Nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही मर्यादित CSS समर्थनासह ब्राउझरची आवृत्ती वापरत आहात. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही शिफारस करतो की तुम्ही अद्ययावत ब्राउझर वापरा (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये कॉम्पॅटिबिलिटी मोड अक्षम करा). याव्यतिरिक्त, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, आम्ही ही साइट स्टाईल्स आणि जावास्क्रिप्टशिवाय दाखवतो.
एकाच वेळी तीन स्लाईड्सचा कॅरोसेल दाखवतो. एका वेळी तीन स्लाईड्स पुढे जाण्यासाठी 'मागील' आणि 'पुढील' बटणे वापरा, किंवा एका वेळी तीन स्लाईड्स पुढे जाण्यासाठी शेवटी असलेली स्लायडर बटणे वापरा.
रक्त-मेंदू अडथळा (ब्लड-ब्रेन बॅरियर) जैविक उपचारात्मक घटकांना (बायोथेरप्युटिक एजंट्स) केंद्रीय मज्जासंस्थेतील त्यांच्या लक्ष्यांपर्यंत पोहोचण्यापासून रोखतो, ज्यामुळे मज्जासंस्थेच्या रोगांवर प्रभावी उपचारात अडथळा येतो. सजीवांमध्ये (इन विवो) नवीन मेंदू वाहक (ब्रेन ट्रान्सपोर्टर्स) शोधण्यासाठी, आम्ही T7 फेज पेप्टाइड लायब्ररी सादर केली आणि कॅन्युलेटेड कॉन्शियस लार्ज पूल मॉडेलच्या साहाय्याने अनुक्रमे रक्त आणि मस्तिष्का मेरुद्रव (CSF) गोळा केले. निवडीच्या चार फेऱ्यांनंतर, विशिष्ट फेज क्लोन्स मस्तिष्का मेरुद्रवामध्ये मोठ्या प्रमाणात आढळले. वैयक्तिक उमेदवार पेप्टाइड्सच्या चाचणीतून मस्तिष्का मेरुद्रवामध्ये १००० पटींहून अधिक वाढ दिसून आली. ओळखल्या गेलेल्या नवीन ट्रान्झिट पेप्टाइडला जोडलेल्या BACE1 पेप्टाइड इनहिबिटरचा वापर करून मस्तिष्का मेरुद्रवातील अमायलॉइड-β च्या पातळीत ४०% घट झाल्याने, मेंदूपर्यंत पेप्टाइड-मध्यस्थी वितरणाची जैविक क्रियाशीलता सिद्ध झाली. हे परिणाम सूचित करतात की सजीवांमध्ये (इन विवो) फेज निवड पद्धतींद्वारे ओळखले गेलेले पेप्टाइड्स, उपचारात्मक परिणामासह मेंदूपर्यंत मॅक्रोमोलेक्यूल्सच्या प्रणालीगत वितरणासाठी उपयुक्त वाहक ठरू शकतात.
केंद्रीय मज्जासंस्थेवर (CNS) लक्ष्यित उपचार पद्धतींवरील संशोधनाने आतापर्यंत मुख्यत्वेकरून CNS-लक्ष्यित गुणधर्म दर्शविणारी अनुकूलित औषधे आणि घटक ओळखण्यावर लक्ष केंद्रित केले आहे, तर मेंदूपर्यंत सक्रिय औषध वितरणास चालना देणाऱ्या यंत्रणा शोधण्यावर कमी प्रयत्न झाले आहेत. आता यात बदल होऊ लागला आहे, कारण औषध वितरण, विशेषतः मोठ्या रेणूंचे (large molecules), हे आधुनिक न्यूरोसायन्स औषध विकासाचा एक अविभाज्य भाग बनले आहे. केंद्रीय मज्जासंस्थेचे वातावरण सेरेब्रोव्हॅस्क्युलर बॅरियर सिस्टीमद्वारे (cerebrovascular barrier system) चांगल्या प्रकारे संरक्षित असते, ज्यात ब्लड-ब्रेन बॅरियर (BBB) ​​आणि ब्लड-ब्रेन बॅरियर (BCBB)¹ यांचा समावेश होतो, ज्यामुळे मेंदूपर्यंत औषधे पोहोचवणे आव्हानात्मक बनते¹,². असा अंदाज आहे की जवळजवळ सर्व मोठ्या रेणूंची औषधे आणि ९८% पेक्षा जास्त लहान रेणूंची औषधे मेंदूतून बाहेर टाकली जातात³. म्हणूनच, CNS पर्यंत उपचारात्मक औषधांचे कार्यक्षम आणि विशिष्ट वितरण करणाऱ्या नवीन मेंदू परिवहन प्रणाली ओळखणे खूप महत्त्वाचे आहे⁴,⁵. तथापि, BBB आणि BCSFB हे औषध वितरणासाठी एक उत्कृष्ट संधी देखील देतात, कारण ते मेंदूच्या विस्तृत रक्तवाहिन्यांच्या जाळ्याद्वारे त्याच्या सर्व संरचनांमध्ये प्रवेश करतात. अशाप्रकारे, मेंदूमध्ये औषध पोहोचवण्यासाठी बिन-आक्रमक पद्धती वापरण्याचे सध्याचे प्रयत्न हे मुख्यत्वे अंतर्जात BBB6 रिसेप्टर वापरून रिसेप्टर-मध्यस्थ वाहतुकीच्या (PMT) यंत्रणेवर आधारित आहेत. ट्रान्सफेरिन रिसेप्टर मार्गाचा वापर करून अलीकडील महत्त्वाच्या प्रगती असूनही7,8, सुधारित गुणधर्मांसह नवीन वितरण प्रणालींचा पुढील विकास आवश्यक आहे. या उद्देशाने, CSF वाहतूक करण्यास सक्षम असलेले पेप्टाइड्स ओळखणे हे आमचे ध्येय होते, कारण तत्त्वतः त्यांचा उपयोग CNS मध्ये मॅक्रोमोलेक्यूल्स पोहोचवण्यासाठी किंवा नवीन रिसेप्टर मार्ग उघडण्यासाठी केला जाऊ शकतो. विशेषतः, सेरेब्रोव्हस्क्युलर प्रणालीचे विशिष्ट रिसेप्टर्स आणि ट्रान्सपोर्टर्स (BBB आणि BSCFB) हे बायोथेरप्युटिक औषधांच्या सक्रिय आणि विशिष्ट वितरणासाठी संभाव्य लक्ष्य म्हणून काम करू शकतात. सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) हे कोरोइड प्लेक्ससचे (CS) एक स्रावी उत्पादन आहे आणि ते सबॲरॅक्नॉइड स्पेस आणि व्हेंट्रिक्युलर स्पेसद्वारे मेंदूच्या इंटरस्टिशियल फ्लुइडच्या थेट संपर्कात असते4. अलीकडे असे दिसून आले आहे की सबॲरॅक्नॉइड सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड मेंदूच्या इंटरस्टिशियममध्ये अत्याधिक प्रमाणात पसरते9. या सबॲरॅक्नॉइड इनफ्लो ट्रॅक्टचा वापर करून किंवा थेट BBB मार्फत पॅरेनकायमल स्पेसमध्ये प्रवेश करण्याची आमची आशा आहे. हे साध्य करण्यासाठी, आम्ही एक मजबूत इन व्हिवो फेज निवड धोरण राबवले, जे आदर्शपणे या दोन भिन्न मार्गांपैकी कोणत्याही एका मार्गाने वाहतूक होणाऱ्या पेप्टाइड्सना ओळखते.
आम्ही आता CSF सॅम्पलिंगसह एक अनुक्रमिक इन व्हिवो फेज डिस्प्ले स्क्रीनिंग पद्धत सादर करत आहोत, जी उच्च थ्रूपुट सिक्वेन्सिंग (HTS) द्वारे सर्वोच्च लायब्ररी विविधतेसह प्रारंभिक निवड फेऱ्यांचे निरीक्षण करते. रक्ताचा संसर्ग टाळण्यासाठी, कायमस्वरूपी मोठी सिस्टर्ना (CM) कॅन्युला बसवलेल्या जागृत उंदरांवर स्क्रीनिंग करण्यात आले. महत्त्वाचे म्हणजे, ही पद्धत मेंदूला लक्ष्य करणारे पेप्टाइड्स आणि सेरेब्रोव्हॅस्क्युलर अडथळ्याच्या पलीकडे वहन करण्याची क्षमता असलेले पेप्टाइड्स या दोन्हींची निवड करते. आम्ही T7 फेजेसचा वापर त्यांच्या लहान आकारामुळे (~60 nm)¹⁰ केला आणि असे सुचवले की ते अशा वेसिकल्सच्या वहनासाठी योग्य आहेत जे एंडोथेलियल आणि/किंवा एपिथेलियल-मेडुला अडथळ्याचे ट्रान्ससेल्युलर क्रॉसिंग करण्यास परवानगी देतात. पॅनिंगच्या चार फेऱ्यांनंतर, फेज समूह वेगळे केले गेले, जे तीव्र इन व्हिवो CSF संवर्धन आणि सेरेब्रल मायक्रोव्हेसल संबंध दर्शवतात. महत्त्वाचे म्हणजे, आम्ही आमच्या निष्कर्षांची पुष्टी करू शकलो, हे दाखवून की पसंतीचे आणि रासायनिकदृष्ट्या संश्लेषित केलेले सर्वोत्तम उमेदवार पेप्टाइड्स सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये प्रथिने वाहून नेण्यास सक्षम आहेत. सर्वप्रथम, एका प्रमुख ट्रान्झिट पेप्टाइडला BACE1 पेप्टाइडच्या अवरोधकासोबत एकत्र करून केंद्रीय मज्जासंस्थेवरील (CNS) औषधगतिकीय परिणाम स्थापित करण्यात आले. इन व्हिविओ कार्यात्मक स्क्रीनिंग धोरणे नवीन मेंदू परिवहन पेप्टाइड्सना प्रभावी प्रथिने वाहक म्हणून ओळखू शकतात हे सिद्ध करण्याव्यतिरिक्त, आम्हाला अपेक्षा आहे की अशाच प्रकारचे कार्यात्मक निवड दृष्टिकोन नवीन मेंदू परिवहन मार्ग ओळखण्यासाठी देखील महत्त्वाचे ठरतील.
प्लाक-फॉर्मिंग युनिट्स (PFU) च्या आधारावर, फेज पॅकेजिंगच्या टप्प्यानंतर, अंदाजे १०९ विविधतेसह यादृच्छिक १२-मर रेखीय T7 फेज पेप्टाइड्सची एक लायब्ररी डिझाइन आणि तयार करण्यात आली (सामग्री आणि पद्धती पहा). हे लक्षात घेणे महत्त्वाचे आहे की आम्ही इन व्हिवो पॅनिंग करण्यापूर्वी या लायब्ररीचे काळजीपूर्वक विश्लेषण केले. सुधारित प्राइमर्स वापरून फेज लायब्ररी नमुन्यांच्या PCR ॲम्प्लिफिकेशनमुळे असे ॲम्प्लिकॉन्स तयार झाले जे थेट HTS साठी लागू होते (पूरक आकृती १अ). अ) HTS11 सिक्वेन्सिंगमधील त्रुटी, ब) प्राइमर्स (NNK)1-12 च्या गुणवत्तेवरील परिणाम, आणि क) स्टँडबाय लायब्ररीमध्ये वाइल्ड-टाइप (wt) फेजची (स्केलेटन इन्सर्ट्स) उपस्थिती, या कारणांमुळे केवळ सत्यापित सिक्वेन्स माहिती काढण्यासाठी एक सिक्वेन्स फिल्टरिंग प्रक्रिया लागू करण्यात आली (पूरक आकृती १ब). हे फिल्टर टप्पे सर्व HTS सिक्वेन्सिंग लायब्ररींना लागू होतात. स्टँडर्ड लायब्ररीसाठी, एकूण २३३,८६८ रीड्स प्राप्त झाले, त्यापैकी ३९% फिल्टर निकषांमध्ये उत्तीर्ण झाले आणि त्यांचा वापर लायब्ररी विश्लेषण व पुढील फेऱ्यांसाठी निवडीकरिता करण्यात आला (पूरक आकृती १c–e). हे रीड्स प्रामुख्याने ३ बेस पेअर्सच्या पटीत लांबीचे होते आणि ३६ न्यूक्लिओटाइड्सवर त्यांची संख्या सर्वाधिक होती (पूरक आकृती १c), ज्यामुळे लायब्ररी डिझाइन (NNK) १-१२ ची पुष्टी झाली. विशेष म्हणजे, लायब्ररीमधील सुमारे ११% सदस्यांमध्ये १२-डायमेन्शनल वाइल्ड-टाइप (wt) बॅकबोन PAGISRELVDKL इन्सर्ट होता, आणि जवळजवळ निम्म्या सिक्वेन्सेसमध्ये (४९%) इन्सर्शन्स किंवा डिलीशन्स होते. लायब्ररीच्या HTS ने लायब्ररीमधील पेप्टाइड्सच्या उच्च विविधतेची पुष्टी केली: ८१% पेक्षा जास्त पेप्टाइड सिक्वेन्सेस फक्त एकदाच आढळले आणि केवळ १.५% सिक्वेन्सेस ≥४ प्रतींमध्ये आढळले (पूरक आकृती २a). रिपर्टोअरमधील सर्व १२ स्थानांवरील अमिनो ॲसिडची (aa) वारंवारता, डिजनरेट NKK रिपर्टोअरद्वारे तयार केलेल्या कोडॉनच्या संख्येसाठी अपेक्षित असलेल्या वारंवारतेशी चांगल्या प्रकारे जुळली (पूरक आकृती २ब). या इन्सर्ट्सद्वारे एन्कोड केलेल्या aa अवशेषांची निरीक्षण केलेली वारंवारता, गणना केलेल्या वारंवारतेशी चांगल्या प्रकारे जुळली (r = ०.८९३) (पूरक आकृती २क). इंजेक्शनसाठी फेज लायब्ररी तयार करण्यामध्ये ॲम्प्लिफिकेशन आणि एंडोटॉक्सिन काढून टाकण्याच्या पायऱ्यांचा समावेश असतो. यामुळे फेज लायब्ररीची विविधता संभाव्यतः कमी होऊ शकते असे पूर्वी दाखवले गेले आहे¹²,¹³. म्हणून, आम्ही एंडोटॉक्सिन काढून टाकलेल्या प्लेट-ॲम्प्लिफाइड फेज लायब्ररीचे सिक्वेन्सिंग केले आणि AA च्या वारंवारतेचा अंदाज घेण्यासाठी तिची मूळ लायब्ररीशी तुलना केली. मूळ पूल आणि ॲम्प्लिफाइड व प्युरिफाइड पूल यांच्यामध्ये एक मजबूत सहसंबंध (r = ०.९९५) दिसून आला (पूरक आकृती २ड), ज्यामुळे हे सूचित होते की T7 फेज वापरून प्लेट्सवर ॲम्प्लिफाइड केलेल्या क्लोन्समधील स्पर्धेमुळे मोठा पक्षपात झाला नाही. ही तुलना प्रत्येक लायब्ररीमधील ट्रायपेप्टाइड मोटिफ्सच्या वारंवारतेवर आधारित आहे, कारण लायब्ररींची विविधता (~१०९) एचटीएसने सुद्धा पूर्णपणे टिपता येत नाही. प्रत्येक स्थानावरील अमिनो ॲसिडच्या वारंवारतेच्या विश्लेषणातून असे दिसून आले की, प्रविष्ट केलेल्या भांडारातील शेवटच्या तीन स्थानांवर स्थानावर अवलंबून असलेला एक लहानसा पक्षपात होता (पूरक आकृती २इ). निष्कर्षतः, आम्ही असा निष्कर्ष काढला की लायब्ररीची गुणवत्ता आणि विविधता स्वीकारार्ह होती आणि निवडीच्या अनेक फेऱ्यांदरम्यान फेज लायब्ररींचे प्रवर्धन आणि तयारीमुळे विविधतेत केवळ किरकोळ बदल दिसून आले.
