Nature.com-এ আসার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি এমন একটি ব্রাউজার সংস্করণ ব্যবহার করছেন যেখানে CSS সাপোর্ট সীমিত। সর্বোত্তম অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি হালনাগাদ ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে কম্প্যাটিবিলিটি মোড নিষ্ক্রিয় করুন)। এছাড়াও, নিরবচ্ছিন্ন সাপোর্ট নিশ্চিত করার জন্য, আমরা সাইটটি স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই প্রদর্শন করছি।
একসাথে তিনটি স্লাইডের একটি ক্যারোসেল প্রদর্শন করে। একবারে তিনটি স্লাইডের মধ্যে দিয়ে যাওয়ার জন্য আগের এবং পরের বাটনগুলো ব্যবহার করুন, অথবা শেষে থাকা স্লাইডার বাটনগুলো ব্যবহার করে একবারে তিনটি স্লাইডের মধ্যে দিয়ে যান।
রক্ত-মস্তিষ্ক প্রতিবন্ধক (Blood-Brain Barrier) বায়োথেরাপিউটিক এজেন্টগুলোকে কেন্দ্রীয় স্নায়ুতন্ত্রে তাদের লক্ষ্যস্থলে পৌঁছাতে বাধা দেয়, যার ফলে স্নায়বিক রোগের কার্যকর চিকিৎসা ব্যাহত হয়। ইন ভিভো (in vivo) পদ্ধতিতে নতুন মস্তিষ্ক পরিবাহক (brain transporters) আবিষ্কার করার জন্য, আমরা একটি T7 ফাজ পেপটাইড লাইব্রেরি প্রবেশ করাই এবং ক্যানুলেটেড সচেতন ইঁদুরের বৃহৎ পুল মডেল ব্যবহার করে ধারাবাহিকভাবে রক্ত ​​এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (CSF) সংগ্রহ করি। চার দফা নির্বাচনের পর নির্দিষ্ট ফাজ ক্লোনগুলো CSF-এ উচ্চ মাত্রায় সমৃদ্ধ হয়েছিল। প্রতিটি ক্যান্ডিডেট পেপটাইডের পরীক্ষায় দেখা গেছে যে CSF-এ এগুলোর পরিমাণ ১০০০ গুণেরও বেশি বৃদ্ধি পেয়েছে। শনাক্তকৃত নতুন ট্রানজিট পেপটাইডের সাথে সংযুক্ত একটি BACE1 পেপটাইড ইনহিবিটর ব্যবহার করে সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে অ্যামাইলয়েড-β-এর মাত্রা ৪০% হ্রাস পাওয়ার মাধ্যমে মস্তিষ্কে পেপটাইড-মধ্যস্থ ডেলিভারির জৈব-সক্রিয়তা নিশ্চিত করা হয়। এই ফলাফলগুলো ইঙ্গিত দেয় যে ইন ভিভো ফাজ নির্বাচন পদ্ধতির মাধ্যমে শনাক্তকৃত পেপটাইডগুলো মস্তিষ্কে ম্যাক্রোমলিকিউলগুলোর সিস্টেমিক ডেলিভারির জন্য কার্যকর বাহক হতে পারে, যা চিকিৎসাগত প্রভাব ফেলবে।
কেন্দ্রীয় স্নায়ুতন্ত্র (CNS) লক্ষ্য করে চিকিৎসা গবেষণার মূল লক্ষ্য ছিল মূলত CNS-কে লক্ষ্য করে কাজ করতে পারে এমন উন্নত ওষুধ ও উপাদান শনাক্ত করা, এবং মস্তিষ্কে সক্রিয়ভাবে ওষুধ পৌঁছে দেওয়ার প্রক্রিয়া আবিষ্কারের ওপর কম মনোযোগ দেওয়া হয়েছে। এখন এই অবস্থার পরিবর্তন হতে শুরু করেছে, কারণ ওষুধ পৌঁছে দেওয়া, বিশেষ করে বড় অণুর ক্ষেত্রে, আধুনিক স্নায়ুবিজ্ঞানের ওষুধ উন্নয়নের একটি অবিচ্ছেদ্য অংশ। কেন্দ্রীয় স্নায়ুতন্ত্রের পরিবেশ সেরিব্রোভাসকুলার ব্যারিয়ার সিস্টেম দ্বারা সুরক্ষিত, যা ব্লাড-ব্রেইন ব্যারিয়ার (BBB) ​​এবং ব্লাড-ব্রেইন ব্যারিয়ার (BCBB)¹ দ্বারা গঠিত, ফলে মস্তিষ্কে ওষুধ পৌঁছে দেওয়া বেশ কঠিন হয়ে পড়ে¹,²। ধারণা করা হয় যে, প্রায় সমস্ত বড় অণুর ওষুধ এবং ৯৮%-এরও বেশি ছোট অণুর ওষুধ মস্তিষ্ক থেকে নিষ্কাশিত হয়ে যায়³। একারণেই নতুন মস্তিষ্ক পরিবহন ব্যবস্থা শনাক্ত করা অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ, যা CNS-এ চিকিৎসাগত ওষুধের কার্যকর এবং সুনির্দিষ্ট সরবরাহ নিশ্চিত করবে⁴,⁵। তবে, BBB এবং BCSFB ওষুধ পৌঁছে দেওয়ার জন্য একটি চমৎকার সুযোগও তৈরি করে, কারণ এগুলো মস্তিষ্কের বিস্তৃত রক্তনালীর মাধ্যমে এর সমস্ত কাঠামোতে প্রবেশ করে। সুতরাং, মস্তিষ্কে ওষুধ পৌঁছে দেওয়ার জন্য নন-ইনভেসিভ পদ্ধতি ব্যবহারের বর্তমান প্রচেষ্টাগুলো মূলত এন্ডোজেনাস BBB6 রিসেপ্টর ব্যবহার করে রিসেপ্টর-মিডিয়েটেড ট্রান্সপোর্ট (PMT) প্রক্রিয়ার উপর ভিত্তি করে গড়ে উঠেছে। ট্রান্সফেরিন রিসেপ্টর পাথওয়ে ব্যবহার করে সাম্প্রতিক গুরুত্বপূর্ণ অগ্রগতি সত্ত্বেও7,8, উন্নত বৈশিষ্ট্যসম্পন্ন নতুন ডেলিভারি সিস্টেমের আরও উন্নয়ন প্রয়োজন। এই লক্ষ্যে, আমাদের উদ্দেশ্য ছিল এমন পেপটাইড শনাক্ত করা যা CSF পরিবহনে মধ্যস্থতা করতে সক্ষম, কারণ এগুলো নীতিগতভাবে CNS-এ ম্যাক্রোমলিকিউল পৌঁছে দিতে বা নতুন রিসেপ্টর পাথওয়ে খুলতে ব্যবহার করা যেতে পারে। বিশেষ করে, সেরিব্রোভাসকুলার সিস্টেমের (BBB এবং BSCFB) নির্দিষ্ট রিসেপ্টর এবং ট্রান্সপোর্টারগুলো বায়োথেরাপিউটিক ওষুধের সক্রিয় এবং নির্দিষ্ট ডেলিভারির জন্য সম্ভাব্য লক্ষ্যবস্তু হিসেবে কাজ করতে পারে। সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (CSF) হলো কোরয়েড প্লেক্সাস (CS)-এর একটি নিঃসৃত পদার্থ এবং এটি সাবঅ্যারাকনয়েড স্পেস ও ভেন্ট্রিকুলার স্পেসের মাধ্যমে মস্তিষ্কের ইন্টারস্টিশিয়াল ফ্লুইডের সাথে সরাসরি সংস্পর্শে থাকে4। সম্প্রতি দেখা গেছে যে সাবঅ্যারাকনয়েড সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড মস্তিষ্কের ইন্টারস্টিশিয়ামে অতিরিক্ত পরিমাণে ছড়িয়ে পড়ে9। আমরা এই সাবঅ্যারাকনয়েড ইনফ্লো ট্র্যাক্ট ব্যবহার করে অথবা সরাসরি BBB-এর মাধ্যমে প্যারেনকাইমাল স্পেসে প্রবেশ করার আশা করি। এটি অর্জন করার জন্য, আমরা একটি শক্তিশালী ইন ভিভো ফেজ সিলেকশন কৌশল প্রয়োগ করেছি যা আদর্শগতভাবে এই দুটি স্বতন্ত্র পথের যেকোনো একটি দ্বারা পরিবাহিত পেপটাইডগুলিকে শনাক্ত করে।
আমরা এখন একটি অনুক্রমিক ইন ভিভো ফেজ ডিসপ্লে স্ক্রিনিং পদ্ধতির বর্ণনা দিচ্ছি, যেখানে সর্বোচ্চ লাইব্রেরি বৈচিত্র্য সহ প্রাথমিক নির্বাচন পর্বগুলো পর্যবেক্ষণের জন্য সিএসএফ স্যাম্পলিং-এর সাথে হাই থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং (এইচটিএস) সংযুক্ত করা হয়েছে। রক্তের দূষণ এড়াতে, স্ক্রিনিংটি সচেতন ইঁদুরের উপর করা হয়েছিল, যাদের দেহে একটি স্থায়ীভাবে স্থাপিত লার্জ সিস্টারনা (সিএম) ক্যানুলা ছিল। গুরুত্বপূর্ণভাবে, এই পদ্ধতিটি মস্তিষ্ক-লক্ষ্যকারী এবং সেরিব্রোভাসকুলার বাধা অতিক্রম করতে সক্ষম পেপটাইড উভয়কেই নির্বাচন করে। আমরা টি৭ ফেজ ব্যবহার করেছি তাদের ছোট আকারের (~৬০ এনএম)¹⁰ কারণে এবং এটি প্রস্তাব করা হয়েছিল যে তারা এমন ভেসিকল পরিবহনের জন্য উপযুক্ত যা এন্ডোথেলিয়াল এবং/অথবা এপিথেলিয়াল-মেডুলা বাধা অতিক্রম করতে পারে। প্যানিং-এর চারটি পর্বের পর, ফেজ পপুলেশনগুলোকে পৃথক করা হয়েছিল যা শক্তিশালী ইন ভিভো সিএসএফ সমৃদ্ধি এবং সেরিব্রাল মাইক্রোভেসেল সংযোগ প্রদর্শন করে। গুরুত্বপূর্ণভাবে, আমরা আমাদের ফলাফল নিশ্চিত করতে সক্ষম হয়েছি এই প্রমাণ করে যে, পছন্দের এবং রাসায়নিকভাবে সংশ্লেষিত সেরা ক্যান্ডিডেট পেপটাইডগুলো সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে প্রোটিন কার্গো পরিবহন করতে সক্ষম। প্রথমত, একটি অগ্রণী ট্রানজিট পেপটাইডের সাথে BACE1 পেপটাইডের একটি ইনহিবিটরকে একত্রিত করে কেন্দ্রীয় স্নায়ুতন্ত্রের (CNS) ফার্মাকোডাইনামিক প্রভাবগুলো প্রতিষ্ঠা করা হয়েছিল। ইন ভিভো ফাংশনাল স্ক্রিনিং কৌশলগুলো যে নতুন ব্রেন ট্রান্সপোর্ট পেপটাইডকে কার্যকর প্রোটিন কার্গো বাহক হিসেবে শনাক্ত করতে পারে, তা প্রদর্শনের পাশাপাশি আমরা আশা করি যে, অনুরূপ ফাংশনাল সিলেকশন পদ্ধতিগুলো নতুন ব্রেন ট্রান্সপোর্ট পাথওয়ে শনাক্ত করার ক্ষেত্রেও গুরুত্বপূর্ণ হয়ে উঠবে।
প্লেক-ফর্মিং ইউনিট (PFU)-এর উপর ভিত্তি করে, ফাজ প্যাকেজিং ধাপের পরে, প্রায় ১০৯-এর বৈচিত্র্য সহ র‍্যান্ডম ১২-মার লিনিয়ার T7 ফাজ পেপটাইডের একটি লাইব্রেরি ডিজাইন ও তৈরি করা হয়েছিল (উপকরণ ও পদ্ধতি দেখুন)। এটি উল্লেখ করা গুরুত্বপূর্ণ যে আমরা ইন ভিভো প্যানিং-এর আগে এই লাইব্রেরিটি সতর্কতার সাথে বিশ্লেষণ করেছি। পরিবর্তিত প্রাইমার ব্যবহার করে ফাজ লাইব্রেরির নমুনাগুলির PCR অ্যামপ্লিফিকেশনের ফলে এমন অ্যামপ্লিকন তৈরি হয়েছিল যা সরাসরি HTS-এর জন্য প্রযোজ্য ছিল (পরিপূরক চিত্র ১ক)। ক) HTS11 সিকোয়েন্সিং ত্রুটি, খ) প্রাইমার (NNK)1-12-এর গুণমানের উপর প্রভাব, এবং গ) স্ট্যান্ডবাই লাইব্রেরিতে ওয়াইল্ড-টাইপ (wt) ফাজের (স্কেলিটন ইনসার্ট) উপস্থিতির কারণে, শুধুমাত্র যাচাইকৃত সিকোয়েন্স তথ্য নিষ্কাশন করার জন্য একটি সিকোয়েন্স ফিল্টারিং পদ্ধতি প্রয়োগ করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র ১খ)। এই ফিল্টার ধাপগুলি সমস্ত HTS সিকোয়েন্সিং লাইব্রেরির জন্য প্রযোজ্য। স্ট্যান্ডার্ড লাইব্রেরির জন্য মোট ২৩৩,৮৬৮টি রিড পাওয়া গিয়েছিল, যার মধ্যে ৩৯% ফিল্টার মানদণ্ড উত্তীর্ণ হয়েছিল এবং পরবর্তী রাউন্ডের জন্য লাইব্রেরি বিশ্লেষণ ও নির্বাচনের কাজে ব্যবহৃত হয়েছিল (পরিশিষ্ট চিত্র ১গ–ঙ)। রিডগুলো দৈর্ঘ্যে প্রধানত ৩ বেস পেয়ারের গুণিতক ছিল এবং ৩৬ নিউক্লিওটাইডে এর সর্বোচ্চ মান দেখা যায় (পরিশিষ্ট চিত্র ১গ), যা লাইব্রেরি ডিজাইন (NNK) ১-১২-কে নিশ্চিত করে। উল্লেখযোগ্যভাবে, লাইব্রেরির প্রায় ১১% সদস্যের মধ্যে একটি ১২-মাত্রিক ওয়াইল্ড-টাইপ (wt) ব্যাকবোন PAGISRELVDKL ইনসার্ট ছিল এবং প্রায় অর্ধেক সিকোয়েন্সে (৪৯%) ইনসারশন বা ডিলিশন ছিল। লাইব্রেরির HTS (হাই-ট্রান্সলেশনাল সিকোয়েন্স অ্যানালাইসিস) লাইব্রেরিতে থাকা পেপটাইডগুলোর উচ্চ বৈচিত্র্য নিশ্চিত করেছে: ৮১%-এর বেশি পেপটাইড সিকোয়েন্স শুধুমাত্র একবার পাওয়া গেছে এবং মাত্র ১.