Nature.com தளத்திற்கு வருகை தந்ததற்கு நன்றி. நீங்கள் வரையறுக்கப்பட்ட CSS ஆதரவு கொண்ட உலாவிப் பதிப்பைப் பயன்படுத்துகிறீர்கள். சிறந்த அனுபவத்தைப் பெற, மேம்படுத்தப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு (அல்லது இன்டர்நெட் எக்ஸ்ப்ளோரரில் இணக்கப் பயன்முறையை முடக்குமாறு) பரிந்துரைக்கிறோம். மேலும், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதி செய்வதற்காக, நாங்கள் இந்தத் தளத்தை ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் காட்டுகிறோம்.
ஒரே நேரத்தில் மூன்று ஸ்லைடுகளைக் கொண்ட ஒரு சுழல் பட்டியலைக் காண்பிக்கும். ஒரே நேரத்தில் மூன்று ஸ்லைடுகள் வழியாகச் செல்ல, முந்தைய மற்றும் அடுத்த பொத்தான்களைப் பயன்படுத்தவும், அல்லது இறுதியில் உள்ள ஸ்லைடர் பொத்தான்களைப் பயன்படுத்தி ஒரே நேரத்தில் மூன்று ஸ்லைடுகள் வழியாகச் செல்லவும்.
இரத்த-மூளைத் தடுப்பு, உயிரியல் சிகிச்சை முகவர்கள் மத்திய நரம்பு மண்டலத்தில் உள்ள அவற்றின் இலக்குகளைச் சென்றடைவதைத் தடுக்கிறது, இதன் மூலம் நரம்பியல் நோய்களுக்கான பயனுள்ள சிகிச்சையைத் தடை செய்கிறது. உயிருள்ள உயிரினங்களில் புதிய மூளைக் கடத்திகளைக் கண்டறிய, நாங்கள் ஒரு T7 ஃபேஜ் பெப்டைட் நூலகத்தை அறிமுகப்படுத்தி, குழாய் பொருத்தப்பட்ட, உணர்வுள்ள பெரிய எலிக் குள மாதிரியைப் பயன்படுத்தி தொடர்ச்சியாக இரத்தம் மற்றும் மூளைத்தண்டு திரவத்தை (CSF) சேகரித்தோம். நான்கு சுற்றுத் தேர்வுகளுக்குப் பிறகு, குறிப்பிட்ட ஃபேஜ் குளோன்கள் மூளைத்தண்டு திரவத்தில் அதிக அளவில் செறிவூட்டப்பட்டன. தனிப்பட்ட வேட்பாளர் பெப்டைடுகளைச் சோதித்ததில், மூளைத்தண்டு திரவத்தில் 1000 மடங்குக்கும் அதிகமான செறிவூட்டல் இருப்பது தெரியவந்தது. அடையாளம் காணப்பட்ட புதிய கடத்தி பெப்டைடுடன் இணைக்கப்பட்ட BACE1 பெப்டைட் தடுப்பானைப் பயன்படுத்தி மூளைத்தண்டு திரவத்தில் உள்ள அமைலாய்டு-β அளவில் 40% குறைப்பு ஏற்பட்டதன் மூலம், மூளைக்கு பெப்டைட் மூலம் வழங்கப்படும் உயிரியல் செயல்பாடு உறுதி செய்யப்பட்டது. இந்த முடிவுகள், உயிருள்ள உயிரினங்களில் ஃபேஜ் தேர்வு முறைகளால் அடையாளம் காணப்பட்ட பெப்டைடுகள், சிகிச்சை விளைவுடன் கூடிய பெருமூலக்கூறுகளை மூளைக்கு உடலெங்கும் கொண்டு செல்ல பயனுள்ள வாகனங்களாக இருக்கலாம் என்று பரிந்துரைக்கின்றன.
மத்திய நரம்பு மண்டலத்தை (CNS) இலக்காகக் கொண்ட சிகிச்சை ஆராய்ச்சி, மூளைக்கு மருந்துகளைச் செயல்திறனுடன் கொண்டு சேர்க்கும் வழிமுறைகளைக் கண்டறிவதில் குறைந்த முயற்சியே எடுத்து, CNS-ஐ இலக்காகக் கொண்ட பண்புகளை வெளிப்படுத்தும் மேம்படுத்தப்பட்ட மருந்துகள் மற்றும் முகவர்களைக் கண்டறிவதில் பெருமளவில் கவனம் செலுத்தி வந்துள்ளது. நவீன நரம்பியல் மருந்து உருவாக்கத்தில், மருந்து விநியோகம், குறிப்பாகப் பெரிய மூலக்கூறுகள், ஒரு ஒருங்கிணைந்த பகுதியாக இருப்பதால், இந்த நிலை இப்போது மாறத் தொடங்கியுள்ளது. மத்திய நரம்பு மண்டலத்தின் சூழலானது, இரத்த-மூளைத் தடுப்பு (BBB) ​​மற்றும் இரத்த-மூளைத் தடுப்பு (BCBB)1 ஆகியவற்றைக் கொண்ட பெருமூளை-இரத்தக்குழாய் தடுப்பு அமைப்பால் நன்கு பாதுகாக்கப்படுகிறது, இது மூளைக்கு மருந்துகளைக் கொண்டு சேர்ப்பதைச் சவாலானதாக ஆக்குகிறது1,2. ஏறக்குறைய அனைத்துப் பெரிய மூலக்கூறு மருந்துகளும் மற்றும் 98%-க்கும் மேற்பட்ட சிறிய மூலக்கூறு மருந்துகளும் மூளையிலிருந்து வெளியேற்றப்படுகின்றன என்று மதிப்பிடப்பட்டுள்ளது3. அதனால்தான், சிகிச்சை மருந்துகளை CNS-க்குத் திறமையாகவும் குறிப்பாகவும் கொண்டு சேர்க்கும் புதிய மூளைப் போக்குவரத்து அமைப்புகளைக் கண்டறிவது மிகவும் முக்கியமானது4,5. இருப்பினும், BBB மற்றும் BCSFB ஆகியவை அதன் விரிவான இரத்தக்குழாய் அமைப்பு வழியாக மூளையின் அனைத்துக் கட்டமைப்புகளிலும் ஊடுருவி நுழைவதால், மருந்து விநியோகத்திற்கு ஒரு சிறந்த வாய்ப்பையும் வழங்குகின்றன. எனவே, மூளைக்கு ஊடுருவாத விநியோக முறைகளைப் பயன்படுத்துவதற்கான தற்போதைய முயற்சிகள், உள்ளார்ந்த BBB6 ஏற்பியைப் பயன்படுத்தி ஏற்பி-மத்தியஸ்த போக்குவரத்து (PMT) பொறிமுறையை பெருமளவில் அடிப்படையாகக் கொண்டுள்ளன. டிரான்ஸ்ஃபெரின் ஏற்பி வழித்தடத்தைப் பயன்படுத்தி சமீபத்திய முக்கிய முன்னேற்றங்கள் இருந்தபோதிலும்7,8, மேம்பட்ட பண்புகளுடன் கூடிய புதிய விநியோக அமைப்புகளின் மேலும் வளர்ச்சி தேவைப்படுகிறது. இந்த நோக்கத்திற்காக, பெருமூளைத் தண்டுவட திரவ (CSF) போக்குவரத்தை மத்தியஸ்தம் செய்யக்கூடிய பெப்டைடுகளை அடையாளம் காண்பதே எங்கள் இலக்காக இருந்தது, ஏனெனில் அவை கோட்பாட்டளவில் பெருமூலக்கூறுகளை மத்திய நரம்பு மண்டலத்திற்கு (CNS) கொண்டு செல்ல அல்லது புதிய ஏற்பி வழித்தடங்களைத் திறக்கப் பயன்படுத்தப்படலாம். குறிப்பாக, பெருமூளை இரத்த நாள அமைப்பின் (BBB மற்றும் BSCFB) குறிப்பிட்ட ஏற்பிகள் மற்றும் கடத்திகள், உயிரியல் சிகிச்சை மருந்துகளின் செயல்திறன் மிக்க மற்றும் குறிப்பிட்ட விநியோகத்திற்கான சாத்தியமான இலக்குகளாகச் செயல்பட முடியும். பெருமூளைத் தண்டுவட திரவம் (CSF) என்பது கோராய்டு பிளெக்ஸஸின் (CS) ஒரு சுரப்புப் பொருளாகும், மேலும் இது சப்அரக்னாய்டு இடைவெளி மற்றும் வென்ட்ரிகுலர் இடைவெளி வழியாக மூளையின் இடைத்திசு திரவத்துடன் நேரடித் தொடர்பில் உள்ளது4. சமீபத்தில், சப்அரக்னாய்டு பெருமூளைத் தண்டுவட திரவம் மூளையின் இடைத்திசுக்களுக்குள் அதிகப்படியாகப் பரவுகிறது என்று காட்டப்பட்டுள்ளது9. இந்த சப்அரக்னாய்டு உள்வழிப் பாதையைப் பயன்படுத்தியோ அல்லது நேரடியாக இரத்த-மூளைத் தடையின் (BBB) ​​வழியாகவோ பாரன்கைமல் இடைவெளியை அணுக நாங்கள் நம்புகிறோம். இதை அடைவதற்காக, இந்த இரண்டு தனித்துவமான பாதைகளில் ஏதேனும் ஒன்றின் மூலம் கொண்டு செல்லப்படும் பெப்டைடுகளைத் துல்லியமாக அடையாளம் காணும் ஒரு வலுவான இன் விவோ பாக்டீரியோஃபேஜ் தேர்வு உத்தியை நாங்கள் செயல்படுத்தினோம்.
மிக உயர்ந்த லைப்ரரி பன்முகத்தன்மையுடன் ஆரம்பத் தேர்வுச் சுற்றுகளைக் கண்காணிக்க, CSF மாதிரியுடன் இணைக்கப்பட்ட உயர் செயல்திறன் வரிசைப்படுத்தலுடன் (HTS) கூடிய ஒரு தொடர்ச்சியான இன் விவோ ஃபேஜ் டிஸ்ப்ளே ஸ்கிரீனிங் முறையை இப்போது விவரிக்கிறோம். இரத்தக் கலப்பைத் தவிர்ப்பதற்காக, நிரந்தரமாகப் பொருத்தப்பட்ட ஒரு பெரிய சிஸ்டெர்னா (CM) கேனுலாவைக் கொண்ட, உணர்வுள்ள எலிகளில் இந்த ஸ்கிரீனிங் செய்யப்பட்டது. முக்கியமாக, இந்த அணுகுமுறை மூளையை இலக்காகக் கொண்ட பெப்டைடுகள் மற்றும் பெருமூளை இரத்த நாளத் தடையைக் கடந்து செல்லும் போக்குவரத்துச் செயல்பாடு கொண்ட பெப்டைடுகள் ஆகிய இரண்டையும் தேர்ந்தெடுக்கிறது. அவற்றின் சிறிய அளவு (~60 nm)¹⁰ காரணமாக நாங்கள் T7 ஃபேஜ்களைப் பயன்படுத்தினோம், மேலும் அவை எண்டோதெலியல் மற்றும்/அல்லது எபிதீலியல்-மெடுல்லா தடையை செல்வழியாகக் கடக்க அனுமதிக்கும் வெசிகல்களைக் கொண்டு செல்வதற்கு ஏற்றவை என்று பரிந்துரைத்தோம். நான்கு சுற்று பேனிங்கிற்குப் பிறகு, வலுவான இன் விவோ CSF செறிவூட்டல் மற்றும் பெருமூளை நுண்குழாய் தொடர்பைக் காட்டும் ஃபேஜ் பாப்புலேஷன்கள் தனிமைப்படுத்தப்பட்டன. முக்கியமாக, விரும்பப்பட்ட மற்றும் வேதியியல் ரீதியாகத் தொகுக்கப்பட்ட சிறந்த வேட்பாளர் பெப்டைடுகள், புரதச் சரக்குகளை பெருமூளைத் தண்டுவட திரவத்திற்குள் கொண்டு செல்ல முடியும் என்பதை நிரூபிப்பதன் மூலம் எங்கள் கண்டுபிடிப்புகளை எங்களால் உறுதிப்படுத்த முடிந்தது. முதலில், ஒரு முன்னணி கடத்து பெப்டைடை BACE1 பெப்டைடின் ஒரு தடுப்பானுடன் இணைப்பதன் மூலம் மத்திய நரம்பு மண்டலத்தின் மருந்தியல் விளைவுகள் நிறுவப்பட்டன. உயிருள்ள உயிரினங்களில் செய்யப்படும் செயல்பாட்டுச் சோதனை உத்திகள், புதிய மூளைக் கடத்து பெப்டைடுகளைத் திறமையான புரதச் சுமை தாங்கிகளாக அடையாளம் காண முடியும் என்பதை நிரூபித்ததோடு மட்டுமல்லாமல், புதிய மூளைக் கடத்து பாதைகளை அடையாளம் காண்பதிலும் இதே போன்ற செயல்பாட்டுத் தேர்வு அணுகுமுறைகள் முக்கியத்துவம் பெறும் என்று நாங்கள் எதிர்பார்க்கிறோம்.
