Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Gumagamit ka ng bersyon ng browser na may limitadong suporta sa CSS. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Bilang karagdagan, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipinapakita namin ang site nang walang mga estilo at JavaScript.
Nagpapakita ng isang carousel ng tatlong slide nang sabay-sabay. Gamitin ang mga button na Nakaraan at Susunod upang lumipat sa tatlong slide nang sabay-sabay, o gamitin ang mga button na slider sa dulo upang lumipat sa tatlong slide nang sabay-sabay.
Pinipigilan ng blood-brain barrier at ng blood-brain barrier ang mga biotherapeutic agent na maabot ang kanilang mga target sa central nervous system, kaya naman nakahahadlang sa epektibong paggamot ng mga sakit sa neurological. Upang matuklasan ang mga nobelang brain transporter in vivo, nagpakilala kami ng isang T7 phage peptide library at sunud-sunod na kinolekta ang dugo at cerebrospinal fluid (CSF) gamit ang isang cannulated conscious large pool model ng mga daga. Ang mga partikular na phage clone ay lubos na pinayaman sa CSF pagkatapos ng apat na round ng pagpili. Ang pagsusuri sa mga indibidwal na kandidatong peptide ay nagpakita ng higit sa 1000-fold na pagpapayaman sa CSF. Ang bioactivity ng peptide-mediated delivery sa utak ay nakumpirma ng 40% na pagbawas sa antas ng amyloid-β sa cerebrospinal fluid gamit ang isang BACE1 peptide inhibitor na naka-link sa natukoy na nobelang transit peptide. Ang mga resultang ito ay nagmumungkahi na ang mga peptide na natukoy ng mga in vivo phage selection methods ay maaaring maging kapaki-pakinabang na mga sasakyan para sa systemic delivery ng mga macromolecule sa utak na may therapeutic effect.
Ang pananaliksik sa central nervous system (CNS) targeted therapy ay higit na nakatuon sa pagtukoy ng mga na-optimize na gamot at ahente na nagpapakita ng mga katangiang naka-target sa CNS, na may mas kaunting pagsisikap sa pagtuklas ng mga mekanismo na nagtutulak sa aktibong paghahatid ng gamot sa utak. Nagsisimula na itong magbago ngayon dahil ang paghahatid ng gamot, lalo na ang malalaking molekula, ay isang mahalagang bahagi ng modernong pag-unlad ng gamot sa neuroscience. Ang kapaligiran ng central nervous system ay mahusay na protektado ng cerebrovascular barrier system, na binubuo ng blood-brain barrier (BBB) ​​​​at ng blood-brain barrier (BCBB)1, na ginagawang mahirap ang paghahatid ng mga gamot sa utak1,2. Tinatayang halos lahat ng malalaking molekula ng gamot at mahigit 98% ng maliliit na molekula ng gamot ay inaalis mula sa utak3. Kaya naman napakahalagang tukuyin ang mga bagong sistema ng transportasyon ng utak na nagbibigay ng mahusay at tiyak na paghahatid ng mga therapeutic na gamot sa CNS 4,5. Gayunpaman, ang BBB at BCSFB ay nagpapakita rin ng isang mahusay na pagkakataon para sa paghahatid ng gamot habang tumatagos at pumapasok ang mga ito sa lahat ng istruktura ng utak sa pamamagitan ng malawak na vasculature nito. Kaya naman, ang kasalukuyang mga pagsisikap na gumamit ng mga hindi nagsasalakay na pamamaraan ng paghahatid sa utak ay higit na nakabatay sa mekanismo ng receptor-mediated transport (PMT) gamit ang endogenous BBB6 receptor. Sa kabila ng mga kamakailang pangunahing pagsulong gamit ang transferrin receptor pathway7,8, kinakailangan ang karagdagang pag-unlad ng mga bagong sistema ng paghahatid na may pinahusay na mga katangian. Para dito, ang aming layunin ay tukuyin ang mga peptide na may kakayahang mamagitan sa transportasyon ng CSF, dahil sa prinsipyo, maaari itong gamitin upang maghatid ng mga macromolecule sa CNS o magbukas ng mga bagong pathway ng receptor. Sa partikular, ang mga partikular na receptor at transporter ng cerebrovascular system (BBB at BSCFB) ay maaaring magsilbing mga potensyal na target para sa aktibo at tiyak na paghahatid ng mga biotherapeutic na gamot. Ang Cerebrospinal fluid (CSF) ay isang produktong secretory ng choroid plexus (CS) at direktang nakikipag-ugnayan sa interstitial fluid ng utak sa pamamagitan ng subarachnoid space at ventricular space4. Kamakailan lamang ay ipinakita na ang subarachnoid cerebrospinal fluid ay labis na kumakalat sa interstitium ng utak9. Umaasa kaming ma-access ang parenchymal space gamit ang subarachnoid inflow tract na ito o direkta sa pamamagitan ng BBB. Upang makamit ito, nagpatupad kami ng isang mahusay na in vivo phage selection strategy na mainam na tumutukoy sa mga peptide na dinadala ng alinman sa dalawang magkaibang pathway na ito.
Inilalarawan namin ngayon ang isang sequential in vivo phage display screening method na may CSF sampling na sinamahan ng high throughput sequencing (HTS) upang masubaybayan ang mga unang selection round na may pinakamataas na library diversity. Isinagawa ang screening sa mga may malay na daga na may permanenteng implanted large cisterna (CM) cannula upang maiwasan ang kontaminasyon ng dugo. Mahalaga, pinipili ng pamamaraang ito ang parehong brain-targeting at mga peptide na may transport activity sa cerebrovascular barrier. Gumamit kami ng mga T7 phage dahil sa kanilang maliit na sukat (~60 nm)10 at iminungkahi na angkop ang mga ito para sa transportasyon ng mga vesicle na nagpapahintulot sa transcellular crossing ng endothelial at/o epithelial-medulla barrier. Pagkatapos ng apat na round ng panning, ang mga populasyon ng phage ay naihiwalay na nagpapakita ng malakas na in vivo CSF ​​​​enrichment at cerebral microvessel association. Mahalaga, nakumpirma namin ang aming mga natuklasan sa pamamagitan ng pagpapakita na ang ginustong at chemically synthesized na pinakamahusay na kandidato na peptide ay kayang magdala ng protein cargo papunta sa cerebrospinal fluid. Una, ang mga pharmacodynamic effect ng CNS ay itinatag sa pamamagitan ng pagsasama ng isang nangungunang transit peptide na may inhibitor ng BACE1 peptide. Bukod sa pagpapakita na ang mga in vivo functional screening strategies ay maaaring matukoy ang mga nobelang brain transport peptides bilang epektibong protein cargo carriers, inaasahan namin na ang mga katulad na functional selection approaches ay magiging mahalaga rin sa pagtukoy ng mga nobelang brain transport pathways.
Batay sa mga plaque-forming unit (PFU), pagkatapos ng hakbang ng phage packaging, isang library ng random na 12-mer linear T7 phage peptides na may diversity na humigit-kumulang 109 ang dinisenyo at nilikha (tingnan ang Mga Materyales at Paraan). Mahalagang tandaan na maingat naming sinuri ang library na ito bago ang in vivo panning. Ang PCR amplification ng mga sample ng phage library gamit ang mga binagong primer ay nakabuo ng mga amplicon na direktang naaangkop sa HTS (Karagdagang Fig. 1a). Dahil sa a) mga error sa sequencing ng HTS11, b) epekto sa kalidad ng mga primer (NNK)1-12, at c) ang pagkakaroon ng wild-type (wt) phage (skeleton inserts) sa standby library, isang pamamaraan ng sequence filtering ang ipinatupad upang kunin lamang ang na-verify na impormasyon ng sequence (Karagdagang Fig. 1b). Ang mga hakbang sa filter na ito ay nalalapat sa lahat ng HTS sequencing library. Para sa karaniwang library, isang kabuuang 233,868 na read ang nakuha, kung saan 39% ang pumasa sa criteria ng filter at ginamit para sa pagsusuri at pagpili ng library para sa mga kasunod na round (Karagdagang Larawan 1c–e). Ang mga nabasa ay pangunahing multiple ng 3 base pairs ang haba na may peak na 36 nucleotides (Supplementary Fig. 1c), na nagpapatunay sa library design (NNK) 1-12. Kapansin-pansin, humigit-kumulang 11% ng mga miyembro ng library ang naglalaman ng 12-dimensional wild-type (wt) backbone PAGISRELVDKL insert, at halos kalahati ng mga sequence (49%) ay naglalaman ng mga insertion o deletion. Kinumpirma ng HTS ng library ang mataas na diversity ng mga peptide sa library: mahigit sa 81% ng mga peptide sequence ang natagpuan nang isang beses lamang at 1.5% lamang ang nangyari sa ≥4 na kopya (Supplementary Fig. 2a). Ang mga frequency ng mga amino acid (aa) sa lahat ng 12 posisyon sa repertoire ay may mahusay na kaugnayan sa mga frequency na inaasahan para sa bilang ng mga codon na nabuo ng degenerate NKK repertoire (Supplementary Fig. 2b). Ang naobserbahang frequency ng mga aa residue na naka-encode ng mga insert na ito ay may mahusay na kaugnayan sa kinakalkulang frequency (r = 0.893) (Supplementary Fig. 2c). Ang paghahanda ng mga phage library para sa iniksyon ay kinabibilangan ng mga hakbang ng amplification at pag-alis ng endotoxin. Nauna nang naipakita na ito ay potensyal na nakakabawas sa pagkakaiba-iba ng mga phage library12,13. Samakatuwid, sinuri namin ang isang plate-amplified phage library na sumailalim sa pag-alis ng endotoxin at inihambing ito sa orihinal na library upang matantya ang dalas ng AA. Isang malakas na ugnayan (r = 0.995) ang naobserbahan sa pagitan ng orihinal na pool at ng amplified at purified pool (Karagdagang Fig. 2d), na nagpapahiwatig na ang kompetisyon sa pagitan ng mga clone na na-amplify sa mga plate gamit ang T7 phage ay hindi nagdulot ng malaking bias. Ang paghahambing na ito ay batay sa dalas ng mga tripeptide motif sa bawat library, dahil ang pagkakaiba-iba ng mga library (~109) ay hindi maaaring ganap na makuha kahit na may HTS. Ang pagsusuri ng dalas ng aa sa bawat posisyon ay nagpakita ng isang maliit na bias na umaasa sa posisyon sa huling tatlong posisyon ng ipinasok na repertoire (Karagdagang Fig. 2e). Bilang konklusyon, napagpasyahan namin na ang kalidad at pagkakaiba-iba ng library ay katanggap-tanggap at maliliit na pagbabago lamang sa pagkakaiba-iba ang naobserbahan dahil sa amplification at paghahanda ng mga phage library sa pagitan ng ilang round ng pagpili.
