Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažuriranu verziju preglednika (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, stranicu prikazujemo bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje vrtuljak s tri slajda odjednom. Koristite gumbe Prethodno i Sljedeće za pomicanje kroz tri slajda odjednom ili upotrijebite klizače na kraju za pomicanje kroz tri slajda odjednom.
Krvno-moždana barijera i krvno-moždana barijera sprječavaju bioterapeutske agense da dosegnu svoje ciljeve u središnjem živčanom sustavu, čime ometaju učinkovito liječenje neuroloških bolesti. Kako bismo otkrili nove moždane transportere in vivo, uveli smo biblioteku T7 fagnih peptida i serijski prikupljali krv i cerebrospinalnu tekućinu (CSF) koristeći kanilirani model velikog skupa svjesnih štakora. Specifični fagni klonovi bili su visoko obogaćeni u CSF-u nakon četiri kruga selekcije. Testiranje pojedinačnih kandidatskih peptida otkrilo je više od 1000 puta obogaćenje u CSF-u. Bioaktivnost peptidom posredovane isporuke u mozak potvrđena je 40%-tnim smanjenjem razine amiloida-β u cerebrospinalnoj tekućini korištenjem inhibitora peptida BACE1 povezanog s identificiranim novim tranzitnim peptidom. Ovi rezultati sugeriraju da bi peptidi identificirani in vivo metodama selekcije faga mogli biti korisni nosači za sistemsku isporuku makromolekula u mozak s terapijskim učinkom.
Istraživanje terapije usmjerene na središnji živčani sustav (SŽS) uglavnom se usredotočilo na identificiranje optimiziranih lijekova i sredstava koja pokazuju svojstva usmjerena na SŽS, s manje napora na otkrivanju mehanizama koji potiču aktivnu dostavu lijekova u mozak. To se sada počinje mijenjati jer je dostava lijekova, posebno velikih molekula, sastavni dio modernog razvoja lijekova u neuroznanosti. Okoliš središnjeg živčanog sustava dobro je zaštićen cerebrovaskularnim barijerskim sustavom, koji se sastoji od krvno-moždane barijere (KMB) i krvno-moždane barijere (KMB)1, što otežava dostavu lijekova u mozak1,2. Procjenjuje se da se gotovo svi lijekovi velikih molekula i više od 98% lijekova malih molekula eliminiraju iz mozga3. Zato je vrlo važno identificirati nove sustave transporta u mozgu koji omogućuju učinkovitu i specifičnu dostavu terapijskih lijekova u SŽS 4,5. Međutim, KMB i KMB također predstavljaju izvrsnu priliku za dostavu lijekova jer prodiru i ulaze u sve strukture mozga kroz njegovu opsežnu vaskulaturu. Stoga se trenutni napori za korištenje neinvazivnih metoda dostave u mozak uvelike temelje na mehanizmu transporta posredovanog receptorima (PMT) korištenjem endogenog receptora BBB6. Unatoč nedavnom ključnom napretku u korištenju puta transferinskog receptora7,8, potreban je daljnji razvoj novih sustava dostave s poboljšanim svojstvima. U tu svrhu, naš je cilj bio identificirati peptide sposobne posredovati u transportu u cerebrospinalnoj tekućini (CSF), jer bi se oni u principu mogli koristiti za dostavu makromolekula u središnji živčani sustav (CNS) ili za otvaranje novih putova receptora. Posebno, specifični receptori i transporteri cerebrospinalnog sustava (BBB i BSCFB) mogu poslužiti kao potencijalne mete za aktivnu i specifičnu dostavu bioterapeutskih lijekova. Likvor (CSF) je sekretorni produkt koroidnog pleksusa (KS) i u izravnom je kontaktu s intersticijskom tekućinom mozga kroz subarahnoidni prostor i ventrikularni prostor4. Nedavno je pokazano da subarahnoidna cerebrospinalna tekućina prekomjerno difundira u intersticij mozga9. Nadamo se da ćemo moći pristupiti parenhimskom prostoru koristeći ovaj subarahnoidni ulazni trakt ili izravno kroz KMB. Kako bismo to postigli, implementirali smo robusnu in vivo strategiju selekcije faga koja idealno identificira peptide transportirane bilo kojim od ova dva različita puta.
Sada opisujemo sekvencijalnu in vivo metodu probira faga s uzorkovanjem cerebrospinalne tekućine (CSF) uparenu s visokopropusnim sekvenciranjem (HTS) kako bismo pratili početne krugove selekcije s najvećom raznolikošću biblioteka. Probir je proveden na svjesnim štakorima s trajno implantiranom kanilom velike cisterne (CM) kako bi se izbjegla kontaminacija krvi. Važno je da ovaj pristup odabire i peptide usmjerene na mozak i peptide s transportnom aktivnošću preko cerebrovaskularne barijere. Koristili smo T7 fage zbog njihove male veličine (~60 nm)10 i sugerirali da su prikladni za transport vezikula koji omogućuju transcelularni prijelaz endotelne i/ili epitelno-medularne barijere. Nakon četiri kruga pretraživanja, izolirane su populacije faga koje pokazuju snažno in vivo obogaćivanje CSF-a i povezanost cerebralnih mikrožila. Važno je da smo uspjeli potvrditi naše nalaze pokazujući da su preferirani i kemijski sintetizirani najbolji kandidati za peptide sposobni transportirati proteinski teret u cerebrospinalnu tekućinu. Prvo, farmakodinamički učinci CNS-a utvrđeni su kombiniranjem vodećeg tranzitnog peptida s inhibitorom BACE1 peptida. Osim što pokazuje da in vivo strategije funkcionalnog probira mogu identificirati nove peptide za transport u mozgu kao učinkovite nosače proteinskog tereta, očekujemo da će slični pristupi funkcionalnoj selekciji postati važni i u identificiranju novih putova transporta u mozgu.
Na temelju jedinica koje stvaraju plak (PFU), nakon koraka pakiranja faga, dizajnirana je i stvorena biblioteka slučajnih 12-mernih linearnih T7 fagnih peptida s raznolikošću od približno 109 (vidi Materijali i metode). Važno je napomenuti da smo pažljivo analizirali ovu biblioteku prije in vivo panninga. PCR amplifikacija uzoraka fagnih biblioteka korištenjem modificiranih primera generirala je amplikone koji su bili izravno primjenjivi na HTS (Dodatna slika 1a). Zbog a) pogrešaka u sekvenciranju HTS11, b) utjecaja na kvalitetu primera (NNK)1-12 i c) prisutnosti faga divljeg tipa (wt) (skeletni umeci) u rezervnoj biblioteci, implementiran je postupak filtriranja sekvenci kako bi se izdvojile samo provjerene informacije o sekvenci (Dodatna slika 1b). Ovi koraci filtriranja primjenjuju se na sve HTS biblioteke za sekvenciranje. Za standardnu ​​biblioteku dobiveno je ukupno 233 868 očitavanja, od kojih je 39% prošlo kriterije filtriranja i korišteno je za analizu i odabir biblioteke za sljedeće runde (Dodatna slika 1c-e). Očitavanja su pretežno bila višekratnici duljine 3 bazna para s vrhom na 36 nukleotida (dodatna slika 1c), što potvrđuje dizajn biblioteke (NNK) 1-12. Značajno je da je približno 11% članova biblioteke sadržavalo 12-dimenzionalni umetak PAGISRELVDKL divljeg tipa (wt), a gotovo polovica sekvenci (49%) sadržavala je insercije ili delecije. HTS biblioteke potvrdio je visoku raznolikost peptida u biblioteci: više od 81% peptidnih sekvenci pronađeno je samo jednom, a samo 1,5% se pojavilo u ≥4 kopije (dodatna slika 2a). Frekvencije aminokiselina (aa) na svih 12 pozicija u repertoaru dobro su se korelirale s frekvencijama očekivanim za broj kodona generiranih degeneriranim NKK repertoarom (dodatna slika 2b). Opažena frekvencija aa ostataka kodiranih ovim umetcima dobro se korelirala s izračunatom frekvencijom (r = 0,893) (dodatna slika 2c). Priprema fagnih knjižnica za injekciju uključuje korake amplifikacije i uklanjanja endotoksina. Prethodno je pokazano da to potencijalno smanjuje raznolikost fagnih knjižnica12,13. Stoga smo sekvencirali fagnu knjižnicu amplificiranu na ploči koja je prošla kroz uklanjanje endotoksina i usporedili je s originalnom knjižnicom kako bismo procijenili učestalost aminokiselina (AA). Uočena je jaka korelacija (r = 0,995) između originalnog skupa i amplificiranog i pročišćenog skupa (Dopunska slika 2d), što ukazuje da konkurencija između klonova amplificiranih na pločama pomoću faga T7 nije uzrokovala veliku pristranost. Ova usporedba temelji se na učestalosti tripeptidnih motiva u svakoj knjižnici, budući da se raznolikost knjižnica (~109) ne može u potpunosti uhvatiti čak ni s HTS-om. Analiza učestalosti aminokiselina na svakoj poziciji otkrila je malu pristranost ovisnu o položaju u posljednje tri pozicije unesenog repertoara (Dopunska slika 2e). Zaključno, zaključili smo da su kvaliteta i raznolikost knjižnice prihvatljive i da su uočene samo manje promjene u raznolikosti zbog amplifikacije i pripreme fagnih knjižnica između nekoliko krugova selekcije.
