د Nature.com د لیدنې لپاره مننه. تاسو د محدود CSS ملاتړ سره د براوزر نسخه کاروئ. د غوره تجربې لپاره، موږ سپارښتنه کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ). سربیره پردې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ څخه ښیو.
په یو وخت کې د دریو سلایډونو یو کیروسل ښیې. په یو وخت کې د دریو سلایډونو څخه د تیریدو لپاره د مخکیني او راتلونکي تڼیو څخه کار واخلئ، یا په پای کې د سلایډر تڼیو څخه کار واخلئ ترڅو په یو وخت کې درې سلایډونه څخه تیر شئ.
د وینې-دماغ خنډ او د وینې-دماغ خنډ د بایوتراپیوټیک اجنټانو مخه نیسي چې په مرکزي عصبي سیسټم کې خپلو اهدافو ته ورسیږي، په دې توګه د عصبي ناروغیو اغیزمن درملنه خنډوي. د نوي دماغ لیږدونکي په ویوو کې کشف کولو لپاره، موږ د T7 فیز پیپټایډ کتابتون معرفي کړ او په ترتیب سره د موږکانو د کینول شوي شعور لوی حوض ماډل په کارولو سره وینه او دماغي نخاعي مایع (CSF) راټول کړل. د انتخاب څلور پړاوونو وروسته په CSF کې ځانګړي فیز کلونونه خورا بډایه شول. د انفرادي نوماند پیپټایډونو ازموینې په CSF کې له 1000 ځله څخه ډیر بډایه کول څرګند کړل. دماغ ته د پیپټایډ-منځګړیتوب رسولو بایو فعالیت د دماغي نخاعي مایع کې د امیلایډ-β په کچه کې د 40٪ کمښت لخوا تایید شو چې د BACE1 پیپټایډ مخنیوی کونکي په کارولو سره د پیژندل شوي نوي لیږد پیپټایډ سره تړاو لري. دا پایلې وړاندیز کوي چې د ان ویوو فیز انتخاب میتودونو لخوا پیژندل شوي پیپټایډونه ممکن د درملنې اغیزې سره دماغ ته د میکرو مالیکولونو سیسټمیک تحویل لپاره ګټور وسایط وي.
د مرکزي عصبي سیسټم (CNS) په نښه شوي درملنې څیړنه په پراخه کچه د مطلوب درملو او اجنټانو پیژندلو باندې تمرکز کړی چې د CNS په نښه کولو ملکیتونه ښیې، د هغه میکانیزمونو په کشف کولو کې لږ هڅې سره چې دماغ ته د فعال درملو رسولو لامل کیږي. دا اوس د بدلون پیل کوي ځکه چې د مخدره توکو رسولو، په ځانګړي توګه لوی مالیکولونه، د عصري عصبي ساینس د درملو پراختیا یوه لازمي برخه ده. د مرکزي عصبي سیسټم چاپیریال د دماغي رګونو خنډ سیسټم لخوا ښه ساتل شوی، چې د وینې دماغ خنډ (BBB) ​​او د وینې دماغ خنډ (BCBB) څخه جوړ دی، چې دماغ ته د درملو رسولو لپاره ننګونه کوي1,2. اټکل کیږي چې نږدې ټول لوی مالیکول درمل او له 98٪ څخه ډیر کوچني مالیکول درمل له دماغ څخه له منځه وړل کیږي3. له همدې امله دا خورا مهم دي چې د نوي دماغ ټرانسپورټ سیسټمونه وپیژندل شي چې CNS ته د معالجوي درملو مؤثره او مشخص تحویلي چمتو کوي 4,5. په هرصورت، BBB او BCSFB د مخدره توکو رسولو لپاره هم یو غوره فرصت وړاندې کوي ځکه چې دوی د دماغ ټولو جوړښتونو ته د هغې د پراخه واسکولچر له لارې ننوځي او ننوځي. په دې توګه، دماغ ته د رسولو غیر برید کونکي میتودونو کارولو لپاره اوسنۍ هڅې په لویه کچه د انډوجینس BBB6 ریسیپټر په کارولو سره د ریسیپټر-مینځګړیتوب ټرانسپورټ (PMT) میکانیزم پراساس دي. د ټرانسفرین ریسیپټر لارې 7،8 په کارولو سره وروستي کلیدي پرمختګونو سره سره، د ښه ملکیتونو سره د نوي تحویلي سیسټمونو نور پراختیا ته اړتیا ده. د دې هدف لپاره، زموږ هدف دا و چې هغه پیپټایډونه وپیژنو چې د CSF ټرانسپورټ منځګړیتوب کولو توان لري، ځکه چې دوی په اصل کې CNS ته د میکرو مالیکولونو رسولو یا د نوي ریسیپټر لارو خلاصولو لپاره کارول کیدی شي. په ځانګړي توګه، د دماغي رګونو سیسټم ځانګړي ریسیپټرونه او لیږدونکي (BBB او BSCFB) کولی شي د بایوتراپیوټیک درملو فعال او ځانګړي تحویلي لپاره د احتمالي هدفونو په توګه کار وکړي. د دماغي نخاعي مایع (CSF) د کورایډ پلیکسس (CS) یو پټونکی محصول دی او د دماغ د انټرسټیټیل مایع سره د subarachnoid ځای او وینټریکولر ځای له لارې مستقیم تماس کې دی. پدې وروستیو کې دا ښودل شوي چې subarachnoid cerebrospinal مایع د دماغ interstitium ته په ډیره اندازه خپریږي. موږ هیله لرو چې د دې فرعي انفلوین لارې په کارولو سره یا په مستقیم ډول د BBB له لارې د پیرنچیمال ځای ته لاسرسی ومومئ. د دې ترلاسه کولو لپاره، موږ د ویوو فیز انتخاب یوه قوي ستراتیژي پلي کړه چې په مثالي توګه د دې دوه جلا لارو څخه د هر یو لخوا لیږدول شوي پیپټایډونه پیژني.
موږ اوس د CSF نمونې سره د لوړ تروپټ ترتیب (HTS) سره یوځای د لوړ کتابتون تنوع سره د لومړني انتخاب پړاوونو څارنه کولو لپاره د ویوو فیز ښودنې سکرینینګ میتود تشریح کوو. سکرینینګ په هوښیار موږکانو کې د دایمي نصب شوي لوی سیسټرنا (CM) کینولا سره ترسره شو ترڅو د وینې ککړتیا څخه مخنیوی وشي. په مهمه توګه، دا طریقه د دماغ هدف ګرځول او پیپټایډونه دواړه د دماغي رګونو خنډ په اوږدو کې د ترانسپورت فعالیت سره غوره کوي. موږ د دوی د کوچني اندازې (~60 nm)10 له امله د T7 فیزونه وکارول او وړاندیز یې وکړ چې دوی د ویسیکلونو لیږد لپاره مناسب دي چې د انډوتیلیل او/یا اپیتیلیل-میدولا خنډ ټرانس سیلولر کراس کولو ته اجازه ورکوي. د پین کولو څلور پړاوونو وروسته، د فیز نفوس جلا شول چې د ویوو رګونو قوي CSF بډایه کول او د دماغي مایکرو ویسل اړیکه ښیې. په مهمه توګه، موږ وکولی شو خپلې موندنې د دې ښودلو سره تایید کړو چې غوره شوي او کیمیاوي ترکیب شوي غوره نوماند پیپټایډونه د پروټین کارګو د دماغي نخاعي مایع ته لیږدولو توان لري. لومړی، د CNS فارماکوډینامیک اغیزې د BACE1 پیپټایډ د مخنیوی کونکي سره د مخکښ ټرانزیټ پیپټایډ یوځای کولو سره رامینځته شوې. د دې ښودلو سربیره چې په ویوو کې فعال سکرینینګ ستراتیژۍ کولی شي د نوي دماغ ټرانسپورټ پیپټایډونه د مؤثره پروټین کارګو کیریر په توګه وپیژني، موږ تمه لرو چې ورته فعال انتخاب طریقې به د نوي دماغ ټرانسپورټ لارو پیژندلو کې هم مهم شي.
د تختې جوړولو واحدونو (PFU) پر بنسټ، د فیز بسته بندۍ مرحلې وروسته، د تصادفي 12-mer خطي T7 فیز پیپټایډونو کتابتون ډیزاین او جوړ شو چې شاوخوا 109 تنوع لري (مواد او میتودونه وګورئ). دا مهمه ده چې په یاد ولرئ چې موږ د ان ویوو پیننګ دمخه دا کتابتون په احتیاط سره تحلیل کړ. د تعدیل شوي پرائمرونو په کارولو سره د فیز کتابتون نمونو PCR امپلیفیکیشن امپلیکونز رامینځته کړل چې مستقیم HTS ته پلي کیدونکي وو (ضمیمه انځور 1a). د a) HTS11 ترتیب کولو غلطیو له امله، b) د پرائمرونو کیفیت باندې اغیزه (NNK) 1-12، او c) د سټینډ بای کتابتون کې د وحشي ډول (wt) فیز (کنکال داخلونه) شتون، د ترتیب فلټر کولو پروسه یوازې د تایید شوي ترتیب معلوماتو استخراج لپاره پلي شوه (ضمیمه انځور 1b). دا فلټر ګامونه د HTS ترتیب کولو ټولو کتابتونونو ته پلي کیږي. د معیاري کتابتون لپاره، ټولټال 233,868 لوستل ترلاسه شوي، چې له هغې څخه 39٪ د فلټر معیارونه پاس کړل او د راتلونکو پړاوونو لپاره د کتابتون تحلیل او انتخاب لپاره کارول شوي (ضمیمه انځور 1c–e). لوستل په عمده توګه د 3 اساس جوړو ضربونه وو چې لوړوالی یې 36 نیوکلیوټایډونه وو (ضمیمه انځور 1c)، چې د کتابتون ډیزاین (NNK) 1-12 تاییدوي. د پام وړ، د کتابتون غړو نږدې 11٪ د 12-dimensional وحشي ډول (wt) بیکبون PAGISRELVDKL داخل کړی و، او نږدې نیمایي ترتیبونه (49٪) داخلول یا حذف کول درلودل. د کتابتون کتابتون HTS په کتابتون کې د پیپټایډونو لوړ تنوع تایید کړ: د پیپټایډ ترتیبونو 81٪ څخه ډیر یوازې یو ځل وموندل شول او یوازې 1.5٪ په ≥4 کاپيونو کې پیښ شول (ضمیمه انځور 2a). د ریپرټویر په ټولو 12 پوستونو کې د امینو اسیدونو (aa) فریکونسۍ د تخریب شوي NKK ریپرټویر لخوا رامینځته شوي کوډونونو شمیر لپاره تمه شوي فریکونسۍ سره ښه اړیکه لري (ضمیمه انځور 2b). د دې داخلونو لخوا کوډ شوي د aa پاتې شونو مشاهده شوي فریکونسۍ د محاسبه شوي فریکونسۍ (r = 0.893) سره ښه اړیکه لري (ضمیمه انځور 2c). د انجیکشن لپاره د فیز کتابتونونو چمتو کول د انډوټوکسین د تقویت او لرې کولو مرحلې شاملې دي. دا دمخه ښودل شوي چې د فیز کتابتونونو تنوع کمولو لپاره په بالقوه توګه ښودل شوی 12,13. له همدې امله، موږ د پلیټ-امپلیفایډ فیز کتابتون ترتیب کړ چې د انډوټوکسین لرې کولو څخه تیر شوی و او د AA فریکونسي اټکل کولو لپاره یې د اصلي کتابتون سره پرتله کړ. د اصلي حوض او امپلیفایډ او پاک شوي حوض (ضمیمه انځور 2d) ترمنځ یو قوي اړیکه (r = 0.995) لیدل شوې، چې دا په ګوته کوي چې د T7 فیز په کارولو سره په پلیټونو کې د تقویت شوي کلونونو ترمنځ سیالي د لوی تعصب لامل نه شوه. دا پرتله کول په هر کتابتون کې د ټریپپټایډ شکلونو فریکونسي پراساس دي، ځکه چې د کتابتونونو تنوع (~109) حتی د HTS سره په بشپړ ډول نشي نیول کیدی. په هر موقعیت کې د AA فریکونسي تحلیل د داخل شوي ریپرټویر په وروستیو دریو موقعیتونو کې د موقعیت پورې تړلی یو کوچنی تعصب څرګند کړ (ضمیمه انځور 2e). په پایله کې، موږ پایله وکړه چې د کتابتون کیفیت او تنوع د منلو وړ و او د انتخاب د څو پړاوونو ترمنځ د فیز کتابتونونو د تقویت او چمتووالي له امله په تنوع کې یوازې کوچني بدلونونه لیدل شوي.