৫% ≥৪টি কপিতে পাওয়া গেছে (পরিশিষ্ট চিত্র ২ক)। রেপার্টরি-র সমস্ত ১২টি অবস্থানে অ্যামিনো অ্যাসিড (aa)-এর ফ্রিকোয়েন্সি, ডিজেনারেট NKK রেপার্টরি দ্বারা উৎপন্ন কোডনের সংখ্যার জন্য প্রত্যাশিত ফ্রিকোয়েন্সির সাথে ভালোভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল (পরিপূরক চিত্র 2b)। এই ইনসার্টগুলি দ্বারা এনকোড করা aa রেসিডিউগুলির পর্যবেক্ষিত ফ্রিকোয়েন্সি, গণনা করা ফ্রিকোয়েন্সির সাথে ভালোভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল (r = 0.893) (পরিপূরক চিত্র 2c)। ইনজেকশনের জন্য ফাজ লাইব্রেরি তৈরির মধ্যে অ্যামপ্লিফিকেশন এবং এন্ডোটক্সিন অপসারণের ধাপগুলি অন্তর্ভুক্ত। পূর্বে দেখানো হয়েছে যে এটি ফাজ লাইব্রেরির বৈচিত্র্য সম্ভাব্যভাবে হ্রাস করতে পারে¹²,¹³। অতএব, আমরা এন্ডোটক্সিন অপসারণ করা একটি প্লেট-অ্যামপ্লিফাইড ফাজ লাইব্রেরির সিকোয়েন্সিং করেছি এবং AA-এর ফ্রিকোয়েন্সি অনুমান করার জন্য এটিকে মূল লাইব্রেরির সাথে তুলনা করেছি। মূল পুল এবং অ্যামপ্লিফাইড ও পিউরিফাইড পুলের মধ্যে একটি শক্তিশালী সম্পর্ক (r = 0.995) পরিলক্ষিত হয়েছে (পরিপূরক চিত্র 2d), যা নির্দেশ করে যে T7 ফাজ ব্যবহার করে প্লেটে অ্যামপ্লিফাইড ক্লোনগুলির মধ্যে প্রতিযোগিতা বড় ধরনের পক্ষপাতিত্ব সৃষ্টি করেনি। এই তুলনাটি প্রতিটি লাইব্রেরিতে ট্রাইপেপটাইড মোটিফের উপস্থিতির উপর ভিত্তি করে করা হয়েছে, কারণ HTS ব্যবহার করেও লাইব্রেরিগুলোর (~১০৯) বৈচিত্র্য সম্পূর্ণরূপে তুলে ধরা সম্ভব নয়। প্রতিটি অবস্থানে অ্যামিনো অ্যাসিডের উপস্থিতি বিশ্লেষণ করে দেখা গেছে যে, অন্তর্ভুক্ত রেপার্টরিটির শেষ তিনটি অবস্থানে একটি সামান্য অবস্থান-নির্ভর পক্ষপাতিত্ব রয়েছে (পরিপূরক চিত্র ২e)। পরিশেষে, আমরা এই সিদ্ধান্তে উপনীত হয়েছি যে লাইব্রেরির গুণমান এবং বৈচিত্র্য গ্রহণযোগ্য ছিল এবং নির্বাচনের বিভিন্ন পর্যায়ের মধ্যে ফাজ লাইব্রেরির বিবর্ধন ও প্রস্তুতির কারণে বৈচিত্র্যে শুধুমাত্র সামান্য পরিবর্তন পরিলক্ষিত হয়েছে।
সচেতন ইঁদুরের সেরিব্রোস্পাইনাল মেমব্রেনে (CM) অস্ত্রোপচারের মাধ্যমে একটি ক্যানুলা স্থাপন করে সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডের ধারাবাহিক নমুনা সংগ্রহ করা যেতে পারে, যা ব্লাড-ব্রেইন ব্যারিয়ার (BBB) ​​এবং/অথবা ব্লাড-ব্রেইন সিএসএফবি (BCSFB) এর মাধ্যমে শিরায় (iv) ইনজেকশন দেওয়া T7 ফাজের শনাক্তকরণকে সহজতর করে (চিত্র 1a-b)। আমরা ইন ভিভো সিলেকশনের প্রথম তিনটি রাউন্ডে দুটি স্বাধীন সিলেকশন আর্ম (আর্ম A এবং B) ব্যবহার করেছি (চিত্র 1c)। আমরা সিলেকশনের প্রথম তিনটি রাউন্ডে প্রবেশ করানো ফাজের মোট পরিমাণ কমিয়ে সিলেকশনের কঠোরতা ক্রমান্বয়ে বাড়িয়েছি। প্যানিং-এর চতুর্থ রাউন্ডের জন্য, আমরা A এবং B শাখা থেকে নমুনা একত্রিত করে আরও তিনটি স্বাধীন সিলেকশন সম্পন্ন করেছি। এই মডেলে T7 ফাজ কণার ইন ভিভো বৈশিষ্ট্য অধ্যয়নের জন্য, ওয়াইল্ড-টাইপ ফাজ (PAGISRELVDKL মাস্টার ইনসার্ট) ইঁদুরের লেজের শিরা দিয়ে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। বিভিন্ন সময়ে সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড এবং রক্ত ​​থেকে ফাজ পুনরুদ্ধারের মাধ্যমে দেখা গেছে যে তুলনামূলকভাবে ছোট T7 আইকোসাহেড্রাল ফাজগুলোর রক্ত ​​বিভাগ থেকে একটি দ্রুত প্রাথমিক নিষ্কাশন পর্যায় ছিল (পরিপূরক চিত্র 3)। প্রয়োগকৃত টাইটার এবং ইঁদুরগুলোর রক্তের পরিমাণের উপর ভিত্তি করে আমরা গণনা করে দেখেছি যে, শিরায় ইনজেকশনের ১০ মিনিট পর রক্তে প্রয়োগকৃত ডোজের মাত্র প্রায় ১% ওজন ফাজ শনাক্ত করা গেছে। এই প্রাথমিক দ্রুত হ্রাসের পর, ২৭.৭ মিনিটের অর্ধায়ু সহ একটি ধীরগতির প্রাথমিক নিষ্কাশন পরিমাপ করা হয়েছিল। গুরুত্বপূর্ণভাবে, সিএসএফ কম্পার্টমেন্ট থেকে খুব অল্প সংখ্যক ফাজ পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল, যা সিএসএফ কম্পার্টমেন্টে ওয়াইল্ড-টাইপ ফাজের স্থানান্তরের জন্য একটি নিম্ন ব্যাকগ্রাউন্ড নির্দেশ করে (পরিপূরক চিত্র ৩)। গড়ে, সম্পূর্ণ নমুনা সংগ্রহের সময়কালে (০-২৫০ মিনিট) রক্তে মাত্র প্রায় ১ x ১০⁻³% টাইটারের T7 ফাজ এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে প্রাথমিকভাবে প্রবেশ করানো ফাজের ৪ x ১০⁻⁸% শনাক্ত করা হয়েছিল। লক্ষণীয়ভাবে, সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে ওয়াইল্ড-টাইপ ফাজের অর্ধায়ু (২৫.৭ মিনিট) রক্তে পরিলক্ষিত অর্ধায়ুর অনুরূপ ছিল। এই তথ্য প্রমাণ করে যে, সিএম-ক্যানুলেটেড ইঁদুরদের ক্ষেত্রে রক্ত ​​থেকে সিএসএফ প্রকোষ্ঠকে পৃথককারী প্রতিবন্ধকটি অক্ষত থাকে, যা ইন ভিভো পদ্ধতিতে ফাজ লাইব্রেরি নির্বাচনের মাধ্যমে এমন ক্লোন শনাক্ত করতে সাহায্য করে, যেগুলো সহজেই রক্ত ​​থেকে সিএসএফ প্রকোষ্ঠে পরিবাহিত হয়।
(ক) একটি বৃহৎ পুল থেকে সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (CSF) পুনঃনমুনা সংগ্রহের একটি পদ্ধতি স্থাপন। (খ) কেন্দ্রীয় স্নায়ুতন্ত্র (CNS) প্রতিবন্ধকের কোষীয় অবস্থান এবং রক্ত-মস্তিষ্ক প্রতিবন্ধক (BBB) ​​অতিক্রমকারী পেপটাইড শনাক্ত করতে ব্যবহৃত নির্বাচন কৌশল প্রদর্শনকারী চিত্র। (গ) ইন ভিভো ফাজ ডিসপ্লে স্ক্রিনিং ফ্লোচার্ট। নির্বাচনের প্রতিটি রাউন্ডে, ফাজ (তীরের ভিতরে প্রাণী শনাক্তকারী) শিরায় ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। দুটি স্বাধীন বিকল্প শাখা (A, B) নির্বাচনের ৪র্থ রাউন্ড পর্যন্ত আলাদাভাবে রাখা হয়। নির্বাচনের ৩য় এবং ৪র্থ রাউন্ডের জন্য, CSF থেকে নিষ্কাশিত প্রতিটি ফাজ ক্লোন ম্যানুয়ালি সিকোয়েন্স করা হয়েছিল। (ঘ) দুটি ক্যানুলেটেড ইঁদুরের মধ্যে T7 পেপটাইড লাইব্রেরি (২ x ১০¹² ফাজ/প্রাণী) শিরায় ইনজেকশন দেওয়ার পর নির্বাচনের প্রথম রাউন্ড চলাকালীন রক্ত ​​(লাল বৃত্ত) এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (সবুজ ত্রিভুজ) থেকে বিচ্ছিন্ন ফাজের গতিবিদ্যা। নীল বর্গক্ষেত্রগুলো রক্তে ফাজের গড় প্রাথমিক ঘনত্ব নির্দেশ করে, যা ইনজেক্ট করা ফাজের পরিমাণ থেকে গণনা করা হয়েছে এবং এতে মোট রক্তের পরিমাণ বিবেচনা করা হয়েছে। কালো বর্গক্ষেত্রগুলো রক্তের ফাজ ঘনত্ব থেকে এক্সট্রাপোলেট করা y-রেখার ছেদবিন্দু নির্দেশ করে। (e,f) পেপটাইডে পাওয়া সমস্ত সম্ভাব্য ওভারল্যাপিং ট্রাইপেপটাইড মোটিফের আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি এবং বিন্যাস উপস্থাপন করা হয়েছে। ১০০০টি রিডিং-এ প্রাপ্ত মোটিফের সংখ্যা দেখানো হয়েছে। উল্লেখযোগ্যভাবে (p < 0.001) সমৃদ্ধ মোটিফগুলোকে লাল বিন্দু দিয়ে চিহ্নিত করা হয়েছে। (e) ইনজেক্ট করা লাইব্রেরির ট্রাইপেপটাইড মোটিফের আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সির সাথে প্রাণী #১.১ এবং #১.২ থেকে প্রাপ্ত রক্ত-উদ্ভূত ফাজের আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সির তুলনা করে একটি কোরিলেশন স্ক্যাটারপ্লট। (f) রক্ত ​​এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড থেকে বিচ্ছিন্ন প্রাণী ফাজ ট্রাইপেপটাইড মোটিফ #১.১ এবং #১.২-এর আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সির তুলনা করে একটি কোরিলেশন স্ক্যাটারপ্লট। (g, h) উভয় প্রাণীর দেহে এক দফা ইন ভিভো সিলেকশনের পর, রক্তে সমৃদ্ধ ফাজ (g) বনাম ইনজেক্টেড লাইব্রেরি এবং সিএসএফ (h) বনাম রক্তের সিকোয়েন্স আইডি উপস্থাপন। এক-অক্ষরের কোডের আকার নির্দেশ করে যে ওই অ্যামিনো অ্যাসিডটি ঐ অবস্থানে কতবার উপস্থিত হয়। সবুজ = পোলার, বেগুনি = নিউট্রাল, নীল = বেসিক, লাল = অ্যাসিডিক এবং কালো = হাইড্রোফোবিক অ্যামিনো অ্যাসিড। চিত্র ১ক, খ এডুয়ার্ড ইউরিচ দ্বারা ডিজাইন ও তৈরি করা হয়েছে।
আমরা দুটি সিএম ইনস্ট্রুমেন্ট ইঁদুরের (ক্লেড এ এবং বি) মধ্যে একটি ফাজ পেপটাইড লাইব্রেরি ইনজেক্ট করি এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড ও রক্ত ​​থেকে ফাজ পৃথক করি (চিত্র ১ডি)। ওয়াইল্ড-টাইপ ফাজের তুলনায় লাইব্রেরির প্রাথমিক দ্রুত অপসারণ কম সুস্পষ্ট ছিল। উভয় প্রাণীর রক্তে ইনজেক্ট করা লাইব্রেরির গড় অর্ধায়ু ছিল ২৪.৮ মিনিট, যা ওয়াইল্ড-টাইপ ফাজের অনুরূপ, এবং সিএসএফ-এ ছিল ৩৮.৫ মিনিট। প্রতিটি প্রাণীর রক্ত ​​এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডের ফাজ নমুনা এইচটিএস-এর জন্য পরীক্ষা করা হয় এবং শনাক্তকৃত সমস্ত পেপটাইডে একটি সংক্ষিপ্ত ট্রাইপেপটাইড মোটিফের উপস্থিতি বিশ্লেষণ করা হয়। ট্রাইপেপটাইড মোটিফ নির্বাচন করা হয়েছিল কারণ এগুলো গঠন প্রক্রিয়া এবং পেপটাইড-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়ার জন্য একটি ন্যূনতম ভিত্তি প্রদান করে¹⁴,¹⁵। আমরা ইনজেক্ট করা ফাজ লাইব্রেরি এবং উভয় প্রাণীর রক্ত ​​থেকে নিষ্কাশিত ক্লোনগুলির মধ্যে মোটিফের বণ্টনে একটি ভালো সম্পর্ক খুঁজে পেয়েছি (চিত্র ১ই)। এই তথ্য নির্দেশ করে যে লাইব্রেরির গঠন রক্ত ​​অংশে সামান্যই সমৃদ্ধ হয়েছে। Weblogo16 সফটওয়্যারের একটি অভিযোজিত সংস্করণ ব্যবহার করে প্রতিটি অবস্থানে অ্যামিনো অ্যাসিডের ফ্রিকোয়েন্সি এবং কনসেনসাস সিকোয়েন্স আরও বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। মজার বিষয় হলো, আমরা রক্তে গ্লাইসিন রেসিডিউ-এর একটি শক্তিশালী সমৃদ্ধি দেখতে পাই (চিত্র ১জি)। যখন রক্তকে সিএসএফ (CSF) থেকে নির্বাচিত ক্লোনগুলির সাথে তুলনা করা হয়, তখন মোটিফগুলির শক্তিশালী নির্বাচন এবং কিছু অনির্বাচন লক্ষ্য করা যায় (চিত্র ১এফ), এবং নির্দিষ্ট কিছু অ্যামিনো অ্যাসিড ১২-সদস্যের পূর্বনির্ধারিত অবস্থানে অগ্রাধিকারমূলকভাবে উপস্থিত ছিল (চিত্র ১এইচ)। উল্লেখযোগ্যভাবে, সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে প্রতিটি প্রাণীর মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল, যদিও উভয় প্রাণীর রক্তেই গ্লাইসিনের সমৃদ্ধি লক্ষ্য করা গেছে (পরিপূরক চিত্র ৪এ-জে)। প্রাণী #১.