Ang serial cerebrospinal fluid sampling ay maaaring isagawa sa pamamagitan ng paglalagay ng cannula sa CM ng mga may malay na daga sa pamamagitan ng operasyon upang mapadali ang pagkilala sa T7 phage na itinurok sa pamamagitan ng intravenous (iv) sa pamamagitan ng BBB at/o BCSFB (Fig. 1a-b). Gumamit kami ng dalawang independent selection arm (arm A at B) sa unang tatlong round ng in vivo selection (Fig. 1c). Unti-unti naming dinagdagan ang higpit ng selection sa pamamagitan ng pagbabawas ng kabuuang dami ng phage na ipinakilala sa unang tatlong round ng selection. Para sa ikaapat na round ng panning, pinagsama namin ang mga sample mula sa mga branch A at B at nagsagawa ng tatlong karagdagang independent selection. Upang pag-aralan ang mga in vivo properties ng mga T7 phage particle sa modelong ito, ang wild-type phage (PAGISRELVDKL master insert) ay itinurok sa mga daga sa pamamagitan ng tail vein. Ang pagbawi ng mga phage mula sa cerebrospinal fluid at dugo sa iba't ibang time point ay nagpakita na ang medyo maliliit na T7 icosahedral phage ay may mabilis na initial clearance phase mula sa blood compartment (Karagdagang Fig. 3). Batay sa mga titer na ibinigay at sa dami ng dugo ng mga daga, kinalkula namin na humigit-kumulang 1% wt. phage lamang mula sa ibinigay na dosis ang natukoy sa dugo 10 minuto pagkatapos ng intravenous injection. Matapos ang unang mabilis na pagbaba na ito, isang mas mabagal na primary clearance ang nasukat na may half-life na 27.7 minuto. Mahalaga, kakaunti lamang ang mga phage ang nakuha mula sa CSF compartment, na nagpapahiwatig ng mababang background para sa wild-type phage migration papunta sa CSF compartment (Karagdagang Larawan 3). Sa karaniwan, humigit-kumulang 1 x 10-3% na titer lamang ng T7 phage sa dugo at 4 x 10-8% ng mga unang na-infuse na phage ang natukoy sa cerebrospinal fluid sa buong panahon ng sampling (0-250 min). Kapansin-pansin, ang half-life (25.7 min) ng wild-type phage sa cerebrospinal fluid ay katulad ng naobserbahan sa dugo. Ipinapakita ng mga datos na ito na ang harang na naghihiwalay sa kompartamento ng CSF mula sa dugo ay buo sa mga daga na may CM cannulation, na nagpapahintulot sa in vivo na pagpili ng mga phage libraries upang matukoy ang mga clone na madaling mailipat mula sa dugo patungo sa kompartamento ng CSF.
(a) Pagtatakda ng isang paraan para sa muling pagkuha ng cerebrospinal fluid (CSF) mula sa isang malaking pool. (b) Diagram na nagpapakita ng lokasyon ng selula ng central nervous system (CNS) barrier at ang estratehiya sa pagpili na ginamit upang matukoy ang mga peptide na tumatawid sa blood-brain barrier (BBB) ​​​​at sa blood-brain barrier. (c) In vivo phage display screening flowchart. Sa bawat round ng pagpili, ang mga phage (mga identifier ng hayop sa loob ng mga arrow) ay tinurukan sa pamamagitan ng intravenous. Dalawang independiyenteng alternatibong sanga (A, B) ang itinatago nang hiwalay hanggang sa ika-4 na round ng pagpili. Para sa selection rounds 3 at 4, ang bawat phage clone na kinuha mula sa CSF ay manu-manong sinundan. (d) Kinetics ng phage na nakahiwalay mula sa dugo (mga pulang bilog) at cerebrospinal fluid (mga berdeng tatsulok) sa unang round ng pagpili sa dalawang cannulated na daga pagkatapos ng intravenous injection ng T7 peptide library (2 x 1012 phages/hayop). Ang mga asul na parisukat ay nagpapahiwatig ng average na paunang konsentrasyon ng phage sa dugo, na kinalkula mula sa dami ng injected phage, na isinasaalang-alang ang kabuuang dami ng dugo. Ang mga itim na parisukat ay nagpapahiwatig ng punto ng interseksyon ng linyang y na kinuha mula sa mga konsentrasyon ng phage sa dugo. (e,f) Ipakita ang relatibong dalas at distribusyon ng lahat ng posibleng magkakapatong na mga motif ng tripeptide na matatagpuan sa peptide. Ang bilang ng mga motif na natagpuan sa 1000 na pagbasa ay ipinapakita. Makabuluhang (p < 0.001) ang mga enriched motif ay minarkahan ng mga pulang tuldok. (e) Correlation scatterplot na naghahambing sa relatibong dalas ng motif ng tripeptide ng injected library sa phage na nagmula sa dugo mula sa mga hayop #1.1 at #1.2. (f) Correlation scatterplot na naghahambing sa relatibong dalas ng mga motif ng tripeptide ng phage ng hayop #1.1 at #1.2 na nakahiwalay sa dugo at cerebrospinal fluid. (g, h) Representasyon ng Sequence ID ng phage na enriched sa dugo (g) kumpara sa mga injected library at phage na enriched sa CSF (h) kumpara sa dugo pagkatapos ng isang round ng in vivo selection sa parehong hayop. Ang laki ng isang-letrang kodigo ay nagpapahiwatig kung gaano kadalas lumilitaw ang amino acid na iyon sa posisyong iyon. Berde = polar, lila = neutral, asul = basic, pula = acidic at itim = hydrophobic amino acids. Ang Figure 1a, b ay dinisenyo at ginawa ni Eduard Urich.
