د Nature.com لیدلو لپاره مننه.تاسو د محدود CSS ملاتړ سره د براوزر نسخه کاروئ.د غوره تجربې لپاره، موږ وړاندیز کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ).برسېره پردې، د روان ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ څخه ښکاره کوو.
په یو وخت کې د دریو سلایډونو کاروسیل ښکاره کوي.په یو وخت کې د دریو سلایډونو له لارې حرکت کولو لپاره مخکیني او راتلونکی تڼۍ وکاروئ، یا په پای کې د سلایډ بټونو څخه کار واخلئ ترڅو په یو وخت کې درې سلایډونو ته لاړ شئ.
د وینې مغز خنډ او د وینې مغز خنډ د بایوتراپیټیک اجنټانو مخه نیسي چې په مرکزي عصبي سیسټم کې خپلو اهدافو ته ورسیږي، په دې توګه د عصبي ناروغیو مؤثره درملنې مخه نیسي.په vivo کې د نوي دماغ ټرانسپورټرونو موندلو لپاره، موږ د T7 فیز پیپټایډ کتابتون معرفي کړ او په منظم ډول یې وینه او دماغي مایع (CSF) راټول کړل چې د موږکانو د شعور لوی حوض ماډل په کارولو سره.ځانګړي فیز کلونونه د انتخاب څلور پړاوونو وروسته په CSF کې خورا بډایه شوي.د انفرادي نوماندانو پیپټایډونو ازموینې په CSF کې د 1000-fold څخه ډیر بډایه څرګنده کړه.دماغ ته د پیپټایډ منځګړیتوب رسولو بایوفعالیت د دماغي مایع کې د امیلایډ-β په کچه کې د 40٪ کمښت لخوا تایید شوی چې د BACE1 پیپټایډ مخنیوی کونکي په کارولو سره د پیژندل شوي ناول ټرانزیټ پیپټایډ سره تړاو لري.دا پایلې وړاندیز کوي چې د ویوو فیز انتخاب میتودونو لخوا پیژندل شوي پیپټایډونه ممکن د درملنې اغیزې سره دماغ ته د میکرومولکولونو سیسټمیک تحویل لپاره ګټور وسایط وي.
د مرکزي عصبي سیسټم (CNS) په نښه شوي درملنې څیړنه په پراخه کچه د مطلوب درملو او اجنټانو پیژندلو باندې تمرکز کوي چې د CNS په نښه کولو ملکیتونه ښیې، د هغه میکانیزمونو په موندلو کې لږې هڅې سره چې دماغ ته د مخدره توکو فعاله تحویل کوي.دا اوس د بدلون پیل کوي ځکه چې د مخدره توکو تحویلي ، په ځانګړي توګه لوی مالیکولونه ، د عصري نیورو ساینس درملو پراختیا لازمي برخه ده.د مرکزي عصبي سیسټم چاپیریال د دماغي خنډ سیسټم لخوا ښه ساتل کیږي، چې د وینې دماغ خنډ (BBB) ​​او د وینې دماغ خنډ (BCBB) 1 لري، دماغ ته د مخدره توکو رسولو لپاره ننګونې کوي 1,2.اټکل کیږي چې نږدې ټول لوی مالیکول درمل او له 98٪ څخه ډیر کوچني مالیکول درمل د مغز څخه له مینځه وړل کیږي.له همدې امله دا خورا مهم دي چې د نوي دماغ ټرانسپورټ سیسټمونه وپیژني کوم چې CNS 4,5 ته د معالجوي درملو مؤثره او ځانګړي تحویل چمتو کوي.په هرصورت، BBB او BCSFB د مخدره توکو رسولو لپاره یو ښه فرصت هم وړاندې کوي ځکه چې دوی د خپل پراخ ویسکولیچر له لارې د دماغ ټولو جوړښتونو ته ننوځي او ننوځي.په دې توګه، دماغ ته د رسولو غیر انتفاعي میتودونو کارولو لپاره اوسنۍ هڅې په لویه کچه د BBB6 ریسیپټر په کارولو سره د ریسیپټر - منځګړیتوب ټرانسپورټ (PMT) میکانیزم پراساس دي.د لیږدونې ریسیپټر لارې 7,8 په کارولو سره د وروستي کلیدي پرمختګونو سره سره ، د ښه ملکیتونو سره د تحویلي نوي سیسټمونو نور پراختیا ته اړتیا ده.د دې پای ته رسولو لپاره، زموږ هدف د پیپټایډونو پیژندل و چې د CSF ټرانسپورټ منځګړیتوب کولو توان لري، ځکه چې دوی په اصل کې CNS ته د میکرومولکولونو رسولو یا د نوي ریسیپټرو لارو خلاصولو لپاره کارول کیدی شي.په ځانګړې توګه، د دماغي سیسټم ځانګړي رسیدونکي او لیږدونکي (BBB او BSCFB) کولی شي د بایوتراپیوټیک درملو فعال او ځانګړي تحویل لپاره د احتمالي اهدافو په توګه خدمت وکړي.Cerebrospinal fluid (CSF) د choroid plexus (CS) secretory محصول دی او د subarachnoid space او ventricular space4 له لارې د مغز د انټرسټیټیل مایع سره په مستقیم تماس کې دی.په دې وروستیو کې دا وښودل شوه چې subarachnoid cerebrospinal مایع په ډیره اندازه د مغز په انترستیتیم کې خپریږي 9.موږ هیله لرو چې د دې subarachnoid د انفلو ټراکټ یا مستقیم د BBB له لارې د parenchymal ځای ته لاسرسی ومومئ.د دې ترلاسه کولو لپاره، موږ د ویوو فیز انتخاب ستراتیژۍ کې یو پیاوړی پلي کړ چې په مثالي توګه د دې دوو جلا لارو څخه لیږدول شوي پیپټایډونه پیژني.
موږ اوس د vivo Phage ښودنې سکرینینګ میتود کې د CSF نمونې سره یو ترتیب بیان کوو چې د لوړ تروپوټ ترتیب (HTS) سره یوځای د خورا لوړ کتابتون تنوع سره د لومړني انتخاب دورې نظارت کوي.سکرینینګ په هوښیار موږکانو کې د دایمي نصب شوي لوی سیسټرنا (CM) کانولا سره ترسره شوی ترڅو د وینې ککړتیا مخه ونیسي.په مهمه توګه، دا طریقه د دماغ په نښه کول او پیپټایډونه دواړه د دماغي خنډ په اوږدو کې د ټرانسپورټ فعالیت سره غوره کوي.موږ د T7 فاجز د دوی د کوچنۍ اندازې (~ 60 nm) 10 له امله کارولي او وړاندیز یې کړی چې دوی د ویسیکلونو ټرانسپورټ لپاره مناسب دي چې د اندوتیلیل او/یا اپیتیلیل - میډولا خنډ ټرانسلولر تیریدو ته اجازه ورکوي.د پیننګ څلور پړاوونو وروسته، د فیز نفوس جلا شوي وو چې د vivo CSF ​​بډایه کولو او دماغي مایکروویسل ایسوسی ایشن کې قوي ښودل شوي.په مهمه توګه، موږ وکولای شو چې خپلې موندنې د دې په ښودلو سره تایید کړو چې غوره او کیمیاوي ترکیب شوي غوره نوماند پیپټایډونه د دې وړتیا لري چې د پروټین کارګو د دماغي مایع ته انتقال کړي.لومړی، د CNS فارماکوډینامیک اغیزې د BACE1 پیپټایډ مخنیوی کونکي سره د مخکښ ټرانزیټ پیپټایډ سره یوځای کولو سره رامینځته شوي.د دې ښودلو سربیره چې د Vivo فعال سکرینینګ ستراتیژیو کې کولی شي د نوي دماغ ټرانسپورټ پیپټایډونه د مؤثره پروټین کارګو کیریر په توګه وپیژني ، موږ تمه لرو چې ورته فعال انتخابي کړنلارې هم د ناول دماغ ټرانسپورټ لارو پیژندلو کې مهم شي.
د تختې جوړونې واحدونو (PFU) پراساس، د فیز بسته بندۍ مرحلې وروسته، د تصادفي 12-mer خطي T7 فیز پیپټایډونو کتابتون د شاوخوا 109 تنوع سره ډیزاین او رامینځته شوی (د موادو او میتودونو وګورئ).دا مهمه ده چې په یاد ولرئ چې موږ دا کتابتون مخکې له دې چې په ویوو پینینګ کې په دقت سره تحلیل کړو.د PCR د فیز کتابتون نمونو پراخول د ترمیم شوي پریمرونو په کارولو سره رامینځته شوي امپلیکونونه چې په مستقیم ډول د HTS لپاره پلي کیږي (اضافی شکل 1a).د الف) د HTS11 ترتیب کولو تېروتنې له امله، ب) د پرائمر کیفیت باندې اغیزه (NNK) 1-12، او c) په سټینډ بای کتابتون کې د وحشي ډوله (wt) فیز (سکلیټون انسرټونو) شتون، د ترتیب فلټر کولو پروسیجر پلي شوی ترڅو یوازې د تایید شوي ترتیب ترتیب معلومات استخراج کړي.دا د فلټر مرحلې په ټولو HTS ترتیب کولو کتابتونونو کې پلي کیږي.د معیاري کتابتون لپاره، په ټولیز ډول 233,868 لوستل شوي، چې 39٪ یې د فلټر معیارونو څخه تېر شوي او د کتابتون تحلیل او د راتلونکو پړاوونو لپاره انتخاب لپاره کارول شوي (اضافی شکل 1c-e).لوستونه په عمده توګه د 3 بیس جوړه په اوږدوالي کې ضربان وو چې د 36 نیوکلیوټایډونو لوړوالی سره (اضافي شکل. 1c)، د کتابتون ډیزاین (NNK) 1-12 تاییدوي.د پام وړ، د کتابتون نږدې 11٪ غړو کې د 12 ابعادي وحشي ډول (wt) بیکبون PAGISRELVDKL داخل کول شامل دي، او نږدې نیمایي ترتیبونه (49٪) شاملول یا حذف کول شامل دي.د کتابتون HTS په کتابتون کې د پیپټایډونو لوړ تنوع تایید کړ: له 81٪ څخه ډیر پیپټایډونه یوازې یو ځل موندل شوي او یوازې 1.5٪ په ≥4 کاپيونو کې پیښ شوي (اضافی شکل 2a).د امینو اسیدونو فریکونسۍ په ریپرټویر کې په ټولو 12 موقعیتونو کې د کوډونونو شمیر لپاره تمه شوي فریکونسۍ سره ښه اړیکه لري چې د تخریب شوي NKK ریپرټویر لخوا رامینځته شوي (اضافي شکل. 2b).د AA د پاتې شونو مشاهده شوي فریکونسۍ د دې داخلونو لخوا کوډ شوي د محاسبې فریکونسۍ (r = 0.893) سره ښه اړیکه لري (اضافی شکل. 2c).د انجیکشن لپاره د فیز کتابتونونو چمتو کول د انډوټوکسین د لوړولو او لرې کولو مرحلې شاملې دي.دا دمخه ښودل شوي چې په احتمالي توګه د فیز کتابتونونو تنوع کم کړي 12,13.له همدې امله، موږ د پلیټ - پراخ شوي فیز کتابتون ترتیب کړ چې د انډوټوکسین لرې کولو څخه تیر شوی و او د AA فریکونسۍ اټکل کولو لپاره یې د اصلي کتابتون سره پرتله کړ.یو قوي اړیکه (r = 0.995) د اصلي حوض او پراخ شوي او پاک شوي حوض (اضافي شکل. 2d) تر مینځ لیدل شوی، دا په ګوته کوي چې د T7 فیز په کارولو سره په پلیټونو کې پراخ شوي کلونونو ترمنځ سیالي د لوی تعصب لامل نه و.دا پرتله کول په هر کتابتون کې د ټرایپټایډ شکلونو فریکونسۍ پراساس دي ، ځکه چې د کتابتونونو تنوع (~ 109) حتی د HTS سره په بشپړ ډول نیول کیدی نشي.په هر موقعیت کې د AA فریکونسۍ تحلیل د ننوتلو ریپرټویر په وروستیو دریو پوستونو کې یو کوچنی موقعیت پورې تړلی تعصب څرګند کړ (اضافی شکل 2e).په پایله کې، موږ دې پایلې ته ورسیدو چې د کتابتون کیفیت او تنوع د منلو وړ و او یوازې د تنوع کې لږ بدلونونه د انتخاب د څو پړاوونو ترمنځ د فیز کتابتونونو د پراخولو او چمتو کولو له امله لیدل شوي.
