Nature.com দেখার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি সীমিত CSS সমর্থন সহ একটি ব্রাউজার সংস্করণ ব্যবহার করছেন। সেরা অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি আপডেট করা ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে সামঞ্জস্যতা মোড অক্ষম করুন)। এছাড়াও, চলমান সহায়তা নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটি দেখাই।
একসাথে তিনটি স্লাইডের একটি ক্যারোজেল প্রদর্শন করে। একসাথে তিনটি স্লাইডের মধ্য দিয়ে যেতে পূর্ববর্তী এবং পরবর্তী বোতামগুলি ব্যবহার করুন, অথবা শেষে স্লাইডার বোতামগুলি ব্যবহার করে একবারে তিনটি স্লাইডের মধ্য দিয়ে যান।
রক্ত-মস্তিষ্ক বাধা এবং রক্ত-মস্তিষ্ক বাধা বায়োথেরাপিউটিক এজেন্টগুলিকে কেন্দ্রীয় স্নায়ুতন্ত্রে তাদের লক্ষ্যে পৌঁছাতে বাধা দেয়, যার ফলে স্নায়বিক রোগের কার্যকর চিকিৎসা বাধাগ্রস্ত হয়। নতুন মস্তিষ্ক পরিবহনকারী আবিষ্কার করার জন্য, আমরা একটি T7 ফেজ পেপটাইড লাইব্রেরি চালু করেছি এবং ইঁদুরের একটি ক্যানুলেটেড সচেতন বৃহৎ পুল মডেল ব্যবহার করে ধারাবাহিকভাবে রক্ত ​​এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (CSF) সংগ্রহ করেছি। চার রাউন্ড নির্বাচনের পর নির্দিষ্ট ফেজ ক্লোনগুলি CSF-তে অত্যন্ত সমৃদ্ধ করা হয়েছিল। পৃথক প্রার্থী পেপটাইডগুলির পরীক্ষায় CSF-তে 1000-গুণেরও বেশি সমৃদ্ধকরণ দেখা গেছে। চিহ্নিত নতুন ট্রানজিট পেপটাইডের সাথে যুক্ত BACE1 পেপটাইড ইনহিবিটর ব্যবহার করে সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে অ্যামাইলয়েড-β-এর মাত্রা 40% হ্রাসের মাধ্যমে মস্তিষ্কে পেপটাইড-মধ্যস্থতা সরবরাহের জৈবিক কার্যকলাপ নিশ্চিত করা হয়েছে। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে ইন ভিভো ফেজ নির্বাচন পদ্ধতি দ্বারা চিহ্নিত পেপটাইডগুলি থেরাপিউটিক প্রভাব সহ মস্তিষ্কে ম্যাক্রোমোলিকিউলের সিস্টেমিক বিতরণের জন্য কার্যকর বাহন হতে পারে।
কেন্দ্রীয় স্নায়ুতন্ত্র (CNS) লক্ষ্যযুক্ত থেরাপি গবেষণা মূলত CNS-লক্ষ্যবস্তু বৈশিষ্ট্য প্রদর্শনকারী অপ্টিমাইজড ওষুধ এবং এজেন্ট সনাক্তকরণের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছে, মস্তিষ্কে সক্রিয় ওষুধ সরবরাহ পরিচালনাকারী প্রক্রিয়াগুলি আবিষ্কার করার জন্য কম প্রচেষ্টা করা হয়েছে। এটি এখন পরিবর্তিত হতে শুরু করেছে কারণ ওষুধ সরবরাহ, বিশেষ করে বৃহৎ অণু, আধুনিক স্নায়ুবিজ্ঞানের ওষুধ বিকাশের একটি অবিচ্ছেদ্য অংশ। কেন্দ্রীয় স্নায়ুতন্ত্রের পরিবেশ সেরিব্রোভাসকুলার বাধা ব্যবস্থা দ্বারা সুরক্ষিত, যার মধ্যে রয়েছে রক্ত-মস্তিষ্ক বাধা (BBB) ​​এবং রক্ত-মস্তিষ্ক বাধা (BCBB)1, যা মস্তিষ্কে ওষুধ সরবরাহ করাকে চ্যালেঞ্জিং করে তোলে1,2। অনুমান করা হয় যে প্রায় সমস্ত বৃহৎ অণু ওষুধ এবং 98% এরও বেশি ছোট অণু ওষুধ মস্তিষ্ক থেকে নির্মূল করা হয়3। এই কারণেই নতুন মস্তিষ্ক পরিবহন ব্যবস্থা সনাক্ত করা খুবই গুরুত্বপূর্ণ যা CNS 4,5-তে থেরাপিউটিক ওষুধের দক্ষ এবং নির্দিষ্ট সরবরাহ প্রদান করে। যাইহোক, BBB এবং BCSFB ওষুধ সরবরাহের জন্য একটি চমৎকার সুযোগও উপস্থাপন করে কারণ তারা মস্তিষ্কের সমস্ত কাঠামোতে এর বিস্তৃত ভাস্কুলেচারের মাধ্যমে প্রবেশ করে এবং প্রবেশ করে। সুতরাং, মস্তিষ্কে অ-আক্রমণাত্মক পদ্ধতি ব্যবহার করে সরবরাহের বর্তমান প্রচেষ্টাগুলি মূলত এন্ডোজেনাস BBB6 রিসেপ্টর ব্যবহার করে রিসেপ্টর-মধ্যস্থ পরিবহন (PMT) প্রক্রিয়ার উপর ভিত্তি করে। ট্রান্সফারিন রিসেপ্টর পথ ব্যবহারে সাম্প্রতিক গুরুত্বপূর্ণ অগ্রগতি সত্ত্বেও, উন্নত বৈশিষ্ট্য সহ নতুন বিতরণ ব্যবস্থার আরও বিকাশ প্রয়োজন। এই লক্ষ্যে, আমাদের লক্ষ্য ছিল CSF পরিবহনের মধ্যস্থতা করতে সক্ষম পেপটাইডগুলি সনাক্ত করা, কারণ এগুলি নীতিগতভাবে CNS-তে ম্যাক্রোমোলিকিউল সরবরাহ করতে বা নতুন রিসেপ্টর পথ খুলতে ব্যবহার করা যেতে পারে। বিশেষ করে, সেরিব্রোভাসকুলার সিস্টেমের নির্দিষ্ট রিসেপ্টর এবং পরিবহনকারীরা (BBB এবং BSCFB) জৈব থেরাপিউটিক ওষুধের সক্রিয় এবং নির্দিষ্ট সরবরাহের জন্য সম্ভাব্য লক্ষ্য হিসাবে কাজ করতে পারে। সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (CSF) হল কোরয়েড প্লেক্সাস (CS) এর একটি সিক্রেটরি পণ্য এবং সাবরাচনয়েড স্পেস এবং ভেন্ট্রিকুলার স্পেসের মাধ্যমে মস্তিষ্কের ইন্টারস্টিশিয়াল ফ্লুইডের সাথে সরাসরি যোগাযোগ করে। সম্প্রতি এটি দেখানো হয়েছে যে সাবরাচনয়েড সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড মস্তিষ্কের ইন্টারস্টিশিয়ামে অত্যধিকভাবে ছড়িয়ে পড়ে। আমরা আশা করি এই সাবঅ্যারাকনয়েড ইনফ্লো ট্র্যাক্ট ব্যবহার করে অথবা সরাসরি BBB এর মাধ্যমে প্যারেনকাইমাল স্পেসে প্রবেশ করতে পারব। এটি অর্জনের জন্য, আমরা একটি শক্তিশালী ইন ভিভো ফেজ নির্বাচন কৌশল বাস্তবায়ন করেছি যা আদর্শভাবে এই দুটি স্বতন্ত্র পথের যেকোনো একটি দ্বারা পরিবহন করা পেপটাইডগুলিকে সনাক্ত করে।
আমরা এখন একটি সিকোয়েন্সিয়াল ইন ভিভো ফেজ ডিসপ্লে স্ক্রিনিং পদ্ধতি বর্ণনা করছি যার মধ্যে CSF স্যাম্পলিং এবং হাই থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং (HTS) ব্যবহার করে সর্বোচ্চ লাইব্রেরি বৈচিত্র্য সহ প্রাথমিক নির্বাচন রাউন্ডগুলি পর্যবেক্ষণ করা হয়। রক্তের দূষণ এড়াতে স্থায়ীভাবে ইমপ্লান্ট করা বৃহৎ সিস্টারনা (CM) ক্যানুলা ব্যবহার করে সচেতন ইঁদুরের উপর স্ক্রিনিং করা হয়েছিল। গুরুত্বপূর্ণভাবে, এই পদ্ধতিটি মস্তিষ্ক-লক্ষ্য এবং সেরিব্রোভাসকুলার বাধা জুড়ে পরিবহন কার্যকলাপ সহ পেপটাইড উভয়কেই নির্বাচন করে। আমরা T7 ফেজগুলি তাদের ছোট আকারের (~60 nm)10 এর কারণে ব্যবহার করেছি এবং পরামর্শ দিয়েছি যে তারা ভেসিকেল পরিবহনের জন্য উপযুক্ত যা এন্ডোথেলিয়াল এবং/অথবা এপিথেলিয়াল-মেডুলা বাধার ট্রান্সসেলুলার ক্রসিংকে অনুমতি দেয়। চার রাউন্ড প্যানিংয়ের পরে, ফেজ জনসংখ্যা বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল যা শক্তিশালী ইন ভিভো CSF সমৃদ্ধকরণ এবং সেরিব্রাল মাইক্রোভেসেল অ্যাসোসিয়েশন দেখিয়েছে। গুরুত্বপূর্ণভাবে, আমরা আমাদের ফলাফল নিশ্চিত করতে সক্ষম হয়েছি যে পছন্দের এবং রাসায়নিকভাবে সংশ্লেষিত সেরা প্রার্থী পেপটাইডগুলি সেরিব্রোস্পাইনাল তরলে প্রোটিন কার্গো পরিবহন করতে সক্ষম। প্রথমত, BACE1 পেপটাইডের একটি ইনহিবিটারের সাথে একটি লিডিং ট্রানজিট পেপটাইডের সংমিশ্রণে CNS-এর ফার্মাকোডাইনামিক প্রভাব প্রতিষ্ঠিত হয়েছিল। ইন ভিভো ফাংশনাল স্ক্রিনিং কৌশলগুলি কার্যকর প্রোটিন কার্গো বাহক হিসাবে নতুন মস্তিষ্ক পরিবহন পেপটাইডগুলিকে সনাক্ত করতে পারে তা প্রদর্শনের পাশাপাশি, আমরা আশা করি যে নতুন মস্তিষ্ক পরিবহন পথ সনাক্তকরণে অনুরূপ কার্যকরী নির্বাচন পদ্ধতিগুলিও গুরুত্বপূর্ণ হয়ে উঠবে।
ফলক-গঠনকারী ইউনিট (PFU) এর উপর ভিত্তি করে, ফেজ প্যাকেজিং ধাপের পরে, প্রায় 109 বৈচিত্র্য সহ র্যান্ডম 12-mer লিনিয়ার T7 ফেজ পেপটাইডের একটি লাইব্রেরি ডিজাইন এবং তৈরি করা হয়েছিল (উপকরণ এবং পদ্ধতি দেখুন)। এটি মনে রাখা গুরুত্বপূর্ণ যে আমরা ইন ভিভো প্যানিংয়ের আগে এই লাইব্রেরিটি সাবধানতার সাথে বিশ্লেষণ করেছি। পরিবর্তিত প্রাইমার ব্যবহার করে ফেজ লাইব্রেরির নমুনাগুলির পিসিআর পরিবর্ধন এমন অ্যামপ্লিকন তৈরি করেছিল যা সরাসরি HTS-এর জন্য প্রযোজ্য ছিল (পরিপূরক চিত্র 1a)। a) HTS11 সিকোয়েন্সিং ত্রুটি, b) প্রাইমারের মানের উপর প্রভাব (NNK)1-12, এবং c) স্ট্যান্ডবাই লাইব্রেরিতে ওয়াইল্ড-টাইপ (wt) ফেজ (কঙ্কাল সন্নিবেশ) এর উপস্থিতির কারণে, শুধুমাত্র যাচাইকৃত সিকোয়েন্স তথ্য বের করার জন্য একটি সিকোয়েন্স ফিল্টারিং পদ্ধতি প্রয়োগ করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 1b)। এই ফিল্টার পদক্ষেপগুলি সমস্ত HTS সিকোয়েন্সিং লাইব্রেরিতে প্রযোজ্য। স্ট্যান্ডার্ড লাইব্রেরির জন্য, মোট 233,868টি রিড প্রাপ্ত হয়েছিল, যার মধ্যে 39% ফিল্টার মানদণ্ডে উত্তীর্ণ হয়েছিল এবং পরবর্তী রাউন্ডের জন্য লাইব্রেরি বিশ্লেষণ এবং নির্বাচনের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 1c–e)। রিডগুলি মূলত ৩টি বেস জোড়ার দৈর্ঘ্যের গুণিতক ছিল যার সর্বোচ্চ ৩৬টি নিউক্লিওটাইড ছিল (পরিপূরক চিত্র ১c), যা লাইব্রেরি ডিজাইন (NNK) ১-১২ নিশ্চিত করে। উল্লেখযোগ্যভাবে, প্রায় ১১% লাইব্রেরি সদস্যের মধ্যে ১২-মাত্রিক ওয়াইল্ড-টাইপ (wt) ব্যাকবোন PAGISRELVDKL ইনসার্ট ছিল এবং প্রায় অর্ধেক সিকোয়েন্সে (৪৯%) ইনসার্ট বা ডিলিটেশন ছিল। লাইব্রেরি লাইব্রেরির HTS লাইব্রেরিতে পেপটাইডের উচ্চ বৈচিত্র্য নিশ্চিত করেছে: ৮১% এরও বেশি পেপটাইড সিকোয়েন্স শুধুমাত্র একবার পাওয়া গেছে এবং মাত্র ১.