Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही मर्यादित CSS सपोर्टसह ब्राउझर आवृत्ती वापरत आहात. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अपडेटेड ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये कंपॅटिबिलिटी मोड अक्षम करा). याव्यतिरिक्त, सतत सपोर्ट सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही शैली आणि जावास्क्रिप्टशिवाय साइट दाखवतो.
एकाच वेळी तीन स्लाईड्सचा कॅरोसेल प्रदर्शित करते. एका वेळी तीन स्लाईड्समधून जाण्यासाठी मागील आणि पुढील बटणे वापरा किंवा एका वेळी तीन स्लाईड्समधून जाण्यासाठी शेवटी स्लाईडर बटणे वापरा.
रक्त-मेंदू अडथळा आणि रक्त-मेंदू अडथळा बायोथेरप्यूटिक एजंट्सना मध्यवर्ती मज्जासंस्थेमध्ये त्यांचे लक्ष्य गाठण्यापासून रोखतात, ज्यामुळे न्यूरोलॉजिकल रोगांवर प्रभावी उपचारांमध्ये अडथळा येतो. नवीन मेंदू वाहतूकदारांचा शोध घेण्यासाठी, आम्ही उंदरांच्या कॅन्युलेटेड कॉन्शस लार्ज पूल मॉडेलचा वापर करून T7 फेज पेप्टाइड लायब्ररी आणि क्रमिकपणे गोळा केलेले रक्त आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) सादर केले. निवडीच्या चार फेऱ्यांनंतर विशिष्ट फेज क्लोन CSF मध्ये खूप समृद्ध झाले. वैयक्तिक उमेदवार पेप्टाइड्सच्या चाचणीत CSF मध्ये 1000 पट पेक्षा जास्त समृद्धी दिसून आली. ओळखल्या गेलेल्या नवीन ट्रान्झिट पेप्टाइडशी जोडलेल्या BACE1 पेप्टाइड इनहिबिटरचा वापर करून सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये अमायलॉइड-β च्या पातळीत 40% घट झाल्यामुळे मेंदूला पेप्टाइड-मध्यस्थी वितरणाची जैविक सक्रियता पुष्टी झाली. हे परिणाम सूचित करतात की इन व्हिव्हो फेज निवड पद्धतींद्वारे ओळखले जाणारे पेप्टाइड्स उपचारात्मक परिणामासह मेंदूला मॅक्रोमोलेक्यूल्सच्या प्रणालीगत वितरणासाठी उपयुक्त वाहने असू शकतात.
मध्यवर्ती मज्जासंस्था (CNS) लक्ष्यित थेरपी संशोधनात मुख्यत्वे CNS-लक्ष्यीकरण गुणधर्म प्रदर्शित करणारे ऑप्टिमाइझ्ड ड्रग्ज आणि एजंट्स ओळखण्यावर लक्ष केंद्रित केले आहे, मेंदूला सक्रिय औषध वितरण करणाऱ्या यंत्रणा शोधण्यासाठी कमी प्रयत्न केले आहेत. हे आता बदलू लागले आहे कारण औषध वितरण, विशेषतः मोठे रेणू, आधुनिक न्यूरोसायन्स औषध विकासाचा एक अविभाज्य भाग आहे. मध्यवर्ती मज्जासंस्थेचे वातावरण सेरेब्रोव्हस्कुलर बॅरियर सिस्टमद्वारे चांगले संरक्षित आहे, ज्यामध्ये रक्त-मेंदू अडथळा (BBB) ​​आणि रक्त-मेंदू अडथळा (BCBB)1 असतो, ज्यामुळे मेंदूला औषधे पोहोचवणे आव्हानात्मक बनते1,2. असा अंदाज आहे की जवळजवळ सर्व मोठ्या रेणू औषधे आणि 98% पेक्षा जास्त लहान रेणू औषधे मेंदूमधून काढून टाकली जातात3. म्हणूनच CNS 4,5 ला उपचारात्मक औषधांची कार्यक्षम आणि विशिष्ट वितरण प्रदान करणाऱ्या नवीन मेंदू वाहतूक प्रणाली ओळखणे खूप महत्वाचे आहे. तथापि, BBB आणि BCSFB देखील औषध वितरणासाठी एक उत्कृष्ट संधी सादर करतात कारण ते मेंदूच्या सर्व संरचनांमध्ये त्याच्या विस्तृत रक्तवहिन्याद्वारे प्रवेश करतात आणि प्रवेश करतात. अशाप्रकारे, मेंदूला नॉन-इनवेसिव्ह पद्धती वापरण्याचे सध्याचे प्रयत्न हे मुख्यत्वे अंतर्जात BBB6 रिसेप्टर वापरून रिसेप्टर-मध्यस्थ वाहतूक (PMT) च्या यंत्रणेवर आधारित आहेत. ट्रान्सफरिन रिसेप्टर मार्ग वापरून अलिकडच्या काळात झालेल्या महत्त्वाच्या प्रगती असूनही7,8, सुधारित गुणधर्मांसह नवीन वितरण प्रणालींचा पुढील विकास आवश्यक आहे. यासाठी, आमचे ध्येय CSF वाहतुकीत मध्यस्थी करण्यास सक्षम पेप्टाइड्स ओळखणे होते, कारण ते तत्वतः CNS ला मॅक्रोमोलेक्यूल्स वितरीत करण्यासाठी किंवा नवीन रिसेप्टर मार्ग उघडण्यासाठी वापरले जाऊ शकतात. विशेषतः, सेरेब्रोव्हस्कुलर सिस्टमचे विशिष्ट रिसेप्टर्स आणि ट्रान्सपोर्टर्स (BBB आणि BSCFB) बायोथेरप्यूटिक औषधांच्या सक्रिय आणि विशिष्ट वितरणासाठी संभाव्य लक्ष्य म्हणून काम करू शकतात. सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) हे कोरोइड प्लेक्सस (CS) चे एक स्रावी उत्पादन आहे आणि सबराक्नोइड स्पेस आणि वेंट्रिक्युलर स्पेसद्वारे मेंदूच्या इंटरस्टिशियल फ्लुइडशी थेट संपर्कात आहे4. अलीकडेच असे दिसून आले आहे की सबराक्नोइड सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड मेंदूच्या इंटरस्टिशियममध्ये जास्त प्रमाणात पसरतो9. आम्हाला आशा आहे की आम्ही या सबअरॅक्नॉइड इनफ्लो ट्रॅक्टचा वापर करून किंवा थेट बीबीबीद्वारे पॅरेन्कायमल स्पेसमध्ये प्रवेश करू शकू. हे साध्य करण्यासाठी, आम्ही एक मजबूत इन व्हिव्हो फेज निवड धोरण लागू केले जे आदर्शपणे या दोन भिन्न मार्गांद्वारे वाहून नेले जाणारे पेप्टाइड्स ओळखते.
आता आम्ही सीएसएफ सॅम्पलिंगसह उच्च थ्रूपुट सिक्वेन्सिंग (एचटीएस) सह अनुक्रमिक इन व्हिव्हो फेज डिस्प्ले स्क्रीनिंग पद्धतीचे वर्णन करतो ज्यामध्ये सर्वोच्च लायब्ररी विविधतेसह प्रारंभिक निवड फेऱ्यांचे निरीक्षण केले जाते. रक्त दूषित होऊ नये म्हणून कायमस्वरूपी प्रत्यारोपित मोठ्या सिस्टर्ना (सीएम) कॅन्युलासह जागरूक उंदरांवर स्क्रीनिंग केले गेले. महत्त्वाचे म्हणजे, हा दृष्टिकोन मेंदू-लक्ष्यीकरण आणि सेरेब्रोव्हस्कुलर अडथळा ओलांडून वाहतूक क्रियाकलाप असलेले पेप्टाइड्स दोन्ही निवडतो. आम्ही त्यांच्या लहान आकारामुळे (~60 एनएम)10 T7 फेज वापरले आणि असे सुचवले की ते एंडोथेलियल आणि/किंवा एपिथेलियल-मेडुला अडथळा ट्रान्ससेल्युलर क्रॉसिंगला परवानगी देणाऱ्या वेसिकल्सच्या वाहतुकीसाठी योग्य आहेत. पॅनिंगच्या चार फेऱ्यांनंतर, फेज लोकसंख्या वेगळ्या करण्यात आली ज्यामध्ये मजबूत इन व्हिव्हो सीएसएफ समृद्धी आणि सेरेब्रल मायक्रोव्हेसेल असोसिएशन दिसून आले. महत्त्वाचे म्हणजे, पसंतीचे आणि रासायनिकरित्या संश्लेषित सर्वोत्तम उमेदवार पेप्टाइड्स सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये प्रथिने कार्गो वाहतूक करण्यास सक्षम आहेत हे दाखवून आम्ही आमच्या निष्कर्षांची पुष्टी करू शकलो. प्रथम, BACE1 पेप्टाइडच्या इनहिबिटरसह अग्रगण्य ट्रान्झिट पेप्टाइड एकत्रित करून CNS चे फार्माकोडायनामिक प्रभाव स्थापित केले गेले. इन व्हिव्हो फंक्शनल स्क्रीनिंग स्ट्रॅटेजीज नवीन मेंदू वाहतूक पेप्टाइड्सना प्रभावी प्रथिने कार्गो वाहक म्हणून ओळखू शकतात हे दाखवण्याव्यतिरिक्त, आम्हाला अशी अपेक्षा आहे की नवीन मेंदू वाहतूक मार्ग ओळखण्यासाठी समान कार्यात्मक निवड दृष्टिकोन देखील महत्त्वाचे बनतील.
प्लेक-फॉर्मिंग युनिट्स (PFU) वर आधारित, फेज पॅकेजिंग स्टेप नंतर, अंदाजे 109 विविधतेसह यादृच्छिक 12-mer रेषीय T7 फेज पेप्टाइड्सची लायब्ररी डिझाइन आणि तयार केली गेली (सामग्री आणि पद्धती पहा). हे लक्षात घेणे महत्वाचे आहे की आम्ही इन व्हिव्हो पॅनिंग करण्यापूर्वी या लायब्ररीचे काळजीपूर्वक विश्लेषण केले. सुधारित प्राइमर्स वापरून फेज लायब्ररी नमुन्यांचे PCR प्रवर्धन केल्याने HTS ला थेट लागू होणारे अॅम्प्लिकॉन तयार झाले (पूरक आकृती 1a). a) HTS11 सिक्वेन्सिंग त्रुटींमुळे, b) प्राइमर्सच्या गुणवत्तेवर परिणाम (NNK)1-12, आणि c) स्टँडबाय लायब्ररीमध्ये वाइल्ड-टाइप (wt) फेज (स्केलेटन इन्सर्ट) ची उपस्थिती, फक्त सत्यापित अनुक्रम माहिती काढण्यासाठी एक अनुक्रम फिल्टरिंग प्रक्रिया लागू करण्यात आली (पूरक आकृती 1b). हे फिल्टर चरण सर्व HTS सिक्वेन्सिंग लायब्ररींना लागू होतात. मानक लायब्ररीसाठी, एकूण 233,868 वाचन प्राप्त झाले, त्यापैकी 39% फिल्टर निकष उत्तीर्ण झाले आणि त्यानंतरच्या फेऱ्यांसाठी लायब्ररी विश्लेषण आणि निवडीसाठी वापरले गेले (पूरक आकृती 1c–e). वाचन प्रामुख्याने लांबीच्या ३ बेस जोड्यांच्या गुणाकारांमध्ये होते ज्यांची शिखर ३६ न्यूक्लियोटाइड्सवर होती (पूरक आकृती १c), जी लायब्ररी डिझाइन (NNK) १-१२ ची पुष्टी करते. उल्लेखनीय म्हणजे, सुमारे ११% लायब्ररी सदस्यांमध्ये १२-आयामी वाइल्ड-टाइप (wt) बॅकबोन PAGISRELVDKL इन्सर्ट होते आणि जवळजवळ अर्ध्या अनुक्रमांमध्ये (४९%) इन्सर्टेशन किंवा डिलीशन होते. लायब्ररी लायब्ररीच्या HTS ने लायब्ररीमध्ये पेप्टाइड्सच्या उच्च विविधतेची पुष्टी केली: ८१% पेक्षा जास्त पेप्टाइड अनुक्रम फक्त एकदाच आढळले आणि फक्त १.५% ≥४ प्रतींमध्ये आढळले (पूरक आकृती २a). रिपर्टॉरमधील सर्व १२ स्थानांवर अमीनो अॅसिड (aa) ची वारंवारता डिजनरेट NKK रिपर्टॉरद्वारे व्युत्पन्न केलेल्या कोडॉनच्या संख्येसाठी अपेक्षित फ्रिक्वेन्सीशी चांगल्या प्रकारे सहसंबंधित होती (पूरक आकृती २b). या इन्सर्टद्वारे एन्कोड केलेल्या aa अवशेषांची निरीक्षण केलेली वारंवारता गणना केलेल्या फ्रिक्वेन्सी (r = ०.८९३) (पूरक आकृती २c) शी चांगल्या प्रकारे सहसंबंधित होती. इंजेक्शनसाठी फेज लायब्ररी तयार करण्यामध्ये एंडोटॉक्सिनचे प्रवर्धन आणि काढून टाकण्याचे टप्पे समाविष्ट आहेत. हे पूर्वी फेज लायब्ररींची विविधता कमी करण्यास संभाव्यतः दर्शविले गेले आहे12,13. म्हणून, आम्ही एंडोटॉक्सिन काढून टाकलेल्या प्लेट-एम्प्लीफाइड फेज लायब्ररीचे अनुक्रमण केले आणि AA ची वारंवारता अंदाज घेण्यासाठी त्याची मूळ लायब्ररीशी तुलना केली. मूळ पूल आणि प्रवर्धित आणि शुद्ध पूल (पूरक आकृती 2d) दरम्यान एक मजबूत सहसंबंध (r = 0.995) दिसून आला, जो दर्शवितो की T7 फेज वापरून प्लेट्सवर प्रवर्धित क्लोनमधील स्पर्धेमुळे मोठा पक्षपात झाला नाही. ही तुलना प्रत्येक लायब्ररीमधील ट्रायपेप्टाइड मोटिफ्सच्या वारंवारतेवर आधारित आहे, कारण HTS सह देखील लायब्ररीची विविधता (~109) पूर्णपणे कॅप्चर केली जाऊ शकत नाही. प्रत्येक स्थानावर aa च्या वारंवारता विश्लेषणाने प्रविष्ट केलेल्या प्रदर्शनाच्या शेवटच्या तीन स्थानांमध्ये एक लहान स्थान-आधारित पूर्वाग्रह दिसून आला (पूरक आकृती 2e). शेवटी, आम्ही असा निष्कर्ष काढला की लायब्ररीची गुणवत्ता आणि विविधता स्वीकार्य होती आणि निवडीच्या अनेक फेऱ्यांदरम्यान फेज लायब्ररीच्या प्रवर्धन आणि तयारीमुळे विविधतेमध्ये फक्त किरकोळ बदल दिसून आले.