د دماغي نخاعي مایعاتو لړۍ نمونه اخیستل د هوښیار موږکانو CM ته د جراحي له لارې د کینولا لګولو له لارې ترسره کیدی شي ترڅو د BBB او/یا BCSFB له لارې د رګونو له لارې (iv) د T7 فیز د پیژندنې اسانتیا لپاره (انځور 1a-b). موږ د ان ویوو انتخاب په لومړیو دریو پړاوونو کې دوه خپلواک انتخابي وسلې (لاسونه A او B) وکارولې (انځور 1c). موږ په تدریجي ډول د انتخاب په لومړیو دریو پړاوونو کې د معرفي شوي فیز ټول مقدار کمولو سره د انتخاب سختوالی زیات کړ. د پینینګ څلورم پړاو لپاره، موږ د A او B څانګو څخه نمونې یوځای کړې او درې اضافي خپلواک انتخابونه یې ترسره کړل. پدې ماډل کې د T7 فیز ذراتو د ان ویوو ملکیتونو مطالعې لپاره، وحشي ډول فیز (PAGISRELVDKL ماسټر داخل) د لکۍ رګ له لارې موږکانو ته داخل شو. د دماغي نخاعي مایع او وینې څخه د فیزونو بیا رغونه په مختلفو وختونو کې ښودلې چې نسبتا کوچني T7 ایکوسایډرل فیزونه د وینې برخې څخه د چټک لومړني پاکولو مرحله درلوده (ضمیمه انځور 3). د موږکانو د ورکړل شویو ټایټرونو او د وینې حجم پراساس، موږ محاسبه وکړه چې د رګونو له لارې د انجیکشن څخه یوازې نږدې 1٪ wt. فیج د 27.7 دقیقو وروسته په وینه کې کشف شو. د دې لومړني چټک کمښت وروسته، د 27.7 دقیقو نیم ژوند سره یو ورو لومړنی پاکوالی اندازه شو. په مهمه توګه، یوازې ډیر لږ فیجونه د CSF برخې څخه ترلاسه شوي، چې د CSF برخې ته د وحشي ډول فیج مهاجرت لپاره ټیټ شالید په ګوته کوي (ضمیمه انځور 3). په اوسط ډول، په ټوله نمونه اخیستنې دوره (0-250 دقیقې) کې د دماغي نخاعي مایع کې د T7 فیج یوازې 1 x 10-3٪ ټیټرونه او د پیل شوي فیجونو 4 x 10-8٪ کشف شوي. د پام وړ، د دماغي نخاعي مایع کې د وحشي ډول فیج نیم ژوند (25.7 دقیقې) د وینې سره ورته و چې په وینه کې لیدل کیږي. دا معلومات ښیي چې د CM-کینول شوي موږکانو کې د وینې څخه د CSF برخې جلا کولو خنډ روغ دی، چې په ژوندیو کې د فیز کتابتونونو انتخاب ته اجازه ورکوي ترڅو هغه کلونونه وپیژني چې په اسانۍ سره د وینې څخه CSF برخې ته لیږدول کیږي.
(الف) د لوی حوض څخه د دماغي نخاعي مایع (CSF) د بیا نمونې لپاره د یوې طریقې تنظیم کول. (ب) ډیاګرام چې د مرکزي عصبي سیسټم (CNS) خنډ د حجروي موقعیت او د انتخاب ستراتیژي ښیې چې د پیپټایډونو پیژندلو لپاره کارول کیږي چې د وینې-دماغ خنډ (BBB) ​​او د وینې-دماغ خنډ څخه تیریږي. (ج) د ویوو فیز ښودنې سکرینینګ فلو چارټ. د انتخاب په هر پړاو کې، فیزونه (د تیرونو دننه د څارویو پیژندونکي) د رګونو له لارې انجیکشن شوي. دوه خپلواک بدیل څانګې (A، B) د انتخاب تر څلورم پړاو پورې په جلا توګه ساتل کیږي. د انتخاب پړاو 3 او 4 لپاره، د CSF څخه استخراج شوي هر فیز کلون په لاسي ډول ترتیب شوی و. (د) د T7 پیپټایډ کتابتون (2 x 1012 فیزونه/حیوان) د رګونو له لارې انجیکشن وروسته په دوه کینول شوي موږکانو کې د انتخاب په لومړي پړاو کې د وینې (سره حلقو) او دماغي نخاعي مایع (شنه مثلثونو) څخه جلا شوي فیز کینیټکس. نیلي مربعونه په وینه کې د فیج اوسط لومړني غلظت ښیي، چې د انجیکشن شوي فیج مقدار څخه محاسبه کیږي، د وینې ټول حجم په پام کې نیولو سره. تور مربعونه د وینې فیج غلظت څخه د y کرښې د تقاطع نقطه ښیي. (e,f) په پیپټایډ کې موندل شوي د ټولو ممکنه اوورلیپینګ ټریپیپټایډ شکلونو نسبي فریکونسي او ویش وړاندې کړئ. په 1000 لوستلو کې موندل شوي شکلونو شمیر ښودل شوی. په پام وړ توګه (p < 0.001) بډایه شکلونه د سره نقطو سره نښه شوي. (e) د انجیکشن شوي کتابتون د ټریپپټایډ شکل د نسبي فریکونسي پرتله کول د څارویو #1.1 او #1.2 څخه د وینې څخه اخیستل شوي شکل سره. (f) د ارتباط سکریټرپلوټ د څارویو د فیج ټریپیپټایډ شکلونو نسبي فریکونسي پرتله کول #1.1 او #1.2 په وینه او دماغي نخاعي مایع کې جلا شوي. (g، h) د دواړو څارویو کې د ان ویوو انتخاب له یوې دورې وروسته د وینې په مقابل کې د انجیکشن شوي کتابتونونو په مقابل کې د فیز (g) او په CSF (h) کې د فیز غني شوي د تسلسل ID استازیتوب. د یو توري کوډ اندازه ښیي چې دا امینو اسید په دې موقعیت کې څو ځله پیښیږي. شنه = قطبي، ارغواني = بې طرفه، نیلي = اساسي، سور = تیزابي او تور = هایدروفوبیک امینو اسیدونه. شکل 1a، b د اډوارډ یوریچ لخوا ډیزاین او تولید شوی.
موږ د فیز پیپټایډ کتابتون په دوو CM وسایلو موږکانو (کلیډونه A او B) کې داخل کړ او د دماغي نخاعي مایع او وینې څخه جلا شو (شکل 1d). د کتابتون لومړنی چټک پاکوالی د وحشي ډول فاج په پرتله لږ څرګند و. په دواړو څارویو کې د انجیکشن شوي کتابتون اوسط نیم ژوند په وینه کې 24.8 دقیقې و، د وحشي ډول فاج سره ورته، او په CSF کې 38.5 دقیقې. د هر څارویو څخه د وینې او دماغي نخاعي مایع فاج نمونې د HTS تابع شوې وې او ټول پیژندل شوي پیپټایډونه د لنډ ټریپپټایډ شکل شتون لپاره تحلیل شوي وو. ټریپپټایډ شکلونه غوره شوي ځکه چې دوی د جوړښت جوړولو او پیپټایډ-پروټین تعاملاتو لپاره لږترلږه اساس چمتو کوي 14,15. موږ د انجیکشن شوي فیز کتابتون او د دواړو څارویو له وینې څخه ایستل شوي کلونونو ترمنځ د شکلونو په ویش کې ښه اړیکه وموندله (شکل 1e). معلومات ښیي چې د کتابتون جوړښت یوازې د وینې په برخه کې په لږ څه ډول بډایه شوی دی. د ویبلوګو 16 سافټویر د تطبیق په کارولو سره په هر موقعیت کې د امینو اسید فریکونسۍ او د موافقې ترتیبونه نور هم تحلیل شول. په زړه پورې خبره دا ده چې موږ د وینې ګلایسین پاتې شونو کې قوي غني کول وموندل (انځور 1g). کله چې وینه د CSF څخه غوره شوي کلونونو سره پرتله شوه، قوي انتخاب او د شکلونو ځینې غیر انتخاب لیدل شوي (انځور 1f)، او ځینې امینو اسیدونه په غوره توګه د 12 غړو (انځور 1h) کې په مخکې ټاکل شوي موقعیتونو کې شتون درلود. د پام وړ، انفرادي څارویو د دماغي نخاعي مایع کې د پام وړ توپیر درلود، پداسې حال کې چې د وینې ګلایسین بډای کول په دواړو څارویو کې لیدل شوي (ضمیمه انځور 4a-j). د څارویو #1.1 او #1.2 د دماغي نخاعي مایع کې د ترتیب معلوماتو سخت فلټر کولو وروسته، ټولټال 964 او 420 ځانګړي 12-mer پیپټایډونه ترلاسه شول (ضمیمه انځور 1d-e). جلا شوي فیج کلونونه پراخ شوي او د ان ویوو انتخاب دوهم پړاو ته تابع شوي. د انتخاب له دوهم پړاو څخه استخراج شوي فیج په هر څاروي کې د HTS تابع شول او ټول پیژندل شوي پیپټایډونه د ټریپیپټایډ شکلونو د پیښې تحلیل لپاره د موټیف پیژندنې پروګرام ته د ننوتلو په توګه کارول شوي وو (انځور 2a، b، ef). د CSF څخه ترلاسه شوي فیج د لومړي دورې په پرتله، موږ په A او B څانګو کې د CSF کې د ډیری شکلونو نور انتخاب او غیر انتخاب ولیدل (انځور 2). د شبکې پیژندنې الګوریتم پلي شو ترڅو معلومه شي چې ایا دوی د دوامداره ترتیب مختلف نمونې استازیتوب کوي. د بدیل کلیډ A (انځور 2c، d) او کلیډ B (انځور 2g، h) کې د CSF لخوا ترلاسه شوي 12-ابعادي ترتیبونو ترمنځ یو روښانه ورته والی لیدل شوی. په هره څانګه کې د راټول شوي تحلیل د 12-mer پیپټایډونو لپاره مختلف انتخاب پروفایلونه (ضمیمه انځور 5c، d) او د انتخاب د لومړي پړاو په پرتله د دوهم پړاو وروسته د راټول شوي کلونونو لپاره د وخت په تیریدو سره د CSF/د وینې ټایټر تناسب کې زیاتوالی څرګند کړ (ضمیمه انځور 5e).
