Nature.com भ्रमण गर्नुभएकोमा धन्यवाद। तपाईं सीमित CSS समर्थन भएको ब्राउजर संस्करण प्रयोग गर्दै हुनुहुन्छ। उत्तम अनुभवको लागि, हामी तपाईंलाई अद्यावधिक गरिएको ब्राउजर प्रयोग गर्न सिफारिस गर्छौं (वा इन्टरनेट एक्सप्लोररमा अनुकूलता मोड असक्षम गर्नुहोस्)। यसको अतिरिक्त, निरन्तर समर्थन सुनिश्चित गर्न, हामी शैली र जाभास्क्रिप्ट बिना साइट देखाउँछौं।
एकै पटकमा तीन स्लाइडहरूको क्यारोसेल प्रदर्शन गर्दछ। एक पटकमा तीन स्लाइडहरू मार्फत सार्न अघिल्लो र अर्को बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्, वा एक पटकमा तीन स्लाइडहरू मार्फत सार्न अन्त्यमा स्लाइडर बटनहरू प्रयोग गर्नुहोस्।
रक्त-मस्तिष्क अवरोध र रक्त-मस्तिष्क अवरोधले बायोथेराप्यूटिक एजेन्टहरूलाई केन्द्रीय स्नायु प्रणालीमा आफ्नो लक्ष्यमा पुग्नबाट रोक्छ, जसले गर्दा स्नायु रोगहरूको प्रभावकारी उपचारमा बाधा पुग्छ। भिभोमा नयाँ मस्तिष्क ट्रान्सपोर्टरहरू पत्ता लगाउन, हामीले मुसाहरूको क्यानुलेटेड सचेत ठूलो पूल मोडेल प्रयोग गरेर T7 फेज पेप्टाइड पुस्तकालय र क्रमिक रूपमा सङ्कलन गरिएको रगत र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) प्रस्तुत गर्यौं। चार चरणको छनोट पछि विशिष्ट फेज क्लोनहरू CSF मा अत्यधिक समृद्ध थिए। व्यक्तिगत उम्मेदवार पेप्टाइडहरूको परीक्षणले CSF मा १०००-गुणा भन्दा बढी संवर्धन प्रकट गर्‍यो। पहिचान गरिएको उपन्यास ट्रान्जिट पेप्टाइडसँग जोडिएको BACE1 पेप्टाइड अवरोधक प्रयोग गरेर सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा एमाइलोइड-β को स्तरमा ४०% कमीले मस्तिष्कमा पेप्टाइड-मध्यस्थता वितरणको जैविक सक्रियता पुष्टि भयो। यी परिणामहरूले सुझाव दिन्छ कि भिभो फेज चयन विधिहरू द्वारा पहिचान गरिएका पेप्टाइडहरू चिकित्सीय प्रभावको साथ मस्तिष्कमा म्याक्रोमोलेक्युलहरूको प्रणालीगत वितरणको लागि उपयोगी साधन हुन सक्छन्।
केन्द्रीय स्नायु प्रणाली (CNS) लक्षित थेरापी अनुसन्धानले मुख्यतया CNS-लक्ष्यीकरण गुणहरू प्रदर्शन गर्ने अनुकूलित औषधिहरू र एजेन्टहरू पहिचान गर्नमा केन्द्रित छ, मस्तिष्कमा सक्रिय औषधि वितरण गर्ने संयन्त्रहरू पत्ता लगाउन कम प्रयासको साथ। यो अब परिवर्तन हुन थालेको छ किनकि औषधि वितरण, विशेष गरी ठूला अणुहरू, आधुनिक न्यूरोसाइन्स औषधि विकासको अभिन्न अंग हो। केन्द्रीय स्नायु प्रणालीको वातावरण सेरेब्रोभास्कुलर अवरोध प्रणालीद्वारा राम्रोसँग सुरक्षित छ, जसमा रक्त-मस्तिष्क अवरोध (BBB) ​​र रक्त-मस्तिष्क अवरोध (BCBB)1 समावेश छ, जसले गर्दा मस्तिष्कमा औषधिहरू पुर्‍याउन चुनौतीपूर्ण हुन्छ1,2। अनुमान गरिएको छ कि लगभग सबै ठूला अणु औषधिहरू र 98% भन्दा बढी साना अणु औषधिहरू मस्तिष्कबाट हटाइन्छ3। त्यसैले CNS 4,5 मा चिकित्सीय औषधिहरूको कुशल र विशिष्ट डेलिभरी प्रदान गर्ने नयाँ मस्तिष्क यातायात प्रणालीहरू पहिचान गर्नु धेरै महत्त्वपूर्ण छ। यद्यपि, BBB र BCSFB ले औषधि वितरणको लागि उत्कृष्ट अवसर पनि प्रस्तुत गर्दछ किनकि तिनीहरू यसको व्यापक भास्कुलचर मार्फत मस्तिष्कको सबै संरचनाहरूमा प्रवेश गर्छन् र प्रवेश गर्छन्। यसरी, मस्तिष्कमा डेलिभरीको गैर-आक्रामक विधिहरू प्रयोग गर्ने हालका प्रयासहरू मुख्यतया एन्डोजेनस BBB6 रिसेप्टर प्रयोग गरेर रिसेप्टर-मध्यस्थता यातायात (PMT) को संयन्त्रमा आधारित छन्। ट्रान्सफरिन रिसेप्टर मार्ग7,8 प्रयोग गरेर हालैका प्रमुख प्रगतिहरूको बावजुद, सुधारिएको गुणहरू भएका नयाँ डेलिभरी प्रणालीहरूको थप विकास आवश्यक छ। यस उद्देश्यका लागि, हाम्रो लक्ष्य CSF यातायातको मध्यस्थता गर्न सक्षम पेप्टाइडहरू पहिचान गर्नु थियो, किनकि तिनीहरू सिद्धान्तमा CNS मा म्याक्रोमोलेक्युलहरू डेलिभर गर्न वा नयाँ रिसेप्टर मार्गहरू खोल्न प्रयोग गर्न सकिन्छ। विशेष गरी, सेरेब्रोभास्कुलर प्रणाली (BBB र BSCFB) का विशिष्ट रिसेप्टरहरू र ट्रान्सपोर्टरहरूले बायोथेराप्यूटिक औषधिहरूको सक्रिय र विशिष्ट डेलिभरीको लागि सम्भावित लक्ष्यको रूपमा काम गर्न सक्छन्। सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) कोरोइड प्लेक्सस (CS) को एक स्रावित उत्पादन हो र सबराक्नोइड स्पेस र वेंट्रिकुलर स्पेस4 मार्फत मस्तिष्कको इन्टरस्टिशियल फ्लुइडसँग प्रत्यक्ष सम्पर्कमा छ। हालै यो देखाइएको छ कि सबराक्नोइड सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड मस्तिष्कको इन्टरस्टिटियममा अत्यधिक रूपमा फैलिन्छ। हामी यो सबराक्नोइड इनफ्लो ट्र्याक्ट प्रयोग गरेर वा सिधै BBB मार्फत प्यारेन्काइमल स्पेसमा पहुँच गर्ने आशा गर्छौं। यो प्राप्त गर्न, हामीले एक बलियो इन भिभो फेज चयन रणनीति लागू गर्यौं जसले आदर्श रूपमा यी दुई फरक मार्गहरू मध्ये कुनै एकद्वारा ढुवानी गरिएका पेप्टाइडहरू पहिचान गर्दछ।
हामी अब उच्चतम पुस्तकालय विविधता भएको प्रारम्भिक चयन राउन्डहरू निगरानी गर्न उच्च थ्रुपुट सिक्वेन्सिङ (HTS) सँग मिलेर CSF नमूना सहितको अनुक्रमिक इन भिभो फेज डिस्प्ले स्क्रिनिङ विधिको वर्णन गर्छौं। रगतको दूषितताबाट बच्न स्थायी रूपमा प्रत्यारोपित ठूलो सिस्टर्ना (CM) क्यानुलाको साथ सचेत मुसाहरूमा स्क्रिनिङ गरिएको थियो। महत्त्वपूर्ण रूपमा, यो दृष्टिकोणले सेरेब्रोभास्कुलर बाधा पार गर्दै यातायात गतिविधि भएका मस्तिष्क-लक्ष्यीकरण र पेप्टाइडहरू दुवै चयन गर्दछ। हामीले T7 फेजहरू तिनीहरूको सानो आकार (~60 nm)10 को कारणले प्रयोग गर्यौं र सुझाव दियौं कि तिनीहरू एन्डोथेलियल र/वा एपिथेलियल-मेडुला बाधाको ट्रान्ससेलुलर क्रसिङलाई अनुमति दिने भेसिकलहरूको ढुवानीको लागि उपयुक्त छन्। प्यानिङको चार राउन्ड पछि, फेज जनसंख्यालाई बलियो इन भिभो CSF संवर्धन र सेरेब्रल माइक्रोवेसेल एसोसिएशन देखाउँदै अलग गरिएको थियो। महत्त्वपूर्ण रूपमा, हामीले मनपर्ने र रासायनिक रूपमा संश्लेषित उत्तम उम्मेदवार पेप्टाइडहरूले सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा प्रोटीन कार्गो ढुवानी गर्न सक्षम छन् भनेर प्रदर्शन गरेर हाम्रो निष्कर्षहरू पुष्टि गर्न सक्षम भयौं। पहिलो, CNS को फार्माकोडायनामिक प्रभावहरू BACE1 पेप्टाइडको अवरोधकसँग एक अग्रणी ट्रान्जिट पेप्टाइड संयोजन गरेर स्थापित गरिएको थियो। इन भिभो कार्यात्मक स्क्रिनिङ रणनीतिहरूले प्रभावकारी प्रोटीन कार्गो वाहकको रूपमा नयाँ मस्तिष्क यातायात पेप्टाइडहरू पहिचान गर्न सक्छ भन्ने प्रदर्शन गर्नुको साथै, हामी नयाँ मस्तिष्क यातायात मार्गहरू पहिचान गर्न समान कार्यात्मक चयन दृष्टिकोणहरू पनि महत्त्वपूर्ण हुने अपेक्षा गर्छौं।
प्लेक-फर्मिङ युनिटहरू (PFU) को आधारमा, फेज प्याकेजिङ चरण पछि, लगभग १०९ को विविधता भएको अनियमित १२-मेर रेखीय T7 फेज पेप्टाइडहरूको पुस्तकालय डिजाइन र सिर्जना गरिएको थियो (सामग्री र विधिहरू हेर्नुहोस्)। यो ध्यान दिनु महत्त्वपूर्ण छ कि हामीले इन भिभो प्यानिङ गर्नु अघि यो पुस्तकालयलाई सावधानीपूर्वक विश्लेषण गरेका थियौं। परिमार्जित प्राइमरहरू प्रयोग गरेर फेज लाइब्रेरी नमूनाहरूको PCR प्रवर्धनले HTS मा प्रत्यक्ष रूपमा लागू हुने एम्प्लिकनहरू उत्पन्न गर्‍यो (पूरक चित्र १a)। a) HTS11 अनुक्रमण त्रुटिहरू, b) प्राइमरहरूको गुणस्तरमा प्रभाव (NNK)1-12, र c) स्ट्यान्डबाइ लाइब्रेरीमा वाइल्ड-टाइप (wt) फेज (कंकाल इन्सर्ट्स) को उपस्थितिको कारणले गर्दा, प्रमाणित अनुक्रम जानकारी मात्र निकाल्नको लागि अनुक्रम फिल्टरिङ प्रक्रिया लागू गरिएको थियो (पूरक चित्र १b)। यी फिल्टर चरणहरू सबै HTS अनुक्रमण पुस्तकालयहरूमा लागू हुन्छन्। मानक पुस्तकालयको लागि, कुल २३३,८६८ पठनहरू प्राप्त गरियो, जसमध्ये ३९% ले फिल्टर मापदण्ड पार गरे र पछिल्ला राउन्डहरूको लागि पुस्तकालय विश्लेषण र छनोटको लागि प्रयोग गरियो (पूरक चित्र १c–e)। पठनहरू मुख्यतया ३ आधार जोडी लम्बाइका गुणनहरू थिए जसको शिखर ३६ न्यूक्लियोटाइडहरू (पूरक चित्र १c) मा थियो, जसले पुस्तकालय डिजाइन (NNK) १-१२ पुष्टि गर्दछ। उल्लेखनीय रूपमा, लगभग ११% पुस्तकालय सदस्यहरूमा १२-आयामी वाइल्ड-टाइप (wt) ब्याकबोन PAGISRELVDKL सम्मिलित थियो, र लगभग आधा अनुक्रमहरू (४९%) मा सम्मिलित वा मेटाइहरू थिए। पुस्तकालय पुस्तकालयको HTS ले पुस्तकालयमा पेप्टाइडहरूको उच्च विविधता पुष्टि गर्‍यो: ८१% भन्दा बढी पेप्टाइड अनुक्रमहरू एक पटक मात्र फेला परे र १.