د سیریبروسپینل مایع نمونه اخیستل د جراحی په واسطه د هوښیار موږکانو سی ایم ته د کینول په نصبولو سره ترسره کیدی شي ترڅو د BBB او/یا BCSFB (Fig. 1a-b) له لارې په رګونو کې د T7 فیز انجیکشن (iv) پیژندل اسانه کړي.موږ د vivo انتخاب په لومړیو دریو پړاوونو کې دوه خپلواکه انتخابي وسلې (A and B وسلې) وکارولې (شکل 1c).موږ په تدریجي ډول د انتخاب سختوالی د انتخاب په لومړیو دریو پړاوونو کې د معرفي شوي فیز ټول مقدار کمولو سره ډیر کړ.د پیننګ د څلورم پړاو لپاره، موږ د څانګو A او B نمونې سره یوځای کړل او درې اضافي خپلواک انتخابونه مو ترسره کړل.په دې ماډل کې د T7 فیز ذرات د vivo ملکیتونو مطالعې لپاره، وحشي ډوله فیز (PAGISRELVDKL ماسټر داخل) موږکانو ته د لکۍ رګ له لارې داخل شو.په مختلفو وختونو کې د دماغي مایعاتو او وینې څخه د پړاوونو بیا رغونه وښودله چې نسبتا کوچني T7 icosahedral پړاوونه د وینې له برخې څخه د چټک ابتدايي تصفیې مرحله درلوده (اضافی شکل 3).د اداره شوي ټایټرونو او موږکانو د وینې حجم پراساس ، موږ محاسبه کړې چې یوازې نږدې 1٪ wt.د اداره شوي دوز څخه فیز د رګونو انجیکشن څخه 10 دقیقې وروسته په وینه کې کشف شو.د دې لومړني چټک کمښت وروسته، یو ورو ابتدايي تصفیه د 27.7 دقیقو نیم ژوند سره اندازه شوې.په مهمه توګه، د CSF کمپارټمینټ څخه یوازې ډیر لږ مرحلې ترلاسه شوي، چې د CSF برخې ته د وحشي ډوله فیز مهاجرت لپاره ټیټ شالید ښیي (اضافی شکل. 3).په اوسط ډول، یوازې په وینه کې د T7 فیز شاوخوا 1 x 10-3٪ ټایټرز او د 4 x 10-8٪ ابتدايي انفیوژن فیزونه د نمونې اخیستلو په ټوله دوره کې (0-250 دقیقې) کې د دماغي مایع کې کشف شوي.د پام وړ، په دماغي مایع کې د وحشي ډوله فیز نیم ژوند (25.7 دقیقې) په وینه کې لیدل شوي ورته ورته و.دا ډاټا ښیي چې د وینې څخه د CSF کمپارټمینټ جلا کولو خنډ د CM-cannulated موږکونو کې پاتې دی، د فیز کتابتونونو vivo انتخاب کې اجازه ورکوي چې کلونونه وپیژني کوم چې په اسانۍ سره د وینې څخه CSF کمپارټمنټ ته لیږدول کیږي.
(a) د لوی حوض څخه د دماغي مایع (CSF) د بیا نمونې لپاره د میتود ترتیب کول.(b) ډیاګرام د مرکزي عصبي سیسټم (CNS) خنډ سیلولر موقعیت ښیې او د انتخاب ستراتیژي د پیپټایډونو پیژندلو لپاره کارول کیږي چې د وینې دماغ خنډ (BBB) ​​او د وینې دماغ خنډ څخه تیریږي.(c) په ویوو فیج کې د سکرینینګ فلو چارټ.د انتخاب په هر پړاو کې، فیزونه (د تیرونو دننه د څارویو پیژندونکي) د رګونو له لارې انجیکشن شوي.دوه خپلواک بدیل څانګې (A، B) د انتخاب څلورم پړاو پورې په جلا توګه ساتل کیږي.د انتخاب پړاوونو 3 او 4 لپاره، هر فیز کلون چې د CSF څخه استخراج شوی په لاسي ډول ترتیب شوی و.(d) د فیز کینیټیکونه د T7 پیپټایډ کتابتون (2 x 1012 فاجز/حیواناتو) د رګونو انجیکشن وروسته په دوه کینول شوي موږکونو کې د انتخاب په لومړي پړاو کې د وینې (سرې حلقې) او دماغي مایع (شنه مثلث) څخه جلا شوي.نیلي مربع په وینه کې د فیز اوسط لومړني غلظت په ګوته کوي ، د انجیکشن شوي فیز مقدار څخه محاسبه کیږي ، د وینې ټول حجم په پام کې نیولو سره.تور مربع د y کرښې د تقاطع نقطه په ګوته کوي چې د وینې د فیز غلظت څخه اختصاص شوي.(e،f) په پیپټایډ کې موندل شوي د ټولو ممکنه اوورلیپینګ ټریپټایډ شکلونو نسبي فریکونسۍ او توزیع وړاندې کړئ.په 1000 لوستلو کې موندل شوي شکلونه ښودل شوي.د پام وړ (p <0.001) بډایه شوي شکلونه د سور نقطو سره نښه شوي.(e) ارتباط scatterplot د انجیکشن شوي کتابتون د ټرایپټایډ شکل نسبي فریکونسۍ پرتله کول د حیواناتو #1.1 او #1.2 څخه د وینې اخیستل شوي فیز سره.(f) د ارتباط سکریټرپلوټ د حیواناتو د فاج ټرایپټایډ موټیف #1.1 او #1.2 په وینه او دماغي مایع کې جلا شوي نسبي فریکونسۍ پرتله کوي.(g, h) په دواړو حیواناتو کې د vivo انتخاب د دورې وروسته په وینه کې د بډایه شوي فیز (g) په مقابل کې د انجیکشن شوي کتابتونونو او په CSF (h) کې د وینې په مقابل کې د بډایه شوي فیز د ترتیب ID نمایش.د یو لیک کوډ اندازه دا په ګوته کوي چې څومره امینو اسید په دې موقعیت کې واقع کیږي.شنه = قطبي، ارغواني = بې طرفه، نیلي = بنسټیز، سور = تیزابي او تور = هایدروفوبیک امینو اسیدونه.شکل 1a، b د اډوارډ یوریچ لخوا ډیزاین او تولید شوی.