Serijsko uzorkovanje cerebrospinalne tekućine može se provesti kirurškim ugradnjom kanile u cerebrospinalni likvor (CM) svjesnih štakora kako bi se olakšala identifikacija T7 faga ubrizganog intravenozno (iv) putem KMB i/ili BCSFB (slika 1a-b). U prva tri kruga in vivo selekcije koristili smo dva neovisna kraka selekcije (krakovi A i B) (slika 1c). Postupno smo povećavali stringentnost selekcije smanjenjem ukupne količine faga uvedenog u prva tri kruga selekcije. Za četvrti krug pretraživanja kombinirali smo uzorke iz grana A i B i proveli tri dodatna neovisna odabira. Kako bismo proučili in vivo svojstva čestica T7 faga u ovom modelu, fag divljeg tipa (PAGISRELVDKL glavni umetak) ubrizgan je štakorima putem repne vene. Oporavak faga iz cerebrospinalne tekućine i krvi u različitim vremenskim točkama pokazao je da relativno mali T7 ikosaedarski fagi imaju brzu početnu fazu uklanjanja iz krvnog odjeljka (dodatna slika 3). Na temelju primijenjenih titara i volumena krvi štakora, izračunali smo da je samo približno 1% tež. faga iz primijenjene doze detektirano u krvi 10 minuta nakon intravenske injekcije. Nakon ovog početnog brzog pada, izmjeren je sporiji primarni klirens s poluživotom od 27,7 minuta. Važno je napomenuti da je iz odjeljka cerebrospinalne tekućine dobiveno samo vrlo malo faga, što ukazuje na nisku pozadinu za migraciju faga divljeg tipa u odjeljak cerebrospinalne tekućine (Dodatna slika 3). U prosjeku je u cerebrospinalnoj tekućini tijekom cijelog razdoblja uzorkovanja (0-250 min) detektirano samo oko 1 x 10-3% titra faga T7 u krvi i 4 x 10-8% početno infuziranih faga. Značajno je da je poluživot (25,7 min) faga divljeg tipa u cerebrospinalnoj tekućini bio sličan onome uočenom u krvi. Ovi podaci pokazuju da je barijera koja odvaja odjeljak cerebrospinalne tekućine od krvi netaknuta kod štakora kojima je kanilirana kongenitalna mikroflora (CM), što omogućuje in vivo selekciju fagnih knjižnica za identifikaciju klonova koji se lako transportiraju iz krvi u odjeljak cerebrospinalne tekućine.
(a) Postavljanje metode za ponovno uzorkovanje cerebrospinalne tekućine (CSF) iz velikog skupa. (b) Dijagram koji prikazuje staničnu lokaciju barijere središnjeg živčanog sustava (SŽS) i strategiju selekcije korištenu za identifikaciju peptida koji prelaze krvno-moždanu barijeru (KMB) ​​i krvno-moždanu barijeru. (c) Dijagram toka probira faga in vivo. U svakom krugu selekcije, fagi (identifikatori životinja unutar strelica) su injektirani intravenozno. Dvije neovisne alternativne grane (A, B) čuvaju se odvojeno do 4. kruga selekcije. Za krugove selekcije 3 i 4, svaki klon faga ekstrahiran iz CSF-a je ručno sekvenciran. (d) Kinetika faga izoliranog iz krvi (crveni krugovi) i cerebrospinalne tekućine (zeleni trokuti) tijekom prvog kruga selekcije u dva kanilirana štakora nakon intravenske injekcije biblioteke peptida T7 (2 x 1012 faga/životinji). Plavi kvadrati označavaju prosječnu početnu koncentraciju faga u krvi, izračunatu iz količine injektiranog faga, uzimajući u obzir ukupni volumen krvi. Crni kvadrati označavaju točku presjeka y linije ekstrapolirane iz koncentracija faga u krvi. (e,f) Prikazuje relativnu učestalost i distribuciju svih mogućih preklapajućih tripeptidnih motiva pronađenih u peptidu. Prikazan je broj motiva pronađenih u 1000 očitanja. Značajno (p < 0,001) obogaćeni motivi označeni su crvenim točkama. (e) Dijagram raspršenja korelacije koji uspoređuje relativnu učestalost tripeptidnog motiva injektirane biblioteke s fagom izvedenim iz krvi životinja #1.1 i #1.2. (f) Dijagram raspršenja korelacije koji uspoređuje relativne učestalosti tripeptidnih motiva životinjskih faga #1.1 i #1.2 izoliranih u krvi i cerebrospinalnoj tekućini. (g, h) Prikaz ID-a sekvence faga obogaćenog u krvi (g) u odnosu na injektirane biblioteke i faga obogaćenog u cerebrospinalnoj tekućini (h) u odnosu na krv nakon kruga in vivo selekcije u obje životinje. Veličina jednoslovnog koda označava koliko često se ta aminokiselina pojavljuje na toj poziciji. Zelena = polarna, ljubičasta = neutralna, plava = bazična, crvena = kisela i crna = hidrofobne aminokiseline. Sliku 1a, b dizajnirao je i izradio Eduard Urich.