BBB आणि/किंवा BCSFB (आकृती 1a-b) द्वारे अंतःप्रेरणेने (iv) इंट्राव्हेनस इंजेक्ट केलेल्या T7 फेजची ओळख सुलभ करण्यासाठी सचेत उंदरांच्या CM मध्ये कॅन्युला शस्त्रक्रिया करून क्रमिक सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड सॅम्पलिंग केले जाऊ शकते. इन व्हिव्हो सिलेक्शनच्या पहिल्या तीन फेजमध्ये (आकृती 1c) आम्ही दोन स्वतंत्र निवड शस्त्रे (बाहू A आणि B) वापरली. निवडीच्या पहिल्या तीन फेजमध्ये सादर केलेल्या फेजची एकूण संख्या कमी करून आम्ही निवडीची कडकपणा हळूहळू वाढवला. पॅनिंगच्या चौथ्या फेरीसाठी, आम्ही शाखा A आणि B मधील नमुने एकत्र केले आणि तीन अतिरिक्त स्वतंत्र निवडी केल्या. या मॉडेलमधील T7 फेज कणांच्या इन व्हिव्हो गुणधर्मांचा अभ्यास करण्यासाठी, शेपटीच्या शिराद्वारे उंदरांमध्ये वाइल्ड-टाइप फेज (PAGISRELVDKL मास्टर इन्सर्ट) इंजेक्ट करण्यात आला. वेगवेगळ्या वेळी सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड आणि रक्तातून फेजची पुनर्प्राप्ती दर्शविली की तुलनेने लहान T7 आयकोसाहेड्रल फेजमध्ये रक्ताच्या डब्यातून जलद प्रारंभिक क्लिअरन्स टप्पा होता (पूरक आकृती 3). उंदरांना दिलेल्या टायटर्स आणि रक्ताच्या प्रमाणाच्या आधारे, आम्ही गणना केली की इंट्राव्हेनस इंजेक्शननंतर १० मिनिटांत रक्तात दिलेल्या डोसमधून फक्त १% wt. फेज आढळले. या सुरुवातीच्या जलद घटानंतर, २७.७ मिनिटांच्या अर्ध-आयुष्यासह मंद प्राथमिक क्लिअरन्स मोजण्यात आला. महत्त्वाचे म्हणजे, CSF कंपार्टमेंटमधून फक्त फार कमी फेज मिळवले गेले, जे CSF कंपार्टमेंटमध्ये वाइल्ड-टाइप फेज स्थलांतरासाठी कमी पार्श्वभूमी दर्शवते (पूरक आकृती ३). सरासरी, संपूर्ण सॅम्पलिंग कालावधीत (०-२५० मिनिटे) सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये रक्तातील T7 फेजचे फक्त १ x १०-३% टायटर्स आणि सुरुवातीला इन्फ्युज केलेल्या फेजचे ४ x १०-८% आढळले. विशेष म्हणजे, सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये वाइल्ड-टाइप फेजचे अर्ध-आयुष्य (२५.७ मिनिटे) रक्तात आढळलेल्यासारखेच होते. या डेटावरून असे दिसून येते की सीएम-कॅन्युलेटेड उंदरांमध्ये रक्तापासून सीएसएफ कंपार्टमेंट वेगळे करणारा अडथळा अबाधित आहे, ज्यामुळे फेज लायब्ररीच्या इन व्हिव्हो निवडीमुळे रक्तातून सीएसएफ कंपार्टमेंटमध्ये सहजपणे वाहून नेले जाणारे क्लोन ओळखता येतात.
(अ) मोठ्या तलावातून सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) पुन्हा नमुना घेण्यासाठी एक पद्धत सेट करणे. (ब) मध्यवर्ती मज्जासंस्था (CNS) अडथळाचे सेल्युलर स्थान आणि रक्त-मेंदू अडथळा (BBB) ​​आणि रक्त-मेंदू अडथळा ओलांडणारे पेप्टाइड्स ओळखण्यासाठी वापरल्या जाणाऱ्या निवड धोरणाचे आरेखन. (क) इन व्हिव्हो फेज डिस्प्ले स्क्रीनिंग फ्लोचार्ट. निवडीच्या प्रत्येक फेरीत, फेज (बाणांमधील प्राणी ओळखकर्ते) अंतःशिराद्वारे इंजेक्शन दिले गेले. निवडीच्या चौथ्या फेरीपर्यंत दोन स्वतंत्र पर्यायी शाखा (A, B) स्वतंत्रपणे ठेवल्या जातात. निवड फेरी 3 आणि 4 साठी, CSF मधून काढलेला प्रत्येक फेज क्लोन मॅन्युअली अनुक्रमित केला गेला. (ड) T7 पेप्टाइड लायब्ररी (2 x 1012 फेज/प्राणी) च्या अंतःशिरा इंजेक्शननंतर दोन कॅन्युलेटेड उंदरांमध्ये निवडीच्या पहिल्या फेरीदरम्यान रक्त (लाल वर्तुळे) आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (हिरवे त्रिकोण) पासून वेगळे केलेल्या फेजचे गतिज. निळे चौरस रक्तातील फेजची सरासरी प्रारंभिक एकाग्रता दर्शवितात, जी इंजेक्शन केलेल्या फेजच्या प्रमाणातून मोजली जाते, एकूण रक्ताचे प्रमाण लक्षात घेऊन. काळे चौरस रक्त फेजच्या सांद्रतेतून एक्स्ट्रापोलेट केलेल्या y रेषेच्या छेदनबिंदू दर्शवितात. (e,f) पेप्टाइडमध्ये आढळणाऱ्या सर्व शक्य ओव्हरलॅपिंग ट्रायपेप्टाइड मोटिफ्सची सापेक्ष वारंवारता आणि वितरण सादर करा. 1000 रीडिंगमध्ये आढळणाऱ्या मोटिफ्सची संख्या दर्शविली आहे. लक्षणीयरीत्या (p < 0.001) समृद्ध मोटिफ्स लाल ठिपक्यांनी चिन्हांकित केले आहेत. (e) प्राण्यांच्या रक्तातून मिळवलेल्या फेजशी इंजेक्शन केलेल्या लायब्ररीच्या ट्रायपेप्टाइड मोटिफच्या सापेक्ष वारंवारतेची तुलना करणारा सहसंबंध स्कॅटरप्लॉट #1.1 आणि #1.2. (f) रक्त आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये वेगळे केलेल्या प्राण्यांच्या फेज ट्रायपेप्टाइड मोटिफ्स #1.1 आणि #1.2 च्या सापेक्ष वारंवारतेची तुलना करणारा सहसंबंध स्कॅटरप्लॉट. (g, h) दोन्ही प्राण्यांमध्ये इन व्हिव्हो निवडीच्या एका फेरीनंतर रक्तात समृद्ध फेज (g) विरुद्ध इंजेक्टेड लायब्ररी आणि CSF (h) मध्ये समृद्ध फेज विरुद्ध रक्त यांचे अनुक्रम आयडी प्रतिनिधित्व. एका अक्षराच्या कोडचा आकार दर्शवितो की त्या स्थितीत तो अमीनो आम्ल किती वेळा आढळतो. हिरवा = ध्रुवीय, जांभळा = तटस्थ, निळा = मूलभूत, लाल = आम्लीय आणि काळा = हायड्रोफोबिक अमीनो आम्ल. आकृती 1a, b ची रचना आणि निर्मिती एडवर्ड उरिच यांनी केली होती.
आम्ही दोन CM इन्स्ट्रुमेंट रॅट्समध्ये (क्लेड A आणि B) फेज पेप्टाइड लायब्ररी इंजेक्ट केली आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड आणि रक्तापासून फेज वेगळे केले (आकृती 1d). लायब्ररीची सुरुवातीची जलद क्लिअरन्स वाइल्ड-टाइप फेजच्या तुलनेत कमी स्पष्ट होती. दोन्ही प्राण्यांमध्ये इंजेक्टेड लायब्ररीचे सरासरी अर्ध-आयुष्य रक्तात 24.8 मिनिटे होते, जे वाइल्ड-टाइप फेजसारखेच होते आणि CSF मध्ये 38.5 मिनिटे होते. प्रत्येक प्राण्यातील रक्त आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड फेजचे नमुने HTS च्या अधीन होते आणि सर्व ओळखल्या जाणाऱ्या पेप्टाइड्सचे विश्लेषण लहान ट्रायपेप्टाइड मोटिफच्या उपस्थितीसाठी केले गेले. ट्रायपेप्टाइड मोटिफ निवडले गेले कारण ते संरचना निर्मिती आणि पेप्टाइड-प्रोटीन परस्परसंवादासाठी किमान आधार प्रदान करतात14,15. आम्हाला इंजेक्टेड फेज लायब्ररी आणि दोन्ही प्राण्यांच्या रक्तातून काढलेल्या क्लोनमधील मोटिफच्या वितरणात चांगला सहसंबंध आढळला (आकृती 1e). डेटा दर्शवितो की लायब्ररीची रचना रक्ताच्या डब्यात फक्त किरकोळ प्रमाणात समृद्ध आहे. Weblogo16 सॉफ्टवेअरच्या अनुकूलनाचा वापर करून प्रत्येक स्थानावर अमीनो आम्ल फ्रिक्वेन्सी आणि एकमत अनुक्रमांचे अधिक विश्लेषण करण्यात आले. मनोरंजक गोष्ट म्हणजे, आम्हाला रक्तातील ग्लाइसिन अवशेषांमध्ये एक मजबूत संवर्धन आढळले (आकृती 1g). जेव्हा रक्ताची तुलना CSF मधून निवडलेल्या क्लोनशी केली गेली, तेव्हा मजबूत निवड आणि काही आकृतिबंधांचे निवड रद्द करणे दिसून आले (आकृती 1f), आणि काही अमीनो आम्ल प्राधान्याने 12-सदस्यांमध्ये पूर्वनिर्धारित स्थानांवर उपस्थित होते (आकृती 1h). उल्लेखनीय म्हणजे, वैयक्तिक प्राण्यांमध्ये सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये लक्षणीय फरक होता, तर दोन्ही प्राण्यांमध्ये रक्तातील ग्लाइसिन संवर्धन दिसून आले (पूरक आकृती 4a-j). प्राण्यांच्या #1.1 आणि #1.2 च्या सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये अनुक्रम डेटाचे कठोर फिल्टरिंग केल्यानंतर, एकूण 964 आणि 420 अद्वितीय 12-मेर पेप्टाइड्स प्राप्त झाले (पूरक आकृती 1d-e). वेगळ्या फेज क्लोन वाढवल्या गेल्या आणि इन व्हिव्हो निवडीच्या दुसऱ्या फेरीत आणल्या गेल्या. निवडीच्या दुसऱ्या फेरीतून काढलेले फेज प्रत्येक प्राण्यामध्ये HTS च्या अधीन होते आणि ट्रायपेप्टाइड मोटिफ्सच्या घटनेचे विश्लेषण करण्यासाठी सर्व ओळखल्या जाणाऱ्या पेप्टाइड्सचा वापर मोटिफ रिकग्निशन प्रोग्राममध्ये इनपुट म्हणून केला गेला (आकृती 2a, b, ef). CSF मधून पुनर्प्राप्त केलेल्या फेजच्या पहिल्या चक्राच्या तुलनेत, आम्ही शाखा A आणि B मध्ये CSF मधील अनेक मोटिफ्सची पुढील निवड आणि निवड रद्द करण्याचे निरीक्षण केले (आकृती 2). ते सुसंगत अनुक्रमाच्या वेगवेगळ्या नमुन्यांचे प्रतिनिधित्व करतात की नाही हे निर्धारित करण्यासाठी नेटवर्क ओळख अल्गोरिदम लागू केला गेला. पर्यायी क्लेड A (आकृती 2c, d) आणि क्लेड B (आकृती 2g, h) मध्ये CSF द्वारे पुनर्प्राप्त केलेल्या 12-आयामी अनुक्रमांमध्ये स्पष्ट समानता दिसून आली. प्रत्येक शाखेतील एकत्रित विश्लेषणातून 12-मेर पेप्टाइड्ससाठी वेगवेगळे निवड प्रोफाइल (पूरक आकृती 5c, d) आणि निवडीच्या पहिल्या फेरीच्या तुलनेत निवडीच्या दुसऱ्या फेरीनंतर एकत्रित क्लोनसाठी कालांतराने CSF/रक्त टायटर गुणोत्तरात वाढ दिसून आली (पूरक आकृती 5e).