৫% ≥৪ কপিতে ঘটেছে (পরিপূরক চিত্র ২a)। রিপারটোয়ের ১২টি অবস্থানে অ্যামিনো অ্যাসিডের (aa) ফ্রিকোয়েন্সি ডিজেনারেট NKK রিপারটোয়ার দ্বারা উৎপন্ন কোডনের সংখ্যার জন্য প্রত্যাশিত ফ্রিকোয়েন্সির সাথে ভালভাবে সম্পর্কযুক্ত (পরিপূরক চিত্র ২b)। এই ইনসার্ট দ্বারা এনকোড করা aa অবশিষ্টাংশের পর্যবেক্ষণ করা ফ্রিকোয়েন্সি গণনা করা ফ্রিকোয়েন্সির সাথে ভালভাবে সম্পর্কযুক্ত (r = 0.893) (পরিপূরক চিত্র ২c)। ইনজেকশনের জন্য ফেজ লাইব্রেরি তৈরিতে এন্ডোটক্সিনের পরিবর্ধন এবং অপসারণের ধাপগুলি অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। এটি পূর্বে ফেজ লাইব্রেরির বৈচিত্র্যকে সম্ভাব্যভাবে হ্রাস করতে দেখা গেছে12,13। অতএব, আমরা একটি প্লেট-পরিবর্ধিত ফেজ লাইব্রেরি সিকোয়েন্স করেছি যা এন্ডোটক্সিন অপসারণের মধ্য দিয়ে গেছে এবং AA এর ফ্রিকোয়েন্সি অনুমান করার জন্য এটিকে মূল লাইব্রেরির সাথে তুলনা করেছি। মূল পুল এবং পরিবর্ধিত এবং পরিশোধিত পুলের মধ্যে একটি শক্তিশালী সম্পর্ক (r = 0.995) পরিলক্ষিত হয়েছে (পরিপূরক চিত্র 2d), যা নির্দেশ করে যে T7 ফেজ ব্যবহার করে প্লেটে পরিবর্ধিত ক্লোনগুলির মধ্যে প্রতিযোগিতা বড় পক্ষপাত সৃষ্টি করেনি। এই তুলনা প্রতিটি লাইব্রেরিতে ট্রাইপেপটাইড মোটিফের ফ্রিকোয়েন্সির উপর ভিত্তি করে, কারণ লাইব্রেরির বৈচিত্র্য (~109) HTS দিয়েও সম্পূর্ণরূপে ধরা যায় না। প্রতিটি অবস্থানে aa এর ফ্রিকোয়েন্সি বিশ্লেষণে প্রবেশ করা ভাণ্ডারের শেষ তিনটি অবস্থানে একটি ছোট অবস্থান-নির্ভর পক্ষপাত প্রকাশ পেয়েছে (পরিপূরক চিত্র 2e)। উপসংহারে, আমরা এই সিদ্ধান্তে পৌঁছেছি যে লাইব্রেরির গুণমান এবং বৈচিত্র্য গ্রহণযোগ্য ছিল এবং নির্বাচনের বেশ কয়েকটি রাউন্ডের মধ্যে ফেজ লাইব্রেরির পরিবর্ধন এবং প্রস্তুতির কারণে বৈচিত্র্যে কেবলমাত্র ছোটখাটো পরিবর্তন পরিলক্ষিত হয়েছিল।
সচেতন ইঁদুরের CM-তে একটি ক্যানুলা সার্জিকাল ইমপ্লান্ট করে ধারাবাহিক সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড স্যাম্পলিং করা যেতে পারে যাতে BBB এবং/অথবা BCSFB (চিত্র 1a-b) এর মাধ্যমে শিরাপথে ইনজেক্ট করা T7 ফেজ সনাক্তকরণ সহজতর হয়। আমরা ইন ভিভো নির্বাচনের প্রথম তিনটি রাউন্ডে (চিত্র 1c) দুটি স্বাধীন নির্বাচন বাহু (বাহু A এবং B) ব্যবহার করেছি। নির্বাচনের প্রথম তিনটি রাউন্ডে প্রবর্তিত ফেজের মোট পরিমাণ হ্রাস করে আমরা ধীরে ধীরে নির্বাচনের কঠোরতা বৃদ্ধি করেছি। প্যানিংয়ের চতুর্থ রাউন্ডের জন্য, আমরা শাখা A এবং B থেকে নমুনা একত্রিত করেছি এবং তিনটি অতিরিক্ত স্বাধীন নির্বাচন করেছি। এই মডেলে T7 ফেজ কণার ইন ভিভো বৈশিষ্ট্যগুলি অধ্যয়ন করার জন্য, ওয়াইল্ড-টাইপ ফেজ (PAGISRELVDKL মাস্টার ইনসার্ট) লেজের শিরার মাধ্যমে ইঁদুরের মধ্যে ইনজেক্ট করা হয়েছিল। বিভিন্ন সময়ে সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড এবং রক্ত ​​থেকে ফেজ পুনরুদ্ধার দেখিয়েছে যে তুলনামূলকভাবে ছোট T7 আইকোসাহেড্রাল ফেজগুলির রক্তের বগি থেকে দ্রুত প্রাথমিক ক্লিয়ারেন্স পর্যায় ছিল (পরিপূরক চিত্র 3)। ইঁদুরের রক্তের পরিমাণ এবং ইনজেকশনের ১০ মিনিট পর রক্তে প্রদত্ত ডোজ থেকে মাত্র ১% ডাব্লুটি ফেজ সনাক্ত করা সম্ভব হয়েছিল। এই প্রাথমিক দ্রুত হ্রাসের পর, প্রাথমিক ক্লিয়ারেন্সের ধীরগতি পরিমাপ করা হয়েছিল যার অর্ধেক জীবনকাল ছিল ২৭.৭ মিনিট। গুরুত্বপূর্ণভাবে, CSF কম্পার্টমেন্ট থেকে খুব কম ফেজই উদ্ধার করা হয়েছিল, যা CSF কম্পার্টমেন্টে বন্য-প্রকারের ফেজ স্থানান্তরের জন্য একটি নিম্ন পটভূমি নির্দেশ করে (পরিপূরক চিত্র ৩)। গড়ে, পুরো নমুনা সময়কালে (০-২৫০ মিনিট) সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে রক্তে T7 ফেজের মাত্র ১ x ১০-৩% টাইটার এবং প্রাথমিকভাবে ইনফিউজড ফেজের ৪ x ১০-৮% সনাক্ত করা হয়েছিল। উল্লেখযোগ্যভাবে, সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে বন্য-প্রকারের ফেজের অর্ধ-জীবন (২৫.৭ মিনিট) রক্তে পরিলক্ষিত মাত্রার অনুরূপ ছিল। এই তথ্যগুলি দেখায় যে সিএম-ক্যানুলেটেড ইঁদুরের রক্ত ​​থেকে সিএসএফ কম্পার্টমেন্টকে আলাদা করার বাধা অক্ষত থাকে, যা ফেজ লাইব্রেরির ভিভো নির্বাচনের মাধ্যমে রক্ত ​​থেকে সিএসএফ কম্পার্টমেন্টে সহজেই পরিবহন করা ক্লোন সনাক্ত করতে সাহায্য করে।
(ক) একটি বৃহৎ পুল থেকে সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (CSF) পুনরায় নমুনা নেওয়ার জন্য একটি পদ্ধতি স্থাপন করা। (খ) কেন্দ্রীয় স্নায়ুতন্ত্রের (CNS) বাধার কোষীয় অবস্থান এবং রক্ত-মস্তিষ্ক বাধা (BBB) ​​এবং রক্ত-মস্তিষ্ক বাধা অতিক্রমকারী পেপটাইড সনাক্ত করতে ব্যবহৃত নির্বাচন কৌশল দেখানো চিত্র। (গ) ইন ভিভো ফেজ ডিসপ্লে স্ক্রিনিং ফ্লোচার্ট। নির্বাচনের প্রতিটি রাউন্ডে, ফেজ (তীরের ভিতরে প্রাণী সনাক্তকারী) শিরাপথে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। নির্বাচনের চতুর্থ রাউন্ড পর্যন্ত দুটি স্বাধীন বিকল্প শাখা (A, B) আলাদাভাবে রাখা হয়েছিল। নির্বাচনের 3 এবং 4 রাউন্ডের জন্য, CSF থেকে নিষ্কাশিত প্রতিটি ফেজ ক্লোন ম্যানুয়ালি সিকোয়েন্স করা হয়েছিল। (ঘ) T7 পেপটাইড লাইব্রেরির (2 x 1012 ফেজ/প্রাণী) শিরাপথে ইনজেকশনের পরে দুটি ক্যানুলেটেড ইঁদুরের নির্বাচনের প্রথম রাউন্ডের সময় রক্ত ​​(লাল বৃত্ত) এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (সবুজ ত্রিভুজ) থেকে বিচ্ছিন্ন ফেজের গতিবিদ্যা। নীল বর্গক্ষেত্র রক্তে ফেজের গড় প্রাথমিক ঘনত্ব নির্দেশ করে, যা ইনজেকশন করা ফেজের পরিমাণ থেকে গণনা করা হয়, মোট রক্তের পরিমাণ বিবেচনা করে। কালো বর্গক্ষেত্রগুলি রক্তের ফেজের ঘনত্ব থেকে এক্সট্রাপোলেট করা y লাইনের ছেদ বিন্দু নির্দেশ করে। (e,f) পেপটাইডে পাওয়া সমস্ত সম্ভাব্য ওভারল্যাপিং ট্রাইপেপটাইড মোটিফের আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি এবং বন্টন উপস্থাপন করুন। 1000 রিডিংয়ে পাওয়া মোটিফের সংখ্যা দেখানো হয়েছে। উল্লেখযোগ্যভাবে (p < 0.001) সমৃদ্ধ মোটিফগুলি লাল বিন্দু দিয়ে চিহ্নিত করা হয়েছে। (e) ইনজেকশন করা লাইব্রেরির ট্রাইপেপটাইড মোটিফের আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি তুলনা করে #1.1 এবং #1.2 প্রাণী থেকে রক্ত ​​থেকে প্রাপ্ত ফেজের সাথে। (f) রক্ত ​​এবং সেরিব্রোস্পাইনাল তরলে বিচ্ছিন্ন প্রাণী ফেজ ট্রাইপেপটাইড মোটিফ #1.1 এবং #1.2 এর আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি তুলনা করে সহসংযোগ স্ক্যাটারপ্লট। (g, h) উভয় প্রাণীর ক্ষেত্রে ইন ভিভো নির্বাচনের এক রাউন্ডের পর রক্তে সমৃদ্ধ ফেজ (g) বনাম ইনজেকশন লাইব্রেরি এবং CSF (h) বনাম রক্তে সমৃদ্ধ ফেজের সিকোয়েন্স আইডি উপস্থাপনা। এক-অক্ষরের কোডের আকার নির্দেশ করে যে সেই অ্যামিনো অ্যাসিডটি কতবার সেই অবস্থানে ঘটে। সবুজ = মেরু, বেগুনি = নিরপেক্ষ, নীল = মৌলিক, লাল = অ্যাসিডিক এবং কালো = হাইড্রোফোবিক অ্যামিনো অ্যাসিড। চিত্র 1a, b ডিজাইন এবং উত্পাদিত হয়েছিল এডুয়ার্ড উরিচ দ্বারা।
আমরা দুটি CM যন্ত্র ইঁদুরের (ক্ল্যাড A এবং B) মধ্যে একটি ফেজ পেপটাইড লাইব্রেরি ইনজেক্ট করেছি এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড এবং রক্ত ​​থেকে ফেজ বিচ্ছিন্ন করেছি (চিত্র 1d)। বন্য-প্রকারের ফেজের তুলনায় লাইব্রেরির প্রাথমিক দ্রুত ক্লিয়ারেন্স কম স্পষ্ট ছিল। উভয় প্রাণীর রক্তে ইনজেক্টেড লাইব্রেরির গড় অর্ধ-জীবন ছিল 24.8 মিনিট, যা বন্য-প্রকারের ফেজের মতো, এবং CSF-তে 38.5 মিনিট। প্রতিটি প্রাণীর রক্ত ​​এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড ফেজের নমুনা HTS-এর অধীনে আনা হয়েছিল এবং একটি সংক্ষিপ্ত ট্রাইপেপটাইড মোটিফের উপস্থিতির জন্য সমস্ত চিহ্নিত পেপটাইড বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ট্রাইপেপটাইড মোটিফগুলি বেছে নেওয়া হয়েছিল কারণ তারা গঠন গঠন এবং পেপটাইড-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়ার জন্য একটি ন্যূনতম ভিত্তি প্রদান করে14,15। ইনজেক্টেড ফেজ লাইব্রেরি এবং উভয় প্রাণীর রক্ত ​​থেকে নিষ্কাশিত ক্লোনগুলির মধ্যে মোটিফ বিতরণে আমরা একটি ভাল সম্পর্ক খুঁজে পেয়েছি (চিত্র 1e)। তথ্য নির্দেশ করে যে লাইব্রেরির গঠন রক্তের বগিতে কেবলমাত্র সামান্য পরিমাণে সমৃদ্ধ। Weblogo16 সফ্টওয়্যারের অভিযোজন ব্যবহার করে প্রতিটি অবস্থানে অ্যামিনো অ্যাসিড ফ্রিকোয়েন্সি এবং ঐক্যমত্য ক্রমগুলি আরও বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। মজার বিষয় হল, আমরা রক্তের গ্লাইসিন অবশিষ্টাংশে একটি শক্তিশালী সমৃদ্ধি খুঁজে পেয়েছি (চিত্র 1g)। যখন CSF থেকে নির্বাচিত ক্লোনগুলির সাথে রক্তের তুলনা করা হয়েছিল, তখন শক্তিশালী নির্বাচন এবং মোটিফগুলির কিছু অনির্বাচন লক্ষ্য করা গিয়েছিল (চিত্র 1f), এবং 12-সদস্যের (চিত্র 1h) পূর্বনির্ধারিত অবস্থানে কিছু অ্যামিনো অ্যাসিড অগ্রাধিকারমূলকভাবে উপস্থিত ছিল। উল্লেখযোগ্যভাবে, পৃথক প্রাণীর সেরিব্রোস্পাইনাল