Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Anjeun nganggo versi browser kalayan dukungan CSS kawates.Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer).Sajaba ti éta, pikeun mastikeun rojongan lumangsung, urang némbongkeun situs tanpa gaya na JavaScript.
Nampilkeun carousel tilu slide sakaligus.Pake tombol Saméméhna jeung Salajengna pikeun mindahkeun ngaliwatan tilu slides dina hiji waktu, atawa make tombol geseran di ahir pikeun mindahkeun ngaliwatan tilu slides dina hiji waktu.
Panghalang getih-otak sareng panghalang getih-otak nyegah agén bioterapeutik ngahontal targetna dina sistem saraf pusat, ku kituna ngahalangan pangobatan anu épéktip pikeun kasakit saraf.Pikeun mendakan pengangkut otak novél dina vivo, kami ngenalkeun perpustakaan péptida phage T7 sareng ngumpulkeun getih sareng cairan cerebrospinal (CSF) sacara séri nganggo modél kolam renang ageung beurit.Klon phage spésifik diperkaya pisan dina CSF saatos opat babak pilihan.Nguji péptida calon individu ngungkabkeun langkung ti 1000 kali pengayaan dina CSF.Bioaktivitas pangiriman péptida-dimédiasi ka otak dikonfirmasi ku pangurangan 40% dina tingkat amyloid-β dina cairan cerebrospinal ngagunakeun inhibitor péptida BACE1 numbu ka péptida transit novél anu diidentifikasi.Hasil ieu nunjukkeun yén péptida anu diidentipikasi ku metode pamilihan in vivo phage tiasa janten wahana anu mangpaat pikeun pangiriman sistemik makromolekul ka otak anu gaduh pangaruh terapi.
Sistem saraf pusat (SSP) panalungtikan terapi sasaran geus sakitu legana fokus kana identifying ubar dioptimalkeun jeung agén nu némbongkeun sipat CNS-targeting, kalawan kirang usaha dina manggihan mékanisme nu ngajalankeun pangiriman ubar aktif kana uteuk.Ieu mimiti robih ayeuna kusabab pangiriman ubar, khususna molekul ageung, mangrupikeun bagian integral tina pamekaran ubar neurosains modern.Lingkungan sistim saraf pusat ogé ditangtayungan ku sistem panghalang cerebrovaskular, diwangun ku panghalang getih-otak (BBB) ​​​​jeung panghalang getih-otak (BCBB)1, sahingga nangtang pikeun ngirim obat ka otak1,2.Diperkirakeun yén ampir kabéh ubar molekul badag sarta leuwih ti 98% ubar molekul leutik dileungitkeun tina otak3.Éta pisan sababna naha éta pohara penting pikeun ngaidentipikasi sistem angkutan otak anyar nu nyadiakeun pangiriman efisien sarta husus ubar terapi ka SSP 4,5.Nanging, BBB sareng BCSFB ogé nampilkeun kasempetan anu saé pikeun pangiriman narkoba nalika aranjeunna nembus sareng asup kana sadaya struktur otak ngalangkungan vasculature anu éksténsif.Ku kituna, usaha ayeuna ngagunakeun métode non-invasif pangiriman ka otak anu sakitu legana dumasar kana mékanisme angkutan reséptor-dimédiasi (PMT) ngagunakeun reséptor BBB6 endogenous.Sanajan kamajuan konci panganyarna ngagunakeun jalur reséptor transferrin7,8, ngembangkeun salajengna sistem pangiriman anyar kalawan sipat ningkat diperlukeun.Pikeun tujuan ieu, tujuan kami nyaéta pikeun ngaidentipikasi péptida anu tiasa nyéépkeun transportasi CSF, sabab prinsipna tiasa dianggo pikeun nganteurkeun makromolekul ka SSP atanapi pikeun muka jalur reséptor énggal.Khususna, reséptor sareng transporter khusus tina sistem cerebrovaskular (BBB sareng BSCFB) tiasa janten target poténsial pikeun pangiriman aktif sareng spésifik obat biotherapeutic.Cairan cerebrospinal (CSF) nyaéta produk sékrési plexus choroid (CS) sareng aya dina kontak langsung sareng cairan interstitial otak ngaliwatan rohangan subarachnoid sareng rohangan ventricular4.Nu anyar geus ditémbongkeun yén cairan cerebrospinal subarachnoid diffuses kaleuleuwihan kana interstitium otak9.Kami ngarepkeun ngaksés rohangan parenkim nganggo saluran aliran subarachnoid ieu atanapi langsung ngalangkungan BBB.Pikeun ngahontal ieu, kami ngalaksanakeun strategi pamilihan vivo phage anu kuat anu idéal pikeun ngaidentipikasi péptida anu diangkut ku salah sahiji tina dua jalur anu béda ieu.