जागृत उंदरांच्या सीएममध्ये (CM) शस्त्रक्रियेने कॅन्युला बसवून सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडचे (cerebrospinal fluid) नमुने टप्प्याटप्प्याने घेतले जाऊ शकतात, जेणेकरून BBB आणि/किंवा BCSFB मार्गे शिरेद्वारे (iv) इंजेक्ट केलेल्या T7 फेजची ओळख सुलभ होईल (आकृती 1a-b). इन विवो निवडीच्या पहिल्या तीन फेऱ्यांमध्ये आम्ही दोन स्वतंत्र निवड शाखा (शाखा A आणि B) वापरल्या (आकृती 1c). निवडीच्या पहिल्या तीन फेऱ्यांमध्ये टाकलेल्या फेजचे एकूण प्रमाण कमी करून आम्ही निवडीची कठोरता हळूहळू वाढवली. पॅनिंगच्या चौथ्या फेरीसाठी, आम्ही शाखा A आणि B मधील नमुने एकत्र केले आणि आणखी तीन स्वतंत्र निवडी केल्या. या मॉडेलमध्ये T7 फेज कणांच्या इन विवो गुणधर्मांचा अभ्यास करण्यासाठी, वाइल्ड-टाइप फेज (PAGISRELVDKL मास्टर इन्सर्ट) शेपटीच्या शिरेद्वारे उंदरांमध्ये इंजेक्ट करण्यात आला. वेगवेगळ्या वेळी सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड आणि रक्तामधून फेज परत मिळवल्यावर असे दिसून आले की तुलनेने लहान T7 आयकोसाहेड्रल फेज रक्तामधून वेगाने बाहेर पडतात (पूरक आकृती 3). दिलेल्या टायटर्स आणि उंदरांच्या रक्ताच्या प्रमाणाच्या आधारावर, आम्ही गणना केली की इंट्राव्हेनस इंजेक्शननंतर १० मिनिटांनी रक्तामध्ये दिलेल्या डोसपैकी केवळ अंदाजे १% वजनी फेज आढळला. या सुरुवातीच्या जलद घसरणीनंतर, २७.७ मिनिटांच्या अर्धायुष्यासह एक मंद प्राथमिक क्लिअरन्स मोजला गेला. महत्त्वाचे म्हणजे, CSF कंपार्टमेंटमधून फक्त खूप कमी फेज परत मिळवले गेले, जे CSF कंपार्टमेंटमध्ये वाइल्ड-टाइप फेजच्या स्थलांतरासाठी कमी पार्श्वभूमी दर्शवते (पूरक आकृती ३). संपूर्ण नमुना घेण्याच्या कालावधीत (०-२५० मिनिटे), सरासरी, रक्तामध्ये T7 फेजचे फक्त सुमारे १ x १०⁻³% टायटर्स आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये सुरुवातीला दिलेल्या फेजपैकी ४ x १०⁻⁸% फेज आढळले. विशेष म्हणजे, सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमधील वाइल्ड-टाइप फेजचे अर्धायुष्य (२५.७ मिनिटे) रक्तामध्ये आढळलेल्या अर्धायुष्यासारखेच होते. या माहितीवरून असे दिसून येते की सीएम-कॅन्युलेटेड उंदरांमध्ये सीएसएफ कंपार्टमेंटला रक्तापासून वेगळे करणारा अडथळा अखंड असतो, ज्यामुळे रक्तामधून सीएसएफ कंपार्टमेंटमध्ये सहजपणे वाहून नेले जाणारे क्लोन ओळखण्यासाठी फेज लायब्ररीची इन व्हिवो निवड करणे शक्य होते.
(अ) मोठ्या साठ्यातून मस्तिष्कमेरु द्रव (CSF) पुन्हा नमुना घेण्यासाठी एक पद्धत स्थापित करणे. (ब) केंद्रीय मज्जासंस्थेच्या (CNS) अडथळ्याचे पेशीय स्थान आणि रक्त-मेंदू अडथळा (BBB) ​​ओलांडणाऱ्या पेप्टाइड्सना ओळखण्यासाठी वापरलेली निवड रणनीती दर्शवणारी आकृती. (क) इन व्हिवो फेज डिस्प्ले स्क्रीनिंग फ्लोचार्ट. निवडीच्या प्रत्येक फेरीत, फेज (बाणांच्या आत प्राण्यांची ओळख) शिरेद्वारे टोचले गेले. दोन स्वतंत्र पर्यायी शाखा (A, B) निवडीच्या चौथ्या फेरीपर्यंत वेगळ्या ठेवल्या जातात. निवडीच्या तिसऱ्या आणि चौथ्या फेरीसाठी, CSF मधून काढलेल्या प्रत्येक फेज क्लोनचे मॅन्युअली सिक्वेन्सिंग केले गेले. (ड) T7 पेप्टाइड लायब्ररी (2 x 10¹² फेज/प्राणी) शिरेद्वारे टोचल्यानंतर दोन कॅन्युलेटेड उंदरांमध्ये निवडीच्या पहिल्या फेरीदरम्यान रक्तामधून (लाल वर्तुळे) आणि मस्तिष्कमेरु द्रवामधून (हिरवे त्रिकोण) वेगळे केलेल्या फेजची गतीशास्त्र. निळे चौरस रक्तातील फेजची सरासरी प्रारंभिक सांद्रता दर्शवतात, जी एकूण रक्ताचे प्रमाण विचारात घेऊन, इंजेक्ट केलेल्या फेजच्या प्रमाणावरून मोजली जाते. काळे चौरस रक्तातील फेजच्या सांद्रतेवरून एक्सट्रापोलेटेड केलेल्या y रेषेचा छेदनबिंदू दर्शवतात. (e,f) पेप्टाइडमध्ये आढळलेल्या सर्व संभाव्य ओव्हरलॅपिंग ट्रायपेप्टाइड मोटिफ्सची सापेक्ष वारंवारता आणि वितरण सादर करतात. १००० रीडिंगमध्ये आढळलेल्या मोटिफ्सची संख्या दर्शविली आहे. लक्षणीयरीत्या (p < 0.001) समृद्ध झालेले मोटिफ्स लाल ठिपक्यांनी चिन्हांकित केले आहेत. (e) इंजेक्ट केलेल्या लायब्ररीच्या ट्रायपेप्टाइड मोटिफच्या सापेक्ष वारंवारतेची तुलना प्राणी #१.१ आणि #१.२ च्या रक्तापासून मिळवलेल्या फेजशी करणारा सहसंबंध स्कॅटरप्लॉट. (f) रक्त आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये वेगळे केलेल्या प्राणी फेज ट्रायपेप्टाइड मोटिफ्स #१.१ आणि #१.२ च्या सापेक्ष वारंवारतेची तुलना करणारा सहसंबंध स्कॅटरप्लॉट. (g, h) दोन्ही प्राण्यांमध्ये इन व्हिविओ निवडीच्या एका फेरीनंतर, रक्तात समृद्ध केलेल्या फेजची (g) इंजेक्ट केलेल्या लायब्ररींशी आणि CSF मध्ये समृद्ध केलेल्या फेजची (h) रक्ताशी तुलना करणारे सिक्वेन्स आयडी सादरीकरण. एका-अक्षरी कोडचा आकार दर्शवतो की ते अमिनो आम्ल त्या स्थानावर किती वेळा येते. हिरवा = ध्रुवीय, जांभळा = उदासीन, निळा = क्षारकीय, लाल = आम्लधर्मी आणि काळा = हायड्रोफोबिक अमिनो आम्ले. आकृती 1a, b एडुआर्ड युरिच यांनी डिझाइन आणि तयार केली आहे.
आम्ही दोन सीएम इन्स्ट्रुमेंट उंदरांमध्ये (क्लेड्स ए आणि बी) एक फेज पेप्टाइड लायब्ररी इंजेक्ट केली आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड व रक्तामधून फेज वेगळे केले (आकृती १डी). वाइल्ड-टाइप फेजच्या तुलनेत लायब्ररीचे सुरुवातीचे जलद निर्मूलन कमी स्पष्ट होते. दोन्ही प्राण्यांमध्ये इंजेक्ट केलेल्या लायब्ररीचे सरासरी अर्धायुष्य रक्तामध्ये २४.८ मिनिटे होते, जे वाइल्ड-टाइप फेजसारखेच होते, आणि सीएसएफमध्ये ३८.५ मिनिटे होते. प्रत्येक प्राण्याच्या रक्त आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमधील फेज नमुन्यांवर एचटीएस (HTS) प्रक्रिया करण्यात आली आणि ओळखल्या गेलेल्या सर्व पेप्टाइड्सचे लहान ट्रायपेप्टाइड मोटिफच्या उपस्थितीसाठी विश्लेषण करण्यात आले. ट्रायपेप्टाइड मोटिफ्स निवडले गेले कारण ते संरचना निर्मिती आणि पेप्टाइड-प्रोटीन परस्परसंवादासाठी किमान आधार प्रदान करतात¹⁴,¹⁵. आम्हाला इंजेक्ट केलेल्या फेज लायब्ररी आणि दोन्ही प्राण्यांच्या रक्तामधून काढलेल्या क्लोन्समधील मोटिफ्सच्या वितरणात चांगला सहसंबंध आढळला (आकृती १ई). डेटा दर्शवतो की लायब्ररीची रचना रक्त विभागात केवळ किंचित समृद्ध आहे. वेबलोगो१६ (Weblogo16) सॉफ्टवेअरच्या सुधारित आवृत्तीचा वापर करून प्रत्येक स्थानावरील अमिनो आम्लांची वारंवारता आणि सर्वसंमत अनुक्रमांचे (consensus sequences) पुढे विश्लेषण करण्यात आले. विशेष म्हणजे, आम्हाला रक्तातील ग्लायसिन अवशेषांमध्ये (glycine residues) तीव्र वाढ आढळली (आकृती १g). जेव्हा रक्ताची तुलना CSF मधून निवडलेल्या क्लोन्सशी केली गेली, तेव्हा मोटिफ्सची (motifs) तीव्र निवड आणि काही प्रमाणात निवड रद्द झाल्याचे दिसून आले (आकृती १f), आणि १२-सदस्यीय रचनेत (12-member sequence) काही विशिष्ट अमिनो आम्ले प्राधान्याने पूर्वनिश्चित स्थानांवर उपस्थित होती (आकृती १h). विशेषतः, प्रत्येक प्राण्याच्या मस्तिष्कमेरु द्रवात (cerebrospinal fluid) लक्षणीय फरक होता, तर दोन्ही प्राण्यांमध्ये रक्तातील ग्लायसिनची वाढ दिसून आली (पूरक आकृती ४a–j). प्राणी #१.१ आणि #१.२ यांच्या मस्तिष्कमेरु द्रवातील अनुक्रम डेटाच्या (sequence data) कठोर गाळणीनंतर, एकूण ९६४ आणि ४२० अद्वितीय १२-मेर पेप्टाइड्स (12-mer peptides) प्राप्त झाले (पूरक आकृती १d–e). वेगळे केलेले फेज क्लोन्स (phage clones) वर्धित (amplified) केले गेले आणि त्यांना शरीरांतर्गत निवडीच्या (in vivo selection) दुसऱ्या फेरीसाठी सादर केले गेले. निवडीच्या दुसऱ्या फेरीतून काढलेल्या फाजवर प्रत्येक प्राण्यामध्ये एचटीएस (HTS) प्रक्रिया करण्यात आली आणि ओळखल्या गेलेल्या सर्व पेप्टाइड्सचा वापर ट्रायपेप्टाइड मोटिफ्सच्या (आकृती २अ, ब, इफ) अस्तित्वाचे विश्लेषण करण्यासाठी मोटिफ ओळखण्याच्या प्रोग्राममध्ये इनपुट म्हणून करण्यात आला. सीएसएफमधून (CSF) मिळवलेल्या फाजच्या पहिल्या चक्राच्या तुलनेत, आम्हाला शाखा ए आणि बी मधील सीएसएफमध्ये अनेक मोटिफ्सची पुढील निवड आणि निवड रद्द झाल्याचे दिसून आले (आकृती २). ते सुसंगत अनुक्रमांचे वेगवेगळे नमुने दर्शवतात की नाही हे ठरवण्यासाठी एक नेटवर्क ओळख अल्गोरिदम लागू करण्यात आला. पर्यायी क्लेड ए (आकृती २क, ड) आणि क्लेड बी (आकृती २ग, ह) मध्ये सीएसएफद्वारे मिळवलेल्या १२-मितीय अनुक्रमांमध्ये स्पष्ट साम्य दिसून आले. प्रत्येक शाखेतील एकत्रित विश्लेषणातून १२-मर पेप्टाइड्ससाठी वेगवेगळे निवड प्रोफाइल (पूरक आकृती ५क, ड) आणि निवडीच्या पहिल्या फेरीच्या तुलनेत निवडीच्या दुसऱ्या फेरीनंतर एकत्रित क्लोन्ससाठी सीएसएफ/रक्त टायटर गुणोत्तरात कालांतराने वाढ झाल्याचे दिसून आले (पूरक आकृती ५इ).