५% मात्र ≥४ प्रतिलिपिहरूमा देखा पर्‍यो (पूरक चित्र २a)। रिपोटाइरमा सबै १२ स्थानहरूमा एमिनो एसिड (aa) को फ्रिक्वेन्सीहरू डिजेनेरेट NKK रिपोटाइरद्वारा उत्पन्न कोडोनहरूको संख्याको लागि अपेक्षित फ्रिक्वेन्सीहरूसँग राम्रोसँग सम्बन्धित थिए (पूरक चित्र २b)। यी इन्सर्ट्सहरूद्वारा एन्कोड गरिएको aa अवशेषहरूको अवलोकन गरिएको फ्रिक्वेन्सी गणना गरिएको फ्रिक्वेन्सी (r = ०.८९३) (पूरक चित्र २c) सँग राम्रोसँग सम्बन्धित थियो। इंजेक्शनको लागि फेज लाइब्रेरीहरूको तयारीमा एन्डोटोक्सिनको प्रवर्धन र हटाउने चरणहरू समावेश छन्। यसले पहिले फेज लाइब्रेरीहरूको विविधतालाई सम्भावित रूपमा कम गर्ने देखाइएको छ १२,१३। त्यसकारण, हामीले एन्डोटोक्सिन हटाउने प्लेट-एम्प्लीफाइड फेज लाइब्रेरीलाई अनुक्रमित गर्यौं र AA को फ्रिक्वेन्सी अनुमान गर्न मूल लाइब्रेरीसँग तुलना गर्यौं। मूल पूल र एम्प्लीफाइड र शुद्ध पूल (पूरक चित्र २d) बीच बलियो सहसम्बन्ध (r = ०.९९५) अवलोकन गरिएको थियो, जसले संकेत गर्दछ कि T7 फेज प्रयोग गरेर प्लेटहरूमा एम्प्लीफाइड क्लोनहरू बीचको प्रतिस्पर्धाले प्रमुख पूर्वाग्रह निम्त्याएन। यो तुलना प्रत्येक पुस्तकालयमा ट्राइपेप्टाइड मोटिफहरूको फ्रिक्वेन्सीमा आधारित छ, किनकि HTS सँग पनि पुस्तकालयहरूको विविधता (~१०९) पूर्ण रूपमा कैद गर्न सकिँदैन। प्रत्येक स्थितिमा aa को फ्रिक्वेन्सी विश्लेषणले प्रविष्ट गरिएको प्रदर्शनीको अन्तिम तीन स्थानहरूमा सानो स्थिति-निर्भर पूर्वाग्रह प्रकट गर्‍यो (पूरक चित्र २e)। निष्कर्षमा, हामीले निष्कर्ष निकाल्यौं कि पुस्तकालयको गुणस्तर र विविधता स्वीकार्य थियो र चयनको धेरै राउन्डहरू बीच फेज पुस्तकालयहरूको प्रवर्धन र तयारीको कारणले विविधतामा केवल सानो परिवर्तनहरू अवलोकन गरिएको थियो।
BBB र/वा BCSFB मार्फत नसामा (iv) इन्जेक्ट गरिएको T7 फेजको पहिचानलाई सहज बनाउन सचेत मुसाको CM मा शल्यक्रियाद्वारा क्यानुला प्रत्यारोपण गरेर क्रमिक सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड नमूना लिन सकिन्छ (चित्र 1a-b)। हामीले इन भिभो चयनको पहिलो तीन राउन्डमा दुई स्वतन्त्र चयन हातहरू (हात A र B) प्रयोग गर्यौं (चित्र 1c)। हामीले चयनको पहिलो तीन राउन्डमा प्रस्तुत गरिएको फेजको कुल मात्रा घटाएर चयनको कडापनलाई बिस्तारै बढायौं। प्यानिङको चौथो राउन्डको लागि, हामीले शाखाहरू A र B बाट नमूनाहरू संयोजन गर्यौं र तीन थप स्वतन्त्र चयनहरू गर्यौं। यस मोडेलमा T7 फेज कणहरूको इन भिभो गुणहरू अध्ययन गर्न, वाइल्ड-टाइप फेज (PAGISRELVDKL मास्टर इन्सर्ट) लाई पुच्छर नसा मार्फत मुसामा इन्जेक्ट गरिएको थियो। सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड र रगतबाट फरक-फरक समय बिन्दुहरूमा फेजहरूको पुन: प्राप्तिले देखाएको छ कि तुलनात्मक रूपमा सानो T7 आइकोसाहेड्रल फेजहरूमा रगतको डिब्बाबाट द्रुत प्रारम्भिक क्लियरेन्स चरण थियो (पूरक चित्र 3)। मुसाको प्रशासित टाइटर र रगतको मात्राको आधारमा, हामीले गणना गर्यौं कि प्रशासित खुराकबाट लगभग १% wt. फेज मात्र रगतमा नसामा इंजेक्शन पछि १० मिनेटमा पत्ता लागेको थियो। यो प्रारम्भिक द्रुत गिरावट पछि, २७.७ मिनेटको आधा-जीवन संग एक ढिलो प्राथमिक क्लियरेन्स मापन गरिएको थियो। महत्त्वपूर्ण कुरा, CSF डिब्बाबाट धेरै कम फेजहरू मात्र प्राप्त गरियो, जसले CSF डिब्बामा जंगली-प्रकारको फेज माइग्रेसनको लागि कम पृष्ठभूमिलाई संकेत गर्दछ (पूरक चित्र ३)। औसतमा, सम्पूर्ण नमूना अवधि (०-२५० मिनेट) मा सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा रगतमा T7 फेजको लगभग १ x १०-३% टाइटर र सुरुमा इन्फ्युज गरिएको फेजहरूको ४ x १०-८% पत्ता लगाइयो। उल्लेखनीय रूपमा, सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा जंगली-प्रकारको फेजको आधा-जीवन (२५.७ मिनेट) रगतमा अवलोकन गरिएको जस्तै थियो। यी तथ्याङ्कहरूले CM-क्यानुलेटेड मुसाहरूमा रगतबाट CSF डिब्बालाई अलग गर्ने अवरोध अक्षुण्ण रहेको देखाउँछन्, जसले गर्दा रगतबाट CSF डिब्बामा सजिलै ढुवानी हुने क्लोनहरू पहिचान गर्न फेज लाइब्रेरीहरूको भिभो चयनलाई अनुमति दिन्छ।
(क) ठूलो पोखरीबाट सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) पुन: नमूना लिने विधि सेटअप गर्दै। (ख) केन्द्रीय स्नायु प्रणाली (CNS) बाधाको सेलुलर स्थान र रक्त-मस्तिष्क बाधा (BBB) ​​र रक्त-मस्तिष्क बाधा पार गर्ने पेप्टाइडहरू पहिचान गर्न प्रयोग गरिने चयन रणनीति देखाउने रेखाचित्र। (ग) इन भिभो फेज डिस्प्ले स्क्रिनिङ फ्लोचार्ट। छनोटको प्रत्येक राउन्डमा, फेजहरू (तीरहरू भित्र जनावर पहिचानकर्ताहरू) नसामा इंजेक्शन गरिएको थियो। दुई स्वतन्त्र वैकल्पिक शाखाहरू (A, B) छनोटको चौथो राउन्डसम्म छुट्टाछुट्टै राखिन्छन्। छनोट राउन्ड ३ र ४ को लागि, CSF बाट निकालिएको प्रत्येक फेज क्लोन म्यानुअल रूपमा अनुक्रमित गरिएको थियो। (घ) T7 पेप्टाइड पुस्तकालय (२ x १०१२ फेज/जनावर) को नसामा इंजेक्शन पछि दुई क्यानुलेटेड मुसाहरूमा छनोटको पहिलो राउन्डको समयमा रगत (रातो घेरा) र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (हरियो त्रिकोण) बाट अलग गरिएको फेजको गतिविज्ञान। नीलो वर्गहरूले रगतमा फेजको औसत प्रारम्भिक सांद्रतालाई जनाउँछ, जुन इन्जेक्ट गरिएको फेजको मात्राबाट गणना गरिन्छ, र कुल रगतको मात्रालाई ध्यानमा राख्दै। कालो वर्गहरूले रगत फेज सांद्रताबाट एक्स्ट्रापोलेट गरिएको y रेखाको प्रतिच्छेदन बिन्दुलाई जनाउँछ। (e,f) पेप्टाइडमा पाइने सबै सम्भावित ओभरल्यापिङ ट्राइपेप्टाइड मोटिफहरूको सापेक्षिक आवृत्ति र वितरण प्रस्तुत गर्नुहोस्। १००० रिडिङहरूमा पाइने मोटिफहरूको संख्या देखाइएको छ। उल्लेखनीय रूपमा (p < ०.००१) समृद्ध मोटिफहरूलाई रातो थोप्लाहरूले चिन्ह लगाइएको छ। (e) जनावरहरू #१.१ र #१.२ बाट रगतबाट प्राप्त फेजसँग इन्जेक्ट गरिएको पुस्तकालयको ट्राइपेप्टाइड मोटिफको सापेक्षिक आवृत्तिको तुलना गर्ने सहसम्बन्ध स्क्याटरप्लट। (f) रगत र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा पृथक गरिएको जनावर फेज ट्राइपेप्टाइड मोटिफ #१.१ र #१.२ को सापेक्षिक आवृत्तिहरूको तुलना गर्ने सहसम्बन्ध स्क्याटरप्लट। (g, h) दुवै जनावरहरूमा इन भिभो चयनको एक राउन्ड पछि रगतमा समृद्ध फेज (g) विरुद्ध इन्जेक्टेड लाइब्रेरीहरू र CSF (h) मा समृद्ध फेजको अनुक्रम ID प्रतिनिधित्व। एक-अक्षर कोडको आकारले त्यो एमिनो एसिड त्यो स्थितिमा कति पटक हुन्छ भनेर संकेत गर्दछ। हरियो = ध्रुवीय, बैजनी = तटस्थ, नीलो = आधारभूत, रातो = अम्लीय र कालो = हाइड्रोफोबिक एमिनो एसिडहरू। चित्र 1a, b एडुआर्ड उरिच द्वारा डिजाइन र उत्पादन गरिएको थियो।
हामीले दुईवटा CM उपकरण मुसाहरू (क्लेड A र B) मा फेज पेप्टाइड लाइब्रेरी इन्जेक्ट गर्यौं र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड र रगतबाट अलग गरिएको फेज (चित्र १d) मा राख्यौं। जंगली-प्रकारको फेजको तुलनामा पुस्तकालयको प्रारम्भिक द्रुत निकासी कम स्पष्ट थियो। दुवै जनावरहरूमा इंजेक्ट गरिएको पुस्तकालयको औसत आधा-जीवन रगतमा २४.८ मिनेट थियो, जुन जंगली-प्रकारको फेज जस्तै थियो, र CSF मा ३८.५ मिनेट थियो। प्रत्येक जनावरबाट रगत र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड फेज नमूनाहरू HTS को अधीनमा थिए र सबै पहिचान गरिएका पेप्टाइडहरूलाई छोटो ट्राइपेप्टाइड मोटिफको उपस्थितिको लागि विश्लेषण गरिएको थियो। ट्राइपेप्टाइड मोटिफहरू छनौट गरिएको थियो किनभने तिनीहरूले संरचना गठन र पेप्टाइड-प्रोटिन अन्तरक्रियाको लागि न्यूनतम आधार प्रदान गर्छन्14,15। हामीले इन्जेक्ट गरिएको फेज लाइब्रेरी र दुवै जनावरहरूको रगतबाट निकालिएका क्लोनहरू बीचको मोटिफहरूको वितरणमा राम्रो सम्बन्ध फेला पार्यौं (चित्र १e)। तथ्याङ्कले संकेत गर्दछ कि पुस्तकालयको संरचना रगतको डिब्बामा केवल थोरै मात्र समृद्ध छ। Weblogo16 सफ्टवेयरको अनुकूलन प्रयोग गरेर प्रत्येक स्थितिमा एमिनो एसिड फ्रिक्वेन्सी र सहमति अनुक्रमहरूको थप विश्लेषण गरियो। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, हामीले रगत ग्लाइसिन अवशेषहरूमा बलियो संवर्धन फेला पार्यौं (चित्र 1g)। जब रगतलाई CSF बाट चयन गरिएका क्लोनहरूसँग तुलना गरियो, बलियो चयन र मोटिफहरूको केही अचयन अवलोकन गरियो (चित्र 1f), र केही एमिनो एसिडहरू प्राथमिकताका साथ 12-सदस्य (चित्र 1h) मा पूर्वनिर्धारित स्थानहरूमा उपस्थित थिए। उल्लेखनीय रूपमा, व्यक्तिगत जनावरहरूमा सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा उल्लेखनीय रूपमा भिन्नता थियो, जबकि दुवै जनावरहरूमा रगत ग्लाइसिन संवर्धन अवलोकन गरिएको थियो (पूरक चित्र 4a-j)। जनावरहरूको सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड #1.1 र #1.2 मा अनुक्रम डेटाको कडा फिल्टरिङ पछि, कुल 964 र 420 अद्वितीय 12-मेर पेप्टाइडहरू प्राप्त गरियो (पूरक चित्र 1d-e)। पृथक फेज क्लोनहरू प्रवर्द्धित गरियो र इन भिभो चयनको दोस्रो चरणको अधीनमा राखियो। दोस्रो चरणको छनोटबाट निकालिएको फेजलाई प्रत्येक जनावरमा HTS को अधीनमा राखिएको थियो र सबै पहिचान गरिएका पेप्टाइडहरूलाई ट्राइपेप्टाइड मोटिफहरूको घटना विश्लेषण गर्न मोटिफ पहिचान कार्यक्रममा इनपुटको रूपमा प्रयोग गरिएको थियो (चित्र 2a, b, ef)। CSF बाट प्राप्त गरिएको फेजको पहिलो चक्रको तुलनामा, हामीले शाखा A र B मा CSF मा धेरै मोटिफहरूको थप चयन र अचयन अवलोकन गर्यौं (चित्र 2)। तिनीहरूले सुसंगत अनुक्रमको फरक ढाँचाहरू प्रतिनिधित्व गर्छन् कि भनेर निर्धारण गर्न नेटवर्क पहिचान एल्गोरिथ्म लागू गरिएको थियो। वैकल्पिक क्लेड A (चित्र 2c, d) र क्लेड B (चित्र 2g, h) मा CSF द्वारा पुन: प्राप्त गरिएको 12-आयामी अनुक्रमहरू बीच स्पष्ट समानता देखियो। प्रत्येक शाखामा पूल गरिएको विश्लेषणले 12-मेर पेप्टाइडहरूको लागि फरक चयन प्रोफाइलहरू (पूरक चित्र 5c, d) र चयनको पहिलो चरणको तुलनामा दोस्रो चरणको छनोट पछि पूल गरिएको क्लोनको लागि समयसँगै CSF/रगत टिटर अनुपातमा वृद्धि प्रकट गर्‍यो (पूरक चित्र 5e)।
इन भिभो फंक्शनल फेज डिस्प्ले चयनको लगातार दुई राउन्डहरूद्वारा सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा मोटिफ र पेप्टाइड्सको समृद्धि।
प्रत्येक जनावर (जनावर #१.१ र #१.२) को पहिलो चरणबाट प्राप्त सबै सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड फेजहरूलाई जम्मा गरियो, प्रवर्द्धन गरियो, HT-अनुक्रमित गरियो र सँगै पुन: इंजेक्ट गरियो (२ x १०१० फेज/जनावर) २ SM क्यानुलेटेड मुसा (#१.१ → #)। २.१ र २.२, १.२ → २.३ र २.४)। (a,b,e,f) पहिलो र दोस्रो चयन राउन्डमा सबै CSF-व्युत्पन्न फेजहरूको ट्राइपेप्टाइड मोटिफहरूको सापेक्षिक आवृत्ति तुलना गर्ने सहसम्बन्ध स्क्याटरप्लटहरू। दुवै अभिमुखीकरणहरूमा पेप्टाइडहरूमा पाइने सबै सम्भावित ओभरल्यापिङ ट्राइपेप्टाइडहरूको प्रतिनिधित्व गर्ने मोटिफहरूको सापेक्षिक आवृत्ति र वितरण। १००० रिडिङहरूमा पाइने मोटिफहरूको संख्या देखाइएको छ। तुलना गरिएको पुस्तकालयहरू मध्ये एकमा उल्लेखनीय रूपमा (p < ०.००१) चयन गरिएका वा बहिष्कृत गरिएका मोटिफहरूलाई रातो थोप्लाहरूले हाइलाइट गरिएको छ। (c, d, g, h) इन भिभो चयनको राउन्ड २ र १ मा आधारित सबै CSF-समृद्ध १२ एमिनो एसिड लामो अनुक्रमहरूको अनुक्रम लोगो प्रतिनिधित्व। एक-अक्षर कोडको आकारले त्यो स्थितिमा त्यो एमिनो एसिड कति पटक हुन्छ भनेर संकेत गर्दछ। लोगो प्रतिनिधित्व गर्न, दुई चयन राउन्डहरू बीच व्यक्तिगत जनावरहरूबाट निकालिएको CSF अनुक्रमहरूको आवृत्ति तुलना गरिन्छ र दोस्रो राउन्डमा समृद्ध अनुक्रमहरू देखाइन्छ: (c) #१.१–#२.१ (d) #१.१–#२.२ (g) #१.२–#२.३ र (h) #१.२–#२.४। (c, d) जनावरहरू नम्बर २.१ र नम्बर २.२ वा (g, h) जनावरहरू नम्बर २.३ र नम्बर २.४ मा दिइएको स्थानमा सबैभन्दा समृद्ध एमिनो एसिडहरू रंगमा देखाइएका छन्। हरियो = ध्रुवीय, बैजनी = तटस्थ, नीलो = आधारभूत, रातो = अम्लीय र कालो = हाइड्रोफोबिक एमिनो एसिडहरू।
तेस्रो चरणको छनोट पछि, हामीले दुई जनावरहरूबाट अलग गरिएका ३३२ CSF-पुनर्गठित फेज क्लोनहरूबाट १२४ अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमहरू (#३.१ र #३.२) पहिचान गर्यौं (पूरक चित्र ६a)। अनुक्रम LGSVS (१८.७%) मा उच्चतम सापेक्षिक अनुपात थियो, त्यसपछि जंगली-प्रकारको सम्मिलितहरू PAGISRELVDKL (८.२%), MRWFFSHASQGR (३%), DVAKVS (३%), TWLFSLG (२.२%), र SARGSWREIVSLS (२.२%) थिए। अन्तिम चौथो चरणमा, हामीले तीन अलग-अलग जनावरहरूबाट दुई स्वतन्त्र रूपमा चयन गरिएका शाखाहरू जम्मा गर्यौं (चित्र १c)। CSF बाट बरामद गरिएका ९२५ अनुक्रमित फेज क्लोनहरू मध्ये, चौथो चरणमा हामीले ६४ अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमहरू (पूरक चित्र ६b) फेला पार्यौं, जसमध्ये जंगली-प्रकारको फेजको सापेक्षिक अनुपात ०.८% मा झर्यो। चौथो राउन्डमा सबैभन्दा सामान्य CSF क्लोनहरू LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) र RLSSVDSDLSGC (3, 2%) थिए। %)। चयन गरिएका पेप्टाइडहरूको लम्बाइ दायरा NNK पुस्तकालय डिजाइनको लागि डिजेनेरेट कोडनहरू प्रयोग गर्दा पुस्तकालय प्राइमरहरूमा न्यूक्लियोटाइड सम्मिलन/मेटाउने वा समयपूर्व स्टप कोडनहरूको कारणले हुन्छ। समयपूर्व स्टप कोडनहरूले छोटो पेप्टाइडहरू उत्पन्न गर्छन् र चयन गरिन्छ किनभने तिनीहरूमा अनुकूल aa मोटिफ हुन्छ। लामो पेप्टाइडहरू सिंथेटिक पुस्तकालयहरूको प्राइमरहरूमा सम्मिलन/मेटाउने परिणाम हुन सक्छ। यसले डिजाइन गरिएको स्टप कोडनलाई फ्रेम बाहिर राख्छ र नयाँ स्टप कोडन डाउनस्ट्रीम देखा नपरेसम्म यसलाई पढ्छ। सामान्यतया, हामीले नमूना आउटपुट डेटासँग इनपुट डेटा तुलना गरेर सबै चार चयन राउन्डहरूको लागि संवर्धन कारकहरू गणना गर्यौं। स्क्रिनिङको पहिलो चरणको लागि, हामीले वाइल्ड-टाइप फेज टाइटरहरूलाई गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि सन्दर्भको रूपमा प्रयोग गर्यौं। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, पहिलो CSF चक्रमा नकारात्मक फेज चयन धेरै बलियो थियो, तर रगतमा थिएन (चित्र 3a), जुन पेप्टाइड पुस्तकालयका अधिकांश सदस्यहरूको CSF कम्पार्टमेन्टमा निष्क्रिय प्रसारको कम सम्भावनाको कारणले हुन सक्छ वा सापेक्ष फेजहरू ब्याक्टेरियोफेजहरू भन्दा बढी कुशलतापूर्वक राखिने वा रक्तप्रवाहबाट हटाइने प्रवृत्ति हुन्छ। यद्यपि, प्यानिङको दोस्रो चरणमा, CSF मा फेजहरूको बलियो चयन दुवै क्लेडहरूमा अवलोकन गरिएको थियो, जसले सुझाव दिन्छ कि अघिल्लो चरण CSF अपटेकलाई बढावा दिने पेप्टाइडहरू प्रदर्शन गर्ने फेजहरूमा समृद्ध थियो (चित्र 3a)। फेरि, महत्त्वपूर्ण रक्त संवर्धन बिना। साथै तेस्रो र चौथो चरणहरूमा, फेज क्लोनहरू CSF मा उल्लेखनीय रूपमा समृद्ध थिए। चयनको अन्तिम दुई चरणहरू बीचको प्रत्येक अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमको सापेक्ष आवृत्तिको तुलना गर्दा, हामीले फेला पार्यौं कि चयनको चौथो चरणमा अनुक्रमहरू अझ बढी समृद्ध थिए (चित्र 3b)। दुवै पेप्टाइड अभिमुखीकरण प्रयोग गरेर सबै ६४ अद्वितीय पेप्टाइड अनुक्रमहरूबाट कुल ९३१ ट्राइपेप्टाइड मोटिफहरू निकालिएका थिए। चौथो राउन्डमा सबैभन्दा समृद्ध मोटिफहरूलाई इन्जेक्टेड लाइब्रेरी (कट-अफ: १०% संवर्धन) (पूरक चित्र ६c) को तुलनामा सबै राउन्डहरूमा तिनीहरूको संवर्धन प्रोफाइलहरूको लागि अझ नजिकबाट जाँच गरिएको थियो। चयनको सामान्य ढाँचाहरूले देखाएको छ कि अध्ययन गरिएका अधिकांश मोटिफहरू दुवै चयन शाखाहरूको सबै अघिल्ला राउन्डहरूमा समृद्ध थिए। यद्यपि, केही मोटिफहरू (जस्तै SGL, VSG, LGS GSV) मुख्यतया वैकल्पिक क्लेड A बाट थिए, जबकि अन्य (जस्तै FGW, RTN, WGF, NTR) वैकल्पिक क्लेड B मा समृद्ध थिए।
स्ट्रेप्टाभिडिन पेलोडहरूमा संयुग्मित CSF-समृद्ध फेज-प्रदर्शित पेप्टाइडहरू र बायोटिनिलेटेड लिडर पेप्टाइडहरूको CSF यातायातको प्रमाणीकरण।
