Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Вы карыстаецеся версіяй браўзера з абмежаванай падтрымкай CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Акрамя таго, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы паказваем сайт без стыляў і JavaScript.
Адлюстроўвае карусель з трох слайдаў адначасова. Выкарыстоўвайце кнопкі «Папярэдні» і «Наступны», каб перамяшчацца паміж трыма слайдамі адначасова, або выкарыстоўвайце кнопкі-паўзункі ў канцы, каб перамяшчацца паміж трыма слайдамі адначасова.
Гематаэнцэфалічны бар'ер і гематаэнцэфалічны бар'ер перашкаджаюць біятэрапеўтычным агентам дасягаць сваіх мішэняў у цэнтральнай нервовай сістэме, тым самым перашкаджаючы эфектыўнаму лячэнню неўралагічных захворванняў. Каб выявіць новыя транспарцёры мозгу in vivo, мы ўвялі бібліятэку пептыдаў фага Т7 і паслядоўна збіралі кроў і спіннамазгавую вадкасць (СМВ) з выкарыстаннем канюляванай мадэлі вялікага пула пацукоў у свядомасці. Канкрэтныя клоны фагаў былі высока ўзбагачаны СМВ пасля чатырох раўндаў адбору. Тэставанне асобных пептыдаў-кандыдатаў паказала больш чым 1000-кратнае ўзбагачэнне СМВ. Біяактыўнасць пептыд-апасродкаванай дастаўкі ў мозг была пацверджана 40% зніжэннем узроўню амілоіда-β у спіннамазгавой вадкасці з выкарыстаннем інгібітара пептыда BACE1, звязанага з ідэнтыфікаваным новым транзітным пептыдам. Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што пептыды, ідэнтыфікаваныя метадамі фагавай селекцыі in vivo, могуць быць карыснымі носьбітамі для сістэмнай дастаўкі макрамалекул у мозг з тэрапеўтычным эфектам.
Даследаванні тэрапіі, накіраванай на цэнтральную нервовую сістэму (ЦНС), у асноўным сканцэнтраваны на выяўленні аптымізаваных лекаў і агентаў, якія праяўляюць уласцівасці, накіраваныя на ЦНС, пры гэтым менш намаганняў прысвечана выяўленню механізмаў, якія забяспечваюць актыўную дастаўку лекаў у мозг. Цяпер сітуацыя пачынае мяняцца, паколькі дастаўка лекаў, асабліва буйных малекул, з'яўляецца неад'емнай часткай сучаснай распрацоўкі лекаў у нейранавуцы. Асяроддзе цэнтральнай нервовай сістэмы добра абаронена сістэмай цэрэбраваскулярнага бар'ера, якая складаецца з гематаэнцэфалічнага бар'ера (ГЭБ) і гематаэнцэфалічнага бар'ера (ГЭБ)1, што ўскладняе дастаўку лекаў у мозг1,2. Паводле ацэнак, амаль усе лекі з вялікімі малекуламі і больш за 98% лекаў з нізкімі малекуламі выводзяцца з мозгу3. Вось чаму вельмі важна вызначыць новыя сістэмы транспарту ў мозг, якія забяспечваюць эфектыўную і спецыфічную дастаўку тэрапеўтычных лекаў у ЦНС4,5. Аднак ГЭБ і ГЭБК таксама прадстаўляюць выдатную магчымасць для дастаўкі лекаў, паколькі яны пранікаюць і трапляюць ва ўсе структуры мозгу праз яго шырокую васкулярызацыю. Такім чынам, цяперашнія намаганні па выкарыстанні неінвазіўных метадаў дастаўкі ў мозг у значнай ступені заснаваныя на механізме рэцэптар-апасродкаванага транспарту (PMT) з выкарыстаннем эндагеннага рэцэптара BBB6. Нягледзячы на ​​нядаўнія ключавыя поспехі ў выкарыстанні шляху рэцэптара трансферыну7,8, патрабуецца далейшая распрацоўка новых сістэм дастаўкі з палепшанымі ўласцівасцямі. З гэтай мэтай нашай мэтай было вызначыць пептыды, здольныя апасродкаваць транспарт спіннамазгавой вадкасці (СМВ), паколькі яны ў прынцыпе маглі б быць выкарыстаны для дастаўкі макрамалекул у ЦНС або для адкрыцця новых рэцэптарных шляхоў. У прыватнасці, спецыфічныя рэцэптары і транспарцёры цэрэбраваскулярнай сістэмы (ГЭБ і БСКФС) могуць служыць патэнцыйнымі мішэнямі для актыўнай і спецыфічнай дастаўкі біятэрапеўтычных прэпаратаў. Спіннамазгавая вадкасць (СМВ) з'яўляецца сакрэторным прадуктам харыяідальнага спляцення (ХС) і знаходзіцца ў непасрэдным кантакце з міжтканкавай вадкасцю мозгу праз субарахноідальную прастору і страўнічкавую прастору4. Нядаўна было паказана, што субарахноідальная спіннамазгавая вадкасць празмерна дыфузуе ў міжтканкавую абалонку мозгу9. Мы спадзяемся атрымаць доступ да парэнхіматознай прасторы, выкарыстоўваючы гэты субарахноідны ўваходны тракт або непасрэдна праз ГЭБ. Для дасягнення гэтай мэты мы ўкаранілі надзейную стратэгію адбору фагаў in vivo, якая ідэальна ідэнтыфікуе пептыды, якія транспартуюцца любым з гэтых двух розных шляхоў.
Зараз мы апісваем паслядоўны метад скрынінга фагавага дысплея in vivo з адборам проб спіннамазгавой вадкасці ў спалучэнні з высокапрадукцыйным секвенаваннем (HTS) для маніторынгу пачатковых раўндаў адбору з найбольшай разнастайнасцю бібліятэк. Скрынінг праводзіўся на свядомых пацуках з пастаянна імплантаванай канюляй вялікай цыстэрны (CM), каб пазбегнуць забруджвання крыві. Важна адзначыць, што гэты падыход адбірае як пептыды, накіраваныя на мозг, так і пептыды з транспартнай актыўнасцю праз цэрэбраваскулярны бар'ер. Мы выкарыстоўвалі фагі T7 з-за іх малога памеру (~60 нм)10 і выказалі здагадку, што яны падыходзяць для транспарту везікул, якія дазваляюць трансклеткавае перасячэнне эндатэліяльнага і/або эпітэліяльна-мазгавога бар'ера. Пасля чатырох раўндаў панінгу былі вылучаны папуляцыі фагаў, якія дэманструюць моцнае ўзбагачэнне спіннамазгавой вадкасці in vivo і асацыяцыю з цэрэбраспінальнымі мікрасасудамі. Важна адзначыць, што мы змаглі пацвердзіць нашы высновы, прадэманстраваўшы, што пераважныя і хімічна сінтэзаваныя найлепшыя кандыдаты-пептыды здольныя транспартаваць бялковы груз у спіннамазгавую вадкасць. Спачатку былі ўстаноўлены фармакадынамічныя эфекты ЦНС шляхам спалучэння вядучага транзітнага пептыда з інгібітарам пептыда BACE1. Акрамя дэманстрацыі таго, што стратэгіі функцыянальнага скрынінгу in vivo могуць ідэнтыфікаваць новыя пептыды транспарту мозгу як эфектыўныя перавозчыкі бялку, мы чакаем, што падобныя падыходы да функцыянальнага адбору таксама стануць важнымі ў вызначэнні новых шляхоў транспарту мозгу.
На аснове адзінак, якія ўтвараюць бляшкі (PFU), пасля этапу ўпакоўкі фага была распрацавана і створана бібліятэка выпадковых 12-мерных лінейных пептыдаў фага T7 з разнастайнасцю прыблізна 109 (гл. Матэрыялы і метады). Важна адзначыць, што мы старанна прааналізавалі гэтую бібліятэку перад пэнінгам in vivo. ПЦР-ампліфікацыя ўзораў фагавай бібліятэкі з выкарыстаннем мадыфікаваных праймераў стварыла ампліконы, якія былі непасрэдна прыдатныя да HTS (Дадатковы малюнак 1a). З-за а) памылак секвенавання HTS11, б) уплыву на якасць праймераў (NNK)1-12 і в) прысутнасці фага дзікага тыпу (wt) (шкілетныя ўстаўкі) у рэзервовай бібліятэцы была ўкаранёна працэдура фільтрацыі паслядоўнасці для здабывання толькі праверанай інфармацыі аб паслядоўнасці (Дадатковы малюнак 1b). Гэтыя этапы фільтрацыі прымяняюцца да ўсіх бібліятэк секвенавання HTS. Для стандартнай бібліятэкі было атрымана ў агульнай складанасці 233 868 прачытанняў, з якіх 39% адпавядалі крытэрыям фільтрацыі і былі выкарыстаны для аналізу і адбору бібліятэкі для наступных раўндаў (Дадатковы малюнак 1c-e). Чытанні былі пераважна кратнымі 3 парам асноў у даўжыню з пікам пры 36 нуклеатыдах (дадатковы малюнак 1c), што пацвярджае дызайн бібліятэкі (NNK) 1-12. Прыкметна, што прыблізна 11% членаў бібліятэкі ўтрымлівалі 12-мерную ўстаўку PAGISRELVDKL дзікага тыпу (wt), і амаль палова паслядоўнасцей (49%) утрымлівала ўстаўкі або дэлецыі. HTS бібліятэкі пацвердзіў высокую разнастайнасць пептыдаў у бібліятэцы: больш за 81% пептыдных паслядоўнасцей былі знойдзены толькі адзін раз, і толькі 1,5% сустракаліся ў ≥4 копіях (дадатковы малюнак 2a). Частоты амінакіслот (АК) ва ўсіх 12 пазіцыях у рэпертуары добра карэлявалі з частотамі, чаканымі для колькасці кодонаў, генераваных дэгенераваным рэпертуарам NKK (дадатковы малюнак 2b). Назіраная частата рэшткаў АК, закадаваных гэтымі ўстаўкамі, добра карэлявала з разліковай частатой (r = 0,893) (дадатковы малюнак 2c). Падрыхтоўка фагавых бібліятэк для ін'екцыі ўключае этапы ампліфікацыі і выдалення эндатаксіну. Раней было паказана, што гэта патэнцыйна зніжае разнастайнасць фагавых бібліятэк12,13. Таму мы секвенавалі ампліфікаваную на пласцінах фагавую бібліятэку, якая падверглася выдаленню эндатаксіну, і параўналі яе з зыходнай бібліятэкай, каб ацаніць частату амінакіслот (АМК). Назіралася моцная карэляцыя (r = 0,995) паміж зыходным пулам і ампліфікаваным і ачышчаным пулам (Дадатковы мал. 2d), што сведчыць аб тым, што канкурэнцыя паміж клонамі, ампліфікаванымі на пласцінах з выкарыстаннем фага T7, не выклікала істотнага зрушэння. Гэта параўнанне заснавана на частаце трыпептыдных матываў у кожнай бібліятэцы, паколькі разнастайнасць бібліятэк (~109) нельга цалкам улічваць нават з дапамогай HTS. Частотны аналіз АМК у кожнай пазіцыі выявіў невялікае зрушэнне, якое залежыць ад пазіцыі, у апошніх трох пазіцыях уведзенага рэпертуару (Дадатковы мал. 2e). У заключэнне мы прыйшлі да высновы, што якасць і разнастайнасць бібліятэкі былі прымальнымі, і назіраліся толькі нязначныя змены ў разнастайнасці з-за ампліфікацыі і падрыхтоўкі фагавых бібліятэк паміж некалькімі раўндамі адбору.