موږ د فیج پیپټایډ کتابتون په دوه CM وسیلو موږکونو (کلیډز A او B) کې انجیکشن کړ او د دماغي مایع او وینې څخه جلا شوي فاج (شکل 1d).د کتابتون لومړنۍ چټک پاکوالی د وحشي ډوله فیز په پرتله لږ څرګند و.په دواړو حیواناتو کې د انجیکشن شوي کتابتون نیم ژوند په وینه کې 24.8 دقیقې و ، د وحشي ډوله فیج په څیر ، او په CSF کې 38.5 دقیقې.د هر څاروي څخه د وینې او دماغي مایع فیز نمونې د HTS سره مخ شوي او ټول پیژندل شوي پیپټایډونه د لنډ ټرایپټایډ شکل شتون لپاره تحلیل شوي.د ټریپټایډ شکلونه غوره شوي ځکه چې دوی د جوړښت جوړولو او پیپټایډ - پروټین تعاملاتو لپاره لږترلږه اساس چمتو کوي 14,15.موږ د انجکشن شوي فیز کتابتون او د دواړو حیواناتو له وینې څخه ایستل شوي کلونونو ترمنځ د شکلونو په ویش کې ښه اړیکه وموندله (انځور 1e).معلومات په ګوته کوي چې د کتابتون جوړښت یوازې د وینې په خونه کې لږ څه بډایه شوی.د امینو اسید فریکونسۍ او د توافق سلسله په هر موقف کې د Weblogo16 سافټویر د تطبیق په کارولو سره نور تحلیل شوي.په زړه پورې خبره دا ده چې موږ د وینې ګلیسین پاتې شونو کې قوي بډایه وموندله (انځور 1g).کله چې وینه د CSF څخه غوره شوي کلونونو سره پرتله شوه، قوي انتخاب او د محرکونو ځینې تخریب لیدل شوي (انځور 1f)، او ځینې امینو اسیدونه په غوره توګه په 12-غړو (انځور 1h) کې مخکې ټاکل شوي موقعیت کې شتون درلود.د پام وړ، انفرادي حیوانات د دماغي مایع په برخه کې د پام وړ توپیر درلود، پداسې حال کې چې په دواړو حیواناتو کې د وینې ګلیسین غني کول لیدل شوي (اضافي شکل. 4a-j).د حیواناتو # 1.1 او # 1.2 په دماغي مایع کې د ترتیب ډیټا د سخت فلټر کولو وروسته، په ټولیز ډول 964 او 420 ځانګړي 12-میر پیپټایډونه ترلاسه شوي (اضافي شکل. 1d-e).جلا شوي فیز کلونونه پراخ شوي او د ویوو انتخاب دوهم پړاو ته رسیدلي.د انتخاب له دوهم پړاو څخه را ایستل شوي فیز په هر حیوان کې د HTS تابع شوي او ټول پیژندل شوي پیپټایډونه د موټیف پیژندنې برنامې کې د ان پټ په توګه کارول شوي ترڅو د ټرایپټایډ شکلونو پیښې تحلیل کړي (انځور 2a, b, ef).د CSF څخه د ترلاسه شوي پړاو د لومړي دورې په پرتله، موږ په CSF کې د A او B په څانګو کې د ډیری موټیفونو نور انتخاب او غیر انتخاب لیدلی (2 انځور).د شبکې پیژندنې الګوریتم پلي شوی و ترڅو معلومه کړي چې ایا دوی د دوامداره ترتیب مختلف نمونې استازیتوب کوي.د CSF لخوا په بدیل کلیډ A (انځور 2c، d) او کلیډ B (انځور 2g، h) کې د 12 اړخیز ترتیبونو تر مینځ روښانه ورته والی لیدل شوی.په هره څانګه کې راټول شوي تحلیل د 12-mer پیپټایډونو لپاره مختلف انتخاب پروفایلونه په ګوته کړل (اضافی شکل. 5c،d) او د وخت په تیریدو سره د CSF/بلډ ټایټر تناسب کې زیاتوالی د انتخاب دوهم پړاو وروسته د انتخاب د لومړي پړاو په پرتله (اضافی شکل 5e).).
په دماغي مایع کې د موټیفونو او پیپټایډونو بډایه کول د دوه پرله پسې پړاوونو په واسطه د vivo فنکشنل فیز ډیسپلی انتخاب.
د هر حیوان د لومړي پړاو څخه د دماغي نخاعي مایع پړاوونه ترلاسه شوي (حیوانات # 1.1 او # 1.2) راټول شوي، پراخ شوي، HT- ترتیب شوي او یوځای شوي (2 x 1010 phages/حیوان) 2 SM کینول شوي موږکان (#1.1 → #).2.1 او 2.2، 1.2 → 2.3 او 2.4).(a,b,e,f) په لومړي او دوهم انتخاب پړاوونو کې د ټولو CSF څخه ترلاسه شوي پړاوونو د ټرایپټایډ شکلونو نسبي فریکونسۍ پرتله کولو سره د ارتباط سکریټ پلاټ.نسبي فریکونسۍ او د موټیفونو توزیع چې د ټولو احتمالي اوورلاپینګ ټریپټایډونو نمایندګي کوي په دواړو لورو کې پیپټایډونو کې موندل شوي.په 1000 لوستلو کې موندل شوي شکلونه ښودل شوي.هغه موټیفونه چې د پام وړ (p <0.001) په یوه پرتله شوي کتابتون کې غوره شوي یا خارج شوي د سور نقطو سره روښانه شوي.(c, d, g, h) د ټول CSF بډایه 12 امینو اسید اوږد ترتیبونو د ترتیب لوګو نمایش د vivo انتخاب کې د 2 او 1 دورې پراساس.د یو لیک کوډ اندازه دا په ګوته کوي چې څومره امینو اسید په دې موقعیت کې واقع کیږي.د لوګو د نمایندګۍ لپاره، د CSF د ترتیبونو فریکوینسي چې د انفرادي څارویو څخه د دوه انتخابي پړاوونو ترمنځ استخراج شوي پرتله کیږي او په دویم پړاو کې بډایه شوي ترتیبونه ښودل شوي: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 او (h) #1.2–#2.په (c, d) حیواناتو کې په یو ټاکل شوي موقعیت کې ترټولو بډایه شوي امینو اسیدونه.2.1 او نه.2.2 یا (g,h) په حیواناتو نمبر.2.3 او نه.2.4 په رنګ کې ښودل شوي.شنه = قطبي، ارغواني = بې طرفه، نیلي = بنسټیز، سور = تیزابي او تور = هایدروفوبیک امینو اسیدونه.
د دریم پړاو انتخاب څخه وروسته، موږ د 332 CSF-بیا جوړ شوي فیز کلونونو څخه 124 ځانګړي پیپټایډ سلسلې (#3.1 او #3.2) په ګوته کړې چې له دوه څارویو څخه جلا شوي دي (اضافی شکل 6a).ترتیب LGSVS (18.7٪) ترټولو لوړ نسب تناسب درلود، ورپسې د وحشي ډوله داخلونو PAGISRELVDKL (8.2٪)، MRWFFSHASQGR (3٪)، DVAKVS (3٪)، TWLFSLG (2.2٪)، او SARGSWREIVSLS (2.2٪).په وروستي څلورم پړاو کې، موږ د دریو جلا څارویو څخه دوه خپلواکه غوره شوي څانګې راټولې کړې (انځور 1c).د 925 ترتیب شوي فیز کلونونو څخه چې د CSF څخه ترلاسه شوي، په څلورم پړاو کې موږ 64 ځانګړي پیپټایډ سلسلې وموندلې (اضافي شکل. 6b)، چې په منځ کې یې د وحشي ډوله فیز نسبي تناسب 0.8٪ ته راټیټ شو.په څلورم پړاو کې تر ټولو عام CSF کلونونه LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18٪)، LGSVS (17٪)، GFVRFRLSNTR (14٪)، KVAWRVFSLFWK (7٪)، SVHGV (5٪)، GRPQKINGARVC (3.6٪)، GRPQKINGARVC (3.6٪)، %SSDRL2) وو.%)).د ټاکل شوي پیپټایډونو اوږدوالی د کتابتون پرائمرونو کې د نیوکلیوټایډ داخلولو/حذفولو یا د وخت څخه دمخه سټاپ کوډونونو له امله دی کله چې د NNK کتابتون ډیزاین لپاره تخریب شوي کوډون کاروي.د وخت دمخه بند کوډون لنډ پیپټایډونه تولیدوي او غوره شوي ځکه چې دوی د مناسب AA شکل لري.اوږده پیپټایډونه کیدای شي د مصنوعي کتابتونونو په پرائمرونو کې د داخلیدو / حذف کیدو پایله ولري.دا ډیزاین شوی سټاپ کوډون د چوکاټ څخه بهر ځای په ځای کوي او تر هغه وخته پورې یې لوستل کوي تر څو چې نوی سټاپ کوډون لاندې راڅرګند شي.په عموم کې، موږ د ټولو څلورو انتخابونو پړاوونو لپاره د بډایه کولو فکتورونه د نمونې محصول ډاټا سره پرتله کولو سره محاسبه کړل.د سکرینینګ د لومړي پړاو لپاره، موږ د غیر مشخص شالید حوالې په توګه د وحشي ډوله فیز ټایټرونه کارولي.په زړه پورې خبره دا ده چې د منفي فیز انتخاب په لومړي CSF دوره کې خورا پیاوړی و، مګر په وینه کې نه و (انځور 3a)، کوم چې کیدای شي د پیپټایډ کتابتون د ډیرو غړو د غیر فعال خپریدو احتمال د CSF برخې ته د کم احتمال له امله وي یا اړونده فیزونه د باکتریو په پرتله د وینې جریان څخه ډیر اغیزمن ساتل کیږي یا لرې کیږي.په هرصورت، د پیننګ په دوهم پړاو کې، په CSF کې د پړاوونو قوي انتخاب په دواړو کلیډونو کې لیدل شوی، دا وړاندیز کوي چې مخکینۍ دورې په هغو مرحلو کې بډایه شوي چې د پیپټایډونو ښکارندوی کوي چې د CSF پورته کولو ته وده ورکوي (انځور 3a).یوځل بیا ، د وینې د پام وړ بډایه کولو پرته.همدارنګه په دریم او څلورم پړاو کې، د فیز کلونونه په CSF کې د پام وړ بډایه شوي.د انتخاب د وروستیو دوو پړاوونو تر منځ د هر ځانګړي پیپټایډ سلسلې نسبي فریکونسۍ پرتله کول، موږ وموندله چې د انتخاب په څلورم پړاو کې ترتیبونه نور هم بډایه شوي (انځور 3b).ټول ټال 931 ټریپټایډ شکلونه د ټولو 64 ځانګړي پیپټایډ ترتیبونو څخه د دواړه پیپټایډ سمتونو په کارولو سره ایستل شوي.په څلورم پړاو کې خورا بډایه شوي شکلونه د انجیکشن شوي کتابتون (کټ آف: 10٪ بډایه کولو) په پرتله په ټولو پړاوونو کې د دوی د بډایه کولو پروفایلونو لپاره ډیر نږدې معاینه شوي (اضافی شکل. 6c).د انتخاب عمومي نمونې وښودله چې ډیری مطالعه شوي انګیزې د دواړو انتخابي څانګو په ټولو پخوانیو پړاوونو کې بډایه شوي.په هرصورت، ځینې شکلونه (د بیلګې په توګه SGL، VSG، LGS GSV) په عمده توګه د بدیل کلاډ A څخه وو، پداسې حال کې چې نور (د بیلګې په توګه FGW، RTN، WGF، NTR) په بدیل کلاډ B کې بډایه شوي.
د CSF د بډایه شوي فیز - ښودل شوي پیپټایډونو او بایوټینیل شوي لیډر پیپټایډونو د CSF ټرانسپورټ اعتبار د سټریپټاویډین پیلوډونو سره یوځای شوی.