তরলে উল্লেখযোগ্যভাবে পার্থক্য ছিল, যেখানে উভয় প্রাণীর মধ্যে রক্তের গ্লাইসিন সমৃদ্ধি লক্ষ্য করা গিয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 4a-j)। প্রাণী #1.1 এবং #1.2 এর সেরিব্রোস্পাইনাল তরলে ক্রম ডেটা কঠোরভাবে ফিল্টার করার পরে, মোট 964 এবং 420 অনন্য 12-মের পেপটাইড প্রাপ্ত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 1d-e)। বিচ্ছিন্ন ফেজ ক্লোনগুলিকে প্রশস্ত করা হয়েছিল এবং ইন ভিভো নির্বাচনের দ্বিতীয় রাউন্ডের শিকার করা হয়েছিল। দ্বিতীয় রাউন্ডের নির্বাচন থেকে নিষ্কাশিত ফেজ প্রতিটি প্রাণীর HTS-এর অধীনে আনা হয়েছিল এবং ট্রাইপেপটাইড মোটিফের ঘটনা বিশ্লেষণ করার জন্য একটি মোটিফ স্বীকৃতি প্রোগ্রামে ইনপুট হিসাবে সমস্ত চিহ্নিত পেপটাইড ব্যবহার করা হয়েছিল (চিত্র 2a, b, ef)। CSF থেকে উদ্ধার করা ফেজের প্রথম চক্রের তুলনায়, আমরা A এবং B শাখায় CSF-এর অনেক মোটিফের আরও নির্বাচন এবং নির্বাচন বিচ্ছিন্নকরণ লক্ষ্য করেছি (চিত্র 2)। তারা সামঞ্জস্যপূর্ণ ক্রমের বিভিন্ন প্যাটার্নের প্রতিনিধিত্ব করে কিনা তা নির্ধারণ করার জন্য একটি নেটওয়ার্ক সনাক্তকরণ অ্যালগরিদম প্রয়োগ করা হয়েছিল। বিকল্প ক্লেড A (চিত্র 2c, d) এবং ক্লেড B (চিত্র 2g, h) তে CSF দ্বারা পুনরুদ্ধার করা 12-মাত্রিক ক্রমগুলির মধ্যে একটি স্পষ্ট মিল লক্ষ্য করা গেছে। প্রতিটি শাখায় পুল করা বিশ্লেষণে 12-মের পেপটাইডের জন্য বিভিন্ন নির্বাচন প্রোফাইল (পরিপূরক চিত্র 5c, d) এবং দ্বিতীয় রাউন্ডের নির্বাচনের পরে পুল করা ক্লোনগুলির জন্য সময়ের সাথে সাথে CSF/রক্ত টাইটার অনুপাত বৃদ্ধি পেয়েছে যা প্রথম রাউন্ডের নির্বাচনের তুলনায় (পরিপূরক চিত্র 5e)।
ইন ভিভো ফাংশনাল ফেজ ডিসপ্লে নির্বাচনের পরপর দুটি রাউন্ডের মাধ্যমে সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে মোটিফ এবং পেপটাইডের সমৃদ্ধি।
প্রতিটি প্রাণীর (প্রাণী #1.1 এবং #1.2) প্রথম রাউন্ড থেকে উদ্ধার করা সমস্ত সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড ফেজগুলিকে পুল, অ্যামপ্লিফাইন্ড, HT-সিকোয়েন্সড এবং একসাথে পুনরায় ইনজেক্ট করা হয়েছিল (2 x 1010 ফেজ/প্রাণী) 2টি SM ক্যানুলেটেড ইঁদুর (#1.1 → #)। 2.1 এবং 2.2, 1.2 → 2.3 এবং 2.4)। (a,b,e,f) প্রথম এবং দ্বিতীয় নির্বাচন রাউন্ডে সমস্ত CSF-প্রাপ্ত ফেজের ট্রাইপেপটাইড মোটিফের আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি তুলনা করে পারস্পরিক সম্পর্ক স্ক্যাটারপ্লট। উভয় ওরিয়েন্টেশনে পেপটাইডে পাওয়া সমস্ত সম্ভাব্য ওভারল্যাপিং ট্রাইপেপটাইডের প্রতিনিধিত্বকারী মোটিফগুলির আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি এবং বিতরণ। 1000 রিডিংয়ে পাওয়া মোটিফের সংখ্যা দেখানো হয়েছে। তুলনামূলক লাইব্রেরিগুলির একটিতে উল্লেখযোগ্যভাবে নির্বাচিত বা বাদ দেওয়া মোটিফগুলি (p < 0.001) লাল বিন্দু দিয়ে হাইলাইট করা হয়েছে। (c, d, g, h) ইন ভিভো নির্বাচনের রাউন্ড 2 এবং 1 এর উপর ভিত্তি করে সমস্ত CSF-সমৃদ্ধ 12 অ্যামিনো অ্যাসিড দীর্ঘ সিকোয়েন্সের সিকোয়েন্স লোগো উপস্থাপনা। এক-অক্ষরের কোডের আকার নির্দেশ করে যে সেই অবস্থানে সেই অ্যামিনো অ্যাসিড কত ঘন ঘন ঘটে। লোগোটি উপস্থাপন করার জন্য, দুটি নির্বাচন রাউন্ডের মধ্যে পৃথক প্রাণী থেকে নিষ্কাশিত CSF সিকোয়েন্সের ফ্রিকোয়েন্সি তুলনা করা হয় এবং দ্বিতীয় রাউন্ডে সমৃদ্ধ সিকোয়েন্সগুলি দেখানো হয়: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 এবং (h) #1.2–#2.4। (c, d) নং 2.1 এবং নং 2.2 প্রাণী বা (g, h) নং 2.3 এবং নং 2.4 প্রাণীর একটি নির্দিষ্ট অবস্থানে সর্বাধিক সমৃদ্ধ অ্যামিনো অ্যাসিডগুলি রঙে দেখানো হয়েছে। সবুজ = মেরু, বেগুনি = নিরপেক্ষ, নীল = মৌলিক, লাল = অ্যাসিডিক এবং কালো = হাইড্রোফোবিক অ্যামিনো অ্যাসিড।
তৃতীয় রাউন্ড নির্বাচনের পর, আমরা দুটি প্রাণী থেকে বিচ্ছিন্ন 332টি CSF-পুনর্গঠিত ফেজ ক্লোন থেকে 124টি অনন্য পেপটাইড সিকোয়েন্স (#3.1 এবং #3.2) সনাক্ত করেছি (পরিপূরক চিত্র 6a)। LGSVS (18.7%) সিকোয়েন্সের আপেক্ষিক অনুপাত সর্বাধিক ছিল, তারপরে বন্য-প্রকারের সন্নিবেশ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), এবং SARGSWREIVSLS (2.2%) রয়েছে। চূড়ান্ত চতুর্থ রাউন্ডে, আমরা তিনটি পৃথক প্রাণী থেকে দুটি স্বাধীনভাবে নির্বাচিত শাখা একত্রিত করেছি (চিত্র 1c)। CSF থেকে উদ্ধার করা 925টি সিকোয়েন্সড ফেজ ক্লোনের মধ্যে, চতুর্থ রাউন্ডে আমরা 64টি অনন্য পেপটাইড সিকোয়েন্স (পরিপূরক চিত্র 6b) পেয়েছি, যার মধ্যে বন্য-প্রকারের ফেজের আপেক্ষিক অনুপাত 0.8% এ নেমে এসেছে। চতুর্থ রাউন্ডে সবচেয়ে সাধারণ CSF ক্লোনগুলি ছিল LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) এবং RLSSVDSDLSGC (3, 2%. %)। নির্বাচিত পেপটাইডগুলির দৈর্ঘ্য পরিসীমা NNK লাইব্রেরি ডিজাইনের জন্য ডিজেনারেট কোডন ব্যবহার করার সময় লাইব্রেরি প্রাইমারগুলিতে নিউক্লিওটাইড সন্নিবেশ/মুছে ফেলা বা অকাল স্টপ কোডনের কারণে হয়। অকাল স্টপ কোডনগুলি ছোট পেপটাইড তৈরি করে এবং নির্বাচিত হয় কারণ এতে অনুকূল aa মোটিফ থাকে। সিন্থেটিক লাইব্রেরির প্রাইমারগুলিতে সন্নিবেশ/মুছে ফেলার ফলে দীর্ঘ পেপটাইড হতে পারে। এটি ডিজাইন করা স্টপ কোডনটিকে ফ্রেমের বাইরে রাখে এবং একটি নতুন স্টপ কোডন ডাউনস্ট্রিম প্রদর্শিত না হওয়া পর্যন্ত এটি পড়ে। সাধারণভাবে, আমরা নমুনা আউটপুট ডেটার সাথে ইনপুট ডেটা তুলনা করে চারটি নির্বাচন রাউন্ডের জন্য সমৃদ্ধকরণের কারণ গণনা করেছি। প্রথম রাউন্ড স্ক্রিনিংয়ের জন্য, আমরা একটি অ-নির্দিষ্ট পটভূমি রেফারেন্স হিসাবে ওয়াইল্ড-টাইপ ফেজ টাইটার ব্যবহার করেছি। মজার বিষয় হল, প্রথম CSF চক্রে নেতিবাচক ফেজ নির্বাচন খুব শক্তিশালী ছিল, কিন্তু রক্তে নয় (চিত্র 3a), যা পেপটাইড লাইব্রেরির বেশিরভাগ সদস্যের CSF কম্পার্টমেন্টে নিষ্ক্রিয় বিস্তারের কম সম্ভাবনার কারণে হতে পারে অথবা আপেক্ষিক ফেজগুলি ব্যাকটিরিওফেজের তুলনায় রক্তপ্রবাহ থেকে আরও দক্ষতার সাথে ধরে রাখা বা অপসারণ করা হয়। যাইহোক, প্যানিংয়ের দ্বিতীয় রাউন্ডে, উভয় ক্লেডেই CSF-তে ফেজের শক্তিশালী নির্বাচন লক্ষ্য করা গেছে, যা ইঙ্গিত দেয় যে পূর্ববর্তী রাউন্ডটি CSF গ্রহণকে উৎসাহিত করে এমন পেপটাইড প্রদর্শনকারী ফেজে সমৃদ্ধ ছিল (চিত্র 3a)। আবার, উল্লেখযোগ্য রক্ত ​​সমৃদ্ধকরণ ছাড়াই। এছাড়াও তৃতীয় এবং চতুর্থ রাউন্ডে, ফেজ ক্লোনগুলি CSF-তে উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ হয়েছিল। নির্বাচনের শেষ দুটি রাউন্ডের মধ্যে প্রতিটি অনন্য পেপটাইড ক্রমের আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি তুলনা করে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে নির্বাচনের চতুর্থ রাউন্ডে (চিত্র 3b) ক্রমগুলি আরও বেশি সমৃদ্ধ হয়েছিল। উভয় পেপটাইড ওরিয়েন্টেশন ব্যবহার করে ৬৪টি অনন্য পেপটাইড সিকোয়েন্স থেকে মোট ৯৩১টি ট্রাইপেপটাইড মোটিফ বের করা হয়েছিল। চতুর্থ রাউন্ডে সবচেয়ে সমৃদ্ধ মোটিফগুলিকে ইনজেক্টেড লাইব্রেরির (কাট-অফ: ১০% সমৃদ্ধকরণ) তুলনায় সমস্ত রাউন্ড জুড়ে তাদের সমৃদ্ধকরণ প্রোফাইলের জন্য আরও নিবিড়ভাবে পরীক্ষা করা হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র ৬c)। নির্বাচনের সাধারণ ধরণগুলি দেখায় যে উভয় নির্বাচন শাখার পূর্ববর্তী সমস্ত রাউন্ডে অধ্যয়ন করা বেশিরভাগ মোটিফ সমৃদ্ধ করা হয়েছিল। তবে, কিছু মোটিফ (যেমন SGL, VSG, LGS GSV) মূলত বিকল্প ক্লেড A থেকে ছিল, অন্যগুলি (যেমন FGW, RTN, WGF, NTR) বিকল্প ক্লেড B তে সমৃদ্ধ করা হয়েছিল।
স্ট্রেপটাভিডিন পেলোডের সাথে সংযুক্ত CSF-সমৃদ্ধ ফেজ-প্রদর্শিত পেপটাইড এবং বায়োটিনিলেটেড লিডার পেপটাইডের CSF পরিবহনের বৈধতা।