Kami ayeuna ngajelaskeun metode saringan tampilan vivo phage anu berurutan sareng sampling CSF gandeng sareng sekuen throughput tinggi (HTS) pikeun ngawas babak pamilihan awal kalayan keragaman perpustakaan anu paling luhur.Screening dipigawé dina beurit sadar kalawan cannula cisterna badag (CM) dipelak permanén pikeun nyegah kontaminasi getih.Anu penting, pendekatan ieu milih dua targeting otak sareng péptida kalayan kagiatan transportasi ngalangkungan halangan cerebrovaskular.Kami nganggo fag T7 kusabab ukuranana leutik (~ 60 nm) 10 sareng nyarankeun yén aranjeunna cocog pikeun transportasi vesikel anu ngamungkinkeun nyebrang transcellular tina halangan endothelial sareng / atanapi épitél-medulla.Saatos opat babak panning, populasi phage diasingkeun nunjukkeun kuat dina vivo CSF ​​​​pengayaan sareng asosiasi microvessel cerebral.Anu penting, urang tiasa ngonfirmasi panemuan urang ku nunjukkeun yén péptida calon pangsaéna anu dipikaresep sareng disintésis sacara kimia tiasa ngangkut kargo protéin kana cairan cerebrospinal.Mimiti, épék farmakodinamik SSP didamel ku ngagabungkeun péptida transit anu unggul sareng inhibitor péptida BACE1.Salian nunjukkeun yén strategi saringan fungsional dina vivo tiasa ngaidentipikasi péptida angkutan otak novel salaku operator kargo protéin anu épéktip, kami ngarepkeun pendekatan pilihan fungsional anu sami ogé janten penting dina ngaidentipikasi jalur angkutan otak novel.
Dumasar unit ngabentuk piagam (PFU), sanggeus hambalan bungkusan phage, perpustakaan acak 12-mer linier T7 phage péptida kalawan diversity kira 109 dirancang jeung dijieun (tingali Bahan jeung Métode).Penting pikeun dicatet yén kami sacara saksama nganalisa perpustakaan ieu sateuacan panning vivo.Gedekeun PCR sampel perpustakaan phage ngagunakeun primers dirobah dihasilkeun amplicons anu langsung lumaku pikeun HTS (Suplemén Gbr. 1a).Alatan a) HTS11 sequencing kasalahan, b) dampak dina kualitas primers (NNK) 1-12, jeung c) ayana liar-tipe (wt) phage (sisipan rorongkong) dina perpustakaan sayaga, prosedur nyaring runtuyan dilaksanakeun pikeun nimba informasi runtuyan ngan diverifikasi (Suplemén Gbr. 1b).Léngkah-léngkah saringan ieu dilarapkeun ka sadaya perpustakaan sekuen HTS.Pikeun perpustakaan standar, jumlahna aya 233,868 bacaan anu dicandak, dimana 39% lulus kriteria saringan sareng dianggo pikeun analisa perpustakaan sareng seleksi pikeun babak salajengna (Suplemén Gambar 1c-e).Nu dibacana utamana lilipetan tina 3 pasangan basa panjangna kalawan puncak dina 36 nukléotida (Suplemén Gbr. 1c), confirming desain perpustakaan (NNK) 1-12.Utamana, kira-kira 11% tina anggota perpustakaan ngandung 12-diménsi wild-type (wt) sisipan PAGISRELVDKL tulang tonggong, sarta ampir satengah tina runtuyan (49%) ngandung insertions atawa ngahapus.HTS perpustakaan perpustakaan dikonfirmasi diversity tinggi péptida di perpustakaan: leuwih ti 81% tina urutan péptida kapanggih ngan sakali sarta ngan 1.5% lumangsung dina ≥4 salinan (Suplemén Gbr. 2a).Frékuénsi asam amino (aa) dina sakabéh 12 posisi dina repertoire correlated ogé kalawan frékuénsi ékspéktasi pikeun jumlah kodon dihasilkeun ku repertoire NKK degenerate (Suplemén Gbr. 2b).Frékuénsi observasi résidu aa disandikeun ku inserts ieu correlated ogé kalawan frékuénsi diitung (r = 0.893) (Suplemén Gbr. 2c).Nyiapkeun perpustakaan phage pikeun suntikan kalebet léngkah-léngkah amplifikasi sareng ngaleungitkeun éndotoksin.Ieu saméméhna geus ditémbongkeun ka berpotensi ngurangan diversity perpustakaan phage12,13.Ku alatan éta, urang sequenced perpustakaan phage plat-amplified nu geus undergone panyabutan endotoxin tur dibandingkeun jeung perpustakaan aslina keur estimasi frékuénsi AA.A korelasi kuat (r = 0.995) ieu observasi antara kolam renang aslina jeung kolam renang amplified na dimurnikeun (Suplemén Gbr. 2d), nunjukkeun yén kompetisi antara clones amplified dina pelat maké T7 phage teu ngabalukarkeun bias utama.Perbandingan ieu dumasar kana frékuénsi motif tripeptida dina unggal perpustakaan, sabab keragaman perpustakaan (~109) teu bisa direbut sapinuhna sanajan kalawan HTS.Analisis frékuénsi aa dina unggal posisi ngungkabkeun bias gumantung posisi leutik dina tilu posisi terakhir tina repertoire anu diasupkeun (Suplemén Gbr. 2e).Dina kacindekan, urang menyimpulkan yén kualitas sarta diversity perpustakaan éta bisa ditarima tur ngan parobahan minor dina diversity anu katalungtik alatan Gedekeun sarta persiapan perpustakaan phage antara sababaraha rounds seleksi.
