Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз CSS колдоосу чектелген браузер версиясын колдонуп жатасыз. Эң жакшы тажрыйба алуу үчүн, биз сизге жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде Шайкештик режимин өчүрүңүз). Мындан тышкары, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн, биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Бир эле учурда үч слайддын каруселин көрсөтөт. Бир убакта үч слайддын арасынан жылуу үчүн "Мурунку" жана "Кийинки" баскычтарын колдонуңуз же бир убакта үч слайддын арасынан жылуу үчүн аягындагы жылдыргыч баскычтарын колдонуңуз.
Гематоэнцефалдык тосмо жана гематоэнцефалдык тосмо биотерапиялык агенттердин борбордук нерв системасындагы максаттарына жетүүсүнө тоскоол болуп, неврологиялык ооруларды натыйжалуу дарылоого тоскоол болот. In vivo шартында жаңы мээ ташуучуларын табуу үчүн биз T7 фаг пептиддеринин китепканасын киргизип, келемиштердин каннуляцияланган аң-сезимдүү чоң пул моделин колдонуп, канды жана жүлүн суюктугун (ЖЖС) сериялык түрдө чогулттук. Төрт тандоодон кийин фагдын белгилүү клондору ЖЖСга абдан байытылган. Жеке талапкер пептиддерди сыноо ЖЖСнын 1000 эседен ашык байыгандыгын көрсөттү. Пептид аркылуу мээге жеткирүүнүн биоактивдүүлүгү аныкталган жаңы транзиттик пептидге байланышкан BACE1 пептид ингибиторун колдонуу менен жүлүн суюктугундагы амилоид-β деңгээлинин 40% га төмөндөшү менен тастыкталды. Бул жыйынтыктар in vivo фаг тандоо ыкмалары менен аныкталган пептиддер макромолекулаларды мээге терапиялык таасир менен системалуу жеткирүү үчүн пайдалуу каражаттар болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Борбордук нерв системасынын (БНС) максаттуу терапиясын изилдөө негизинен БНСти бутага алуучу касиеттерди көрсөткөн оптималдаштырылган дары-дармектерди жана агенттерди аныктоого багытталган, мээге активдүү дары-дармек жеткирүү механизмдерин ачууга аз күч жумшалган. Дары-дармек жеткирүү, айрыкча чоң молекулалар, заманбап нейробиологиялык дары-дармектерди иштеп чыгуунун ажырагыс бөлүгү болгондуктан, бул азыр өзгөрө баштады. Борбордук нерв системасынын чөйрөсү кан-мээ тосмосунан (BBB) ​​жана кан-мээ тосмосунан (BCBB) турган цереброваскулярдык тосмо системасы менен жакшы корголгон1,2, бул дары-дармектерди мээге жеткирүүнү кыйындатат1,2. Дээрлик бардык чоң молекулалуу дары-дармектер жана кичинекей молекулалуу дары-дармектердин 98% дан ашыгы мээден чыгарылат3 деп болжолдонууда. Ошондуктан БНСке терапиялык дары-дармектерди натыйжалуу жана спецификалык жеткирүүнү камсыз кылган жаңы мээ транспорт системаларын аныктоо абдан маанилүү4,5. Бирок, BBB жана BCSFB да дары-дармектерди жеткирүү үчүн эң сонун мүмкүнчүлүк берет, анткени алар мээнин кеңири кан тамырлары аркылуу анын бардык түзүмдөрүнө кирип, кирет. Ошентип, мээге жеткирүүнүн инвазивдүү эмес ыкмаларын колдонуу боюнча учурдагы аракеттер көбүнчө эндогендик BBB6 рецепторун колдонуу менен рецептор аркылуу ташуунун (PMT) механизмине негизделген. Трансферрин рецепторунун жолун колдонуудагы акыркы маанилүү жетишкендиктерге карабастан7,8, жакшыртылган касиеттери бар жаңы жеткирүү системаларын андан ары иштеп чыгуу талап кылынат. Бул үчүн биздин максатыбыз жүлүн суюктугун ташууну ортомчулук кылууга жөндөмдүү пептиддерди аныктоо болчу, анткени алар принцип боюнча борбордук нерв системасына макромолекулаларды жеткирүү же жаңы рецептордук жолдорду ачуу үчүн колдонулушу мүмкүн. Атап айтканда, мээ кан тамыр системасынын белгилүү бир рецепторлору жана ташуучулары (BBB жана BSCFB) биотерапиялык дары-дармектерди активдүү жана спецификалык жеткирүү үчүн потенциалдуу бута катары кызмат кыла алат. Жүлүн суюктугу (ЖЖС) хориоиддик плексустун (КӨ) секретордук продуктусу болуп саналат жана субарахноиддик мейкиндик жана карынча мейкиндиги аркылуу мээнин интерстициалдык суюктугу менен түз байланышта болот4. Жакында эле субарахноиддик жүлүн суюктугу мээнин интерстициалдык бөлүкчөсүнө ашыкча диффузияланаары көрсөтүлдү9. Биз паренхималдык мейкиндикке ушул субарахноидалдык агып кирүү жолун колдонуп же түздөн-түз ГЭБ аркылуу жетүүнү үмүттөнөбүз. Буга жетүү үчүн биз ушул эки башка жолдун бири менен ташылган пептиддерди идеалдуу түрдө аныктоочу күчтүү in vivo фаг тандоо стратегиясын ишке ашырдык.
Эми биз эң жогорку китепкана ар түрдүүлүгү менен баштапкы тандоо раунддарын көзөмөлдөө үчүн жүлүн суюктугунан үлгү алуу менен бирге жогорку өткөрүү жөндөмдүүлүгүн ырааттуу түрдө in vivo фаг дисплей скрининг ыкмасын сүрөттөйбүз. Скрининг кандын булганышына жол бербөө үчүн туруктуу имплантацияланган чоң цистерна (CM) канюлясы бар аң-сезимдүү келемиштерге жүргүзүлдү. Маанилүүсү, бул ыкма мээге багытталган жана мээ кан тамыр тосмосу аркылуу ташуу активдүүлүгү бар пептиддерди тандайт. Биз T7 фагдарын кичинекей өлчөмүнө (~60 нм)10 байланыштуу колдондук жана алар эндотелий жана/же эпителий-медулла тосмосунан клетка аркылуу өтүүгө мүмкүндүк берген везикулаларды ташуу үчүн ылайыктуу деп сунуштадык. Төрт раунддук паннингден кийин, in vivo жүлүн суюктугунун байытылгандыгын жана мээнин микротамырларынын ассоциациясын көрсөткөн фаг популяциялары бөлүнүп алынды. Маанилүүсү, биз артыкчылыктуу жана химиялык жол менен синтезделген эң жакшы талапкер пептиддер белок жүктөрүн жүлүн суюктугуна ташый аларын көрсөтүү менен жыйынтыктарыбызды тастыктай алдык. Биринчиден, БНСтин фармакодинамикалык таасири алдыңкы транзиттик пептидди BACE1 пептидинин ингибитору менен айкалыштыруу аркылуу аныкталган. In vivo функционалдык скрининг стратегиялары мээнин жаңы ташуу пептиддерин натыйжалуу белок жүк ташуучулары катары аныктай аларын көрсөтүүдөн тышкары, биз ушул сыяктуу функционалдык тандоо ыкмалары мээнин жаңы ташуу жолдорун аныктоодо да маанилүү болуп калат деп күтөбүз.
Бляшка түзүүчү бирдиктердин (PFU) негизинде, фагды таңгактоо этабынан кийин, болжол менен 109 ар түрдүүлүккө ээ болгон кокустук 12-мер сызыктуу T7 фаг пептиддеринин китепканасы иштелип чыгып, түзүлгөн (Материалдар жана методдорду караңыз). Белгилей кетүүчү нерсе, биз in vivo панорамалоодон мурун бул китепкананы кылдат талдап чыкканбыз. Модификацияланган праймерлерди колдонуу менен фаг китепканасынын үлгүлөрүн ПЦР менен күчөтүү HTSке түздөн-түз тиешелүү болгон ампликондорду түздү (Кошумча 1a-сүрөт). а) HTS11 секвенирлөө каталарына, б) праймерлердин (NNK)1-12 сапатына тийгизген таасирине жана в) күтүү китепканасында жапайы типтеги (салмактуу) фагдын (скелеттик кошумчалардын) болушуна байланыштуу, текшерилген ырааттуулук маалыматын гана алуу үчүн ырааттуулукту чыпкалоо процедурасы ишке ашырылган (Кошумча 1b-сүрөт). Бул чыпкалоо кадамдары бардык HTS секвенирлөө китепканаларына тиешелүү. Стандарттык китепкана үчүн жалпысынан 233 868 окуу алынган, алардын 39% чыпкалоо критерийлеринен өтүп, кийинки раунддар үчүн китепкананы талдоо жана тандоо үчүн колдонулган (1c–e кошумча сүрөт). Окуулардын саны негизинен 3 базалык жуптун узундугуна көбөйтүлгөн, чокулары 36 нуклеотидде болгон (1c кошумча сүрөт), бул китепкананын дизайнын (NNK) 1-12 тастыктайт. Белгилей кетчү нерсе, китепкана мүчөлөрүнүн болжол менен 11% 12 өлчөмдүү жапайы типтеги (салмак) негизги PAGISRELVDKL кошумчасын камтыган, ал эми ырааттуулуктардын дээрлик жарымында (49%) кошумчалар же алып салуулар болгон. Китепкана китепканасынын HTSи китепканадагы пептиддердин ар түрдүүлүгүн тастыктады: пептиддик ырааттуулуктардын 81% дан ашыгы бир гана жолу табылган жана 1,5% гана ≥4 нускада кездешкен (2a кошумча сүрөт). Репертуардагы бардык 12 позициядагы аминокислоталардын (aa) жыштыктары дегенерацияланган NKK репертуары тарабынан түзүлгөн кодондордун саны үчүн күтүлгөн жыштыктар менен жакшы корреляцияланган (2b-кошумча сүрөт). Бул кошумчалар менен коддолгон AA калдыктарынын байкалган жыштыгы эсептелген жыштык менен жакшы корреляцияланган (r = 0,893) (2c-кошумча сүрөт). Фаг китепканаларын инъекцияга даярдоо эндотоксинди күчөтүү жана алып салуу кадамдарын камтыйт. Бул мурда фаг китепканаларынын ар түрдүүлүгүн азайтууга мүмкүндүк берери көрсөтүлгөн12,13. Ошондуктан, биз эндотоксинди алып салуудан өткөн пластинка менен күчөтүлгөн фаг китепканасын секвенирлеп, аны AA жыштыгын баалоо үчүн баштапкы китепкана менен салыштырдык. Баштапкы пул менен күчөтүлгөн жана тазаланган пулдун ортосунда күчтүү корреляция (r = 0,995) байкалган (2d-кошумча сүрөт), бул T7 фагын колдонуп пластинкаларда күчөтүлгөн клондордун ортосундагы атаандаштык чоң бурмалоолорду жаратпаганын көрсөтүп турат. Бул салыштыруу ар бир китепканадагы трипептиддик мотивдердин жыштыгына негизделген, анткени китепканалардын ар түрдүүлүгүн (~109) HTS менен да толук чагылдырууга мүмкүн эмес. Ар бир позициядагы аанын жыштык анализи киргизилген репертуардын акыркы үч позициясында позицияга көз каранды кичинекей бир жактуулукту көрсөттү (2e кошумча сүрөт). Жыйынтыктап айтканда, биз китепкананын сапаты жана ар түрдүүлүгү алгылыктуу жана тандоонун бир нече раунддарынын ортосунда фаг китепканаларын күчөтүү жана даярдоодон улам ар түрдүүлүктө анча чоң эмес өзгөрүүлөр гана байкалган деген жыйынтыкка келдик.