Серыйны адбор проб спіннамазгавой вадкасці можна праводзіць шляхам хірургічнай імплантацыі канюлі ў цэрэбраспінальную вадкасць свядомых пацукоў для палягчэння ідэнтыфікацыі фага Т7, які ўводзіцца нутравенна (в/в) праз ГЭБ і/або БКСФБ (мал. 1a-b). У першых трох раўндах адбору in vivo мы выкарыстоўвалі дзве незалежныя групы адбору (групы А і В) (мал. 1c). Мы паступова павялічвалі строгасць адбору, памяншаючы агульную колькасць фага, уведзенага ў першых трох раўндах адбору. Для чацвёртага раўнда панінгу мы аб'ядналі ўзоры з галін А і В і правялі тры дадатковыя незалежныя адборы. Для вывучэння ўласцівасцей часціц фага Т7 in vivo ў гэтай мадэлі фаг дзікага тыпу (галоўная ўстаўка PAGISRELVDKL) быў уведзены пацукам праз хваставую вену. Вылучэнне фагаў з спіннамазгавой вадкасці і крыві ў розныя моманты часу паказала, што адносна невялікія ікасаэдрычныя фагі Т7 мелі хуткую пачатковую фазу вывядзення з крывянога адсека (дадатковы мал. 3). Зыходзячы з тытраў уведзеных прэпаратаў і аб'ёму крыві пацукоў, мы падлічылі, што праз 10 хвілін пасля нутравеннай ін'екцыі ў крыві было выяўлена толькі прыблізна 1% фага па вазе ад уведзенай дозы. Пасля гэтага першапачатковага хуткага зніжэння быў вымераны больш павольны першасны кліранс з перыядам паўраспаду 27,7 хвіліны. Важна адзначыць, што з спіннамазгавой вадкасці было атрымана толькі вельмі мала фагаў, што сведчыць аб нізкім фонавым узроўні міграцыі фагаў дзікага тыпу ў спіннамазгавую вадкасць (Дадатковы мал. 3). У сярэднім за ўвесь перыяд адбору проб (0-250 хвілін) у спіннамазгавой вадкасці было выяўлена толькі каля 1 x 10⁻⁶% тытраў фага Т7 у крыві і 4 x 10⁻⁶% першапачаткова ўведзеных фагаў. Прыкметна, што перыяд паўраспаду (25,7 хвілін) фага дзікага тыпу ў спіннамазгавой вадкасці быў падобны да перыяду паўраспаду ў крыві. Гэтыя дадзеныя паказваюць, што бар'ер, які аддзяляе адсек спіннамазгавой вадкасці ад крыві, непашкоджаны ў пацукоў з канюляваным карцыномам, што дазваляе in vivo адбіраць фагавыя бібліятэкі для ідэнтыфікацыі клонаў, якія лёгка транспартуюцца з крыві ў адсек спіннамазгавой вадкасці.
(a) Распрацоўка метаду паўторнага адбору проб спіннамазгавой вадкасці (СМВ) з вялікага пула. (b) Дыяграма, якая паказвае клетачнае размяшчэнне бар'ера цэнтральнай нервовай сістэмы (ЦНС) і стратэгію адбору, якая выкарыстоўваецца для ідэнтыфікацыі пептыдаў, якія перасякаюць гематоэнцэфалічны бар'ер (ГЭБ) і гематоэнцэфалічны бар'ер. (c) Блок-схема скрынінга фагавага дысплея in vivo. У кожным раўндзе адбору фагі (ідэнтыфікатары жывёл унутры стрэлак) уводзіліся нутравенна. Дзве незалежныя альтэрнатыўныя галіны (A, B) захоўваліся асобна да 4-га раўнда адбору. Для раўндаў адбору 3 і 4 кожны клон фага, экстрагаваны з СМВ, быў секвенаваны ўручную. (d) Кінетыка фага, вылучанага з крыві (чырвоныя кругі) і спіннамазгавой вадкасці (зялёныя трохвугольнікі) падчас першага раўнда адбору ў двух канюляваных пацукоў пасля нутравеннага ўвядзення бібліятэкі пептыдаў T7 (2 x 1012 фагаў/жывёла). Сінія квадраты паказваюць сярэднюю пачатковую канцэнтрацыю фага ў крыві, разлічаную па колькасці ўведзенага фага з улікам агульнага аб'ёму крыві. Чорныя квадраты паказваюць кропку перасячэння лініі y, экстрапаляванай з канцэнтрацый фагаў крыві. (e,f) Пакажыце адносную частату і размеркаванне ўсіх магчымых перакрываючыхся трыпептыдных матываў, знойдзеных у пептыдзе. Паказана колькасць матываў, знойдзеных у 1000 вымярэннях. Значна (p < 0,001) узбагачаныя матывы пазначаны чырвонымі кропкамі. (e) Дыяграма рассейвання карэляцыі, якая параўноўвае адносную частату трыпептыднага матыву ўведзенай бібліятэкі з фагам, атрыманым з крыві жывёл № 1.1 і № 1.2. (f) Дыяграма рассейвання карэляцыі, якая параўноўвае адносныя частаты трыпептыдных матываў жывёльных фагаў № 1.1 і № 1.2, вылучаных у крыві і спіннамазгавой вадкасці. (g, h) Прадстаўленне ідэнтыфікатара паслядоўнасці фага, узбагачанага крывёю (g), у параўнанні з уведзенымі бібліятэкамі і фага, узбагачанага спіннамазгавой вадкасцю (h), у параўнанні з крывёю пасля раўнда селекцыі in vivo ў абедзвюх жывёл. Памер адналітарнага кода паказвае, як часта гэтая амінакіслата сустракаецца ў гэтай пазіцыі. Зялёны = палярны, фіялетавы = нейтральны, сіні = асноўны, чырвоны = кіслы і чорны = гідрафобныя амінакіслоты. Малюнак 1a, b быў распрацаваны і выраблены Эдуардам Урыхам.