इन व्हिव्हो फंक्शनल फेज डिस्प्ले सिलेक्शनच्या सलग दोन फेऱ्यांद्वारे सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये मोटिफ्स आणि पेप्टाइड्सचे समृद्धीकरण.
प्रत्येक प्राण्याच्या पहिल्या फेरीतून (प्राणी #१.१ आणि #१.२) पुनर्प्राप्त केलेले सर्व सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड फेजेस एकत्रित केले गेले, प्रवर्धित केले गेले, एचटी-अनुक्रमित केले गेले आणि पुन्हा एकत्र केले गेले (२ x १०१० फेजेस/प्राणी) २ एसएम कॅन्युलेटेड उंदीर (#१.१ → #). २.१ आणि २.२, १.२ → २.३ आणि २.४). (अ,ब,ई,एफ) पहिल्या आणि दुसऱ्या निवड फेरीत सर्व सीएसएफ-व्युत्पन्न फेजच्या ट्रायपेप्टाइड मोटिफ्सच्या सापेक्ष वारंवारतेची तुलना करणारे सहसंबंध स्कॅटरप्लॉट्स. दोन्ही अभिमुखतेमध्ये पेप्टाइड्समध्ये आढळणाऱ्या सर्व संभाव्य ओव्हरलॅपिंग ट्रायपेप्टाइड्सचे प्रतिनिधित्व करणारे मोटिफ्सची सापेक्ष वारंवारता आणि वितरण. १००० वाचनांमध्ये आढळणाऱ्या मोटिफ्सची संख्या दर्शविली आहे. तुलना केलेल्या लायब्ररींपैकी एकामध्ये लक्षणीयरीत्या (पी < ०.००१) निवडलेले किंवा वगळलेले मोटिफ लाल ठिपक्यांनी हायलाइट केले आहेत. (c, d, g, h) इन व्हिव्हो सिलेक्शनच्या राउंड २ आणि १ वर आधारित सर्व CSF-समृद्ध १२ अमीनो आम्ल लांब अनुक्रमांचे अनुक्रम लोगो प्रतिनिधित्व. एका-अक्षरी कोडचा आकार दर्शवितो की त्या स्थानावर तो अमीनो आम्ल किती वेळा येतो. लोगोचे प्रतिनिधित्व करण्यासाठी, दोन निवड फेऱ्यांमधील वैयक्तिक प्राण्यांमधून काढलेल्या CSF अनुक्रमांची वारंवारता तुलना केली जाते आणि दुसऱ्या फेरीतील समृद्ध अनुक्रम दर्शविले जातात: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 आणि (h) #1.2–#2.4. (c, d) प्राणी क्रमांक २.१ आणि क्रमांक २.२ किंवा (g, h) प्राणी क्रमांक २.३ आणि क्रमांक २.४ मध्ये दिलेल्या स्थानावरील सर्वात समृद्ध अमीनो आम्ले रंगात दर्शविली आहेत. हिरवा = ध्रुवीय, जांभळा = तटस्थ, निळा = मूलभूत, लाल = आम्लयुक्त आणि काळा = हायड्रोफोबिक अमीनो आम्ले.
निवडीच्या तिसऱ्या फेरीनंतर, आम्ही दोन प्राण्यांपासून वेगळे केलेल्या 332 CSF-पुनर्निर्मित फेज क्लोनमधून 124 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रम (#3.1 आणि #3.2) ओळखले (पूरक आकृती 6a). LGSVS (18.7%) या अनुक्रमात सर्वाधिक सापेक्ष प्रमाण होते, त्यानंतर वाइल्ड-टाइप इन्सर्ट PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), आणि SARGSWREIVSLS (2.2%) होते. शेवटच्या चौथ्या फेरीत, आम्ही तीन वेगवेगळ्या प्राण्यांमधून स्वतंत्रपणे निवडलेल्या दोन शाखा एकत्र केल्या (आकृती 1c). CSF मधून पुनर्प्राप्त केलेल्या 925 अनुक्रमित फेज क्लोनपैकी, चौथ्या फेरीत आम्हाला 64 अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रम (पूरक आकृती 6b) आढळले, ज्यामध्ये वाइल्ड-टाइप फेजचे सापेक्ष प्रमाण 0.8% पर्यंत घसरले. चौथ्या फेरीत सर्वात सामान्य CSF क्लोन LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) आणि RLSSVDSDLSGC (3, 2%. %) होते. NNK लायब्ररी डिझाइनसाठी डिजनरेट कोडॉन वापरताना लायब्ररी प्राइमर्समध्ये न्यूक्लियोटाइड इन्सर्शन/डिलीशन किंवा अकाली स्टॉप कोडॉनमुळे निवडलेल्या पेप्टाइड्सची लांबी श्रेणी असते. अकाली स्टॉप कोडॉन लहान पेप्टाइड्स तयार करतात आणि निवडले जातात कारण त्यात अनुकूल aa मोटिफ असतो. सिंथेटिक लायब्ररीच्या प्राइमर्समध्ये इन्सर्शन/डिलीशनमुळे लांब पेप्टाइड्स होऊ शकतात. हे डिझाइन केलेले स्टॉप कोडॉन फ्रेमच्या बाहेर ठेवते आणि नवीन स्टॉप कोडॉन डाउनस्ट्रीम येईपर्यंत ते वाचते. सर्वसाधारणपणे, आम्ही नमुना आउटपुट डेटासह इनपुट डेटाची तुलना करून चारही निवड फेऱ्यांसाठी समृद्धी घटकांची गणना केली. स्क्रीनिंगच्या पहिल्या फेरीसाठी, आम्ही विशिष्ट नसलेल्या पार्श्वभूमी संदर्भ म्हणून वाइल्ड-टाइप फेज टायटर्सचा वापर केला. मनोरंजक गोष्ट म्हणजे, पहिल्या CSF चक्रात नकारात्मक फेज निवड खूप मजबूत होती, परंतु रक्तात नव्हती (आकृती 3a), जी पेप्टाइड लायब्ररीच्या बहुतेक सदस्यांच्या CSF कंपार्टमेंटमध्ये निष्क्रिय प्रसाराची कमी संभाव्यता किंवा सापेक्ष फेज बॅक्टेरियोफेजपेक्षा रक्तप्रवाहातून अधिक कार्यक्षमतेने राखले जातात किंवा काढून टाकले जातात या कमी संभाव्यतेमुळे असू शकते. तथापि, पॅनिंगच्या दुसऱ्या फेरीत, दोन्ही क्लेडमध्ये CSF मधील फेजची मजबूत निवड दिसून आली, ज्यामुळे असे सूचित होते की मागील फेरी CSF अपटेकला प्रोत्साहन देणाऱ्या पेप्टाइड्स प्रदर्शित करणाऱ्या फेजमध्ये समृद्ध होती (आकृती 3a). पुन्हा, लक्षणीय रक्त संवर्धनाशिवाय. तसेच तिसऱ्या आणि चौथ्या फेरीत, फेज क्लोन CSF मध्ये लक्षणीयरीत्या समृद्ध होते. निवडीच्या शेवटच्या दोन फेरींमधील प्रत्येक अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमाच्या सापेक्ष वारंवारतेची तुलना करताना, आम्हाला आढळले की निवडीच्या चौथ्या फेरीत (आकृती 3b) अनुक्रम आणखी समृद्ध होते. दोन्ही पेप्टाइड ओरिएंटेशन वापरून सर्व ६४ अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमांमधून एकूण ९३१ ट्रायपेप्टाइड आकृतिबंध काढले गेले. चौथ्या फेरीतील सर्वात समृद्ध आकृतिबंधांचे इंजेक्टेड लायब्ररीच्या तुलनेत सर्व फेरींमध्ये त्यांच्या समृद्धीकरण प्रोफाइलसाठी अधिक बारकाईने परीक्षण केले गेले (कट-ऑफ: १०% समृद्धीकरण) (पूरक आकृती ६c). निवडीच्या सामान्य नमुन्यांवरून असे दिसून आले की अभ्यासलेले बहुतेक आकृतिबंध दोन्ही निवड शाखांच्या मागील सर्व फेरींमध्ये समृद्ध केले गेले होते. तथापि, काही आकृतिबंध (उदा. SGL, VSG, LGS GSV) प्रामुख्याने पर्यायी क्लेड A मधून होते, तर इतर (उदा. FGW, RTN, WGF, NTR) पर्यायी क्लेड B मध्ये समृद्ध केले गेले.
स्ट्रेप्टाव्हिडिन पेलोड्समध्ये संयुग्मित केलेल्या CSF-समृद्ध फेज-प्रदर्शित पेप्टाइड्स आणि बायोटिनिलेटेड लीडर पेप्टाइड्सच्या CSF वाहतुकीचे प्रमाणीकरण.