U dva štakora s CM instrumentom (kladovi A i B) ubrizgali smo biblioteku fagnih peptida i izolirali fag iz cerebrospinalne tekućine i krvi (Slika 1d). Početno brzo uklanjanje biblioteke bilo je manje izraženo u usporedbi s fagom divljeg tipa. Srednje vrijeme poluraspada ubrizgane biblioteke u obje životinje bilo je 24,8 minuta u krvi, slično fagu divljeg tipa, i 38,5 minuta u cerebrospinalnoj tekućini. Uzorci faga krvi i cerebrospinalne tekućine od svake životinje podvrgnuti su HTS-u i svi identificirani peptidi analizirani su na prisutnost kratkog tripeptidnog motiva. Tripeptidni motivi odabrani su jer pružaju minimalnu osnovu za stvaranje strukture i interakcije peptid-protein14,15. Pronašli smo dobru korelaciju u distribuciji motiva između ubrizgane biblioteke faga i klonova ekstrahiranih iz krvi obje životinje (Slika 1e). Podaci pokazuju da je sastav biblioteke samo marginalno obogaćen u odjeljku krvi. Frekvencije aminokiselina i konsenzusne sekvence dodatno su analizirane na svakoj poziciji korištenjem adaptacije softvera Weblogo16. Zanimljivo je da smo pronašli snažno obogaćenje ostacima glicina u krvi (slika 1g). Kada je krv uspoređena s klonovima odabranima iz cerebrospinalne tekućine, uočena je jaka selekcija i određena deselekcija motiva (slika 1f), a određene aminokiseline bile su preferencijalno prisutne na unaprijed određenim pozicijama u 12-članom sustavu (slika 1h). Značajno je da su se pojedinačne životinje značajno razlikovale u cerebrospinalnoj tekućini, dok je obogaćenje glicinom u krvi uočeno kod obje životinje (dodatna slika 4a-j). Nakon strogog filtriranja podataka o sekvenci u cerebrospinalnoj tekućini životinja #1.1 i #1.2, dobiveno je ukupno 964 i 420 jedinstvenih 12-mernih peptida (dodatna slika 1d-e). Izolirani fagni klonovi su amplificirani i podvrgnuti drugom krugu in vivo selekcije. Fagi ekstrahirani iz drugog kruga selekcije podvrgnuti su HTS-u u svakoj životinji i svi identificirani peptidi korišteni su kao ulaz u program prepoznavanja motiva za analizu pojave tripeptidnih motiva (slika 2a, b, ef). U usporedbi s prvim ciklusom faga dobivenog iz cerebrospinalne tekućine (CSF), uočili smo daljnju selekciju i deselekciju mnogih motiva u CSF-u u granama A i B (slika 2). Primijenjen je algoritam za identifikaciju mreže kako bi se utvrdilo predstavljaju li različite obrasce konzistentne sekvence. Uočena je jasna sličnost između 12-dimenzionalnih sekvenci dobivenih CSF-om u alternativnoj kladi A (slika 2c, d) i kladi B (slika 2g, h). Združena analiza u svakoj grani otkrila je različite profile selekcije za 12-merne peptide (dodatna slika 5c, d) i povećanje omjera titra CSF/krv tijekom vremena za združene klonove nakon drugog kruga selekcije u usporedbi s prvim krugom selekcije (dodatna slika 5e).
Obogaćivanje motiva i peptida u cerebrospinalnoj tekućini pomoću dva uzastopna kruga in vivo selekcije funkcionalnog prikaza faga.
Svi fagi cerebrospinalne tekućine dobiveni iz prvog kruga svake životinje (životinje #1.1 i #1.2) su združeni, amplificirani, HT-sekvencirani i ponovno injektirani zajedno (2 x 1010 faga/životinji) 2 SM kaniliranim štakorima (#1.1 → #). 2.1 i 2.2, 1.2 → 2.3 i 2.4). (a,b,e,f) Dijagrami korelacije raspršenja koji uspoređuju relativnu učestalost tripeptidnih motiva svih faga izvedenih iz cerebrospinalne tekućine u prvom i drugom krugu selekcije. Relativna učestalost i distribucija motiva koji predstavljaju sve moguće preklapajuće tripeptide pronađene u peptidima u obje orijentacije. Prikazan je broj motiva pronađenih u 1000 očitanja. Motivi koji su značajno (p < 0,001) odabrani ili isključeni u jednoj od uspoređenih knjižnica označeni su crvenim točkama. (c, d, g, h) Prikaz logotipa sekvence svih CSF-bogatih sekvenci dugih 12 aminokiselina na temelju 2. i 1. kruga selekcije in vivo. Veličina jednoslovnog koda označava koliko se često ta aminokiselina pojavljuje na toj poziciji. Za prikaz logotipa, uspoređuje se učestalost CSF sekvenci ekstrahiranih iz pojedinačnih životinja između dva kruga selekcije i prikazane su obogaćene sekvence u drugom krugu: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 i (h) #1.2–#2.4. Najobogaćenije aminokiseline na danoj poziciji u (c, d) životinjama br. 2.1 i br. 2.2 ili (g, h) u životinjama br. 2.3 i br. 2.4 prikazane su u boji. Zelena = polarna, ljubičasta = neutralna, plava = bazična, crvena = kisela i crna = hidrofobne aminokiseline.
Nakon trećeg kruga selekcije, identificirali smo 124 jedinstvena peptidna slijeda (#3.1 i #3.2) iz 332 klona faga rekonstituiranih iz cerebrospinalne tekućine (CSF) izoliranih iz dvije životinje (Dopunska slika 6a). Slijed LGSVS (18,7%) imao je najveći relativni udio, a slijede ga umetci divljeg tipa PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) i SARGSWREIVSLS (2,2%). U posljednjem četvrtom krugu, objedinili smo dvije neovisno odabrane grane iz tri odvojene životinje (Slika 1c). Od 925 sekvenciranih klonova faga dobivenih iz CSF-a, u četvrtom krugu pronašli smo 64 jedinstvena peptidna slijeda (Dopunska slika 6b), među kojima je relativni udio faga divljeg tipa pao na 0,8%. Najčešći CSF klonovi u četvrtom krugu bili su LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) i RLSSVDSDLSGC (3,2%). Raspon duljina odabranih peptida posljedica je insercija/delecija nukleotida ili preuranjenih stop kodona u primerima biblioteke pri korištenju degeneriranih kodona za dizajn NNK biblioteke. Preuranjeni stop kodoni generiraju kraće peptide i odabrani su jer sadrže povoljan aminokiselinski motiv. Dulji peptidi mogu nastati insercijama/delecijama u primerima sintetskih biblioteka. To pozicionira dizajnirani stop kodon izvan okvira i čita ga dok se nizvodno ne pojavi novi stop kodon. Općenito, izračunali smo faktore obogaćivanja za sva četiri kruga odabira uspoređujući ulazne podatke s izlaznim podacima uzorka. Za prvi krug probira koristili smo titre faga divljeg tipa kao nespecifične pozadinske reference. Zanimljivo je da je negativna selekcija faga bila vrlo jaka u prvom ciklusu cerebrospinalne tekućine (CSF), ali ne i u krvi (slika 3a), što može biti posljedica male vjerojatnosti pasivne difuzije većine članova peptidne biblioteke u odjeljak CSF-a ili da se relativni fagi učinkovitije zadržavaju ili uklanjaju iz krvotoka od bakteriofaga. Međutim, u drugom krugu pretraživanja, uočena je jaka selekcija faga u CSF-u u oba klada, što sugerira da je prethodni krug bio obogaćen fagima koji prikazuju peptide koji potiču unos CSF-a (slika 3a). Ponovno, bez značajnog obogaćivanja krvi. Također u trećem i četvrtom krugu, klonovi faga bili su značajno obogaćeni u CSF-u. Uspoređujući relativnu učestalost svakog jedinstvenog peptidnog slijeda između posljednja dva kruga selekcije, otkrili smo da su slijedovi bili još obogaćeniji u četvrtom krugu selekcije (slika 3b). Ukupno 931 tripeptidni motiv ekstrahiran je iz svih 64 jedinstvena peptidna slijeda korištenjem obje orijentacije peptida. Najobogaćeniji motivi u četvrtom krugu detaljnije su ispitani s obzirom na profile obogaćenja u svim krugovima u usporedbi s ubrizganom bibliotekom (granica: 10% obogaćenja) (Dodatna slika 6c). Opći obrasci selekcije pokazali su da je većina proučavanih motiva obogaćena u svim prethodnim krugovima obje grane selekcije. Međutim, neki motivi (npr. SGL, VSG, LGS GSV) pretežno su bili iz alternativne klade A, dok su drugi (npr. FGW, RTN, WGF, NTR) bili obogaćeni u alternativnoj kladi B.
Validacija transporta peptida prikazanih fagom, obogaćenih cerebrospinalnom tekućinom, i biotiniliranih vodećih peptida konjugiranih sa streptavidinskim sadržajem u cerebrospinalnoj tekućini.
