Շնորհակալություն Nature.com կայք այցելելու համար: Դուք օգտագործում եք սահմանափակ CSS աջակցությամբ դիտարկիչի տարբերակ: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Բացի այդ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար մենք կայքը ցուցադրում ենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Միաժամանակ ցուցադրում է երեք սլայդից բաղկացած կարուսել: Օգտագործեք «Նախորդ» և «Հաջորդ» կոճակները՝ միաժամանակ երեք սլայդով անցնելու համար, կամ օգտագործեք վերջում գտնվող սահող կոճակները՝ միաժամանակ երեք սլայդով անցնելու համար:
Արյունաուղեղային պատնեշը և արյունաուղեղային պատնեշը կանխում են կենսաթերապևտիկ նյութերի հասնելը կենտրոնական նյարդային համակարգում իրենց թիրախներին, դրանով իսկ խոչընդոտելով նյարդաբանական հիվանդությունների արդյունավետ բուժումը: Նոր ուղեղային փոխադրիչներ in vivo հայտնաբերելու համար մենք ներդրեցինք T7 ֆագի պեպտիդների գրադարան և սերիականորեն հավաքեցինք արյուն և ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկ (ՈՈՀ)՝ օգտագործելով առնետների կանուլացված գիտակից մեծ լողավազանի մոդել: Ընտրության չորս փուլերից հետո հատուկ ֆագերի կլոնները բարձր հարստացվեցին ՈՈՀ-ում: Առանձին թեկնածու պեպտիդների փորձարկումը ցույց տվեց ՈՈՀ-ի ավելի քան 1000 անգամ հարստացում: Պեպտիդային միջնորդությամբ ուղեղ առաքման կենսաակտիվությունը հաստատվեց ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում ամիլոիդ-β մակարդակի 40% նվազմամբ՝ օգտագործելով նույնականացված նոր տարանցիկ պեպտիդին կապված BACE1 պեպտիդի ինհիբիտոր: Այս արդյունքները ենթադրում են, որ in vivo ֆագերի ընտրության մեթոդներով նույնականացված պեպտիդները կարող են օգտակար միջոցներ լինել մակրոմոլեկուլների համակարգային ուղեղ առաքման համար՝ թերապևտիկ ազդեցությամբ:
Կենտրոնական նյարդային համակարգի (ԿՆՀ) թիրախային թերապիայի հետազոտությունները հիմնականում կենտրոնացած են եղել ԿՆՀ-ին թիրախավորող հատկություններ ցուցաբերող օպտիմալացված դեղամիջոցների և նյութերի հայտնաբերման վրա՝ ավելի քիչ ջանքեր գործադրելով այն մեխանիզմների հայտնաբերման վրա, որոնք խթանում են դեղերի ակտիվ առաքումը ուղեղ: Սա սկսում է փոխվել հիմա, քանի որ դեղերի, հատկապես խոշոր մոլեկուլների, առաքումը ժամանակակից նյարդաբանական դեղերի մշակման անբաժանելի մասն է կազմում: Կենտրոնական նյարդային համակարգի միջավայրը լավ պաշտպանված է ուղեղանոթային պատնեշային համակարգով, որը բաղկացած է արյունաուղեղային պատնեշից (ԱԷՊ) և արյունաուղեղային պատնեշից (ԱԷՊՊ)1, ինչը դժվարացնում է դեղերի առաքումը ուղեղ1,2: Հաշվարկվում է, որ գրեթե բոլոր խոշոր մոլեկուլային դեղամիջոցները և փոքր մոլեկուլային դեղամիջոցների ավելի քան 98%-ը դուրս են գալիս ուղեղից3: Ահա թե ինչու շատ կարևոր է բացահայտել ուղեղի նոր փոխադրման համակարգեր, որոնք ապահովում են թերապևտիկ դեղերի արդյունավետ և կոնկրետ առաքում ԿՆՀ4,5: Այնուամենայնիվ, ԱԷՊ-ն և ԲԷՊՊ-ն նույնպես հիանալի հնարավորություն են ներկայացնում դեղերի առաքման համար, քանի որ դրանք թափանցում և մտնում են ուղեղի բոլոր կառուցվածքները՝ դրա լայն անոթային համակարգի միջոցով: Այսպիսով, ուղեղ առաքման ոչ ինվազիվ մեթոդների կիրառման ներկայիս ջանքերը մեծապես հիմնված են ընկալիչ-միջնորդավորված փոխադրման (PMT) մեխանիզմի վրա՝ օգտագործելով էնդոգեն BBB6 ընկալիչը: Չնայած տրանսֆերինային ընկալիչի ուղու վերջին կարևոր առաջընթացներին7,8, անհրաժեշտ է բարելավված հատկություններով նոր առաքման համակարգերի հետագա մշակում: Այս նպատակով մեր նպատակն էր բացահայտել պեպտիդներ, որոնք ունակ են միջնորդել ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի փոխադրումը, քանի որ դրանք սկզբունքորեն կարող են օգտագործվել մակրոմոլեկուլներ ԿՆՀ հասցնելու կամ նոր ընկալիչային ուղիներ բացելու համար: Մասնավորապես, ուղեղանոթային համակարգի հատուկ ընկալիչներն ու փոխադրիչները (BBB և BSCFB) կարող են ծառայել որպես կենսաթերապևտիկ դեղամիջոցների ակտիվ և հատուկ առաքման պոտենցիալ թիրախներ: Ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկը (ՈՈՀ) խորոիդային հյուսակի (ՈՈՀ) արտազատիչ արգասիք է և անմիջական շփման մեջ է ուղեղի միջբջջային հեղուկի հետ՝ ենթարախնոիդալ և փորոքային տարածությունների միջոցով4: Վերջերս ցույց է տրվել, որ ենթարախնոիդալ ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկը չափազանց շատ է դիֆուզվում ուղեղի միջբջջային հեղուկի մեջ9: Մենք հույս ունենք պարենքիմալ տարածություն մուտք գործել այս ենթարախնոիդալ ներհոսքային ուղու միջոցով կամ անմիջապես արյան-բջջային բլոկի միջոցով։ Դրան հասնելու համար մենք ներդրել ենք in vivo ֆագերի ընտրության հուսալի ռազմավարություն, որը իդեալականորեն նույնականացնում է այս երկու տարբեր ուղիներով տեղափոխվող պեպտիդները։
Այժմ մենք նկարագրում ենք հաջորդական in vivo ֆագերի ցուցադրման սկրինինգի մեթոդ՝ ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի նմուշառմամբ, զուգակցված բարձր թողունակության հաջորդականության (HTS) հետ, որպեսզի վերահսկենք սկզբնական ընտրության փուլերը՝ գրադարանի ամենաբարձր բազմազանությամբ: Սկրինինգը կատարվել է գիտակից առնետների վրա, որոնց վրա մշտապես տեղադրված էր մեծ ցիստերնա (CM) կանուլա՝ արյան աղտոտումից խուսափելու համար: Կարևոր է, որ այս մոտեցումը ընտրում է ինչպես ուղեղի թիրախային, այնպես էլ պեպտիդներ, որոնք ունեն ուղեղանոթային պատնեշի միջով տրանսպորտային ակտիվություն: Մենք օգտագործել ենք T7 ֆագեր՝ դրանց փոքր չափի (~60 նմ) ​​պատճառով10 և ենթադրել ենք, որ դրանք հարմար են վեզիկուլների տեղափոխման համար, որոնք թույլ են տալիս միջբջջային հատել էնդոթելային և/կամ էպիթելային-մեդուլյար պատնեշի միջով: Չորս փուլից հետո ֆագերի պոպուլյացիաները մեկուսացվել են՝ ցույց տալով in vivo ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի ուժեղ հարստացում և ուղեղային միկրոանոթային ասոցիացիա: Կարևոր է, որ մենք կարողացանք հաստատել մեր արդյունքները՝ ցույց տալով, որ նախընտրելի և քիմիապես սինթեզված լավագույն թեկնածու պեպտիդները կարող են սպիտակուցային բեռ տեղափոխել ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկ: Նախ, ԿՆՀ-ի ֆարմակոդինամիկ ազդեցությունները հաստատվել են՝ առաջատար տարանցիկ պեպտիդը BACE1 պեպտիդի ինհիբիտորի հետ համատեղելով: Բացի այն բանից, որ ցույց ենք տալիս, որ in vivo ֆունկցիոնալ սկրինինգի ռազմավարությունները կարող են նույնականացնել նոր ուղեղային տրանսպորտային պեպտիդները որպես արդյունավետ սպիտակուցային բեռի կրողներ, մենք ակնկալում ենք, որ նմանատիպ ֆունկցիոնալ ընտրության մոտեցումները նույնպես կարևոր կդառնան ուղեղային տրանսպորտային նոր ուղիների նույնականացման գործում։
Ֆագի փաթեթավորման քայլից հետո, հիմք ընդունելով պլակաստեղծ միավորները (PFU), նախագծվել և ստեղծվել է պատահական 12-մեր գծային T7 ֆագ պեպտիդների գրադարան՝ մոտավորապես 109 բազմազանությամբ (տե՛ս Նյութեր և մեթոդներ): Կարևոր է նշել, որ մենք ուշադիր վերլուծել ենք այս գրադարանը in vivo պանորամավորումից առաջ: Ֆագի գրադարանի նմուշների ՊՇՌ ուժեղացումը՝ օգտագործելով մոդիֆիկացված պրայմերներ, առաջացրել է ամպլիկոններ, որոնք ուղղակիորեն կիրառելի էին HTS-ի համար (Լրացուցիչ Նկ. 1ա): Ա) HTS11 հաջորդականության սխալների, բ) պրայմերների (NNK)1-12 որակի վրա ազդեցության և գ) պահուստային գրադարանում վայրի տիպի (wt) ֆագի (կմախքի ներդիրների) առկայության պատճառով, իրականացվել է հաջորդականության ֆիլտրման ընթացակարգ՝ միայն ստուգված հաջորդականության տեղեկատվությունը արդյունահանելու համար (Լրացուցիչ Նկ. 1բ): Այս ֆիլտրման քայլերը վերաբերում են բոլոր HTS հաջորդականության գրադարաններին: Ստանդարտ գրադարանի համար ստացվել է ընդհանուր առմամբ 233,868 ընթերցում, որոնցից 39%-ը անցել է ֆիլտրի չափանիշները և օգտագործվել է գրադարանի վերլուծության և ընտրության համար հետագա փուլերի համար (Լրացուցիչ Նկ. 1գ-ե): Ընթերցումները հիմնականում 3 հիմքային զույգերի երկարության բազմապատիկներ էին՝ 36 նուկլեոտիդում գագաթնակետով (Լրացուցիչ Նկ. 1գ), հաստատելով գրադարանի դիզայնը (NNK) 1-12: Հատկանշական է, որ գրադարանի անդամների մոտավորապես 11%-ը պարունակում էր 12-չափանի վայրի տիպի (wt) PAGISRELVDKL ներդիր, և հաջորդականությունների գրեթե կեսը (49%) պարունակում էր ներդիրներ կամ ջնջումներ: Գրադարանի գրադարանի HTS-ը հաստատեց գրադարանում պեպտիդների բարձր բազմազանությունը. պեպտիդային հաջորդականությունների ավելի քան 81%-ը հայտնաբերվել է միայն մեկ անգամ, և միայն 1.5%-ը տեղի է ունեցել ≥4 օրինակում (Լրացուցիչ Նկ. 2ա): Ամինաթթուների (aa) հաճախականությունները ռեպերտուարի բոլոր 12 դիրքերում լավ էին համընկնում դեգեներացված NKK