Hatur nuhun parantos nganjang ka Nature.com. Anjeun nganggo vérsi browser anu dukungan CSSna terbatas. Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun anjeun nganggo browser anu diénggalan (atanapi mareuman Modeu Kompatibilitas dina Internet Explorer). Salian ti éta, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami nunjukkeun situs ieu tanpa gaya sareng JavaScript.
Nampilkeun korsel tilu slide sakaligus. Anggo tombol Sateuacanna sareng Salajengna pikeun ngaléngkah dina tilu slide sakaligus, atanapi anggo tombol slider di tungtungna pikeun ngaléngkah dina tilu slide sakaligus.
Panghalang getih-otak sareng panghalang getih-otak nyegah agén bioterapi pikeun ngahontal targetna dina sistem saraf pusat, sahingga ngahalangan pangobatan panyakit neurologis anu efektif. Pikeun mendakan transporter otak anyar in vivo, kami ngenalkeun perpustakaan péptida fag T7 sareng ngumpulkeun getih sareng cairan serebrospinal (CSF) sacara serial nganggo modél kolam renang ageung anu sadar anu dikanulasi tina beurit. Klon fag spésifik diperkaya pisan dina CSF saatos opat puteran seleksi. Tés péptida calon individu ngungkabkeun langkung ti 1000 kali lipat pengayaan dina CSF. Bioaktivitas pangiriman anu dimediasi péptida ka otak dikonfirmasi ku réduksi 40% dina tingkat amiloid-β dina cairan serebrospinal nganggo inhibitor péptida BACE1 anu aya hubunganana sareng péptida transit anyar anu diidentifikasi. Hasil ieu nunjukkeun yén péptida anu diidentifikasi ku metode seleksi fag in vivo tiasa janten wahana anu mangpaat pikeun pangiriman makromolekul sistemik ka otak kalayan pangaruh terapi.
Panalungtikan terapi anu ditujukeun kana sistem saraf pusat (SSP) sacara umum museur kana idéntifikasi ubar sareng agén anu dioptimalkeun anu nunjukkeun sipat targeting SSP, kalayan usaha anu langkung sakedik pikeun mendakan mékanisme anu ngadorong pangiriman ubar aktif ka uteuk. Ieu mimiti robih ayeuna sabab pangiriman ubar, khususna molekul ageung, mangrupikeun bagian integral tina pamekaran ubar neurosains modéren. Lingkungan sistem saraf pusat dijaga kalayan saé ku sistem panghalang serebrovaskular, anu diwangun ku panghalang getih-otak (BBB) ​​​​sareng panghalang getih-otak (BCBB)1, janten hésé pikeun nganteurkeun ubar ka uteuk1,2. Diperkirakeun yén ampir sadaya ubar molekul ageung sareng langkung ti 98% ubar molekul alit dikaluarkeun tina uteuk3. Éta sababna penting pisan pikeun idéntifikasi sistem transportasi uteuk énggal anu nyayogikeun pangiriman ubar terapi anu efisien sareng spésifik ka SSP 4,5. Nanging, BBB sareng BCSFB ogé nampilkeun kasempetan anu saé pikeun pangiriman ubar sabab nembus sareng lebet kana sadaya struktur uteuk ngalangkungan vaskularna anu éksténsif. Ku kituna, usaha ayeuna pikeun ngagunakeun metode pangiriman non-invasif ka uteuk seuseueurna dumasar kana mékanisme transportasi anu dimediasi ku reséptor (PMT) nganggo reséptor BBB6 éndogén. Sanaos aya kamajuan konci anyar anu nganggo jalur reséptor transferrin7,8, pamekaran salajengna tina sistem pangiriman énggal kalayan sipat anu ningkat diperyogikeun. Pikeun tujuan ieu, tujuan urang nyaéta pikeun ngaidentipikasi péptida anu sanggup ngamediasi transportasi CSF, sabab sacara prinsip tiasa dianggo pikeun nganteurkeun makromolekul ka SSP atanapi pikeun muka jalur reséptor énggal. Khususna, reséptor sareng transporter spésifik tina sistem serebrovaskular (BBB sareng BSCFB) tiasa janten target poténsial pikeun pangiriman ubar bioterapi anu aktip sareng spésifik. Cairan serebrospinal (CSF) mangrupikeun produk sékrési tina pleksus koroid (CS) sareng aya dina kontak langsung sareng cairan interstitial uteuk ngalangkungan rohangan subarachnoid sareng rohangan ventrikel4. Nembe waé parantos dipidangkeun yén cairan serebrospinal subarachnoid nyebar kaleuleuwihi kana interstitium uteuk9. Kami ngaharepkeun tiasa ngaksés rohangan parenkim nganggo saluran aliran subarachnoid ieu atanapi langsung ngalangkungan BBB. Pikeun ngahontal ieu, kami nerapkeun strategi pamilihan fag in vivo anu kuat anu idéal pikeun ngaidentipikasi péptida anu diangkut ku salah sahiji tina dua jalur anu béda ieu.
Ayeuna urang ngajelaskeun metode panyaringan tampilan fag in vivo sekuensial kalayan sampling CSF digabungkeun sareng sekuensing throughput anu luhur (HTS) pikeun ngawas babak seleksi awal kalayan keragaman perpustakaan pangluhurna. Panyaringan dilakukeun dina beurit sadar kalayan kanula cisterna ageung (CM) anu dipasang sacara permanén pikeun nyingkahan kontaminasi getih. Anu penting, pendekatan ieu milih targeting otak sareng péptida kalayan aktivitas transportasi ngalangkungan panghalang serebrovaskular. Kami nganggo fag T7 kusabab ukuranana anu alit (~60 nm)10 sareng nunjukkeun yén éta cocog pikeun transportasi vesikel anu ngamungkinkeun panyabrangan transélular tina panghalang endotel sareng / atanapi épitél-medula. Saatos opat babak panning, populasi fag diisolasi nunjukkeun pangayaan CSF in vivo anu kuat sareng asosiasi mikrovaskular serebral. Anu penting, kami tiasa mastikeun panemuan kami ku nunjukkeun yén péptida calon anu pangsaéna anu dipikaresep sareng disintésis sacara kimiawi tiasa ngangkut kargo protéin kana cairan serebrospinal. Mimiti, épék farmakodinamik tina SSP ditetepkeun ku ngagabungkeun péptida transit anu unggul sareng inhibitor péptida BACE1. Salian ti nunjukkeun yén strategi panyaringan fungsional in vivo tiasa ngaidentipikasi péptida transportasi otak anyar salaku pamawa kargo protéin anu efektif, kami ngarepkeun pendekatan seleksi fungsional anu sami ogé janten penting dina ngaidentipikasi jalur transportasi otak anyar.