Serial sampling cairan cerebrospinal bisa dipigawé ku surgically implanting cannula kana CM beurit sadar pikeun mempermudah idéntifikasi T7 phage nyuntik intravenously (iv) via BBB jeung / atawa BCSFB (Gbr. 1a-b).Urang dipaké dua leungeun pilihan bebas (leungeun A jeung B) dina tilu rounds mimiti seleksi in vivo (Gbr. 1c).Urang laun-laun ningkatkeun stringency seleksi ku cara ngurangan jumlah total phage diwanohkeun dina tilu rounds mimiti seleksi.Pikeun babak kaopat panning, urang ngagabungkeun sampel tina cabang A jeung B sarta dipigawé tilu pilihan bebas tambahan.Pikeun diajar sipat in vivo tina partikel phage T7 dina modél ieu, fage tipe liar (PAGISRELVDKL master insert) disuntik kana beurit ngaliwatan urat buntut.Pamulihan fag tina cairan cerebrospinal sareng getih dina titik waktos anu béda nunjukkeun yén fag icosahedral T7 anu kawilang leutik ngagaduhan fase bersihan awal anu gancang tina kompartemen getih (Gambar Tambahan 3).Dumasar titer anu dikaluarkeun sareng volume getih beurit, urang ngitung yén ngan ukur 1% beurat.phage tina dosis anu dikaluarkeun dideteksi dina getih 10 menit saatos suntikan intravena.Sanggeus turunna gancang awal ieu, clearance primér laun diukur kalawan satengah-umur 27,7 menit.Anu penting, ngan ukur sababaraha phages anu dicandak tina kompartemen CSF, nunjukkeun latar tukang anu handap pikeun migrasi phage tipe liar kana kompartemen CSF (Suplemén Gbr. 3).Rata-rata, ngan ngeunaan 1 x 10-3% titer of T7 phage dina getih jeung 4 x 10-8% tina mimitina infused phages dideteksi dina cairan cerebrospinal dina sakabéh periode sampling (0-250 mnt).Utamana, satengah hirup (25.7 mnt) tina tipe liar phage dina cairan cerebrospinal éta sarupa jeung nu observasi dina getih.Data ieu nunjukkeun yén panghalang anu misahkeun kompartemen CSF tina getih gembleng dina beurit CM-cannulated, ngamungkinkeun pilihan vivo perpustakaan phage pikeun ngaidentipikasi klon anu gampang diangkut tina getih kana kompartemen CSF.
(a) Nyetél métode pikeun ulang sampling cairan cerebrospinal (CSF) ti kolam renang badag.(b) Diagram anu nunjukkeun lokasi sélulér penghalang sistem saraf pusat (CNS) sareng strategi pamilihan anu dianggo pikeun ngaidentipikasi péptida anu nyebrang halangan getih-otak (BBB) ​​sareng halangan getih-otak.(c) In vivo phage tampilan screening flowchart.Dina unggal babak seleksi, phages (identifiers sato di jero panah) disuntik intravena.Dua cabang alternatif bebas (A, B) diteundeun misah nepi ka babak 4 seleksi.Pikeun babak pamilihan 3 sareng 4, unggal klon phage sasari tina CSF diurutkeun sacara manual.(d) Kinétika phage diisolasi tina getih (bunderan beureum) jeung cairan cerebrospinal (segitiga héjo) salila babak kahiji seleksi dina dua beurit cannulated sanggeus suntik intravena perpustakaan péptida T7 (2 x 1012 phages / sato).Kuadrat biru nunjukkeun konsentrasi awal rata-rata phage dina getih, diitung tina jumlah phage anu disuntik, kalayan ngitung volume getih total.Kuadrat hideung nunjukkeun titik simpang garis y anu diekstrapolasi tina konsentrasi fag getih.(e,f) Nepikeun frékuénsi rélatif jeung distribusi sakabéh kamungkinan tumpang tindih motif tripeptida kapanggih dina péptida.Jumlah motif kapanggih dina 1000 bacaan ditémbongkeun.Nyata (p < 0,001) motif anu dieuyeuban dicirian ku titik-titik beureum.(e) Korelasi scatterplot ngabandingkeun frékuénsi relatif motif tripeptida perpustakaan nyuntik jeung phage getih-turunan tina sato # 1.1 jeung # 1.2.(f) Korelasi scatterplot ngabandingkeun frékuénsi relatif motif tripeptida fag sato # 1.1 jeung # 1.2 diisolasi dina getih jeung cairan cerebrospinal.(g, h) Répréséntasi ID runtuyan phage enriched dina getih (g) versus nyuntik perpustakaan jeung phage enriched di CSF (h) versus getih sanggeus hiji babak pilihan in vivo dina duanana sato.Ukuran kode hiji-hurup nunjukkeun sabaraha sering asam amino lumangsung dina posisi éta.Héjo = polar, wungu = netral, biru = basa, beureum = asam jeung hideung = asam amino hidrofobik.Gambar 1a, b dirarancang sareng diproduksi ku Eduard Urich.
