Hvala što ste posjetili Nature.com.Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).Osim toga, kako bismo osigurali stalnu podršku, web stranicu prikazujemo bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje vrtuljak od tri slajda odjednom.Koristite gumbe Prethodno i Sljedeće za pomicanje kroz tri slajda istovremeno ili koristite gumbe klizača na kraju za kretanje kroz tri slajda odjednom.
Krvno-moždana barijera i krvno-moždana barijera sprječavaju bioterapijske tvari da dođu do svojih ciljeva u središnjem živčanom sustavu, čime se otežava učinkovito liječenje neuroloških bolesti.Kako bismo otkrili nove moždane transportere in vivo, uveli smo biblioteku peptida faga T7 i serijski skupljali krv i cerebrospinalnu tekućinu (CSF) korištenjem kaniliranog modela velikog bazena štakora u svijesti.Specifični klonovi faga bili su visoko obogaćeni CSF-om nakon četiri kruga selekcije.Testiranje pojedinačnih peptida kandidata otkrilo je više od 1000 puta obogaćenje CSF-a.Bioaktivnost peptidno posredovane dostave u mozak potvrđena je 40%-tnim smanjenjem razine amiloida-β u cerebrospinalnoj tekućini pomoću BACE1 peptidnog inhibitora povezanog s identificiranim novim tranzitnim peptidom.Ovi rezultati sugeriraju da peptidi identificirani in vivo metodama selekcije faga mogu biti korisna sredstva za sustavnu dostavu makromolekula u mozak s terapeutskim učinkom.
Istraživanja ciljane terapije središnjeg živčanog sustava (SŽS) uglavnom su usmjerena na identifikaciju optimiziranih lijekova i agenasa koji pokazuju svojstva ciljanja na središnji živčani sustav, s manje truda na otkrivanju mehanizama koji pokreću aktivnu dostavu lijeka u mozak.To se sada počinje mijenjati jer je isporuka lijekova, posebno velikih molekula, sastavni dio modernog neuroznanstvenog razvoja lijekova.Okolina središnjeg živčanog sustava dobro je zaštićena sustavom cerebrovaskularne barijere, koji se sastoji od krvno-moždane barijere (BBB) ​​​​i krvno-moždane barijere (BCBB)1, zbog čega je dostava lijekova u mozak izazovna1,2.Procjenjuje se da se gotovo svi lijekovi velikih molekula i više od 98% lijekova malih molekula eliminiraju iz mozga3.Zbog toga je vrlo važno identificirati nove moždane transportne sustave koji omogućuju učinkovitu i specifičnu dostavu terapeutskih lijekova u CNS 4,5.Međutim, BBB i BCSFB također predstavljaju izvrsnu priliku za dostavu lijeka jer prodiru i ulaze u sve strukture mozga kroz njegovu opsežnu vaskulaturu.Stoga se trenutačni napori da se koriste neinvazivne metode dostave u mozak uglavnom temelje na mehanizmu prijenosa posredovanog receptorima (PMT) pomoću endogenog receptora BBB6.Unatoč nedavnom ključnom napretku u korištenju puta transferinskog receptora7,8, potreban je daljnji razvoj novih sustava za isporuku s poboljšanim svojstvima.U tu svrhu, naš je cilj bio identificirati peptide koji mogu posredovati u transportu CSF-a, budući da bi se oni u načelu mogli koristiti za isporuku makromolekula u CNS ili za otvaranje novih receptorskih putova.Konkretno, specifični receptori i transporteri cerebrovaskularnog sustava (BBB i BSCFB) mogu poslužiti kao potencijalne mete za aktivnu i specifičnu dostavu bioterapijskih lijekova.Cerebrospinalna tekućina (CSF) je sekretorni produkt koroidnog pleksusa (CS) iu izravnom je kontaktu s intersticijskom tekućinom mozga kroz subarahnoidalni prostor i ventrikularni prostor4.Nedavno je pokazano da subarahnoidna cerebrospinalna tekućina pretjerano difundira u intersticij mozga9.Nadamo se da ćemo pristupiti parenhimskom prostoru koristeći ovaj subarahnoidalni ulazni trakt ili izravno kroz BBB.Da bismo to postigli, implementirali smo robusnu in vivo strategiju selekcije faga koja idealno identificira peptide koji se prenose bilo kojim od ova dva različita puta.
Sada opisujemo sekvencijalnu in vivo metodu skrininga prikaza faga s uzorkovanjem CSF-a zajedno sa sekvenciranjem visoke propusnosti (HTS) za praćenje početnih krugova selekcije s najvećom raznolikošću biblioteke.Probir je proveden na štakorima pri svijesti s trajno ugrađenom kanilom velike cisterne (CM) kako bi se izbjegla kontaminacija krvi.Važno je da ovaj pristup odabire i ciljanje mozga i peptide s transportnom aktivnošću preko cerebrovaskularne barijere.Koristili smo T7 fage zbog njihove male veličine (~60 nm)10 i sugerirali da su prikladni za transport vezikula koje omogućuju transcelularni prijelaz endotelne i/ili epitelno-medulne barijere.Nakon četiri runde istraživanja, populacije faga su izolirane pokazujući snažno in vivo obogaćenje CSF-a i povezanost cerebralnih mikrožila.Što je još važnije, uspjeli smo potvrditi naša otkrića pokazujući da preferirani i kemijski sintetizirani najbolji peptidi kandidati mogu transportirati proteinski teret u cerebrospinalnu tekućinu.Prvo su utvrđeni farmakodinamički učinci CNS-a kombinacijom vodećeg tranzitnog peptida s inhibitorom BACE1 peptida.Uz pokazivanje da in vivo funkcionalne strategije probira mogu identificirati nove moždane transportne peptide kao učinkovite prijenosnike proteinskog tereta, očekujemo da će slični pristupi funkcionalne selekcije također postati važni u identificiranju novih moždanih transportnih putova.
Na temelju jedinica za stvaranje plakova (PFU), nakon koraka pakiranja faga, dizajnirana je i stvorena biblioteka nasumičnih 12-mernih linearnih T7 fagnih peptida s raznolikošću od približno 109 (vidi Materijali i metode).Važno je napomenuti da smo pažljivo analizirali ovu biblioteku prije in vivo pomicanja.PCR amplifikacija uzoraka biblioteke faga korištenjem modificiranih početnica generirala je amlikone koji su bili izravno primjenjivi na HTS (dodatna slika 1a).Zbog a) pogrešaka u sekvenciranju HTS11, b) utjecaja na kvalitetu početnica (NNK) 1-12, i c) prisutnosti faga divljeg tipa (wt) (kosturnih umetaka) u biblioteci u stanju pripravnosti, implementiran je postupak filtriranja sekvence kako bi se izdvojile samo provjerene informacije o sekvenci (dodatna slika 1b).Ovi koraci filtra primjenjuju se na sve biblioteke HTS sekvenciranja.Za standardnu ​​biblioteku dobiveno je ukupno 233 868 očitanja, od kojih je 39% prošlo kriterije filtra i korišteno je za analizu biblioteke i odabir za sljedeće runde (dodatna slika 1c–e).Očitavanja su bila pretežno višestruka od 3 para baza u duljini s vrhom na 36 nukleotida (dopunska slika 1c), potvrđujući dizajn knjižnice (NNK) 1-12.Značajno, približno 11% članova biblioteke sadržavalo je 12-dimenzionalni divlji tip (wt) okosnice PAGISRELVDKL umetka, a gotovo polovica sekvenci (49%) sadržavala je umetanja ili brisanja.HTS knjižnične knjižnice potvrdio je veliku raznolikost peptida u knjižnici: više od 81% peptidnih sekvenci pronađeno je samo jednom, a samo 1,5% pojavilo se u ≥4 kopije (dodatna slika 2a).Frekvencije aminokiselina (aa) na svih 12 pozicija u repertoaru dobro su korelirale s očekivanim frekvencijama za broj kodona generiranih degeneriranim NKK repertoarom (dodatna slika 2b).Opažena učestalost aa ostataka kodiranih ovim umetcima dobro je korelirala s izračunatom učestalošću (r = 0,893) (dodatna slika 2c).Priprema fagnih biblioteka za injekciju uključuje korake pojačanja i uklanjanja endotoksina.Prethodno se pokazalo da to potencijalno smanjuje raznolikost biblioteka faga12,13.Stoga smo sekvencirali biblioteku faga pojačanu na ploči koja je prošla uklanjanje endotoksina i usporedili je s izvornom bibliotekom kako bismo procijenili učestalost AA.Uočena je snažna korelacija (r = 0,995) između izvornog skupa i amplificiranog i pročišćenog skupa (dodatna slika 2d), što ukazuje da kompeticija između klonova umnoženih na pločama pomoću faga T7 nije uzrokovala veliku pristranost.Ova se usporedba temelji na učestalosti tripeptidnih motiva u svakoj biblioteci, budući da se raznolikost biblioteka (~109) ne može u potpunosti obuhvatiti čak ni HTS-om.Analiza učestalosti aa na svakom položaju otkrila je malu pristranost ovisnu o položaju u zadnja tri položaja unesenog repertoara (dodatna slika 2e).Zaključno, zaključili smo da su kvaliteta i raznolikost biblioteke prihvatljivi i da su primijećene samo manje promjene u raznolikosti zbog amplifikacije i pripreme biblioteka faga između nekoliko krugova selekcije.