Dumasar kana unit pembentuk plak (PFU), saatos léngkah pengemasan fag, perpustakaan péptida fag T7 linier 12-mer acak kalayan rupa-rupa sakitar 109 dirancang sareng didamel (tingali Bahan sareng Métode). Penting pikeun dicatet yén kami sacara saksama nganalisis perpustakaan ieu sateuacan panning in vivo. Amplifikasi PCR sampel perpustakaan fag nganggo primer anu dimodifikasi ngahasilkeun amplikon anu langsung tiasa diterapkeun ka HTS (Gambar Tambahan 1a). Kusabab a) kasalahan sekuensing HTS11, b) dampak kana kualitas primer (NNK)1-12, sareng c) ayana fag tipe liar (wt) (sisipan rangka) dina perpustakaan siaga, prosedur panyaringan sekuen dilaksanakeun pikeun ngekstrak ngan ukur inpormasi sekuen anu diverifikasi (Gambar Tambahan 1b). Léngkah-léngkah filter ieu lumaku pikeun sadaya perpustakaan sekuen HTS. Pikeun perpustakaan standar, total 233.868 bacaan diala, anu 39% lulus kriteria filter sareng dianggo pikeun analisis perpustakaan sareng pilihan pikeun babak salajengna (Gambar Tambahan 1c–e). Bacaan-bacaan éta didominasi ku kelipatan 3 pasangan basa panjangna kalayan puncak dina 36 nukléotida (Gambar Tambahan 1c), anu mastikeun desain perpustakaan (NNK) 1-12. Anu penting, sakitar 11% anggota perpustakaan ngandung sisipan PAGISRELVDKL tulang tonggong tipe liar (wt) 12 diménsi, sareng ampir satengah tina sekuen (49%) ngandung sisipan atanapi delesi. HTS perpustakaan perpustakaan mastikeun karagaman péptida anu luhur di perpustakaan: langkung ti 81% sekuen péptida ngan ukur kapanggih sakali sareng ngan ukur 1,5% lumangsung dina ≥4 salinan (Gambar Tambahan 2a). Frékuénsi asam amino (aa) dina sadaya 12 posisi dina repertoar berkorelasi saé sareng frékuénsi anu dipiharep pikeun jumlah kodon anu dihasilkeun ku repertoar NKK anu degenerasi (Gambar Tambahan 2b). Frékuénsi résidu aa anu dititénan anu dikodekeun ku sisipan ieu berkorelasi saé sareng frékuénsi anu diitung (r = 0,893) (Gambar Tambahan 2c). Nyiapkeun perpustakaan fag pikeun injeksi ngawengku léngkah-léngkah amplifikasi sareng miceun endotoksin. Ieu sateuacanna parantos dipidangkeun poténsial pikeun ngirangan karagaman perpustakaan fag12,13. Ku alatan éta, urang ngurutkeun perpustakaan fag anu diamplifikasi pelat anu parantos ngalaman panyabutan endotoksin sareng ngabandingkeunana sareng perpustakaan aslina pikeun ngira-ngira frékuénsi AA. Korélasi anu kuat (r = 0,995) dititénan antara kolam aslina sareng kolam anu diamplifikasi sareng dimurnikeun (Gambar Tambahan 2d), nunjukkeun yén persaingan antara klon anu diamplifikasi dina pelat nganggo fag T7 henteu nyababkeun bias utama. Perbandingan ieu dumasar kana frékuénsi motif tripeptida dina unggal perpustakaan, kumargi karagaman perpustakaan (~109) henteu tiasa ditangkep sapinuhna bahkan nganggo HTS. Analisis frékuénsi aa dina unggal posisi ngungkabkeun bias anu gumantung kana posisi dina tilu posisi terakhir tina repertoar anu diasupkeun (Gambar Tambahan 2e). Dina kacindekan, urang nyimpulkeun yén kualitas sareng karagaman perpustakaan tiasa ditampi sareng ngan ukur parobihan minor dina karagaman anu dititénan kusabab amplifikasi sareng persiapan perpustakaan fag antara sababaraha puteran seleksi.
Sampling cairan serebrospinal serial tiasa dilakukeun ku cara masang kanula sacara bedah kana CM beurit anu sadar pikeun ngagampangkeun idéntifikasi fag T7 anu disuntikkeun sacara intravena (iv) ngalangkungan BBB sareng/atanapi BCSFB (Gambar 1a-b). Kami nganggo dua panangan seleksi mandiri (panangan A sareng B) dina tilu puteran munggaran seleksi in vivo (Gambar 1c). Kami laun-laun ningkatkeun kateguhan seleksi ku cara ngirangan jumlah total fag anu diwanohkeun dina tilu puteran munggaran seleksi. Pikeun puteran kaopat panning, kami ngagabungkeun sampel tina cabang A sareng B sareng ngalaksanakeun tilu seleksi mandiri tambahan. Pikeun nalungtik sipat in vivo partikel fag T7 dina modél ieu, fag tipe liar (sisipan master PAGISRELVDKL) disuntikkeun kana beurit ngalangkungan véna buntut. Pamulihan fag tina cairan serebrospinal sareng getih dina titik waktos anu béda nunjukkeun yén fag ikosahedral T7 anu relatif alit ngagaduhan fase pembersihan awal anu gancang tina kompartemen getih (Gambar Tambahan 3). Dumasar kana titer anu dikaluarkeun sareng volume getih beurit, urang ngitung yén ngan ukur sakitar 1% wt. fag tina dosis anu dikaluarkeun anu dideteksi dina getih 10 menit saatos injeksi intravena. Saatos panurunan awal anu gancang ieu, clearance primér anu langkung laun diukur kalayan satengah hirup 27,7 menit. Anu penting, ngan ukur saeutik pisan fag anu dicandak tina kompartemen CSF, nunjukkeun latar tukang anu handap pikeun migrasi fag tipe liar kana kompartemen CSF (Gambar Tambahan 3). Rata-rata, ngan ukur sakitar 1 x 10-3% titer fag T7 dina getih sareng 4 x 10-8% tina fag anu mimitina diinfus dideteksi dina cairan serebrospinal salami sakabéh période sampling (0-250 menit). Anu penting, satengah hirup (25,7 menit) fag tipe liar dina cairan serebrospinal sami sareng anu dititénan dina getih. Data ieu nunjukkeun yén panghalang anu misahkeun kompartemen CSF tina getih masih utuh dina beurit anu dikanulasi CM, anu ngamungkinkeun pamilihan perpustakaan fag in vivo pikeun ngaidentipikasi klon anu gampang diangkut tina getih kana kompartemen CSF.
(a) Nyetél metode pikeun nyokot deui sampel cairan serebrospinal (CSF) tina kolam anu ageung. (b) Diagram anu nunjukkeun lokasi sélular tina panghalang sistem saraf pusat (SSP) sareng strategi seleksi anu dianggo pikeun ngaidentipikasi péptida anu meuntas panghalang getih-otak (BBB) ​​​​sareng panghalang getih-otak. (c) Diagram alur panyaringan tampilan fag in vivo. Dina unggal babak seleksi, fag (idéntifikasi sato di jero panah) disuntikkeun sacara intravena. Dua cabang alternatif mandiri (A, B) disimpen misah dugi ka babak ka-4 seleksi. Pikeun babak seleksi 3 sareng 4, unggal klon fag anu diekstrak tina CSF diurutkeun sacara manual. (d) Kinétika fag anu diisolasi tina getih (bunderan beureum) sareng cairan serebrospinal (segitiga héjo) salami babak kahiji seleksi dina dua beurit anu dikanulasi saatos suntikan intravena tina perpustakaan péptida T7 (2 x 1012 fag/sato). Kotak biru nunjukkeun konsentrasi awal rata-rata fag dina getih, diitung tina jumlah fag anu disuntikkeun, kalayan merhatikeun total volume getih. Kotak hideung nunjukkeun titik patepang garis y anu diekstrapolasi tina konsentrasi fag getih. (e,f) Némbongkeun frékuénsi relatif sareng distribusi sadaya motif tripeptida anu tumpang tindih anu kapanggih dina péptida. Jumlah motif anu kapanggih dina 1000 bacaan dipidangkeun. Sacara signifikan (p < 0,001) motif anu diperkaya ditandaan ku titik beureum. (e) Plot sebaran korélasi anu ngabandingkeun frékuénsi relatif motif tripeptida tina perpustakaan anu disuntikkeun sareng fag anu diturunkeun tina getih tina sato #1.1 sareng #1.2. (f) Plot sebaran korélasi anu ngabandingkeun frékuénsi relatif motif tripeptida fag sato #1.1 sareng #1.2 anu diisolasi dina getih sareng cairan serebrospinal. (g, h) Répréséntasi ID runtuyan fag anu diperkaya ku getih (g) dibandingkeun perpustakaan anu disuntikkeun sareng fag anu diperkaya ku CSF (h) dibandingkeun getih saatos puteran seleksi in vivo dina duanana sato. Ukuran kode hiji hurup nunjukkeun sabaraha sering asam amino éta aya dina posisi éta. Héjo = polar, wungu = nétral, biru = basa, beureum = asam sareng hideung = asam amino hidrofobik. Gambar 1a, b dirancang sareng diproduksi ku Eduard Urich.