(a) د بډایه کولو تناسب په ټولو څلورو پړاوونو کې محاسبه شوي (R1-R4) د انجیکشن (input = I) فیز (PFU) ټایټرونو او ټاکل شوي CSF فیز ټایټرونو (آؤټ پټ = O) پراساس.د تیرو دریو پړاوونو (R2-R4) لپاره د غني کولو فکتورونه د تیر پړاو او لومړي پړاو (R1) سره د وزن ډیټا سره پرتله شوي.خلاص بارونه د دماغي مایع دي، سیوري شوي بارونه پلازما دي.(***p <0.001، د زده کوونکو د ټیسټ پر بنسټ).(b) د خورا بډایه فیز پیپټایډونو لیست، د دوی د نسبي تناسب له مخې په CSF کې د 4 پړاو انتخاب وروسته راټول شوي.شپږ خورا عام فیز کلونونه په رنګ، شمیره او د دوی د غني کولو فکتورونو د انتخاب د 3 او 4 پړاوونو (انسیټونو) ترمنځ روښانه شوي.(c،d) د څلورم پړاو څخه شپږ خورا بډایه شوي فیز کلونونه، خالي فیز او د والدینو فیز پیپټایډ کتابتونونه په انفرادي ډول د CSF نمونې کولو ماډل کې تحلیل شوي.CSF او د وینې نمونې په ټاکل شوي وخت کې راټول شوي.(c) په مساوي مقدار کې د 6 امیدوار فیز کلونونه (2 x 1010 فیز/حیوانات)، خالي فیزونه (#1779) (2 x 1010 فیز/حیوانات) او د سټاک فیز پیپټایډ کتابتونونه (2 x 1012 فیزونه/حیوانات) لږ تر لږه د 3 CM په ذریعه د حیواناتو د پوستکي په جلا توګه تنظیم کیدی شي.د وخت په تیریدو سره د هر انجیکشن شوي فیز کلون او فیج پیپټایډ کتابتون CSF فارماکوکینیټکس ښودل شوي.(d) د نمونې اخیستلو په وخت کې د ټولو ترلاسه شویو فیزونو/mL لپاره اوسط CSF/د وینې تناسب ښیي.(e) څلور مصنوعي لیډر پیپټایډونه او یو سکرمبل شوی کنټرول د بایوټین سره سټریپټاویډین سره د دوی د N-ټرمینس (ټیټرامر ډیسپلی) له لارې وصل شوی و وروسته د انجیکشن (د دم رګ iv، 10 ملی ګرامه سټریپټاویډین/کیلوګرام).لږ ترلږه درې انټیوب شوي موږکان (N = 3).).د CSF نمونې په ټاکل شوي وخت کې راټول شوي او د سټریپټاویډین غلظت د CSF ضد سټریپټاویډین ELISA (nd = نه کشف شوی) لخوا اندازه شوی.(*p <0.05، **p <0.01، ***p <0.001، د ANOVA ازموینې پر بنسټ).(f) د خورا غني شوي فیز پیپټایډ کلون #2002 (جامني) د امینو اسید سلسلې پرتله کول د انتخاب له څلورم پړاو څخه د نورو غوره شوي فیز پیپټایډ کلونونو سره.ورته او ورته امینو اسید ټوټې د رنګ کوډ شوي دي.
په څلورم پړاو کې د ټولو بډایه شویو مرحلو څخه (3b انځور)، د کاندیدانو شپږ کلونونه د CSF نمونې کولو ماډل کې د نورو انفرادي تحلیلونو لپاره غوره شوي.په مساوي مقدار کې شپږ امیدواره فیز، خالي فیز (نه داخلول) او د پروفیج پیپټایډ کتابتونونه په دریو کینول شوي CM حیواناتو کې انجیکشن شوي، او فارماکوکینیټکس په CSF (انځور 3c) او وینې (اضافی شکل 7) تشخیص کې ټاکل شوي.ټول فیز کلون ازمویل شوي د CSF کمپارټمینټ په نښه شوي د خالي کنټرول فیز (#1779) په پرتله 10-1000 ځله لوړ.د مثال په توګه، کلون #2020 او #2077 د کنټرول فیج په پرتله شاوخوا 1000 ځله لوړ CSF ټایټرونه درلودل.د هر ټاکل شوي پیپټایډ فارماکوکینټیک پروفایل توپیر لري، مګر دا ټول د لوړ CSF کور کولو وړتیا لري.موږ د وخت په تیریدو سره د #1903 او #2011 کلونونو لپاره دوامداره کمښت ولید، پداسې حال کې چې د کلون #2077، #2002 او #2009 لپاره په لومړیو 10 دقیقو کې زیاتوالی ممکن فعال ټرانسپورټ په ګوته کړي مګر تایید ته اړتیا لري.کلون #2020، #2002، او #2077 په لوړه کچه ثبات لري، پداسې حال کې چې د کلون #2009 CSF غلظت د لومړني زیاتوالي وروسته ورو ورو کم شوی.بیا موږ د هر CSF کاندید نسبي فریکونسۍ د هغې د وینې غلظت سره پرتله کوو (انځور 3d).د هر CSF کاندید د وینې ټایټر سره د نمونې اخیستنې په ټولو وختونو کې د اوسط ټایټر تړاو ښودلې چې له شپږو نوماندانو څخه درې یې د وینې CSF کې د پام وړ بډایه شوي.په زړه پورې خبره، کلون #2077 د وینې لوړ ثبات ښودلی (اضافی شکل 7).د دې لپاره چې تایید شي چې پیپټایډونه پخپله د دې وړتیا لري چې په فعاله توګه د CSF برخې ته د فزیک ذرات پرته نور کارګو لیږد کړي، موږ څلور لیډر پیپټایډونه ترکیب کړل چې د بایوټین سره اخستل شوي په N-ټرمینس کې چیرې چې پیپټایډونه د فیز ذرات سره نښلوي.بایوټینیل شوي پیپټایډونه (نمبر 2002، 2009، 2020 او 2077) د سټریپټاویډین (SA) سره یوځای شوي ترڅو څو اړخیزه شکلونه ترلاسه کړي چې یو څه د فیز جیومیټري نقل کوي.دې بڼه موږ ته اجازه راکړه چې په وینه او دماغي مایع کې د کارګو لیږدونکي پروټین پیپټایډونو په توګه د SA افشا کولو اندازه وکړو.په مهمه توګه، د فیز ډیټا اکثرا بیا تولید کیدی شي کله چې مصنوعي پیپټایډونه په دې SA-conjugated بڼه کې اداره شوي (انځور 3e).سکرمبل شوي پیپټایډونه لږ ابتدايي افشا کول او د 48 ساعتونو په اوږدو کې د نه پیژندل شوي کچې سره ګړندي CSF پاکول درلودل.د CSF ځای ته د دې پیپټایډ فیز کلونونو د تحویلي لارو په اړه بصیرت ترلاسه کولو لپاره ، موږ د امیونوهیسټ کیمیا (IHC) په کارولو سره د انفرادي فیز پیپټایډ هیټونو ځایی کول تحلیل کړل ترڅو په مستقیم ډول په ویوو کې د رګونو انجیکشن 1 ساعت وروسته د فیز ذرات کشف کړي.د پام وړ، کلون #2002، #2077، او #2009 د دماغ په کیپلیرونو کې د قوي داغونو په واسطه کشف کیدی شي، پداسې حال کې چې د کنټرول فیز (#1779) او کلون #2020 ندي کشف شوي (اضافی شکل 8).دا وړاندیز کوي چې دا پیپټایډونه په دقیق ډول د BBB په تیریدو سره په دماغ باندې تاثیر کې مرسته کوي.د دې فرضیې د ازموینې لپاره نور تفصیلي تحلیل ته اړتیا ده، ځکه چې د BSCFB لاره هم ښکیل کیدی شي.کله چې د خورا غني شوي کلون (#2002) د امینو اسید سلسله د نورو غوره شوي پیپټایډونو سره پرتله کړئ، نو یادونه وشوه چې ځینې یې ورته امینو اسید توسیعونه لري، کوم چې ممکن ورته ټرانسپورټ میکانیزم په ګوته کړي (انځور 3f).
د خپل ځانګړي پلازما پروفایل او د وخت په تیریدو سره په CSF کې د پام وړ زیاتوالي له امله، د فیج ډیسپلی کلون #2077 د 48-ساعت په اوږده موده کې نور هم وڅیړل شو او د دې توان درلود چې د CSF د ګړندۍ زیاتوالی بیا تولید کړي چې د دوامدار SA کچې سره په اړیکه کې لیدل شوي (انځور 4a).د نورو پیژندل شویو فیز کلونونو په اړه، #2077 د دماغ کیپلیرونو لپاره په کلکه داغ شوي او د کیپیلري مارکر لیکټین سره د پام وړ راټولول ښودل شوي کله چې په لوړ ریزولوشن کې لیدل کیږي او ممکن د پارینچیمل ځای کې ځینې داغونه (شکل 4b).د دې لپاره چې وڅیړل شي چې آیا د پیپټایډ منځګړیتوب درملیز اغیزې په CNS کې ترلاسه کیدی شي، موږ یوه تجربه ترسره کړه چې په کې د بایوټینیل شوي نسخې i) #2077 ټرانزیټ پیپټایډ او ii) د BACE1 مخنیوی پیپټایډ د SA سره په دوه مختلف تناسب کې مخلوط شوي.د یو ترکیب لپاره موږ یوازې د BACE1 پیپټایډ مخنیوی کونکي کارولي او د بل لپاره موږ د BACE1 پیپټایډ مخنیوی کونکي 1:3 تناسب #2077 پیپټایډ ته کارولی.دواړه نمونې د رګونو له لارې اداره شوي او د وخت په تیریدو سره د beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) د وینې او دماغي مایع کچه اندازه شوې.Abeta40 په CSF کې اندازه شوی ځکه چې دا د دماغ پارینچیما کې د BACE1 مخنیوی منعکس کوي.لکه څنګه چې تمه کیده، دواړه پیچلتیاوې د پام وړ د Abeta40 د وینې کچه کمه کړې (انځور 4c، d).په هرصورت، یوازې هغه نمونې چې د پیپټایډ مخلوط لري.2077 او SA ته د BACE1 پیپټایډ مخنیوی کونکي د دماغي مایع په Abeta40 کې د پام وړ کمښت لامل شو (انځور 4c).معلومات ښیې چې پیپټایډ نمبر.2077 د دې وړتیا لري چې د 60 kDa SA پروټین CNS ته ولیږدوي او همدارنګه د BACE1 پیپټایډ د SA-conjugated inhibitors سره د فارماکولوژیکي اغیزو لامل کیږي.