பிளேக் உருவாக்கும் அலகுகளின் (PFU) அடிப்படையில், ஃபேஜ் பேக்கேஜிங் படிக்குப் பிறகு, தோராயமாக 109 பன்முகத்தன்மை கொண்ட சீரற்ற 12-மெர் நேரியல் T7 ஃபேஜ் பெப்டைடுகளின் ஒரு நூலகம் வடிவமைக்கப்பட்டு உருவாக்கப்பட்டது (பொருட்கள் மற்றும் முறைகளைப் பார்க்கவும்). இன் விவோ பேனிங்கிற்கு முன்பு இந்த நூலகத்தை நாங்கள் கவனமாகப் பகுப்பாய்வு செய்தோம் என்பது குறிப்பிடத்தக்கது. மாற்றியமைக்கப்பட்ட பிரைமர்களைப் பயன்படுத்தி ஃபேஜ் நூலக மாதிரிகளின் PCR பெருக்கமானது, HTS-க்கு நேரடியாகப் பொருந்தக்கூடிய ஆம்ப்ளிகான்களை உருவாக்கியது (துணைப் படம் 1a). a) HTS11 வரிசைப்படுத்தல் பிழைகள், b) பிரைமர்கள் (NNK)1-12-இன் தரத்தில் ஏற்பட்ட தாக்கம், மற்றும் c) காத்திருப்பு நூலகத்தில் வைல்ட்-டைப் (wt) ஃபேஜ் (ஸ்கெலிட்டன் இன்செர்ட்ஸ்) இருப்பது ஆகிய காரணங்களால், சரிபார்க்கப்பட்ட வரிசைத் தகவலை மட்டும் பிரித்தெடுக்க ஒரு வரிசை வடிகட்டுதல் செயல்முறை செயல்படுத்தப்பட்டது (துணைப் படம் 1b). இந்த வடிகட்டுதல் படிகள் அனைத்து HTS வரிசைப்படுத்தல் நூலகங்களுக்கும் பொருந்தும். தரநிலை நூலகத்திற்காக, மொத்தம் 233,868 வாசிப்புகள் பெறப்பட்டன, அவற்றில் 39% வடிகட்டுதல் அளவுகோல்களைக் கடந்து, நூலகப் பகுப்பாய்வு மற்றும் அடுத்தடுத்த சுற்றுகளுக்கான தேர்வுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டன (துணைப் படம் 1c–e). இந்த வாசிப்புகள் பெரும்பாலும் 3 பேஸ் ஜோடிகளின் மடங்குகளில் நீளமுடையவையாக இருந்தன, மேலும் 36 நியூக்ளியோடைடுகளில் ஒரு உச்சத்தைக் கொண்டிருந்தன (துணைப் படம் 1c), இது நூலக வடிவமைப்பு (NNK) 1-12-ஐ உறுதிப்படுத்தியது. குறிப்பிடத்தக்க வகையில், நூலக உறுப்பினர்களில் சுமார் 11%, 12-பரிமாண இயல்புவகை (wt) முதுகெலும்பு PAGISRELVDKL செருகலைக் கொண்டிருந்தன, மேலும் கிட்டத்தட்ட பாதி வரிசைமுறைகள் (49%) செருகல்கள் அல்லது நீக்கங்களைக் கொண்டிருந்தன. நூலகத்தின் HTS, நூலகத்தில் உள்ள பெப்டைடுகளின் அதிக பன்முகத்தன்மையை உறுதிப்படுத்தியது: 81%-க்கும் மேற்பட்ட பெப்டைட் வரிசைமுறைகள் ஒருமுறை மட்டுமே காணப்பட்டன, மேலும் 1.5% மட்டுமே ≥4 பிரதிகளில் காணப்பட்டன (துணைப் படம் 2a). தொகுப்பில் உள்ள 12 நிலைகளிலும் உள்ள அமினோ அமிலங்களின் (aa) அதிர்வெண்கள், சிதைந்த NKK தொகுப்பால் உருவாக்கப்பட்ட கோடான்களின் எண்ணிக்கைக்கு எதிர்பார்க்கப்படும் அதிர்வெண்களுடன் நன்கு ஒத்திருந்தன (துணைப் படம் 2b). இந்தச் செருகல்களால் குறியிடப்பட்ட aa எச்சங்களின் காணப்பட்ட அதிர்வெண், கணக்கிடப்பட்ட அதிர்வெண்ணுடன் நன்கு ஒத்திருந்தது (r = 0.893) (துணைப் படம் 2c). ஊசி செலுத்துவதற்காக ஃபேஜ் நூலகங்களைத் தயாரிப்பதில், பெருக்கம் மற்றும் எண்டோடாக்சினை அகற்றுதல் ஆகிய படிகள் அடங்கும். இது ஃபேஜ் நூலகங்களின் பன்முகத்தன்மையைக் குறைக்கக்கூடும் என்று முன்னர் காட்டப்பட்டுள்ளது¹²,¹³. எனவே, எண்டோடாக்சின் அகற்றப்பட்ட ஒரு தட்டு-பெருக்கப்பட்ட ஃபேஜ் நூலகத்தை நாங்கள் வரிசைப்படுத்தி, அமினோ அமிலங்களின் அதிர்வெண்ணை மதிப்பிடுவதற்கு அதை அசல் நூலகத்துடன் ஒப்பிட்டோம். அசல் தொகுப்பிற்கும், பெருக்கப்பட்டு சுத்திகரிக்கப்பட்ட தொகுப்பிற்கும் இடையே ஒரு வலுவான தொடர்பு (r = 0.995) காணப்பட்டது (துணைப் படம் 2d), இது T7 ஃபேஜைப் பயன்படுத்தி தட்டுகளில் பெருக்கப்பட்ட குளோன்களுக்கு இடையேயான போட்டி பெரிய சார்புநிலையை ஏற்படுத்தவில்லை என்பதைக் குறிக்கிறது. இந்த ஒப்பீடு ஒவ்வொரு லைப்ரரியிலும் உள்ள டிரைபெப்டைட் மோட்டிஃப்களின் அதிர்வெண்ணை அடிப்படையாகக் கொண்டது, ஏனெனில் லைப்ரரிகளின் பன்முகத்தன்மையை (~109) HTS மூலம்கூட முழுமையாகப் படம்பிடிக்க முடியாது. ஒவ்வொரு நிலையிலும் உள்ள அமினோ அமிலங்களின் அதிர்வெண் பகுப்பாய்வு, உள்ளிடப்பட்ட தொகுப்பின் கடைசி மூன்று நிலைகளில் ஒரு சிறிய நிலை-சார்ந்த சார்புநிலையை வெளிப்படுத்தியது (துணைப் படம் 2e). முடிவாக, லைப்ரரியின் தரம் மற்றும் பன்முகத்தன்மை ஏற்றுக்கொள்ளத்தக்கவை என்றும், பல சுற்றுத் தேர்வுகளுக்கு இடையில் ஃபேஜ் லைப்ரரிகளைப் பெருக்குதல் மற்றும் தயாரித்தல் காரணமாக பன்முகத்தன்மையில் சிறிய மாற்றங்கள் மட்டுமே காணப்பட்டன என்றும் நாங்கள் முடிவு செய்தோம்.
விழிப்பு நிலையில் உள்ள எலிகளின் பெருமூளைத் தண்டுவட திரவத்தில் (CM) அறுவை சிகிச்சை மூலம் ஒரு குழாயைப் பொருத்தி, தொடர்ச்சியான பெருமூளைத் தண்டுவட திரவ மாதிரிகளைச் சேகரிக்கலாம். இது, இரத்த-மூளைத் தடை (BBB) ​​மற்றும்/அல்லது இரத்த-மூளைத் தண்டுவட திரவத் தடை (BCSFB) வழியாக நரம்பு வழி உட்செலுத்தப்பட்ட (iv) T7 ஃபேஜை அடையாளம் காண்பதை எளிதாக்குகிறது (படம் 1a-b). உயிருள்ள உயிரினத்தில் செய்யப்படும் தேர்வின் முதல் மூன்று சுற்றுகளில், நாங்கள் இரண்டு தனித்தனி தேர்வுப் பிரிவுகளை (பிரிவுகள் A மற்றும் B) பயன்படுத்தினோம் (படம் 1c). தேர்வின் முதல் மூன்று சுற்றுகளில் அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட ஃபேஜின் மொத்த அளவைக் குறைப்பதன் மூலம், தேர்வின் கடுமையை நாங்கள் படிப்படியாக அதிகரித்தோம். நான்காவது சுற்று வடிகட்டுதலுக்காக, நாங்கள் பிரிவுகள் A மற்றும் B-இலிருந்து மாதிரிகளை ஒன்றிணைத்து, மேலும் மூன்று தனித்தனி தேர்வுகளைச் செய்தோம். இந்த மாதிரியில் T7 ஃபேஜ் துகள்களின் உயிருள்ள உயிரினப் பண்புகளை ஆய்வு செய்ய, இயல்பு வகை ஃபேஜ் (PAGISRELVDKL முதன்மைச் செருகல்) எலிகளுக்கு வால் சிரை வழியாக உட்செலுத்தப்பட்டது. வெவ்வேறு நேரங்களில் பெருமூளைத் தண்டுவட திரவம் மற்றும் இரத்தத்திலிருந்து ஃபேஜ்களை மீட்டெடுத்ததில், ஒப்பீட்டளவில் சிறிய T7 ஐகோசஹெட்ரல் ஃபேஜ்கள் இரத்தப் பகுதியிலிருந்து ஒரு விரைவான ஆரம்ப வெளியேற்றக் கட்டத்தைக் கொண்டிருந்தன என்பது தெரியவந்தது (துணைப் படம் 3). செலுத்தப்பட்ட டைட்டர்கள் மற்றும் எலிகளின் இரத்த அளவின் அடிப்படையில், நரம்பு வழி ஊசி மூலம் செலுத்தப்பட்ட 10 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு, செலுத்தப்பட்ட மருந்தளவிலிருந்து தோராயமாக 1% எடை ஃபேஜ் மட்டுமே இரத்தத்தில் கண்டறியப்பட்டது என்று நாங்கள் கணக்கிட்டோம். இந்த ஆரம்ப விரைவான சரிவுக்குப் பிறகு, 27.7 நிமிட அரை ஆயுளுடன் ஒரு மெதுவான முதன்மை நீக்கம் அளவிடப்பட்டது. முக்கியமாக, மூளைத்தண்டு திரவப் பகுதியிலிருந்து மிகச் சில ஃபேஜ்கள் மட்டுமே மீட்கப்பட்டன, இது மூளைத்தண்டு திரவப் பகுதிக்குள் இயல்பு வகை ஃபேஜ் இடம்பெயர்வதற்கான குறைந்த பின்னணியைக் குறிக்கிறது (துணைப் படம் 3). சராசரியாக, முழு மாதிரி சேகரிப்புக் காலத்திலும் (0-250 நிமிடம்), இரத்தத்தில் உள்ள T7 ஃபேஜின் டைட்டர்கள் சுமார் 1 x 10-3% மற்றும் ஆரம்பத்தில் செலுத்தப்பட்ட ஃபேஜ்களில் 4 x 10-8% மட்டுமே மூளைத்தண்டு திரவத்தில் கண்டறியப்பட்டன. குறிப்பிடத்தக்க வகையில், மூளைத்தண்டு திரவத்தில் உள்ள இயல்பு வகை ஃபேஜின் அரை ஆயுள் (25.7 நிமிடம்), இரத்தத்தில் காணப்பட்டதைப் போலவே இருந்தது. CM குழாய் பொருத்தப்பட்ட எலிகளில், மூளைத்தண்டு திரவப் பகுதியை இரத்தத்திலிருந்து பிரிக்கும் தடுப்புச் சுவர் சிதைவின்றி உள்ளது என்பதை இந்தத் தரவுகள் நிரூபிக்கின்றன. இது, இரத்தத்திலிருந்து மூளைத்தண்டு திரவப் பகுதிக்கு எளிதில் கொண்டு செல்லப்படும் குளோன்களை அடையாளம் காண, பாக்டீரியோஃபேஜ் நூலகங்களை உயிருள்ள உடலிலேயே தேர்ந்தெடுக்க அனுமதிக்கிறது.
(அ) ​​ஒரு பெரிய தொகுப்பிலிருந்து மூளைத்தண்டுவட திரவத்தை (CSF) மீண்டும் மாதிரியாக எடுப்பதற்கான ஒரு முறையை அமைத்தல். (ஆ) மத்திய நரம்பு மண்டல (CNS) தடையின் செல்லுலார் இருப்பிடத்தையும், இரத்த-மூளைத் தடையை (BBB) ​​கடக்கும் பெப்டைடுகளை அடையாளம் காணப் பயன்படுத்தப்படும் தேர்வு உத்தியையும் காட்டும் வரைபடம். (இ) உயிருள்ள உயிரினத்தில் ஃபேஜ் டிஸ்ப்ளே ஸ்கிரீனிங் செயல்முறை விளக்கப்படம். தேர்வின் ஒவ்வொரு சுற்றிலும், ஃபேஜ்கள் (அம்புக்குறிகளுக்குள் விலங்கு அடையாளங்கள்) நரம்பு வழியாகச் செலுத்தப்பட்டன. தேர்வின் 4வது சுற்று வரை இரண்டு சுயாதீனமான மாற்று கிளைகள் (A, B) தனித்தனியாகப் பராமரிக்கப்படுகின்றன. தேர்வுச் சுற்றுகள் 3 மற்றும் 4-க்கு, மூளைத்தண்டுவட திரவத்திலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஒவ்வொரு ஃபேஜ் குளோனும் கைமுறையாக வரிசைப்படுத்தப்பட்டது. (ஈ) T7 பெப்டைட் லைப்ரரியை (2 x 10¹² ஃபேஜ்கள்/விலங்கு) நரம்பு வழியாகச் செலுத்திய பிறகு, குழாய் பொருத்தப்பட்ட இரண்டு எலிகளில் தேர்வின் முதல் சுற்றின் போது இரத்தத்திலிருந்து (சிவப்பு வட்டங்கள்) மற்றும் மூளைத்தண்டுவட திரவத்திலிருந்து (பச்சை முக்கோணங்கள்) பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஃபேஜின் இயக்கவியல். நீல சதுரங்கள், மொத்த இரத்த அளவைக் கணக்கில் கொண்டு, செலுத்தப்பட்ட ஃபேஜின் அளவிலிருந்து கணக்கிடப்பட்ட, இரத்தத்தில் உள்ள ஃபேஜின் சராசரி ஆரம்ப செறிவைக் குறிக்கின்றன. கருப்பு சதுரங்கள், இரத்த ஃபேஜ் செறிவுகளிலிருந்து நீட்டிக்கப்பட்ட y கோட்டின் வெட்டும் புள்ளியைக் குறிக்கின்றன. (e,f) பெப்டைடில் காணப்படும் சாத்தியமான அனைத்து ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் டிரைபெப்டைட் மோட்டிஃப்களின் சார்பு அதிர்வெண் மற்றும் பரவலைக் காட்டுகிறது. 1000 அளவீடுகளில் காணப்படும் மோட்டிஃப்களின் எண்ணிக்கை காட்டப்பட்டுள்ளது. குறிப்பிடத்தக்க அளவில் (p < 0.001) செறிவூட்டப்பட்ட மோட்டிஃப்கள் சிவப்பு புள்ளிகளால் குறிக்கப்பட்டுள்ளன. (e) செலுத்தப்பட்ட லைப்ரரியின் டிரைபெப்டைட் மோட்டிஃபின் சார்பு அதிர்வெண்ணை, விலங்குகள் #1.1 மற்றும் #1.2-இன் இரத்தத்திலிருந்து பெறப்பட்ட ஃபேஜுடன் ஒப்பிடும் தொடர்பு சிதறல் வரைபடம். (f) இரத்தம் மற்றும் மூளைத்தண்டுவட திரவத்தில் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட விலங்கு ஃபேஜ் டிரைபெப்டைட் மோட்டிஃப்கள் #1.1 மற்றும் #1.2-இன் சார்பு அதிர்வெண்களை ஒப்பிடும் தொடர்பு சிதறல் வரைபடம். (g, h) இரண்டு விலங்குகளிலும் ஒரு சுற்று இன் விவோ தேர்வுக்குப் பிறகு, இரத்தத்தில் செறிவூட்டப்பட்ட ஃபேஜ் (g) மற்றும் உட்செலுத்தப்பட்ட லைப்ரரிகள், மற்றும் CSF-ல் செறிவூட்டப்பட்ட ஃபேஜ் (h) மற்றும் இரத்தம் ஆகியவற்றின் வரிசை அடையாளக் குறியீடுகள். ஒற்றை-எழுத்துக் குறியீட்டின் அளவு, அந்த அமினோ அமிலம் அந்த இடத்தில் எவ்வளவு அடிக்கடி நிகழ்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. பச்சை = முனைவுள்ள, ஊதா = நடுநிலை, நீலம் = காரத்தன்மையுள்ள, சிவப்பு = அமிலத்தன்மையுள்ள மற்றும் கருப்பு = நீர் விலக்கும் அமினோ அமிலங்கள். படம் 1a, b எட்வர்ட் யூரிச் என்பவரால் வடிவமைக்கப்பட்டு உருவாக்கப்பட்டது.