Serijsko uzorkovanje cerebrospinalne tekućine može se izvesti kirurškim implantiranjem kanile u CM svjesnih štakora kako bi se olakšala identifikacija T7 faga ubrizganog intravenozno (iv) putem BBB i/ili BCSFB (Slika 1a-b).Koristili smo dva neovisna kraka selekcije (krake A i B) u prva tri kruga in vivo selekcije (slika 1c).Postupno smo povećavali strogost selekcije smanjivanjem ukupne količine faga uvedenog u prva tri kruga selekcije.Za četvrti krug istraživanja kombinirali smo uzorke iz grana A i B i izvršili tri dodatna neovisna odabira.Za proučavanje in vivo svojstava čestica T7 faga u ovom modelu, divlji tip faga (PAGISRELVDKL glavni umetak) ubrizgan je štakorima preko repne vene.Oporavak faga iz cerebrospinalne tekućine i krvi u različitim vremenskim točkama pokazao je da su relativno mali T7 ikosaedarski fagi imali brzu početnu fazu čišćenja iz krvnog odjeljka (dodatna slika 3).Na temelju primijenjenih titara i volumena krvi štakora, izračunali smo da samo približno 1% tež.fag iz primijenjene doze otkriven je u krvi 10 minuta nakon intravenske injekcije.Nakon ovog početnog brzog pada, izmjeren je sporiji primarni klirens s poluvijekom od 27,7 minuta.Važno je da je samo vrlo malo faga izvučeno iz odjeljka CSF-a, što ukazuje na nisku pozadinu za migraciju faga divljeg tipa u odjeljak CSF-a (dodatna slika 3).U prosjeku, samo oko 1 x 10-3% titara T7 faga u krvi i 4 x 10-8% inicijalno infundiranih faga otkriveno je u cerebrospinalnoj tekućini tijekom cijelog perioda uzorkovanja (0-250 min).Značajno je da je poluvrijeme života (25,7 min) divljeg tipa faga u cerebrospinalnoj tekućini bilo slično onom opaženom u krvi.Ovi podaci pokazuju da je barijera koja odvaja odjeljak CSF-a od krvi netaknuta kod štakora s CM kanilom, što omogućuje in vivo selekciju biblioteka faga za identifikaciju klonova koji se lako prenose iz krvi u odjeljak CSF-a.
(a) Postavljanje metode za ponovno uzorkovanje cerebrospinalne tekućine (likvora) iz velikog bazena.(b) Dijagram koji prikazuje staničnu lokaciju barijere središnjeg živčanog sustava (CNS) i strategiju odabira koja se koristi za identifikaciju peptida koji prolaze krvno-moždanu barijeru (BBB) ​​​​i krvno-moždanu barijeru.(c) In vivo dijagram toka prikaza faga.U svakom krugu selekcije, fagi (identifikatori životinja unutar strelica) ubrizgani su intravenozno.Dvije neovisne alternativne grane (A, B) drže se odvojeno do 4. kruga selekcije.Za runde selekcije 3 i 4, svaki klon faga ekstrahiran iz CSF-a je ručno sekvenciran.(d) Kinetika faga izoliranog iz krvi (crveni kružići) i cerebrospinalne tekućine (zeleni trokuti) tijekom prvog kruga selekcije u dva štakora s kanilom nakon intravenske injekcije biblioteke peptida T7 (2 x 1012 faga/životinji).Plavi kvadratići označavaju prosječnu početnu koncentraciju faga u krvi, izračunatu iz količine ubrizganog faga, uzimajući u obzir ukupni volumen krvi.Crni kvadratići označavaju točku sjecišta y linije ekstrapolirane iz koncentracija faga u krvi.(e,f) Predstavite relativnu učestalost i distribuciju svih mogućih preklapajućih tripeptidnih motiva pronađenih u peptidu.Prikazan je broj pronađenih motiva u 1000 čitanja.Crvenim točkama označeni su značajno (p < 0,001) obogaćeni motivi.(e) Korelacijski dijagram raspršenosti koji uspoređuje relativnu učestalost tripeptidnog motiva ubrizgane biblioteke s fagom dobivenim iz krvi životinja #1.1 i #1.2.(f) Korelacijski dijagram raspršenosti koji uspoređuje relativne učestalosti tripeptidnih motiva životinjskog faga #1.1 i #1.2 izoliranih u krvi i cerebrospinalnoj tekućini.(g, h) Prikaz ID-a sekvence faga obogaćenog krvlju (g) ​​naspram ubrizganih biblioteka i faga obogaćenog CSF-om (h) naspram krvi nakon runde in vivo selekcije u obje životinje.Veličina koda od jednog slova pokazuje koliko se često ta aminokiselina pojavljuje na tom mjestu.Zeleno = polarne, ljubičaste = neutralne, plave = bazične, crvene = kisele i crne = hidrofobne aminokiseline.Sliku 1a, b dizajnirao je i izradio Eduard Urich.