ռեպերտուարի կողմից առաջացած կոդոնների քանակի համար սպասվող հաճախականությունների հետ (Լրացուցիչ Նկ. 2բ): Այս ներդիրներով կոդավորված aa մնացորդների դիտարկված հաճախականությունը լավ էր համընկնում հաշվարկված հաճախականության հետ (r = 0.893) (Լրացուցիչ Նկ. 2գ): Ֆագային գրադարանների ներարկման նախապատրաստումը ներառում է էնդոտոքսինի ուժեղացման և հեռացման քայլերը: Նախկինում ցույց է տրվել, որ սա պոտենցիալ նվազեցնում է ֆագային գրադարանների բազմազանությունը12,13: Հետևաբար, մենք հաջորդականացրեցինք ափսեի վրա ուժեղացված ֆագային գրադարան, որը ենթարկվել էր էնդոտոքսինի հեռացման և համեմատեցինք այն սկզբնական գրադարանի հետ՝ AA-ի հաճախականությունը գնահատելու համար: Սկզբնական հավաքածուի և ուժեղացված ու մաքրված հավաքածուի միջև նկատվել է ուժեղ կապ (r = 0.995) (Լրացուցիչ նկ. 2դ), ինչը ցույց է տալիս, որ T7 ֆագ օգտագործող ափսեների վրա ուժեղացված կլոնների միջև մրցակցությունը մեծ շեղում չի առաջացրել: Այս համեմատությունը հիմնված է յուրաքանչյուր գրադարանում եռապեպտիդային մոտիվների հաճախականության վրա, քանի որ գրադարանների բազմազանությունը (~109) չի կարող լիովին արտացոլվել նույնիսկ HTS-ի միջոցով: aa-ի հաճախականության վերլուծությունը յուրաքանչյուր դիրքում բացահայտել է փոքր դիրքից կախված շեղում մուտքագրված ռեպերտուարի վերջին երեք դիրքերում (Լրացուցիչ նկ. 2ե): Եզրափակելով՝ մենք եզրակացրեցինք, որ գրադարանի որակը և բազմազանությունը ընդունելի էին, և բազմազանության մեջ նկատվել են միայն աննշան փոփոխություններ՝ ընտրության մի քանի փուլերի միջև ֆագային գրադարանների ուժեղացման և նախապատրաստման պատճառով:
Գլխուղեղային հեղուկի հաջորդական նմուշառումը կարող է իրականացվել վիրաբուժական եղանակով կանուլա տեղադրելով գիտակից առնետների CM-ում՝ ներերակային (iv) BBB-ի և/կամ BCSFB-ի միջոցով ներարկված T7 ֆագի նույնականացումը հեշտացնելու համար (Նկար 1a-b): In vivo ընտրության առաջին երեք փուլերում մենք օգտագործեցինք երկու անկախ ընտրության թևեր (թևեր A և B) (Նկար 1c): Մենք աստիճանաբար մեծացրինք ընտրության խստությունը՝ նվազեցնելով ընտրության առաջին երեք փուլերում ներմուծված ֆագի ընդհանուր քանակը: Պանինգի չորրորդ փուլի համար մենք միավորեցինք A և B ճյուղերից նմուշները և կատարեցինք երեք լրացուցիչ անկախ ընտրություն: Այս մոդելում T7 ֆագի մասնիկների in vivo հատկությունները ուսումնասիրելու համար վայրի տիպի ֆագը (PAGISRELVDKL գլխավոր ներդիր) ներարկվեց առնետների մեջ պոչային երակի միջոցով: Ֆագերի վերականգնումը գլխուղեղային հեղուկից և արյունից տարբեր ժամանակային կետերում ցույց տվեց, որ համեմատաբար փոքր T7 իկոսաեդրիկ ֆագերը ունեին արյան խցիկից արագ նախնական մաքրման փուլ (Լրացուցիչ Նկ. 3): Կիրառված տիտրերի և առնետների արյան ծավալի հիման վրա մենք հաշվարկեցինք, որ միայն մոտավորապես 1% քաշով... Կիրառված դեղաչափից ֆագը հայտնաբերվել է արյան մեջ ներերակային ներարկումից 10 րոպե անց: Այս սկզբնական արագ անկումից հետո չափվել է ավելի դանդաղ առաջնային մաքրում՝ 27.7 րոպե կիսատրոհման պարբերությամբ: Կարևոր է, որ ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկից դուրս են բերվել միայն շատ քիչ ֆագեր, ինչը վկայում է վայրի տիպի ֆագերի ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի խցիկ միգրացիայի ցածր ֆոնի մասին (Լրացուցիչ նկ. 3): Միջին հաշվով, արյան մեջ T7 ֆագի միայն մոտ 1 x 10-3% տիտր և սկզբնապես ներարկված ֆագերի 4 x 10-8%-ն է հայտնաբերվել ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում ամբողջ նմուշառման ժամանակահատվածում (0-250 րոպե): Հատկանշական է, որ ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում վայրի տիպի ֆագի կիսատրոհման պարբերությունը (25.7 րոպե) նման է արյան մեջ դիտարկվածին: Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի խցիկը արյունից բաժանող պատնեշը անվնաս է CM-կանուլացված առնետների մոտ, ինչը թույլ է տալիս in vivo ընտրել ֆագային գրադարաններ՝ արյունից ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի խցիկ հեշտությամբ տեղափոխվող կլոնները նույնականացնելու համար:
(ա) Մեծ ջրամբարից ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի (ՈՈՀ) վերստին նմուշառման մեթոդի մշակում: (բ) Կենտրոնական նյարդային համակարգի (ԿՆՀ) պատնեշի բջջային տեղակայումը ցույց տվող դիագրամ և արյան-ուղեղային պատնեշը (ԲՈՊ) և արյուն-ուղեղային պատնեշը հատող պեպտիդները նույնականացնելու համար օգտագործվող ընտրության ռազմավարությունը: (գ) In vivo ֆագերի ցուցադրման սկրինինգի հոսքագիծ: Ընտրության յուրաքանչյուր փուլում ֆագերը (կենդանիների նույնականացուցիչները նետերի ներսում) ներարկվել են ներերակային: Երկու անկախ այլընտրանքային ճյուղերը (A, B) պահվում են առանձին մինչև ընտրության 4-րդ փուլը: 3-րդ և 4-րդ ընտրության փուլերի համար ՈՈՀ-ից արդյունահանված յուրաքանչյուր ֆագի կլոնը ձեռքով հաջորդականացվել է: (դ) Արյանից (կարմիր շրջանակներ) և ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկից (կանաչ եռանկյունիներ) մեկուսացված ֆագի կինետիկան ընտրության առաջին փուլում երկու կանուլացված առնետների մոտ T7 պեպտիդային գրադարանի (2 x 1012 ֆագ/կենդանի) ներերակային ներարկումից հետո: Կապույտ քառակուսիները ցույց են տալիս ֆագի միջին սկզբնական կոնցենտրացիան արյան մեջ, որը հաշվարկվում է ներարկված ֆագի քանակից՝ հաշվի առնելով արյան ընդհանուր ծավալը: Սև քառակուսիները ցույց են տալիս արյան ֆագերի կոնցենտրացիաներից էքստրապոլացված y գծի հատման կետը: (e,f) Ներկայացրեք պեպտիդում հայտնաբերված բոլոր հնարավոր համընկնող եռապեպտիդային մոտիվների հարաբերական հաճախականությունը և բաշխումը: Ցույց է տրված 1000 ընթերցման ժամանակ հայտնաբերված մոտիվների քանակը: Կարմիր կետերով նշված են նշանակալիորեն (p < 0.001) հարստացված մոտիվները: (e) Համակցման ցրման գրաֆիկ, որը համեմատում է ներարկված գրադարանի եռապեպտիդային մոտիվի հարաբերական հաճախականությունը #1.1 և #1.2 կենդանիների արյունից ստացված ֆագի հետ: (f) Համակցման ցրման գրաֆիկ, որը համեմատում է արյան և ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկից մեկուսացված #1.1 և #1.2 կենդանիների ֆագի եռապեպտիդային մոտիվների հարաբերական հաճախականությունները: (g, h) Արյան մեջ հարստացված ֆագի (g) հաջորդականության ID ներկայացումը ներարկված գրադարանների և ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում հարստացված ֆագի (h) համեմատած արյան հետ՝ երկու կենդանիների մոտ in vivo ընտրության փուլից հետո: Մեկ տառանոց կոդի չափը ցույց է տալիս, թե որքան հաճախ է այդ ամինաթթուն հանդիպում այդ դիրքում: Կանաչ = բևեռային, մանուշակագույն = չեզոք, կապույտ = հիմնային, կարմիր = թթվային և սև = հիդրոֆոբ ամինաթթուներ: Նկար 1ա, բ-ն նախագծվել և արտադրվել է Էդուարդ Ուրիչի կողմից:
Մենք ֆագի պեպտիդային գրադարան ներարկեցինք երկու CM գործիքային առնետների մեջ (կլադներ A և B) և ֆագը առանձնացրինք ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկից և արյունից (Նկար 1դ): Գրադարանի սկզբնական արագ մաքրումը պակաս արտահայտված էր վայրի տիպի ֆագի համեմատ: Երկու կենդանիների մոտ էլ ներարկված գրադարանի միջին կիսատրոհման պարբերությունը արյան մեջ կազմել է 24.8 րոպե, նման վայրի տիպի ֆագին, և 38.5 րոպե ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում: Յուրաքանչյուր կենդանուց վերցված արյան և ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի ֆագերի նմուշները ենթարկվել են HTS-ի, և բոլոր նույնականացված պեպտիդները վերլուծվել են կարճ եռապեպտիդային մոտիվի առկայության համար: Եռապեպտիդային մոտիվները ընտրվել են, քանի որ դրանք ապահովում են կառուցվածքի ձևավորման և պեպտիդ-սպիտակուց փոխազդեցությունների նվազագույն հիմք14,15: Մենք լավ կապ ենք հայտնաբերել ներարկված ֆագի գրադարանի և երկու կենդանիների արյունից արդյունահանված կլոնների միջև մոտիվների բաշխման մեջ (Նկար 1ե): Տվյալները ցույց են տալիս, որ գրադարանի կազմը արյան խցիկում միայն աննշանորեն է հարստացված: Ամինաթթուների հաճախականությունները և կոնսենսուսի հաջորդականությունները հետագայում վերլուծվել են յուրաքանչյուր դիրքում՝ օգտագործելով Weblogo16 ծրագրաշարի ադապտացիան: Հետաքրքիր է, որ մենք հայտնաբերեցինք արյան մեջ գլիցինի մնացորդների ուժեղ հարստացում (Նկար 1գ): Երբ արյունը համեմատվեց ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկից ընտրված կլոնների հետ, նկատվեց մոտիվների ուժեղ ընտրություն և որոշակի ապաընտրություն (Նկար 1զ), և որոշակի ամինաթթուներ նախընտրելիորեն առկա էին 12 անդամից բաղկացած կլոնի նախապես որոշված ​​դիրքերում (Նկար 1ժ): Հատկանշական է, որ առանձին կենդանիները զգալիորեն