Kami nyuntikkeun pustaka péptida fag kana dua beurit instrumen CM (clades A sareng B) sareng ngasingkeun fag tina cairan serebrospinal sareng getih (Gambar 1d). Pembersihan gancang awal pustaka kirang katingali dibandingkeun sareng fag tipe liar. Rata-rata satengah hirup pustaka anu disuntikkeun dina dua sato nyaéta 24,8 menit dina getih, sami sareng fag tipe liar, sareng 38,5 menit dina CSF. Sampel fag getih sareng cairan serebrospinal ti unggal sato diuji HTS sareng sadaya péptida anu diidentipikasi dianalisis pikeun ayana motif tripéptida pondok. Motif tripéptida dipilih sabab nyayogikeun dasar minimal pikeun formasi struktur sareng interaksi péptida-protéin14,15. Kami mendakan korélasi anu saé dina distribusi motif antara pustaka fag anu disuntikkeun sareng klon anu diekstrak tina getih dua sato (Gambar 1e). Data nunjukkeun yén komposisi pustaka ngan ukur saeutik beunghar dina kompartemen getih. Frékuénsi asam amino sareng runtuyan konsensus salajengna dianalisis dina unggal posisi nganggo adaptasi tina parangkat lunak Weblogo16. Anu pikaresepeun, urang mendakan pangayaan anu kuat dina résidu glisin getih (Gambar 1g). Nalika getih dibandingkeun sareng klon anu dipilih tina CSF, seleksi anu kuat sareng sababaraha deseleksi motif katingali (Gambar 1f), sareng asam amino anu tangtu langkung dipikaresep aya dina posisi anu ditangtukeun dina 12 anggota (Gambar 1h). Anu penting, sato individu béda sacara signifikan dina cairan serebrospinal, sedengkeun pangayaan glisin getih katingali dina duanana sato (Gambar Tambahan 4a–j). Saatos nyaring data runtuyan anu ketat dina cairan serebrospinal sato #1.1 sareng #1.2, total 964 sareng 420 péptida 12-mer unik diala (Gambar Tambahan 1d–e). Klon fag anu diisolasi diamplifikasi sareng dilakukeun puteran kadua seleksi in vivo. Fag anu diekstrak tina puteran kadua seleksi dilakukeun HTS dina unggal sato sareng sadaya péptida anu diidentifikasi dianggo salaku input kana program pangakuan motif pikeun nganalisis kajadian motif tripeptida (Gambar 2a, b, ef). Dibandingkeun sareng siklus munggaran fag anu dicandak tina CSF, urang niténan pamilihan sareng panghapusan pamilihan salajengna tina seueur motif dina CSF dina cabang A sareng B (Gambar 2). Algoritma idéntifikasi jaringan diterapkeun pikeun nangtukeun naha éta ngagambarkeun pola anu béda tina runtuyan anu konsisten. Kamiripan anu jelas katingali antara runtuyan 12 diménsi anu dicandak ku CSF dina clade alternatif A (Gambar 2c, d) sareng clade B (Gambar 2g, h). Analisis gabungan dina unggal cabang ngungkabkeun profil pamilihan anu béda pikeun péptida 12-mer (Gambar Tambahan 5c, d) sareng paningkatan dina babandingan titer CSF/getih kana waktosna pikeun klon gabungan saatos puteran kadua pamilihan dibandingkeun sareng puteran kahiji pamilihan (Gambar Tambahan 5e). ).
Pangayaan motif sareng péptida dina cairan serebrospinal ku dua puteran pamilihan tampilan fag fungsional in vivo sacara berturut-turut.
Sadaya fag cairan serebrospinal anu dicandak tina babak kahiji unggal sato (sato #1.1 sareng #1.2) dikumpulkeun, diamplifikasi, diurutkeun HT sareng diinjeksi deui babarengan (2 x 1010 fag/sato) 2 beurit anu dikanulasi SM (#1.1 → #). 2.1 sareng 2.2, 1.2 → 2.3 sareng 2.4). (a,b,e,f) Sebaran plot korelasi anu ngabandingkeun frékuénsi relatif motif tripeptida sadaya fag anu diturunkeun tina CSF dina babak seleksi kahiji sareng kadua. Frékuénsi relatif sareng distribusi motif anu ngawakilan sadaya tripeptida anu tumpang tindih anu kapanggih dina péptida dina dua orientasi. Jumlah motif anu kapanggih dina 1000 bacaan dipidangkeun. Motif anu sacara signifikan (p < 0,001) dipilih atanapi dikaluarkeun dina salah sahiji perpustakaan anu dibandingkeun disorot ku titik beureum. (c, d, g, h) Répréséntasi logo runtuyan sadaya runtuyan panjang 12 asam amino anu beunghar CSF dumasar kana babak 2 sareng 1 tina seleksi in vivo. Ukuran kode hiji hurup nunjukkeun sabaraha sering asam amino éta muncul dina posisi éta. Pikeun ngagambarkeun logo, frékuénsi runtuyan CSF anu diekstrak tina sato individu antara dua babak seleksi dibandingkeun sareng runtuyan anu beunghar dina babak kadua dipidangkeun: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 sareng (h) #1.2–#2.4. Asam amino anu paling beunghar dina posisi anu dipasihkeun dina (c, d) sato no. 2.1 sareng no. 2.2 atanapi (g, h) dina sato no. 2.3 sareng no. 2.4 dipidangkeun dina warna. Héjo = polar, wungu = nétral, biru = basa, beureum = asam sareng hideung = asam amino hidrofobik.
Saatos babak katilu seleksi, urang ngaidentipikasi 124 runtuyan péptida unik (#3.1 sareng #3.2) tina 332 klon fag anu dibentuk deui CSF anu diisolasi tina dua sato (Gambar Tambahan 6a). Urutan LGSVS (18,7%) ngagaduhan proporsi relatif pangluhurna, dituturkeun ku sisipan tipe liar PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%), sareng SARGSWREIVSLS (2,2%). Dina babak kaopat pamungkas, urang ngumpulkeun dua cabang anu dipilih sacara mandiri tina tilu sato anu misah (Gambar 1c). Tina 925 klon fag anu diurutkeun anu pulih tina CSF, dina babak kaopat urang mendakan 64 runtuyan péptida unik (Gambar Tambahan 6b), di antarana proporsi relatif fag tipe liar turun janten 0,8%. Klon CSF anu paling umum dina babak kaopat nyaéta LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) sareng RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). Rentang panjang péptida anu dipilih disababkeun ku sisipan/délesi nukléotida atanapi kodon eureun prématur dina primer perpustakaan nalika nganggo kodon degenerasi pikeun desain perpustakaan NNK. Kodon eureun prématur ngahasilkeun péptida anu langkung pondok sareng dipilih sabab ngandung motif aa anu nguntungkeun. Péptida anu langkung panjang tiasa hasil tina sisipan/délesi dina primer perpustakaan sintétik. Ieu nempatkeun kodon eureun anu dirancang di luar pigura sareng macana dugi ka kodon eureun énggal muncul di hilir. Sacara umum, kami ngitung faktor pangayaan pikeun sadaya opat babak pilihan ku cara ngabandingkeun data input sareng data kaluaran sampel. Pikeun babak kahiji panyaringan, urang nganggo titer fag tipe liar salaku rujukan latar tukang anu teu spésifik. Anu pikaresepeun, pamilihan fag négatip kuat pisan dina siklus CSF kahiji, tapi sanés dina getih (Gambar 3a), anu tiasa disababkeun ku probabilitas difusi pasif anu handap tina kalolobaan anggota perpustakaan péptida kana kompartemen CSF atanapi fag relatif condong langkung épisién ditahan atanapi dipiceun tina aliran getih tibatan baktériofag. Nanging, dina babak kadua panning, pamilihan fag anu kuat dina CSF dititénan dina dua clade, nunjukkeun yén babak sateuacanna diperkaya dina fag anu nampilkeun péptida anu ngamajukeun serapan CSF (Gambar 3a). Sakali deui, tanpa pengayaan getih anu signifikan. Ogé dina babak katilu sareng kaopat, klon fag diperkaya sacara signifikan dina CSF. Ngabandingkeun frékuénsi relatif unggal runtuyan péptida unik antara dua babak pamilihan terakhir, urang mendakan yén runtuyan éta langkung diperkaya dina babak kaopat pamilihan (Gambar 3b). Total 931 motif tripeptida diekstrak tina sadaya 64 runtuyan péptida unik nganggo duanana orientasi péptida. Motif anu paling beunghar dina babak kaopat ditalungtik langkung saksama pikeun profil pangayaanna di sadaya babak dibandingkeun sareng perpustakaan anu diinjeksi (cut-off: pangayaan 10%) (Gambar Tambahan 6c). Pola umum seleksi nunjukkeun yén kalolobaan motif anu ditalungtik beunghar dina sadaya babak sateuacana tina dua cabang seleksi. Nanging, sababaraha motif (contona SGL, VSG, LGS GSV) utamina tina klade alternatif A, sedengkeun anu sanésna (contona FGW, RTN, WGF, NTR) beunghar dina klade alternatif B.
Validasi transportasi CSF tina peptida anu diperkaya ku fag anu ditampilkeun ku CSF sareng peptida pamimpin biotinilasi anu dikonjugasi kana muatan streptavidin.