Ubrizgali smo biblioteku peptida faga u dva štakora CM instrumenta (klade A i B) i izolirali fag iz cerebrospinalne tekućine i krvi (Slika 1d).Početno brzo uklanjanje biblioteke bilo je manje izraženo u usporedbi s divljim tipom faga.Prosječni poluživot ubrizgane biblioteke u obje životinje bio je 24,8 minuta u krvi, slično divljem tipu faga, i 38,5 minuta u likvoru.Uzorci faga krvi i cerebrospinalne tekućine svake životinje podvrgnuti su HTS-u i svi identificirani peptidi analizirani su na prisutnost kratkog tripeptidnog motiva.Tripeptidni motivi odabrani su jer daju minimalnu osnovu za formiranje strukture i interakcije peptid-protein14,15.Pronašli smo dobru korelaciju u distribuciji motiva između ubrizgane biblioteke faga i klonova ekstrahiranih iz krvi obiju životinja (slika 1e).Podaci pokazuju da je sastav biblioteke samo marginalno obogaćen u odjeljku krvi.Učestalosti aminokiselina i konsenzusne sekvence dalje su analizirane na svakoj poziciji korištenjem prilagodbe softvera Weblogo16.Zanimljivo je da smo pronašli snažno obogaćivanje ostataka glicina u krvi (slika 1g).Kada je krv uspoređena s klonovima odabranim iz CSF-a, primijećena je jaka selekcija i neka deselekcija motiva (Slika 1f), a određene aminokiseline bile su prvenstveno prisutne na unaprijed određenim položajima u 12-članom (Slika 1h).Značajno je da su se pojedinačne životinje značajno razlikovale u cerebrospinalnoj tekućini, dok je obogaćivanje krvi glicinom primijećeno u obje životinje (dodatna slika 4a-j).Nakon strogog filtriranja podataka o sekvencama u cerebrospinalnoj tekućini životinja #1.1 i #1.2, dobiveno je ukupno 964 i 420 jedinstvenih 12-mernih peptida (dodatna slika 1d–e).Izolirani klonovi faga su amplificirani i podvrgnuti drugom krugu in vivo selekcije.Fagi ekstrahirani iz drugog kruga selekcije podvrgnuti su HTS-u u svakoj životinji i svi identificirani peptidi korišteni su kao input u program prepoznavanja motiva za analizu pojave tripeptidnih motiva (Slika 2a, b, ef).U usporedbi s prvim ciklusom faga oporavljenog iz CSF-a, promatrali smo daljnju selekciju i deselekciju mnogih motiva u CSF-u u granama A i B (slika 2).Primijenjen je algoritam mrežne identifikacije kako bi se utvrdilo predstavljaju li različite obrasce dosljednog slijeda.Uočena je jasna sličnost između 12-dimenzionalnih sekvenci otkrivenih CSF-om u alternativnom klasu A (Slika 2c, d) i klasu B (Slika 2g, h).Skupna analiza u svakoj grani otkrila je različite selekcijske profile za 12-merne peptide (dodatna slika 5c,d) i povećanje omjera titra CSF/krv tijekom vremena za objedinjene klonove nakon druge runde selekcije u usporedbi s prvom rundom selekcije (dopunska slika 5e).).
Obogaćivanje motiva i peptida u cerebrospinalnoj tekućini pomoću dva uzastopna kruga in vivo selekcije funkcionalnog prikaza faga.
Svi fagi cerebrospinalne tekućine izdvojeni iz prve runde svake životinje (životinje #1.1 i #1.2) skupljeni su, pojačani, HT-sekvencirani i ponovno injektirani zajedno (2 x 1010 faga/životinji) 2 štakora s kanilom SM (#1.1 → #).2.1 i 2.2, 1.2 → 2.3 i 2.4).(a,b,e,f) Korelacijski dijagrami raspršenosti koji uspoređuju relativnu učestalost tripeptidnih motiva svih faga izvedenih iz CSF-a u prvom i drugom krugu selekcije.Relativna učestalost i distribucija motiva koji predstavljaju sve moguće preklapajuće tripeptide koji se nalaze u peptidima u obje orijentacije.Prikazan je broj pronađenih motiva u 1000 čitanja.Motivi koji su značajno (p <0,001) odabrani ili isključeni u jednoj od uspoređivanih biblioteka označeni su crvenim točkama.(c, d, g, h) Prikaz logotipa sekvence svih sekvenci dugih 12 aminokiselina bogatih CSF-om na temelju krugova 2 i 1 in vivo selekcije.Veličina koda od jednog slova pokazuje koliko se često ta aminokiselina pojavljuje na tom mjestu.Za predstavljanje loga, uspoređuje se učestalost likvorskih sekvenci ekstrahiranih iz pojedinačnih životinja između dva kruga selekcije i prikazane su obogaćene sekvence u drugom krugu: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 i (h) #1.2–#2.4.Najviše obogaćenih aminokiselina na danom položaju kod (c, d) životinja br.2.1 i br.2.2 ili (g, h) kod životinja br.2.3 i br.2.4 prikazani su u boji.Zeleno = polarne, ljubičaste = neutralne, plave = bazične, crvene = kisele i crne = hidrofobne aminokiseline.
Nakon treće runde selekcije, identificirali smo 124 jedinstvene peptidne sekvence (#3.1 i #3.2) iz 332 klona faga rekonstituiranih u CSF-u izoliranih iz dvije životinje (dodatna slika 6a).Sekvenca LGSVS (18,7%) imala je najveći relativni udio, a zatim slijede umetci divljeg tipa PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) i SARGSWREIVSLS (2,2%).U posljednjem četvrtom krugu spojili smo dvije neovisno odabrane grane iz tri odvojene životinje (slika 1c).Od 925 sekvenciranih klonova faga izdvojenih iz CSF-a, u četvrtom krugu pronašli smo 64 jedinstvene peptidne sekvence (dopunska slika 6b), među kojima je relativni udio divljeg tipa faga pao na 0,8%.Najčešći klonovi likvora u četvrtom krugu bili su LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) i RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Raspon duljina odabranih peptida je zbog umetanja/brisanja nukleotida ili preuranjenih zaustavnih kodona u početnicama biblioteke kada se koriste degenerirani kodoni za dizajn NNK biblioteke.Prijevremeni stop kodoni stvaraju kraće peptide i odabrani su jer sadrže povoljan aa motiv.Dulji peptidi mogu biti rezultat umetanja/delecija u početnicama sintetskih biblioteka.Ovo postavlja dizajnirani zaustavni kodon izvan okvira i čita ga dok se novi zaustavni kodon ne pojavi nizvodno.Općenito, izračunali smo faktore obogaćivanja za sva četiri kruga odabira uspoređujući ulazne podatke s izlaznim podacima uzorka.Za prvu rundu probira koristili smo titre divljeg tipa faga kao nespecifičnu pozadinsku referencu.Zanimljivo je da je negativna selekcija faga bila vrlo jaka u prvom ciklusu CSF-a, ali ne i u krvi (Slika 3a), što može biti posljedica niske vjerojatnosti pasivne difuzije većine članova biblioteke peptida u odjeljak CSF-a ili se odnosni fagi teže učinkovitije zadržati ili ukloniti iz krvotoka od bakteriofaga.Međutim, u drugom krugu istraživanja, primijećena je jaka selekcija faga u CSF-u u oba klada, što sugerira da je prethodni krug bio obogaćen fagima koji pokazuju peptide koji potiču unos CSF-a (Slika 3a).Opet, bez značajnog obogaćivanja krvi.Također u trećem i četvrtom krugu, klonovi faga su značajno obogaćeni CSF-om.Uspoređujući relativnu učestalost svake jedinstvene peptidne sekvence između zadnja dva kruga selekcije, otkrili smo da su sekvencije još više obogaćene u četvrtom krugu selekcije (slika 3b).Ukupno 931 tripeptidni motiv ekstrahiran je iz sva 64 jedinstvena peptidna slijeda korištenjem obje peptidne orijentacije.Najviše obogaćeni motivi u četvrtom krugu pomnije su ispitani za njihove profile obogaćivanja u svim krugovima u usporedbi s ubrizganom bibliotekom (granična vrijednost: 10% obogaćenja) (dopunska slika 6c).Opći uzorci selekcije pokazali su da je većina proučavanih motiva obogaćena u svim prethodnim ciklusima obiju selekcijskih grana.Međutim, neki motivi (npr. SGL, VSG, LGS GSV) bili su pretežno iz alternativne klade A, dok su drugi (npr. FGW, RTN, WGF, NTR) bili obogaćeni alternativnom klasom B.
Validacija CSF transporta peptida prikazanih fagom obogaćenih CSF-om i biotiniliranih vodećih peptida konjugiranih na streptavidin.