১ এবং #১.২-এর সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডের সিকোয়েন্স ডেটা কঠোরভাবে ফিল্টার করার পর, মোট ৯৬৪ এবং ৪২০টি অনন্য ১২-মার পেপটাইড পাওয়া যায় (পরিপূরক চিত্র ১ডি-ই)। বিচ্ছিন্ন ফাজ ক্লোনগুলিকে বিবর্ধিত করা হয় এবং ইন ভিভো নির্বাচনের দ্বিতীয় রাউন্ডে পাঠানো হয়। দ্বিতীয় দফার সিলেকশন থেকে নিষ্কাশিত ফাজগুলোকে প্রতিটি প্রাণীর উপর HTS-এর অধীনে আনা হয়েছিল এবং শনাক্তকৃত সমস্ত পেপটাইডকে একটি মোটিফ রিকগনিশন প্রোগ্রামের ইনপুট হিসাবে ব্যবহার করে ট্রাইপেপটাইড মোটিফের উপস্থিতি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল (চিত্র ২ক, খ, ঙ)। CSF থেকে পুনরুদ্ধার করা ফাজের প্রথম চক্রের তুলনায়, আমরা শাখা A এবং B-তে CSF-এর মধ্যে অনেক মোটিফের আরও সিলেকশন এবং ডি-সিলেকশন পর্যবেক্ষণ করেছি (চিত্র ২)। এগুলি সামঞ্জস্যপূর্ণ সিকোয়েন্সের ভিন্ন ভিন্ন প্যাটার্ন উপস্থাপন করে কিনা তা নির্ধারণ করার জন্য একটি নেটওয়ার্ক আইডেন্টিফিকেশন অ্যালগরিদম প্রয়োগ করা হয়েছিল। বিকল্প ক্লেড A (চিত্র ২গ, ঘ) এবং ক্লেড B (চিত্র ২ছ, জ)-তে CSF দ্বারা পুনরুদ্ধার করা ১২-মাত্রিক সিকোয়েন্সগুলির মধ্যে একটি স্পষ্ট সাদৃশ্য পরিলক্ষিত হয়েছিল। প্রতিটি শাখার সম্মিলিত বিশ্লেষণে ১২-মার পেপটাইডগুলির জন্য ভিন্ন ভিন্ন সিলেকশন প্রোফাইল (পরিপূরক চিত্র ৫গ, ঘ) এবং প্রথম দফার সিলেকশনের তুলনায় দ্বিতীয় দফার সিলেকশনের পরে সম্মিলিত ক্লোনগুলির জন্য সময়ের সাথে সাথে CSF/রক্ত টাইটার অনুপাতের বৃদ্ধি প্রকাশ পেয়েছে (পরিপূরক চিত্র ৫ঙ)।
পরপর দুই দফা ইন ভিভো ফাংশনাল ফেজ ডিসপ্লে সিলেকশন প্রক্রিয়ার মাধ্যমে সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে মোটিফ ও পেপটাইডের সমৃদ্ধকরণ।
প্রতিটি প্রাণীর (প্রাণী #১.১ এবং #১.২) প্রথম রাউন্ড থেকে সংগৃহীত সমস্ত সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড ফাজগুলোকে একত্রিত করে, বিবর্ধন করে, HT-সিকোয়েন্সিং করা হয় এবং একসাথে পুনরায় ইনজেক্ট করা হয় (২ x ১০¹⁰ ফাজ/প্রাণী) ২টি SM ক্যানুলেটেড ইঁদুরের মধ্যে (#১.১ → #২.১ এবং ২.২, ১.২ → ২.৩ এবং ২.৪)। (ক, খ, ঙ, চ) প্রথম এবং দ্বিতীয় সিলেকশন রাউন্ডে সমস্ত CSF-উদ্ভূত ফাজের ট্রাইপেপটাইড মোটিফের আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সির তুলনা করে কোরিলেশন স্ক্যাটারপ্লট। উভয় ওরিয়েন্টেশনে পেপটাইডে পাওয়া সমস্ত সম্ভাব্য ওভারল্যাপিং ট্রাইপেপটাইডের প্রতিনিধিত্বকারী মোটিফগুলোর আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি এবং বিন্যাস। ১০০০ রিডিং-এ প্রাপ্ত মোটিফের সংখ্যা দেখানো হয়েছে। তুলনাকৃত লাইব্রেরিগুলোর মধ্যে কোনো একটিতে যে মোটিফগুলো উল্লেখযোগ্যভাবে (p < ০.০০১) নির্বাচিত বা বাদ দেওয়া হয়েছিল, সেগুলোকে লাল বিন্দু দিয়ে হাইলাইট করা হয়েছে। (c, d, g, h) ইন ভিভো সিলেকশনের ২য় এবং ১ম রাউন্ডের উপর ভিত্তি করে সমস্ত CSF-সমৃদ্ধ ১২টি অ্যামিনো অ্যাসিড দীর্ঘ সিকোয়েন্সের সিকোয়েন্স লোগো উপস্থাপনা। এক-অক্ষরের কোডের আকার নির্দেশ করে যে সেই অ্যামিনো অ্যাসিডটি ঐ অবস্থানে কতবার ঘটে। লোগোটি উপস্থাপন করার জন্য, দুটি সিলেকশন রাউন্ডের মধ্যে পৃথক প্রাণী থেকে সংগৃহীত CSF সিকোয়েন্সের পুনরাবৃত্তির তুলনা করা হয় এবং দ্বিতীয় রাউন্ডে সমৃদ্ধ সিকোয়েন্সগুলি দেখানো হয়: (c) #১.১–#২.১ (d) #১.১–#২.২ (g) #১.২–#২.৩ এবং (h) #১.২–#২.৪। (c, d) প্রাণী নং ২.১ এবং নং ২.২-এর অথবা (g, h) প্রাণী নং ২.৩ এবং নং ২.৪-এর একটি নির্দিষ্ট অবস্থানে সবচেয়ে সমৃদ্ধ অ্যামিনো অ্যাসিডগুলি রঙে দেখানো হয়েছে। সবুজ = পোলার, বেগুনি = নিউট্রাল, নীল = বেসিক, লাল = অ্যাসিডিক এবং কালো = হাইড্রোফোবিক অ্যামিনো অ্যাসিড।
তৃতীয় দফা নির্বাচনের পর, আমরা দুটি প্রাণী থেকে বিচ্ছিন্ন করা ৩৩২টি সিএসএফ-পুনর্গঠিত ফাজ ক্লোন থেকে ১২৪টি অনন্য পেপটাইড সিকোয়েন্স (#৩.১ এবং #৩.২) শনাক্ত করেছি (পরিশিষ্ট চিত্র ৬ক)। LGSVS সিকোয়েন্সটির (১৮.৭%) আপেক্ষিক অনুপাত ছিল সর্বোচ্চ, এরপরে ছিল ওয়াইল্ড-টাইপ ইনসার্ট PAGISRELVDKL (৮.২%), MRWFFSHASQGR (৩%), DVAKVS (৩%), TWLFSLG (২.২%), এবং SARGSWREIVSLS (২.২%)। চূড়ান্ত চতুর্থ দফায়, আমরা তিনটি পৃথক প্রাণী থেকে স্বাধীনভাবে নির্বাচিত দুটি শাখাকে একত্রিত করেছি (চিত্র ১গ)। সিএসএফ থেকে পুনরুদ্ধার করা ৯২৫টি সিকোয়েন্সকৃত ফাজ ক্লোনের মধ্যে, চতুর্থ দফায় আমরা ৬৪টি অনন্য পেপটাইড সিকোয়েন্স পেয়েছি (পরিশিষ্ট চিত্র ৬খ), যার মধ্যে ওয়াইল্ড-টাইপ ফাজের আপেক্ষিক অনুপাত কমে ০.৮%-এ নেমে আসে। চতুর্থ রাউন্ডে সবচেয়ে সাধারণ CSF ক্লোনগুলো ছিল LYVLHSRGLWGFKLAAALE (১৮%), LGSVS (১৭%), GFVRFRLSNTR (১৪%), KVAWRVFSLFWK (৭%), SVHGV (৫%), GRPQKINGARVC (৩.৬%) এবং RLSSVDSDLSGC (৩.২%)। NNK লাইব্রেরি ডিজাইনের জন্য ডিজেনারেট কোডন ব্যবহার করার সময় লাইব্রেরি প্রাইমারে নিউক্লিওটাইড সংযোজন/অপসারণ অথবা অকাল স্টপ কোডনের কারণে নির্বাচিত পেপটাইডগুলোর দৈর্ঘ্যের এই ভিন্নতা দেখা যায়। অকাল স্টপ কোডনগুলো ছোট পেপটাইড তৈরি করে এবং এগুলো নির্বাচিত হয় কারণ সেগুলোতে অনুকূল অ্যামিনো অ্যাসিড মোটিফ থাকে। সিন্থেটিক লাইব্রেরির প্রাইমারে সংযোজন/অপসারণের ফলে দীর্ঘতর পেপটাইড তৈরি হতে পারে। এটি ডিজাইন করা স্টপ কোডনটিকে ফ্রেমের বাইরে স্থাপন করে এবং ডাউনস্ট্রিমে একটি নতুন স্টপ কোডন না আসা পর্যন্ত এটিকে পড়তে থাকে। সাধারণভাবে, আমরা ইনপুট ডেটার সাথে স্যাম্পল আউটপুট ডেটা তুলনা করে চারটি সিলেকশন রাউন্ডের জন্যই এনরিচমেন্ট ফ্যাক্টর গণনা করেছি। স্ক্রিনিং-এর প্রথম রাউন্ডের জন্য, আমরা একটি নন-স্পেসিফিক ব্যাকগ্রাউন্ড রেফারেন্স হিসেবে ওয়াইল্ড-টাইপ ফাজ টাইটার ব্যবহার করেছি। মজার বিষয় হলো, প্রথম CSF চক্রে নেগেটিভ ফাজ সিলেকশন খুব জোরালো ছিল, কিন্তু রক্তে তা ছিল না (চিত্র ৩ক), যার কারণ হতে পারে পেপটাইড লাইব্রেরির বেশিরভাগ সদস্যের CSF কম্পার্টমেন্টে প্যাসিভ ডিফিউশনের সম্ভাবনা কম থাকা অথবা ব্যাকটেরিওফাজের তুলনায় আপেক্ষিক ফাজগুলো রক্তপ্রবাহ থেকে আরও দক্ষতার সাথে ধরে রাখা বা অপসারণ করা যায়। তবে, প্যানিং-এর দ্বিতীয় রাউন্ডে, উভয় ক্লেডেই CSF-এ ফাজের জোরালো সিলেকশন দেখা গেছে, যা থেকে বোঝা যায় যে আগের রাউন্ডে এমন ফাজগুলো সমৃদ্ধ হয়েছিল যেগুলো CSF-এ শোষণে সহায়ক পেপটাইড প্রদর্শন করে (চিত্র ৩ক)। এক্ষেত্রেও রক্তে উল্লেখযোগ্য সমৃদ্ধি দেখা যায়নি। তৃতীয় এবং চতুর্থ রাউন্ডেও, ফাজ ক্লোনগুলো CSF-এ উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ হয়েছিল। সিলেকশনের শেষ দুটি রাউন্ডের মধ্যে প্রতিটি অনন্য পেপটাইড সিকোয়েন্সের আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি তুলনা করে আমরা দেখেছি যে, সিলেকশনের চতুর্থ রাউন্ডে সিকোয়েন্সগুলো আরও বেশি সমৃদ্ধ হয়েছিল (চিত্র ৩খ)। উভয় পেপটাইড বিন্যাস ব্যবহার করে ৬৪টি অনন্য পেপটাইড অনুক্রম থেকে মোট ৯৩১টি ট্রাইপেপটাইড মোটিফ নিষ্কাশন করা হয়েছিল। চতুর্থ রাউন্ডের সর্বাধিক সমৃদ্ধ মোটিফগুলোকে ইনজেক্টেড লাইব্রেরির (কাট-অফ: ১০% সমৃদ্ধি) তুলনায় সমস্ত রাউন্ড জুড়ে তাদের সমৃদ্ধি প্রোফাইলের জন্য আরও নিবিড়ভাবে পরীক্ষা করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র ৬গ)। নির্বাচনের সাধারণ ধরণ থেকে দেখা যায় যে, অধ্যয়নকৃত বেশিরভাগ মোটিফই উভয় নির্বাচন শাখার পূর্ববর্তী সমস্ত রাউন্ডে সমৃদ্ধ ছিল। তবে, কিছু মোটিফ (যেমন SGL, VSG, LGS GSV) প্রধানত বিকল্প ক্লেড A থেকে এসেছে, যেখানে অন্যগুলো (যেমন FGW, RTN, WGF, NTR) বিকল্প ক্লেড B-তে সমৃদ্ধ হয়েছে।
স্ট্রেপ্টাভিডিন পেলোডের সাথে সংযুক্ত সিএসএফ-সমৃদ্ধ ফাজ-প্রদর্শিত পেপটাইড এবং বায়োটিনযুক্ত লিডার পেপটাইডের সিএসএফ পরিবহনের বৈধতা যাচাই।
