peptide này và sự ưu tiên liên kết của chúng với hệ vi mạch máu đặc hiệu cho vùng não. Điều này có thể dẫn đến việc phát hiện ra các con đường mới cho sự vận chuyển qua hàng rào máu não (BBB) ​​và các thụ thể. Chúng tôi kỳ vọng rằng các peptide được xác định có thể liên kết trực tiếp với các thụ thể mạch máu não hoặc với các phối tử lưu hành được vận chuyển qua BBB hoặc BCSFB. Các vector peptide có hoạt tính vận chuyển dịch não tủy được phát hiện trong nghiên cứu này sẽ được nghiên cứu sâu hơn. Hiện tại, chúng tôi đang nghiên cứu tính đặc hiệu của các peptide này đối với não bộ về khả năng vượt qua BBB và/hoặc BCSFB. Các peptide mới này sẽ là những công cụ vô cùng quý giá cho việc khám phá tiềm năng các thụ thể hoặc con đường tín hiệu mới, cũng như cho việc phát triển các nền tảng hiệu quả cao mới để vận chuyển các đại phân tử, chẳng hạn như các thuốc sinh học, đến não.
Đặt ống thông vào bể não lớn (CM) bằng cách sửa đổi phương pháp đã mô tả trước đó. Chuột Wistar (200-350 g) được gây mê và đặt trên thiết bị định vị não, sau đó rạch một đường giữa trên da đầu đã cạo sạch và được chuẩn bị vô trùng để lộ hộp sọ. Khoan hai lỗ ở vùng xương thái dương trên và cố định bằng vít vào các lỗ. Khoan thêm một lỗ ở mào chẩm bên để định vị bằng phương pháp định vị não cho ống thông bằng thép không gỉ vào CM. Bôi xi măng nha khoa xung quanh ống thông và cố định bằng vít. Sau khi chiếu đèn quang trùng hợp và xi măng cứng lại, vết thương trên da được khâu lại bằng chỉ supramid 4/0. Vị trí đặt ống thông chính xác được xác nhận bằng sự rò rỉ tự phát của dịch não tủy (CSF). Lấy chuột ra khỏi thiết bị định vị não, chăm sóc hậu phẫu và kiểm soát cơn đau thích hợp, và cho phép chuột hồi phục ít nhất một tuần cho đến khi quan sát thấy dấu hiệu máu trong dịch não tủy. Chuột Wistar (Crl:WI/Han) được mua từ Charles River (Pháp). Tất cả chuột đều được nuôi trong điều kiện không có mầm bệnh cụ thể. Tất cả các thí nghiệm trên động vật đều được Văn phòng Thú y thành phố Basel, Thụy Sĩ phê duyệt và được thực hiện theo Giấy phép Động vật số 2474 (Đánh giá vận chuyển não chủ động bằng cách đo nồng độ các ứng viên điều trị trong dịch não tủy và não của chuột).
Nhẹ nhàng giữ cho chuột tỉnh táo trong khi cầm ống thông CM. Tháo cây Datura ra khỏi ống thông và thu thập 10 µl dịch não tủy tự chảy. Vì độ thông suốt của ống thông cuối cùng bị ảnh hưởng, chỉ những mẫu dịch não tủy trong suốt, không có dấu hiệu nhiễm bẩn máu hoặc đổi màu mới được đưa vào nghiên cứu này. Song song đó, khoảng 10–20 μl máu được lấy từ một vết rạch nhỏ ở đầu đuôi vào các ống chứa heparin (Sigma-Aldrich). Dịch não tủy và máu được thu thập tại các thời điểm khác nhau sau khi tiêm tĩnh mạch phage T7. Khoảng 5–10 μl dịch được loại bỏ trước khi thu thập mỗi mẫu dịch não tủy, tương ứng với thể tích chết của ống thông.