(a) Omjeri obogaćivanja izračunati u sva četiri kruga (R1-R4) na temelju ubrizganih (unos = I) titara faga (PFU) i utvrđenih titara faga CSF (izlaz = O).Faktori obogaćivanja za posljednja tri kruga (R2-R4) izračunati su usporedbom s prethodnim krugom i prvim krugom (R1) s podacima o težini.Otvorene trake predstavljaju cerebrospinalnu tekućinu, osjenčane trake su plazma.(***p<0,001, temeljeno na Studentovom t-testu).(b) Popis najzastupljenijih fagnih peptida, rangiranih prema njihovom relativnom udjelu u odnosu na sve fage sakupljene u CSF-u nakon 4. kruga selekcije.Šest najčešćih klonova faga istaknuto je bojom, označeno brojevima i njihovim faktorima obogaćivanja između 3. i 4. kruga selekcije (umetci).(c,d) Šest najobogaćenijih fagnih klonova, prazne fagne i roditeljske fagne peptidne biblioteke iz kruga 4 analizirani su pojedinačno u modelu uzorkovanja CSF-a.CSF i uzorci krvi prikupljeni su u naznačenim vremenskim točkama.(c) Jednake količine 6 kandidata za klonove faga (2 x 1010 faga/životinja), praznih faga (#1779) (2 x 1010 faga/životinja) i knjižnica peptida osnovnog faga (2 x 1012 faga/životinja) Ubrizgajte najmanje 3 CM odvojeno putem repne vene.Prikazana je farmakokinetika CSF-a svakog ubrizganog klona faga i biblioteke peptida faga tijekom vremena.(d) pokazuje prosječni omjer CSF/krv za sve oporavljene fage/mL tijekom vremena uzorkovanja.(e) Četiri sintetička vodeća peptida i jedan kodirani kontrolni bili su povezani s biotinom na streptavidin preko njihovog N-kraja (prikaz tetramera) nakon čega je uslijedila injekcija (repna vena iv, 10 mg streptavidina/kg).Najmanje tri intubirana štakora (N = 3).).Uzorci likvora su prikupljeni u naznačenim vremenskim točkama i koncentracije streptavidina su izmjerene pomoću ELISA testa protiv streptavidina u likvoru (nd = nije detektirano).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, na temelju ANOVA testa).(f) Usporedba aminokiselinske sekvence najobogaćenijeg fagnog peptidnog klona #2002 (ljubičasto) s drugim odabranim fagnim peptidnim klonovima iz 4. kruga selekcije.Identični i slični fragmenti aminokiselina označeni su bojama.
Od svih obogaćenih faga u četvrtom krugu (Slika 3b), šest kandidatskih klonova je odabrano za daljnju individualnu analizu u modelu uzorkovanja CSF-a.Jednake količine šest kandidatskih faga, praznih faga (bez umetka) i biblioteka peptida profaga ubrizgane su u tri CM životinje s kanilom, a farmakokinetika je određena u CSF (Slika 3c) i krvi (Dodatna slika 7).Svi testirani klonovi faga ciljali su odjeljak CSF na razini 10-1000 puta višoj od razine praznog kontrolnog faga (#1779).Na primjer, klonovi #2020 i #2077 imali su oko 1000 puta veće titre CSF-a od kontrolnog faga.Farmakokinetički profil svakog odabranog peptida je različit, ali svi oni imaju visoku sposobnost samonavođenja u CSF.Promatrali smo stalno smanjenje tijekom vremena za klonove #1903 i #2011, dok za klonove #2077, #2002 i #2009 povećanje tijekom prvih 10 minuta može ukazivati ​​na aktivan transport, ali to treba potvrditi.Klonovi #2020, #2002 i #2077 stabilizirali su se na visokim razinama, dok je koncentracija CSF klona #2009 polako opadala nakon početnog povećanja.Zatim smo usporedili relativnu učestalost svakog kandidata za likvor s njegovom koncentracijom u krvi (slika 3d).Korelacija srednjeg titra svakog kandidata za likvor s njegovim titrom u krvi u svim vremenima uzorkovanja pokazala je da su tri od šest kandidata značajno obogaćena likvorom u krvi.Zanimljivo je da je klon #2077 pokazao veću stabilnost krvi (dodatna slika 7).Kako bismo potvrdili da su sami peptidi sposobni aktivno prenositi teret osim čestica faga u odjeljak likvora, sintetizirali smo četiri vodeća peptida derivatizirana biotinom na N-kraju gdje se peptidi vežu za česticu faga.Biotinilirani peptidi (br. 2002, 2009, 2020 i 2077) konjugirani su sa streptavidinom (SA) kako bi se dobili multimerni oblici koji donekle oponašaju geometriju faga.Ovaj nam je format također omogućio mjerenje izloženosti SA u krvi i cerebrospinalnoj tekućini kao proteinskim peptidima koji prenose teret.Važno je da se podaci o fagu često mogu reproducirati kada su sintetski peptidi primijenjeni u ovom SA-konjugiranom formatu (slika 3e).Kodirani peptidi imali su manju početnu izloženost i brže čišćenje CSF-a s nemjerljivim razinama unutar 48 sati.Kako bismo stekli uvid u puteve dostave ovih klonova peptidnih faga u prostor CSF-a, analizirali smo lokalizaciju pojedinačnih pogodaka peptida faga pomoću imunohistokemije (IHC) za izravno otkrivanje čestica faga 1 sat nakon intravenske injekcije in vivo.Značajno, klonovi #2002, #2077 i #2009 mogli su se otkriti jakim bojenjem u kapilarama mozga, dok kontrolni fag (#1779) i klon #2020 nisu otkriveni (dodatna slika 8).To sugerira da ovi peptidi doprinose učinku na mozak upravo prelazeći BBB.Potrebna je daljnja detaljna analiza kako bi se testirala ova hipoteza, budući da BSCFB put također može biti uključen.Pri usporedbi aminokiselinske sekvence najbogatijeg klona (#2002) s drugim odabranim peptidima, primijećeno je da neki od njih imaju slične aminokiselinske ekstenzije, što može ukazivati ​​na sličan transportni mehanizam (slika 3f).
Zbog svog jedinstvenog profila u plazmi i značajnog porasta CSF-a tijekom vremena, klon s prikazom faga #2077 dodatno je istražen tijekom duljeg razdoblja od 48 sati i uspio je reproducirati brzi porast CSF-a uočen u vezi s održanim razinama SA (Slika 4a).Što se tiče drugih identificiranih klonova faga, #2077 je snažno obojen na moždane kapilare i pokazao je značajnu kolokalizaciju s lektinom markera kapilara kada se gleda u višoj rezoluciji i moguće malo bojenja u parenhimskom prostoru (Slika 4b).Kako bismo istražili mogu li se postići farmakološki učinci posredovani peptidima u CNS-u, izveli smo eksperiment u kojem su biotinilirane verzije i) #2077 tranzitnog peptida i ii) peptida inhibitora BACE1 pomiješane sa SA u dva različita omjera.Za jednu kombinaciju koristili smo samo inhibitor peptida BACE1, a za drugu smo koristili omjer 1:3 inhibitora peptida BACE1 prema peptidu #2077.Oba su uzorka primijenjena intravenozno i ​​tijekom vremena mjerene su razine beta-amiloidnog peptida 40 (Abeta40) u krvi i cerebrospinalnoj tekućini.Abeta40 je izmjeren u likvoru jer odražava inhibiciju BACE1 u moždanom parenhimu.Kao što se očekivalo, oba su kompleksa značajno smanjila razine Abeta40 u krvi (Slika 4c, d).Međutim, samo uzorci koji sadrže mješavinu peptida br.2077 i inhibitor peptida BACE1 konjugiranog sa SA uzrokovali su značajno smanjenje Abeta40 u cerebrospinalnoj tekućini (slika 4c).Podaci pokazuju da je peptid br.2077 može prenijeti 60 kDa SA protein u CNS i također izaziva farmakološke učinke sa SA-konjugiranim inhibitorima peptida BACE1.
