Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Folosiți o versiune de browser cu suport CSS limitat. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). În plus, pentru a asigura suport continuu, afișăm site-ul fără stiluri și JavaScript.
Afișează un carusel cu trei diapozitive simultan. Folosește butoanele Anterior și Următor pentru a parcurge trei diapozitive simultan sau folosește butoanele cursorului de la final pentru a parcurge trei diapozitive simultan.
Bariera hematoencefalică și bariera hematoencefalică împiedică agenții bioterapici să își atingă țintele în sistemul nervos central, împiedicând astfel tratamentul eficient al bolilor neurologice. Pentru a descoperi noi transportori cerebrali in vivo, am introdus o bibliotecă de peptide fagice T7 și am colectat în serie sânge și lichid cefalorahidian (LCR) utilizând un model de șobolani canulat, cu un grup mare de fagi. Clone specifice de fagi au fost puternic îmbogățite în LCR după patru runde de selecție. Testarea peptidelor candidate individuale a relevat o îmbogățire de peste 1000 de ori în LCR. Bioactivitatea administrării mediate de peptide către creier a fost confirmată printr-o reducere cu 40% a nivelului de amiloid-β în lichidul cefalorahidian utilizând un inhibitor de peptidă BACE1 legat de noua peptidă de tranzit identificată. Aceste rezultate sugerează că peptidele identificate prin metode de selecție a fagilor in vivo pot fi vehicule utile pentru administrarea sistemică a macromoleculelor către creier cu efect terapeutic.
Cercetarea terapiei țintite asupra sistemului nervos central (SNC) s-a concentrat în mare măsură pe identificarea medicamentelor și agenților optimizați care prezintă proprietăți de țintire a SNC, cu mai puțin efort pentru descoperirea mecanismelor care determină administrarea activă a medicamentelor către creier. Acest lucru începe să se schimbe acum, deoarece administrarea medicamentelor, în special a moleculelor mari, este o parte integrantă a dezvoltării moderne a medicamentelor în neuroștiințe. Mediul sistemului nervos central este bine protejat de sistemul de barieră cerebrovasculară, format din bariera hematoencefalică (BHE) și bariera hematoencefalică (BHE)1, ceea ce face dificilă administrarea medicamentelor către creier1,2. Se estimează că aproape toate medicamentele cu molecule mari și peste 98% din medicamentele cu molecule mici sunt eliminate din creier3. De aceea este foarte important să se identifice noi sisteme de transport cerebral care să asigure o administrare eficientă și specifică a medicamentelor terapeutice către SNC4,5. Cu toate acestea, BHE și BHE prezintă, de asemenea, o oportunitate excelentă pentru administrarea medicamentelor, deoarece acestea pătrund și intră în toate structurile creierului prin vasculatura sa extinsă. Astfel, eforturile actuale de a utiliza metode neinvazive de administrare la nivelul creierului se bazează în mare măsură pe mecanismul transportului mediat de receptori (PMT) utilizând receptorul endogen BBB6. În ciuda progreselor cheie recente în utilizarea căii receptorilor de transferină7,8, este necesară dezvoltarea în continuare a unor noi sisteme de administrare cu proprietăți îmbunătățite. În acest scop, obiectivul nostru a fost de a identifica peptide capabile să medieze transportul LCR, deoarece acestea ar putea fi utilizate în principiu pentru a livra macromolecule către SNC sau pentru a deschide noi căi receptorilor. În special, receptorii și transportorii specifici ai sistemului cerebrovascular (BBB și BSCFB) pot servi ca ținte potențiale pentru administrarea activă și specifică a medicamentelor bioterapice. Lichidul cefalorahidian (LCR) este un produs secretor al plexului coroidian (CS) și este în contact direct cu lichidul interstițial al creierului prin spațiul subarahnoidian și spațiul ventricular4. Recent, s-a demonstrat că lichidul cefalorahidian subarahnoidian difuzează excesiv în interstițiul creierului9. Sperăm să accesăm spațiul parenchimal utilizând acest tract de influx subarahnoidian sau direct prin BHE. Pentru a realiza acest lucru, am implementat o strategie robustă de selecție a fagilor in vivo care identifică în mod ideal peptidele transportate prin oricare dintre aceste două căi distincte.
Descriem acum o metodă secvențială de screening in vivo cu fagi, cu prelevare de probe din LCR cuplată cu secvențiere cu randament ridicat (HTS) pentru a monitoriza rundele inițiale de selecție cu cea mai mare diversitate a bibliotecii. Screening-ul a fost efectuat pe șobolani conștienți, cu o canulă de cisternă mare (CM) implantată permanent, pentru a evita contaminarea cu sânge. Este important de menționat că această abordare selectează atât peptidele care vizează creierul, cât și peptidele cu activitate de transport prin bariera cerebrovasculară. Am utilizat fagi T7 datorită dimensiunii lor mici (~60 nm)10 și am sugerat că sunt potriviți pentru transportul veziculelor care permit traversarea transcelulară a barierei endoteliale și/sau epitelio-medulare. După patru runde de panning, populațiile de fagi au fost izolate, prezentând o îmbogățire puternică in vivo a LCR și o asociere a microvaselor cerebrale. Este important de menționat că am putut confirma descoperirile noastre demonstrând că peptidele candidate preferate și sintetizate chimic sunt capabile să transporte încărcătura proteică în lichidul cefalorahidian. În primul rând, efectele farmacodinamice ale SNC au fost stabilite prin combinarea unei peptide de tranzit principale cu un inhibitor al peptidei BACE1. Pe lângă demonstrarea faptului că strategiile de screening funcțional in vivo pot identifica noi peptide de transport cerebral ca purtători eficienți de marfă proteică, ne așteptăm ca abordări similare de selecție funcțională să devină importante și în identificarea unor noi căi de transport cerebral.
Pe baza unităților formatoare de plăci (PFU), după etapa de împachetare a fagilor, a fost proiectată și creată o bibliotecă de peptide fagice T7 liniare aleatorii de 12 meruri cu o diversitate de aproximativ 109 (vezi Materiale și metode). Este important de menționat că am analizat cu atenție această bibliotecă înainte de panning-ul in vivo. Amplificarea PCR a probelor din biblioteca de fagi folosind primeri modificați a generat ampliconi care au fost direct aplicabili la HTS (Figura suplimentară 1a). Din cauza a) erorilor de secvențiere HTS11, b) impactului asupra calității primerilor (NNK)1-12 și c) prezenței fagului de tip sălbatic (wt) (inserții de schelet) în biblioteca standby, a fost implementată o procedură de filtrare a secvenței pentru a extrage doar informațiile verificate despre secvență (Figura suplimentară 1b). Acești pași de filtrare se aplică tuturor bibliotecilor de secvențiere HTS. Pentru biblioteca standard, au fost obținute un total de 233.868 de citiri, dintre care 39% au îndeplinit criteriile de filtrare și au fost utilizate pentru analiza și selecția bibliotecii pentru rundele ulterioare (Figura suplimentară 1c-e). Citirile au fost predominant multipli de 3 perechi de baze în lungime, cu un vârf la 36 de nucleotide (Fig. suplimentară 1c), confirmând designul bibliotecii (NNK) 1-12. În special, aproximativ 11% dintre membrii bibliotecii conțineau un insert PAGISRELVDKL de tip sălbatic (wt) în 12 dimensiuni, iar aproape jumătate din secvențe (49%) conțineau inserții sau deleții. HTS-ul bibliotecii a confirmat diversitatea ridicată a peptidelor din bibliotecă: peste 81% dintre secvențele peptidice au fost găsite o singură dată și doar 1,5% au apărut în ≥4 copii (Fig. suplimentară 2a). Frecvențele aminoacizilor (aa) la toate cele 12 poziții din repertoriu s-au corelat bine cu frecvențele așteptate pentru numărul de codoni generați de repertoriul NKK degenerat (Fig. suplimentară 2b). Frecvența observată a reziduurilor aa codificate de aceste inserții s-a corelat bine cu frecvența calculată (r = 0,893) (Fig. suplimentară 2c). Prepararea bibliotecilor de fagi pentru injectare include etapele de amplificare și eliminare a endotoxinei. Anterior, s-a demonstrat că acest lucru poate reduce diversitatea bibliotecilor de fagi12,13. Prin urmare, am secvențiat o bibliotecă de fagi amplificată pe placă, care a suferit eliminarea endotoxinei, și am comparat-o cu biblioteca originală pentru a estima frecvența AA. O corelație puternică (r = 0,995) a fost observată între grupul original și grupul amplificat și purificat (Fig. suplimentară 2d), indicând faptul că competiția dintre clonele amplificate pe plăci folosind fagul T7 nu a cauzat o tendință majoră. Această comparație se bazează pe frecvența motivelor tripeptidice din fiecare bibliotecă, deoarece diversitatea bibliotecilor (~109) nu poate fi surprinsă complet nici măcar cu HTS. Analiza frecvenței aa la fiecare poziție a relevat o mică tendință dependentă de poziție în ultimele trei poziții ale repertoriului introdus (Fig. suplimentară 2e). În concluzie, am concluzionat că calitatea și diversitatea bibliotecii au fost acceptabile și că s-au observat doar modificări minore ale diversității datorită amplificării și preparării bibliotecilor de fagi între mai multe runde de selecție.