Các thư viện được tạo ra bằng cách sử dụng vectơ T7Select 10-3b như mô tả trong hướng dẫn sử dụng hệ thống T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Tóm lại, một đoạn DNA chèn ngẫu nhiên 12-mer được tổng hợp theo định dạng sau:
Mã bộ ba NNK được sử dụng để tránh mã dừng kép và sự biểu hiện quá mức axit amin trong đoạn chèn. N là tỷ lệ mol bằng nhau được trộn thủ công của mỗi nucleotide, và K là tỷ lệ mol bằng nhau được trộn thủ công của các nucleotide adenine và cytosine. Các vùng mạch đơn được chuyển đổi thành DNA mạch đôi bằng cách ủ tiếp với dNTP (Novagen) và enzyme Klenow (New England Biolabs) trong dung dịch đệm Klenow (New England Biolabs) trong 3 giờ ở 37°C. Sau phản ứng, DNA mạch đôi được thu hồi bằng cách kết tủa EtOH. DNA thu được được cắt bằng các enzyme hạn chế EcoRI và HindIII (cả hai đều của Roche). Đoạn chèn đã được cắt và tinh chế (QIAquick, Qiagen) (ligase T4, New England Biolabs) sau đó được nối đúng khung vào vector T7 đã được cắt trước đó sau axit amin 348 của gen vỏ capsid 10B. Các phản ứng nối được ủ ở 16°C trong 18 giờ trước khi đóng gói in vitro. Quá trình đóng gói phage trong ống nghiệm được thực hiện theo hướng dẫn kèm theo bộ kit nhân bản T7Select 10-3b (Novagen) và dung dịch đóng gói được khuếch đại một lần đến khi ly giải bằng Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Dịch ly giải được ly tâm, chuẩn độ và đông lạnh ở -80°C để làm dung dịch gốc glycerol.
Khuếch đại PCR trực tiếp các vùng biến đổi của phage được khuếch đại trong môi trường nuôi cấy lỏng hoặc trên đĩa bằng cách sử dụng các mồi lai ghép khuếch đại 454/Roche độc ​​quyền. Mồi lai ghép phía trước chứa các trình tự bao quanh vùng biến đổi (NNK) 12 (đặc hiệu khuôn mẫu), bộ chuyển đổi GS FLX Titanium Adapter A và một trình tự khóa thư viện bốn base (TCAG) (Hình bổ sung 1a):
Mồi khuếch đại ngược cũng chứa biotin gắn vào các hạt bắt giữ và bộ chuyển đổi GS FLX Titanium Adapter B cần thiết cho quá trình khuếch đại dòng vô tính trong PCR nhũ tương:
Các đoạn khuếch đại sau đó được giải trình tự bằng phương pháp pyrosequencing 454/Roche theo quy trình 454 GS-FLX Titanium. Đối với giải trình tự Sanger thủ công (máy phân tích DNA Applied Biosystems Hitachi 3730 xl), DNA phage T7 được khuếch đại bằng PCR và giải trình tự với các cặp mồi sau:
Các đoạn chèn từ từng mảng khuẩn lạc riêng lẻ được khuếch đại bằng PCR sử dụng bộ kit Roche Fast Start DNA Polymerase (theo hướng dẫn của nhà sản xuất). Thực hiện chu kỳ khởi động nóng (10 phút ở 95 °C) và 35 chu kỳ tăng cường (50 giây ở 95 °C, 1 phút ở 50 °C và 1 phút ở 72 °C).
Các phage từ thư viện, phage kiểu hoang dã, phage được phân lập từ dịch não tủy và máu, hoặc các dòng vô tính riêng lẻ được nhân lên trong Escherichia coli BL5615 trong môi trường TB broth (Sigma Aldrich) hoặc trong đĩa 500 cm2 (Thermo Scientific) trong 4 giờ ở 37°C. Phage được chiết xuất từ ​​đĩa bằng cách rửa đĩa với dung dịch đệm Tris-EDTA (Fluka Analytical) hoặc bằng cách thu thập các khuẩn lạc bằng đầu pipet vô trùng. Phage được phân lập từ dịch nuôi cấy hoặc dung dịch đệm chiết xuất bằng một vòng kết tủa polyethylene glycol (PEG 8000) (Promega) và được huyền phù lại trong dung dịch đệm Tris-EDTA.