Kami nyuntik perpustakaan péptida phage kana dua beurit instrumen CM (clades A sareng B) sareng phage terasing tina cairan cerebrospinal sareng getih (Gambar 1d).Clearance gancang awal perpustakaan ieu kirang dibaca dibandingkeun jeung tipe liar phage.Rata-rata satengah umur perpustakaan anu disuntik dina duanana sato nyaéta 24.8 menit dina getih, mirip sareng phage tipe liar, sareng 38.5 menit dina CSF.Sampel phage getih sareng cairan cerebrospinal tina unggal sato dikenakeun kana HTS sareng sadaya péptida anu diidentifikasi dianalisis pikeun ayana motif tripeptida pondok.Motif tripeptida dipilih sabab nyadiakeun dasar minimal pikeun formasi struktur jeung interaksi péptida-protéin14,15.Urang kapanggih korelasi alus dina sebaran motif antara perpustakaan phage nyuntik jeung clones sasari tina getih duanana sato (Gbr. 1e).Data nunjukkeun yén komposisi perpustakaan ngan saeutik enriched dina kompartemen getih.Frékuénsi asam amino sareng urutan konsensus dianalisis satuluyna dina unggal posisi nganggo adaptasi parangkat lunak Weblogo16.Narikna, urang kapanggih hiji pengayaan kuat dina résidu glisin getih (Gbr. 1g).Nalika getih dibandingkeun sareng klon anu dipilih tina CSF, seleksi anu kuat sareng sababaraha motif ngaleungit (Gbr. 1f), sareng asam amino anu tangtu langkung milih aya dina posisi anu parantos ditangtukeun dina anggota 12 (Gbr. 1h).Utamana, sato individu béda sacara signifikan dina cairan cerebrospinal, sedengkeun pengayaan glisin getih dititénan dina duanana sato (Suplemén Gbr. 4a-j).Saatos nyaring stringent data runtuyan dina cairan cerebrospinal sato # 1.1 jeung # 1.2, jumlahna aya 964 na 420 unik 12-mer péptida diala (Suplemén Gbr. 1d-e).Klon phage anu terasing diamplifikasi sareng dipasihan babak kadua seleksi in vivo.Phage sasari ti babak kadua seleksi anu subjected kana HTS dina unggal sato jeung sakabéh péptida dicirikeun dipaké salaku input ka program pangakuan motif pikeun nganalisis lumangsungna motif tripeptida (Gbr. 2a, b, ef).Dibandingkeun jeung siklus mimiti phage pulih tina CSF, urang observasi Pilihan salajengna jeung deselection loba motif di CSF dina cabang A jeung B (Gbr. 2).Algoritma idéntifikasi jaringan diterapkeun pikeun nangtukeun naha éta ngagambarkeun pola anu béda tina sekuen konsisten.A kasaruaan jelas ieu observasi antara runtuyan 12-dimensi pulih ku CSF dina clade alternatif A (Gbr. 2c, d) jeung clade B (Gbr. 2g, h).Analisis pooled dina unggal cabang ngungkabkeun propil pilihan béda pikeun péptida 12-mer (Suplemén Gbr. 5c, d) jeung paningkatan dina CSF / rasio titer getih kana waktu pikeun clones pooled sanggeus babak kadua seleksi dibandingkeun babak kahiji seleksi (Suplemén Gbr. 5e).).
Pengayaan motif sareng péptida dina cairan cerebrospinal ku dua babak berturut-turut pilihan tampilan fag fungsional in vivo.
Kabéh fag cairan cerebrospinal pulih tina babak kahiji unggal sato (sato # 1.1 jeung # 1.2) ieu pooled, amplified, HT-sequenced na reinjected babarengan (2 x 1010 phages / sato) 2 SM cannulated beurit (# 1.1 → #).2.1 jeung 2.2, 1.2 → 2.3 jeung 2.4).(a, b, e, f) Korélasi scatterplots ngabandingkeun frékuénsi relatif motif tripeptida sadaya fag turunan CSF dina babak pilihan kahiji jeung kadua.Frékuénsi relatif jeung distribusi motif ngalambangkeun sakabéh mungkin tumpang tindihna tripéptida kapanggih dina péptida dina duanana orientasi.Jumlah motif kapanggih dina 1000 bacaan ditémbongkeun.Motif anu sacara signifikan (p < 0.001) dipilih atanapi dikaluarkeun dina salah sahiji perpustakaan anu dibandingkeun disorot ku titik-titik beureum.(c, d, g, h) Répréséntasi logo runtuyan sadaya CSF-euyeub 12 asam amino runtuyan panjang dumasar kana rounds 2 jeung 1 tina pilihan vivo.Ukuran kode hiji-hurup nunjukkeun sabaraha sering asam amino lumangsung dina posisi éta.Pikeun ngagambarkeun logo, frékuénsi runtuyan CSF sasari tina sato individu antara dua rounds pilihan dibandingkeun jeung runtuyan enriched dina babak kadua ditémbongkeun: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 jeung (h) #1.2–#2.4.Asam amino anu paling diperkaya dina posisi anu ditangtukeun dina (c, d) sato no.2.1 jeung No.2.2 atawa (g, h) dina sato No.2.3 jeung No.2.4 ditémbongkeun dina warna.Héjo = polar, wungu = netral, biru = basa, beureum = asam jeung hideung = asam amino hidrofobik.