Сериялык жүлүн суюктугунан үлгү алуу үчүн, мээ-жүлүн суюктугунан канюляны хирургиялык жол менен имплантациялоо менен, мээ-жүлүн суюктугунан үлгү алуу, мээ-жүлүн түтүгү жана/же BCSFB аркылуу венага сайылган Т7 фагын аныктоону жеңилдетүү үчүн жүргүзүлүшү мүмкүн (1a-b-сүрөт). In vivo тандоонун алгачкы үч айлампасында биз эки көз карандысыз тандоо колун (А жана В колдору) колдондук (1c-сүрөт). Тандоонун алгачкы үч айлампасында киргизилген фагдын жалпы көлөмүн азайтуу менен тандоонун катуулугун акырындык менен жогорулаттык. Паннингдин төртүнчү айлампасы үчүн биз А жана В бутактарынан үлгүлөрдү бириктирип, үч кошумча көз карандысыз тандоо жүргүздүк. Бул моделдеги Т7 фаг бөлүкчөлөрүнүн in vivo касиеттерин изилдөө үчүн, келемиштерге куйрук венасы аркылуу жапайы типтеги фаг (PAGISRELVDKL башкы киргизүү) сайылган. Фагдардын ар кандай убакыт чекиттеринде жүлүн суюктугунан жана кандан калыбына келиши салыштырмалуу кичинекей Т7 икосаэдрдик фагдарынын кан бөлүмүнөн тез баштапкы тазалоо фазасы бар экенин көрсөттү (3-кошумча сүрөт). Келемиштердин титрлерине жана кан көлөмүнө таянып, биз венага сайылгандан 10 мүнөттөн кийин канда сайылган дозадан болжол менен 1% гана фаг аныкталганын эсептеп чыктык. Бул баштапкы тез төмөндөөдөн кийин, жарым ажыроо мезгили 27,7 мүнөт болгон баштапкы клиренстин жайыраак болушу өлчөнгөн. Маанилүүсү, жүлүн суюктугунан өтө аз гана фагдар алынган, бул жапайы типтеги фагдардын жүлүн суюктугуна миграциясынын төмөн фонун көрсөтүп турат (Кошумча 3-сүрөт). Орточо эсеп менен, бүткүл үлгү алуу мезгилинде (0-250 мүнөт) жүлүн суюктугунда канда Т7 фагынын болжол менен 1 x 10-3% титрлери жана башында куюлган фагдардын 4 x 10-8%ы гана аныкталган. Белгилей кетчү нерсе, жүлүн суюктугундагы жапайы типтеги фагдын жарым ажыроо мезгили (25,7 мүнөт) канда байкалганга окшош болгон. Бул маалыматтар CM-каннуляцияланган келемиштерде жүлүн суюктугун кандан бөлүп турган тосмо бүтүн бойдон калаарын көрсөтүп турат, бул фаг китепканаларын in vivo тандоого кандан жүлүн суюктугунун бөлүмүнө оңой ташылуучу клондорду аныктоого мүмкүндүк берет.
(а) Чоң көлмөдөн жүлүн суюктугун (ЖС) кайра үлгү алуу ыкмасын түзүү. (б) Борбордук нерв системасынын (ЖНС) тосмосунун клеткалык жайгашкан жерин жана кан-мээ тосмосун (ГББ) жана кан-мээ тосмосун кесип өткөн пептиддерди аныктоо үчүн колдонулган тандоо стратегиясын көрсөткөн диаграмма. (в) In vivo фаг дисплейинин скринингдик блок-схемасы. Тандоонун ар бир айлампасында фагдар (жебелердин ичиндеги жаныбарлардын идентификаторлору) венага сайылган. Эки көз карандысыз альтернативдүү бутак (А, В) тандоонун 4-айлампасына чейин өзүнчө сакталат. 3 жана 4-тандоо айлампалары үчүн ЖСдан алынган ар бир фаг клону кол менен секвенирленген. (г) T7 пептиддик китепканасын (2 x 1012 фаг/жаныбар) венага сайгандан кийин эки канюляцияланган келемиште тандоонун биринчи айлампасында кандан (кызыл тегерекчелер) жана жүлүн суюктугунан (жашыл үч бурчтуктар) бөлүнүп алынган фагдын кинетикасы. Көк квадраттар кандагы фагдын баштапкы орточо концентрациясын көрсөтөт, ал кандын жалпы көлөмүн эске алуу менен сайылган фагдын көлөмүнөн эсептелет. Кара квадраттар кандагы фагдын концентрациясынан экстраполяцияланган y сызыгынын кесилишкен чекитин көрсөтөт. (e,f) Пептидде табылган бардык мүмкүн болгон дал келген трипептиддик мотивдердин салыштырмалуу жыштыгын жана бөлүштүрүлүшүн көрсөтүңүз. 1000 окууда табылган мотивдердин саны көрсөтүлгөн. Байытылган (p < 0,001) мотивдер кызыл чекиттер менен белгиленген. (e) Сайылган китепкананын трипептиддик мотивинин салыштырмалуу жыштыгын №1.1 жана №1.2 жаныбарлардан алынган фаг менен салыштырган корреляциялык чачырандылык графиги. (f) Канда жана жүлүн суюктугунда бөлүнүп алынган №1.1 жана №1.2 жаныбарлардын фаг трипептиддик мотивдеринин салыштырмалуу жыштыктарын салыштырган корреляциялык чачырандылык графиги. (g, h) Эки жаныбарда тең in vivo тандоодон кийин канга байытылган фагдын (g) сайылган китепканаларга жана жүлүн суюктугуна байытылган фагдын (h) канга салыштырмалуу ырааттуулук ID көрсөтүлүшү. Бир тамгалуу коддун өлчөмү ал аминокислотанын ошол абалда канчалык көп кездешкенин көрсөтөт. Жашыл = полярдык, кызгылт көк = нейтралдуу, көк = негиздик, кызыл = кислоталуу жана кара = гидрофобдук аминокислоталар. 1a, b сүрөттөрү Эдуард Урих тарабынан иштелип чыккан жана чыгарылган.