Prelevarea serială de lichid cefalorahidian poate fi efectuată prin implantarea chirurgicală a unei canule în matricea spatelui (CM) a șobolanilor conștienți pentru a facilita identificarea fagului T7 injectat intravenos (iv) prin intermediul BBB și/sau BCSFB (Fig. 1a-b). Am utilizat două brațe de selecție independente (brațele A și B) în primele trei runde de selecție in vivo (Fig. 1c). Am crescut treptat stringența selecției prin scăderea cantității totale de fag introdusă în primele trei runde de selecție. Pentru a patra rundă de panning, am combinat probe din ramurile A și B și am efectuat trei selecții independente suplimentare. Pentru a studia proprietățile in vivo ale particulelor de fag T7 în acest model, fagul de tip sălbatic (insert principal PAGISRELVDKL) a fost injectat la șobolani prin vena cozii. Recuperarea fagilor din lichidul cefalorahidian și sânge la diferite momente de timp a arătat că fagii icosaedrici T7 relativ mici au avut o fază inițială rapidă de eliminare din compartimentul sanguin (Fig. suplimentară 3). Pe baza titrurilor administrate și a volumului sanguin al șobolanilor, am calculat că doar aproximativ 1% din greutatea fagului din doza administrată a fost detectat în sânge la 10 minute după injectarea intravenoasă. După această scădere rapidă inițială, s-a măsurat un clearance primar mai lent, cu un timp de înjumătățire de 27,7 minute. Este important de menționat că doar foarte puțini fagi au fost recuperați din compartimentul LCR, indicând un nivel scăzut de migrare a fagilor de tip sălbatic în compartimentul LCR (Figura suplimentară 3). În medie, doar aproximativ 1 x 10-3% titruri de fag T7 în sânge și 4 x 10-8% din fagii perfuzați inițial au fost detectați în lichidul cefalorahidian pe întreaga perioadă de prelevare a probelor (0-250 min). În mod notabil, timpul de înjumătățire (25,7 min) al fagului de tip sălbatic în lichidul cefalorahidian a fost similar cu cel observat în sânge. Aceste date demonstrează că bariera care separă compartimentul LCR de sânge este intactă la șobolanii canulați cu CM, permițând selecția in vivo a bibliotecilor de fagi pentru a identifica clone care sunt ușor transportate din sânge în compartimentul LCR.
(a) Configurarea unei metode de re-eșantionare a lichidului cefalorahidian (LCR) dintr-un grup mare. (b) Diagramă care prezintă locația celulară a barierei sistemului nervos central (SNC) și strategia de selecție utilizată pentru a identifica peptidele care traversează bariera hematoencefalică (BHE) și bariera hematoencefalică. (c) Diagramă de flux a screening-ului fagic in vivo. În fiecare rundă de selecție, fagii (identificatorii de animale din interiorul săgeților) au fost injectați intravenos. Două ramificații alternative independente (A, B) sunt păstrate separat până la a 4-a rundă de selecție. Pentru rundele de selecție 3 și 4, fiecare clonă de fag extrasă din LCR a fost secvențiată manual. (d) Cinetica fagului izolat din sânge (cercuri roșii) și lichidul cefalorahidian (triunghiuri verzi) în timpul primei runde de selecție la doi șobolani canulați după injectarea intravenoasă a bibliotecii de peptide T7 (2 x 1012 fagi/animal). Pătratele albastre indică concentrația inițială medie a fagului în sânge, calculată din cantitatea de fag injectat, ținând cont de volumul total de sânge. Pătratele negre indică punctul de intersecție al liniei y extrapolate din concentrațiile de fagi din sânge. (e,f) Prezintă frecvența și distribuția relativă a tuturor motivelor tripeptidice suprapuse posibile găsite în peptidă. Este afișat numărul de motive găsite în 1000 de citiri. Motivele îmbogățite semnificativ (p < 0,001) sunt marcate cu puncte roșii. (e) Diagramă de dispersie a corelației care compară frecvența relativă a motivului tripeptidic al bibliotecii injectate cu fagul derivat din sânge de la animalele #1.1 și #1.2. (f) Diagramă de dispersie a corelației care compară frecvențele relative ale motivelor tripeptidice ale fagului animal #1.1 și #1.2 izolate în sânge și lichidul cefalorahidian. (g, h) Reprezentarea ID-ului secvenței fagului îmbogățit în sânge (g) față de bibliotecile injectate și a fagului îmbogățit în LCR (h) față de sânge după o rundă de selecție in vivo la ambele animale. Mărimea codului format din o literă indică cât de des apare aminoacidul respectiv în poziția respectivă. Verde = polar, violet = neutru, albastru = bazic, roșu = acid și negru = aminoacizi hidrofobi. Figura 1a, b a fost proiectată și realizată de Eduard Urich.