տարբերվում էին ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկով, մինչդեռ արյան մեջ գլիցինի հարստացում նկատվեց երկու կենդանիների մոտ էլ (Լրացուցիչ Նկ. 4ա-ջ): #1.1 և #1.2 կենդանիների ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում հաջորդականության տվյալների խիստ ֆիլտրացումից հետո ստացվեցին ընդհանուր առմամբ 964 և 420 եզակի 12-մեր պեպտիդներ (Լրացուցիչ Նկ. 1դ-ե): Մեկուսացված ֆագի կլոնները ուժեղացվեցին և ենթարկվեցին in vivo ընտրության երկրորդ փուլի: Ընտրության երկրորդ փուլից արդյունահանված ֆագը յուրաքանչյուր կենդանու մոտ ենթարկվեց HTS-ի, և բոլոր նույնականացված պեպտիդներն օգտագործվեցին որպես մոտիվների ճանաչման ծրագրի մուտքային տվյալներ՝ եռապեպտիդային մոտիվների առկայությունը վերլուծելու համար (Նկար 2ա, բ, էֆ): Համեմատած ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկից վերականգնված ֆագի առաջին ցիկլի հետ, մենք դիտարկեցինք ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում բազմաթիվ մոտիվների հետագա ընտրություն և ընտրությունից դուրսբերում A և B ճյուղերում (Նկար 2): Կիրառվեց ցանցային նույնականացման ալգորիթմ՝ որոշելու համար, թե արդյոք դրանք ներկայացնում են համապատասխան հաջորդականության տարբեր օրինաչափություններ: Ակնհայտ նմանություն նկատվեց ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի կողմից վերականգնված 12-չափ հաջորդականությունների միջև այլընտրանքային A կլադում (Նկար 2գ, դ) և B կլադում (Նկար 2գ, ը): Յուրաքանչյուր ճյուղում համակցված վերլուծությունը բացահայտեց 12-մեր պեպտիդների տարբեր ընտրության պրոֆիլներ (Լրացուցիչ Նկ. 5գ, դ) և ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի/արյուն տիտրի հարաբերակցության աճ ժամանակի ընթացքում համակցված կլոնների համար ընտրության երկրորդ փուլից հետո՝ համեմատած ընտրության առաջին փուլի հետ (Լրացուցիչ Նկ. 5ե):
Ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի մոտիվների և պեպտիդների հարստացում in vivo ֆունկցիոնալ ֆագային ցուցադրման ընտրության երկու հաջորդական փուլերով։
Յուրաքանչյուր կենդանու առաջին փուլից (կենդանիներ #1.1 և #1.2) ստացված բոլոր ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի ֆագերը միավորվել են, ուժեղացվել, HT-հաջորդականացվել և վերստին ներարկվել են միասին (2 x 1010 ֆագ/կենդանի) 2 SM կանուլացված առնետներ (#1.1 → #): 2.1 և 2.2, 1.2 → 2.3 և 2.4): (a,b,e,f) Համեմատության ցրման գրաֆիկներ, որոնք համեմատում են բոլոր ՈՂՀ-ից ստացված ֆագերի եռապեպտիդային մոտիվների հարաբերական հաճախականությունը առաջին և երկրորդ ընտրության փուլերում: Ցուցադրվում է երկու կողմնորոշումներով պեպտիդներում հայտնաբերված բոլոր հնարավոր համընկնող եռապեպտիդները ներկայացնող մոտիվների հարաբերական հաճախականությունը և բաշխումը: Ցուցադրվում է 1000 ընթերցումներում հայտնաբերված մոտիվների քանակը: Համեմատված գրադարաններից մեկում նշանակալիորեն (p < 0.001) ընտրված կամ բացառված մոտիվները նշված են կարմիր կետերով: (c, d, g, h) Բոլոր ողնուղեղային հեղուկով հարուստ 12 ամինաթթուների երկար հաջորդականությունների հաջորդականության լոգոյի ներկայացումը՝ հիմնված in vivo ընտրության 2-րդ և 1-ին փուլերի վրա: Մեկ տառանոց կոդի չափը ցույց է տալիս, թե որքան հաճախ է այդ ամինաթթուն հանդիպում այդ դիրքում: Լոգոն ներկայացնելու համար համեմատվում է առանձին կենդանիներից երկու ընտրության փուլերի միջև ընկած ժամանակահատվածում արդյունահանված ողնուղեղային հեղուկի հաջորդականությունների հաճախականությունը, և ցույց են տրված երկրորդ փուլում հարստացված հաջորդականությունները. (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 և (h) #1.2–#2.4: Առավել հարստացված ամինաթթուները տվյալ դիրքում (c, d) № 2.1 և № 2.2 կենդանիների կամ (g, h) № 2.3 և № 2.4 կենդանիների մոտ ցույց են տրված գունավոր: Կանաչը = բևեռային, մանուշակագույնը = չեզոք, կապույտը = հիմնային, կարմիրը = թթվային և սևը = հիդրոֆոբ ամինաթթուներ:
Ընտրության երրորդ փուլից հետո մենք երկու կենդանիներից մեկուսացված 332 ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում վերականգնված ֆագերի կլոններից (Լրացուցիչ նկ. 6ա) նույնականացրեցինք 124 եզակի պեպտիդային հաջորդականություններ (#3.1 և #3.2): LGSVS հաջորդականությունը (18.7%) ուներ ամենաբարձր հարաբերական համամասնությունը, որին հաջորդում էին վայրի տիպի ներդիրները՝ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) և SARGSWREIVSLS (2.2%): Վերջին չորրորդ փուլում մենք միավորեցինք երեք առանձին կենդանիներից անկախ ընտրված երկու ճյուղեր (Նկ. 1գ): Ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկից վերականգնված 925 հաջորդականացված ֆագերի կլոններից չորրորդ փուլում մենք հայտնաբերեցինք 64 եզակի պեպտիդային հաջորդականություններ (Լրացուցիչ նկ. 6բ), որոնց մեջ վայրի տիպի ֆագի հարաբերական համամասնությունը նվազեց մինչև 0.8%: Չորրորդ փուլում ամենատարածված ողնուղեղային հեղուկի հեղուկի կլոններն էին՝ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) և RLSSVDSDLSGC (3, 2%): %) Ընտրված պեպտիդների երկարության միջակայքը պայմանավորված է նուկլեոտիդային ինսերցիաներով/դելեցիաներով կամ գրադարանի պրայմերներում վաղաժամ կանգառ կոդոններով, երբ օգտագործվում են NNK գրադարանի նախագծման համար դեգեներացված կոդոններ: Վաղաժամ կանգառ կոդոնները առաջացնում են ավելի կարճ պեպտիդներ և ընտրվում են, քանի որ պարունակում են բարենպաստ aa մոտիվ: Ավելի երկար պեպտիդներ կարող են առաջանալ սինթետիկ գրադարանների պրայմերներում ինսերցիաներից/դելեցիաներից: Սա տեղադրում է նախագծված կանգառ կոդոնը շրջանակից դուրս և կարդում է այն մինչև նոր կանգառ կոդոնի հայտնվելը ներքևում: Ընդհանուր առմամբ, մենք հաշվարկել ենք հարստացման գործակիցները բոլոր չորս ընտրության փուլերի համար՝ համեմատելով մուտքային տվյալները նմուշի ելքային տվյալների հետ: Սկրինինգի առաջին փուլի համար մենք որպես ոչ սպեցիֆիկ ֆոնային հղում օգտագործեցինք վայրի տիպի ֆագերի տիտրերը: Հետաքրքիր է, որ բացասական ֆագերի ընտրությունը շատ ուժեղ էր առաջին ՈՂՀ ցիկլում, բայց ոչ արյան մեջ (Նկար 3ա), ինչը կարող է պայմանավորված լինել պեպտիդային գրադարանի անդամների մեծ մասի ՈՂՀ խցիկ պասիվ դիֆուզիայի ցածր հավանականությամբ, կամ հարաբերական ֆագերը հակված են ավելի արդյունավետորեն պահպանվել կամ հեռացվել արյան շրջանառությունից, քան բակտերիոֆագերը: Այնուամենայնիվ, երկրորդ փուլում երկու կլադներում էլ դիտվել է ՈՂՀ-ում ֆագերի ուժեղ ընտրություն, ինչը ենթադրում է, որ նախորդ փուլը հարստացված էր ՈՂՀ-ի կլանումը խթանող պեպտիդներ ցուցադրող ֆագերով (Նկար 3ա): Կրկին, առանց արյան զգալի հարստացման: Երրորդ և չորրորդ փուլերում նույնպես ֆագերի կլոնները զգալիորեն հարստացված էին ՈՂՀ-ով: Համեմատելով ընտրության վերջին երկու փուլերի միջև յուրաքանչյուր եզակի պեպտիդային հաջորդականության հարաբերական հաճախականությունը, մենք պարզեցինք, որ ընտրության չորրորդ փուլում հաջորդականություններն ավելի հարստացված էին (Նկար 3բ): Բոլոր 64 եզակի պեպտիդային հաջորդականություններից արդյունահանվել է ընդհանուր առմամբ 931 եռապեպտիդային մոտիվ՝ օգտագործելով երկու պեպտիդային կողմնորոշումները: Չորրորդ փուլի ամենահարստացված մոտիվները ավելի մանրամասն ուսումնասիրվեցին բոլոր փուլերում իրենց հարստացման պրոֆիլների համար՝ համեմատած ներարկված գրադարանի հետ (շեմային արժեք՝ 10% հարստացում) (Լրացուցիչ նկ. 6c): Ընտրության ընդհանուր օրինաչափությունները ցույց տվեցին, որ ուսումնասիրված մոտիվների մեծ մասը հարստացվել է ընտրության երկու ճյուղերի նախորդ բոլոր փուլերում: Այնուամենայնիվ, որոշ մոտիվներ (օրինակ՝ SGL, VSG, LGS GSV) հիմնականում այլընտրանքային A կլադից էին, մինչդեռ մյուսները (օրինակ՝ FGW, RTN, WGF, NTR) հարստացվել են այլընտրանքային B կլադում:
Ողնուղեղային հեղուկով հարստացված ֆագ-ցուցադրված պեպտիդների և ստրեպտավիդինի օգտակար բեռների հետ կոնյուգացված բիոտինիլացված առաջնորդական պեպտիդների ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի փոխադրման վավերացումը։