Биз эки CM инструмент келемишине (А жана В кладалары) фаг пептиддеринин китепканасын сайып, фагды мээ-жүлүн суюктугунан жана кандан бөлүп алдык (1d-сүрөт). Китепкананын алгачкы тез тазаланышы жапайы типтеги фагга салыштырмалуу анча байкалбаган. Эки жаныбарда тең сайылган китепкананын орточо жарым ажыроо мезгили кандагы жапайы типтеги фагга окшош 24,8 мүнөттү жана жүлүн суюктугунда 38,5 мүнөттү түзгөн. Ар бир жаныбардан алынган кан жана мээ-жүлүн суюктугунун фаг үлгүлөрү HTSке дуушар болуп, аныкталган бардык пептиддер кыска трипептиддик мотивдин бар-жогун талданган. Трипептиддик мотивдер тандалып алынган, анткени алар түзүлүштүн пайда болушу жана пептид-белок өз ара аракеттенүүсү үчүн минималдуу негиз түзөт14,15. Биз сайылган фаг китепканасы менен эки жаныбардын канынан алынган клондордун ортосундагы мотивдердин бөлүштүрүлүшүндө жакшы корреляцияны таптык (1e-сүрөт). Маалыматтар китепкананын курамы кан бөлүмүндө бир аз гана байытылганын көрсөтүп турат. Аминокислоталардын жыштыктары жана консенсус ырааттуулугу Weblogo16 программасынын адаптациясын колдонуу менен ар бир позицияда андан ары талданды. Кызыктуусу, биз кандагы глицин калдыктарынын күчтүү байытылганын байкадык (1g-сүрөт). Канды CSFтен тандалган клондор менен салыштырганда, күчтүү тандоо жана мотивдердин айрым тандоосуз калганы байкалган (1f-сүрөт), ал эми айрым аминокислоталар 12 мүчөлүү бөлүктө алдын ала аныкталган позицияларда артыкчылыктуу түрдө болгон (1h-сүрөт). Белгилей кетчү нерсе, айрым жаныбарлар жүлүн суюктугунда олуттуу айырмаланган, ал эми кандагы глициндин байышы эки жаныбарда тең байкалган (4a–j кошумча сүрөт). №1.1 жана №1.2 жаныбарлардын жүлүн суюктугундагы ырааттуулук маалыматтарын катуу чыпкалоодон кийин, жалпысынан 964 жана 420 уникалдуу 12-мер пептиддери алынган (1d–e кошумча сүрөт). Изоляцияланган фаг клондору күчөтүлүп, in vivo тандоонун экинчи айлампасына дуушар болгон. Тандоодон экинчи айлампадан алынган фаг ар бир жаныбарда HTSке дуушар болгон жана аныкталган бардык пептиддер трипептиддик мотивдердин пайда болушун талдоо үчүн мотивдерди таануу программасына киргизүү катары колдонулган (2a, b, ef сүрөт). Жүлүн суюктугунан алынган фагдын биринчи цикли менен салыштырганда, биз А жана В бутактарында жүлүн суюктугундагы көптөгөн мотивдердин андан ары тандалышын жана тандалбай калганын байкадык (2-сүрөт). Алар ырааттуу ырааттуулуктун ар кандай үлгүлөрүн билдирерин аныктоо үчүн тармактык идентификация алгоритми колдонулган. Альтернативдик А кладында (2c, d сүрөт) жана В кладында (2g, h сүрөт) жүлүн суюктугу тарабынан калыбына келтирилген 12 өлчөмдүү ырааттуулуктардын ортосунда ачык окшоштук байкалган. Ар бир бутактагы бириктирилген анализ 12-мер пептиддери үчүн ар кандай тандоо профилдерин (5c, d кошумча сүрөт) жана тандоонун экинчи айлампасынан кийин бириктирилген клондор үчүн тандоонун биринчи айлампасына салыштырмалуу убакыттын өтүшү менен жүлүн суюктугу/кан титринин катышынын жогорулаганын көрсөттү (5e кошумча сүрөт).
Жүлүн суюктугундагы мотивдерди жана пептиддерди in vivo функционалдык фаг дисплейин тандоонун эки катары менен байытуу.
Ар бир жаныбардын (№1.1 жана №1.2 жаныбарлар) биринчи раунддан алынган бардык мээ жүлүн суюктугунун фагдары бириктирилип, күчөтүлүп, HT менен ыраатташтырылып, кайрадан сайылган (2 x 1010 фаг/жаныбар) 2 SM канюляцияланган келемиш (№1.1 → #). 2.1 жана 2.2, 1.2 → 2.3 жана 2.4). (a,b,e,f) Биринчи жана экинчи тандоо раунддарындагы бардык CSFтен алынган фагдардын трипептиддик мотивдеринин салыштырмалуу жыштыгын салыштырган корреляциялык чачыранды графиктер. Эки багытта тең пептиддерде кездешкен бардык мүмкүн болгон дал келген трипептиддерди билдирген мотивдердин салыштырмалуу жыштыгы жана бөлүштүрүлүшү. 1000 окууда табылган мотивдердин саны көрсөтүлгөн. Салыштырылган китепканалардын биринде олуттуу түрдө тандалып алынган же алынып салынган мотивдер (p < 0.001) кызыл чекиттер менен белгиленген. (c, d, g, h) In vivo тандоонун 2 жана 1-турларына негизделген бардык жүлүн суюктугуна бай 12 аминокислоталуу узун ырааттуулуктардын ырааттуулук логотибинин көрсөтүлүшү. Бир тамгалуу коддун өлчөмү ал аминокислотанын ошол абалда канчалык көп кездешкенин көрсөтөт. Логотипти көрсөтүү үчүн, эки тандоо турунун ортосунда жеке жаныбарлардан алынган жүлүн суюктугунун ырааттуулук жыштыгы салыштырылат жана экинчи турдагы байытылган ырааттуулуктар көрсөтүлөт: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 жана (h) #1.2–#2.4. (c, d) №2.1 жана №2.2 жаныбарларындагы же (g, h) №2.3 жана №2.4 жаныбарларындагы берилген абалдагы эң байытылган аминокислоталар түстө көрсөтүлгөн. Жашыл = полярдык, кызгылт көк = нейтралдуу, көк = негиздүү, кызыл = кислоталуу жана кара = гидрофобдук аминокислоталар.
Үчүнчү тандоодон кийин, биз эки жаныбардан бөлүнүп алынган 332 CSF менен калыбына келтирилген фаг клондорунан 124 уникалдуу пептиддик ырааттуулукту (#3.1 жана #3.2) аныктадык (6a-кошумча сүрөт). LGSVS ырааттуулугу (18.7%) эң жогорку салыштырмалуу үлүшүнө ээ болду, андан кийин PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) жана SARGSWREIVSLS (2.2%) жапайы типтеги кошумчалар келди. Акыркы төртүнчү раундда биз үч башка жаныбардан эки көз карандысыз тандалган бутактарды бириктирдик (1c-сүрөт). CSFтен калыбына келтирилген 925 секвенирленген фаг клондорунун ичинен төртүнчү раундда биз 64 уникалдуу пептиддик ырааттуулукту таптык (6b-кошумча сүрөт), алардын арасында жапайы типтеги фагдын салыштырмалуу үлүшү 0.8% га чейин төмөндөдү. Төртүнчү раундда эң көп кездешкен CSF клондору LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) жана RLSSVDSDLSGC (3, 2%) болгон. %)). Тандалган пептиддердин узундук диапазону NNK китепканасын долбоорлоо үчүн дегенеративдик кодондорду колдонууда китепкана праймерлериндеги нуклеотиддик киргизүүлөр/өчүрүүлөр же эрте токтоп калуу кодондоруна байланыштуу. Эрте жетилген токтоп калуу кодондору кыска пептиддерди пайда кылат жана аларда жагымдуу AA мотиви болгондуктан тандалат. Узунураак пептиддер синтетикалык китепканалардын праймерлериндеги киргизүүлөр/өчүрүүлөрдөн келип чыгышы мүмкүн. Бул иштелип чыккан токтоп калуу кодонун алкактын сыртына жайгаштырат жана аны агымдын аягында жаңы токтоп калуу кодону пайда болгонго чейин окуйт. Жалпысынан алганда, биз киргизүү маалыматтарын үлгүнүн чыгуу маалыматтары менен салыштыруу менен төрт тандоо раундунун баары үчүн байытуу коэффициенттерин эсептедик. Скринингдин биринчи айлампасында биз жапайы типтеги фаг титрлерин спецификалык эмес фон шилтемеси катары колдондук. Кызыктуусу, фагдын терс тандалышы биринчи жүлүн суюктугу циклинде абдан күчтүү болгон, бирок канда эмес (3a-сүрөт), бул пептиддик китепкананын көпчүлүк мүчөлөрүнүн жүлүн суюктугу бөлүмүнө пассивдүү диффузиясынын төмөн ыктымалдуулугуна же салыштырмалуу фагдар бактериофагдарга караганда кан агымынан натыйжалуураак кармалып же алынып салынышына байланыштуу болушу мүмкүн. Бирок, паннингдин экинчи айлампасында эки кладада тең жүлүн суюктугундагы фагдардын күчтүү тандалышы байкалган, бул мурунку айлампа жүлүн суюктугунун сиңишин күчөтүүчү пептиддерди көрсөткөн фагдар менен байытылганын көрсөтүп турат (3a-сүрөт). Дагы бир жолу, кандын олуттуу байытуусу жок. Ошондой эле үчүнчү жана төртүнчү айлампаларда фаг клондору жүлүн суюктугу менен бир топ байытылган. Тандоонун акыркы эки айлампасынын ортосундагы ар бир уникалдуу пептиддик ырааттуулуктун салыштырмалуу жыштыгын салыштырып көрсөк, биз тандоонун төртүнчү айлампасында ырааттуулуктар ого бетер байыганын аныктадык (3b-сүрөт). Бардык 64 уникалдуу пептиддик ырааттуулуктан пептиддик багыттарды колдонуу менен жалпысынан 931 трипептиддик мотив алынган. Төртүнчү раунддагы эң байытылган мотивдер сайылган китепканага салыштырмалуу бардык раунддардагы байытуу профилдери боюнча кылдаттык менен изилденген (чектөө: 10% байытуу) (Кошумча 6c-сүрөт). Тандоонун жалпы үлгүлөрү көрсөткөндөй, изилденген мотивдердин көпчүлүгү эки тандоо бутагынын мурунку раунддарынын баарында байытылган. Бирок, кээ бир мотивдер (мисалы, SGL, VSG, LGS GSV) негизинен альтернативдүү А кладынан алынган, ал эми башкалары (мисалы, FGW, RTN, WGF, NTR) альтернативдүү В кладында байытылган.
Стрептавидиндин пайдалуу жүктөмүнө кошулган жүлүн суусунда байытылган фаг менен көрсөтүлгөн пептиддердин жана биотинилденген лидер пептиддердин жүлүн суусунда ташылышын валидациялоо.