(ক) ইনজেক্ট করা (ইনপুট = I) ফাজ (PFU) টাইটার এবং নির্ধারিত CSF ফাজ টাইটারের (আউটপুট = O) উপর ভিত্তি করে চারটি রাউন্ডেই (R1-R4) গণনা করা সমৃদ্ধি অনুপাত। শেষ তিনটি রাউন্ডের (R2-R4) সমৃদ্ধি গুণকগুলো পূর্ববর্তী রাউন্ড এবং প্রথম রাউন্ডের (R1) ওজনের তথ্যের সাথে তুলনা করে গণনা করা হয়েছিল। খোলা বারগুলো হলো সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড, এবং ছায়াযুক্ত বারগুলো হলো প্লাজমা। (***p<0.001, স্টুডেন্ট'স টি-টেস্টের উপর ভিত্তি করে)। (খ) নির্বাচনের চতুর্থ রাউন্ডের পর CSF-এ সংগৃহীত সমস্ত ফাজের মধ্যে তাদের আপেক্ষিক অনুপাত অনুসারে সাজানো সবচেয়ে প্রাচুর্যপূর্ণ ফাজ পেপটাইডগুলোর তালিকা। সবচেয়ে সাধারণ ছয়টি ফাজ ক্লোনকে রঙে হাইলাইট করা হয়েছে, সংখ্যায়িত করা হয়েছে এবং নির্বাচনের তৃতীয় ও চতুর্থ রাউন্ডের মধ্যে তাদের সমৃদ্ধি গুণকগুলো (ইনসেট) দেখানো হয়েছে। (গ,ঘ) চতুর্থ রাউন্ড থেকে প্রাপ্ত সবচেয়ে সমৃদ্ধ ছয়টি ফাজ ক্লোন, খালি ফাজ এবং প্যারেন্টাল ফাজ পেপটাইড লাইব্রেরিগুলোকে একটি CSF স্যাম্পলিং মডেলে পৃথকভাবে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। নির্দেশিত সময় বিন্দুতে সিএসএফ এবং রক্তের নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল। (গ) ৬টি ক্যান্ডিডেট ফাজ ক্লোন (২ x ১০¹⁰ ফাজ/প্রাণী), খালি ফাজ (#১৭৭৯) (২ x ১০¹⁰ ফাজ/প্রাণী) এবং স্টক ফাজ পেপটাইড লাইব্রেরি (২ x ১০¹² ফাজ/প্রাণী) সমান পরিমাণে, ক্যানুলেটেড প্রাণীকে লেজের শিরা দিয়ে আলাদাভাবে কমপক্ষে ৩ সিএম ইনজেক্ট করা হয়। সময়ের সাথে সাথে প্রতিটি ইনজেক্ট করা ফাজ ক্লোন এবং ফাজ পেপটাইড লাইব্রেরির সিএসএফ ফার্মাকোকাইনেটিক্স দেখানো হয়েছে। (ঘ) নমুনা সংগ্রহের সময় জুড়ে সমস্ত পুনরুদ্ধারকৃত ফাজ/এমএল-এর জন্য গড় সিএসএফ/রক্ত অনুপাত দেখায়। (ঙ) চারটি সিন্থেটিক লিডার পেপটাইড এবং একটি স্ক্র্যাম্বলড কন্ট্রোলকে তাদের এন-টার্মিনাসের মাধ্যমে বায়োটিন দিয়ে স্ট্রেপ্টাভিডিনের সাথে যুক্ত করা হয়েছিল (টেট্রামার ডিসপ্লে) এবং তারপরে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল (লেজের শিরায় আইভি, ১০ মিলিগ্রাম স্ট্রেপ্টাভিডিন/কেজি)। কমপক্ষে তিনটি ইনটিউবেটেড ইঁদুর (N = ৩)। নির্দেশিত সময় বিন্দুতে সিএসএফ (CSF) নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং সিএসএফ অ্যান্টি-স্ট্রেপ্টাভিডিন এলিসা (ELISA) দ্বারা স্ট্রেপ্টাভিডিনের ঘনত্ব পরিমাপ করা হয়েছিল (nd = শনাক্ত করা যায়নি)। (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, অ্যানোভা (ANOVA) পরীক্ষার উপর ভিত্তি করে)। (f) চতুর্থ দফার নির্বাচন থেকে নির্বাচিত অন্যান্য ফাজ পেপটাইড ক্লোনগুলির সাথে সর্বাধিক সমৃদ্ধ ফাজ পেপটাইড ক্লোন #2002 (বেগুনি)-এর অ্যামিনো অ্যাসিড অনুক্রমের তুলনা। অভিন্ন এবং অনুরূপ অ্যামিনো অ্যাসিড খণ্ডগুলিকে রঙ দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছে।
চতুর্থ রাউন্ডে সমৃদ্ধ করা সমস্ত ফাজগুলোর মধ্যে (চিত্র ৩খ), সিএসএফ স্যাম্পলিং মডেলে আরও পৃথক বিশ্লেষণের জন্য ছয়টি ক্যান্ডিডেট ক্লোন নির্বাচন করা হয়েছিল। ছয়টি ক্যান্ডিডেট ফাজ, খালি ফাজ (কোনো ইনসার্ট ছাড়া) এবং প্রোফাজ পেপটাইড লাইব্রেরির সমান পরিমাণ তিনটি ক্যানুলেটেড সিএম প্রাণীর দেহে ইনজেক্ট করা হয়েছিল এবং সিএসএফ (চিত্র ৩গ) ও রক্তের (পরিপূরক চিত্র ৭) পরীক্ষায় ফার্মাকোকাইনেটিক্স নির্ধারণ করা হয়েছিল। পরীক্ষিত সমস্ত ফাজ ক্লোন খালি কন্ট্রোল ফাজ (#১৭৭৯)-এর তুলনায় ১০-১০০০ গুণ বেশি মাত্রায় সিএসএফ কম্পার্টমেন্টকে টার্গেট করেছিল। উদাহরণস্বরূপ, ক্লোন #২০২০ এবং #২০৭৭-এর সিএসএফ টাইটার কন্ট্রোল ফাজের তুলনায় প্রায় ১০০০ গুণ বেশি ছিল। প্রতিটি নির্বাচিত পেপটাইডের ফার্মাকোকাইনেটিক প্রোফাইল ভিন্ন, কিন্তু সবগুলোরই সিএসএফ হোমিং ক্ষমতা অনেক বেশি। আমরা ক্লোন #১৯০৩ এবং #২০১১-এর ক্ষেত্রে সময়ের সাথে সাথে একটি স্থির হ্রাস লক্ষ্য করেছি, যেখানে ক্লোন #২০৭৭, #২০০২ এবং #২০০৯-এর ক্ষেত্রে প্রথম ১০ মিনিটে একটি বৃদ্ধি সক্রিয় পরিবহন নির্দেশ করতে পারে, তবে এটি যাচাই করা প্রয়োজন। ক্লোন #২০২০, #২০০২ এবং #২০৭৭ উচ্চ মাত্রায় স্থিতিশীল হয়েছিল, যেখানে ক্লোন #২০০৯-এর সিএসএফ ঘনত্ব প্রাথমিক বৃদ্ধির পর ধীরে ধীরে হ্রাস পেয়েছিল। এরপর আমরা প্রতিটি সিএসএফ ক্যান্ডিডেটের আপেক্ষিক হারকে তার রক্তের ঘনত্বের সাথে তুলনা করেছি (চিত্র ৩ডি)। সমস্ত নমুনা সংগ্রহের সময়ে প্রতিটি সিএসএফ ক্যান্ডিডেটের গড় টাইটারের সাথে তার রক্তের টাইটারের পারস্পরিক সম্পর্ক দেখিয়েছে যে ছয়টি ক্যান্ডিডেটের মধ্যে তিনটি রক্তের সিএসএফ-এ উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ ছিল। মজার বিষয় হলো, ক্লোন #২০৭৭ রক্তে উচ্চতর স্থিতিশীলতা দেখিয়েছে (পরিপূরক চিত্র ৭)। পেপটাইডগুলো নিজেরাই ফাজ কণা ছাড়া অন্য কার্গোকে সক্রিয়ভাবে সিএসএফ প্রকোষ্ঠে পরিবহন করতে সক্ষম কিনা তা নিশ্চিত করার জন্য, আমরা চারটি লিডার পেপটাইড সংশ্লেষণ করেছি যেগুলোর এন-টার্মিনাসে বায়োটিন যুক্ত করা হয়েছে, যেখানে পেপটাইডগুলো ফাজ কণার সাথে সংযুক্ত হয়। বায়োটিনযুক্ত পেপটাইড (নং ২০০২, ২০০৯, ২০২০ এবং ২০৭৭) স্ট্রেপ্টাভিডিন (SA)-এর সাথে সংযুক্ত করে মাল্টিমেরিক ফর্ম তৈরি করা হয়েছিল, যা কিছুটা ফাজের জ্যামিতিকে অনুকরণ করে। এই ফর্ম্যাটটি আমাদের কার্গো-পরিবহনকারী প্রোটিন পেপটাইড হিসাবে রক্ত ​​এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে SA-এর উপস্থিতি পরিমাপ করার সুযোগ করে দিয়েছিল। গুরুত্বপূর্ণভাবে, যখন সিন্থেটিক পেপটাইডগুলি এই SA-সংযুক্ত ফর্ম্যাটে প্রয়োগ করা হয়েছিল, তখন ফাজের ডেটা প্রায়শই পুনরুৎপাদন করা সম্ভব হয়েছিল (চিত্র ৩e)। স্ক্র্যাম্বলড পেপটাইডগুলির প্রাথমিক উপস্থিতি কম ছিল এবং CSF থেকে দ্রুত নিষ্কাশিত হয়ে ৪৮ ঘণ্টার মধ্যে শনাক্ত করা যায়নি। এই পেপটাইড ফাজ ক্লোনগুলির CSF স্পেসে প্রবেশের পথ সম্পর্কে ধারণা পেতে, আমরা ইন ভিভোতে ইন্ট্রাভেনাস ইনজেকশনের ১ ঘণ্টা পরে ফাজ কণা সরাসরি শনাক্ত করার জন্য ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি (IHC) ব্যবহার করে প্রতিটি ফাজ পেপটাইড হিটের অবস্থান বিশ্লেষণ করেছি। উল্লেখযোগ্যভাবে, ক্লোন #2002, #2077, এবং #2009 মস্তিষ্কের কৈশিকনালীতে তীব্র রঞ্জনের মাধ্যমে শনাক্ত করা সম্ভব হয়েছিল, যেখানে নিয়ন্ত্রক ফাজ (#1779) এবং ক্লোন #2020 শনাক্ত করা যায়নি (পরিপূরক চিত্র 8)। এটি ইঙ্গিত দেয় যে এই পেপটাইডগুলি BBB অতিক্রম করার মাধ্যমেই মস্তিষ্কের উপর প্রভাব ফেলে। এই অনুমানটি পরীক্ষা করার জন্য আরও বিস্তারিত বিশ্লেষণ প্রয়োজন, কারণ BSCFB পথটিও জড়িত থাকতে পারে। সবচেয়ে সমৃদ্ধ ক্লোন (#2002)-এর অ্যামিনো অ্যাসিড ক্রমকে অন্যান্য নির্বাচিত পেপটাইডগুলির সাথে তুলনা করার সময়, এটি লক্ষ্য করা গেছে যে তাদের মধ্যে কয়েকটির অ্যামিনো অ্যাসিড এক্সটেনশন একই রকম, যা একটি অনুরূপ পরিবহন প্রক্রিয়া নির্দেশ করতে পারে (চিত্র 3f)।
এর অনন্য প্লাজমা প্রোফাইল এবং সময়ের সাথে সাথে সিএসএফ-এর উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধির কারণে, ফেজ ডিসপ্লে ক্লোন #২০৭৭-কে আরও দীর্ঘ ৪৮-ঘণ্টার জন্য পরীক্ষা করা হয়েছিল এবং এটি টেকসই এসএ স্তরের সাথে সম্পর্কিত সিএসএফ-এর দ্রুত বৃদ্ধিকে পুনরুৎপাদন করতে সক্ষম হয়েছিল (চিত্র ৪ক)। অন্যান্য শনাক্তকৃত ফেজ ক্লোনগুলির তুলনায়, #২০৭৭ মস্তিষ্কের কৈশিক নালীর জন্য তীব্রভাবে স্টেইনড হয়েছিল এবং উচ্চতর রেজোলিউশনে দেখার সময় কৈশিক নালীর মার্কার লেকটিনের সাথে উল্লেখযোগ্য কোলোকালাইজেশন দেখিয়েছিল এবং সম্ভবত প্যারেনকাইমাল স্পেসেও কিছু স্টেইনিং দেখা গিয়েছিল (চিত্র ৪খ)। সিএনএস-এ পেপটাইড-মধ্যস্থ ফার্মাকোলজিক্যাল প্রভাব পাওয়া যেতে পারে কিনা তা তদন্ত করার জন্য, আমরা একটি পরীক্ষা করেছিলাম যেখানে i) #২০৭৭ ট্রানজিট পেপটাইড এবং ii) BACE1 ইনহিবিটর পেপটাইডের বায়োটিনযুক্ত সংস্করণ দুটি ভিন্ন অনুপাতে এসএ-এর সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল। একটি মিশ্রণের জন্য আমরা শুধুমাত্র BACE1 পেপটাইড ইনহিবিটর ব্যবহার করেছি এবং অন্যটির জন্য আমরা BACE1 পেপটাইড ইনহিবিটর এবং #২০৭৭ পেপটাইডের ১:৩ অনুপাত ব্যবহার করেছি। উভয় নমুনা শিরায় প্রয়োগ করা হয়েছিল এবং সময়ের সাথে সাথে রক্ত ​​ও সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে বিটা-অ্যামাইলয়েড পেপটাইড ৪০ (Abeta40)-এর মাত্রা পরিমাপ করা হয়েছিল। সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে Abeta40 পরিমাপ করা হয়েছিল কারণ এটি মস্তিষ্কের প্যারেনকাইমায় BACE1-এর বাধাদানকে প্রতিফলিত করে। প্রত্যাশিতভাবেই, উভয় কমপ্লেক্সই রক্তে Abeta40-এর মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছিল (চিত্র ৪গ, ঘ)। তবে, শুধুমাত্র পেপটাইড নং ২০৭৭ এবং SA-এর সাথে সংযুক্ত BACE1 পেপটাইডের একটি ইনহিবিটরের মিশ্রণযুক্ত নমুনাগুলোই সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে Abeta40-এর উল্লেখযোগ্য হ্রাস ঘটিয়েছে (চিত্র ৪গ)। এই তথ্য থেকে দেখা যায় যে, পেপটাইড নং ২০৭৭ ৬০ kDa SA প্রোটিনকে কেন্দ্রীয় স্নায়ুতন্ত্রে পরিবহন করতে সক্ষম এবং এটি SA-এর সাথে সংযুক্ত BACE1 পেপটাইডের ইনহিবিটরগুলোর সাথে ঔষধীয় প্রভাবও সৃষ্টি করে।