(a) इन्जेक्टेड (इनपुट = I) फेज (PFU) टाइटर र निर्धारित CSF फेज टाइटर (आउटपुट = O) को आधारमा चारै राउन्ड (R1-R4) मा गणना गरिएको संवर्धन अनुपात। अन्तिम तीन राउन्ड (R2-R4) को लागि संवर्धन कारकहरू अघिल्लो राउन्ड र पहिलो राउन्ड (R1) सँग तौल डेटाको तुलना गरेर गणना गरिएको थियो। खुला बारहरू सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड हुन्, छायादार बारहरू प्लाज्मा हुन्। (***p<0.001, विद्यार्थीको t-परीक्षणमा आधारित)। (b) सबैभन्दा प्रचुर मात्रामा फेज पेप्टाइडहरूको सूची, छनोटको राउन्ड 4 पछि CSF मा सङ्कलन गरिएका सबै फेजहरूको सापेक्षिक अनुपात अनुसार क्रमबद्ध। छवटा सबैभन्दा सामान्य फेज क्लोनहरू राउन्ड 3 र 4 चयन (इन्सेटहरू) बीच रंग, संख्या र तिनीहरूको संवर्धन कारकहरूमा हाइलाइट गरिएका छन्। (c,d) राउन्ड 4 बाट छवटा सबैभन्दा समृद्ध फेज क्लोनहरू, खाली फेज र अभिभावक फेज पेप्टाइड पुस्तकालयहरू CSF नमूना मोडेलमा व्यक्तिगत रूपमा विश्लेषण गरिएको थियो। संकेत गरिएको समय बिन्दुहरूमा CSF र रगतका नमूनाहरू सङ्कलन गरियो। (c) समान मात्रामा ६ उम्मेदवार फेज क्लोनहरू (२ x १०१० फेज/जनावरहरू), खाली फेजहरू (#१७७९) (२ x १०१० फेज/जनावरहरू) र स्टक फेज पेप्टाइड पुस्तकालयहरू (२ x १०१२ फेज/जनावरहरू)। कम्तिमा ३ CM इन्जेक्सन गरेर पुच्छर नसा मार्फत क्यानुलेटेड जनावरलाई छुट्टै दिइन्छ। प्रत्येक इन्जेक्टेड फेज क्लोन र फेज पेप्टाइड पुस्तकालयको CSF फार्माकोकाइनेटिक्स समयसँगै देखाइएको छ। (d) नमूना लिने समयमा सबै बरामद फेज/मिलीको लागि औसत CSF/रगत अनुपात देखाउँछ। (e) चार सिंथेटिक लिडर पेप्टाइडहरू र एउटा स्क्र्याम्बल गरिएको नियन्त्रणलाई तिनीहरूको N-टर्मिनस (टेट्रामर डिस्प्ले) मार्फत बायोटिनसँग स्ट्रेप्टाभिडिनसँग जोडिएको थियो र त्यसपछि इंजेक्शन (पुच्छर नस iv, १० मिलीग्राम स्ट्रेप्टाभिडिन/किग्रा) दिइएको थियो। कम्तिमा तीन इन्ट्युबेटेड मुसाहरू (N = ३)। CSF नमूनाहरू संकेत गरिएको समय बिन्दुहरूमा सङ्कलन गरिएको थियो र CSF एन्टी-स्ट्रेप्टाभिडिन ELISA द्वारा स्ट्रेप्टाभिडिन सांद्रता मापन गरिएको थियो (nd = पत्ता लागेन)। (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA परीक्षणमा आधारित)। (f) चौथो चरणको छनोटबाट अन्य चयन गरिएका फेज पेप्टाइड क्लोनहरूसँग सबैभन्दा समृद्ध फेज पेप्टाइड क्लोन #2002 (बैजनी) को एमिनो एसिड अनुक्रमको तुलना। समान र समान एमिनो एसिड टुक्राहरू रंग-कोड गरिएका छन्।
चौथो राउन्ड (चित्र ३ख) मा सबै समृद्ध फेजहरू मध्ये, CSF नमूना मोडेलमा थप व्यक्तिगत विश्लेषणको लागि छ उम्मेदवार क्लोनहरू चयन गरिएको थियो। छ उम्मेदवार फेज, खाली फेज (कुनै सम्मिलित छैन) र प्रोफेज पेप्टाइड पुस्तकालयहरूको समान मात्रा तीन क्यान्युलेटेड CM जनावरहरूमा इन्जेक्ट गरिएको थियो, र CSF (चित्र ३ग) र रगत (पूरक चित्र ७) परीक्षणहरूमा फार्माकोकाइनेटिक्स निर्धारण गरिएको थियो। परीक्षण गरिएका सबै फेज क्लोनहरूले खाली नियन्त्रण फेज (#१७७९) भन्दा १०-१००० गुणा बढी स्तरमा CSF डिब्बालाई लक्षित गरे। उदाहरणका लागि, क्लोन #२०२० र #२०७७ मा नियन्त्रण फेज भन्दा लगभग १००० गुणा बढी CSF टाइटरहरू थिए। प्रत्येक चयन गरिएको पेप्टाइडको फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल फरक छ, तर तिनीहरू सबैमा उच्च CSF होमिङ क्षमता छ। हामीले क्लोन #१९०३ र #२०११ को लागि समयसँगै निरन्तर कमी देख्यौं, जबकि क्लोन #२०७७, #२००२ र #२००९ को लागि पहिलो १० मिनेटमा वृद्धिले सक्रिय यातायातलाई संकेत गर्न सक्छ तर प्रमाणित गर्न आवश्यक छ। क्लोन #२०२०, #२००२, र #२०७७ उच्च स्तरमा स्थिर भयो, जबकि क्लोन #२००९ को CSF सांद्रता प्रारम्भिक वृद्धि पछि बिस्तारै घट्यो। त्यसपछि हामीले प्रत्येक CSF उम्मेदवारको सापेक्षिक आवृत्तिलाई यसको रगत सांद्रतासँग तुलना गर्यौं (चित्र ३d)। सबै नमूना समयमा प्रत्येक CSF उम्मेदवारको औसत टाइटरको यसको रगत टाइटरसँगको सहसम्बन्धले देखायो कि छ उम्मेदवारहरू मध्ये तीन रगत CSF मा उल्लेखनीय रूपमा समृद्ध थिए। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, क्लोन #२०७७ ले उच्च रक्त स्थिरता देखायो (पूरक चित्र ७)। पेप्टाइडहरू आफैं सक्रिय रूपमा CSF कम्पार्टमेन्टमा फेज कणहरू बाहेक अन्य कार्गो ढुवानी गर्न सक्षम छन् भनेर पुष्टि गर्न, हामीले N-टर्मिनसमा बायोटिनसँग व्युत्पन्न चार नेता पेप्टाइडहरू संश्लेषित गर्यौं जहाँ पेप्टाइडहरू फेज कणमा संलग्न हुन्छन्। बायोटिनिलेटेड पेप्टाइडहरू (संख्या २००२, २००९, २०२० र २०७७) लाई स्ट्रेप्टाभिडिन (SA) सँग संयुग्मित गरिएको थियो जसले गर्दा फेज ज्यामितिको केही हदसम्म नक्कल गर्ने बहुमेरिक रूपहरू प्राप्त भए। यो ढाँचाले हामीलाई रगत र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा कार्गो-ट्रान्सपोर्टिङ प्रोटीन पेप्टाइडहरूको रूपमा SA एक्सपोजर मापन गर्न पनि अनुमति दियो। महत्त्वपूर्ण कुरा, जब सिंथेटिक पेप्टाइडहरू यस SA-संयुग्मित ढाँचा (चित्र ३e) मा प्रशासित गरिन्थ्यो तब फेज डेटा प्रायः पुन: उत्पादन गर्न सकिन्छ। स्क्र्याम्बल्ड पेप्टाइडहरूमा कम प्रारम्भिक एक्सपोजर र ४८ घण्टा भित्र पत्ता लगाउन नसकिने स्तरहरूको साथ छिटो CSF क्लियरेन्स थियो। CSF स्पेसमा यी पेप्टाइड फेज क्लोनको डेलिभरी मार्गहरूमा अन्तर्दृष्टि प्राप्त गर्न, हामीले भिभोमा इन्ट्राभेनस इंजेक्शन पछि १ घण्टा पछि प्रत्यक्ष रूपमा फेज कणहरू पत्ता लगाउन इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) प्रयोग गरेर व्यक्तिगत फेज पेप्टाइड हिटहरूको स्थानीयकरणको विश्लेषण गर्यौं। उल्लेखनीय रूपमा, क्लोन #२००२, #२०७७, र #२००९ मस्तिष्क केशिकाहरूमा बलियो दाग द्वारा पत्ता लगाउन सकिन्छ, जबकि नियन्त्रण फेज (#१७७९) र क्लोन #२०२० पत्ता लागेन (पूरक चित्र ८)। यसले सुझाव दिन्छ कि यी पेप्टाइडहरूले BBB पार गरेर मस्तिष्कमा प्रभावमा योगदान पुर्‍याउँछन्। यो परिकल्पना परीक्षण गर्न थप विस्तृत विश्लेषण आवश्यक छ, किनकि BSCFB मार्ग पनि संलग्न हुन सक्छ। सबैभन्दा समृद्ध क्लोन (#२००२) को एमिनो एसिड अनुक्रमलाई अन्य चयन गरिएका पेप्टाइडहरूसँग तुलना गर्दा, यो उल्लेख गरिएको थियो कि तिनीहरूमध्ये केहीमा समान एमिनो एसिड विस्तारहरू छन्, जसले समान यातायात संयन्त्रलाई संकेत गर्न सक्छ (चित्र ३f)।
यसको अद्वितीय प्लाज्मा प्रोफाइल र समयसँगै CSF मा उल्लेखनीय वृद्धिको कारण, फेज डिस्प्ले क्लोन #२०७७ लाई ४८-घण्टाको लामो अवधिमा थप अन्वेषण गरिएको थियो र निरन्तर SA स्तरहरूसँग सम्बन्धित CSF मा द्रुत वृद्धि पुन: उत्पादन गर्न सक्षम थियो (चित्र ४a)। अन्य पहिचान गरिएका फेज क्लोनहरूको सन्दर्भमा, #२०७७ ले मस्तिष्क केशिकाहरूको लागि कडा रूपमा दाग लगायो र उच्च रिजोलुसनमा हेर्दा केशिका मार्कर लेक्टिनको साथ महत्त्वपूर्ण कोलोकलाइजेसन देखायो र सम्भवतः प्यारेन्काइमल स्पेसमा केही दाग ​​लगायो (चित्र ४b)। CNS मा पेप्टाइड-मध्यस्थ औषधीय प्रभावहरू प्राप्त गर्न सकिन्छ कि भनेर अनुसन्धान गर्न, हामीले एउटा प्रयोग गर्यौं जसमा i) #२०७७ ट्रान्जिट पेप्टाइड र ii) BACE1 अवरोधक पेप्टाइडको बायोटिनिलेटेड संस्करणहरू दुई फरक अनुपातमा SA सँग मिसाइएका थिए। एउटा संयोजनको लागि हामीले BACE1 पेप्टाइड अवरोधक मात्र प्रयोग गर्यौं र अर्कोको लागि हामीले #२०७७ पेप्टाइडमा BACE1 पेप्टाइड अवरोधकको १:३ अनुपात प्रयोग गर्यौं। दुबै नमूनाहरूलाई नसाबाट दिइयो र समयसँगै रगत र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडको स्तर बीटा-एमाइलोइड पेप्टाइड ४० (एबेटा४०) मापन गरियो। Abeta40 लाई CSF मा मापन गरिएको थियो किनकि यसले मस्तिष्क प्यारेन्काइमामा BACE1 अवरोधलाई प्रतिबिम्बित गर्दछ। अपेक्षा गरिए अनुसार, दुबै कम्प्लेक्सहरूले Abeta40 को रगत स्तरलाई उल्लेखनीय रूपमा घटाए (चित्र ४c, d)। यद्यपि, पेप्टाइड नम्बर २०७७ र SA मा संयुग्मित BACE1 पेप्टाइडको अवरोधकको मिश्रण भएको नमूनाहरूले मात्र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा Abeta40 मा उल्लेखनीय कमी ल्यायो (चित्र ४c)। तथ्याङ्कले देखाउँछ कि पेप्टाइड नम्बर २०७७ ले ६० kDa SA प्रोटिनलाई CNS मा ढुवानी गर्न सक्षम छ र BACE1 पेप्टाइडको SA-संयुग्मित अवरोधकहरूसँग औषधीय प्रभावहरू पनि प्रेरित गर्दछ।