Am injectat o bibliotecă de peptide fagice la doi șobolani din instrumentul CM (cladele A și B) și am izolat fagul din lichidul cefalorahidian și sânge (Figura 1d). Eliminarea rapidă inițială a bibliotecii a fost mai puțin pronunțată în comparație cu fagul de tip sălbatic. Timpul mediu de înjumătățire al bibliotecii injectate la ambele animale a fost de 24,8 minute în sânge, similar cu fagul de tip sălbatic, și de 38,5 minute în LCR. Probele de sânge și lichid cefalorahidian de la fiecare animal au fost supuse HTS și toate peptidele identificate au fost analizate pentru prezența unui motiv tripeptidic scurt. Motivele tripeptidice au fost alese deoarece oferă o bază minimă pentru formarea structurii și interacțiunile peptidă-proteină14,15. Am găsit o bună corelație în distribuția motivelor între biblioteca de fagice injectată și clonele extrase din sângele ambelor animale (Fig. 1e). Datele indică faptul că compoziția bibliotecii este doar marginal îmbogățită în compartimentul sanguin. Frecvențele aminoacizilor și secvențele consens au fost analizate în continuare la fiecare poziție folosind o adaptare a software-ului Weblogo16. Interesant este că am descoperit o îmbogățire puternică a reziduurilor de glicină din sânge (Fig. 1g). Când sângele a fost comparat cu clonele selectate din LCR, s-a observat o selecție puternică și o oarecare deselectări a motivelor (Fig. 1f), iar anumiți aminoacizi au fost prezenți preferențial în poziții predeterminate în structura cu 12 membri (Fig. 1h). În mod notabil, animalele individuale au prezentat diferențe semnificative în lichidul cefalorahidian, în timp ce îmbogățirea cu glicină din sânge a fost observată la ambele animale (Fig. suplimentară 4a-j). După filtrarea strictă a datelor secvențiale în lichidul cefalorahidian al animalelor #1.1 și #1.2, s-au obținut un total de 964 și 420 de peptide unice de 12 meruri (Fig. suplimentară 1d-e). Clonele fagice izolate au fost amplificate și supuse unei a doua runde de selecție in vivo. Fagii extrași din a doua rundă de selecție au fost supuși HTS la fiecare animal, iar toate peptidele identificate au fost utilizate ca date de intrare într-un program de recunoaștere a motivelor pentru a analiza apariția motivelor tripeptidice (Fig. 2a, b, ef). Comparativ cu primul ciclu al fagului recuperat din LCR, am observat o selecție și deselectie suplimentară a multor motive în LCR în ramurile A și B (Fig. 2). A fost aplicat un algoritm de identificare a rețelei pentru a determina dacă acestea reprezentau modele diferite de secvență consistentă. S-a observat o similaritate clară între secvențele 12-dimensionale recuperate de LCR în clada alternativă A (Fig. 2c, d) și clada B (Fig. 2g, h). Analiza combinată în fiecare ramură a relevat profiluri de selecție diferite pentru peptidele 12-meri (Fig. suplimentară 5c, d) și o creștere a raportului titru LCR/sânge în timp pentru clonele combinate după a doua rundă de selecție, comparativ cu prima rundă de selecție (Fig. suplimentară 5e).
Îmbogățirea motivelor și peptidelor în lichidul cefalorahidian prin două runde succesive de selecție funcțională in vivo a fagilor.
Toți fagii din lichidul cefalorahidian recuperați din prima rundă a fiecărui animal (animalele #1.1 și #1.2) au fost reuniți, amplificați, secvențiați HT și reinjectați împreună (2 x 1010 fagi/animal) la 2 șobolani canulați SM (#1.1 → #). 2.1 și 2.2, 1.2 → 2.3 și 2.4). (a,b,e,f) Diagrame de dispersie de corelație care compară frecvența relativă a motivelor tripeptidice ale tuturor fagilor derivați din LCR în prima și a doua rundă de selecție. Frecvența relativă și distribuția motivelor care reprezintă toate tripeptidele posibil suprapuse găsite în peptide în ambele orientări. Este prezentat numărul de motive găsite în 1000 de citiri. Motivele care au fost selectate sau excluse semnificativ (p < 0,001) într-una dintre bibliotecile comparate sunt evidențiate cu puncte roșii. (c, d, g, h) Reprezentarea logo-ului secvenței tuturor secvențelor lungi de 12 aminoacizi bogate în LCR, bazată pe rundele 2 și 1 ale selecției in vivo. Dimensiunea codului de o literă indică cât de des apare aminoacidul respectiv în acea poziție. Pentru a reprezenta logo-ul, se compară frecvența secvențelor LCR extrase de la animale individuale între două runde de selecție, iar secvențele îmbogățite din a doua rundă sunt prezentate: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 și (h) #1.2–#2.4. Aminoacizii cei mai îmbogățiți la o anumită poziție la (c, d) animalele nr. 2.1 și nr. 2.2 sau (g, h) la animalele nr. 2.3 și nr. 2.4 sunt arătați în culori. Verde = polar, violet = neutru, albastru = bazic, roșu = acid și negru = aminoacizi hidrofobi.
După a treia rundă de selecție, am identificat 124 de secvențe peptidice unice (#3.1 și #3.2) din 332 de clone de fagi reconstituiți din LCR, izolate de la două animale (Fig. suplimentară 6a). Secvența LGSVS (18,7%) a avut cea mai mare proporție relativă, urmată de inserturile de tip sălbatic PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) și SARGSWREIVSLS (2,2%). În a patra rundă finală, am reunit două ramificații selectate independent de la trei animale separate (Fig. 1c). Dintre cele 925 de clone de fagi secvențiate recuperate din LCR, în a patra rundă am găsit 64 de secvențe peptidice unice (Fig. suplimentară 6b), dintre care proporția relativă de fagi de tip sălbatic a scăzut la 0,8%. Cele mai frecvente clone CSF în runda a patra au fost LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) și RLSSVDSDLSGC (3,2%). Intervalul de lungime al peptidelor selectate se datorează inserțiilor/delețiilor de nucleotide sau codonilor stop prematuri în primerii bibliotecii atunci când se utilizează codoni degenerați pentru proiectarea bibliotecii NNK. Codonii stop prematuri generează peptide mai scurte și sunt selectați deoarece conțin motivul aa favorabil. Peptidele mai lungi pot rezulta din inserții/deleții în primerii bibliotecilor sintetice. Aceasta poziționează codonul stop proiectat în afara cadrului și îl citește până când apare un nou codon stop în aval. În general, am calculat factorii de îmbogățire pentru toate cele patru runde de selecție comparând datele de intrare cu datele de ieșire ale eșantionului. Pentru prima rundă de screening, am folosit titruri de fagi de tip sălbatic ca referință de fundal nespecifică. Interesant este că selecția negativă a fagilor a fost foarte puternică în primul ciclu LCR, dar nu și în sânge (Fig. 3a), ceea ce se poate datora probabilității scăzute de difuzie pasivă a majorității membrilor bibliotecii de peptide în compartimentul LCR sau fagii relativi tind să fie reținuți sau eliminați mai eficient din fluxul sanguin decât bacteriofagii. Cu toate acestea, în a doua rundă de panning, s-a observat o selecție puternică a fagilor în LCR în ambele clade, sugerând că runda anterioară a fost îmbogățită în fagi care prezintă peptide ce promovează absorbția LCR (Fig. 3a). Din nou, fără o îmbogățire semnificativă a sângelui. De asemenea, în a treia și a patra rundă, clonele fagilor au fost îmbogățite semnificativ în LCR. Comparând frecvența relativă a fiecărei secvențe peptidice unice între ultimele două runde de selecție, am constatat că secvențele au fost și mai îmbogățite în a patra rundă de selecție (Fig. 3b). Un total de 931 de motive tripeptidice au fost extrase din toate cele 64 de secvențe peptidice unice folosind ambele orientări peptidice. Cele mai îmbogățite motive din a patra rundă au fost examinate mai atent pentru profilurile lor de îmbogățire în toate rundele, comparativ cu biblioteca injectată (prag limită: îmbogățire de 10%) (Fig. suplimentară 6c). Modelele generale de selecție au arătat că majoritatea motivelor studiate au fost îmbogățite în toate rundele anterioare ale ambelor ramuri de selecție. Cu toate acestea, unele motive (de exemplu, SGL, VSG, LGS GSV) au provenit predominant din clada alternativă A, în timp ce altele (de exemplu, FGW, RTN, WGF, NTR) au fost îmbogățite în clada alternativă B.
Validarea transportului în LCR al peptidelor afișate în fagi îmbogățite cu LCR și al peptidelor lider biotinilate conjugate cu încărcături de streptavidină.