(ক) অন্তত তিনটি সিএম-ইনটিউবেটেড ইঁদুরের দেহে টি৭ ফাজের ক্লোনাল ইনজেকশন (২ × ১০⁶ ফাজ/প্রাণী) প্রয়োগের ফলে সিএসএফ পেপটাইড #২০৭৭ (RLSSVDSDLSGC) এবং ইনজেকশনবিহীন কন্ট্রোল ফাজ (#১৭৭৯)-এর দীর্ঘমেয়াদী ফার্মাকোকাইনেটিক প্রোফাইল দেখা যাচ্ছে। (খ) ফাজ-ইনজেক্টেড ইঁদুরের (২ × ১০⁶ ফাজ/প্রাণী) কর্টেক্সের প্রতিনিধিত্বকারী ক্ষুদ্র রক্তনালীর কনফোকাল মাইক্রোস্কোপিক চিত্র, যেখানে পেপটাইড #২০৭৭ এবং রক্তনালীর (লেকটিন) কাউন্টারস্টেইনিং দেখা যাচ্ছে। এই ফাজ ক্লোনগুলো ৩টি ইঁদুরের দেহে প্রয়োগ করা হয়েছিল এবং পারফিউশনের আগে ১ ঘণ্টা ধরে সঞ্চালিত হতে দেওয়া হয়েছিল। মস্তিষ্ককে খণ্ডিত করে টি৭ ফাজ ক্যাপসিডের বিরুদ্ধে পলিক্লোনাল FITC-লেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডি দিয়ে স্টেইন করা হয়েছিল। পারফিউশন এবং পরবর্তী ফিক্সেশনের দশ মিনিট আগে, DyLight594-লেবেলযুক্ত লেকটিন শিরায় প্রয়োগ করা হয়েছিল। ফ্লুরোসেন্ট চিত্রগুলিতে মাইক্রোভেসেলের লুমিনাল দিকে লেকটিন স্টেইনিং (লাল) এবং কৈশিক নালী ও পেরভাসকুলার মস্তিষ্কের টিস্যুর লুমেনে ফাজ (সবুজ) দেখা যাচ্ছে। স্কেল বারটি ১০ µm নির্দেশ করে। (গ, ঘ) বায়োটিনযুক্ত BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইড একা অথবা বায়োটিনযুক্ত ট্রানজিট পেপটাইড #২০৭৭-এর সাথে একত্রে স্ট্রেপ্টাভিডিনের সাথে যুক্ত করা হয়েছিল এবং এরপর কমপক্ষে তিনটি ক্যানুলেটেড CM ইঁদুরের শিরায় ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল (১০ মিলিগ্রাম স্ট্রেপ্টাভিডিন/কেজি)। নির্দেশিত সময় বিন্দুতে রক্তে (লাল) এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে (কমলা) Aβ1-40 ELISA-এর মাধ্যমে BACE1 পেপটাইড ইনহিবিটর দ্বারা Aβ40-এর হ্রাস পরিমাপ করা হয়েছিল। আরও স্পষ্টতার জন্য, গ্রাফের উপর ১০০% স্কেলে একটি ডটেড লাইন আঁকা হয়েছে। (গ) ৩:১ অনুপাতে ট্রানজিট পেপটাইড #২০৭৭ এবং BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইডের সাথে সংযুক্ত স্ট্রেপ্টাভিডিন দ্বারা চিকিৎসাপ্রাপ্ত ইঁদুরের রক্তে (লাল ত্রিভুজ) এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে (কমলা ত্রিভুজ) Aβ40-এর শতকরা হ্রাস। (ঘ) শুধুমাত্র একটি BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইডের সাথে সংযুক্ত স্ট্রেপ্টাভিডিন দ্বারা চিকিৎসাপ্রাপ্ত ইঁদুরের রক্তে (লাল বৃত্ত) এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে (কমলা বৃত্ত) Aβ40-এর শতকরা হ্রাস। কন্ট্রোলে Aβ-এর ঘনত্ব ছিল ৪২০ pg/ml (স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন = ১০১ pg/ml)।
ফ্যাজ ডিসপ্লে বায়োমেডিকেল গবেষণার বিভিন্ন ক্ষেত্রে সফলভাবে প্রয়োগ করা হয়েছে¹⁷। এই পদ্ধতিটি ইন ভিভো ভাস্কুলার ডাইভারসিটি স্টাডিজ¹⁸,¹⁹ এবং সেরিব্রাল ভেসেলকে লক্ষ্য করে করা স্টাডিজ²⁰,²¹,²²,²³,²⁴,²⁵,²⁶-এর জন্য ব্যবহৃত হয়েছে। এই গবেষণায়, আমরা এই সিলেকশন পদ্ধতির প্রয়োগকে শুধুমাত্র সেরিব্রাল ভেসেলকে লক্ষ্য করে পেপটাইডের সরাসরি শনাক্তকরণের মধ্যেই সীমাবদ্ধ রাখিনি, বরং ব্লাড-ব্রেন ব্যারিয়ার অতিক্রম করার মতো সক্রিয় পরিবহন বৈশিষ্ট্যযুক্ত ক্যান্ডিডেট আবিষ্কারের জন্যও প্রসারিত করেছি। আমরা এখন সিএম ইনটিউবেটেড ইঁদুরের উপর একটি ইন ভিভো সিলেকশন পদ্ধতির বিকাশের বর্ণনা দিচ্ছি এবং সিএসএফ হোমিং বৈশিষ্ট্যযুক্ত পেপটাইড শনাক্ত করার ক্ষেত্রে এর সম্ভাবনা প্রদর্শন করছি। ১২-মার র‍্যান্ডম পেপটাইডের একটি লাইব্রেরি প্রদর্শনকারী টি৭ ফ্যাজ ব্যবহার করে, আমরা দেখাতে সক্ষম হয়েছি যে টি৭ ফ্যাজটি ব্লাড-ব্রেন ব্যারিয়ারের সাথে খাপ খাইয়ে নেওয়ার জন্য যথেষ্ট ছোট (ব্যাস প্রায় ৬০ ন্যানোমিটার)¹⁰, যার ফলে এটি সরাসরি ব্লাড-ব্রেন ব্যারিয়ার বা কোরয়েড প্লেক্সাস অতিক্রম করতে পারে। আমরা লক্ষ্য করেছি যে ক্যানুলেটেড সিএম ইঁদুর থেকে সিএসএফ সংগ্রহ একটি সুনিয়ন্ত্রিত ইন ভিভো কার্যকরী স্ক্রিনিং পদ্ধতি ছিল, এবং নিষ্কাশিত ফাজ কেবল রক্তনালীর সাথেই আবদ্ধ হয়নি, বরং রক্ত-মস্তিষ্ক প্রতিবন্ধক জুড়ে একটি পরিবাহক হিসাবেও কাজ করেছে। অধিকন্তু, একই সাথে রক্ত ​​সংগ্রহ করে এবং সিএসএফ ও রক্ত ​​থেকে প্রাপ্ত ফাজের উপর এইচটিএস প্রয়োগ করে, আমরা নিশ্চিত করেছি যে আমাদের সিএসএফ নির্বাচন রক্তে সমৃদ্ধি বা নির্বাচনের বিভিন্ন পর্যায়ের মধ্যে বিস্তারের উপযুক্ততা দ্বারা প্রভাবিত হয়নি। তবে, রক্তের স্তরটি নির্বাচন পদ্ধতির একটি অংশ, কারণ যে ফাজগুলো সিএসএফ স্তরে পৌঁছাতে সক্ষম, মস্তিষ্কে নিজেদের সমৃদ্ধ করার জন্য তাদের রক্তপ্রবাহে যথেষ্ট দীর্ঘ সময় বেঁচে থাকতে ও সঞ্চালিত হতে হয়। কাঁচা এইচটিএস ডেটা থেকে নির্ভরযোগ্য সিকোয়েন্স তথ্য বের করার জন্য, আমরা বিশ্লেষণ কার্যপ্রবাহে প্ল্যাটফর্ম-নির্দিষ্ট সিকোয়েন্সিং ত্রুটির সাথে খাপ খাইয়ে নেওয়া ফিল্টার প্রয়োগ করেছি। স্ক্রিনিং পদ্ধতিতে কাইনেটিক প্যারামিটার অন্তর্ভুক্ত করার মাধ্যমে, আমরা রক্তে ওয়াইল্ড-টাইপ T7 ফ্যাজের দ্রুত ফার্মাকোকাইনেটিক্স (t½ ~ ২৮ মিনিট) নিশ্চিত করেছি²⁴,²⁷,²⁸ এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে (CSF) তাদের অর্ধায়ুও (t½ ~ ২৬ মিনিট) নির্ধারণ করেছি। রক্ত ​​এবং CSF-এ একই রকম ফার্মাকোকাইনেটিক প্রোফাইল থাকা সত্ত্বেও, রক্তে ফ্যাজের ঘনত্বের মাত্র ০.০০১% CSF-এ শনাক্ত করা সম্ভব হয়েছে, যা ব্লাড-ব্রেন ব্যারিয়ার জুড়ে ওয়াইল্ড-টাইপ T7 ফ্যাজের কম ব্যাকগ্রাউন্ড গতিশীলতা নির্দেশ করে। এই কাজটি ইন ভিভো প্যানিং কৌশল ব্যবহার করার সময় নির্বাচনের প্রথম ধাপের গুরুত্ব তুলে ধরে, বিশেষ করে সেইসব ফ্যাজ সিস্টেমের জন্য যা রক্ত ​​সঞ্চালন থেকে দ্রুত অপসারিত হয়, কারণ খুব কম সংখ্যক ক্লোনই CNS কম্পার্টমেন্টে পৌঁছাতে সক্ষম হয়। সুতরাং, প্রথম ধাপে লাইব্রেরির বৈচিত্র্য অনেক বেশি হ্রাস পেয়েছিল, কারণ এই অত্যন্ত কঠোর CSF মডেলে শেষ পর্যন্ত সীমিত সংখ্যক ক্লোনই সংগ্রহ করা সম্ভব হয়েছিল। এই ইন ভিভো প্যানিং কৌশলে বেশ কয়েকটি নির্বাচন ধাপ অন্তর্ভুক্ত ছিল, যেমন সিএসএফ (CSF) প্রকোষ্ঠে সক্রিয়ভাবে জমা হওয়া, রক্ত ​​প্রকোষ্ঠে ক্লোনের টিকে থাকা, এবং প্রথম ১০ মিনিটের মধ্যে রক্ত ​​থেকে টি৭ (T7) ফাজ ক্লোনগুলোর দ্রুত অপসারণ (চিত্র ১ডি এবং পরিপূরক চিত্র ৪এম)। ফলে, প্রথম রাউন্ডের পর সিএসএফ-এ ভিন্ন ভিন্ন ফাজ ক্লোন শনাক্ত করা হয়েছিল, যদিও প্রতিটি প্রাণীর জন্য একই প্রাথমিক পুল ব্যবহার করা হয়েছিল। এটি ইঙ্গিত দেয় যে, বিপুল সংখ্যক সদস্যবিশিষ্ট উৎস লাইব্রেরির জন্য একাধিক কঠোর নির্বাচন ধাপ বৈচিত্র্যের উল্লেখযোগ্য হ্রাস ঘটায়। অতএব, দৈব ঘটনাগুলো প্রাথমিক নির্বাচন প্রক্রিয়ার একটি অবিচ্ছেদ্য অংশ হয়ে উঠবে, যা ফলাফলকে ব্যাপকভাবে প্রভাবিত করবে। সম্ভবত মূল লাইব্রেরির অনেক ক্লোনেরই সিএসএফ-এ সমৃদ্ধ হওয়ার প্রবণতা খুব কাছাকাছি ছিল। তবে, একই পরীক্ষামূলক পরিস্থিতিতেও, প্রাথমিক পুলে প্রতিটি নির্দিষ্ট ক্লোনের সংখ্যা কম থাকার কারণে নির্বাচনের ফলাফল ভিন্ন হতে পারে।
সিএসএফ-এ সমৃদ্ধ মোটিফগুলো রক্তের মোটিফগুলো থেকে ভিন্ন। মজার বিষয় হলো, আমরা স্বতন্ত্র প্রাণীদের রক্তে গ্লাইসিন-সমৃদ্ধ পেপটাইডের দিকে প্রথম পরিবর্তন লক্ষ্য করেছি। (চিত্র ১জি, পরিপূরক চিত্র ৪ই, ৪এফ)। গ্লাইসিন পেপটাইডযুক্ত ফাজগুলো সম্ভবত অধিক স্থিতিশীল এবং রক্তসঞ্চালন থেকে অপসারিত হওয়ার সম্ভাবনা কম। তবে, এই গ্লাইসিন-সমৃদ্ধ পেপটাইডগুলো সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডের নমুনাগুলোতে শনাক্ত করা যায়নি, যা থেকে বোঝা যায় যে কিউরেটেড লাইব্রেরিগুলো দুটি ভিন্ন নির্বাচন ধাপের মধ্য দিয়ে গেছে: একটি রক্তে এবং অন্যটি সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে জমা হতে দেওয়া হয়েছে। চতুর্থ দফার নির্বাচনের ফলে প্রাপ্ত সিএসএফ-সমৃদ্ধ ক্লোনগুলো ব্যাপকভাবে পরীক্ষা করা হয়েছে। স্বতন্ত্রভাবে পরীক্ষিত প্রায় সমস্ত ক্লোনই ব্ল্যাঙ্ক কন্ট্রোল ফাজের তুলনায় সিএসএফ-এ সমৃদ্ধ বলে নিশ্চিত করা হয়েছে। একটি পেপটাইড হিট (#২০৭৭) আরও বিস্তারিতভাবে পরীক্ষা করা হয়েছে। এটি অন্যান্য হিটের তুলনায় দীর্ঘতর প্লাজমা অর্ধ-জীবন দেখিয়েছে (চিত্র 3d এবং পরিপূরক চিত্র 7), এবং মজার বিষয় হলো, এই পেপটাইডটির C-টার্মিনাসে একটি সিস্টেইন রেসিডিউ ছিল। সম্প্রতি দেখা গেছে যে পেপটাইডে সিস্টেইন যোগ করলে তা অ্যালবুমিনের সাথে আবদ্ধ হয়ে তাদের ফার্মাকোকাইনেটিক বৈশিষ্ট্য উন্নত করতে পারে 29। পেপটাইড #2077-এর ক্ষেত্রে এটি বর্তমানে অজানা এবং এর জন্য আরও গবেষণার প্রয়োজন। কিছু পেপটাইড CSF সমৃদ্ধকরণে একটি ভ্যালেন্স-নির্ভরতা দেখিয়েছে (ডেটা দেখানো হয়নি), যা T7 ক্যাপসিডের প্রদর্শিত পৃষ্ঠ জ্যামিতির সাথে সম্পর্কিত হতে পারে। আমরা যে T7 সিস্টেমটি ব্যবহার করেছি তাতে প্রতিটি ফাজ কণার জন্য প্রতিটি পেপটাইডের 5-15টি কপি দেখা গেছে। ইঁদুরের সেরিব্রাল কর্টেক্সে শিরায় ইনজেকশন দেওয়া ক্যান্ডিডেট লিড ফাজ ক্লোনগুলির উপর IHC করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 8)। ডেটা দেখিয়েছে যে অন্তত তিনটি ক্লোন (নং 2002, নং 2009 এবং নং 2077) BBB-এর সাথে ইন্টারঅ্যাক্ট করেছে। এই BBB মিথস্ক্রিয়ার ফলে CSF জমা হয়, নাকি এই ক্লোনগুলো সরাসরি BCSFB-তে স্থানান্তরিত হয়, তা এখনও নির্ধারণ করা বাকি আছে। গুরুত্বপূর্ণভাবে, আমরা দেখিয়েছি যে নির্বাচিত পেপটাইডগুলো সংশ্লেষিত হওয়ার পর এবং প্রোটিন কার্গোর সাথে আবদ্ধ হওয়ার পরেও তাদের CSF পরিবহনের ক্ষমতা ধরে রাখে। SA-এর সাথে N-টার্মিনাল বায়োটিনিলেটেড পেপটাইডগুলোর আবদ্ধ হওয়া মূলত রক্ত ​​এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে তাদের নিজ নিজ ফাজ ক্লোনগুলোর সাথে প্রাপ্ত ফলাফলেরই পুনরাবৃত্তি করে (চিত্র 3e)। পরিশেষে, আমরা দেখিয়েছি যে প্রধান পেপটাইড #2077, SA-এর সাথে সংযুক্ত BACE1-এর একটি বায়োটিনিলেটেড পেপটাইড ইনহিবিটরের মস্তিষ্কের ক্রিয়াকে ত্বরান্বিত করতে সক্ষম, যা CSF-এ Abeta40-এর মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করার মাধ্যমে CNS-এ সুস্পষ্ট ফার্মাকোডাইনামিক প্রভাব সৃষ্টি করে (চিত্র 4)। সমস্ত প্রাপ্ত ফলাফলের পেপটাইড সিকোয়েন্স হোমোলজি অনুসন্ধান করেও আমরা ডেটাবেসে কোনো হোমোলগ শনাক্ত করতে পারিনি। এটা উল্লেখ করা গুরুত্বপূর্ণ যে T7 লাইব্রেরির আকার প্রায় 10⁹, যেখানে 12-মারের জন্য তাত্ত্বিক লাইব্রেরির আকার হলো 4 x 10¹⁵। সুতরাং, আমরা 12-মার পেপটাইড লাইব্রেরির বৈচিত্র্য পরিসরের একটি ক্ষুদ্র অংশই নির্বাচন করেছি, যার অর্থ হতে পারে যে এই চিহ্নিত হিটগুলোর সংলগ্ন সিকোয়েন্স পরিসর মূল্যায়ন করে আরও অপ্টিমাইজড পেপটাইড শনাক্ত করা যেতে পারে। অনুমান করা যায় যে, আমরা এই পেপটাইডগুলোর কোনো প্রাকৃতিক হোমোলগ খুঁজে না পাওয়ার একটি কারণ হতে পারে বিবর্তনের সময় মস্তিষ্কে নির্দিষ্ট পেপটাইড মোটিফের অনিয়ন্ত্রিত প্রবেশ রোধ করার জন্য কিছু নির্দিষ্ট পেপটাইডকে বাদ দেওয়া।