(ա) Հարստացման հարաբերակցությունները հաշվարկվել են բոլոր չորս փուլերում (R1-R4)՝ հիմնվելով ներարկված (մուտք = I) ֆագի (PFU) տիտրերի և որոշված ​​ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի ֆագի տիտրերի (ելք = O) վրա: Վերջին երեք փուլերի (R2-R4) հարստացման գործակիցները հաշվարկվել են նախորդ փուլի և առաջին փուլի (R1) հետ համեմատության միջոցով՝ կշռի տվյալներով: Բաց սյուները ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկն են, ստվերագծված սյուները՝ պլազման: (***p<0.001, հիմնված Ստյուդենտի t-թեստի վրա): (բ) Առավել առատ ֆագային պեպտիդների ցանկը, դասակարգված ըստ ընտրության 4-րդ փուլից հետո ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում հավաքված բոլոր ֆագերի նկատմամբ իրենց հարաբերական համամասնության: Վեց ամենատարածված ֆագային կլոնները ընդգծված են գույնով, համարակալված և դրանց հարստացման գործակիցներով ընտրության 3-րդ և 4-րդ փուլերի միջև (ներդիրներ): (գ,դ) 4-րդ փուլից վեց ամենաշատ հարստացված ֆագային կլոնները, դատարկ ֆագը և ծնողական ֆագային պեպտիդային գրադարանները վերլուծվել են անհատապես ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի նմուշառման մոդելում: Ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի և արյան նմուշները հավաքվել են նշված ժամանակային կետերում: (գ) Հավասար քանակությամբ 6 թեկնածու ֆագի կլոններ (2 x 1010 ֆագ/կենդանի), դատարկ ֆագեր (#1779) (2 x 1010 ֆագ/կենդանի) և ֆագի պեպտիդային գրադարաններ (2 x 1012 ֆագ/կենդանի): Առնվազն 3 սմ ներարկվում է կանուլացված կենդանուն առանձին՝ պոչի երակի միջոցով: Ցուցադրված է յուրաքանչյուր ներարկված ֆագի կլոնի և ֆագի պեպտիդային գրադարանի ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի ֆարմակոկինետիկան ժամանակի ընթացքում: (դ) ցույց է տալիս բոլոր վերականգնված ֆագերի/մլ-ի ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի/արյուն միջին հարաբերակցությունը նմուշառման ժամանակահատվածում: (ե) Չորս սինթետիկ առաջնորդ պեպտիդներ և մեկ խառնված վերահսկիչ միացվել են բիոտինի հետ ստրեպտավիդինի հետ իրենց N-ծայրամասի միջոցով (տետրամերային ցուցադրություն), որին հաջորդել է ներարկումը (պոչի երակ ներերակային, 10 մգ ստրեպտավիդին/կգ): Առնվազն երեք ինտուբացված առնետներ (N = 3): ): Ողնուղեղային հեղուկի նմուշները հավաքվել են նշված ժամանակային կետերում, և ստրեպտավիդինի կոնցենտրացիաները չափվել են Ողնուղեղային հեղուկի հակաստրեպտավիդինային ELISA մեթոդով (nd = չի հայտնաբերվել): (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA թեստի հիման վրա): (f) Առավել հարստացված #2002 ֆագային պեպտիդի կլոնի (մանուշակագույն) ամինաթթվային հաջորդականության համեմատություն ընտրության 4-րդ փուլից ընտրված այլ ֆագային պեպտիդի կլոնների հետ: Նույնական և նմանատիպ ամինաթթվային բեկորները գունավոր կոդավորված են:
Չորրորդ փուլի բոլոր հարստացված ֆագերից (Նկար 3բ) ընտրվել են վեց թեկնածու կլոններ՝ ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի նմուշառման մոդելում հետագա անհատական ​​վերլուծության համար: Վեց թեկնածու ֆագի, դատարկ ֆագի (առանց ներդիրի) և պրոֆագ պեպտիդային գրադարանների հավասար քանակություններ ներարկվել են երեք կանուլացված CM կենդանիների մեջ, և ֆարմակոկինետիկան որոշվել է ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի (Նկար 3գ) և արյան (Լրացուցիչ Նկ. 7) անալիզներում: Բոլոր փորձարկված ֆագի կլոնները թիրախավորել են ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի խցիկը դատարկ վերահսկիչ ֆագի (#1779) մակարդակից 10-1000 անգամ ավելի բարձր մակարդակով: Օրինակ՝ #2020 և #2077 կլոններն ունեցել են մոտ 1000 անգամ ավելի բարձր ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի տիտրեր, քան վերահսկիչ ֆագը: Յուրաքանչյուր ընտրված պեպտիդի ֆարմակոկինետիկ պրոֆիլը տարբեր է, բայց բոլորն էլ ունեն ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի բարձր ուղղորդման ունակություն: Մենք #1903 և #2011 կլոնների համար ժամանակի ընթացքում նկատեցինք կայուն նվազում, մինչդեռ #2077, #2002 և #2009 կլոնների համար առաջին 10 րոպեների ընթացքում աճը կարող է վկայել ակտիվ տեղափոխման մասին, բայց այն պետք է ստուգվի: #2020, #2002 և #2077 կլոնները կայունացել են բարձր մակարդակներում, մինչդեռ #2009 կլոնի ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի կոնցենտրացիան դանդաղորեն նվազել է սկզբնական աճից հետո: Այնուհետև մենք համեմատեցինք յուրաքանչյուր ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի թեկնածուի հարաբերական հաճախականությունը նրա արյան կոնցենտրացիայի հետ (Նկար 3դ): Յուրաքանչյուր ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի թեկնածուի միջին տիտրի և նրա արյան տիտրի համադրությունը բոլոր նմուշառման ժամանակ ցույց տվեց, որ վեց թեկնածուներից երեքը զգալիորեն հարստացված էին արյան ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկով: Հետաքրքիր է, որ #2077 կլոնը ցույց տվեց արյան մեջ ավելի բարձր կայունություն (Լրացուցիչ նկար 7): Հաստատելու համար, որ պեպտիդներն իրենք ունակ են ակտիվորեն տեղափոխել բեռը, բացի ֆագի մասնիկներից, ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի խցիկ, մենք սինթեզեցինք չորս առաջնորդ պեպտիդներ, որոնք ստացվել են բիոտինով N-ծայրում, որտեղ պեպտիդները միանում են ֆագի մասնիկին: Բիոտինիլացված պեպտիդները (համարներ 2002, 2009, 2020 և 2077) կոնյուգացվել են ստրեպտավիդինի (SA) հետ՝ ֆագի երկրաչափությունը որոշ չափով ընդօրինակող բազմամերային ձևեր ստանալու համար: Այս ձևաչափը նաև թույլ է տվել մեզ չափել SA-ի ազդեցությունը արյան և ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի մեջ՝ որպես բեռ տեղափոխող սպիտակուցային պեպտիդներ: Կարևոր է, որ ֆագի տվյալները հաճախ կարող էին վերարտադրվել, երբ սինթետիկ պեպտիդները կիրառվում էին այս SA-կոնյուգացված ձևաչափով (Նկար 3ե): Խառնված պեպտիդներն ունեին ավելի քիչ սկզբնական ազդեցություն և ավելի արագ ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի մաքրում՝ 48 ժամվա ընթացքում աննկատելի մակարդակներով: Այս պեպտիդ-ֆագային կլոնների ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի տարածություն մատակարարման ուղիների վերաբերյալ պատկերացում կազմելու համար մենք վերլուծել ենք առանձին ֆագային պեպտիդային հարվածների տեղայնացումը՝ օգտագործելով իմունահյուսվածքաքիմիա (IHC)՝ ֆագի մասնիկները in vivo ներերակային ներարկումից 1 ժամ անց ուղղակիորեն հայտնաբերելու համար: Հատկանշական է, որ #2002, #2077 և #2009 կլոնները կարող էին հայտնաբերվել ուղեղի մազանոթներում ուժեղ ներկման միջոցով, մինչդեռ վերահսկիչ ֆագը (#1779) և #2020 կլոնը չեն հայտնաբերվել (Լրացուցիչ նկար 8): Սա ենթադրում է, որ այս պեպտիդները նպաստում են ուղեղի վրա ազդեցությանը՝ հենց արյան-անոթային անոթը հատելով: Այս վարկածը ստուգելու համար անհրաժեշտ է հետագա մանրամասն վերլուծություն, քանի որ կարող է ներգրավված լինել նաև BSCFB ուղին: Առավել հարստացված կլոնի (#2002) ամինաթթվային հաջորդականությունը այլ ընտրված պեպտիդների հետ համեմատելիս նշվեց, որ դրանցից մի քանիսն ունեն նմանատիպ ամինաթթվային ընդլայնումներ, ինչը կարող է վկայել նմանատիպ տեղափոխման մեխանիզմի մասին (Նկար 3f):
Իր յուրահատուկ պլազմային պրոֆիլի և ժամանակի ընթացքում ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի (ՈՈՀ) զգալի աճի շնորհիվ, #2077 ֆագային ցուցադրման կլոնը հետագայում ուսումնասիրվել է ավելի երկար՝ 48 ժամվա ընթացքում և կարողացել է վերարտադրել ՈՈՀ-ի արագ աճը, որը դիտվել է SA-ի կայուն մակարդակների հետ միասին (Նկար 4ա): Ինչ վերաբերում է այլ նույնականացված ֆագային կլոններին, #2077-ը ուժեղ ներկվել է ուղեղի մազանոթների համար և ցույց է տվել զգալի համատեղ տեղակայում մազանոթային մարկերային լեկտինի հետ, երբ դիտվել է ավելի բարձր լուծաչափով, և հնարավոր է՝ որոշակի ներկում պարենքիմալ տարածքում (Նկար 4բ): Հետազոտելու համար, թե արդյոք պեպտիդային միջնորդավորված դեղաբանական ազդեցությունները կարող են ստացվել ԿՆՀ-ում, մենք անցկացրել ենք փորձ, որի ընթացքում i) #2077 տրանզիտային պեպտիդի և ii) BACE1 արգելակիչ պեպտիդի բիոտինիլացված տարբերակները խառնվել են SA-ի հետ երկու տարբեր հարաբերակցությամբ: Մեկ համակցության համար մենք օգտագործել ենք միայն BACE1 պեպտիդի արգելակիչը, իսկ մյուսի համար՝ BACE1 պեպտիդի արգելակիչի և #2077 պեպտիդի 1:3 հարաբերակցությունը: Երկու նմուշներն էլ ներարկվել են ներերակային, և բետա-ամիլոիդ պեպտիդ 40-ի (Abeta40) մակարդակը արյան և ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում չափվել է ժամանակի ընթացքում: Abeta40-ը չափվել է ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում, քանի որ այն արտացոլում է BACE1-ի արգելակումը ուղեղի պարենքիմում: Ինչպես և սպասվում էր, երկու համալիրներն էլ զգալիորեն նվազեցրել են Abeta40-ի մակարդակը արյան մեջ (Նկար 4գ, դ): Այնուամենայնիվ, միայն 2077 պեպտիդի խառնուրդ պարունակող նմուշները և SA-ին կոնյուգացված BACE1 պեպտիդի ինհիբիտորը առաջացրել են Abeta40-ի զգալի նվազում ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում (Նկար 4գ): Տվյալները ցույց են տալիս, որ 2077 պեպտիդը կարող է տեղափոխել 60 կԴա SA սպիտակուցը ԿՆՀ և նաև դեղաբանական ազդեցություններ է առաջացնում BACE1 պեպտիդի SA-կոնյուգացված ինհիբիտորների միջոցով:
(ա) T7 ֆագի կլոնային ներարկում (2 × 10 ֆագ/կենդանի), որը ցույց է տալիս ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի #2077 պեպտիդի (RLSSVDSDLSGC) և չներարկված վերահսկիչ ֆագի (#1779) երկարատև ֆարմակոկինետիկ պրոֆիլները առնվազն երեք CM-ինտուբացված առնետների մոտ։ (բ) Ֆագով ներարկված առնետների (2 × 10 10 ֆագ/կենդանի) ներկայացուցչական կեղևային միկրոանոթների կոնֆոկալ մանրադիտակային պատկեր, որը ցույց է տալիս #2077 պեպտիդի և անոթների (լեկտին) հակագունավորումը։ Այս ֆագի կլոնները տրվել են 3 առնետների և թողնվել են շրջանառվել 1 ժամ՝ պերֆուզիայից առաջ։ Ուղեղները կտրվել և ներկվել են T7 ֆագի կապսիդի դեմ պոլիկլոնալ FITC-նշագրված հակամարմիններով։ Պերֆուզիայից և հետագա ֆիքսացիայից տասը րոպե առաջ ներերակային ներարկվել է DyLight594-նշագրված լեկտին։ Ֆլուորեսցենտ պատկերներ, որոնք ցույց են տալիս միկրոանոթների լուսային կողմի լեկտինային ներկումը (կարմիր) և ֆագերը (կանաչ) մազանոթների և պերվասկուլյար ուղեղային հյուսվածքի լուսանցքում: Սանդղակի գիծը համապատասխանում է 10 մկմ-ի: (գ, դ) Բիոտինիլացված BACE1 արգելակող պեպտիդը առանձին կամ բիոտինիլացված #2077 տրանզիտային պեպտիդի հետ համատեղ զուգակցվել է ստրեպտավիդինի հետ, որին հաջորդել է առնվազն երեք կանուլացված CM առնետների ներերակային ներարկումը (10 մգ ստրեպտավիդին/կգ): BACE1 պեպտիդի արգելակիչով պայմանավորված Aβ40-ի նվազումը չափվել է Aβ1-40 ELISA-ի միջոցով արյան (կարմիր) և ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի (նարնջագույն) մեջ նշված ժամանակային կետերում: Ավելի լավ պարզության համար գրաֆիկի վրա գծված է կետավոր գիծ՝ 100% մասշտաբով: (գ) Aβ40-ի տոկոսային նվազումը արյան (կարմիր եռանկյունիներ) և ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի (նարնջագույն եռանկյունիներ) մեջ այն առնետների մոտ, որոնք բուժվել են #2077 տրանզիտային պեպտիդինին կոնյուգացված և BACE1 արգելակող պեպտիդով 3:1 հարաբերակցությամբ: (դ) Միայն BACE1 արգելակող պեպտիդի հետ զուգակցված ստրեպտավիդինով բուժված առնետների արյան Aβ40-ի (կարմիր շրջանակներ) և ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի (նարնջագույն շրջանակներ) տոկոսային նվազում: Վերահսկիչ խմբի Aβ կոնցենտրացիան կազմել է 420 պգ/մլ (ստանդարտ շեղում = 101 պգ/մլ):
Ֆագի ցուցադրումը հաջողությամբ կիրառվել է կենսաբժշկական հետազոտությունների մի շարք ոլորտներում17: Այս մեթոդը օգտագործվել է in vivo անոթային բազմազանության ուսումնասիրությունների համար18,19, ինչպես նաև ուղեղային անոթներին ուղղված ուսումնասիրությունների համար20,21,22,23,24,25,26: Այս ուսումնասիրության մեջ մենք ընդլայնել ենք այս ընտրության մեթոդի կիրառումը ոչ միայն ուղեղային անոթներին ուղղված պեպտիդների անմիջական նույնականացման, այլև արյուն-ուղեղային պատնեշը հատելու համար ակտիվ տրանսպորտային հատկություններ ունեցող թեկնածուների հայտնաբերման համար: Այժմ մենք նկարագրում ենք CM ինտուբացված առնետների մոտ in vivo ընտրության ընթացակարգի մշակումը և ցույց ենք տալիս դրա ներուժը՝ ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի հետադարձման հատկություններ ունեցող պեպտիդները նույնականացնելու համար: Օգտագործելով T7 ֆագը, որը ցուցադրում է 12-մեր պատահական պեպտիդների գրադարան, մենք կարողացանք ցույց տալ, որ T7 ֆագը բավականաչափ փոքր է (մոտավորապես 60 նմ տրամագծով)10՝ արյուն-ուղեղային պատնեշին հարմարվելու համար, այդպիսով անմիջապես հատելով արյուն-ուղեղային պատնեշը կամ խորոիդային հյուսակը: Մենք նկատեցինք, որ կանուլացված CM առնետներից ՈՂՀ հավաքագրումը լավ վերահսկվող in vivo ֆունկցիոնալ սկրինինգի մեթոդ էր, և որ արդյունահանված ֆագը ոչ միայն կապվում էր անոթային համակարգի հետ, այլև գործում էր որպես փոխադրող արյուն-ուղեղային պատնեշի միջով: Ավելին, միաժամանակ արյուն հավաքելով և ՈՂՀ-ին և արյունից ստացված ֆագերին HTS կիրառելով, մենք հաստատեցինք, որ ՈՂՀ-ի մեր ընտրությունը չի ազդվել արյան հարստացումից կամ ընտրության փուլերի միջև ընդարձակման պիտանիությունից: Այնուամենայնիվ, արյան խցիկը ընտրության ընթացակարգի մի մասն է, քանի որ ՈՂՀ խցիկ հասնելու ունակ ֆագերը պետք է գոյատևեն և շրջանառվեն արյան մեջ բավականաչափ երկար՝ ուղեղում հարստանալու համար: HTS հում տվյալներից հուսալի հաջորդականության տեղեկատվություն ստանալու համար մենք ներդրեցինք ֆիլտրեր, որոնք հարմարեցված էին վերլուծության աշխատանքային հոսքում հարթակին հատուկ հաջորդականության սխալներին: Սկրինինգի մեթոդում կինետիկ պարամետրերը ներառելով՝ մենք հաստատեցինք վայրի տիպի T7 ֆագերի արագ ֆարմակոկինետիկան (t½ ~ 28 րոպե) արյան մեջ24, 27, 28 և նաև որոշեցինք դրանց կիսատրոհման պարբերությունը ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում (t½ ~ 26 րոպե) րոպեում: Արյան և ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի նմանատիպ դեղաբանական պրոֆիլներին չնայած, ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում ֆագի արյան մեջ կոնցենտրացիայի միայն 0.001%-ն է հայտնաբերվել, ինչը վկայում է վայրի տիպի T7 ֆագի ցածր ֆոնային շարժունակության մասին արյուն-ուղեղային պատնեշի միջով: Այս աշխատանքը ընդգծում է ընտրության առաջին փուլի կարևորությունը in vivo պաննինգի ռազմավարություններ կիրառելիս, հատկապես այն ֆագային համակարգերի համար, որոնք արագորեն մաքրվում են շրջանառությունից, քանի որ քիչ կլոններ են կարողանում հասնել ԿՆՀ բաժին: Այսպիսով, առաջին փուլում գրադարանի բազմազանության նվազումը շատ մեծ էր, քանի որ այս շատ խիստ ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի մոդելում ի վերջո հավաքվել է միայն սահմանափակ թվով կլոններ: Այս in vivo պաննինգի ռազմավարությունը ներառում էր մի քանի ընտրության քայլեր, ինչպիսիք են ակտիվ կուտակումը ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի բաժնում, կլոնի գոյատևումը արյան բաժնում և T7 ֆագի կլոնների արագ հեռացումը արյունից առաջին 10 րոպեների ընթացքում (Նկար 1դ և լրացուցիչ նկար 4Մ): Այսպիսով, առաջին փուլից հետո ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում նույնականացվել են տարբեր ֆագի կլոններ, չնայած առանձին կենդանիների համար օգտագործվել է նույն սկզբնական խումբը: Սա ենթադրում է, որ գրադարանի անդամների մեծ թվով աղբյուրային գրադարանների համար բազմակի խիստ ընտրության քայլերը հանգեցնում են բազմազանության զգալի կրճատման: Հետևաբար, պատահական իրադարձությունները կդառնան սկզբնական ընտրության գործընթացի անբաժանելի մասը՝ մեծապես ազդելով արդյունքի վրա: Հավանական է, որ սկզբնական գրադարանի շատ կլոններ ունեցել են ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի հարստացման շատ նման հակում: Այնուամենայնիվ, նույնիսկ նույն փորձարարական պայմաններում ընտրության արդյունքները կարող են տարբերվել սկզբնական լողավազանում յուրաքանչյուր կոնկրետ կլոնի փոքր թվի պատճառով:
Ողնուղեղային հեղուկով հարստացված մոտիվները տարբերվում են արյան մեջ առկա մոտիվներից: Հետաքրքիր է, որ մենք նկատեցինք առաջին տեղաշարժը դեպի գլիցինով հարուստ պեպտիդներ առանձին կենդանիների արյան մեջ (Նկար 1գ, Լրացուցիչ Նկարներ 4ե, 4ֆ): Գլիցինային պեպտիդներ պարունակող ֆագը կարող է ավելի կայուն լինել և ավելի քիչ հավանականություն ունենալ շրջանառությունից դուրս գալու: Այնուամենայնիվ, այս գլիցինով հարուստ պեպտիդները չեն հայտնաբերվել ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի նմուշներում, ինչը ենթադրում է, որ ընտրված գրադարաններն անցել են երկու տարբեր ընտրության փուլերով՝ մեկը արյան մեջ, իսկ մյուսը՝ կուտակվել ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում: Ընտրության չորրորդ փուլից ստացված Ողնուղեղային հեղուկով հարստացված կլոնները լայնորեն փորձարկվել են: Հաստատվել է, որ անհատապես փորձարկված գրեթե բոլոր կլոնները հարստացված են Ողնուղեղային հեղուկով՝ համեմատած դատարկ վերահսկիչ ֆագի հետ: Մեկ պեպտիդային արդյունք (#2077) ուսումնասիրվել է ավելի մանրամասն: Այն ցույց է տվել ավելի երկար պլազմային կիսատրոհման պարբերություն՝ համեմատած այլ արդյունքների հետ (Նկար 3դ և Լրացուցիչ Նկար 7), և հետաքրքիր է, որ այս պեպտիդը պարունակում էր ցիստեինի մնացորդ C-ծայրամասում: Վերջերս ցույց է տրվել, որ պեպտիդներին ցիստեինի ավելացումը կարող է բարելավել դրանց դեղագործական հատկությունները՝ կապվելով ալբումին 29-ի հետ: Սա ներկայումս անհայտ է #2077 պեպտիդի համար և պահանջում է հետագա ուսումնասիրություն: Որոշ պեպտիդներ ցույց են տվել վալենտային կախվածություն ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի հարստացման մեջ (տվյալները չեն ներկայացված), որը կարող է կապված լինել T7 կապսիդի ցուցադրված մակերեսային երկրաչափության հետ: Մեր օգտագործած T7 համակարգը ցույց է տվել յուրաքանչյուր պեպտիդի 5-15 պատճեն յուրաքանչյուր ֆագի մասնիկի վրա: IHC-ն իրականացվել է թեկնածու առաջատար ֆագի կլոնների վրա, որոնք ներերակային ներարկվել են առնետների ուղեղային կեղև (Լրացուցիչ նկ. 8): Տվյալները ցույց են տվել, որ առնվազն երեք կլոն (թիվ 2002, թիվ 2009 և թիվ 2077) փոխազդել են արյունա-կմախքային համակարգի (BBB) ​​հետ: Մնում է պարզել, թե արդյոք այս BBB փոխազդեցությունը հանգեցնում է ուղեղ-կմախքային հեղուկի կուտակման, թե՞ այդ կլոնների ուղղակիորեն BCSFB տեղափոխման: Կարևոր է, որ մենք ցույց ենք տալիս, որ ընտրված պեպտիդները պահպանում են իրենց ուղեղ-կմախքային հեղուկի տեղափոխման կարողությունը, երբ սինթեզվում և կապվում են սպիտակուցային բեռի հետ: N-ծայրային բիոտինիլացված պեպտիդների կապումը SA-ի հետ էապես կրկնում է արյան և ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի համապատասխան ֆագային կլոններով ստացված արդյունքները (Նկար 3ե): Վերջապես, մենք ցույց ենք տալիս, որ #2077 առաջատար պեպտիդը կարող է խթանել SA-ի հետ կոնյուգացված BACE1-ի բիոտինիլացված պեպտիդի ինհիբիտորի ուղեղային ազդեցությունը՝ առաջացնելով ԿՆՀ-ում արտահայտված դեղաբանական ազդեցություններ՝ զգալիորեն նվազեցնելով Abeta40 մակարդակը ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում (Նկար 4): Մենք չկարողացանք տվյալների բազայում որևէ հոմոլոգ հայտնաբերել՝ բոլոր արդյունքների պեպտիդային հաջորդականության հոմոլոգության որոնում կատարելով: Կարևոր է նշել, որ T7 գրադարանի չափը մոտավորապես 109 է, մինչդեռ 12-մերների համար տեսական գրադարանի չափը 4 x 1015 է: Հետևաբար, մենք ընտրել ենք 12-մեր պեպտիդային գրադարանի բազմազանության տարածության միայն մի փոքր մասը, ինչը կարող է նշանակել, որ ավելի օպտիմալացված պեպտիդներ կարող են հայտնաբերվել՝ գնահատելով այդ նույնականացված արդյունքների հարակից հաջորդականության տարածությունը: Հիպոթետիկորեն, այս պեպտիդների որևէ բնական հոմոլոգ չհայտնաբերելու պատճառներից մեկը կարող է լինել էվոլյուցիայի ընթացքում դրանց ընտրությունը դադարեցնելը՝ որոշակի պեպտիդային մոտիվների անվերահսկելի մուտքը ուղեղ կանխելու համար։
Ամփոփելով՝ մեր արդյունքները հիմք են հանդիսանում ապագա աշխատանքների համար՝ ուղեղանոթային պատնեշի տրանսպորտային համակարգերը in vivo ավելի մանրամասնորեն նույնականացնելու և բնութագրելու համար: Այս մեթոդի հիմնական կառուցվածքը հիմնված է ֆունկցիոնալ ընտրության ռազմավարության վրա, որը ոչ միայն նույնականացնում է ուղեղանոթային կապող հատկություններ ունեցող կլոնները, այլև ներառում է կարևոր քայլ, որի ընթացքում հաջողակ կլոնները in vivo ունեն ներքին ակտիվություն՝ կենսաբանական պատնեշները CNS բաժին անցնելու համար: Այս պեպտիդների տեղափոխման մեխանիզմի և ուղեղի շրջանին բնորոշ միկրոանոթային համակարգին կապվելու նրանց նախընտրության պարզաբանումն է: Սա կարող է հանգեցնել BBB-ի և ընկալիչների տեղափոխման նոր ուղիների հայտնաբերմանը: Մենք ակնկալում ենք, որ նույնականացված պեպտիդները կարող են անմիջապես կապվել ուղեղանոթային ընկալիչների կամ BBB-ի կամ BCSFB-ի միջոցով տեղափոխվող շրջանառվող լիգանդների հետ: Այս աշխատանքում հայտնաբերված ողնուղեղային հեղուկի տրանսպորտային ակտիվությամբ պեպտիդային վեկտորները հետագայում կուսումնասիրվեն: Մենք ներկայումս ուսումնասիրում ենք այս պեպտիդների ուղեղային յուրահատկությունը՝ BBB-ն և/կամ BCSFB-ն անցնելու նրանց ունակության համար: Այս նոր պեպտիդները չափազանց արժեքավոր գործիքներ կլինեն նոր ընկալիչների կամ ուղիների հնարավոր հայտնաբերման և մակրոմոլեկուլների, ինչպիսիք են կենսաբանական պատրաստուկները, ուղեղ մատակարարելու նոր, բարձր արդյունավետ հարթակների մշակման համար։
Մեծ ցիստեռնան (ՄՑ) կանուլավորեք՝ օգտագործելով նախկինում նկարագրված մեթոդի փոփոխությունը: Անզգայացված Վիստար առնետները (200-350 գ) տեղադրվել են ստերեոտաքսիկ ապարատի վրա, և միջին կտրվածք է կատարվել սափրված և ասեպտիկորեն պատրաստված գլխամաշկի վրա՝ գանգի բացման համար: Վերին շերտի տարածքում բացեք երկու անցք և ամրացրեք ամրացնող պտուտակները անցքերի մեջ: Կողմնային ծոծրակի կատարին լրացուցիչ անցք է բացվել՝ չժանգոտվող պողպատե կանուլան ՄՑ-ի մեջ ստերեոտաքսիկ ուղղորդելու համար: Կանուլայի շուրջը տեղադրեք ատամնաբուժական ցեմենտ և ամրացրեք պտուտակներով: Լուսակարծրացումից և ցեմենտի կարծրացումից հետո մաշկի վերքը փակվել է 4/0 սուպրամիդային կարով: Կանուլայի ճիշտ տեղադրումը հաստատվում է ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի (ՈՈՀ) ինքնաբուխ արտահոսքով: Հանեք առնետին ստերեոտաքսիկ ապարատից, ստացեք համապատասխան հետվիրահատական ​​խնամք և ցավի կառավարում, և թողեք, որ նա վերականգնվի առնվազն մեկ շաբաթ, մինչև ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում արյան նշաններ նկատվեն: Վիստար առնետները (Crl:WI/Han) ձեռք են բերվել Շառլ Ռիվերից (Ֆրանսիա): Բոլոր առնետները պահվել են հատուկ պաթոգեններից զերծ պայմաններում: Բոլոր կենդանիների վրա կատարված փորձերը հաստատվել են Շվեյցարիայի Բազել քաղաքի անասնաբուժական գրասենյակի կողմից և իրականացվել են կենդանիների համար 2474 լիցենզիայի համաձայն (ակտիվ ուղեղային տրանսպորտի գնահատում՝ առնետի ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում և ուղեղում թերապևտիկ թեկնածուների մակարդակների չափման միջոցով):
Զգուշորեն պահեք առնետին գիտակցության մեջ՝ CM կանուլան ձեռքում։ Հանեք Դատուրան կանուլայից և հավաքեք 10 մկլ ինքնաբուխ հոսող ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկ։ Քանի որ կանուլայի անցանելիությունը, ի վերջո, խաթարվեց, այս ուսումնասիրության մեջ ներառվեցին միայն արյան աղտոտման կամ գունաթափման որևէ նշան չունեցող մաքուր ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի նմուշներ։ Զուգահեռաբար, պոչի ծայրին գտնվող փոքր կտրվածքից վերցվեց մոտավորապես 10-20 մկլ արյուն՝ հեպարինով (Sigma-Aldrich) խողովակների մեջ։ Ողնուղեղային հեղուկը և արյունը հավաքվեցին տարբեր ժամանակային կետերում՝ T7 ֆագի ներերակային ներարկումից հետո։ Ողնուղեղային հեղուկի յուրաքանչյուր նմուշ հավաքելուց առաջ թափվեց մոտավորապես 5-10 մկլ հեղուկ, որը համապատասխանում է կաթետերի մեռյալ ծավալին։
Գրադարանները ստեղծվել են T7Select 10-3b վեկտորի միջոցով, ինչպես նկարագրված է T7Select համակարգի ձեռնարկում (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996): Հակիրճ ասած, պատահական 12-մեր ԴՆԹ ներդիրը սինթեզվել է հետևյալ ձևաչափով՝
NNK կոդոնն օգտագործվել է ներդիրում կրկնակի կանգառի կոդոններից և ամինաթթվի գերարտահայտումից խուսափելու համար: N-ը յուրաքանչյուր նուկլեոտիդի ձեռքով խառնված էկվիմոլյար հարաբերակցությունն է, իսկ K-ն՝ ադենինի և ցիտոզինի նուկլեոտիդների ձեռքով խառնված էկվիմոլյար հարաբերակցությունը: Միաշղթա շրջանները վերածվել են երկշղթա ԴՆԹ-ի՝ dNTP-ի (Novagen) և Klenow ֆերմենտի (New England Biolabs) հետ հետագա ինկուբացիայի միջոցով Klenow բուֆերում (New England Biolabs) 3 ժամ 37°C ջերմաստիճանում: Ռեակցիայից հետո երկշղթա ԴՆԹ-ն վերականգնվել է EtOH նստեցման միջոցով: Արդյունքում ստացված ԴՆԹ-ն մարսվել է EcoRI և HindIII սահմանափակող ֆերմենտներով (երկուսն էլ՝ Roche-ից): Կտրված և մաքրված (QIAquick, Qiagen) ներդիրը (T4 լիգազ, New England Biolabs) այնուհետև լիգացվել է շրջանակի մեջ՝ նախապես կտրված T7 վեկտորի մեջ՝ 10B կապսիդ գենի 348-րդ ամինաթթվից հետո: Լիգացման ռեակցիաները ինկուբացվել են 16°C ջերմաստիճանում 18 ժամ՝ in ​​vitro փաթեթավորումից առաջ: Ֆագի փաթեթավորումը in vitro իրականացվել է T7Select 10-3b կլոնավորման հավաքածուի (Novagen) հետ տրամադրված հրահանգների համաձայն, և փաթեթավորման լուծույթը մեկ անգամ ամպլիֆիկացվել է մինչև լիզիս՝ օգտագործելով Escherichia coli (BLT5615, Novagen): Լիզատները ցենտրիֆուգացվել են, տիտրացվել և սառեցվել -80°C ջերմաստիճանում՝ որպես գլիցերինի հիմնական լուծույթ:
Ֆագի փոփոխական շրջանների ուղղակի ՊՇՌ ուժեղացում արգանակում կամ ափսեում՝ օգտագործելով սեփական 454/Roche-amplicon միաձուլման պրայմերներ: Առաջխաղացման միաձուլման պրայմերը պարունակում է փոփոխական շրջանի (NNK) 12 (շաբլոն-սպեցիֆիկ), GS FLX տիտանի ադապտեր A-ի և չորս հիմք ունեցող գրադարանային բանալիային հաջորդականության (TCAG) կողքերում գտնվող հաջորդականություններ (Լրացուցիչ նկար 1ա):
Հակադարձ միաձուլման պրայմերը պարունակում է նաև բիոտին, որը կցված է գնդիկները որսալուն, և GS FLX տիտանի ադապտեր B-ն, որը անհրաժեշտ է էմուլսիոն ՊՇՌ-ի ընթացքում կլոնային ուժեղացման համար։