(a) कम्तिमा तीन CM-इन्ट्युबेटेड मुसाहरूमा CSF पेप्टाइड #2077 (RLSSVDSDLSGC) र अनइन्जेक्टेड नियन्त्रण फेज (#1779) को दीर्घकालीन फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइल देखाउने T7 फेजको क्लोनल इंजेक्शन (2 × 10 फेज/जनावर)। (b) फेज-इन्जेक्टेड मुसाहरूमा प्रतिनिधि कोर्टिकल माइक्रोवेसलहरूको कन्फोकल माइक्रोस्कोपिक छवि (2 × 10 10 फेज/जनावर) पेप्टाइड #2077 र भाँडाहरू (लेक्टिन) को काउन्टरस्टेनिङ देखाउँदै। यी फेज क्लोनहरू 3 मुसाहरूमा प्रशासित गरिएको थियो र पर्फ्यूजन अघि 1 घण्टाको लागि परिसंचरण गर्न अनुमति दिइएको थियो। मस्तिष्कलाई T7 फेज क्याप्सिड विरुद्ध पोलिक्लोनल FITC-लेबल गरिएको एन्टिबडीहरूले सेक्शन गरिएको थियो र दाग लगाइएको थियो। पर्फ्यूजन र त्यसपछिको फिक्सेशनको दस मिनेट अघि, DyLight594-लेबल गरिएको लेक्टिन नसामा प्रशासित गरिएको थियो। केशिका र पेरिभास्कुलर मस्तिष्क तन्तुको लुमेनमा माइक्रोभेसल र फेजहरू (हरियो) को ल्युमिनल साइडको लेक्टिन स्टेनिङ (रातो) देखाउने फ्लोरोसेन्ट छविहरू। स्केल बार १० µm सँग मेल खान्छ। (c, d) बायोटिनिलेटेड BACE1 इनहिबिटर पेप्टाइड एक्लै वा बायोटिनिलेटेड ट्रान्जिट पेप्टाइड #2077 सँग संयोजनमा स्ट्रेप्टाभिडिनमा जोडिएको थियो र त्यसपछि कम्तिमा तीन क्यानुलेटेड CM मुसा (१० मिलीग्राम स्ट्रेप्टाभिडिन/किग्रा) को नसामा इंजेक्शन दिइएको थियो। Aβ40 मा BACE1 पेप्टाइड इन्हिबिटर-मध्यस्थता कमीलाई Aβ1-40 ELISA द्वारा रगत (रातो) र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (सुन्तला) मा संकेत गरिएको समय बिन्दुहरूमा मापन गरिएको थियो। राम्रो स्पष्टताको लागि, ग्राफमा १००% को स्केलमा डटेड रेखा कोरिएको छ। (ग) ३:१ अनुपातमा ट्रान्जिट पेप्टाइड #२०७७ र BACE1 निरोधक पेप्टाइडसँग संयुग्मित स्ट्रेप्टाभिडिनले उपचार गरिएका मुसाहरूमा रगत (रातो त्रिकोण) र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (सुन्तला त्रिकोण) मा Aβ40 मा प्रतिशत कमी। (घ) BACE1 निरोधक पेप्टाइडसँग मात्र जोडिएको स्ट्रेप्टाभिडिनले उपचार गरिएका मुसाहरूको रगत Aβ40 (रातो वृत्त) र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (सुन्तला वृत्त) मा प्रतिशत कमी। नियन्त्रणमा Aβ सांद्रता ४२० pg/ml (मानक विचलन = १०१ pg/ml) थियो।
बायोमेडिकल अनुसन्धानका धेरै क्षेत्रहरूमा फेज डिस्प्ले सफलतापूर्वक लागू गरिएको छ17। यो विधि इन भिभो भास्कुलर विविधता अध्ययन18,19 साथै सेरेब्रल भास्कुलर विविधता अध्ययन20,21,22,23,24,25,26 मा प्रयोग गरिएको छ। यस अध्ययनमा, हामीले यो चयन विधिको प्रयोगलाई सेरेब्रल भास्कुलर भास्कुलर विविधता अध्ययन20,21,22,23,24,25,26 मा लक्षित गर्ने अध्ययनहरूमा मात्र नभई रगत-मस्तिष्क अवरोध पार गर्न सक्रिय यातायात गुणहरू भएका उम्मेदवारहरूको खोजमा पनि विस्तार गर्यौं। हामी अब CM इन्ट्युबेटेड मुसाहरूमा इन भिभो चयन प्रक्रियाको विकासको वर्णन गर्छौं र CSF होमिङ गुणहरू भएका पेप्टाइडहरू पहिचान गर्ने यसको क्षमता प्रदर्शन गर्छौं। 12-mer अनियमित पेप्टाइडहरूको पुस्तकालय प्रदर्शन गर्ने T7 फेज प्रयोग गरेर, हामीले T7 फेज पर्याप्त सानो छ (लगभग 60 nm व्यास)10 रगत-मस्तिष्क अवरोधमा अनुकूलित हुनको लागि प्रदर्शन गर्न सक्षम भयौं, जसले गर्दा सिधै रगत-मस्तिष्क बाधा वा कोरोइड प्लेक्सस पार गर्दछ। हामीले अवलोकन गर्यौं कि क्यानुलेटेड CM मुसाबाट CSF सङ्कलन एक राम्रोसँग नियन्त्रित इन भिभो फंक्शनल स्क्रिनिङ विधि थियो, र निकालिएको फेजले भास्कुलेचरमा मात्र बाँधिएको थिएन तर रक्त-मस्तिष्क अवरोध पार गर्ने ट्रान्सपोर्टरको रूपमा पनि काम गर्‍यो। यसबाहेक, एकैसाथ रगत सङ्कलन गरेर र CSF र रगत-व्युत्पन्न फेजहरूमा HTS लागू गरेर, हामीले पुष्टि गर्यौं कि CSF को हाम्रो छनोट रगत संवर्धन वा चयनको राउन्डहरू बीच विस्तारको लागि फिटनेसबाट प्रभावित थिएन। यद्यपि, रक्त डिब्बा चयन प्रक्रियाको एक हिस्सा हो, किनकि CSF डिब्बामा पुग्न सक्षम फेजहरू मस्तिष्कमा आफूलाई समृद्ध बनाउन पर्याप्त लामो समयसम्म रक्तप्रवाहमा बाँच्न र परिसंचरण गर्नुपर्छ। कच्चा HTS डेटाबाट भरपर्दो अनुक्रम जानकारी निकाल्नको लागि, हामीले विश्लेषण कार्यप्रवाहमा प्लेटफर्म-विशिष्ट अनुक्रम त्रुटिहरूमा अनुकूलित फिल्टरहरू लागू गर्यौं। स्क्रिनिङ विधिमा गतिज प्यारामिटरहरू समावेश गरेर, हामीले रगतमा जंगली-प्रकार T7 फेजहरू (t½ ~ 28 मिनेट) को द्रुत फार्माकोकाइनेटिक्स पुष्टि गर्यौं 24, 27, 28 र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (t½ ~ 26 मिनेट) प्रति मिनेटमा तिनीहरूको आधा-जीवन पनि निर्धारण गर्यौं। रगत र CSF मा समान फार्माकोकाइनेटिक प्रोफाइलहरूको बावजुद, CSF मा फेजको रगत सांद्रताको केवल ०.००१% पत्ता लगाउन सकियो, जसले रक्त-मस्तिष्क अवरोध पार गर्दै जंगली-प्रकार T7 फेजको कम पृष्ठभूमि गतिशीलतालाई संकेत गर्दछ। यो कामले इन भिभो प्यानिङ रणनीतिहरू प्रयोग गर्दा पहिलो चरणको छनोटको महत्त्वलाई प्रकाश पार्छ, विशेष गरी फेज प्रणालीहरूको लागि जुन परिसंचरणबाट द्रुत रूपमा खाली गरिन्छ, किनकि थोरै क्लोनहरू CNS डिब्बामा पुग्न सक्षम हुन्छन्। यसरी, पहिलो चरणमा, पुस्तकालय विविधतामा कमी धेरै ठूलो थियो, किनकि यो धेरै कडा CSF मोडेलमा अन्ततः सीमित संख्यामा क्लोनहरू मात्र सङ्कलन गरिएको थियो। यो इन भिभो प्यानिङ रणनीतिमा CSF डिब्बामा सक्रिय संचय, रगत डिब्बामा क्लोन अस्तित्व, र पहिलो १० मिनेट भित्र रगतबाट T7 फेज क्लोनहरूको द्रुत हटाउने जस्ता धेरै चयन चरणहरू समावेश थिए (चित्र १d र पूरक चित्र ४M)। यसरी, पहिलो चरण पछि, CSF मा फरक फेज क्लोनहरू पहिचान गरियो, यद्यपि व्यक्तिगत जनावरहरूको लागि एउटै प्रारम्भिक पूल प्रयोग गरिएको थियो। यसले सुझाव दिन्छ कि ठूलो संख्यामा पुस्तकालय सदस्यहरू भएका स्रोत पुस्तकालयहरूको लागि धेरै कडा चयन चरणहरूले विविधतामा उल्लेखनीय कमी ल्याउँछ। त्यसकारण, अनियमित घटनाहरू प्रारम्भिक चयन प्रक्रियाको अभिन्न अंग बन्नेछन्, जसले परिणामलाई धेरै प्रभाव पार्नेछ। यो सम्भव छ कि मूल पुस्तकालयका धेरै क्लोनहरूमा धेरै समान CSF संवर्धन प्रवृत्ति थियो। यद्यपि, समान प्रयोगात्मक अवस्थाहरूमा पनि, प्रारम्भिक पूलमा प्रत्येक विशेष क्लोनको सानो संख्याको कारणले चयन परिणामहरू फरक हुन सक्छन्।
CSF मा समृद्ध मोटिफहरू रगतमा भएका भन्दा फरक छन्। चाखलाग्दो कुरा के छ भने, हामीले व्यक्तिगत जनावरहरूको रगतमा ग्लाइसिन-समृद्ध पेप्टाइडहरू तर्फ पहिलो परिवर्तन याद गर्यौं। (चित्र १g, पूरक चित्र ४e, ४f)। ग्लाइसिन पेप्टाइडहरू भएको फेज बढी स्थिर हुन सक्छ र परिसंचरणबाट बाहिर निकालिने सम्भावना कम हुन सक्छ। यद्यपि, यी ग्लाइसिन-समृद्ध पेप्टाइडहरू सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड नमूनाहरूमा पत्ता लागेनन्, जसले सुझाव दिन्छ कि क्युरेट गरिएको पुस्तकालयहरू दुई फरक चयन चरणहरू पार गरे: एउटा रगतमा र अर्को सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा जम्मा हुन अनुमति दिइएको। छनोटको चौथो चरणबाट उत्पन्न CSF-समृद्ध क्लोनहरूको व्यापक रूपमा परीक्षण गरिएको छ। लगभग सबै व्यक्तिगत रूपमा परीक्षण गरिएका क्लोनहरू खाली नियन्त्रण फेजको तुलनामा CSF मा समृद्ध भएको पुष्टि भयो। एउटा पेप्टाइड हिट (#२०७७) लाई थप विवरणमा जाँच गरिएको थियो। यसले अन्य हिटहरूको तुलनामा लामो प्लाज्मा आधा-जीवन देखाएको छ (चित्र 3d र पूरक चित्र 7), र रोचक कुरा के छ भने, यो पेप्टाइडमा C-टर्मिनसमा सिस्टिन अवशेष थियो। हालै यो देखाइएको छ कि पेप्टाइडहरूमा सिस्टिन थप्दा एल्बुमिन 29 मा बाँधिएर तिनीहरूको फार्माकोकाइनेटिक गुणहरू सुधार गर्न सकिन्छ। यो हाल पेप्टाइड #2077 को लागि अज्ञात छ र थप अध्ययन आवश्यक छ। केही पेप्टाइडहरूले CSF संवर्धनमा भ्यालेन्स-निर्भरता देखाए (डेटा देखाइएको छैन), जुन T7 क्याप्सिडको प्रदर्शित सतह ज्यामितिसँग सम्बन्धित हुन सक्छ। हामीले प्रयोग गरेको T7 प्रणालीले प्रत्येक पेप्टाइड प्रति फेज कणको 5-15 प्रतिहरू देखायो। IHC मुसाको सेरेब्रल कोर्टेक्समा नसामा इन्जेक्ट गरिएका उम्मेदवार लिड फेज क्लोनहरूमा प्रदर्शन गरिएको थियो (पूरक चित्र 8)। डेटाले देखाएको छ कि कम्तिमा तीन क्लोनहरू (नम्बर 2002, नम्बर 2009 र नम्बर 2077) ले BBB सँग अन्तरक्रिया गरे। यो BBB अन्तरक्रियाले CSF को संचयमा परिणाम दिन्छ वा यी क्लोनहरूको सिधै BCSFB मा आन्दोलनमा परिणाम दिन्छ भन्ने कुरा निर्धारण गर्न बाँकी छ। महत्त्वपूर्ण कुरा, हामी देखाउँछौं कि चयन गरिएका पेप्टाइडहरूले संश्लेषित र प्रोटीन कार्गोमा बाँध्दा तिनीहरूको CSF यातायात क्षमता कायम राख्छन्। N-टर्मिनल बायोटिनाइलेटेड पेप्टाइडहरूलाई SA मा बाँध्दा रगत र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा तिनीहरूको सम्बन्धित फेज क्लोनहरूसँग प्राप्त परिणामहरू अनिवार्य रूपमा दोहोरिन्छ (चित्र 3e)। अन्तमा, हामी देखाउँछौं कि लिड पेप्टाइड #2077 ले SA मा संयुग्मित BACE1 को बायोटिनाइलेटेड पेप्टाइड अवरोधकको मस्तिष्क कार्यलाई बढावा दिन सक्षम छ, जसले CSF मा Abeta40 स्तरहरू उल्लेखनीय रूपमा घटाएर CNS मा स्पष्ट फार्माकोडायनामिक प्रभावहरू निम्त्याउँछ (चित्र 4)। हामी सबै हिटहरूको पेप्टाइड अनुक्रम समरूपता खोज गरेर डाटाबेसमा कुनै पनि समरूपहरू पहिचान गर्न असमर्थ थियौं। यो कुरा ध्यान दिनु महत्त्वपूर्ण छ कि T7 पुस्तकालयको आकार लगभग १०९ छ, जबकि १२-मेरको लागि सैद्धान्तिक पुस्तकालयको आकार ४ x १०१५ छ। त्यसकारण, हामीले १२-मेर पेप्टाइड पुस्तकालयको विविधता ठाउँको सानो अंश मात्र चयन गर्यौं, जसको अर्थ यी पहिचान गरिएका हिटहरूको छेउछाउको अनुक्रम ठाउँको मूल्याङ्कन गरेर थप अनुकूलित पेप्टाइडहरू पहिचान गर्न सकिन्छ। काल्पनिक रूपमा, हामीले यी पेप्टाइडहरूको कुनै पनि प्राकृतिक समरूपताहरू फेला नपर्नुको एउटा कारण मस्तिष्कमा निश्चित पेप्टाइड मोटिफहरूको अनियन्त्रित प्रवेशलाई रोक्नको लागि विकासको क्रममा अचयन हुन सक्छ।