Nag-inject kami ng phage peptide library sa dalawang CM instrument rats (clades A at B) at inihiwalay ang phage mula sa cerebrospinal fluid at dugo (Figure 1d). Ang unang mabilis na clearance ng library ay hindi gaanong kapansin-pansin kumpara sa wild-type phage. Ang mean half-life ng injected library sa parehong hayop ay 24.8 minuto sa dugo, katulad ng wild-type phage, at 38.5 minuto sa CSF. Ang mga sample ng phage ng dugo at cerebrospinal fluid mula sa bawat hayop ay isinailalim sa HTS at lahat ng natukoy na peptide ay sinuri para sa presensya ng isang maikling tripeptide motif. Pinili ang mga tripeptide motif dahil nagbibigay ang mga ito ng kaunting batayan para sa pagbuo ng istraktura at mga interaksyon ng peptide-protein14,15. Nakakita kami ng magandang ugnayan sa distribusyon ng mga motif sa pagitan ng injected phage library at mga clone na kinuha mula sa dugo ng parehong hayop (Fig. 1e). Ipinapahiwatig ng datos na ang komposisyon ng library ay bahagyang pinayaman lamang sa blood compartment. Ang mga amino acid frequency at consensus sequence ay karagdagang sinuri sa bawat posisyon gamit ang isang adaptasyon ng Weblogo16 software. Kapansin-pansin, nakahanap kami ng malakas na pagpapayaman sa mga residue ng glycine sa dugo (Larawan 1g). Nang ikumpara ang dugo sa mga clone na napili mula sa CSF, naobserbahan ang malakas na seleksyon at ilang deseleksyon ng mga motif (Larawan 1f), at ang ilang amino acid ay mas pinipiling naroroon sa mga paunang natukoy na posisyon sa 12-member (Larawan 1h). Kapansin-pansin, ang mga indibidwal na hayop ay may malaking pagkakaiba sa cerebrospinal fluid, samantalang ang pagpapayaman ng glycine sa dugo ay naobserbahan sa parehong hayop (Karagdagang Larawan 4a–j). Matapos ang mahigpit na pagsala ng datos ng sequence sa cerebrospinal fluid ng mga hayop #1.1 at #1.2, isang kabuuang 964 at 420 natatanging 12-mer peptide ang nakuha (Karagdagang Larawan 1d–e). Ang mga nakahiwalay na phage clone ay pinalaki at isinailalim sa pangalawang round ng in vivo selection. Ang mga phage na kinuha mula sa pangalawang round ng seleksyon ay isinailalim sa HTS sa bawat hayop at lahat ng natukoy na peptide ay ginamit bilang input sa isang programa sa pagkilala ng motif upang suriin ang paglitaw ng mga tripeptide motif (Larawan 2a, b, ef). Kung ikukumpara sa unang siklo ng phage na nakuha mula sa CSF, naobserbahan namin ang karagdagang pagpili at pag-alis ng pagpili ng maraming motif sa CSF sa mga sanga A at B (Larawan 2). Isang algorithm ng pagtukoy sa network ang inilapat upang matukoy kung kinakatawan nila ang iba't ibang mga pattern ng pare-parehong pagkakasunud-sunod. Isang malinaw na pagkakatulad ang naobserbahan sa pagitan ng 12-dimensional na mga pagkakasunud-sunod na nakuha ng CSF sa alternatibong clade A (Larawan 2c, d) at clade B (Larawan 2g, h). Ang pinagsamang pagsusuri sa bawat sanga ay nagpakita ng iba't ibang mga profile ng pagpili para sa 12-mer peptides (Karagdagang Larawan 5c, d) at isang pagtaas sa ratio ng CSF/blood titer sa paglipas ng panahon para sa mga pinagsamang clone pagkatapos ng ikalawang round ng pagpili kumpara sa unang round ng pagpili (Karagdagang Larawan 5e).
Pagpapayaman ng mga motif at peptide sa cerebrospinal fluid sa pamamagitan ng dalawang magkakasunod na pag-ikot ng in vivo functional phage display selection.
Lahat ng cerebrospinal fluid phages na nakuha mula sa unang round ng bawat hayop (mga hayop #1.1 at #1.2) ay pinagsama-sama, pinalaki, sinuri ang HT at muling iniksyon nang magkasama (2 x 1010 phages/hayop) 2 SM cannulated na daga (#1.1 → #). 2.1 at 2.2, 1.2 → 2.3 at 2.4). (a,b,e,f) Mga correlation scatterplots na naghahambing sa relatibong dalas ng mga tripeptide motif ng lahat ng CSF-derived phages sa una at pangalawang selection rounds. Ang relatibong dalas at distribusyon ng mga motif na kumakatawan sa lahat ng posibleng magkakapatong na tripeptide na matatagpuan sa mga peptide sa parehong oryentasyon. Ang bilang ng mga motif na natagpuan sa 1000 na pagbasa ay ipinapakita. Ang mga motif na makabuluhang (p < 0.001) na napili o hindi isinama sa isa sa mga pinaghambing na library ay naka-highlight gamit ang mga pulang tuldok. (c, d, g, h) Representasyon ng logo ng sequence ng lahat ng mahahabang sequence na mayaman sa CSF na may 12 amino acid batay sa round 2 at 1 ng in vivo selection. Ang laki ng one-letter code ay nagpapahiwatig kung gaano kadalas lumilitaw ang amino acid na iyon sa posisyong iyon. Upang kumatawan sa logo, ang dalas ng mga sequence ng CSF na kinuha mula sa mga indibidwal na hayop sa pagitan ng dalawang selection round ay inihambing at ang mga enriched sequence sa ikalawang round ay ipinapakita: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 at (h) #1.2–#2.4. Ang mga amino acid na may pinakamaraming enriched sa isang partikular na posisyon sa (c, d) mga hayop blg. 2.1 at blg. 2.2 o (g, h) sa mga hayop blg. 2.3 at blg. 2.4 ay ipinapakita sa kulay. Berde = polar, lila = neutral, asul = basic, pula = acidic at itim = hydrophobic amino acid.
Pagkatapos ng ikatlong round ng pagpili, nakatukoy kami ng 124 na natatanging peptide sequences (#3.1 at #3.2) mula sa 332 CSF-reconstituted phage clones na nakahiwalay mula sa dalawang hayop (Supplementary Fig. 6a). Ang sequence na LGSVS (18.7%) ang may pinakamataas na relatibong proporsyon, kasunod ang wild-type inserts na PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), at SARGSWREIVSLS (2.2%). Sa huling ikaapat na round, pinagsama-sama namin ang dalawang magkahiwalay na napiling sanga mula sa tatlong magkakahiwalay na hayop (Fig. 1c). Sa 925 sequenced phage clones na nakuha mula sa CSF, sa ikaapat na round ay nakahanap kami ng 64 na natatanging peptide sequences (Supplementary Fig. 6b), kung saan ang relatibong proporsyon ng wild-type phage ay bumaba sa 0.8%. Ang pinakakaraniwang mga clone ng CSF sa ikaapat na round ay ang LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) at RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %). Ang saklaw ng haba ng mga napiling peptide ay dahil sa mga pagpasok/pagtanggal ng nucleotide o mga napaaga na stop codon sa mga library primer kapag gumagamit ng mga degenerate codon para sa disenyo ng NNK library. Ang mga napaaga na stop codon ay bumubuo ng mas maiikling peptide at pinipili dahil naglalaman ang mga ito ng kanais-nais na aa motif. Ang mas mahahabang peptide ay maaaring magresulta mula sa mga pagpasok/pagtanggal sa mga primer ng mga synthetic library. Pinoposisyon nito ang dinisenyong stop codon sa labas ng frame at binabasa ito hanggang sa lumitaw ang isang bagong stop codon sa ibaba ng agos. Sa pangkalahatan, kinalkula namin ang mga enrichment factor para sa lahat ng apat na selection round sa pamamagitan ng paghahambing ng input data sa sample output data. Para sa unang round ng screening, gumamit kami ng wild-type phage titers bilang non-specific background reference. Kapansin-pansin, ang negatibong pagpili ng phage ay napakalakas sa unang CSF cycle, ngunit hindi sa dugo (Fig. 3a), na maaaring dahil sa mababang probabilidad ng passive diffusion ng karamihan sa mga miyembro ng peptide library papunta sa CSF compartment o ang mga relatibong phage ay may posibilidad na mas mahusay na mapanatili o maalis mula sa daluyan ng dugo kaysa sa mga bacteriophage. Gayunpaman, sa ikalawang round ng panning, ang malakas na pagpili ng mga phage sa CSF ay naobserbahan sa parehong clade, na nagmumungkahi na ang nakaraang round ay pinayaman sa mga phage na nagpapakita ng mga peptide na nagtataguyod ng CSF uptake (Fig. 3a). Muli, nang walang makabuluhang pagpapayaman sa dugo. Gayundin sa ikatlo at ikaapat na round, ang mga phage clone ay makabuluhang pinayaman sa CSF. Sa paghahambing ng relatibong dalas ng bawat natatanging peptide sequence sa pagitan ng huling dalawang round ng selection, natuklasan namin na ang mga sequence ay mas pinayaman pa sa ikaapat na round ng selection (Fig. 3b). Isang kabuuang 931 tripeptide motif ang nakuha mula sa lahat ng 64 na natatanging peptide sequence gamit ang parehong peptide orientations. Ang mga motif na may pinakamayamang disenyo sa ikaapat na round ay mas masusing sinuri para sa kanilang mga enrichment profile sa lahat ng round kumpara sa injected library (cut-off: 10% enrichment) (Karagdagang Fig. 6c). Ipinakita ng mga pangkalahatang pattern ng seleksyon na karamihan sa mga pinag-aralang motif ay pinayaman sa lahat ng nakaraang round ng parehong sangay ng seleksyon. Gayunpaman, ang ilang mga motif (hal. SGL, VSG, LGS GSV) ay pangunahing mula sa alternatibong clade A, habang ang iba (hal. FGW, RTN, WGF, NTR) ay pinayaman sa alternatibong clade B.
Pagpapatunay ng transportasyon ng CSF ng mga peptide na ipinapakita ng phage na pinayaman ng CSF at mga biotinylated leader peptide na nakakabit sa mga payload ng streptavidin.