(a) Ratele de îmbogățire calculate în toate cele patru runde (R1-R4) pe baza titrurilor de fagi (PFU) injectate (intrare = I) și a titrurilor de fagi din LCR determinate (ieșire = O). Factorii de îmbogățire pentru ultimele trei runde (R2-R4) au fost calculați prin comparație cu runda anterioară și prima rundă (R1) cu date despre greutate. Barele deschise reprezintă lichidul cefalorahidian, barele umbrite reprezintă plasma. (***p<0,001, bazat pe testul t Student). (b) Lista celor mai abundente peptide fagice, clasificate în funcție de proporția lor relativă față de toți fagii colectați în LCR după runda 4 de selecție. Cele șase clone de fagi cele mai comune sunt evidențiate prin culoare, numerotate și au factorii lor de îmbogățire între rundele 3 și 4 de selecție (inserții). (c,d) Cele șase clone de fagi cele mai îmbogățite, bibliotecile goale de peptide fagice și parentale din runda 4 au fost analizate individual într-un model de eșantionare a LCR. Probele de LCR și sânge au fost colectate la momentele de timp indicate. (c) Cantități egale de 6 clone de fagi candidați (2 x 1010 fagi/animale), fagi goi (#1779) (2 x 1010 fagi/animale) și biblioteci de peptide fagice stoc (2 x 1012 fagi/animale). Injectați cel puțin 3 CM și administrați animalului canulat separat prin vena cozii. Este prezentată farmacocinetica LCR a fiecărei clone de fag injectate și a fiecărei biblioteci de peptide fagice în funcție de timp. (d) prezintă raportul mediu LCR/sânge pentru toți fagii/ml recuperați pe parcursul perioadei de prelevare a probelor. (e) Patru peptide lider sintetice și un control amestecat au fost legate cu biotină la streptavidină prin capătul lor N-terminal (expunerea tetramerului), urmată de injectare (vena cozii iv, 10 mg streptavidină/kg). Cel puțin trei șobolani intubați (N = 3). ). Probele de LCR au fost colectate la momentele indicate, iar concentrațiile de streptavidină au fost măsurate prin test ELISA anti-streptavidină în LCR (nd = nedetectat). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, bazat pe testul ANOVA). (f) Compararea secvenței de aminoacizi a clonei peptidice fagice #2002 (violet) celei mai îmbogățite cu alte clone peptidice fagice selectate din a 4-a rundă de selecție. Fragmentele de aminoacizi identice și similare sunt codificate prin culori.
Dintre toți fagii îmbogățiți în runda a patra (Fig. 3b), șase clone candidate au fost selectate pentru analize individuale ulterioare în modelul de eșantionare CSF. Cantități egale de șase biblioteci de fagi candidați, fagi goi (fără insert) și peptide profage au fost injectate în trei animale CM canulate, iar farmacocinetica a fost determinată în teste CSF (Fig. 3c) și sânge (Fig. suplimentară 7). Toate clonele de fagi testate au vizat compartimentul CSF la un nivel de 10-1000 de ori mai mare decât cel al fagului de control gol (#1779). De exemplu, clonele #2020 și #2077 au avut titruri CSF de aproximativ 1000 de ori mai mari decât fagul de control. Profilul farmacocinetic al fiecărei peptide selectate este diferit, dar toate au o capacitate ridicată de localizare a CSF. Am observat o scădere constantă în timp pentru clonele #1903 și #2011, în timp ce pentru clonele #2077, #2002 și #2009 o creștere în primele 10 minute ar putea indica transport activ, dar trebuie verificată. Clonele #2020, #2002 și #2077 s-au stabilizat la niveluri ridicate, în timp ce concentrația LCR a clonei #2009 a scăzut lent după creșterea inițială. Apoi am comparat frecvența relativă a fiecărui candidat LCR cu concentrația sa din sânge (Fig. 3d). Corelarea titrului mediu al fiecărui candidat LCR cu titrul său din sânge la toate momentele de prelevare a probelor a arătat că trei dintre cei șase candidați au fost îmbogățiți semnificativ în LCR din sânge. Interesant este că clona #2077 a prezentat o stabilitate sanguină mai mare (Figura suplimentară 7). Pentru a confirma că peptidele în sine sunt capabile să transporte activ încărcături, altele decât particulele de fag, în compartimentul LCR, am sintetizat patru peptide lider derivatizate cu biotină la capătul N-terminal, unde peptidele se atașează de particula de fag. Peptidele biotinilate (nr. 2002, 2009, 2020 și 2077) au fost conjugate cu streptavidină (SA) pentru a obține forme multimerice care imită oarecum geometria fagilor. Acest format ne-a permis, de asemenea, să măsurăm expunerea la SA în sânge și lichidul cefalorahidian ca peptide proteice transportoare de marfă. Este important de menționat că datele despre fagi au putut fi adesea reproduse atunci când peptidele sintetice au fost administrate în acest format SA-conjugat (Fig. 3e). Peptidele amestecate au avut o expunere inițială mai mică și un clearance mai rapid al LCR, cu niveluri nedetectabile în decurs de 48 de ore. Pentru a obține informații despre căile de administrare ale acestor clone peptidice de fag în spațiul LCR, am analizat localizarea peptidelor fagice individuale folosind imunohistochimia (IHC) pentru a detecta direct particulele de fag la 1 oră după injectarea intravenoasă in vivo. În mod special, clonele #2002, #2077 și #2009 au putut fi detectate prin colorare puternică în capilarele cerebrale, în timp ce fagul de control (#1779) și clona #2020 nu au fost detectate (Figura suplimentară 8). Acest lucru sugerează că aceste peptide contribuie la efectul asupra creierului tocmai prin traversarea BBB. Sunt necesare analize suplimentare detaliate pentru a testa această ipoteză, deoarece este posibil să fie implicată și ruta BSCFB. La compararea secvenței de aminoacizi a clonei celei mai îmbogățite (#2002) cu alte peptide selectate, s-a observat că unele dintre ele au extensii similare de aminoacizi, ceea ce poate indica un mecanism de transport similar (Fig. 3f).
Datorită profilului său plasmatic unic și creșterii semnificative a LCR în timp, clona #2077 cu afișare fagică a fost explorată în continuare pe o perioadă mai lungă de 48 de ore și a fost capabilă să reproducă creșterea rapidă a LCR observată în asociere cu niveluri susținute de aciditate sulfică (SA) (Fig. 4a). În ceea ce privește alte clone fagice identificate, #2077 s-a colorat puternic pentru capilarele cerebrale și a prezentat o colocalizare semnificativă cu lectina marker capilară atunci când a fost vizualizată la o rezoluție mai mare și, eventual, o oarecare colorare în spațiul parenchimal (Figura 4b). Pentru a investiga dacă efectele farmacologice mediate de peptide ar putea fi obținute în SNC, am efectuat un experiment în care versiuni biotinilate ale i) peptidei de tranzit #2077 și ii) peptidei inhibitoare BACE1 au fost amestecate cu SA în două raporturi diferite. Pentru o combinație am utilizat doar inhibitorul peptidic BACE1, iar pentru cealaltă am utilizat un raport de 1:3 de inhibitor peptidic BACE1 la peptida #2077. Ambele probe au fost administrate intravenos, iar nivelurile de beta-amiloid peptid 40 (Abeta40) din sânge și lichidul cefalorahidian au fost măsurate în timp. Abeta40 a fost măsurat în LCR, deoarece reflectă inhibarea BACE1 în parenchimul cerebral. Așa cum era de așteptat, ambele complexe au redus semnificativ nivelurile sanguine de Abeta40 (Fig. 4c, d). Cu toate acestea, doar probele care conțin un amestec de peptidă nr. 2077 și un inhibitor al peptidei BACE1 conjugat cu SA au cauzat o scădere semnificativă a Abeta40 în lichidul cefalorahidian (Fig. 4c). Datele arată că peptida nr. 2077 este capabilă să transporte proteina SA de 60 kDa în SNC și, de asemenea, induce efecte farmacologice cu inhibitori SA-conjugați ai peptidei BACE1.