इन व्हिविओ फंक्शनल फेज डिस्प्ले सिलेक्शनच्या दोन सलग फेऱ्यांद्वारे सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमधील मोटिफ्स आणि पेप्टाइड्सचे संवर्धन.
प्रत्येक प्राण्याच्या (प्राणी #१.१ आणि #१.२) पहिल्या फेरीतून मिळवलेले सर्व सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड फाजेस एकत्र केले गेले, त्यांचे प्रवर्धन केले गेले, HT-सिक्वेन्सिंग केले गेले आणि २ SM कॅन्युलेटेड उंदरांमध्ये (#१.१ → #२.१ आणि २.२, १.२ → २.३ आणि २.४) एकत्र पुन्हा इंजेक्ट केले गेले (२ x १०¹⁰ फाजेस/प्राणी). (अ, ब, इ, फ) पहिल्या आणि दुसऱ्या निवड फेऱ्यांमधील सर्व CSF-व्युत्पन्न फाजेसच्या ट्रायपेप्टाइड मोटिफ्सच्या सापेक्ष वारंवारतेची तुलना करणारे सहसंबंध स्कॅटरप्लॉट्स. दोन्ही ओरिएंटेशन्समधील पेप्टाइड्समध्ये आढळलेल्या सर्व संभाव्य ओव्हरलॅपिंग ट्रायपेप्टाइड्सचे प्रतिनिधित्व करणाऱ्या मोटिफ्सची सापेक्ष वारंवारता आणि वितरण. १००० रीडिंग्समध्ये आढळलेल्या मोटिफ्सची संख्या दर्शविली आहे. तुलना केलेल्या लायब्ररींपैकी एकामध्ये लक्षणीयरीत्या (p < ०.००१) निवडलेले किंवा वगळलेले मोटिफ्स लाल ठिपक्यांनी हायलाइट केले आहेत. (c, d, g, h) इन व्हिविओ निवडीच्या फेरी २ आणि १ वर आधारित, सर्व CSF-समृद्ध १२ अमिनो आम्ल लांबीच्या अनुक्रमांचे अनुक्रम लोगो सादरीकरण. एक-अक्षरी संकेताचा आकार हे दर्शवतो की ते अमिनो आम्ल त्या स्थानावर किती वेळा आढळते. लोगो दर्शवण्यासाठी, दोन निवड फेऱ्यांदरम्यान वैयक्तिक प्राण्यांमधून काढलेल्या CSF अनुक्रमांच्या वारंवारतेची तुलना केली जाते आणि दुसऱ्या फेरीतील समृद्ध अनुक्रम दर्शवले आहेत: (c) #१.१–#२.१ (d) #१.१–#२.२ (g) #१.२–#२.३ आणि (h) #१.२–#२.४. (c, d) प्राणी क्र. २.१ आणि क्र. २.२ मध्ये किंवा (g, h) प्राणी क्र. २.३ आणि क्र. २.४ मध्ये दिलेल्या स्थानावरील सर्वात समृद्ध अमिनो आम्ले रंगांमध्ये दर्शवली आहेत. हिरवा = ध्रुवीय, जांभळा = उदासीन, निळा = क्षारकीय, लाल = आम्लधर्मी आणि काळा = जलविरोधी अमिनो आम्ले.
निवडीच्या तिसऱ्या फेरीनंतर, आम्ही दोन प्राण्यांमधून वेगळे केलेल्या ३३२ CSF-पुनर्रचित फेज क्लोन्समधून १२४ अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रम (#३.१ आणि #३.२) ओळखले (पूरक आकृती ६अ). LGSVS या अनुक्रमाचे (१८.७%) सापेक्ष प्रमाण सर्वाधिक होते, त्यानंतर वाइल्ड-टाइप इन्सर्ट्स PAGISRELVDKL (८.२%), MRWFFSHASQGR (३%), DVAKVS (३%), TWLFSLG (२.२%), आणि SARGSWREIVSLS (२.२%) होते. अंतिम चौथ्या फेरीत, आम्ही तीन वेगवेगळ्या प्राण्यांमधून स्वतंत्रपणे निवडलेल्या दोन शाखा एकत्र केल्या (आकृती १क). CSF मधून मिळवलेल्या ९२५ अनुक्रमित फेज क्लोन्सपैकी, चौथ्या फेरीत आम्हाला ६४ अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रम आढळले (पूरक आकृती ६ब), ज्यामध्ये वाइल्ड-टाइप फेजचे सापेक्ष प्रमाण ०.८% पर्यंत कमी झाले. चौथ्या फेरीतील सर्वात सामान्य CSF क्लोन्स LYVLHSRGLWGFKLAAALE (१८%), LGSVS (१७%), GFVRFRLSNTR (१४%), KVAWRVFSLFWK (७%), SVHGV (५%), GRPQKINGARVC (३.६%) आणि RLSSVDSDLSGC (३.२%) होते. NNK लायब्ररी डिझाइनसाठी डिजनरेट कोडॉन्स वापरताना लायब्ररी प्रायमर्समधील न्यूक्लिओटाइड इन्सर्शन्स/डिलिशन्स किंवा प्रीमेच्युअर स्टॉप कोडॉन्समुळे निवडलेल्या पेप्टाइड्सच्या लांबीमध्ये तफावत आढळते. प्रीमेच्युअर स्टॉप कोडॉन्समुळे लहान पेप्टाइड्स तयार होतात आणि त्यांची निवड केली जाते कारण त्यामध्ये अनुकूल aa मोटिफ असतो. सिंथेटिक लायब्ररीच्या प्रायमर्समधील इन्सर्शन्स/डिलिशन्समुळे लांब पेप्टाइड्स तयार होऊ शकतात. यामुळे डिझाइन केलेला स्टॉप कोडॉन फ्रेमच्या बाहेर ठेवला जातो आणि पुढे नवीन स्टॉप कोडॉन येईपर्यंत तो वाचला जातो. सर्वसाधारणपणे, आम्ही इनपुट डेटाची सॅम्पल आउटपुट डेटाशी तुलना करून सर्व चार निवड फेऱ्यांसाठी एनरिचमेंट फॅक्टर्सची गणना केली. स्क्रिनिंगच्या पहिल्या फेरीसाठी, आम्ही एक गैर-विशिष्ट पार्श्वभूमी संदर्भ म्हणून वाइल्ड-टाइप फेज टायटर्सचा वापर केला. विशेष म्हणजे, पहिल्या CSF चक्रात नकारात्मक फेज निवड खूप तीव्र होती, परंतु रक्तात नव्हती (आकृती ३अ). याचे कारण पेप्टाइड लायब्ररीमधील बहुतेक सदस्यांचे CSF कंपार्टमेंटमध्ये निष्क्रिय प्रसार होण्याची कमी शक्यता किंवा बॅक्टेरिओफेजच्या तुलनेत सापेक्ष फेज रक्तप्रवाहात अधिक कार्यक्षमतेने टिकून राहतात किंवा काढून टाकले जातात हे असू शकते. तथापि, पॅनिंगच्या दुसऱ्या फेरीत, दोन्ही क्लेड्समध्ये CSF मध्ये फेजची तीव्र निवड दिसून आली, ज्यामुळे असे सूचित होते की मागील फेरीत CSF अपटेकला प्रोत्साहन देणारे पेप्टाइड्स दर्शविणाऱ्या फेजचे प्रमाण अधिक होते (आकृती ३अ). पुन्हा, रक्तात लक्षणीय वाढ न होता. तसेच तिसऱ्या आणि चौथ्या फेरीत, फेज क्लोन्सचे प्रमाण CSF मध्ये लक्षणीयरीत्या वाढले होते. निवडीच्या शेवटच्या दोन फेऱ्यांमधील प्रत्येक अद्वितीय पेप्टाइड सिक्वेन्सच्या सापेक्ष वारंवारतेची तुलना केल्यावर, आम्हाला आढळले की निवडीच्या चौथ्या फेरीत सिक्वेन्सचे प्रमाण आणखी वाढले होते (आकृती ३ब). दोन्ही पेप्टाइड ओरिएंटेशनचा वापर करून सर्व ६४ अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमांमधून एकूण ९३१ ट्रायपेप्टाइड मोटिफ्स काढण्यात आले. चौथ्या फेरीतील सर्वात समृद्ध मोटिफ्सच्या समृद्धी प्रोफाइलची, इंजेक्ट केलेल्या लायब्ररीच्या तुलनेत (कट-ऑफ: १०% समृद्धी) सर्व फेऱ्यांमध्ये अधिक बारकाईने तपासणी करण्यात आली (पूरक आकृती ६क). निवडीच्या सामान्य पद्धतींनी दाखवले की, अभ्यासलेले बहुतेक मोटिफ्स दोन्ही निवड शाखांच्या मागील सर्व फेऱ्यांमध्ये समृद्ध होते. तथापि, काही मोटिफ्स (उदा. SGL, VSG, LGS GSV) प्रामुख्याने पर्यायी क्लेड A मधून होते, तर इतर (उदा. FGW, RTN, WGF, NTR) पर्यायी क्लेड B मध्ये समृद्ध होते.
CSF-समृद्ध फेज-डिस्प्लेड पेप्टाइड्स आणि स्ट्रेप्टाव्हिडिन पेलोड्सशी जोडलेल्या बायोटिनिलेटेड लीडर पेप्टाइड्सच्या CSF वहनाची पडताळणी.