(a) Mga ratio ng pagpapayaman na kinalkula sa lahat ng apat na round (R1-R4) batay sa mga injected (input = I) phage (PFU) titer at mga natukoy na CSF phage titer (output = O). Ang mga enrichment factor para sa huling tatlong round (R2-R4) ay kinalkula sa pamamagitan ng paghahambing sa nakaraang round at sa unang round (R1) gamit ang datos ng timbang. Ang mga open bar ay cerebrospinal fluid, ang mga shaded bar ay plasma. (***p<0.001, batay sa t-test ng Student). (b) Listahan ng mga pinakamaraming phage peptide, niraranggo ayon sa kanilang relatibong proporsyon sa lahat ng phage na nakolekta sa CSF pagkatapos ng round 4 ng pagpili. Ang anim na pinakakaraniwang phage clone ay naka-highlight sa kulay, may numero at ang kanilang mga enrichment factor sa pagitan ng round 3 at 4 ng pagpili (mga inset). (c,d) Ang anim na pinakamayaman na phage clone, empty phage at parental phage peptide library mula sa round 4 ay sinuri nang paisa-isa sa isang CSF sampling model. Ang mga sample ng CSF at dugo ay nakolekta sa mga ipinahiwatig na oras. (c) Pantay na dami ng 6 na kandidatong phage clones (2 x 1010 phages/hayop), mga walang laman na phages (#1779) (2 x 1010 phages/hayop) at mga stock phage peptide libraries (2 x 1012 phages/hayop). Ang pag-iniksyon ng hindi bababa sa 3 CM ay ibinibigay sa hayop na na-cannulate nang hiwalay sa pamamagitan ng ugat sa buntot. Ang pharmacokinetics ng CSF ng bawat na-inject na phage clone at phage peptide library sa paglipas ng panahon ay ipinapakita. (d) ay nagpapakita ng average na ratio ng CSF/dugo para sa lahat ng nakuhang phages/mL sa oras ng sampling. (e) Apat na synthetic leader peptides at isang scrambled control ang iniugnay sa biotin sa streptavidin sa pamamagitan ng kanilang N-terminus (tetramer display) na sinundan ng iniksyon (tail vein iv, 10 mg streptavidin/kg). Hindi bababa sa tatlong intubated na daga (N = 3). ). Ang mga sample ng CSF ay kinolekta sa mga ipinahiwatig na oras at ang mga konsentrasyon ng streptavidin ay sinukat gamit ang CSF anti-streptavidin ELISA (nd = hindi natukoy). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, batay sa ANOVA test). (f) Paghahambing ng amino acid sequence ng pinakapinayaman na phage peptide clone #2002 (lila) sa iba pang napiling phage peptide clones mula sa ika-4 na round ng pagpili. Ang magkapareho at magkatulad na mga fragment ng amino acid ay may color-code.
Sa lahat ng pinayaman na phage sa ikaapat na round (Fig. 3b), anim na kandidatong clone ang napili para sa karagdagang indibidwal na pagsusuri sa modelo ng sampling ng CSF. Pantay na dami ng anim na kandidatong phage, empty phage (walang insert) at prophage peptide libraries ang iniksyon sa tatlong cannulated na CM animals, at ang pharmacokinetics ay natukoy sa CSF (Fig. 3c) at blood (Supplementary Fig. 7) assays. Lahat ng phage clone na sinubukan ay naka-target sa CSF compartment sa antas na 10-1000 beses na mas mataas kaysa sa empty control phage (#1779). Halimbawa, ang mga clone #2020 at #2077 ay may humigit-kumulang 1000 beses na mas mataas na CSF titers kaysa sa control phage. Magkakaiba ang pharmacokinetic profile ng bawat napiling peptide, ngunit lahat sila ay may mataas na kakayahan sa CSF homing. Naobserbahan namin ang patuloy na pagbaba sa paglipas ng panahon para sa mga clone #1903 at #2011, habang para sa mga clone #2077, #2002 at #2009, ang pagtaas sa unang 10 minuto ay maaaring magpahiwatig ng aktibong transportasyon ngunit kailangang beripikahin. Ang mga clone #2020, #2002, at #2077 ay nanatiling matatag sa mataas na antas, habang ang konsentrasyon ng CSF ng clone #2009 ay unti-unting bumaba pagkatapos ng unang pagtaas. Pagkatapos ay inihambing namin ang relatibong dalas ng bawat kandidato ng CSF sa konsentrasyon nito sa dugo (Fig. 3d). Ang ugnayan ng mean titer ng bawat kandidato ng CSF sa titer ng dugo nito sa lahat ng oras ng sampling ay nagpakita na tatlo sa anim na kandidato ay may malaking yaman sa CSF ng dugo. Kapansin-pansin, ang clone #2077 ay nagpakita ng mas mataas na katatagan ng dugo (Karagdagang Larawan 7). Upang kumpirmahin na ang mga peptide mismo ay may kakayahang aktibong magdala ng kargamento maliban sa mga particle ng phage papunta sa kompartamento ng CSF, nag-synthesize kami ng apat na leader peptide na derivatized gamit ang biotin sa N-terminus kung saan kumakapit ang mga peptide sa particle ng phage. Ang mga biotinylated peptide (blg. 2002, 2009, 2020 at 2077) ay pinagsama sa streptavidin (SA) upang makakuha ng mga multimeric na anyo na medyo ginagaya ang geometry ng phage. Ang format na ito ay nagbigay-daan din sa amin upang masukat ang pagkakalantad sa SA sa dugo at cerebrospinal fluid bilang mga peptide ng protina na nagdadala ng kargamento. Mahalaga, ang datos ng phage ay kadalasang maaaring kopyahin kapag ang mga sintetikong peptide ay ibinigay sa SA-conjugated format na ito (Fig. 3e). Ang mga scrambled peptide ay may mas kaunting initial exposure at mas mabilis na CSF clearance na may mga hindi matukoy na antas sa loob ng 48 oras. Upang makakuha ng kaalaman sa mga delivery pathway ng mga peptide phage clone na ito sa espasyo ng CSF, sinuri namin ang lokalisasyon ng mga indibidwal na phage peptide hits gamit ang immunohistochemistry (IHC) upang direktang matukoy ang mga phage particle 1 oras pagkatapos ng intravenous injection in vivo. Kapansin-pansin, ang mga clone #2002, #2077, at #2009 ay maaaring matukoy sa pamamagitan ng malakas na paglamlam sa mga capillary ng utak, habang ang control phage (#1779) at clone #2020 ay hindi natukoy (Karagdagang Larawan 8). Ipinahihiwatig nito na ang mga peptide na ito ay nakakatulong sa epekto sa utak nang tumpak sa pamamagitan ng pagtawid sa BBB. Kinakailangan ang karagdagang detalyadong pagsusuri upang masubukan ang hypothesis na ito, dahil maaaring kasangkot din ang ruta ng BSCFB. Nang ihambing ang amino acid sequence ng pinaka-enriched na clone (#2002) sa iba pang napiling mga peptide, napansin na ang ilan sa mga ito ay may magkatulad na amino acid extension, na maaaring magpahiwatig ng isang katulad na mekanismo ng transportasyon (Larawan 3f).
Dahil sa kakaibang plasma profile nito at makabuluhang pagtaas sa CSF sa paglipas ng panahon, ang phage display clone #2077 ay mas sinuri pa sa loob ng mas mahabang 48-oras na panahon at nagawang kopyahin ang mabilis na pagtaas sa CSF na naobserbahan kaugnay ng patuloy na antas ng SA (Fig. 4a). Tungkol sa iba pang natukoy na phage clones, ang #2077 ay malakas na kinulayan para sa mga capillary ng utak at nagpakita ng makabuluhang colocalization na may capillary marker lectin kapag tiningnan sa mas mataas na resolution at posibleng ilang paglamlam sa parenchymal space (Figure 4b). Upang siyasatin kung ang mga peptide-mediated pharmacological effect ay maaaring makuha sa CNS, nagsagawa kami ng isang eksperimento kung saan ang mga biotinylated na bersyon ng i) ang #2077 transit peptide at ii) ang BACE1 inhibitor peptide ay hinaluan ng SA sa dalawang magkaibang ratio. Para sa isang kumbinasyon, ginamit lamang namin ang BACE1 peptide inhibitor at para sa isa pa, gumamit kami ng 1:3 ratio ng BACE1 peptide inhibitor sa #2077 peptide. Ang parehong sample ay ibinigay sa pamamagitan ng intravenous at ang mga antas ng beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) sa dugo at cerebrospinal fluid ay sinukat sa paglipas ng panahon. Ang Abeta40 ay sinukat sa CSF dahil ipinapakita nito ang pagsugpo sa BACE1 sa brain parenchyma. Gaya ng inaasahan, ang parehong complex ay makabuluhang nagpababa ng mga antas ng Abeta40 sa dugo (Fig. 4c, d). Gayunpaman, tanging ang mga sample na naglalaman ng pinaghalong peptide no. 2077 at isang inhibitor ng BACE1 peptide na naka-conjugate sa SA ang nagdulot ng makabuluhang pagbaba sa Abeta40 sa cerebrospinal fluid (Fig. 4c). Ipinapakita ng datos na ang peptide no. 2077 ay kayang magdala ng 60 kDa SA protein papunta sa CNS at nagdudulot din ng mga pharmacological effect gamit ang SA-conjugated inhibitors ng BACE1 peptide.