(ক) ইনজেক্টেড (ইনপুট = I) ফেজ (PFU) টাইটার এবং নির্ধারিত CSF ফেজ টাইটার (আউটপুট = O) এর উপর ভিত্তি করে চারটি রাউন্ডে (R1-R4) গণনা করা সমৃদ্ধকরণ অনুপাত। শেষ তিনটি রাউন্ডের (R2-R4) সমৃদ্ধকরণ ফ্যাক্টরগুলি ওজন ডেটা সহ পূর্ববর্তী রাউন্ড এবং প্রথম রাউন্ড (R1) এর সাথে তুলনা করে গণনা করা হয়েছিল। খোলা বারগুলি হল সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড, ছায়াযুক্ত বারগুলি হল প্লাজমা। (***p<0.001, ছাত্রের টি-টেস্টের উপর ভিত্তি করে)। (খ) নির্বাচনের চতুর্থ রাউন্ডের পরে CSF-তে সংগৃহীত সমস্ত ফেজের আপেক্ষিক অনুপাত অনুসারে সর্বাধিক প্রচুর ফেজ পেপটাইডের তালিকা। ছয়টি সর্বাধিক সাধারণ ফেজ ক্লোন নির্বাচনের তৃতীয় এবং চতুর্থ রাউন্ডের মধ্যে রঙ, সংখ্যা এবং তাদের সমৃদ্ধকরণ ফ্যাক্টরগুলিতে হাইলাইট করা হয়েছে (ইনসেট)। (গ,ঘ) চতুর্থ রাউন্ডের ছয়টি সর্বাধিক সমৃদ্ধ ফেজ ক্লোন, খালি ফেজ এবং প্যারেন্টাল ফেজ পেপটাইড লাইব্রেরিগুলি একটি CSF নমুনা মডেলে পৃথকভাবে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। নির্দিষ্ট সময়ে CSF এবং রক্তের নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল। (c) সমান পরিমাণে 6টি প্রার্থী ফেজ ক্লোন (2 x 1010 ফেজ/প্রাণী), খালি ফেজ (#1779) (2 x 1010 ফেজ/প্রাণী) এবং স্টক ফেজ পেপটাইড লাইব্রেরি (2 x 1012 ফেজ/প্রাণী)। লেজের শিরার মাধ্যমে পৃথকভাবে ক্যানুলেটেড প্রাণীতে কমপক্ষে 3 CM ইনজেকশন দেওয়া হয়। প্রতিটি ইনজেকশন করা ফেজ ক্লোন এবং ফেজ পেপটাইড লাইব্রেরির CSF ফার্মাকোকিনেটিক্স সময়ের সাথে সাথে দেখানো হয়েছে। (d) নমুনা গ্রহণের সময় সমস্ত পুনরুদ্ধার করা ফেজ/mL এর জন্য গড় CSF/রক্ত অনুপাত দেখায়। (e) চারটি সিন্থেটিক লিডার পেপটাইড এবং একটি স্ক্র্যাম্বলড কন্ট্রোল তাদের N-টার্মিনাস (টেট্রামার ডিসপ্লে) এর মাধ্যমে স্ট্রেপটাভিডিনের সাথে বায়োটিনের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল এবং তারপরে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল (টেল ভেইন iv, 10 মিলিগ্রাম স্ট্রেপটাভিডিন/কেজি)। কমপক্ষে তিনটি ইনটিউবেটেড ইঁদুর (N = 3)। নির্দিষ্ট সময়ে CSF নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং CSF অ্যান্টি-স্ট্রেপ্টাভিডিন ELISA (nd = সনাক্ত করা হয়নি) দ্বারা স্ট্রেপ্টাভিডিনের ঘনত্ব পরিমাপ করা হয়েছিল। (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA পরীক্ষার উপর ভিত্তি করে)। (f) চতুর্থ রাউন্ড নির্বাচন থেকে নির্বাচিত অন্যান্য ফেজ পেপটাইড ক্লোনের সাথে সর্বাধিক সমৃদ্ধ ফেজ পেপটাইড ক্লোন #2002 (বেগুনি) এর অ্যামিনো অ্যাসিড ক্রম তুলনা। অভিন্ন এবং অনুরূপ অ্যামিনো অ্যাসিড খণ্ডগুলি রঙ-কোডেড।
চতুর্থ রাউন্ডে (চিত্র 3b) সমস্ত সমৃদ্ধ ফেজের মধ্যে, CSF নমুনা মডেলে আরও পৃথক বিশ্লেষণের জন্য ছয়টি প্রার্থী ক্লোন নির্বাচন করা হয়েছিল। তিনটি ক্যানুলেটেড CM প্রাণীর মধ্যে সমান পরিমাণে ছয়টি প্রার্থী ফেজ, খালি ফেজ (কোনও সন্নিবেশ নেই) এবং প্রোফেজ পেপটাইড লাইব্রেরি ইনজেক্ট করা হয়েছিল এবং CSF (চিত্র 3c) এবং রক্তে (পরিপূরক চিত্র 7) অ্যাসে ফার্মাকোকাইনেটিক্স নির্ধারণ করা হয়েছিল। পরীক্ষিত সমস্ত ফেজ ক্লোন খালি নিয়ন্ত্রণ ফেজের (#1779) চেয়ে 10-1000 গুণ বেশি স্তরে CSF কম্পার্টমেন্টকে লক্ষ্য করে। উদাহরণস্বরূপ, ক্লোন #2020 এবং #2077-এ নিয়ন্ত্রণ ফেজের তুলনায় প্রায় 1000 গুণ বেশি CSF টাইটার ছিল। প্রতিটি নির্বাচিত পেপটাইডের ফার্মাকোকাইনেটিক প্রোফাইল আলাদা, তবে তাদের সকলেরই উচ্চ CSF হোমিং ক্ষমতা রয়েছে। আমরা সময়ের সাথে সাথে ক্লোন #1903 এবং #2011 এর ক্ষেত্রে একটি ধ্রুবক হ্রাস লক্ষ্য করেছি, যেখানে ক্লোন #2077, #2002 এবং #2009 এর ক্ষেত্রে প্রথম 10 মিনিটের মধ্যে বৃদ্ধি সক্রিয় পরিবহন নির্দেশ করতে পারে তবে যাচাই করা প্রয়োজন। ক্লোন #2020, #2002, এবং #2077 উচ্চ স্তরে স্থিতিশীল হয়েছে, যেখানে ক্লোন #2009 এর CSF ঘনত্ব প্রাথমিক বৃদ্ধির পরে ধীরে ধীরে হ্রাস পেয়েছে। এরপর আমরা প্রতিটি CSF প্রার্থীর আপেক্ষিক ফ্রিকোয়েন্সি তার রক্তের ঘনত্বের সাথে তুলনা করেছি (চিত্র 3d)। সমস্ত নমুনার সময় প্রতিটি CSF প্রার্থীর গড় টাইটারের সাথে তার রক্তের টাইটারের পারস্পরিক সম্পর্ক দেখিয়েছে যে ছয়জন প্রার্থীর মধ্যে তিনটি রক্তের CSF-তে উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ ছিল। মজার বিষয় হল, ক্লোন #2077 উচ্চ রক্তের স্থিতিশীলতা দেখিয়েছে (পরিপূরক চিত্র 7)। পেপটাইডগুলি নিজেই ফেজ কণা ছাড়া অন্যান্য কার্গো সক্রিয়ভাবে CSF কম্পার্টমেন্টে পরিবহন করতে সক্ষম তা নিশ্চিত করার জন্য, আমরা N-টার্মিনাসে বায়োটিন দিয়ে তৈরি চারটি লিডার পেপটাইড সংশ্লেষিত করেছি যেখানে পেপটাইডগুলি ফেজ কণার সাথে সংযুক্ত থাকে। বায়োটিনিলেটেড পেপটাইডগুলি (নম্বর ২০০২, ২০০৯, ২০২০ এবং ২০৭৭) স্ট্রেপটাভিডিন (SA) এর সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল যাতে ফেজ জ্যামিতির অনুকরণকারী মাল্টিমেরিক ফর্ম পাওয়া যায়। এই ফর্ম্যাটটি আমাদের রক্ত ​​এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে কার্গো-পরিবহনকারী প্রোটিন পেপটাইড হিসাবে SA এক্সপোজার পরিমাপ করার অনুমতি দেয়। গুরুত্বপূর্ণভাবে, এই SA-কনজুগেটেড ফর্ম্যাটে (চিত্র 3e) সিন্থেটিক পেপটাইডগুলি পরিচালনা করার সময় ফেজ ডেটা প্রায়শই পুনরুত্পাদন করা যেতে পারে। স্ক্র্যাম্বলড পেপটাইডগুলির প্রাথমিক এক্সপোজার কম ছিল এবং 48 ঘন্টার মধ্যে সনাক্ত করা যায় না এমন স্তরের সাথে দ্রুত CSF ক্লিয়ারেন্স ছিল। CSF স্পেসে এই পেপটাইড ফেজ ক্লোনগুলির ডেলিভারি পথ সম্পর্কে অন্তর্দৃষ্টি পেতে, আমরা ভিভোতে শিরায় ইনজেকশন দেওয়ার 1 ঘন্টা পরে সরাসরি ফেজ কণা সনাক্ত করতে ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি (IHC) ব্যবহার করে পৃথক ফেজ পেপটাইড হিটের স্থানীয়করণ বিশ্লেষণ করেছি। উল্লেখযোগ্যভাবে, ক্লোন #2002, #2077, এবং #2009 মস্তিষ্কের কৈশিকগুলিতে শক্তিশালী দাগের মাধ্যমে সনাক্ত করা যেতে পারে, যেখানে নিয়ন্ত্রণ ফেজ (#1779) এবং ক্লোন #2020 সনাক্ত করা যায়নি (পরিপূরক চিত্র 8)। এটি পরামর্শ দেয় যে এই পেপটাইডগুলি BBB অতিক্রম করে মস্তিষ্কের উপর প্রভাবে অবদান রাখে। এই অনুমানটি পরীক্ষা করার জন্য আরও বিশদ বিশ্লেষণ প্রয়োজন, কারণ BSCFB রুটটিও জড়িত থাকতে পারে। সর্বাধিক সমৃদ্ধ ক্লোন (#2002) এর অ্যামিনো অ্যাসিড ক্রমকে অন্যান্য নির্বাচিত পেপটাইডের সাথে তুলনা করার সময়, এটি লক্ষ্য করা গেছে যে তাদের মধ্যে কিছুতে একই রকম অ্যামিনো অ্যাসিড এক্সটেনশন রয়েছে, যা একই রকম পরিবহন প্রক্রিয়া নির্দেশ করতে পারে (চিত্র 3f)।
এর অনন্য প্লাজমা প্রোফাইল এবং সময়ের সাথে সাথে CSF-তে উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধির কারণে, ফেজ ডিসপ্লে ক্লোন #2077 দীর্ঘ 48-ঘন্টা সময় ধরে আরও অন্বেষণ করা হয়েছিল এবং টেকসই SA স্তরের সাথে মিলিত CSF-তে দ্রুত বৃদ্ধি পুনরুত্পাদন করতে সক্ষম হয়েছিল (চিত্র 4a)। অন্যান্য চিহ্নিত ফেজ ক্লোনগুলির ক্ষেত্রে, #2077 মস্তিষ্কের কৈশিকগুলির জন্য দৃঢ়ভাবে দাগযুক্ত এবং উচ্চ রেজোলিউশনে দেখা গেলে কৈশিক মার্কার লেকটিনের সাথে উল্লেখযোগ্য সমষ্টিগতকরণ এবং সম্ভবত প্যারেনকাইমাল স্পেসে কিছু দাগযুক্ততা দেখিয়েছে (চিত্র 4b)। CNS-তে পেপটাইড-মধ্যস্থতাযুক্ত ফার্মাকোলজিক্যাল প্রভাব পাওয়া যেতে পারে কিনা তা তদন্ত করার জন্য, আমরা একটি পরীক্ষা চালিয়েছি যেখানে i) #2077 ট্রানজিট পেপটাইড এবং ii) BACE1 ইনহিবিটর পেপটাইডের বায়োটিনাইলেটেড সংস্করণগুলিকে SA-এর সাথে দুটি ভিন্ন অনুপাতে মিশ্রিত করা হয়েছিল। একটি সংমিশ্রণের জন্য আমরা শুধুমাত্র BACE1 পেপটাইড ইনহিবিটর ব্যবহার করেছি এবং অন্যটির জন্য আমরা BACE1 পেপটাইড ইনহিবিটরের #2077 পেপটাইডের সাথে 1:3 অনুপাত ব্যবহার করেছি। দুটি নমুনাই শিরাপথে দেওয়া হয়েছিল এবং রক্ত ​​ও সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডের মাত্রা সময়ের সাথে সাথে পরিমাপ করা হয়েছিল। Abeta40 CSF-তে পরিমাপ করা হয়েছিল কারণ এটি মস্তিষ্কের প্যারেনকাইমায় BACE1 প্রতিরোধকে প্রতিফলিত করে। যেমনটি প্রত্যাশা করা হয়েছিল, উভয় জটিলই Abeta40-এর রক্তের মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে (চিত্র 4c, d)। তবে, কেবলমাত্র পেপটাইড নং 2077 এবং SA-তে সংযোজিত BACE1 পেপটাইডের একটি প্রতিরোধকের মিশ্রণ ধারণকারী নমুনাগুলি সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে Abeta40-এর উল্লেখযোগ্য হ্রাস ঘটায় (চিত্র 4c)। তথ্য দেখায় যে পেপটাইড নং 2077 60 kDa SA প্রোটিনকে CNS-তে পরিবহন করতে সক্ষম এবং BACE1 পেপটাইডের SA-সংযোজিত ইনহিবিটরগুলির সাথে ফার্মাকোলজিকাল প্রভাবও প্ররোচিত করে।