நாங்கள் இரண்டு CM கருவி எலிகளில் (கிளேடுகள் A மற்றும் B) ஒரு ஃபேஜ் பெப்டைட் லைப்ரரியைச் செலுத்தி, மூளைத்தண்டுவடத் திரவம் மற்றும் இரத்தத்திலிருந்து ஃபேஜைப் பிரித்தெடுத்தோம் (படம் 1d). இயல்பு வகை ஃபேஜுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​லைப்ரரியின் ஆரம்பகால விரைவான நீக்கம் குறைவாகவே காணப்பட்டது. இரண்டு விலங்குகளிலும் செலுத்தப்பட்ட லைப்ரரியின் சராசரி அரை ஆயுட்காலம், இரத்தத்தில் இயல்பு வகை ஃபேஜைப் போலவே 24.8 நிமிடங்களாகவும், மூளைத்தண்டுவடத் திரவத்தில் 38.5 நிமிடங்களாகவும் இருந்தது. ஒவ்வொரு விலங்கின் இரத்தம் மற்றும் மூளைத்தண்டுவடத் திரவ ஃபேஜ் மாதிரிகளும் HTS-க்கு உட்படுத்தப்பட்டு, அடையாளம் காணப்பட்ட அனைத்து பெப்டைடுகளும் ஒரு குறுகிய டிரைபெப்டைட் மோட்டிஃப் உள்ளதா எனப் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. டிரைபெப்டைட் மோட்டிஃப்கள் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன, ஏனெனில் அவை கட்டமைப்பு உருவாக்கம் மற்றும் பெப்டைட்-புரத இடைவினைகளுக்கு ஒரு குறைந்தபட்ச அடிப்படையை வழங்குகின்றன¹⁴,¹⁵. செலுத்தப்பட்ட ஃபேஜ் லைப்ரரிக்கும் இரண்டு விலங்குகளின் இரத்தத்திலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட குளோன்களுக்கும் இடையே மோட்டிஃப்களின் பரவலில் ஒரு நல்ல தொடர்பைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 1e). இந்தத் தரவுகள், லைப்ரரியின் கலவை இரத்தப் பகுதியில் மிகக் குறைவாகவே செறிவூட்டப்பட்டுள்ளது என்பதைக் காட்டுகின்றன. வெப்லோகோ16 மென்பொருளின் ஒரு தழுவலைப் பயன்படுத்தி, ஒவ்வொரு நிலையிலும் அமினோ அமில அதிர்வெண்களும் ஒருமித்த வரிசைகளும் மேலும் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. சுவாரஸ்யமாக, இரத்த கிளைசின் எச்சங்களில் ஒரு வலுவான செறிவூட்டலைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 1g). இரத்தத்தை மூளைத்தண்டு திரவத்திலிருந்து தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட குளோன்களுடன் ஒப்பிட்டபோது, ​​மோட்டிஃப்களின் வலுவான தேர்வும் சில தேர்வுநீக்கமும் காணப்பட்டன (படம் 1f), மேலும் சில அமினோ அமிலங்கள் 12-மெர் வரிசையில் முன்னரே தீர்மானிக்கப்பட்ட நிலைகளில் முன்னுரிமையுடன் இருந்தன (படம் 1h). குறிப்பிடத்தக்க வகையில், தனிப்பட்ட விலங்குகள் மூளைத்தண்டு திரவத்தில் கணிசமாக வேறுபட்டன, அதேசமயம் இரண்டு விலங்குகளிலும் இரத்த கிளைசின் செறிவூட்டல் காணப்பட்டது (துணைப் படம் 4a–j). விலங்குகள் #1.1 மற்றும் #1.2 ஆகியவற்றின் மூளைத்தண்டு திரவத்தில் உள்ள வரிசைத் தரவுகளைக் கடுமையாக வடிகட்டிய பிறகு, மொத்தம் 964 மற்றும் 420 தனித்துவமான 12-மெர் பெப்டைடுகள் பெறப்பட்டன (துணைப் படம் 1d–e). தனிமைப்படுத்தப்பட்ட ஃபேஜ் குளோன்கள் பெருக்கப்பட்டு, இரண்டாவது சுற்று இன் விவோ தேர்வுக்கு உட்படுத்தப்பட்டன. இரண்டாவது சுற்றுத் தேர்வில் இருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஃபேஜ்கள் ஒவ்வொரு விலங்கிலும் HTS-க்கு உட்படுத்தப்பட்டன. மேலும், அடையாளம் காணப்பட்ட அனைத்து பெப்டைடுகளும், டிரைபெப்டைட் மோட்டிஃப்களின் நிகழ்வைப் பகுப்பாய்வு செய்வதற்காக, ஒரு மோட்டிஃப் அங்கீகார நிரலுக்கு உள்ளீடாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன (படம் 2a, b, ef). CSF-இலிருந்து மீட்கப்பட்ட ஃபேஜின் முதல் சுழற்சியுடன் ஒப்பிடுகையில், கிளைகள் A மற்றும் B-இல் உள்ள CSF-இல் பல மோட்டிஃப்களின் மேலும் தேர்வு மற்றும் தேர்வுநீக்கத்தை நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (படம் 2). அவை சீரான வரிசைமுறையின் வெவ்வேறு வடிவங்களைக் குறிக்கின்றனவா என்பதைத் தீர்மானிக்க ஒரு நெட்வொர்க் அடையாள அல்காரிதம் பயன்படுத்தப்பட்டது. மாற்று கிளேட் A (படம் 2c, d) மற்றும் கிளேட் B (படம் 2g, h) ஆகியவற்றில் CSF-ஆல் மீட்கப்பட்ட 12-பரிமாண வரிசைமுறைகளுக்கு இடையே ஒரு தெளிவான ஒற்றுமை காணப்பட்டது. ஒவ்வொரு கிளையிலும் செய்யப்பட்ட ஒருங்கிணைந்த பகுப்பாய்வு, 12-மெர் பெப்டைடுகளுக்கான வெவ்வேறு தேர்வு விவரங்களையும் (துணைப் படம் 5c,d), முதல் சுற்றுத் தேர்வுடன் ஒப்பிடும்போது இரண்டாவது சுற்றுத் தேர்வுக்குப் பிறகு ஒருங்கிணைந்த குளோன்களில் காலப்போக்கில் CSF/இரத்த டைட்டர் விகிதத்தில் அதிகரிப்பையும் வெளிப்படுத்தியது (துணைப் படம் 5e).
உயிருள்ள உயிரினங்களுக்குள் செய்யப்படும் செயல்பாட்டு ஃபேஜ் டிஸ்ப்ளே தேர்வின் இரண்டு தொடர்ச்சியான சுற்றுகள் மூலம் மூளைத்தண்டு திரவத்தில் உள்ள மோட்டிஃப்கள் மற்றும் பெப்டைடுகளின் செறிவூட்டல்.
ஒவ்வொரு விலங்கின் (விலங்குகள் #1.1 மற்றும் #1.2) முதல் சுற்றிலிருந்து மீட்கப்பட்ட அனைத்து மூளைத்தண்டுவட திரவ ஃபேஜ்களும் ஒன்றாகச் சேர்க்கப்பட்டு, பெருக்கப்பட்டு, HT-வரிசைப்படுத்தப்பட்டு, 2 SM குழாய் பொருத்தப்பட்ட எலிகளுக்கு (#1.1 → #1.1 மற்றும் 2.2, 1.2 → 2.3 மற்றும் 2.4) மீண்டும் ஒன்றாகச் செலுத்தப்பட்டன (2 x 10¹⁰ ஃபேஜ்கள்/விலங்கு). (a,b,e,f) முதல் மற்றும் இரண்டாவது தேர்வுச் சுற்றுகளில் உள்ள அனைத்து CSF-வழி ஃபேஜ்களின் டிரைபெப்டைட் மோட்டிஃப்களின் சார்பு அதிர்வெண்ணை ஒப்பிடும் தொடர்பு சிதறல் வரைபடங்கள். இரண்டு திசைகளிலும் உள்ள பெப்டைடுகளில் காணப்படும், சாத்தியமான அனைத்து ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் டிரைபெப்டைடுகளையும் குறிக்கும் மோட்டிஃப்களின் சார்பு அதிர்வெண் மற்றும் பரவல். 1000 அளவீடுகளில் காணப்படும் மோட்டிஃப்களின் எண்ணிக்கை காட்டப்பட்டுள்ளது. ஒப்பிடப்பட்ட லைப்ரரிகளில் ஒன்றில் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் (p < 0.001) தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட அல்லது விலக்கப்பட்ட மோட்டிஃப்கள் சிவப்புப் புள்ளிகளால் சிறப்பித்துக் காட்டப்பட்டுள்ளன. (c, d, g, h) உயிருள்ள விலங்குகளில் நடத்தப்பட்ட தேர்வுச் சுற்று 2 மற்றும் 1-ஐ அடிப்படையாகக் கொண்ட, மூளைத் தண்டுவட திரவத்தில் (CSF) செறிந்துள்ள 12 அமினோ அமிலங்கள் நீளமுள்ள அனைத்து வரிசைகளின் வரிசைச் சின்னப் பிரதிநிதித்துவம். ஒற்றை-எழுத்துக் குறியீட்டின் அளவு, அந்த அமினோ அமிலம் அந்த இடத்தில் எவ்வளவு அடிக்கடி நிகழ்கிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. இந்தச் சின்னத்தைப் பிரதிநிதித்துவப்படுத்த, இரண்டு தேர்வுச் சுற்றுகளுக்கு இடையில் தனிப்பட்ட விலங்குகளிடமிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட மூளைத் தண்டுவட திரவ வரிசைகளின் நிகழ்வெண் ஒப்பிடப்பட்டு, இரண்டாவது சுற்றில் செறிவூட்டப்பட்ட வரிசைகள் காட்டப்பட்டுள்ளன: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 மற்றும் (h) #1.2–#2.4. (c, d) விலங்குகள் எண் 2.1 மற்றும் 2.2 அல்லது (g, h) விலங்குகள் எண் 2.3 மற்றும் 2.4 ஆகியவற்றில் ஒரு குறிப்பிட்ட இடத்தில் மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட அமினோ அமிலங்கள் வண்ணத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளன. பச்சை = முனைவுள்ள, ஊதா = நடுநிலையான, நீலம் = காரத்தன்மையுள்ள, சிவப்பு = அமிலத்தன்மையுள்ள மற்றும் கருப்பு = நீர்வெறுப்பு அமினோ அமிலங்கள்.
மூன்றாவது சுற்றுத் தேர்வுக்குப் பிறகு, இரண்டு விலங்குகளிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட 332 மூளைத்தண்டு திரவத்தில் மறுசீரமைக்கப்பட்ட ஃபேஜ் குளோன்களிலிருந்து 124 தனித்துவமான பெப்டைட் வரிசைகளை (#3.1 மற்றும் #3.2) நாங்கள் அடையாளம் கண்டோம் (துணைப் படம் 6a). LGSVS (18.7%) வரிசையானது மிக உயர்ந்த சார்பு விகிதத்தைக் கொண்டிருந்தது, அதைத் தொடர்ந்து இயல்புவகைச் செருகல்களான PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), மற்றும் SARGSWREIVSLS (2.2%) ஆகியவை இருந்தன. இறுதியான நான்காவது சுற்றில், மூன்று தனித்தனி விலங்குகளிலிருந்து சுயாதீனமாகத் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட இரண்டு கிளைகளை நாங்கள் ஒன்றிணைத்தோம் (படம் 1c). மூளைத்தண்டு திரவத்திலிருந்து மீட்கப்பட்ட 925 வரிசைப்படுத்தப்பட்ட ஃபேஜ் குளோன்களில், நான்காவது சுற்றில் நாங்கள் 64 தனித்துவமான பெப்டைட் வரிசைகளைக் கண்டறிந்தோம் (துணைப் படம் 6b), அவற்றுள் இயல்புவகை ஃபேஜின் சார்பு விகிதம் 0.8% ஆகக் குறைந்தது. நான்காவது சுற்றில் மிகவும் பொதுவான CSF குளோன்கள் LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) மற்றும் RLSSVDSDLSGC (3.2%) ஆகும். NNK லைப்ரரி வடிவமைப்பிற்காக டீஜெனரேட் கோடான்களைப் பயன்படுத்தும்போது, ​​லைப்ரரி பிரைமர்களில் ஏற்படும் நியூக்ளியோடைடு செருகல்கள்/நீக்கங்கள் அல்லது முன்கூட்டிய நிறுத்தக் கோடான்களால் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பெப்டைடுகளின் நீள வரம்பு ஏற்படுகிறது. முன்கூட்டிய நிறுத்தக் கோடான்கள் குறுகிய பெப்டைடுகளை உருவாக்குகின்றன, மேலும் அவை சாதகமான aa மோட்டிஃபைக் கொண்டிருப்பதால் தேர்ந்தெடுக்கப்படுகின்றன. செயற்கை லைப்ரரிகளின் பிரைமர்களில் ஏற்படும் செருகல்கள்/நீக்கங்களால் நீண்ட பெப்டைடுகள் உருவாகலாம். இது வடிவமைக்கப்பட்ட நிறுத்தக் கோடானை ஃபிரேமிற்கு வெளியே நிலைநிறுத்தி, அதன் கீழ் ஒரு புதிய நிறுத்தக் கோடான் தோன்றும் வரை அதைப் படிக்கிறது. பொதுவாக, உள்ளீட்டுத் தரவை மாதிரி வெளியீட்டுத் தரவுடன் ஒப்பிடுவதன் மூலம், நான்கு தேர்வுச் சுற்றுகளுக்குமான செறிவூட்டல் காரணிகளை நாங்கள் கணக்கிட்டோம். முதல் சுற்று ஆய்வுக்கு, நாங்கள் இயல்புவகை ஃபேஜ் செறிவுகளை ஒரு குறிப்பிட்ட தன்மையற்ற பின்னணிக் குறிப்பாகப் பயன்படுத்தினோம். சுவாரஸ்யமாக, முதல் மூளைத்தண்டுவட திரவ (CSF) சுழற்சியில் எதிர்மறை ஃபேஜ் தேர்வு மிகவும் வலுவாக இருந்தது, ஆனால் இரத்தத்தில் அவ்வாறு இல்லை (படம் 3a). இதற்கு, பெப்டைட் தொகுப்பின் பெரும்பாலான உறுப்பினர்கள் மூளைத்தண்டுவட திரவப் பகுதிக்குள் செயலற்ற முறையில் பரவுவதற்கான குறைந்த நிகழ்தகவு காரணமாக இருக்கலாம் அல்லது பாக்டீரியோஃபேஜ்களை விட தொடர்புடைய ஃபேஜ்கள் இரத்த ஓட்டத்தில் இருந்து மிகவும் திறமையாகத் தக்கவைக்கப்படுகின்றன அல்லது அகற்றப்படுகின்றன. இருப்பினும், இரண்டாவது சுற்று ஆய்வில், இரண்டு கிளைகளிலும் மூளைத்தண்டுவட திரவத்தில் ஃபேஜ்களின் வலுவான தேர்வு காணப்பட்டது. இது, முந்தைய சுற்றில் மூளைத்தண்டுவட திரவ உட்கொள்ளலை ஊக்குவிக்கும் பெப்டைடுகளைக் காட்டும் ஃபேஜ்கள் செறிவூட்டப்பட்டிருந்தன என்பதைக் காட்டுகிறது (படம் 3a). மீண்டும், குறிப்பிடத்தக்க இரத்தச் செறிவூட்டல் இல்லாமல். மூன்றாவது மற்றும் நான்காவது சுற்றுகளிலும், ஃபேஜ் குளோன்கள் மூளைத்தண்டுவட திரவத்தில் கணிசமாகச் செறிவூட்டப்பட்டிருந்தன. கடைசி இரண்டு சுற்றுத் தேர்வுகளுக்கு இடையில் ஒவ்வொரு தனித்துவமான பெப்டைட் வரிசையின் சார்பு அதிர்வெண்ணை ஒப்பிட்டுப் பார்த்ததில், நான்காவது சுற்றுத் தேர்வில் அந்த வரிசைகள் இன்னும் அதிகமாகச் செறிவூட்டப்பட்டிருப்பதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 3b). இரு பெப்டைட் நோக்குநிலைகளையும் பயன்படுத்தி, அனைத்து 64 தனித்துவமான பெப்டைட் வரிசைகளிலிருந்தும் மொத்தம் 931 டிரைபெப்டைட் மோட்டிஃப்கள் பிரித்தெடுக்கப்பட்டன. நான்காவது சுற்றில் மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட மோட்டிஃப்கள், உட்செலுத்தப்பட்ட லைப்ரரியுடன் (கட்-ஆஃப்: 10% செறிவூட்டல்) ஒப்பிடும்போது, ​​அனைத்து சுற்றுகளிலும் அவற்றின் செறிவூட்டல் விவரங்களுக்காக மிகவும் உன்னிப்பாக ஆராயப்பட்டன (துணைப் படம் 6c). தேர்வின் பொதுவான வடிவங்கள், ஆய்வு செய்யப்பட்ட பெரும்பாலான மோட்டிஃப்கள் இரு தேர்வு கிளைகளின் முந்தைய அனைத்து சுற்றுகளிலும் செறிவூட்டப்பட்டிருந்தன என்பதைக் காட்டின. இருப்பினும், சில மோட்டிஃப்கள் (எ.கா. SGL, VSG, LGS GSV) பெரும்பாலும் மாற்று கிளேட் A-வைச் சேர்ந்தவையாக இருந்தன, மற்றவை (எ.கா. FGW, RTN, WGF, NTR) மாற்று கிளேட் B-யில் செறிவூட்டப்பட்டிருந்தன.
ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் சுமைகளுடன் இணைக்கப்பட்ட, மூளைத்தண்டு திரவத்தில் செறிவூட்டப்பட்ட ஃபேஜ்-காட்சிப்படுத்தப்பட்ட பெப்டைடுகள் மற்றும் பயோட்டினிலேட்டட் லீடர் பெப்டைடுகளின் மூளைத்தண்டு திரவப் போக்குவரத்தைச் சரிபார்த்தல்.