(a) د T7 فیز کلونل انجیکشن (2 × 10 فیجز/حیوان) لږ تر لږه په دریو CM-intubated موږکونو کې د CSF پیپټایډ #2077 (RLSSVDSDLSGC) او غیر انجیکشن کنټرول فیز (#1779) اوږدمهاله فارماکوکینیټیک پروفایلونه ښیې.(b) د فیز انجیکشن شوي موږکونو (2 × 10 10 فیزونو/حیواناتو) کې د نمایندګي کورټیکل مایکروسکوپیک عکس العمل د پیپټایډ #2077 او رګونو (لیکټین) د مخنیوي ښکارندوی کوي.دا فیز کلونونه 3 موږکانو ته اداره شوي او د پرفیوژن دمخه د 1 ساعت لپاره گردش ته اجازه ورکړل شوې.دماغونه د T7 Phage capsid په وړاندې د پولی کلونل FITC-لیبل شوي انټي باډي سره قطع شوي او داغ شوي.لس دقیقې مخکې د پرفیوژن او وروسته فکسیشن، DyLight594 لیبل شوی لیکټین د رګونو له لارې اداره شوی و.د فلوروسینټ عکسونه د کیپیلری او د دماغي نسج په لیمین کې د مایکرو ویسلز او فیزونو (شنه) د لیټینین داغ (سرخ) ښیې.د پیمانه بار د 10 µm سره مطابقت لري.(c,d) Biotinylated BACE1 inhibitory peptide یوازې یا د biotinylated ټرانزیټ پیپټایډ #2077 سره په ترکیب کې د سټرپټاویډین سره یوځای شوی و چې وروسته لږترلږه درې کینول شوي CM موږکانو (10 mg streptavidin/kg) د رګونو له لارې انجیکشن ورکړل شو.په Aβ40 کې د BACE1 پیپټایډ مخنیوی منځګړیتوب کمښت د Aβ1-40 ELISA لخوا په وینه کې (سرخ) او د دماغي مایع (نارنج) لخوا په ټاکل شوي وخت کې اندازه شوی.د ښه وضاحت لپاره، په ګراف کې د 100٪ په پیمانه یوه نقطه کرښه رسم شوې.(c) په موږکانو کې په وینه کې د Aβ40 سلنه کمښت (سرخ مثلث) او د دماغي مایعاتو (نارنج مثلث) په موږکانو کې چې د سټرپټاویډین سره درملنه کیږي د پیپټایډ #2077 او BACE1 مخنیوی پیپټایډ په 3:1 تناسب کې.(d) د وینې Aβ40 (سرې حلقې) او د موږکانو دماغي مایع (نارنج حلقې) کې سلنه کمښت یوازې د BACE1 مخنیوی پیپټایډ سره یوځای د سټریپټاویډین سره درملنه کیږي.په کنټرول کې د Aβ غلظت 420 pg/ml (معیاري انحراف = 101 pg/ml).
د فیج ښودنه په بریالیتوب سره د بایو میډیکل څیړنې په ډیری برخو کې پلي شوې 17.دا میتود د vivo vascular تنوع مطالعاتو 18,19 او همدارنګه د دماغي رګونو 20,21,22,23,24,25,26 په نښه کولو مطالعاتو کې کارول شوی.پدې څیړنه کې ، موږ د دې انتخاب میتود پلي کول نه یوازې د دماغي رګونو په نښه کولو د پیپټایډونو مستقیم پیژندنې ته ، بلکه د فعال ټرانسپورټ ملکیتونو لرونکي نوماندانو کشف ته هم وغځول چې د وینې مغز خنډ څخه تیریږي.موږ اوس په CM intubated موږکونو کې د vivo انتخاب پروسې پراختیا تشریح کوو او د CSF هومینګ ملکیتونو سره د پیپټایډونو پیژندلو احتمال څرګندوو.د T7 فیز په کارولو سره چې د 12-mer تصادفي پیپټایډونو کتابتون ښیې، موږ وتوانیدو چې وښیو چې T7 فیز دومره کوچنی دی (تقریبا 60 nm په قطر کې) 10 د وینې - مغز خنډ سره تطابق کیږي، په دې توګه په مستقیم ډول د وینې - دماغ خنډ یا choroid choroid څخه تیریږي.موږ ولیدل چې د کینول شوي CM موږکونو څخه د CSF راټولول د vivo فعال سکرینینګ میتود کې ښه کنټرول شوی و ، او دا چې استخراج شوي فیز نه یوازې ویسکولیچر پورې تړلی بلکه د وینې مغز خنډ کې د لیږدونکي په توګه هم کار کوي.سربیره پردې ، په ورته وخت کې د وینې راټولولو او CSF او د وینې ترلاسه شوي مرحلو ته د HTS پلي کولو سره ، موږ تایید کړه چې زموږ د CSF انتخاب د انتخاب دورې ترمینځ پراخولو لپاره د وینې بډایه کولو یا فټنس لخوا اغیزه نلري.په هرصورت، د وینې کڅوړه د انتخاب طرزالعمل یوه برخه ده، ځکه چې هغه پړاوونه چې د CSF برخې ته د رسیدو وړتیا لري باید ژوندي پاتې شي او د وینې جریان کې دومره وخت تیریږي چې خپل ځان په مغز کې بډایه کړي.د خام HTS ډاټا څخه د اعتبار وړ ترتیب معلوماتو استخراج کولو لپاره، موږ د تحلیل کاري فلو کې د پلیټ فارم ځانګړي ترتیب کولو غلطیو سره تطبیق شوي فلټرونه پلي کړل.د سکرینینګ میتود کې د متحرک پیرامیټرو په شاملولو سره، موږ په وینه کې د وحشي ډوله T7 فیزونو (t½ ~ 28 min) ګړندۍ درملتونیک تایید کړ او همدارنګه د دوی نیم ژوند په دماغي مایع (t½ ~ 26 min) کې په یوه دقیقه کې مشخص کړ.په وینه او CSF کې د ورته فارماکوکینیټیک پروفایلونو سره سره، په CSF کې د فیز د وینې غلظت یوازې 0.001٪ کشف کیدی شي، د وینی دماغ خنډ په اوږدو کې د وحشي ډول T7 فیز کم شالید خوځښت په ګوته کوي.دا کار د انتخاب د لومړي پړاو اهمیت په ګوته کوي کله چې د vivo panning ستراتیژیو کې کارول کیږي، په ځانګړې توګه د فیز سیسټمونو لپاره چې په چټکۍ سره د جریان څخه پاک شوي، ځکه چې لږ کلون د CNS برخې ته د رسیدو توان لري.په دې توګه، په لومړي پړاو کې، د کتابتون تنوع کې کمښت خورا لوی و، ځکه چې یوازې یو محدود شمیر کلونونه په پای کې په دې سخت CSF ماډل کې راټول شوي.پدې کې د vivo panning ستراتیژۍ کې د انتخاب ډیری مرحلې شاملې وې لکه د CSF په کمپارټمینټ کې فعاله جمع کول، په وینه کې د کلون بقا، او په لومړیو 10 دقیقو کې د وینې څخه د T7 فیز کلون ګړندي لرې کول (انځور 1d او اضافي شکل 4M).).په دې توګه، د لومړي پړاو وروسته، په CSF کې مختلف فیز کلونونه پیژندل شوي، که څه هم ورته ابتدايي حوض د انفرادي څارویو لپاره کارول کیده.دا وړاندیز کوي چې د سرچینې کتابتونونو لپاره د انتخاب ډیری سخت ګامونه د لوی شمیر کتابتون غړو سره د تنوع کې د پام وړ کمښت لامل کیږي.له همدې امله، تصادفي پیښې به د ابتدايي انتخاب پروسې یوه لازمي برخه شي، په پایله کې به ډیره اغیزه وکړي.دا احتمال شته چې په اصلي کتابتون کې ډیری کلونونه د CSF د بډایه کولو سره ورته ورته والی درلود.په هرصورت، حتی د ورته تجربوي شرایطو لاندې، د انتخاب پایلې ممکن په ابتدايي حوض کې د هر ځانګړي کلون د لږ شمیر له امله توپیر ولري.
په CSF کې بډایه شوي شکلونه په وینه کې د هغو څخه توپیر لري.په زړه پورې، موږ د انفرادي څارویو په وینه کې د ګلیسین بډایه پیپټایډونو په لور لومړی بدلون یادونه وکړه.(انځور. 1g، بشپړونکي انځر. 4e، 4f).هغه فیز چې د ګلیسین پیپټایډونه لري ممکن ډیر باثباته وي او لږ احتمال ولري چې د دوران څخه لرې شي.په هرصورت، دا ګلیسین بډایه پیپټایډونه د دماغي مایع په نمونو کې ندي موندل شوي، دا وړاندیز کوي چې جوړ شوي کتابتونونه د دوه مختلف انتخاب مرحلو څخه تیریږي: یو په وینه کې او بل یې د دماغي مایع په جریان کې د راټولولو اجازه درلوده.د CSF بډایه کلونونه چې د انتخاب څلورم پړاو پایله لري په پراخه کچه ازمول شوي.نږدې ټول انفرادي ازمول شوي کلونونه د خالي کنټرول فیز په پرتله په CSF کې بډایه شوي تایید شوي.یو پیپټایډ برید (#2077) په ډیر تفصیل سره معاینه شوی.دا د نورو هټیو په پرتله اوږد پلازما نیم ژوند ښودلی (شکل 3d او ضمیمه شکل 7)، او په زړه پورې خبره دا ده چې دا پیپټایډ په C-ټرمینس کې د سیسټین پاتې شوني لري.دا پدې وروستیو کې ښودل شوي چې پیپټایډونو ته د سیستین اضافه کول کولی شي د البومین 29 سره تړلو سره د دوی فارماکوکینټیک ملکیتونه ښه کړي.دا اوس مهال د پیپټایډ #2077 لپاره نامعلوم دی او نورې مطالعې ته اړتیا لري.ځینې ​​​​پیپټایډونه د CSF بډایه کولو کې د والینس انحصار ښودلی (ډیټا نه ښودل شوي) ، کوم چې ممکن د T7 کیپسیډ ښودل شوي سطحې جیومیټري پورې اړه ولري.د T7 سیسټم چې موږ یې کاروو د هر فیز ذرې د هر پیپټایډ 5-15 کاپي ښودلې.IHC د امیدوار لیډ فیز کلونونو باندې ترسره شوی و چې د موږکانو دماغي کورټیکس ته د رګونو له لارې انجیکشن شوی و (اضافی شکل 8).معلوماتو ښودلې چې لږترلږه درې کلونونه (نمبر 2002، شمیره 2009 او شمیره 2077) د BBB سره اړیکه درلوده.دا باید معلومه شي چې ایا دا د BBB تعامل د CSF راټولیدو یا د دې کلونونو حرکت مستقیم BCSFB ته د حرکت پایله ده.په مهمه توګه، موږ وښیو چې ټاکل شوي پیپټایډونه د دوی د CSF ټرانسپورټ ظرفیت ساتي کله چې ترکیب کیږي او د پروټین کارګو ته پابند وي.SA ته د N-terminal biotinylated peptides پابند کول په اصل کې په وینه او دماغي مایع کې د خپلو اړوندو فیز کلونونو سره ترلاسه شوي پایلې تکراروي (انځور 3e).په نهایت کې، موږ وښیو چې لیډ پیپټایډ #2077 د دې وړتیا لري چې د BACE1 بایوټینیل شوي پیپټایډ انابیټر دماغ عمل ته وده ورکړي چې SA سره یوځای شوي، په CSF کې د پام وړ د Abeta40 کچې کمولو سره په CNS کې د څرګند فارماکوډینامیک اغیزو لامل کیږي (انځور 4).موږ نشو کولی په ډیټابیس کې د ټولو هټیو د پیپټایډ ترتیب هومولوژي لټون ترسره کولو سره په ډیټابیس کې کوم هومولوګونه وپیژنو.دا مهمه ده چې په یاد ولرئ چې د T7 کتابتون اندازه نږدې 109 ده، پداسې حال کې چې د 12-mers لپاره د نظري کتابتون اندازه 4 x 1015 ده. له همدې امله، موږ یوازې د 12-mer پیپټایډ کتابتون د تنوع ځای یوه کوچنۍ برخه غوره کړې، چې دا پدې مانا ده چې د پیپټایډونو د پیپټایډونو د پیژندلو سره د پیپټایډونو د پیژندلو لپاره د پیپټایډونو د پیژندلو لپاره ډیر مطلوب ځای پیژندل کیدی شي.په فرضي توګه، یو له هغو دلیلونو څخه چې ولې موږ د دې پیپټایډونو طبیعي هومولوګونه نه دي موندلي ممکن د تکامل په جریان کې له مینځه وړل وي ترڅو مغز ته د ځانګړي پیپټایډونو غیر کنټرول شوي ننوتلو مخه ونیسي.