(a) Clonal injection (2 × 10 phages/hayop) ng T7 phage na nagpapakita ng pangmatagalang pharmacokinetic profiles ng CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) at hindi tinurukan na control phage (#1779) sa hindi bababa sa tatlong CM-intubated na daga. (b) Confocal microscopic na imahe ng mga kinatawan na cortical microvessels sa mga daga na tinurukan ng phage (2 × 10 10 phages/hayop) na nagpapakita ng counterstaining ng peptide #2077 at mga daluyan ng dugo (lectin). Ang mga phage clone na ito ay ibinigay sa 3 daga at hinayaang umikot nang 1 oras bago ang perfusion. Ang mga utak ay pinaghiwa-hiwalay at kinulayan ng polyclonal FITC-labeled antibodies laban sa T7 phage capsid. Sampung minuto bago ang perfusion at kasunod na fixation, ang DyLight594-labeled lectin ay ibinigay sa pamamagitan ng intravenous. Mga larawang fluorescent na nagpapakita ng lectin staining (pula) ng luminal na bahagi ng mga microvessel at phage (berde) sa lumen ng mga capillary at perivascular brain tissue. Ang scale bar ay katumbas ng 10 µm. (c, d) Ang biotinylated BACE1 inhibitory peptide nang mag-isa o kasama ng biotinylated transit peptide #2077 ay ikinabit sa streptavidin na sinundan ng intravenous injection ng hindi bababa sa tatlong cannulated CM rats (10 mg streptavidin/kg). Ang BACE1 peptide inhibitor-mediated reduction sa Aβ40 ay sinukat gamit ang Aβ1-40 ELISA sa dugo (pula) at cerebrospinal fluid (orange) sa mga ipinahiwatig na time point. Para sa mas malinaw na pag-unawa, isang tuldok-tuldok na linya ang iginuhit sa graph sa scale na 100%. (c) Porsyento ng pagbawas sa Aβ40 sa dugo (mga pulang tatsulok) at cerebrospinal fluid (mga orange na tatsulok) sa mga daga na ginamot ng streptavidin na nakaugnay sa transit peptide #2077 at BACE1 inhibitory peptide sa 3:1 na ratio. (d) Porsyento ng pagbawas sa Aβ40 sa dugo (mga pulang bilog) at cerebrospinal fluid (mga orange na bilog) ng mga daga na ginamot ng streptavidin na nakaugnay sa isang BACE1 inhibitory peptide lamang. Ang konsentrasyon ng Aβ sa kontrol ay 420 pg/ml (standard deviation = 101 pg/ml).
Matagumpay na nailapat ang phage display sa ilang larangan ng biomedical na pananaliksik17. Ang pamamaraang ito ay ginamit para sa mga in vivo vascular diversity studies18,19 pati na rin sa mga pag-aaral na nagta-target sa mga cerebral vessels20,21,22,23,24,25,26. Sa pag-aaral na ito, pinalawak namin ang aplikasyon ng pamamaraang ito ng pagpili hindi lamang sa direktang pagtukoy ng mga peptide na nagta-target sa mga cerebral vessels, kundi pati na rin sa pagtuklas ng mga kandidato na may mga aktibong katangian ng transportasyon upang makatawid sa blood-brain barrier. Inilalarawan namin ngayon ang pag-unlad ng isang in vivo na pamamaraan ng pagpili sa mga daga na may CM intubated at ipinapakita ang potensyal nito na matukoy ang mga peptide na may mga katangian ng CSF homing. Gamit ang T7 phage na nagpapakita ng isang library ng 12-mer random peptides, naipakita namin na ang T7 phage ay sapat na maliit (humigit-kumulang 60 nm ang diyametro)10 upang maiakma sa blood-brain barrier, sa gayon ay direktang tumatawid sa blood-brain barrier o choroid plexus. Naobserbahan namin na ang pagkuha ng CSF mula sa mga cannulated CM rats ay isang mahusay na kontroladong in vivo functional screening method, at ang nakuha na phage ay hindi lamang nakagapos sa vasculature kundi gumana rin bilang isang transporter sa blood-brain barrier. Bukod pa rito, sa pamamagitan ng sabay na pagkolekta ng dugo at paglalapat ng HTS sa CSF at mga phage na nagmula sa dugo, nakumpirma namin na ang aming pagpili ng CSF ay hindi naiimpluwensyahan ng pagpapayaman ng dugo o kaangkupan para sa pagpapalawak sa pagitan ng mga round ng selection. Gayunpaman, ang blood compartment ay bahagi ng proseso ng pagpili, dahil ang mga phage na may kakayahang makarating sa CSF compartment ay dapat mabuhay at umikot sa daluyan ng dugo nang sapat na katagalan upang mapayaman ang kanilang sarili sa utak. Upang makakuha ng maaasahang impormasyon sa sequence mula sa raw HTS data, nagpatupad kami ng mga filter na inangkop sa mga platform-specific sequencing error sa workflow ng pagsusuri. Sa pamamagitan ng pagsasama ng mga kinetic parameter sa screening method, nakumpirma namin ang mabilis na pharmacokinetics ng wild-type T7 phages (t½ ~ 28 min) sa dugo24, 27, 28 at natukoy din ang kanilang half-life sa cerebrospinal fluid (t½ ~ 26 min) kada minuto). Sa kabila ng magkatulad na mga profile ng pharmacokinetic sa dugo at CSF, 0.001% lamang ng konsentrasyon ng phage sa dugo ang natukoy sa CSF, na nagpapahiwatig ng mababang background mobility ng wild-type T7 phage sa blood-brain barrier. Itinatampok ng gawaing ito ang kahalagahan ng unang round ng selection kapag gumagamit ng in vivo panning strategies, lalo na para sa mga phage system na mabilis na nalilinis mula sa sirkulasyon, dahil kakaunti ang mga clone na nakakarating sa CNS compartment. Kaya, sa unang round, ang pagbawas sa library diversity ay napakalaki, dahil limitado lamang ang bilang ng mga clone ang kalaunan ay nakolekta sa napakahigpit na modelong CSF na ito. Kasama sa in vivo panning strategy na ito ang ilang hakbang sa pagpili tulad ng aktibong akumulasyon sa CSF compartment, clone survival sa blood compartment, at mabilis na pag-alis ng mga T7 phage clone mula sa dugo sa loob ng unang 10 minuto (Fig. 1d at Supplementary Fig. 4M). Kaya, pagkatapos ng unang round, iba't ibang phage clone ang natukoy sa CSF, bagama't ang parehong initial pool ang ginamit para sa mga indibidwal na hayop. Ipinahihiwatig nito na ang maraming mahigpit na hakbang sa pagpili para sa mga source library na may malaking bilang ng mga miyembro ng library ay nagreresulta sa isang makabuluhang pagbawas sa pagkakaiba-iba. Samakatuwid, ang mga random na kaganapan ay magiging isang mahalagang bahagi ng paunang proseso ng pagpili, na lubos na nakakaimpluwensya sa resulta. Malamang na marami sa mga clone sa orihinal na library ay may halos katulad na likas na kakayahan sa pagpapayaman ng CSF. Gayunpaman, kahit na sa ilalim ng parehong mga kondisyon sa eksperimento, ang mga resulta ng pagpili ay maaaring magkaiba dahil sa maliit na bilang ng bawat partikular na clone sa paunang pool.