Phage được khuếch đại đã trải qua 2-3 vòng loại bỏ nội độc tố bằng cách sử dụng các hạt loại bỏ nội độc tố (Miltenyi Biotec) trước khi tiêm tĩnh mạch (500 μl/động vật). Ở vòng đầu tiên, 2×10¹² phage được đưa vào; ở vòng thứ hai, 2×10¹⁰ phage; ở vòng chọn lọc thứ ba và thứ tư, 2×10⁹ phage mỗi động vật. Hàm lượng phage trong dịch não tủy và mẫu máu được thu thập tại các thời điểm đã chỉ định được xác định bằng phương pháp đếm mảng bám theo hướng dẫn của nhà sản xuất (sổ tay hệ thống T7Select). Quá trình chọn lọc phage được thực hiện bằng cách tiêm tĩnh mạch các thư viện đã được tinh chế vào tĩnh mạch đuôi hoặc bằng cách tiêm lại phage được chiết xuất từ ​​dịch não tủy từ vòng chọn lọc trước đó, và các lần thu hoạch tiếp theo được thực hiện lần lượt ở các thời điểm 10 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 180 phút và 240 phút đối với mẫu dịch não tủy và máu. Tổng cộng có bốn vòng sàng lọc in vivo được tiến hành, trong đó hai nhánh được chọn được lưu trữ và phân tích riêng biệt trong ba vòng chọn lọc đầu tiên. Tất cả các đoạn gen phage được chiết xuất từ ​​dịch não tủy (CSF) trong hai vòng chọn lọc đầu tiên đều được giải trình tự bằng máy pyrosequencing 454/Roche, trong khi tất cả các dòng phage được chiết xuất từ ​​CSF trong hai vòng chọn lọc cuối cùng đều được giải trình tự thủ công. Tất cả các phage trong máu từ vòng chọn lọc đầu tiên cũng được giải trình tự bằng máy pyrosequencing 454/Roche. Để tiêm các dòng phage, các phage được chọn được nhân lên trong E. coli (BL5615) trên đĩa 500 cm2 ở 37°C trong 4 giờ. Các dòng phage được chọn riêng lẻ và giải trình tự thủ công được nuôi cấy trong môi trường TB. Sau khi chiết xuất, tinh chế và loại bỏ nội độc tố (như mô tả ở trên), 2×1010 phage/động vật trong 300 μl được tiêm tĩnh mạch vào một tĩnh mạch đuôi.
Xử lý sơ bộ và lọc định tính dữ liệu trình tự. Dữ liệu thô 454/Roche được chuyển đổi từ định dạng bản đồ luồng chuẩn nhị phân (sff) sang định dạng dễ đọc cho con người của Pearson (fasta) bằng phần mềm của nhà cung cấp. Việc xử lý tiếp theo trình tự nucleotide được thực hiện bằng các chương trình và tập lệnh C độc quyền (gói phần mềm chưa được phát hành) như mô tả bên dưới. Phân tích dữ liệu chính bao gồm các quy trình lọc nhiều giai đoạn nghiêm ngặt. Để lọc ra các đoạn đọc không chứa trình tự DNA chèn 12mer hợp lệ, các đoạn đọc được căn chỉnh tuần tự theo nhãn bắt đầu (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), nhãn kết thúc (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) và đoạn chèn nền (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) bằng cách sử dụng phép thử Needleman-Wunsch toàn cục. Việc căn chỉnh cho phép tối đa 2 sự không nhất quán trên mỗi lần căn chỉnh31. Do đó, các đoạn đọc không có thẻ bắt đầu và kết thúc và các đoạn đọc chứa đoạn chèn nền, tức là các căn chỉnh vượt quá số lượng sai lệch cho phép, đã bị loại bỏ khỏi thư viện. Đối với các trình tự đọc còn lại, chuỗi DNA N-mer kéo dài từ điểm bắt đầu và kết thúc trước điểm kết thúc được cắt ra từ chuỗi đọc gốc và được xử lý tiếp (sau đây gọi là “chèn”). Sau khi dịch đoạn chèn, phần sau codon dừng đầu tiên ở đầu 5′ của mồi được loại bỏ khỏi đoạn chèn. Ngoài ra, các nucleotide dẫn đến codon không hoàn chỉnh ở đầu 3′ của mồi cũng được loại bỏ. Để loại trừ các đoạn chèn chỉ chứa trình tự nền, các đoạn chèn đã dịch bắt đầu bằng mẫu axit amin “PAG” cũng được loại bỏ. Các peptide có chiều dài sau dịch mã nhỏ hơn 3 axit amin đã được loại bỏ khỏi thư viện. Cuối cùng, loại bỏ sự trùng lặp trong tập hợp các đoạn chèn và xác định tần suất của mỗi đoạn chèn duy nhất. Kết quả của phân tích này bao gồm một danh sách các trình tự nucleotide (đoạn chèn) và tần suất (trình tự đọc) của chúng (Hình bổ sung 1c và 2).