Мы ўвялі фагавую пептыдную бібліятэку двум пацукам з інструментальнай CM (клады A і B) і вылучылі фаг з спіннамазгавой вадкасці і крыві (Малюнак 1d). Пачатковае хуткае вывядзенне бібліятэкі было менш выяўленым у параўнанні з фагам дзікага тыпу. Сярэдні перыяд паўраспаду ўведзенай бібліятэкі ў абедзвюх жывёл склаў 24,8 хвіліны ў крыві, што падобна да фага дзікага тыпу, і 38,5 хвіліны ў спіннамазгавой вадкасці. Узоры фагаў крыві і спіннамазгавой вадкасці ад кожнай жывёлы падвяргалі HTS, і ўсе ідэнтыфікаваныя пептыды былі прааналізаваны на наяўнасць кароткага трыпептыднага матыву. Трыпептыдныя матывы былі выбраны таму, што яны забяспечваюць мінімальную аснову для ўтварэння структуры і ўзаемадзеяння пептыдаў і бялкоў14,15. Мы выявілі добрую карэляцыю ў размеркаванні матываў паміж уведзенай фагавай бібліятэкай і клонамі, выдзеленымі з крыві абедзвюх жывёл (Малюнак 1e). Дадзеныя паказваюць, што склад бібліятэкі толькі нязначна ўзбагачаны ў крывяным адсеку. Частоты амінакіслот і кансенсусныя паслядоўнасці былі дадаткова прааналізаваны ў кожнай пазіцыі з выкарыстаннем адаптаванага праграмнага забеспячэння Weblogo16. Цікава, што мы выявілі моцнае ўзбагачэнне крыві рэшткамі гліцыну (мал. 1g). Пры параўнанні крыві з клонамі, адабранымі з спіннамазгавой вадкасці, назіраўся моцны адбор і некаторая дэселекцыя матываў (мал. 1f), і некаторыя амінакіслоты пераважна прысутнічалі ў загадзя вызначаных пазіцыях у 12-членным ланцугу (мал. 1h). Прыкметна, што асобныя жывёлы значна адрозніваліся па спіннамазгавой вадкасці, тады як узбагачэнне крыві гліцынам назіралася ў абедзвюх жывёл (дадатковы мал. 4a-j). Пасля строгай фільтрацыі дадзеных паслядоўнасці ў спіннамазгавой вадкасці жывёл № 1.1 і № 1.2 было атрымана ў агульнай складанасці 964 і 420 унікальных 12-мерных пептыдаў (дадатковы мал. 1d-e). Ізаляваныя фагавыя клоны былі ампліфікаваны і падвергнуты другому раўнду адбору in vivo. Фагі, экстрагаваныя з другога раўнда адбору, падвяргаліся HTS у кожнай жывёлы, і ўсе ідэнтыфікаваныя пептыды выкарыстоўваліся ў якасці ўваходных дадзеных для праграмы распазнавання матываў для аналізу наяўнасці трыпептыдных матываў (мал. 2a, b, ef). У параўнанні з першым цыклам фага, атрыманага з СМР, мы назіралі далейшы адбор і дэселекцыя многіх матываў у СМР у галінах A і B (мал. 2). Для вызначэння таго, ці прадстаўляюць яны розныя шаблоны паслядоўнасці, быў ужыты алгарытм ідэнтыфікацыі сеткі. Было выяўлена відавочнае падабенства паміж 12-мернымі паслядоўнасцямі, атрыманымі з дапамогай СМР у альтэрнатыўнай клады A (мал. 2c, d) і клады B (мал. 2g, h). Аб'яднаны аналіз у кожнай галіны выявіў розныя профілі адбору для 12-мерных пептыдаў (дадатковы мал. 5c, d) і павелічэнне суадносін тытраў СМР/крыві з цягам часу для аб'яднаных клонаў пасля другога раўнда адбору ў параўнанні з першым раўндам адбору (дадатковы мал. 5e).
Узбагачэнне матываў і пептыдаў у спіннамазгавой вадкасці шляхам двух паслядоўных раўндаў адбору функцыянальнага фагавага дысплея in vivo.
Усе фагі спіннамазгавой вадкасці, атрыманыя ў першым раўндзе ад кожнай жывёлы (жывёлы № 1.1 і № 1.2), былі аб'яднаны, ампліфікаваны, падвергнуты HT-секвенаванню і паўторна ін'екцыі разам (2 x 1010 фагаў/жывёла) 2 канюляваным пацукам SM (№ 1.1 → №). 2.1 і 2.2, 1.2 → 2.3 і 2.4). (a,b,e,f) Карэляцыйныя дыяграмы рассейвання, якія параўноўваюць адносную частату трыпептыдных матываў усіх фагаў, атрыманых з спіннамазгавой вадкасці, у першым і другім раўндах адбору. Адносная частата і размеркаванне матываў, якія прадстаўляюць усе магчымыя перакрываючыяся трыпептыды, знойдзеныя ў пептыдах у абедзвюх арыентацыях. Паказана колькасць матываў, знойдзеных у 1000 вымярэннях. Матывы, якія былі значна (p < 0,001) адабраны або выключаны ў адной з параўнаных бібліятэк, вылучаны чырвонымі кропкамі. (c, d, g, h) Лагатып паслядоўнасці, які прадстаўляе ўсе багатыя на спіннамазгавую вадкасць паслядоўнасці даўжынёй 12 амінакіслот, заснаваныя на 2-м і 1-м раўндах адбору in vivo. Памер адналітарнага кода паказвае, як часта гэтая амінакіслата сустракаецца ў гэтай пазіцыі. Для прадстаўлення лагатыпа параўноўваецца частата паслядоўнасцей спіннамазгавой вадкасці, вылучаных з асобных жывёл паміж двума раўндамі адбору, і паказаны ўзбагачаныя паслядоўнасці ў другім раўндзе: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 і (h) #1.2–#2.4. Найбольш узбагачаныя амінакіслоты ў зададзенай пазіцыі ў (c, d) жывёл № 2.1 і № 2.2 або (g, h) у жывёл № 2.3 і № 2.4 паказаны колерам. Зялёны = палярны, фіялетавы = нейтральны, сіні = асноўны, чырвоны = кіслы і чорны = гідрафобныя амінакіслоты.
Пасля трэцяга раўнда адбору мы вызначылі 124 унікальныя пептыдныя паслядоўнасці (№ 3.1 і № 3.2) з 332 клонаў фагаў, адноўленых з дапамогай спіннамазгавой вадкасці, выдзеленых з дзвюх жывёл (дадатковы малюнак 6a). Паслядоўнасць LGSVS (18,7%) мела найбольшую адносную долю, за ёй ішлі ўстаўкі дзікага тыпу PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) і SARGSWREIVSLS (2,2%). У апошнім чацвёртым раўндзе мы аб'ядналі дзве незалежна адабраныя галіны з трох асобных жывёл (мал. 1c). З 925 секвенаваных клонаў фагаў, атрыманых з спіннамазгавой вадкасці, у чацвёртым раўндзе мы знайшлі 64 унікальныя пептыдныя паслядоўнасці (дадатковы малюнак 6b), сярод якіх адносная доля фагаў дзікага тыпу знізілася да 0,8%. Найбольш распаўсюджанымі клонамі CSF у чацвёртым раўндзе былі LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) і RLSSVDSDLSGC (3,2%). Дыяпазон даўжынь выбраных пептыдаў абумоўлены нуклеатыднымі ўстаўкамі/дэлецыямі або заўчаснымі стоп-кадонамі ў праймерах бібліятэкі пры выкарыстанні выроджаных кодонаў для дызайну бібліятэкі NNK. Заўчасныя стоп-кадоны генеруюць карацейшыя пептыды і адбіраюцца, таму што яны ўтрымліваюць спрыяльны матыў α-кіслоты. Больш доўгія пептыды могуць узнікаць у выніку ўставак/дэлецый у праймерах сінтэтычных бібліятэк. Гэта размяшчае распрацаваны стоп-кадон па-за рамкай і зчытвае яго, пакуль не з'явіцца новы стоп-кадон ніжэй па плыні. У цэлым, мы разлічылі каэфіцыенты ўзбагачэння для ўсіх чатырох раўндаў адбору, параўноўваючы ўваходныя дадзеныя з выходнымі дадзенымі ўзору. Для першага раўнда скрынінга мы выкарыстоўвалі тытры фагаў дзікага тыпу ў якасці неспецыфічнай фонавай эталона. Цікава, што адмоўны адбор фагаў быў вельмі моцным у першым цыкле спіннамазгавой вадкасці, але не ў крыві (мал. 3а), што можа быць звязана з нізкай верагоднасцю пасіўнай дыфузіі большасці членаў пептыднай бібліятэкі ў адсек спіннамазгавой вадкасці, або з тым, што адносныя фагі, як правіла, больш эфектыўна ўтрымліваюцца або выдаляюцца з крыві, чым бактэрыяфагі. Аднак у другім раўндзе панінгу моцны адбор фагаў у спіннамазгавой вадкасці назіраўся ў абедзвюх кладах, што сведчыць аб тым, што папярэдні раўнд быў узбагачаны фагамі, якія дэманструюць пептыды, якія спрыяюць паглынанню спіннамазгавой вадкасці (мал. 3а). Зноў жа, без значнага ўзбагачэння крыві. Таксама ў трэцім і чацвёртым раўндах фагавыя клоны былі значна ўзбагачаны спіннамазгавой вадкасцю. Параўноўваючы адносную частату кожнай унікальнай пептыднай паслядоўнасці паміж двума апошнімі раўндамі адбору, мы выявілі, што паслядоўнасці былі яшчэ больш узбагачаныя ў чацвёртым раўндзе адбору (мал. 3б). Усяго з усіх 64 унікальных пептыдных паслядоўнасцей было вынята 931 трыпептыдны матыў з выкарыстаннем абедзвюх пептыдных арыентацый. Найбольш узбагачаныя матывы ў чацвёртым раўндзе былі больш уважліва вывучаны на прадмет іх профіляў узбагачэння ва ўсіх раўндах у параўнанні з уведзенай бібліятэкай (парогавае значэнне: 10% узбагачэння) (Дадатковы мал. 6c). Агульныя заканамернасці адбору паказалі, што большасць вывучаных матываў былі ўзбагачаны ва ўсіх папярэдніх раўндах абедзвюх галін адбору. Аднак некаторыя матывы (напрыклад, SGL, VSG, LGS GSV) пераважна паходзілі з альтэрнатыўнай клады A, у той час як іншыя (напрыклад, FGW, RTN, WGF, NTR) былі ўзбагачаны альтэрнатыўнай кладай B.
Валідацыя транспарту ў спіннамазгавой вадкасці (СМР) пептыдаў, узбагачаных фагамі, і біятыніляваных лідэрных пептыдаў, кан'югаваных з карыснымі нагрузкамі стрэптавідыну.