(அ) ​​உட்செலுத்தப்பட்ட (உள்ளீடு = I) ஃபேஜ் (PFU) டைட்டர்கள் மற்றும் தீர்மானிக்கப்பட்ட CSF ஃபேஜ் டைட்டர்கள் (வெளியீடு = O) ஆகியவற்றின் அடிப்படையில் நான்கு சுற்றுகளிலும் (R1-R4) கணக்கிடப்பட்ட செறிவூட்டல் விகிதங்கள். கடைசி மூன்று சுற்றுகளுக்கான (R2-R4) செறிவூட்டல் காரணிகள், முந்தைய சுற்று மற்றும் முதல் சுற்று (R1) ஆகியவற்றுடன் எடைத் தரவுகளைக் கொண்டு ஒப்பிட்டு கணக்கிடப்பட்டன. திறந்த பட்டைகள் பெருமூளைத் தண்டுவட திரவத்தையும், நிழலிடப்பட்ட பட்டைகள் பிளாஸ்மாவையும் குறிக்கின்றன. (***p<0.001, ஸ்டூடண்ட்ஸ் t-சோதனையின் அடிப்படையில்). (ஆ) தேர்வுச் சுற்று 4-க்குப் பிறகு CSF-இல் சேகரிக்கப்பட்ட அனைத்து ஃபேஜ்களுக்கும் அவற்றின் சார்பு விகிதத்தின்படி தரவரிசைப்படுத்தப்பட்ட, மிகவும் அதிகமாகக் காணப்படும் ஃபேஜ் பெப்டைடுகளின் பட்டியல். மிகவும் பொதுவான ஆறு ஃபேஜ் குளோன்கள் வண்ணத்தில் சிறப்பித்துக் காட்டப்பட்டு, எண்ணிடப்பட்டு, தேர்வுச் சுற்று 3 மற்றும் 4-க்கு இடையில் அவற்றின் செறிவூட்டல் காரணிகள் (உட்படங்கள்) கொடுக்கப்பட்டுள்ளன. (இ, ஈ) சுற்று 4-இலிருந்து மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட ஆறு ஃபேஜ் குளோன்கள், வெற்று ஃபேஜ் மற்றும் மூல ஃபேஜ் பெப்டைட் நூலகங்கள் ஆகியவை ஒரு CSF மாதிரி மாதிரியில் தனித்தனியாகப் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. குறிப்பிட்ட நேரங்களில் CSF மற்றும் இரத்த மாதிரிகள் சேகரிக்கப்பட்டன. (c) சம அளவிலான 6 சாத்தியமான ஃபேஜ் குளோன்கள் (2 x 10¹⁰ ஃபேஜ்கள்/விலங்குகள்), வெற்று ஃபேஜ்கள் (#1779) (2 x 10¹⁰ ஃபேஜ்கள்/விலங்குகள்) மற்றும் இருப்பு ஃபேஜ் பெப்டைட் நூலகங்கள் (2 x 10¹² ஃபேஜ்கள்/விலங்குகள்) குழாய் பொருத்தப்பட்ட விலங்கிற்கு வால் சிரை வழியாகத் தனியாகச் செலுத்தப்பட்டன. செலுத்தப்பட்ட ஒவ்வொரு ஃபேஜ் குளோன் மற்றும் ஃபேஜ் பெப்டைட் நூலகத்தின் CSF மருந்தியல் இயக்கவியல் காலப்போக்கில் காட்டப்பட்டுள்ளது. (d) மாதிரி எடுக்கும் நேரத்தில் மீட்கப்பட்ட அனைத்து ஃபேஜ்கள்/mL-க்கான சராசரி CSF/இரத்த விகிதத்தைக் காட்டுகிறது. (e) நான்கு செயற்கை லீடர் பெப்டைடுகள் மற்றும் ஒரு ஸ்க்ராம்பிள்ட் கட்டுப்பாடு ஆகியவை அவற்றின் N-முனை வழியாக பயோட்டின் மூலம் ஸ்ட்ரெப்டாவிடினுடன் இணைக்கப்பட்டு (டெட்ராமர் டிஸ்ப்ளே), அதைத் தொடர்ந்து ஊசி மூலம் செலுத்தப்பட்டது (வால் சிரை iv, 10 mg ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்/கிலோ). குறைந்தது மூன்று குழாய் பொருத்தப்பட்ட எலிகள் (N = 3). குறிப்பிட்ட நேரங்களில் CSF மாதிரிகள் சேகரிக்கப்பட்டு, CSF ஆன்டி-ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் ELISA மூலம் ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் செறிவுகள் அளவிடப்பட்டன (nd = கண்டறியப்படவில்லை). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA சோதனையின் அடிப்படையில்). (f) மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட ஃபேஜ் பெப்டைட் குளோன் #2002 (ஊதா) இன் அமினோ அமில வரிசையை, 4வது சுற்றுத் தேர்வில் இருந்து தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட மற்ற ஃபேஜ் பெப்டைட் குளோன்களுடன் ஒப்பிடுதல். ஒரே மாதிரியான மற்றும் ஒத்த அமினோ அமிலத் துண்டுகள் வண்ணக் குறியிடப்பட்டுள்ளன.
நான்காவது சுற்றில் (படம் 3b) செறிவூட்டப்பட்ட அனைத்து ஃபேஜ்களிலிருந்தும், CSF மாதிரி மாதிரியில் மேலும் தனிப்பட்ட பகுப்பாய்விற்காக ஆறு சாத்தியமான குளோன்கள் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன. ஆறு சாத்தியமான ஃபேஜ்கள், வெற்று ஃபேஜ் (செருகல் இல்லாதது) மற்றும் புரோஃபேஜ் பெப்டைட் நூலகங்கள் சம அளவில் குழாய் பொருத்தப்பட்ட மூன்று CM விலங்குகளுக்குள் செலுத்தப்பட்டன, மேலும் மருந்தியல் இயக்கவியல் CSF (படம் 3c) மற்றும் இரத்த (துணைப் படம் 7) சோதனைகளில் தீர்மானிக்கப்பட்டது. சோதிக்கப்பட்ட அனைத்து ஃபேஜ் குளோன்களும் வெற்று கட்டுப்பாட்டு ஃபேஜை (#1779) விட 10-1000 மடங்கு அதிக அளவில் CSF பகுதியை இலக்காகக் கொண்டிருந்தன. உதாரணமாக, குளோன்கள் #2020 மற்றும் #2077 ஆகியவை கட்டுப்பாட்டு ஃபேஜை விட சுமார் 1000 மடங்கு அதிக CSF டைட்டர்களைக் கொண்டிருந்தன. தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ஒவ்வொரு பெப்டைடின் மருந்தியல் இயக்கவியல் விவரம் வேறுபட்டது, ஆனால் அவை அனைத்தும் அதிக CSF இலக்குத் திறனைக் கொண்டுள்ளன. குளோன்கள் #1903 மற்றும் #2011-க்கு காலப்போக்கில் ஒரு நிலையான குறைவை நாங்கள் கவனித்தோம், அதேசமயம் குளோன்கள் #2077, #2002 மற்றும் #2009-க்கு முதல் 10 நிமிடங்களில் ஏற்பட்ட அதிகரிப்பு, செயல்திறன் மிக்க கடத்தலைக் குறிக்கக்கூடும், ஆனால் அது சரிபார்க்கப்பட வேண்டும். குளோன்கள் #2020, #2002 மற்றும் #2077 உயர் மட்டங்களில் நிலைபெற்றன, அதேசமயம் குளோன் #2009-இன் CSF செறிவு ஆரம்ப அதிகரிப்புக்குப் பிறகு மெதுவாகக் குறைந்தது. பின்னர், ஒவ்வொரு CSF வேட்பாளரின் சார்பு அதிர்வெண்ணை அதன் இரத்தச் செறிவுடன் ஒப்பிட்டோம் (படம் 3d). அனைத்து மாதிரி எடுக்கும் நேரங்களிலும் ஒவ்வொரு CSF வேட்பாளரின் சராசரி டைட்டருக்கும் அதன் இரத்த டைட்டருக்கும் இடையிலான தொடர்பு, ஆறு வேட்பாளர்களில் மூன்று இரத்த CSF-இல் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் செறிவூட்டப்பட்டிருப்பதைக் காட்டியது. சுவாரஸ்யமாக, குளோன் #2077 அதிக இரத்த நிலைத்தன்மையைக் காட்டியது (துணைப் படம் 7). பெப்டைடுகள் தாங்களாகவே ஃபேஜ் துகள்களைத் தவிர மற்ற சரக்குகளை CSF பகுதிக்குள் செயல்திறன் மிக்க முறையில் கடத்தும் திறன் கொண்டவை என்பதை உறுதிப்படுத்த, பெப்டைடுகள் ஃபேஜ் துகளுடன் இணையும் N-முனையில் பயோட்டின் சேர்க்கப்பட்ட நான்கு லீடர் பெப்டைடுகளை நாங்கள் தொகுத்தோம். பயோட்டினிலேட்டட் பெப்டைடுகள் (எண்கள். 2002, 2009, 2020 மற்றும் 2077) ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் (SA) உடன் இணைக்கப்பட்டு, ஃபேஜ் வடிவவியலை ஓரளவு ஒத்த பலபகுதி வடிவங்கள் பெறப்பட்டன. இந்த வடிவம், சரக்குகளைக் கடத்தும் புரத பெப்டைடுகளாக, இரத்தம் மற்றும் மூளைத்தண்டுவட திரவத்தில் SA வெளிப்பாட்டை அளவிடவும் எங்களுக்கு உதவியது. முக்கியமாக, செயற்கை பெப்டைடுகள் இந்த SA-இணைக்கப்பட்ட வடிவத்தில் செலுத்தப்பட்டபோது, ​​ஃபேஜ் தரவுகளைப் பெரும்பாலும் மீண்டும் உருவாக்க முடிந்தது (படம் 3e). கலக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் குறைந்த ஆரம்ப வெளிப்பாட்டையும், மூளைத்தண்டுவட திரவத்திலிருந்து (CSF) விரைவான வெளியேற்றத்தையும் கொண்டிருந்தன, மேலும் 48 மணி நேரத்திற்குள் அவற்றின் அளவுகள் கண்டறிய முடியாத நிலையை அடைந்தன. இந்த பெப்டைட் ஃபேஜ் குளோன்கள் மூளைத்தண்டுவட திரவப் பகுதிக்குள் செல்லும் பாதைகள் குறித்த புரிதலைப் பெறுவதற்காக, நரம்பு வழியாக ஊசி மூலம் செலுத்திய 1 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு ஃபேஜ் துகள்களை நேரடியாகக் கண்டறிய, இம்யூனோஹிஸ்டோகெமிஸ்ட்ரி (IHC) முறையைப் பயன்படுத்தி தனிப்பட்ட ஃபேஜ் பெப்டைட் தாக்கங்களின் இருப்பிடத்தை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம். குறிப்பாக, குளோன்கள் #2002, #2077 மற்றும் #2009 ஆகியவை மூளை நுண்குழாய்களில் வலுவான சாயமேற்றல் மூலம் கண்டறியப்பட்டன, அதேசமயம் கட்டுப்பாட்டு ஃபேஜ் (#1779) மற்றும் குளோன் #2020 ஆகியவை கண்டறியப்படவில்லை (துணைப் படம் 8). இந்த பெப்டைடுகள் இரத்த-மூளைத் தடையைக் (BBB) ​​கடப்பதன் மூலமே மூளையின் மீதான விளைவுக்குப் பங்களிக்கின்றன என்பதை இது உணர்த்துகிறது. BSCFB வழித்தடமும் இதில் சம்பந்தப்பட்டிருக்கக்கூடும் என்பதால், இந்தக் கருதுகோளைச் சோதிக்க மேலும் விரிவான பகுப்பாய்வு தேவைப்படுகிறது. மிகவும் செறிவூட்டப்பட்ட குளோனின் (#2002) அமினோ அமில வரிசையை மற்ற தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பெப்டைடுகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​அவற்றில் சில ஒத்த அமினோ அமில நீட்சிகளைக் கொண்டிருப்பது கவனிக்கப்பட்டது, இது ஒரு ஒத்த கடத்தல் வழிமுறையைக் குறிக்கக்கூடும் (படம் 3f).
அதன் தனித்துவமான பிளாஸ்மா தன்மை மற்றும் காலப்போக்கில் மூளைத் தண்டு திரவத்தில் (CSF) ஏற்படும் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்பு காரணமாக, ஃபேஜ் டிஸ்ப்ளே குளோன் #2077 ஒரு நீண்ட 48 மணி நேர காலத்திற்கு மேலும் ஆராயப்பட்டது. மேலும், நீடித்த SA அளவுகளுடன் தொடர்புடையதாகக் காணப்பட்ட மூளைத் தண்டு திரவத்தின் விரைவான அதிகரிப்பை அதனால் மீண்டும் உருவாக்க முடிந்தது (படம் 4a). அடையாளம் காணப்பட்ட மற்ற ஃபேஜ் குளோன்களைப் பொறுத்தவரை, #2077 மூளைத் தந்துகிகளுக்கு வலுவாக நிறமேற்றப்பட்டது. மேலும், உயர் தெளிவுத்திறனில் பார்க்கும்போது, ​​தந்துகி குறிப்பானான லெக்டினுடன் குறிப்பிடத்தக்க இணை இருப்பிடத்தையும், பாரன்கைமல் இடைவெளியில் சிறிதளவு நிறமேற்றத்தையும் காட்டியது (படம் 4b). மத்திய நரம்பு மண்டலத்தில் (CNS) பெப்டைடு-மத்தியஸ்த மருந்தியல் விளைவுகளைப் பெற முடியுமா என்பதை ஆராய, நாங்கள் ஒரு சோதனையை மேற்கொண்டோம். அதில், i) #2077 டிரான்சிட் பெப்டைடு மற்றும் ii) BACE1 தடுப்பான் பெப்டைடு ஆகியவற்றின் பயோட்டினிலேட்டட் வடிவங்கள், இரண்டு வெவ்வேறு விகிதங்களில் SA உடன் கலக்கப்பட்டன. ஒரு கலவைக்கு, நாங்கள் BACE1 பெப்டைடு தடுப்பானை மட்டுமே பயன்படுத்தினோம். மற்றொன்றுக்கு, BACE1 பெப்டைடு தடுப்பானுக்கும் #2077 பெப்டைடுக்கும் 1:3 என்ற விகிதத்தைப் பயன்படுத்தினோம். இரண்டு மாதிரிகளும் நரம்பு வழியாகச் செலுத்தப்பட்டு, இரத்தம் மற்றும் மூளைத்தண்டுவட திரவத்தில் உள்ள பீட்டா-அமைலாய்டு பெப்டைட் 40 (Abeta40) அளவுகள் காலப்போக்கில் அளவிடப்பட்டன. மூளைப் பாரன்கைமாவில் BACE1 தடுப்பை Abeta40 பிரதிபலிப்பதால், அது மூளைத்தண்டுவட திரவத்தில் அளவிடப்பட்டது. எதிர்பார்த்தபடியே, இரண்டு கலவைகளும் Abeta40-இன் இரத்த அளவுகளைக் கணிசமாகக் குறைத்தன (படம் 4c, d). இருப்பினும், பெப்டைட் எண் 2077 மற்றும் SA உடன் இணைக்கப்பட்ட BACE1 பெப்டைடின் தடுப்பான் ஆகியவற்றின் கலவையைக் கொண்ட மாதிரிகள் மட்டுமே மூளைத்தண்டுவட திரவத்தில் Abeta40-இல் குறிப்பிடத்தக்க குறைவை ஏற்படுத்தின (படம் 4c). பெப்டைட் எண் 2077, 60 kDa SA புரதத்தை மத்திய நரம்பு மண்டலத்திற்குள் கொண்டு செல்ல வல்லது என்பதையும், மேலும் BACE1 பெப்டைடின் SA-உடன் இணைக்கப்பட்ட தடுப்பான்களுடன் மருந்தியல் விளைவுகளைத் தூண்டுகிறது என்பதையும் இந்தத் தரவுகள் காட்டுகின்றன.