(a) Babandingan pangayaan anu diitung dina opat babak (R1-R4) dumasar kana titer fag (PFU) anu diinjeksi (input = I) sareng titer fag CSF anu ditangtukeun (output = O). Faktor pangayaan pikeun tilu babak terakhir (R2-R4) diitung ku cara ngabandingkeun sareng babak sateuacana sareng babak kahiji (R1) kalayan data beurat. Batang kabuka nyaéta cairan serebrospinal, batang anu diarsir nyaéta plasma. (***p<0,001, dumasar kana uji-t Student). (b) Daptar péptida fag anu paling loba, dirangking dumasar kana proporsi relatifna ka sadaya fag anu dikumpulkeun dina CSF saatos babak ka-4 seleksi. Genep klon fag anu paling umum disorot dina warna, dinomeran sareng faktor pangayaanna antara babak ka-3 sareng ka-4 seleksi (sisipan). (c,d) Genep klon fag anu paling beunghar, perpustakaan péptida fag kosong sareng fag kolot ti babak ka-4 dianalisis sacara individual dina modél sampling CSF. Sampel CSF sareng getih dikumpulkeun dina titik waktos anu dituduhkeun. (c) Jumlah anu sami tina 6 calon klon fag (2 x 1010 fag/sato), fag kosong (#1779) (2 x 1010 fag/sato) sareng perpustakaan peptida fag stok (2 x 1012 fag/sato) Suntikan sahenteuna 3 CM dikaluarkeun ka sato anu dikanulasi sacara misah ngalangkungan véna buntut. Farmakokinetik CSF tina unggal klon fag anu disuntik sareng perpustakaan peptida fag kana waktos dipidangkeun. (d) nunjukkeun rasio CSF/getih rata-rata pikeun sadaya fag/mL anu pulih salami waktos sampling. (e) Opat peptida pamimpin sintétik sareng hiji kontrol acak dihubungkeun sareng biotin kana streptavidin ngalangkungan N-terminusna (tampilan tetramer) dituturkeun ku suntikan (véna buntut iv, 10 mg streptavidin/kg). Sahenteuna tilu beurit anu diintubasi (N = 3). ). Sampel CSF dikumpulkeun dina titik waktu anu dituduhkeun sareng konsentrasi streptavidin diukur ku CSF anti-streptavidin ELISA (nd = teu kadeteksi). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, dumasar kana uji ANOVA). (f) Babandingan runtuyan asam amino tina klon péptida fag anu paling beunghar #2002 (wungu) sareng klon péptida fag anu dipilih anu sanés tina puteran ka-4 seleksi. Fragmen asam amino anu idéntik sareng anu sami dibéré kode warna.
Tina sadaya fag anu diperkaya dina babak kaopat (Gambar 3b), genep calon klon dipilih pikeun analisis individu salajengna dina modél sampling CSF. Jumlah anu sami tina genep calon perpustakaan péptida fag, fag kosong (tanpa sisipan) sareng profag disuntikkeun kana tilu sato CM anu dikanulasi, sareng farmakokinetik ditangtukeun dina uji CSF (Gambar 3c) sareng getih (Gambar Tambahan 7). Sadaya klon fag anu diuji narékahan kompartemen CSF dina tingkat 10-1000 kali langkung luhur tibatan fag kontrol kosong (#1779). Salaku conto, klon #2020 sareng #2077 ngagaduhan titer CSF sakitar 1000 kali langkung luhur tibatan fag kontrol. Profil farmakokinetik tina unggal péptida anu dipilih béda, tapi sadayana ngagaduhan kamampuan homing CSF anu luhur. Kami niténan panurunan anu konstan salami waktos kanggo klon #1903 sareng #2011, sedengkeun kanggo klon #2077, #2002 sareng #2009 paningkatan salami 10 menit mimiti tiasa nunjukkeun transportasi aktif tapi kedah diverifikasi. Klon #2020, #2002, sareng #2077 stabil dina tingkat anu luhur, sedengkeun konsentrasi CSF klon #2009 laun-laun turun saatos paningkatan awal. Teras kami ngabandingkeun frékuénsi relatif unggal calon CSF sareng konsentrasi getihna (Gambar 3d). Korélasi titer rata-rata unggal calon CSF sareng titer getihna dina sadaya waktos sampling nunjukkeun yén tilu tina genep calon diperkaya sacara signifikan dina CSF getih. Anu pikaresepeun, klon #2077 nunjukkeun stabilitas getih anu langkung luhur (Gambar Tambahan 7). Pikeun mastikeun yén péptida sorangan sanggup sacara aktif ngangkut kargo salian ti partikel fag kana kompartemen CSF, kami nyintésis opat péptida pamimpin anu diderivatisasi ku biotin di N-terminus dimana péptida napel kana partikel fag. Peptida biotinilasi (no. 2002, 2009, 2020 sareng 2077) dikonjugasi sareng streptavidin (SA) pikeun kéngingkeun bentuk multimerik anu rada niru géométri fag. Format ieu ogé ngamungkinkeun urang pikeun ngukur paparan SA dina getih sareng cairan serebrospinal salaku peptida protéin anu ngangkut kargo. Anu penting, data fag sering tiasa direproduksi nalika peptida sintétis dikaluarkeun dina format konjugasi SA ieu (Gambar 3e). Peptida anu diacak ngagaduhan paparan awal anu langkung sakedik sareng clearance CSF anu langkung gancang kalayan tingkat anu teu tiasa dideteksi dina 48 jam. Pikeun kéngingkeun wawasan ngeunaan jalur pangiriman klon fag peptida ieu kana rohangan CSF, urang nganalisis lokalisasi hit peptida fag individu nganggo imunohistokimia (IHC) pikeun langsung ngadeteksi partikel fag 1 jam saatos injeksi intravena in vivo. Anu penting, klon #2002, #2077, sareng #2009 tiasa dideteksi ku pewarnaan anu kuat dina kapiler otak, sedengkeun fag kontrol (#1779) sareng klon #2020 henteu dideteksi (Gambar Tambahan 8). Ieu nunjukkeun yén péptida ieu nyumbang kana pangaruh kana otak sacara tepat ku cara meuntas BBB. Analisis anu langkung lengkep diperyogikeun pikeun nguji hipotesis ieu, sabab rute BSCFB ogé tiasa kalibet. Nalika ngabandingkeun runtuyan asam amino tina klon anu paling beunghar (#2002) sareng péptida anu dipilih anu sanés, dicatet yén sababaraha di antarana gaduh ekstensi asam amino anu sami, anu tiasa nunjukkeun mékanisme transportasi anu sami (Gambar 3f).
Kusabab profil plasma anu unik sareng paningkatan anu signifikan dina CSF kana waktosna, klon tampilan fag #2077 salajengna ditalungtik salami periode 48 jam anu langkung lami sareng tiasa ngahasilkeun deui paningkatan gancang dina CSF anu dititénan dina hubunganana sareng tingkat SA anu lestari (Gambar 4a). Ngeunaan klon fag anu diidentipikasi anu sanés, #2077 diwarnaan kuat pikeun kapiler otak sareng nunjukkeun kolokalisasi anu signifikan sareng lektin spidol kapiler nalika ditingali dina résolusi anu langkung luhur sareng kamungkinan sababaraha pewarnaan dina rohangan parenkim (Gambar 4b). Pikeun nalungtik naha épék farmakologis anu dimediasi péptida tiasa diala dina SSP, kami ngalaksanakeun ékspérimén dimana vérsi biotinilasi tina i) péptida transit #2077 sareng ii) péptida inhibitor BACE1 dicampur sareng SA dina dua babandingan anu béda. Pikeun hiji kombinasi kami ngan ukur nganggo inhibitor péptida BACE1 sareng pikeun anu sanésna kami nganggo babandingan 1:3 tina inhibitor péptida BACE1 ka péptida #2077. Kadua sampel dikaluarkeun sacara intravena sareng tingkat péptida béta-amiloid 40 (Abeta40) dina getih sareng cairan serebrospinal diukur salami waktos. Abeta40 diukur dina CSF sabab ngagambarkeun inhibisi BACE1 dina parenkim otak. Sapertos anu dipiharep, duanana kompleks sacara signifikan ngirangan tingkat getih Abeta40 (Gambar 4c, d). Nanging, ngan ukur sampel anu ngandung campuran péptida no. 2077 sareng inhibitor péptida BACE1 anu dikonjugasi kana SA nyababkeun panurunan anu signifikan dina Abeta40 dina cairan serebrospinal (Gambar 4c). Data nunjukkeun yén péptida no. 2077 tiasa ngangkut protéin SA 60 kDa kana SSP sareng ogé ngainduksi épék farmakologis sareng inhibitor konjugasi SA tina péptida BACE1.