(a) Каэфіцыенты ўзбагачэння, разлічаныя ва ўсіх чатырох раўндах (R1-R4) на аснове тытраў уведзеных (уваход = I) фагаў (PFU) і вызначаных тытраў фагаў у спіннамазгавой вадкасці (выхад = O). Фактары ўзбагачэння для апошніх трох раўндаў (R2-R4) былі разлічаны шляхам параўнання з папярэднім раўндам і першым раўндам (R1) з дадзенымі аб вазе. Пустыя слупкі - гэта спіннамазгавая вадкасць, зацененыя слупкі - плазма. (***p<0,001, на аснове t-крытэрыя Стьюдэнта). (b) Спіс найбольш распаўсюджаных фагавых пептыдаў, ранжыраваных у адпаведнасці з іх адноснай доляй да ўсіх фагаў, сабраных у спіннамазгавой вадкасці пасля 4 раўнда адбору. Шэсць найбольш распаўсюджаных фагавых клонаў вылучаны колерам, пранумараваны, а іх каэфіцыенты ўзбагачэння паміж 3 і 4 раўндамі адбору (устаўкі). (c,d) Шэсць найбольш узбагачаных фагавых клонаў, пустыя фагі і бацькоўскія бібліятэкі фагавых пептыдаў з 4 раўнда былі прааналізаваны асобна ў мадэлі адбору проб спіннамазгавой вадкасці. Узоры спіннамазгавой вадкасці і крыві былі сабраны ў пазначаныя моманты часу. (c) Роўныя колькасці 6 кандыдатных фагавых клонаў (2 x 1010 фагаў/жывёл), пустых фагаў (#1779) (2 x 1010 фагаў/жывёл) ​​і запасных фагавых пептыдных бібліятэк (2 x 1012 фагаў/жывёл). Уводзяць не менш за 3 CM асобна праз хваставую вену жывёле з канюляцыяй. Паказана фармакокінетыка спіннамазгавой вадкасці кожнага ўведзенага фагавага клона і фагавай пептыднай бібліятэкі з цягам часу. (d) паказвае сярэдняе суадносіны спіннамазгавой вадкасці/кроў для ўсіх атрыманых фагаў/мл на працягу часу адбору проб. (e) Чатыры сінтэтычныя лідэрскія пептыды і адзін кантрольны змяшаны былі звязаны біятынам са стрэптавідынам праз іх N-канец (тэтрамерная дысплей) з наступнай ін'екцыяй (нутравенна ў хваставую вену, 10 мг стрэптавідыну/кг). Не менш за тры інтубаваныя пацукі (N = 3). Узоры спіннамазгавой вадкасці (СМР) збіралі ў пазначаныя моманты часу, і канцэнтрацыі стрэптавідыну вымяралі з дапамогай ІФА з антыстрэптавідынам у СМР (nd = не выяўлена). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, на аснове тэсту ANOVA). (f) Параўнанне амінакіслотнай паслядоўнасці найбольш узбагачанага клона фагавага пептыду № 2002 (фіялетавы) з іншымі выбранымі клонамі фагавага пептыду з 4-га раўнда адбору. Ідэнтычныя і падобныя амінакіслотныя фрагменты пазначаны колерам.
З усіх узбагачаных фагаў у чацвёртым раўндзе (мал. 3b) шэсць кандыдатных клонаў былі адабраны для далейшага індывідуальнага аналізу ў мадэлі адбору проб спіннамазгавой вадкасці. Роўныя колькасці бібліятэк пептыдаў з шасці кандыдатных фагаў, пустых фагаў (без устаўкі) і прафагаў былі ўведзены тром канюляваным жывёлам з кандыцыянернай міялкі (КМ), і фармакокінетыка была вызначана ў аналізах спіннамазгавой вадкасці (мал. 3c) і крыві (дадатковы мал. 7). Усе пратэставаныя фагавыя клоны былі накіраваны на адсек спіннамазгавой вадкасці на ўзроўні, у 10-1000 разоў вышэйшым, чым у пустога кантрольнага фага (#1779). Напрыклад, клоны № 2020 і № 2077 мелі тытры ў спіннамазгавой вадкасці прыкладна ў 1000 разоў вышэйшыя, чым у кантрольнага фага. Фармакокінетычны профіль кожнага абранага пептыда адрозніваецца, але ўсе яны маюць высокую здольнасць да хоўмінгу ў спіннамазгавой вадкасці. Мы назіралі пастаяннае зніжэнне з цягам часу для клонаў № 1903 і № 2011, у той час як для клонаў № 2077, № 2002 і № 2009 павелічэнне на працягу першых 10 хвілін можа сведчыць аб актыўным транспарте, але патрабуе праверкі. Клоны № 2020, № 2002 і № 2077 стабілізаваліся на высокім узроўні, у той час як канцэнтрацыя ў спіннамазгавой вадкасці клона № 2009 павольна зніжалася пасля першапачатковага павелічэння. Затым мы параўналі адносную частату кожнага кандыдата ў спіннамазгавой вадкасці з яго канцэнтрацыяй у крыві (мал. 3d). Карэляцыя сярэдняга тытра кожнага кандыдата ў спіннамазгавой вадкасці з яго тытрам у крыві ва ўсе часы адбору проб паказала, што тры з шасці кандыдатаў былі значна ўзбагачаны спіннамазгавой вадкасцю крыві. Цікава, што клон № 2077 прадэманстраваў больш высокую стабільнасць у крыві (дадатковы малюнак 7). Каб пацвердзіць, што самі пептыды здольныя актыўна транспартаваць грузы, акрамя фагавых часціц, у адсек спіннамазгавой вадкасці, мы сінтэзавалі чатыры лідэрскія пептыды, вытворныя біятынам на N-канцы, дзе пептыды далучаюцца да фагавай часціцы. Біятыніляваныя пептыды (№ 2002, 2009, 2020 і 2077) былі кан'югаваныя са стрэптавідынам (SA) для атрымання мультымерных формаў, якія ў пэўнай ступені імітуюць геаметрыю фага. Гэты фармат таксама дазволіў нам вымераць уздзеянне SA ў крыві і спіннамазгавой вадкасці ў якасці бялковых пептыдаў, якія пераносяць груз. Важна адзначыць, што дадзеныя па фагах часта можна было прайграць, калі сінтэтычныя пептыды ўводзіліся ў гэтым фармаце, кан'югаваным з SA (мал. 3e). Змяшаныя пептыды мелі меншае пачатковае ўздзеянне і хутчэйшы клірэнс з спіннамазгавой вадкасці з невыяўляльнымі ўзроўнямі на працягу 48 гадзін. Каб атрымаць уяўленне аб шляхах дастаўкі гэтых пептыдных фагавых клонаў у спіннамазгавую вадкасць, мы прааналізавалі лакалізацыю асобных трапленняў фагавых пептыдаў з дапамогай імунагістахіміі (IHC) для непасрэднага выяўлення фагавых часціц праз 1 гадзіну пасля нутравеннай ін'екцыі in vivo. Характэрна, што клоны № 2002, № 2077 і № 2009 можна было выявіць шляхам моцнага афарбоўвання ў капілярах мозгу, у той час як кантрольны фаг (№ 1779) і клон № 2020 не былі выяўлены (Дадатковы малюнак 8). Гэта сведчыць аб тым, што гэтыя пептыды спрыяюць уздзеянню на мозг менавіта праз перасячэнне ГЭБ. Для праверкі гэтай гіпотэзы неабходны далейшы падрабязны аналіз, паколькі шлях BSCFB таксама можа быць задзейнічаны. Пры параўнанні амінакіслотнай паслядоўнасці найбольш узбагачанага клона (№ 2002) з іншымі абранымі пептыдамі было адзначана, што некаторыя з іх маюць падобныя пашырэнні амінакіслот, што можа сведчыць аб падобным механізме транспарту (мал. 3f).
Дзякуючы свайму ўнікальнаму профілю ў плазме і значнаму павелічэнню ўзроўню спіннамазгавой вадкасці з цягам часу, клон фагавага дысплея № 2077 быў дадаткова даследаваны на працягу больш працяглага 48-гадзіннага перыяду і змог узнавіць хуткае павелічэнне ўзроўню спіннамазгавой вадкасці, якое назіралася ў сувязі з устойлівым узроўнем СК (мал. 4a). Што тычыцца іншых ідэнтыфікаваных фагавых клонаў, № 2077 моцна афарбоўваўся на капіляры мозгу і прадэманстраваў значную калакалізацыю з капілярным маркерам лекцінам пры разглядзе з больш высокім разрозненнем і, магчыма, некаторае афарбоўванне ў парэнхіматознай прасторы (мал. 4b). Каб даследаваць, ці можна атрымаць фармакалагічныя эфекты, апасродкаваныя пептыдам, у ЦНС, мы правялі эксперымент, у якім біятыніляваныя версіі i) транзітнага пептыда № 2077 і ii) пептыда-інгібітара BACE1 змешвалі з СК у двух розных суадносінах. Для адной камбінацыі мы выкарыстоўвалі толькі інгібітар пептыду BACE1, а для другой - суадносіны 1:3 інгібітара пептыду BACE1 да пептыду № 2077. Абодва ўзоры ўводзіліся нутравенна, і ўзровень бэта-амілоіднага пептыду 40 (Abeta40) у крыві і спіннамазгавой вадкасці вымяраўся з цягам часу. Узровень Abeta40 вымяраўся ў спіннамазгавой вадкасці, бо ён адлюстроўвае інгібіраванне BACE1 у парэнхіме галаўнога мозгу. Як і чакалася, абодва комплексы значна знізілі ўзровень Abeta40 у крыві (мал. 4c, d). Аднак толькі ўзоры, якія змяшчалі сумесь пептыда № 2077 і інгібітара пептыда BACE1, кан'югаванага з SA, выклікалі значнае зніжэнне ўзроўню Abeta40 у спіннамазгавой вадкасці (мал. 4c). Дадзеныя паказваюць, што пептыд № 2077 здольны транспартаваць бялок SA з масай 60 кДа ў ЦНС, а таксама выклікае фармакалагічныя эфекты з дапамогай кан'югаваных з SA інгібітараў пептыда BACE1.