(a) Injecție clonală (2 × 10⁶ fagi/animal) cu fag T7, prezentând profiluri farmacocinetice pe termen lung ale peptidei CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) și ale fagului de control neinjectat (#1779) la cel puțin trei șobolani intubați cu CM. (b) Imagine microscopică confocală a microvaselor corticale reprezentative la șobolanii injectați cu fagi (2 × 10⁶ fagi/animal), prezentând contracolorarea peptidei #2077 și a vaselor (lectină). Aceste clone de fagi au fost administrate la 3 șobolani și lăsate să circule timp de 1 oră înainte de perfuzie. Creierele au fost secționate și colorate cu anticorpi policlonali marcați cu FITC împotriva capsidei fagului T7. Cu zece minute înainte de perfuzie și fixarea ulterioară, s-a administrat intravenos lectină marcată cu DyLight594. Imagini fluorescente care prezintă colorarea cu lectină (roșu) a părții luminale a microvaselor și fagilor (verde) în lumenul capilarelor și țesutul cerebral perivascular. Bara de scală corespunde la 10 µm. (c, d) Peptida inhibitoare BACE1 biotinilată, singură sau în combinație cu peptida de tranzit biotinilată #2077, a fost cuplată cu streptavidină, urmată de injectarea intravenoasă la cel puțin trei șobolani CM canulați (10 mg streptavidină/kg). Reducerea Aβ40 mediată de inhibitorul peptidei BACE1 a fost măsurată prin testul ELISA Aβ1-40 în sânge (roșu) și lichid cefalorahidian (portocaliu) la momentele de timp indicate. Pentru o mai bună claritate, pe grafic este trasată o linie punctată la o scară de 100%. (c) Reducerea procentuală a Aβ40 în sânge (triunghiuri roșii) și lichidul cefalorahidian (triunghiuri portocalii) la șobolanii tratați cu streptavidină conjugată cu peptida de tranzit #2077 și peptida inhibitoare BACE1 într-un raport de 3:1. (d) Reducerea procentuală a Aβ40 din sânge (cercuri roșii) și lichidul cefalorahidian (cercuri portocalii) la șobolanii tratați doar cu streptavidină cuplată cu o peptidă inhibitoare BACE1. Concentrația de Aβ în lotul de control a fost de 420 pg/ml (deviație standard = 101 pg/ml).
Metoda de afișare fagică a fost aplicată cu succes în mai multe domenii ale cercetării biomedicale17. Această metodă a fost utilizată pentru studii in vivo despre diversitate vasculară18,19, precum și pentru studii care vizează vasele cerebrale20,21,22,23,24,25,26. În acest studiu, am extins aplicarea acestei metode de selecție nu numai la identificarea directă a peptidelor care vizează vasele cerebrale, ci și la descoperirea de candidați cu proprietăți de transport activ pentru a traversa bariera hematoencefalică. Acum descriem dezvoltarea unei proceduri de selecție in vivo la șobolani intubați în CM și demonstrăm potențialul acesteia de a identifica peptide cu proprietăți de localizare în LCR. Folosind fagul T7 care afișează o bibliotecă de peptide aleatorii de 12-meri, am putut demonstra că fagul T7 este suficient de mic (aproximativ 60 nm în diametru)10 pentru a fi adaptat la bariera hematoencefalică, traversând astfel direct bariera hematoencefalică sau plexul coroidian. Am observat că recoltarea LCR de la șobolani CM canulați a fost o metodă de screening funcțional in vivo bine controlată și că fagul extras nu numai că s-a legat de vasculatură, dar a funcționat și ca transportor prin bariera hematoencefalică. Mai mult, prin colectarea simultană a sângelui și aplicarea HTS pe LCR și pe fagii derivați din sânge, am confirmat că alegerea noastră de LCR nu a fost influențată de îmbogățirea sângelui sau de capacitatea de expansiune între rundele de selecție. Cu toate acestea, compartimentul sanguin face parte din procedura de selecție, deoarece fagii capabili să ajungă în compartimentul LCR trebuie să supraviețuiască și să circule în fluxul sanguin suficient de mult timp pentru a se îmbogăți în creier. Pentru a extrage informații fiabile despre secvență din datele HTS brute, am implementat filtre adaptate la erorile de secvențiere specifice platformei în fluxul de lucru de analiză. Prin încorporarea parametrilor cinetici în metoda de screening, am confirmat farmacocinetica rapidă a fagilor T7 de tip sălbatic (t½ ~ 28 min) în sânge24, 27, 28 și am determinat, de asemenea, timpul lor de înjumătățire în lichidul cefalorahidian (t½ ~ 26 min) pe minut. În ciuda profilurilor farmacocinetice similare din sânge și LCR, doar 0,001% din concentrația sanguină a fagului a putut fi detectată în LCR, indicând o mobilitate de fond scăzută a fagului T7 de tip sălbatic prin bariera hematoencefalică. Această lucrare subliniază importanța primei runde de selecție atunci când se utilizează strategii de panning in vivo, în special pentru sistemele de fagi care sunt eliminate rapid din circulație, deoarece puține clone sunt capabile să ajungă în compartimentul SNC. Astfel, în prima rundă, reducerea diversității bibliotecii a fost foarte mare, deoarece doar un număr limitat de clone au fost colectate în cele din urmă în acest model LCR foarte strict. Această strategie de panning in vivo a inclus mai multe etape de selecție, cum ar fi acumularea activă în compartimentul LCR, supraviețuirea clonelor în compartimentul sanguin și îndepărtarea rapidă a clonelor de fag T7 din sânge în primele 10 minute (Fig. 1d și Fig. suplimentară 4M). Astfel, după prima rundă, au fost identificate diferite clone de fagi în LCR, deși același grup inițial a fost utilizat pentru animalele individuale. Acest lucru sugerează că mai mulți pași stricti de selecție pentru bibliotecile sursă cu un număr mare de membri au ca rezultat o reducere semnificativă a diversității. Prin urmare, evenimentele aleatorii vor deveni o parte integrantă a procesului inițial de selecție, influențând semnificativ rezultatul. Este probabil ca multe dintre clonele din biblioteca originală să fi avut o tendință de îmbogățire a LCR foarte similară. Cu toate acestea, chiar și în aceleași condiții experimentale, rezultatele selecției pot diferi din cauza numărului mic de clone din fiecare grup inițial.