(a) Төрт раунддун баарында (R1-R4) сайылган (киргизүү = I) фаг (PFU) титрлерине жана аныкталган жүлүн суюктугунун фаг титрлерине (чыгуу = O) негизделген байытуу коэффициенттери эсептелген. Акыркы үч раунддун (R2-R4) байытуу коэффициенттери мурунку раунд жана биринчи раунд (R1) менен салмак маалыматтары менен салыштыруу аркылуу эсептелген. Ачык тилкелер - жүлүн суюктугу, көлөкөлүү тилкелер - плазма. (***p<0.001, Стьюденттин t-тестине негизделген). (b) Тандоонун 4-раундунан кийин жүлүн суюктугунда чогултулган бардык фагдарга салыштырмалуу үлүшүнө жараша эң көп кездешкен фаг пептиддеринин тизмеси. Тандоонун 3 жана 4-раунддарынын ортосундагы эң көп кездешкен алты фаг клоны түстүү, номерленген жана алардын байытуу коэффициенттери менен белгиленген (кошумчалар). (c, d) 4-раунддагы эң көп байытылган алты фаг клоны, бош фаг жана ата-энелик фаг пептиддик китепканалары жүлүн суюктугун тандоо моделинде өз-өзүнчө талданган. Көрсөтүлгөн убакыт чекиттеринде жүлүн суюктугу жана кан үлгүлөрү чогултулган. (в) 6 талапкер фаг клонунун (2 x 1010 фаг/жаныбар), бош фагдардын (#1779) (2 x 1010 фаг/жаныбар) жана запастагы фаг пептиддик китепканаларынын (2 x 1012 фаг/жаныбар) бирдей өлчөмдөгү инъекциясы. Канюляцияланган жаныбарга куйрук венасы аркылуу өзүнчө кеминде 3 CM сайылат. Ар бир сайылган фаг клонунун жана фаг пептиддик китепканасынын убакыттын өтүшү менен жүлүн суюктугунун фармакокинетикасы көрсөтүлгөн. (г) үлгү алуу убактысынын ичинде бардык калыбына келтирилген фагдар/мл үчүн орточо жүлүн суюктугу/кан катышын көрсөтөт. (д) Төрт синтетикалык лидер пептиди жана бир аралаштырылган контролдук топ биотин менен стрептавидиндин N-терминалы (тетрамер дисплейи) аркылуу байланыштырылган, андан кийин инъекция (куйрук венасы венасы, 10 мг стрептавидин/кг). Кеминде үч интубацияланган келемиш (N = 3). Жүлүн суюктугунун үлгүлөрү көрсөтүлгөн убакыт чекиттеринде чогултулуп, стрептавидиндин концентрациясы жүлүн суюктугунун антистрептавидин ELISA ыкмасы менен өлчөнгөн (nd = аныкталган эмес). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA тестинин негизинде). (f) Эң байытылган фаг пептиддик клонунун №2002 (кызгылт көк) аминокислота тизмегин тандоонун 4-турунан алынган башка тандалган фаг пептиддик клондору менен салыштыруу. Окшош жана окшош аминокислота фрагменттери түстүү коддолгон.
Төртүнчү раунддагы бардык байытылган фагдардын ичинен (3b-сүрөт), жүлүн суюктугун тандоо моделинде андан ары жекече талдоо үчүн алты кандидат клон тандалып алынган. Үч канюляцияланган CM жаныбарларына алты кандидат фаг, бош фаг (кошумча жок) жана профаг пептид китепканаларынын бирдей өлчөмдөрү сайылып, фармакокинетикасы жүлүн суюктугунда (3c-сүрөт) жана кан (кошумча 7-сүрөт) анализдеринде аныкталган. Сыналган бардык фаг клондору жүлүн суюктугу бөлүмүн бош контролдук фагга (#1779) караганда 10-1000 эсе жогору деңгээлде бутага алган. Мисалы, #2020 жана #2077 клондорунда контролдук фагга караганда жүлүн суюктугунун титрлери болжол менен 1000 эсе жогору болгон. Тандалган ар бир пептиддин фармакокинетикалык профили ар башка, бирок алардын баарында жүлүн суюктугун үйгө алуу жөндөмү жогору. Биз #1903 жана #2011 клондору үчүн убакыттын өтүшү менен туруктуу төмөндөөнү байкадык, ал эми #2077, #2002 жана #2009 клондору үчүн алгачкы 10 мүнөттүн ичинде көбөйүү активдүү ташууну билдириши мүмкүн, бирок аны текшерүү керек. #2020, #2002 жана #2077 клондору жогорку деңгээлде турукташып, #2009 клонунун жүлүн суюктугунун концентрациясы баштапкы көбөйүүдөн кийин акырындык менен төмөндөдү. Андан кийин биз ар бир жүлүн суюктугунун салыштырмалуу жыштыгын анын кандагы концентрациясы менен салыштырдык (3d-сүрөт). Ар бир жүлүн суюктугунун орточо титринин бардык үлгү алуу убактысындагы кандагы титр менен корреляциясы алты талапкердин үчөө кандагы жүлүн суюктугуна бир топ байыганын көрсөттү. Кызыгы, #2077 клону кандын жогорку туруктуулугун көрсөттү (7-кошумча сүрөт). Пептиддердин өздөрү жүлүн суюктугунун бөлүмүнө фаг бөлүкчөлөрүнөн башка жүктөрдү активдүү ташый аларын ырастоо үчүн, биз пептиддер фаг бөлүкчөсүнө туташкан N-терминалында биотин менен алынган төрт лидер пептидди синтездедик. Биотинделген пептиддер (№ 2002, 2009, 2020 жана 2077) стрептавидин (SA) менен конъюгацияланып, фаг геометриясын бир аз туураган мультимердик формаларды алышкан. Бул формат бизге кандагы жана жүлүн суюктугундагы SA таасирин жүк ташуучу белок пептиддери катары өлчөөгө мүмкүндүк берген. Маанилүүсү, синтетикалык пептиддер ушул SA менен конъюгацияланган форматта берилгенде, фаг маалыматтарын көп учурда кайра чыгарууга болот (3e-сүрөт). Аралаштырылган пептиддердин баштапкы таасири азыраак жана жүлүн суюктугунан тезирээк клиренс болуп, 48 сааттын ичинде аныкталбай турган деңгээлдер болгон. Бул пептиддик фаг клондорунун жүлүн суюктугу мейкиндигине жеткирүү жолдорун түшүнүү үчүн, биз in vivo венага сайылгандан 1 саат өткөндөн кийин фаг бөлүкчөлөрүн түздөн-түз аныктоо үчүн иммуногистохимияны (IHC) колдонуп, жеке фаг пептиддеринин тийүүсүнүн локализациясын талдадык. Белгилей кетчү нерсе, #2002, #2077 жана #2009 клондорун мээ капиллярларындагы күчтүү боёктор аркылуу аныктоого болот, ал эми контролдук фаг (#1779) жана #2020 клоны аныкталган эмес (кошумча 8-сүрөт). Бул пептиддер мээге таасир этүүгө BBB аркылуу так салым кошоорун көрсөтүп турат. Бул гипотезаны текшерүү үчүн андан ары деталдуу талдоо талап кылынат, анткени BSCFB жолу да катышышы мүмкүн. Эң байытылган клондун (#2002) аминокислота тизмегин башка тандалган пептиддер менен салыштырганда, алардын айрымдарынын окшош аминокислоталардын кеңейиши бар экени белгиленди, бул окшош ташуу механизмин көрсөтүшү мүмкүн (3f-сүрөт).
Уникалдуу плазма профилине жана убакыттын өтүшү менен жүлүн суюктугунун олуттуу көбөйүшүнө байланыштуу, №2077 фаг-дисплей клоны 48 сааттык узак мөөнөттө андан ары изилденип, туруктуу SA деңгээли менен байланышкан байкалган жүлүн суюктугунун тез көбөйүшүн кайталай алды (4a-сүрөт). Башка аныкталган фаг клондоруна келсек, №2077 мээ капиллярлары үчүн күчтүү боёлгон жана жогорку чечилиште караганда капиллярдык маркер лектин менен олуттуу колокализацияны жана паренхималдык мейкиндикте бир аз боёлууну көрсөткөн (4b-сүрөт). Пептид аркылуу жүргүзүлгөн фармакологиялык эффекттерди БНСда алууга болобу же жокпу, изилдөө үчүн биз эксперимент жүргүздүк, анда i) №2077 транзиттик пептидинин жана ii) BACE1 ингибитор пептидинин биотинделген версиялары SA менен эки башка катышта аралаштырылган. Бир айкалыш үчүн биз BACE1 пептид ингибиторун гана колдондук, ал эми экинчиси үчүн BACE1 пептид ингибиторунун №2077 пептидине 1:3 катышын колдондук. Эки үлгү тең венага куюлуп, кан жана мээ-жүлүн суюктугундагы бета-амилоиддик пептид 40 (Abeta40) деңгээли убакыттын өтүшү менен өлчөнгөн. Abeta40 мээ паренхимасында BACE1 ингибирлөөсүн чагылдыргандыктан, жүлүн суюктугунда өлчөнгөн. Күтүлгөндөй, эки комплекс тең Abeta40тун кандагы деңгээлин бир кыйла төмөндөткөн (4c, d-сүрөт). Бирок, 2077-пептид жана SA менен конъюгацияланган BACE1 пептидинин ингибиторунун аралашмасын камтыган үлгүлөр гана жүлүн суюктугунда Abeta40тун бир кыйла төмөндөшүнө алып келген (4c-сүрөт). Маалыматтар көрсөткөндөй, 2077-пептид 60 кДа SA протеинин БНСке ташый алат жана ошондой эле BACE1 пептидинин SA менен конъюгацияланган ингибиторлору менен фармакологиялык таасирлерди пайда кылат.