(अ) इंजेक्ट केलेल्या (इनपुट = I) फेज (PFU) टायटर्स आणि निर्धारित केलेल्या CSF फेज टायटर्स (आउटपुट = O) च्या आधारावर सर्व चार फेऱ्यांमध्ये (R1-R4) मोजलेले संवर्धन गुणोत्तर. शेवटच्या तीन फेऱ्यांसाठी (R2-R4) संवर्धन घटक, मागील फेरी आणि वजनाच्या डेटासह पहिल्या फेरीशी (R1) तुलना करून मोजले गेले. मोकळे बार सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) दर्शवतात, तर छायांकित बार प्लाझ्मा दर्शवतात. (***p<0.001, स्टुडंटच्या टी-टेस्टवर आधारित). (ब) निवडीच्या चौथ्या फेरीनंतर CSF मध्ये गोळा केलेल्या सर्व फेजेसच्या सापेक्ष प्रमाणानुसार क्रमवारी लावलेल्या, सर्वाधिक प्रमाणात आढळणाऱ्या फेज पेप्टाइड्सची यादी. सहा सर्वात सामान्य फेज क्लोन्स रंगाने हायलाइट केले आहेत, त्यांना क्रमांक दिले आहेत आणि निवडीच्या तिसऱ्या व चौथ्या फेरीमधील त्यांचे संवर्धन घटक (इनसेट) दर्शवले आहेत. (क, ड) चौथ्या फेरीतील सहा सर्वाधिक संवर्धित फेज क्लोन्स, एम्प्टी फेज आणि पॅरेंटल फेज पेप्टाइड लायब्ररी यांचे CSF सॅम्पलिंग मॉडेलमध्ये स्वतंत्रपणे विश्लेषण केले गेले. CSF आणि रक्ताचे नमुने सूचित केलेल्या वेळेनुसार गोळा केले गेले. (c) 6 उमेदवार फेज क्लोन्स (2 x 10¹⁰ फेज/प्राणी), रिक्त फेज (#1779) (2 x 10¹⁰ फेज/प्राणी) आणि स्टॉक फेज पेप्टाइड लायब्ररी (2 x 10¹² फेज/प्राणी) यांचे समान प्रमाण, कॅन्युलेटेड प्राण्याला शेपटीच्या शिरेद्वारे स्वतंत्रपणे दिले जाते. प्रत्येक इंजेक्ट केलेल्या फेज क्लोन आणि फेज पेप्टाइड लायब्ररीचे CSF फार्माकोकायनेटिक्स वेळेनुसार दर्शविले आहे. (d) नमुना घेण्याच्या वेळेनुसार सर्व पुनर्प्राप्त फेज/mL साठी सरासरी CSF/रक्त गुणोत्तर दर्शवते. (e) चार सिंथेटिक लीडर पेप्टाइड्स आणि एक स्क्रॅम्बल्ड कंट्रोल त्यांच्या N-टर्मिनसद्वारे (टेट्रामर डिस्प्ले) बायोटिनने स्ट्रेप्टाव्हिडिनला जोडले गेले आणि त्यानंतर इंजेक्शन (शेपटीच्या शिरेद्वारे iv, 10 mg स्ट्रेप्टाव्हिडिन/kg) दिले गेले. किमान तीन इंट्यूबेटेड उंदीर (N = 3). निर्दिष्ट वेळेनुसार CSF नमुने गोळा केले गेले आणि CSF अँटी-स्ट्रेप्टाव्हिडिन ELISA द्वारे स्ट्रेप्टाव्हिडिनची सांद्रता मोजली गेली (nd = आढळले नाही). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA चाचणीवर आधारित). (f) सर्वाधिक समृद्ध फेज पेप्टाइड क्लोन #2002 (जांभळा) च्या अमिनो आम्ल क्रमाची, निवडीच्या चौथ्या फेरीतील इतर निवडक फेज पेप्टाइड क्लोन्ससोबत तुलना. एकसारखे आणि समान अमिनो आम्ल खंड रंग-संकेतित केले आहेत.
चौथ्या फेरीतील सर्व संवर्धित फाजेसपैकी (आकृती ३ब), सीएसएफ नमुना मॉडेलमध्ये पुढील वैयक्तिक विश्लेषणासाठी सहा उमेदवार क्लोन्स निवडण्यात आले. सहा उमेदवार फाज, रिक्त फाज (इन्सर्टशिवाय) आणि प्रोफाज पेप्टाइड लायब्ररी समान प्रमाणात तीन कॅन्युलेटेड सीएम प्राण्यांमध्ये इंजेक्ट करण्यात आल्या, आणि सीएसएफ (आकृती ३क) व रक्त (पूरक आकृती ७) चाचण्यांमध्ये फार्माकोकायनेटिक्स निश्चित करण्यात आले. चाचणी केलेल्या सर्व फाज क्लोन्सनी रिक्त नियंत्रण फाज (#१७७९) पेक्षा १०-१००० पट जास्त पातळीवर सीएसएफ कंपार्टमेंटला लक्ष्य केले. उदाहरणार्थ, क्लोन #२०२० आणि #२०७७ मध्ये नियंत्रण फाजपेक्षा सुमारे १००० पट जास्त सीएसएफ टायटर्स होते. प्रत्येक निवडलेल्या पेप्टाइडचे फार्माकोकायनेटिक प्रोफाइल भिन्न आहे, परंतु त्या सर्वांमध्ये उच्च सीएसएफ होमिंग क्षमता आहे. क्लोन #१९०३ आणि #२०११ साठी आम्हाला कालांतराने सातत्यपूर्ण घट दिसून आली, तर क्लोन #२०७७, #२००२ आणि #२००९ साठी पहिल्या १० मिनिटांत झालेली वाढ सक्रिय वहन दर्शवू शकते, परंतु याची पडताळणी करणे आवश्यक आहे. क्लोन #२०२०, #२००२ आणि #२०७७ उच्च पातळीवर स्थिर झाले, तर क्लोन #२००९ ची CSF सांद्रता सुरुवातीच्या वाढीनंतर हळूहळू कमी झाली. त्यानंतर आम्ही प्रत्येक CSF उमेदवाराच्या सापेक्ष वारंवारतेची त्याच्या रक्तातील सांद्रतेशी तुलना केली (आकृती ३d). सर्व नमुना घेण्याच्या वेळी प्रत्येक CSF उमेदवाराच्या सरासरी टायटरचा त्याच्या रक्तातील टायटरशी असलेला सहसंबंध दर्शवितो की सहापैकी तीन उमेदवार रक्ताच्या CSF मध्ये लक्षणीयरीत्या समृद्ध होते. विशेष म्हणजे, क्लोन #२०७७ ने रक्तामध्ये अधिक स्थिरता दर्शविली (पूरक आकृती ७). पेप्टाइड्स स्वतःच फेज कणांव्यतिरिक्त इतर कार्गोला CSF कप्प्यात सक्रियपणे वाहून नेण्यास सक्षम आहेत याची पुष्टी करण्यासाठी, आम्ही चार लीडर पेप्टाइड्स संश्लेषित केले, ज्यांच्या N-टर्मिनसवर बायोटिनचे डेरिव्हेटायझेशन केले होते, जिथे हे पेप्टाइड्स फेज कणांना जोडले जातात. बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड्स (क्रमांक २००२, २००९, २०२० आणि २०७७) यांना स्ट्रेप्टाव्हिडिन (SA) सोबत संयुग्मित करून बहु-आण्विक रूपे मिळवण्यात आली, जी काही प्रमाणात फेजच्या भूमितीची नक्कल करतात. या स्वरूपामुळे आम्हाला मालवाहू प्रथिन पेप्टाइड्सच्या रूपात रक्त आणि मस्तिष्कमेरु द्रवातील (CSF) SA च्या संपर्काचे मोजमाप करणे देखील शक्य झाले. महत्त्वाचे म्हणजे, जेव्हा कृत्रिम पेप्टाइड्स या SA-संयुग्मित स्वरूपात दिले गेले, तेव्हा फेजचा डेटा अनेकदा पुन्हा मिळवता आला (आकृती ३इ). स्क्रॅम्बल्ड पेप्टाइड्सचा सुरुवातीचा संपर्क कमी होता आणि मस्तिष्कमेरु द्रवातून (CSF) जलद गतीने निचरा होऊन ४८ तासांच्या आत त्यांची पातळी शोधण्यायोग्य राहिली नाही. या पेप्टाइड फेज क्लोन्सच्या मस्तिष्कमेरु द्रवातील (CSF) वितरण मार्गांची सखोल माहिती मिळवण्यासाठी, आम्ही शरीरात शिरेद्वारे इंजेक्शन दिल्यानंतर १ तासाने फेज कण थेट शोधण्याकरिता इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) वापरून प्रत्येक फेज पेप्टाइड हिट्सच्या स्थानाचे विश्लेषण केले. विशेष म्हणजे, क्लोन #2002, #2077, आणि #2009 हे मेंदूच्या केशवाहिन्यांमध्ये तीव्र रंगाने शोधता आले, तर नियंत्रण फेज (#1779) आणि क्लोन #2020 आढळले नाहीत (पूरक आकृती 8). यावरून असे सूचित होते की हे पेप्टाइड्स BBB ओलांडूनच मेंदूवरील परिणामात योगदान देतात. या गृहितकाची चाचणी घेण्यासाठी पुढील सविस्तर विश्लेषणाची आवश्यकता आहे, कारण BSCFB मार्ग देखील यात सामील असू शकतो. सर्वात समृद्ध क्लोन (#2002) च्या अमिनो आम्ल क्रमाची इतर निवडक पेप्टाइड्सशी तुलना केली असता, असे लक्षात आले की त्यापैकी काहींमध्ये समान अमिनो आम्ल विस्तार आहेत, जे समान परिवहन यंत्रणा दर्शवू शकते (आकृती 3f).
त्याच्या अद्वितीय प्लाझ्मा प्रोफाइलमुळे आणि कालांतराने CSF मध्ये होणाऱ्या लक्षणीय वाढीमुळे, फेज डिस्प्ले क्लोन #2077 चा ४८ तासांच्या दीर्घ कालावधीसाठी अधिक अभ्यास करण्यात आला आणि तो SA ची पातळी स्थिर असताना दिसून येणारी CSF मधील जलद वाढ पुन्हा निर्माण करण्यास सक्षम ठरला (आकृती ४अ). इतर ओळखल्या गेलेल्या फेज क्लोन्सच्या बाबतीत, #2077 मेंदूच्या केशवाहिन्यांसाठी तीव्रपणे रंगला आणि उच्च रिझोल्यूशनवर पाहिल्यावर केशवाहिनी मार्कर लेक्टिनसोबत लक्षणीय सहस्थानिकरण (colocalization) दर्शवले, तसेच पॅरेनकायमल जागेतही शक्यतो काही रंगलेपन दिसून आले (आकृती ४ब). CNS मध्ये पेप्टाइड-मध्यस्थी औषधशास्त्रीय परिणाम मिळवता येतात की नाही हे तपासण्यासाठी, आम्ही एक प्रयोग केला ज्यामध्ये i) #2077 ट्रान्झिट पेप्टाइड आणि ii) BACE1 इनहिबिटर पेप्टाइडच्या बायोटिनिलेटेड आवृत्त्या दोन वेगवेगळ्या गुणोत्तरांमध्ये SA सोबत मिसळल्या गेल्या. एका मिश्रणासाठी आम्ही फक्त BACE1 पेप्टाइड इनहिबिटर वापरला आणि दुसऱ्यासाठी आम्ही BACE1 पेप्टाइड इनहिबिटर आणि #2077 पेप्टाइड यांचे १:३ गुणोत्तर वापरले. दोन्ही नमुने शिरेद्वारे देण्यात आले आणि कालांतराने रक्तातील व मस्तिष्कमेरु द्रवातील बीटा-अमायलॉइड पेप्टाइड ४० (Abeta40) ची पातळी मोजण्यात आली. मस्तिष्कमेरु द्रवामध्ये Abeta40 मोजण्यात आले, कारण ते मेंदूच्या पॅरेनकायमामधील BACE1 च्या अवरोधनाचे प्रतिबिंब दर्शवते. अपेक्षेप्रमाणे, दोन्ही कॉम्प्लेक्सनी रक्तातील Abeta40 ची पातळी लक्षणीयरीत्या कमी केली (आकृती ४c, d). तथापि, केवळ पेप्टाइड क्र. २०७७ आणि SA शी संयुग्मित केलेल्या BACE1 पेप्टाइडच्या अवरोधकाचे मिश्रण असलेल्या नमुन्यांमुळेच मस्तिष्कमेरु द्रवातील Abeta40 मध्ये लक्षणीय घट झाली (आकृती ४c). या माहितीवरून असे दिसून येते की पेप्टाइड क्र. २०७७ हे ६० kDa SA प्रथिनाला केंद्रीय मज्जासंस्थेमध्ये (CNS) वाहून नेण्यास सक्षम आहे आणि ते BACE1 पेप्टाइडच्या SA-संयुग्मित अवरोधकांसोबत औषधीय परिणाम देखील घडवून आणते.