एकसाथ लिँदा, हाम्रा नतिजाहरूले सेरेब्रोभास्कुलर अवरोध इन भिभोको यातायात प्रणालीहरूलाई थप विस्तृत रूपमा पहिचान गर्न र विशेषता दिन भविष्यको कामको लागि आधार प्रदान गर्दछ। यस विधिको आधारभूत सेटअप एक कार्यात्मक चयन रणनीतिमा आधारित छ जसले सेरेब्रल भास्कुलर बाइन्डिङ गुणहरू भएका क्लोनहरूलाई मात्र पहिचान गर्दैन, तर एक महत्वपूर्ण चरण पनि समावेश गर्दछ जसमा सफल क्लोनहरूमा सीएनएस डिब्बामा भिभोमा जैविक अवरोधहरू पार गर्न आन्तरिक गतिविधि हुन्छ। यी पेप्टाइडहरूको ढुवानीको संयन्त्र र मस्तिष्क क्षेत्रको लागि विशिष्ट माइक्रोभास्कुलेचरमा बाँध्नको लागि तिनीहरूको प्राथमिकता स्पष्ट पार्नु हो। यसले BBB र रिसेप्टरहरूको ढुवानीको लागि नयाँ मार्गहरूको खोज निम्त्याउन सक्छ। हामी आशा गर्छौं कि पहिचान गरिएका पेप्टाइडहरू सिधै सेरेब्रोभास्कुलर रिसेप्टरहरूमा वा BBB वा BCSFB मार्फत ढुवानी गरिएका परिसंचरण लिगान्डहरूमा बाँध्न सक्छन्। यस कार्यमा पत्ता लगाइएको CSF यातायात गतिविधि भएका पेप्टाइड भेक्टरहरूको थप अनुसन्धान गरिनेछ। हामी हाल BBB र/वा BCSFB पार गर्ने क्षमताको लागि यी पेप्टाइडहरूको मस्तिष्क विशिष्टताको अनुसन्धान गरिरहेका छौं। यी नयाँ पेप्टाइडहरू नयाँ रिसेप्टर वा मार्गहरूको सम्भावित खोजको लागि र मस्तिष्कमा जैविक पदार्थ जस्ता म्याक्रोमोलेक्युलहरू पुर्‍याउनको लागि नयाँ अत्यधिक कुशल प्लेटफर्महरूको विकासको लागि अत्यन्तै मूल्यवान उपकरणहरू हुनेछन्।
पहिले वर्णन गरिएको विधिको परिमार्जन प्रयोग गरेर ठूलो सिस्टर्ना (CM) क्यानुलेट गर्नुहोस्। बेहोश पारिएका विस्टार मुसाहरू (२००-३५० ग्राम) लाई स्टेरियोट्याक्सिक उपकरणमा माउन्ट गरियो र खोपडीलाई खुलासा गर्न मुसाको मुसा र एसेप्टिक रूपमा तयार गरिएको टाउकोमाथि मध्य चीरा बनाइयो। माथिल्लो स्याशको क्षेत्रमा दुईवटा प्वालहरू ड्रिल गर्नुहोस् र प्वालहरूमा फिक्सिङ स्क्रूहरू बाँध्नुहोस्। स्टेनलेस स्टील क्यानुलालाई स्टेरियोट्याक्टिक मार्गदर्शनको लागि CM मा पार्श्व ओसिपिटल क्रेस्टमा थप प्वाल ड्रिल गरियो। क्यानुला वरिपरि डेन्टल सिमेन्ट लगाउनुहोस् र स्क्रूले सुरक्षित गर्नुहोस्। फोटो-क्युरिङ र सिमेन्ट कडा भएपछि, छालाको घाउ ४/० सुप्रामिड सिवनले बन्द गरियो। सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड (CSF) को सहज चुहावट द्वारा क्यानुलाको उचित स्थान पुष्टि हुन्छ। स्टेरियोट्याक्सिक उपकरणबाट मुसालाई हटाउनुहोस्, शल्यक्रिया पछि उपयुक्त हेरचाह र दुखाइ व्यवस्थापन प्राप्त गर्नुहोस्, र सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइडमा रगतको संकेत नदेखिएसम्म कम्तिमा एक हप्ताको लागि यसलाई निको हुन दिनुहोस्। विस्टार मुसाहरू (Crl:WI/Han) चार्ल्स रिभर (फ्रान्स) बाट प्राप्त गरिएको थियो। सबै मुसाहरूलाई विशिष्ट रोगजनक-मुक्त अवस्थामा राखिएको थियो। सबै पशु प्रयोगहरू स्विट्जरल्याण्डको बासेल शहरको पशु चिकित्सा कार्यालयद्वारा अनुमोदित गरिएको थियो र पशु इजाजतपत्र नम्बर २४७४ (मुसाको सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड र मस्तिष्कमा चिकित्सीय उम्मेदवारहरूको स्तर मापन गरेर सक्रिय मस्तिष्क यातायातको मूल्याङ्कन) अनुसार गरिएको थियो।
CM क्यानुला हातमा राखेर मुसालाई बिस्तारै सचेत राख्नुहोस्। क्यानुलाबाट डातुरा निकाल्नुहोस् र १० μl स्वतःस्फूर्त रूपमा बग्ने सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड सङ्कलन गर्नुहोस्। क्यानुलाको पेटेन्सी अन्ततः सम्झौता भएको हुनाले, रगत दूषित वा रङ्गिन भएको कुनै प्रमाण नभएको स्पष्ट सेरेब्रोस्पाइनल फ्लुइड नमूनाहरू मात्र यस अध्ययनमा समावेश गरिएको थियो। समानान्तर रूपमा, पुच्छरको टुप्पोमा रहेको सानो चीराबाट हेपरिन (सिग्मा-एल्ड्रिच) सहितको ट्यूबहरूमा लगभग १०-२० μl रगत लिइएको थियो। T7 फेजको नसामा इन्जेक्सन पछि विभिन्न समय बिन्दुहरूमा CSF र रगत सङ्कलन गरिएको थियो। प्रत्येक CSF नमूना सङ्कलन गर्नु अघि लगभग ५-१० μl तरल पदार्थ खारेज गरिएको थियो, जुन क्याथेटरको मृत मात्रासँग मेल खान्छ।
T7Select प्रणाली पुस्तिका (नोभाजेन, रोजेनबर्ग एट अल।, इननोभेसन ६, १-६, १९९६) मा वर्णन गरिए अनुसार T7Select १०-३b भेक्टर प्रयोग गरेर पुस्तकालयहरू उत्पन्न गरिएको थियो। संक्षेपमा, एक अनियमित १२-मेर डीएनए सम्मिलित निम्न ढाँचामा संश्लेषित गरिएको थियो:
इन्सर्टमा डबल स्टप कोडन र एमिनो एसिड ओभरएक्सप्रेसनबाट बच्न NNK कोडन प्रयोग गरिएको थियो। N प्रत्येक न्यूक्लियोटाइडको म्यानुअली मिश्रित समतुल्य अनुपात हो, र K एडेनिन र साइटोसिन न्यूक्लियोटाइडहरूको म्यानुअली मिश्रित समतुल्य अनुपात हो। एकल स्ट्रेन्डेड क्षेत्रहरूलाई dNTP (नोभाजेन) र क्लेनो इन्जाइम (न्यू इङ्गल्याण्ड बायोल्याब्स) सँग ३७°C मा ३ घण्टाको लागि क्लेनो बफर (न्यू इङ्गल्याण्ड बायोल्याब्स) मा थप इन्क्युबेशन गरेर डबल स्ट्रेन्डेड DNA मा रूपान्तरण गरिएको थियो। प्रतिक्रिया पछि, EtOH वर्षा द्वारा डबल-स्ट्रेन्डेड DNA पुन: प्राप्त गरिएको थियो। परिणामस्वरूप DNA प्रतिबन्ध इन्जाइमहरू EcoRI र HindIII (दुबै रोशेबाट) सँग पचाइएको थियो। क्लेभ गरिएको र शुद्ध गरिएको (QIAquick, Qiagen) इन्सर्ट (T4 ligase, New England Biolabs) त्यसपछि १०B क्याप्सिड जीनको एमिनो एसिड ३४८ पछि फ्रेममा पूर्व-क्लेभ गरिएको T7 भेक्टरमा बाँधिएको थियो। इन भिट्रो प्याकेजिङ गर्नुअघि १८ घण्टाको लागि लिगेसन प्रतिक्रियाहरू १६° सेल्सियसमा इन्क्युबेट गरिएको थियो। T7Select 10-3b क्लोनिङ किट (नोभाजेन) सँग प्रदान गरिएको निर्देशन अनुसार इन भिट्रोमा फेज प्याकेजिङ गरिएको थियो र प्याकेजिङ समाधानलाई एस्चेरिचिया कोलाई (BLT5615, नोभाजेन) प्रयोग गरेर लिसिस गर्न एक पटक प्रवर्द्धन गरिएको थियो। लाइसेट्सलाई ग्लिसरोलको स्टक घोलको रूपमा -८०° सेल्सियसमा सेन्ट्रीफ्यूज, टाइट्रेटेड र फ्रिज गरिएको थियो।
स्वामित्व 454/Roche-amplicon फ्युजन प्राइमरहरू प्रयोग गरेर ब्रोथ वा प्लेटमा प्रवर्द्धित फेज चर क्षेत्रहरूको प्रत्यक्ष PCR प्रवर्धन। फर्वार्ड फ्युजन प्राइमरमा चर क्षेत्र (NNK) 12 (टेम्पलेट-विशिष्ट), GS FLX टाइटेनियम एडाप्टर A, र चार-आधार लाइब्रेरी कुञ्जी अनुक्रम (TCAG) (पूरक चित्र 1a) लाई फ्ल्याङ्क गर्ने अनुक्रमहरू छन्:
रिभर्स फ्युजन प्राइमरमा क्याप्चर बीड्समा जोडिएको बायोटिन र इमल्शन पीसीआरको समयमा क्लोनल एम्प्लिफिकेशनको लागि आवश्यक पर्ने GS FLX टाइटेनियम एडाप्टर B पनि हुन्छ:
त्यसपछि एम्प्लिकनहरूलाई ४५४ GS-FLX टाइटेनियम प्रोटोकल अनुसार ४५४/रोचे पाइरोसेक्वेन्सिङको अधीनमा राखियो। म्यानुअल स्याङ्गर सिक्वेन्सिङ (एप्लाइड बायोसिस्टम हिताची ३७३० xl DNA विश्लेषक) को लागि, T7 फेज DNA लाई PCR द्वारा प्रवर्द्धन गरिएको थियो र निम्न प्राइमर जोडीहरूसँग अनुक्रमित गरिएको थियो:
व्यक्तिगत प्लाकहरूबाट इन्सर्टहरूलाई रोश फास्ट स्टार्ट डीएनए पोलिमरेज किट प्रयोग गरेर पीसीआर प्रवर्धनको अधीनमा राखिएको थियो (निर्माताको निर्देशन अनुसार)। तातो सुरुवात (९५ डिग्री सेल्सियसमा १० मिनेट) र ३५ बूस्ट चक्रहरू (९५ डिग्री सेल्सियसमा ५० सेकेन्ड, ५० डिग्री सेल्सियसमा १ मिनेट, र ७२ डिग्री सेल्सियसमा १ मिनेट) प्रदर्शन गर्नुहोस्।