Saatos babak katilu pamilihan, kami ngaidentipikasi 124 sekuen péptida unik (# 3.1 sareng # 3.2) tina 332 klon phage CSF-reconstituted diisolasi tina dua sato (Suplemén Gbr. 6a).Sekuen LGSVS (18,7%) miboga proporsi relatif pangluhurna, dituturkeun ku liar-tipe inserts PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%), sarta SARGSWREIVSLS (2,2%).Dina babak kaopat final, kami pooled dua cabang dipilih bebas tina tilu sato misah (Gbr. 1c).Tina 925 clones phage sequenced pulih tina CSF, dina babak kaopat kami mendakan 64 sekuen péptida unik (Suplemén Gbr. 6b), diantarana proporsi relatif fag tipe liar turun ka 0,8%.Klon CSF anu paling umum dina babak kaopat nyaéta LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) sareng RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Kisaran panjang péptida nu dipilih téh alatan insertions nukléotida / hapusan atawa kodon eureun prématur dina primers perpustakaan lamun ngagunakeun kodon degenerate pikeun desain perpustakaan NNK.Kodon eureun prématur ngahasilkeun péptida anu leuwih pondok tur dipilih sabab ngandung motif aa anu nguntungkeun.Péptida nu leuwih panjang bisa jadi hasil tina sisipan/penghapusan dina primer perpustakaan sintétik.Ieu posisi kodon eureun dirancang luar pigura jeung maca eta nepi ka kodon eureun anyar mucunghul hilir.Sacara umum, urang ngitung faktor pengayaan pikeun sakabéh opat rounds Pilihan ku ngabandingkeun data input jeung data kaluaran sampel.Pikeun saringan babak kahiji, kami nganggo titer phage tipe liar salaku rujukan latar non-spésifik.Narikna, seleksi phage négatip éta pohara kuat dina siklus CSF munggaran, tapi teu dina getih (Gbr. 3a), nu bisa jadi alatan probability low difusi pasip lolobana anggota perpustakaan péptida kana kompartemen CSF atawa phages relatif condong jadi leuwih éfisién dipikagaduh atawa dikaluarkeun tina aliran getih ti bacteriophages.Sanajan kitu, dina babak kadua panning, Pilihan kuat phages dina CSF dititénan dina duanana clades, suggesting yén babak saméméhna ieu enriched di phages mintonkeun péptida nu ngamajukeun uptake CSF (Gbr. 3a).Sakali deui, tanpa pengayaan getih anu signifikan.Ogé dina babak katilu sareng kaopat, klon phage sacara signifikan diperkaya dina CSF.Ngabandingkeun frékuénsi rélatif unggal runtuyan péptida unik antara dua rounds panungtungan seleksi, kami manggihan yén runtuyan éta malah leuwih enriched dina babak kaopat seleksi (Gbr. 3b).Jumlahna aya 931 motif tripéptida sasari tina sakabéh 64 runtuyan péptida unik ngagunakeun duanana orientasi péptida.Motif paling enriched dina babak kaopat anu leuwih raket nalungtik pikeun profil pengayaan maranéhanana sakuliah sakabéh rounds dibandingkeun perpustakaan nyuntik (cut-off: 10% pengayaan) (Suplemén Gbr. 6c).Pola umum seléksi nunjukkeun yén kalolobaan motif anu ditalungtik diperkaya dina sadaya babak sateuacana tina dua cabang pilihan.Sanajan kitu, sababaraha motif (misalna SGL, VSG, LGS GSV) utamana tina alternatif clade A, sedengkeun nu sejenna (misalna FGW, RTN, WGF, NTR) anu enriched dina alternatif clade B.
Validasi angkutan CSF tina péptida phage-diperkaya CSF jeung péptida pamimpin biotinilated conjugated kana payloads streptavidin.
(a) Babandingan pengayaan diitung dina sakabéh opat rounds (R1-R4) dumasar kana nyuntik (input = I) phage (PFU) titers jeung ditangtukeun titers phage CSF (output = O).Faktor pengayaan pikeun tilu rounds panungtungan (R2-R4) diitung ku ngabandingkeun jeung babak saméméhna jeung babak kahiji (R1) kalawan data beurat.Bar kabuka nyaéta cairan cerebrospinal, bar shaded nyaéta plasma.(***p<0,001, dumasar kana tés-t Siswa).(b) Daptar péptida fag paling loba pisan, rengking nurutkeun proporsi relatif maranéhna pikeun sakabéh fag dikumpulkeun dina CSF sanggeus babak 4 seleksi.Genep klon phage paling umum disorot dina warna, wilanganana sareng faktor pengayaanna antara babak 3 sareng 4 pilihan (inset).(c, d) Genep klon phage anu paling diperkaya, phage kosong sareng perpustakaan péptida phage parental ti babak 4 dianalisis masing-masing dina modél sampling CSF.CSF sareng sampel getih dikumpulkeun dina titik waktos anu dituduhkeun.(c) Jumlah sarua 6 klon fag calon (2 x 1010 fag / sato), fag kosong (# 1779) (2 x 1010 fag / sato) jeung stock phage pustaka péptida (2 x 1012 phages / sato) Nyuntik sahenteuna 3 CM via kaléng sato nu misah.Farmakokinetik CSF unggal klon phage anu disuntik sareng perpustakaan péptida phage dina waktosna dipidangkeun.(d) nunjukkeun rata-rata rasio CSF ​​/ getih pikeun sadaya fag / ml anu pulih dina waktos sampling.(e) Opat péptida pamimpin sintétik sareng hiji kontrol scrambled dikaitkeun sareng biotin ka streptavidin ngaliwatan N-terminus (tampilan tetramer) dituturkeun ku suntikan (urat urat iv, 10 mg streptavidin / kg).Sahenteuna tilu beurit intubated (N = 3).).Sampel CSF dikumpulkeun dina titik waktos anu dituduhkeun sareng konsentrasi streptavidin diukur ku CSF anti-streptavidin ELISA (nd = henteu kadeteksi).(* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, dumasar kana tés ANOVA).(f) Babandingan runtuyan asam amino tina klon péptida fag paling enriched #2002 (ungu) jeung klon péptida fag séjén dipilih ti babak 4 seleksi.fragmen asam amino idéntik jeung sarupa anu disandi warna.