(a) इंजेक्टेड (इनपुट = I) फेज (PFU) टायटर्स आणि निर्धारित CSF फेज टायटर्स (आउटपुट = O) वर आधारित चारही फेज (R1-R4) मध्ये गणना केलेले समृद्धीकरण गुणोत्तर. शेवटच्या तीन फेज (R2-R4) साठी समृद्धीकरण घटक मागील फेरी आणि पहिल्या फेरी (R1) च्या वजन डेटासह तुलना करून मोजले गेले. ओपन बार हे सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड आहेत, छायांकित बार प्लाझ्मा आहेत. (***p<0.001, विद्यार्थ्यांच्या टी-टेस्टवर आधारित). (b) निवडीच्या चौथ्या फेरीनंतर CSF मध्ये गोळा केलेल्या सर्व फेजच्या सापेक्ष प्रमाणानुसार रँक केलेल्या सर्वात मुबलक फेज पेप्टाइड्सची यादी. सहा सर्वात सामान्य फेज क्लोन रंगात, क्रमांकित आणि निवडीच्या तिसऱ्या आणि चौथ्या फेरी (कंटेस्ट) दरम्यान त्यांचे समृद्धीकरण घटक हायलाइट केले आहेत. (c,d) चौथ्या फेरीतील सहा सर्वात समृद्ध फेज क्लोन, रिक्त फेज आणि पॅरेंटल फेज पेप्टाइड लायब्ररीचे CSF सॅम्पलिंग मॉडेलमध्ये वैयक्तिकरित्या विश्लेषण केले गेले. दर्शविलेल्या वेळेनुसार CSF आणि रक्ताचे नमुने गोळा केले गेले. (c) 6 उमेदवार फेज क्लोन (2 x 1010 फेज/प्राणी), रिक्त फेज (#1779) (2 x 1010 फेज/प्राणी) आणि स्टॉक फेज पेप्टाइड लायब्ररी (2 x 1012 फेज/प्राणी) समान प्रमाणात. कॅन्युलेटेड प्राण्याला शेपटीच्या शिराद्वारे स्वतंत्रपणे किमान 3 CM इंजेक्ट करा. प्रत्येक इंजेक्टेड फेज क्लोन आणि फेज पेप्टाइड लायब्ररीचे CSF फार्माकोकाइनेटिक्स कालांतराने दर्शविले आहेत. (d) सॅम्पलिंग वेळेत सर्व पुनर्प्राप्त फेज/मिलीसाठी सरासरी CSF/रक्त गुणोत्तर दर्शविते. (e) चार सिंथेटिक लीडर पेप्टाइड्स आणि एक स्क्रॅम्बल्ड कंट्रोल त्यांच्या N-टर्मिनस (टेट्रामर डिस्प्ले) द्वारे बायोटिनशी स्ट्रेप्टाव्हिडिनशी जोडले गेले आणि त्यानंतर इंजेक्शन (टेल व्हेन iv, 10 मिग्रॅ स्ट्रेप्टाव्हिडिन/किग्रा) दिले गेले. किमान तीन इंट्यूबेटेड उंदीर (N = 3). CSF नमुने दर्शविलेल्या वेळेनुसार गोळा केले गेले आणि CSF अँटी-स्ट्रेप्टाव्हिडिन ELISA द्वारे स्ट्रेप्टाव्हिडिन सांद्रता मोजली गेली (nd = आढळले नाही). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA चाचणीवर आधारित). (f) निवडीच्या चौथ्या फेरीतील इतर निवडलेल्या फेज पेप्टाइड क्लोनसह सर्वात समृद्ध फेज पेप्टाइड क्लोन #2002 (जांभळा) च्या अमीनो आम्ल अनुक्रमाची तुलना. एकसारखे आणि समान अमीनो आम्ल तुकडे रंग-कोड केलेले आहेत.
चौथ्या फेरीतील सर्व समृद्ध फेजपैकी (आकृती 3b), CSF सॅम्पलिंग मॉडेलमध्ये पुढील वैयक्तिक विश्लेषणासाठी सहा उमेदवार क्लोन निवडले गेले. तीन कॅन्युलेटेड CM प्राण्यांमध्ये सहा उमेदवार फेज, रिक्त फेज (इन्सर्टशिवाय) आणि प्रोफेज पेप्टाइड लायब्ररी समान प्रमाणात इंजेक्ट करण्यात आल्या आणि CSF (आकृती 3c) आणि रक्त (पूरक आकृती 7) चाचण्यांमध्ये फार्माकोकाइनेटिक्स निश्चित केले गेले. चाचणी केलेल्या सर्व फेज क्लोनने रिक्त नियंत्रण फेज (#1779) पेक्षा 10-1000 पट जास्त पातळीवर CSF कंपार्टमेंटला लक्ष्य केले. उदाहरणार्थ, क्लोन #2020 आणि #2077 मध्ये नियंत्रण फेजपेक्षा सुमारे 1000 पट जास्त CSF टायटर्स होते. प्रत्येक निवडलेल्या पेप्टाइडचे फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल वेगळे आहे, परंतु त्या सर्वांमध्ये उच्च CSF होमिंग क्षमता आहे. क्लोन #१९०३ आणि #२०११ मध्ये कालांतराने सतत घट होत असल्याचे आम्हाला आढळले, तर क्लोन #२०७७, #२००२ आणि #२००९ मध्ये पहिल्या १० मिनिटांत वाढ सक्रिय वाहतूक दर्शवू शकते परंतु त्याची पडताळणी करणे आवश्यक आहे. क्लोन #२०२०, #२००२ आणि #२०७७ उच्च पातळीवर स्थिर झाले, तर क्लोन #२००९ ची CSF एकाग्रता सुरुवातीच्या वाढीनंतर हळूहळू कमी झाली. त्यानंतर आम्ही प्रत्येक CSF उमेदवाराच्या सापेक्ष वारंवारतेची त्याच्या रक्त एकाग्रतेशी तुलना केली (आकृती ३d). सर्व सॅम्पलिंग वेळेत प्रत्येक CSF उमेदवाराच्या सरासरी टायटरचा त्याच्या रक्त टायटरशी सहसंबंध दर्शवितो की सहा उमेदवारांपैकी तीन जण रक्त CSF मध्ये लक्षणीयरीत्या समृद्ध होते. मनोरंजक म्हणजे, क्लोन #२०७७ ने उच्च रक्त स्थिरता दर्शविली (पूरक आकृती ७). पेप्टाइड्स स्वतः फेज कणांव्यतिरिक्त इतर कार्गो CSF कंपार्टमेंटमध्ये सक्रियपणे वाहून नेण्यास सक्षम आहेत याची पुष्टी करण्यासाठी, आम्ही N-टर्मिनसवर बायोटिनसह व्युत्पन्न केलेले चार लीडर पेप्टाइड्स संश्लेषित केले जिथे पेप्टाइड्स फेज कणाला जोडतात. बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड्स (क्रमांक २००२, २००९, २०२० आणि २०७७) स्ट्रेप्टाव्हिडिन (एसए) सह संयुग्मित केले गेले जेणेकरून फेज भूमितीची नक्कल करणारे मल्टीमेरिक फॉर्म मिळतील. या फॉरमॅटमुळे आम्हाला रक्त आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये कार्गो-ट्रान्सपोर्टिंग प्रोटीन पेप्टाइड्स म्हणून एसए एक्सपोजर मोजता आले. महत्त्वाचे म्हणजे, जेव्हा एसए-कंजुगेटेड फॉरमॅटमध्ये सिंथेटिक पेप्टाइड्स दिले जातात तेव्हा फेज डेटा अनेकदा पुनरुत्पादित केला जाऊ शकतो (आकृती ३ई). स्क्रॅम्बल्ड पेप्टाइड्समध्ये कमी प्रारंभिक एक्सपोजर आणि ४८ तासांच्या आत न शोधता येणारे स्तर असलेले जलद CSF क्लिअरन्स होते. CSF जागेत या पेप्टाइड फेज क्लोनच्या वितरण मार्गांबद्दल अंतर्दृष्टी मिळविण्यासाठी, आम्ही व्हिव्होमध्ये इंट्राव्हेनस इंजेक्शननंतर १ तासाने फेज कण थेट शोधण्यासाठी इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) वापरून वैयक्तिक फेज पेप्टाइड हिट्सच्या स्थानिकीकरणाचे विश्लेषण केले. विशेषतः, क्लोन #२००२, #२०७७ आणि #२००९ हे मेंदूच्या केशिकांमध्ये मजबूत स्टेनिंगद्वारे शोधले जाऊ शकतात, तर कंट्रोल फेज (#१७७९) आणि क्लोन #२०२० आढळले नाहीत (पूरक आकृती ८). हे सूचित करते की हे पेप्टाइड्स BBB ओलांडून मेंदूवर होणाऱ्या परिणामात अचूक योगदान देतात. या गृहीतकाची चाचणी घेण्यासाठी अधिक तपशीलवार विश्लेषण आवश्यक आहे, कारण BSCFB मार्ग देखील यात सामील असू शकतो. सर्वात समृद्ध क्लोन (#२००२) च्या अमिनो आम्ल अनुक्रमाची इतर निवडक पेप्टाइड्सशी तुलना करताना, असे लक्षात आले की त्यापैकी काहींमध्ये समान अमिनो आम्ल विस्तार आहेत, जे समान वाहतूक यंत्रणा दर्शवू शकतात (आकृती ३f).
त्याच्या अद्वितीय प्लाझ्मा प्रोफाइलमुळे आणि कालांतराने CSF मध्ये लक्षणीय वाढ झाल्यामुळे, फेज डिस्प्ले क्लोन #2077 चा 48 तासांच्या दीर्घ कालावधीत अधिक शोध घेण्यात आला आणि तो SA पातळीच्या सततच्या संबंधात CSF मध्ये जलद वाढ दिसून आली (आकृती 4a). इतर ओळखल्या गेलेल्या फेज क्लोनबद्दल, #2077 मेंदूच्या केशिकांसाठी जोरदारपणे रंगवले गेले आणि उच्च रिझोल्यूशनवर पाहिल्यावर केशिका मार्कर लेक्टिनसह लक्षणीय कोलोकलायझेशन आणि कदाचित पॅरेन्कायमल स्पेसमध्ये काही रंगवले गेले (आकृती 4b). CNS मध्ये पेप्टाइड-मध्यस्थ औषधीय प्रभाव मिळू शकतात का हे तपासण्यासाठी, आम्ही एक प्रयोग केला ज्यामध्ये i) #2077 ट्रान्झिट पेप्टाइड आणि ii) BACE1 इनहिबिटर पेप्टाइडच्या बायोटिनिलेटेड आवृत्त्या SA मध्ये दोन वेगवेगळ्या गुणोत्तरांमध्ये मिसळल्या गेल्या. एका संयोजनासाठी आम्ही फक्त BACE1 पेप्टाइड इनहिबिटर वापरला आणि दुसऱ्यासाठी आम्ही BACE1 पेप्टाइड इनहिबिटरचा #2077 पेप्टाइडशी 1:3 गुणोत्तर वापरला. दोन्ही नमुने अंतःप्रेरणाने देण्यात आले आणि कालांतराने बीटा-अमायलॉइड पेप्टाइड 40 (Abeta40) चे रक्त आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड पातळी मोजण्यात आली. Abeta40 चे CSF मध्ये मोजले गेले कारण ते मेंदूच्या पॅरेन्कायमामध्ये BACE1 प्रतिबंध प्रतिबिंबित करते. अपेक्षेप्रमाणे, दोन्ही कॉम्प्लेक्समुळे Abeta40 चे रक्त पातळी लक्षणीयरीत्या कमी झाली (आकृती 4c, d). तथापि, पेप्टाइड क्रमांक 2077 आणि SA मध्ये संयुग्मित BACE1 पेप्टाइडच्या इनहिबिटरचे मिश्रण असलेल्या नमुन्यांमुळेच सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये Abeta40 मध्ये लक्षणीय घट झाली (आकृती 4c). डेटा दर्शवितो की पेप्टाइड क्रमांक 2077 60 kDa SA प्रथिने CNS मध्ये वाहून नेण्यास सक्षम आहे आणि BACE1 पेप्टाइडच्या SA-संयुग्मित इनहिबिटरसह औषधीय प्रभाव देखील प्रेरित करतो.
(a) T7 फेजचे क्लोनल इंजेक्शन (2 × 10 फेज/प्राणी) जे कमीत कमी तीन CM-इंट्युबेटेड उंदरांमध्ये CSF पेप्टाइड #2077 (RLSSVDSDLSGC) आणि इंजेक्टेड नसलेल्या नियंत्रण फेज (#1779) चे दीर्घकालीन फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल दर्शविते. (b) फेज-इंजेक्टेड उंदरांमध्ये (2 × 10 10 फेज/प्राणी) प्रतिनिधी कॉर्टिकल मायक्रोव्हेसल्सची कॉन्फोकल सूक्ष्म प्रतिमा पेप्टाइड #2077 आणि रक्तवाहिन्यांचे (लेक्टिन) काउंटरस्टेनिंग दर्शविते. हे फेज क्लोन 3 उंदरांना देण्यात आले आणि परफ्यूजनपूर्वी 1 तासासाठी रक्ताभिसरण करू दिले. मेंदूंना T7 फेज कॅप्सिड विरुद्ध पॉलीक्लोनल FITC-लेबल केलेल्या अँटीबॉडीजने विभागण्यात आले आणि रंगवले गेले. परफ्यूजन आणि त्यानंतरच्या फिक्सेशनच्या दहा मिनिटे आधी, DyLight594-लेबल केलेले लेक्टिन अंतःशिराद्वारे देण्यात आले. केशिका आणि पेरीव्हस्कुलर ब्रेन टिश्यूच्या लुमेनमध्ये मायक्रोव्हेसल्स आणि फेजेस (हिरव्या) च्या ल्युमिनल बाजूचे लेक्टिन स्टेनिंग (लाल) दर्शविणारी फ्लोरोसेंट प्रतिमा. स्केल बार 10 µm शी संबंधित आहे. (c, d) बायोटिनिलेटेड BACE1 इनहिबिटरी पेप्टाइड एकट्याने किंवा बायोटिनिलेटेड ट्रान्झिट पेप्टाइड #2077 सह संयोजनात स्ट्रेप्टाव्हिडिनशी जोडले गेले आणि त्यानंतर किमान तीन कॅन्युलेटेड CM उंदरांचे इंट्राव्हेनस इंजेक्शन (10 मिग्रॅ स्ट्रेप्टाव्हिडिन/किग्रा) दिले गेले. BACE1 पेप्टाइड इनहिबिटर-मध्यस्थीने Aβ40 मध्ये घट Aβ1-40 ELISA द्वारे रक्त (लाल) आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (नारिंगी) मध्ये दर्शविलेल्या वेळेच्या बिंदूंवर मोजली गेली. चांगल्या स्पष्टतेसाठी, ग्राफवर 100% च्या स्केलवर एक ठिपकेदार रेषा काढली आहे. (c) 3:1 प्रमाणात ट्रान्झिट पेप्टाइड #2077 आणि BACE1 इनहिबिटरी पेप्टाइडशी जोडलेल्या स्ट्रेप्टाव्हिडिनने उपचार केलेल्या उंदरांमध्ये रक्तातील Aβ40 (लाल त्रिकोण) आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (नारिंगी त्रिकोण) मध्ये टक्केवारी घट. (d) फक्त BACE1 इनहिबिटरी पेप्टाइडशी जोडलेल्या स्ट्रेप्टाव्हिडिनने उपचार केलेल्या उंदरांच्या रक्तातील Aβ40 (लाल वर्तुळे) आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (नारिंगी वर्तुळे) मध्ये टक्केवारी घट. नियंत्रणात Aβ सांद्रता 420 pg/ml (मानक विचलन = 101 pg/ml) होती.