Ang mga motif na mayaman sa CSF ay naiiba sa mga nasa dugo. Kapansin-pansin, napansin namin ang unang pagbabago patungo sa mga glycine-rich peptide sa dugo ng mga indibidwal na hayop. (Fig. 1g, Supplementary Figs. 4e, 4f). Ang mga phage na naglalaman ng glycine peptide ay maaaring mas matatag at mas malamang na hindi maalis sa sirkulasyon. Gayunpaman, ang mga glycine-rich peptide na ito ay hindi nakita sa mga sample ng cerebrospinal fluid, na nagmumungkahi na ang mga curated library ay dumaan sa dalawang magkaibang hakbang sa pagpili: isa sa dugo at ang isa ay hinayaan na maipon sa cerebrospinal fluid. Ang mga CSF-enriched clone na nagresulta mula sa ikaapat na round ng pagpili ay malawakang sinubukan. Halos lahat ng indibidwal na sinubukang clone ay nakumpirma na mayaman sa CSF kumpara sa blank control phage. Isang peptide hit (#2077) ang mas detalyado na sinuri. Nagpakita ito ng mas mahabang plasma half-life kumpara sa iba pang mga hit (Figure 3d at Supplementary Figure 7), at kawili-wili, ang peptide na ito ay naglalaman ng cysteine ​​​​residue sa C-terminus. Kamakailan lamang ay ipinakita na ang pagdaragdag ng cysteine ​​​​sa mga peptide ay maaaring mapabuti ang kanilang mga katangian ng pharmacokinetic sa pamamagitan ng pagbigkis sa albumin 29. Sa kasalukuyan, hindi pa ito alam para sa peptide #2077 at nangangailangan ng karagdagang pag-aaral. Ang ilang mga peptide ay nagpakita ng valence-dependency sa pagpapayaman ng CSF (hindi ipinakita ang datos), na maaaring nauugnay sa ipinakitang geometry ng ibabaw ng T7 capsid. Ang sistemang T7 na ginamit namin ay nagpakita ng 5-15 kopya ng bawat peptide bawat phage particle. Ang IHC ay isinagawa sa mga kandidatong lead phage clone na injected intravenously sa cerebral cortex ng mga daga (Karagdagang Larawan 8). Ipinakita ng datos na hindi bababa sa tatlong clone (Blg. 2002, Blg. 2009 at Blg. 2077) ang nakipag-ugnayan sa BBB. Kailangan pang matukoy kung ang interaksyon ng BBB na ito ay nagreresulta sa akumulasyon ng CSF o sa paggalaw ng mga clone na ito nang direkta sa BCSFB. Mahalaga, ipinapakita namin na ang mga napiling peptide ay nagpapanatili ng kanilang kapasidad sa transportasyon ng CSF kapag na-synthesize at nakagapos sa kargamento ng protina. Ang pagbigkis ng mga N-terminal biotinylated peptides sa SA ay mahalagang inuulit ang mga resultang nakuha gamit ang kani-kanilang mga phage clone sa dugo at cerebrospinal fluid (Fig. 3e). Panghuli, ipinapakita namin na ang lead peptide #2077 ay kayang itaguyod ang aksyon sa utak ng isang biotinylated peptide inhibitor ng BACE1 na naka-conjugate sa SA, na nagdudulot ng malinaw na pharmacodynamic effect sa CNS sa pamamagitan ng makabuluhang pagbabawas ng mga antas ng Abeta40 sa CSF (Fig. 4). Hindi namin natukoy ang anumang homologue sa database sa pamamagitan ng pagsasagawa ng peptide sequence homology search ng lahat ng hit. Mahalagang tandaan na ang laki ng T7 library ay humigit-kumulang 109, habang ang theoretical library size para sa 12-mers ay 4 x 1015. Samakatuwid, pumili lamang kami ng isang maliit na bahagi ng diversity space ng 12-mer peptide library, na maaaring mangahulugan na ang mas na-optimize na mga peptide ay maaaring matukoy sa pamamagitan ng pagsusuri sa katabing sequence space ng mga natukoy na hit na ito. Sa palagay ko, isa sa mga dahilan kung bakit wala pa kaming natagpuang natural na homologue ng mga peptide na ito ay maaaring ang deselection sa panahon ng ebolusyon upang maiwasan ang hindi makontrol na pagpasok ng ilang partikular na peptide motif sa utak.
Kung pagsasama-samahin, ang aming mga resulta ay nagbibigay ng batayan para sa mga susunod na gawain upang matukoy at makilala ang mga sistema ng transportasyon ng cerebrovascular barrier in vivo nang mas detalyado. Ang pangunahing pag-setup ng pamamaraang ito ay batay sa isang functional selection strategy na hindi lamang tumutukoy sa mga clone na may mga katangian ng cerebral vascular binding, kundi kabilang din ang isang kritikal na hakbang kung saan ang matagumpay na mga clone ay may intrinsic activity upang tumawid sa mga biological barrier in vivo papunta sa CNS compartment. Ito ay upang linawin ang mekanismo ng transportasyon ng mga peptide na ito at ang kanilang kagustuhan para sa pagbubuklod sa microvasculature na partikular sa rehiyon ng utak. Maaari itong humantong sa pagtuklas ng mga bagong pathway para sa transportasyon ng BBB at mga receptor. Inaasahan namin na ang mga natukoy na peptide ay maaaring direktang magbigkis sa mga cerebrovascular receptor o sa mga circulating ligand na dinadala sa pamamagitan ng BBB o BCSFB. Ang mga peptide vector na may aktibidad sa transportasyon ng CSF na natuklasan sa gawaing ito ay higit pang susuriin. Kasalukuyan naming sinisiyasat ang brain specificity ng mga peptide na ito para sa kanilang kakayahang tumawid sa BBB at/o BCSFB. Ang mga bagong peptide na ito ay magiging lubhang mahalagang kagamitan para sa potensyal na pagtuklas ng mga bagong receptor o pathway at para sa pagbuo ng mga bago at lubos na mahusay na plataporma para sa paghahatid ng mga macromolecule, tulad ng mga biologic, sa utak.
Isinailalim sa cannulation ang malaking cisterna (CM) gamit ang isang pagbabago sa naunang inilarawan na pamamaraan. Ang mga inanestesiyang Wistar na daga (200-350 g) ay ikinabit sa isang stereotaxic apparatus at isang median incision ang ginawa sa ibabaw ng inahit at aseptikong inihandang anit upang ilantad ang bungo. Magbutas ng dalawang butas sa bahagi ng itaas na sash at ikabit ang mga fixing screw sa mga butas. Isang karagdagang butas ang binutas sa lateral occipital crest para sa stereotactic guidance ng isang stainless steel cannula sa CM. Maglagay ng dental cement sa paligid ng cannula at ikabit gamit ang mga turnilyo. Pagkatapos ng photo-curing at pagpapatigas ng semento, ang sugat sa balat ay isinara gamit ang 4/0 supramid suture. Ang wastong pagkakalagay ng cannula ay kinukumpirma ng kusang pagtagas ng cerebrospinal fluid (CSF). Alisin ang daga mula sa stereotaxic apparatus, tumanggap ng naaangkop na postoperative care at pamamahala ng sakit, at hayaan itong gumaling nang hindi bababa sa isang linggo hanggang sa maobserbahan ang mga palatandaan ng dugo sa cerebrospinal fluid. Ang mga Wistar rats (Crl:WI/Han) ay nakuha mula sa Charles River (France). Ang lahat ng mga daga ay pinanatili sa ilalim ng mga partikular na kondisyon na walang pathogen. Ang lahat ng mga eksperimento sa hayop ay inaprubahan ng Beterinaryo ng Lungsod ng Basel, Switzerland, at isinagawa alinsunod sa Animal License No. 2474 (Pagtatasa ng Aktibong Transportasyon ng Utak sa pamamagitan ng Pagsukat ng mga Antas ng mga Therapeutic Candidate sa Cerebrospinal Fluid at Utak ng Daga).
Dahan-dahang panatilihing malay ang daga habang hawak ang CM cannula. Tanggalin ang Datura mula sa cannula at kumuha ng 10 µl ng kusang dumadaloy na cerebrospinal fluid. Dahil naapektuhan ang patency ng cannula, tanging ang malinaw na mga sample ng cerebrospinal fluid na walang ebidensya ng kontaminasyon ng dugo o pagkawalan ng kulay ang isinama sa pag-aaral na ito. Kasabay nito, humigit-kumulang 10-20 μl ng dugo ang kinuha mula sa isang maliit na hiwa sa dulo ng buntot papunta sa mga tubo na may heparin (Sigma-Aldrich). Ang CSF at dugo ay kinolekta sa iba't ibang oras pagkatapos ng intravenous injection ng T7 phage. Humigit-kumulang 5-10 μl ng likido ang itinapon bago ang bawat sample ng CSF na kinolekta, na katumbas ng dead volume ng catheter.
Ang mga library ay nabuo gamit ang T7Select 10-3b vector gaya ng inilarawan sa manwal ng sistema ng T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Sa madaling salita, isang random na 12-mer DNA insert ang na-synthesize sa sumusunod na format:
Ginamit ang NNK codon upang maiwasan ang mga double stop codon at labis na ekspresyon ng amino acid sa insert. Ang N ay isang manu-manong pinaghalong equimolar ratio ng bawat nucleotide, at ang K ay isang manu-manong pinaghalong equimolar ratio ng adenine at cytosine nucleotides. Ang mga single stranded na rehiyon ay ginawang double stranded DNA sa pamamagitan ng karagdagang incubation gamit ang dNTP (Novagen) at Klenow enzyme (New England Biolabs) sa Klenow buffer (New England Biolabs) sa loob ng 3 oras sa 37°C. Pagkatapos ng reaksyon, ang double-stranded na DNA ay nakuha sa pamamagitan ng EtOH precipitation. Ang nagresultang DNA ay dinurog gamit ang mga restriction enzyme na EcoRI at HindIII (parehong mula sa Roche). Ang cleaved at purified (QIAquick, Qiagen) insert (T4 ligase, New England Biolabs) ay pagkatapos ay ini-ligate in-frame sa isang pre-cleaved na T7 vector pagkatapos ng amino acid 348 ng 10B capsid gene. Ang mga reaksyon ng ligation ay in-incubate sa 16°C sa loob ng 18 oras bago ang in vitro packaging. Ang phage packaging in vitro ay isinagawa ayon sa mga tagubiling kasama ng T7Select 10-3b cloning kit (Novagen) at ang solusyon sa packaging ay pinalaki nang isang beses upang mag-lysis gamit ang Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Ang mga lysate ay sinentrifuga, tinitrate, at pinalamig sa -80° C bilang isang stock solution ng glycerol.