Phân nhóm các đoạn DNA N-mer theo độ tương đồng trình tự: Để loại bỏ các lỗi trình tự đặc trưng của 454/Roche (chẳng hạn như các vấn đề với việc giải trình tự phần mở rộng homopolymer) và loại bỏ các phần dư thừa ít quan trọng hơn, các đoạn DNA N-mer đã được lọc trước đó (các đoạn chèn) được sắp xếp theo độ tương đồng. Các đoạn chèn (cho phép tối đa 2 base không khớp) được sử dụng bằng thuật toán lặp được định nghĩa như sau: các đoạn chèn được sắp xếp trước theo tần suất của chúng (cao nhất đến thấp nhất), và nếu chúng giống nhau, thì được sắp xếp thứ hai theo chiều dài (dài nhất đến ngắn nhất). Do đó, các đoạn chèn thường xuyên nhất và dài nhất xác định "nhóm" đầu tiên. Tần suất của nhóm được đặt bằng tần suất khóa. Sau đó, mỗi đoạn chèn còn lại trong danh sách đã được sắp xếp được thử thêm vào nhóm bằng cách căn chỉnh Needleman-Wunsch theo cặp. Nếu số lượng sai khớp, đoạn chèn hoặc đoạn xóa trong một sự căn chỉnh không vượt quá ngưỡng 2, một đoạn chèn sẽ được thêm vào nhóm và tần suất tổng thể của nhóm được tăng lên bằng tần suất đoạn chèn được thêm vào. Các đoạn chèn được thêm vào một nhóm được đánh dấu là đã sử dụng và bị loại trừ khỏi quá trình xử lý tiếp theo. Nếu chuỗi chèn không thể được thêm vào một nhóm đã tồn tại, chuỗi chèn đó sẽ được sử dụng để tạo một nhóm mới với tần suất chèn phù hợp và được đánh dấu là đã sử dụng. Quá trình lặp kết thúc khi mỗi chuỗi chèn đã được sử dụng để tạo thành một nhóm mới hoặc có thể được đưa vào một nhóm đã tồn tại. Sau cùng, các chuỗi chèn được nhóm lại bao gồm các nucleotide cuối cùng sẽ được dịch thành các chuỗi peptide (thư viện peptide). Kết quả của phân tích này là một tập hợp các chuỗi chèn và tần suất tương ứng của chúng tạo nên số lượng các lần đọc liên tiếp (Hình bổ sung 2).
Tạo mẫu (Motif Generation): Dựa trên danh sách các peptide duy nhất, một thư viện được tạo ra chứa tất cả các mẫu axit amin (aa) có thể có như hình dưới đây. Mỗi mẫu có thể có với độ dài 3 được trích xuất từ ​​peptide và mẫu nghịch đảo của nó được thêm vào cùng với một thư viện mẫu chung chứa tất cả các mẫu (tripeptide). Các thư viện mẫu có tính lặp lại cao được giải trình tự và loại bỏ sự dư thừa. Sau đó, đối với mỗi tripeptide trong thư viện mẫu, chúng tôi kiểm tra sự hiện diện của nó trong thư viện bằng các công cụ tính toán. Trong trường hợp này, tần suất của peptide chứa tripeptide mẫu được tìm thấy được cộng lại và gán cho mẫu trong thư viện mẫu (“số lượng mẫu”). Kết quả của việc tạo mẫu là một mảng hai chiều chứa tất cả các lần xuất hiện của tripeptide (mẫu) và các giá trị tương ứng của chúng, đó là số lượng trình tự đọc tạo ra mẫu tương ứng khi các trình tự đọc được lọc, nhóm và dịch. Các chỉ số được mô tả chi tiết ở trên.