बायोमेडिकल संशोधनाच्या अनेक क्षेत्रांमध्ये फेज डिस्प्ले यशस्वीरित्या लागू केला गेला आहे17. ही पद्धत इन व्हिव्हो व्हॅस्क्युलर डायव्हर्सिटी स्टडीज18,19 तसेच सेरेब्रल व्हेसल्स20,21,22,23,24,25,26 ला लक्ष्य करणाऱ्या अभ्यासांसाठी वापरली गेली आहे. या अभ्यासात, आम्ही या निवड पद्धतीचा वापर केवळ सेरेब्रल व्हेसल्सना लक्ष्य करणाऱ्या पेप्टाइड्सच्या थेट ओळखीपर्यंतच नाही तर रक्त-मेंदू अडथळा ओलांडण्यासाठी सक्रिय वाहतूक गुणधर्म असलेल्या उमेदवारांच्या शोधापर्यंत देखील वाढवला आहे. आम्ही आता CM इंट्यूबेटेड उंदरांमध्ये इन व्हिव्हो निवड प्रक्रियेच्या विकासाचे वर्णन करतो आणि CSF होमिंग गुणधर्मांसह पेप्टाइड्स ओळखण्याची त्याची क्षमता प्रदर्शित करतो. 12-मेर रँडम पेप्टाइड्सची लायब्ररी प्रदर्शित करणाऱ्या T7 फेजचा वापर करून, आम्ही हे दाखवू शकलो की T7 फेज रक्त-मेंदू अडथळाशी जुळवून घेण्यासाठी पुरेसे लहान आहे (अंदाजे 60 nm व्यासाचा)10 आहे, ज्यामुळे थेट रक्त-मेंदू अडथळा किंवा कोरोइड प्लेक्सस ओलांडला जातो. आम्हाला आढळून आले की कॅन्युलेटेड सीएम उंदरांपासून सीएसएफ काढणे ही एक सु-नियंत्रित इन व्हिव्हो फंक्शनल स्क्रीनिंग पद्धत होती आणि काढलेला फेज केवळ रक्तवाहिन्यांशी जोडलेला नव्हता तर रक्त-मेंदूच्या अडथळ्यावर ट्रान्सपोर्टर म्हणून देखील काम करत होता. शिवाय, एकाच वेळी रक्त गोळा करून आणि सीएसएफ आणि रक्त-व्युत्पन्न फेजवर एचटीएस लागू करून, आम्ही पुष्टी केली की सीएसएफची आमची निवड रक्त समृद्धी किंवा निवडीच्या फेज दरम्यान विस्तारासाठी फिटनेसने प्रभावित झाली नाही. तथापि, रक्ताचा कंपार्टमेंट निवड प्रक्रियेचा एक भाग आहे, कारण सीएसएफ कंपार्टमेंटपर्यंत पोहोचण्यास सक्षम असलेले फेज मेंदूमध्ये स्वतःला समृद्ध करण्यासाठी पुरेसा काळ रक्तप्रवाहात टिकून राहावे आणि फिरावे. कच्च्या एचटीएस डेटामधून विश्वसनीय अनुक्रम माहिती काढण्यासाठी, आम्ही विश्लेषण कार्यप्रवाहात प्लॅटफॉर्म-विशिष्ट अनुक्रम त्रुटींशी जुळवून घेतलेले फिल्टर लागू केले. स्क्रीनिंग पद्धतीमध्ये गतिज पॅरामीटर्स समाविष्ट करून, आम्ही रक्तामध्ये वाइल्ड-टाइप टी7 फेज (t½ ~ 28 मिनिट) च्या जलद फार्माकोकाइनेटिक्सची पुष्टी केली24, 27, 28 आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये त्यांचे अर्ध-आयुष्य देखील निश्चित केले (t½ ~ 26 मिनिट) प्रति मिनिट). रक्त आणि CSF मध्ये समान फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल असूनही, CSF मध्ये फेजच्या रक्तातील एकाग्रतेच्या फक्त 0.001% शोधता आले, जे रक्त-मेंदूच्या अडथळ्या ओलांडून वाइल्ड-टाइप T7 फेजची कमी पार्श्वभूमी गतिशीलता दर्शवते. हे काम इन व्हिव्हो पॅनिंग स्ट्रॅटेजीज वापरताना निवडीच्या पहिल्या फेरीचे महत्त्व अधोरेखित करते, विशेषत: फेज सिस्टमसाठी जे रक्ताभिसरणातून वेगाने साफ केले जातात, कारण काही क्लोन CNS कंपार्टमेंटमध्ये पोहोचण्यास सक्षम असतात. अशा प्रकारे, पहिल्या फेरीत, लायब्ररी विविधतेतील घट खूप मोठी होती, कारण या अतिशय कठोर CSF मॉडेलमध्ये अखेर मर्यादित संख्येने क्लोन गोळा केले गेले. या इन व्हिव्हो पॅनिंग स्ट्रॅटेजीमध्ये CSF कंपार्टमेंटमध्ये सक्रिय संचय, रक्त कंपार्टमेंटमध्ये क्लोन जगणे आणि पहिल्या 10 मिनिटांत रक्तातून T7 फेज क्लोन जलद काढून टाकणे यासारख्या अनेक निवड चरणांचा समावेश होता (आकृती 1d आणि पूरक आकृती 4M). अशा प्रकारे, पहिल्या फेरीनंतर, CSF मध्ये वेगवेगळे फेज क्लोन ओळखले गेले, जरी वैयक्तिक प्राण्यांसाठी समान प्रारंभिक पूल वापरला गेला. यावरून असे सूचित होते की मोठ्या संख्येने ग्रंथालय सदस्य असलेल्या स्त्रोत ग्रंथालयांसाठी अनेक कठोर निवड चरणांमुळे विविधतेत लक्षणीय घट होते. म्हणून, यादृच्छिक घटना प्रारंभिक निवड प्रक्रियेचा एक अविभाज्य भाग बनतील, ज्यामुळे निकालावर मोठा परिणाम होईल. मूळ ग्रंथालयातील अनेक क्लोनमध्ये CSF समृद्धीची प्रवृत्ती खूप समान असण्याची शक्यता आहे. तथापि, समान प्रायोगिक परिस्थितीत देखील, प्रारंभिक पूलमध्ये प्रत्येक विशिष्ट क्लोनची संख्या कमी असल्याने निवड परिणाम भिन्न असू शकतात.
CSF मध्ये समृद्ध केलेले आकृतिबंध रक्तातील आकृत्यांपेक्षा वेगळे असतात. मनोरंजकपणे, आम्ही वैयक्तिक प्राण्यांच्या रक्तात ग्लाइसिन-समृद्ध पेप्टाइड्सकडे पहिला बदल लक्षात घेतला. (आकृती 1g, पूरक आकृती 4e, 4f). ग्लाइसिन पेप्टाइड्स असलेले फेज अधिक स्थिर असू शकतात आणि रक्ताभिसरणातून बाहेर काढण्याची शक्यता कमी असू शकते. तथापि, सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड नमुन्यांमध्ये हे ग्लाइसिन-समृद्ध पेप्टाइड्स आढळले नाहीत, जे सूचित करते की क्युरेटेड लायब्ररी दोन वेगवेगळ्या निवड चरणांमधून गेल्या: एक रक्तात आणि दुसरा सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये जमा होऊ दिला. निवडीच्या चौथ्या फेरीतून उद्भवणारे CSF-समृद्ध क्लोनची विस्तृत चाचणी घेण्यात आली आहे. जवळजवळ सर्व वैयक्तिकरित्या चाचणी केलेले क्लोन ब्लँक कंट्रोल फेजच्या तुलनेत CSF मध्ये समृद्ध असल्याची पुष्टी झाली. एका पेप्टाइड हिट (#2077) ची अधिक तपशीलवार तपासणी करण्यात आली. इतर हिटच्या तुलनेत त्याने जास्त प्लाझ्मा अर्ध-आयुष्य दर्शविले (आकृती 3d आणि पूरक आकृती 7), आणि मनोरंजकपणे, या पेप्टाइडमध्ये C-टर्मिनसवर सिस्टीन अवशेष होता. अलिकडेच असे दिसून आले आहे की पेप्टाइड्समध्ये सिस्टीनची भर घालल्याने अल्ब्युमिन २९ ला बांधून त्यांचे फार्माकोकाइनेटिक गुणधर्म सुधारू शकतात. पेप्टाइड #२०७७ साठी हे सध्या अज्ञात आहे आणि पुढील अभ्यासाची आवश्यकता आहे. काही पेप्टाइड्सनी CSF समृद्धीमध्ये व्हॅलेन्स-डिपेंडन्सी दर्शविली (डेटा दर्शविला नाही), जो T7 कॅप्सिडच्या प्रदर्शित पृष्ठभाग भूमितीशी संबंधित असू शकतो. आम्ही वापरलेल्या T7 प्रणालीमध्ये प्रत्येक पेप्टाइड प्रति फेज कणाच्या ५-१५ प्रती दर्शविल्या. उंदरांच्या सेरेब्रल कॉर्टेक्समध्ये अंतःप्रेरणाने इंजेक्शन दिलेल्या उमेदवार लीड फेज क्लोनवर IHC केले गेले (पूरक आकृती ८). डेटावरून असे दिसून आले की किमान तीन क्लोन (क्रमांक २००२, क्रमांक २००९ आणि क्रमांक २०७७) BBB शी संवाद साधतात. या BBB परस्परसंवादामुळे CSF जमा होतो की या क्लोनची थेट BCSFB कडे हालचाल होते हे निश्चित करणे बाकी आहे. महत्त्वाचे म्हणजे, आम्ही दाखवतो की निवडलेले पेप्टाइड्स संश्लेषित केल्यावर आणि प्रथिने कार्गोशी बांधले गेल्यावर त्यांची CSF वाहतूक क्षमता टिकवून ठेवतात. एन-टर्मिनल बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड्सचे SA ला बंधन मूलतः रक्त आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये त्यांच्या संबंधित फेज क्लोनसह प्राप्त झालेल्या परिणामांची पुनरावृत्ती करते (आकृती 3e). शेवटी, आम्ही दाखवतो की लीड पेप्टाइड #2077 SA ला संयुग्मित केलेल्या BACE1 च्या बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड इनहिबिटरच्या मेंदूच्या क्रियेस चालना देण्यास सक्षम आहे, ज्यामुळे CSF मध्ये Abeta40 पातळी लक्षणीयरीत्या कमी करून CNS मध्ये स्पष्ट फार्माकोडायनामिक प्रभाव निर्माण होतो (आकृती 4). सर्व हिट्सचा पेप्टाइड सीक्वेन्स होमोलोजी शोध करून आम्ही डेटाबेसमधील कोणतेही होमोलोग ओळखू शकलो नाही. हे लक्षात घेणे महत्त्वाचे आहे की T7 लायब्ररीचा आकार अंदाजे 109 आहे, तर 12-मेर्ससाठी सैद्धांतिक लायब्ररीचा आकार 4 x 1015 आहे. म्हणून, आम्ही 12-मेर्स पेप्टाइड लायब्ररीच्या विविधतेच्या जागेचा फक्त एक छोटासा अंश निवडला, ज्याचा अर्थ असा असू शकतो की या ओळखल्या गेलेल्या हिट्सच्या समीप अनुक्रम जागेचे मूल्यांकन करून अधिक ऑप्टिमाइझ केलेले पेप्टाइड्स ओळखले जाऊ शकतात. काल्पनिकदृष्ट्या, या पेप्टाइड्सचे कोणतेही नैसर्गिक समरूप आपल्याला का सापडले नाहीत याचे एक कारण म्हणजे उत्क्रांतीदरम्यान मेंदूमध्ये काही पेप्टाइड आकृतिबंधांच्या अनियंत्रित प्रवेशास प्रतिबंध करण्यासाठी निवड रद्द करणे.