(a) Omjeri obogaćivanja izračunati u sva četiri kruga (R1-R4) na temelju injektiranih (ulaz = I) titara faga (PFU) i određenih titara faga u cerebrospinalnoj tekućini (izlaz = O). Faktori obogaćivanja za posljednja tri kruga (R2-R4) izračunati su usporedbom s prethodnim krugom i prvim krugom (R1) s podacima o težini. Otvoreni stupci predstavljaju cerebrospinalnu tekućinu, zasjenjeni stupci predstavljaju plazmu. (***p<0,001, na temelju Studentovog t-testa). (b) Popis najzastupljenijih fagnih peptida, rangiranih prema njihovom relativnom udjelu u svim fagima prikupljenim u cerebrospinalnoj tekućini nakon 4. kruga selekcije. Šest najčešćih fagnih klonova označeno je bojom, numerirano, a njihovi faktori obogaćivanja između 3. i 4. kruga selekcije (umetci). (c,d) Šest najobogaćenijih fagnih klonova, prazni fagi i matične biblioteke fagnih peptida iz 4. kruga analizirani su pojedinačno u modelu uzorkovanja cerebrospinalne tekućine. Uzorci cerebrospinalne tekućine i krvi prikupljeni su u navedenim vremenskim točkama. (c) Jednake količine 6 kandidatskih fagnih klonova (2 x 1010 faga/životinja), praznih faga (#1779) (2 x 1010 faga/životinja) i osnovnih biblioteka fagnih peptida (2 x 1012 faga/životinja). Ubrizgati najmanje 3 CM se primjenjuje kaniliranoj životinji odvojeno putem repne vene. Prikazana je farmakokinetika cerebrospinalne tekućine (CSF) svakog ubrizganog fagnog klona i biblioteke fagnih peptida tijekom vremena. (d) prikazuje prosječni omjer CSF/krv za sve oporavljene fage/mL tijekom vremena uzorkovanja. (e) Četiri sintetska vodeća peptida i jedan miješani kontrolni peptid povezani su biotinom sa streptavidinom preko njihovog N-terminusa (tetramerni prikaz) nakon čega slijedi injekcija (repna vena i.v., 10 mg streptavidina/kg). Najmanje tri intubirana štakora (N = 3). Uzorci cerebrospinalne tekućine (CSF) prikupljeni su u navedenim vremenskim točkama, a koncentracije streptavidina izmjerene su ELISA testom protiv streptavidina u CSF (nd = nije detektirano). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, na temelju ANOVA testa). (f) Usporedba aminokiselinske sekvence najobogaćenijeg klona fagnog peptida #2002 (ljubičasta) s drugim odabranim klonovima fagnog peptida iz 4. kruga selekcije. Identični i slični fragmenti aminokiselina označeni su bojama.
Od svih obogaćenih faga u četvrtom krugu (slika 3b), šest kandidatskih klonova odabrano je za daljnju pojedinačnu analizu u modelu uzorkovanja cerebrospinalne tekućine (CSF). Jednake količine biblioteka od šest kandidatskih faga, praznih faga (bez umetka) i profagnih peptida injektirane su u tri kanilirane CM životinje, a farmakokinetika je određena u testovima CSF (slika 3c) i krvi (dodatna slika 7). Svi testirani fagni klonovi ciljali su odjeljak CSF na razini 10-1000 puta većoj od one kod praznog kontrolnog faga (#1779). Na primjer, klonovi #2020 i #2077 imali su oko 1000 puta veće titre CSF od kontrolnog faga. Farmakokinetički profil svakog odabranog peptida je različit, ali svi imaju visoku sposobnost navođenja CSF-a. Za klonove #1903 i #2011 primijetili smo konstantan pad tijekom vremena, dok je za klonove #2077, #2002 i #2009 porast tijekom prvih 10 minuta mogao ukazivati ​​na aktivni transport, ali ga je potrebno provjeriti. Klonovi #2020, #2002 i #2077 stabilizirali su se na visokim razinama, dok se koncentracija u cerebrospinalnoj tekućini (CSF) klona #2009 polako smanjivala nakon početnog porasta. Zatim smo usporedili relativnu učestalost svakog kandidata u CSF s njegovom koncentracijom u krvi (slika 3d). Korelacija srednjeg titra svakog kandidata u CSF s njegovim titrom u krvi u svim vremenima uzorkovanja pokazala je da su tri od šest kandidata značajno obogaćena u CSF krvi. Zanimljivo je da je klon #2077 pokazao veću stabilnost u krvi (dodatna slika 7). Kako bismo potvrdili da su sami peptidi sposobni aktivno prenositi teret osim fagnih čestica u odjeljak CSF-a, sintetizirali smo četiri vodeća peptida derivatizirana biotinom na N-terminusu gdje se peptidi vežu za fagnu česticu. Biotinilirani peptidi (br. 2002, 2009, 2020 i 2077) konjugirani su sa streptavidinom (SA) kako bi se dobili multimerni oblici koji donekle oponašaju geometriju faga. Ovaj format nam je također omogućio mjerenje izloženosti SA u krvi i cerebrospinalnoj tekućini kao proteinskih peptida koji prenose teret. Važno je da su se podaci o fagima često mogli reproducirati kada su sintetski peptidi primijenjeni u ovom SA-konjugiranom formatu (slika 3e). Pomiješani peptidi imali su manju početnu izloženost i brže uklanjanje iz cerebrospinalne tekućine s nedetektabilnim razinama unutar 48 sati. Kako bismo dobili uvid u putove isporuke ovih peptidnih fagnih klonova u cerebrospinalnu tekućinu, analizirali smo lokalizaciju pojedinačnih pogodaka fagnih peptida pomoću imunohistokemije (IHC) kako bismo izravno detektirali čestice faga 1 sat nakon intravenske injekcije in vivo. Značajno je da su klonovi #2002, #2077 i #2009 mogli biti detektirani jakim bojenjem u moždanim kapilarama, dok kontrolni fag (#1779) i klon #2020 nisu detektirani (Dodatna slika 8). To sugerira da ovi peptidi doprinose učinku na mozak upravo prelaskom kroz KMB. Potrebna je daljnja detaljna analiza kako bi se testirala ova hipoteza, budući da bi mogao biti uključen i BSCFB put. Prilikom usporedbe aminokiselinske sekvence najobogaćenijeg klona (#2002) s drugim odabranim peptidima, uočeno je da neki od njih imaju slična aminokiselinska proširenja, što može ukazivati ​​na sličan mehanizam transporta (slika 3f).
Zbog svog jedinstvenog profila u plazmi i značajnog povećanja cerebrospinalne tekućine tijekom vremena, klon fagnog prikaza #2077 dalje je istražen tijekom duljeg razdoblja od 48 sati i uspio je reproducirati brzi porast cerebrospinalne tekućine uočen u vezi s održivim razinama SA (slika 4a). Što se tiče drugih identificiranih fagnih klonova, #2077 se snažno obojio za moždane kapilare i pokazao značajnu kolokalizaciju s kapilarnim markerom lektinom kada se promatrao u većoj rezoluciji i moguće neko bojenje u parenhimalnom prostoru (slika 4b). Kako bismo istražili mogu li se farmakološki učinci posredovani peptidima postići u CNS-u, proveli smo eksperiment u kojem su biotinilirane verzije i) tranzitnog peptida #2077 i ii) peptida inhibitora BACE1 pomiješane sa SA u dva različita omjera. Za jednu kombinaciju koristili smo samo inhibitor peptida BACE1, a za drugu smo koristili omjer 1:3 inhibitora peptida BACE1 i peptida #2077. Oba uzorka su primijenjena intravenozno, a razine beta-amiloidnog peptida 40 (Abeta40) u krvi i cerebrospinalnoj tekućini mjerene su tijekom vremena. Abeta40 je mjeren u cerebrospinalnoj tekućini jer odražava inhibiciju BACE1 u moždanom parenhimu. Kao što se i očekivalo, oba kompleksa značajno su smanjila razinu Abeta40 u krvi (slika 4c, d). Međutim, samo uzorci koji sadrže smjesu peptida br. 2077 i inhibitora peptida BACE1 konjugiranog sa SA uzrokovali su značajno smanjenje Abeta40 u cerebrospinalnoj tekućini (slika 4c). Podaci pokazuju da peptid br. 2077 može transportirati protein SA od 60 kDa u središnji živčani sustav, a također inducira farmakološke učinke s inhibitorima peptida BACE1 konjugiranima sa SA.