(ক) কমপক্ষে তিনটি CM-ইনটিউবেটেড ইঁদুরের মধ্যে CSF পেপটাইড #2077 (RLSSVDSDLSGC) এবং ইনজেক্টেড কন্ট্রোল ফেজ (#1779) এর দীর্ঘমেয়াদী ফার্মাকোকিনেটিক প্রোফাইল দেখানো T7 ফেজের ক্লোনাল ইনজেকশন (2 × 10 ফেজ/প্রাণী)। (খ) ফেজ-ইনজেক্টেড ইঁদুরের (2 × 10 10 ফেজ/প্রাণী) প্রতিনিধিত্বমূলক কর্টিকাল মাইক্রোভেসেলের কনফোকাল মাইক্রোস্কোপিক চিত্র যা পেপটাইড #2077 এবং জাহাজের (লেক্টিন) প্রতি-রঙিনতা দেখায়। এই ফেজ ক্লোনগুলি 3টি ইঁদুরকে দেওয়া হয়েছিল এবং পারফিউশনের আগে 1 ঘন্টা ধরে সঞ্চালনের অনুমতি দেওয়া হয়েছিল। মস্তিষ্ককে T7 ফেজ ক্যাপসিডের বিরুদ্ধে পলিক্লোনাল FITC-লেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডি দিয়ে ভাগ করা হয়েছিল এবং দাগ দেওয়া হয়েছিল। পারফিউশন এবং পরবর্তী স্থিরকরণের দশ মিনিট আগে, DyLight594-লেবেলযুক্ত লেকটিন শিরাপথে দেওয়া হয়েছিল। ফ্লুরোসেন্ট ছবিতে কৈশিক এবং পেরিভাসকুলার মস্তিষ্কের টিস্যুর লুমেনে মাইক্রোভেসেল এবং ফেজ (সবুজ) এর লুমিনাল পাশে লেকটিন দাগ (লাল) দেখা যাচ্ছে। স্কেল বারটি 10 ​​µm এর সাথে মিলে যায়। (c, d) বায়োটিনাইলেটেড BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইড একা বা বায়োটিনাইলেটেড ট্রানজিট পেপটাইড #2077 এর সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল স্ট্রেপটাভিডিনের সাথে, তারপরে কমপক্ষে তিনটি ক্যানুলেটেড CM ইঁদুরের (10 মিলিগ্রাম স্ট্রেপটাভিডিন/কেজি) শিরায় ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। BACE1 পেপটাইড ইনহিবিটর-মধ্যস্থতা হ্রাস Aβ40 এর মধ্যে নির্দেশিত সময় বিন্দুতে রক্তে (লাল) এবং সেরিব্রোস্পাইনাল তরলে (কমলা) Aβ1-40 ELISA দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। আরও স্পষ্টতার জন্য, গ্রাফে 100% স্কেলে একটি বিন্দুযুক্ত রেখা আঁকা হয়েছে। (c) 3:1 অনুপাতে স্ট্রেপটাভিডিন ট্রানজিট পেপটাইড #2077 এবং BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইডের সাথে সংযুক্ত ইঁদুরের রক্তে Aβ40 (লাল ত্রিভুজ) এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (কমলা ত্রিভুজ) এর শতাংশ হ্রাস। (d) শুধুমাত্র BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইডের সাথে সংযুক্ত স্ট্রেপটাভিডিন দিয়ে চিকিত্সা করা ইঁদুরের রক্তে Aβ40 (লাল বৃত্ত) এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (কমলা বৃত্ত) এর শতাংশ হ্রাস। নিয়ন্ত্রণে Aβ ঘনত্ব ছিল 420 pg/ml (মানক বিচ্যুতি = 101 pg/ml)।
বায়োমেডিকেল গবেষণার বিভিন্ন ক্ষেত্রে ফেজ ডিসপ্লে সফলভাবে প্রয়োগ করা হয়েছে17। এই পদ্ধতিটি ইন ভিভো ভাস্কুলার ডাইভারসিটি স্টাডি 18,19 এর পাশাপাশি সেরিব্রাল ভেসেলগুলিকে লক্ষ্য করে করা গবেষণায় ব্যবহার করা হয়েছে20,21,22,23,24,25,26। এই গবেষণায়, আমরা এই নির্বাচন পদ্ধতির প্রয়োগ কেবল সেরিব্রাল ভেসেলগুলিকে লক্ষ্য করে পেপটাইডগুলির সরাসরি সনাক্তকরণের জন্যই নয়, বরং রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা অতিক্রম করার জন্য সক্রিয় পরিবহন বৈশিষ্ট্যযুক্ত প্রার্থীদের আবিষ্কারের জন্যও প্রসারিত করেছি। আমরা এখন CM ইনটিউবেটেড ইঁদুরগুলিতে একটি ইন ভিভো নির্বাচন পদ্ধতির বিকাশ বর্ণনা করছি এবং CSF হোমিং বৈশিষ্ট্য সহ পেপটাইডগুলি সনাক্ত করার সম্ভাবনা প্রদর্শন করছি। 12-মের র্যান্ডম পেপটাইডের একটি লাইব্রেরি প্রদর্শনকারী T7 ফেজ ব্যবহার করে, আমরা প্রমাণ করতে সক্ষম হয়েছি যে T7 ফেজ যথেষ্ট ছোট (প্রায় 60 nm ব্যাস)10 রক্ত-মস্তিষ্কের বাধার সাথে খাপ খাইয়ে নেওয়ার জন্য, যার ফলে সরাসরি রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা বা কোরয়েড প্লেক্সাস অতিক্রম করে। আমরা লক্ষ্য করেছি যে ক্যানুলেটেড সিএম ইঁদুর থেকে CSF সংগ্রহ একটি সু-নিয়ন্ত্রিত ইন ভিভো কার্যকরী স্ক্রিনিং পদ্ধতি ছিল এবং নিষ্কাশিত ফেজ কেবল ভাস্কুলেচারের সাথে আবদ্ধ ছিল না বরং রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা পেরিয়ে একটি পরিবহনকারী হিসাবেও কাজ করেছিল। তদুপরি, একই সাথে রক্ত ​​সংগ্রহ করে এবং CSF এবং রক্ত ​​থেকে প্রাপ্ত ফেজগুলিতে HTS প্রয়োগ করে, আমরা নিশ্চিত করেছি যে আমাদের CSF পছন্দ রক্ত ​​সমৃদ্ধকরণ বা নির্বাচনের রাউন্ডগুলির মধ্যে সম্প্রসারণের জন্য উপযুক্ততার দ্বারা প্রভাবিত হয়নি। যাইহোক, রক্তের বগি নির্বাচন পদ্ধতির অংশ, যেহেতু CSF বগিতে পৌঁছাতে সক্ষম ফেজগুলিকে মস্তিষ্কে সমৃদ্ধ করার জন্য যথেষ্ট সময় ধরে রক্তপ্রবাহে বেঁচে থাকতে হবে এবং সঞ্চালিত হতে হবে। কাঁচা HTS ডেটা থেকে নির্ভরযোগ্য ক্রম তথ্য বের করার জন্য, আমরা বিশ্লেষণ কর্মপ্রবাহে প্ল্যাটফর্ম-নির্দিষ্ট সিকোয়েন্সিং ত্রুটির সাথে অভিযোজিত ফিল্টারগুলি প্রয়োগ করেছি। স্ক্রিনিং পদ্ধতিতে গতিগত পরামিতি অন্তর্ভুক্ত করে, আমরা রক্তে বন্য-টাইপ T7 ফেজ (t½ ~ 28 মিনিট) এর দ্রুত ফার্মাকোকিনেটিক্স নিশ্চিত করেছি 24, 27, 28 এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে তাদের অর্ধ-জীবন (t½ ~ 26 মিনিট) প্রতি মিনিটে নির্ধারণ করেছি। রক্ত এবং CSF-তে একই রকম ফার্মাকোকাইনেটিক প্রোফাইল থাকা সত্ত্বেও, CSF-তে ফেজের রক্তের ঘনত্বের মাত্র 0.001% সনাক্ত করা সম্ভব হয়েছে, যা রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা পেরিয়ে বন্য-প্রকার T7 ফেজের কম পটভূমি গতিশীলতা নির্দেশ করে। এই কাজটি ইন ভিভো প্যানিং কৌশল ব্যবহার করার সময় প্রথম রাউন্ড নির্বাচনের গুরুত্ব তুলে ধরে, বিশেষ করে ফেজ সিস্টেমের জন্য যা দ্রুত সঞ্চালন থেকে পরিষ্কার করা হয়, কারণ খুব কম ক্লোনই CNS কম্পার্টমেন্টে পৌঁছাতে সক্ষম হয়। সুতরাং, প্রথম রাউন্ডে, লাইব্রেরি বৈচিত্র্য হ্রাস খুব বড় ছিল, কারণ এই অত্যন্ত কঠোর CSF মডেলে শেষ পর্যন্ত সীমিত সংখ্যক ক্লোন সংগ্রহ করা হয়েছিল। এই ইন ভিভো প্যানিং কৌশলটিতে বেশ কয়েকটি নির্বাচন পদক্ষেপ অন্তর্ভুক্ত ছিল যেমন CSF কম্পার্টমেন্টে সক্রিয় জমা, রক্ত ​​কম্পার্টমেন্টে ক্লোন বেঁচে থাকা এবং প্রথম 10 মিনিটের মধ্যে রক্ত ​​থেকে T7 ফেজ ক্লোন দ্রুত অপসারণ (চিত্র 1d এবং পরিপূরক চিত্র 4M)। সুতরাং, প্রথম রাউন্ডের পরে, CSF-তে বিভিন্ন ফেজ ক্লোন সনাক্ত করা হয়েছিল, যদিও পৃথক প্রাণীর জন্য একই প্রাথমিক পুল ব্যবহার করা হয়েছিল। এর থেকে বোঝা যায় যে, বিপুল সংখ্যক লাইব্রেরি সদস্যের উৎস লাইব্রেরির জন্য একাধিক কঠোর নির্বাচন পদক্ষেপের ফলে বৈচিত্র্য উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পাবে। অতএব, এলোমেলো ঘটনাগুলি প্রাথমিক নির্বাচন প্রক্রিয়ার একটি অবিচ্ছেদ্য অংশ হয়ে উঠবে, যা ফলাফলকে ব্যাপকভাবে প্রভাবিত করবে। সম্ভবত মূল লাইব্রেরির অনেক ক্লোনের CSF সমৃদ্ধকরণ প্রবণতা একই রকম ছিল। তবে, একই পরীক্ষামূলক অবস্থার অধীনেও, প্রাথমিক পুলে প্রতিটি নির্দিষ্ট ক্লোনের সংখ্যা কম থাকার কারণে নির্বাচনের ফলাফল ভিন্ন হতে পারে।
CSF-তে সমৃদ্ধ মোটিফগুলি রক্তের মোটিফগুলির থেকে আলাদা। মজার বিষয় হল, আমরা পৃথক প্রাণীর রক্তে গ্লাইসিন-সমৃদ্ধ পেপটাইডের দিকে প্রথম পরিবর্তন লক্ষ্য করেছি। (চিত্র 1g, পরিপূরক চিত্র 4e, 4f)। গ্লাইসিন পেপটাইডযুক্ত ফেজ আরও স্থিতিশীল হতে পারে এবং সঞ্চালন থেকে বের করে দেওয়ার সম্ভাবনা কম হতে পারে। তবে, এই গ্লাইসিন-সমৃদ্ধ পেপটাইডগুলি সেরিব্রোস্পাইনাল তরল নমুনাগুলিতে সনাক্ত করা যায়নি, যা ইঙ্গিত করে যে কিউরেটেড লাইব্রেরিগুলি দুটি ভিন্ন নির্বাচন ধাপের মধ্য দিয়ে গেছে: একটি রক্তে এবং অন্যটি সেরিব্রোস্পাইনাল তরলে জমা হতে দেওয়া হয়েছে। নির্বাচনের চতুর্থ রাউন্ডের ফলে CSF-সমৃদ্ধ ক্লোনগুলি ব্যাপকভাবে পরীক্ষা করা হয়েছে। খালি নিয়ন্ত্রণ ফেজের তুলনায় পৃথকভাবে পরীক্ষিত প্রায় সমস্ত ক্লোন CSF-তে সমৃদ্ধ হয়েছে বলে নিশ্চিত করা হয়েছে। একটি পেপটাইড হিট (#2077) আরও বিশদে পরীক্ষা করা হয়েছিল। এটি অন্যান্য হিটের তুলনায় দীর্ঘ প্লাজমা অর্ধ-জীবন দেখিয়েছে (চিত্র 3d এবং পরিপূরক চিত্র 7), এবং মজার বিষয় হল, এই পেপটাইডে সি-টার্মিনাসে একটি সিস্টাইন অবশিষ্টাংশ রয়েছে। সম্প্রতি দেখা গেছে যে পেপটাইডে সিস্টাইন যোগ করলে অ্যালবুমিন 29 এর সাথে আবদ্ধ হয়ে তাদের ফার্মাকোকিনেটিক বৈশিষ্ট্য উন্নত হতে পারে। পেপটাইড #2077 এর জন্য এটি বর্তমানে অজানা এবং আরও গবেষণার প্রয়োজন। কিছু পেপটাইড CSF সমৃদ্ধকরণে একটি ভ্যালেন্স-নির্ভরতা দেখিয়েছে (ডেটা দেখানো হয়নি), যা T7 ক্যাপসিডের প্রদর্শিত পৃষ্ঠের জ্যামিতির সাথে সম্পর্কিত হতে পারে। আমরা যে T7 সিস্টেমটি ব্যবহার করেছি তাতে প্রতি ফেজ কণার প্রতিটি পেপটাইডের 5-15 কপি দেখানো হয়েছে। ইঁদুরের সেরিব্রাল কর্টেক্সে শিরাপথে ইনজেকশন দেওয়া প্রার্থী সীসা ফেজ ক্লোনগুলিতে IHC সঞ্চালিত হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র 8)। তথ্য দেখায় যে কমপক্ষে তিনটি ক্লোন (নং 2002, নং 2009 এবং নং 2077) BBB এর সাথে মিথস্ক্রিয়া করেছে। এই BBB মিথস্ক্রিয়া CSF জমা করে নাকি এই ক্লোনগুলি সরাসরি BCSFB-তে স্থানান্তরিত করে তা নির্ধারণ করা এখনও বাকি। গুরুত্বপূর্ণভাবে, আমরা দেখাই যে নির্বাচিত পেপটাইডগুলি সংশ্লেষিত এবং প্রোটিন কার্গোতে আবদ্ধ হওয়ার সময় তাদের CSF পরিবহন ক্ষমতা ধরে রাখে। N-টার্মিনাল বায়োটিনিলেটেড পেপটাইডগুলিকে SA-তে আবদ্ধ করার ফলে রক্ত ​​এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে তাদের নিজ নিজ ফেজ ক্লোনের সাথে প্রাপ্ত ফলাফলের পুনরাবৃত্তি হয় (চিত্র 3e)। পরিশেষে, আমরা দেখাই যে সীসা পেপটাইড #2077 SA-তে সংযুক্ত BACE1-এর একটি বায়োটিনিলেটেড পেপটাইড ইনহিবিটারের মস্তিষ্কের ক্রিয়াকে উৎসাহিত করতে সক্ষম, যা CSF-তে Abeta40 মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করে CNS-তে উচ্চারিত ফার্মাকোডাইনামিক প্রভাব সৃষ্টি করে (চিত্র 4)। সমস্ত হিটের পেপটাইড সিকোয়েন্স হোমোলজি অনুসন্ধান করে আমরা ডাটাবেসে কোনও হোমোলগ সনাক্ত করতে পারিনি। এটি মনে রাখা গুরুত্বপূর্ণ যে T7 লাইব্রেরির আকার প্রায় 109, যেখানে 12-মেরের জন্য তাত্ত্বিক লাইব্রেরির আকার 4 x 1015। অতএব, আমরা 12-মের পেপটাইড লাইব্রেরির বৈচিত্র্য স্থানের একটি ছোট ভগ্নাংশ নির্বাচন করেছি, যার অর্থ হতে পারে যে এই চিহ্নিত হিটগুলির সংলগ্ন সিকোয়েন্স স্থান মূল্যায়ন করে আরও অপ্টিমাইজড পেপটাইড সনাক্ত করা যেতে পারে। কাল্পনিকভাবে, এই পেপটাইডগুলির কোনও প্রাকৃতিক সমরূপতা আমরা খুঁজে না পাওয়ার একটি কারণ হতে পারে বিবর্তনের সময় মস্তিষ্কে নির্দিষ্ট পেপটাইড মোটিফের অনিয়ন্ত্রিত প্রবেশ রোধ করার জন্য নির্বাচন বিচ্ছিন্ন করা।