(a) Klonalna injekcija (2 × 10 faga/životinji) faga T7 koja pokazuje dugoročne farmakokinetičke profile CSF peptida #2077 (RLSSVDSDLSGC) i neinjektiranog kontrolnog faga (#1779) u najmanje tri štakora intubirana CM-om.(b) Konfokalna mikroskopska slika reprezentativnih kortikalnih mikrožila u štakora kojima je ubrizgan fag (2 × 10 10 faga/životinji) koja pokazuje suprotno bojenje peptida #2077 i žila (lektin).Ovi klonovi faga dani su 3 štakora i ostavljeni su da cirkuliraju 1 sat prije perfuzije.Mozgovi su presječeni i obojeni poliklonalnim FITC-obilježenim antitijelima protiv kapside T7 faga.Deset minuta prije perfuzije i naknadne fiksacije, lektin obilježen DyLight594 primijenjen je intravenski.Fluorescentne slike koje pokazuju obojenje lektinom (crveno) luminalne strane mikrožila i faga (zeleno) u lumenu kapilara i perivaskularnom moždanom tkivu.Traka mjerila odgovara 10 µm.(c, d) Biotinilirani BACE1 inhibicijski peptid sam ili u kombinaciji s biotiniliranim tranzitnim peptidom #2077 povezan je sa streptavidinom nakon čega je uslijedila intravenozna injekcija najmanje tri kanilirana CM štakora (10 mg streptavidina/kg).Smanjenje Aβ40 posredovano inhibitorom peptida BACE1 mjereno je Aβ1-40 ELISA testom u krvi (crveno) i cerebrospinalnoj tekućini (narančasto) u naznačenim vremenskim točkama.Radi bolje preglednosti, na grafikonu je nacrtana isprekidana linija u mjerilu od 100%.(c) Postotno smanjenje Aβ40 u krvi (crveni trokuti) i cerebrospinalnoj tekućini (narančasti trokuti) u štakora liječenih streptavidinom konjugiranim na tranzitni peptid #2077 i BACE1 inhibitorni peptid u omjeru 3:1.(d) Postotak smanjenja Aβ40 u krvi (crveni kružići) i cerebrospinalne tekućine (narančasti kružići) štakora liječenih samo streptavidinom spojenim na BACE1 inhibitorni peptid.Koncentracija Ap u kontroli bila je 420 pg/ml (standardna devijacija = 101 pg/ml).
Prikaz faga uspješno se primjenjuje u nekoliko područja biomedicinskih istraživanja17.Ova je metoda korištena za in vivo studije vaskularne raznolikosti18,19 kao i studije usmjerene na cerebralne žile20,21,22,23,24,25,26.U ovoj smo studiji proširili primjenu ove selekcijske metode ne samo na izravnu identifikaciju peptida koji ciljaju cerebralne žile, već i na otkrivanje kandidata s aktivnim transportnim svojstvima za prelazak krvno-moždane barijere.Sada opisujemo razvoj postupka selekcije in vivo kod štakora intubiranih u CM i demonstriramo njegov potencijal za identifikaciju peptida sa svojstvima navođenja u CSF.Koristeći T7 fag koji prikazuje biblioteku 12-mernih nasumičnih peptida, uspjeli smo pokazati da je T7 fag dovoljno malen (približno 60 nm u promjeru)10 da se prilagodi krvno-moždanoj barijeri, čime izravno prelazi krvno-moždanu barijeru ili horoidni pleksus.Primijetili smo da je prikupljanje CSF-a iz kaniliranih CM štakora bila dobro kontrolirana in vivo funkcionalna metoda probira, te da se ekstrahirani fag ne samo vezao za vaskulaturu, već je također funkcionirao kao prijenosnik kroz krvno-moždanu barijeru.Nadalje, istodobnim prikupljanjem krvi i primjenom HTS-a na likvor i fage izvedene iz krvi, potvrdili smo da na naš izbor likvora nije utjecalo obogaćivanje krvi ili sposobnost za širenje između krugova odabira.Međutim, krvni odjeljak je dio postupka odabira, budući da fagi koji mogu doći do odjeljka CSF moraju preživjeti i cirkulirati u krvotoku dovoljno dugo da se obogate u mozgu.Kako bismo izdvojili pouzdane informacije o sekvenci iz sirovih HTS podataka, implementirali smo filtre prilagođene pogreškama sekvenciranja specifičnim za platformu u tijeku rada analize.Uključivanjem kinetičkih parametara u metodu probira, potvrdili smo brzu farmakokinetiku divljeg tipa T7 faga (t½ ~ 28 min) u krvi24, 27, 28 i također odredili njihov poluživot u cerebrospinalnoj tekućini (t½ ~ 26 min) po minuti).Unatoč sličnim farmakokinetičkim profilima u krvi i likvoru, samo 0,001% koncentracije faga u krvi može se detektirati u likvoru, što ukazuje na nisku pokretljivost divljeg tipa faga T7 kroz krvno-moždanu barijeru.Ovaj rad naglašava važnost prvog kruga selekcije pri korištenju in vivo strategija panninga, posebno za sustave faga koji se brzo uklanjaju iz cirkulacije, budući da mali broj klonova može doći do odjeljka CNS-a.Stoga je u prvom krugu smanjenje raznolikosti knjižnice bilo vrlo veliko, jer je samo ograničen broj klonova na kraju prikupljen u ovom vrlo strogom CSF modelu.Ova in vivo strategija panninga uključivala je nekoliko koraka selekcije kao što je aktivno nakupljanje u odjeljku CSF-a, preživljavanje klonova u odjeljku krvi i brzo uklanjanje klonova faga T7 iz krvi unutar prvih 10 minuta (Slika 1d i Dodatna slika 4M).).Dakle, nakon prve runde, različiti klonovi faga su identificirani u CSF-u, iako je isti početni skup korišten za pojedinačne životinje.Ovo sugerira da višestruki strogi odabir koraka za izvorne knjižnice s velikim brojem članova knjižnice rezultira značajnim smanjenjem raznolikosti.Stoga će nasumični događaji postati sastavni dio početnog procesa odabira, uvelike utječući na rezultat.Vjerojatno je da su mnogi klonovi u izvornoj biblioteci imali vrlo sličnu sklonost obogaćivanju CSF-a.Međutim, čak i pod istim eksperimentalnim uvjetima, rezultati selekcije mogu se razlikovati zbog malog broja svakog pojedinog klona u početnom skupu.