(a) Klonska injekcija (2 × 10 faga/životinji) faga T7 koja prikazuje dugoročne farmakokinetičke profile CSF peptida #2077 (RLSSVDSDLSGC) i neinjiciranog kontrolnog faga (#1779) u najmanje tri štakora intubirana CM-om. (b) Konfokalna mikroskopska slika reprezentativnih kortikalnih mikrožila u štakora kojima su injektirani fagi (2 × 10 10 faga/životinji) koja prikazuje kontrastno bojenje peptida #2077 i žila (lektin). Ovi fagni klonovi primijenjeni su na 3 štakora i ostavljeni su da cirkuliraju 1 sat prije perfuzije. Mozgovi su secirani i obojeni poliklonskim FITC-obilježenim antitijelima protiv kapside faga T7. Deset minuta prije perfuzije i naknadne fiksacije, intravenozno je primijenjen lektin obilježen s DyLight594. Fluorescentne slike koje prikazuju bojenje lektinom (crveno) luminalne strane mikrožila i faga (zeleno) u lumenu kapilara i perivaskularnom moždanom tkivu. Mjerna traka odgovara 10 µm. (c, d) Biotinilirani BACE1 inhibitorni peptid sam ili u kombinaciji s biotiniliranim tranzitnim peptidom #2077 spojen je na streptavidin, nakon čega je uslijedila intravenska injekcija najmanje tri kanilirana CM štakora (10 mg streptavidina/kg). Smanjenje Aβ40 posredovano inhibitorom BACE1 peptida mjereno je Aβ1-40 ELISA testom u krvi (crveno) i cerebrospinalnoj tekućini (narančasto) u naznačenim vremenskim točkama. Radi bolje jasnoće, na grafu je nacrtana isprekidana linija u mjerilu od 100%. (c) Postotno smanjenje Aβ40 u krvi (crveni trokutići) i cerebrospinalnoj tekućini (narančasti trokutići) kod štakora tretiranih streptavidinom konjugiranim s tranzitnim peptidom #2077 i BACE1 inhibitornim peptidom u omjeru 3:1. (d) Postotno smanjenje Aβ40 u krvi (crveni krugovi) i cerebrospinalnoj tekućini (narančasti krugovi) štakora tretiranih streptavidinom spojenim samo s BACE1 inhibitornim peptidom. Koncentracija Aβ u kontroli bila je 420 pg/ml (standardna devijacija = 101 pg/ml).
Prikaz faga uspješno je primijenjen u nekoliko područja biomedicinskih istraživanja17. Ova metoda je korištena za in vivo studije vaskularne raznolikosti18,19 kao i za studije usmjerene na moždane žile20,21,22,23,24,25,26. U ovoj studiji proširili smo primjenu ove metode selekcije ne samo na izravnu identifikaciju peptida usmjerenih na moždane žile, već i na otkrivanje kandidata s aktivnim transportnim svojstvima za prelazak krvno-moždane barijere. Sada opisujemo razvoj in vivo postupka selekcije kod intubiranih štakora s KM i pokazujemo njegov potencijal za identifikaciju peptida sa svojstvima usmjeravanja u cerebrospinalnu tekućinu (CSF). Koristeći T7 fag koji prikazuje biblioteku 12-mernih nasumičnih peptida, uspjeli smo pokazati da je T7 fag dovoljno malen (približno 60 nm u promjeru)10 da se prilagodi krvno-moždanoj barijeri, čime izravno prelazi krvno-moždanu barijeru ili koroidni pleksus. Uočili smo da je uzimanje cerebrospinalne tekućine (CSF) iz kaniliranih CM štakora dobro kontrolirana in vivo metoda funkcionalnog probira te da se ekstrahirani fag ne samo veže za vaskulaturu, već i funkcionira kao transporter kroz krvno-moždanu barijeru. Nadalje, istovremenim prikupljanjem krvi i primjenom HTS-a na CSF i fage izvedene iz krvi, potvrdili smo da na naš izbor CSF-a nije utjecalo obogaćivanje krvi ili sposobnost za širenje između krugova selekcije. Međutim, odjeljak krvi dio je postupka selekcije, budući da fagi sposobni dosegnuti odjeljak CSF moraju preživjeti i cirkulirati u krvotoku dovoljno dugo da se obogate u mozgu. Kako bismo izvukli pouzdane informacije o sekvenciranju iz sirovih HTS podataka, implementirali smo filtere prilagođene platformski specifičnim pogreškama sekvenciranja u tijeku analize. Uključivanjem kinetičkih parametara u metodu probira potvrdili smo brzu farmakokinetiku faga divljeg tipa T7 (t½ ~ 28 min) u krvi24, 27, 28, a također smo odredili njihov poluživot u cerebrospinalnoj tekućini (t½ ~ 26 min) u minuti). Unatoč sličnim farmakokinetskim profilima u krvi i cerebrospinalnoj tekućini, u cerebrospinalnoj tekućini moglo se otkriti samo 0,001% koncentracije faga u krvi, što ukazuje na nisku pozadinsku mobilnost divljeg tipa T7 faga preko krvno-moždane barijere. Ovaj rad naglašava važnost prvog kruga selekcije pri korištenju in vivo strategija odabira, posebno za fagne sustave koji se brzo uklanjaju iz cirkulacije, budući da malo klonova može dosegnuti odjeljak CNS-a. Stoga je u prvom krugu smanjenje raznolikosti biblioteke bilo vrlo veliko, jer je u ovom vrlo strogom modelu cerebrospinalne tekućine na kraju prikupljen samo ograničen broj klonova. Ova in vivo strategija odabira uključivala je nekoliko koraka selekcije kao što su aktivna akumulacija u odjeljku cerebrospinalne tekućine, preživljavanje klonova u odjeljku krvi i brzo uklanjanje klonova T7 faga iz krvi unutar prvih 10 minuta (slika 1d i dodatna slika 4M). Dakle, nakon prvog kruga, različiti klonovi faga identificirani su u cerebrospinalnoj tekućini, iako je isti početni skup korišten za pojedinačne životinje. To sugerira da višestruki strogi koraci selekcije za izvorne biblioteke s velikim brojem članova biblioteke rezultiraju značajnim smanjenjem raznolikosti. Stoga će slučajni događaji postati sastavni dio početnog procesa selekcije, uvelike utječući na rezultat. Vjerojatno je da su mnogi klonovi u izvornoj biblioteci imali vrlo sličnu sklonost obogaćivanju CSF-a. Međutim, čak i pod istim eksperimentalnim uvjetima, rezultati selekcije mogu se razlikovati zbog malog broja svakog pojedinog klona u početnom skupu.