د ان ویوو فعال فیز ښودنې انتخاب د دوه پرله پسې پړاوونو لخوا د دماغي نخاعي مایع کې د شکلونو او پیپټایډونو بډایه کول.
د هر څاروي (څاروي #1.1 او #1.2) د لومړي پړاو څخه ترلاسه شوي ټول دماغي نخاعي مایع فیزونه راټول شوي، پراخ شوي، HT-ترتیب شوي او بیا یوځای شوي (2 x 1010 فیزونه/حیوان) 2 SM کینول شوي موږکان (#1.1 → #). 2.1 او 2.2، 1.2 → 2.3 او 2.4). (a,b,e,f) د ارتباط سکیټرپلاټونه چې د لومړي او دوهم انتخاب پړاوونو کې د ټولو CSF څخه اخیستل شوي فیزونو د ټرای پیپټایډ شکلونو نسبي فریکونسي پرتله کوي. د موټیفونو نسبي فریکونسي او ویش چې په دواړو لوریو کې په پیپټایډونو کې موندل شوي ټول ممکنه اوورلیپ ټری پیپټایډونه استازیتوب کوي. د 1000 لوستلو کې موندل شوي موټیفونو شمیر ښودل شوی. هغه موټیفونه چې د پام وړ (p < 0.001) د پرتله شوي کتابتونونو څخه په یوه کې غوره شوي یا خارج شوي وو د سره نقطو سره روښانه شوي. (c، d، g، h) د ټولو CSF بډایه 12 امینو اسید اوږد ترتیبونو د ترتیب لوګو استازیتوب د ان ویوو انتخاب د 2 او 1 پړاوونو پراساس. د یو حرف کوډ اندازه ښیي چې دا امینو اسید په دې موقعیت کې څومره ځله پیښیږي. د لوګو استازیتوب کولو لپاره، د دوه انتخاب پړاوونو ترمنځ د انفرادي څارویو څخه استخراج شوي CSF ترتیبونو فریکونسي پرتله کیږي او په دوهم پړاو کې بډایه شوي ترتیبونه ښودل شوي: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 او (h) #1.2–#2.4. په (c، d) څارویو نمبر 2.1 او نمبر 2.2 یا (g، h) کې په ورکړل شوي موقعیت کې ترټولو بډایه شوي امینو اسیدونه په 2.3 او نمبر 2.4 څارویو نمبر 2.1 او نمبر 2.2 کې په رنګ کې ښودل شوي. شنه = قطبي، ارغواني = بې طرفه، نیلي = اساسي، سور = تیزابي او تور = هایدروفوبیک امینو اسیدونه.
د انتخاب د دریم پړاو وروسته، موږ د 332 CSF-بیا جوړ شوي فیز کلونونو څخه 124 ځانګړي پیپټایډ ترتیبونه (#3.1 او #3.2) وپیژندل چې د دوو څارویو څخه جلا شوي وو (ضمیمه انځور 6a). د LGSVS ترتیب (18.7٪) ترټولو لوړ نسبي تناسب درلود، ورپسې د وحشي ډول داخلونه PAGISRELVDKL (8.2٪)، MRWFFSHASQGR (3٪)، DVAKVS (3٪)، TWLFSLG (2.2٪)، او SARGSWREIVSLS (2.2٪). په وروستي څلورم پړاو کې، موږ د دریو جلا څارویو څخه دوه په خپلواکه توګه غوره شوي څانګې راټولې کړې (شکل 1c). د CSF څخه ترلاسه شوي 925 ترتیب شوي فیز کلونونو څخه، په څلورم پړاو کې موږ 64 ځانګړي پیپټایډ ترتیبونه (ضمیمه انځور 6b) وموندل، چې په منځ کې یې د وحشي ډول فیز نسبي تناسب 0.8٪ ته راټیټ شو. په څلورم پړاو کې تر ټولو عام CSF کلونونه LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18٪)، LGSVS (17٪)، GFVRFRLSNTR (14٪)، KVAWRVFSLFWK (7٪)، SVHGV (5٪)، GRPQKINGARVC (3.6٪) او RLSSVDSDLSGC (3، 2٪) وو. %). د ټاکل شوي پیپټایډونو اوږدوالی حد د NNK کتابتون ډیزاین لپاره د تخریب شوي کوډونونو کارولو پرمهال د کتابتون پرائمرونو کې د نیوکلیوټایډ داخلولو / حذف کولو یا د وخت دمخه بند کوډونونو له امله دی. د وخت دمخه بند کوډونونه لنډ پیپټایډونه تولیدوي او غوره کیږي ځکه چې دوی د AA مناسب شکل لري. اوږد پیپټایډونه ممکن د مصنوعي کتابتونونو پرائمرونو کې د داخلولو / حذف کولو له امله رامینځته شي. دا ډیزاین شوی سټاپ کوډون د چوکاټ څخه بهر موقعیت لري او تر هغه وخته پورې یې لوستل کیږي تر څو چې یو نوی سټاپ کوډون ښکته ښکاري. په عمومي توګه، موږ د نمونې محصول ډیټا سره د ان پټ ډیټا پرتله کولو سره د ټولو څلورو انتخاب پړاوونو لپاره د غني کولو عوامل محاسبه کړل. د سکرینینګ د لومړي پړاو لپاره، موږ د غیر مشخص شالید حوالې په توګه د وحشي ډوله فیج ټایټرونو څخه کار واخیست. په زړه پورې خبره دا ده چې د منفي فیج انتخاب په لومړي CSF دوره کې خورا قوي و، مګر په وینه کې نه (انځور 3a)، کوم چې ممکن د پیپټایډ کتابتون د ډیری غړو د CSF برخې ته د غیر فعال خپریدو د ټیټ احتمال له امله وي یا نسبي فیجونه د باکتریوفیجونو په پرتله په ډیر مؤثره توګه ساتل کیږي یا د وینې جریان څخه لرې کیږي. په هرصورت، د پین کولو په دوهم پړاو کې، په CSF کې د فیجونو قوي انتخاب په دواړو کلیډونو کې لیدل شوی، چې وړاندیز کوي چې مخکینی پړاو په هغو فیجونو کې بډای شوی و چې پیپټایډونه ښیې چې د CSF جذب هڅوي (انځور 3a). بیا، د پام وړ وینې بډایه کولو پرته. همدارنګه په دریم او څلورم پړاو کې، د فیج کلونونه په CSF کې د پام وړ بډایه شوي وو. د انتخاب د وروستیو دوو پړاوونو ترمنځ د هر ځانګړي پیپټایډ ترتیب نسبي فریکونسۍ پرتله کول، موږ وموندله چې سلسلې د انتخاب په څلورم پړاو کې حتی ډیرې بډایه شوي (انځور 3b). د دواړو پیپټایډ سمتونو په کارولو سره د ټولو 64 ځانګړو پیپټایډ ترتیبونو څخه ټولټال 931 ټرای پیپټایډ شکلونه استخراج شول. په څلورم پړاو کې ترټولو بډایه شوي شکلونه د انجیکشن شوي کتابتون (کټ آف: 10٪ بډایه کول) په پرتله په ټولو پړاوونو کې د دوی د بډایه کولو پروفایلونو لپاره ډیر نږدې معاینه شوي (ضمیمه انځور 6c). د انتخاب عمومي نمونې ښودلې چې ډیری مطالعه شوي محرکات د دواړو انتخاب څانګو په ټولو تیرو پړاوونو کې بډایه شوي. په هرصورت، ځینې نقشونه (د مثال په توګه SGL، VSG، LGS GSV) په عمده توګه د بدیل کلیډ A څخه وو، پداسې حال کې چې نور (د مثال په توګه FGW، RTN، WGF، NTR) په بدیل کلیډ B کې بډایه شوي وو.
د CSF- غني شوي فیز- ښودل شوي پیپټایډونو او بایوټینیلیټ شوي لیډر پیپټایډونو د CSF لیږد تایید چې د سټریپټاویډین پیلوډونو سره یوځای شوي.