(a) Клональная ін'екцыя (2 × 10 фагаў/жывёла) фага T7, якая паказвае доўгатэрміновыя фармакакінетычныя профілі пептыда CSF № 2077 (RLSSVDSDLSGC) і неін'екаванага кантрольнага фага (№ 1779) як мінімум у трох пацукоў з інтубаванай карой. (b) Канфакальная мікраскапічная выява рэпрэзентатыўных коркавых мікрасасудаў у пацукоў з ін'екцыяй фагаў (2 × 10 10 фагаў/жывёла), якая паказвае кантрастнае афарбоўванне пептыду № 2077 і сасудаў (лектын). Гэтыя фагавыя клоны ўводзілі 3 пацукам і давалі ім цыркуляваць на працягу 1 гадзіны перад перфузіяй. Мозг зрэзалі і афарбоўвалі полікланальнымі антыцеламі, мечанымі FITC, супраць капсіду фага T7. За дзесяць хвілін да перфузіі і наступнай фіксацыі нутравенна ўводзілі лектын, мечаны DyLight594. Флуарэсцэнтныя выявы, якія паказваюць афарбоўванне лектынам (чырвоны колер) прасветнага боку мікрасасудаў і фагаў (зялёны колер) у прасвеце капіляраў і перываскулярнай тканіны мозгу. Маштабная лінейка адпавядае 10 мкм. (c, d) Біятыніляваны інгібіруючы пептыд BACE1 асобна або ў спалучэнні з біятыніляваным транзітным пептыдам № 2077 быў злучаны са стрэптавідынам, а затым уведзены нутравенна як мінімум тром канюляваным пацукам CM (10 мг стрэптавідыну/кг). Зніжэнне ўзроўню Aβ40, апасродкаванае інгібітарам пептыду BACE1, вымяралася з дапамогай ELISA з Aβ1-40 у крыві (чырвоны колер) і спіннамазгавой вадкасці (аранжавы колер) у пазначаныя моманты часу. Для лепшай яснасці на графіку праведзена пункцірная лінія ў маштабе 100%. (c) Працэнтнае зніжэнне ўзроўню Aβ40 у крыві (чырвоныя трохвугольнікі) і спіннамазгавой вадкасці (аранжавыя трохвугольнікі) у пацукоў, якія атрымлівалі стрэптавідын, кан'югаваны з транзітным пептыдам № 2077 і інгібіруючым пептыдам BACE1 у суадносінах 3:1. (d) Працэнтнае зніжэнне ўзроўню Aβ40 у крыві (чырвоныя кругі) і спіннамазгавой вадкасці (аранжавыя кругі) у пацукоў, якія атрымлівалі стрэптавідын, звязаны толькі з інгібіруючым пептыдам BACE1. Канцэнтрацыя Aβ у кантролі складала 420 пг/мл (стандартнае адхіленне = 101 пг/мл).
Фагавы дысплей паспяхова ўжываецца ў некалькіх галінах біямедыцынскіх даследаванняў17. Гэты метад выкарыстоўваўся для даследаванняў сасудзістай разнастайнасці in vivo18,19, а таксама для даследаванняў, накіраваных на сасуды галаўнога мозгу20,21,22,23,24,25,26. У гэтым даследаванні мы пашырылі прымяненне гэтага метаду адбору не толькі на прамую ідэнтыфікацыю пептыдаў, накіраваных на сасуды галаўнога мозгу, але і на выяўленне кандыдатаў з уласцівасцямі актыўнага транспарту для перасячэння гематаэнцэфалічнага бар'ера. Зараз мы апісваем распрацоўку працэдуры адбору in vivo ў інтубаваных пацукоў з міякардычнай карцыномай і дэманструем яе патэнцыял для ідэнтыфікацыі пептыдаў з уласцівасцямі хомінгу ў спіннамазгавой вадкасці. Выкарыстоўваючы фаг T7, які дэманструе бібліятэку 12-мерных выпадковых пептыдаў, мы змаглі прадэманстраваць, што фаг T7 дастаткова малы (прыблізна 60 нм у дыяметры)10, каб адаптавацца да гематаэнцэфалічнага бар'ера, тым самым непасрэдна перасякаючы гематаэнцэфалічны бар'ер або харыяідальнае спляценне. Мы назіралі, што збор спіннамазгавой вадкасці (СМР) у канюляваных пацукоў CM з'яўляецца добра кантраляваным метадам функцыянальнага скрынінгу in vivo, і што экстрагаваны фаг не толькі звязваецца з сасудамі, але і функцыянуе як транспарцёр праз гематоэнцэфалічны бар'ер. Акрамя таго, адначасова збіраючы кроў і прымяняючы HTS да СМР і фагаў, атрыманых з крыві, мы пацвердзілі, што на наш выбар СМР не паўплывала ўзбагачэнне крыві або прыдатнасць да пашырэння паміж раўндамі адбору. Аднак крывяны адсек з'яўляецца часткай працэдуры адбору, паколькі фагі, здольныя дасягнуць адсека СМР, павінны выжываць і цыркуляваць у крыві дастаткова доўга, каб узбагаціцца ў мозгу. Каб атрымаць надзейную інфармацыю аб паслядоўнасці з неапрацаваных дадзеных HTS, мы ўкаранілі фільтры, адаптаваныя да спецыфічных для платформы памылак секвенавання, у працоўны працэс аналізу. Уключыўшы кінетычныя параметры ў метад скрынінга, мы пацвердзілі хуткую фармакокінетыку фагаў T7 дзікага тыпу (t½ ~ 28 хвілін) у крыві24, 27, 28, а таксама вызначылі іх перыяд паўраспаду ў спіннамазгавой вадкасці (t½ ~ 26 хвілін у хвіліну). Нягледзячы на ​​падобныя фармакокінетычныя профілі ў крыві і спіннамазгавой вадкасці, у спіннамазгавой вадкасці можна было выявіць толькі 0,001% канцэнтрацыі фага ў крыві, што сведчыць аб нізкай фонавай мабільнасці фага Т7 дзікага тыпу праз гематоэнцэфалічны бар'ер. Гэтая праца падкрэслівае важнасць першага раўнда адбору пры выкарыстанні стратэгій паніравання in vivo, асабліва для фагавых сістэм, якія хутка выводзяцца з кровазвароту, паколькі мала клонаў здольныя дасягнуць адсека ЦНС. Такім чынам, у першым раўндзе зніжэнне разнастайнасці бібліятэкі было вельмі значным, бо ў гэтай вельмі строгай мадэлі спіннамазгавой вадкасці ў канчатковым выніку была сабрана толькі абмежаваная колькасць клонаў. Гэтая стратэгія паніравання in vivo ўключала некалькі этапаў адбору, такіх як актыўнае назапашванне ў адсеку спіннамазгавой вадкасці, выжыванне клонаў у адсеку крыві і хуткае выдаленне клонаў фага Т7 з крыві на працягу першых 10 хвілін (мал. 1d і дадатковы мал. 4M). Такім чынам, пасля першага раўнда ў спіннамазгавой вадкасці былі ідэнтыфікаваны розныя клоны фагаў, хоць для асобных жывёл выкарыстоўваўся адзін і той жа пачатковы пул. Гэта сведчыць аб тым, што некалькі этапаў строгага адбору для зыходных бібліятэк з вялікай колькасцю членаў бібліятэкі прыводзяць да значнага зніжэння разнастайнасці. Такім чынам, выпадковыя падзеі стануць неад'емнай часткай пачатковага працэсу адбору, значна ўплываючы на ​​вынік. Верагодна, што многія клоны ў зыходнай бібліятэцы мелі вельмі падобную схільнасць да ўзбагачэння КСФ. Аднак, нават пры аднолькавых эксперыментальных умовах вынікі адбору могуць адрознівацца з-за невялікай колькасці кожнага канкрэтнага клона ў пачатковым пуле.