Motivi obogaćeni likvorom razlikuju se od onih u krvi.Zanimljivo je da smo primijetili prvi pomak prema peptidima bogatim glicinom u krvi pojedinačnih životinja.(Slika 1g, dopunske slike 4e, 4f).Peptidi glicina koji sadrže fage mogu biti stabilniji i manje je vjerojatno da će biti izbačeni iz cirkulacije.Međutim, ti peptidi bogati glicinom nisu otkriveni u uzorcima cerebrospinalne tekućine, što sugerira da su odabrane biblioteke prošle kroz dva različita koraka odabira: jedan u krvi i drugi da se akumulira u cerebrospinalnoj tekućini.Klonovi obogaćeni CSF-om koji su rezultat četvrtog kruga selekcije opsežno su testirani.Potvrđeno je da su gotovo svi pojedinačno testirani klonovi obogaćeni CSF-om u usporedbi s fagom slijepe kontrole.Jedan pogodak peptida (#2077) je detaljnije ispitan.Pokazao je duži poluživot u plazmi u usporedbi s drugim pogocima (slika 3d i dopunska slika 7), a zanimljivo je da je ovaj peptid sadržavao cisteinski ostatak na C-kraju.Nedavno je pokazano da dodavanje cisteina peptidima može poboljšati njihova farmakokinetička svojstva vezanjem na albumin 29 .Ovo je trenutno nepoznato za peptid #2077 i zahtijeva daljnje istraživanje.Neki peptidi pokazali su ovisnost o valenciji u obogaćivanju likvora (podaci nisu prikazani), što može biti povezano s prikazanom geometrijom površine kapside T7.Sustav T7 koji smo koristili pokazao je 5-15 kopija svakog peptida po čestici faga.IHC je provedena na kandidatskim klonovima vodećih faga koji su intravenozno ubrizgani u cerebralni korteks štakora (dodatna slika 8).Podaci su pokazali da su najmanje tri klona (br. 2002, br. 2009 i br. 2077) bila u interakciji s BBB.Ostaje za utvrditi rezultira li ova interakcija BBB nakupljanjem CSF-a ili kretanjem ovih klonova izravno u BCSFB.Ono što je važno, pokazujemo da odabrani peptidi zadržavaju svoj transportni kapacitet CSF-a kada se sintetiziraju i vežu za proteinski teret.Vezanje N-terminalnih biotiniliranih peptida na SA u biti ponavlja rezultate dobivene s njihovim odgovarajućim fagnim klonovima u krvi i cerebrospinalnoj tekućini (slika 3e).Konačno, pokazujemo da vodeći peptid #2077 može potaknuti moždano djelovanje biotiniliranog peptidnog inhibitora BACE1 konjugiranog na SA, uzrokujući izražene farmakodinamičke učinke u CNS-u značajnim smanjenjem razine Abeta40 u CSF-u (Slika 4).Nismo uspjeli identificirati nijedan homolog u bazi podataka izvođenjem pretrage homologije peptidne sekvence svih pogodaka.Važno je napomenuti da je veličina biblioteke T7 približno 109, dok je teorijska veličina biblioteke za 12-mere 4 x 1015. Stoga smo odabrali samo mali dio prostora raznolikosti biblioteke 12-mernih peptida, što može značiti da se optimiziraniji peptidi mogu identificirati procjenom susjednog prostora sekvenci ovih identificiranih pogodaka.Hipotetski, jedan od razloga zašto nismo pronašli nikakve prirodne homologe ovih peptida može biti deselekcija tijekom evolucije kako bi se spriječio nekontrolirani ulazak određenih peptidnih motiva u mozak.
Uzeti zajedno, naši rezultati pružaju osnovu za budući rad na detaljnijoj identifikaciji i karakterizaciji transportnih sustava cerebrovaskularne barijere in vivo.Osnovna postavka ove metode temelji se na funkcionalnoj selekcijskoj strategiji koja ne samo da identificira klonove sa svojstvima cerebralnog vaskularnog vezanja, već također uključuje kritični korak u kojem uspješni klonovi imaju intrinzičnu aktivnost da prijeđu biološke barijere in vivo u odjeljak CNS-a.je razjasniti mehanizam transporta ovih peptida i njihovu sklonost vezanju na mikrovaskulaturu specifičnu za regiju mozga.To može dovesti do otkrića novih puteva za transport BBB i receptora.Očekujemo da se identificirani peptidi mogu izravno vezati na cerebrovaskularne receptore ili na cirkulirajuće ligande transportirane kroz BBB ili BCSFB.Peptidni vektori s transportnom aktivnošću likvora otkriveni u ovom radu bit će dalje istraženi.Trenutno istražujemo moždanu specifičnost ovih peptida za njihovu sposobnost prolaska kroz BBB i/ili BCSFB.Ovi novi peptidi bit će iznimno vrijedni alati za potencijalno otkrivanje novih receptora ili putova i za razvoj novih visoko učinkovitih platformi za isporuku makromolekula, poput bioloških lijekova, u mozak.
Kanulirajte veliku cisternu (CM) modifikacijom prethodno opisane metode.Anestezirani Wistar štakori (200-350 g) postavljeni su na stereotaksički aparat i napravljen je srednji rez preko obrijanog i aseptički pripremljenog vlasišta da se otkrije lubanja.Izbušite dvije rupe u području gornjeg krila i pričvrstite vijke za pričvršćivanje u rupe.Dodatna rupa je izbušena u bočnom okcipitalnom grebenu za stereotaktičko vođenje kanile od nehrđajućeg čelika u CM.Nanesite zubni cement oko kanile i pričvrstite vijcima.Nakon fotostvrdnjavanja i stvrdnjavanja cementa, kožna rana je zatvorena supramidnim šavom 4/0.Pravilno postavljanje kanile potvrđuje se spontanim istjecanjem cerebrospinalne tekućine (likvora).Uklonite štakora iz stereotaksijskog aparata, primite odgovarajuću postoperativnu njegu i liječenje boli i ostavite ga da se oporavi najmanje tjedan dana dok se u cerebrospinalnoj tekućini ne uoče znakovi krvi.Wistar štakori (Crl:WI/Han) dobiveni su iz Charles Rivera (Francuska).Svi štakori držani su u specifičnim uvjetima bez patogena.Sve pokuse na životinjama odobrio je Veterinarski ured grada Basela u Švicarskoj, a izvedeni su u skladu s dozvolom za životinje br. 2474 (Procjena aktivnog transporta mozga mjerenjem razina terapeutskih kandidata u cerebrospinalnoj tekućini i mozgu štakora).
Nježno održavajte štakora pri svijesti s CM kanilom u ruci.Izvadite Daturu iz kanile i sakupite 10 µl cerebrospinalne tekućine koja spontano teče.Budući da je prohodnost kanile u konačnici bila ugrožena, u ovu studiju uključeni su samo uzorci bistre cerebrospinalne tekućine bez dokaza kontaminacije krvi ili promjene boje.Paralelno je iz malog reza na vrhu repa uzeto približno 10-20 μl krvi u epruvete s heparinom (Sigma-Aldrich).CSF i krv su prikupljeni u različitim vremenskim točkama nakon intravenske injekcije T7 faga.Otprilike 5-10 μl tekućine odbačeno je prije svakog uzorka likvora, što odgovara mrtvom volumenu katetera.
Biblioteke su generirane korištenjem vektora T7Select 10-3b kao što je opisano u priručniku sustava T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Ukratko, nasumični 12-merni DNA umetak sintetiziran je u sljedećem formatu:
NNK kodon je korišten da se izbjegnu dvostruki stop kodoni i prekomjerna ekspresija aminokiselina u umetku.N je ručno miješani ekvimolarni omjer svakog nukleotida, a K je ručno miješani ekvimolarni omjer adenin i citozin nukleotida.Jednolančane regije pretvorene su u dvolančanu DNA daljnjom inkubacijom s dNTP (Novagen) i Klenow enzimom (New England Biolabs) u Klenow puferu (New England Biolabs) tijekom 3 sata na 37°C.Nakon reakcije, dvolančana DNA je obnovljena taloženjem EtOH.Dobivena DNA je digestirana restrikcijskim enzimima EcoRI i HindIII (oba od Rochea).Odcijepljeni i pročišćeni (QIAquick, Qiagen) umetak (T4 ligaza, New England Biolabs) zatim je povezan u okviru u prethodno odcijepljeni T7 vektor nakon aminokiseline 348 10B kapsidnog gena.Reakcije vezivanja su inkubirane na 16°C 18 sati prije in vitro pakiranja.Pakiranje faga in vitro provedeno je prema uputama isporučenim s kompletom za kloniranje T7Select 10-3b (Novagen), a otopina za pakiranje jednom je amplificirana do lize pomoću Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lizati su centrifugirani, titrirani i zamrznuti na -80°C kao osnovna otopina glicerola.
Izravno PCR umnažanje varijabilnih regija faga umnoženih u bujonu ili na ploči upotrebom zaštićenih 454/Roche-amplicon fuzionih početnica.Prednji fuzijski primer sadrži sekvence koje okružuju varijabilnu regiju (NNK) 12 (specifičnu za predložak), GS FLX Titanium Adapter A i ključnu sekvencu knjižnice s četiri baze (TCAG) (dodatna slika 1a):
Primer reverzne fuzije također sadrži biotin vezan za zrnca za hvatanje i GS FLX Titanium Adapter B potreban za klonsko pojačanje tijekom emulzijske PCR:
Amplikoni su zatim podvrgnuti 454/Roche pirosekvenciranju prema 454 GS-FLX Titanium protokolu.Za ručno Sangerovo sekvenciranje (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNK T7 faga umnožena je PCR-om i sekvencionirana sa sljedećim parovima primera:
Umetci iz pojedinačnih plakova podvrgnuti su PCR amplifikaciji pomoću Roche Fast Start DNA Polymerase Kita (prema uputama proizvođača).Izvedite vrući start (10 min na 95 °C) i 35 ciklusa pojačanja (50 s na 95 °C, 1 min na 50 °C i 1 min na 72 °C).