একসাথে বিবেচনা করলে, আমাদের ফলাফলগুলি ভবিষ্যতের কাজের জন্য একটি ভিত্তি প্রদান করে যাতে সেরিব্রোভাসকুলার বাধা ইন ভিভোর পরিবহন ব্যবস্থাগুলিকে আরও বিশদে সনাক্ত এবং বৈশিষ্ট্যযুক্ত করা যায়। এই পদ্ধতির মূল সেটআপটি একটি কার্যকরী নির্বাচন কৌশলের উপর ভিত্তি করে তৈরি যা কেবল সেরিব্রাল ভাস্কুলার বাঁধাই বৈশিষ্ট্যযুক্ত ক্লোনগুলিকে সনাক্ত করে না, বরং একটি গুরুত্বপূর্ণ পদক্ষেপও অন্তর্ভুক্ত করে যেখানে সফল ক্লোনগুলির সিএনএস কম্পার্টমেন্টে জৈবিক বাধা অতিক্রম করার জন্য অভ্যন্তরীণ কার্যকলাপ থাকে। এই পেপটাইডগুলির পরিবহনের প্রক্রিয়া এবং মস্তিষ্ক অঞ্চলের নির্দিষ্ট মাইক্রোভাস্কুলেচারের সাথে আবদ্ধ হওয়ার জন্য তাদের পছন্দ ব্যাখ্যা করা। এর ফলে BBB এবং রিসেপ্টরগুলির পরিবহনের জন্য নতুন পথ আবিষ্কার হতে পারে। আমরা আশা করি যে চিহ্নিত পেপটাইডগুলি সরাসরি সেরিব্রোভাসকুলার রিসেপ্টর বা BBB বা BCSFB এর মাধ্যমে পরিবহন করা সঞ্চালিত লিগ্যান্ডের সাথে আবদ্ধ হতে পারে। এই কাজে আবিষ্কৃত CSF পরিবহন কার্যকলাপ সহ পেপটাইড ভেক্টরগুলি আরও তদন্ত করা হবে। আমরা বর্তমানে BBB এবং/অথবা BCSFB অতিক্রম করার ক্ষমতার জন্য এই পেপটাইডগুলির মস্তিষ্কের নির্দিষ্টতা তদন্ত করছি। এই নতুন পেপটাইডগুলি নতুন রিসেপ্টর বা পথের সম্ভাব্য আবিষ্কারের জন্য এবং মস্তিষ্কে জৈবিক পদার্থের মতো ম্যাক্রোমোলিকিউল সরবরাহের জন্য নতুন অত্যন্ত দক্ষ প্ল্যাটফর্ম তৈরির জন্য অত্যন্ত মূল্যবান হাতিয়ার হবে।
পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতির একটি পরিবর্তন ব্যবহার করে বৃহৎ সিস্টারনা (CM) ক্যানুলেট করুন। অ্যানেস্থেসাইজড উইস্টার ইঁদুর (200-350 গ্রাম) একটি স্টেরিওট্যাক্সিক যন্ত্রপাতির উপর স্থাপন করা হয়েছিল এবং মাথার খুলিটি উন্মুক্ত করার জন্য শেভ করা এবং অ্যাসেপটিকভাবে প্রস্তুত মাথার ত্বকের উপর একটি মাঝারি ছেদ তৈরি করা হয়েছিল। উপরের স্যাশের অংশে দুটি গর্ত ড্রিল করুন এবং গর্তগুলিতে ফিক্সিং স্ক্রুগুলি বেঁধে দিন। স্টেইনলেস স্টিলের ক্যানুলার স্টেরিওট্যাকটিক নির্দেশনার জন্য পার্শ্বীয় অক্সিপিটাল ক্রেস্টে একটি অতিরিক্ত গর্ত ড্রিল করা হয়েছিল। ক্যানুলার চারপাশে ডেন্টাল সিমেন্ট লাগান এবং স্ক্রু দিয়ে সুরক্ষিত করুন। ফটো-কিউরিং এবং সিমেন্ট শক্ত করার পরে, ত্বকের ক্ষতটি 4/0 সুপারামিড সেলাই দিয়ে বন্ধ করা হয়েছিল। সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড (CSF) এর স্বতঃস্ফূর্ত ফুটো দ্বারা ক্যানুলার সঠিক অবস্থান নিশ্চিত করা হয়। স্টেরিওট্যাক্সিক যন্ত্রপাতি থেকে ইঁদুরটিকে সরিয়ে ফেলুন, অস্ত্রোপচারের পরে উপযুক্ত যত্ন এবং ব্যথা ব্যবস্থাপনা পান এবং সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইডে রক্তের লক্ষণ দেখা না যাওয়া পর্যন্ত কমপক্ষে এক সপ্তাহের জন্য এটিকে পুনরুদ্ধার করতে দিন। উইস্টার ইঁদুর (Crl:WI/Han) চার্লস রিভার (ফ্রান্স) থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল। সমস্ত ইঁদুরকে নির্দিষ্ট রোগজীবাণুমুক্ত অবস্থায় রাখা হয়েছিল। সমস্ত প্রাণী পরীক্ষা সুইজারল্যান্ডের বাসেল শহরের পশুচিকিৎসা অফিস দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল এবং পশু লাইসেন্স নং 2474 (ইঁদুরের সেরিব্রোস্পাইনাল ফ্লুইড এবং মস্তিষ্কে থেরাপিউটিক প্রার্থীদের স্তর পরিমাপ করে সক্রিয় মস্তিষ্ক পরিবহনের মূল্যায়ন) অনুসারে সম্পাদিত হয়েছিল।
CM ক্যানুলা হাতে নিয়ে ইঁদুরটিকে সাবধানে সচেতন রাখুন। ক্যানুলা থেকে ডাতুরা বের করুন এবং স্বতঃস্ফূর্তভাবে প্রবাহিত সেরিব্রোস্পাইনাল তরল ১০ μl সংগ্রহ করুন। যেহেতু ক্যানুলার পেটেন্সি শেষ পর্যন্ত ঝুঁকিপূর্ণ ছিল, তাই এই গবেষণায় শুধুমাত্র স্পষ্ট সেরিব্রোস্পাইনাল তরল নমুনা অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল যেখানে রক্তের দূষণ বা বিবর্ণতার কোনও প্রমাণ ছিল না। একই সাথে, লেজের ডগায় একটি ছোট ছেদ থেকে প্রায় ১০-২০ μl রক্ত ​​হেপারিন (সিগমা-অ্যালড্রিচ) দিয়ে টিউবে নেওয়া হয়েছিল। T7 ফেজের শিরায় ইনজেকশনের পরে বিভিন্ন সময়ে CSF এবং রক্ত ​​সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রতিটি CSF নমুনা সংগ্রহের আগে প্রায় ৫-১০ μl তরল ফেলে দেওয়া হয়েছিল, যা ক্যাথেটারের মৃত আয়তনের সাথে মিলে যায়।
T7Select সিস্টেম ম্যানুয়াল (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) তে বর্ণিত T7Select 10-3b ভেক্টর ব্যবহার করে লাইব্রেরি তৈরি করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, একটি এলোমেলো 12-mer DNA সন্নিবেশ নিম্নলিখিত বিন্যাসে সংশ্লেষিত করা হয়েছিল:
ইনসার্টে ডাবল স্টপ কোডন এবং অ্যামিনো অ্যাসিডের অতিরিক্ত এক্সপ্রেশন এড়াতে NNK কোডন ব্যবহার করা হয়েছিল। N হল প্রতিটি নিউক্লিওটাইডের একটি ম্যানুয়াল মিশ্রিত সমতুল্য অনুপাত, এবং K হল অ্যাডেনিন এবং সাইটোসিন নিউক্লিওটাইডের একটি ম্যানুয়াল মিশ্রিত সমতুল্য অনুপাত। ক্লেনো বাফারে (নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস) 37°C তাপমাত্রায় 3 ঘন্টা ধরে dNTP (নোভাজেন) এবং ক্লেনো এনজাইম (নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস) দিয়ে আরও ইনকিউবেশনের মাধ্যমে একক স্ট্র্যান্ডেড অঞ্চলগুলিকে ডাবল স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএতে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। বিক্রিয়ার পরে, EtOH বৃষ্টিপাত দ্বারা ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ ডিএনএ রেস্ট্রিকশন এনজাইম EcoRI এবং HindIII (উভয়ই রোচে থেকে) দিয়ে হজম করা হয়েছিল। ক্লিভড এবং পিউরিফাই করা (QIAquick, Qiagen) ইনসার্ট (T4 ligase, New England Biolabs) তারপর 10B ক্যাপসিড জিনের অ্যামিনো অ্যাসিড 348 পরে একটি প্রি-ক্লিভড T7 ভেক্টরে ফ্রেমের মধ্যে লিগেটেড করা হয়েছিল। ইন ভিট্রো প্যাকেজিংয়ের আগে 18 ঘন্টা ধরে 16° সেলসিয়াসে লিগেশন বিক্রিয়ার ইনকিউবেট করা হয়েছিল। T7Select 10-3b ক্লোনিং কিট (নোভাজেন) এর সাথে সরবরাহিত নির্দেশাবলী অনুসারে ফেজ প্যাকেজিং ইন ভিট্রো করা হয়েছিল এবং Escherichia coli (BLT5615, Novagen) ব্যবহার করে প্যাকেজিং দ্রবণটি একবার লাইসিসের জন্য প্রশস্ত করা হয়েছিল। লাইসেটগুলিকে গ্লিসারলের স্টক দ্রবণ হিসাবে -80° সেলসিয়াসে সেন্ট্রিফিউজ, টাইট্রেটেড এবং হিমায়িত করা হয়েছিল।
প্রোপ্রাইটারি 454/রোশে-অ্যামপ্লিকন ফিউশন প্রাইমার ব্যবহার করে ব্রোথ বা প্লেটে প্রশস্ত ফেজ ভেরিয়েবল অঞ্চলের সরাসরি পিসিআর প্রশস্তকরণ। ফরোয়ার্ড ফিউশন প্রাইমারে ভেরিয়েবল অঞ্চল (NNK) 12 (টেমপ্লেট-নির্দিষ্ট), GS FLX টাইটানিয়াম অ্যাডাপ্টার A এবং একটি চার-বেস লাইব্রেরি কী সিকোয়েন্স (TCAG) এর পাশের সিকোয়েন্স রয়েছে (পরিপূরক চিত্র 1a):
রিভার্স ফিউশন প্রাইমারে ক্যাপচার বিডসের সাথে সংযুক্ত বায়োটিন এবং ইমালসন পিসিআরের সময় ক্লোনাল অ্যামপ্লিফিকেশনের জন্য প্রয়োজনীয় জিএস এফএলএক্স টাইটানিয়াম অ্যাডাপ্টার বি রয়েছে:
এরপর ৪৫৪ জিএস-এফএলএক্স টাইটানিয়াম প্রোটোকল অনুসারে অ্যামপ্লিকনগুলিকে ৪৫৪/রোশে পাইরোসেকোয়েন্সিং করানো হয়। ম্যানুয়াল স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস হিটাচি ৩৭৩০ এক্সএল ডিএনএ অ্যানালাইজার), টি৭ ফেজ ডিএনএ পিসিআর দ্বারা প্রশস্ত করা হয়েছিল এবং নিম্নলিখিত প্রাইমার জোড়া দিয়ে সিকোয়েন্স করা হয়েছিল:
পৃথক ফলক থেকে প্রাপ্ত সন্নিবেশগুলি রোচে ফাস্ট স্টার্ট ডিএনএ পলিমারেজ কিট ব্যবহার করে পিসিআর পরিবর্ধনের শিকার হয়েছিল (নির্মাতার নির্দেশ অনুসারে)। একটি হট স্টার্ট (৯৫ ডিগ্রি সেলসিয়াসে ১০ মিনিট) এবং ৩৫টি বুস্ট চক্র (৯৫ ডিগ্রি সেলসিয়াসে ৫০ সেকেন্ড, ৫০ ডিগ্রি সেলসিয়াসে ১ মিনিট এবং ৭২ ডিগ্রি সেলসিয়াসে ১ মিনিট) সম্পাদন করুন।
লাইব্রেরি থেকে ফেজ, বন্য-প্রকারের ফেজ, CSF এবং রক্ত ​​থেকে উদ্ধার করা ফেজ, অথবা পৃথক ক্লোনগুলিকে Escherichia coli BL5615-এ TB ব্রোথ (Sigma Aldrich) অথবা 500 cm2 থালায় (থার্মো সায়েন্টিফিক) 37°C তাপমাত্রায় 4 ঘন্টা ধরে বর্ধিত করা হয়েছিল। Tris-EDTA বাফার (Fluka Analytical) দিয়ে প্লেটগুলি ধুয়ে অথবা জীবাণুমুক্ত পিপেট টিপস দিয়ে প্লেকগুলি সংগ্রহ করে প্লেটগুলি থেকে ফেজ বের করা হয়েছিল। পলিথিলিন গ্লাইকোল (PEG 8000) প্রসারণ (Promega) এক রাউন্ড দিয়ে কালচার সুপারনাট্যান্ট বা এক্সট্রাকশন বাফার থেকে ফেজ আলাদা করা হয়েছিল এবং Tris-EDTA বাফারে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল।