সামগ্রিকভাবে, আমাদের ফলাফলগুলো ইন ভিভোতে সেরিব্রোভাসকুলার ব্যারিয়ারের পরিবহন ব্যবস্থাগুলোকে আরও বিস্তারিতভাবে শনাক্ত ও বৈশিষ্ট্যমণ্ডিত করার জন্য ভবিষ্যৎ গবেষণার ভিত্তি প্রদান করে। এই পদ্ধতির মূল কাঠামোটি একটি কার্যকরী নির্বাচন কৌশলের উপর ভিত্তি করে তৈরি, যা কেবল সেরিব্রাল ভাসকুলার বাইন্ডিং বৈশিষ্ট্যযুক্ত ক্লোনগুলোকেই শনাক্ত করে না, বরং এতে একটি গুরুত্বপূর্ণ ধাপও অন্তর্ভুক্ত রয়েছে যেখানে সফল ক্লোনগুলোর মধ্যে ইন ভিভোতে জৈবিক বাধা অতিক্রম করে সিএনএস কম্পার্টমেন্টে প্রবেশ করার সহজাত ক্ষমতা থাকে। এর উদ্দেশ্য হলো এই পেপটাইডগুলোর পরিবহনের প্রক্রিয়া এবং মস্তিষ্কের নির্দিষ্ট অঞ্চলের মাইক্রোভাস্কুলেচারের সাথে সংযুক্ত হওয়ার ক্ষেত্রে তাদের পছন্দের কারণ ব্যাখ্যা করা। এর ফলে BBB এবং রিসেপ্টরগুলোর পরিবহনের জন্য নতুন পথ আবিষ্কৃত হতে পারে। আমরা আশা করি যে শনাক্তকৃত পেপটাইডগুলো সরাসরি সেরিব্রোভাসকুলার রিসেপ্টরগুলোর সাথে অথবা BBB বা BCSFB-এর মাধ্যমে পরিবাহিত সঞ্চালনশীল লিগ্যান্ডগুলোর সাথে সংযুক্ত হতে পারবে। এই গবেষণায় আবিষ্কৃত সিএসএফ পরিবহন ক্ষমতাসম্পন্ন পেপটাইড ভেক্টরগুলো নিয়ে আরও তদন্ত করা হবে। আমরা বর্তমানে BBB এবং/অথবা BCSFB অতিক্রম করার ক্ষমতার জন্য এই পেপটাইডগুলোর মস্তিষ্ক-নির্দিষ্টতা নিয়ে গবেষণা করছি। এই নতুন পেপটাইডগুলো নতুন রিসেপ্টর বা পথ আবিষ্কারের সম্ভাবনা এবং মস্তিষ্কে বায়োলজিকসের মতো ম্যাক্রোমলিকিউল সরবরাহের জন্য নতুন অত্যন্ত কার্যকর প্ল্যাটফর্ম তৈরির ক্ষেত্রে অত্যন্ত মূল্যবান উপকরণ হবে।
পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতির একটি পরিবর্তিত রূপ ব্যবহার করে লার্জ সিস্টারনা (CM)-তে ক্যানুলেশন করুন। চেতনানাশক প্রয়োগ করা উইস্টার ইঁদুরকে (২০০-৩৫০ গ্রাম) একটি স্টেরিওট্যাক্সিক যন্ত্রে স্থাপন করা হয় এবং মাথার খুলি উন্মুক্ত করার জন্য শেভ করা ও জীবাণুমুক্তভাবে প্রস্তুত করা স্ক্যাল্পের উপর একটি মধ্যবর্তী ছেদ দেওয়া হয়। উপরের স্যাশের (upper sash) অংশে দুটি ছিদ্র করুন এবং ছিদ্রগুলিতে ফিক্সিং স্ক্রু লাগিয়ে দিন। CM-এর মধ্যে একটি স্টেইনলেস স্টিলের ক্যানুলাকে স্টেরিওট্যাকটিক গাইডেন্সের জন্য ল্যাটারাল অক্সিপিটাল ক্রেস্টে একটি অতিরিক্ত ছিদ্র করা হয়। ক্যানুলার চারপাশে ডেন্টাল সিমেন্ট লাগান এবং স্ক্রু দিয়ে সুরক্ষিত করুন। ফটো-কিউরিং এবং সিমেন্ট শক্ত হয়ে যাওয়ার পর, ত্বকের ক্ষতটি ৪/০ সুপ্রামিড সুচার দিয়ে বন্ধ করে দেওয়া হয়। সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (CSF) স্বতঃস্ফূর্তভাবে বের হয়ে আসার মাধ্যমে ক্যানুলার সঠিক অবস্থান নিশ্চিত করা হয়। ইঁদুরটিকে স্টেরিওট্যাক্সিক যন্ত্র থেকে নামিয়ে আনুন, যথাযথ অস্ত্রোপচার-পরবর্তী যত্ন ও ব্যথা ব্যবস্থাপনা প্রদান করুন এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে রক্তের চিহ্ন দেখা না যাওয়া পর্যন্ত এটিকে কমপক্ষে এক সপ্তাহ সুস্থ হতে দিন। উইস্টার ইঁদুর (Crl:WI/Han) ফ্রান্সের চার্লস রিভার থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল। সমস্ত ইঁদুরকে নির্দিষ্ট রোগজীবাণু-মুক্ত পরিবেশে রাখা হয়েছিল। সমস্ত প্রাণী পরীক্ষা সুইজারল্যান্ডের বাসেল শহরের ভেটেরিনারি অফিস দ্বারা অনুমোদিত ছিল এবং প্রাণী লাইসেন্স নং ২৪৭৪ (ইঁদুরের সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড এবং মস্তিষ্কে থেরাপিউটিক ক্যান্ডিডেটের মাত্রা পরিমাপের মাধ্যমে সক্রিয় মস্তিষ্ক পরিবহনের মূল্যায়ন) অনুসারে পরিচালিত হয়েছিল।
হাতে সিএম ক্যানুলা নিয়ে ইঁদুরটিকে আলতোভাবে সজাগ রাখুন। ক্যানুলা থেকে ডাটুরা সরিয়ে ফেলুন এবং স্বতঃস্ফূর্তভাবে প্রবাহিত ১০ মাইক্রোলিটার সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড সংগ্রহ করুন। যেহেতু ক্যানুলার কার্যকারিতা শেষ পর্যন্ত ব্যাহত হয়েছিল, তাই এই গবেষণায় শুধুমাত্র রক্তের দূষণ বা বিবর্ণতার কোনো প্রমাণ ছাড়া স্বচ্ছ সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডের নমুনা অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল। সমান্তরালভাবে, লেজের ডগায় একটি ছোট ছিদ্র থেকে হেপারিনযুক্ত টিউবে (সিগমা-অলড্রিচ) প্রায় ১০-২০ মাইক্রোলিটার রক্ত ​​নেওয়া হয়েছিল। টি৭ ফেজ শিরায় ইনজেকশনের পর বিভিন্ন সময়ে সিএসএফ এবং রক্ত ​​সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রতিটি সিএসএফ নমুনা সংগ্রহের আগে প্রায় ৫-১০ মাইক্রোলিটার তরল ফেলে দেওয়া হয়েছিল, যা ক্যাথেটারের ডেড ভলিউমের সমতুল্য।
T7Select সিস্টেম ম্যানুয়ালে (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে T7Select 10-3b ভেক্টর ব্যবহার করে লাইব্রেরিগুলো তৈরি করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, নিম্নলিখিত বিন্যাসে একটি র‍্যান্ডম ১২-মার ডিএনএ ইনসার্ট সংশ্লেষণ করা হয়েছিল:
ইনসার্টে ডাবল স্টপ কোডন এবং অ্যামিনো অ্যাসিডের অতিরিক্ত প্রকাশ এড়ানোর জন্য NNK কোডন ব্যবহার করা হয়েছিল। N হলো প্রতিটি নিউক্লিওটাইডের হাতে মেশানো সমমোলার অনুপাত, এবং K হলো অ্যাডেনিন ও সাইটোসিন নিউক্লিওটাইডের হাতে মেশানো সমমোলার অনুপাত। একক-সূত্রক অঞ্চলগুলোকে ৩৭°C তাপমাত্রায় ৩ ঘণ্টা ধরে ক্লেনো বাফারে (নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস) dNTP (নোভাজেন) এবং ক্লেনো এনজাইম (নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস)-এর সাথে ইনকিউবেশনের মাধ্যমে দ্বি-সূত্রক ডিএনএ-তে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। বিক্রিয়ার পর, EtOH অধঃক্ষেপণের মাধ্যমে দ্বি-সূত্রক ডিএনএ পুনরুদ্ধার করা হয়। প্রাপ্ত ডিএনএ-কে রেস্ট্রিকশন এনজাইম EcoRI এবং HindIII (উভয়ই রোশ থেকে প্রাপ্ত) দিয়ে ডাইজেস্ট করা হয়েছিল। এরপর, খণ্ডিত ও বিশুদ্ধকৃত (QIAquick, কায়াজেন) ইনসার্টটিকে (T4 লাইগেজ, নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস) 10B ক্যাপসিড জিনের ৩৪৮ নম্বর অ্যামিনো অ্যাসিডের পরে একটি পূর্ব-খণ্ডিত T7 ভেক্টরে ইন-ফ্রেম লাইগেট করা হয়েছিল। ইন ভিট্রো প্যাকেজিং-এর পূর্বে লাইগেশন বিক্রিয়াগুলোকে ১৬° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ১৮ ঘন্টা ধরে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। T7Select 10-3b ক্লোনিং কিট (নোভাজেন)-এর সাথে সরবরাহকৃত নির্দেশাবলী অনুসারে ইন ভিট্রো ফাজ প্যাকেজিং সম্পন্ন করা হয়েছিল এবং এসচেরিকিয়া কোলাই (BLT5615, নোভাজেন) ব্যবহার করে প্যাকেজিং দ্রবণটিকে একবার লাইসিস পর্যন্ত বিবর্ধিত করা হয়েছিল। লাইসেটগুলোকে সেন্ট্রিফিউজ, টাইট্রেট এবং গ্লিসারলের স্টক দ্রবণ হিসেবে -৮০° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় হিমায়িত করা হয়েছিল।
স্বত্বাধিকারযুক্ত 454/Roche-অ্যাম্পলিকন ফিউশন প্রাইমার ব্যবহার করে ব্রথ বা প্লেটে বিবর্ধিত ফাজের পরিবর্তনশীল অঞ্চলের সরাসরি পিসিআর বিবর্ধন। ফরোয়ার্ড ফিউশন প্রাইমারটিতে পরিবর্তনশীল অঞ্চলের পার্শ্ববর্তী সিকোয়েন্স (NNK) 12 (টেমপ্লেট-নির্দিষ্ট), GS FLX টাইটানিয়াম অ্যাডাপ্টার A, এবং একটি চার-বেস লাইব্রেরি কী সিকোয়েন্স (TCAG) রয়েছে (পরিশিষ্ট চিত্র 1a):
রিভার্স ফিউশন প্রাইমারটিতে ক্যাপচার বিডের সাথে সংযুক্ত বায়োটিন এবং ইমালশন পিসিআর চলাকালীন ক্লোনাল অ্যামপ্লিফিকেশনের জন্য প্রয়োজনীয় জিএস এফএলএক্স টাইটানিয়াম অ্যাডাপ্টার বি-ও থাকে:
এরপর 454 GS-FLX Titanium প্রোটোকল অনুসারে অ্যামপ্লিকনগুলোকে 454/Roche পাইরোসিকোয়েন্সিং করা হয়েছিল। ম্যানুয়াল স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং-এর জন্য (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস হিটাচি 3730 xl ডিএনএ অ্যানালাইজার), T7 ফাজ ডিএনএ পিসিআর দ্বারা অ্যামপ্লিফাই করা হয়েছিল এবং নিম্নলিখিত প্রাইমার জোড়া ব্যবহার করে সিকোয়েন্স করা হয়েছিল:
প্রতিটি প্ল্যাক থেকে প্রাপ্ত ইনসার্টগুলোকে রোশ ফাস্ট স্টার্ট ডিএনএ পলিমারেজ কিট ব্যবহার করে (উৎপাদকের নির্দেশাবলী অনুসারে) পিসিআর অ্যামপ্লিফিকেশনের জন্য প্রস্তুত করা হয়েছিল। একটি হট স্টার্ট (৯৫ °C তাপমাত্রায় ১০ মিনিট) এবং ৩৫টি বুস্ট সাইকেল (৯৫ °C তাপমাত্রায় ৫০ সেকেন্ড, ৫০ °C তাপমাত্রায় ১ মিনিট এবং ৭২ °C তাপমাত্রায় ১ মিনিট) সম্পন্ন করুন।