Матывы, узбагачаныя ў спіннамазгавой вадкасці (СМР), адрозніваюцца ад матываў у крыві. Цікава, што мы адзначылі першы зрух у бок пептыдаў, багатых гліцынам, у крыві асобных жывёл (мал. 1g, дадатковыя мал. 4e, 4f). Фагі, якія змяшчаюць гліцынавыя пептыды, могуць быць больш стабільнымі і з меншай верагоднасцю выводзіцца з кровазвароту. Аднак гэтыя багатыя гліцынам пептыды не былі выяўлены ва ўзорах спіннамазгавой вадкасці, што сведчыць аб тым, што курыраваныя бібліятэкі прайшлі два розныя этапы адбору: адзін у крыві, а другі назапашваўся ў спіннамазгавой вадкасці. Клоны, узбагачаныя СМР, атрыманыя ў выніку чацвёртага раўнда адбору, былі шырока пратэставаны. Было пацверджана, што амаль усе асобна пратэставаныя клоны ўзбагачаны СМР у параўнанні з фагам-бланшом. Адзін пептыдны хіт (#2077) быў даследаваны больш падрабязна. Ён паказаў больш працяглы перыяд паўраспаду ў плазме ў параўнанні з іншымі хітамі (малюнак 3d і дадатковы мал. 7), і цікава, што гэты пептыд утрымліваў рэшту цыстэіну на С-канцы. Нядаўна было паказана, што даданне цыстэіну да пептыдаў можа палепшыць іх фармакакінетычныя ўласцівасці шляхам звязвання з альбумінам 29. У цяперашні час гэта невядома для пептыда № 2077 і патрабуе далейшага вывучэння. Некаторыя пептыды прадэманстравалі валентную залежнасць ва ўзбагачэнні спіннамазгавой вадкасці (дадзеныя не паказаны), што можа быць звязана з адлюстраванай геаметрыяй паверхні капсіда Т7. Сістэма Т7, якую мы выкарыстоўвалі, паказала 5-15 копій кожнага пептыда на фагавую часціцу. ІГХ была праведзена на кандыдатных клонах фага, якія былі ўведзены нутравенна ў кару галаўнога мозгу пацукоў (Дадатковы мал. 8). Дадзеныя паказалі, што прынамсі тры клоны (№ 2002, № 2009 і № 2077) узаемадзейнічалі з ГЭБ. Застаецца вызначыць, ці прыводзіць гэтае ўзаемадзеянне з ГЭБ да назапашвання СМР або да перамяшчэння гэтых клонаў непасрэдна ў БКСФБ. Важна адзначыць, што мы паказваем, што выбраныя пептыды захоўваюць сваю транспартную здольнасць СМР пры сінтэзе і звязванні з бялковым грузам. Звязванне N-канцавых біятыніляваных пептыдаў з СК па сутнасці паўтарае вынікі, атрыманыя з адпаведнымі фагавымі клонамі ў крыві і спіннамазгавой вадкасці (мал. 3e). Нарэшце, мы паказваем, што вядучы пептыд № 2077 здольны стымуляваць дзеянне на мозг біятыніляванага пептыднага інгібітара BACE1, кан'югаванага з СК, выклікаючы выяўленыя фармакадынамічныя эфекты ў ЦНС, значна зніжаючы ўзровень Abeta40 у спіннамазгавой вадкасці (мал. 4). Нам не ўдалося ідэнтыфікаваць ніякіх гамолагаў у базе дадзеных, выканаўшы пошук гамалогіі пептыдных паслядоўнасцей ва ўсіх супадзеннях. Важна адзначыць, што памер бібліятэкі T7 складае прыблізна 109, у той час як тэарэтычны памер бібліятэкі для 12-мераў складае 4 x 1015. Такім чынам, мы выбралі толькі невялікую частку прасторы разнастайнасці 12-мернай пептыднай бібліятэкі, што можа азначаць, што больш аптымізаваныя пептыды можна ідэнтыфікаваць, ацэньваючы суседнюю прастору паслядоўнасцей гэтых ідэнтыфікаваных супадзенняў. Гіпатэтычна, адной з прычын, чаму мы не знайшлі ніякіх натуральных гомолагаў гэтых пептыдаў, можа быць дэселекцыя падчас эвалюцыі, каб прадухіліць некантраляванае пранікненне пэўных пептыдных матываў у мозг.
У сукупнасці нашы вынікі забяспечваюць аснову для будучай працы па больш падрабязнай ідэнтыфікацыі і характарызацыі транспартных сістэм цэрэбраваскулярнага бар'ера in vivo. Асноўная пазіцыя гэтага метаду заснавана на стратэгіі функцыянальнага адбору, якая не толькі ідэнтыфікуе клоны са ўласцівасцямі звязвання з цэрэбраваскулярнымі сасудамі, але і ўключае крытычны этап, на якім паспяховыя клоны валодаюць унутрыпазітыўнай актыўнасцю для пераадолення біялагічных бар'ераў in vivo ў адсек ЦНС. Мэта метаду заключаецца ў высвятленні механізму транспарту гэтых пептыдаў і іх перавагі для звязвання з мікрасасудамі, спецыфічнымі для вобласці мозгу. Гэта можа прывесці да адкрыцця новых шляхоў для транспарту ГЭБ і рэцэптараў. Мы чакаем, што ідэнтыфікаваныя пептыды могуць непасрэдна звязвацца з цэрэбраваскулярнымі рэцэптарамі або з цыркулюючымі лігандамі, якія транспартуюцца праз ГЭБ або БКСФБ. Пептыдныя вектары з актыўнасцю транспарту СМР, выяўленыя ў гэтай працы, будуць дадаткова даследаваны. У цяперашні час мы даследуем спецыфічнасць гэтых пептыдаў да мозгу адносна іх здольнасці пераадольваць ГЭБ і/або БКСФБ. Гэтыя новыя пептыды стануць надзвычай каштоўнымі інструментамі для патэнцыйнага адкрыцця новых рэцэптараў або шляхоў, а таксама для распрацоўкі новых высокаэфектыўных платформаў для дастаўкі макрамалекул, такіх як біялагічныя прэпараты, у мозг.
Кануляваць вялікую цыстэрну (ВЦ) з выкарыстаннем мадыфікацыі раней апісанага метаду. Анестезаваных пацукоў Вістар (200-350 г) пад наркозам падключылі да стэрэатаксічнага апарата, і па паголенай і асептычна падрыхтаванай скуры галавы зрабілі сярэдні разрэз, каб агаліць чэрап. Прасвідравалі дзве адтуліны ў вобласці верхняй створкі і замацавалі ў адтулінах фіксуючыя шрубы. Дадатковая адтуліна была прасвідравана ў бакавым патылічным грэбні для стэрэатаксічнага накіравання канюлі з нержавеючай сталі ў ВЦ. Нанесці стаматалагічны цэмент вакол канюлі і зафіксаваць шрубамі. Пасля фотапалімерызацыі і зацвярдзення цэменту скурную рану зашылі швом супрамід 4/0. Правільнае размяшчэнне канюлі пацвярджаецца спантанным уцечкай спіннамазгавой вадкасці (СМВ). Выняць пацука са стэрэатаксічнага апарата, атрымаць адпаведны пасляаперацыйны догляд і лячэнне болю і даць яму аднавіцца не менш за адзін тыдзень, пакуль не з'явяцца прыкметы крыві ў спіннамазгавой вадкасці. Пацукі Вістар (Crl:WI/Han) былі атрыманы ад Charles River (Францыя). Усіх пацукоў утрымлівалі ў спецыяльных умовах, свабодных ад патагенаў. Усе эксперыменты на жывёлах былі ўхвалены Ветэрынарнай службай горада Базель, Швейцарыя, і праводзіліся ў адпаведнасці з Ліцэнзіяй на жывёл № 2474 (Ацэнка актыўнага транспарту мозгу шляхам вымярэння ўзроўняў тэрапеўтычных кандыдатаў у спіннамазгавой вадкасці і мозгу пацукоў).
Асцярожна трымайце пацука ў прытомнасці, трымаючы ў руцэ канюлю спіннамазгавой вадкасці (СК). Выміце дурман з канюлі і збярыце 10 мкл спантанна цякучай спіннамазгавой вадкасці. Паколькі праходнасць канюлі ў канчатковым выніку была парушаная, у гэта даследаванне былі ўключаны толькі празрыстыя ўзоры спіннамазгавой вадкасці без прыкмет забруджвання крывёю або змены колеру. Паралельна з невялікага разрэзу на кончыку хваста ў прабіркі з гепарынам (Sigma-Aldrich) бралі прыблізна 10-20 мкл крыві. Спіннамазгавая вадкасць і кроў збіралі ў розныя моманты часу пасля нутравеннага ўвядзення фага T7. Перад кожным зборам узору СМР выкідвалі прыблізна 5-10 мкл вадкасці, што адпавядае мёртваму аб'ёму катетера.
Бібліятэкі былі створаны з выкарыстаннем вектара T7Select 10-3b, як апісана ў кіраўніцтве па сістэме T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Карацей кажучы, выпадковая 12-мерная ўстаўка ДНК была сінтэзавана ў наступным фармаце:
Кадон NNK выкарыстоўваўся для пазбягання падвойных стоп-кадонаў і празмернай экспрэсіі амінакіслот ва ўстаўцы. N — гэта ўручную змяшанае эквімалярнае суадносіны кожнага нуклеатыду, а K — гэта ўручную змяшанае эквімалярнае суадносіны нуклеатыдаў аденіну і цытазіну. Адналанцуговыя ўчасткі былі пераўтвораны ў двухланцуговую ДНК шляхам далейшай інкубацыі з dNTP (Novagen) і ферментам Кленава (New England Biolabs) у буферы Кленава (New England Biolabs) на працягу 3 гадзін пры тэмпературы 37°C. Пасля рэакцыі двухланцуговая ДНК была атрымана шляхам асаджэння этанолам. Атрыманая ДНК была расшчаплена рэстрыкцыйнымі ферментамі EcoRI і HindIII (абодва ад Roche). Расшчапленая і ачышчаная (QIAquick, Qiagen) ўстаўка (лігаза Т4, New England Biolabs) затым была лігіравана ў рамцы считывания ў папярэдне расшчаплены вектар Т7 пасля амінакіслаты 348 капсіднага гена 10B. Рэакцыі лігіравання інкубавалі пры тэмпературы 16°C на працягу 18 гадзін перад упакоўкай in vitro. Упакоўка фагаў in vitro была выканана ў адпаведнасці з інструкцыямі, якія пастаўляюцца з наборам для кланавання T7Select 10-3b (Novagen), і раствор для ўпакоўкі быў аднаразова ампліфікаваны для лізісу з выкарыстаннем Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Лізаты цэнтрыфугавалі, тытравалі і замарожвалі пры -80°C у якасці маткавага раствора гліцэрыны.