Այնուհետև ամպլիկոնները ենթարկվել են 454/Roche պիրոսեքվենավորման՝ համաձայն 454 GS-FLX Titanium արձանագրության: Սանգերի ձեռքով հաջորդականության համար (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 ֆագի ԴՆԹ-ն ուժեղացվել է ՊՇՌ-ով և հաջորդականացվել հետևյալ պրայմեր զույգերով՝
Առանձին թիթեղներից ստացված ներդիրները ենթարկվել են ՊՇՌ ամպլիֆիկացիայի՝ օգտագործելով Roche Fast Start DNA Polymerase Kit-ը (արտադրողի հրահանգների համաձայն): Կատարել տաք մեկնարկ (10 րոպե 95 °C-ում) և 35 բուստ ցիկլ (50 վրկ 95 °C-ում, 1 րոպե 50 °C-ում և 1 րոպե 72 °C-ում):
Ֆագը գրադարաններից, վայրի տիպի ֆագը, ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկից և արյունից վերցված ֆագը կամ առանձին կլոնները ամպլիֆիկացվել են Escherichia coli BL5615-ում՝ TB արգանակում (Sigma Aldrich) կամ 500 սմ2 տարողությամբ ամաններում (Thermo Scientific) 4 ժամ 37°C ջերմաստիճանում: Ֆագը արդյունահանվել է թիթեղներից՝ թիթեղները լվանալով Tris-EDTA բուֆերով (Fluka Analytical) կամ հավաքելով ստերիլ պիպետի ծայրերով: Ֆագը մեկուսացվել է կուլտուրայի վերին շերտից կամ արդյունահանման բուֆերից՝ պոլիէթիլենգլիկոլի (PEG 8000) մեկ շրջան նստվածքով (Promega) և վերասուզվել Tris-EDTA բուֆերում:
Ամպլիֆիկացված ֆագը ենթարկվել է էնդոտոքսինի հեռացման 2-3 փուլի՝ օգտագործելով էնդոտոքսինի հեռացման գնդիկներ (Miltenyi Biotec)՝ ներերակային (IV) ներարկումից առաջ (500 մկլ/կենդանի): Առաջին փուլում ներմուծվել է 2×1012 ֆագ, երկրորդում՝ 2×1010 ֆագ, երրորդ և չորրորդ ընտրության փուլերում՝ 2×109 ֆագ մեկ կենդանու համար: Նշված ժամանակահատվածներում հավաքված ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկում և արյան նմուշներում ֆագի պարունակությունը որոշվել է արտադրողի հրահանգներին համապատասխան (T7Select համակարգի ձեռնարկ): Ֆագի ընտրությունը կատարվել է մաքրված գրադարանների ներերակային ներարկմամբ պոչի երակ կամ նախորդ ընտրության փուլից ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկից արդյունահանված ֆագի կրկնակի ներարկմամբ, իսկ հետագա հավաքագրումները կատարվել են ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի և արյան նմուշների համապատասխանաբար 10 րոպե, 30 րոպե, 60 րոպե, 90 րոպե, 120 րոպե, 180 րոպե և 240 րոպե հետո: Ընդհանուր առմամբ իրականացվել է in vivo պանինգի չորս փուլ, որոնց ընթացքում երկու ընտրված ճյուղերը առանձին պահվել և վերլուծվել են ընտրության առաջին երեք փուլերի ընթացքում: Ընտրության առաջին երկու փուլերից ՈՂՀ-ից արդյունահանված բոլոր ֆագային ներդիրները ենթարկվել են 454/Roche պիրոսեքվենավորման, մինչդեռ ընտրության վերջին երկու փուլերից ՈՂՀ-ից արդյունահանված բոլոր կլոնները ձեռքով սեկվենավորվել են: Ընտրության առաջին փուլի բոլոր արյան ֆագերը նույնպես ենթարկվել են 454/Roche պիրոսեքվենավորման: Ֆագային կլոնների ներարկման համար ընտրված ֆագերը ուժեղացվել են E. coli (BL5615)-ում 500 սմ2 թիթեղների վրա 37°C ջերմաստիճանում 4 ժամ: Անհատապես ընտրված և ձեռքով սեկվենավորված կլոնները բազմացվել են TB միջավայրում: Ֆագի արդյունահանումից, մաքրումից և էնդոտոքսինի հեռացումից հետո (ինչպես նկարագրված է վերևում), 300 մկլ-ում 2×1010 ֆագ/կենդանի ներարկվել է ներերակային մեկ պոչային երակի մեջ:
Հաջորդականության տվյալների նախնական մշակում և որակական ֆիլտրում: 454/Roche-ի հում տվյալները երկուական ստանդարտ հոսքային քարտեզի ձևաչափից (sff) փոխակերպվել են Pearson-ի մարդու համար ընթերցվող ձևաչափի (fasta)՝ օգտագործելով մատակարարի ծրագրակազմը: Նուկլեոտիդային հաջորդականության հետագա մշակումը կատարվել է սեփական C ծրագրերի և սկրիպտների միջոցով (չթողարկված ծրագրային փաթեթ), ինչպես նկարագրված է ստորև: Առաջնային տվյալների վերլուծությունը ներառում է խիստ բազմաստիճան ֆիլտրման ընթացակարգեր: 12մեր ներդիր ԴՆԹ-ի վավեր հաջորդականություն չպարունակող ընթերցումները զտելու համար ընթերցումները հաջորդաբար համապատասխանեցվել են մեկնարկային պիտակին (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), կանգառի պիտակին (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) և ֆոնային ներդիրին (CCCTGCAGGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC)՝ օգտագործելով գլոբալ Նիդլման-Վունշի թեստը: Հավասարեցումը թույլ է տալիս մինչև 2 անհամապատասխանություն մեկ հավասարեցման համար31: Հետևաբար, ընթերցումները առանց մեկնարկային և կանգառի պիտակների և ֆոնային ներդիրներ պարունակող ընթերցումները, այսինքն՝ հավասարեցումները, որոնք գերազանցում են թույլատրելի անհամապատասխանությունների քանակը, հեռացվել են գրադարանից: Ինչ վերաբերում է մնացած ընթերցումներին, սկզբնական ընթերցման հաջորդականությունից հեռացվել է սկզբնական նշանից մինչև կանգառի նշանը ձգվող N-մեր ԴՆԹ հաջորդականությունը և հետագայում մշակվել (այսուհետ՝ «ներդիր»): Ներդիրի թարգմանությունից հետո, պրայմերի 5' ծայրում առաջին կանգառի կոդոնից հետո գտնվող հատվածը հեռացվել է ներդիրից: Բացի այդ, հեռացվել են նաև պրայմերի 3' ծայրում գտնվող անավարտ կոդոններին տանող նուկլեոտիդները: Միայն ֆոնային հաջորդականություններ պարունակող ներդիրները բացառելու համար հեռացվել են նաև «PAG» ամինաթթվային նախշով սկսվող թարգմանված ներդիրները: Գրադարանից հեռացվել են 3-ից պակաս ամինաթթուներից հետո թարգմանության երկարություն ունեցող պեպտիդները: Վերջապես, հեռացնել ներդիրների հավաքածուի ավելորդությունը և որոշել յուրաքանչյուր եզակի ներդիրի հաճախականությունը: Այս վերլուծության արդյունքները ներառում էին նուկլեոտիդային հաջորդականությունների (ներդիրների) ցանկը և դրանց (ընթերցման) հաճախականությունները (Լրացուցիչ նկար 1c և 2):
Խմբային N-մեր ԴՆԹ ներդիրներ ըստ հաջորդականության նմանության. 454/Roche-ի հաջորդականության սխալները վերացնելու համար (օրինակ՝ հոմոպոլիմերային ընդլայնումների հաջորդականության հետ կապված խնդիրները) և պակաս կարևոր ավելորդությունները հեռացնելու համար, նախկինում զտված N-մեր ԴՆԹ հաջորդականության ներդիրները (ներդիրները) տեսակավորվում են ըստ նմանության։ Ներդիրները (թույլատրվում է մինչև 2 չհամապատասխանող հիմք)՝ օգտագործելով հետևյալ կերպ սահմանված իտերատիվ ալգորիթմ. Ներդիրները տեսակավորվում են նախ ըստ իրենց հաճախականության (ամենաբարձրից մինչև ամենացածր), իսկ եթե նույնն են՝ ըստ իրենց երկրորդայինի (տեսակավորվում են ըստ երկարության (ամենաերկարից մինչև ամենակարճը))։ Այսպիսով, ամենահաճախակի և ամենաերկար ներդիրները սահմանում են առաջին «խումբը»։ Խմբի հաճախականությունը սահմանվում է որպես բանալիի հաճախականություն։ Այնուհետև, տեսակավորված ցուցակում մնացած յուրաքանչյուր ներդիր փորձ է արվել ավելացնել խմբին զույգերով Նիդլման-Վունշի հավասարեցմամբ։ Եթե հավասարեցման մեջ անհամապատասխանությունների, ներդիրների կամ ջնջումների քանակը չի գերազանցում 2 շեմը, խմբին ավելացվում է ներդիր, և խմբի ընդհանուր հաճախականությունը մեծանում է ներդրման ավելացման հաճախականությամբ։ Խմբում ավելացված ներդիրները նշվում են որպես օգտագործված և բացառվում են հետագա մշակումից։ Եթե ​​ներդրման հաջորդականությունը չի կարող ավելացվել արդեն գոյություն ունեցող խմբին, ներդրման հաջորդականությունն օգտագործվում է համապատասխան ներդրման հաճախականությամբ նոր խումբ ստեղծելու համար և նշվում է որպես օգտագործված: Իտերացիան ավարտվում է, երբ յուրաքանչյուր ներդրման հաջորդականություն կամ օգտագործվել է նոր խումբ ձևավորելու համար, կամ կարող է ներառվել արդեն գոյություն ունեցող խմբում: Ի վերջո, նուկլեոտիդներից բաղկացած խմբավորված ներդրումները ի վերջո թարգմանվում են պեպտիդային հաջորդականությունների (պեպտիդային գրադարաններ): Այս վերլուծության արդյունքը ներդրումների և դրանց համապատասխան հաճախականությունների հավաքածու է, որը կազմում է հաջորդական ընթերցումների քանակը (Լրացուցիչ նկ. 2):
Մոտիվի ստեղծում. Եզակի պեպտիդների ցանկի հիման վրա ստեղծվել է գրադարան, որը պարունակում է բոլոր հնարավոր ամինաթթվային նախշերը (aa), ինչպես ցույց է տրված ստորև: 3 երկարությամբ յուրաքանչյուր հնարավոր նախշ առանձնացվել է պեպտիդից, և դրա հակադարձ նախշը ավելացվել է բոլոր նախշերը (եռապեպտիդներ) պարունակող ընդհանուր մոտիվային գրադարանի հետ միասին: Բարձր կրկնվող մոտիվների գրադարանները հաջորդականացվել են, և ավելորդությունը հեռացվել է: Այնուհետև, մոտիվային գրադարանում յուրաքանչյուր եռապեպտիդի համար մենք ստուգել ենք դրա առկայությունը գրադարանում՝ օգտագործելով հաշվողական գործիքներ: Այս դեպքում, հայտնաբերված մոտիվային եռապեպտիդը պարունակող պեպտիդի հաճախականությունը ավելացվում է և վերագրվում մոտիվային գրադարանում գտնվող մոտիվին («մոտիվների քանակ»): Մոտիվի ստեղծման արդյունքը երկչափ զանգված է, որը պարունակում է եռապեպտիդների (մոտիվների) բոլոր դեպքերը և դրանց համապատասխան արժեքները, որոնք հաջորդականության ընթերցումների քանակն են, որոնք հանգեցնում են համապատասխան մոտիվի, երբ ընթերցումները զտվում, խմբավորվում և թարգմանվում են: Չափանիշները, ինչպես մանրամասն նկարագրված է վերևում:
Մոտիվների քանակի և համապատասխան ցրման գրաֆիկների նորմալացում. Յուրաքանչյուր նմուշի մոտիվների քանակը նորմալացվել է օգտագործելով
որտեղ ni-ն i թեման պարունակող ընթերցումների քանակն է։ Այսպիսով, vi-ն ներկայացնում է նմուշում i մոտիվ պարունակող ընթերցումների (կամ պեպտիդների) տոկոսային հաճախականությունը։ Մոտիվների ոչ նորմալացված քանակի P-արժեքները հաշվարկվել են Ֆիշերի ճշգրիտ թեստի միջոցով։ Մոտիվների քանակի կորելոգրամների վերաբերյալ Սփիրմանի կորելացիաները հաշվարկվել են R-ով նորմալացված մոտիվների քանակի միջոցով։
Պեպտիդային գրադարանի յուրաքանչյուր դիրքում ամինաթթուների պարունակությունը պատկերացնելու համար ստեղծվել են վեբ լոգոգրամներ 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com): Նախ, 12-մեր պեպտիդի յուրաքանչյուր դիրքում ամինաթթուների պարունակությունը պահվում է 20×12 մատրիցում: Այնուհետև, fasta-sequence ձևաչափով ստեղծվում է 1000 պեպտիդներից բաղկացած հավաքածու, որոնք պարունակում են յուրաքանչյուր դիրքում նույն հարաբերական ամինաթթուների պարունակությունը և մուտքագրվում են web-logo 3-ում, որը տվյալ պեպտիդային գրադարանի համար ստեղծում է յուրաքանչյուր դիրքում հարաբերական ամինաթթուների պարունակության գրաֆիկական ներկայացում: Բազմաչափ տվյալների հավաքածուները պատկերացնելու համար ստեղծվել են ջերմային քարտեզներ՝ օգտագործելով R-ում ներքին մշակված գործիք (biosHeatmap, դեռևս չթողարկվող R փաթեթ): Ջերմային քարտեզներում ներկայացված դենդրոգրամները հաշվարկվել են Ուորդի հիերարխիկ կլաստերացման մեթոդով՝ Էվկլիդեսյան հեռավորության մետրիկայով: Մոտիվի գնահատման տվյալների վիճակագրական վերլուծության համար չնորմալացված գնահատման P արժեքները հաշվարկվել են Ֆիշերի ճշգրիտ թեստի միջոցով: Այլ տվյալների հավաքածուների P-արժեքները հաշվարկվել են R-ում՝ օգտագործելով Ստյուդենտի t-թեստը կամ ANOVA-ն։
Ընտրված ֆագերի կլոնները և ներդիրներ չունեցող ֆագերը ներարկվել են ներերակային եղանակով՝ պոչի երակի միջոցով (2×1010 ֆագ/կենդանի 300 մկլ PBS-ի մեջ): Պերֆուզիայից և հետագա ֆիքսացիայից տասը րոպե առաջ նույն կենդանիներին ներերակային ներարկվել է 100 մկլ DyLight594-ով նշագրված լեկտին (Vector Laboratories Inc., DL-1177): Ֆագի ներարկումից 60 րոպե անց առնետներին սրտի միջոցով ներարկվել է 50 մլ PBS, որին հաջորդել է 50 մլ 4% PFA/PBS: Ուղեղի նմուշները լրացուցիչ ֆիքսվել են գիշերը 4% PFA/PBS-ի մեջ և թրջվել 30% սախարոզայի մեջ գիշերը 4°C ջերմաստիճանում: Նմուշները արագ սառեցվել են OCT խառնուրդում: Սառեցված նմուշների իմունահյուսվածքաքիմիական վերլուծությունը կատարվել է սենյակային ջերմաստիճանում 30 մկմ կրիոսեկցիաների վրա, որոնք բլոկավորվել են 1% BSA-ով և ինկուբացվել T7 ֆագի դեմ պոլիկլոնալ FITC-նշագրված հակամարմիններով (Novus NB 600-376A) 4°C ջերմաստիճանում: Ինկուբացեք ամբողջ գիշեր։ Վերջապես, հատվածները լվացվեցին 3 անգամ PBS-ով և հետազոտվեցին կոնֆոկալ լազերային մանրադիտակով (Leica TCS SP5):
Բոլոր պեպտիդները, որոնք ունեն առնվազն 98% մաքրություն, սինթեզվել են GenScript USA-ի կողմից, բիոտինիլացվել և լիոֆիլացվել են։ Բիոտինը կապված է N-ծայրամասում լրացուցիչ եռակի գլիցինային միջադիրի միջոցով։ Ստուգեք բոլոր պեպտիդները զանգվածային սպեկտրոմետրիայի միջոցով։
Ստրեպտավիդինը (Sigma S0677) խառնվել է բիոտինիլացված պեպտիդի 5-ապատիկ հավասարամոլային ավելցուկի, բիոտինիլացված BACE1 արգելակող պեպտիդի կամ բիոտինիլացված BACE1 արգելակող պեպտիդի և BACE1 արգելակող պեպտիդի համադրության (3:1 հարաբերակցությամբ) հետ 5–10% DMSO-ում/ինկուբացվել է PBS-ում: Ներարկումից 1 ժամ առաջ սենյակային ջերմաստիճանում: Ստրեպտավիդին-կոնյուգացված պեպտիդները ներարկվել են ներերակային՝ 10 մգ/կգ դեղաչափով, ուղեղային խոռոչ ունեցող առնետների պոչային երակներից մեկի մեջ:
Ստրեպտավիդին-պեպտիդային համալիրների կոնցենտրացիան գնահատվել է ELISA մեթոդով: Nunc Maxisorp միկրոտիտրային թիթեղները (Sigma) գիշերը պատվել են 4°C ջերմաստիճանում 1.5 մկգ/մլ մկան հակաստրեպտավիդինային հակամարմինով (Thermo, MA1-20011): Բլոկավորումից (բլոկավորման բուֆեր՝ 140 նՄ NaCL, 5 մՄ EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ժելատին, 1% BSA) սենյակային ջերմաստիճանում 2 ժամ շարունակ, թիթեղը 3 վայրկյան լվանալ 0.05% Tween-20/PBS-ով (լվացման բուֆեր), ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի և պլազմայի նմուշները ավելացվել են բլոկավորման բուֆերով նոսրացված անցքերի մեջ (պլազմա 1:10,000, CSF 1:115): Այնուհետև թիթեղը ինկուբացվել է գիշերը 4°C ջերմաստիճանում հայտնաբերման հակամարմինով (1 մկգ/մլ, հակաստրեպտավիդին-HRP, Novus NB120-7239): Երեք լվացման փուլից հետո ստրեպտավիդինը հայտնաբերվել է TMB սուբստրատ լուծույթում (Roche) մինչև 20 րոպե ինկուբացիայի միջոցով: 1M H2SO4-ով գույնի զարգացումը դադարեցնելուց հետո չափել աբսորբցիան ​​450 նմ-ում:
Ստրեպտավիդին-պեպտիդ-BACE1 արգելակիչ համալիրի ֆունկցիան գնահատվել է Aβ(1-40) ELISA մեթոդով՝ համաձայն արտադրողի արձանագրության (Wako, 294-64701): Հակիրճ ասած, ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկի նմուշները նոսրացվել են ստանդարտ նոսրացուցիչով (1:23) և ինկուբացվել են գիշերը 4°C ջերմաստիճանում 96-խոռոչանոց թիթեղներում, որոնք պատված են BNT77 որսացող հակամարմինով: Հինգ լվացման փուլից հետո ավելացվել է HRP-կոնյուգացված BA27 հակամարմին և ինկուբացվել է 2 ժամ 4°C ջերմաստիճանում, որին հաջորդել են հինգ լվացման փուլեր: Aβ(1–40)-ը հայտնաբերվել է TMB լուծույթում 30 րոպե ինկուբացիայի միջոցով սենյակային ջերմաստիճանում: Գույնի զարգացումը կանգնեցնելուց հետո կանգառի լուծույթով, չափել աբսորբցիան ​​450 նմ-ում: Պլազմայի նմուշները ենթարկվել են պինդ փուլի արդյունահանման՝ Aβ(1–40) ELISA-ից առաջ: Պլազման ավելացվել է 0.2% DEA (Sigma) լուծույթին 96-խոռոչանոց թիթեղներում և ինկուբացվել սենյակային ջերմաստիճանում 30 րոպե: SPE թիթեղները (Oasis, 186000679) ջրով և 100% մեթանոլով հաջորդաբար լվանալուց հետո, պլազմայի նմուշները ավելացվեցին SPE թիթեղներին, և ամբողջ հեղուկը հեռացվեց։ Նմուշները լվացվեցին (սկզբում 5% մեթանոլով, ապա 30% մեթանոլով) և էլուացվեցին 2% NH4OH/90% մեթանոլով։ Էլյուատը 55°C ջերմաստիճանում 99 րոպե հաստատուն N2 հոսանքի տակ չորացնելուց հետո, նմուշները վերականգնվեցին ստանդարտ նոսրացուցիչներով, և Aβ(1–40)-ը չափվեց վերևում նկարագրվածի պես։
Ինչպես մեջբերել այս հոդվածը. Ուրիչ, Է. և այլք: Բեռի առաքում ուղեղին՝ օգտագործելով in vivo հայտնաբերված տրանզիտային պեպտիդներ: The Science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015):
Լիխոտա Ջ., Սկյորրինգե Տ., Թոմսեն Լ.Բ. և Մուս Տ. Մակրոմոլեկուլային դեղամիջոցների ուղեղին ներարկումը՝ թիրախային թերապիայի միջոցով: Նեյրոքիմիայի հանդես 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010):
Բրասնևիչ, Ի., Ստեյնբուշ, Հ.Վ., Շմից, Ք., և Մարտինես-Մարտինես, Պ. Պեպտիդային և սպիտակուցային դեղամիջոցների ներարկումը արյուն-ուղեղային պատնեշով: Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009):
Փարդիջ, ՎՄ Արյան-ուղեղային պատնեշը. ուղեղի դեղամիջոցների մշակման խոչընդոտ։ NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005)։
Յոհանսոն, Կ.Ե., Դունկան, Ջ.Ա., Ստոպա, Է.Գ. և Բըրդ, Ա. Դեղերի առաքման և ուղեղին թիրախավորման բարելավման հեռանկարներ՝ խորոիդային հյուսակ-ողնուղեղային հեղուկ հեղուկի ուղու միջոցով: Դեղագործական հետազոտություններ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005):
Փարդիջ, ՎՄ Կենսադեղագործական միջոցների արդիականացում մոլեկուլային տրոյական ձիերով՝ ուղեղի առաքման համար: Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008):
Փարդիջ, WM ընկալիչով միջնորդված պեպտիդային փոխադրում արյուն-ուղեղային պատնեշի միջով։ Endocr Rev. 7, 314–330 (1986)։
Նիվոեներ, Ջ. և այլք։ Միարժեք մոլեկուլային շաթլների միջոցով թերապևտիկ հակամարմինների ուղեղային ներթափանցման և արդյունավետության բարձրացում։ Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)։
Բիեն-Լի, Ն. և այլք։ Տրանսֆերինային ընկալիչի (TfR) փոխադրումը որոշում է TfR հակամարմինների աֆինային տարբերակների ուղեղային կլանումը։ J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014)։