(а) Кеминде үч CM-интубацияланган келемиште CSF пептидинин #2077 (RLSSVDSDLSGC) жана сайылбаган контролдук фагдын (#1779) узак мөөнөттүү фармакокинетикалык профилдерин көрсөткөн Т7 фагынын клоналдык инъекциясы (2 × 10 фаг/жаныбар). (б) Фаг сайылган келемиштердеги (2 × 10 10 фаг/жаныбар) репрезентативдик кортикалдык микротамырларынын конфокалдык микроскопиялык сүрөтү №2077 пептидинин жана кан тамырларынын (лектин) контрбоёгунун көрсөтүлүшүн көрсөтөт. Бул фаг клондору 3 келемишке берилип, перфузиядан мурун 1 саат бою айланууга уруксат берилген. Мээлер кесилип, Т7 фаг капсидине каршы поликлоналдык FITC менен белгиленген антителолор менен боёлгон. Перфузиядан жана андан кийинки фиксациядан он мүнөт мурун DyLight594 менен белгиленген лектин венага сайылган. Капиллярлардын жана периваскулярдык мээ тканынын көңдөйүндөгү микротамырлар менен фагдардын люменинин (жашыл) лектин менен боёлушун көрсөткөн флуоресценттик сүрөттөр. Шкала тилкеси 10 мкмге туура келет. (c, d) Биотинделген BACE1 ингибирлөөчү пептиди өзүнчө же биотинделген транзиттик пептид менен айкалыштырылган #2077 стрептавидинге кошулуп, андан кийин кеминде үч канюляцияланган CM келемишине (10 мг стрептавидин/кг) вена ичине сайылган. BACE1 пептидинин ингибитору аркылуу Aβ40тун азайышы көрсөтүлгөн убакыт чекиттеринде кандагы (кызыл) жана жүлүн суюктугундагы (кызгылт сары) Aβ1-40 ELISA менен өлчөнгөн. Жакшыраак түшүнүү үчүн, графикте 100% масштабда чекиттүү сызык чийилген. (c) Стрептавидин менен дарыланган келемиштердин канындагы (кызыл үч бурчтуктар) жана жүлүн суюктугундагы (кызгылт сары үч бурчтуктар) Aβ40тун пайыздык төмөндөшү, транзиттик пептид №2077 жана BACE1 ингибирлөөчү пептид менен 3:1 катышта конъюгацияланган. (d) Стрептавидин менен дарыланган келемиштердин канындагы Aβ40тун (кызыл тегерекчелер) жана жүлүн суюктугундагы (кызгылт сары тегерекчелер) пайыздык төмөндөшү, BACE1 ингибирлөөчү пептид менен гана. Контролдук топтогу Aβ концентрациясы 420 пг/мл болгон (стандарттык четтөө = 101 пг/мл).
Фагдын көрсөтүлүшү биомедициналык изилдөөлөрдүн бир нече тармактарында ийгиликтүү колдонулган17. Бул ыкма in vivo кан тамырлардын ар түрдүүлүгүн изилдөөдө18,19, ошондой эле мээ кан тамырларына багытталган изилдөөлөрдө20,21,22,23,24,25,26 колдонулган. Бул изилдөөдө биз бул тандоо ыкмасын мээ кан тамырларына багытталган пептиддерди түз аныктоого гана эмес, ошондой эле кан-мээ тосмосунан өтүү үчүн активдүү ташуу касиеттерине ээ болгон кандидаттарды ачууга да кеңейттик. Эми биз CM интубацияланган келемиштерде in vivo тандоо процедурасынын иштелип чыгышын сүрөттөп, анын CSF homing касиеттери бар пептиддерди аныктоо мүмкүнчүлүгүн көрсөтөбүз. 12-мер кокустук пептиддердин китепканасын көрсөткөн T7 фагын колдонуп, биз T7 фагынын кан-мээ тосмосуна ыңгайлашуу үчүн жетиштүү кичинекей (диаметри болжол менен 60 нм)10 экенин көрсөтө алдык, ошону менен кан-мээ тосмосуна же хориоиддик плексуска түз өтүүгө болот. Биз канюляцияланган CM келемиштеринен жүлүн суюктугун чогултуу in vivo функционалдык скрининг ыкмасы жакшы көзөмөлдөнгөнүн жана алынган фаг кан тамыр системасына гана байланбастан, кан-мээ тосмосу аркылуу ташуучу катары да иштээрин байкадык. Андан тышкары, бир эле учурда кан чогултуу жана жүлүн суюктугуна жана кандан алынган фагдарга HTS колдонуу менен, биз жүлүн суюктугун тандообузга кандын байышы же тандоо раунддарынын ортосундагы кеңейүүгө жарамдуулугу таасир этпегенин тастыктадык. Бирок, кан бөлүмү тандоо процедурасынын бир бөлүгү болуп саналат, анткени жүлүн суюктугуна жете алган фагдар мээде байытуу үчүн кан агымында жетиштүү убакыт бою жашап, айланып жүрүшү керек. Чийки HTS маалыматтарынан ишенимдүү ырааттуулук маалыматын алуу үчүн, биз анализдин жумуш агымында платформага мүнөздүү ырааттуулук каталарына ылайыкташтырылган чыпкаларды киргиздик. Скрининг ыкмасына кинетикалык параметрлерди киргизүү менен, биз кандагы жапайы типтеги T7 фагдарынын тез фармакокинетикасын (t½ ~ 28 мүн) тастыктадык24, 27, 28 ошондой эле алардын жүлүн суюктугундагы жарым ажыроо мезгилин (t½ ~ 26 мүн) мүнөтүнө аныктадык. Кандагы жана жүлүн суюктугундагы окшош фармакокинетикалык профилдерге карабастан, фагдын кан концентрациясынын 0,001% гана жүлүн суюктугунда аныкталды, бул жапайы типтеги Т7 фагынын кан-мээ тосмосу аркылуу төмөн мобилдүүлүгүн көрсөтүп турат. Бул иш in vivo паннинг стратегияларын колдонууда, айрыкча кан айлануудан тез тазаланган фаг системалары үчүн тандоонун биринчи айлампасынын маанилүүлүгүн баса белгилейт, анткени аз сандагы клондор БНС бөлүмүнө жете алат. Ошентип, биринчи айлампада китепкананын ар түрдүүлүгүнүн азайышы абдан чоң болду, анткени акыры бул абдан катуу ЖНС моделинде чектелген сандагы клондор гана чогултулган. Бул in vivo паннинг стратегиясы бир нече тандоо кадамдарын камтыган, мисалы, ЖНС бөлүмүндө активдүү топтолуу, кан бөлүмүндө клондун жашап кетиши жана алгачкы 10 мүнөттүн ичинде кандан Т7 фаг клондорун тез алып салуу (1d-сүрөт жана кошумча 4M-сүрөт). Ошентип, биринчи айлампадан кийин, ЖНСде ар кандай фаг клондору аныкталган, бирок ар бир жаныбарлар үчүн бирдей баштапкы топ колдонулган. Бул китепкана мүчөлөрү көп болгон булак китепканалары үчүн бир нече катуу тандоо кадамдары ар түрдүүлүктүн олуттуу төмөндөшүнө алып келерин көрсөтүп турат. Ошондуктан, кокустук окуялар баштапкы тандоо процессинин ажырагыс бөлүгүнө айланып, натыйжага чоң таасирин тийгизет. Баштапкы китепканадагы көптөгөн клондор CSF байытууга абдан окшош болгон болушу мүмкүн. Бирок, ошол эле эксперименталдык шарттарда да, баштапкы пулдагы ар бир конкреттүү клондун саны аз болгондуктан, тандоо жыйынтыктары ар кандай болушу мүмкүн.
Жүлүн суюктугуна бай мотивдер кандагы мотивдерден айырмаланат. Кызыктуусу, биз ар бир жаныбарлардын канында глицинге бай пептиддерге карай биринчи жылыш болгонун байкадык. (1g-сүрөт, Кошумча 4e, 4f-сүрөттөр). Глицин камтыган фагдар туруктуураак болушу мүмкүн жана кан айлануудан чыгып кетүү ыктымалдыгы азыраак. Бирок, бул глицинге бай пептиддер жүлүн суюктугунун үлгүлөрүндө аныкталган эмес, бул тандалган китепканалар эки башка тандоо этабынан өткөнүн көрсөтүп турат: бири кандагы, экинчиси жүлүн суюктугунда топтолууга мүмкүндүк берген. Төртүнчү тандоо раундунан келип чыккан жүлүн суюктугу менен байытылган клондор кеңири сыналган. Жекече сыналган дээрлик бардык клондор бош контролдук фагга салыштырмалуу жүлүн суюктугуна байытылганы тастыкталган. Бир пептиддик таасир (#2077) кененирээк изилденген. Ал башка таасирлерге салыштырмалуу плазманын жарым ажыроо мезгилин узагыраак көрсөттү (3d-сүрөт жана 7-кошумча сүрөт) жана кызыктуусу, бул пептидде С-терминалында цистеин калдыгы бар болчу. Жакында эле пептиддерге цистеин кошуу алардын фармакокинетикалык касиеттерин альбумин 29 менен байланышуу аркылуу жакшырта алары көрсөтүлдү. Бул учурда №2077 пептиди үчүн белгисиз жана андан ары изилдөөнү талап кылат. Айрым пептиддер жүлүн суюктугунун байышында валенттүүлүккө көз карандылыкты көрсөтүштү (маалыматтар көрсөтүлгөн эмес), бул T7 капсидинин көрсөтүлгөн беттик геометриясы менен байланыштуу болушу мүмкүн. Биз колдонгон T7 системасы ар бир фаг бөлүкчөсүндө ар бир пептиддин 5-15 көчүрмөсүн көрсөттү. IHC келемиштердин мээ кабыгына венага сайылган коргошун фаг клондоруна жүргүзүлдү (8-кошумча сүрөт). Маалыматтар көрсөткөндөй, жок дегенде үч клон (№2002, №2009 жана №2077) BBB менен өз ара аракеттенет. Бул BBB өз ара аракеттенүүсү жүлүн суюктугунун топтолушуна же бул клондордун түздөн-түз BCSFBге жылышына алып келеби же жокпу, азырынча аныктала элек. Маанилүүсү, тандалган пептиддер синтезделип, белок жүгүнө байланганда жүлүн суюктугунун ташуу жөндөмдүүлүгүн сактап калаарын көрсөтөбүз. N-терминалдык биотинилденген пептиддердин SAга байланышы кандагы жана жүлүн суюктугундагы алардын фаг клондору менен алынган натыйжаларды кайталайт (3e-сүрөт). Акырында, биз коргошун пептиди #2077 SAга конъюгацияланган BACE1 биотинилденген пептид ингибиторунун мээдеги аракетин күчөтө аларын, жүлүн суюктугундагы Abeta40 деңгээлин бир кыйла төмөндөтүү менен БНСте айкын фармакодинамикалык таасирлерди пайда кылаарын көрсөтөбүз (4-сүрөт). Бардык хиттердин пептиддик ырааттуулук гомологиясын издөө менен маалымат базасында эч кандай гомологдорду аныктай алган жокпуз. Белгилей кетүүчү нерсе, T7 китепканасынын көлөмү болжол менен 109, ал эми 12-мер үчүн теориялык китепкананын көлөмү 4 x 1015. Ошондуктан, биз 12-мер пептиддик китепканасынын ар түрдүүлүк мейкиндигинин кичинекей бөлүгүн гана тандап алдык, бул аныкталган хиттердин жанаша ырааттуулук мейкиндигин баалоо менен оптималдаштырылган пептиддерди аныктоого болот дегенди билдириши мүмкүн. Гипотетикалык жактан алганда, бул пептиддердин табигый гомологдорун таппаганыбыздын себептеринин бири, эволюция учурунда мээге белгилүү бир пептиддик мотивдердин көзөмөлсүз киришине жол бербөө үчүн тандоодон баш тартуу болушу мүмкүн.