पुस्तकालयहरूबाट प्राप्त फेज, जंगली-प्रकारको फेज, CSF र रगतबाट उद्धार गरिएको फेज, वा व्यक्तिगत क्लोनहरूलाई Escherichia coli BL5615 मा TB ब्रोथ (सिग्मा एल्ड्रिच) मा वा 500 cm2 भाँडामा (थर्मो साइन्टिफिक) मा 37°C मा 4 घण्टाको लागि प्रवर्द्धन गरिएको थियो। प्लेटहरूलाई Tris-EDTA बफर (फ्लुका एनालिटिक्स) ले पखालेर वा बाँझ पिपेट टिप्सले प्लेकहरू सङ्कलन गरेर प्लेटहरूबाट फेज निकालिएको थियो। फेजलाई पोलिथिलीन ग्लाइकोल (PEG 8000) वर्षा (प्रोमेगा) को एक राउन्डको साथ कल्चर सुपरनेटेन्ट वा एक्स्ट्र्याक्शन बफरबाट अलग गरिएको थियो र Tris-EDTA बफरमा पुन: निलम्बन गरिएको थियो।
प्रवर्धित फेजलाई इन्ट्राभेनस (IV) इंजेक्शन (५०० μl/जनावर) गर्नु अघि एन्डोटोक्सिन रिमूभल बीड्स (मिल्टेनी बायोटेक) प्रयोग गरेर एन्डोटोक्सिन हटाउने २-३ राउन्ड गरिएको थियो। पहिलो राउन्डमा, २×१०१२ फेजहरू प्रस्तुत गरिएको थियो; दोस्रोमा, २×१०१० फेजहरू; तेस्रो र चौथो चयन राउन्डमा, प्रति जनावर २×१०९ फेजहरू। CSF मा फेज सामग्री र संकेतित समय बिन्दुहरूमा सङ्कलन गरिएको रगत नमूनाहरू निर्माताको निर्देशन (T7Select प्रणाली म्यानुअल) अनुसार प्लेक गणना गरेर निर्धारण गरिएको थियो। फेज चयन पुच्छरको नसामा शुद्ध पुस्तकालयहरूको इन्ट्राभेनस इंजेक्शनद्वारा वा अघिल्लो चयन राउन्डबाट CSF बाट निकालिएको फेजको पुन: इंजेक्शनद्वारा गरिएको थियो, र त्यसपछिको फसलहरू क्रमशः १० मिनेट, ३० मिनेट, ६० मिनेट, ९० मिनेट, १२० मिनेट, १८० मिनेट, र २४० मिनेटमा गरिएको थियो। इन भिभो प्यानिङका कुल चार राउन्डहरू सञ्चालन गरिएका थिए जसमा दुई चयन गरिएका शाखाहरूलाई छनोटको पहिलो तीन राउन्डहरूमा छुट्टाछुट्टै भण्डारण र विश्लेषण गरिएको थियो। छनोटको पहिलो दुई राउन्डहरूबाट CSF बाट निकालिएका सबै फेज इन्सर्टहरू 454/Roche पाइरोसेक्वेन्सिङको अधीनमा थिए, जबकि छनोटको अन्तिम दुई राउन्डहरूबाट CSF बाट निकालिएका सबै क्लोनहरू म्यानुअल रूपमा अनुक्रमित थिए। छनोटको पहिलो राउन्डबाट सबै रगत फेजहरू पनि 454/Roche पाइरोसेक्वेन्सिङको अधीनमा थिए। फेज क्लोनको इंजेक्शनको लागि, चयन गरिएका फेजहरूलाई E. coli (BL5615) मा 500 cm2 प्लेटहरूमा 37°C मा 4 घण्टाको लागि प्रवर्द्धन गरिएको थियो। व्यक्तिगत रूपमा चयन गरिएका र म्यानुअल रूपमा अनुक्रमित क्लोनहरू TB माध्यममा प्रचार गरिएको थियो। फेज निकासी, शुद्धीकरण र एन्डोटोक्सिन हटाउने (माथि वर्णन गरिए अनुसार), 300 μl मा 2×1010 फेजहरू/जनावरलाई एउटा पुच्छर नसामा नसाबाट इंजेक्ट गरिएको थियो।
अनुक्रम डेटाको पूर्व-प्रशोधन र गुणात्मक फिल्टरिङ। कच्चा ४५४/रोचे डेटालाई विक्रेता सफ्टवेयर प्रयोग गरेर बाइनरी मानक स्ट्रिम नक्सा ढाँचा (sff) बाट पियर्सन मानव पठनीय ढाँचा (fasta) मा रूपान्तरण गरिएको थियो। न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमको थप प्रशोधन तल वर्णन गरिए अनुसार स्वामित्व C कार्यक्रमहरू र स्क्रिप्टहरू (अप्रकाशित सफ्टवेयर प्याकेज) प्रयोग गरेर गरिएको थियो। प्राथमिक डेटाको विश्लेषणमा कडा बहु-चरण फिल्टरिङ प्रक्रियाहरू समावेश छन्। वैध १२mer इन्सर्ट DNA अनुक्रम नभएका रिडहरू फिल्टर गर्न, रिडहरूलाई ग्लोबल निडलम्यान-वुनस्च परीक्षण प्रयोग गरेर स्टार्ट लेबल (GTGATGTCGGGATCCGAATTCT), स्टप लेबल (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) र ब्याकग्राउन्ड इन्सर्ट (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC) मा क्रमिक रूपमा पङ्क्तिबद्ध गरिएको थियो। पङ्क्तिबद्धताले प्रति पङ्क्तिबद्धता ३१ सम्म २ विसंगतिहरूलाई अनुमति दिन्छ। त्यसकारण, स्टार्ट र स्टप ट्यागहरू बिना पढ्ने र पृष्ठभूमि इन्सर्टहरू समावेश गर्ने पढ्ने, अर्थात्, बेमेलको अनुमति दिइएको संख्या भन्दा बढी पङ्क्तिबद्धताहरू, पुस्तकालयबाट हटाइयो। बाँकी पठनहरूको सन्दर्भमा, N-mer DNA अनुक्रम सुरु चिन्हबाट विस्तारित र अन्त्यमा रहेको स्टप चिन्हलाई मूल पठन अनुक्रमबाट निकालेर थप प्रशोधन गरिएको थियो (यसपछि "इन्सर्ट" भनिन्छ)। इन्सर्टको अनुवाद पछि, प्राइमरको ५′ छेउमा पहिलो स्टप कोडन पछिको भाग इन्सर्टबाट हटाइन्छ। थप रूपमा, प्राइमरको ३′ छेउमा अपूर्ण कोडनहरू निम्त्याउने न्यूक्लियोटाइडहरू पनि हटाइए। केवल पृष्ठभूमि अनुक्रमहरू भएको इन्सर्टहरू बहिष्कार गर्न, एमिनो एसिड ढाँचा "PAG" बाट सुरु हुने अनुवादित इन्सर्टहरू पनि हटाइए। ३ भन्दा कम एमिनो एसिडको अनुवादोत्तर लम्बाइ भएका पेप्टाइडहरू पुस्तकालयबाट हटाइए। अन्तमा, इन्सर्ट पूलमा रिडन्डन्सी हटाउनुहोस् र प्रत्येक अद्वितीय इन्सर्टको आवृत्ति निर्धारण गर्नुहोस्। यस विश्लेषणको नतिजामा न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमहरू (इन्सर्टहरू) र तिनीहरूको (पढ्ने) फ्रिक्वेन्सीहरूको सूची समावेश थियो (पूरक चित्रहरू १c र २)।
समूह N-mer DNA अनुक्रम समानताद्वारा सम्मिलित: ४५४/रोचे-विशिष्ट अनुक्रम त्रुटिहरू (जस्तै अनुक्रम होमोपोलिमर विस्तारहरूमा समस्याहरू) हटाउन र कम महत्त्वपूर्ण अनावश्यकताहरू हटाउन, पहिले फिल्टर गरिएको N-mer DNA अनुक्रम सम्मिलितहरू (सम्मिलितहरू) समानताद्वारा क्रमबद्ध गरिन्छ। सम्मिलनहरू (२ गैर-मिल्ने आधारहरू सम्म अनुमति दिइएको) निम्न रूपमा परिभाषित पुनरावृत्ति एल्गोरिथ्म प्रयोग गरेर: सम्मिलनहरू पहिले तिनीहरूको आवृत्ति (उच्चतम देखि न्यूनतम) द्वारा क्रमबद्ध गरिन्छ, र यदि तिनीहरू समान छन् भने, तिनीहरूको माध्यमिक क्रम द्वारा लम्बाइ (सबैभन्दा लामो देखि छोटो) द्वारा)। यसरी, सबैभन्दा बारम्बार र सबैभन्दा लामो सम्मिलनहरूले पहिलो "समूह" परिभाषित गर्दछ। समूह आवृत्ति कुञ्जी आवृत्तिमा सेट गरिएको छ। त्यसपछि, क्रमबद्ध सूचीमा बाँकी प्रत्येक सम्मिलनलाई जोडी अनुसार Needleman-Wunsch पङ्क्तिबद्धताद्वारा समूहमा थप्ने प्रयास गरिएको थियो। यदि पङ्क्तिबद्धतामा बेमेल, सम्मिलन, वा मेटाउने संख्या २ को थ्रेसहोल्ड भन्दा बढी छैन भने, समूहमा सम्मिलित थपिन्छ, र समग्र समूह आवृत्ति कति पटक सम्मिलित थपिएको थियो द्वारा बढाइन्छ। समूहमा थपिएका सम्मिलनहरू प्रयोग गरिएको रूपमा चिन्ह लगाइन्छ र थप प्रशोधनबाट बहिष्कृत गरिन्छ। यदि सम्मिलित अनुक्रम पहिले नै अवस्थित समूहमा थप्न सकिँदैन भने, सम्मिलित अनुक्रम उपयुक्त सम्मिलित आवृत्तिको साथ नयाँ समूह सिर्जना गर्न प्रयोग गरिन्छ र प्रयोग गरिएको रूपमा चिन्ह लगाइन्छ। पुनरावृत्ति समाप्त हुन्छ जब प्रत्येक सम्मिलित अनुक्रम या त नयाँ समूह बनाउन प्रयोग गरिन्छ वा पहिले नै अवस्थित समूहमा समावेश गर्न सकिन्छ। आखिर, न्यूक्लियोटाइडहरू मिलेर समूहबद्ध सम्मिलितहरू अन्ततः पेप्टाइड अनुक्रमहरू (पेप्टाइड पुस्तकालयहरू) मा अनुवाद गरिन्छ। यस विश्लेषणको परिणाम सम्मिलितहरूको सेट र तिनीहरूको सम्बन्धित आवृत्तिहरू हो जसले लगातार पठनहरूको संख्या बनाउँछ (पूरक चित्र २)।
मोटिफ जेनेरेसन: अद्वितीय पेप्टाइडहरूको सूचीको आधारमा, तल देखाइए अनुसार सबै सम्भावित एमिनो एसिड ढाँचाहरू (aa) समावेश गर्ने एउटा पुस्तकालय सिर्जना गरिएको थियो। लम्बाइ ३ को प्रत्येक सम्भावित ढाँचा पेप्टाइडबाट निकालिएको थियो र यसको उल्टो ढाँचा सबै ढाँचाहरू (ट्रिपेप्टाइडहरू) समावेश गर्ने साझा मोटिफ लाइब्रेरीसँगै थपिएको थियो। अत्यधिक दोहोरिने मोटिफहरूको पुस्तकालयहरू अनुक्रमित गरियो र रिडन्डन्सी हटाइयो। त्यसपछि, मोटिफ लाइब्रेरीमा प्रत्येक ट्राइपेप्टाइडको लागि, हामीले कम्प्युटेसनल उपकरणहरू प्रयोग गरेर पुस्तकालयमा यसको उपस्थितिको लागि जाँच गर्यौं। यस अवस्थामा, फेला परेको मोटिफ ट्राइपेप्टाइड भएको पेप्टाइडको फ्रिक्वेन्सी थपिएको छ र मोटिफ लाइब्रेरीमा मोटिफमा तोकिएको छ ("मोटिफहरूको संख्या")। मोटिफ जेनेरेसनको परिणाम दुई-आयामी एरे हो जसमा ट्राइपेप्टाइडहरू (मोटिफहरू) र तिनीहरूको सम्बन्धित मानहरूको सबै घटनाहरू समावेश हुन्छन्, जुन अनुक्रमण पढ्ने संख्या हो जुन पठनहरू फिल्टर, समूहबद्ध र अनुवाद गर्दा सम्बन्धित मोटिफमा परिणाम दिन्छ। माथि विस्तृत रूपमा वर्णन गरिए अनुसार मेट्रिक्स।
मोटिफहरूको संख्या र सम्बन्धित स्क्याटरप्लटहरूको सामान्यीकरण: प्रत्येक नमूनाको लागि मोटिफहरूको संख्या प्रयोग गरेर सामान्यीकृत गरिएको थियो