एकत्रितपणे, आमचे निकाल सेरेब्रोव्हस्कुलर बॅरियर इन व्हिव्होच्या वाहतूक प्रणालींना अधिक तपशीलवार ओळखण्यासाठी आणि त्यांचे वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी भविष्यातील कामासाठी आधार प्रदान करतात. या पद्धतीची मूलभूत रचना एका कार्यात्मक निवड धोरणावर आधारित आहे जी केवळ सेरेब्रल व्हॅस्क्युलर बंधनकारक गुणधर्मांसह क्लोन ओळखत नाही तर एक महत्त्वपूर्ण पायरी देखील समाविष्ट करते ज्यामध्ये यशस्वी क्लोनमध्ये सीएनएस कंपार्टमेंटमध्ये जैविक अडथळे पार करण्यासाठी अंतर्गत क्रियाकलाप असतात. या पेप्टाइड्सच्या वाहतुकीची यंत्रणा आणि मेंदूच्या क्षेत्रासाठी विशिष्ट मायक्रोव्हस्क्युलेचरशी बंधनासाठी त्यांची पसंती स्पष्ट करणे. यामुळे बीबीबी आणि रिसेप्टर्सच्या वाहतुकीसाठी नवीन मार्गांचा शोध लागू शकतो. आम्हाला अपेक्षा आहे की ओळखले जाणारे पेप्टाइड्स थेट सेरेब्रोव्हस्कुलर रिसेप्टर्सशी किंवा बीबीबी किंवा बीसीएसएफबीद्वारे वाहून नेल्या जाणाऱ्या फिरत्या लिगँड्सशी बांधले जाऊ शकतात. या कामात सापडलेल्या सीएसएफ वाहतूक क्रियाकलाप असलेल्या पेप्टाइड वेक्टरची अधिक तपासणी केली जाईल. आम्ही सध्या बीबीबी आणि/किंवा बीसीएसएफबी ओलांडण्याच्या क्षमतेसाठी या पेप्टाइड्सच्या मेंदूच्या विशिष्टतेची तपासणी करत आहोत. हे नवीन पेप्टाइड्स नवीन रिसेप्टर्स किंवा मार्गांच्या संभाव्य शोधासाठी आणि मेंदूपर्यंत जैविक पदार्थांसारखे मॅक्रोमोलेक्यूल्स पोहोचवण्यासाठी नवीन अत्यंत कार्यक्षम प्लॅटफॉर्म विकसित करण्यासाठी अत्यंत मौल्यवान साधने असतील.
पूर्वी वर्णन केलेल्या पद्धतीत बदल करून मोठ्या सिस्टर्ना (सीएम) चे कॅन्युलेट करा. भूल दिलेल्या विस्टार उंदरांना (२००-३५० ग्रॅम) स्टिरिओटॅक्सिक उपकरणावर बसवण्यात आले आणि कवटी उघड करण्यासाठी शेव्ह केलेल्या आणि अ‍ॅसेप्टिकली तयार केलेल्या टाळूवर एक मध्यवर्ती चीरा बनवण्यात आला. वरच्या सॅशच्या भागात दोन छिद्रे ड्रिल करा आणि छिद्रांमध्ये फिक्सिंग स्क्रू बांधा. स्टेनलेस स्टील कॅन्युला सीएममध्ये स्टिरिओटॅक्टिक मार्गदर्शनासाठी पार्श्व ओसीपिटल क्रेस्टमध्ये एक अतिरिक्त छिद्र ड्रिल करण्यात आले. कॅन्युलाभोवती डेंटल सिमेंट लावा आणि स्क्रूने सुरक्षित करा. फोटो-क्युरिंग आणि सिमेंट कडक झाल्यानंतर, त्वचेची जखम ४/० सुपरमिड सिवनीने बंद करण्यात आली. सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (सीएसएफ) च्या उत्स्फूर्त गळतीमुळे कॅन्युलाचे योग्य स्थान निश्चित केले जाते. स्टिरिओटॅक्सिक उपकरणातून उंदराला काढून टाका, शस्त्रक्रियेनंतर योग्य काळजी आणि वेदना व्यवस्थापन मिळवा आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये रक्ताची चिन्हे दिसेपर्यंत किमान एक आठवडा बरे होऊ द्या. विस्टार उंदीर (Crl:WI/Han) हे चार्ल्स रिव्हर (फ्रान्स) येथून मिळवण्यात आले होते. सर्व उंदीर विशिष्ट रोगजनक-मुक्त परिस्थितीत ठेवण्यात आले होते. सर्व प्राण्यांवरील प्रयोग स्वित्झर्लंडमधील बासेल शहरातील पशुवैद्यकीय कार्यालयाने मंजूर केले होते आणि ते प्राणी परवाना क्रमांक २४७४ (उंदराच्या मेंदूतील सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड आणि उपचारात्मक उमेदवारांच्या पातळीचे मोजमाप करून सक्रिय मेंदू वाहतुकीचे मूल्यांकन) नुसार केले गेले.
CM कॅन्युला हातात घेऊन उंदराला हळूवारपणे जागृत ठेवा. कॅन्युलामधून डातुरा काढा आणि आपोआप वाहणारे १० μl सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड गोळा करा. कॅन्युला पेटेन्सी शेवटी धोक्यात आली असल्याने, या अभ्यासात फक्त रक्त दूषित होण्याचे किंवा रंग बदलण्याचे कोणतेही पुरावे नसलेले स्पष्ट सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड नमुने समाविष्ट केले गेले. त्याच वेळी, शेपटीच्या टोकावरील एका लहान चीरातून अंदाजे १०-२० μl रक्त हेपरिन (सिग्मा-अल्ड्रिच) असलेल्या नळ्यांमध्ये घेण्यात आले. T7 फेजच्या इंट्राव्हेनस इंजेक्शननंतर वेगवेगळ्या वेळी CSF आणि रक्त गोळा केले गेले. प्रत्येक CSF नमुना गोळा करण्यापूर्वी अंदाजे ५-१० μl द्रव टाकून देण्यात आला, जो कॅथेटरच्या मृत व्हॉल्यूमशी संबंधित आहे.
T7Select सिस्टीम मॅन्युअलमध्ये वर्णन केल्याप्रमाणे T7Select 10-3b वेक्टर वापरून लायब्ररी तयार केल्या गेल्या (नोव्हाजेन, रोझेनबर्ग आणि इतर, इननोव्हेशन्स 6, 1-6, 1996). थोडक्यात, एक यादृच्छिक 12-मेर डीएनए इन्सर्ट खालील स्वरूपात संश्लेषित केले गेले:
इन्सर्टमध्ये डबल स्टॉप कोडॉन आणि अमिनो अॅसिड ओव्हरएक्सप्रेशन टाळण्यासाठी NNK कोडॉनचा वापर करण्यात आला. N हा प्रत्येक न्यूक्लियोटाइडचा मॅन्युअली मिश्रित समतुल्य गुणोत्तर आहे आणि K हा अॅडेनाइन आणि सायटोसिन न्यूक्लियोटाइड्सचा मॅन्युअली मिश्रित समतुल्य गुणोत्तर आहे. क्लेनॉ बफर (न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स) मध्ये 37°C तापमानावर 3 तासांसाठी dNTP (नोव्हाजेन) आणि क्लेनॉ एन्झाइम (न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स) सह पुढील उष्मायनाद्वारे सिंगल स्ट्रँडेड प्रदेशांना डबल स्ट्रँडेड डीएनएमध्ये रूपांतरित केले गेले. अभिक्रियेनंतर, EtOH अवक्षेपणाने डबल-स्ट्रँडेड डीएनए पुनर्प्राप्त केला गेला. परिणामी डीएनए प्रतिबंधक एंजाइम EcoRI आणि HindIII (दोन्ही रोशेपासून) सह पचवण्यात आला. क्लीव्ह केलेले आणि शुद्ध केलेले (QIAquick, Qiagen) इन्सर्ट (T4 लिगेस, न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स) नंतर 10B कॅप्सिड जनुकाच्या अमिनो अॅसिड 348 नंतर फ्रेममध्ये प्री-क्लीव्हेड T7 वेक्टरमध्ये बंधनकारक केले गेले. इन विट्रो पॅकेजिंग करण्यापूर्वी १८ तासांसाठी लिगेशन रिअॅक्शन्स १६° सेल्सिअस तापमानावर इनक्युबेट करण्यात आल्या. T7Select 10-3b क्लोनिंग किट (नोव्हाजेन) सोबत दिलेल्या सूचनांनुसार इन विट्रोमध्ये फेज पॅकेजिंग करण्यात आले आणि एस्चेरिचिया कोलाई (BLT5615, नोव्हाजेन) वापरून पॅकेजिंग सोल्यूशन एकदा लिसिससाठी वाढवले ​​गेले. ग्लिसरॉलच्या स्टॉक सोल्यूशन म्हणून लायसेट्स -८०° सेल्सिअस तापमानावर सेंट्रीफ्यूज, टायट्रेटेड आणि गोठवले गेले.
प्रोप्रायटरी ४५४/रोशे-अ‍ॅम्प्लिकॉन फ्यूजन प्रायमर वापरून ब्रॉथ किंवा प्लेटमध्ये एम्प्लिफाय केलेल्या फेज व्हेरिएबल क्षेत्रांचे डायरेक्ट पीसीआर अॅम्प्लिफिकेशन. फॉरवर्ड फ्यूजन प्रायमरमध्ये व्हेरिएबल क्षेत्र (NNK) १२ (टेम्पलेट-विशिष्ट), GS FLX टायटॅनियम अॅडॉप्टर A आणि चार-बेस लायब्ररी की सिक्वेन्स (TCAG) (पूरक आकृती १a) यांच्याशी जोडलेले सीक्वेन्स असतात:
रिव्हर्स फ्यूजन प्राइमरमध्ये कॅप्चर बीड्सशी जोडलेले बायोटिन आणि इमल्शन पीसीआर दरम्यान क्लोनल अॅम्प्लिफिकेशनसाठी आवश्यक असलेले जीएस एफएलएक्स टायटॅनियम अॅडॉप्टर बी देखील असते:
त्यानंतर ४५४ GS-FLX टायटॅनियम प्रोटोकॉलनुसार अँप्लिकॉन्सवर ४५४/रोशे पायरोसेक्वेन्सिंग करण्यात आले. मॅन्युअल सेंगर सिक्वेन्सिंगसाठी (अप्लाइड बायोसिस्टम्स हिताची ३७३० xl डीएनए अॅनालायझर), T7 फेज डीएनए पीसीआर द्वारे अॅम्प्लीफाय केले गेले आणि खालील प्राइमर जोड्यांसह अनुक्रमित केले गेले:
रोश फास्ट स्टार्ट डीएनए पॉलिमरेज किट वापरून वैयक्तिक प्लेक्समधील इन्सर्ट पीसीआर अॅम्प्लिफिकेशनच्या अधीन करण्यात आले (निर्मात्याच्या सूचनांनुसार). हॉट स्टार्ट (९५ डिग्री सेल्सिअस तापमानावर १० मिनिटे) आणि ३५ बूस्ट सायकल (९५ डिग्री सेल्सिअस तापमानावर ५० सेकंद, ५० डिग्री सेल्सिअस तापमानावर १ मिनिट आणि ७२ डिग्री सेल्सिअस तापमानावर १ मिनिट) करा.