Прамая ПЦР-ампліфікацыя варыябельных участкаў фага, ампліфікаваных у булёне або пласціне з выкарыстаннем запатэнтаваных праймераў для зліцця 454/ампліконаў Roche. Праймер для прамога зліцця змяшчае паслядоўнасці, фланкіруючыя варыябельную вобласць (NNK) 12 (спецыфічная для шаблону), адаптар GS FLX Titanium A і ключавую паслядоўнасць бібліятэкі з чатырох асноў (TCAG) (дадатковы малюнак 1a):
Праймер для зваротнага зліцця таксама змяшчае біятын, прымацаваны да захопных шарыкаў, і адаптар GS FLX Titanium B, неабходны для клональнай ампліфікацыі падчас эмульсійнай ПЦР:
Затым ампліконы падвяргалі пірасеквенаванню з дапамогай пратакола 454/Roche згодна з пратаколам 454 GS-FLX Titanium. Для ручнога секвенавання па Сангеру (аналізатар ДНК Applied Biosystems Hitachi 3730 xl) ДНК фага Т7 ампліфікавалі з дапамогай ПЦР і секвенавалі з наступнымі парамі праймераў:
Устаўкі з асобных бляшак падвяргалі ПЛР-ампліфікацыі з выкарыстаннем набору Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (згодна з інструкцыямі вытворцы). Правялі гарачы старт (10 хвілін пры 95 °C) і 35 цыклаў буст-ампліфікацыі (50 с пры 95 °C, 1 хвіліна пры 50 °C і 1 хвіліна пры 72 °C).
Фагі з бібліятэк, фагі дзікага тыпу, фагі, вынятыя з спіннамазгавой вадкасці і крыві, або асобныя клоны ампліфікавалі ў Escherichia coli BL5615 у булёне TB (Sigma Aldrich) або ў чашках аб'ёмам 500 см² (Thermo Scientific) на працягу 4 гадзін пры тэмпературы 37°C. Фагі экстрагавалі з пласцін шляхам прамывання пласцін буферам Tris-EDTA (Fluka Analytical) або шляхам збору бляшак стэрыльнымі наканечнікамі піпетак. Фагі вылучалі з культуральнага супернатанту або буфера для экстракцыі адным раўндам асаджэння поліэтыленгліколем (PEG 8000) (Promega) і рэсуспендавалі ў буферы Tris-EDTA.
Ампліфікаваны фаг падвяргалі 2-3 раўндам выдалення эндатаксіну з выкарыстаннем гранул для выдалення эндатаксіну (Miltenyi Biotec) перад нутравеннай (IV) ін'екцыяй (500 мкл/жывёла). У першым раўндзе ўводзілі 2×1012 фагаў; у другім - 2×1010 фагаў; у трэцім і чацвёртым раўндах адбору - 2×109 фагаў на жывёлу. Змест фагаў у пробах спіннамазгавой вадкасці і крыві, сабраных у пазначаныя моманты часу, вызначалі шляхам падліку бляшак у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы (кіраўніцтва па сістэме T7Select). Адбор фагаў праводзілі шляхам нутравеннага ўвядзення ачышчаных бібліятэк у хваставую вену або шляхам паўторнага ўвядзення фага, экстрагаванага з спіннамазгавой вадкасці з папярэдняга раўнда адбору, а наступныя зборы праводзілі праз 10 хвілін, 30 хвілін, 60 хвілін, 90 хвілін, 120 хвілін, 180 хвілін і 240 хвілін адпаведна для проб спіннамазгавой вадкасці і крыві. Усяго было праведзена чатыры раўнды пэнінгу in vivo, у якіх дзве выбраныя галіны захоўваліся і аналізаваліся асобна падчас першых трох раўндаў адбору. Усе фагавыя ўстаўкі, экстрагаваныя з спіннамазгавой вадкасці з першых двух раўндаў адбору, былі падвергнуты пірасеквенаванню 454/Roche, у той час як усе клоны, экстрагаваныя з спіннамазгавой вадкасці з апошніх двух раўндаў адбору, былі секвенаваны ўручную. Усе крывяныя фагі з першага раўнда адбору таксама былі падвергнуты пірасеквенаванню 454/Roche. Для ін'екцыі фагавых клонаў выбраныя фагі былі ампліфікаваны ў E. coli (BL5615) на пласцінах плошчай 500 см2 пры тэмпературы 37°C на працягу 4 гадзін. Асобна адабраныя і секвенаваныя ўручную клоны былі размнажаны ў асяроддзі TB. Пасля экстракцыі фагаў, ачысткі і выдалення эндатаксіну (як апісана вышэй) 2×1010 фагаў/жывёлу ў 300 мкл было ўведзена нутравенна ў адну хваставую вену.
Папярэдняя апрацоўка і якасная фільтрацыя дадзеных паслядоўнасці. Неапрацаваныя дадзеныя 454/Roche былі пераўтвораны з двайковага стандартнага фармату карты патоку (sff) у фармат Pearson, прыдатны для чытання чалавекам (fasta) з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння пастаўшчыка. Далейшая апрацоўка нуклеатыднай паслядоўнасці была выканана з выкарыстаннем запатэнтаваных праграм і скрыптоў на мове C (невыдадзены праграмны пакет), як апісана ніжэй. Аналіз першасных дадзеных уключае строгія шматэтапныя працэдуры фільтрацыі. Каб адфільтраваць счытванні, якія не ўтрымлівалі сапраўднай паслядоўнасці ДНК-ўстаўкі 12-мер, счытванні былі паслядоўна выраўнаваны па пачатковай метцы (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), стоп-метцы (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) і фонавай устаўцы (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) з выкарыстаннем глабальнага тэсту Нідлмана-Вунша. выраўноўванне, якое дапускае да 2 неадпаведнасцей на выраўноўванне31. Такім чынам, счытванні без пачатковых і стоп-метак і счытванні, якія змяшчаюць фонавыя ўстаўкі, г.зн. выраўноўванні, якія перавышаюць дазволеную колькасць неадпаведнасцей, былі выдалены з бібліятэкі. Што тычыцца астатніх прачытанняў, то N-мерная паслядоўнасць ДНК, якая распасціраецца ад пачатковай меткі і заканчваецца перад стоп-меткай, была выразана з зыходнай паслядоўнасці прачытання і далей апрацавана (далей — «устаўка»). Пасля трансляцыі ўстаўкі з устаўкі выдаляецца частка пасля першага стоп-кадона на 5′-канцы праймера. Акрамя таго, былі выдалены нуклеатыды, якія вядуць да няпоўных каданаў на 3′-канцы праймера. Каб выключыць устаўкі, якія змяшчаюць толькі фонавыя паслядоўнасці, былі выдалены і трансляваныя ўстаўкі, якія пачынаюцца з амінакіслотнага шаблону «PAG». Пептыды з посттрансляцыйнай даўжынёй менш за 3 амінакіслоты былі выдалены з бібліятэкі. Нарэшце, выдалілі лішак у пуле ўставак і вызначалі частату кожнай унікальнай устаўкі. Вынікі гэтага аналізу ўключалі спіс нуклеатыдных паслядоўнасцей (уставак) і іх (чытаных) частат (дадатковыя малюнкі 1c і 2).
Групаванне ўставак ДНК N-мераў па падабенстве паслядоўнасці: каб ліквідаваць спецыфічныя для 454/Roche памылкі секвенавання (напрыклад, праблемы з секвенаваннем гамапалімерных пашырэнняў) і выдаліць менш важныя лішнія элементы, папярэдне адфільтраваныя ўстаўкі паслядоўнасці ДНК N-мераў (устаўкі) сартуюцца па падабенстве. Устаўкі (устаўкі) сартуюцца па падабенстве (дапускаюцца да 2 несупадаючых асноў) з выкарыстаннем ітэрацыйнага алгарытму, вызначанага наступным чынам: устаўкі спачатку сартуюцца па частаце (ад найбольшай да найменшай), а калі яны аднолькавыя, па другаснай сартоўцы па даўжыні (ад самай доўгай да самай кароткай). Такім чынам, найбольш частыя і самыя доўгія ўстаўкі вызначаюць першую «групу». Частата групы ўстанаўліваецца на ключавую частату. Затым кожную ўстаўку, якая засталася ў адсартаваным спісе, спрабавалі дадаць у групу шляхам парнага выраўноўвання Нідлмана-Вунша. Калі колькасць несупадзенняў, уставак або выдаленняў у выраўноўванні не перавышае парога 2, у групу дадаецца ўстаўка, і агульная частата групы павялічваецца на частату дадання ўстаўкі. Устаўкі, дададзеныя ў групу, пазначаюцца як выкарыстаныя і выключаюцца з далейшай апрацоўкі. Калі паслядоўнасць устаўкі нельга дадаць да ўжо існуючай групы, гэтая паслядоўнасць устаўкі выкарыстоўваецца для стварэння новай групы з адпаведнай частатой устаўкі і пазначаецца як выкарыстаная. Ітэрацыя заканчваецца, калі кожная паслядоўнасць устаўкі альбо выкарыстоўваецца для фарміравання новай групы, альбо можа быць уключана ва ўжо існуючую групу. У рэшце рэшт, згрупаваныя ўстаўкі, якія складаюцца з нуклеатыдаў, у рэшце рэшт транслююцца ў пептыдныя паслядоўнасці (пептыдныя бібліятэкі). Вынікам гэтага аналізу з'яўляецца набор уставак і іх адпаведных частат, якія складаюць колькасць паслядоўных чытанняў (Дадатковы малюнак 2).
Генерацыя матываў: на аснове спісу унікальных пептыдаў была створана бібліятэка, якая змяшчае ўсе магчымыя амінакіслотныя шаблоны (АК), як паказана ніжэй. Кожны магчымы шаблон даўжынёй 3 быў выняты з пептыда, і яго адваротны шаблон быў дададзены разам з агульнай бібліятэкай матываў, якая змяшчае ўсе шаблоны (трыпептыды). Бібліятэкі высокапаўтаральных матываў былі секвенаваны, а лішняя інфармацыя выдалена. Затым для кожнага трыпептыда ў бібліятэцы матываў мы правяралі яго наяўнасць у бібліятэцы з дапамогай вылічальных інструментаў. У гэтым выпадку частата пептыда, які змяшчае знойдзены матыў трыпептыда, дадаецца і прысвойваецца матыву ў бібліятэцы матываў («колькасць матываў»). Вынікам генерацыі матываў з'яўляецца двухмерны масіў, які змяшчае ўсе з'яўленні трыпептыдаў (матываў) і іх адпаведныя значэнні, якія з'яўляюцца колькасцю счытванняў секвенавання, якія прыводзяць да адпаведнага матыву, калі счытванні фільтруюцца, групаюцца і перакладаюцца. Метрыкі, як падрабязна апісана вышэй.