Motivi obogaćeni u cerebrospinalnoj tekućini razlikuju se od onih u krvi. Zanimljivo je da smo primijetili prvi pomak prema peptidima bogatim glicinom u krvi pojedinih životinja (slika 1g, dodatne slike 4e, 4f). Fagi koji sadrže glicinske peptide mogu biti stabilniji i manja je vjerojatnost da će biti izbačeni iz cirkulacije. Međutim, ovi peptidi bogati glicinom nisu otkriveni u uzorcima cerebrospinalne tekućine, što sugerira da su kurirane biblioteke prošle kroz dva različita koraka selekcije: jedan u krvi, a drugi kojem je dopušteno akumuliranje u cerebrospinalnoj tekućini. Klonovi obogaćeni cerebrospinalnom tekućinom, koji su rezultat četvrtog kruga selekcije, opsežno su testirani. Potvrđeno je da su gotovo svi pojedinačno testirani klonovi obogaćeni cerebrospinalnom tekućinom u usporedbi s fagom s prazne kontrolne uzorke. Jedan pogodak peptida (#2077) detaljnije je ispitan. Pokazao je dulji poluživot u plazmi u usporedbi s drugim pogodcima (slika 3d i dodatna slika 7), a zanimljivo je da je ovaj peptid sadržavao ostatak cisteina na C-terminusu. Nedavno je pokazano da dodatak cisteina peptidima može poboljšati njihova farmakokinetička svojstva vezanjem na albumin 29. To je trenutno nepoznato za peptid #2077 i zahtijeva daljnja istraživanja. Neki peptidi pokazali su valentnu ovisnost u obogaćivanju cerebrospinalne tekućine (podaci nisu prikazani), što može biti povezano s prikazanom geometrijom površine T7 kapside. T7 sustav koji smo koristili pokazao je 5-15 kopija svakog peptida po čestici faga. IHC je proveden na kandidatima za vodeće klonove faga ubrizganim intravenozno u moždanu koru štakora (Dodatna slika 8). Podaci su pokazali da su najmanje tri klona (br. 2002, br. 2009 i br. 2077) interagirala s KMB. Ostaje utvrditi rezultira li ova interakcija KMB nakupljanjem cerebrospinalne tekućine ili kretanjem ovih klonova izravno u BCSFB. Važno je da pokazujemo da odabrani peptidi zadržavaju svoj kapacitet transporta u cerebrospinalnoj tekućini kada se sintetiziraju i vežu za proteinski teret. Vezanje N-terminalnih biotiniliranih peptida na SA u biti ponavlja rezultate dobivene s njihovim odgovarajućim fagnim klonovima u krvi i cerebrospinalnoj tekućini (slika 3e). Konačno, pokazujemo da vodeći peptid #2077 može potaknuti djelovanje biotiniliranog peptidnog inhibitora BACE1 konjugiranog na SA na mozak, uzrokujući izražene farmakodinamičke učinke u CNS-u značajnim smanjenjem razine Abeta40 u cerebrospinalnoj tekućini (slika 4). Nismo uspjeli identificirati nijedan homolog u bazi podataka provođenjem pretraživanja homologije peptidnih sekvenci svih pogodaka. Važno je napomenuti da je veličina T7 biblioteke približno 109, dok je teorijska veličina biblioteke za 12-mere 4 x 1015. Stoga smo odabrali samo mali dio prostora raznolikosti 12-merne peptidne biblioteke, što može značiti da se optimiziraniji peptidi mogu identificirati procjenom susjednog prostora sekvenci ovih identificiranih pogodaka. Hipotetski, jedan od razloga zašto nismo pronašli nikakve prirodne homologe ovih peptida može biti deselekcija tijekom evolucije kako bi se spriječio nekontrolirani ulazak određenih peptidnih motiva u mozak.
Uzeti zajedno, naši rezultati pružaju osnovu za budući rad na detaljnijoj identifikaciji i karakterizaciji transportnih sustava cerebrovaskularne barijere in vivo. Osnovna postavka ove metode temelji se na strategiji funkcionalne selekcije koja ne samo da identificira klonove sa svojstvima vezanja za cerebralne krvne žile, već uključuje i ključni korak u kojem uspješni klonovi imaju intrinzičnu aktivnost za prelazak bioloških barijera in vivo u odjeljak središnjeg živčanog sustava (CNS). Cilj je razjasniti mehanizam transporta ovih peptida i njihovu sklonost vezanju na mikrovaskulaturo specifičnu za područje mozga. To bi moglo dovesti do otkrića novih putova za transport KMB i receptora. Očekujemo da se identificirani peptidi mogu izravno vezati za cerebrovaskularne receptore ili za cirkulirajuće ligande koji se transportiraju kroz KMB ili BCSFB. Peptidni vektori s aktivnošću transporta u CSF otkriveni u ovom radu bit će dalje istraženi. Trenutno istražujemo specifičnost ovih peptida za mozak zbog njihove sposobnosti prelaska KMB i/ili BCSFB. Ovi novi peptidi bit će izuzetno vrijedni alati za potencijalno otkrivanje novih receptora ili puteva te za razvoj novih visoko učinkovitih platformi za isporuku makromolekula, poput bioloških lijekova, u mozak.
Kanilirati veliku cisternu (CM) koristeći modifikaciju prethodno opisane metode. Anestezirani Wistar štakori (200-350 g) postavljeni su na stereotaksički aparat i napravljen je medijal rez preko obrijanog i aseptično pripremljenog vlasišta kako bi se otkrila lubanja. Izbušiti dvije rupe u području gornjeg dijela krila i pričvrstiti vijke za fiksiranje u rupe. Dodatna rupa izbušena je u lateralnom okcipitalnom grebenu za stereotaktičko vođenje kanile od nehrđajućeg čelika u CM. Nanijeti zubni cement oko kanile i učvrstiti vijcima. Nakon fotosenzitivizacije i stvrdnjavanja cementa, rana na koži zatvorena je supraamidnim šavom 4/0. Pravilno postavljanje kanile potvrđuje se spontanim curenjem cerebrospinalne tekućine (CSF). Ukloniti štakora iz stereotaksičkog aparata, primiti odgovarajuću postoperativnu njegu i liječenje boli te mu ostaviti da se oporavlja najmanje tjedan dana dok se ne uoče znakovi krvi u cerebrospinalnoj tekućini. Wistar štakori (Crl:WI/Han) nabavljeni su od Charles Rivera (Francuska). Svi štakori držani su u specifičnim uvjetima bez patogena. Sve pokuse na životinjama odobrio je Veterinarski ured grada Basela u Švicarskoj i provedeni su u skladu s Dozvolom za životinje br. 2474 (Procjena aktivnog transporta u mozgu mjerenjem razina terapijskih kandidata u cerebrospinalnoj tekućini i mozgu štakora).
Nježno držite štakora pri svijesti s CM kanilom u ruci. Izvadite Daturu iz kanile i prikupite 10 µl spontano tekuće cerebrospinalne tekućine. Budući da je prohodnost kanile na kraju bila ugrožena, u ovu studiju uključeni su samo bistri uzorci cerebrospinalne tekućine bez znakova kontaminacije krvlju ili promjene boje. Paralelno s tim, približno 10–20 μl krvi uzeto je iz malog reza na vrhu repa u epruvete s heparinom (Sigma-Aldrich). CSF i krv prikupljeni su u različitim vremenskim točkama nakon intravenske injekcije faga T7. Otprilike 5–10 μl tekućine odbačeno je prije nego što je uzet svaki uzorak cerebrospinalne tekućine, što odgovara mrtvom volumenu katetera.
Biblioteke su generirane korištenjem T7Select 10-3b vektora kako je opisano u priručniku za T7Select sustav (Novagen, Rosenberg i sur., InNovations 6, 1-6, 1996). Ukratko, sintetiziran je slučajni 12-merni DNA umetak u sljedećem formatu:
NNK kodon je korišten kako bi se izbjegli dvostruki stop kodoni i prekomjerna ekspresija aminokiselina u insertu. N je ručno miješani ekvimolarni omjer svakog nukleotida, a K je ručno miješani ekvimolarni omjer adeninskih i citozinskih nukleotida. Jednolančane regije su pretvorene u dvolančanu DNA daljnjom inkubacijom s dNTP-om (Novagen) i Klenow enzimom (New England Biolabs) u Klenow puferu (New England Biolabs) tijekom 3 sata na 37°C. Nakon reakcije, dvolančana DNA je izolirana precipitacijom EtOH. Rezultirajuća DNA je probavljena restrikcijskim enzimima EcoRI i HindIII (oba od Rochea). Cijepani i pročišćeni (QIAquick, Qiagen) insert (T4 ligaza, New England Biolabs) je zatim ligiran u okvir u prethodno cjepani T7 vektor nakon aminokiseline 348 kapsidnog gena 10B. Reakcije ligacije su inkubirane na 16°C tijekom 18 sati prije in vitro pakiranja. Pakiranje faga in vitro provedeno je prema uputama koje su priložene uz T7Select 10-3b klonirajući kit (Novagen), a otopina za pakiranje je jednom amplificirana do lize pomoću Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lizati su centrifugirani, titrirani i zamrznuti na -80°C kao osnovna otopina glicerola.