(a) د غني کولو تناسب چې په ټولو څلورو پړاوونو (R1-R4) کې د انجیکشن شوي (ان پټ = I) فیز (PFU) ټایټرونو او ټاکل شوي CSF فیز ټایټرونو (آؤټ پټ = O) پراساس محاسبه شوي. د تیرو دریو پړاوونو (R2-R4) لپاره د غني کولو عوامل د وزن معلوماتو سره د تیر پړاو او لومړي پړاو (R1) سره پرتله کولو سره محاسبه شوي. خلاص بارونه د دماغي نخاعي مایع دي، سیوري شوي بارونه پلازما دي. (***p<0.001، د زده کونکي د t-ټیسټ پراساس). (b) د خورا بډایه فیز پیپټایډونو لیست، د انتخاب د څلورم پړاو وروسته په CSF کې راټول شوي ټولو فیزونو سره د دوی د نسبي تناسب له مخې درجه بندي شوی. شپږ خورا عام فیز کلونونه په رنګ، شمیرل شوي او د انتخاب د دریم او څلورم پړاو (ان سیټونو) ترمنځ د دوی د غني کولو عوامل روښانه شوي. (c,d) د څلورم پړاو څخه شپږ خورا بډایه فیز کلونونه، خالي فیز او د والدین فیز پیپټایډ کتابتونونه په انفرادي ډول د CSF نمونې ماډل کې تحلیل شوي. د CSF او د وینې نمونې په ټاکل شوي وخت ټکو کې راټولې شوې. (c) د 6 نوماند فیز کلونونو مساوي مقدار (2 x 1010 فیزونه/حیوانات)، خالي فیزونه (#1779) (2 x 1010 فیزونه/حیوانات) او د سټاک فیز پیپټایډ کتابتونونه (2 x 1012 فیزونه/حیوانات). لږترلږه 3 CM انجیکشن کړئ چې کینول شوي څاروي ته په جلا توګه د لکۍ رګ له لارې اداره کیږي. د هر انجیکشن شوي فیز کلون او د فیز پیپټایډ کتابتون CSF فارماکوکینیټکس د وخت په تیریدو سره ښودل شوی. (d) د نمونې اخیستلو په وخت کې د ټولو بیرته ترلاسه شوي فیزونو/mL لپاره د CSF/وینې اوسط تناسب ښیې. (e) څلور مصنوعي مشر پیپټایډونه او یو سکریمبیل شوی کنټرول د دوی د N-ټرمینس (ټیټرمر ښودنه) له لارې د بایوټین سره سټریپټاویډین سره وصل شوي وو چې وروسته یې انجیکشن (د لکۍ رګ iv، 10 ملی ګرامه سټریپټاویډین/کیلوګرام). لږترلږه درې انټیوب شوي موږکان (N = 3). د CSF نمونې په ټاکل شوي وخت ټکو کې راټولې شوې او د سټریپټاویډین غلظت د CSF ضد سټریپټاویډین ELISA لخوا اندازه شو (nd = نه دی کشف شوی). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, د ANOVA ازموینې پراساس). (f) د غوره شوي څلورم پړاو څخه د نورو غوره شوي فیز پیپټایډی کلونونو سره د خورا غني شوي فیز پیپټایډی کلون #2002 (ارغواني) د امینو اسید ترتیب پرتله کول. ورته او ورته امینو اسید ټوټې د رنګ کوډ شوي دي.
په څلورم پړاو کې د ټولو غني شویو فیجونو څخه (انځور 3b)، د CSF نمونې ماډل کې د نورو انفرادي تحلیل لپاره شپږ د کاندید کلونونه غوره شوي. د شپږو کاندید فیج، خالي فیج (نه داخل شوی) او د پروفیج پیپټایډ کتابتونونو مساوي مقدارونه په دریو کینول شوي CM څارویو کې داخل شوي، او فارماکوکینیټکس په CSF (انځور 3c) او وینې (ضمیمه شکل 7) ارزونو کې ټاکل شوي. ټول د فیج کلونونه ازمول شوي د CSF برخې په نښه کوي چې د خالي کنټرول فیج (#1779) په پرتله 10-1000 ځله لوړ دي. د مثال په توګه، کلون #2020 او #2077 د کنټرول فیج په پرتله شاوخوا 1000 ځله لوړ CSF ټایټرونه درلودل. د هر غوره شوي پیپټایډ فارماکوکینیټیک پروفایل توپیر لري، مګر ټول یې د CSF لوړ کور کولو وړتیا لري. موږ د کلونونو #1903 او #2011 لپاره د وخت په تیریدو سره دوامداره کمښت ولید، پداسې حال کې چې د کلونونو #2077، #2002 او #2009 لپاره د لومړیو 10 دقیقو په جریان کې زیاتوالی ممکن فعال لیږد په ګوته کړي مګر باید تایید شي. کلونونو #2020، #2002، او #2077 په لوړه کچه ثبات درلود، پداسې حال کې چې د کلونونو #2009 CSF غلظت ورو ورو د لومړني زیاتوالي وروسته کم شو. بیا موږ د هر CSF نوماند نسبي فریکونسي د هغې د وینې غلظت سره پرتله کړه (انځور 3d). د نمونې اخیستلو په ټولو وختونو کې د هر CSF نوماند د اوسط ټایټر سره د هغې د وینې ټایټر سره اړیکه وښودله چې د شپږو نوماندانو څخه درې یې د وینې CSF کې د پام وړ بډایه شوي. په زړه پورې خبره دا ده چې کلون #2077 د وینې لوړ ثبات ښودلی (ضمیمه شکل 7). د دې تایید لپاره چې پیپټایډونه پخپله د فیج ذراتو پرته د کارګو په فعاله توګه د CSF برخې ته د لیږدولو وړتیا لري، موږ د N-ټرمینس کې د بایوټین سره مشتق شوي څلور مشر پیپټایډونه ترکیب کړل چیرې چې پیپټایډونه د فیج ذراتو سره نښلوي. بایوټینیلیټ شوي پیپټایډونه (شمېره 2002، 2009، 2020 او 2077) د سټریپټاویډین (SA) سره یوځای شوي ترڅو څو اړخیز شکلونه ترلاسه کړي چې یو څه د فیج جیومیټري تقلید کوي. دې بڼې موږ ته اجازه هم راکړه چې د کارګو لیږدونکي پروټین پیپټایډونو په توګه په وینه او دماغي نخاعي مایع کې د SA افشا کول اندازه کړو. په مهمه توګه، د فیج ډیټا ډیری وختونه بیا تولید کیدی شي کله چې مصنوعي پیپټایډونه په دې SA-conjugated بڼه کې اداره کیږي (شکل 3e). سکریبل شوي پیپټایډونه لږ لومړني افشا کول او د 48 ساعتونو دننه د نه کشف کیدونکي کچې سره د CSF ګړندی پاکول درلودل. د CSF ځای ته د دې پیپټایډ فیج کلونونو د تحویلي لارو په اړه بصیرت ترلاسه کولو لپاره، موږ د امیونوهیسټو کیمیا (IHC) په کارولو سره د انفرادي فیج پیپټایډ هټونو ځایی کول تحلیل کړل ترڅو په ویوو کې د رګونو انجیکشن څخه 1 ساعت وروسته د فیج ذرات مستقیم کشف کړي. د پام وړ، کلون #2002، #2077، او #2009 د دماغ کیپلیریز کې د قوي داغ له لارې کشف کیدی شي، پداسې حال کې چې کنټرول فیج (#1779) او کلون #2020 کشف شوي ندي (ضمیمه شکل 8). دا وړاندیز کوي چې دا پیپټایډونه د BBB څخه تیریدو سره په سمه توګه په دماغ باندې اغیز کې مرسته کوي. د دې فرضیې ازموینې لپاره نور تفصيلي تحلیل ته اړتیا ده، ځکه چې د BSCFB لاره هم ممکن دخیل وي. کله چې د خورا بډایه شوي کلون (#2002) د امینو اسید ترتیب د نورو غوره شوي پیپټایډونو سره پرتله کول، دا یادونه وشوه چې ځینې یې ورته امینو اسید توسیعونه لري، کوم چې ممکن ورته ټرانسپورټ میکانیزم په ګوته کړي (انځور 3f).
د خپل ځانګړي پلازما پروفایل او د وخت په تیریدو سره په CSF کې د پام وړ زیاتوالي له امله، د فیز ډیسپلی کلون #2077 د 48 ساعتونو په اوږدو کې نور هم وپلټل شو او د SA د دوامداره کچو سره په ملګرتیا کې لیدل شوي CSF کې د چټک زیاتوالي بیا تولید کولو توان درلود (انځور 4a). د نورو پیژندل شوي فیز کلونونو په اړه، #2077 د دماغ کیپلیریز لپاره په کلکه رنګ شوی او د کیپلیریز مارکر لیکټین سره د پام وړ ګډول ښودلی کله چې په لوړ ریزولوشن کې لیدل کیږي او ممکن په پیرنچیمال ځای کې ځینې رنګ کول (انځور 4b). د دې لپاره چې ایا د پیپټایډ منځګړیتوب فارماسولوژیکي اغیزې په CNS کې ترلاسه کیدی شي، موږ یوه تجربه ترسره کړه چې په کې د i) #2077 ټرانزیټ پیپټایډ او ii) BACE1 مخنیوی کونکي پیپټایډ بایوټینیلیټ شوي نسخې د SA سره په دوه مختلف تناسب کې مخلوط شوې. د یو ترکیب لپاره موږ یوازې BACE1 پیپټایډ مخنیوی کونکی وکاروو او د بل لپاره موږ د BACE1 پیپټایډ مخنیوی کونکی د #2077 پیپټایډ سره 1:3 تناسب وکاروو. دواړه نمونې د رګونو له لارې ورکړل شوې او د وخت په تیریدو سره د بیټا امیلایډ پیپټایډ 40 (Abeta40) د وینې او دماغي نخاعي مایع کچه اندازه شوه. Abeta40 په CSF کې اندازه شو ځکه چې دا د دماغ په پارینچیما کې د BACE1 مخنیوی منعکس کوي. لکه څنګه چې تمه کیده، دواړو کمپلیکسونو د Abeta40 د وینې کچه د پام وړ کمه کړه (انځور 4c، d). په هرصورت، یوازې هغه نمونې چې د پیپټایډ نمبر 2077 او د BACE1 پیپټایډ یو مخنیوی کوونکی چې SA سره یوځای شوی و، د دماغي نخاعي مایع کې د Abeta40 کې د پام وړ کمښت لامل شو (انځور 4c). معلومات ښیې چې پیپټایډ نمبر 2077 د 60 kDa SA پروټین CNS ته لیږدولو توان لري او همدارنګه د BACE1 پیپټایډ د SA-conjugated inhibitors سره د فارماسولوژیکي اغیزو هڅوي.