जहाँ ni भनेको विषय i समावेश गर्ने पठनहरूको संख्या हो। यसरी, vi ले नमूनामा मोटिफ i समावेश गर्ने पठनहरू (वा पेप्टाइडहरू) को प्रतिशत आवृत्तिलाई प्रतिनिधित्व गर्दछ। गैर-सामान्यीकृत संख्याका मोटिफहरूको लागि P-मानहरू फिशरको सटीक परीक्षण प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो। मोटिफहरूको संख्याको सहसंबंधहरूको सन्दर्भमा, स्पियरम्यानको सहसंबंधहरू R सँगको सामान्यीकृत संख्याको उद्देश्यहरू प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो।
पेप्टाइड पुस्तकालयमा प्रत्येक स्थानमा एमिनो एसिडको सामग्री कल्पना गर्न, वेब लोगोग्राम ३२, ३३ (http://weblogo.threeplusone.com) सिर्जना गरिएको थियो। पहिले, १२-मेर पेप्टाइडको प्रत्येक स्थानमा एमिनो एसिडको सामग्री २०×१२ म्याट्रिक्समा भण्डारण गरिन्छ। त्यसपछि, प्रत्येक स्थानमा समान सापेक्ष एमिनो एसिड सामग्री भएको १००० पेप्टाइडहरूको सेट फास्टा-अनुक्रम ढाँचामा उत्पन्न गरिन्छ र वेब-लोगो ३ मा इनपुटको रूपमा प्रदान गरिन्छ, जसले प्रत्येक स्थानमा सापेक्ष एमिनो एसिड सामग्रीको ग्राफिकल प्रतिनिधित्व उत्पन्न गर्दछ। दिइएको पेप्टाइड पुस्तकालयको लागि। बहुआयामिक डेटासेटहरू कल्पना गर्न, R (biosHeatmap, अझै जारी नभएको R प्याकेज) मा आन्तरिक रूपमा विकसित उपकरण प्रयोग गरेर ताप नक्साहरू सिर्जना गरिएको थियो। ताप नक्सामा प्रस्तुत गरिएका डेन्ड्रोग्रामहरू युक्लिडियन दूरी मेट्रिकको साथ वार्डको पदानुक्रमित क्लस्टरिङ विधि प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो। मोटिफ स्कोरिङ डेटाको सांख्यिकीय विश्लेषणको लागि, असामान्य स्कोरिङको लागि P मानहरू फिशरको सटीक परीक्षण प्रयोग गरेर गणना गरिएको थियो। अन्य डेटासेटहरूको लागि P-मानहरू विद्यार्थीको t-परीक्षण वा ANOVA प्रयोग गरेर R मा गणना गरिएको थियो।
चयन गरिएका फेज क्लोनहरू र इन्सर्ट्स बिनाका फेजहरूलाई पुच्छरको नसा (२×१०१० फेज/जनावर ३०० μl PBS मा) मार्फत नसामा इन्जेक्सन गरिएको थियो। पर्फ्युजन र त्यसपछिको फिक्सेसनको दस मिनेट अघि, उही जनावरहरूलाई १०० μl DyLight594-लेबल गरिएको लेक्टिन (भेक्टर ल्याबोरेटरीज इंक., DL-११७७) को नसामा इन्जेक्सन गरिएको थियो। फेज इन्जेक्सन पछि ६० मिनेट पछि, मुसाहरूलाई ५० मिलीलीटर PBS र त्यसपछि ५० मिलीलीटर ४% PFA/PBS को साथ मुटुमा पर्फ्युज गरिएको थियो। मस्तिष्कका नमूनाहरूलाई ४% PFA/PBS मा रातभरि थप गरिएको थियो र ४°C मा ३०% सुक्रोजमा रातभर भिजाइएको थियो। नमूनाहरूलाई OCT मिश्रणमा फ्ल्याश फ्रिज गरिएको छ। जमेको नमूनाहरूको इम्युनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण कोठाको तापक्रममा १% BSA ले ब्लक गरिएको ३० µm क्रायोसेक्शनहरूमा गरिएको थियो र ४ डिग्री सेल्सियसमा T7 फेज (नोभस NB ६००-३७६A) विरुद्ध पोलिक्लोनल FITC-लेबल गरिएको एन्टिबडीहरूद्वारा इन्क्युबेट गरिएको थियो। रातभर इन्क्युबेट गर्नुहोस्। अन्तमा, खण्डहरू PBS ले ३ पटक धोइयो र कन्फोकल लेजर माइक्रोस्कोप (Leica TCS SP5) ले जाँच गरियो।
९८% को न्यूनतम शुद्धता भएका सबै पेप्टाइडहरू GenScript USA द्वारा संश्लेषित गरिएको थियो, बायोटिनिलेटेड र लियोफिलाइज गरिएको थियो। बायोटिन N-टर्मिनसमा अतिरिक्त ट्रिपल ग्लाइसिन स्पेसर मार्फत बाँधिएको छ। मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोग गरेर सबै पेप्टाइडहरू जाँच गर्नुहोस्।
स्ट्रेप्टाभिडिन (सिग्मा S0677) लाई ५-गुणा समतुल्य बायोटिनाइलेटेड पेप्टाइड, बायोटिनाइलेटेड BACE1 इनहिबिटर पेप्टाइड, वा बायोटिनाइलेटेड BACE1 इनहिबिटर पेप्टाइड र BACE1 इनहिबिटर पेप्टाइडको संयोजन (३:१ अनुपात) ५-१०% DMSO/PBS मा इन्क्युबेटेडमा मिसाइएको थियो। इंजेक्शन अघि कोठाको तापक्रममा १ घण्टा। स्ट्रेप्टाभिडिन-कन्जुगेटेड पेप्टाइडहरू मस्तिष्क गुहा भएको मुसाको पुच्छरको नसा मध्ये एकमा १० मिलीग्राम/किग्राको मात्रामा नसाबाट इंजेक्शन गरिएको थियो।
स्ट्रेप्टाभिडिन-पेप्टाइड कम्प्लेक्सको सांद्रता ELISA द्वारा मूल्याङ्कन गरिएको थियो। Nunc Maxisorp माइक्रोटाइटर प्लेटहरू (सिग्मा) लाई ४°C मा १.५ μg/ml माउस एन्टी-स्ट्रेप्टाभिडिन एन्टिबडी (थर्मो, MA1-20011) ले रातभर लेपित गरिएको थियो। कोठाको तापक्रममा २ घण्टासम्म ब्लकिङ (ब्लकिङ बफर: १४० nM NaCL, ५ mM EDTA, ०.०५% NP40, ०.२५% जिलेटिन, १% BSA) गरेपछि, प्लेटलाई ०.०५% Tween-२०/PBS (वाश बफर) ले ३ सेकेन्डको लागि धुनुहोस्, CSF र प्लाज्मा नमूनाहरू ब्लकिङ बफर (प्लाज्मा १:१०,०००, CSF १:११५) ले पातलो पारिएको इनारमा थपियो। त्यसपछि प्लेटलाई ४°C मा पत्ता लगाउने एन्टिबडी (१ μg/ml, एन्टी-स्ट्रेप्टाभिडिन-HRP, Novus NB120-7239) सँग रातभर इन्क्युबेट गरिएको थियो। तीनवटा धुने चरणहरू पछि, TMB सब्सट्रेट घोल (रोचे) मा २० मिनेटसम्म इन्क्युबेशन गरेर स्ट्रेप्टाभिडिन पत्ता लाग्यो। १M H2SO4 को साथ रङ विकास रोकेपछि, ४५० nm मा अवशोषण मापन गर्नुहोस्।
स्ट्रेप्टाभिडिन-पेप्टाइड-BACE1 अवरोधक कम्प्लेक्सको कार्य Aβ(1-40) ELISA द्वारा निर्माताको प्रोटोकल (वाको, 294-64701) अनुसार मूल्याङ्कन गरिएको थियो। संक्षेपमा, CSF नमूनाहरूलाई मानक पातलो (1:23) मा पातलो पारिएको थियो र BNT77 क्याप्चर एन्टिबडीले लेपित 96-वेल प्लेटहरूमा 4°C मा रातभर इन्क्युबेट गरिएको थियो। पाँच धुने चरणहरू पछि, HRP-संयुग्मित BA27 एन्टिबडी थपिएको थियो र 4°C मा 2 घण्टाको लागि इन्क्युबेट गरिएको थियो, त्यसपछि पाँच धुने चरणहरू। कोठाको तापक्रममा 30 मिनेटको लागि TMB घोलमा इन्क्युबेट गरिएको द्वारा Aβ(1–40) पत्ता लगाइएको थियो। स्टप घोलको साथ रङ विकास रोकिएपछि, 450 nm मा अवशोषण मापन गर्नुहोस्। Aβ(1–40) ELISA अघि प्लाज्मा नमूनाहरूलाई ठोस चरण निकासीको अधीनमा राखिएको थियो। प्लाज्मालाई 96-वेल प्लेटहरूमा 0.2% DEA (सिग्मा) मा थपिएको थियो र 30 मिनेटको लागि कोठाको तापक्रममा इन्क्युबेट गरिएको थियो। SPE प्लेटहरू (Oasis, 186000679) लाई पानी र १००% मेथानोलले क्रमिक रूपमा धोएपछि, SPE प्लेटहरूमा प्लाज्मा नमूनाहरू थपियो र सबै तरल पदार्थ हटाइयो। नमूनाहरू धोइयो (पहिले ५% मेथानोल त्यसपछि ३०% मेथानोलले) र २% NH4OH/९०% मेथानोलले इल्युट गरियो। स्थिर N2 करेन्टमा ५५°C मा ९९ मिनेटको लागि इल्युएट सुकाएपछि, नमूनाहरूलाई मानक पातलो पदार्थमा घटाइयो र माथि वर्णन गरिए अनुसार Aβ(1–40) मापन गरियो।
यो लेख कसरी उद्धृत गर्ने: उरिच, ई. एट अल। भिभोमा पहिचान गरिएको ट्रान्जिट पेप्टाइडहरू प्रयोग गरेर मस्तिष्कमा कार्गो डेलिभरी। द साइन्स। ५, १४१०४; doi:१०.१०३८/srep१४१०४ (२०१५)।
लिखोटा जे., स्कजोरिन्ज टी., थोमसेन एलबी र मुस टी. लक्षित थेरापी प्रयोग गरेर मस्तिष्कमा म्याक्रोमोलेकुलर औषधिहरूको डेलिभरी। जर्नल अफ न्यूरोकेमिस्ट्री ११३, १–१३, १०.११११/j.१४७१-४१५९.२००९.०६५४४.x (२०१०)।
ब्रास्न्जेभिक, आई., स्टेनबुश, एचडब्ल्यू, स्मिट्ज, सी., र मार्टिनेज-मार्टिनेज, पी. रगत-मस्तिष्क अवरोध पार गर्दै पेप्टाइड र प्रोटिन औषधिहरूको डेलिभरी। प्रोग न्यूरोबायोल ८७, २१२–२५१, १०.१०१६/j.pneurobio.२००८.१२.००२ (२००९)।
पारड्रिज, WM रक्त-मस्तिष्क अवरोध: मस्तिष्क औषधि विकासमा एक अवरोध। NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005)।
जोहानसन, केई, डंकन, जेए, स्टोपा, ईजी, र बर्ड, ए। कोरोइड प्लेक्सस-सीएसएफ मार्ग मार्फत मस्तिष्कमा औषधि वितरण र लक्ष्यीकरणमा सुधारको सम्भावना। औषधि अनुसन्धान २२, १०११–१०३७, १०.१००७/s११०९५-००५-६०३९-० (२००५)।
पारड्रिज, WM मस्तिष्क डेलिभरीको लागि आणविक ट्रोजन घोडाहरू सहितको बायोफार्मास्युटिकल्सको आधुनिकीकरण। बायोकन्जुग केम १९, १३२७–१३३८, १०.१०२१/bc800148t (२००८)।
पारड्रिज, रगत-मस्तिष्क अवरोध पार गर्दै WM रिसेप्टर-मध्यस्थता पेप्टाइड यातायात। Endocr Rev. 7, 314–330 (1986)।
निवोहनर, जे. एट अल। मोनोभ्यालेन्ट आणविक शटलहरू प्रयोग गरेर मस्तिष्क प्रवेश र चिकित्सीय एन्टिबडीहरूको प्रभावकारिता बढाउनुहोस्। न्यूरोन ८१, ४९–६०, १०.१०१६/j.neuron.२०१३.१०.०६१ (२०१४)।
बिएन-ली, एन. एट अल। ट्रान्सफरिन रिसेप्टर (TfR) ट्रान्सपोर्टले TfR एन्टिबडीहरूको आत्मीयता भेरियन्टहरूको मस्तिष्क अपटेक निर्धारण गर्दछ। J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014)।