लायब्ररीमधून फेज, वाइल्ड-टाइप फेज, CSF आणि रक्तातून वाचवलेले फेज किंवा वैयक्तिक क्लोन एस्चेरिचिया कोलाई BL5615 मध्ये टीबी ब्रॉथ (सिग्मा अल्ड्रिक) मध्ये किंवा 500 सेमी 2 डिशमध्ये (थर्मो सायंटिफिक) 37°C वर 4 तासांसाठी वाढवले ​​गेले. प्लेट्स ट्रिस-ईडीटीए बफर (फ्लुका अॅनालिटिकल) ने धुवून किंवा स्टेरलाइज पिपेट टिप्सने प्लेक्स गोळा करून प्लेट्समधून फेज काढले गेले. पॉलीथिलीन ग्लायकॉल (PEG 8000) प्रक्षेपण (प्रोमेगा) च्या एका फेरीने कल्चर सुपरनॅटंट किंवा एक्स्ट्रॅक्शन बफरमधून फेज वेगळे केले गेले आणि ट्रिस-ईडीटीए बफरमध्ये पुन्हा सस्पेंड केले गेले.
इंट्राव्हेनस (IV) इंजेक्शन (५०० μl/प्राणी) देण्यापूर्वी एंडोटॉक्सिन रिमूव्हल बीड्स (मिल्टेनी बायोटेक) वापरून एंडोटॉक्सिन काढण्याच्या २-३ फेऱ्या अॅम्प्लीफायड फेजला करण्यात आल्या. पहिल्या फेरीत, २×१०१२ फेज सादर करण्यात आले; दुसऱ्या फेरीत, २×१०१० फेज; तिसऱ्या आणि चौथ्या निवड फेरीत, प्रति प्राणी २×१०९ फेज. CSF आणि रक्ताच्या नमुन्यांमधील फेजचे प्रमाण उत्पादकाच्या सूचनांनुसार (T7Select सिस्टम मॅन्युअल) प्लेक मोजणीद्वारे निश्चित केले गेले. फेज निवड शेपटीच्या शिरामध्ये शुद्ध लायब्ररीच्या इंट्राव्हेनस इंजेक्शनद्वारे किंवा मागील निवड फेरीतून CSF मधून काढलेल्या फेजचे पुन्हा इंजेक्शन देऊन केली गेली आणि त्यानंतरची कापणी अनुक्रमे १० मिनिटे, ३० मिनिटे, ६० मिनिटे, ९० मिनिटे, १२० मिनिटे, १८० मिनिटे आणि २४० मिनिटांनी CSF आणि रक्ताच्या नमुन्यांवर करण्यात आली. इन व्हिव्हो पॅनिंगच्या एकूण चार फेऱ्या घेण्यात आल्या ज्यामध्ये निवडीच्या पहिल्या तीन फेऱ्यांमध्ये दोन निवडलेल्या शाखा स्वतंत्रपणे संग्रहित आणि विश्लेषण करण्यात आल्या. निवडीच्या पहिल्या दोन फेऱ्यांमधून CSF मधून काढलेले सर्व फेज इन्सर्ट 454/रोचे पायरोसेक्वेन्सिंगच्या अधीन होते, तर निवडीच्या शेवटच्या दोन फेऱ्यांमधून CSF मधून काढलेले सर्व क्लोन मॅन्युअली सीक्वेन्सिंगच्या अधीन होते. निवडीच्या पहिल्या फेरीतील सर्व रक्त फेज देखील 454/रोचे पायरोसेक्वेन्सिंगच्या अधीन होते. फेज क्लोनच्या इंजेक्शनसाठी, निवडलेल्या फेजना E. coli (BL5615) मध्ये 500 cm2 प्लेट्सवर 37°C वर 4 तासांसाठी प्रवर्धित केले गेले. वैयक्तिकरित्या निवडलेले आणि मॅन्युअली सीक्वेन्स केलेले क्लोन क्षयरोग माध्यमात प्रसारित केले गेले. फेज काढल्यानंतर, शुद्धीकरण आणि एंडोटॉक्सिन काढून टाकल्यानंतर (वर वर्णन केल्याप्रमाणे), 300 μl मध्ये 2×1010 फेज/प्राणी एका शेपटीच्या शिरामध्ये इंट्राव्हेनस इंजेक्ट केले गेले.
अनुक्रम डेटाचे पूर्व-प्रक्रिया आणि गुणात्मक फिल्टरिंग. विक्रेता सॉफ्टवेअर वापरून रॉ 454/रोश डेटा बायनरी स्टँडर्ड स्ट्रीम मॅप फॉरमॅट (sff) मधून पिअर्सन ह्यूमन रीडेबल फॉरमॅट (फास्टा) मध्ये रूपांतरित करण्यात आला. खाली वर्णन केल्याप्रमाणे प्रोप्रायटरी सी प्रोग्राम्स आणि स्क्रिप्ट्स (अप्रकाशित सॉफ्टवेअर पॅकेज) वापरून न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमाची पुढील प्रक्रिया करण्यात आली. प्राथमिक डेटाच्या विश्लेषणामध्ये कठोर मल्टी-स्टेज फिल्टरिंग प्रक्रिया समाविष्ट आहेत. वैध 12mer इन्सर्ट डीएनए अनुक्रम नसलेले वाचन फिल्टर करण्यासाठी, जागतिक नीडलमन-वुनश चाचणी वापरून वाचनांना प्रारंभ लेबल (GTGATGTCGGGATCCGAATTCT), स्टॉप लेबल (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) आणि पार्श्वभूमी घाला (CCCTGCAGGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGTCGTCG) वर अनुक्रमिकरित्या संरेखित केले गेले. संरेखन प्रति संरेखन 31 पर्यंत 2 विसंगतींना अनुमती देते. म्हणून, प्रारंभ आणि थांबा टॅगशिवाय वाचन आणि पार्श्वभूमी घाला असलेले वाचन, म्हणजेच, अनुमत संख्येपेक्षा जास्त जुळणारे संरेखन, लायब्ररीमधून काढून टाकण्यात आले. उर्वरित वाचनांबद्दल, प्रारंभ चिन्हापासून सुरू होणारा आणि स्टॉप मार्क मूळ वाचन क्रमातून काढून टाकण्यापूर्वी संपणारा N-mer DNA क्रम (इन्सर्ट) पुढे प्रक्रिया केला जातो (यापुढे "इन्सर्ट" म्हणून संदर्भित). इन्सर्टचे भाषांतर केल्यानंतर, प्राइमरच्या 5′ टोकावरील पहिल्या स्टॉप कोडॉन नंतरचा भाग इन्सर्टमधून काढून टाकला जातो. याव्यतिरिक्त, प्राइमरच्या 3′ टोकावरील अपूर्ण कोडॉनकडे नेणारे न्यूक्लियोटाइड देखील काढून टाकण्यात आले. फक्त पार्श्वभूमी अनुक्रम असलेले इन्सर्ट वगळण्यासाठी, अमिनो आम्ल नमुना "PAG" ने सुरू होणारे भाषांतरित इन्सर्ट देखील काढून टाकण्यात आले. लायब्ररीमधून 3 पेक्षा कमी अमिनो आम्लांच्या पोस्ट-ट्रान्सलेशनल लांबीचे पेप्टाइड्स काढून टाकण्यात आले. शेवटी, इन्सर्ट पूलमधील रिडंडन्सी काढून टाका आणि प्रत्येक अद्वितीय इन्सर्टची वारंवारता निश्चित करा. या विश्लेषणाच्या निकालांमध्ये न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम (इन्सर्ट) आणि त्यांच्या (वाचलेल्या) फ्रिक्वेन्सीची यादी समाविष्ट होती (पूरक आकृती 1c आणि 2).
अनुक्रम समानतेनुसार गट N-mer DNA इन्सर्ट: 454/रोश-विशिष्ट अनुक्रम त्रुटी (जसे की अनुक्रम होमोपॉलिमर विस्तारांमधील समस्या) दूर करण्यासाठी आणि कमी महत्त्वाच्या रिडंडन्सी दूर करण्यासाठी, पूर्वी फिल्टर केलेले N-mer DNA सिक्वेन्स इन्सर्ट (इन्सर्ट) समानतेनुसार क्रमवारी लावले जातात. खालीलप्रमाणे परिभाषित केलेल्या पुनरावृत्ती अल्गोरिदमचा वापर करून इन्सर्टेशन (2 न जुळणाऱ्या बेसपर्यंत परवानगी आहे): इन्सर्टेशन प्रथम त्यांच्या वारंवारतेनुसार (सर्वात उच्च ते सर्वात कमी) क्रमवारी लावले जातात आणि जर ते समान असतील तर त्यांच्या दुय्यम क्रमवारीनुसार लांबीनुसार (सर्वात लांब ते सर्वात लहान) क्रमवारी लावले जातात. अशा प्रकारे, सर्वात वारंवार आणि सर्वात लांब इन्सर्टेशन पहिल्या "गट" ला परिभाषित करतात. गट वारंवारता की फ्रिक्वेन्सीवर सेट केली जाते. नंतर, क्रमवारी केलेल्या यादीत उर्वरित प्रत्येक इन्सर्टेशन पेअरवाइज नीडलमन-वन्श अलाइनमेंटद्वारे गटात जोडण्याचा प्रयत्न केला गेला. जर अलाइनमेंटमध्ये जुळत नसलेली, इन्सर्टेशन किंवा डिलीशनची संख्या 2 च्या थ्रेशोल्डपेक्षा जास्त नसेल, तर गटात एक इन्सर्टेशन जोडला जातो आणि एकूण गट वारंवारता किती वेळा इन्सर्टेशन जोडली गेली याने वाढवली जाते. गटात जोडलेले इन्सर्ट वापरलेले म्हणून चिन्हांकित केले जातात आणि पुढील प्रक्रियेतून वगळले जातात. जर इन्सर्ट सीक्वेन्स आधीच अस्तित्वात असलेल्या ग्रुपमध्ये जोडता येत नसेल, तर इन्सर्ट सीक्वेन्सचा वापर योग्य इन्सर्ट फ्रिक्वेन्सीसह एक नवीन ग्रुप तयार करण्यासाठी केला जातो आणि वापरला म्हणून चिन्हांकित केला जातो. जेव्हा प्रत्येक इन्सर्ट सीक्वेन्स एकतर नवीन ग्रुप तयार करण्यासाठी वापरला जातो किंवा आधीच अस्तित्वात असलेल्या ग्रुपमध्ये समाविष्ट केला जाऊ शकतो तेव्हा पुनरावृत्ती संपते. शेवटी, न्यूक्लियोटाइड्स असलेले ग्रुप केलेले इन्सर्ट अखेर पेप्टाइड सीक्वेन्समध्ये (पेप्टाइड लायब्ररी) रूपांतरित केले जातात. या विश्लेषणाचा परिणाम म्हणजे इन्सर्टेशनचा संच आणि त्यांच्या संबंधित फ्रिक्वेन्सीज ज्या सलग रीड्सची संख्या बनवतात (पूरक आकृती 2).
मोटिफ जनरेशन: अद्वितीय पेप्टाइड्सच्या यादीवर आधारित, खाली दर्शविल्याप्रमाणे सर्व संभाव्य अमीनो आम्ल नमुने (aa) असलेली एक लायब्ररी तयार करण्यात आली. लांबी 3 चा प्रत्येक संभाव्य नमुना पेप्टाइडमधून काढला गेला आणि त्याचा उलटा नमुना सर्व नमुने (ट्रिपेप्टाइड्स) असलेल्या सामान्य मोटिफ लायब्ररीसह जोडला गेला. अत्यंत पुनरावृत्ती होणाऱ्या मोटिफ्सच्या लायब्ररी अनुक्रमित केल्या गेल्या आणि रिडंडंसी काढून टाकल्या गेल्या. त्यानंतर, मोटिफ लायब्ररीमधील प्रत्येक ट्रायपेप्टाइडसाठी, आम्ही संगणकीय साधनांचा वापर करून लायब्ररीमध्ये त्याची उपस्थिती तपासली. या प्रकरणात, आढळलेल्या मोटिफ ट्रायपेप्टाइड असलेल्या पेप्टाइडची वारंवारता जोडली जाते आणि मोटिफ लायब्ररीमधील मोटिफला नियुक्त केली जाते ("मोटिफ्सची संख्या"). मोटिफ जनरेशनचा परिणाम म्हणजे ट्रायपेप्टाइड्स (मोटिफ्स) च्या सर्व घटना आणि त्यांची संबंधित मूल्ये असलेली एक द्विमितीय अॅरे असते, जी अनुक्रमित वाचनांची संख्या असते जी वाचन फिल्टर, गटबद्ध आणि भाषांतरित केल्यावर संबंधित मोटिफमध्ये परिणाम करते. वर तपशीलवार वर्णन केल्याप्रमाणे मेट्रिक्स.