ইন্ট্রাভেনাস (IV) ইনজেকশন (500 μl/প্রাণী) দেওয়ার আগে এন্ডোটক্সিন অপসারণ বিডস (Miltenyi Biotec) ব্যবহার করে অ্যামপ্লিফাইড ফেজটি 2-3 রাউন্ডে এন্ডোটক্সিন অপসারণ করা হয়েছিল। প্রথম রাউন্ডে, 2×1012 ফেজ চালু করা হয়েছিল; দ্বিতীয় রাউন্ডে, 2×1010 ফেজ; তৃতীয় এবং চতুর্থ নির্বাচন রাউন্ডে, প্রতি প্রাণীর জন্য 2×109 ফেজ। CSF এবং রক্তের নমুনায় ফেজের পরিমাণ নির্মাতার নির্দেশ অনুসারে প্লাক গণনার মাধ্যমে নির্ধারিত হয়েছিল (T7Select সিস্টেম ম্যানুয়াল)। লেজের শিরায় পরিশোধিত লাইব্রেরিগুলির শিরায় ইনজেকশনের মাধ্যমে অথবা পূর্ববর্তী নির্বাচন রাউন্ড থেকে CSF থেকে নিষ্কাশিত ফেজের পুনঃইনজেকশনের মাধ্যমে ফেজ নির্বাচন করা হয়েছিল এবং পরবর্তী ফসল যথাক্রমে 10 মিনিট, 30 মিনিট, 60 মিনিট, 90 মিনিট, 120 মিনিট, 180 মিনিট এবং 240 মিনিটে CSF এবং রক্তের নমুনায় সঞ্চালিত হয়েছিল। মোট চারটি রাউন্ড ইন ভিভো প্যানিং পরিচালিত হয়েছিল যেখানে দুটি নির্বাচিত শাখা পৃথকভাবে সংরক্ষণ করা হয়েছিল এবং নির্বাচনের প্রথম তিনটি রাউন্ডের সময় বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। নির্বাচনের প্রথম দুটি রাউন্ড থেকে CSF থেকে নিষ্কাশিত সমস্ত ফেজ ইনসার্ট 454/Roche পাইরোসেকোয়েন্সিং করা হয়েছিল, যখন নির্বাচনের শেষ দুটি রাউন্ড থেকে CSF থেকে নিষ্কাশিত সমস্ত ক্লোন ম্যানুয়ালি সিকোয়েন্সিং করা হয়েছিল। নির্বাচনের প্রথম রাউন্ড থেকে সমস্ত রক্তের ফেজগুলিও 454/Roche পাইরোসেকোয়েন্সিং করা হয়েছিল। ফেজ ক্লোন ইনজেকশনের জন্য, নির্বাচিত ফেজগুলিকে E. coli (BL5615) 500 cm2 প্লেটে 37°C তাপমাত্রায় 4 ঘন্টার জন্য প্রশস্ত করা হয়েছিল। পৃথকভাবে নির্বাচিত এবং ম্যানুয়ালি সিকোয়েন্সড ক্লোনগুলি টিবি মাধ্যমে প্রচার করা হয়েছিল। ফেজ নিষ্কাশন, পরিশোধন এবং এন্ডোটক্সিন অপসারণের পরে (উপরে বর্ণিত হিসাবে), 300 μl-এ 2×1010 ফেজ/প্রাণী একটি লেজের শিরায় শিরায় ইনজেকশন করা হয়েছিল।
সিকোয়েন্স ডেটার প্রাক-প্রক্রিয়াকরণ এবং গুণগত ফিল্টারিং। Raw 454/Roche ডেটা একটি বাইনারি স্ট্যান্ডার্ড স্ট্রিম ম্যাপ ফর্ম্যাট (sff) থেকে একটি পিয়ারসন হিউম্যান রিডেবল ফর্ম্যাট (fasta) তে বিক্রেতা সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। নীচে বর্ণিত মালিকানাধীন C প্রোগ্রাম এবং স্ক্রিপ্ট (অপ্রকাশিত সফ্টওয়্যার প্যাকেজ) ব্যবহার করে নিউক্লিওটাইড সিকোয়েন্সের আরও প্রক্রিয়াকরণ করা হয়েছিল। প্রাথমিক ডেটা বিশ্লেষণে কঠোর মাল্টি-স্টেজ ফিল্টারিং পদ্ধতি অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। যে রিডগুলিতে একটি বৈধ 12mer ইনসার্ট ডিএনএ সিকোয়েন্স ছিল না সেগুলিকে ফিল্টার করার জন্য, রিডগুলিকে গ্লোবাল নিডলম্যান-ওয়ান্স পরীক্ষা ব্যবহার করে স্টার্ট লেবেল (GTGATGTCGGGATCCGAATTCT), স্টপ লেবেল (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) এবং ব্যাকগ্রাউন্ড ইনসার্ট (CCCTGCAGGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGTCGTCG) এর সাথে ক্রমানুসারে সারিবদ্ধ করা হয়েছিল। অ্যালাইনমেন্ট প্রতি অ্যালাইনমেন্ট 31 পর্যন্ত 2টি অসঙ্গতি অনুমোদন করে। অতএব, স্টার্ট এবং স্টপ ট্যাগ ছাড়া রিড এবং ব্যাকগ্রাউন্ড ইনসার্ট ধারণকারী রিড, অর্থাৎ, অ্যালাইনমেন্ট যা অমিলের অনুমোদিত সংখ্যা অতিক্রম করে, লাইব্রেরি থেকে সরানো হয়েছে। অবশিষ্ট পাঠের ক্ষেত্রে, N-mer DNA ক্রমটি শুরুর চিহ্ন থেকে শুরু করে শেষ পর্যন্ত স্টপ চিহ্নটি মূল পাঠ ক্রম থেকে কেটে আরও প্রক্রিয়াজাত করা হয়েছিল (এরপরে "সন্নিবেশ" হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে)। সন্নিবেশের অনুবাদের পরে, প্রাইমারের 5′ প্রান্তে প্রথম স্টপ কোডনের পরে অংশটি সন্নিবেশ থেকে সরানো হয়। এছাড়াও, প্রাইমারের 3′ প্রান্তে অসম্পূর্ণ কোডনের দিকে পরিচালিত নিউক্লিওটাইডগুলিও সরানো হয়েছিল। শুধুমাত্র পটভূমি ক্রম ধারণকারী সন্নিবেশগুলি বাদ দেওয়ার জন্য, অ্যামিনো অ্যাসিড প্যাটার্ন "PAG" দিয়ে শুরু হওয়া অনুবাদিত সন্নিবেশগুলিও সরানো হয়েছিল। লাইব্রেরি থেকে 3 টিরও কম অ্যামিনো অ্যাসিডের অনুবাদ-পরবর্তী দৈর্ঘ্যের পেপটাইডগুলি সরানো হয়েছিল। অবশেষে, সন্নিবেশ পুলে অপ্রয়োজনীয়তা অপসারণ করুন এবং প্রতিটি অনন্য সন্নিবেশের ফ্রিকোয়েন্সি নির্ধারণ করুন। এই বিশ্লেষণের ফলাফলে নিউক্লিওটাইড ক্রম (সন্নিবেশ) এবং তাদের (পঠিত) ফ্রিকোয়েন্সিগুলির একটি তালিকা অন্তর্ভুক্ত ছিল (পরিপূরক চিত্র 1c এবং 2)।
ক্রম সাদৃশ্য অনুসারে গ্রুপ N-mer DNA সন্নিবেশ: 454/Roche-নির্দিষ্ট সিকোয়েন্সিং ত্রুটি (যেমন সিকোয়েন্সিং হোমোপলিমার এক্সটেনশনের সমস্যা) দূর করতে এবং কম গুরুত্বপূর্ণ অপ্রয়োজনীয়তা দূর করতে, পূর্বে ফিল্টার করা N-mer DNA ক্রম সাদৃশ্য অনুসারে সাজানো হয়। সন্নিবেশ (2টি অ-মিলিত বেস পর্যন্ত অনুমোদিত) একটি পুনরাবৃত্তিমূলক অ্যালগরিদম ব্যবহার করে নিম্নরূপ সংজ্ঞায়িত করা হয়: সন্নিবেশগুলি প্রথমে তাদের ফ্রিকোয়েন্সি (সর্বোচ্চ থেকে সর্বনিম্ন) অনুসারে সাজানো হয়, এবং যদি তারা একই হয়, তবে তাদের গৌণ সাজানোর মাধ্যমে দৈর্ঘ্য অনুসারে (দীর্ঘতম থেকে সংক্ষিপ্ততম) অনুসারে সাজানো হয়। সুতরাং, সবচেয়ে ঘন ঘন এবং দীর্ঘতম সন্নিবেশগুলি প্রথম "গ্রুপ" সংজ্ঞায়িত করে। গ্রুপ ফ্রিকোয়েন্সি কী ফ্রিকোয়েন্সিতে সেট করা হয়। তারপর, সাজানো তালিকায় থাকা প্রতিটি সন্নিবেশকে জোড়াওয়াইজ Needleman-Wunsch সারিবদ্ধকরণ দ্বারা গ্রুপে যুক্ত করার চেষ্টা করা হয়েছিল। যদি একটি সারিবদ্ধকরণে অমিল, সন্নিবেশ বা মুছে ফেলার সংখ্যা 2 এর থ্রেশহোল্ড অতিক্রম না করে, তাহলে গ্রুপে একটি সন্নিবেশ যোগ করা হয় এবং সামগ্রিক গ্রুপ ফ্রিকোয়েন্সি কতবার সন্নিবেশ যোগ করা হয়েছিল তার দ্বারা বৃদ্ধি করা হয়। একটি গোষ্ঠীতে যোগ করা সন্নিবেশগুলিকে ব্যবহৃত হিসাবে চিহ্নিত করা হয় এবং আরও প্রক্রিয়াকরণ থেকে বাদ দেওয়া হয়। যদি সন্নিবেশ ক্রমটি ইতিমধ্যে বিদ্যমান কোনও গ্রুপে যোগ করা না যায়, তাহলে সন্নিবেশ ক্রমটি উপযুক্ত সন্নিবেশ ফ্রিকোয়েন্সি সহ একটি নতুন গ্রুপ তৈরি করতে এবং ব্যবহৃত হিসাবে চিহ্নিত করতে ব্যবহৃত হয়। প্রতিটি সন্নিবেশ ক্রমটি হয় একটি নতুন গ্রুপ তৈরি করতে ব্যবহৃত হলে অথবা ইতিমধ্যে বিদ্যমান গ্রুপে অন্তর্ভুক্ত করা যেতে পারে তখন পুনরাবৃত্তি শেষ হয়। সর্বোপরি, নিউক্লিওটাইড সমন্বিত গোষ্ঠীবদ্ধ সন্নিবেশগুলি অবশেষে পেপটাইড সিকোয়েন্সে (পেপটাইড লাইব্রেরি) অনুবাদ করা হয়। এই বিশ্লেষণের ফলাফল হল সন্নিবেশের একটি সেট এবং তাদের সংশ্লিষ্ট ফ্রিকোয়েন্সি যা ধারাবাহিক পাঠের সংখ্যা তৈরি করে (পরিপূরক চিত্র 2)।
মোটিফ জেনারেশন: অনন্য পেপটাইডের তালিকার উপর ভিত্তি করে, নীচে দেখানো সমস্ত সম্ভাব্য অ্যামিনো অ্যাসিড প্যাটার্ন (aa) সমন্বিত একটি লাইব্রেরি তৈরি করা হয়েছিল। দৈর্ঘ্য 3 এর প্রতিটি সম্ভাব্য প্যাটার্ন পেপটাইড থেকে বের করা হয়েছিল এবং এর বিপরীত প্যাটার্নটি সমস্ত প্যাটার্ন (ট্রাইপেপটাইড) সমন্বিত একটি সাধারণ মোটিফ লাইব্রেরির সাথে যুক্ত করা হয়েছিল। অত্যন্ত পুনরাবৃত্তিমূলক মোটিফের লাইব্রেরিগুলি ক্রমানুসারে এবং রিডানডেন্সি অপসারণ করা হয়েছিল। তারপরে, মোটিফ লাইব্রেরির প্রতিটি ট্রাইপেপটাইডের জন্য, আমরা গণনামূলক সরঞ্জাম ব্যবহার করে লাইব্রেরিতে এর উপস্থিতি পরীক্ষা করেছি। এই ক্ষেত্রে, পাওয়া মোটিফ ট্রাইপেপটাইড ধারণকারী পেপটাইডের ফ্রিকোয়েন্সি যোগ করা হয় এবং মোটিফ লাইব্রেরিতে মোটিফের সাথে নির্ধারিত হয় ("মোটিফের সংখ্যা")। মোটিফ জেনারেশনের ফলাফল হল একটি দ্বি-মাত্রিক অ্যারে যাতে ট্রাইপেপটাইডের সমস্ত ঘটনা (মোটিফ) এবং তাদের নিজ নিজ মান থাকে, যা সিকোয়েন্সিং রিডের সংখ্যা যা রিডগুলি ফিল্টার, গোষ্ঠীভুক্ত এবং অনুবাদ করার সময় সংশ্লিষ্ট মোটিফের ফলাফল দেয়। উপরে বিস্তারিতভাবে বর্ণিত মেট্রিক্স।
মোটিফ এবং সংশ্লিষ্ট স্ক্যাটারপ্লটের সংখ্যার স্বাভাবিকীকরণ: প্রতিটি নমুনার জন্য মোটিফের সংখ্যা ব্যবহার করে স্বাভাবিক করা হয়েছিল
যেখানে ni হল বিষয় i ধারণকারী পাঠের সংখ্যা। সুতরাং, vi নমুনায় মোটিফ i ধারণকারী পাঠের (অথবা পেপটাইড) শতাংশের ফ্রিকোয়েন্সি প্রতিনিধিত্ব করে। ফিশারের সঠিক পরীক্ষা ব্যবহার করে অ-স্বাভাবিক সংখ্যার মোটিফের জন্য P-মান গণনা করা হয়েছিল। মোটিফের সংখ্যার সহ-সম্পর্কিত বিন্যাসের ক্ষেত্রে, স্পিয়ারম্যানের পারস্পরিক সম্পর্কগুলি R এর সাথে সাধারণীকৃত সংখ্যার মোটিফ ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল।