Tina sakabéh fag enriched dina babak kaopat (Gbr. 3b), genep clones calon dipilih pikeun analisis individu salajengna dina model sampling CSF.Jumlah sarua genep calon phage, phage kosong (euweuh sisipan) jeung perpustakaan péptida prophage anu nyuntik kana tilu sato CM cannulated, sarta pharmacokinetics ditangtukeun dina CSF (Gbr. 3c) jeung getih (Suplemén Gbr. 7) assays.Sadaya klon phage anu diuji nargétkeun kompartemen CSF dina tingkat 10-1000 kali langkung luhur tibatan phage kontrol kosong (# 1779).Salaku conto, klon #2020 sareng #2077 ngagaduhan titer CSF 1000 kali langkung luhur tibatan kontrol phage.Profil farmakokinetik unggal péptida anu dipilih béda-béda, tapi sadayana gaduh kamampuan homing CSF anu luhur.Urang observasi panurunan konstan kana waktu pikeun clones #1903 jeung #2011, sedengkeun pikeun clones #2077, #2002 jeung #2009 paningkatan salila 10 menit kahiji bisa nunjukkeun angkutan aktif tapi perlu diverifikasi.Klon #2020, #2002, sareng #2077 stabil dina tingkat anu luhur, sedengkeun konsentrasi CSF klon #2009 lalaunan turun saatos paningkatan awal.Urang lajeng ngabandingkeun frékuénsi relatif unggal calon CSF kalawan konsentrasi getih na (Gbr. 3d).Korélasi tina mean titer unggal calon CSF kalawan titer getih na di sadaya waktu sampling némbongkeun yén tilu ti genep calon anu nyata enriched dina CSF getih.Narikna, klon #2077 nunjukkeun stabilitas getih anu langkung luhur (Gambar Tambahan 7).Pikeun mastikeun yén péptida sorangan sanggup aktip ngangkut kargo lian ti partikel fag kana kompartemen CSF, urang disintésis opat pamimpin péptida turunan jeung biotin dina N-terminus dimana péptida ngagantelkeun kana partikel fag.Péptida biotinilated (nos. 2002, 2009, 2020, jeung 2077) dikonjugasi jeung streptavidin (SA) pikeun ménta bentuk multimérik anu rada mimicking géométri phage.Format ieu ogé ngamungkinkeun urang pikeun ngukur paparan SA dina getih sareng cairan cerebrospinal salaku péptida protéin anu ngangkut kargo.Importantly, data phage mindeng bisa dihasilkeun nalika péptida sintétik anu dikaluarkeun dina format SA-conjugated ieu (Gbr. 3e).Péptida anu diacak ngagaduhan paparan awal anu kirang sareng bersihan CSF langkung gancang kalayan tingkat anu teu kadeteksi dina 48 jam.Pikeun meunangkeun wawasan ngeunaan jalur pangiriman klon phage péptida ieu kana rohangan CSF, urang nganalisis lokalisasi phage péptida hits individu ngagunakeun immunohistochemistry (IHC) pikeun langsung ngadeteksi partikel phage 1 jam saatos suntikan intravena di vivo.Utamana, klon #2002, #2077, sareng #2009 tiasa dideteksi ku ngawarnaan kuat dina kapiler otak, sedengkeun kontrol phage (#1779) sareng klon #2020 henteu dideteksi (Suplemén Gambar 8).Ieu nunjukkeun yén péptida ieu nyumbang kana pangaruh kana otak persis ku nyebrang BBB.Analisis anu langkung rinci diperyogikeun pikeun nguji hipotésis ieu, sabab jalur BSCFB ogé tiasa kalibet.Lamun ngabandingkeun runtuyan asam amino tina clone paling enriched (# 2002) kalawan péptida dipilih séjén, ieu dicatet yén sababaraha di antarana boga ekstensi asam amino sarupa, nu bisa nunjukkeun mékanisme angkutan sarupa (Gbr. 3f).