Жалпысынан алганда, биздин жыйынтыктар in vivo шартында цереброваскулярдык тосмонун транспорттук системаларын кененирээк аныктоо жана мүнөздөө боюнча келечектеги иштер үчүн негиз түзөт. Бул ыкманын негизги түзүлүшү мээ кан тамырларынын байланыш касиеттери бар клондорду гана аныктабастан, ошондой эле ийгиликтүү клондордун in vivo шартында CNS бөлүмүнө биологиялык тоскоолдуктардан өтүү үчүн ички активдүүлүгү бар маанилүү кадамды камтыган функционалдык тандоо стратегиясына негизделген. Бул пептиддердин ташуу механизмин жана алардын мээ аймагына мүнөздүү микроваскулярдык байланышка болгон артыкчылыктарын аныктоо болуп саналат. Бул BBB жана рецепторлорду ташуу үчүн жаңы жолдордун ачылышына алып келиши мүмкүн. Аныкталган пептиддер BBB же BCSFB аркылуу ташылган цереброваскулярдык рецепторлорго же айлануучу лиганддарга түздөн-түз байланыша алат деп күтөбүз. Бул иште табылган CSF ташуу активдүүлүгү бар пептид векторлору андан ары изилденет. Учурда биз бул пептиддердин BBB жана/же BCSFB аркылуу өтүү жөндөмү боюнча мээнин өзгөчөлүгүн изилдеп жатабыз. Бул жаңы пептиддер жаңы рецепторлорду же жолдорду ачуу жана биологиялык препараттар сыяктуу макромолекулаларды мээге жеткирүү үчүн жаңы жогорку натыйжалуу платформаларды иштеп чыгуу үчүн өтө баалуу куралдар болот.
Чоң цистернаны (ЧЦ) мурда сүрөттөлгөн ыкманын модификациясын колдонуп канюляциялаңыз. Анестезияланган Вистар келемиштери (200-350 г) стереотаксикалык аппаратка орнотулуп, кырылган жана асептикалык жактан даярдалган баш сөөгүнүн үстүнөн ортоңку кесик жасалып, баш сөөгү ачыкка чыгарылды. Үстүнкү курдун аймагында эки тешик бургулап, тешиктерге бекитүүчү бурамаларды бекитиңиз. Дат баспас болоттон жасалган канюляны ЧЦга стереотаксикалык багыттоо үчүн каптал желке кыркасында кошумча тешик бургуланды. Канюланын айланасына тиш цементин сүйкөп, бурама менен бекитиңиз. Фотокатуудан жана цемент катуулангандан кийин, тери жарааты 4/0 супрамиддик тигиш менен жабылды. Канюланын туура жайгаштырылышы жүлүн суюктугунун (ЖС) өзүнөн-өзү агып кетиши менен тастыкталат. Келемишти стереотаксикалык аппараттан алып салыңыз, операциядан кийинки тийиштүү жардам жана ооруну басаңдатыңыз жана жүлүн суюктугунда кан белгилери байкалганга чейин жок дегенде бир жума калыбына келүүсүнө мүмкүнчүлүк бериңиз. Вистар келемиштери (Crl:WI/Han) Чарльз Риверден (Франция) алынган. Бардык келемиштер белгилүү бир патогенсиз шарттарда кармалган. Бардык жаныбарлар менен жүргүзүлгөн эксперименттер Швейцариянын Базель шаарынын Ветеринардык кеңсеси тарабынан бекитилген жана № 2474 Жаныбарларды изилдөө лицензиясына (Келемиштин жүлүн суюктугундагы жана мээсиндеги терапиялык талапкерлердин деңгээлин өлчөө менен мээнин активдүү ташылышын баалоо) ылайык жүргүзүлгөн.
Келемишти CM канюлясы менен этияттык менен эсинде кармаңыз. Датураны канюлядан алып чыгып, өзүнөн-өзү агып жаткан 10 мкл жүлүн суюктугун чогултуңуз. Канюланын өткөрүмдүүлүгү акыры бузулгандыктан, бул изилдөөгө кандын булганышы же түсүнүн өзгөрүшү байкалбаган тунук жүлүн суюктугунун үлгүлөрү гана киргизилген. Ошол эле учурда, куйруктун учундагы кичинекей кесиктен гепарин (Sigma-Aldrich) кошулган түтүкчөлөргө болжол менен 10–20 мкл кан алынган. T7 фагын венага сайгандан кийин жүлүн суюктугу жана кан ар кандай убакыт чекиттеринде чогултулган. Ар бир жүлүн суюктугунун үлгүсү чогултулганга чейин болжол менен 5–10 мкл суюктук төгүлгөн, бул катетердин өлүк көлөмүнө туура келет.
Китепканалар T7Select системасынын колдонмосунда сүрөттөлгөндөй T7Select 10-3b векторун колдонуу менен түзүлгөн (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Кыскача айтканда, кокустук 12-мердик ДНК кошулмасы төмөнкү форматта синтезделген:
Кош стоп кодондордон жана кошумчадагы аминокислоталардын ашыкча экспрессиясынан качуу үчүн NNK кодону колдонулган. N - ар бир нуклеотиддин кол менен аралаштырылган эквимолярдык катышы, ал эми K - аденин менен цитозин нуклеотиддеринин кол менен аралаштырылган эквимолярдык катышы. Бир катарлуу аймактар ​​dNTP (Novagen) жана Klenow ферменти (New England Biolabs) менен Klenow буферинде (New England Biolabs) 37°C температурада 3 саат бою андан ары инкубациялоо жолу менен кош катарлуу ДНКга айландырылган. Реакциядан кийин кош катарлуу ДНК EtOH чөкмө жолу менен калыбына келтирилген. Алынган ДНК EcoRI жана HindIII (экөө тең Rocheдон) рестрикциялык ферменттери менен сиңирилген. Андан кийин кесилген жана тазаланган (QIAquick, Qiagen) кошумча (T4 лигаза, New England Biolabs) 10B капсид генинин 348 аминокислотасынан кийин алдын ала кесилген T7 векторуна кадр ичинде байланган. Байлоо реакциялары in vitro таңгактоодон мурун 16°C температурада 18 саат инкубацияланган. In vitro фаг таңгактоо T7Select 10-3b клондоо комплекти (Novagen) менен берилген көрсөтмөлөргө ылайык жүргүзүлдү жана таңгактоо эритмеси Escherichia coli (BLT5615, Novagen) колдонуп лизиске бир жолу күчөтүлдү. Лизаттар центрифугаланып, титрленип, -80°C температурада глицериндин запастык эритмеси катары тоңдурулган.
Фагдын өзгөрмөлүү аймактарын сорподо же пластинада күчөтүлгөн 454/Roche-amplicon синтездөөчү праймерлерин колдонуу менен түз ПЦР аркылуу күчөтүү. Алдыга карай синтездөөчү праймер өзгөрмөлүү аймактын (NNK) 12 (шаблонго мүнөздүү) капталындагы ырааттуулуктарды, GS FLX титан адаптеринин A жана төрт базалык китепкананын ачкыч ырааттуулугун (TCAG) камтыйт (кошумча 1a-сүрөт):
Тескери синтез праймеринин курамында ошондой эле кармоочу мончокторго бекитилген биотин жана эмульсиялык ПТР учурунда клоналдык күчөтүү үчүн талап кылынган GS FLX титан адаптери B бар:
Андан кийин ампликондор 454 GS-FLX Titanium протоколуна ылайык 454/Roche пиросеквенирлөөсүнө дуушар болгон. Кол менен Sanger секвенирлөөсү үчүн (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl ДНК анализатору), T7 фаг ДНКсы ПЦР аркылуу күчөтүлүп, төмөнкү праймер жуптары менен секвенирленген:
Жеке бляшкалардан алынган кошумчалар Roche Fast Start ДНК полимераза комплектин колдонуу менен ПЦР күчөтүүсүнө дуушар болгон (өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык). Ысык баштоону (95 °C температурада 10 мүнөт) жана 35 күчөтүү циклин (95 °C температурада 50 секунд, 50 °C температурада 1 мүнөт жана 72 °C температурада 1 мүнөт) аткарыңыз.