(अ) कमीत कमी तीन सीएम-इंट्यूबेटेड उंदरांमध्ये टी७ फेजचे क्लोनल इंजेक्शन (२ × १० फेज/प्राणी), जे सीएसएफ पेप्टाइड #२०७७ (आरएलएसएसव्हीडीएसडीएलएसजीसी) आणि इंजेक्शन न दिलेल्या कंट्रोल फेज (#१७७९) यांचे दीर्घकालीन फार्माकोकायनेटिक प्रोफाइल दर्शवते. (ब) फेज-इंजेक्टेड उंदरांमधील (२ × १० १० फेज/प्राणी) प्रातिनिधिक कॉर्टिकल सूक्ष्मवाहिन्यांची कॉन्फोकल मायक्रोस्कोपिक प्रतिमा, जी पेप्टाइड #२०७७ आणि वाहिन्यांचे (लेक्टिन) काउंटरस्टेनिंग दर्शवते. हे फेज क्लोन्स ३ उंदरांना देण्यात आले आणि परफ्यूजन करण्यापूर्वी १ तास रक्ताभिसरणात फिरू दिले. मेंदूचे सेक्शन कापून टी७ फेज कॅप्सिडच्या विरुद्ध पॉलीक्लोनल एफआयटीसी-लेबल केलेल्या अँटीबॉडीजने रंगवले गेले. परफ्यूजन आणि त्यानंतरच्या फिक्सेशनच्या दहा मिनिटे आधी, डायलाइट५९४-लेबल केलेले लेक्टिन शिरेद्वारे देण्यात आले. सूक्ष्म रक्तवाहिन्यांच्या आतील बाजूस लेक्टिन स्टैनिंग (लाल) आणि केशवाहिन्या व रक्तवाहिन्यांभोवतीच्या मेंदूच्या ऊतींच्या पोकळीत फाजेस (हिरवे) दर्शविणाऱ्या प्रतिदीप्त प्रतिमा. स्केल बार १० µm दर्शवतो. (c, d) बायोटिनिलेटेड BACE1 प्रतिबंधक पेप्टाइड एकटे किंवा बायोटिनिलेटेड ट्रान्झिट पेप्टाइड #२०७७ सोबत जोडून स्ट्रेप्टाव्हिडिनशी जोडले गेले आणि त्यानंतर किमान तीन कॅन्युलेटेड CM उंदरांना (१० मिग्रॅ स्ट्रेप्टाव्हिडिन/किलो) शिरेद्वारे इंजेक्शन दिले गेले. BACE1 पेप्टाइड प्रतिबंधकामुळे होणारी Aβ40 मधील घट, दर्शविलेल्या वेळेनुसार रक्तातील (लाल) आणि मस्तिष्कमेरु द्रवातील (नारंगी) Aβ1-40 ELISA द्वारे मोजली गेली. अधिक स्पष्टतेसाठी, आलेखावर १००% स्केलवर तुटक रेषा काढली आहे. (c) ३:१ प्रमाणात ट्रान्झिट पेप्टाइड #२०७७ आणि BACE1 अवरोधक पेप्टाइडशी संयुग्मित केलेल्या स्ट्रेप्टाव्हिडिनने उपचार केलेल्या उंदरांच्या रक्तातील (लाल त्रिकोण) आणि मस्तिष्कमेरु द्रवातील (नारंगी त्रिकोण) Aβ40 मध्ये झालेली टक्केवारी घट. (d) केवळ BACE1 अवरोधक पेप्टाइडशी जोडलेल्या स्ट्रेप्टाव्हिडिनने उपचार केलेल्या उंदरांच्या रक्तातील (लाल वर्तुळे) आणि मस्तिष्कमेरु द्रवातील (नारंगी वर्तुळे) Aβ40 मध्ये झालेली टक्केवारी घट. नियंत्रणामध्ये Aβ चे प्रमाण ४२० pg/ml होते (प्रमाणित विचलन = १०१ pg/ml).
बायोमेडिकल संशोधनाच्या अनेक क्षेत्रांमध्ये फेज डिस्प्ले यशस्वीरित्या लागू करण्यात आला आहे¹⁷. ही पद्धत इन व्हिवो व्हॅस्क्युलर डायव्हर्सिटी अभ्यासांसाठी¹⁸,¹⁹ तसेच सेरेब्रल व्हेसल्सना लक्ष्य करणाऱ्या अभ्यासांसाठी²⁰,²¹,²²,²³,²⁴,²⁵,²⁶ वापरली गेली आहे. या अभ्यासात, आम्ही या निवड पद्धतीचा उपयोग केवळ सेरेब्रल व्हेसल्सना लक्ष्य करणाऱ्या पेप्टाइड्सच्या थेट ओळखीपुरताच नाही, तर ब्लड-ब्रेन बॅरियर ओलांडण्यासाठी सक्रिय वहन गुणधर्म असलेल्या उमेदवारांच्या शोधापर्यंतही वाढवला. आम्ही आता सीएम इंट्यूबेटेड उंदरांमध्ये इन व्हिवो निवड प्रक्रियेच्या विकासाचे वर्णन करतो आणि सीएसएफ होमिंग गुणधर्म असलेल्या पेप्टाइड्सना ओळखण्याची तिची क्षमता दाखवतो. १२-मर रँडम पेप्टाइड्सची लायब्ररी प्रदर्शित करणाऱ्या टी७ फेजचा वापर करून, आम्ही हे दाखवू शकलो की टी७ फेज ब्लड-ब्रेन बॅरियरशी जुळवून घेण्यासाठी पुरेसा लहान आहे (व्यासाने अंदाजे ६० एनएम)¹⁰, ज्यामुळे तो थेट ब्लड-ब्रेन बॅरियर किंवा कोरोइड प्लेक्सस ओलांडू शकतो. आम्ही असे निरीक्षण केले की, कॅन्युलेटेड सीएम उंदरांमधून सीएसएफ (CSF) गोळा करणे ही एक सु-नियंत्रित इन-व्हिव्हो कार्यात्मक स्क्रीनिंग पद्धत होती, आणि काढलेले फेज केवळ रक्तवाहिन्यांशीच जोडले जात नव्हते, तर ते रक्त-मेंदू अडथळ्याच्या पलीकडे वाहक म्हणूनही कार्य करत होते. शिवाय, एकाच वेळी रक्त गोळा करून आणि सीएसएफ व रक्तापासून मिळवलेल्या फेजेसवर एचटीएस (HTS) लागू करून, आम्ही याची पुष्टी केली की आमच्या सीएसएफच्या निवडीवर रक्ताचे संवर्धन किंवा निवडीच्या फेऱ्यांमधील विस्ताराच्या योग्यतेचा प्रभाव पडला नव्हता. तथापि, रक्ताचा भाग हा निवड प्रक्रियेचा एक भाग आहे, कारण सीएसएफच्या भागापर्यंत पोहोचण्यास सक्षम असलेल्या फेजेसना मेंदूमध्ये स्वतःला समृद्ध करण्यासाठी रक्तप्रवाहात पुरेसा वेळ टिकून राहावे लागते आणि फिरावे लागते. कच्च्या एचटीएस डेटामधून विश्वसनीय अनुक्रम माहिती मिळवण्यासाठी, आम्ही विश्लेषण कार्यप्रवाहात प्लॅटफॉर्म-विशिष्ट अनुक्रम त्रुटींसाठी अनुकूलित फिल्टर्स लागू केले. स्क्रीनिंग पद्धतीमध्ये कायनेटिक पॅरामीटर्सचा समावेश करून, आम्ही रक्तातील वाइल्ड-टाइप T7 फाजेसच्या जलद फार्माकोकायनेटिक्सची (t½ ~ २८ मिनिटे) पुष्टी केली²⁴,²⁷,²⁸ आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमधील (CSF) त्यांचे अर्धायुष्य (t½ ~ २६ मिनिटे प्रति मिनिट) देखील निश्चित केले. रक्त आणि CSF मध्ये समान फार्माकोकायनेटिक प्रोफाइल असूनही, CSF मध्ये फाजच्या रक्तातील सांद्रतेपैकी केवळ ०.००१% सांद्रता आढळू शकली, जे ब्लड-ब्रेन बॅरियरमधून वाइल्ड-टाइप T7 फाजची कमी पार्श्वभूमी गतिशीलता दर्शवते. हे कार्य इन-व्हिवो पॅनिंग स्ट्रॅटेजी वापरताना निवडीच्या पहिल्या फेरीचे महत्त्व अधोरेखित करते, विशेषतः अशा फाज सिस्टीम्ससाठी ज्या रक्ताभिसरणातून वेगाने काढून टाकल्या जातात, कारण काही मोजकेच क्लोन्स CNS कंपार्टमेंटपर्यंत पोहोचू शकतात. त्यामुळे, पहिल्या फेरीत लायब्ररीच्या विविधतेत खूप मोठी घट झाली, कारण या अत्यंत कठोर CSF मॉडेलमध्ये अखेरीस केवळ मर्यादित संख्येने क्लोन्स गोळा केले गेले. या इन व्हिविओ पॅनिंग स्ट्रॅटेजीमध्ये अनेक निवड टप्प्यांचा समावेश होता, जसे की CSF कंपार्टमेंटमध्ये सक्रिय संचय, रक्त कंपार्टमेंटमध्ये क्लोनचे टिकून राहणे, आणि पहिल्या १० मिनिटांत रक्तातून T7 फेज क्लोन जलदगतीने काढून टाकणे (आकृती १d आणि पूरक आकृती ४M). अशाप्रकारे, पहिल्या फेरीनंतर, CSF मध्ये वेगवेगळे फेज क्लोन ओळखले गेले, जरी प्रत्येक प्राण्यासाठी तोच प्रारंभिक संच वापरला गेला होता. यावरून असे सूचित होते की, मोठ्या संख्येने सदस्य असलेल्या सोर्स लायब्ररीसाठी अनेक कठोर निवड टप्प्यांमुळे विविधतेत लक्षणीय घट होते. त्यामुळे, यादृच्छिक घटना प्रारंभिक निवड प्रक्रियेचा एक अविभाज्य भाग बनतील, ज्यामुळे निकालावर मोठा प्रभाव पडेल. अशी शक्यता आहे की मूळ लायब्ररीमधील अनेक क्लोनमध्ये CSF मध्ये जमा होण्याची प्रवृत्ती खूप सारखी होती. तथापि, समान प्रायोगिक परिस्थितीतही, प्रारंभिक संचामध्ये प्रत्येक विशिष्ट क्लोनची संख्या कमी असल्यामुळे निवडीचे निकाल भिन्न असू शकतात.
CSF मध्ये समृद्ध असलेले मोटिफ्स रक्तातील मोटिफ्सपेक्षा वेगळे आहेत. विशेष म्हणजे, आम्हाला वैयक्तिक प्राण्यांच्या रक्तात ग्लायसिन-समृद्ध पेप्टाइड्सकडे पहिला बदल दिसून आला. (आकृती 1g, पूरक आकृत्या 4e, 4f). ग्लायसिन पेप्टाइड्स असलेले फेज अधिक स्थिर असू शकतात आणि रक्ताभिसरणातून बाहेर काढले जाण्याची शक्यता कमी असते. तथापि, हे ग्लायसिन-समृद्ध पेप्टाइड्स सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडच्या नमुन्यांमध्ये आढळले नाहीत, यावरून असे सूचित होते की क्युरेटेड लायब्ररी दोन वेगवेगळ्या निवड टप्प्यांमधून गेल्या: एक रक्तात आणि दुसरा सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये जमा होऊ देऊन. निवडीच्या चौथ्या फेरीतून मिळालेल्या CSF-समृद्ध क्लोन्सची विस्तृतपणे चाचणी केली गेली आहे. ब्लँक कंट्रोल फेजच्या तुलनेत, वैयक्तिकरित्या चाचणी केलेल्या जवळजवळ सर्व क्लोन्स CSF मध्ये समृद्ध असल्याची पुष्टी झाली. एका पेप्टाइड हिटची (#2077) अधिक तपशीलवार तपासणी करण्यात आली. इतर हिट्सच्या तुलनेत याने जास्त प्लाझ्मा अर्ध-आयुष्य दाखवले (आकृती ३डी आणि पूरक आकृती ७), आणि विशेष म्हणजे, या पेप्टाइडमध्ये सी-टर्मिनसवर सिस्टीन अवशेष होता. अलीकडेच असे दिसून आले आहे की पेप्टाइड्समध्ये सिस्टीन जोडल्याने अल्ब्युमिन २९ शी बंधन साधून त्यांचे फार्माकोकायनेटिक गुणधर्म सुधारू शकतात. पेप्टाइड #२०७७ साठी हे सध्या अज्ञात आहे आणि यासाठी पुढील अभ्यासाची आवश्यकता आहे. काही पेप्टाइड्सनी सीएसएफ संवर्धनामध्ये व्हॅलेन्स-अवलंबित्व दाखवले (माहिती दर्शविलेली नाही), जे टी७ कॅप्सिडच्या दर्शविलेल्या पृष्ठभागाच्या भूमितीशी संबंधित असू शकते. आम्ही वापरलेल्या टी७ प्रणालीने प्रत्येक फेज कणावर प्रत्येक पेप्टाइडच्या ५-१५ प्रती दाखवल्या. उंदरांच्या सेरेब्रल कॉर्टेक्समध्ये शिरेद्वारे इंजेक्ट केलेल्या उमेदवार लीड फेज क्लोन्सवर आयएचसी केले गेले (पूरक आकृती ८). माहितीवरून असे दिसून आले की किमान तीन क्लोन्स (क्र. २००२, क्र. २००९ आणि क्र. २०७७) बीबीडीशी आंतरक्रिया करतात. या BBB आंतरक्रियेमुळे CSF चा संचय होतो की हे क्लोन्स थेट BCSFB कडे जातात, हे अद्याप निश्चित व्हायचे आहे. महत्त्वाचे म्हणजे, आम्ही दाखवतो की निवडलेले पेप्टाइड्स संश्लेषित झाल्यावर आणि प्रोटीन कार्गोला जोडल्यावर त्यांची CSF वहन क्षमता टिकवून ठेवतात. N-टर्मिनल बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड्सचे SA शी बंधन, रक्त आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमधील त्यांच्या संबंधित फेज क्लोन्ससह मिळालेल्या परिणामांचीच पुनरावृत्ती करते (आकृती 3e). शेवटी, आम्ही दाखवतो की लीड पेप्टाइड #2077 हे SA शी संयुग्मित केलेल्या BACE1 च्या बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड इनहिबिटरच्या मेंदूतील क्रियेला चालना देण्यास सक्षम आहे, ज्यामुळे CSF मधील Abeta40 ची पातळी लक्षणीयरीत्या कमी होऊन CNS मध्ये स्पष्ट फार्माकोडायनॅमिक परिणाम दिसून येतात (आकृती 4). सर्व हिट्सचा पेप्टाइड सिक्वेन्स होमोलॉजी शोध घेऊनही, आम्हाला डेटाबेसमध्ये कोणतेही होमोलॉग्स ओळखता आले नाहीत. हे लक्षात घेणे महत्त्वाचे आहे की T7 लायब्ररीचा आकार अंदाजे 109 आहे, तर 12-मर्ससाठी सैद्धांतिक लायब्ररीचा आकार 4 x 1015 आहे. त्यामुळे, आम्ही 12-मर पेप्टाइड लायब्ररीच्या विविधता जागेचा केवळ एक छोटासा भाग निवडला, ज्याचा अर्थ असा असू शकतो की या ओळखलेल्या हिट्सच्या लगतच्या अनुक्रम जागेचे मूल्यांकन करून अधिक अनुकूलित पेप्टाइड्स ओळखले जाऊ शकतात. गृहीत धरल्यास, आम्हाला या पेप्टाइड्सचे कोणतेही नैसर्गिक समरूप न सापडण्याचे एक कारण म्हणजे, मेंदूमध्ये विशिष्ट पेप्टाइड मोटिफ्सचा अनियंत्रित प्रवेश रोखण्यासाठी उत्क्रांतीदरम्यान झालेली निवड-रद्दीकरण असू शकते.