(a) Injeksi klonal (2 × 10 fag/sato) tina fag T7 anu nunjukkeun profil farmakokinetik jangka panjang tina péptida CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) sareng fag kontrol anu teu disuntik (#1779) dina sahenteuna tilu beurit anu diintubasi CM. (b) Gambar mikroskopis konfokal tina pembuluh darah kortikal anu representatif dina beurit anu disuntik fag (2 × 10 10 fag/sato) anu nunjukkeun counterstaining péptida #2077 sareng pembuluh darah (lektin). Klon fag ieu dibikeun ka 3 beurit sareng diidinan sirkulasi salami 1 jam sateuacan perfusi. Otak dipotong sareng diwarnaan ku antibodi poliklonal anu dilabélan FITC ngalawan kapsid fag T7. Sapuluh menit sateuacan perfusi sareng fiksasi salajengna, lektin anu dilabélan DyLight594 dibikeun sacara intravena. Gambar fluoresensi anu nunjukkeun pewarnaan lektin (beureum) tina sisi luminal pembuluh darah mikro sareng fag (héjo) dina lumen kapiler sareng jaringan otak perivaskular. Bar skala pakait sareng 10 µm. (c, d) Péptida inhibisi BACE1 biotinilasi nyalira atanapi digabungkeun sareng péptida transit biotinilasi #2077 digandengkeun kana streptavidin dituturkeun ku suntikan intravena sahenteuna tilu beurit CM anu dikanulasi (10 mg streptavidin/kg). Réduksi anu dimediasi ku inhibitor péptida BACE1 dina Aβ40 diukur ku Aβ1-40 ELISA dina getih (beureum) sareng cairan serebrospinal (oranyeu) dina titik waktos anu dituduhkeun. Pikeun kajelasan anu langkung saé, garis putus-putus digambar dina grafik dina skala 100%. (c) Pangurangan perséntase dina Aβ40 dina getih (segitiga beureum) sareng cairan serebrospinal (segitiga oranyeu) dina beurit anu dirawat ku streptavidin anu dikonjugasi sareng péptida transit #2077 sareng péptida inhibisi BACE1 dina babandingan 3:1. (d) Pangurangan perséntase dina Aβ40 getih (bunderan beureum) sareng cairan serebrospinal (bunderan oranyeu) beurit anu dirawat ku streptavidin anu digandéngkeun sareng péptida inhibisi BACE1 hungkul. Konsentrasi Aβ dina kontrol nyaéta 420 pg/ml (standar deviasi = 101 pg/ml).
Tampilan fag parantos suksés diterapkeun dina sababaraha widang panalungtikan biomédis17. Métode ieu parantos dianggo pikeun studi karagaman vaskular in vivo18,19 ogé studi anu narékahan pembuluh otak20,21,22,23,24,25,26. Dina panilitian ieu, kami ngalegaan aplikasi metode seleksi ieu henteu ngan ukur pikeun idéntifikasi langsung péptida anu narékahan pembuluh otak, tapi ogé pikeun kapanggihna calon anu gaduh sipat transportasi aktif pikeun meuntas panghalang getih-otak. Ayeuna kami ngajelaskeun pamekaran prosedur seleksi in vivo dina beurit anu diintubasi CM sareng nunjukkeun poténsina pikeun ngaidentipikasi péptida kalayan sipat homing CSF. Nganggo fag T7 anu nampilkeun perpustakaan péptida acak 12-mer, kami tiasa nunjukkeun yén fag T7 cukup alit (diaméter sakitar 60 nm)10 pikeun diadaptasi kana panghalang getih-otak, ku kituna langsung meuntas panghalang getih-otak atanapi pleksus koroid. Kami niténan yén panén CSF tina beurit CM anu dikanulasi mangrupikeun metode panyaringan fungsional in vivo anu dikontrol kalayan saé, sareng yén fag anu diekstrak henteu ngan ukur kabeungkeut kana vaskulatur tapi ogé fungsina salaku transporter anu meuntas panghalang getih-otak. Salajengna, ku cara ngumpulkeun getih sareng nerapkeun HTS kana CSF sareng fag anu diturunkeun tina getih, kami mastikeun yén pilihan CSF kami henteu dipangaruhan ku pangayaan getih atanapi kabugaran pikeun ékspansi antara puteran seleksi. Nanging, kompartemen getih mangrupikeun bagian tina prosedur seleksi, kumargi fag anu sanggup ngahontal kompartemen CSF kedah salamet sareng ngiderkeun dina aliran getih cukup lami pikeun ngabeungharan dirina dina uteuk. Pikeun nimba inpormasi runtuyan anu tiasa dipercaya tina data HTS atah, kami nerapkeun filter anu diadaptasi kana kasalahan sekuensing khusus platform dina alur kerja analisis. Ku cara ngasupkeun parameter kinétik kana metode panyaringan, kami mastikeun farmakokinetik gancang tina fag T7 tipe liar (t½ ~ 28 menit) dina getih24, 27, 28 sareng ogé nangtukeun satengah hirupna dina cairan serebrospinal (t½ ~ 26 menit) per menit). Sanaos profil farmakokinetik anu sami dina getih sareng CSF, ngan ukur 0,001% tina konsentrasi fag dina getih anu tiasa dideteksi dina CSF, nunjukkeun mobilitas latar tukang anu handap tina fag T7 tipe liar meuntas panghalang getih-otak. Karya ieu nyorot pentingna babak kahiji seleksi nalika nganggo strategi panning in vivo, khususna pikeun sistem fag anu gancang dibersihkeun tina sirkulasi, sabab saeutik klon anu tiasa ngahontal kompartemen SSP. Ku kituna, dina babak kahiji, réduksi dina karagaman perpustakaan ageung pisan, sabab ngan ukur jumlah klon anu terbatas anu pamustunganana dikumpulkeun dina modél CSF anu ketat pisan ieu. Strategi panning in vivo ieu kalebet sababaraha léngkah seleksi sapertos akumulasi aktif dina kompartemen CSF, salametna klon dina kompartemen getih, sareng miceun klon fag T7 tina getih dina 10 menit kahiji (Gambar 1d sareng Gambar Tambahan 4M). ). Ku kituna, saatos babak kahiji, klon fag anu béda diidentifikasi dina CSF, sanaos kolam renang awal anu sami dianggo pikeun sato individu. Ieu nunjukkeun yén sababaraha léngkah seleksi anu ketat pikeun perpustakaan sumber kalayan seueur anggota perpustakaan nyababkeun réduksi anu signifikan dina karagaman. Ku alatan éta, kajadian acak bakal janten bagian integral tina prosés seleksi awal, anu mangaruhan pisan kana hasilna. Kamungkinan seueur klon dina perpustakaan aslina gaduh kecenderungan pangayaan CSF anu sami pisan. Nanging, bahkan dina kaayaan ékspérimén anu sami, hasil seleksi tiasa bénten kusabab jumlah unggal klon khusus dina kumpulan awal anu sakedik.