Motivele îmbogățite în LCR diferă de cele din sânge. Interesant este că am observat prima schimbare către peptide bogate în glicină în sângele animalelor individuale. (Fig. 1g, Figurile suplimentare 4e, 4f). Fagii care conțin peptide cu glicină pot fi mai stabili și mai puțin probabil să fie scoși din circulație. Cu toate acestea, aceste peptide bogate în glicină nu au fost detectate în probele de lichid cefalorahidian, ceea ce sugerează că bibliotecile selectate au trecut prin două etape de selecție diferite: una în sânge și alta lăsată să se acumuleze în lichidul cefalorahidian. Clonele îmbogățite cu LCR rezultate din a patra rundă de selecție au fost testate extensiv. Aproape toate clonele testate individual au fost confirmate ca fiind îmbogățite în LCR în comparație cu fagul de control martor. O peptidă rezultată (#2077) a fost examinată mai detaliat. Aceasta a arătat un timp de înjumătățire plasmatică mai lung în comparație cu alte rezultate (Figura 3d și Figura suplimentară 7) și, interesant, această peptidă conținea un reziduu de cisteină la capătul C-terminal. Recent s-a demonstrat că adăugarea de cisteină la peptide poate îmbunătăți proprietățile farmacocinetice ale acestora prin legarea la albumina 29. Acest lucru este în prezent necunoscut pentru peptida #2077 și necesită studii suplimentare. Unele peptide au prezentat o dependență de valență în îmbogățirea LCR (datele nu sunt prezentate), care poate fi legată de geometria suprafeței afișate a capsidei T7. Sistemul T7 pe care l-am utilizat a arătat 5-15 copii ale fiecărei peptide per particulă de fag. IHC a fost efectuată pe clone candidate de fag principal injectate intravenos în cortexul cerebral al șobolanilor (Fig. suplimentară 8). Datele au arătat că cel puțin trei clone (nr. 2002, nr. 2009 și nr. 2077) au interacționat cu BBB. Rămâne de stabilit dacă această interacțiune BBB are ca rezultat acumularea de LCR sau mișcarea acestor clone direct către BCSFB. Este important de menționat că arătăm că peptidele selectate își păstrează capacitatea de transport a LCR atunci când sunt sintetizate și legate de încărcătura proteică. Legarea peptidelor biotinilate N-terminale la SA repetă, în esență, rezultatele obținute cu clonele lor fagice respective în sânge și lichidul cefalorahidian (Fig. 3e). În cele din urmă, demonstrăm că peptida principală #2077 este capabilă să promoveze acțiunea cerebrală a unui inhibitor peptidic biotinilat al BACE1 conjugat cu SA, provocând efecte farmacodinamice pronunțate în SNC prin reducerea semnificativă a nivelurilor de Abeta40 în LCR (Fig. 4). Nu am putut identifica niciun omologi în baza de date efectuând o căutare de omologie a secvenței peptidice pentru toate rezultatele. Este important de menționat că dimensiunea bibliotecii T7 este de aproximativ 109, în timp ce dimensiunea teoretică a bibliotecii pentru 12-meri este de 4 x 1015. Prin urmare, am selectat doar o mică fracțiune din spațiul de diversitate al bibliotecii de peptide 12-meri, ceea ce poate însemna că pot fi identificate peptide mai optimizate prin evaluarea spațiului de secvență adiacent al acestor rezultate identificate. Ipotetic, unul dintre motivele pentru care nu am găsit omologi naturali ai acestor peptide ar putea fi deselectia în timpul evoluției pentru a preveni intrarea necontrolată a anumitor motive peptidice în creier.
Luate împreună, rezultatele noastre oferă o bază pentru lucrări viitoare pentru identificarea și caracterizarea mai detaliată a sistemelor de transport ale barierei cerebrovasculare in vivo. Configurarea de bază a acestei metode se bazează pe o strategie de selecție funcțională care nu numai că identifică clonele cu proprietăți de legare vasculară cerebrală, dar include și o etapă critică în care clonele de succes au activitate intrinsecă de a traversa barierele biologice in vivo în compartimentul SNC. Scopul este de a elucida mecanismul de transport al acestor peptide și preferința lor pentru legarea la microvasculatura specifică regiunii creierului. Acest lucru poate duce la descoperirea de noi căi pentru transportul BHE și al receptorilor. Ne așteptăm ca peptidele identificate să se poată lega direct de receptorii cerebrovasculari sau de liganzii circulanți transportați prin BHE sau BCSFB. Vectorii peptidici cu activitate de transport în LCR descoperiți în această lucrare vor fi investigați în continuare. În prezent, investigăm specificitatea cerebrală a acestor peptide pentru capacitatea lor de a traversa BHE și/sau BCSFB. Aceste noi peptide vor fi instrumente extrem de valoroase pentru descoperirea potențială de noi receptori sau căi metabolice și pentru dezvoltarea de noi platforme extrem de eficiente pentru livrarea de macromolecule, cum ar fi produsele biologice, către creier.
Canulați cisterna mare (MC) folosind o modificare a metodei descrise anterior. Șobolani Wistar anesteziați (200-350 g) au fost montați pe un aparat stereotaxic și s-a făcut o incizie mediană peste scalpul ras și pregătit aseptic pentru a expune craniul. Se forează două găuri în zona canulei superioare și se fixează șuruburile de fixare în găuri. S-a forat o gaură suplimentară în creasta occipitală laterală pentru ghidarea stereotactică a unei canule din oțel inoxidabil în MC. Se aplică ciment dentar în jurul canulei și se fixează cu șuruburi. După fotopolimerizare și întărire a cimentului, plaga cutanată a fost închisă cu sutură supramid 4/0. Plasarea corectă a canulei este confirmată prin scurgerea spontană de lichid cefalorahidian (LCR). Scoateți șobolanul din aparatul stereotaxic, primiți îngrijiri postoperatorii adecvate și gestionarea durerii și lăsați-l să se recupereze timp de cel puțin o săptămână până când se observă semne de sânge în lichidul cefalorahidian. Șobolanii Wistar (Crl:WI/Han) au fost obținuți din Charles River (Franța). Toți șobolanii au fost ținuți în condiții specifice, fără agenți patogeni. Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Oficiul Veterinar al orașului Basel, Elveția, și au fost efectuate în conformitate cu Licența pentru animale nr. 2474 (Evaluarea transportului cerebral activ prin măsurarea nivelurilor de candidați terapeutici în lichidul cefalorahidian și creierul șobolanului).
Mențineți ușor șobolanul conștient cu canula CM în mână. Scoateți Datura din canulă și colectați 10 µl de lichid cefalorahidian care curge spontan. Deoarece permeabilitatea canulei a fost în cele din urmă compromisă, în acest studiu au fost incluse doar probe limpezi de lichid cefalorahidian, fără dovezi de contaminare sau decolorare cu sânge. În paralel, aproximativ 10-20 μl de sânge au fost prelevate dintr-o mică incizie la vârful cozii în tuburi cu heparină (Sigma-Aldrich). LCR și sânge au fost colectate la diferite momente în timp după injectarea intravenoasă cu fag T7. Aproximativ 5-10 μl de lichid au fost aruncați înainte de colectarea fiecărei probe de LCR, ceea ce corespunde volumului mort al cateterului.
Bibliotecile au fost generate folosind vectorul T7Select 10-3b așa cum este descris în manualul sistemului T7Select (Novagen, Rosenberg și colab., InNovations 6, 1-6, 1996). Pe scurt, un insert de ADN aleatoriu de 12 meruri a fost sintetizat în următorul format:
Codonul NNK a fost utilizat pentru a evita codonii stop dubli și supraexprimarea aminoacizilor în insert. N este un raport echimolar amestecat manual pentru fiecare nucleotidă, iar K este un raport echimolar amestecat manual pentru nucleotidele de adenină și citozină. Regiunile monocatenare au fost convertite în ADN bicatenar prin incubare ulterioară cu dNTP (Novagen) și enzima Klenow (New England Biolabs) în tampon Klenow (New England Biolabs) timp de 3 ore la 37°C. După reacție, ADN-ul bicatenar a fost recuperat prin precipitare cu EtOH. ADN-ul rezultat a fost digerat cu enzimele de restricție EcoRI și HindIII (ambele de la Roche). Insertul scindat și purificat (QIAquick, Qiagen) (ligaza T4, New England Biolabs) a fost apoi ligat în cadru într-un vector T7 pre-scindat după aminoacidul 348 al genei capsidei 10B. Reacțiile de ligare au fost incubate la 16°C timp de 18 ore înainte de ambalare in vitro. Ambalarea fagilor in vitro a fost efectuată conform instrucțiunilor furnizate împreună cu kitul de clonare T7Select 10-3b (Novagen), iar soluția de ambalare a fost amplificată o dată până la liză folosind Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lizatele au fost centrifugate, titrate și congelate la -80°C ca soluție stoc de glicerol.