Китепканалардан алынган фагдар, жапайы типтеги фагдар, жүлүн суюктугунан жана кандан куткарылган фагдар же жеке клондор Escherichia coli BL5615 бактериясынын кургак учук сорпосунда (Sigma Aldrich) же 500 см2 идиштерде (Thermo Scientific) 37°C температурада 4 саат бою күчөтүлгөн. Фагдар плиталардан Tris-EDTA буфери (Fluka Analytical) менен чайкап же плиталарды стерилденген пипетка учтары менен чогултуп алынган. Фагдар культуранын үстүнкү катмарынан же экстракция буферинен бир айлампа полиэтиленгликол (PEG 8000) чөкмөсүнүн (Promega) жардамы менен бөлүнүп алынып, Tris-EDTA буферинде кайра эритилген.
Күчөтүлгөн фаг венага (IV) сайылардан мурун (500 мкл/жаныбар) эндотоксинди жок кылуучу мончокторду (Miltenyi Biotec) колдонуп 2-3 жолу эндотоксинди жок кылуудан өткөрүлдү. Биринчи айлампада 2×1012 фаг; экинчисинде 2×1010 фаг; үчүнчү жана төртүнчү тандоо айлампаларында ар бир жаныбардан 2×109 фаг киргизилген. Көрсөтүлгөн убакыт чекиттеринде чогултулган жүлүн суюктугундагы жана кан үлгүлөрүндөгү фагдын курамы өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык бляшкаларды эсептөө менен аныкталган (T7Select системасынын колдонмосу). Фагды тандоо куйрук венага тазаланган китепканаларды венага сайуу же мурунку тандоо айлампасынан жүлүн суюктугунан алынган фагды кайра сайуу аркылуу жүргүзүлдү, ал эми кийинки чогултуулар тиешелүүлүгүнө жараша 10 мүнөт, 30 мүнөт, 60 мүнөт, 90 мүнөт, 120 мүнөт, 180 мүнөт жана 240 мүнөттө жүлүн суюктугу жана кан үлгүлөрүн алуу менен жүргүзүлдү. Жалпысынан төрт айлампа in vivo паннинг жүргүзүлдү, анда тандалган эки бутак өзүнчө сакталып, тандоонун алгачкы үч айлампасында талданды. Тандоонун алгачкы эки айлампасынан жүлүн суюктугунан алынган бардык фагдардын кошумчалары 454/Roche пиросеквенирлөөсүнө дуушар болду, ал эми тандоонун акыркы эки айлампасынан жүлүн суюктугунан алынган бардык клондор кол менен секвенирленди. Тандоонун биринчи айлампасынан алынган бардык кан фагдары да 454/Roche пиросеквенирлөөсүнө дуушар болду. Фаг клондорун сайуу үчүн тандалган фагдар E. coli (BL5615) 500 см2 пластинкаларда 37°C температурада 4 саат бою күчөтүлдү. Жекече тандалып алынган жана кол менен секвенирленген клондор кургак учук чөйрөсүндө көбөйтүлдү. Фагдарды экстракциялоодон, тазалоодон жана эндотоксинди алып салуудан кийин (жогоруда сүрөттөлгөндөй), 300 мклдеги 2 × 1010 фаг/жаныбар бир куйрук венага вена аркылуу сайылды.
Ырааттуулук маалыматтарын алдын ала иштетүү жана сапаттык чыпкалоо. Чийки 454/Roche маалыматтары бинардык стандарттык агым картасынын форматынан (sff) өндүрүүчүнүн программасын колдонуу менен Pearson адам окуй турган форматына (fasta) айландырылды. Нуклеотиддик ырааттуулукту андан ары иштетүү төмөндө сүрөттөлгөндөй менчик C программаларын жана скрипттерин (чыгарылбаган программалык пакет) колдонуу менен жүргүзүлдү. Баштапкы маалыматтарды талдоо катуу көп баскычтуу чыпкалоо процедураларын камтыйт. Жарактуу 12мердик киргизүү ДНКсынын ырааттуулугун камтыбаган окууларды чыпкалоо үчүн, окуулар глобалдык Needleman-Wunsch тестин колдонуу менен баштоо энбелгисине (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), токтотуу энбелгисине (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) жана фон киргизүүсүнө (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) ырааттуу түрдө тегизделген. тегиздөө ар бир тегиздөөдө 2ге чейин дал келбестикке жол берген31. Ошондуктан, баштоо жана токтотуу тегдери жок окуулар жана фон киргизүүлөрүн камтыган окуулар, б.а., уруксат берилген дал келбестиктердин санынан ашкан тегиздөөлөр китепканадан алынып салынган. Калган окууларга келсек, баштапкы окуу ырааттуулугунан токтото турган белги алынып салынганга жана андан ары иштетилгенге чейин башталган белгиден баштап аяктаган N-мер ДНК ырааттуулугу (мындан ары "киргизүү" деп аталат). Киргизүүнү которуудан кийин, праймердин 5' учундагы биринчи токтотуучу кодондон кийинки бөлүк киргизүүдөн алынып салынат. Мындан тышкары, праймердин 3' учундагы толук эмес кодондорго алып келүүчү нуклеотиддер да алынып салынды. Фондук ырааттуулуктарды гана камтыган киргизмелерди алып салуу үчүн, "PAG" аминокислота үлгүсүнөн башталган которулган киргизмелер да алынып салынды. Китепканадан которуудан кийинки узундугу 3 аминокислотадан аз болгон пептиддер алынып салынды. Акырында, киргизме пулундагы ашыкчалыкты алып салып, ар бир уникалдуу киргизменин жыштыгын аныктаңыз. Бул анализдин жыйынтыктарына нуклеотиддик ырааттуулуктардын (киргизмелердин) тизмеси жана алардын (окуу) жыштыктары кирди (1c жана 2-кошумча сүрөттөр).
N-мер ДНК тобунун кошумчалары ырааттуулук окшоштугу боюнча: 454/Рошко мүнөздүү секвенирлөө каталарын (мисалы, гомополимер кеңейтүүлөрүн секвенирлөөдөгү көйгөйлөр) жок кылуу жана анча маанилүү эмес ашыкчаларды алып салуу үчүн, мурда чыпкаланган N-мер ДНКнын кошумчалары (кошумчалары) окшоштук боюнча иреттелет. кошумчалары (2ге чейин дал келбеген негизге уруксат берилет) төмөнкүдөй аныкталган итеративдик алгоритмди колдонуу менен: кошумчалар алгач жыштыгы боюнча (эң жогоркудан эң төмөнкүгө чейин), ал эми эгер алар бирдей болсо, узундугу боюнча экинчилик сорттоо боюнча (эң узундан эң кыскага чейин) иреттелет. Ошентип, эң көп жана эң узун кошумчалар биринчи "топту" аныктайт. Топтун жыштыгы ачкыч жыштыгына коюлат. Андан кийин, иреттелген тизмеде калган ар бир кошумчаны жуп Нидлман-Вунш тегиздөөсү аркылуу топко кошууга аракет кылынган. Эгерде тегиздөөдөгү дал келбестиктердин, кошумчалардын же жок кылуулардын саны 2 босогодон ашпаса, топко кошумча кошулат жана топтун жалпы жыштыгы кошумчанын канчалык көп кошулганына жараша көбөйөт. Топко кошулган кошумчалар колдонулган деп белгиленет жана андан ары иштетүүдөн чыгарылат. Эгерде киргизүү ырааттуулугун мурунтан эле бар болгон топко кошууга мүмкүн болбосо, киргизүү ырааттуулугу тиешелүү киргизүү жыштыгы менен жаңы топ түзүү үчүн колдонулат жана колдонулган деп белгиленет. Итерация ар бир киргизүү ырааттуулугу жаңы топту түзүү үчүн колдонулганда же мурунтан эле бар болгон топко киргизилиши мүмкүн болгондо аяктайт. Кантсе да, нуклеотиддерден турган топтолгон киргизүүлөр акыры пептиддик ырааттуулуктарга (пептиддик китепканаларга) которулат. Бул анализдин натыйжасы катары менен окуулардын санын түзгөн киргизүүлөрдүн жыйындысы жана аларга тиешелүү жыштыктар болуп саналат (2-кошумча сүрөт).
Мотивдерди түзүү: Уникалдуу пептиддердин тизмесинин негизинде, төмөндө көрсөтүлгөндөй, бардык мүмкүн болгон аминокислота үлгүлөрүн (аа) камтыган китепкана түзүлдү. Узундугу 3 болгон ар бир мүмкүн болгон үлгү пептидден алынып, анын тескери үлгүсү бардык үлгүлөрдү (трипептиддерди) камтыган жалпы мотив китепканасы менен кошо кошулду. Өтө кайталануучу мотивдердин китепканалары секвенирленип, ашыкчалык алынып салынды. Андан кийин, мотив китепканасындагы ар бир трипептид үчүн биз эсептөө куралдарын колдонуп, анын китепканада бар-жогун текшердик. Бул учурда, табылган мотив трипептидин камтыган пептиддин жыштыгы кошулуп, мотив китепканасындагы мотивге дайындалат ("мотивдердин саны"). Мотивдерди түзүүнүн натыйжасы трипептиддердин (мотивдердин) бардык пайда болушун жана алардын тиешелүү маанилерин камтыган эки өлчөмдүү массив болуп саналат, алар окуулар чыпкаланганда, топтоштурулганда жана которулганда тиешелүү мотивге алып келген ырааттуулук менен окуулардын саны. Жогоруда кененирээк сүрөттөлгөн метрикалар.