(அ) ​​குறைந்தது மூன்று CM-குழாய் பொருத்தப்பட்ட எலிகளில், T7 ஃபேஜின் குளோனல் ஊசி (ஒரு விலங்கிற்கு 2 × 10 ஃபேஜ்கள்) செலுத்தப்பட்டு, CSF பெப்டைட் #2077 (RLSSVDSDLSGC) மற்றும் செலுத்தப்படாத கட்டுப்பாட்டு ஃபேஜ் (#1779) ஆகியவற்றின் நீண்ட கால மருந்தியல் இயக்க சுயவிவரங்கள் காட்டப்பட்டுள்ளன. (ஆ) ஃபேஜ் செலுத்தப்பட்ட எலிகளில் (ஒரு விலங்கிற்கு 2 × 10 ஃபேஜ்கள்) உள்ள பிரதிநிதித்துவ புறணி நுண்குழாய்களின் கான்ஃபோகல் நுண்ணோக்கிப் படம், பெப்டைட் #2077 மற்றும் குழாய்களின் (லெக்டின்) எதிர்நிறமூட்டலைக் காட்டுகிறது. இந்த ஃபேஜ் குளோன்கள் 3 எலிகளுக்குச் செலுத்தப்பட்டு, பெர்ஃப்யூஷனுக்கு முன் 1 மணி நேரம் சுழற்சிக்கு அனுமதிக்கப்பட்டன. மூளைகள் துண்டுகளாக்கப்பட்டு, T7 ஃபேஜ் கேப்சிடுக்கு எதிரான பாலிகுளோனல் FITC-குறியிடப்பட்ட ஆன்டிபாடிகளைக் கொண்டு நிறமூட்டப்பட்டன. பெர்ஃப்யூஷன் மற்றும் அதைத் தொடர்ந்த நிலைநிறுத்தலுக்குப் பத்து நிமிடங்களுக்கு முன்பு, DyLight594-குறியிடப்பட்ட லெக்டின் நரம்பு வழியாகச் செலுத்தப்பட்டது. நுண்குழாய்களின் உள்ளகப் பக்கத்தில் லெக்டின் கறை படிதலையும் (சிவப்பு), தந்துகிகள் மற்றும் இரத்தக்குழாயைச் சுற்றியுள்ள மூளைத் திசுக்களின் உள்ளகத்தில் ஃபேஜ்களையும் (பச்சை) காட்டும் ஒளிரும் படங்கள். அளவுகோல் பட்டை 10 µm-க்குச் சமமானது. (c, d) பயோட்டினிலேட்டட் BACE1 தடுப்பு பெப்டைடு தனியாகவோ அல்லது பயோட்டினிலேட்டட் டிரான்சிட் பெப்டைடு #2077 உடன் இணைந்தோ ஸ்ட்ரெப்டாவிடினுடன் பிணைக்கப்பட்டு, அதனைத் தொடர்ந்து குழாய் பொருத்தப்பட்ட குறைந்தது மூன்று CM எலிகளுக்கு (10 மி.கி ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்/கிலோ) நரம்பு வழி ஊசி மூலம் செலுத்தப்பட்டது. BACE1 பெப்டைடு தடுப்பானால் Aβ40-இல் ஏற்பட்ட குறைப்பு, குறிப்பிட்ட நேரங்களில் இரத்தத்திலும் (சிவப்பு) மற்றும் மூளைத்தண்டு திரவத்திலும் (ஆரஞ்சு) Aβ1-40 ELISA மூலம் அளவிடப்பட்டது. மேலும் தெளிவுக்காக, வரைபடத்தில் 100% அளவில் ஒரு புள்ளிக் கோடு வரையப்பட்டுள்ளது. (c) டிரான்சிட் பெப்டைட் #2077 மற்றும் BACE1 தடுப்பு பெப்டைடுடன் 3:1 விகிதத்தில் இணைக்கப்பட்ட ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் மூலம் சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட எலிகளின் இரத்தம் (சிவப்பு முக்கோணங்கள்) மற்றும் மூளைத்தண்டுவட திரவத்தில் (ஆரஞ்சு முக்கோணங்கள்) Aβ40-இன் சதவீதக் குறைப்பு. (d) BACE1 தடுப்பு பெப்டைடுடன் மட்டும் இணைக்கப்பட்ட ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் மூலம் சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட எலிகளின் இரத்தம் Aβ40 (சிவப்பு வட்டங்கள்) மற்றும் மூளைத்தண்டுவட திரவத்தில் (ஆரஞ்சு வட்டங்கள்) ஏற்பட்ட சதவீதக் குறைப்பு. கட்டுப்பாட்டுக் குழுவில் Aβ செறிவு 420 pg/ml ஆக இருந்தது (திட்ட விலகல் = 101 pg/ml).
ஃபேஜ் டிஸ்ப்ளே உயிர்மருத்துவ ஆராய்ச்சியின் பல துறைகளில் வெற்றிகரமாகப் பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளது¹⁷. இந்த முறை, உயிருள்ள உயிரினங்களுக்குள் செய்யப்படும் இரத்த நாளப் பன்முகத்தன்மை ஆய்வுகளுக்கும்¹⁸,¹⁹, அத்துடன் மூளை இரத்த நாளங்களைக் குறிவைக்கும் ஆய்வுகளுக்கும்²⁰,²¹,²²,²³,²⁴,²⁵,²⁶ பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளது. இந்த ஆய்வில், இந்தத் தேர்வு முறையின் பயன்பாட்டை, மூளை இரத்த நாளங்களைக் குறிவைக்கும் பெப்டைடுகளை நேரடியாக அடையாளம் காண்பதற்கு மட்டுமல்லாமல், இரத்த-மூளைத் தடையைக் கடக்கும் திறன் கொண்ட செயலூக்கப் போக்குவரத்துப் பண்புகளைக் கொண்ட வேட்பாளர்களைக் கண்டறிவதற்கும் நாங்கள் விரிவுபடுத்தினோம். இப்போது, ​​CM குழாய் பொருத்தப்பட்ட எலிகளில் ஒரு உயிருள்ள உயிரினங்களுக்குள் செய்யப்படும் தேர்வு செயல்முறையின் வளர்ச்சியை நாங்கள் விவரிக்கிறோம், மேலும் CSF-ஐ நோக்கிச் செல்லும் பண்புகளைக் கொண்ட பெப்டைடுகளை அடையாளம் காண்பதற்கான அதன் திறனையும் நிரூபிக்கிறோம். 12-மெர் சீரற்ற பெப்டைடுகளின் தொகுப்பைக் காண்பிக்கும் T7 ஃபேஜைப் பயன்படுத்தி, T7 ஃபேஜ் இரத்த-மூளைத் தடையுடன் பொருந்துவதற்குப் போதுமான அளவு சிறியது (சுமார் 60 நானோமீட்டர் விட்டம்)¹⁰ என்பதை எங்களால் நிரூபிக்க முடிந்தது, இதன் மூலம் அது இரத்த-மூளைத் தடை அல்லது கோராய்டு பிளெக்ஸஸை நேரடியாகக் கடக்கிறது. குழாய் பொருத்தப்பட்ட CM எலிகளிடமிருந்து CSF-ஐ சேகரிப்பது, ஒரு நன்கு கட்டுப்படுத்தப்பட்ட இன் விவோ செயல்பாட்டுச் சோதனை முறையாக இருப்பதையும், பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஃபேஜ் இரத்த நாளங்களுடன் பிணைவது மட்டுமல்லாமல், இரத்த-மூளைத் தடையைக் கடக்கும் ஒரு கடத்தியாகவும் செயல்படுவதையும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம். மேலும், ஒரே நேரத்தில் இரத்தத்தைச் சேகரித்து, CSF மற்றும் இரத்தத்திலிருந்து பெறப்பட்ட ஃபேஜ்களுக்கு HTS-ஐப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், தேர்வுச் சுற்றுகளுக்கு இடையில் இரத்தச் செறிவூட்டல் அல்லது விரிவாக்கத்திற்கான தகுதி ஆகியவற்றால் எங்கள் CSF தேர்வு பாதிக்கப்படவில்லை என்பதை நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம். இருப்பினும், இரத்தப் பகுதி தேர்வு நடைமுறையின் ஒரு பகுதியாகும், ஏனெனில் CSF பகுதியை அடையக்கூடிய ஃபேஜ்கள், மூளையில் தங்களைச் செறிவூட்டிக் கொள்ளும் அளவுக்கு நீண்ட காலம் இரத்த ஓட்டத்தில் உயிர்வாழவும் சுழலவும் வேண்டும். மூல HTS தரவுகளிலிருந்து நம்பகமான வரிசைத் தகவலைப் பிரித்தெடுப்பதற்காக, பகுப்பாய்வுப் பணிப்பாய்வில் தளம் சார்ந்த வரிசைப்படுத்தல் பிழைகளுக்கு ஏற்ற வடிப்பான்களை நாங்கள் செயல்படுத்தினோம். பரிசோதனை முறையில் இயக்கவியல் அளவுருக்களை இணைப்பதன் மூலம், இரத்தத்தில் காட்டுவகை T7 ஃபேஜ்களின் விரைவான மருந்தியல் இயக்கவியலை (t½ ~ 28 நிமிடம்) நாங்கள் உறுதிப்படுத்தினோம்²⁴,²⁷,²⁸ மேலும் மூளைத்தண்டுவட திரவத்தில் அவற்றின் அரை ஆயுளையும் (t½ ~ 26 நிமிடம்) நிமிடத்திற்குத் தீர்மானித்தோம். இரத்தம் மற்றும் மூளைத்தண்டுவட திரவத்தில் ஒரே மாதிரியான மருந்தியல் இயக்கவியல் சுயவிவரங்கள் இருந்தபோதிலும், ஃபேஜின் இரத்தச் செறிவில் 0.001% மட்டுமே மூளைத்தண்டுவட திரவத்தில் கண்டறிய முடிந்தது, இது இரத்த-மூளைத் தடையைக் கடந்து காட்டுவகை T7 ஃபேஜின் குறைந்த பின்னணி நகர்வைக் குறிக்கிறது. இந்த ஆய்வு, உடலுக்குள் வடிகட்டும் உத்திகளைப் பயன்படுத்தும்போது முதல் சுற்றுத் தேர்வின் முக்கியத்துவத்தை எடுத்துக்காட்டுகிறது, குறிப்பாக இரத்த ஓட்டத்தில் இருந்து விரைவாக அகற்றப்படும் ஃபேஜ் அமைப்புகளுக்கு இது முக்கியம், ஏனெனில் சில குளோன்களால் மட்டுமே மத்திய நரம்பு மண்டலப் பகுதியை அடைய முடிகிறது. எனவே, முதல் சுற்றில், நூலகப் பன்முகத்தன்மையில் ஏற்பட்ட குறைவு மிக அதிகமாக இருந்தது, ஏனெனில் இந்த மிகவும் கண்டிப்பான மூளைத்தண்டுவட திரவ மாதிரியில் இறுதியில் ஒரு குறிப்பிட்ட எண்ணிக்கையிலான குளோன்கள் மட்டுமே சேகரிக்கப்பட்டன. இந்த இன் விவோ பேனிங் உத்தியானது, CSF பகுதியில் தீவிரமாக குவிதல், இரத்தப் பகுதியில் குளோன் உயிர்வாழ்தல், மற்றும் முதல் 10 நிமிடங்களுக்குள் இரத்தத்திலிருந்து T7 ஃபேஜ் குளோன்களை விரைவாக அகற்றுதல் போன்ற பல தேர்வுப் படிகளை உள்ளடக்கியது (படம் 1d மற்றும் துணைப் படம் 4M). இதனால், முதல் சுற்றுக்குப் பிறகு, தனிப்பட்ட விலங்குகளுக்கு ஒரே ஆரம்பத் தொகுப்பு பயன்படுத்தப்பட்ட போதிலும், CSF-இல் வெவ்வேறு ஃபேஜ் குளோன்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன. அதிக எண்ணிக்கையிலான லைப்ரரி உறுப்பினர்களைக் கொண்ட மூல லைப்ரரிகளுக்கான பல கடுமையான தேர்வுப் படிகள், பன்முகத்தன்மையில் குறிப்பிடத்தக்க குறைவை ஏற்படுத்துகின்றன என்பதை இது சுட்டிக்காட்டுகிறது. எனவே, சீரற்ற நிகழ்வுகள் ஆரம்பத் தேர்வுச் செயல்முறையின் ஒரு ஒருங்கிணைந்த பகுதியாக மாறி, முடிவைப் பெரிதும் பாதிக்கும். அசல் லைப்ரரியில் உள்ள பல குளோன்கள் மிகவும் ஒத்த CSF செறிவூட்டல் போக்கைக் கொண்டிருந்திருக்கலாம். இருப்பினும், ஒரே சோதனை நிலைமைகளின் கீழ் கூட, ஆரம்பத் தொகுப்பில் ஒவ்வொரு குறிப்பிட்ட குளோனின் சிறிய எண்ணிக்கையின் காரணமாக தேர்வு முடிவுகள் வேறுபடலாம்.
மூளைத்தண்டு திரவத்தில் (CSF) செறிவூட்டப்பட்ட மோட்டிஃப்கள் இரத்தத்தில் உள்ளவற்றிலிருந்து வேறுபடுகின்றன. சுவாரஸ்யமாக, தனிப்பட்ட விலங்குகளின் இரத்தத்தில் கிளைசின் நிறைந்த பெப்டைடுகளை நோக்கிய முதல் நகர்வை நாங்கள் கவனித்தோம். (படம் 1g, துணைப் படங்கள் 4e, 4f). கிளைசின் பெப்டைடுகளைக் கொண்ட ஃபேஜ்கள் அதிக நிலைத்தன்மையுடன் இருக்கலாம் மற்றும் புழக்கத்திலிருந்து வெளியேற்றப்படுவதற்கான வாய்ப்பு குறைவாக இருக்கலாம். இருப்பினும், இந்த கிளைசின் நிறைந்த பெப்டைடுகள் மூளைத்தண்டு திரவ மாதிரிகளில் கண்டறியப்படவில்லை, இது தொகுக்கப்பட்ட லைப்ரரிகள் இரண்டு வெவ்வேறு தேர்வு நிலைகளைக் கடந்தன என்பதைக் காட்டுகிறது: ஒன்று இரத்தத்தில், மற்றொன்று மூளைத்தண்டு திரவத்தில் சேர அனுமதிக்கப்பட்டது. நான்காவது சுற்று தேர்வின் விளைவாக உருவான, மூளைத்தண்டு திரவத்தில் செறிவூட்டப்பட்ட குளோன்கள் விரிவாக சோதிக்கப்பட்டுள்ளன. வெற்று கட்டுப்பாட்டு ஃபேஜுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​தனித்தனியாக சோதிக்கப்பட்ட குளோன்களில் கிட்டத்தட்ட அனைத்தும் மூளைத்தண்டு திரவத்தில் செறிவூட்டப்பட்டிருப்பது உறுதி செய்யப்பட்டது. ஒரு பெப்டைட் ஹிட் (#2077) மேலும் விரிவாக ஆராயப்பட்டது. மற்ற ஹிட்களுடன் ஒப்பிடும்போது இது நீண்ட பிளாஸ்மா அரை ஆயுளைக் காட்டியது (படம் 3d மற்றும் துணைப் படம் 7), மேலும் சுவாரஸ்யமாக, இந்த பெப்டைடில் C-முனையில் ஒரு சிஸ்டைன் எச்சம் இருந்தது. பெப்டைடுகளுடன் சிஸ்டைனைச் சேர்ப்பது, அல்புமின் 29 உடன் பிணைவதன் மூலம் அவற்றின் மருந்தியல் பண்புகளை மேம்படுத்த முடியும் என்று சமீபத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளது. பெப்டைட் #2077-க்கு இது தற்போது தெரியவில்லை மற்றும் மேலும் ஆய்வு தேவைப்படுகிறது. சில பெப்டைடுகள் CSF செறிவூட்டலில் ஒரு இணைதிறன்-சார்பைக் காட்டின (தரவு காட்டப்படவில்லை), இது T7 கேப்சிடின் காட்டப்பட்ட மேற்பரப்பு வடிவவியலுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம். நாங்கள் பயன்படுத்திய T7 அமைப்பு, ஒரு ஃபேஜ் துகளுக்கு ஒவ்வொரு பெப்டைடின் 5-15 பிரதிகளைக் காட்டியது. எலிகளின் பெருமூளைப் புறணியில் நரம்பு வழியாகச் செலுத்தப்பட்ட வேட்பாளர் முன்னணி ஃபேஜ் குளோன்களில் IHC செய்யப்பட்டது (துணைப் படம் 8). குறைந்தது மூன்று குளோன்கள் (எண். 2002, எண். 2009 மற்றும் எண். 2077) BBB உடன் தொடர்பு கொண்டன என்பதை தரவு காட்டியது. இந்த இரத்த-மூளைத் தடை (BBB) ​​இடைவினை, மூளைத் தண்டுவட திரவத்தின் (CSF) திரட்சியில் விளைகிறதா அல்லது இந்தக் குளோன்கள் நேரடியாக BCSFB-க்கு நகர்வதில் விளைகிறதா என்பது இன்னும் தீர்மானிக்கப்பட வேண்டும். முக்கியமாக, தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் தொகுக்கப்பட்டு புரதச் சரக்குடன் பிணைக்கப்படும்போது அவற்றின் மூளைத் தண்டுவட திரவப் போக்குவரத்துத் திறனைத் தக்கவைத்துக் கொள்கின்றன என்பதை நாங்கள் காட்டுகிறோம். N-முனை பயோட்டினிலேட்டட் பெப்டைடுகள் SA உடன் பிணைவது, இரத்தம் மற்றும் மூளைத் தண்டுவட திரவத்தில் அந்தந்த ஃபேஜ் குளோன்களுடன் பெறப்பட்ட முடிவுகளை அடிப்படையில் மீண்டும் தருகிறது (படம் 3e). இறுதியாக, முன்னணி பெப்டைடு #2077, SA உடன் இணைக்கப்பட்ட BACE1-இன் பயோட்டினிலேட்டட் பெப்டைடு தடுப்பானின் மூளைச் செயல்பாட்டை ஊக்குவிக்கக் கூடியது என்பதையும், மூளைத் தண்டுவட திரவத்தில் Abeta40 அளவுகளைக் கணிசமாகக் குறைப்பதன் மூலம் மத்திய நரம்பு மண்டலத்தில் (CNS) குறிப்பிடத்தக்க மருந்தியல் விளைவுகளை ஏற்படுத்துகிறது என்பதையும் நாங்கள் காட்டுகிறோம் (படம் 4). அனைத்து முடிவுகளிலும் பெப்டைடு வரிசை ஒத்த தன்மைத் தேடலைச் செய்வதன் மூலம் தரவுத்தளத்தில் எந்த ஒத்த கூறுகளையும் எங்களால் அடையாளம் காண முடியவில்லை. T7 நூலகத்தின் அளவு தோராயமாக 10⁹ ஆகவும், 12-மெர்களுக்கான கோட்பாட்டு நூலக அளவு 4 x 10¹⁵ ஆகவும் உள்ளது என்பதைக் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டியது அவசியம். எனவே, நாங்கள் 12-மெர் பெப்டைட் நூலகத்தின் பன்முகத்தன்மை வெளியின் ஒரு சிறிய பகுதியை மட்டுமே தேர்ந்தெடுத்தோம்; இதன் பொருள், அடையாளம் காணப்பட்ட இந்த இணைப்புகளின் அருகாமை வரிசை வெளியை மதிப்பிடுவதன் மூலம் மேலும் மேம்படுத்தப்பட்ட பெப்டைடுகளை அடையாளம் காண முடியும் என்பதாகும். கருதுகோளின்படி, இந்த பெப்டைடுகளின் எந்தவொரு இயற்கையான ஒத்தவடிவங்களையும் நாங்கள் கண்டறியாததற்கான காரணங்களில் ஒன்று, சில பெப்டைட் உருவமைப்புகள் மூளைக்குள் கட்டுப்பாடின்றி நுழைவதைத் தடுப்பதற்காக பரிணாம வளர்ச்சியின் போது ஏற்பட்ட தேர்வுநீக்கமாக இருக்கலாம்.