Fag iz biblioteka, divlji tip faga, fag spašen iz CSF-a i krvi ili pojedinačni klonovi umnoženi su u Escherichia coli BL5615 u TB bujonu (Sigma Aldrich) ili u posudama od 500 cm2 (Thermo Scientific) tijekom 4 sata na 37°C.Fagi su ekstrahirani s ploča ispiranjem ploča s Tris-EDTA puferom (Fluka Analytical) ili skupljanjem ploča sterilnim vrhovima pipeta.Fagi su izolirani iz supernatanta kulture ili ekstrakcijskog pufera s jednom rundom taloženja polietilen glikolom (PEG 8000) (Promega) i resuspendirani u Tris-EDTA puferu.
Umnoženi fag podvrgnut je 2-3 kruga uklanjanja endotoksina pomoću kuglica za uklanjanje endotoksina (Miltenyi Biotec) prije intravenske (IV) injekcije (500 µl/životinji).U prvom krugu uvedeno je 2×1012 faga;u drugom 2×1010 faga;u trećem i četvrtom krugu selekcije, 2×109 faga po životinji.Sadržaj faga u likvoru i uzorcima krvi prikupljenim u navedenim vremenskim točkama određen je brojanjem plakova prema uputama proizvođača (priručnik sustava T7Select).Selekcija faga provedena je intravenskom injekcijom pročišćenih biblioteka u repnu venu ili ponovnim ubrizgavanjem faga ekstrahiranog iz CSF-a iz prethodnog kruga selekcije, a naknadna žetva obavljena je nakon 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min i 240 min respektivno CSF ​​i uzoraka krvi.Provedena su ukupno četiri ciklusa in vivo istraživanja u kojima su dvije odabrane grane odvojeno pohranjene i analizirane tijekom prva tri kruga odabira.Svi umetci faga ekstrahirani iz CSF-a iz prva dva kruga selekcije podvrgnuti su 454/Roche pirosekvenciranju, dok su svi klonovi ekstrahirani iz CSF-a iz zadnja dva kruga selekcije ručno sekvencionirani.Svi krvni fagi iz prvog kruga selekcije također su podvrgnuti 454/Roche pirosekvenciranju.Za injekciju klonova faga, odabrani fagi su amplificirani u E. coli (BL5615) na pločama od 500 cm2 na 37°C tijekom 4 sata.Pojedinačno odabrani i ručno sekvencirani klonovi razmnoženi su u TB mediju.Nakon ekstrakcije faga, pročišćavanja i uklanjanja endotoksina (kao što je gore opisano), 2 × 1010 faga/životinji u 300 μl ubrizgano je intravenozno u jednu repnu venu.
Predobrada i kvalitativno filtriranje sekvenci podataka.Neobrađeni 454/Roche podaci pretvoreni su iz binarnog standardnog formata mape toka (sff) u Pearsonov format čitljiv ljudima (fasta) pomoću softvera dobavljača.Daljnja obrada nukleotidnog slijeda provedena je korištenjem vlasničkih C programa i skripti (neobjavljeni programski paket) kako je opisano u nastavku.Analiza primarnih podataka uključuje stroge višestupanjske postupke filtriranja.Kako bi se filtrirala očitanja koja nisu sadržavala važeći 12-merni umetak sekvence DNK, očitanja su bila sekvencijalno poravnata na početnu oznaku (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), završnu oznaku (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) i pozadinski umetak (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) korištenjem globalnog Needleman-Wunsch testa.poravnanje koje dopušta do 2 nedosljednosti po poravnanju31.Stoga su iz biblioteke uklonjena čitanja bez oznaka za početak i zaustavljanje i čitanja koja sadrže pozadinske umetke, tj. poravnanja koja premašuju dopušteni broj nepodudaranja.Što se tiče preostalih čitanja, N-mer DNA sekvenca koja se proteže od početne oznake i završava prije stop oznake izrezana je iz izvorne očitane sekvence i dalje obrađena (u daljnjem tekstu "umetnuti").Nakon translacije umetka, dio nakon prvog zaustavnog kodona na 5' kraju početnice uklanja se iz umetka.Dodatno, uklonjeni su i nukleotidi koji vode do nepotpunih kodona na 3' kraju početnice.Kako bi se isključili umetci koji sadrže samo pozadinske sekvence, prevedeni umetci koji počinju s uzorkom aminokiselina "PAG" također su uklonjeni.Peptidi s post-translacijskom duljinom manjom od 3 aminokiseline uklonjeni su iz biblioteke.Konačno, uklonite redundanciju u skupu umetanja i odredite učestalost svakog jedinstvenog umetanja.Rezultati ove analize uključivali su popis nukleotidnih sekvenci (umetaka) i njihove (čitane) frekvencije (dopunske slike 1c i 2).
Grupirajte N-mer DNK umetke prema sličnosti sekvenci: Kako bi se eliminirale 454/Roche-specifične pogreške sekvenciranja (kao što su problemi sa sekvenciranjem homopolimernih ekstenzija) i uklonile manje važne redundancije, prethodno filtrirani N-mer DNK umetci sekvenci (umetci) sortirani su prema sličnosti.umetanja (dopuštene su do 2 baze koje se ne podudaraju) korištenjem iterativnog algoritma definiranog na sljedeći način: umetanja se prvo razvrstavaju prema njihovoj učestalosti (od najveće do najniže), a ako su ista, prema sekundarnom razvrstavanju prema duljini (od najduljeg prema najkraćem)).Dakle, najčešća i najduža umetanja definiraju prvu “skupinu”.Grupna frekvencija postavljena je na ključnu frekvenciju.Zatim se svaki umetak koji je ostao na sortiranom popisu pokušao dodati u grupu Needleman-Wunsch poravnanjem u paru.Ako broj nepodudaranja, umetanja ili brisanja u poravnanju ne premašuje prag od 2, umetanje se dodaje grupi, a ukupna učestalost grupe povećava se koliko je često umetanje dodavano.Umeci dodani u grupu označavaju se kao korišteni i isključuju iz daljnje obrade.Ako se sekvenca umetanja ne može dodati već postojećoj grupi, sekvenca umetanja koristi se za stvaranje nove grupe s odgovarajućom učestalošću umetanja i označava se kao iskorištena.Iteracija završava kada je svaki niz umetanja iskorišten za formiranje nove grupe ili se može uključiti u već postojeću grupu.Uostalom, grupirani umeci koji se sastoje od nukleotida na kraju se prevode u peptidne sekvence (biblioteke peptida).Rezultat ove analize je skup umetanja i njihovih odgovarajućih frekvencija koje čine broj uzastopnih čitanja (dodatna slika 2).
Stvaranje motiva: Na temelju popisa jedinstvenih peptida stvorena je biblioteka koja sadrži sve moguće obrasce aminokiselina (aa) kao što je prikazano u nastavku.Svaki mogući uzorak duljine 3 ekstrahiran je iz peptida i njegov inverzni uzorak je dodan zajedno sa zajedničkom bibliotekom motiva koja sadrži sve uzorke (tripeptide).Biblioteke vrlo ponavljajućih motiva su sekvencionirane i redundantnost je uklonjena.Zatim smo za svaki tripeptid u biblioteci motiva provjerili njegovu prisutnost u biblioteci pomoću računalnih alata.U ovom slučaju, frekvencija peptida koji sadrži tripeptid pronađenog motiva dodaje se i dodjeljuje motivu u biblioteci motiva ("broj motiva").Rezultat generiranja motiva je dvodimenzionalni niz koji sadrži sva pojavljivanja tripeptida (motiva) i njihove odgovarajuće vrijednosti, koje su broj čitanja sekvenciranja koja rezultiraju odgovarajućim motivom kada se očitanja filtriraju, grupiraju i prevode.Mjerni podaci kako je gore detaljno opisano.