په ګډه اخیستل شوي، زموږ پایلې د راتلونکي کار لپاره اساس چمتو کوي ترڅو په ویوو کې د سیریروواسکولر خنډ ټرانسپورټ سیسټمونه په ډیر تفصیل سره وپیژني او مشخص کړي.د دې میتود اساسی ترتیب د انتخابي انتخابي ستراتیژۍ پراساس دی چې نه یوازې د دماغي ویسکولر پابند ملکیتونو سره کلونونه پیژني ، بلکه یو مهم ګام هم پکې شامل دی چې بریالي کلونونه د CNS برخې ته په vivo کې د بیولوژیکي خنډونو څخه تیرولو لپاره داخلي فعالیت لري.د دې پیپټایډونو د لیږد میکانیزم روښانه کول او د مغز سیمې ته ځانګړي مایکروواسکولیچر پورې تړلو لپاره د دوی غوره توب روښانه کول دي.دا کیدای شي د BBB او ریسیپټرونو ترانسپورت لپاره د نوي لارو موندلو المل شي.موږ تمه لرو چې پیژندل شوي پیپټایډونه کولی شي په مستقیم ډول د سیربرواسکولر ریسیپټرونو یا د BBB یا BCSFB له لارې لیږدول شوي ligands گردش کولو سره وصل شي.په دې کار کې کشف شوي د CSF ټرانسپورټ فعالیت سره د پیپټایډ ویکتورونه به نور تحقیق شي.موږ اوس مهال د BBB او/یا BCSFB څخه د تیریدو وړتیا لپاره د دې پیپټایډونو دماغ ځانګړتیا تحقیق کوو.دا نوي پیپټایډونه به د نوي ریسیپټرو یا لارو احتمالي کشف او دماغ ته د میکرو مالیکولونو لکه بیولوژیکي تحویل لپاره د نوي خورا موثر پلیټ فارمونو پراختیا لپاره خورا ارزښتناکه وسیلې وي.
د مخکیني بیان شوي میتود د تعدیل په کارولو سره لوی سیسټرنا (CM) کینول کړئ.د ویستار موږکونه (200-350 ګرامه) په سټریوټاکسیک اپریټس کې ایښودل شوي او د سر د ویښتو او په زړه پورې ډول چمتو شوي سر باندې د مینځنۍ چیرا اچول شوي ترڅو سر خلاص کړي.د پورتنۍ سیش په ساحه کې دوه سوري ډریل کړئ او په سوري کې د فکس کولو پیچونه ټینګ کړئ.CM ته د سټینلیس سټیل کینول د سټیریو تاکتیک لارښود لپاره د وروستي occipital crest کې یو اضافي سوری ډرل شوی و.د کینول په شاوخوا کې د غاښونو سیمنټ تطبیق کړئ او د پیچونو سره خوندي کړئ.د عکس اخیستلو او سیمنټو سخت کولو وروسته، د پوستکي زخم د 4/0 سوپرامیډ سیون سره تړل شوی.د کانولا مناسب ځای په ځای کول د سیریبروسپینل مایع (CSF) د ناڅاپه لیک کیدو لخوا تایید شوي.موږک د سټیریوټیکسیک اپریټس څخه لیرې کړئ، د عملیات څخه وروسته مناسبه پاملرنه او د درد مدیریت ترلاسه کړئ، او لږ تر لږه د یوې اونۍ لپاره یې د بیا رغونې لپاره اجازه ورکړئ تر هغه چې د دماغي مایع کې د وینې نښې نښانې لیدل کیږي.ویسټار موږکان (Crl:WI/Han) د چارلس سیند (فرانسې) څخه ترلاسه شوي.ټول موږکان د ځانګړو ناروغیو څخه پاک شرایطو لاندې ساتل شوي.د څارویو ټولې تجربې د سویس د باسل ښار د وترنري دفتر لخوا تصویب شوي او د څارویو جواز نمبر 2474 (د دماغي مایع او د موږک دماغ کې د معالجوي نوماندانو د کچې اندازه کولو له لارې د فعال دماغ ټرانسپورټ ارزونه) سره سم ترسره شوي.
په لاس کې د CM کینول سره په نرمۍ سره موږک هوښیار وساتئ.د کانولا څخه داتورا لرې کړئ او 10 µl په ناڅاپي ډول جریان لرونکي دماغي مایع راټول کړئ.څرنګه چې د کانولا پیټینسی په نهایت کې جوړ شوی و، په دې څیړنه کې یوازې د دماغي مایعاتو روښانه نمونې شاملې وې چې د وینې د ککړتیا یا رنګ کولو ثبوت نلري.په موازي ډول، نږدې 10-20 μl وینه د لکۍ په څنډه کې د کوچني چیرا څخه د هیپرین (سګما-الډریچ) سره ټیوبونو ته وړل شوي.CSF او وینه په مختلفو وختونو کې د T7 فیز د رګونو د انجیکشن وروسته راټول شوي.د هر CSF نمونې راټولولو دمخه نږدې 5-10 μl مایع پریښودل شوي ، کوم چې د کیتیټر د مړ شوي حجم سره مطابقت لري.
کتابتونونه د T7Select 10-3b ویکتور په کارولو سره رامینځته شوي لکه څنګه چې د T7Select سیسټم لارښود (Novagen, Rosenberg et al., Innovations 6, 1-6, 1996) کې تشریح شوي.په لنډه توګه، یو تصادفي 12-mer DNA داخل په لاندې شکل کې ترکیب شوی:
د NNK کوډون په داخل کې د ډبل سټاپ کوډون او امینو اسید اوور ایکسپریشن مخنیوي لپاره کارول شوی و.N د هر نیوکلیوټایډ په لاسي ډول مخلوط انډول تناسب دی، او K د اډینین او سایټوسین نیوکلیوټایډونو په لاسي ډول مخلوط انډول تناسب دی.واحد ځړیدلي سیمې د dNTP (Novagen) او Klenow enzyme (New England Biolabs) په مرسته په کلونیو بفر (نیو انګلینډ بایولابس) کې د 37 درجې سانتي ګراد په حرارت کې د 3 ساعتونو لپاره د نور انکیوبیشن په واسطه په دوه ګوني ډنډ شوي DNA بدل شوي.د عکس العمل وروسته، د EtOH باران لخوا دوه اړخیزه DNA بیرته ترلاسه شو.پایله شوې DNA د محدودیت انزایمونو EcoRI او HindIII (دواړه د Roche څخه) سره هضم شوي.پاک شوی او پاک شوی (QIAquick، Qiagen) داخل (T4 ligase، New England Biolabs) بیا د 10B کیپسید جین څخه د امینو اسید 348 وروسته د مخکینۍ کلیو شوي T7 ویکتور کې په چوکاټ کې تړل شوی و.د ویټرو بسته بندۍ څخه دمخه د 18 ساعتونو لپاره د لیګیشن عکس العملونه په 16 درجې سانتي ګراد کې انکیوب شوي و.په ویټرو کې د فیج بسته کول د لارښوونو سره سم ترسره شوي چې د T7Select 10-3b کلونینګ کټ (نوواګین) سره چمتو شوي او د بسته بندۍ محلول یو ځل د Escherichia coli (BLT5615، Novagen) په کارولو سره لیسز ته پراخ شوی و.lysates د ګلیسیرول د ذخیره کولو محلول په توګه په -80 ° C کې سینټرفیوژ شوي، ټیټریټ شوي او منجمد شوي.