Chuẩn hóa số lượng họa tiết và biểu đồ phân tán tương ứng: Số lượng họa tiết cho mỗi mẫu được chuẩn hóa bằng cách sử dụng
trong đó ni là số lượng lượt đọc chứa chủ đề i. Như vậy, vi biểu thị tần suất phần trăm của các lượt đọc (hoặc peptide) chứa mô típ i trong mẫu. Giá trị P cho số lượng mô típ chưa được chuẩn hóa được tính bằng phép thử chính xác của Fisher. Đối với biểu đồ tương quan của số lượng mô típ, hệ số tương quan Spearman được tính bằng cách sử dụng số lượng mô típ đã được chuẩn hóa với R.
Để trực quan hóa hàm lượng axit amin tại mỗi vị trí trong thư viện peptide, các biểu đồ web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) đã được tạo ra. Đầu tiên, hàm lượng axit amin tại mỗi vị trí của peptide 12-mer được lưu trữ trong ma trận 20×12. Sau đó, một tập hợp 1000 peptide chứa cùng hàm lượng axit amin tương đối tại mỗi vị trí được tạo ra ở định dạng chuỗi fasta và được cung cấp làm đầu vào cho web-logo 3, tạo ra biểu diễn đồ họa về hàm lượng axit amin tương đối tại mỗi vị trí cho một thư viện peptide nhất định. Để trực quan hóa các tập dữ liệu đa chiều, bản đồ nhiệt được tạo ra bằng cách sử dụng một công cụ được phát triển nội bộ trong R (biosHeatmap, một gói R chưa được phát hành). Các biểu đồ cây được trình bày trong bản đồ nhiệt được tính toán bằng phương pháp phân cụm phân cấp Ward với thước đo khoảng cách Euclidean. Đối với phân tích thống kê dữ liệu điểm số mô típ, giá trị P cho điểm số chưa được chuẩn hóa được tính toán bằng cách sử dụng kiểm định chính xác Fisher. Giá trị P cho các tập dữ liệu khác được tính toán trong R bằng cách sử dụng phép kiểm định t của Student hoặc ANOVA.
Các dòng phage được chọn và phage không có đoạn chèn được tiêm tĩnh mạch qua tĩnh mạch đuôi (2×10¹⁰ phage/động vật trong 300 μl PBS). Mười phút trước khi truyền dịch và cố định tiếp theo, các động vật này được tiêm tĩnh mạch 100 μl lectin được gắn nhãn DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 phút sau khi tiêm phage, chuột được truyền dịch qua tim với 50 ml PBS tiếp theo là 50 ml dung dịch PFA 4%/PBS. Các mẫu não được cố định thêm qua đêm trong dung dịch PFA 4%/PBS và ngâm trong dung dịch sucrose 30% qua đêm ở 4°C. Các mẫu được đông lạnh nhanh trong hỗn hợp OCT. Phân tích miễn dịch mô học trên các mẫu đông lạnh được thực hiện ở nhiệt độ phòng trên các lát cắt đông lạnh 30 µm được chặn bằng 1% BSA và ủ với kháng thể đa dòng được gắn nhãn FITC chống lại phage T7 (Novus NB 600-376A) ở 4 °C. Ủ qua đêm. Cuối cùng, các lát cắt được rửa 3 lần bằng PBS và kiểm tra bằng kính hiển vi laser confocal (Leica TCS SP5).
Tất cả các peptide với độ tinh khiết tối thiểu 98% đều được tổng hợp bởi GenScript USA, gắn biotin và đông khô. Biotin được gắn vào thông qua một đoạn nối ba glycine bổ sung ở đầu N. Kiểm tra tất cả các peptide bằng phương pháp phổ khối lượng.
Streptavidin (Sigma S0677) được trộn với lượng dư gấp 5 lần về mặt mol của peptide biotin hóa, peptide ức chế BACE1 biotin hóa, hoặc hỗn hợp (tỷ lệ 3:1) của peptide ức chế BACE1 biotin hóa và peptide ức chế BACE1 trong 5–10% DMSO/ủ trong PBS. Ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng trước khi tiêm. Các peptide liên hợp streptavidin được tiêm tĩnh mạch với liều 10 mg/kg vào một trong các tĩnh mạch đuôi của chuột có khoang não.