Motif-motif anu beunghar dina CSF béda sareng anu aya dina getih. Anu pikaresepeun, urang perhatoskeun parobahan munggaran nuju péptida anu beunghar glisin dina getih sato individu. (Gambar 1g, Gambar Tambahan. 4e, 4f). Péptida glisin anu ngandung fag tiasa langkung stabil sareng kirang kamungkinan dikaluarkeun tina sirkulasi. Nanging, péptida anu beunghar glisin ieu henteu dideteksi dina sampel cairan serebrospinal, nunjukkeun yén perpustakaan anu dikurator ngalangkungan dua léngkah seleksi anu béda: hiji dina getih sareng anu sanésna diidinan akumulasi dina cairan serebrospinal. Klon anu beunghar CSF anu hasil tina puteran seleksi kaopat parantos diuji sacara éksténsif. Ampir sadaya klon anu diuji sacara individual dikonfirmasi beunghar dina CSF dibandingkeun sareng fag kontrol kosong. Hiji hit péptida (#2077) ditalungtik langkung rinci. Éta nunjukkeun satengah hirup plasma anu langkung lami dibandingkeun sareng hit anu sanés (Gambar 3d sareng Gambar Tambahan 7), sareng anu pikaresepeun, péptida ieu ngandung sésa sistein di C-terminus. Anyar-anyar ieu parantos dipidangkeun yén panambahan sistein kana péptida tiasa ningkatkeun sipat farmakokinetikna ku cara ngabeungkeut albumin 29. Ieu ayeuna teu dipikanyaho pikeun péptida #2077 sareng meryogikeun panilitian salajengna. Sababaraha péptida nunjukkeun gumantungna valénsi dina pangayaan CSF (data teu dipidangkeun), anu tiasa aya hubunganana sareng géométri permukaan kapsid T7 anu dipidangkeun. Sistem T7 anu kami anggo nunjukkeun 5-15 salinan unggal péptida per partikel fag. IHC dilakukeun dina calon klon fag utama anu disuntikkeun sacara intravena kana korteks serebral beurit (Gambar Tambahan 8). Data nunjukkeun yén sahenteuna tilu klon (No. 2002, No. 2009 sareng No. 2077) berinteraksi sareng BBB. Masih kedah ditangtukeun naha interaksi BBB ieu nyababkeun akumulasi CSF atanapi gerakan klon ieu langsung ka BCSFB. Anu penting, kami nunjukkeun yén péptida anu dipilih nahan kapasitas transportasi CSF na nalika disintésis sareng kabeungkeut kana kargo protéin. Ngabeungkeutna péptida biotinilasi N-terminal ka SA sacara dasarna ngulang hasil anu diala ku klon fag masing-masing dina getih sareng cairan serebrospinal (Gambar 3e). Pamungkas, urang nunjukkeun yén péptida timbal #2077 tiasa ningkatkeun tindakan otak tina inhibitor péptida biotinilasi BACE1 anu dikonjugasi ka SA, nyababkeun épék farmakodinamik anu jelas dina SSP ku cara ngirangan sacara signifikan tingkat Abeta40 dina CSF (Gambar 4). Kami henteu tiasa ngaidentipikasi homolog naon waé dina database ku cara ngalakukeun pamilarian homologi runtuyan péptida tina sadaya hit. Penting pikeun dicatet yén ukuran perpustakaan T7 sakitar 109, sedengkeun ukuran perpustakaan téoritis pikeun 12-mers nyaéta 4 x 1015. Ku alatan éta, kami ngan ukur milih fraksi leutik tina rohangan karagaman perpustakaan péptida 12-mer, anu tiasa hartosna yén péptida anu langkung dioptimalkeun tiasa diidentifikasi ku cara meunteun rohangan runtuyan anu caket tina hit anu diidentifikasi ieu. Sacara hipotétis, salah sahiji alesan kunaon urang teu acan mendakan homolog alami tina péptida ieu nyaéta kusabab deseleksi nalika évolusi pikeun nyegah asupna motif péptida anu tangtu kana uteuk anu teu dikontrol.
Sacara gembleng, hasil panilitian kami nyayogikeun dasar pikeun panilitian ka hareup pikeun ngaidentipikasi sareng ngacirikeun sistem transportasi panghalang serebrovaskular in vivo sacara langkung rinci. Susunan dasar metode ieu dumasar kana strategi seleksi fungsional anu henteu ngan ukur ngaidentipikasi klon kalayan sipat ngabeungkeut vaskular serebro, tapi ogé kalebet léngkah kritis dimana klon anu suksés gaduh aktivitas intrinsik pikeun meuntas panghalang biologis in vivo kana kompartemen SSP. nyaéta pikeun ngajelaskeun mékanisme transportasi péptida ieu sareng karesepna pikeun ngabeungkeut kana mikrovaskular khusus pikeun daérah otak. Ieu tiasa nyababkeun kapanggihna jalur énggal pikeun transportasi BBB sareng reséptor. Kami ngarepkeun yén péptida anu diidentipikasi tiasa langsung ngabeungkeut kana reséptor serebrovaskular atanapi kana ligan anu sirkulasi anu diangkut ngalangkungan BBB atanapi BCSFB. Véktor péptida kalayan aktivitas transportasi CSF anu kapanggih dina panilitian ieu bakal ditalungtik salajengna. Kami ayeuna nuju nalungtik spésifisitas otak péptida ieu pikeun kamampuanna pikeun meuntas BBB sareng/atanapi BCSFB. Péptida anyar ieu bakal janten alat anu berharga pisan pikeun poténsi panemuan reséptor atanapi jalur anyar sareng pikeun pamekaran platform énggal anu épisién pisan pikeun pangiriman makromolekul, sapertos biologis, ka uteuk.
Kanulasi cisterna ageung (CM) nganggo modifikasi tina metode anu dijelaskeun sateuacanna. Tikus Wistar anu dibius (200-350 g) dipasang dina alat stereotaksik sareng sayatan median dilakukeun dina kulit sirah anu dicukur sareng disiapkeun sacara aseptik pikeun ngalaan tangkorak. Bor dua liang di daérah sash luhur sareng pasang sekrup pangiket dina liang éta. Liang tambahan dibor dina puncak oksipital lateral pikeun panduan stereotaktik kanula stainless steel kana CM. Pasang semén dental di sakitar kanula sareng amankeun nganggo sekrup. Saatos photo-curing sareng pengerasan semén, tatu kulit ditutup ku jahitan supramid 4/0. Panempatan kanula anu leres dikonfirmasi ku bocor spontan cairan serebrospinal (CSF). Cabut beurit tina alat stereotaksik, tampi perawatan pasca operasi sareng manajemen nyeri anu pas, sareng antepkeun pikeun pulih sahenteuna saminggu dugi ka tanda-tanda getih katingali dina cairan serebrospinal. Tikus Wistar (Crl:WI/Han) diala ti Charles River (Perancis). Sadaya beurit dijaga dina kaayaan anu bébas patogén anu khusus. Sadaya ékspérimén sato parantos disatujuan ku Kantor Dokter Hewan Kota Basel, Swiss, sareng dilaksanakeun saluyu sareng Lisénsi Sato No. 2474 (Penilaian Transportasi Otak Aktif ku Ngukur Tingkat Calon Terapeutik dina Cairan Serebrospinal sareng Otak Tikus).
Jaga beurit tetep sadar kalayan kanula CM di leungeunna. Kaluarkeun Datura tina kanula teras kumpulkeun 10 µl cairan serebrospinal anu ngalir sacara spontan. Kusabab patensi kanula pamustunganana kaganggu, ngan ukur sampel cairan serebrospinal anu bening tanpa bukti kontaminasi getih atanapi perubahan warna anu dilebetkeun dina panilitian ieu. Sacara paralel, sakitar 10–20 μl getih dicandak tina sayatan leutik di tungtung buntut kana tabung anu nganggo heparin (Sigma-Aldrich). CSF sareng getih dikumpulkeun dina sababaraha titik waktos saatos suntikan intravena fag T7. Sakitar 5–10 μl cairan dipiceun sateuacan unggal sampel CSF dikumpulkeun, anu saluyu sareng volume katéter anu paéh.
Pustaka dihasilkeun nganggo véktor T7Select 10-3b sakumaha anu dijelaskeun dina manual sistem T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Sacara singget, sisipan DNA 12-mer acak disintésis dina format ieu:
Kodon NNK dianggo pikeun nyingkahan kodon eureun ganda sareng éksprési asam amino anu kaleuleuwihi dina sisipan. N nyaéta babandingan ékuimolar anu dicampur sacara manual tina unggal nukléotida, sareng K nyaéta babandingan ékuimolar anu dicampur sacara manual tina nukléotida adénin sareng sitosin. Daérah untaian tunggal dirobih janten DNA untaian ganda ku inkubasi salajengna sareng dNTP (Novagen) sareng énzim Klenow (New England Biolabs) dina buffer Klenow (New England Biolabs) salami 3 jam dina suhu 37°C. Saatos réaksi, DNA untaian ganda dipulihkeun ku présipitasi EtOH. DNA anu dihasilkeun dicerna ku énzim réstriksi EcoRI sareng HindIII (duanana ti Roche). Sisipan anu dibelah sareng dimurnikeun (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) teras diligasi dina pigura kana véktor T7 anu tos dibelah saatos asam amino 348 tina gén kapsid 10B. Réaksi ligasi diinkubasi dina suhu 16°C salami 18 jam sateuacan dibungkus in vitro. Bungkusan fag in vitro dilaksanakeun dumasar kana parentah anu disayogikeun sareng kit kloning T7Select 10-3b (Novagen) sareng larutan bungkusan diamplifikasi sakali pikeun lisis nganggo Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lisat disentrifugasi, dititrasi sareng dibekukeun dina suhu -80° C salaku larutan stok gliserol.