Direktang PCR amplification ng mga rehiyon ng phage variable na pinalaki sa broth o plate gamit ang proprietary 454/Roche-amplicon fusion primers. Ang forward fusion primer ay naglalaman ng mga sequence na nakapalibot sa variable region (NNK) 12 (template-specific), GS FLX Titanium Adapter A, at isang four-base library key sequence (TCAG) (Karagdagang Larawan 1a):
Ang reverse fusion primer ay naglalaman din ng biotin na nakakabit sa mga capture beads at ng GS FLX Titanium Adapter B na kinakailangan para sa clonal amplification habang isinasagawa ang emulsion PCR:
Ang mga amplicon ay isinailalim sa 454/Roche pyrosequencing ayon sa 454 GS-FLX Titanium protocol. Para sa manu-manong Sanger sequencing (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ang T7 phage DNA ay pinalaki sa pamamagitan ng PCR at sinundan ng sequence gamit ang mga sumusunod na pares ng primer:
Ang mga insert mula sa mga indibidwal na plake ay isinailalim sa PCR amplification gamit ang Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (ayon sa mga tagubilin ng gumawa). Magsagawa ng hot start (10 min sa 95 °C) at 35 boost cycle (50 s sa 95 °C, 1 min sa 50 °C, at 1 min sa 72 °C).
Ang mga phage mula sa mga library, wild-type phage, phage na nailigtas mula sa CSF at dugo, o mga indibidwal na clone ay pinalaki sa Escherichia coli BL5615 sa TB broth (Sigma Aldrich) o sa 500 cm2 dish (Thermo Scientific) sa loob ng 4 na oras sa 37°C. Ang mga phage ay kinuha mula sa mga plate sa pamamagitan ng pagbabanlaw sa mga plate gamit ang Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical) o sa pamamagitan ng pagkolekta ng mga plaque gamit ang mga sterile pipette tip. Ang mga phage ay inihiwalay mula sa culture supernatant o extraction buffer gamit ang isang round ng polyethylene glycol (PEG 8000) precipitation (Promega) at muling isinalin sa Tris-EDTA buffer.
Ang pinalakas na phage ay isinailalim sa 2-3 rounds ng pag-alis ng endotoxin gamit ang mga endotoxin removal beads (Miltenyi Biotec) bago ang intravenous (IV) injection (500 μl/hayop). Sa unang round, ipinakilala ang 2×1012 phages; sa pangalawa, 2×1010 phages; sa pangatlo at pang-apat na selection rounds, 2×109 phages bawat hayop. Ang nilalaman ng phage sa CSF at mga sample ng dugo na nakolekta sa mga ipinahiwatig na oras ay natukoy sa pamamagitan ng pagbibilang ng plake ayon sa mga tagubilin ng tagagawa (T7Select system manual). Ang pagpili ng phage ay isinagawa sa pamamagitan ng intravenous injection ng mga purified library sa ugat ng buntot o sa pamamagitan ng muling pag-iniksyon ng phage na kinuha mula sa CSF mula sa nakaraang selection round, at ang mga kasunod na pag-aani ay isinagawa sa loob ng 10 minuto, 30 minuto, 60 minuto, 90 minuto, 120 minuto, 180 minuto, at 240 minuto ayon sa pagkakabanggit. Isang kabuuang apat na round ng in vivo panning ang isinagawa kung saan ang dalawang napiling sanga ay magkahiwalay na iniimbak at sinuri sa unang tatlong round ng pagpili. Lahat ng phage inserts na kinuha mula sa CSF mula sa unang dalawang round ng pagpili ay isinailalim sa 454/Roche pyrosequencing, habang lahat ng clone na kinuha mula sa CSF mula sa huling dalawang round ng pagpili ay manu-manong sinuri ang pagkakasunod-sunod. Lahat ng blood phage mula sa unang round ng pagpili ay isinailalim din sa 454/Roche pyrosequencing. Para sa pag-iniksyon ng mga phage clone, ang mga napiling phage ay pinalaki sa E. coli (BL5615) sa 500 cm2 plates sa 37°C sa loob ng 4 na oras. Ang mga indibidwal na napili at manu-manong sinuri ang pagkakasunod-sunod ng mga clone ay pinarami sa TB medium. Pagkatapos ng phage extraction, purification at pag-alis ng endotoxin (tulad ng inilarawan sa itaas), 2×1010 phage/hayop sa 300 μl ay ini-inject nang intravenously sa isang tail vein.
Paunang pagproseso at kwalitatibong pagsala ng datos ng sequence. Ang hilaw na datos ng 454/Roche ay na-convert mula sa isang binary standard stream map format (sff) patungo sa isang Pearson human readable format (fasta) gamit ang vendor software. Ang karagdagang pagproseso ng sequence ng nucleotide ay isinagawa gamit ang mga proprietary C program at script (unreleased software package) gaya ng inilarawan sa ibaba. Ang pagsusuri ng pangunahing datos ay kinabibilangan ng mahigpit na multi-stage filtering procedures. Upang masala ang mga read na hindi naglalaman ng wastong 12mer insert DNA sequence, ang mga read ay sunud-sunod na inayos sa start label (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stop label (TAAGCTTGCGGCCGCCACTCGAGTA) at background insert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGAC) gamit ang global Needleman-Wunsch test. alignment na nagpapahintulot ng hanggang 2 inconsistencies bawat alignment31. Samakatuwid, ang mga read na walang start at stop tag at mga read na naglalaman ng mga background insert, ibig sabihin, mga alignment na lumalagpas sa pinapayagang bilang ng mga mismatch, ay inalis mula sa library. Para sa mga natitirang reads, ang N-mer DNA sequence na nagmumula sa start mark at nagtatapos bago ang stop mark ay tinanggal mula sa orihinal na read sequence at pinoproseso pa (mula rito ay tatawaging "insert"). Pagkatapos ng pagsasalin ng insert, ang bahagi pagkatapos ng unang stop codon sa 5′ na dulo ng primer ay inalis mula sa insert. Bukod pa rito, ang mga nucleotide na humahantong sa mga hindi kumpletong codon sa 3′ na dulo ng primer ay inalis din. Upang ibukod ang mga insert na naglalaman lamang ng mga background sequence, ang mga translated insert na nagsisimula sa amino acid pattern na "PAG" ay inalis din. Ang mga peptide na may post-translational length na mas mababa sa 3 amino acid ay inalis mula sa library. Panghuli, inalis ang redundancy sa insert pool at tinutukoy ang frequency ng bawat natatanging insert. Kasama sa mga resulta ng pagsusuring ito ang isang listahan ng mga nucleotide sequence (inserts) at ang kanilang (read) na mga frequency (Mga Karagdagang Larawan 1c at 2).
Mga pagsingit ng DNA ng Group N-mer ayon sa pagkakatulad ng sequence: Upang maalis ang mga error sa sequencing na 454/Roche-specific (tulad ng mga problema sa mga extension ng homopolymer sa sequencing) at alisin ang mga hindi gaanong mahahalagang kalabisan, ang mga dating na-filter na pagsingit ng sequence ng DNA ng N-mer (mga pagsingit) ay inaayos ayon sa pagkakatulad. mga pagsingit (hanggang 2 hindi magkatugmang base ang pinapayagan) gamit ang isang iterative algorithm na tinukoy bilang sumusunod: ang mga pagsingit ay inaayos muna ayon sa kanilang dalas (pinakamataas hanggang pinakamababa), at kung pareho sila, ayon sa kanilang pangalawang pag-uuri ayon sa haba (pinakamahaba hanggang pinakamaikli)). Kaya, ang pinakamadalas at pinakamahabang pagsingit ay tumutukoy sa unang "grupo". Ang dalas ng grupo ay itinatakda sa key frequency. Pagkatapos, ang bawat pagsingit na natitira sa listahan ng inayos ay sinubukang idagdag sa grupo sa pamamagitan ng pairwise Needleman-Wunsch alignment. Kung ang bilang ng mga hindi pagtutugma, pagsingit, o pagtanggal sa isang alignment ay hindi lalampas sa isang threshold na 2, isang pagsingit ang idinaragdag sa grupo, at ang pangkalahatang dalas ng grupo ay pinapataas ayon sa kung gaano kadalas idinagdag ang pagsingit. Ang mga pagsingit na idinagdag sa isang grupo ay minarkahan bilang ginamit at hindi kasama sa karagdagang pagproseso. Kung ang insert sequence ay hindi maidaragdag sa isang umiiral nang grupo, ang insert sequence ay ginagamit upang lumikha ng isang bagong grupo na may naaangkop na insert frequency at minarkahan bilang nagamit na. Ang iteration ay nagtatapos kapag ang bawat insertion sequence ay ginamit na upang bumuo ng isang bagong grupo o maaaring maisama sa isang umiiral nang grupo. Tutal, ang mga naka-grupong insert na binubuo ng mga nucleotide ay kalaunan ay isinasalin sa mga peptide sequence (peptide libraries). Ang resulta ng pagsusuring ito ay isang hanay ng mga insertion at ang kanilang mga kaukulang frequency na bumubuo sa bilang ng magkakasunod na reads (Karagdagang Larawan 2).