د فیز متغیر سیمو مستقیم PCR پراخول د ملکیت 454/Roche-amplicon فیوژن پریمرونو په کارولو سره په بروت یا پلیټ کې پراخ شوي.فارورډ فیوژن پریمر د متغیر سیمې (NNK) 12 (د ټیمپلیټ ځانګړي) ، GS FLX ټایټانیوم اډاپټر A ، او د څلور اساس کتابتون کلیدي ترتیب (TCAG) (اضافی شکل 1a) پورې اړوند ترتیبونه لري:
د ریورس فیوژن پرائمر کې بایوټین هم شامل دی چې د کیپچر موتی سره وصل دی او د GS FLX ټایټینیم اډاپټر B د ایمولشن PCR په جریان کې د کلونل امپلیفیکیشن لپاره اړین دی:
امپلیکون بیا د 454 GS-FLX Titanium پروتوکول سره سم د 454/Roche pyrosequencing تابع شوي.د لاسي سنجر ترتیب لپاره (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer)، د T7 Phage DNA د PCR لخوا پراخ شوی او د لاندې پریمر جوړه سره ترتیب شوی:
د انفرادي تختو داخلول د روچ فاسټ سټارټ DNA پولیمریز کټ (د جوړونکي لارښوونو سره سم) په کارولو سره د PCR امپلیفیکیشن تابع شوي.یو ګرم پیل (10 دقیقې په 95 ° C) او 35 بوسټ دورې (50 s په 95 ° C ، 1 دقیقې په 50 ° C ، او 1 دقیقې په 72 ° C کې) ترسره کړئ.
د کتابتونونو څخه فیز، د وحشي ډوله فیز، د CSF او وینې څخه ژغورل شوي فیز، یا انفرادي کلونونه په Escherichia coli BL5615 کې د TB بروت (Sigma Aldrich) یا په 500 cm2 لوښو (Thermo Scientific) کې د 4 ساعتونو لپاره په 37 درجې سانتي ګراد کې پراخ شوي.Phage د پلیټونو څخه د Tris-EDTA بفر (Fluka Analytical) سره د پلیټونو په مینځلو یا د جراثیمي پایپټ لارښوونو سره د تختو په راټولولو سره ایستل شوي.Phage د کلچر سپرناټینټ یا استخراج بفر څخه جلا شوي د پولیټین ګلایکول (PEG 8000) باران (Promega) یو پړاو سره او په Tris-EDTA بفر کې بیا ځای پرځای شوي.
پراخ شوی فیز د انډوټوکسین لیرې کولو 2-3 پړاوونو سره د انډوټوکسین لیرې کولو موزونو (Miltenyi Biotec) په کارولو سره د رګونو (IV) انجیکشن (500 μl/حیوان) څخه مخکې ترسره شوی و.په لومړي پړاو کې، 2×1012 پړاوونه معرفي شول؛په دویمه کې، 2 × 1010 پړاوونه؛په دریم او څلورم انتخاب پړاوونو کې، په هر حیوان کې 2×109 پړاوونه.په CSF کې د فیز مینځپانګه او د وینې نمونې په ټاکل شوي وخت کې راټول شوي د تولید کونکي لارښوونو سره سم د تختې شمیرې لخوا ټاکل شوي (د T7 انتخاب سیسټم لارښود).Phage selection was performed by intravenous injection of purified libraries into the tail vein or by re-injection of phage extracted from CSF from the previous selection round, and subsequent harvests were performed at 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, and 240 min respectively CSF and blood samples.د vivo panning ټولټال څلور پړاوونه ترسره شوي چې په کې دوه غوره شوي څانګې په جلا توګه ذخیره شوي او د انتخاب په لومړیو دریو پړاوونو کې تحلیل شوي.د انتخاب له لومړیو دوه پړاوونو څخه د CSF څخه استخراج شوي ټول فیز داخلونه د 454/Roche pyrosequencing تابع شوي، پداسې حال کې چې ټول کلونونه د انتخاب له وروستیو دوو پړاوونو څخه د CSF څخه ایستل شوي په لاسي ډول ترتیب شوي.د انتخاب د لومړي پړاو څخه د وینې ټول پړاوونه هم د 454/Roche pyrosequencing سره مخامخ شوي.د فیز کلونونو د انجیکشن لپاره، ټاکل شوي پړاوونه په E. coli (BL5615) کې په 500 cm2 پلیټونو کې د 37 درجې سانتي ګراد د 4 ساعتونو لپاره پراخ شوي.په انفرادي ډول غوره شوي او په لاسي ډول ترتیب شوي کلونونه د TB په مینځ کې تبلیغ شوي.د فیز استخراج، د انډوټوکسین پاکولو او له مینځه وړلو وروسته (لکه څنګه چې پورته تشریح شوي)، 2 × 1010 فیزونه / حیوان په 300 μl کې د رګونو له لارې په یوه لکۍ رګ کې داخل شوي.
د ترتیب معلوماتو دمخه پروسس کول او کیفیتي فلټر کول.Raw 454/Roche ډاټا د بائنری معیاري سټریم نقشې فارمیټ (sff) څخه د پیرسن انسان لوستلو وړ فارمیټ (فاسټا) ته د پلورونکي سافټویر په کارولو سره بدله شوې.د نیوکلیوټایډ سلسلې نور پروسس د ملکیت C برنامو او سکریپټونو په کارولو سره ترسره شو (د سافټویر نه خپور شوی کڅوړه) لکه څنګه چې لاندې تشریح شوي.د لومړنیو معلوماتو په تحلیل کې د څو مرحلو فلټر کولو سختې کړنلارې شاملې دي.د لوستلو لوستلو لپاره چې د 12Mer داخل نه لري د DNA داخلول شوی، لوستل شوي لیبل ګنډکسمون په هر ترتیب کې تر 2 پورې متضادو ته اجازه ورکوي31.له همدې امله، پرته له پیل او ودرولو ټاګونو لوستل او لوستل چې د شالید داخلونه پکې شامل دي، د بیلګې په توګه، هغه سمونونه چې د اجازې شوي شمیرې څخه ډیر وي، له کتابتون څخه لیرې شوي.لکه څنګه چې د پاتې لوستلو لپاره، د N-mer DNA سلسله د پیل نښه څخه غزیدلې او د سټاپ نښه څخه مخکې پای ته رسیدل د اصلي لوستلو ترتیب څخه جلا شوي او نور پروسس شوي (له دې وروسته د "داخل" په توګه راجع کیږي).د داخلولو له ژباړې وروسته، د پریمر په 5′ پای کې د لومړي بند کوډون وروسته برخه له داخل څخه لرې کیږي.سربیره پردې، نیوکلیوټایډونه چې د پریمر په 3′ پای کې د نامکمل کوډونونو لامل کیږي هم لرې شوي.د هغو داخلونو خارجولو لپاره چې یوازې د شالید ترتیبونه لري، ژباړل شوي داخلونه چې د امینو اسید نمونې "PAG" سره پیل کیږي هم لیرې شوي.پیپټایډونه چې د ژباړې وروسته اوږدوالی یې له 3 امینو اسیدونو څخه کم وو له کتابتون څخه لرې شوي.په نهایت کې ، د ننوتلو حوض کې بې ځایه والی لرې کړئ او د هر ځانګړي داخل کولو فریکوینسي وټاکئ.د دې تحلیل په پایلو کې د نیوکلیوټایډ سلسلې (انسرټونه) او د دوی (لوستلو) فریکونسۍ (اضافي ارقام 1c او 2) شامل وو.
ګروپ N-mer DNA د ترتیب ورته والی په واسطه داخلوي: د 454/Roche-ځانګړي ترتیب کولو غلطیو له مینځه وړو لپاره (لکه د homopolymer توسیعونو ترتیب کولو کې ستونزې) او لږ مهم بې ځایه شوي لرې کول، مخکې فلټر شوي N-mer DNA تسلسل داخلونه (انسرټونه) د ورته والي له مخې ترتیب شوي.داخلونه (تر 2 پورې غیر مطابقت لرونکي اډو ته اجازه ورکړل شوې) د تکراري الګوریتم په کارولو سره په لاندې ډول تعریف شوي: داخلونه لومړی د دوی د فریکونسۍ (له لوړې څخه تر ټیټ) پورې ترتیب شوي ، او که دوی ورته وي ، د دوی ثانوي ترتیب د اوږدوالي له مخې (د اوږدوالي تر ټولو لنډ)).په دې توګه، ډیری بار بار او تر ټولو اوږد داخلول لومړی "ډله" تعریفوي.د ګروپ فریکونسۍ کلیدي فریکونسۍ ته ټاکل شوې ده.بیا، په ترتیب شوي لیست کې پاتې هر داخلول هڅه شوې چې د Needleman-Wunsch alignment په واسطه ګروپ ته اضافه شي.که چیرې په یو ترتیب کې د نابرابرۍ، داخلولو، یا حذف کولو شمیر د 2 له حد څخه زیات نه وي، نو ګروپ ته داخلول اضافه کیږي، او د ټول ګروپ فریکونسۍ د څو ځله اضافه کولو سره زیاتیږي.په ګروپ کې اضافه شوي داخلونه د کارول شوي په توګه په نښه شوي او د نورو پروسس څخه ایستل شوي.که چیرې د ننوتلو ترتیب دمخه موجود ګروپ کې اضافه نشي ، نو د داخلولو ترتیب د مناسب داخل فریکونسۍ سره د نوي ګروپ رامینځته کولو لپاره کارول کیږي او د کارول شوي په توګه نښه کیږي.تکرار پای ته رسیږي کله چې د هر داخل کولو ترتیب یا د نوي ګروپ جوړولو لپاره کارول شوی وي یا په پخوانۍ موجوده ګروپ کې شامل شي.په هرصورت، ګروپ شوي داخلونه چې نیوکلیوټایډونه لري په پای کې د پیپټایډ په ترتیب (پیپټایډ کتابتونونو) کې ژباړل کیږي.د دې تحلیل پایله د ننوتلو یوه ټولګه ده او د دوی اړوند فریکونسۍ دي چې د پرله پسې لوستلو شمیر جوړوي (اضافی شکل. 2).
د موټیف جنریشن: د ځانګړي پیپټایډونو لیست پراساس ، یو کتابتون رامینځته شوی چې ټول احتمالي امینو اسید نمونې لري (aa) لکه څنګه چې لاندې ښودل شوي.د اوږدوالي 3 هر ممکنه نمونه د پیپټایډ څخه ایستل شوې او د هغې برعکس نمونه د یو عام شکل کتابتون سره اضافه شوې چې ټولې نمونې لري (ټریپټایډز).د خورا تکراري شکلونو کتابتونونه ترتیب شوي او بې ځایه شوي لرې شوي.بیا، د موټیف په کتابتون کې د هر ټریپټایډ لپاره، موږ د کمپیوټري وسیلو په کارولو سره په کتابتون کې د هغې شتون چیک کړ.په دې حالت کې، د پیپټایډ فریکونسۍ چې موندل شوي موټیف ټریپپټایډ لري اضافه کیږي او د موټیف کتابتون کې موټیف ته ټاکل کیږي ("د شکلونو شمیر").د موټیف تولید پایله یو دوه اړخیزه لړۍ ده چې د ټریپټایډز (موټیف) ټول پیښې او د دوی اړوند ارزښتونه لري ، کوم چې د لوستلو ترتیب کولو شمیره ده چې پایله یې ورته شکل رامینځته کیږي کله چې لوستل فلټر شوي ، ګروپ شوي او ژباړل کیږي.میټریکونه لکه څنګه چې پورته تشریح شوي.