(a) د T7 فیز کلونل انجیکشن (2 × 10 فیزونه/حیوان) چې د CSF پیپټایډ #2077 (RLSSVDSDLSGC) او غیر انجیکشن شوي کنټرول فیز (#1779) اوږدمهاله فارماکوکینټیک پروفایلونه ښیې چې لږترلږه په دریو CM-انټیوب شوي موږکانو کې دي. (b) د فیز انجیکشن شوي موږکانو کې د استازي کورټیکل مایکرو رګونو کنفوکل مایکروسکوپي عکس (2 × 10 10 فیزونه/حیوان) د پیپټایډ #2077 او رګونو (لیکټین) ضد داغ ښیې. دا فیز کلونونه 3 موږکانو ته ورکړل شوي او د پرفیوژن دمخه د 1 ساعت لپاره د گردش کولو اجازه ورکړل شوې. دماغونه د T7 فیز کیپسډ پروړاندې د پولی کلونل FITC لیبل شوي انټي باډیز سره قطع شوي او رنګ شوي. د پرفیوژن او وروسته فکسیشن څخه لس دقیقې دمخه، DyLight594 لیبل شوی لیکټین د رګونو له لارې اداره شوی و. فلوروسینټ انځورونه چې د کیپلیري او پیریواسکولر دماغ نسجونو په لومین کې د مایکرو رګونو او فیجونو (شنه) د لیټین رنګ (سور) ښیې. د پیمانه بار د 10 µm سره مطابقت لري. (c، d) بایوټینیلیټ شوی BACE1 مخنیوی پیپټایډ یوازې یا د بایوټینیلیټ شوي ټرانزیټ پیپټایډ سره په ترکیب کې #2077 د سټریپټاویډین سره یوځای شوی و او وروسته د لږترلږه درې کینول شوي CM موږکانو (10 ملی ګرامه سټریپټاویډین / کیلوګرام) د رګونو انجیکشن لخوا. د BACE1 پیپټایډ مخنیوی کونکي منځګړیتوب کمښت په Aβ40 کې د Aβ1-40 ELISA لخوا په وینه (سور) او دماغي نخاعي مایع (نارنج) کې په اشاره شوي وخت ټکو کې اندازه شو. د ښه وضاحت لپاره، په ګراف کې د 100٪ پیمانه کې یوه نقطه شوې کرښه رسم شوې ده. (ج) په هغو موږکانو کې چې د سټریپټاویډین سره درملنه شوي او د ټرانزیټ پیپټایډ #2077 او BACE1 مخنیوی پیپټایډ سره یوځای شوي، په وینه کې د Aβ40 (سره حلقې) او د 3:1 تناسب کې د دماغي نخاعي مایع (نارنجي حلقې) کې د Aβ40 سلنه کمښت. (د) د هغو موږکانو په وینه کې د Aβ40 (سره حلقې) او د دماغي نخاعي مایع (نارنجي حلقې) کې د سلنه کمښت چې د سټریپټاویډین سره درملنه شوي او یوازې د BACE1 مخنیوی پیپټایډ سره یوځای شوي. په کنټرول کې د Aβ غلظت 420 pg/ml (معیاري انحراف = 101 pg/ml) و.
د فیج ښودنه په بریالیتوب سره د بایومیډیکل څیړنو په ډیری برخو کې کارول شوې ده17. دا طریقه د ان ویوو واسکولر تنوع مطالعاتو لپاره کارول شوې ده18,19 او همدارنګه د دماغي رګونو په نښه کولو مطالعاتو لپاره 20,21,22,23,24,25,26. پدې څیړنه کې، موږ د دې انتخاب میتود پلي کول نه یوازې د دماغي رګونو په نښه کولو پیپټایډونو مستقیم پیژندنې ته، بلکه د هغو نوماندانو کشف ته هم وغځول چې د وینې دماغ خنډ څخه تیریږي. موږ اوس په CM انټیوبیټ شوي موږکانو کې د ان ویوو انتخاب پروسې پراختیا تشریح کوو او د CSF کور کولو ملکیتونو سره د پیپټایډونو پیژندلو لپاره د هغې وړتیا ښیې. د T7 فیج په کارولو سره چې د 12-mer تصادفي پیپټایډونو کتابتون ښیې، موږ وکولی شو وښیو چې T7 فیج دومره کوچنی دی (تقریبا 60 nm قطر)10 چې د وینې دماغ خنډ سره تطابق شي، په دې توګه په مستقیم ډول د وینې دماغ خنډ یا کورایډ پلیکسس څخه تیریږي. موږ ولیدل چې د کینول شوي CM موږکانو څخه د CSF راټولول د ان ویوو فعال سکرینینګ یوه ښه کنټرول شوې طریقه وه، او دا چې استخراج شوی فیج نه یوازې د رګونو سره تړلی و بلکې د وینې-دماغ خنډ په اوږدو کې د لیږدونکي په توګه هم کار کاوه. سربیره پردې، په ورته وخت کې د وینې راټولولو او CSF او د وینې څخه اخیستل شوي فیجونو ته د HTS پلي کولو سره، موږ تایید کړه چې زموږ د CSF انتخاب د وینې بډایه کولو یا د انتخاب د پړاوونو ترمنځ د پراختیا لپاره فټنس لخوا اغیزمن شوی نه و. په هرصورت، د وینې کمپارټمینټ د انتخاب پروسې برخه ده، ځکه چې هغه فیجونه چې د CSF کمپارټمینټ ته د رسیدو وړتیا لري باید ژوندي پاتې شي او د وینې جریان کې دومره اوږد گردش وکړي چې په دماغ کې ځان بډایه کړي. د خام HTS ډیټا څخه د باور وړ ترتیب معلوماتو استخراج لپاره، موږ د تحلیل کاري فلو کې د پلیټ فارم ځانګړي ترتیب غلطیو سره تطابق شوي فلټرونه پلي کړل. د سکرینینګ میتود کې د کاینټیک پیرامیټرونو شاملولو سره، موږ په وینه کې د وحشي ډول T7 فیجونو (t½ ~ 28 دقیقې) چټک فارماکوکینیټکس تایید کړ24، 27، 28 او همدارنګه د دوی نیم ژوند په دماغي نخاعي مایع (t½ ~ 26 دقیقې) کې په یوه دقیقه کې ټاکلی. سره له دې چې په وینه او CSF کې ورته فارماکوکینټیک پروفایلونه شتون لري، د فیز د وینې غلظت یوازې 0.001٪ په CSF کې کشف کیدی شي، چې د وینې-دماغ خنډ په اوږدو کې د وحشي ډول T7 فیز ټیټ پس منظر حرکت په ګوته کوي. دا کار د ان ویوو پیننګ ستراتیژیو کارولو پرمهال د انتخاب د لومړي پړاو اهمیت روښانه کوي، په ځانګړي توګه د فیز سیسټمونو لپاره چې په چټکۍ سره د دوران څخه پاک شوي، ځکه چې لږ کلونونه د CNS برخې ته د رسیدو توان لري. پدې توګه، په لومړي پړاو کې، د کتابتون تنوع کمول خورا لوی و، ځکه چې یوازې محدود شمیر کلونونه په پای کې پدې خورا سخت CSF ماډل کې راټول شوي. پدې ان ویوو پیننګ ستراتیژۍ کې د انتخاب ډیری مرحلې شاملې وې لکه د CSF برخې کې فعال راټولول، د وینې برخې کې د کلون بقا، او د لومړیو 10 دقیقو کې د وینې څخه د T7 فیز کلونونو چټک لرې کول (انځور 1d او ضمیمه انځور 4M). په دې توګه، د لومړي پړاو وروسته، په CSF کې مختلف فیز کلونونه پیژندل شوي، که څه هم ورته لومړني حوض د انفرادي څارویو لپاره کارول شوی و. دا وړاندیز کوي چې د سرچینو کتابتونونو لپاره د انتخاب ډیری سخت ګامونه چې د کتابتون غړو لوی شمیر لري د تنوع کې د پام وړ کمښت لامل کیږي. له همدې امله، ناڅاپي پیښې به د لومړني انتخاب پروسې یوه لازمي برخه شي، چې پایله به یې خورا اغیزمنه کړي. احتمال لري چې په اصلي کتابتون کې ډیری کلونونه د CSF بډایه کولو ډیر ورته تمایل درلود. په هرصورت، حتی د ورته تجربوي شرایطو لاندې، د انتخاب پایلې ممکن په لومړني حوض کې د هر ځانګړي کلون د لږ شمیر له امله توپیر ولري.
په CSF کې غني شوي شکلونه د وینې له شکلونو څخه توپیر لري. په زړه پورې خبره دا ده چې موږ د انفرادي څارویو په وینه کې د ګلایسین بډایه پیپټایډونو په لور لومړی بدلون ولید. (انځور 1g، ضمیمه شوي شکلونه 4e، 4f). د ګلایسین پیپټایډونو لرونکی فیج ممکن ډیر مستحکم وي او د دوران څخه د ایستلو احتمال یې لږ وي. په هرصورت، دا ګلایسین بډایه پیپټایډونه د دماغي نخاعي مایع نمونو کې ندي کشف شوي، چې دا وړاندیز کوي چې جوړ شوي کتابتونونه د انتخاب دوه مختلف مرحلو څخه تیر شوي: یو په وینه کې او بل ته اجازه ورکړل شوې چې د دماغي نخاعي مایع کې راټول شي. د انتخاب د څلورم پړاو څخه پایله کې د CSF بډایه شوي کلونونه په پراخه کچه ازمول شوي. نږدې ټول انفرادي ازمول شوي کلونونه د خالي کنټرول فیج په پرتله په CSF کې غني شوي تایید شوي. یو پیپټایډ هټ (#2077) په ډیر تفصیل سره معاینه شوی. دا د نورو هټونو په پرتله د پلازما نیم ژوند اوږد ښودلی (شکل 3d او ضمیمه شکل 7)، او په زړه پورې خبره دا ده چې دا پیپټایډ په C-ټرمینس کې د سیستین پاتې شوني درلودل. پدې وروستیو کې ښودل شوي چې د پیپټایډونو ته د سیستین اضافه کول کولی شي د البومین 29 سره تړلو سره د دوی فارماکوکینټیک ملکیتونه ښه کړي. دا اوس مهال د پیپټایډ #2077 لپاره نامعلوم دی او نورو مطالعې ته اړتیا لري. ځینې پیپټایډونو د CSF بډایه کولو کې د والینس انحصار ښودلی (ډاټا نه ښودل کیږي)، کوم چې ممکن د T7 کیپسید ښودل شوي سطح جیومیټري سره تړاو ولري. هغه T7 سیسټم چې موږ یې کارولی د هر پیپټایډ د هر فیز ذرې 5-15 کاپي ښودلې. IHC د امیدوار لیډ فیز کلونونو باندې ترسره شو چې د موږکانو دماغي کورټیکس ته په رګونو کې انجیکشن شوي (ضمیمه شکل 8). معلوماتو ښودلې چې لږترلږه درې کلونونه (نمبر 2002، نمبر 2009 او نمبر 2077) د BBB سره تعامل وکړ. دا لا تر اوسه معلومه نه ده چې ایا د BBB تعامل د CSF د راټولیدو لامل کیږي یا د دې کلونونو مستقیم BCSFB ته حرکت کوي. په مهمه توګه، موږ ښیې چې غوره شوي پیپټایډونه د پروټین کارګو سره د ترکیب او تړل کیدو پرمهال خپل CSF ټرانسپورټ ظرفیت ساتي. د N-ټرمینل بایوټینیلیټ شوي پیپټایډونو SA سره تړل په اصل کې هغه پایلې تکراروي چې د دوی اړوند فیز کلونونو سره په وینه او دماغي مایع کې ترلاسه شوي (شکل 3e). په پای کې، موږ ښیې چې لیډ پیپټایډ #2077 د SA سره یوځای شوي BACE1 د بایوټینیلیټ شوي پیپټایډ مخنیوی کونکي دماغ عمل ته وده ورکولو توان لري، چې په CSF کې د Abeta40 کچه د پام وړ کمولو سره په CNS کې د فارماکوډینامیک اغیزو لامل کیږي (شکل 4). موږ نشو کولی د ټولو هټونو د پیپټایډ ترتیب هومولوژي لټون ترسره کولو سره په ډیټابیس کې کوم هومولوګونه وپیژنو. دا مهمه ده چې په یاد ولرئ چې د T7 کتابتون اندازه نږدې 109 ده، پداسې حال کې چې د 12-mers لپاره د نظري کتابتون اندازه 4 x 1015 ده. له همدې امله، موږ یوازې د 12-mer پیپټایډ کتابتون د تنوع ځای یوه کوچنۍ برخه غوره کړه، چې ممکن پدې معنی وي چې ډیر اصلاح شوي پیپټایډونه د دې پیژندل شوي هټونو د نږدې ترتیب ځای ارزولو سره پیژندل کیدی شي. په فرضي ډول، یو له هغو دلیلونو څخه چې ولې موږ د دې پیپټایډونو هیڅ طبیعي همجنسونه نه دي موندلي ممکن د ارتقا په جریان کې غیر انتخاب وي ترڅو دماغ ته د ځینې پیپټایډ شکلونو غیر کنټرول شوي ننوتلو مخه ونیسي.