एकत्रितपणे पाहता, आमचे निष्कर्ष भविष्यातील कार्यासाठी एक आधार प्रदान करतात, ज्याद्वारे सजीवांमध्ये (in vivo) सेरेब्रोव्हॅस्क्युलर बॅरियरच्या परिवहन प्रणाली अधिक तपशीलवारपणे ओळखता आणि त्यांचे वैशिष्ट्यीकरण करता येईल. या पद्धतीची मूलभूत रचना एका कार्यात्मक निवड धोरणावर आधारित आहे, जे केवळ सेरेब्रल व्हॅस्क्युलर बंधन गुणधर्म असलेले क्लोन्स ओळखत नाही, तर त्यात एक महत्त्वपूर्ण टप्पा देखील समाविष्ट आहे, ज्यामध्ये यशस्वी क्लोन्समध्ये सजीवांमध्ये (in vivo) जैविक अडथळे ओलांडून सीएनएस (CNS) विभागात जाण्याची आंतरिक क्रियाशीलता असते. या पेप्टाइड्सच्या परिवहनाची यंत्रणा आणि मेंदूच्या विशिष्ट भागातील सूक्ष्म रक्तवाहिन्यांशी (microvasculature) जोडले जाण्याची त्यांची पसंती स्पष्ट करणे हे यामागील उद्दिष्ट आहे. यामुळे रक्त-मेंदू अडथळा (BBB) ​​आणि रिसेप्टर्सच्या परिवहनासाठी नवीन मार्गांचा शोध लागू शकतो. आम्हाला अपेक्षा आहे की ओळखलेले पेप्टाइड्स थेट सेरेब्रोव्हॅस्क्युलर रिसेप्टर्सशी किंवा रक्त-मेंदू अडथळा (BBB) ​​किंवा मेंदू-मेंदू-सेरेब्रोव्हॅस्क्युलर बॅरियर (BCSFB) मधून परिवहन होणाऱ्या अभिसारी लिगँड्सशी (circulating ligands) जोडले जाऊ शकतात. या कार्यात शोधलेल्या सेरेब्रोव्हॅस्क्युलर (CSF) परिवहन क्रियाशीलता असलेल्या पेप्टाइड व्हेक्टर्सचा पुढील तपास केला जाईल. आम्ही सध्या या पेप्टाइड्सच्या रक्त-मेंदू अडथळा (BBB) ​​आणि/किंवा मेंदू-सेरेब्रोव्हॅस्क्युलर बॅरियर (BCSFB) ओलांडण्याच्या क्षमतेसाठी त्यांच्या मेंदू-विशिष्टतेचा तपास करत आहोत. हे नवीन पेप्टाइड्स, नवीन रिसेप्टर्स किंवा मार्गांच्या संभाव्य शोधासाठी आणि बायोलॉजिक्ससारख्या मॅक्रोमोलेक्यूल्सना मेंदूपर्यंत पोहोचवण्यासाठी नवीन अत्यंत कार्यक्षम प्लॅटफॉर्मच्या विकासासाठी अत्यंत मौल्यवान साधने ठरतील.
पूर्वी वर्णन केलेल्या पद्धतीत बदल करून मोठ्या सिस्टर्नामध्ये (CM) कॅन्युला टाका. भूल दिलेल्या विस्टार उंदरांना (२००-३५० ग्रॅम) स्टीरिओटॅक्सिक उपकरणावर बसवण्यात आले आणि कवटी उघडी करण्यासाठी, केस काढलेल्या व निर्जंतुक केलेल्या टाळूवर मध्यभागी एक छेद घेण्यात आला. वरच्या सॅशच्या भागात दोन छिद्रे पाडा आणि त्या छिद्रांमध्ये फिक्सिंग स्क्रू लावा. स्टेनलेस स्टीलचा कॅन्युला CM मध्ये स्टीरिओटॅक्टिक मार्गदर्शनाने टाकण्यासाठी लॅटरल ऑक्सिपिटल क्रेस्टमध्ये एक अतिरिक्त छिद्र पाडण्यात आले. कॅन्युलाभोवती डेंटल सिमेंट लावा आणि स्क्रूने घट्ट करा. फोटो-क्युरिंग आणि सिमेंट कडक झाल्यावर, त्वचेवरील जखम ४/० सुप्रामिड सिवनीने शिवण्यात आली. सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) आपोआप बाहेर येऊ लागल्यास कॅन्युला योग्य जागी बसल्याची खात्री होते. उंदराला स्टीरिओटॅक्सिक उपकरणावरून काढा, शस्त्रक्रियेनंतरची योग्य काळजी आणि वेदना व्यवस्थापन द्या, आणि सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमध्ये रक्ताची चिन्हे दिसेपर्यंत त्याला किमान एक आठवडा बरे होऊ द्या. विस्टार उंदीर (Crl:WI/Han) चार्ल्स रिव्हर (फ्रान्स) येथून मिळवण्यात आले. सर्व उंदीर विशिष्ट रोगजनक-मुक्त परिस्थितीत ठेवण्यात आले होते. सर्व प्राणी प्रयोगांना स्वित्झर्लंडमधील बासेल शहराच्या पशुवैद्यकीय कार्यालयाने मान्यता दिली होती आणि ते प्राणी परवाना क्रमांक २४७४ (उंदराच्या मस्तिष्कमेरु द्रव आणि मेंदूतील उपचारात्मक उमेदवारांच्या पातळीचे मापन करून सक्रिय मेंदू वहनाचे मूल्यांकन) नुसार करण्यात आले.
हातात सीएम कॅन्युला धरून उंदराला हळुवारपणे शुद्धीवर ठेवा. कॅन्युलामधून दातुरा काढा आणि आपोआप वाहणारे १० µl मस्तिष्कमेरु द्रव (CSF) गोळा करा. कॅन्युलाची कार्यक्षमता अखेरीस धोक्यात आल्यामुळे, या अभ्यासात केवळ रक्ताच्या दूषिततेचा किंवा रंगातील बदलाचा कोणताही पुरावा नसलेले स्वच्छ मस्तिष्कमेरु द्रवाचे नमुने समाविष्ट केले गेले. त्याच वेळी, शेपटीच्या टोकावरील एका लहान छेदातून हेपॅरिन (सिग्मा-अल्ड्रिच) असलेल्या नळ्यांमध्ये अंदाजे १०-२० μl रक्त घेण्यात आले. T7 फेजचे शिरेतून इंजेक्शन दिल्यानंतर वेगवेगळ्या वेळी CSF आणि रक्त गोळा करण्यात आले. प्रत्येक CSF नमुना गोळा करण्यापूर्वी अंदाजे ५-१० μl द्रव टाकून देण्यात आला, जो कॅथेटरच्या डेड व्हॉल्यूमशी जुळतो.
T7Select सिस्टीम मॅन्युअलमध्ये (नोव्हाजेन, रोझेनबर्ग इत्यादी, इननोव्हेशन्स ६, १-६, १९९६) वर्णन केल्यानुसार T7Select 10-3b व्हेक्टरचा वापर करून लायब्ररी तयार करण्यात आल्या. थोडक्यात, एक यादृच्छिक १२-मर डीएनए इन्सर्ट खालील स्वरूपात संश्लेषित करण्यात आला:
इन्सर्टमधील दुहेरी स्टॉप कोडॉन आणि अमिनो ॲसिडचे अति-अभिव्यक्ती टाळण्यासाठी NNK कोडॉनचा वापर करण्यात आला. N हे प्रत्येक न्यूक्लिओटाइडचे हाताने मिसळलेले सम-मोलर प्रमाण आहे, आणि K हे ॲडेनाइन व सायटोसिन न्यूक्लिओटाइड्सचे हाताने मिसळलेले सम-मोलर प्रमाण आहे. एकेरी-धाग्याच्या भागांना क्लेनो बफरमध्ये (न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स) dNTP (नोव्हाजेन) आणि क्लेनो एन्झाइम (न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स) सोबत ३७°C तापमानावर ३ तास ​​उबवून दुहेरी-धाग्याच्या DNA मध्ये रूपांतरित करण्यात आले. अभिक्रियेनंतर, EtOH अवक्षेपणाद्वारे दुहेरी-धाग्याचा DNA मिळवण्यात आला. परिणामी मिळालेल्या DNA चे EcoRI आणि HindIII (दोन्ही रोश कंपनीचे) या रेस्ट्रिक्शन एन्झाइम्सद्वारे पाचन करण्यात आले. त्यानंतर, कापलेला आणि शुद्ध केलेला (QIAquick, कियाजेन) इन्सर्ट (T4 लायगेज, न्यू इंग्लंड बायोलॅब्स) 10B कॅप्सिड जीनच्या ३४८ व्या अमिनो ॲसिडनंतर, आधीच कापलेल्या T7 व्हेक्टरमध्ये इन-फ्रेम जोडण्यात आला. इन विट्रो पॅकेजिंग करण्यापूर्वी लायगेशन अभिक्रिया १८ तासांसाठी १६° से. तापमानावर उबवल्या गेल्या. टी७सिलेक्ट १०-३बी क्लोनिंग किट (नोव्हाजेन) सोबत दिलेल्या सूचनांनुसार इन विट्रो फेज पॅकेजिंग करण्यात आले आणि पॅकेजिंग द्रावणाचे एशेरिकिया कोलाय (बीएलटी५६१५, नोव्हाजेन) वापरून एकदा लायसिस होईपर्यंत प्रवर्धन करण्यात आले. लायसेट्सचे सेंट्रीफ्युगेशन करून, टायट्रेशन केले गेले आणि ग्लिसरॉलचे स्टॉक द्रावण म्हणून -८०° से. तापमानावर गोठवले गेले.
मालकीच्या 454/रोश-अँप्लिकॉन फ्यूजन प्राइमर्सचा वापर करून ब्रॉथ किंवा प्लेटमध्ये अँप्लिफाय केलेल्या फेज व्हेरिएबल रिजनचे थेट PCR अँप्लिफिकेशन. फॉरवर्ड फ्यूजन प्राइमरमध्ये व्हेरिएबल रिजनच्या दोन्ही बाजूंना असलेले सिक्वेन्सेस (NNK) 12 (टेम्पलेट-विशिष्ट), GS FLX टायटॅनियम अडॅप्टर A, आणि चार-बेस लायब्ररी की सिक्वेन्स (TCAG) यांचा समावेश आहे (पूरक आकृती 1a):
रिव्हर्स फ्युजन प्रायमरमध्ये कॅप्चर बीड्सना जोडलेले बायोटिन आणि इमल्शन पीसीआर दरम्यान क्लोनल ॲम्प्लिफिकेशनसाठी आवश्यक असलेला जीएस एफएलएक्स टायटॅनियम ॲडॉप्टर बी यांचाही समावेश असतो:
त्यानंतर 454 GS-FLX टायटॅनियम प्रोटोकॉलनुसार ॲम्प्लिकॉन्सचे 454/रोश पायरोसिक्वेन्सिंग करण्यात आले. मॅन्युअल सँगर सिक्वेन्सिंगसाठी (ॲप्लाइड बायोसिस्टम्स हिताची 3730 xl डीएनए ॲनालायझर), T7 फेज डीएनए पीसीआरद्वारे ॲम्प्लिफाय करण्यात आला आणि खालील प्रायमर जोड्या वापरून त्याचे सिक्वेन्सिंग करण्यात आले:
प्रत्येक प्लेक्समधील इन्सर्ट्सचे रोश फास्ट स्टार्ट डीएनए पॉलिमरेज किट वापरून (उत्पादकाच्या सूचनांनुसार) पीसीआर ॲम्प्लिफिकेशन करण्यात आले. एक हॉट स्टार्ट (95 °C वर 10 मिनिटे) आणि 35 बूस्ट सायकल (95 °C वर 50 सेकंद, 50 °C वर 1 मिनिट आणि 72 °C वर 1 मिनिट) करा.