Amplifikasi PCR langsung tina daérah variabel fag anu diamplifikasi dina kaldu atanapi piring nganggo primer fusi 454/Roche-amplicon anu dipatenkeun. Primer fusi maju ngandung runtuyan anu ngapit daérah variabel (NNK) 12 (spésifik citakan), GS FLX Titanium Adapter A, sareng runtuyan konci perpustakaan opat-basa (TCAG) (Gambar Tambahan 1a):
Primer fusi terbalik ogé ngandung biotin anu napel kana manik-manik panangkep sareng GS FLX Titanium Adapter B anu diperyogikeun pikeun amplifikasi klonal salami PCR emulsi:
Amplikon-amplikon éta teras di-pyrosequencing 454/Roche numutkeun protokol Titanium 454 GS-FLX. Pikeun sekuensing Sanger manual (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNA fag T7 diamplifikasi ku PCR sareng di-sekuensing ku pasangan primer ieu:
Sisipan tina plak individu diamplifikasi ku PCR nganggo Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (numutkeun pitunjuk produsén). Laksanakeun hot start (10 menit dina 95 °C) sareng 35 siklus boost (50 detik dina 95 °C, 1 menit dina 50 °C, sareng 1 menit dina 72 °C).
Fag tina perpustakaan, fag tipe liar, fag anu disalametkeun tina CSF sareng getih, atanapi klon individu diamplifikasi dina Escherichia coli BL5615 dina kaldu TB (Sigma Aldrich) atanapi dina piring 500 cm2 (Thermo Scientific) salami 4 jam dina suhu 37°C. Fag diekstrak tina pelat ku cara ngumbah pelat nganggo buffer Tris-EDTA (Fluka Analytical) atanapi ku cara ngumpulkeun plak nganggo ujung pipet steril. Fag diisolasi tina supernatan kultur atanapi buffer ékstraksi nganggo hiji puteran présipitasi polietilen glikol (PEG 8000) (Promega) sareng disuspensikeun deui dina buffer Tris-EDTA.
Fag anu diamplifikasi diekstraksikeun kana 2-3 puteran panyabutan endotoksin nganggo manik-manik panyabutan endotoksin (Miltenyi Biotec) sateuacan injeksi intravena (IV) (500 μl/sato). Dina puteran kahiji, 2 × 1012 fag diwanohkeun; dina puteran kadua, 2 × 1010 fag; dina puteran seleksi katilu sareng kaopat, 2 × 109 fag per sato. Eusi fag dina sampel CSF sareng getih anu dikumpulkeun dina titik waktos anu dituduhkeun ditangtukeun ku cacah plak numutkeun pitunjuk produsén (manual sistem T7Select). Seleksi fag dilakukeun ku suntikan intravena tina perpustakaan anu dimurnikeun kana véna buntut atanapi ku suntikan ulang fag anu diekstrak tina CSF tina puteran seleksi sateuacana, sareng panén salajengna dilakukeun dina 10 menit, 30 menit, 60 menit, 90 menit, 120 menit, 180 menit, sareng 240 menit masing-masing sampel CSF sareng getih. Sajumlah opat puteran panning in vivo dilaksanakeun dimana dua cabang anu dipilih disimpen sacara misah sareng dianalisis salami tilu puteran seleksi munggaran. Sadaya sisipan fag anu diekstrak tina CSF tina dua puteran seleksi munggaran dikenakeun pirosekuensing 454/Roche, sedengkeun sadaya klon anu diekstrak tina CSF tina dua puteran seleksi terakhir diurutkeun sacara manual. Sadaya fag getih tina puteran seleksi munggaran ogé dikenakeun pirosekuensing 454/Roche. Pikeun injeksi klon fag, fag anu dipilih diamplifikasi dina E. coli (BL5615) dina pelat 500 cm2 dina suhu 37°C salami 4 jam. Klon anu dipilih sacara individual sareng diurutkeun sacara manual disebarkeun dina média TB. Saatos ékstraksi fag, purifikasi sareng panyabutan endotoksin (sakumaha anu dijelaskeun di luhur), 2 × 1010 fag/sato dina 300 μl disuntikkeun sacara intravena kana hiji véna buntut.
Pamrosésan awal sareng panyaringan kualitatif data runtuyan. Data atah 454/Roche dirobah tina format peta aliran standar binér (sff) kana format anu tiasa dibaca ku manusa Pearson (fasta) nganggo parangkat lunak vendor. Pamrosésan salajengna tina runtuyan nukléotida dilakukeun nganggo program sareng skrip C anu dipatenkeun (paket parangkat lunak anu teu acan dirilis) sapertos anu dijelaskeun di handap. Analisis data primér kalebet prosedur panyaringan multi-tahap anu ketat. Pikeun nyaring bacaan anu henteu ngandung runtuyan DNA sisipan 12mer anu valid, bacaan dijajarkeun sacara sekuensial pikeun labél awal (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), labél eureun (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) sareng sisipan latar (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGAC) nganggo tés Needleman-Wunsch global. alignment anu ngamungkinkeun dugi ka 2 inkonsistensi per alignment31. Ku alatan éta, bacaan tanpa tag awal sareng eureun sareng bacaan anu ngandung sisipan latar, nyaéta, alignment anu ngaleuwihan jumlah ketidakcocokan anu diidinan, dihapus tina perpustakaan. Sedengkeun pikeun bacaan anu sésana, runtuyan DNA N-mer anu manjang ti tanda awal sareng réngsé sateuacan tanda eureun dipiceun tina runtuyan bacaan aslina sareng diprosés salajengna (salajengna disebut "sisipan"). Saatos translasi sisipan, bagian saatos kodon eureun munggaran dina tungtung 5′ primer dipiceun tina sisipan. Salaku tambahan, nukléotida anu ngarah kana kodon anu teu lengkep dina tungtung 3′ primer ogé dipiceun. Pikeun ngaluarkeun sisipan anu ngan ukur ngandung runtuyan latar, sisipan anu ditarjamahkeun anu dimimitian ku pola asam amino "PAG" ogé dipiceun. Péptida kalayan panjang pasca-translasi kirang ti 3 asam amino dipiceun tina perpustakaan. Pamungkas, miceun redundansi dina kumpulan sisipan sareng nangtukeun frékuénsi unggal sisipan anu unik. Hasil analisis ieu kalebet daptar runtuyan nukléotida (sisipan) sareng frékuénsi (baca) na (Gambar Tambahan 1c sareng 2).
Sisipan DNA Grup N-mer dumasar kana kamiripan runtuyan: Pikeun ngaleungitkeun kasalahan sekuensing spésifik 454/Roche (sapertos masalah sareng éksténsi homopolimer sekuensing) sareng miceun redundansi anu kirang penting, sisipan runtuyan DNA N-mer anu disaring sateuacanna (sisipan) diurutkeun dumasar kana kamiripan. sisipan (dugi ka 2 basa anu henteu cocog diidinan) nganggo algoritma iteratif anu ditetepkeun sapertos kieu: sisipan diurutkeun heula dumasar kana frékuénsina (ti pangluhurna ka panghandapna), sareng upami sami, dumasar kana urutan sekundérna dumasar kana panjangna (ti pangpanjangna ka pangpondokna)). Ku kituna, sisipan anu paling sering sareng pangpanjangna ngahartikeun "grup" anu munggaran. Frékuénsi grup disetel ka frékuénsi konci. Teras, unggal sisipan anu sésana dina daptar anu diurutkeun dicobian ditambahkeun kana grup ku alignment Needleman-Wunsch sacara berpasangan. Upami jumlah ketidakcocokan, sisipan, atanapi ngahapus dina hiji alignment henteu ngaleuwihan ambang 2, hiji sisipan ditambahkeun kana grup, sareng frékuénsi grup sacara umum ningkat dumasar kana sabaraha sering sisipan ditambahkeun. Sisipan anu ditambahkeun kana grup ditandaan salaku dianggo sareng dikaluarkeun tina pamrosésan salajengna. Upami runtuyan sisipan teu tiasa ditambahkeun kana grup anu parantos aya, runtuyan sisipan dianggo pikeun nyiptakeun grup énggal kalayan frékuénsi sisipan anu pas sareng ditandaan salaku parantos dianggo. Iterasi réngsé nalika unggal runtuyan sisipan parantos dianggo pikeun ngabentuk grup énggal atanapi tiasa dilebetkeun kana grup anu parantos aya. Sabab, sisipan anu dikelompokkeun anu diwangun ku nukléotida pamustunganana ditarjamahkeun kana runtuyan péptida (perpustakaan péptida). Hasil tina analisis ieu nyaéta sakumpulan sisipan sareng frékuénsi anu saluyu anu ngawangun jumlah bacaan berturut-turut (Gambar Tambahan 2).