په ګډه سره، زموږ پایلې د راتلونکي کار لپاره یو اساس چمتو کوي ترڅو د دماغي عصبي خنډ د ټرانسپورټ سیسټمونه په ویوو کې په ډیر تفصیل سره وپیژني او مشخص کړي. د دې میتود بنسټیز ترتیب د فعال انتخاب ستراتیژۍ پراساس دی چې نه یوازې د دماغي عصبي تړلو ملکیتونو سره کلونونه پیژني، بلکه یو مهم ګام هم پکې شامل دی چې پکې بریالي کلونونه د CNS برخې ته د ویوو کې د بیولوژیکي خنډونو څخه د تیریدو لپاره داخلي فعالیت لري. د دې پیپټایډونو د لیږد میکانیزم او د دماغ سیمې ته ځانګړي مایکرو واسکولچر سره د تړلو لپاره د دوی غوره توب روښانه کول دي. دا ممکن د BBB او ریسیپټرونو د لیږد لپاره د نویو لارو کشف لامل شي. موږ تمه لرو چې پیژندل شوي پیپټایډونه کولی شي په مستقیم ډول د دماغي عصبي ریسیپټرونو یا د BBB یا BCSFB له لارې لیږدول شوي گردش لیګنډونو سره وصل شي. پدې کار کې کشف شوي د CSF ټرانسپورټ فعالیت سره پیپټایډ ویکتورونه به نور هم وڅیړل شي. موږ اوس مهال د BBB او/یا BCSFB څخه د تیریدو وړتیا لپاره د دې پیپټایډونو د دماغ ځانګړتیا څیړو. دا نوي پیپټایډونه به د نوي ریسیپټرونو یا لارو د احتمالي کشف او دماغ ته د میکرو مالیکولونو، لکه بیولوژیکونو، رسولو لپاره د نوي خورا اغیزمن پلیټ فارمونو پراختیا لپاره خورا ارزښتناکه وسیلې وي.
د مخکینۍ تشریح شوي میتود د تعدیل په کارولو سره لوی سیسټرنا (CM) کینول کړئ. بې هوښه شوي ویستار موږکان (200-350 ګرامه) په سټیریوټیکسیک اپریټس کې نصب شوي وو او د سر د خلاصولو لپاره د منحني او غیر فعال ډول چمتو شوي سر په سر کې یو میډین چیرا جوړ شوی و. د پورتنۍ سیش په ساحه کې دوه سوري ډرل کړئ او په سوریو کې د فکس کولو پیچونه ټینګ کړئ. د سټینلیس سټیل کینول د سټیریوټیکیک لارښود لپاره د سی ایم کې د لیټرل اوکسیپیټل کریسټ کې یو اضافي سوري ډرل شوی و. د کینول شاوخوا د غاښونو سیمنټ واچوئ او د پیچونو سره خوندي کړئ. د عکس درملنې او سیمنټ سختیدو وروسته، د پوستکي زخم د 4/0 سوپرامډ سیون سره تړل شوی و. د کینول مناسب ځای پرځای کول د دماغي نخاعي مایع (CSF) د ناڅاپي لیکیدو لخوا تایید کیږي. موږکان د سټیریوټیکسیک اپریټس څخه لرې کړئ، د جراحي وروسته مناسب پاملرنه او د درد مدیریت ترلاسه کړئ، او اجازه ورکړئ چې لږترلږه یوه اونۍ لپاره روغ شي تر هغه چې د دماغي نخاعي مایع کې د وینې نښې ولیدل شي. د ویسټار موږکان (Crl:WI/Han) د چارلس سیند (فرانسې) څخه ترلاسه شوي. ټول موږکان د ځانګړو ناروغیو څخه پاک شرایطو لاندې ساتل شوي وو. د څارویو ټولې تجربې د سویس د باسل ښار د وترنري دفتر لخوا تصویب شوې وې او د څارویو جواز نمبر 2474 (د موږکانو د دماغي نخاعي مایع او دماغ کې د معالجوي نوماندانو د کچې اندازه کولو له لارې د فعال دماغ لیږد ارزونه) سره سم ترسره شوې.
موږک په نرمۍ سره د CM کانولا په لاس کې په هوش کې وساتئ. داتورا له کانولا څخه وباسئ او د دماغي نخاعي مایع 10 μl په ناڅاپي ډول بهیدونکي راټول کړئ. څرنګه چې د کانولا پیټینسي په نهایت کې له خطر سره مخ شوه، یوازې د دماغي نخاعي مایع روښانه نمونې چې د وینې ککړتیا یا رنګ بدلیدو هیڅ شواهد نلري پدې څیړنه کې شاملې شوې. په موازي ډول، نږدې 10-20 μl وینه د لکۍ په سر کې د یوې کوچنۍ چیرا څخه د هیپرین (سیګما-الډریچ) سره ټیوبونو ته اخیستل شوې. CSF او وینه د T7 فیز د رګونو انجیکشن وروسته په مختلفو وختونو کې راټولې شوې. د هر CSF نمونې راټولولو دمخه نږدې 5-10 μl مایع پریښودل شو، کوم چې د کتیټر د مړ حجم سره مطابقت لري.
کتابتونونه د T7Select 10-3b ویکتور په کارولو سره رامینځته شوي لکه څنګه چې د T7Select سیسټم لارښود کې تشریح شوي (نوواګن، روزنبرګ او نور، ان نوویشنز 6، 1-6، 1996). په لنډه توګه، د 12-mer DNA یو ناڅاپي داخل په لاندې بڼه کې ترکیب شوی و:
د NNK کوډون د دوه ګوني بند کوډونونو او امینو اسید ډیر څرګندیدو څخه د مخنیوي لپاره کارول شوی و. N د هر نیوکلیوټایډ د لاسي مخلوط مساوي تناسب دی، او K د اډینین او سایټوسین نیوکلیوټایډونو لاسي مخلوط مساوي تناسب دی. واحدې تړل شوې سیمې د dNTP (نوواګین) او کلینو انزایم (نیو انګلینډ بایولابز) سره د 3 ساعتونو لپاره په 37 درجو سانتي ګراد کې د 3 ساعتونو لپاره د انکیوبیشن له لارې په دوه ګوني تړل شوې DNA بدلې شوې. د تعامل وروسته، دوه ګونی تړل شوی DNA د EtOH باران لخوا بیرته ترلاسه شو. پایله لرونکی DNA د محدودیت انزایمونو EcoRI او HindIII (دواړه د روش څخه) سره هضم شو. ټوټه شوی او پاک شوی (QIAquick، Qiagen) داخل شوی (T4 لیګیز، نیو انګلینډ بایولابز) بیا د 10B کیپسیډ جین د امینو اسید 348 وروسته په چوکاټ کې د مخکې تړل شوي T7 ویکتور کې تړل شوی و. د ان ویټرو بسته بندۍ څخه دمخه د 18 ساعتونو لپاره د لیګیشن تعاملات په 16 درجو سانتي ګراد کې انکیوبیټ شوي وو. د فیج بسته بندۍ په ان ویټرو کې د T7Select 10-3b کلونینګ کټ (نوواګن) سره چمتو شوي لارښوونو سره سم ترسره شوې او د بسته بندۍ محلول یو ځل د ایسچریچیا کولی (BLT5615، نوواګن) په کارولو سره د لیسس کولو لپاره پراخه شوی و. لایسیټونه د ګلیسیرول د سټاک محلول په توګه په -80 درجو سانتي ګراد کې سینټرفیوج شوي، ټایټریټ شوي او کنګل شوي وو.
د فیز متغیر سیمو مستقیم PCR امپلیفیکیشن چې د ملکیت 454/Roche-amplicon فیوژن پرائمرونو په کارولو سره په شوروا یا پلیټ کې امپلیفیکیشن شوی. د فارورډ فیوژن پرائمر د متغیر سیمې (NNK) 12 (ټیمپلیټ-ځانګړی)، GS FLX ټایټانیوم اډاپټر A، او د څلور اساس کتابتون کیلي ترتیب (TCAG) سره تړلي ترتیبونه لري (ضمیمه شکل 1a):
د ریورس فیوژن پرائمر کې د کیپچر بیډز سره تړلی بایوټین او د ایمولشن PCR په جریان کې د کلونل امپلیفیکیشن لپاره اړین GS FLX ټایټانیوم اډاپټر B هم شامل دی:
بیا امپلیکونونه د 454 GS-FLX ټایټانیوم پروتوکول سره سم 454/Roche pyrosequencing سره مخ شول. د لاسي سنجر ترتیب لپاره (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer)، T7 فیز DNA د PCR لخوا پراخ شو او د لاندې پرائمر جوړو سره ترتیب شو:
د انفرادي تختو څخه داخل شوي مواد د روش فاسټ سټارټ DNA پولیمیریز کټ په کارولو سره د PCR امپلیفیکیشن سره مخ شوي (د جوړونکي لارښوونو سره سم). ګرم پیل (په 95 °C کې 10 دقیقې) او 35 بوسټ دورې (په 95 °C کې 50 ثانیې، په 50 °C کې 1 دقیقې، او په 72 °C کې 1 دقیقې) ترسره کړئ.