Amplificare PCR directă a regiunilor variabile ale fagilor amplificate în bulion sau placă utilizând primeri de fuziune 454/Roche-amplicon brevetați. Primerul de fuziune directă conține secvențe care flanchează regiunea variabilă (NNK) 12 (specifică șablonului), adaptorul GS FLX Titanium A și o secvență cheie de bibliotecă cu patru baze (TCAG) (Figura suplimentară 1a):
Primerul de fuziune inversă conține, de asemenea, biotină atașată la perlele de captare și adaptorul GS FLX Titanium B necesar pentru amplificarea clonală în timpul PCR-ului în emulsie:
Ampliconii au fost apoi supuși pirosecvențierii 454/Roche conform protocolului 454 GS-FLX Titanium. Pentru secvențierea manuală Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ADN-ul fagului T7 a fost amplificat prin PCR și secvențiat cu următoarele perechi de primeri:
Inserturile din plăcile individuale au fost supuse amplificării PCR utilizând kitul Roche Fast Start DNA Polymerase (conform instrucțiunilor producătorului). Se efectuează o pornire la cald (10 min la 95 °C) și 35 de cicluri de boost (50 s la 95 °C, 1 min la 50 °C și 1 min la 72 °C).
Fagii din biblioteci, fagii de tip sălbatic, fagii recuperați din LCR și sânge sau clonele individuale au fost amplificați în Escherichia coli BL5615 în bulion TB (Sigma Aldrich) sau în vase de 500 cm2 (Thermo Scientific) timp de 4 ore la 37°C. Fagii au fost extrași de pe plăci prin clătirea plăcilor cu tampon Tris-EDTA (Fluka Analytical) sau prin colectarea plăcilor cu vârfuri sterile de pipetă. Fagii au fost izolați din supernatantul culturii sau din tamponul de extracție cu o rundă de precipitare cu polietilen glicol (PEG 8000) (Promega) și resuspendați în tampon Tris-EDTA.
Fagul amplificat a fost supus la 2-3 runde de îndepărtare a endotoxinelor folosind sfere de îndepărtare a endotoxinelor (Miltenyi Biotec) înainte de injectarea intravenoasă (IV) (500 μl/animal). În prima rundă, au fost introduși 2×1012 fagi; în a doua, 2×1010 fagi; în a treia și a patra rundă de selecție, 2×109 fagi per animal. Conținutul de fagi din probele de LCR și sânge colectate la momentele de timp indicate a fost determinat prin numărarea plăcilor, conform instrucțiunilor producătorului (manualul sistemului T7Select). Selecția fagilor a fost efectuată prin injectarea intravenoasă a bibliotecilor purificate în vena cozii sau prin reinjectarea fagilor extrași din LCR din runda de selecție anterioară, iar recoltările ulterioare au fost efectuate la 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min și, respectiv, 240 min pentru probele de LCR și sânge. Au fost efectuate un total de patru runde de panning in vivo, în care cele două ramificații selectate au fost stocate separat și analizate în timpul primelor trei runde de selecție. Toate inserturile de fagi extrase din LCR din primele două runde de selecție au fost supuse pirosecvențierii 454/Roche, în timp ce toate clonele extrase din LCR din ultimele două runde de selecție au fost secvențiate manual. Toți fagii din sânge din prima rundă de selecție au fost, de asemenea, supuși pirosecvențierii 454/Roche. Pentru injectarea clonelor de fagi, fagii selectați au fost amplificați în E. coli (BL5615) pe plăci de 500 cm2 la 37°C timp de 4 ore. Clonele selectate individual și secvențiate manual au fost propagate în mediu TB. După extracția fagilor, purificare și îndepărtarea endotoxinei (așa cum s-a descris mai sus), 2×1010 fagi/animal în 300 μl au fost injectați intravenos într-o venă caudală.
Preprocesarea și filtrarea calitativă a datelor secvențiale. Datele brute 454/Roche au fost convertite dintr-un format binar standard de hartă a fluxului (sff) într-un format Pearson lizibil de către om (fasta) utilizând software-ul furnizorului. Prelucrarea ulterioară a secvenței de nucleotide a fost efectuată utilizând programe și scripturi C proprietare (pachet software nelansat), așa cum este descris mai jos. Analiza datelor primare include proceduri stricte de filtrare în mai multe etape. Pentru a filtra citirile care nu conțineau o secvență validă de ADN cu insert de 12 meruri, citirile au fost aliniate secvențial la eticheta de început (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), eticheta de oprire (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) și insertul de fundal (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) utilizând testul global Needleman-Wunsch. Alinierea permițând până la 2 inconsistențe per aliniere31. Prin urmare, citirile fără etichete de început și oprire și citirile care conțin inserturi de fundal, adică alinieri care depășesc numărul permis de nepotriviri, au fost eliminate din bibliotecă. În ceea ce privește citirile rămase, secvența de ADN N-mer care se extinde de la marcajul de început și se termină înainte de marcajul de oprire a fost excizată din secvența originală de citire și procesată ulterior (denumită în continuare „inserție”). După traducerea insertului, porțiunea de după primul codon stop de la capătul 5′ al primerului este îndepărtată din insert. În plus, au fost îndepărtate și nucleotidele care duc la codoni incompleți la capătul 3′ al primerului. Pentru a exclude inserturile care conțin doar secvențe de fundal, au fost îndepărtate și inserturile traduse care încep cu modelul de aminoacizi „PAG”. Peptidele cu o lungime post-translațională mai mică de 3 aminoacizi au fost eliminate din bibliotecă. În cele din urmă, s-a eliminat redundanța din setul de inserturi și s-a determinat frecvența fiecărui insert unic. Rezultatele acestei analize au inclus o listă de secvențe de nucleotide (inserții) și frecvențele lor (de citire) (Figurile suplimentare 1c și 2).
Gruparea inserțiilor de ADN N-mer după similaritatea secvenței: Pentru a elimina erorile de secvențiere specifice 454/Roche (cum ar fi problemele cu secvențierea extensiilor homopolimerice) și a elimina redundanțele mai puțin importante, inserțiile (inserțiile) secvenței de ADN N-mer filtrate anterior sunt sortate după similaritate. Inserțiile sunt sortate mai întâi după frecvența lor (de la cea mai mare la cea mai mică), iar dacă sunt identice, după sortarea lor secundară după lungime (de la cea mai lungă la cea mai scurtă). Astfel, cele mai frecvente și mai lungi inserții definesc primul „grup”. Frecvența grupului este setată la frecvența cheie. Apoi, s-a încercat adăugarea fiecărei inserții rămase în lista sortată la grup prin aliniere Needleman-Wunsch în perechi. Dacă numărul de nepotriviri, inserții sau deleții dintr-o aliniere nu depășește un prag de 2, se adaugă o inserție la grup, iar frecvența generală a grupului este crescută cu frecvența cu care a fost adăugată inserția. Inserțiile adăugate la un grup sunt marcate ca utilizate și excluse de la procesarea ulterioară. Dacă secvența de inserție nu poate fi adăugată la un grup deja existent, secvența de inserție este utilizată pentru a crea un grup nou cu frecvența de inserție corespunzătoare și marcată ca utilizată. Iterația se încheie atunci când fiecare secvență de inserție a fost fie utilizată pentru a forma un grup nou, fie poate fi inclusă într-un grup deja existent. La urma urmei, inserțiile grupate constând din nucleotide sunt în cele din urmă traduse în secvențe peptidice (biblioteci de peptide). Rezultatul acestei analize este un set de inserții și frecvențele lor corespunzătoare care alcătuiesc numărul de citiri consecutive (Figura suplimentară 2).
Generarea de motive: Pe baza unei liste de peptide unice, a fost creată o bibliotecă care conține toate modelele posibile de aminoacizi (aa), așa cum se arată mai jos. Fiecare model posibil de lungime 3 a fost extras din peptidă, iar modelul său invers a fost adăugat împreună cu o bibliotecă comună de motive care conține toate modelele (tripeptidele). Bibliotecile de motive extrem de repetitive au fost secvențiate, iar redundanța a fost eliminată. Apoi, pentru fiecare tripeptidă din biblioteca de motive, am verificat prezența acesteia în bibliotecă folosind instrumente de calcul. În acest caz, frecvența peptidei care conține tripeptida motiv găsită este adăugată și atribuită motivului din biblioteca de motive („numărul de motive”). Rezultatul generării de motive este o matrice bidimensională care conține toate aparițiile tripeptidelor (motive) și valorile lor respective, care reprezintă numărul de citiri de secvențiere care au ca rezultat motivul corespunzător atunci când citirile sunt filtrate, grupate și traduse. Metricile sunt descrise în detaliu mai sus.