লাইব্রেরি থেকে প্রাপ্ত ফাজ, ওয়াইল্ড-টাইপ ফাজ, সিএসএফ (CSF) ও রক্ত ​​থেকে উদ্ধারকৃত ফাজ, অথবা স্বতন্ত্র ক্লোনসমূহকে ৩৭°C তাপমাত্রায় ৪ ঘণ্টা ধরে টিবি ব্রথে (সিগমা অলড্রিচ) অথবা ৫০০ বর্গ সেমি (cm²) ডিশে (থার্মো সায়েন্টিফিক) এসচেরিকিয়া কোলাই বিএল৫৬১৫ (Escherichia coli BL5615) মাধ্যমে বিবর্ধন করা হয়েছিল। প্লেটগুলোকে ট্রিস-ইডিটিএ (Tris-EDTA) বাফার (ফ্লুকা অ্যানালিটিক্যাল) দিয়ে ধুয়ে অথবা জীবাণুমুক্ত পিপেট টিপস দিয়ে প্ল্যাকগুলো সংগ্রহ করে প্লেটগুলো থেকে ফাজ নিষ্কাশন করা হয়েছিল। কালচার সুপারন্যাট্যান্ট বা নিষ্কাশন বাফার থেকে এক দফা পলিইথিলিন গ্লাইকোল (PEG 8000) অধঃক্ষেপণ (প্রোমেগা) দ্বারা ফাজ পৃথক করা হয়েছিল এবং ট্রিস-ইডিটিএ বাফারে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল।
শিরায় (IV) ইনজেকশন (৫০০ μl/প্রাণী) দেওয়ার আগে, বিবর্ধিত ফাজকে মিল্টেনি বায়োটেকের এন্ডোটক্সিন রিমুভাল বিডস ব্যবহার করে ২-৩ বার এন্ডোটক্সিন অপসারণ করা হয়েছিল। প্রথম রাউন্ডে ২×১০¹² ফাজ প্রবেশ করানো হয়েছিল; দ্বিতীয় রাউন্ডে ২×১০¹⁰ ফাজ; এবং তৃতীয় ও চতুর্থ সিলেকশন রাউন্ডে প্রতি প্রাণীতে ২×১০⁹ ফাজ। প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী (T7Select সিস্টেম ম্যানুয়াল) অনুযায়ী প্ল্যাক কাউন্টিংয়ের মাধ্যমে নির্দিষ্ট সময়ে সংগৃহীত সিএসএফ (CSF) এবং রক্তের নমুনায় ফাজের পরিমাণ নির্ণয় করা হয়েছিল। লেজের শিরায় বিশুদ্ধ লাইব্রেরি শিরায় ইনজেকশনের মাধ্যমে অথবা পূর্ববর্তী সিলেকশন রাউন্ড থেকে সিএসএফ থেকে নিষ্কাশিত ফাজ পুনরায় ইনজেকশনের মাধ্যমে ফাজ সিলেকশন করা হয়েছিল, এবং পরবর্তীকালে যথাক্রমে ১০ মিনিট, ৩০ মিনিট, ৬০ মিনিট, ৯০ মিনিট, ১২০ মিনিট, ১৮০ মিনিট এবং ২৪০ মিনিটে সিএসএফ এবং রক্তের নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল। মোট চারটি ইন ভিভো প্যানিং রাউন্ড পরিচালনা করা হয়েছিল, যেখানে নির্বাচনের প্রথম তিনটি রাউন্ডের সময় দুটি নির্বাচিত শাখাকে আলাদাভাবে সংরক্ষণ ও বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। নির্বাচনের প্রথম দুটি রাউন্ড থেকে সিএসএফ (CSF) থেকে নিষ্কাশিত সমস্ত ফাজ ইনসার্টকে 454/Roche পাইরোসিকোয়েন্সিং করা হয়েছিল, অন্যদিকে নির্বাচনের শেষ দুটি রাউন্ড থেকে সিএসএফ (CSF) থেকে নিষ্কাশিত সমস্ত ক্লোন ম্যানুয়ালি সিকোয়েন্স করা হয়েছিল। নির্বাচনের প্রথম রাউন্ডের সমস্ত ব্লাড ফাজকেও 454/Roche পাইরোসিকোয়েন্সিং করা হয়েছিল। ফাজ ক্লোন ইনজেকশনের জন্য, নির্বাচিত ফাজগুলোকে E. coli (BL5615)-তে 500 cm² প্লেটে 37°C তাপমাত্রায় 4 ঘন্টা ধরে বিবর্ধিত করা হয়েছিল। পৃথকভাবে নির্বাচিত এবং ম্যানুয়ালি সিকোয়েন্স করা ক্লোনগুলোকে টিবি (TB) মিডিয়ামে বংশবৃদ্ধি করানো হয়েছিল। ফাজ নিষ্কাশন, পরিশোধন এবং এন্ডোটক্সিন অপসারণের পর (যেমন উপরে বর্ণনা করা হয়েছে), 300 μl দ্রবণে 2×10¹⁰ ফাজ/প্রাণী একটি লেজের শিরায় ইন্ট্রাভেনাসভাবে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল।
সিকোয়েন্স ডেটার প্রাক-প্রক্রিয়াকরণ এবং গুণগত ফিল্টারিং। কাঁচা 454/Roche ডেটাকে ভেন্ডর সফটওয়্যার ব্যবহার করে একটি বাইনারি স্ট্যান্ডার্ড স্ট্রিম ম্যাপ ফরম্যাট (sff) থেকে একটি পিয়ারসন মানব-পাঠযোগ্য ফরম্যাটে (fasta) রূপান্তর করা হয়েছিল। নিউক্লিওটাইড সিকোয়েন্সের পরবর্তী প্রক্রিয়াকরণ নিচে বর্ণিত মালিকানাধীন C প্রোগ্রাম এবং স্ক্রিপ্ট (অপ্রকাশিত সফটওয়্যার প্যাকেজ) ব্যবহার করে সম্পন্ন করা হয়েছিল। প্রাথমিক ডেটার বিশ্লেষণে কঠোর বহু-পর্যায়ের ফিল্টারিং পদ্ধতি অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। যে রিডগুলিতে একটি বৈধ 12mer ইনসার্ট ডিএনএ সিকোয়েন্স ছিল না, সেগুলিকে ফিল্টার করে বাদ দেওয়ার জন্য, রিডগুলিকে গ্লোবাল নিডলম্যান-উন্সচ টেস্ট ব্যবহার করে ক্রমানুসারে স্টার্ট লেবেল (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), স্টপ লেবেল (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) এবং ব্যাকগ্রাউন্ড ইনসার্ট (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC)-এর সাথে অ্যালাইন করা হয়েছিল। অ্যালাইনমেন্ট প্রতি 2টি পর্যন্ত অসামঞ্জস্যের অনুমতি দেয়। অতএব, স্টার্ট এবং স্টপ ট্যাগবিহীন রিড এবং ব্যাকগ্রাউন্ড ইনসার্টযুক্ত রিড, অর্থাৎ, যে অ্যালাইনমেন্টগুলিতে অনুমোদিত অমিলের সংখ্যা অতিক্রম করে, সেগুলিকে লাইব্রেরি থেকে সরিয়ে দেওয়া হয়েছিল। অবশিষ্ট রিডগুলোর ক্ষেত্রে, মূল রিড সিকোয়েন্স থেকে স্টার্ট মার্ক থেকে শুরু হয়ে স্টপ মার্কের আগে শেষ হওয়া এন-মার ডিএনএ সিকোয়েন্সটি কেটে নিয়ে আরও প্রক্রিয়াজাত করা হয়েছিল (এরপরে এটিকে "ইনসার্ট" হিসাবে উল্লেখ করা হবে)। ইনসার্টটির ট্রান্সলেশনের পর, প্রাইমারের ৫' প্রান্তের প্রথম স্টপ কোডনের পরের অংশটি ইনসার্ট থেকে সরিয়ে ফেলা হয়। এছাড়াও, প্রাইমারের ৩' প্রান্তে অসম্পূর্ণ কোডন তৈরি করে এমন নিউক্লিওটাইডগুলোও সরিয়ে ফেলা হয়েছিল। শুধুমাত্র ব্যাকগ্রাউন্ড সিকোয়েন্সযুক্ত ইনসার্টগুলো বাদ দেওয়ার জন্য, "PAG" অ্যামিনো অ্যাসিড প্যাটার্ন দিয়ে শুরু হওয়া ট্রান্সলেটেড ইনসার্টগুলোও সরিয়ে ফেলা হয়েছিল। ৩টির কম অ্যামিনো অ্যাসিড পোস্ট-ট্রান্সলেশনাল দৈর্ঘ্যের পেপটাইডগুলো লাইব্রেরি থেকে সরিয়ে ফেলা হয়েছিল। সবশেষে, ইনসার্ট পুল থেকে পুনরাবৃত্তি দূর করা হয় এবং প্রতিটি অনন্য ইনসার্টের ফ্রিকোয়েন্সি নির্ধারণ করা হয়। এই বিশ্লেষণের ফলাফলে নিউক্লিওটাইড সিকোয়েন্স (ইনসার্ট) এবং তাদের (রিড) ফ্রিকোয়েন্সির একটি তালিকা অন্তর্ভুক্ত ছিল (পরিপূরক চিত্র ১সি এবং ২)।
সিকোয়েন্সের সাদৃশ্য অনুসারে এন-মার ডিএনএ ইনসার্টগুলোকে গ্রুপ করা: 454/রোশ-নির্দিষ্ট সিকোয়েন্সিং ত্রুটি (যেমন হোমোপলিমার এক্সটেনশনের সিকোয়েন্সিং-এর সমস্যা) দূর করতে এবং কম গুরুত্বপূর্ণ পুনরাবৃত্তিগুলো অপসারণ করতে, পূর্বে ফিল্টার করা এন-মার ডিএনএ সিকোয়েন্স ইনসার্টগুলোকে (ইনসার্ট) সাদৃশ্য অনুসারে সাজানো হয়। নিম্নলিখিতভাবে সংজ্ঞায়িত একটি পুনরাবৃত্তিমূলক অ্যালগরিদম ব্যবহার করে ইনসারশনগুলোকে (সর্বোচ্চ ২টি অমিল বেস অনুমোদিত) সাজানো হয়: ইনসারশনগুলোকে প্রথমে তাদের ফ্রিকোয়েন্সি (সর্বোচ্চ থেকে সর্বনিম্ন) অনুসারে সাজানো হয়, এবং যদি তারা একই হয়, তবে তাদের দৈর্ঘ্য (দীর্ঘতম থেকে সংক্ষিপ্ততম) অনুসারে দ্বিতীয়বার সাজানো হয়। এইভাবে, সবচেয়ে বেশিবার আসা এবং দীর্ঘতম ইনসারশনগুলো প্রথম "গ্রুপ" গঠন করে। গ্রুপের ফ্রিকোয়েন্সি মূল ফ্রিকোয়েন্সির সমান নির্ধারণ করা হয়। তারপর, সাজানো তালিকায় থাকা প্রতিটি ইনসারশনকে জোড়ায় জোড়ায় নিডলম্যান-উন্স অ্যালাইনমেন্টের মাধ্যমে গ্রুপে যুক্ত করার চেষ্টা করা হয়। যদি একটি অ্যালাইনমেন্টে অমিল, ইনসারশন বা ডিলিশনের সংখ্যা ২-এর থ্রেশহোল্ড অতিক্রম না করে, তবে একটি ইনসারশনকে গ্রুপে যুক্ত করা হয় এবং ইনসারশনটি যতবার যুক্ত হয়েছে, সেই অনুপাতে গ্রুপের সামগ্রিক ফ্রিকোয়েন্সি বৃদ্ধি পায়। একটি গ্রুপে যোগ করা ইনসার্টগুলোকে ব্যবহৃত হিসেবে চিহ্নিত করা হয় এবং পরবর্তী প্রক্রিয়াকরণ থেকে বাদ দেওয়া হয়। যদি ইনসার্ট সিকোয়েন্সটি আগে থেকে বিদ্যমান কোনো গ্রুপে যোগ করা না যায়, তবে ইনসার্ট সিকোয়েন্সটি ব্যবহার করে উপযুক্ত ইনসার্ট ফ্রিকোয়েন্সি সহ একটি নতুন গ্রুপ তৈরি করা হয় এবং সেটিকে ব্যবহৃত হিসেবে চিহ্নিত করা হয়। পুনরাবৃত্তিটি তখন শেষ হয় যখন প্রতিটি ইনসারশন সিকোয়েন্স হয় একটি নতুন গ্রুপ তৈরি করতে ব্যবহৃত হয় অথবা আগে থেকে বিদ্যমান কোনো গ্রুপে অন্তর্ভুক্ত করা যায়। সবশেষে, নিউক্লিওটাইড দ্বারা গঠিত গ্রুপবদ্ধ ইনসার্টগুলো অবশেষে পেপটাইড সিকোয়েন্সে (পেপটাইড লাইব্রেরি) রূপান্তরিত হয়। এই বিশ্লেষণের ফলাফল হলো এক সেট ইনসারশন এবং তাদের সংশ্লিষ্ট ফ্রিকোয়েন্সি, যা পরপর রিডের সংখ্যা তৈরি করে (পরিপূরক চিত্র ২)।
মোটিফ তৈরি: অনন্য পেপটাইডের একটি তালিকার উপর ভিত্তি করে, নীচে দেখানো সমস্ত সম্ভাব্য অ্যামিনো অ্যাসিড প্যাটার্ন (aa) সম্বলিত একটি লাইব্রেরি তৈরি করা হয়েছিল। পেপটাইড থেকে ৩ দৈর্ঘ্যের প্রতিটি সম্ভাব্য প্যাটার্ন নিষ্কাশন করা হয়েছিল এবং এর বিপরীত প্যাটার্নটি সমস্ত প্যাটার্ন (ট্রাইপেপটাইড) সম্বলিত একটি সাধারণ মোটিফ লাইব্রেরির সাথে যুক্ত করা হয়েছিল। অত্যন্ত পুনরাবৃত্তিমূলক মোটিফের লাইব্রেরিগুলো সিকোয়েন্স করা হয়েছিল এবং অপ্রয়োজনীয় অংশগুলো অপসারণ করা হয়েছিল। তারপর, মোটিফ লাইব্রেরির প্রতিটি ট্রাইপেপটাইডের জন্য, আমরা কম্পিউটেশনাল টুল ব্যবহার করে লাইব্রেরিতে এর উপস্থিতি পরীক্ষা করেছি। এক্ষেত্রে, প্রাপ্ত মোটিফ ট্রাইপেপটাইড ধারণকারী পেপটাইডের ফ্রিকোয়েন্সি যোগ করা হয় এবং মোটিফ লাইব্রেরিতে মোটিফের সাথে যুক্ত করা হয় (“মোটিফের সংখ্যা”)। মোটিফ তৈরির ফলাফল হলো একটি দ্বি-মাত্রিক অ্যারে, যেখানে ট্রাইপেপটাইড (মোটিফ)-এর সমস্ত উপস্থিতি এবং তাদের নিজ নিজ মান থাকে। এই মানগুলো হলো সিকোয়েন্সিং রিডের সংখ্যা, যা রিডগুলোকে ফিল্টার, গ্রুপ এবং অনুবাদ করার পর সংশ্লিষ্ট মোটিফ তৈরি করে। মেট্রিকগুলো উপরে বিস্তারিতভাবে বর্ণনা করা হয়েছে।