Izravna PCR amplifikacija varijabilnih regija faga amplificiranih u bujonu ili na ploči korištenjem vlasničkih 454/Roche-amplicon fuzijskih primera. Primer za direktnu fuziju sadrži sekvence koje okružuju varijabilnu regiju (NNK) 12 (specifična za predložak), GS FLX Titanium Adapter A i ključnu sekvencu biblioteke s četiri baze (TCAG) (Dodatna slika 1a):
Primer za reverznu fuziju također sadrži biotin pričvršćen za kuglice za hvatanje i GS FLX Titanium Adapter B potreban za klonsku amplifikaciju tijekom emulzijske PCR:
Amplikoni su zatim podvrgnuti pirosekvenciranju 454/Roche prema protokolu 454 GS-FLX Titanium. Za ručno Sanger sekvenciranje (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNA faga T7 je amplificirana PCR-om i sekvencirana sa sljedećim parovima primera:
Umetci iz pojedinačnih plakova podvrgnuti su PCR amplifikaciji korištenjem Roche Fast Start DNA Polymerase Kita (prema uputama proizvođača). Proveden je vrući start (10 min na 95 °C) i 35 ciklusa pojačanja (50 s na 95 °C, 1 min na 50 °C i 1 min na 72 °C).
Fagi iz knjižnica, fagi divljeg tipa, fagi oslobođeni iz cerebrospinalne tekućine i krvi ili pojedinačni klonovi amplificirani su u Escherichia coli BL5615 u TB bujonu (Sigma Aldrich) ili u posudama od 500 cm2 (Thermo Scientific) tijekom 4 sata na 37°C. Fagi su ekstrahirani s ploča ispiranjem ploča Tris-EDTA puferom (Fluka Analytical) ili sakupljanjem plakova sterilnim vrhovima pipeta. Fagi su izolirani iz supernatanta kulture ili pufera za ekstrakciju s jednim krugom precipitacije polietilen glikolom (PEG 8000) (Promega) i resuspendirani u Tris-EDTA puferu.
Amplificirani fag podvrgnut je 2-3 kruga uklanjanja endotoksina pomoću kuglica za uklanjanje endotoksina (Miltenyi Biotec) prije intravenske (IV) injekcije (500 μl/životinji). U prvom krugu uvedeno je 2×1012 faga; u drugom, 2×1010 faga; u trećem i četvrtom krugu selekcije, 2×109 faga po životinji. Sadržaj faga u uzorcima cerebrospinalne tekućine i krvi prikupljenim u navedenim vremenskim točkama određen je brojanjem plaka prema uputama proizvođača (priručnik za T7Select sustav). Selekcija faga provedena je intravenskom injekcijom pročišćenih biblioteka u repnu venu ili ponovnom injekcijom faga ekstrahiranog iz cerebrospinalne tekućine iz prethodnog kruga selekcije, a naknadna sakupljanja provedena su nakon 10 minuta, 30 minuta, 60 minuta, 90 minuta, 120 minuta, 180 minuta i 240 minuta uzoraka cerebrospinalne tekućine i krvi. Ukupno su provedena četiri kruga in vivo panninga u kojima su dvije odabrane grane odvojeno pohranjene i analizirane tijekom prva tri kruga selekcije. Svi fagni umetci ekstrahirani iz cerebrospinalne tekućine iz prva dva kruga selekcije podvrgnuti su 454/Roche pirosekvenciranju, dok su svi klonovi ekstrahirani iz cerebrospinalne tekućine iz posljednja dva kruga selekcije ručno sekvencirani. Svi krvni fagi iz prvog kruga selekcije također su podvrgnuti 454/Roche pirosekvenciranju. Za injekciju fagnih klonova, odabrani fagi su amplificirani u E. coli (BL5615) na pločama od 500 cm2 na 37°C tijekom 4 sata. Pojedinačno odabrani i ručno sekvencirani klonovi su razmnoženi u TB mediju. Nakon ekstrakcije faga, pročišćavanja i uklanjanja endotoksina (kao što je gore opisano), 2×1010 faga/životinji u 300 μl intravenozno je injektirano u jednu repnu venu.
Prethodna obrada i kvalitativno filtriranje podataka o sekvenci. Sirovi 454/Roche podaci pretvoreni su iz binarnog standardnog formata mape toka (sff) u Pearsonov format čitljiv ljudima (fasta) pomoću softvera dobavljača. Daljnja obrada nukleotidne sekvence provedena je korištenjem vlasničkih C programa i skripti (neobjavljeni softverski paket) kako je opisano u nastavku. Analiza primarnih podataka uključuje stroge postupke višefaznog filtriranja. Kako bi se filtrirali očitanja koja nisu sadržavala valjanu sekvencu DNA umetka od 12 merih, očitanja su sekvencijalno poravnata s početnom oznakom (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), zaustavnom oznakom (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) i pozadinskim umetkom (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) korištenjem globalnog Needleman-Wunsch testa. poravnanje koje dopušta do 2 neusklađenosti po poravnanju31. Stoga su iz biblioteke uklonjena očitanja bez početnih i zaustavnih oznaka i očitanja koja sadrže pozadinske umetke, tj. poravnanja koja premašuju dopušteni broj neusklađenosti. Što se tiče preostalih očitanja, N-merna DNA sekvenca koja se proteže od početne oznake i završava prije stop oznake izrezana je iz izvorne pročitane sekvence i dalje obrađena (u daljnjem tekstu: „umetak“). Nakon translacije umetka, dio nakon prvog stop kodona na 5′ kraju primera uklanja se iz umetka. Osim toga, uklonjeni su i nukleotidi koji vode do nepotpunih kodona na 3′ kraju primera. Kako bi se isključili umetci koji sadrže samo pozadinske sekvence, uklonjeni su i prevedeni umetci koji počinju s aminokiselinskim uzorkom „PAG“. Peptidi s posttranslacijskom duljinom manjom od 3 aminokiseline uklonjeni su iz biblioteke. Konačno, uklonite redundanciju u skupu umetaka i odredite učestalost svakog jedinstvenog umetka. Rezultati ove analize uključivali su popis nukleotidnih sekvenci (umetaka) i njihove (očitane) učestalosti (dodatne slike 1c i 2).
Grupiranje N-mernih DNA umetaka prema sličnosti sekvence: Kako bi se uklonile pogreške u sekvenciranju specifične za 454/Roche (kao što su problemi sa sekvenciranjem homopolimernih ekstenzija) i uklonile manje važne redundancije, prethodno filtrirani N-merni DNA umetci (inserti) sortiraju se prema sličnosti. insercije (dopuštene su do 2 nepodudarne baze) korištenjem iterativnog algoritma definiranog na sljedeći način: insercije se prvo sortiraju prema učestalosti (od najveće do najniže), a ako su iste, prema sekundarnom sortiranju prema duljini (od najdulje do najkraće). Dakle, najčešće i najdulje insercije definiraju prvu „grupu“. Učestalost grupe postavljena je na ključnu učestalost. Zatim se svaka preostala insercija na sortiranom popisu pokušala dodati u grupu parnim Needleman-Wunschovim poravnanjem. Ako broj nepodudarnosti, insercija ili brisanja u poravnanju ne prelazi prag od 2, insercija se dodaje u grupu, a ukupna učestalost grupe povećava se za učestalost dodavanja insercije. Umetci dodani u grupu označavaju se kao korišteni i isključuju se iz daljnje obrade. Ako se umetnuti slijed ne može dodati već postojećoj skupini, umetnuti slijed se koristi za stvaranje nove skupine s odgovarajućom frekvencijom umetanja i označava se kao korišten. Iteracija završava kada je svaki umetnuti slijed ili korišten za stvaranje nove skupine ili se može uključiti u već postojeću skupinu. Uostalom, grupirani umetci koji se sastoje od nukleotida na kraju se prevode u peptidne slijedove (peptidne knjižnice). Rezultat ove analize je skup umetanja i njihovih odgovarajućih frekvencija koje čine broj uzastopnih očitavanja (Dopunska slika 2).