Normalizarea numărului de motive și a diagramelor de dispersie corespunzătoare: Numărul de motive pentru fiecare probă a fost normalizat folosind
unde ni este numărul de citiri care conțin subiectul i. Astfel, vi reprezintă frecvența procentuală a citirilor (sau peptidelor) care conțin motivul i în eșantion. Valorile P pentru numărul nenormalizat de motive au fost calculate folosind testul exact Fisher. În ceea ce privește corelogramele numărului de motive, corelațiile Spearman au fost calculate folosind numărul normalizat de motive cu R.
Pentru a vizualiza conținutul de aminoacizi la fiecare poziție din biblioteca de peptide, au fost create logogramele web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Mai întâi, conținutul de aminoacizi la fiecare poziție a peptidei 12-meri este stocat într-o matrice de 20×12. Apoi, un set de 1000 de peptide care conțin același conținut relativ de aminoacizi la fiecare poziție este generat în format fasta-sequence și furnizat ca intrare către web-logo 3, care generează o reprezentare grafică a conținutului relativ de aminoacizi la fiecare poziție pentru o anumită bibliotecă de peptide. Pentru a vizualiza seturi de date multidimensionale, au fost create hărți termice folosind un instrument dezvoltat intern în R (biosHeatmap, un pachet R care urmează să fie lansat). Dendrogramele prezentate în hărțile termice au fost calculate folosind metoda de clustering ierarhic Ward cu metrica distanței euclidiene. Pentru analiza statistică a datelor de scorare a motivelor, valorile P pentru scorarea nenormalizată au fost calculate folosind testul exact Fisher. Valorile P pentru alte seturi de date au fost calculate în R folosind testul t Student sau ANOVA.
Clonele de fagi selectați și fagii fără inserturi au fost injectați intravenos prin vena cozii (2×1010 fagi/animal în 300 μl PBS). Cu zece minute înainte de perfuzie și fixare ulterioară, aceleași animale au fost injectate intravenos cu 100 μl de lectină marcată cu DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). La 60 de minute după injectarea cu fagi, șobolanii au fost perfuzați prin inimă cu 50 ml PBS, urmat de 50 ml PFA/PBS 4%. Probele de creier au fost fixate suplimentar peste noapte în PFA/PBS 4% și înmuiate în zaharoză 30% peste noapte la 4°C. Probele sunt congelate rapid în amestecul OCT. Analiza imunohistochimică a probelor congelate a fost efectuată la temperatura camerei pe criosecțiuni de 30 µm blocate cu 1% BSA și incubate cu anticorpi policlonali marcați cu FITC împotriva fagului T7 (Novus NB 600-376A) la 4 °C. Se incubează peste noapte. În final, secțiunile au fost spălate de 3 ori cu PBS și examinate cu un microscop laser confocal (Leica TCS SP5).
Toate peptidele cu o puritate minimă de 98% au fost sintetizate de GenScript USA, biotinilate și liofilizate. Biotina este legată printr-un distanțier triplu de glicină suplimentar la capătul N-terminal. Verificați toate peptidele folosind spectrometria de masă.
Streptavidina (Sigma S0677) a fost amestecată cu un exces echimolar de 5 ori de peptidă biotinilată, peptidă inhibitoare BACE1 biotinilată sau o combinație (raport 3:1) de peptidă inhibitoare BACE1 biotinilată și peptidă inhibitoare BACE1 în 5-10% DMSO/incubată în PBS. 1 oră la temperatura camerei înainte de injectare. Peptidele conjugate cu streptavidină au fost injectate intravenos la o doză de 10 mg/kg într-una din venele cozii șobolanilor cu cavitate cerebrală.
Concentrația complexelor streptavidină-peptidă a fost evaluată prin ELISA. Plăcile de microtitrare Nunc Maxisorp (Sigma) au fost acoperite peste noapte la 4°C cu 1,5 μg/ml anticorp de șoarece anti-streptavidină (Thermo, MA1-20011). După blocare (tampon de blocare: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatină, 1% BSA) la temperatura camerei timp de 2 ore, placa s-a spălat cu 0,05% Tween-20/PBS (tampon de spălare) timp de 3 secunde. Probele de LCR și plasmă au fost adăugate în godeuri diluate cu tampon de blocare (plasmă 1:10.000, LCR 1:115). Placa a fost apoi incubată peste noapte la 4°C cu anticorp de detecție (1 μg/ml, anti-streptavidină-HRP, Novus NB120-7239). După trei etape de spălare, streptavidina a fost detectată prin incubare în soluție de substrat TMB (Roche) timp de până la 20 de minute. După oprirea dezvoltării culorii cu H2SO4 1M, se măsoară absorbanța la 450 nm.
Funcția complexului streptavidină-peptidă-inhibitor BACE1 a fost evaluată prin testul ELISA Aβ(1-40) conform protocolului producătorului (Wako, 294-64701). Pe scurt, probele de LCR au fost diluate în diluant standard (1:23) și incubate peste noapte la 4°C în plăci cu 96 de godeuri acoperite cu anticorp de captură BNT77. După cinci etape de spălare, s-a adăugat anticorp BA27 conjugat cu HRP și s-a incubat timp de 2 ore la 4°C, urmat de cinci etape de spălare. Aβ(1-40) a fost detectat prin incubare în soluție TMB timp de 30 de minute la temperatura camerei. După ce dezvoltarea culorii a fost oprită cu soluție de oprire, se măsoară absorbanța la 450 nm. Probele de plasmă au fost supuse extracției în fază solidă înainte de testul ELISA Aβ(1-40). Plasma a fost adăugată la DEA 0,2% (Sigma) în plăci cu 96 de godeuri și incubată la temperatura camerei timp de 30 de minute. După spălarea succesivă a plăcilor SPE (Oasis, 186000679) cu apă și metanol 100%, probele de plasmă au fost adăugate pe plăcile SPE și tot lichidul a fost îndepărtat. Probele au fost spălate (mai întâi cu metanol 5%, apoi cu metanol 30%) și eluate cu NH4OH 2%/metanol 90%. După uscarea eluatului la 55°C timp de 99 de minute la curent constant de N2, probele au fost reduse în diluenți standard și Aβ(1–40) a fost măsurat așa cum s-a descris mai sus.
Cum se citează acest articol: Urich, E. și colab. Transportul de marfă către creier folosind peptide de tranzit identificate in vivo. The Science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB și Moos T. Administrarea de medicamente macromoleculare la nivelul creierului prin terapie țintită. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. și Martinez-Martinez, P. Administrarea medicamentelor peptidice și proteice prin bariera hematoencefalică. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Bariera hematoencefalică: un blocaj în dezvoltarea medicamentelor pentru creier. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG și Byrd, A. Perspective pentru îmbunătățirea administrării medicamentelor și direcționării acestora către creier prin intermediul căii plexului coroidian-LCR. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizarea produselor biofarmaceutice cu cai troieni moleculari pentru livrarea în creier. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, Transportul peptidic mediat de receptorul WM prin bariera hematoencefalică. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. și colab. Creșterea penetrării cerebrale și a eficacității anticorpilor terapeutici utilizând navete moleculare monovalente. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. și colab. Transportul receptorului de transferină (TfR) determină absorbția cerebrală a variantelor de afinitate ale anticorpilor TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).