ஒட்டுமொத்தமாக, எங்கள் முடிவுகள், உயிருள்ள நிலையில் பெருமூளை இரத்த நாளத் தடையின் போக்குவரத்து அமைப்புகளை இன்னும் விரிவாக அடையாளம் கண்டு வகைப்படுத்துவதற்கான எதிர்காலப் பணிகளுக்கு ஒரு அடிப்படையை வழங்குகின்றன. இந்த முறையின் அடிப்படை அமைப்பு ஒரு செயல்பாட்டுத் தேர்வு உத்தியை அடிப்படையாகக் கொண்டது. இது பெருமூளை இரத்த நாளங்களுடன் பிணைக்கும் பண்புகளைக் கொண்ட குளோன்களை அடையாளம் காண்பது மட்டுமல்லாமல், வெற்றிகரமான குளோன்கள் உயிருள்ள நிலையில் உயிரியல் தடைகளைக் கடந்து மத்திய நரம்பு மண்டலப் பகுதிக்குள் நுழையும் உள்ளார்ந்த செயல்பாட்டைக் கொண்டிருக்கும் ஒரு முக்கியமான படியையும் உள்ளடக்கியுள்ளது. இந்தப் பெப்டைடுகளின் போக்குவரத்து வழிமுறையையும், மூளைப் பகுதிக்குத் தனித்துவமான நுண் இரத்த நாளங்களுடன் பிணைவதற்கான அவற்றின் விருப்பத்தையும் தெளிவுபடுத்துவதே இதன் நோக்கமாகும். இது இரத்த-மூளைத் தடை மற்றும் ஏற்பிகளின் போக்குவரத்திற்கான புதிய பாதைகளைக் கண்டறிய வழிவகுக்கலாம். அடையாளம் காணப்பட்ட பெப்டைடுகள் பெருமூளை இரத்த நாள ஏற்பிகளுடனோ அல்லது இரத்த-மூளைத் தடை அல்லது பெருமூளை-மூளைத் தண்டுவட திரவத் தடை வழியாகக் கொண்டு செல்லப்படும் சுழற்சி லிகண்டுகளுடனோ நேரடியாகப் பிணைக்க முடியும் என்று நாங்கள் எதிர்பார்க்கிறோம். இந்தப் பணியில் கண்டறியப்பட்ட, பெருமூளைத் தண்டுவட திரவப் போக்குவரத்துச் செயல்பாட்டைக் கொண்ட பெப்டைட் வெக்டர்கள் மேலும் ஆராயப்படும். இரத்த-மூளைத் தடை மற்றும்/அல்லது பெருமூளை-மூளைத் தண்டுவட திரவத் தடையைக் கடக்கும் திறனுக்காக, இந்தப் பெப்டைடுகளின் மூளைத் தனித்துவத்தை நாங்கள் தற்போது ஆராய்ந்து வருகிறோம். இந்தப் புதிய பெப்டைடுகள், புதிய ஏற்பிகள் அல்லது வழித்தடங்களைக் கண்டறிவதற்கும், உயிரியல் மருந்துகள் போன்ற பெருமூலக்கூறுகளை மூளைக்குக் கொண்டு சேர்ப்பதற்கான புதிய, மிகவும் செயல்திறன் மிக்க தளங்களை உருவாக்குவதற்கும் மிகவும் மதிப்புமிக்க கருவிகளாக விளங்கும்.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட முறையின் ஒரு மாற்றியமைக்கப்பட்ட வடிவத்தைப் பயன்படுத்தி, பெரிய சிஸ்டெர்னாவில் (CM) குழாய் செருகவும். மயக்க மருந்து கொடுக்கப்பட்ட விஸ்டார் எலிகள் (200-350 கிராம்) ஒரு ஸ்டீரியோடாக்ஸிக் கருவியில் பொருத்தப்பட்டு, மண்டை ஓட்டை வெளிப்படுத்துவதற்காக, மழிக்கப்பட்ட மற்றும் கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட்ட உச்சந்தலையின் மீது ஒரு மையக் கீறல் செய்யப்பட்டது. மேல் தாடைப் பகுதியில் இரண்டு துளைகளை இட்டு, அந்தத் துளைகளில் பொருத்தும் திருகுகளைப் பொருத்தவும். துருப்பிடிக்காத எஃகு குழாயை ஸ்டீரியோடாக்ஸிக் வழிகாட்டுதலுடன் பெரிய சிஸ்டெர்னாவிற்குள் செலுத்துவதற்காக, பக்கவாட்டு பிடரி முகட்டில் ஒரு கூடுதல் துளை இடப்பட்டது. குழாயைச் சுற்றி பல் சிமெண்ட்டைப் பூசி, திருகுகள் கொண்டு பாதுகாப்பாகப் பொருத்தவும். ஒளிக்கதிர் மூலம் பதப்படுத்தப்பட்டு, சிமெண்ட் கெட்டியான பிறகு, தோலில் ஏற்பட்ட காயம் 4/0 சுப்ராமிட் தையல் மூலம் மூடப்பட்டது. மூளைத்தண்டு திரவம் (CSF) தானாகவே கசிவதன் மூலம் குழாய் சரியாகப் பொருத்தப்பட்டுள்ளது என்பது உறுதி செய்யப்படுகிறது. எலியை ஸ்டீரியோடாக்ஸிக் கருவியிலிருந்து அகற்றி, அறுவை சிகிச்சைக்குப் பிந்தைய தகுந்த கவனிப்பு மற்றும் வலி நிவாரணத்தை அளித்து, மூளைத்தண்டு திரவத்தில் இரத்தத்தின் அறிகுறிகள் தென்படும் வரை குறைந்தது ஒரு வாரமாவது அது குணமடைய அனுமதிக்கவும். விஸ்டார் எலிகள் (Crl:WI/Han) பிரான்சின் சார்லஸ் ரிவர் நிறுவனத்திடமிருந்து பெறப்பட்டன. அனைத்து எலிகளும் குறிப்பிட்ட நோய்க்கிருமிகள் இல்லாத சூழலில் வைக்கப்பட்டிருந்தன. அனைத்து விலங்கு சோதனைகளும் சுவிட்சர்லாந்தின் பேசல் நகர கால்நடை மருத்துவ அலுவலகத்தால் அங்கீகரிக்கப்பட்டு, விலங்கு உரிமம் எண் 2474-இன் படி (எலியின் மூளைத்தண்டுவடத் திரவம் மற்றும் மூளையில் உள்ள சிகிச்சைக்கான மருந்துகளின் அளவை அளவிடுவதன் மூலம் மூளையின் செயல்மிகு கடத்தலை மதிப்பிடுதல்) மேற்கொள்ளப்பட்டன.
CM கேனுலாவைக் கையில் வைத்துக்கொண்டு, எலியை மெதுவாக சுயநினைவுடன் வைத்திருக்கவும். கேனுலாவிலிருந்து டாட்டுராவை அகற்றி, தானாகப் பாயும் 10 µl மூளைத்தண்டுவடத் திரவத்தைச் சேகரிக்கவும். கேனுலாவின் திறந்த நிலை இறுதியில் பாதிக்கப்பட்டதால், இரத்தக் கலப்படம் அல்லது நிறமாற்றத்திற்கான எந்த ஆதாரமும் இல்லாத தெளிவான மூளைத்தண்டுவடத் திரவ மாதிரிகள் மட்டுமே இந்த ஆய்வில் சேர்க்கப்பட்டன. அதே நேரத்தில், வால் நுனியில் ஒரு சிறிய கீறல் மூலம் ஹெப்பரின் (சிக்மா-ஆல்ட்ரிச்) உள்ள குழாய்களில் சுமார் 10–20 μl இரத்தம் எடுக்கப்பட்டது. T7 ஃபேஜை நரம்பு வழியாகச் செலுத்திய பிறகு, பல்வேறு நேரங்களில் மூளைத்தண்டுவடத் திரவமும் இரத்தமும் சேகரிக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு மூளைத்தண்டுவடத் திரவ மாதிரியும் சேகரிக்கப்படுவதற்கு முன்பு, சுமார் 5–10 μl திரவம் அகற்றப்பட்டது, இது வடிகுழாயின் பயனற்ற கனஅளவிற்குச் சமமாகும்.
T7Select அமைப்பு கையேட்டில் (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, T7Select 10-3b வெக்டரைப் பயன்படுத்தி நூலகங்கள் உருவாக்கப்பட்டன. சுருக்கமாக, ஒரு சமவாய்ப்பு 12-மெர் டிஎன்ஏ செருகல் பின்வரும் வடிவத்தில் தொகுக்கப்பட்டது:
செருகலில் இரட்டை நிறுத்தக் குறியீடுகளையும் அமினோ அமில மிகை வெளிப்பாட்டையும் தவிர்ப்பதற்காக NNK குறியீடு பயன்படுத்தப்பட்டது. N என்பது ஒவ்வொரு நியூக்ளியோடைடின் சமமோலார் விகிதத்தில் கைமுறையாகக் கலக்கப்பட்டதாகும், மற்றும் K என்பது அடினைன் மற்றும் சைட்டோசின் நியூக்ளியோடைடுகளின் சமமோலார் விகிதத்தில் கைமுறையாகக் கலக்கப்பட்டதாகும். ஒற்றை இழைப் பகுதிகள், 37°C வெப்பநிலையில் 3 மணி நேரத்திற்கு க்ளெனோ இடையகத்தில் (நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ்) dNTP (நோவாஜென்) மற்றும் க்ளெனோ நொதியுடன் (நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ்) மேலும் அடைகாப்பதன் மூலம் இரட்டை இழை டிஎன்ஏவாக மாற்றப்பட்டன. வினைக்குப் பிறகு, எத்தனால் வீழ்படிவாக்கல் மூலம் இரட்டை இழை டிஎன்ஏ மீட்கப்பட்டது. இதன் விளைவாகக் கிடைத்த டிஎன்ஏ, ஈகோஆர்ஐ மற்றும் ஹிண்ட்III (இரண்டும் ரோஷே நிறுவனத்தைச் சேர்ந்தவை) ஆகிய கட்டுப்படுத்தும் நொதிகளால் செரிக்கப்பட்டது. பின்னர், பிளவுபட்டுத் தூய்மைப்படுத்தப்பட்ட (QIAquick, கியாகென்) செருகல் (T4 லிகேஸ், நியூ இங்கிலாந்து பயோலாப்ஸ்), 10B கேப்சிட் மரபணுவின் 348வது அமினோ அமிலத்திற்குப் பிறகு, முன்னரே பிளவுபட்ட T7 வெக்டரில் நேர் வரிசையில் இணைக்கப்பட்டது. இன் விட்ரோ பேக்கேஜிங்கிற்கு முன்னர், லிகேஷன் வினைகள் 16° C வெப்பநிலையில் 18 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டன. இன் விட்ரோ ஃபேஜ் பேக்கேஜிங், T7Select 10-3b குளோனிங் கிட் (நோவாஜென்) உடன் வழங்கப்பட்ட வழிமுறைகளின்படி செய்யப்பட்டது. மேலும், பேக்கேஜிங் கரைசல் எஸ்செரிச்சியா கோலை (BLT5615, நோவாஜென்) பயன்படுத்தி லைசிஸ் வரை ஒருமுறை பெருக்கப்பட்டது. லைசேட்டுகள் மையவிலக்கி செய்யப்பட்டு, டைட்ரேட் செய்யப்பட்டு, கிளிசரால் ஸ்டாக் கரைசலாக -80° C வெப்பநிலையில் உறையவைக்கப்பட்டன.
பிராத் அல்லது தட்டில் பெருக்கப்பட்ட ஃபேஜ் மாறுபடும் பகுதிகளை, தனியுரிம 454/ரோச்-ஆம்ப்ளிகான் இணைவு பிரைமர்களைப் பயன்படுத்தி நேரடி PCR பெருக்கம் செய்தல். முன்னோக்கிய இணைவு பிரைமரில், மாறுபடும் பகுதியைச் சுற்றியுள்ள வரிசைமுறைகள் (NNK) 12 (டெம்ப்ளேட்-சார்ந்தது), GS FLX டைட்டானியம் அடாப்டர் A, மற்றும் நான்கு-அடிப்படை நூலக முக்கிய வரிசைமுறை (TCAG) ஆகியவை உள்ளன (துணைப் படம் 1a):
ரிவர்ஸ் ஃபியூஷன் பிரைமரில், கேப்சர் பீட்ஸ்களுடன் இணைக்கப்பட்ட பயோட்டின் மற்றும் எமல்ஷன் PCR-ன் போது குளோனல் பெருக்கத்திற்குத் தேவைப்படும் GS FLX டைட்டானியம் அடாப்டர் B ஆகியவையும் அடங்கியுள்ளன:
பின்னர், அந்த ஆம்ப்ளிகான்கள் 454 GS-FLX டைட்டானியம் நெறிமுறையின்படி 454/ரோச் பைரோசீக்வென்சிங்கிற்கு உட்படுத்தப்பட்டன. கைமுறை சாங்கர் சீக்வென்சிங்கிற்காக (அப்ளைடு பயோசிஸ்டம்ஸ் ஹிட்டாச்சி 3730 xl டிஎன்ஏ அனலைசர்), T7 ஃபேஜ் டிஎன்ஏ, பிசிஆர் மூலம் பெருக்கப்பட்டு, பின்வரும் பிரைமர் ஜோடிகளைக் கொண்டு வரிசைப்படுத்தப்பட்டது:
ரோச் ஃபாஸ்ட் ஸ்டார்ட் டிஎன்ஏ பாலிமரேஸ் கிட்டைப் பயன்படுத்தி (உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி), தனித்தனி பிளேக்குகளிலிருந்து எடுக்கப்பட்ட செருகல்கள் பிசிஆர் பெருக்கத்திற்கு உட்படுத்தப்பட்டன. ஒரு ஹாட் ஸ்டார்ட் (95 °C-ல் 10 நிமிடம்) மற்றும் 35 பூஸ்ட் சுழற்சிகளை (95 °C-ல் 50 வி, 50 °C-ல் 1 நிமிடம், மற்றும் 72 °C-ல் 1 நிமிடம்) செய்யவும்.