Alatan profil plasma unik sarta kanaékan signifikan dina CSF kana waktu, clone tampilan phage #2077 ieu salajengna digali leuwih periode 48-jam deui sarta éta bisa baranahan kanaékan gancang dina CSF observasi dina pergaulan jeung tingkat SA sustained (Gbr. 4a).Ngeunaan klon phage anu dicirikeun, #2077 diwarnaan kuat pikeun kapilér otak sareng nunjukkeun kolokalisasi anu signifikan sareng lektin spidol kapiler nalika ditingali dina résolusi anu langkung luhur sareng kamungkinan sababaraha ngawarnaan dina rohangan parenchymal (Gambar 4b).Pikeun nalungtik naha épék farmakologis anu dimédiasi péptida tiasa didapet dina SSP, urang ngalaksanakeun ékspérimén dimana versi biotinilasi tina i) péptida transit #2077 sareng ii) péptida inhibitor BACE1 dicampur sareng SA dina dua babandingan anu béda.Pikeun hiji kombinasi kami ngan ukur nganggo inhibitor péptida BACE1 sareng anu sanésna kami nganggo rasio 1: 3 tina inhibitor péptida BACE1 sareng #2077 péptida.Duanana sampel dikaluarkeun sacara intravena sareng tingkat getih sareng cairan cerebrospinal péptida beta-amyloid 40 (Abeta40) diukur kana waktosna.Abeta40 diukur dina CSF sabab ngagambarkeun inhibisi BACE1 dina parenchyma otak.Saperti nu diharapkeun, duanana kompléx nyata ngurangan tingkat getih Abeta40 (Gbr. 4c, d).Tapi, ngan sampel anu ngandung campuran péptida No.2077 sarta inhibitor tina péptida BACE1 conjugated ka SA ngabalukarkeun panurunan signifikan dina Abeta40 dina cairan cerebrospinal (Gbr. 4c).Data nunjukkeun yén péptida No.2077 tiasa ngangkut protéin 60 kDa SA kana SSP sareng ogé nyababkeun épék farmakologis sareng sambetan SA-conjugated péptida BACE1.
(a) suntik klonal (2 × 10 phages / sato) tina T7 phage némbongkeun propil pharmacokinetic jangka panjang péptida CSF #2077 (RLSSVDSDLLSGC) jeung kontrol phage uninjected (#1779) dina sahanteuna tilu beurit CM-intubated.(b) Gambar mikroskopis confocal of wawakil microvessels cortical dina beurit phage-nyuntik (2 × 10 10 phages / sato) némbongkeun counterstaining péptida #2077 jeung pembuluh (lectin).Klon phage ieu dikaluarkeun ka 3 beurit sareng diidinan ngiderkeun salami 1 jam sateuacan perfusi.Otak dipotong sareng diwarnaan ku antibodi anu dilabélan FITC polyclonal ngalawan kapsid phage T7.Sapuluh menit sateuacan perfusi sareng fiksasi salajengna, lektin anu dilabélan DyLight594 dikaluarkeun sacara intravena.Gambar fluoresensi nunjukkeun pewarnaan lektin (beureum) sisi luminal microvessels sareng fag (héjo) dina lumen kapilér sareng jaringan otak perivaskular.Bar skala pakait sareng 10 µm.(c, d) Biotinylated BACE1 inhibitory péptida nyalira atanapi dina kombinasi kalayan biotinilated transit péptida #2077 ieu gandeng ka streptavidin dituturkeun ku suntikan intravena sahenteuna tilu cannulated CM beurit (10 mg streptavidin / kg).Ngurangan BACE1 péptida inhibitor-dimédiasi dina Aβ40 diukur ku Aβ1-40 ELISA dina getih (beureum) jeung cairan cerebrospinal (oranyeu) dina titik waktu nu dituduhkeun.Pikeun kajelasan hadé, garis dotted digambar dina grafik dina skala 100%.(c) Pangurangan perséntase dina Aβ40 dina getih (segitiga beureum) sareng cairan cerebrospinal (segitiga jeruk) dina beurit anu dirawat ku streptavidin konjugasi kana péptida transit #2077 sareng péptida ngahambat BACE1 dina rasio 3: 1.(d) Pangurangan perséntase dina getih Aβ40 (bunderan beureum) sareng cairan cerebrospinal (lingkaran oranyeu) beurit anu dirawat ku streptavidin gandeng sareng péptida inhibitor BACE1 wungkul.Konsentrasi Aβ dina kontrol éta 420 pg / ml (standar deviasi = 101 pg / ml).