د کتابتونونو څخه فیج، وحشي ډول فیج، د CSF او وینې څخه ژغورل شوي فیج، یا انفرادي کلونونه په Escherichia coli BL5615 کې د TB په شوروا (Sigma Aldrich) کې یا په 500 cm2 لوښو (Thermo Scientific) کې د 4 ساعتونو لپاره په 37 درجو سانتي ګراد کې لوړ شوي وو. فیج د Tris-EDTA بفر (Fluka Analytical) سره د پلیټونو په مینځلو سره یا د تعقیم پایپټ لارښوونو سره د تختو راټولولو سره له پلیټونو څخه ایستل شوي وو. فیج د پولیټیلین ګلایکول (PEG 8000) باران (Promega) د یو پړاو سره د کلچر سپرنټینټ یا استخراج بفر څخه جلا شوي وو او په Tris-EDTA بفر کې بیا ځړول شوي وو.
امپلیفایډ شوی فیج د رګونو له لارې (IV) انجیکشن (500 μl/حیوان) څخه دمخه د انډوټوکسین لرې کولو موتی (Miltenyi Biotec) په کارولو سره د انډوټوکسین لرې کولو 2-3 پړاوونه ترسره کړل. په لومړي پړاو کې، 2×1012 فیجونه معرفي شول؛ په دوهم کې، 2×1010 فیجونه؛ په دریم او څلورم انتخاب پړاوونو کې، په هر څاروي کې 2×109 فیجونه. په CSF او د وینې نمونو کې د فیج مینځپانګه په ټاکل شوي وخت ټکو کې راټوله شوې وه د تولید کونکي لارښوونو سره سم د تختې شمیرنې لخوا ټاکل شوې وه (T7Select سیسټم لارښود). د فیج انتخاب د لکۍ رګ ته د پاک شوي کتابتونونو د رګونو انجیکشن یا د تیر انتخاب پړاو څخه د CSF څخه ایستل شوي فیج بیا انجیکشن لخوا ترسره شو، او وروسته حاصلات په ترتیب سره په 10 دقیقو، 30 دقیقو، 60 دقیقو، 90 دقیقو، 120 دقیقو، 180 دقیقو، او 240 دقیقو کې په ترتیب سره CSF او د وینې نمونې ترسره شوې. د ان ویوو پیننګ ټول څلور پړاوونه ترسره شول چې پکې دوه غوره شوي څانګې په جلا توګه د انتخاب په لومړیو دریو پړاوونو کې زیرمه او تحلیل شوې. د انتخاب له لومړیو دوو پړاوونو څخه د CSF څخه استخراج شوي ټول فیز داخلونه د 454/Roche pyrosequencing تابع وو، پداسې حال کې چې د انتخاب له وروستیو دوو پړاوونو څخه د CSF څخه استخراج شوي ټول کلونونه په لاسي ډول ترتیب شوي وو. د انتخاب له لومړي پړاو څخه ټول د وینې فیزونه هم د 454/Roche pyrosequencing تابع وو. د فیز کلونونو د انجیکشن لپاره، غوره شوي فیزونه په E. coli (BL5615) کې د 500 cm2 پلیټونو کې د 4 ساعتونو لپاره په 37°C کې لوړ شوي وو. په انفرادي ډول غوره شوي او په لاسي ډول ترتیب شوي کلونونه د TB په منځ کې تکثیر شوي وو. د فیز استخراج، پاکولو او د انډوټوکسین لرې کولو وروسته (لکه څنګه چې پورته تشریح شوي)، په 300 μl کې 2×1010 فیزونه/حیوان په یوه لکۍ رګ کې د رګ له لارې انجیکشن شوي وو.
د ترتیب معلوماتو دمخه پروسس کول او کیفیتي فلټر کول. د خام 454/Roche ډاټا د پلورونکي سافټویر په کارولو سره د بائنری معیاري سټریم نقشې فارمیټ (sff) څخه د پیرسن انساني لوستلو وړ فارمیټ (fasta) ته بدله شوه. د نیوکلیوټایډ ترتیب نور پروسس د ملکیت C برنامو او سکریپټونو (نه خپور شوی سافټویر پیکج) په کارولو سره ترسره شو لکه څنګه چې لاندې تشریح شوی. د لومړني معلوماتو تحلیل کې سخت څو مرحلې فلټر کولو پروسیجرونه شامل دي. د هغه لوستلو فلټر کولو لپاره چې د اعتبار وړ 12mer داخل DNA ترتیب نلري، لوستل په ترتیب سره د پیل لیبل (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT)، سټاپ لیبل (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) او شالید داخل (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGTCGTCG) سره سمون درلود چې د نړیوال Needleman-Wunsch ازموینې په کارولو سره. سمون په هر سمون کې تر 2 پورې ناانډولۍ ته اجازه ورکوي 31. له همدې امله، د پیل او بند ټګونو پرته لوستل او د شالید داخلونه لرونکي لوستل، د بیلګې په توګه، هغه سمونونه چې د بې اتفاقۍ اجازه ورکړل شوي شمیر څخه ډیر وي، له کتابتون څخه لرې شوي. د پاتې لوستلو په اړه، د N-mer DNA ترتیب چې د پیل نښه څخه پیل او پای ته رسیږي مخکې لدې چې د سټاپ نښه د اصلي لوستلو ترتیب څخه جلا شي او نور پروسس شي (له دې وروسته "داخل کړئ"). د داخلولو وروسته، د پرائمر په 5′ پای کې د لومړي سټاپ کوډون وروسته برخه د داخلولو څخه لرې کیږي. سربیره پردې، نیوکلیوټایډونه چې د پرائمر په 3′ پای کې نیمګړي کوډونونو ته لار هواروي هم لرې شوي. د هغو داخلونو د خارجولو لپاره چې یوازې د شالید ترتیبونه لري، د امینو اسید نمونې "PAG" سره پیل شوي ژباړل شوي داخلونه هم لرې شوي. د ژباړې وروسته اوږدوالی سره پیپټایډونه چې له 3 څخه کم امینو اسیدونه لري له کتابتون څخه لرې شوي. په پای کې، د داخلولو حوض کې بې ځایه کیدل لرې کړئ او د هر ځانګړي داخلولو فریکونسي وټاکئ. د دې تحلیل پایلو کې د نیوکلیوټایډ ترتیبونو (داخلولو) او د دوی (لوستلو) فریکونسۍ لیست شامل و (ضمیمه ارقام 1c او 2).
د ګروپ N-mer DNA داخلونه د ترتیب ورته والي له مخې: د 454/Roche-ځانګړي ترتیب غلطۍ له منځه وړلو لپاره (لکه د ترتیب هوموپولیمر توسیعونو سره ستونزې) او لږ مهم بې ځایه والی لرې کولو لپاره، مخکې فلټر شوي N-mer DNA ترتیب داخلونه (داخلونه) د ورته والي له مخې ترتیب شوي. داخلونه (تر 2 غیر مطابقت لرونکي اساساتو پورې اجازه لري) د تکراري الګوریتم په کارولو سره چې په لاندې ډول تعریف شوي: داخلونه لومړی د دوی فریکونسۍ (تر ټولو لوړ څخه تر ټیټ پورې) له مخې ترتیب شوي، او که دوی ورته وي، د دوی د ثانوي ترتیب له مخې د اوږدوالي له مخې (تر ټولو اوږد څخه تر لنډ). په دې توګه، ترټولو مکرر او اوږد داخلونه لومړی "ګروپ" تعریفوي. د ګروپ فریکونسۍ د کلیدي فریکونسۍ سره تنظیم شوې. بیا، په ترتیب شوي لیست کې پاتې هر داخل هڅه وشوه چې د جوړه نیډل مین-ونش سمون لخوا ګروپ ته اضافه شي. که چیرې په یوه ترتیب کې د بې اتفاقۍ، داخلونو، یا حذفونو شمیر د 2 حد څخه ډیر نه وي، نو ګروپ ته داخلول اضافه کیږي، او د ګروپ ټول فریکونسي د دې له مخې زیاتیږي چې څومره ځله داخلول اضافه شوي. په ګروپ کې اضافه شوي داخلونه د کارول شوي په توګه نښه شوي او د نورو پروسس کولو څخه خارج شوي. که چیرې د داخلولو ترتیب په موجوده ګروپ کې اضافه نشي، د داخلولو ترتیب د مناسب داخلولو فریکونسۍ سره د نوي ګروپ جوړولو لپاره کارول کیږي او د کارول شوي په توګه نښه کیږي. تکرار پای ته رسیږي کله چې د داخلولو هر ترتیب یا د نوي ګروپ جوړولو لپاره کارول شوی وي یا په موجوده ګروپ کې شامل کیدی شي. په هرصورت، ګروپ شوي داخلونه چې د نیوکلیوټایډونو څخه جوړ شوي په پای کې د پیپټایډ ترتیبونو (پیپټایډ کتابتونونو) ته ژباړل کیږي. د دې تحلیل پایله د داخلولو یوه ټولګه او د دوی اړونده فریکونسۍ دي چې د پرله پسې لوستلو شمیر جوړوي (ضمیمه شکل 2).
د موټیف نسل: د ځانګړو پیپټایډونو د لیست پر بنسټ، یو کتابتون جوړ شو چې د ټولو ممکنه امینو اسید نمونو (aa) پکې شامل وو لکه څنګه چې لاندې ښودل شوي. د اوږدوالي 3 هر ممکنه نمونه د پیپټایډ څخه استخراج شوه او د هغې معکوس نمونه د یو عام موټیف کتابتون سره یوځای شوه چې ټول نمونې (ټریپپټایډونه) پکې شاملې وې. د ډیر تکراري موټیفونو کتابتونونه ترتیب شوي او بې ځایه کیدل لرې شوي. بیا، د موټیف کتابتون کې د هر ټریپپټایډ لپاره، موږ د محاسبې وسیلو په کارولو سره په کتابتون کې د هغې شتون چیک کړ. پدې حالت کې، د موندل شوي موټیف ټریپپټایډ لرونکي پیپټایډ فریکونسي اضافه کیږي او د موټیف کتابتون کې موټیف ته ټاکل کیږي ("د موټیفونو شمیر"). د موټیف تولید پایله دوه اړخیزه صف دی چې د ټریپپټایډونو (موټیفونو) ټولې پیښې او د دوی اړوند ارزښتونه لري، کوم چې د لوستلو ترتیب شمیره ده چې پایله یې اړونده موټیف وي کله چې لوستل فلټر شوي، ګروپ شوي او ژباړل شوي وي. میټریکونه لکه څنګه چې پورته په تفصیل سره تشریح شوي.
د نقشو او اړوندو تحلیلي پلاټونو د شمیر نورمال کول: د هرې نمونې لپاره د نقشو شمیر د کارولو سره نورمال شوی و
چیرې چې ni د هغو لوستلو شمیر دی چې موضوع i لري. په دې توګه، vi د لوستلو (یا پیپټایډونو) سلنه فریکونسي استازیتوب کوي چې په نمونه کې موټیف i لري. د غیر نورمال شوي شمیر موټیفونو لپاره P-ارزښتونه د فشر دقیق ازموینې په کارولو سره محاسبه شوي. د انګیزو شمیر د correlograms په اړه، د سپیرمین اړیکې د R سره د انګیزو نورمال شوي شمیر په کارولو سره محاسبه شوي.