Generiranje motiva: Na temelju popisa jedinstvenih peptida, stvorena je biblioteka koja sadrži sve moguće uzorke aminokiselina (aa) kao što je prikazano u nastavku. Svaki mogući uzorak duljine 3 izdvojen je iz peptida i njegov inverzni uzorak dodan je zajedno sa zajedničkom bibliotekom motiva koja sadrži sve uzorke (tripeptide). Biblioteke visoko repetitivnih motiva su sekvencirane i redundantnost je uklonjena. Zatim smo za svaki tripeptid u biblioteci motiva provjerili njegovu prisutnost u biblioteci pomoću računalnih alata. U ovom slučaju, učestalost peptida koji sadrži pronađeni motiv tripeptida dodaje se i dodjeljuje motivu u biblioteci motiva („broj motiva“). Rezultat generiranja motiva je dvodimenzionalni niz koji sadrži sva pojavljivanja tripeptida (motiva) i njihove odgovarajuće vrijednosti, koje predstavljaju broj očitavanja sekvenciranja koja rezultiraju odgovarajućim motivom kada se očitavanja filtriraju, grupiraju i prevedu. Metrike su detaljno opisane gore.
Normalizacija broja motiva i odgovarajućih dijagrama raspršenja: Broj motiva za svaki uzorak normaliziran je pomoću
gdje je ni broj očitanja koja sadrže temu i. Dakle, vi predstavlja postotnu učestalost očitanja (ili peptida) koji sadrže motiv i u uzorku. P-vrijednosti za nenormalizirani broj motiva izračunate su pomoću Fisherovog egzaktnog testa. Što se tiče korelograma broja motiva, Spearmanove korelacije izračunate su pomoću normaliziranog broja motiva s R.
Za vizualizaciju sadržaja aminokiselina na svakoj poziciji u biblioteci peptida, kreirani su web logogrami 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Prvo se sadržaj aminokiselina na svakoj poziciji 12-mernog peptida pohranjuje u matricu 20×12. Zatim se skup od 1000 peptida koji sadrže isti relativni sadržaj aminokiselina na svakoj poziciji generira u fasta-sequence formatu i daje kao ulaz web-logu 3, koji generira grafički prikaz relativnog sadržaja aminokiselina na svakoj poziciji za zadanu biblioteku peptida. Za vizualizaciju višedimenzionalnih skupova podataka, kreirane su toplinske karte pomoću interno razvijenog alata u R-u (biosHeatmap, R paket koji još nije objavljen). Dendrogrami prikazani na toplinskim kartama izračunati su pomoću Wardove metode hijerarhijskog grupiranja s euklidskom metrikom udaljenosti. Za statističku analizu podataka o bodovanju motiva, P vrijednosti za nenormalizirano bodovanje izračunate su pomoću Fisherovog egzaktnog testa. P-vrijednosti za ostale skupove podataka izračunate su u R-u pomoću Studentovog t-testa ili ANOVA-e.
Odabrani fagni klonovi i fagi bez umetaka injektirani su intravenozno putem repne vene (2×1010 faga/životinji u 300 μl PBS-a). Deset minuta prije perfuzije i naknadne fiksacije, istim životinjama je intravenozno injektirano 100 μl lektina obilježenog s DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minuta nakon injekcije faga, štakori su perfuzirani kroz srce s 50 ml PBS-a, a zatim s 50 ml 4% PFA/PBS-a. Uzorci mozga dodatno su fiksirani preko noći u 4% PFA/PBS-u i natopljeni u 30% saharozi preko noći na 4°C. Uzorci su brzo zamrznuti u OCT smjesi. Imunohistokemijska analiza smrznutih uzoraka provedena je na sobnoj temperaturi na kriosekcijama od 30 µm blokiranim s 1% BSA i inkubiranim s poliklonskim FITC-obilježenim antitijelima protiv faga T7 (Novus NB 600-376A) na 4°C. Inkubirajte preko noći. Konačno, rezovi su isprani 3 puta s PBS-om i pregledani konfokalnim laserskim mikroskopom (Leica TCS SP5).
Sve peptide s minimalnom čistoćom od 98% sintetizirala je tvrtka GenScript USA, biotinilirala ih i liofilizirala. Biotin je vezan putem dodatnog trostrukog glicinskog razmaknika na N-terminusu. Provjerite sve peptide pomoću masene spektrometrije.
Streptavidin (Sigma S0677) pomiješan je s 5-strukim ekvimolarnim viškom biotiniliranog peptida, biotiniliranog BACE1 inhibitornog peptida ili kombinacijom (omjer 3:1) biotiniliranog BACE1 inhibitornog peptida i BACE1 inhibitornog peptida u 5–10% DMSO/inkubirano u PBS-u. 1 sat na sobnoj temperaturi prije injekcije. Streptavidin-konjugirani peptidi injektirani su intravenozno u dozi od 10 mg/kg u jednu od repnih vena štakora s moždanom šupljinom.
Koncentracija streptavidin-peptidnih kompleksa procijenjena je ELISA testom. Nunc Maxisorp mikrotitarske ploče (Sigma) premazane su preko noći na 4°C s 1,5 μg/ml mišjeg anti-streptavidin antitijela (Thermo, MA1-20011). Nakon blokiranja (pufer za blokiranje: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% želatine, 1% BSA) na sobnoj temperaturi tijekom 2 sata, ploča je isprana s 0,05% Tween-20/PBS (pufer za pranje) tijekom 3 sekunde. Uzorci cerebrospinalne tekućine i plazme dodani su u jažice razrijeđene puferom za blokiranje (plazma 1:10 000, cerebrospinalna tekućina 1:115). Ploča je zatim inkubirana preko noći na 4°C s detekcijskim antitijelom (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Nakon tri koraka ispiranja, streptavidin je detektiran inkubacijom u otopini TMB supstrata (Roche) do 20 minuta. Nakon zaustavljanja razvoja boje s 1M H2SO4, izmjerite apsorbanciju na 450 nm.
Funkcija kompleksa streptavidin-peptid-BACE1 inhibitor procijenjena je Aβ(1-40) ELISA testom prema protokolu proizvođača (Wako, 294-64701). Ukratko, uzorci CSF-a razrijeđeni su u standardnom razrjeđivaču (1:23) i inkubirani preko noći na 4°C u pločama s 96 jažica obloženim antitijelom za hvatanje BNT77. Nakon pet koraka ispiranja, dodano je HRP-konjugirano BA27 antitijelo i inkubirano 2 sata na 4°C, nakon čega je uslijedilo pet koraka ispiranja. Aβ(1–40) je detektiran inkubacijom u otopini TMB tijekom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon što je razvoj boje zaustavljen otopinom za zaustavljanje, izmjerite apsorbanciju na 450 nm. Uzorci plazme podvrgnuti su ekstrakciji na čvrstoj fazi prije Aβ(1–40) ELISA testa. Plazma je dodana u 0,2% DEA (Sigma) u pločama s 96 jažica i inkubirana na sobnoj temperaturi tijekom 30 minuta. Nakon uzastopnog ispiranja SPE ploča (Oasis, 186000679) vodom i 100% metanolom, uzorci plazme dodani su na SPE ploče i sva tekućina je uklonjena. Uzorci su isprani (prvo s 5% metanolom, a zatim s 30% metanolom) i eluirani s 2% NH4OH/90% metanolom. Nakon sušenja eluata na 55°C tijekom 99 minuta pri konstantnoj struji N2, uzorci su reducirani u standardnim razrjeđivačima i Aβ(1–40) je mjeren kako je gore opisano.
Kako citirati ovaj članak: Urich, E. i dr. Dostava tereta u mozak korištenjem tranzitnih peptida identificiranih in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB i Moos T. Isporuka makromolekularnih lijekova u mozak korištenjem ciljane terapije. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. i Martinez-Martinez, P. Isporuka peptidnih i proteinskih lijekova preko krvno-moždane barijere. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Krvno-moždana barijera: usko grlo u razvoju lijekova za mozak. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG i Byrd, A. Izgledi za poboljšanu dostavu lijekova i ciljanje mozga putem puta koroidnog pleksusa-cerebrospinalne tekućine. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizacija biofarmaceutika s molekularnim trojanskim konjima za dostavu u mozak. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptorom posredovan transport peptida preko krvno-moždane barijere. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. i dr. Povećanje penetracije u mozak i učinkovitosti terapijskih antitijela korištenjem monovalentnih molekularnih shuttleova. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. i dr. Transport receptora transferina (TfR) određuje unos afinitetnih varijanti TfR antitijela u mozak. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).