Мотивдердин санын жана аларга тиешелүү чачыранды графиктерди нормалдаштыруу: Ар бир үлгү үчүн мотивдердин саны төмөнкүнү колдонуу менен нормалдаштырылган
мында ni - i темасын камтыган окуулардын саны. Ошентип, vi үлгүдөгү i мотивин камтыган окуулардын (же пептиддердин) пайыздык жыштыгын билдирет. Нормалдаштырылбаган мотивдердин саны үчүн P-маанилери Фишердин так тести аркылуу эсептелген. Мотивдердин санынын коррелограммаларына келсек, Спирмендин корреляциялары R менен нормалаштырылган мотивдердин санын колдонуу менен эсептелген.
Пептиддик китепканадагы ар бир позициядагы аминокислоталардын курамын визуалдаштыруу үчүн 32, 33 веб-логограммалары (http://weblogo.threeplusone.com) түзүлгөн. Алгач, 12-мер пептидинин ар бир позициясындагы аминокислоталардын курамы 20×12 матрицада сакталат. Андан кийин, ар бир позицияда бирдей салыштырмалуу аминокислота курамын камтыган 1000 пептиддин жыйындысы fasta-sequence форматында түзүлүп, берилген пептиддик китепкана үчүн ар бир позициядагы салыштырмалуу аминокислота курамынын графикалык көрсөтүлүшүн түзгөн веб-лого 3кө киргизүү катары берилет. Көп өлчөмдүү маалыматтар топтомдорун визуалдаштыруу үчүн жылуулук карталары R ичинде иштелип чыккан куралды (biosHeatmap, азырынча чыгарыла элек R пакети) колдонуу менен түзүлгөн. Жылуулук карталарында көрсөтүлгөн дендрограммалар Уорддун иерархиялык кластерлөө ыкмасын колдонуу менен Евклид аралык метрикасы менен эсептелген. Мотивдик баллдоо маалыматтарын статистикалык талдоо үчүн нормалдаштырылбаган баллдоо үчүн P маанилери Фишердин так тестин колдонуу менен эсептелген. Башка маалымат топтомдору үчүн P-маанилери Rде Студенттин t-тест же ANOVA колдонуу менен эсептелген.
Тандалган фаг клондору жана кыстармалары жок фагдар куйрук венасы аркылуу венага сайылган (2 × 1010 фаг/жаныбар 300 мкл PBSте). Перфузиядан жана андан кийинки фиксациядан он мүнөт мурун, ошол эле жаныбарларга 100 мкл DyLight594 менен белгиленген лектин (Vector Laboratories Inc., DL-1177) венага сайылган. Фаг сайылгандан 60 мүнөт өткөндөн кийин, келемиштерге жүрөк аркылуу 50 мл PBS, андан кийин 50 мл 4% PFA/PBS менен перфузияланган. Мээ үлгүлөрү кошумча түрдө 4% PFA/PBSте түнү бою фиксацияланган жана 4°C температурада түнү бою 30% сахарозага чыланган. Үлгүлөр OCT аралашмасында тез тоңдурулган. Тоңдурулган үлгүлөрдүн иммуногистохимиялык анализи бөлмө температурасында 1% BSA менен бөгөттөлгөн жана 4°C температурада T7 фагына (Novus NB 600-376A) каршы поликлоналдык FITC менен белгиленген антителолор менен инкубацияланган 30 мкм криосекцияларда жүргүзүлдү. Түнкүсүн инкубациялаңыз. Акырында, кесиндилер PBS менен 3 жолу жуулуп, конфокалдык лазердик микроскоп (Leica TCS SP5) менен каралды.
98% кем эмес тазалыктагы бардык пептиддер GenScript USA тарабынан синтезделип, биотиндештирилип жана лиофилизацияланган. Биотин N-терминалында кошумча үч глицин аралык аркылуу байланышат. Бардык пептиддерди массалык спектрометрияны колдонуп текшериңиз.
Стрептавидин (Sigma S0677) биотинделген пептиддин 5 эсе эквимолярдык ашыкчасы, биотинделген BACE1 ингибирлөөчү пептиди же биотинделген BACE1 ингибирлөөчү пептидинин жана BACE1 ингибирлөөчү пептидинин айкалышы (3:1 катышы) менен 5–10% DMSOдо аралаштырылган/PBSте инкубацияланган. Инъекциядан 1 саат мурун бөлмө температурасында. Стрептавидин менен конъюгацияланган пептиддер мээ көңдөйү бар келемиштердин куйрук веналарынын бирине 10 мг/кг дозада вена ичине сайылган.
Стрептавидин-пептиддик комплекстердин концентрациясы ELISA аркылуу бааланган. Nunc Maxisorp микротитр плиталары (Sigma) 4°C температурада түнү бою 1,5 мкг/мл чычкандын стрептавидинге каршы антителосу (Thermo, MA1-20011) менен капталган. Блоктоп салгандан кийин (блоктоп жаткан буфер: 140 нМ NaCL, 5 мМ EDTA, 0,05% NP40, 0,25% желатин, 1% BSA) бөлмө температурасында 2 саат бою, плитаны 0,05% Tween-20/PBS (жуу буфери) менен 3 секунд жууп, жүлүн суюктугу жана плазма үлгүлөрү блоктоп жаткан буфер менен суюлтулган кудуктарга кошулган (плазма 1:10,000, CSF 1:115). Андан кийин плита 4°C температурада түнү бою аныктоочу антитело менен (1 мкг/мл, стрептавидинге каршы HRP, Novus NB120-7239) инкубацияланган. Үч жуугандан кийин, стрептавидин TMB субстрат эритмесинде (Roche) 20 мүнөткө чейин инкубациялоо жолу менен аныкталган. 1M H2SO4 менен түстүн пайда болушун токтоткондон кийин, 450 нмде абсорбцияны өлчөңүз.
Стрептавидин-пептид-BACE1 ингибитор комплексинин функциясы өндүрүүчүнүн протоколуна (Wako, 294-64701) ылайык Aβ(1-40) ELISA аркылуу бааланган. Кыскача айтканда, жүлүн суюктугунун үлгүлөрү стандарттуу эриткичте (1:23) суюлтулуп, BNT77 кармоочу антитело менен капталган 96 кудуктуу пластиналарда 4°C температурада түнү бою инкубацияланган. Беш жуугандан кийин, HRP менен конъюгацияланган BA27 антителосу кошулуп, 4°C температурада 2 саат инкубацияланган, андан кийин беш жуугандан кийин. Aβ(1–40) бөлмө температурасында TMB эритмесинде 30 мүнөт инкубациялоо жолу менен аныкталган. Түстүн өнүгүшү токтотуучу эритме менен токтотулгандан кийин, 450 нмде абсорбцияны өлчөңүз. Плазма үлгүлөрү Aβ(1–40) ELISAга чейин катуу фазалуу экстракцияга дуушар болгон. Плазма 96 кудуктуу пластиналарда 0,2% DEA (Sigma) кошулуп, бөлмө температурасында 30 мүнөт инкубацияланган. SPE плиталарын (Oasis, 186000679) суу жана 100% метанол менен удаалаш жуугандан кийин, плазма үлгүлөрү SPE плиталарына кошулуп, бардык суюктук алынып салынган. Үлгүлөр жуулган (алгач 5% метанол, андан кийин 30% метанол менен) жана 2% NH4OH/90% метанол менен элюцияланган. Элюатты 55°C температурада 99 мүнөт туруктуу N2 тогунда кургаткандан кийин, үлгүлөр стандарттуу эриткичтерде калыбына келтирилген жана Aβ(1–40) жогоруда сүрөттөлгөндөй өлчөнгөн.
Бул макаланы кантип шилтемелөө керек: Урих, Э. жана башкалар. In vivo аныкталган транзиттик пептиддерди колдонуу менен мээге жүк жеткирүү. Science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Лихота Ж., Скьорринге Т., Томсен Л.Б. жана Мус Т. Макромолекулярдык дары-дармектерди мээге максаттуу терапияны колдонуу менен жеткирүү. Нейрохимия журналы 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Брасневич, И., Штайнбуш, Х.В., Шмиц, К. жана Мартинес-Мартинес, П. Пептиддик жана белоктук дарыларды кан-мээ тосмосу аркылуу жеткирүү. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардридж, ВМ. Гематоэнцефалдык тосмо: мээге дары-дармектерди иштеп чыгуудагы тоскоолдук. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Йохансон, К.Е., Дункан, Ж.А., Стопа, Э.Г. жана Берд, А. Хороиддик өрүм-жүлүн жолу аркылуу мээге дары-дармектерди жеткирүүнү жана аларды максаттуу түрдө жеткирүүнү жакшыртуу келечеги. Фармацевтикалык изилдөөлөр 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардридж, ВМ Мээге жеткирүү үчүн молекулярдык троян аттары менен биофармацевтикалык каражаттарды модернизациялоо. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардридж, WM рецептору аркылуу пептиддердин кан-мээ тосмосу аркылуу ташылышы. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Нивунер, Ж. жана башкалар. Монокаленттүү молекулярдык шаттлдарды колдонуу менен мээге кирүүсүн жана терапиялык антителолордун натыйжалуулугун жогорулатуу. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Биен-Ли, Н. жана башкалар. Трансферрин рецепторунун (TfR) ташылышы TfR антителолорунун аффиндик варианттарынын мээге сиңишин аныктайт. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).