মোটিফ সংখ্যার স্বাভাবিকীকরণ এবং সংশ্লিষ্ট স্ক্যাটারপ্লট: প্রতিটি নমুনার মোটিফ সংখ্যা নিম্নলিখিত সূত্র ব্যবহার করে স্বাভাবিকীকরণ করা হয়েছিল:
যেখানে ni হলো টপিক i ধারণকারী রিডের সংখ্যা। সুতরাং, vi নমুনাটিতে মোটিফ i ধারণকারী রিড (বা পেপটাইড)-এর শতকরা হারকে নির্দেশ করে। ফিশারের এক্সাক্ট টেস্ট ব্যবহার করে নন-নরম্যালাইজড মোটিফ সংখ্যার জন্য পি-ভ্যালু গণনা করা হয়েছিল। মোটিফ সংখ্যার কোরেলোগ্রামের ক্ষেত্রে, R ব্যবহার করে নরম্যালাইজড মোটিফ সংখ্যা দিয়ে স্পিয়ারম্যানের কোরিলেশন গণনা করা হয়েছিল।
পেপটাইড লাইব্রেরির প্রতিটি অবস্থানে অ্যামিনো অ্যাসিডের পরিমাণ দৃশ্যমান করার জন্য, ওয়েব লোগোগ্রাম ৩২, ৩৩ (http://weblogo.threeplusone.com) তৈরি করা হয়েছিল। প্রথমে, ১২-মার পেপটাইডের প্রতিটি অবস্থানে অ্যামিনো অ্যাসিডের পরিমাণ একটি ২০×১২ ম্যাট্রিক্সে সংরক্ষণ করা হয়। তারপর, প্রতিটি অবস্থানে একই আপেক্ষিক অ্যামিনো অ্যাসিড পরিমাণযুক্ত ১০০০টি পেপটাইডের একটি সেট ফাস্টা-সিকোয়েন্স ফরম্যাটে তৈরি করা হয় এবং ওয়েব-লোগো ৩-এ ইনপুট হিসাবে সরবরাহ করা হয়, যা একটি প্রদত্ত পেপটাইড লাইব্রেরির জন্য প্রতিটি অবস্থানে আপেক্ষিক অ্যামিনো অ্যাসিড পরিমাণের একটি গ্রাফিক্যাল উপস্থাপনা তৈরি করে। বহুমাত্রিক ডেটাসেট দৃশ্যমান করার জন্য, R-এ অভ্যন্তরীণভাবে তৈরি একটি টুল (biosHeatmap, একটি অপ্রকাশিত R প্যাকেজ) ব্যবহার করে হিট ম্যাপ তৈরি করা হয়েছিল। হিট ম্যাপে উপস্থাপিত ডেনড্রোগ্রামগুলি ইউক্লিডিয়ান ডিসটেন্স মেট্রিক সহ ওয়ার্ডের হায়ারারকিক্যাল ক্লাস্টারিং পদ্ধতি ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল। মোটিফ স্কোরিং ডেটার পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের জন্য, ফিশারের এক্সাক্ট টেস্ট ব্যবহার করে আননরম্যালাইজড স্কোরিংয়ের জন্য পি-ভ্যালু গণনা করা হয়েছিল। অন্যান্য ডেটাসেটগুলোর পি-ভ্যালু R-এ স্টুডেন্ট'স টি-টেস্ট অথবা অ্যানোভা ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল।
নির্বাচিত ফাজ ক্লোন এবং ইনসার্টবিহীন ফাজ লেজের শিরা দিয়ে শিরায় ইনজেক্ট করা হয়েছিল (৩০০ μl PBS-এ প্রতি প্রাণীতে ২×১০¹⁰ ফাজ)। পারফিউশন এবং পরবর্তী ফিক্সেশনের দশ মিনিট আগে, একই প্রাণীগুলোকে শিরায় ১০০ μl DyLight594-লেবেলযুক্ত লেকটিন (ভেক্টর ল্যাবরেটরিজ ইনক., DL-1177) ইনজেক্ট করা হয়েছিল। ফাজ ইনজেকশনের ৬০ মিনিট পর, ইঁদুরগুলোকে হৃৎপিণ্ডের মাধ্যমে প্রথমে ৫০ ml PBS এবং তারপর ৫০ ml ৪% PFA/PBS দিয়ে পারফিউজ করা হয়েছিল। মস্তিষ্কের নমুনাগুলোকে অতিরিক্তভাবে ৪% PFA/PBS-এ সারারাত ফিক্স করা হয়েছিল এবং ৪°C তাপমাত্রায় সারারাত ৩০% সুক্রোজে ভিজিয়ে রাখা হয়েছিল। নমুনাগুলোকে OCT মিশ্রণে ফ্ল্যাশ-ফ্রোজেন করা হয়। হিমায়িত নমুনাগুলির ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যাল বিশ্লেষণ কক্ষ তাপমাত্রায় করা হয়েছিল। এর জন্য প্রথমে ১% BSA দিয়ে ব্লক করা ৩০ µm ক্রায়োসেকশনগুলিকে ৪ °C তাপমাত্রায় T7 ফ্যাজের বিরুদ্ধে পলিক্লোনাল FITC-লেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডি (Novus NB 600-376A) দিয়ে সারারাত ইনকিউবেট করা হয়। অবশেষে, সেকশনগুলিকে PBS দিয়ে ৩ বার ধুয়ে একটি কনফোকাল লেজার মাইক্রোস্কোপ (Leica TCS SP5) দিয়ে পরীক্ষা করা হয়।
ন্যূনতম ৯৮% বিশুদ্ধতা সম্পন্ন সমস্ত পেপটাইড জেনস্ক্রিপ্ট ইউএসএ দ্বারা সংশ্লেষিত, বায়োটিনযুক্ত এবং লাইওফিলাইজড করা হয়েছিল। এন-টার্মিনাসে একটি অতিরিক্ত ট্রিপল গ্লাইসিন স্পেসারের মাধ্যমে বায়োটিন সংযুক্ত থাকে। ভর বর্ণালিবীক্ষণ (mass spectrometry) ব্যবহার করে সমস্ত পেপটাইড পরীক্ষা করুন।
ইনজেকশনের আগে, স্ট্রেপ্টাভিডিন (সিগমা S0677)-কে ৫-১০% DMSO-তে ৫-গুণ সমমোলার আধিক্যে মিশিয়ে PBS-এ ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং কক্ষ তাপমাত্রায় ১ ঘন্টা রাখা হয়েছিল। এরপর স্ট্রেপ্টাভিডিন-সংযুক্ত পেপটাইডগুলিকে সেরিব্রাল ক্যাভিটিযুক্ত ইঁদুরের লেজের একটি শিরায় ১০ মিলিগ্রাম/কেজি ডোজে ইন্ট্রাভেনাসভাবে ইনজেক্ট করা হয়েছিল।
ELISA-এর মাধ্যমে স্ট্রেপ্টাভিডিন-পেপটাইড কমপ্লেক্সের ঘনত্ব নির্ণয় করা হয়েছিল। Nunc Maxisorp মাইক্রোটাইটার প্লেট (Sigma)-কে ৪°C তাপমাত্রায় সারারাত ধরে ১.৫ μg/ml মাউস অ্যান্টি-স্ট্রেপ্টাভিডিন অ্যান্টিবডি (Thermo, MA1-20011) দিয়ে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল। ঘরের তাপমাত্রায় ২ ঘণ্টা ধরে ব্লকিং (ব্লকিং বাফার: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% জিলেটিন, 1% BSA) করার পর, প্লেটটিকে ০.০৫% Tween-20/PBS (ওয়াশ বাফার) দিয়ে ৩ সেকেন্ড ধরে ধুয়ে নেওয়া হয়। এরপর, ব্লকিং বাফার দিয়ে লঘু করা CSF এবং প্লাজমার নমুনা ওয়েলগুলিতে যোগ করা হয় (প্লাজমা ১:১০,০০০, CSF ১:১১৫)। তারপর প্লেটটিকে ৪°C তাপমাত্রায় সারারাত ধরে ডিটেকশন অ্যান্টিবডি (১ μg/ml, অ্যান্টি-স্ট্রেপ্টাভিডিন-HRP, Novus NB120-7239) দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়। তিনবার ধৌত করার পর, TMB সাবস্ট্রেট দ্রবণে (রোশ) ২০ মিনিট পর্যন্ত ইনকিউবেশনের মাধ্যমে স্ট্রেপ্টাভিডিন শনাক্ত করা হয়। ১M H2SO4 দিয়ে রঙের বিকাশ বন্ধ করার পর, ৪৫০ nm-এ শোষণমাত্রা পরিমাপ করা হয়।
প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল (Wako, 294-64701) অনুসারে Aβ(1-40) ELISA ব্যবহার করে স্ট্রেপ্টাভিডিন-পেপটাইড-BACE1 ইনহিবিটর কমপ্লেক্সের কার্যকারিতা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, CSF নমুনাগুলিকে স্ট্যান্ডার্ড ডাইলুয়েন্টে (১:২৩) মিশ্রিত করে BNT77 ক্যাপচার অ্যান্টিবডি দিয়ে প্রলেপযুক্ত ৯৬-ওয়েল প্লেটে ৪°C তাপমাত্রায় সারারাত ইনকিউবেট করা হয়েছিল। পাঁচবার ধোয়ার পর, HRP-সংযুক্ত BA27 অ্যান্টিবডি যোগ করে ৪°C তাপমাত্রায় ২ ঘন্টা ইনকিউবেট করা হয়, এবং এরপর পুনরায় পাঁচবার ধোয়া হয়। ঘরের তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য TMB দ্রবণে ইনকিউবেট করে Aβ(1–40) শনাক্ত করা হয়েছিল। স্টপ সলিউশন দিয়ে রঙের বিকাশ বন্ধ করার পর, ৪৫০ nm তরঙ্গদৈর্ঘ্যে শোষণমাত্রা পরিমাপ করা হয়। Aβ(1–40) ELISA করার আগে প্লাজমা নমুনাগুলিকে সলিড ফেজ এক্সট্র্যাকশনের মাধ্যমে পৃথক করা হয়েছিল। প্লাজমাকে ৯৬-ওয়েল প্লেটে ০.২% DEA (Sigma)-এর সাথে যোগ করে ঘরের তাপমাত্রায় ৩০ মিনিট ইনকিউবেট করা হয়েছিল। পর্যায়ক্রমে জল এবং ১০০% মিথানল দিয়ে SPE প্লেট (Oasis, 186000679) ধোয়ার পর, প্লাজমার নমুনাগুলি SPE প্লেটে যোগ করা হয়েছিল এবং সমস্ত তরল অপসারণ করা হয়েছিল। নমুনাগুলি ধোয়া হয়েছিল (প্রথমে ৫% মিথানল এবং তারপর ৩০% মিথানল দিয়ে) এবং ২% NH4OH/৯০% মিথানল দিয়ে এলুশন করা হয়েছিল। স্থির N2 প্রবাহে ৫৫°C তাপমাত্রায় ৯৯ মিনিট ধরে এলুয়েট শুকানোর পর, নমুনাগুলিকে স্ট্যান্ডার্ড ডাইলুয়েন্টে বিজারিত করা হয়েছিল এবং উপরে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে Aβ(1–40) পরিমাপ করা হয়েছিল।
এই প্রবন্ধটি কীভাবে উদ্ধৃত করবেন: Urich, E. et al. Cargo delivery to the brain using transit peptides identified in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
লিখোটা জে., স্কজোরিঞ্জ টি., থমসন এলবি এবং মুস টি.। টার্গেটেড থেরাপি ব্যবহার করে মস্তিষ্কে ম্যাক্রোমলিকিউলার ওষুধের সরবরাহ। জার্নাল অফ নিউরোকেমিস্ট্রি ১১৩, ১–১৩, ১০.১১১১/জে.১৪৭১-৪১৫৯.২০০৯.০৬৫৪৪.এক্স (২০১০)।
ব্রাসঞ্জেভিচ, আই., স্টাইনবুশ, এইচডব্লিউ, শ্মিটজ, সি., এবং মার্টিনেজ-মার্টিনেজ, পি.। রক্ত-মস্তিষ্ক প্রতিবন্ধকের মাধ্যমে পেপটাইড এবং প্রোটিন ওষুধের সরবরাহ। প্রোগ নিউরোবায়োল ৮৭, ২১২–২৫১, ১০.১০১৬/জে.পিনিউরোবায়ো.২০০৮.১২.০০২ (২০০৯)।
পারড্রিজ, ডব্লিউএম রক্ত-মস্তিষ্ক প্রতিবন্ধক: মস্তিষ্কের ঔষধ বিকাশে একটি প্রতিবন্ধকতা। নিউরোআরএক্স ২, ৩–১৪, ১০.১৬০২/নিউরোআরএক্স.২.১.৩ (২০০৫)।
জোহানসন, কে.ই., ডানকান, জে.এ., স্টোপা, ই.জি., এবং বার্ড, এ.। কোরয়েড প্লেক্সাস-সিএসএফ পথের মাধ্যমে মস্তিষ্কে উন্নততর ঔষধ সরবরাহ এবং লক্ষ্য নির্ধারণের সম্ভাবনা। ফার্মাসিউটিক্যাল রিসার্চ ২২, ১০১১–১০৩৭, ১০.১০০৭/এস১১০৯৫-০০৫-৬০৩৯-০ (২০০৫)।
পারড্রিজ, ডব্লিউএম "মস্তিষ্কে সরবরাহের জন্য আণবিক ট্রোজান হর্সের সাহায্যে বায়োফার্মাসিউটিক্যালসের আধুনিকীকরণ"। বায়োকনজুগ কেম ১৯, ১৩২৭–১৩৩৮, ১০.১০২১/বিসি৮০০১৪৮টি (২০০৮)।
পারড্রিজ, রক্ত-মস্তিষ্ক প্রতিবন্ধক জুড়ে WM রিসেপ্টর-মধ্যস্থ পেপটাইড পরিবহন। এন্ডোক্রাইন রিভিউ। ৭, ৩১৪–৩৩০ (১৯৮৬)।
নিভোহনার, জে. প্রমুখ। মনোভ্যালেন্ট মলিকিউলার শাটল ব্যবহার করে থেরাপিউটিক অ্যান্টিবডির মস্তিষ্কে প্রবেশ এবং কার্যকারিতা বৃদ্ধি। নিউরন ৮১, ৪৯–৬০, ১০.১০১৬/জে.নিউরন.২০১৩.১০.০৬১ (২০১৪)।
বিয়েন-লি, এন. এট আল. ট্রান্সফেরিন রিসেপ্টর (TfR) পরিবহন TfR অ্যান্টিবডির অ্যাফিনিটি ভ্যারিয়েন্টের মস্তিষ্কে গ্রহণ নির্ধারণ করে। জে এক্সপ মেড 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014)।