आकृतिबंधांची संख्या आणि संबंधित स्कॅटरप्लॉट्सचे सामान्यीकरण: प्रत्येक नमुन्यासाठी आकृतिबंधांची संख्या वापरून सामान्यीकृत केली गेली
जिथे ni हा विषय i असलेल्या वाचनांची संख्या आहे. अशाप्रकारे, vi हा नमुन्यातील आकृतिबंध i असलेल्या वाचनांची (किंवा पेप्टाइड्स) टक्केवारी वारंवारता दर्शवतो. सामान्यीकृत नसलेल्या आकृतिबंधांसाठी P-मूल्ये फिशरच्या अचूक चाचणीचा वापर करून मोजली गेली. हेतूंच्या संख्येच्या सहसंबंधांबद्दल, स्पीअरमनचे सहसंबंध R सह सामान्यीकृत आकृतिबंधांची संख्या वापरून मोजले गेले.
पेप्टाइड लायब्ररीमध्ये प्रत्येक स्थानावर अमीनो आम्लांची सामग्री पाहण्यासाठी, वेब लोगोग्राम 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) तयार केले गेले. प्रथम, 12-मेर पेप्टाइडच्या प्रत्येक स्थानावर अमीनो आम्लांची सामग्री 20×12 मॅट्रिक्समध्ये संग्रहित केली जाते. त्यानंतर, प्रत्येक स्थानावर समान सापेक्ष अमीनो आम्ल सामग्री असलेले 1000 पेप्टाइड्सचा संच फास्टा-सिक्वेन्स स्वरूपात तयार केला जातो आणि वेब-लोगो 3 मध्ये इनपुट म्हणून प्रदान केला जातो, जो प्रत्येक स्थानावर सापेक्ष अमीनो आम्ल सामग्रीचे ग्राफिकल प्रतिनिधित्व तयार करतो. दिलेल्या पेप्टाइड लायब्ररीसाठी. बहुआयामी डेटासेट्सची कल्पना करण्यासाठी, R मध्ये अंतर्गत विकसित साधन (बायोसहीटमॅप, अद्याप रिलीज न झालेले R पॅकेज) वापरून उष्णता नकाशे तयार केले गेले. उष्णतेच्या नकाशांमध्ये सादर केलेले डेंड्रोग्राम युक्लिडियन अंतर मेट्रिकसह वॉर्डच्या श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग पद्धतीचा वापर करून मोजले गेले. मोटिफ स्कोअरिंग डेटाच्या सांख्यिकीय विश्लेषणासाठी, फिशरच्या अचूक चाचणीचा वापर करून असामान्य स्कोअरिंगसाठी P मूल्ये मोजली गेली. इतर डेटासेटसाठी P-मूल्ये विद्यार्थ्यांच्या टी-टेस्ट किंवा ANOVA वापरून R मध्ये मोजली गेली.
निवडलेले फेज क्लोन आणि इन्सर्टशिवाय फेज शेपटीच्या शिराद्वारे (३०० μl PBS मध्ये २×१०१० फेज/प्राणी) अंतःशिराद्वारे इंजेक्शनने इंजेक्शनने दिले गेले. परफ्यूजन आणि त्यानंतरच्या फिक्सेशनच्या दहा मिनिटे आधी, त्याच प्राण्यांना १०० μl DyLight594-लेबल केलेले लेक्टिन (व्हेक्टर लॅबोरेटरीज इंक., DL-1177) इंजेक्शनने इंजेक्शनने दिले गेले. फेज इंजेक्शननंतर ६० मिनिटांनी, उंदरांना हृदयातून ५० मिली PBS आणि त्यानंतर ५० मिली ४% PFA/PBS परफ्यूज केले गेले. मेंदूचे नमुने ४% PFA/PBS मध्ये रात्रभर निश्चित केले गेले आणि ४°C तापमानावर ३०% सुक्रोजमध्ये रात्रभर भिजवले गेले. नमुने OCT मिश्रणात फ्लॅश फ्रोझन केले जातात. गोठवलेल्या नमुन्यांचे इम्युनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण खोलीच्या तपमानावर १% BSA ने ब्लॉक केलेल्या ३० µm क्रायोसेक्शनवर केले गेले आणि ४ °C तापमानावर T7 फेज (नोव्हस NB 600-376A) विरुद्ध पॉलीक्लोनल FITC-लेबल असलेल्या अँटीबॉडीजने उबवले गेले. रात्रभर उबवले गेले. शेवटी, विभाग PBS ने ३ वेळा धुतले गेले आणि कॉन्फोकल लेसर मायक्रोस्कोप (Leica TCS SP5) ने तपासले गेले.
९८% च्या किमान शुद्धतेसह सर्व पेप्टाइड्स जेनस्क्रिप्ट यूएसए द्वारे संश्लेषित केले गेले, बायोटिनिलेटेड आणि लायोफिलाइज्ड केले गेले. बायोटिन एन-टर्मिनसवर अतिरिक्त ट्रिपल ग्लाइसिन स्पेसरद्वारे बांधले जाते. मास स्पेक्ट्रोमेट्री वापरून सर्व पेप्टाइड्स तपासा.
स्ट्रेप्टाव्हिडिन (सिग्मा S0677) हे बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड, बायोटिनिलेटेड BACE1 इनहिबिटरी पेप्टाइड किंवा बायोटिनिलेटेड BACE1 इनहिबिटरी पेप्टाइड आणि BACE1 इनहिबिटरी पेप्टाइडच्या संयोजनात (3:1 गुणोत्तर) 5-10% DMSO/PBS मध्ये इनक्युबेटेडमध्ये मिसळले गेले. इंजेक्शन देण्यापूर्वी खोलीच्या तपमानावर 1 तास. स्ट्रेप्टाव्हिडिन-कंजुगेटेड पेप्टाइड्स मेंदूच्या पोकळी असलेल्या उंदरांच्या शेपटीच्या एका शिरामध्ये 10 mg/kg च्या डोसवर अंतःशिराद्वारे इंजेक्ट केले गेले.
स्ट्रेप्टाव्हिडिन-पेप्टाइड कॉम्प्लेक्सची एकाग्रता ELISA द्वारे मूल्यांकन करण्यात आली. Nunc Maxisorp मायक्रोटायटर प्लेट्स (सिग्मा) रात्रभर ४°C वर १.५ μg/ml माऊस अँटी-स्ट्रेप्टाव्हिडिन अँटीबॉडी (थर्मो, MA1-20011) सह लेपित केल्या गेल्या. ब्लॉकिंग केल्यानंतर (ब्लॉकिंग बफर: १४० nM NaCL, ५ mM EDTA, ०.०५% NP40, ०.२५% जिलेटिन, १% BSA) खोलीच्या तपमानावर २ तासांसाठी, प्लेट ०.०५% ट्वीन-२०/PBS (वॉश बफर) ने ३ सेकंदांसाठी धुवा, CSF आणि प्लाझ्मा नमुने ब्लॉकिंग बफरने पातळ केलेल्या विहिरींमध्ये जोडले गेले (प्लाझ्मा १:१०,०००, CSF १:११५). त्यानंतर प्लेट ४°C वर डिटेक्शन अँटीबॉडी (१ μg/ml, अँटी-स्ट्रेप्टाव्हिडिन-HRP, नोव्हस NB120-7239) सह रात्रभर इनक्युबेट केली गेली. तीन धुण्याच्या टप्प्यांनंतर, TMB सब्सट्रेट सोल्युशन (रोशे) मध्ये २० मिनिटांपर्यंत उष्मायन करून स्ट्रेप्टाव्हिडिन आढळून आले. १M H2SO4 सह रंग विकास थांबवल्यानंतर, ४५० nm वर शोषण मोजा.
स्ट्रेप्टाव्हिडिन-पेप्टाइड-BACE1 इनहिबिटर कॉम्प्लेक्सचे कार्य उत्पादकाच्या प्रोटोकॉल (वाको, 294-64701) नुसार Aβ(1-40) ELISA द्वारे मूल्यांकन केले गेले. थोडक्यात, CSF नमुने मानक डायल्युएंट (1:23) मध्ये पातळ केले गेले आणि BNT77 कॅप्चर अँटीबॉडीने लेपित 96-वेल प्लेट्समध्ये 4°C वर रात्रभर उबवले गेले. पाच वॉशिंग चरणांनंतर, HRP-कंज्युगेटेड BA27 अँटीबॉडी जोडण्यात आली आणि 4°C वर 2 तास उबवले गेले, त्यानंतर पाच वॉशिंग चरणे. खोलीच्या तपमानावर 30 मिनिटांसाठी TMB द्रावणात उबवले गेल्याने Aβ(1–40) आढळले. स्टॉप सोल्यूशनने रंग विकास थांबवल्यानंतर, 450 nm वर शोषण मोजा. Aβ(1–40) ELISA करण्यापूर्वी प्लाझ्मा नमुन्यांवर सॉलिड फेज एक्सट्रॅक्शन केले गेले. प्लाझ्मा 96-वेल प्लेट्समध्ये 0.2% DEA (सिग्मा) मध्ये जोडण्यात आला आणि 30 मिनिटांसाठी खोलीच्या तपमानावर उबवले गेले. SPE प्लेट्स (ओएसिस, १८६०००६७९) पाण्याने आणि १००% मिथेनॉलने सलग धुतल्यानंतर, प्लाझ्मा नमुने SPE प्लेट्समध्ये जोडले गेले आणि सर्व द्रव काढून टाकण्यात आले. नमुने धुतले गेले (प्रथम ५% मिथेनॉलने नंतर ३०% मिथेनॉलने) आणि २% NH4OH/९०% मिथेनॉलने एल्युएट केले गेले. स्थिर N2 करंटवर ५५°C वर ९९ मिनिटे एल्युएट सुकवल्यानंतर, नमुने मानक डायल्युएंट्समध्ये कमी केले गेले आणि वर वर्णन केल्याप्रमाणे Aβ(१–४०) मोजले गेले.
हा लेख कसा उद्धृत करायचा: युरिच, ई. आणि इतर. व्हिव्होमध्ये ओळखल्या जाणाऱ्या ट्रान्झिट पेप्टाइड्सचा वापर करून मेंदूला कार्गो डिलिव्हरी. द सायन्स. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
लिखोटा जे., स्कजोरिंग टी., थॉमसेन एलबी आणि मूस टी. लक्ष्यित थेरपी वापरून मेंदूपर्यंत मॅक्रोमोलेक्युलर औषधांची डिलिव्हरी. जर्नल ऑफ न्यूरोकेमिस्ट्री ११३, १–१३, १०.११११/जे.१४७१-४१५९.२००९.०६५४४.x (२०१०).
ब्रास्न्जेविक, आय., स्टाइनबुश, एचडब्ल्यू, श्मिट्झ, सी., आणि मार्टिनेझ-मार्टिनेझ, पी. रक्त-मेंदूच्या अडथळ्या ओलांडून पेप्टाइड आणि प्रथिने औषधांची डिलिव्हरी. प्रोग न्यूरोबायोल 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
पारड्रिज, डब्ल्यूएम रक्त-मेंदू अडथळा: मेंदूच्या औषध विकासातील एक अडथळा. न्यूरोआरएक्स 2, 3–14, 10.1602/न्यूरोरएक्स.2.1.3 (2005).
जोहानसन, केई, डंकन, जेए, स्टोपा, ईजी, आणि बायर्ड, ए. कोरोइड प्लेक्सस-सीएसएफ मार्गाद्वारे मेंदूला औषध वितरण आणि लक्ष्यीकरण सुधारण्याची शक्यता. फार्मास्युटिकल रिसर्च 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
पारड्रिज, डब्ल्यूएम मेंदूच्या वितरणासाठी आण्विक ट्रोजन हॉर्ससह बायोफार्मास्युटिकल्सचे आधुनिकीकरण. बायोकॉनजग केम 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
रक्त-मेंदूच्या अडथळ्यामधून पारड्रिज, डब्ल्यूएम रिसेप्टर-मध्यस्थ पेप्टाइड वाहतूक. एंडोक्र रेव्ह. ७, ३१४–३३० (१९८६).
निवोहनर, जे. आणि इतर. मोनोव्हॅलेंट आण्विक शटल वापरून मेंदूत प्रवेश आणि उपचारात्मक अँटीबॉडीजची कार्यक्षमता वाढवा. न्यूरॉन 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
बिएन-ली, एन. आणि इतर. ट्रान्सफरिन रिसेप्टर (टीएफआर) वाहतूक मेंदूद्वारे टीएफआर अँटीबॉडीजच्या अ‍ॅफिनिटी प्रकारांचे शोषण निश्चित करते. जे एक्सप मेड २११, २३३–२४४, १०.१०८४/जेएम.२०१३१६६० (२०१४).