Generasi Motif: Dumasar kana daptar péptida unik, hiji perpustakaan dijieun anu ngandung sadaya pola asam amino (aa) anu mungkin sapertos anu dipidangkeun di handap. Unggal pola anu mungkin panjangna 3 diekstrak tina péptida sareng pola tibalikna ditambahkeun sareng perpustakaan motif umum anu ngandung sadaya pola (tripéptida). Perpustakaan motif anu sering diulang-ulang diurutkeun sareng redundansi dihapus. Teras, pikeun unggal tripéptida dina perpustakaan motif, urang mariksa ayana dina perpustakaan nganggo alat komputasi. Dina hal ieu, frékuénsi péptida anu ngandung tripéptida motif anu kapanggih ditambahkeun sareng ditugaskeun kana motif dina perpustakaan motif ("jumlah motif"). Hasil tina generasi motif nyaéta array dua diménsi anu ngandung sadaya kajadian tripéptida (motif) sareng nilai masing-masing, nyaéta jumlah bacaan sekuensing anu ngahasilkeun motif anu saluyu nalika bacaan disaring, dikelompokkeun, sareng ditarjamahkeun. Métrik sapertos anu dijelaskeun sacara rinci di luhur.
Normalisasi jumlah motif sareng scatterplot anu saluyu: Jumlah motif pikeun unggal sampel dinormalisasi nganggo
dimana ni nyaéta jumlah bacaan anu ngandung topik i. Ku kituna, vi ngagambarkeun persentase frékuénsi bacaan (atanapi péptida) anu ngandung motif i dina sampel. Nilai-P pikeun jumlah motif anu teu dinormalisasi diitung nganggo uji pasti Fisher. Ngeunaan korélogram jumlah motif, korélasi Spearman diitung nganggo jumlah motif anu dinormalisasi nganggo R.
Pikeun ngabayangkeun eusi asam amino dina unggal posisi dina perpustakaan péptida, logogram wéb 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) dijieun. Mimitina, eusi asam amino dina unggal posisi péptida 12-mer disimpen dina matriks 20 × 12. Teras, sakumpulan 1000 péptida anu ngandung eusi asam amino relatif anu sami dina unggal posisi dihasilkeun dina format runtuyan-fasta sareng disayogikeun salaku input kana logo-wéb 3, anu ngahasilkeun répréséntasi grafis tina eusi asam amino relatif dina unggal posisi. pikeun perpustakaan péptida anu dipasihkeun. Pikeun ngabayangkeun sét data multidiménsi, peta panas dijieun nganggo alat anu dikembangkeun sacara internal dina R (biosHeatmap, pakét R anu tacan dirilis). Déndrogram anu dipidangkeun dina peta panas diitung nganggo metode klaster hirarkis Ward kalayan métrik jarak Euclidean. Pikeun analisis statistik data skor motif, nilai P pikeun skor anu teu dinormalisasi diitung nganggo uji pasti Fisher. Nilai-P pikeun sét data anu sanés diitung dina R nganggo uji-t Student atanapi ANOVA.
Klon fag sareng fag anu dipilih tanpa sisipan disuntik sacara intravena ngalangkungan véna buntut (2 × 1010 fag/sato dina 300 μl PBS). Sapuluh menit sateuacan perfusi sareng fiksasi salajengna, sato anu sami disuntik sacara intravena ku 100 μl lektin anu dilabélan DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 menit saatos injeksi fag, beurit diperfusi ngalangkungan jantung ku 50 ml PBS dituturkeun ku 50 ml 4% PFA/PBS. Sampel otak salajengna difiksasi sapeuting dina 4% PFA/PBS sareng direndem dina 30% sukrosa sapeuting dina suhu 4°C. Sampel dibekukeun gancang dina campuran OCT. Analisis imunohistokimia tina sampel beku dilakukeun dina suhu kamar dina krioseksi 30 µm anu diblokir ku 1% BSA sareng diinkubasi ku antibodi poliklonal anu dilabélan FITC ngalawan fag T7 (Novus NB 600-376A) dina suhu 4 °C. Inkubasi sapeuting. Pamungkas, bagian-bagian éta dikumbah 3 kali ku PBS sareng dipariksa ku mikroskop laser confocal (Leica TCS SP5).
Sadaya péptida kalayan kamurnian minimum 98% disintésis ku GenScript USA, dibiotinilasi sareng diliofilisasi. Biotin dihijikeun ngalangkungan spacer triple glicin tambahan di N-terminus. Pariksa sadaya péptida nganggo spéktrométri massa.
Streptavidin (Sigma S0677) dicampur sareng kaleuwihan 5 kali lipat equimolar tina péptida biotinilasi, péptida inhibisi BACE1 biotinilasi, atanapi kombinasi (rasio 3:1) tina péptida inhibisi BACE1 biotinilasi sareng péptida inhibisi BACE1 dina 5–10% DMSO/diinkubasi dina PBS. 1 jam dina suhu kamar sateuacan injeksi. Péptida konjugasi streptavidin disuntikkeun sacara intravena dina dosis 10 mg/kg kana salah sahiji urat buntut beurit anu gaduh rongga otak.
Konsentrasi kompleks streptavidin-péptida ditaksir ku ELISA. Pelat mikrotiter Nunc Maxisorp (Sigma) dilapis sapeuting dina suhu 4°C ku antibodi anti-streptavidin beurit 1,5 μg/ml (Thermo, MA1-20011). Saatos diblokir (buffer blocking: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatin, 1% BSA) dina suhu kamar salami 2 jam, kumbah pelat ku 0,05% Tween-20/PBS (buffer cuci) salami 3 Detik, sampel CSF sareng plasma ditambahkeun kana sumur anu diéncérkeun ku buffer blocking (plasma 1:10.000, CSF 1:115). Pelat teras diinkubasi sapeuting dina suhu 4°C ku antibodi deteksi (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Saatos tilu léngkah ngumbah, streptavidin dideteksi ku cara inkubasi dina larutan substrat TMB (Roche) salami 20 menit. Saatos ngeureunkeun kamekaran warna nganggo 1M H2SO4, ukur absorbansi dina 450 nm.
Fungsi kompleks inhibitor streptavidin-peptide-BACE1 dipeunteun ku Aβ(1-40) ELISA numutkeun protokol produsén (Wako, 294-64701). Sacara singget, sampel CSF diéncérkeun dina pangencerna standar (1:23) sareng diinkubasi sapeuting dina suhu 4°C dina pelat 96-sumur anu dilapis ku antibodi panangkep BNT77. Saatos lima léngkah ngumbah, antibodi BA27 anu dikonjugasi HRP ditambahkeun sareng diinkubasi salami 2 jam dina suhu 4°C, dituturkeun ku lima léngkah ngumbah. Aβ(1–40) dideteksi ku inkubasi dina larutan TMB salami 30 menit dina suhu kamar. Saatos kamekaran warna dieureunkeun ku larutan eureun, ukur absorbansi dina 450 nm. Sampel plasma diékstraksi fase padet sateuacan Aβ(1–40) ELISA. Plasma ditambahkeun kana 0,2% DEA (Sigma) dina pelat 96-sumur sareng diinkubasi dina suhu kamar salami 30 menit. Saatos ngumbah pelat SPE (Oasis, 186000679) sacara berturut-turut nganggo cai sareng 100% metanol, sampel plasma ditambahkeun kana pelat SPE sareng sadaya cairan dipiceun. Sampel dikumbah (mimiti nganggo 5% metanol teras 30% metanol) sareng diélusi nganggo 2% NH4OH/90% metanol. Saatos ngagaringkeun eluat dina suhu 55°C salami 99 menit dina arus N2 konstan, sampel diréduksi dina pangencerkeun standar sareng Aβ(1–40) diukur sapertos anu dijelaskeun di luhur.
Kumaha nyutat artikel ieu: Urich, E. et al. Pangiriman kargo ka uteuk nganggo péptida transit anu diidéntifikasi in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB sareng Moos T. Pangiriman ubar makromolekul ka uteuk nganggo terapi anu ditargetkeun. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., sareng Martinez-Martinez, P. Pangiriman ubar péptida sareng protéin ngaliwatan panghalang getih-otak. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Panghalang getih-otak: halangan dina pamekaran ubar otak. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, sareng Byrd, A. Prospek pikeun ningkatkeun pangiriman ubar sareng targeting ka uteuk ngalangkungan jalur pleksus koroid-CSF. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisasi biofarmasi nganggo kuda Trojan molekuler pikeun pangiriman otak. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, transportasi péptida anu dimediasi ku reséptor WM ngaliwatan panghalang getih-otak. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Ningkatkeun penetrasi uteuk sareng khasiat antibodi terapi nganggo shuttle molekular monovalen. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transportasi reséptor transferrin (TfR) nangtukeun serapan otak tina varian afinitas antibodi TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).