Нармалізацыя колькасці матываў і адпаведныя дыяграмы рассейвання: колькасць матываў для кожнага ўзору была нармалізавана з дапамогай
дзе ni — колькасць прачытанняў, якія змяшчаюць тэму i. Такім чынам, vi прадстаўляе працэнтную частату прачытанняў (або пептыдаў), якія змяшчаюць матыў i, у выбарцы. P-значэнні для ненармалізаванай колькасці матываў былі разлічаны з выкарыстаннем дакладнага тэсту Фішэра. Што тычыцца карэляграм колькасці матываў, карэляцыі Спірмена былі разлічаны з выкарыстаннем нармалізаванай колькасці матываў з R.
Для візуалізацыі зместу амінакіслот у кожнай пазіцыі ў бібліятэцы пептыдаў былі створаны вэб-лагаграмы 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Спачатку змест амінакіслот у кожнай пазіцыі 12-мернага пептыда захоўваецца ў матрыцы 20×12. Затым набор з 1000 пептыдаў, якія змяшчаюць аднолькавы адносны змест амінакіслот у кожнай пазіцыі, генеруецца ў фармаце fasta-sequence і падаецца ў якасці ўваходных дадзеных для web-logo 3, які генеруе графічнае прадстаўленне адноснага зместу амінакіслот у кожнай пазіцыі для дадзенай бібліятэкі пептыдаў. Для візуалізацыі шматмерных набораў даных цеплавыя карты былі створаны з выкарыстаннем уласна распрацаванага інструмента ў R (biosHeatmap, пакет R, які яшчэ не выпушчаны). Дэндраграмы, прадстаўленыя на цеплавых картах, былі разлічаны з выкарыстаннем іерархічнага метаду кластэрызацыі Уорда з метрыкай эўклідавай адлегласці. Для статыстычнага аналізу даных ацэнкі матываў значэнні P для ненармалізаванай ацэнкі былі разлічаны з выкарыстаннем дакладнага тэсту Фішэра. P-значэнні для іншых набораў дадзеных былі разлічаны ў R з выкарыстаннем t-крытэрыя Стьюдэнта або ANOVA.
Абраныя фагавыя клоны і фагі без уставак уводзілі нутравенна праз хваставую вену (2×1010 фагаў/жывёлу ў 300 мкл PBS). За дзесяць хвілін да перфузіі і наступнай фіксацыі гэтым жа жывёлам нутравенна ўводзілі 100 мкл лекціну, мечанага DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Праз 60 хвілін пасля ін'екцыі фага пацукам праз сэрца ўводзілі 50 мл PBS, а затым 50 мл 4% PFA/PBS. Узоры мозгу дадаткова фіксавалі на ноч у 4% PFA/PBS і замочвалі ў 30% цукрозе на ноч пры 4°C. Узоры хутка замарожвалі ў сумесі OCT. Імунагістахімічны аналіз замарожаных узораў праводзілі пры пакаёвай тэмпературы на крыязрэзах таўшчынёй 30 мкм, блакаваных 1% BSA, і інкубавалі з полікланальнымі FITC-мечанымі антыцеламі супраць фага T7 (Novus NB 600-376A) пры 4°C. Інкубавалі на працягу ночы. Нарэшце, зрэзы тройчы прамывалі PBS і даследавалі з дапамогай канфакальнага лазернага мікраскопа (Leica TCS SP5).
Усе пептыды з мінімальнай чысцінёй 98% былі сінтэзаваны кампаніяй GenScript USA, біятыніляваны і ліяфілізаваны. Біятын звязаны праз дадатковы патройны гліцынавы спэйсер на N-канцы. Праверце ўсе пептыды з дапамогай мас-спектрометрыі.
Стрептавідын (Sigma S0677) змешвалі з 5-кратным эквімалярным лішкам біятыніляванага пептыду, біятыніляванага інгібіруючага пептыду BACE1 або камбінацыі (у суадносінах 3:1) біятыніляванага інгібіруючага пептыду BACE1 і інгібіруючага пептыду BACE1 у 5–10% ДМСО/інкубавалі ў PBS. 1 гадзіну пры пакаёвай тэмпературы перад ін'екцыяй. Кан'югаваныя са стрэптавідынам пептыды ўводзілі нутравенна ў дозе 10 мг/кг у адну з хваставых вен пацукоў з мазгавой поласці.
Канцэнтрацыю стрэптавідынавых пептыдных комплексаў вызначалі з дапамогай ІФА. Мікратытрацыйныя пласціны Nunc Maxisorp (Sigma) пакрывалі на працягу ночы пры 4°C 1,5 мкг/мл мышынымі антыцеламі супраць стрэптавідыну (Thermo, MA1-20011). Пасля блакавання (блакавальны буфер: 140 нМ NaCL, 5 мМ EDTA, 0,05% NP40, 0,25% жэлаціну, 1% BSA) пры пакаёвай тэмпературы на працягу 2 гадзін, пласціну прамывалі 0,05% Tween-20/PBS (прамыўны буфер) на працягу 3 секунд. Узоры спіннамазгавой вадкасці і плазмы дадавалі ў лункі, разведзеныя блакавальным буферам (плазма 1:10 000, спіннамазгавая вадкасць 1:115). Затым пласціну інкубавалі на працягу ночы пры 4°C з дэтэктарнымі антыцеламі (1 мкг/мл, антыцелы супраць стрэптавідыну-HRP, Novus NB120-7239). Пасля трох этапаў прамывання стрэптавідын выяўлялі шляхам інкубацыі ў растворы субстрата TMB (Roche) на працягу да 20 хвілін. Пасля спынення развіцця колеру з дапамогай 1M H2SO4 вымяралі паглынанне пры 450 нм.
Функцыя комплексу стрэптавідын-пептыд-інгібітар BACE1 ацэньвалася з дапамогай ІФА Aβ(1-40) у адпаведнасці з пратаколам вытворцы (Wako, 294-64701). Карацей кажучы, узоры спіннамазгавой вадкасці (СМР) разводзілі ў стандартным разбаўляльніку (1:23) і інкубавалі на працягу ночы пры 4°C у 96-лункавых планшэтах, пакрытых захоплівальнымі антыцеламі BNT77. Пасля пяці этапаў прамывання дадавалі кан'югаваныя з HRP антыцелы BA27 і інкубавалі на працягу 2 гадзін пры 4°C, а затым пяць этапаў прамывання. Aβ(1–40) выяўлялі шляхам інкубацыі ў растворы TMB на працягу 30 хвілін пры пакаёвай тэмпературы. Пасля спынення развіцця колеру стоп-растворам вымяралі паглынанне пры 450 нм. Узоры плазмы падвяргалі цвёрдафазнай экстракцыі перад ІФА Aβ(1–40). Плазму дадавалі да 0,2% DEA (Sigma) у 96-лункавых планшэтах і інкубавалі пры пакаёвай тэмпературы на працягу 30 хвілін. Пасля паслядоўнага прамывання пласцін для ТФЭ (Oasis, 186000679) вадой і 100% метанолам, узоры плазмы былі дададзены да пласцін для ТФЭ, і ўся вадкасць была выдалена. Узоры былі прамыты (спачатку 5% метанолам, затым 30% метанолам) і элюяваны 2% NH4OH/90% метанолам. Пасля сушкі элюата пры тэмпературы 55°C на працягу 99 хвілін пры пастаянным току N2, узоры былі адноўлены ў стандартных разбаўляльніках і вымераны Aβ(1–40), як апісана вышэй.
Як цытаваць гэты артыкул: Урых, Э. і інш. Дастаўка грузаў у мозг з дапамогай транзітных пептыдаў, ідэнтыфікаваных in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Ліхота Дж., Ск'ёрынге Т., Томсен Л.Б. і Мус Т. Дастаўка макрамалекулярных прэпаратаў у мозг з дапамогай мэтанакіраванай тэрапіі. Часопіс нейрахіміі 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Брасневіч, І., Штайнбуш, Х.В., Шмітц, К. і Марцінес-Марцінес, П. Дастаўка пептыдных і бялковых прэпаратаў праз гематоэнцэфалічны бар'ер. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардрыдж, У. М. Гематоэнцэфалічны бар'ер: вузкае месца ў распрацоўцы лекаў для мозгу. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Ёхансан, К.Е., Дункан, Дж.А., Стопа, Э.Г. і Берд, А. Перспектывы паляпшэння дастаўкі лекаў і іх нацэльвання на мозг праз шлях харыяіднага спляцення-спіннамазгавая вадкасць. Фармацэўтычныя даследаванні 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардрыдж, У. М. Мадэрнізацыя біяфармацэўтычных прэпаратаў з дапамогай малекулярных траянскіх коней для дастаўкі ў мозг. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардрыдж, WM рэцэптар-апасродкаваны транспарт пептыдаў праз гематоэнцэфалічны бар'ер. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Ніўонер, Дж. і інш. Павелічэнне пранікнення ў мозг і эфектыўнасці тэрапеўтычных антыцелаў з выкарыстаннем монавалентных малекулярных чоўнаў. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Б'ен-Лі, Н. і інш. Транспарт рэцэптара трансферыну (TfR) вызначае паглынанне мозгам афінных варыянтаў антыцелаў да TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).