Pagbuo ng Motibo: Batay sa isang listahan ng mga natatanging peptide, isang library ang nilikha na naglalaman ng lahat ng posibleng mga pattern ng amino acid (aa) gaya ng ipinapakita sa ibaba. Ang bawat posibleng pattern na may haba na 3 ay kinuha mula sa peptide at ang kabaligtaran nitong pattern ay idinagdag kasama ang isang karaniwang library ng motif na naglalaman ng lahat ng mga pattern (tripeptide). Ang mga library ng mga paulit-ulit na motif ay sinundan at inalis ang redundancy. Pagkatapos, para sa bawat tripeptide sa library ng motif, sinuri namin ang presensya nito sa library gamit ang mga computational tool. Sa kasong ito, ang dalas ng peptide na naglalaman ng natagpuang motif tripeptide ay idinaragdag at itinalaga sa motif sa library ng motif ("bilang ng mga motif"). Ang resulta ng pagbuo ng motif ay isang two-dimensional array na naglalaman ng lahat ng paglitaw ng mga tripeptide (motif) at ang kani-kanilang mga halaga, na siyang bilang ng mga sequencing read na nagreresulta sa kaukulang motif kapag ang mga read ay sinala, pinagsama-sama, at isinalin. Mga sukatan gaya ng detalyadong inilarawan sa itaas.
Normalisasyon ng bilang ng mga motif at kaukulang scatterplots: Ang bilang ng mga motif para sa bawat sample ay na-normalize gamit ang
kung saan ang ni ay ang bilang ng mga nabasa na naglalaman ng paksang i. Kaya, ang vi ay kumakatawan sa porsyento ng dalas ng mga nabasa (o peptide) na naglalaman ng motif i sa sample. Ang mga P-value para sa hindi normalized na bilang ng mga motif ay kinalkula gamit ang eksaktong pagsubok ni Fisher. Tungkol sa mga correlogram ng bilang ng mga motif, ang mga korelasyon ni Spearman ay kinalkula gamit ang normalized na bilang ng mga motif na may R.
Upang mailarawan ang nilalaman ng mga amino acid sa bawat posisyon sa peptide library, nilikha ang mga web logogram 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Una, ang nilalaman ng mga amino acid sa bawat posisyon ng 12-mer peptide ay iniimbak sa isang 20×12 matrix. Pagkatapos, isang set ng 1000 peptide na naglalaman ng parehong relatibong nilalaman ng amino acid sa bawat posisyon ang binuo sa fasta-sequence format at ibinigay bilang input sa web-logo 3, na bumubuo ng isang graphical na representasyon ng relatibong nilalaman ng amino acid sa bawat posisyon para sa isang partikular na peptide library. Upang mailarawan ang mga multidimensional dataset, nilikha ang mga heat map gamit ang isang internally developed tool sa R ​​(biosHeatmap, isang R package na hindi pa nailalabas). Ang mga dendrogram na ipinakita sa mga heat map ay kinalkula gamit ang hierarchical clustering method ni Ward gamit ang Euclidean distance metric. Para sa statistical analysis ng motif scoring data, ang mga P value para sa unnormalized scoring ay kinalkula gamit ang Fisher's exact test. Ang mga P-value para sa iba pang mga dataset ay kinalkula sa R ​​gamit ang Student's t-test o ANOVA.
Ang mga piling phage clone at phage na walang inserts ay tinurukan nang intravenous sa pamamagitan ng tail vein (2×1010 phages/hayop sa 300 μl PBS). Sampung minuto bago ang perfusion at kasunod na fixation, ang parehong mga hayop ay tinurukan nang intravenous ng 100 μl ng DyLight594-labeled lectin (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minuto pagkatapos ng phage injection, ang mga daga ay tinurukan ng 50 ml PBS sa puso na sinundan ng 50 ml 4% PFA/PBS. Ang mga sample ng utak ay inayos din magdamag sa 4% PFA/PBS at ibinabad sa 30% sucrose magdamag sa 4°C. Ang mga sample ay flash frozen sa OCT mixture. Isinagawa ang immunohistochemical analysis ng mga nakapirming sample sa temperatura ng silid sa 30 µm cryosections na hinarangan ng 1% BSA at in-incubate gamit ang polyclonal FITC-labeled antibodies laban sa T7 phage (Novus NB 600-376A) sa 4 °C. Incubate magdamag. Panghuli, ang mga seksyon ay hinugasan ng 3 beses gamit ang PBS at sinuri gamit ang confocal laser microscope (Leica TCS SP5).
Lahat ng peptide na may minimum na kadalisayan na 98% ay na-synthesize gamit ang GenScript USA, na-biotinylate at na-lyophilize. Ang biotin ay pinagbuklod sa pamamagitan ng isang karagdagang triple glycine spacer sa N-terminus. Suriin ang lahat ng peptide gamit ang mass spectrometry.
Ang Streptavidin (Sigma S0677) ay hinaluan ng 5-fold equimolar excess ng biotinylated peptide, biotinylated BACE1 inhibitory peptide, o isang kombinasyon (3:1 ratio) ng biotinylated BACE1 inhibitory peptide at BACE1 inhibitory peptide sa 5–10% DMSO/incubated sa PBS. 1 oras sa temperatura ng silid bago ang iniksyon. Ang mga peptide na may Streptavidin ay iniksyon sa pamamagitan ng intravenous sa dosis na 10 mg/kg sa isa sa mga ugat sa buntot ng mga daga na may cerebral cavity.
Ang konsentrasyon ng mga streptavidin-peptide complex ay tinasa gamit ang ELISA. Ang mga Nunc Maxisorp microtiter plate (Sigma) ay pinahiran nang magdamag sa 4°C ng 1.5 μg/ml mouse anti-streptavidin antibody (Thermo, MA1-20011). Pagkatapos ng pagharang (blocking buffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) sa temperatura ng silid sa loob ng 2 oras, hugasan ang plato gamit ang 0.05% Tween-20/PBS (wash buffer) sa loob ng 3 segundo, ang mga sample ng CSF at plasma ay idinagdag sa mga balon na diluted na may blocking buffer (plasma 1:10,000, CSF 1:115). Ang plato ay pagkatapos ay in-incubate nang magdamag sa 4°C gamit ang detection antibody (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Pagkatapos ng tatlong hakbang sa paghuhugas, ang streptavidin ay natukoy sa pamamagitan ng inkubasyon sa TMB substrate solution (Roche) nang hanggang 20 minuto. Matapos ihinto ang pagbuo ng kulay gamit ang 1M H2SO4, sukatin ang absorbance sa 450 nm.
Ang tungkulin ng streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor complex ay tinasa gamit ang Aβ(1-40) ELISA ayon sa protocol ng gumawa (Wako, 294-64701). Sa madaling salita, ang mga sample ng CSF ay diluted sa standard diluent (1:23) at in-incubate magdamag sa 4°C sa 96-well plates na pinahiran ng BNT77 capture antibody. Pagkatapos ng limang hakbang sa paghuhugas, idinagdag ang HRP-conjugated BA27 antibody at in-incubate sa loob ng 2 oras sa 4°C, na sinundan ng limang hakbang sa paghuhugas. Ang Aβ(1–40) ay na-detect sa pamamagitan ng incubation sa TMB solution sa loob ng 30 minuto sa temperatura ng silid. Matapos matigil ang pag-unlad ng kulay gamit ang stop solution, sukatin ang absorbance sa 450 nm. Ang mga plasma sample ay isinailalim sa solid phase extraction bago ang Aβ(1–40) ELISA. Ang plasma ay idinagdag sa 0.2% DEA (Sigma) sa 96-well plates at in-incubate sa temperatura ng silid sa loob ng 30 minuto. Matapos ang sunod-sunod na paghuhugas ng mga SPE plate (Oasis, 186000679) gamit ang tubig at 100% methanol, idinagdag ang mga plasma sample sa mga SPE plate at inalis ang lahat ng likido. Ang mga sample ay hinugasan (una gamit ang 5% methanol pagkatapos ay 30% methanol) at ni-elute gamit ang 2% NH4OH/90% methanol. Matapos matuyo ang eluate sa 55°C sa loob ng 99 minuto sa constant N2 current, ang mga sample ay binawasan sa standard diluents at ang Aβ(1–40) ay sinukat gaya ng inilarawan sa itaas.
Paano banggitin ang artikulong ito: Urich, E. et al. Paghahatid ng kargamento sa utak gamit ang mga transit peptide na kinilala in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB at Moos T. Paghahatid ng mga macromolecular na gamot sa utak gamit ang naka-target na therapy. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., at Martinez-Martinez, P. Paghahatid ng mga gamot na peptide at protina sa kabila ng blood-brain barrier. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Ang harang sa pagitan ng dugo at utak: isang hadlang sa pagbuo ng gamot sa utak. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, at Byrd, A. Mga inaasahan para sa pinahusay na paghahatid ng gamot at pag-target sa utak sa pamamagitan ng choroid plexus-CSF pathway. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisasyon ng mga biopharmaceutical gamit ang mga molecular Trojan horse para sa paghahatid ng utak. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptor-mediated peptide transport sa blood-brain barrier. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Pagtaas ng pagtagos sa utak at bisa ng mga therapeutic antibodies gamit ang monovalent molecular shuttles. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Ang transportasyon ng transferrin receptor (TfR) ay tumutukoy sa pagsipsip ng utak ng mga affinity variant ng mga TfR antibodies. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).