Nồng độ phức hợp streptavidin-peptide được đánh giá bằng phương pháp ELISA. Các đĩa vi giếng Nunc Maxisorp (Sigma) được phủ qua đêm ở 4°C với kháng thể kháng streptavidin chuột 1,5 μg/ml (Thermo, MA1-20011). Sau khi chặn (dung dịch chặn: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatin, 1% BSA) ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ, rửa đĩa với dung dịch 0,05% Tween-20/PBS (dung dịch rửa) trong 3 giây, mẫu dịch não tủy và huyết tương được thêm vào các giếng đã pha loãng với dung dịch chặn (huyết tương 1:10.000, dịch não tủy 1:115). Sau đó, đĩa được ủ qua đêm ở 4°C với kháng thể phát hiện (1 μg/ml, kháng thể kháng streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Sau ba bước rửa, streptavidin được phát hiện bằng cách ủ trong dung dịch chất nền TMB (Roche) trong tối đa 20 phút. Sau khi dừng quá trình phát triển màu bằng H2SO4 1M, đo độ hấp thụ ở bước sóng 450 nm.
Chức năng của phức hợp streptavidin-peptide-chất ức chế BACE1 được đánh giá bằng ELISA Aβ(1-40) theo quy trình của nhà sản xuất (Wako, 294-64701). Tóm lại, các mẫu dịch não tủy được pha loãng trong dung dịch pha loãng tiêu chuẩn (1:23) và ủ qua đêm ở 4°C trong các đĩa 96 giếng được phủ kháng thể bắt giữ BNT77. Sau năm bước rửa, kháng thể BA27 liên hợp HRP được thêm vào và ủ trong 2 giờ ở 4°C, sau đó là năm bước rửa. Aβ(1–40) được phát hiện bằng cách ủ trong dung dịch TMB trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi quá trình phát triển màu dừng lại bằng dung dịch dừng, đo độ hấp thụ ở 450 nm. Các mẫu huyết tương được xử lý bằng phương pháp chiết pha rắn trước khi thực hiện ELISA Aβ(1–40). Huyết tương được thêm vào 0,2% DEA (Sigma) trong các đĩa 96 giếng và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Sau khi rửa liên tục các tấm SPE (Oasis, 186000679) bằng nước và methanol 100%, các mẫu huyết tương được thêm vào các tấm SPE và toàn bộ chất lỏng được loại bỏ. Các mẫu được rửa (đầu tiên bằng methanol 5% sau đó bằng methanol 30%) và được rửa giải bằng 2% NH4OH/90% methanol. Sau khi làm khô dịch rửa giải ở 55°C trong 99 phút với dòng khí N2 không đổi, các mẫu được khử trong dung dịch pha loãng tiêu chuẩn và Aβ(1–40) được đo như mô tả ở trên.
Cách trích dẫn bài báo này: Urich, E. et al. Vận chuyển hàng hóa đến não bằng cách sử dụng các peptide vận chuyển được xác định trong cơ thể sống. Khoa học. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB và Moos T. Vận chuyển thuốc phân tử lớn đến não bằng liệu pháp nhắm mục tiêu. Tạp chí Hóa học thần kinh 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., và Martinez-Martinez, P. Vận chuyển thuốc peptide và protein qua hàng rào máu não. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM. Hàng rào máu não: một nút thắt cổ chai trong phát triển thuốc điều trị não. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, và Byrd, A. Triển vọng cải thiện việc đưa thuốc và nhắm mục tiêu đến não thông qua con đường đám rối màng mạch-dịch não tủy. Nghiên cứu Dược phẩm 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Hiện đại hóa dược phẩm sinh học bằng những "ngựa Trojan" phân tử để vận chuyển đến não. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, Vận chuyển peptide qua hàng rào máu não thông qua thụ thể WM. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. và cộng sự. Tăng cường khả năng thâm nhập vào não và hiệu quả của kháng thể điều trị bằng cách sử dụng các chất vận chuyển phân tử đơn giá. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. và cộng sự. Vận chuyển thụ thể transferrin (TfR) quyết định sự hấp thu của các biến thể ái lực của kháng thể TfR vào não. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).