நூலகங்களிலிருந்து பெறப்பட்ட ஃபேஜ்கள், இயல்புவகை ஃபேஜ்கள், மூளைத்தண்டு திரவம் மற்றும் இரத்தத்திலிருந்து மீட்கப்பட்ட ஃபேஜ்கள், அல்லது தனிப்பட்ட குளோன்கள் ஆகியவை எஸ்செரிச்சியா கோலை BL5615-ல், காசநோய் குழம்பில் (சிக்மா ஆல்ட்ரிச்) அல்லது 500 செ.மீ² தட்டுகளில் (தெர்மோ சயின்டிஃபிக்) 37°C வெப்பநிலையில் 4 மணி நேரம் பெருக்கப்பட்டன. தட்டுகளை டிரிஸ்-EDTA இடையகக் கரைசலால் (ஃப்ளூகா அனலிட்டிகல்) கழுவுவதன் மூலமாகவோ அல்லது கிருமியழிக்கப்பட்ட குழாய் முனைகளைக் கொண்டு பிளேக்குகளைச் சேகரிப்பதன் மூலமாகவோ ஃபேஜ்கள் தட்டுகளிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்டன. வளர்ப்பு மேல்கரைசல் அல்லது பிரித்தெடுப்பு இடையகக் கரைசலிலிருந்து, ஒரு சுற்று பாலிஎதிலீன் கிளைக்கால் (PEG 8000) வீழ்படிவாக்கல் (ப்ரோமேகா) மூலம் ஃபேஜ்கள் தனிமைப்படுத்தப்பட்டு, டிரிஸ்-EDTA இடையகக் கரைசலில் மீண்டும் கரைக்கப்பட்டன.
பெருக்கப்பட்ட ஃபேஜ், நரம்பு வழி (IV) ஊசி மூலம் (ஒரு விலங்கிற்கு 500 μl) செலுத்துவதற்கு முன்பு, எண்டோடாக்சின் நீக்கும் மணிகளை (மில்டெனி பயோடெக்) பயன்படுத்தி 2-3 சுற்று எண்டோடாக்சின் நீக்கத்திற்கு உட்படுத்தப்பட்டது. முதல் சுற்றில், 2×10¹² ஃபேஜ்கள் செலுத்தப்பட்டன; இரண்டாவதில், 2×10¹⁰ ஃபேஜ்கள்; மூன்றாவது மற்றும் நான்காவது தேர்வுச் சுற்றுகளில், ஒரு விலங்கிற்கு 2×10⁹ ஃபேஜ்கள் செலுத்தப்பட்டன. குறிப்பிட்ட நேரங்களில் சேகரிக்கப்பட்ட மூளைத் தண்டு திரவம் (CSF) மற்றும் இரத்த மாதிரிகளில் உள்ள ஃபேஜின் அளவு, உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி (T7Select சிஸ்டம் கையேடு) பிளேக் எண்ணிக்கை மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்டது. சுத்திகரிக்கப்பட்ட லைப்ரரிகளை வால் நரம்பில் நரம்பு வழியாகச் செலுத்துவதன் மூலமோ அல்லது முந்தைய தேர்வுச் சுற்றிலிருந்து மூளைத் தண்டு திரவத்திலிருந்து (CSF) பிரித்தெடுக்கப்பட்ட ஃபேஜை மீண்டும் செலுத்துவதன் மூலமோ ஃபேஜ் தேர்வு செய்யப்பட்டது. அதைத் தொடர்ந்து, மூளைத் தண்டு திரவம் (CSF) மற்றும் இரத்த மாதிரிகளிலிருந்து முறையே 10 நிமிடம், 30 நிமிடம், 60 நிமிடம், 90 நிமிடம், 120 நிமிடம், 180 நிமிடம் மற்றும் 240 நிமிடங்களில் அடுத்தடுத்த அறுவடைகள் செய்யப்பட்டன. மொத்தம் நான்கு சுற்று இன் விவோ பேனிங் நடத்தப்பட்டது, இதில் முதல் மூன்று சுற்றுத் தேர்வின் போது தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட இரண்டு கிளைகளும் தனித்தனியாக சேமிக்கப்பட்டு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன. முதல் இரண்டு சுற்றுத் தேர்வில் இருந்து CSF-இலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட அனைத்து ஃபேஜ் செருகல்களும் 454/ரோச் பைரோசீக்வென்சிங்கிற்கு உட்படுத்தப்பட்டன, அதே நேரத்தில் கடைசி இரண்டு சுற்றுத் தேர்வில் இருந்து CSF-இலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்ட அனைத்து குளோன்களும் கைமுறையாக வரிசைப்படுத்தப்பட்டன. முதல் சுற்றுத் தேர்வில் இருந்து அனைத்து இரத்த ஃபேஜ்களும் 454/ரோச் பைரோசீக்வென்சிங்கிற்கு உட்படுத்தப்பட்டன. ஃபேஜ் குளோன்களை உட்செலுத்துவதற்காக, தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ஃபேஜ்கள் 500 செ.மீ² தட்டுகளில் 37°C வெப்பநிலையில் 4 மணி நேரத்திற்கு E. coli (BL5615)-இல் பெருக்கப்பட்டன. தனித்தனியாக தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டு கைமுறையாக வரிசைப்படுத்தப்பட்ட குளோன்கள் TB ஊடகத்தில் பெருக்கப்பட்டன. ஃபேஜ் பிரித்தெடுத்தல், சுத்திகரிப்பு மற்றும் எண்டோடாக்சின் நீக்கம் (மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி) ஆகியவற்றுக்குப் பிறகு, ஒரு விலங்கிற்கு 300 μl அளவில் 2×10¹⁰ ஃபேஜ்கள் ஒரு வால் நரம்பில் நரம்பு வழியாக உட்செலுத்தப்பட்டன.
வரிசைத் தரவின் முன்செயலாக்கம் மற்றும் பண்புசார் வடிகட்டல். மூல 454/ரோச் தரவு, விற்பனையாளர் மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி, பைனரி தரநிலை ஸ்ட்ரீம் மேப் வடிவத்திலிருந்து (sff) பியர்சன் மனிதனால் படிக்கக்கூடிய வடிவத்திற்கு (fasta) மாற்றப்பட்டது. நியூக்ளியோடைடு வரிசையின் மேலதிக செயலாக்கம், கீழே விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, தனியுரிம C நிரல்கள் மற்றும் ஸ்கிரிப்ட்களைப் (வெளியிடப்படாத மென்பொருள் தொகுப்பு) பயன்படுத்தி மேற்கொள்ளப்பட்டது. முதன்மைத் தரவின் பகுப்பாய்வில் கடுமையான பல-நிலை வடிகட்டல் நடைமுறைகள் அடங்கும். செல்லுபடியாகும் 12-மெர் செருகல் டிஎன்ஏ வரிசையைக் கொண்டிராத ரீடுகளை வடிகட்டுவதற்காக, உலகளாவிய நீடில்மேன்-வுன்ஷ் சோதனையைப் பயன்படுத்தி, ரீடுகள் தொடக்க லேபிள் (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), நிறுத்த லேபிள் (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) மற்றும் பின்னணி செருகல் (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ஆகியவற்றுடன் வரிசையாக சீரமைக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு சீரமைப்பிற்கும் 2 முரண்பாடுகள் வரை அனுமதிக்கப்பட்டன³¹. எனவே, தொடக்க மற்றும் நிறுத்தக் குறிச்சொற்கள் இல்லாத ரீடுகள் மற்றும் பின்னணி செருகல்களைக் கொண்ட ரீடுகள், அதாவது, அனுமதிக்கப்பட்ட பொருந்தாமை எண்ணிக்கையை மீறும் சீரமைப்புகள், நூலகத்திலிருந்து அகற்றப்பட்டன. மீதமுள்ள வாசிப்புகளைப் பொறுத்தவரை, தொடக்கக் குறியிலிருந்து தொடங்கி நிறுத்தக் குறிக்கு முன்பு முடிவடையும் N-மெர் டிஎன்ஏ வரிசையானது, அசல் வாசிப்பு வரிசையிலிருந்து வெட்டி எடுக்கப்பட்டு மேலும் செயலாக்கப்பட்டது (இனிமேல் "செருகல்" எனக் குறிப்பிடப்படுகிறது). செருகலின் மொழிபெயர்ப்பிற்குப் பிறகு, பிரைமரின் 5′ முனையில் உள்ள முதல் நிறுத்தக் குறியீட்டிற்குப் பிறகான பகுதி செருகலிலிருந்து அகற்றப்படுகிறது. கூடுதலாக, பிரைமரின் 3′ முனையில் முழுமையற்ற குறியீட்டான்களுக்கு வழிவகுக்கும் நியூக்ளியோடைடுகளும் அகற்றப்பட்டன. பின்னணி வரிசைகளை மட்டுமே கொண்ட செருகல்களைத் தவிர்ப்பதற்காக, "PAG" என்ற அமினோ அமில வடிவத்துடன் தொடங்கும் மொழிபெயர்க்கப்பட்ட செருகல்களும் அகற்றப்பட்டன. 3 அமினோ அமிலங்களுக்கும் குறைவான மொழிபெயர்ப்புக்குப் பிந்தைய நீளத்தைக் கொண்ட பெப்டைடுகள் நூலகத்திலிருந்து அகற்றப்பட்டன. இறுதியாக, செருகல் தொகுப்பில் உள்ள மிகைத்தன்மையை அகற்றி, ஒவ்வொரு தனித்துவமான செருகலின் அதிர்வெண்ணையும் தீர்மானிக்கவும். இந்தப் பகுப்பாய்வின் முடிவுகளில் நியூக்ளியோடைடு வரிசைகள் (செருகல்கள்) மற்றும் அவற்றின் (வாசிப்பு) அதிர்வெண்களின் பட்டியல் அடங்கும் (துணைப் படங்கள் 1c மற்றும் 2).
வரிசை ஒற்றுமையின் அடிப்படையில் N-மெர் டிஎன்ஏ செருகல்களைக் குழுவாக்குதல்: 454/ரோச்-சார்ந்த வரிசைப்படுத்தல் பிழைகளை (ஹோமோபாலிமர் நீட்டிப்புகளை வரிசைப்படுத்துவதில் உள்ள சிக்கல்கள் போன்றவை) நீக்குவதற்கும், முக்கியத்துவம் குறைந்த தேவையற்ற பகுதிகளை அகற்றுவதற்கும், முன்னரே வடிகட்டப்பட்ட N-மெர் டிஎன்ஏ வரிசைச் செருகல்கள் (செருகல்கள்) ஒற்றுமையின் அடிப்படையில் வரிசைப்படுத்தப்படுகின்றன. பின்வருமாறு வரையறுக்கப்பட்ட ஒரு தொடர்முறை வழிமுறையைப் பயன்படுத்தி, செருகல்கள் (ஒவ்வாத 2 கார மூலங்கள் வரை அனுமதிக்கப்படும்) முதலில் அவற்றின் நிகழ்வெண்ணின் அடிப்படையில் (அதிகரித்ததிலிருந்து குறைந்தது வரை) வரிசைப்படுத்தப்படுகின்றன, மேலும் அவை ஒரே மாதிரியாக இருந்தால், அவற்றின் நீளத்தின் அடிப்படையில் (நீளமானதிலிருந்து குட்டையானது வரை) இரண்டாம் நிலை வரிசைப்படுத்தலுக்கு உட்படுத்தப்படுகின்றன. இவ்வாறு, மிகவும் அடிக்கடி நிகழும் மற்றும் மிக நீளமான செருகல்கள் முதல் "குழுவை" வரையறுக்கின்றன. குழுவின் நிகழ்வெண், முக்கிய நிகழ்வெண்ணுக்கு அமைக்கப்படுகிறது. பின்னர், வரிசைப்படுத்தப்பட்ட பட்டியலில் மீதமுள்ள ஒவ்வொரு செருகலும், ஜோடி வாரியான நீடில்மேன்-வுன்ஷ் சீரமைப்பு மூலம் குழுவில் சேர்க்க முயற்சிக்கப்பட்டது. ஒரு சீரமைப்பில் உள்ள பொருந்தாமைகள், செருகல்கள் அல்லது நீக்கங்களின் எண்ணிக்கை 2 என்ற வரம்பைத் தாண்டவில்லை என்றால், ஒரு செருகல் குழுவில் சேர்க்கப்பட்டு, அந்தச் செருகல் எவ்வளவு அடிக்கடி சேர்க்கப்பட்டதோ அந்த அளவிற்கு ஒட்டுமொத்த குழு நிகழ்வெண் அதிகரிக்கப்படுகிறது. ஒரு குழுவில் சேர்க்கப்பட்ட செருகல்கள், பயன்படுத்தப்பட்டதாகக் குறிக்கப்பட்டு, மேலதிக செயலாக்கத்திலிருந்து விலக்கப்படுகின்றன. செருகல் வரிசையை ஏற்கனவே உள்ள ஒரு குழுவில் சேர்க்க முடியாவிட்டால், அந்த செருகல் வரிசையானது பொருத்தமான செருகல் அதிர்வெண்ணுடன் ஒரு புதிய குழுவை உருவாக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டு, பயன்படுத்தப்பட்டதாகக் குறிக்கப்படுகிறது. ஒவ்வொரு செருகல் வரிசையும் ஒரு புதிய குழுவை உருவாக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டாலோ அல்லது ஏற்கனவே உள்ள ஒரு குழுவில் சேர்க்கப்பட முடிந்தாலோ இந்தச் சுழற்சி முடிவடைகிறது. எல்லாவற்றிற்கும் மேலாக, நியூக்ளியோடைடுகளைக் கொண்ட குழுவாக்கப்பட்ட செருகல்கள் இறுதியில் பெப்டைட் வரிசைகளாக (பெப்டைட் நூலகங்கள்) மொழிபெயர்க்கப்படுகின்றன. இந்தப் பகுப்பாய்வின் விளைவாக, தொடர்ச்சியான வாசிப்புகளின் எண்ணிக்கையை உருவாக்கும் செருகல்களின் தொகுப்பும் அவற்றின் தொடர்புடைய அதிர்வெண்களும் கிடைக்கின்றன (துணைப் படம் 2).
மோட்டிஃப் உருவாக்கம்: தனித்துவமான பெப்டைடுகளின் பட்டியலின் அடிப்படையில், கீழே காட்டப்பட்டுள்ளபடி சாத்தியமான அனைத்து அமினோ அமில வடிவங்களையும் (aa) கொண்ட ஒரு நூலகம் உருவாக்கப்பட்டது. 3 நீளமுள்ள ஒவ்வொரு சாத்தியமான வடிவமும் பெப்டைடிலிருந்து பிரித்தெடுக்கப்பட்டு, அதன் நேர்மாறு வடிவமும், அனைத்து வடிவங்களையும் (டிரைபெப்டைடுகள்) கொண்ட ஒரு பொதுவான மோட்டிஃப் நூலகமும் சேர்க்கப்பட்டன. அதிகளவில் மீண்டும் மீண்டும் வரும் மோட்டிஃப்களின் நூலகங்கள் வரிசைப்படுத்தப்பட்டு, தேவையற்றவை நீக்கப்பட்டன. பின்னர், மோட்டிஃப் நூலகத்தில் உள்ள ஒவ்வொரு டிரைபெப்டைடும், கணக்கீட்டுக் கருவிகளைப் பயன்படுத்தி நூலகத்தில் உள்ளதா எனச் சரிபார்க்கப்பட்டது. இந்த நிலையில், கண்டறியப்பட்ட மோட்டிஃப் டிரைபெப்டைடைக் கொண்ட பெப்டைடின் அதிர்வெண் சேர்க்கப்பட்டு, மோட்டிஃப் நூலகத்தில் உள்ள மோட்டிஃபிற்கு ஒதுக்கப்படுகிறது ("மோட்டிஃப்களின் எண்ணிக்கை"). மோட்டிஃப் உருவாக்கத்தின் விளைவாக, டிரைபெப்டைடுகளின் (மோட்டிஃப்கள்) அனைத்து நிகழ்வுகளையும் அவற்றின் மதிப்புகளையும் கொண்ட ஒரு இரு பரிமாண அணி கிடைக்கிறது. இந்த மதிப்புகள், வரிசைமுறை வாசிப்புகள் வடிகட்டப்பட்டு, குழுவாக்கப்பட்டு, மொழிபெயர்க்கப்படும்போது, ​​தொடர்புடைய மோட்டிஃபை உருவாக்கும் வரிசைமுறை வாசிப்புகளின் எண்ணிக்கையாகும். அளவீடுகள் மேலே விரிவாக விவரிக்கப்பட்டுள்ளன.