د پیپټایډ کتابتون کې په هر موقعیت کې د امینو اسیدونو مینځپانګې لیدلو لپاره، ویب لوګوګرامونه 32، 33 (http://weblogo.threeplusone.com) رامینځته شوي. لومړی، د 12-mer پیپټایډ په هر موقعیت کې د امینو اسیدونو مینځپانګه په 20×12 میټریکس کې زیرمه شوې. بیا، د 1000 پیپټایډونو سیټ چې په هر موقعیت کې ورته نسبي امینو اسید مینځپانګه لري د فاسټا-سیکون فارمیټ کې رامینځته کیږي او د ویب لوګو 3 ته د ان پټ په توګه چمتو کیږي، کوم چې په هر موقعیت کې د نسبي امینو اسید مینځپانګې ګرافیکي استازیتوب رامینځته کوي. د ورکړل شوي پیپټایډ کتابتون لپاره. د څو اړخیز ډیټاسیټونو لیدلو لپاره، د تودوخې نقشې په R کې د داخلي پرمختللي وسیلې په کارولو سره رامینځته شوې (بایوس هیټ میپ، یو چې لا تر اوسه خپور شوی R بسته). د تودوخې نقشو کې وړاندې شوي ډینډروګرامونه د یوکلیډین فاصلې میټریک سره د وارډ د هیرایریکل کلسترینګ میتود په کارولو سره محاسبه شوي. د موټیف سکور کولو ډیټا احصایوي تحلیل لپاره، د غیر نورمال شوي سکور کولو لپاره P ارزښتونه د فشر دقیق ازموینې په کارولو سره محاسبه شوي. د نورو ډیټاسیټونو لپاره د P ارزښتونه د زده کونکي د t-ټیسټ یا ANOVA په کارولو سره په R کې محاسبه شوي.
ټاکل شوي فیج کلونونه او فیجونه پرته له داخلونو د لکۍ رګ له لارې په رګونو کې انجیکشن شوي (2×1010 فیجونه/حیوان په 300 μl PBS کې). د پرفیوژن او وروسته فکسیشن څخه لس دقیقې دمخه، ورته څارویو ته د DyLight594 لیبل شوي لیکټین 100 μl سره د رګونو له لارې انجیکشن شوی و (ویکټر لابراتوارونو شرکت، DL-1177). د فیج انجیکشن څخه 60 دقیقې وروسته، موږکان د زړه له لارې د 50 ملی لیتر PBS سره پرفیوز شوي او وروسته 50 ملی لیتر 4٪ PFA/PBS. د دماغ نمونې په 4٪ PFA/PBS کې د شپې لپاره اضافه شوي او د شپې په 4 ° C کې په 30٪ سوکروز کې ډوب شوي. نمونې د OCT مخلوط کې فلش کنګل شوي دي. د کنګل شویو نمونو د امیونوهیسټو کیمیکل تحلیل د خونې په تودوخه کې د 1٪ BSA سره بند شوي 30 µm کرایوسیکشنونو کې ترسره شو او د T7 فیز (Novus NB 600-376A) په وړاندې د پولی کلونل FITC لیبل شوي انټي باډیز سره په 4 °C کې انکیوبیټ شو. د شپې انکیوبیټ شو. په پای کې، برخې د PBS سره 3 ځله ومینځل شوې او د کنفوکل لیزر مایکروسکوپ (Leica TCS SP5) سره معاینه شوې.
ټول پیپټایډونه چې لږترلږه 98٪ پاکوالی لري د GenScript USA لخوا ترکیب شوي، بایوټینیلیټ شوي او لیوفیل شوي. بایوټین د N-ټرمینس کې د اضافي درې ګوني ګلیسین فاصلې له لارې تړل شوی. د ډله ایز سپیکټرومیټري په کارولو سره ټول پیپټایډونه چیک کړئ.
سټریپټاویډین (سیګما S0677) د بایوټینیلیټ شوي پیپټایډ، بایوټینیلیټ شوي BACE1 انحیبیټري پیپټایډ، یا د بایوټینیلیټ شوي BACE1 انحیبیټري پیپټایډ او BACE1 انحیبیټري پیپټایډ ترکیب (3:1 تناسب) سره د 5-10٪ DMSO/په PBS کې انکیوبیټ شوي سره مخلوط شو. د انجیکشن څخه 1 ساعت دمخه د خونې په حرارت کې. سټریپټاویډین-کنجوګیټ شوي پیپټایډونه د دماغي غار سره د موږکانو د لکۍ رګونو څخه یو ته د 10 ملی ګرامه / کیلو ګرامه په دوز کې د رګ له لارې انجیکشن شوي.
د سټریپټاویدین-پیپټایډ کمپلیکسونو غلظت د ELISA لخوا ارزول شوی. د Nunc Maxisorp مایکروټیټر پلیټونه (Sigma) د شپې په 4 درجو سانتی ګراد کې د 1.5 μg/ml موږک ضد سټریپټاویدین انټي باډي (Thermo, MA1-20011) سره پوښل شوي. د بلاک کولو وروسته (د بلاک کولو بفر: 140 nM NaCL، 5 mM EDTA، 0.05٪ NP40، 0.25٪ جیلاتین، 1٪ BSA) د خونې په تودوخه کې د 2 ساعتونو لپاره، پلیټ د 0.05٪ Tween-20/PBS (د مینځلو بفر) سره د 3 ثانیو لپاره ومینځئ، CSF او د پلازما نمونې د بلاک کولو بفر سره حل شوي څاګانو ته اضافه شوي (پلازما 1:10,000، CSF 1:115). بیا پلیټ د شپې په 4 درجو سانتی ګراد کې د کشف انټي باډي (1 μg/ml، ضد سټریپټاویدین-HRP، Novus NB120-7239) سره انکیوبیټ شوی. د مینځلو درې مرحلو وروسته، سټریپټاویډین د TMB سبسټریټ محلول (روش) کې تر 20 دقیقو پورې د انکیوبیشن له لارې کشف شو. د 1M H2SO4 سره د رنګ پراختیا بندولو وروسته، جذب په 450 nm کې اندازه کړئ.
د سټریپټاویدین-پیپټایډ-BACE1 مخنیوی کونکي کمپلیکس فعالیت د Aβ(1-40) ELISA لخوا د جوړونکي پروتوکول (واکو، 294-64701) سره سم ارزول شوی. په لنډه توګه، د CSF نمونې په معیاري ډیلوینټ (1:23) کې حل شوې او د شپې په 4 درجو سانتي ګراد کې په 96 څاه پلیټونو کې چې د BNT77 کیپچر انټي باډي سره پوښل شوي وو، انکیوبیټ شوي. د مینځلو پنځه مرحلو وروسته، د HRP-conjugated BA27 انټي باډي اضافه شوه او د 2 ساعتونو لپاره په 4 درجو سانتي ګراد کې انکیوبیټ شوه، ورپسې د مینځلو پنځه مرحلې. Aβ(1–40) د خونې په حرارت کې د 30 دقیقو لپاره د TMB محلول کې د انکیوبیټیشن لخوا کشف شو. وروسته له دې چې د رنګ پراختیا د سټاپ محلول سره ودرول شي، جذب په 450 nm کې اندازه کړئ. د پلازما نمونې د Aβ(1–40) ELISA څخه دمخه د جامد پړاو استخراج سره مخ شوې. پلازما په 96 څاه پلیټونو کې 0.2٪ DEA (Sigma) ته اضافه شوه او د 30 دقیقو لپاره د خونې په حرارت کې انکیوبیټ شوه. د SPE پلیټونو (Oasis, 186000679) د اوبو او 100٪ میتانول سره په پرله پسې ډول مینځلو وروسته، د پلازما نمونې د SPE پلیټونو ته اضافه شوې او ټول مایع لرې شول. نمونې مینځل شوې (لومړی د 5٪ میتانول سره بیا 30٪ میتانول سره) او د 2٪ NH4OH/90٪ میتانول سره ایلیټ شوې. د ثابت N2 جریان کې د 99 دقیقو لپاره د 55 ° C په تودوخې کې د ایلیټ وچولو وروسته، نمونې په معیاري ډیلوینټونو کې کمې شوې او Aβ(1–40) اندازه شوه لکه څنګه چې پورته تشریح شوي.
دا مقاله څنګه حواله کړو: یوریچ، ای. او نور. دماغ ته د ټرانزیټ پیپټایډونو په کارولو سره د کارګو تحویلي چې په ویوو کې پیژندل شوي. ساینس. 5، 14104؛ doi:10.1038/srep14104 (2015).
لیکوټا جي.، سکجورینج ټي.، تومسن ایل بي او موس ټي. د هدفمند درملنې په کارولو سره دماغ ته د میکرو مالیکولر درملو رسول. د نیورو کیمیا ژورنال 113، 1–13، 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
برازنجیویچ، آی.، سټینبوش، ایچ ډبلیو، شمیټز، سي.، او مارټینز-مارټینز، پي. د وینې-دماغ خنډ له لارې د پیپټایډ او پروټین درملو رسولو. پروګ نیوروبیول 87، 212-251، 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
پارډریج، ډبلیو ایم د وینې-دماغ خنډ: د دماغ د درملو په پراختیا کې یو خنډ. نیورو آر ایکس ۲، ۳-۱۴، ۱۰.۱۶۰۲/نیورور ایکس ۲.۱.۳ (۲۰۰۵).
جوهانسن، KE، ډنکن، JA، سټوپا، EG، او بایډ، A. د کورویډ پلیکسس-CSF لارې له لارې دماغ ته د درملو رسولو او هدف ګرځولو لپاره ښه امکانات. د درملو څیړنه 22، 1011-1037، 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
پارډریج، ډبلیو ایم د دماغ رسولو لپاره د مالیکولي ټروجن اسونو سره د بایوفارماسوټیکل عصري کول. بایوکونجګ کیم 19، 1327-1338، 10.1021/bc800148t (2008).
پارډریج، د وینې-دماغ خنډ له لارې د WM ریسیپټر-منځګړیتوب پیپټایډ لیږد. انډوکر ریو. 7، 314-330 (1986).
نیووینر، جي. او نور. د مونوولینټ مالیکولر شټلونو په کارولو سره د دماغ نفوذ او د درملنې انټي باډیز اغیزمنتوب زیات کړئ. نیورون 81، 49-60، 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
بین-لي، این. او نور. د ټرانسفرین ریسیپټر (TfR) ټرانسپورټ د TfR انټي باډیز د عاطفي ډولونو دماغ جذب ټاکي. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).