পেপটাইড লাইব্রেরির প্রতিটি অবস্থানে অ্যামিনো অ্যাসিডের বিষয়বস্তু কল্পনা করার জন্য, ওয়েব লোগোগ্রাম 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) তৈরি করা হয়েছিল। প্রথমে, 12-মের পেপটাইডের প্রতিটি অবস্থানে অ্যামিনো অ্যাসিডের বিষয়বস্তু 20×12 ম্যাট্রিক্সে সংরক্ষণ করা হয়। তারপর, প্রতিটি অবস্থানে একই আপেক্ষিক অ্যামিনো অ্যাসিডের বিষয়বস্তু ধারণকারী 1000 পেপটাইডের একটি সেট ফাস্টা-সিকোয়েন্স ফর্ম্যাটে তৈরি করা হয় এবং ওয়েব-লোগো 3-এর ইনপুট হিসাবে সরবরাহ করা হয়, যা প্রতিটি অবস্থানে আপেক্ষিক অ্যামিনো অ্যাসিডের বিষয়বস্তুর একটি গ্রাফিক্যাল উপস্থাপনা তৈরি করে। একটি প্রদত্ত পেপটাইড লাইব্রেরির জন্য। বহুমাত্রিক ডেটাসেট কল্পনা করার জন্য, R-তে একটি অভ্যন্তরীণভাবে বিকশিত টুল (biosHeatmap, একটি এখনও প্রকাশিত R প্যাকেজ) ব্যবহার করে তাপ মানচিত্র তৈরি করা হয়েছিল। তাপ মানচিত্রে উপস্থাপিত ডেনড্রোগ্রামগুলি ইউক্লিডীয় দূরত্ব মেট্রিক সহ ওয়ার্ডের শ্রেণিবদ্ধ ক্লাস্টারিং পদ্ধতি ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল। মোটিফ স্কোরিং ডেটার পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের জন্য, অস্বাভাবিক স্কোরিংয়ের জন্য P মানগুলি ফিশারের সঠিক পরীক্ষা ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল। অন্যান্য ডেটাসেটের জন্য P-মানগুলি স্টুডেন্টস টি-টেস্ট বা ANOVA ব্যবহার করে R তে গণনা করা হয়েছিল।
নির্বাচিত ফেজ ক্লোন এবং ইনসার্ট ছাড়া ফেজগুলিকে লেজের শিরার মাধ্যমে শিরাপথে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল (300 μl PBS-এ 2×1010 ফেজ/প্রাণী)। পারফিউশন এবং পরবর্তী ফিক্সেশনের দশ মিনিট আগে, একই প্রাণীদের শিরাপথে DyLight594-লেবেলযুক্ত লেকটিন (Vector Laboratories Inc., DL-1177) 100 μl ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। ফেজ ইনজেকশন দেওয়ার 60 মিনিট পরে, ইঁদুরদের হৃদপিণ্ডে 50 মিলি PBS এবং তারপরে 50 মিলি 4% PFA/PBS দিয়ে পারফিউশন করা হয়েছিল। মস্তিষ্কের নমুনাগুলি অতিরিক্তভাবে 4% PFA/PBS-এ রাতারাতি স্থির করা হয়েছিল এবং 4°C তাপমাত্রায় 30% সুক্রোজ দিয়ে রাতারাতি ভিজিয়ে রাখা হয়েছিল। নমুনাগুলি OCT মিশ্রণে ফ্ল্যাশ হিমায়িত করা হয়েছিল। হিমায়িত নমুনার ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যাল বিশ্লেষণ ঘরের তাপমাত্রায় 1% BSA দিয়ে ব্লক করা 30 µm ক্রায়োসেকশনের উপর করা হয়েছিল এবং 4 °C তাপমাত্রায় T7 ফেজ (Novus NB 600-376A) এর বিরুদ্ধে পলিক্লোনাল FITC-লেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল। রাতারাতি ইনকিউবেটেড করা হয়েছিল। অবশেষে, অংশগুলি PBS দিয়ে 3 বার ধুয়ে একটি কনফোকাল লেজার মাইক্রোস্কোপ (Leica TCS SP5) দিয়ে পরীক্ষা করা হয়েছিল।
ন্যূনতম ৯৮% বিশুদ্ধতা সম্পন্ন সমস্ত পেপটাইড GenScript USA দ্বারা সংশ্লেষিত, বায়োটিনিলেটেড এবং লাইওফিলাইজড করা হয়েছিল। N-টার্মিনাসে একটি অতিরিক্ত ট্রিপল গ্লাইসিন স্পেসারের মাধ্যমে বায়োটিন আবদ্ধ থাকে। ভর স্পেকট্রোমেট্রি ব্যবহার করে সমস্ত পেপটাইড পরীক্ষা করুন।
স্ট্রেপ্টাভিডিন (সিগমা S0677) কে ৫-১০% DMSO/PBS-তে ইনকিউবেটেড অবস্থায় ৫-গুণ সমতুল্য বায়োটিনিলেটেড পেপটাইড, বায়োটিনিলেটেড BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইড, অথবা বায়োটিনিলেটেড BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইড এবং BACE1 ইনহিবিটরি পেপটাইডের সংমিশ্রণ (৩:১ অনুপাত) এর সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল। ইনজেকশন দেওয়ার ১ ঘন্টা আগে ঘরের তাপমাত্রায়। স্ট্রেপ্টাভিডিন-কনজুগেটেড পেপটাইডগুলি মস্তিষ্কের গহ্বরযুক্ত ইঁদুরের লেজের শিরাগুলির একটিতে ১০ মিলিগ্রাম/কেজি ডোজে শিরাপথে ইনজেকশন করা হয়েছিল।
ELISA দ্বারা স্ট্রেপ্টাভিডিন-পেপটাইড কমপ্লেক্সের ঘনত্ব মূল্যায়ন করা হয়েছিল। Nunc Maxisorp মাইক্রোটাইটার প্লেট (Sigma) রাতারাতি 4°C তাপমাত্রায় 1.5 μg/ml মাউস অ্যান্টি-স্ট্রেপ্টাভিডিন অ্যান্টিবডি (থার্মো, MA1-20011) দিয়ে লেপ দেওয়া হয়েছিল। ব্লক করার পরে (ব্লকিং বাফার: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% জেলটিন, 1% BSA) ঘরের তাপমাত্রায় 2 ঘন্টা ধরে, প্লেটটি 0.05% Tween-20/PBS (ওয়াশ বাফার) দিয়ে 3 সেকেন্ডের জন্য ধুয়ে ফেলুন, CSF এবং প্লাজমা নমুনাগুলি ব্লকিং বাফার (প্লাজমা 1:10,000, CSF 1:115) দিয়ে মিশ্রিত কূপে যোগ করা হয়েছিল। তারপরে প্লেটটি 4°C তাপমাত্রায় ডিটেকশন অ্যান্টিবডি (1 μg/ml, অ্যান্টি-স্ট্রেপ্টাভিডিন-HRP, Novus NB120-7239) দিয়ে রাতারাতি ইনকিউবেট করা হয়েছিল। তিনটি ধোয়ার ধাপের পর, TMB সাবস্ট্রেট দ্রবণে (রোশে) ২০ মিনিট পর্যন্ত ইনকিউবেশনের মাধ্যমে স্ট্রেপটাভিডিন সনাক্ত করা হয়েছিল। ১M H2SO4 দিয়ে রঙের বিকাশ বন্ধ করার পর, ৪৫০ nm এ শোষণ পরিমাপ করুন।
স্ট্রেপটাভিডিন-পেপটাইড-BACE1 ইনহিবিটর কমপ্লেক্সের কার্যকারিতা Aβ(1-40) ELISA দ্বারা প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল (Wako, 294-64701) অনুসারে মূল্যায়ন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, CSF নমুনাগুলিকে স্ট্যান্ডার্ড ডাইলুয়েন্টে (1:23) পাতলা করা হয়েছিল এবং BNT77 ক্যাপচার অ্যান্টিবডি দিয়ে লেপা 96-ওয়েল প্লেটে 4°C তাপমাত্রায় রাতারাতি ইনকিউবেট করা হয়েছিল। পাঁচটি ধোয়ার ধাপের পরে, HRP-কনজুগেটেড BA27 অ্যান্টিবডি যোগ করা হয়েছিল এবং 4°C তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল, তারপরে পাঁচটি ধোয়ার ধাপ। ঘরের তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য TMB দ্রবণে ইনকিউবেট করে Aβ(1–40) সনাক্ত করা হয়েছিল। স্টপ দ্রবণ দিয়ে রঙের বিকাশ বন্ধ করার পরে, 450 nm এ শোষণ পরিমাপ করুন। Aβ(1–40) ELISA এর আগে প্লাজমা নমুনাগুলিকে সলিড ফেজ নিষ্কাশনের শিকার করা হয়েছিল। 96-ওয়েল প্লেটে 0.2% DEA (সিগমা) প্লাজমা যোগ করা হয়েছিল এবং 30 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা হয়েছিল। SPE প্লেটগুলি (Oasis, 186000679) ধারাবাহিকভাবে জল এবং 100% মিথানল দিয়ে ধোয়ার পর, SPE প্লেটে প্লাজমা নমুনা যোগ করা হয়েছিল এবং সমস্ত তরল অপসারণ করা হয়েছিল। নমুনাগুলি ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল (প্রথমে 5% মিথানল দিয়ে তারপর 30% মিথানল দিয়ে) এবং 2% NH4OH/90% মিথানল দিয়ে এলিউট করা হয়েছিল। স্থির N2 কারেন্টে 55°C তাপমাত্রায় 99 মিনিটের জন্য এলিউট শুকানোর পর, নমুনাগুলিকে স্ট্যান্ডার্ড ডাইলুয়েন্টে হ্রাস করা হয়েছিল এবং উপরে বর্ণিত Aβ(1–40) পরিমাপ করা হয়েছিল।
এই নিবন্ধটি কীভাবে উদ্ধৃত করবেন: ইউরিচ, ই. এট আল। ভিভোতে চিহ্নিত ট্রানজিট পেপটাইড ব্যবহার করে মস্তিষ্কে কার্গো ডেলিভারি। বিজ্ঞান। 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015)।
লিখোটা জে., স্কজোরিঞ্জ টি., থমসেন এলবি এবং মুস টি. লক্ষ্যযুক্ত থেরাপি ব্যবহার করে মস্তিষ্কে ম্যাক্রোমলিকুলার ওষুধ সরবরাহ। জার্নাল অফ নিউরোকেমিস্ট্রি 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)।
ব্রাসনজেভিক, আই., স্টেইনবুশ, এইচডব্লিউ, স্মিটজ, সি., এবং মার্টিনেজ-মার্টিনেজ, পি. রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা পেরিয়ে পেপটাইড এবং প্রোটিন ওষুধ সরবরাহ। প্রোগ নিউরোবিওল 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009)।
পারড্রিজ, ডব্লিউএম রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা: মস্তিষ্কের ওষুধ বিকাশে একটি বাধা। নিউরোআরএক্স 2, 3–14, 10.1602/নিউরক্স.2.1.3 (2005)।
জোহানসন, কেই, ডানকান, জেএ, স্টপা, ইজি, এবং বাইর্ড, এ। কোরয়েড প্লেক্সাস-সিএসএফ পথের মাধ্যমে মস্তিষ্কে উন্নত ওষুধ সরবরাহ এবং লক্ষ্যবস্তু করার সম্ভাবনা। ফার্মাসিউটিক্যাল রিসার্চ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005)।
পারড্রিজ, ডব্লিউএম মস্তিষ্ক সরবরাহের জন্য আণবিক ট্রোজান ঘোড়া সহ জৈব-ঔষধের আধুনিকীকরণ। বায়োকনজুগ কেম 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008)।
পারড্রিজ, WM রিসেপ্টর-মধ্যস্থ পেপটাইড পরিবহন রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা জুড়ে। এন্ডোক্র রেভ. 7, 314–330 (1986)।
নিওওহনার, জে. প্রমুখ। মনোভ্যালেন্ট মলিকুলার শাটল ব্যবহার করে মস্তিষ্কের অনুপ্রবেশ এবং থেরাপিউটিক অ্যান্টিবডির কার্যকারিতা বৃদ্ধি করুন। নিউরন 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)।
বিয়েন-লি, এন. এট আল। ট্রান্সফারিন রিসেপ্টর (TfR) পরিবহন TfR অ্যান্টিবডির অ্যাফিনিটি ভ্যারিয়েন্টের মস্তিষ্কের শোষণ নির্ধারণ করে। J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014)।