लायब्ररीमधील फेज, वाइल्ड-टाइप फेज, CSF आणि रक्तामधून मिळवलेले फेज, किंवा वैयक्तिक क्लोन्स यांचे एशेरिकिया कोलाय BL5615 मध्ये टीबी ब्रॉथ (सिग्मा एल्ड्रिच) मध्ये किंवा ५०० सेमी² डिशेसमध्ये (थर्मो सायंटिफिक) ३७°C तापमानावर ४ तास प्रवर्धन करण्यात आले. प्लेट्सना ट्रिस-ईडीटीए बफरने (फ्लुका ॲनालिटिकल) धुवून किंवा निर्जंतुक पिपेट टिप्सने प्लेक्स गोळा करून प्लेट्समधून फेज काढण्यात आले. पॉलीएथिलीन ग्लायकॉल (PEG 8000) अवक्षेपणाच्या (प्रोमेगा) एका फेरीने कल्चर सुपरनॅटंट किंवा एक्सट्रॅक्शन बफरमधून फेज वेगळे करण्यात आले आणि त्यांना ट्रिस-ईडीटीए बफरमध्ये पुन्हा निलंबित करण्यात आले.
शिरावाटे (IV) इंजेक्शन (५०० μl/प्राणी) देण्यापूर्वी, वाढवलेल्या फेजवर एंडोटॉक्सिन रिमूव्हल बीड्स (मिल्टेनी बायोटेक) वापरून एंडोटॉक्सिन काढण्याच्या २-३ फेऱ्या करण्यात आल्या. पहिल्या फेरीत, २×१०¹² फेज टाकण्यात आले; दुसऱ्या फेरीत, २×१०¹⁰ फेज; आणि तिसऱ्या व चौथ्या निवड फेऱ्यांमध्ये, प्रत्येक प्राण्यामागे २×१०⁹ फेज टाकण्यात आले. नमूद केलेल्या वेळी गोळा केलेल्या CSF आणि रक्ताच्या नमुन्यांमधील फेजचे प्रमाण, उत्पादकाच्या सूचनांनुसार (T7Select सिस्टीम मॅन्युअल) प्लाक काउंटिंगद्वारे निश्चित करण्यात आले. फेजची निवड, शुद्ध केलेल्या लायब्ररीजचे शेपटीच्या शिरेमध्ये इंजेक्शन देऊन किंवा मागील निवड फेरीतील CSF मधून काढलेल्या फेजचे पुन्हा इंजेक्शन देऊन करण्यात आली, आणि त्यानंतरचे नमुने अनुक्रमे १० मिनिटे, ३० मिनिटे, ६० मिनिटे, ९० मिनिटे, १२० मिनिटे, १८० मिनिटे आणि २४० मिनिटांनी CSF आणि रक्ताच्या नमुन्यांमधून काढण्यात आले. एकूण चार फेऱ्यांमध्ये इन व्हिविओ पॅनिंग (in vivo panning) करण्यात आले, ज्यामध्ये निवडीच्या पहिल्या तीन फेऱ्यांदरम्यान निवडलेल्या दोन शाखा स्वतंत्रपणे साठवून त्यांचे विश्लेषण करण्यात आले. निवडीच्या पहिल्या दोन फेऱ्यांमधील CSF मधून काढलेल्या सर्व फेज इन्सर्ट्सचे 454/रोश पायरोसिक्वेन्सिंग (454/Roche pyrosequencing) करण्यात आले, तर निवडीच्या शेवटच्या दोन फेऱ्यांमधील CSF मधून काढलेल्या सर्व क्लोन्सचे मॅन्युअली सिक्वेन्सिंग (manual sequenced) करण्यात आले. निवडीच्या पहिल्या फेरीतील सर्व ब्लड फेजेसचे देखील 454/रोश पायरोसिक्वेन्सिंग करण्यात आले. फेज क्लोन्सच्या इंजेक्शनसाठी, निवडलेले फेजेस E. coli (BL5615) मध्ये 500 cm2 प्लेट्सवर 37°C तापमानावर 4 तासांसाठी प्रवर्धित (amplified) करण्यात आले. स्वतंत्रपणे निवडलेले आणि मॅन्युअली सिक्वेन्स केलेले क्लोन्स टीबी माध्यमात (TB medium) वाढवण्यात आले. फेजचे निष्कर्षण, शुद्धीकरण आणि एंडोटॉक्सिन काढून टाकल्यानंतर (वर वर्णन केल्याप्रमाणे), 300 μl मध्ये 2×10¹⁰ फेजेस/प्राणी एका शेपटीच्या शिरेमध्ये इंट्राव्हेनसली (intravenously) इंजेक्ट करण्यात आले.
सिक्वेन्स डेटाचे प्रीप्रोसेसिंग आणि गुणात्मक फिल्टरिंग. विक्रेता सॉफ्टवेअर वापरून कच्चा 454/रोश डेटा बायनरी स्टँडर्ड स्ट्रीम मॅप फॉरमॅट (sff) मधून पिअरसन मानवी वाचनीय फॉरमॅट (fasta) मध्ये रूपांतरित करण्यात आला. खाली वर्णन केल्याप्रमाणे, मालकीच्या C प्रोग्राम्स आणि स्क्रिप्ट्स (अप्रकाशित सॉफ्टवेअर पॅकेज) वापरून न्यूक्लिओटाइड सिक्वेन्सवर पुढील प्रक्रिया करण्यात आली. प्राथमिक डेटाच्या विश्लेषणात कठोर बहु-स्तरीय फिल्टरिंग प्रक्रियांचा समावेश आहे. वैध 12mer इन्सर्ट डीएनए सिक्वेन्स नसलेले रीड्स फिल्टर करण्यासाठी, ग्लोबल नीडलमन-वुन्श चाचणी वापरून रीड्सना स्टार्ट लेबल (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), स्टॉप लेबल (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) आणि बॅकग्राउंड इन्सर्ट (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) सोबत अनुक्रमे अलाइन करण्यात आले. या अलाइनमेंटमध्ये प्रति अलाइनमेंट 2 विसंगतींपर्यंत परवानगी होती³¹. त्यामुळे, स्टार्ट आणि स्टॉप टॅग नसलेले रीड्स आणि बॅकग्राउंड इन्सर्ट असलेले रीड्स, म्हणजेच, परवानगी असलेल्या विसंगतींच्या संख्येपेक्षा जास्त असलेल्या अलाइनमेंट्स, लायब्ररीमधून काढून टाकण्यात आले. उर्वरित रीड्सच्या बाबतीत, स्टार्ट मार्कपासून सुरू होऊन स्टॉप मार्कच्या आधी संपणारा एन-मर डीएनए क्रम मूळ रीड क्रमामधून कापून काढण्यात आला आणि त्यावर पुढील प्रक्रिया करण्यात आली (यापुढे याला "इन्सर्ट" म्हटले जाईल). इन्सर्टच्या भाषांतरानंतर, प्रायमरच्या ५' टोकावरील पहिल्या स्टॉप कोडॉननंतरचा भाग इन्सर्टमधून काढून टाकला जातो. याव्यतिरिक्त, प्रायमरच्या ३' टोकावर अपूर्ण कोडॉन निर्माण करणारे न्यूक्लिओटाइड्स देखील काढून टाकण्यात आले. केवळ बॅकग्राउंड क्रम असलेले इन्सर्ट वगळण्यासाठी, "PAG" या अमिनो ॲसिड पॅटर्नने सुरू होणारे भाषांतरित इन्सर्ट देखील काढून टाकण्यात आले. भाषांतरानंतरची लांबी ३ अमिनो ॲसिडपेक्षा कमी असलेले पेप्टाइड्स लायब्ररीमधून काढून टाकण्यात आले. शेवटी, इन्सर्ट पूलमधील अनावश्यकता दूर करा आणि प्रत्येक अद्वितीय इन्सर्टची वारंवारता निश्चित करा. या विश्लेषणाच्या परिणामांमध्ये न्यूक्लिओटाइड क्रमांची (इन्सर्ट्स) यादी आणि त्यांची (रीड) वारंवारता समाविष्ट होती (पूरक आकृत्या १क आणि २).
अनुक्रम समानतेनुसार एन-मर डीएनए इन्सर्ट्सचे गट करणे: 454/रोश-विशिष्ट अनुक्रमण त्रुटी (जसे की होमोपॉलिमर एक्सटेंशन्सच्या अनुक्रमणातील समस्या) दूर करण्यासाठी आणि कमी महत्त्वाच्या अनावश्यकता काढून टाकण्यासाठी, पूर्वी फिल्टर केलेले एन-मर डीएनए अनुक्रम इन्सर्ट्स (इन्सर्ट्स) खालीलप्रमाणे परिभाषित केलेल्या पुनरावृत्ती अल्गोरिदमचा वापर करून समानतेनुसार क्रमवारी लावली जाते (जास्तीत जास्त २ न जुळणारे बेस अनुमत आहेत): इन्सर्ट्सची क्रमवारी प्रथम त्यांच्या वारंवारतेनुसार (सर्वाधिक ते सर्वात कमी) लावली जाते, आणि जर त्या समान असतील, तर त्यांच्या लांबीनुसार (सर्वात लांब ते सर्वात लहान) दुय्यम क्रमवारी लावली जाते. अशाप्रकारे, सर्वात वारंवार येणारे आणि सर्वात लांब इन्सर्ट्स पहिला "गट" परिभाषित करतात. गटाची वारंवारता मुख्य वारंवारतेवर सेट केली जाते. त्यानंतर, क्रमवारी लावलेल्या यादीत राहिलेल्या प्रत्येक इन्सर्टला जोडीने नीडलमन-वुन्श अलाइनमेंटद्वारे गटात जोडण्याचा प्रयत्न केला जातो. जर अलाइनमेंटमधील मिसमॅचेस, इन्सर्ट्स किंवा डिलीशन्सची संख्या २ च्या मर्यादेपेक्षा जास्त नसेल, तर एक इन्सर्ट गटात जोडला जातो आणि तो इन्सर्ट किती वेळा जोडला गेला त्यानुसार एकूण गटाची वारंवारता वाढवली जाते. एका गटामध्ये जोडलेले इन्सर्ट्स 'वापरलेले' म्हणून चिन्हांकित केले जातात आणि पुढील प्रक्रियेतून वगळले जातात. जर इन्सर्ट सिक्वेन्स आधीपासून अस्तित्वात असलेल्या गटामध्ये जोडता येत नसेल, तर त्या इन्सर्ट सिक्वेन्सचा वापर करून योग्य इन्सर्ट फ्रिक्वेन्सीसह एक नवीन गट तयार केला जातो आणि तो 'वापरलेला' म्हणून चिन्हांकित केला जातो. जेव्हा प्रत्येक इन्सर्शन सिक्वेन्सचा वापर एकतर नवीन गट तयार करण्यासाठी केला जातो किंवा तो आधीपासून अस्तित्वात असलेल्या गटामध्ये समाविष्ट केला जाऊ शकतो, तेव्हा ही पुनरावृत्ती समाप्त होते. अखेरीस, न्यूक्लिओटाइड्सनी बनलेल्या गटबद्ध इन्सर्ट्सचे पेप्टाइड सिक्वेन्समध्ये (पेप्टाइड लायब्ररीज) भाषांतर केले जाते. या विश्लेषणाचा परिणाम म्हणजे इन्सर्शन्सचा एक संच आणि त्यांच्या संबंधित फ्रिक्वेन्सी, ज्या मिळून सलग रीड्सची संख्या (पूरक आकृती २) तयार होते.
मोटिफ निर्मिती: अद्वितीय पेप्टाइड्सच्या सूचीवर आधारित, खाली दर्शविल्याप्रमाणे सर्व संभाव्य अमिनो आम्ल पॅटर्न (aa) असलेली एक लायब्ररी तयार केली गेली. पेप्टाइडमधून ३ लांबीचा प्रत्येक संभाव्य पॅटर्न काढण्यात आला आणि त्याचा व्यस्त पॅटर्न, सर्व पॅटर्न (ट्रायपेप्टाइड्स) असलेल्या सामान्य मोटिफ लायब्ररीसह जोडण्यात आला. अत्यंत पुनरावृत्ती होणाऱ्या मोटिफ्सच्या लायब्ररींचे अनुक्रमण (sequencing) केले गेले आणि त्यातील अनावश्यकता काढून टाकण्यात आली. त्यानंतर, मोटिफ लायब्ररीमधील प्रत्येक ट्रायपेप्टाइडसाठी, आम्ही संगणकीय साधनांचा वापर करून लायब्ररीमध्ये त्याची उपस्थिती तपासली. या प्रकरणात, आढळलेला मोटिफ ट्रायपेप्टाइड असलेल्या पेप्टाइडची वारंवारता जोडली जाते आणि मोटिफ लायब्ररीमधील मोटिफला नियुक्त केली जाते ("मोटिफ्सची संख्या"). मोटिफ निर्मितीचा परिणाम म्हणजे एक द्विमितीय अॅरे, ज्यामध्ये ट्रायपेप्टाइड्सच्या (मोटिफ्सच्या) सर्व घटना आणि त्यांची संबंधित मूल्ये असतात. ही मूल्ये म्हणजे सिक्वेन्सिंग रीड्सची संख्या, ज्यामुळे रीड्स फिल्टर, गटबद्ध आणि अनुवादित केल्यावर संबंधित मोटिफ मिळतो. मेट्रिक्सचे तपशीलवार वर्णन वर केले आहे.