Normalizacija broja motiva i odgovarajućih dijagrama raspršenosti: Broj motiva za svaki uzorak normaliziran je pomoću
gdje je ni broj čitanja koja sadrže temu i.Dakle, vi predstavlja postotnu učestalost čitanja (ili peptida) koji sadrže motiv i u uzorku.P-vrijednosti za nenormalizirani broj motiva izračunate su pomoću Fisherova egzaktnog testa.Što se tiče korelograma broja motiva, Spearmanove korelacije izračunate su pomoću normaliziranog broja motiva s R.
Kako bi se vizualizirao sadržaj aminokiselina na svakoj poziciji u biblioteci peptida, stvoreni su web logogrami 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Prvo, sadržaj aminokiselina na svakom položaju 12-mernog peptida pohranjuje se u 20×12 matricu.Zatim se skup od 1000 peptida koji sadrže isti relativni sadržaj aminokiselina na svakom položaju generira u formatu brze sekvence i daje kao ulaz za web-logo 3, koji generira grafički prikaz relativnog sadržaja aminokiselina na svakom položaju.za danu biblioteku peptida.Za vizualizaciju višedimenzionalnih skupova podataka stvorene su toplinske karte pomoću interno razvijenog alata u R-u (biosHeatmap, R paket koji tek treba biti objavljen).Dendrogrami prikazani u toplinskim kartama izračunati su pomoću Wardove metode hijerarhijskog klasteriranja s metrikom Euklidske udaljenosti.Za statističku analizu podataka o bodovanju motiva, P vrijednosti za nenormalizirano ocjenjivanje izračunate su korištenjem Fisherova egzaktnog testa.P-vrijednosti za druge skupove podataka izračunate su u R koristeći Studentov t-test ili ANOVA.
Odabrani klonovi faga i fagi bez umetaka ubrizgani su intravenski putem repne vene (2×1010 faga/životinji u 300 μl PBS).Deset minuta prije perfuzije i naknadne fiksacije, istim je životinjama intravenozno ubrizgano 100 μl DyLight594-označenog lektina (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minuta nakon injekcije faga, štakori su perfundirani kroz srce s 50 ml PBS-a nakon čega slijedi 50 ml 4% PFA/PBS.Uzorci mozga su dodatno fiksirani preko noći u 4% PFA/PBS i namočeni u 30% saharoze preko noći na 4°C.Uzorci se brzo zamrznu u OCT smjesi.Imunohistokemijska analiza zamrznutih uzoraka provedena je na sobnoj temperaturi na kriosekcijama od 30 µm blokiranim s 1% BSA i inkubiranim s poliklonskim FITC-obilježenim protutijelima protiv T7 faga (Novus NB 600-376A) na 4 °C.Inkubirajte preko noći.Na kraju, rezovi su isprani 3 puta s PBS-om i ispitani konfokalnim laserskim mikroskopom (Leica TCS SP5).
Svi peptidi s minimalnom čistoćom od 98% sintetizirani su pomoću GenScript USA, biotinilirani i liofilizirani.Biotin je vezan preko dodatnog trostrukog glicinskog razmaknice na N-kraju.Provjerite sve peptide spektrometrijom mase.
Streptavidin (Sigma S0677) pomiješan je s 5-strukim ekvimolarnim viškom biotiniliranog peptida, biotiniliranog BACE1 inhibitornog peptida ili kombinacije (omjer 3:1) biotiniliranog BACE1 inhibitornog peptida i BACE1 inhibitornog peptida u 5-10% DMSO/inkubiranog u PBS.1 sat na sobnoj temperaturi prije injekcije.Streptavidin-konjugirani peptidi ubrizgani su intravenski u dozi od 10 mg/kg u jednu od repnih vena štakora s cerebralnom šupljinom.
Koncentracija kompleksa streptavidina i peptida određena je ELISA testom.Nunc Maxisorp mikrotitarske ploče (Sigma) obložene su preko noći na 4°C s 1,5 μg/ml mišjeg anti-streptavidin protutijela (Thermo, MA1-20011).Nakon blokiranja (pufer za blokiranje: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% želatina, 1% BSA) na sobnoj temperaturi 2 sata, isperite ploču s 0,05% Tween-20/PBS (pufer za ispiranje) 3 sekunde, CSF i uzorci plazme dodani su u jažice razrijeđene puferom za blokiranje (plazma 1: 10 000, CSF 1:115).Ploča je zatim inkubirana preko noći na 4°C s antitijelima za detekciju (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Nakon tri koraka ispiranja, streptavidin je detektiran inkubacijom u otopini supstrata TMB (Roche) do 20 minuta.Nakon zaustavljanja razvijanja boje s 1 M H2SO4, izmjerite apsorbanciju na 450 nm.
Funkcija kompleksa streptavidin-peptid-BACE1 inhibitor procijenjena je pomoću Aβ(1-40) ELISA prema protokolu proizvođača (Wako, 294-64701).Ukratko, uzorci likvora su razrijeđeni u standardnom razrjeđivaču (1:23) i inkubirani preko noći na 4°C u pločama s 96 jažica obloženim protutijelom za hvatanje BNT77.Nakon pet koraka ispiranja, HRP-konjugirano BA27 antitijelo je dodano i inkubirano 2 sata na 4°C, nakon čega je uslijedilo pet koraka ispiranja.Aβ(1-40) je detektiran inkubacijom u TMB otopini 30 minuta na sobnoj temperaturi.Nakon zaustavljanja razvoja boje otopinom za zaustavljanje, izmjerite apsorbanciju na 450 nm.Uzorci plazme podvrgnuti su ekstrakciji čvrste faze prije Aβ(1-40) ELISA.Plazma je dodana u 0,2% DEA (Sigma) u ploče s 96 jažica i inkubirana na sobnoj temperaturi 30 minuta.Nakon uzastopnog ispiranja SPE ploča (Oasis, 186000679) s vodom i 100% metanolom, uzorci plazme dodani su na SPE ploče i sva tekućina je uklonjena.Uzorci su isprani (prvo s 5% metanola, zatim 30% metanola) i eluirani s 2% NH4OH/90% metanola.Nakon sušenja eluata na 55°C tijekom 99 minuta uz konstantnu struju N2, uzorci su reducirani u standardnim razrjeđivačima i Aβ(1-40) je izmjeren kako je gore opisano.
Kako citirati ovaj članak: Urich, E. et al.Dostava tereta u mozak pomoću tranzitnih peptida identificiranih in vivo.znanost.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB i Moos T. Dostava makromolekularnih lijekova u mozak pomoću ciljane terapije.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010.).
Brašnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. i Martinez-Martinez, P. Dostava peptidnih i proteinskih lijekova preko krvno-moždane barijere.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Krvno-moždana barijera: usko grlo u razvoju lijekova za mozak.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, i Byrd, A. Izgledi za poboljšanu isporuku lijeka i ciljanje u mozak putem horoidnog pleksusa-CSF puta.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizacija biofarmaceutike s molekularnim trojanskim konjima za isporuku mozga.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, prijenos peptida posredovan WM receptorom kroz krvno-moždanu barijeru.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. i sur.Povećajte prodiranje u mozak i učinkovitost terapijskih antitijela pomoću monovalentnih molekularnih šatlova.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. i sur.Transport receptora transferina (TfR) određuje moždani unos varijanti afiniteta TfR antitijela.J Exp Med 211, 233-244, 10.1084/jem.20131660 (2014).