மையக்கருக்களின் எண்ணிக்கை மற்றும் அதனுடன் தொடர்புடைய சிதறல் வரைபடங்களின் இயல்பாக்கம்: ஒவ்வொரு மாதிரிக்கான மையக்கருக்களின் எண்ணிக்கை பின்வருவனவற்றைப் பயன்படுத்தி இயல்பாக்கப்பட்டது:
இதில் ni என்பது தலைப்பு i-ஐக் கொண்ட வாசிப்புகளின் எண்ணிக்கையாகும். எனவே, vi என்பது மாதிரியில் உள்ள மோட்டிஃப் i-ஐக் கொண்ட வாசிப்புகளின் (அல்லது பெப்டைடுகளின்) சதவீத அதிர்வெண்ணைக் குறிக்கிறது. இயல்பாக்கப்படாத மோட்டிஃப்களின் எண்ணிக்கைக்கான P-மதிப்புகள் ஃபிஷரின் துல்லியச் சோதனையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டன. மோட்டிஃப்களின் எண்ணிக்கையின் தொடர்பு வரைபடங்களைப் பொறுத்தவரை, இயல்பாக்கப்பட்ட மோட்டிஃப்களின் எண்ணிக்கையைப் பயன்படுத்தி R உடன் ஸ்பியர்மேனின் தொடர்புகள் கணக்கிடப்பட்டன.
பெப்டைட் லைப்ரரியில் உள்ள ஒவ்வொரு இடத்திலும் உள்ள அமினோ அமிலங்களின் உள்ளடக்கத்தைக் காட்சிப்படுத்த, வெப் லோகோகிராம்கள் 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) உருவாக்கப்பட்டன. முதலில், 12-மெர் பெப்டைடின் ஒவ்வொரு இடத்திலும் உள்ள அமினோ அமிலங்களின் உள்ளடக்கம் ஒரு 20×12 மேட்ரிக்ஸில் சேமிக்கப்படுகிறது. பின்னர், ஒவ்வொரு இடத்திலும் ஒரே மாதிரியான சார்பு அமினோ அமில உள்ளடக்கத்தைக் கொண்ட 1000 பெப்டைடுகளின் தொகுப்பு ஃபாஸ்டா-சீக்வென்ஸ் வடிவத்தில் உருவாக்கப்பட்டு, வெப்-லோகோ 3-க்கு உள்ளீடாக வழங்கப்படுகிறது. இது, கொடுக்கப்பட்ட ஒரு பெப்டைட் லைப்ரரிக்காக, ஒவ்வொரு இடத்திலும் உள்ள சார்பு அமினோ அமில உள்ளடக்கத்தின் வரைகலைப் பிரதிநிதித்துவத்தை உருவாக்குகிறது. பல்பரிமாண தரவுத்தொகுப்புகளைக் காட்சிப்படுத்த, R-இல் உள்நாட்டில் உருவாக்கப்பட்ட ஒரு கருவியைப் (பயோஸ்ஹீட்மேப், இன்னும் வெளியிடப்படாத ஒரு R தொகுப்பு) பயன்படுத்தி ஹீட் மேப்கள் உருவாக்கப்பட்டன. ஹீட் மேப்களில் வழங்கப்பட்ட டென்ட்ரோகிராம்கள், யூக்ளிடியன் தொலைவு அளவீட்டுடன் வார்டின் படிநிலை கிளஸ்டரிங் முறையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டன. மையக்கருத்து மதிப்பிடும் தரவுகளின் புள்ளிவிவரப் பகுப்பாய்விற்காக, இயல்பாக்கப்படாத மதிப்பிடுதலுக்கான P மதிப்புகள் ஃபிஷரின் துல்லியச் சோதனையைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டன. மற்ற தரவுத்தொகுப்புகளுக்கான P மதிப்புகள், R-இல் ஸ்டூடண்ட்ஸ் t-சோதனை அல்லது ANOVA-வைப் பயன்படுத்தி கணக்கிடப்பட்டன.
தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட ஃபேஜ் குளோன்கள் மற்றும் செருகல்கள் இல்லாத ஃபேஜ்கள் வால் சிரை வழியாக நரம்பு வழி உட்செலுத்தப்பட்டன (ஒரு விலங்கிற்கு 300 μl PBS-இல் 2×10¹⁰ ஃபேஜ்கள்). பெர்ஃப்யூஷன் மற்றும் அதைத் தொடர்ந்த ஃபிக்சேஷனுக்கு பத்து நிமிடங்களுக்கு முன்பு, அதே விலங்குகளுக்கு 100 μl டைலைட்594-லேபிளிடப்பட்ட லெக்டின் (வெக்டர் லேபரட்டரீஸ் இன்க்., DL-1177) நரம்பு வழி உட்செலுத்தப்பட்டது. ஃபேஜ் உட்செலுத்தப்பட்ட 60 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு, எலிகளின் இதயம் வழியாக 50 ml PBS-ம், அதைத் தொடர்ந்து 50 ml 4% PFA/PBS-ம் பெர்ஃப்யூஷன் செய்யப்பட்டன. மூளை மாதிரிகள் கூடுதலாக 4% PFA/PBS-ல் ஒரே இரவில் ஃபிக்சேஷன் செய்யப்பட்டு, 4°C வெப்பநிலையில் ஒரே இரவில் 30% சுக்ரோஸில் ஊறவைக்கப்பட்டன. மாதிரிகள் OCT கலவையில் உடனடியாக உறையவைக்கப்பட்டன. உறைந்த மாதிரிகளின் இம்யூனோஹிஸ்டோகெமிக்கல் பகுப்பாய்வானது, அறை வெப்பநிலையில், 1% BSA கொண்டு தடுக்கப்பட்ட 30 µm கிரையோசெக்ஷன்களில் செய்யப்பட்டது. பின்னர் அவை, T7 ஃபேஜுக்கு எதிரான பாலிக்ளோனல் FITC-குறியிடப்பட்ட ஆன்டிபாடிகளுடன் (Novus NB 600-376A) 4 °C வெப்பநிலையில் இன்குபேட் செய்யப்பட்டன. இரவு முழுவதும் இன்குபேட் செய்யவும். இறுதியாக, அந்த செக்ஷன்கள் PBS கொண்டு 3 முறை கழுவப்பட்டு, ஒரு கான்கோகல் லேசர் மைக்ரோஸ்கோப் (Leica TCS SP5) மூலம் ஆய்வு செய்யப்பட்டன.
குறைந்தபட்சம் 98% தூய்மை கொண்ட அனைத்து பெப்டைடுகளும் ஜென்ஸ்கிரிப்ட் யுஎஸ்ஏ-வால் தொகுக்கப்பட்டு, பயோட்டினேற்றம் செய்யப்பட்டு, உறைநிலை உலர்த்தல் செய்யப்பட்டன. N-முனையில் உள்ள ஒரு கூடுதல் மும்முனை கிளைசின் இடைவெளி வழியாக பயோட்டின் பிணைக்கப்பட்டுள்ளது. நிறை நிறமாலைமானியைப் பயன்படுத்தி அனைத்து பெப்டைடுகளையும் சரிபார்க்கவும்.
ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் (சிக்மா S0677) ஆனது, பயோட்டினிலேட்டட் பெப்டைட், பயோட்டினிலேட்டட் BACE1 தடுப்பு பெப்டைட், அல்லது பயோட்டினிலேட்டட் BACE1 தடுப்பு பெப்டைட் மற்றும் BACE1 தடுப்பு பெப்டைட் ஆகியவற்றின் கலவை (3:1 விகிதம்) ஆகியவற்றின் 5 மடங்கு சமமோலார் அதிகப்படியான அளவுகளுடன் 5–10% DMSO-வில் கலக்கப்பட்டு, PBS-இல் அடைகாக்கப்பட்டது. ஊசி போடுவதற்கு முன்பு அறை வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் வைக்கப்பட்டது. ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்-இணைக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள், மூளைக்குழி கொண்ட எலிகளின் வால் சிரைகளில் ஒன்றில் 10 மி.கி/கி.கி என்ற அளவில் நரம்பு வழியாகச் செலுத்தப்பட்டன.
ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்-பெப்டைட் கலவைகளின் செறிவு ELISA மூலம் மதிப்பிடப்பட்டது. Nunc Maxisorp மைக்ரோடைட்டர் தட்டுகள் (சிக்மா) 4°C வெப்பநிலையில் ஒரே இரவில் 1.5 μg/ml மவுஸ் ஆன்டி-ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் ஆன்டிபாடி (தெர்மோ, MA1-20011) கொண்டு பூசப்பட்டன. அறை வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரம் தடுப்புக்குப் (தடுப்பு இடையகக் கரைசல்: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ஜெலட்டின், 1% BSA) பிறகு, தட்டை 0.05% ட்வீன்-20/PBS (கழுவும் இடையகக் கரைசல்) கொண்டு 3 விநாடிகள் கழுவவும். பின்னர், தடுப்பு இடையகக் கரைசலுடன் நீர்க்கப்பட்ட கிணறுகளில் CSF மற்றும் பிளாஸ்மா மாதிரிகள் (பிளாஸ்மா 1:10,000, CSF 1:115) சேர்க்கப்பட்டன. பிறகு, அந்தத் தட்டு 4°C வெப்பநிலையில் ஒரே இரவில் கண்டறியும் ஆன்டிபாடியுடன் (1 μg/ml, ஆன்டி-ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்-HRP, நோவஸ் NB120-7239) அடைகாக்கப்பட்டது. மூன்று முறை கழுவிய பிறகு, ஸ்ட்ரெப்டாவிடின், TMB சப்ஸ்ட்ரேட் கரைசலில் (ரோச்) 20 நிமிடங்கள் வரை ஊறவைப்பதன் மூலம் கண்டறியப்பட்டது. 1M H2SO4 கொண்டு நிற வளர்ச்சி நிறுத்தப்பட்ட பிறகு, 450 nm-ல் உறிஞ்சுதிறனை அளவிடவும்.
ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்-பெப்டைட்-BACE1 தடுப்பான் கூட்டுப்பொருளின் செயல்பாடு, உற்பத்தியாளரின் நெறிமுறைப்படி (Wako, 294-64701) Aβ(1-40) ELISA மூலம் மதிப்பிடப்பட்டது. சுருக்கமாக, CSF மாதிரிகள் நிலையான நீர்க்கரைப்பானில் (1:23) நீர்த்தப்பட்டு, BNT77 பிடிப்பு எதிர்ப்பொருள் பூசப்பட்ட 96-குழித் தட்டுகளில் 4°C வெப்பநிலையில் இரவு முழுவதும் அடைகாக்கப்பட்டன. ஐந்து முறை கழுவிய பிறகு, HRP-இணைக்கப்பட்ட BA27 எதிர்ப்பொருள் சேர்க்கப்பட்டு, 4°C வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரம் அடைகாக்கப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து ஐந்து முறை கழுவப்பட்டது. அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு TMB கரைசலில் அடைகாப்பதன் மூலம் Aβ(1–40) கண்டறியப்பட்டது. நிற வளர்ச்சி நிறுத்தும் கரைசலைக் கொண்டு நிறுத்தப்பட்ட பிறகு, 450 nm-ல் உறிஞ்சுதலை அளவிடவும். Aβ(1–40) ELISA-விற்கு முன்னர் பிளாஸ்மா மாதிரிகள் திட நிலை பிரித்தெடுத்தலுக்கு உட்படுத்தப்பட்டன. பிளாஸ்மா 96-குழித் தட்டுகளில் 0.2% DEA (சிக்மா) உடன் சேர்க்கப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்பட்டது. SPE தட்டுகளை (Oasis, 186000679) தண்ணீர் மற்றும் 100% மெத்தனால் கொண்டு அடுத்தடுத்துக் கழுவிய பிறகு, பிளாஸ்மா மாதிரிகள் SPE தட்டுகளில் சேர்க்கப்பட்டு, அனைத்து திரவமும் அகற்றப்பட்டது. மாதிரிகள் (முதலில் 5% மெத்தனால், பின்னர் 30% மெத்தனால் கொண்டு) கழுவப்பட்டு, 2% NH4OH/90% மெத்தனால் கொண்டு பிரித்தெடுக்கப்பட்டன. பிரித்தெடுக்கப்பட்ட திரவத்தை 55°C வெப்பநிலையில், நிலையான N2 மின்னோட்டத்தில் 99 நிமிடங்களுக்கு உலர்த்திய பிறகு, மாதிரிகள் தரநிலை நீர்க்கும் பொருட்களில் ஒடுக்கப்பட்டு, மேலே விவரிக்கப்பட்டபடி Aβ(1–40) அளவிடப்பட்டது.
இந்தக் கட்டுரையை மேற்கோள் காட்டுவது எப்படி: யூரிச், ஈ. மற்றும் பலர். உயிருள்ள உயிரினங்களில் அடையாளம் காணப்பட்ட கடத்து பெப்டைடுகளைப் பயன்படுத்தி மூளைக்கு சரக்கு விநியோகம். தி சயின்ஸ். 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
லிகோட்டா ஜே., ஸ்கோரிங்கே டி., தாம்சன் எல்.பி மற்றும் மூஸ் டி. இலக்கு சிகிச்சை முறையைப் பயன்படுத்தி மூளைக்கு பெருமூலக்கூறு மருந்துகளைக் கொண்டு செல்லுதல். ஜர்னல் ஆஃப் நியூரோகெமிஸ்ட்ரி 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
பிராஸ்னெவிக், ஐ., ஸ்டீன்புஷ், எச்.டபிள்யூ., ஷ்மிட்ஸ், சி., மற்றும் மார்டினெஸ்-மார்டினெஸ், பி. இரத்த-மூளைத் தடையைக் கடந்து பெப்டைட் மற்றும் புரத மருந்துகளின் விநியோகம். ப்ராக் நியூரோபயோல் 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
பார்ட்ரிட்ஜ், டபிள்யூ.எம். இரத்த-மூளைத் தடுப்பு: மூளை மருந்து உருவாக்கத்தில் ஒரு முட்டுக்கட்டை. நியூரோஆர்எக்ஸ் 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
ஜோஹன்சன், கே.இ., டங்கன், ஜே.ஏ., ஸ்டோபா, இ.ஜி., மற்றும் பைர்ட், ஏ. கோராய்டு பிளெக்ஸஸ்-சிஎஸ்எஃப் பாதை வழியாக மூளைக்கு மேம்படுத்தப்பட்ட மருந்து விநியோகம் மற்றும் இலக்கு வைப்பதற்கான வாய்ப்புகள். மருந்தியல் ஆராய்ச்சி 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
பார்ட்ரிட்ஜ், டபிள்யூ.எம். மூளைக்கு மருந்துகளைக் கொண்டு செல்வதற்கான மூலக்கூறு ட்ரோஜன் குதிரைகளைக் கொண்டு உயிரிமருந்துகளை நவீனமயமாக்குதல். பயோகான்ஜக் கெம் 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
பார்ட்ரிட்ஜ், இரத்த-மூளைத் தடையின் குறுக்கே WM ஏற்பி வழி பெப்டைட் கடத்தல். எண்டோக்ரின் ரெவ். 7, 314–330 (1986).
நியுவோனர், ஜே. மற்றும் பலர். ஒற்றை இணைதிறன் மூலக்கூறு ஷட்டில்களைப் பயன்படுத்தி சிகிச்சைசார் ஆன்டிபாடிகளின் மூளை ஊடுருவலையும் செயல்திறனையும் அதிகரித்தல். நியூரோன் 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
பியன்-லீ, என். மற்றும் பலர். டிரான்ஸ்ஃபெரின் ஏற்பி (TfR) கடத்தலானது, TfR ஆன்டிபாடிகளின் பிணைப்பு மாறுபாடுகளை மூளைக்குள் எடுத்துக்கொள்வதைத் தீர்மானிக்கிறது. ஜே எக்ஸ்ப் மெட் 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).