मोटिफ्सच्या संख्येचे सामान्यीकरण आणि संबंधित स्कॅटरप्लॉट्स: प्रत्येक नमुन्यासाठी मोटिफ्सची संख्या वापरून सामान्यीकृत करण्यात आली.
येथे ni म्हणजे टॉपिक i असलेल्या रीड्सची संख्या आहे. अशाप्रकारे, vi हे नमुन्यातील मोटिफ i असलेल्या रीड्सची (किंवा पेप्टाइड्सची) टक्केवारी वारंवारता दर्शवते. मोटिफ्सच्या नॉन-नॉर्मलाइज्ड संख्येसाठी P-व्हॅल्यूज फिशरच्या अचूक चाचणीचा वापर करून मोजण्यात आल्या. मोटिफ्सच्या संख्येच्या कोरिओग्राम्सच्या संदर्भात, R वापरून नॉर्मलाइज्ड मोटिफ्सच्या संख्येसह स्पीअरमनचे सहसंबंध मोजण्यात आले.
पेप्टाइड लायब्ररीमधील प्रत्येक स्थानावरील अमिनो ॲसिडचे प्रमाण दृश्यमान करण्यासाठी, वेब लॉगोग्राम ३२, ३३ (http://weblogo.threeplusone.com) तयार करण्यात आले. सर्वप्रथम, १२-मर पेप्टाइडच्या प्रत्येक स्थानावरील अमिनो ॲसिडचे प्रमाण एका २०×१२ मॅट्रिक्समध्ये साठवले जाते. त्यानंतर, प्रत्येक स्थानावर समान सापेक्ष अमिनो ॲसिड प्रमाण असलेल्या १००० पेप्टाइड्सचा एक संच फास्टा-सिक्वेन्स स्वरूपात तयार केला जातो आणि वेब-लोगो ३ ला इनपुट म्हणून दिला जातो, जो दिलेल्या पेप्टाइड लायब्ररीसाठी प्रत्येक स्थानावरील सापेक्ष अमिनो ॲसिड प्रमाणाचे आलेखी सादरीकरण तयार करतो. बहुआयामी डेटासेट दृश्यमान करण्यासाठी, R मधील अंतर्गत विकसित साधन (biosHeatmap, एक अद्याप प्रकाशित न झालेले R पॅकेज) वापरून हीट मॅप्स तयार करण्यात आले. हीट मॅप्समध्ये सादर केलेले डेंड्रोग्राम्स युक्लिडियन अंतर मेट्रिकसह वॉर्डच्या पदानुक्रमित क्लस्टरिंग पद्धतीचा वापर करून मोजण्यात आले. मोटिफ स्कोअरिंग डेटाच्या सांख्यिकीय विश्लेषणासाठी, अननॉर्मलाइज्ड स्कोअरिंगसाठी पी-व्हॅल्यूज फिशरच्या एक्झॅक्ट टेस्टचा वापर करून मोजण्यात आल्या. इतर डेटासेटसाठी पी-व्हॅल्यूज आर (R) मध्ये स्टुडंटच्या टी-टेस्ट किंवा ॲनोव्हा (ANOVA) चा वापर करून मोजण्यात आल्या.
निवडलेले फेज क्लोन्स आणि इन्सर्ट नसलेले फेज शेपटीच्या शिरेद्वारे शिरावाटे टोचण्यात आले (३०० μl PBS मध्ये २×१०¹⁰ फेज/प्राणी). परफ्यूजन आणि त्यानंतरच्या फिक्सेशनच्या दहा मिनिटे आधी, त्याच प्राण्यांना १०० μl डायलाइट५९४-लेबल केलेले लेक्टिन (व्हेक्टर लॅबोरेटरीज इंक., DL-1177) शिरावाटे टोचण्यात आले. फेज इंजेक्शननंतर ६० मिनिटांनी, उंदरांच्या हृदयातून ५० ml PBS आणि त्यानंतर ५० ml ४% PFA/PBS ने परफ्यूजन करण्यात आले. मेंदूचे नमुने अतिरिक्तपणे ४% PFA/PBS मध्ये रात्रभर फिक्स करण्यात आले आणि ४°C तापमानावर रात्रभर ३०% सुक्रोजमध्ये भिजवून ठेवण्यात आले. नमुने OCT मिश्रणामध्ये त्वरित गोठवले जातात. गोठवलेल्या नमुन्यांचे इम्युनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण खोलीच्या तापमानावर करण्यात आले. यासाठी १% BSA ने ब्लॉक केलेल्या ३० µm क्रायोसेक्शन्सना ४ °C तापमानावर T7 फेज विरुद्धच्या पॉलीक्लोनल FITC-लेबल केलेल्या अँटीबॉडीज (Novus NB 600-376A) सोबत इनक्युबेट करण्यात आले. रात्रभर इनक्युबेट केले. शेवटी, सेक्शन्सना PBS ने ३ वेळा धुतले आणि कॉन्फोकल लेझर मायक्रोस्कोप (Leica TCS SP5) वापरून तपासले.
किमान ९८% शुद्धता असलेले सर्व पेप्टाइड्स जेनस्क्रिप्ट यूएसए द्वारे संश्लेषित, बायोटिनयुक्त आणि लायोफिलाइज्ड करण्यात आले. एन-टर्मिनसवर एका अतिरिक्त ट्रिपल ग्लायसिन स्पेसरद्वारे बायोटिन जोडलेले आहे. मास स्पेक्ट्रोमेट्री वापरून सर्व पेप्टाइड्स तपासा.
स्ट्रेप्टाव्हिडिन (सिग्मा S0677) हे बायोटिनिलेटेड पेप्टाइड, बायोटिनिलेटेड BACE1 इनहिबिटरी पेप्टाइड, किंवा बायोटिनिलेटेड BACE1 इनहिबिटरी पेप्टाइड आणि BACE1 इनहिबिटरी पेप्टाइड यांच्या मिश्रणाच्या (३:१ गुणोत्तर) ५-पट सममोल अतिरिक्त प्रमाणासह ५-१०% DMSO मध्ये मिसळले गेले आणि PBS मध्ये उबवले गेले. इंजेक्शन देण्यापूर्वी १ तास खोलीच्या तापमानावर ठेवले. स्ट्रेप्टाव्हिडिन-संयुग्मित पेप्टाइड्स हे मेंदूची पोकळी असलेल्या उंदरांच्या शेपटीच्या एका शिरेमध्ये १० मिग्रॅ/किलो या मात्रेत शिरावाटे टोचले गेले.
स्ट्रेप्टाव्हिडिन-पेप्टाइड कॉम्प्लेक्सची सांद्रता ELISA द्वारे तपासण्यात आली. नंक मॅक्सिसॉर्प मायक्रोटायटर प्लेट्स (सिग्मा) 4°C तापमानावर रात्रभर 1.5 μg/ml माऊस अँटी-स्ट्रेप्टाव्हिडिन अँटीबॉडीने (थर्मो, MA1-20011) लेपित करण्यात आल्या. खोलीच्या तापमानावर 2 तास ब्लॉकिंग (ब्लॉकिंग बफर: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% जिलेटिन, 1% BSA) केल्यानंतर, प्लेट 0.05% ट्विन-20/PBS (वॉश बफर) ने 3 सेकंदांसाठी धुतली गेली. त्यानंतर CSF आणि प्लाझ्माचे नमुने ब्लॉकिंग बफरने पातळ करून वेल्समध्ये टाकण्यात आले (प्लाझ्मा 1:10,000, CSF 1:115). त्यानंतर प्लेट 4°C तापमानावर रात्रभर डिटेक्शन अँटीबॉडीसह (1 μg/ml, अँटी-स्ट्रेप्टाव्हिडिन-HRP, नोव्हस NB120-7239) इनक्युबेट करण्यात आली. तीन वेळा धुण्याच्या प्रक्रियेनंतर, TMB सबस्ट्रेट द्रावणात (रोश) २० मिनिटांपर्यंत उबवून स्ट्रेप्टाव्हिडिन शोधण्यात आले. 1M H2SO4 वापरून रंगाची निर्मिती थांबवल्यानंतर, 450 nm वर शोषणक्षमता मोजा.
स्ट्रेप्टाव्हिडिन-पेप्टाइड-BACE1 इनहिबिटर कॉम्प्लेक्सच्या कार्याचे मूल्यांकन उत्पादकाच्या प्रोटोकॉलनुसार (वाको, 294-64701) Aβ(1-40) ELISA द्वारे करण्यात आले. थोडक्यात, CSF नमुने मानक डायल्यूएंटमध्ये (१:२३) विरळ केले गेले आणि BNT77 कॅप्चर अँटीबॉडीने लेपित केलेल्या ९६-वेल प्लेट्समध्ये ४°C तापमानावर रात्रभर इनक्युबेट केले गेले. पाच वेळा धुतल्यानंतर, HRP-कॉन्जुगेटेड BA27 अँटीबॉडी टाकण्यात आली आणि ४°C तापमानावर २ तास इनक्युबेट करण्यात आली, त्यानंतर पुन्हा पाच वेळा धुण्यात आले. खोलीच्या तापमानावर ३० मिनिटांसाठी TMB द्रावणात इनक्युबेट करून Aβ(1–40) शोधण्यात आले. स्टॉप सोल्यूशनने रंग विकसित होणे थांबवल्यानंतर, ४५० nm वर ॲब्सॉर्बन्स मोजण्यात आला. Aβ(1–40) ELISA करण्यापूर्वी प्लाझ्मा नमुन्यांवर सॉलिड फेज एक्सट्रॅक्शन प्रक्रिया करण्यात आली. प्लाझ्मा ९६-वेल प्लेट्समधील ०.२% DEA (सिग्मा) मध्ये टाकण्यात आला आणि खोलीच्या तापमानावर ३० मिनिटांसाठी इनक्युबेट करण्यात आला. SPE प्लेट्स (Oasis, 186000679) पाण्याने आणि १००% मिथेनॉलने क्रमशः धुतल्यानंतर, प्लाझ्माचे नमुने SPE प्लेट्समध्ये टाकण्यात आले आणि सर्व द्रव काढून टाकण्यात आला. नमुने धुतले गेले (प्रथम ५% मिथेनॉलने, नंतर ३०% मिथेनॉलने) आणि २% NH4OH/९०% मिथेनॉलने विलग केले गेले. स्थिर N2 प्रवाहावर ५५°C तापमानावर ९९ मिनिटांसाठी विलगित द्रव सुकवल्यानंतर, नमुने प्रमाणित विरलकांमध्ये क्षीण केले गेले आणि वर वर्णन केल्याप्रमाणे Aβ(1–40) चे मापन केले गेले.
या लेखाचा संदर्भ कसा द्यावा: युरिच, ई. व इतर. इन विवोमध्ये ओळखलेल्या ट्रान्झिट पेप्टाइड्सचा वापर करून मेंदूला कार्गो डिलिव्हरी. द सायन्स. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
लिखोटा जे., स्कोरिंगे टी., थॉमसेन एलबी आणि मूस टी. लक्ष्यित थेरपी वापरून मेंदूमध्ये मॅक्रोमोलेक्युलर औषधांचे वितरण. जर्नल ऑफ न्यूरोकेमिस्ट्री 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
ब्रास्नेविच, आय., स्टाइनबुश, एचडब्ल्यू, श्मिट्झ, सी., आणि मार्टिनेझ-मार्टिनेझ, पी. रक्त-मेंदू अडथळ्यामधून पेप्टाइड आणि प्रथिन औषधांचे वितरण. प्रोग न्यूरोबायोल 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
पार्ड्रिज, डब्ल्यूएम रक्त-मेंदू अडथळा: मेंदूच्या औषध विकासातील एक अडथळा. न्यूरोआरएक्स 2, 3-14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
जोहानसन, केई, डंकन, जेए, स्टॉपा, ईजी, आणि बर्ड, ए. कोरोइड प्लेक्सस-सीएसएफ मार्गाद्वारे मेंदूमध्ये सुधारित औषध वितरण आणि लक्ष्यीकरणाची शक्यता. फार्मास्युटिकल रिसर्च 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
पार्ड्रिज, डब्ल्यूएम मेंदूत पोहोचवण्यासाठी आण्विक ट्रोजन हॉर्ससह बायोफार्मास्युटिकल्सचे आधुनिकीकरण. बायोकोंजुग केम 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
पार्ड्रिज, रक्त-मेंदू अडथळ्यापलीकडे डब्ल्यूएम रिसेप्टर-मध्यस्थ पेप्टाइड वाहतूक. एंडोक्राइन रिव्ह्यू. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Increase brain penetration and efficacy of therapeutic antibodies using monovalent molecular shuttles. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
बिएन-ली, एन. व इतर. ट्रान्सफेरिन रिसेप्टर (TfR) वाहतूक TfR अँटीबॉडीजच्या ॲफिनिटी प्रकारांचे मेंदूतील ग्रहण ठरवते. जे एक्सप मेड 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).