د موټیفونو شمیر نورمال کول او ورته سکریټرپلاټونه: د هرې نمونې لپاره د شکلونو شمیر په کارولو سره نورمال شوی و
چیرته چې ni د لوستلو شمیره ده چې موضوع لري.په دې توګه، vi د لوستلو (یا پیپټایډونو) فیصدي فریکونسۍ څرګندوي چې په نمونه کې موټیف i لري.د غیر نورمال شوي شکلونو لپاره P - ارزښتونه د فشر دقیق ازموینې په کارولو سره محاسبه شوي.د محرکاتو د شمیر د ارتباطاتو په اړه، د سپیرمین ارتباط د R سره د انګیزو د نورمال شوي شمیر په کارولو سره محاسبه شوي.
د پیپټایډ کتابتون کې په هر موقعیت کې د امینو اسیدونو مینځپانګې لیدو لپاره ، ویب لوګوګرامونه 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) رامینځته شوي.لومړی، د 12-mer پیپټایډ په هر موقعیت کې د امینو اسیدونو مینځپانګه په 20 × 12 میټریکس کې زیرمه کیږي.بیا، د 1000 پیپټایډونو یوه سیټ چې په هر موقعیت کې ورته نسبي امینو اسید مینځپانګې لري د فاسټا - ترتیب په شکل کې رامینځته کیږي او د ویب لوګو 3 ته د ننوتلو په توګه چمتو کیږي ، کوم چې په هر موقعیت کې د نسبي امینو اسید مینځپانګې ګرافیکي نمایش رامینځته کوي.د ورکړل شوي پیپټایډ کتابتون لپاره.د څو اړخیز ډیټاسیټونو لیدلو لپاره، د تودوخې نقشې په R کې د داخلي پرمختللې وسیلې په کارولو سره رامینځته شوي (biosHeatmap، یو لا تر اوسه خپور شوی R پیکج).د تودوخې په نقشه کې وړاندې شوي ډینډروګرامونه د وارډ د درجه بندي کلستر کولو میتود په کارولو سره د Euclidean واټن میټریک سره محاسبه شوي.د موټیف سکور کولو ډیټا احصایوي تحلیل لپاره، د غیر نورمال شوي نمرې لپاره P ارزښتونه د فشر دقیق ازموینې په کارولو سره محاسبه شوي.د نورو ډیټاسیټونو لپاره P- ارزښتونه په R کې د زده کونکي د ټیسټ یا ANOVA په کارولو سره محاسبه شوي.
ټاکل شوي فیز کلونونه او فیزونه پرته له داخلیدو څخه د رګونو له لارې د رګونو له لارې انجیکشن شوي (2×1010 فیز/حیوان په 300 μl PBS کې).د پرفیوژن او وروسته فکسیشن څخه لس دقیقې مخکې، ورته حیوانات د 100 μl DyLight594 لیبل شوي لیکټین (Vector Laboratories Inc., DL-1177) سره د رګونو له لارې انجیکشن شوي.د فیج انجیکشن څخه 60 دقیقې وروسته ، موږکان د زړه له لارې د 50 ملی لیتر PBS سره عطر شوي او ورپسې 50 ملی 4٪ PFA/PBS.د مغزو نمونې د شپې په 4% PFA/PBS کې ثابتې شوې او د شپې په 4°C کې په 30% سوکروز کې ډوب شوي.نمونې په OCT مخلوط کې فلش منجمد شوي.د منجمد نمونو امونوهیسټو کیمیکل تحلیل د خونې په تودوخه کې د 30 µm کرایوسیکشنونو کې ترسره شو چې د 1٪ BSA سره بلاک شوي او د T7 Phage (Novus NB 600-376A) په وړاندې د پولی کلونل FITC-لیبل شوي انټي باډیز سره په 4 °C کې تودوخه شوي.د شپې په اوږدو کې تنفس کړئ.په نهایت کې ، برخې د PBS سره 3 ځله مینځل شوې او د کنفوکال لیزر مایکروسکوپ (Leica TCS SP5) سره معاینه شوې.
ټول پیپټایډونه د لږترلږه 98٪ پاکوالي سره د GenScript USA لخوا ترکیب شوي، بایوټینیل شوي او لیوفیلیز شوي.بایوټین په N-ټرمینس کې د اضافي درې ګالیسین سپیسر له لارې تړل کیږي.ټول پیپټایډونه د ډله ایز سپیکرومیټري په کارولو سره چیک کړئ.
Streptavidin (Sigma S0677) د بایوټینیلیټ پیپټایډ، بایوټینیل شوي BACE1 مخنیوی پیپټایډ، یا د بایوټینیل شوي BACE1 مخنیوی پیپټایډ او د BACE1 مخنیوی پیپټایډ په SO5 / SOBC %5 DM 1 inhibitory peptide کې ترکیب (3:1 تناسب) سره مخلوط شوی.د انجیکشن دمخه 1 ساعت د خونې په حرارت کې.Streptavidin-conjugated peptides د 10 mg/kg په دوز کې د رګونو په واسطه د موږکانو د پښې رګونو کې د دماغي غار سره داخل شوي.
د سټریپټاویډین پیپټایډ کمپلیکس غلظت د ELISA لخوا ارزول شوی.Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) د شپې په 4°C کې د 1.5 μg/ml موږک ضد سټریپټاویډین انټي باډي سره پوښل شوي (Thermo, MA1-20011).د بلاک کولو وروسته (د بلاک کولو بفر: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% Gelatin, 1% BSA) د خونې په حرارت کې د 2 ساعتونو لپاره ، پلیټ د 0.05% Tween-20/PBS (واش بفر) سره مینځل شوي او د دوهم بلاک لپاره د 3 پلا فلو نمونې سره د buffer سی ایس ایس اضافه شوي. لسما 1:10,000، CSF 1:115).بیا پلیټ د شپې په 4°C کې د کشف انټي باډي (1 μg/ml، anti-streptavidin-HRP، Novus NB120-7239) سره د شپې په اوږدو کې سینګار شوی و.د مینځلو له دریو مرحلو وروسته ، سټرپټاویډین تر 20 دقیقو پورې د TMB سبسټریټ محلول (Roche) کې د انکیوبیشن لخوا کشف شو.د 1M H2SO4 سره د رنګ پراختیا ودرولو وروسته، جذب په 450 nm اندازه کړئ.
د streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor کمپلیکس فعالیت د Aβ(1-40) ELISA لخوا د تولید کونکي پروتوکول (واکو، 294-64701) له مخې ارزول شوی.په لنډه توګه، د CSF نمونې په معیاري خړوب (1:23) کې حل شوي او د شپې په 4°C کې په 96-څاه پلیټونو کې د BNT77 کیپچر انټي باډي سره پوښل شوي.د مینځلو له پنځو مرحلو وروسته، د HRP-conjugated BA27 انټي باډي اضافه شوي او د 2 ساعتونو لپاره په 4° C. تودوخه کې مینځل شوي، وروسته د مینځلو پنځه مرحلې.Aβ(1–40) د خونې په حرارت کې د 30 دقیقو لپاره د TMB محلول کې د انکیوبیشن لخوا کشف شو.وروسته له دې چې د سټاپ محلول سره د رنګ وده ودرول شوه، جذب په 450 nm اندازه کړئ.د پلازما نمونې د Aβ(1-40) ELISA څخه دمخه د قوي مرحلې استخراج سره مخ شوي.پلازما په 0.2% DEA (سګما) کې په 96 څاه پلیټونو کې اضافه شوی او د 30 دقیقو لپاره د خونې په حرارت درجه کې کینول شوی.د SPE پلیټونو (Oasis, 186000679) په پرله پسې توګه د اوبو او 100% میتانول سره مینځلو وروسته، د پلازما نمونې د SPE پلیټونو کې اضافه شوي او ټول مایع لرې شوي.نمونې مینځل شوي (لومړی د 5٪ میتانول بیا 30٪ میتانول سره) او د 2٪ NH4OH/90٪ میتانول سره مینځل شوي.په ثابته N2 کرنټ کې د 99 دقیقو لپاره په 55 ° C کې د ایلویټ وچولو وروسته، نمونې په معیاري تودوخې کې کمې شوې او Aβ(1–40) اندازه شوې لکه څنګه چې پورته تشریح شوي.
دا مقاله څنګه حواله کول: Urich, E. et al.دماغ ته د کارګو تحویلي د ټرانزیټ پیپټایډونو په کارولو سره چې په vivo کې پیژندل شوي.ساینس۵، ۱۴۱۰۴;doi: 10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB او Moos T. د هدفي درملنې په کارولو سره دماغ ته د میکرومولکولر درملو تحویلي.د نیوروکیمیا ژورنال 113، 1-13، 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., او Martinez-Martinez, P. د وینې مغز خنډ ته د پیپټایډ او پروټین درملو تحویلي.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
پرډریج، WM د وینې دماغ خنډ: د دماغ د مخدره توکو په پراختیا کې خنډ.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, and Byrd, A. د کورایډ پلیکسس-CSF لارې له لارې دماغ ته د مخدره توکو رسولو او هدف کولو لپاره امکانات.د درمل جوړولو څیړنه 22، 1011-1037، 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM د بایوفرماسیوټیکلونو عصري کول د مغز تحویل لپاره د مالیکولر ټروجن آسونو سره.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
پرډریج، د WM ریسیپټر منځګړیتوب پیپټایډ ټرانسپورټ د وینې - دماغ خنډ په اوږدو کې.Endocr Rev. 7، 314-330 (1986).
Niewohner، J. et al.د monovalent مالیکولر شټلونو په کارولو سره د مغز نفوذ او د معالجوي انټي باډیز موثریت زیات کړئ.نیورون 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.د ټرانسفرین ریسیپټر (TfR) ټرانسپورټ د TfR انټي باډیز سره د تړاو ډولونو مغز جذب ټاکي.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).