Tampilan Phage parantos suksés diterapkeun dina sababaraha daérah panalungtikan biomédis17.Metoda ieu geus dipaké pikeun in vivo vascular diversity studies18,19 ogé studi targeting vessels cerebral20,21,22,23,24,25,26.Dina ulikan ieu, urang ngalegaan aplikasi tina metoda Pilihan ieu teu ukur keur idéntifikasi langsung tina péptida targeting pembuluh cerebral, tapi ogé kapanggihna calon mibanda sipat angkutan aktif meuntas halangan getih-otak.Urang ayeuna ngajelaskeun ngembangkeun prosedur pamilihan in vivo dina beurit intubated CM sareng nunjukkeun poténsina pikeun ngaidentipikasi péptida sareng sipat homing CSF.Ngagunakeun T7 phage mintonkeun perpustakaan 12-mer péptida acak, kami bisa demonstrate yén T7 phage cukup leutik (kira-kira 60 nm diaméterna) 10 bisa diadaptasi kana panghalang getih-otak, kukituna langsung nyebrang halangan getih-otak atawa plexus choroid.Kami niténan yén panén CSF tina beurit CM cannulated mangrupikeun padika saringan fungsional dina vivo, sareng yén phage anu diekstrak henteu ngan ukur kabeungkeut kana vasculature tapi ogé fungsina salaku transporter peuntas halangan getih-otak.Salajengna, ku cara ngumpulkeun getih sakaligus sareng nerapkeun HTS kana CSF sareng fag turunan getih, kami negeskeun yén pilihan CSF kami henteu dipangaruhan ku pengayaan getih atanapi kabugaran pikeun ékspansi antara babak pilihan.Sanajan kitu, kompartemen getih mangrupa bagian tina prosedur seleksi, saprak fag sanggup ngahontal kompartemen CSF kudu salamet tur ngiderkeun dina aliran getih cukup lila pikeun enrich diri dina uteuk.Dina raraga nimba informasi runtuyan dipercaya tina data HTS atah, urang nerapkeun saringan diadaptasi kana kasalahan sequencing platform-spésifik dina workflow analisis.Ku ngalebetkeun parameter kinétik kana metode saringan, kami mastikeun pharmacokinetics gancang tina fag T7 tipe liar (t½ ~ 28 mnt) dina getih24, 27, 28 sareng ogé nangtukeun satengah hirupna dina cairan cerebrospinal (t½ ~ 26 mnt) per menit).Sanaos propil farmakokinetik anu sami dina getih sareng CSF, ngan ukur 0.001% tina konsentrasi getih phage anu tiasa dideteksi dina CSF, nunjukkeun mobilitas latar tukang anu lemah tina fage T7 tipe liar ngalangkungan halangan getih-otak.Karya ieu nyorot pentingna seleksi babak kahiji nalika ngagunakeun strategi panning in vivo, khususna pikeun sistem phage anu gancang dibersihkeun tina sirkulasi, sabab sababaraha klon anu tiasa ngahontal kompartemen SSP.Ku kituna, dina babak kahiji, ngurangan diversity perpustakaan éta pisan badag, sabab ngan jumlah kawates clones ahirna dikumpulkeun dina model CSF ketat pisan ieu.Strategi panning in vivo ieu kalebet sababaraha léngkah pilihan sapertos akumulasi aktif dina kompartemen CSF, survival clone dina kompartemen getih, sareng gancang ngaleungitkeun klon phage T7 tina getih dina menit 10 munggaran (Gbr. 1d sareng Gambar Tambahan 4M).).Ku kituna, sanggeus babak kahiji, klon phage béda dicirikeun dina CSF, sanajan kolam renang awal sarua dipaké pikeun sato individu.Ieu nunjukkeun yén sababaraha léngkah pilihan anu ketat pikeun perpustakaan sumber anu jumlahna ageung anggota perpustakaan nyababkeun réduksi anu signifikan dina karagaman.Ku alatan éta, acara acak bakal jadi bagian integral tina prosés seleksi awal, greatly influencing hasilna.Eta kamungkinan yén loba clones di perpustakaan aslina miboga propensity pengayaan CSF pisan sarupa.Sanajan kitu, sanajan dina kaayaan ékspérimén sarua, hasil seleksi bisa jadi béda alatan jumlah leutik unggal clone tinangtu dina pool awal.
Motif anu diperkaya dina CSF béda sareng anu aya dina getih.Narikna, urang nyatet pergeseran kahiji nuju péptida-euyeub glisin dina getih sato individu.(Gbr. 1g, Gbr tambahan. 4e, 4f).Fag nu ngandung péptida glisin bisa jadi leuwih stabil sarta kurang kamungkinan kana dikaluarkeun tina sirkulasi.Sanajan kitu, péptida-euyeub glisin ieu teu kauninga dina sampel cairan cerebrospinal, suggesting yén perpustakaan curated ngaliwatan dua hambalan pilihan béda: hiji dina getih sarta séjén diwenangkeun pikeun ngumpulkeun dina cairan cerebrospinal.Klon-klon anu diperkaya CSF hasil tina pilihan babak kaopat parantos diuji sacara éksténsif.Ampir sadaya klon anu diuji sacara individu dikonfirmasi bakal diperkaya dina CSF dibandingkeun sareng phage kontrol kosong.Hiji péptida hit (#2077) ieu nalungtik di leuwih jéntré.Éta nunjukkeun satengah hirup plasma anu langkung panjang dibandingkeun sareng hits anu sanés (Gambar 3d sareng Gambar Tambahan 7), sareng anu pikaresepeun, péptida ieu ngandung sésa sistein dina terminal C.Ayeuna parantos nunjukkeun yén tambihan sistein kana péptida tiasa ningkatkeun sipat farmakokinetikna ku cara ngabeungkeut albumin 29.Ieu ayeuna kanyahoan pikeun péptida #2077 sarta merlukeun ulikan satuluyna.Sababaraha péptida nunjukkeun katergantungan valénsi dina pengayaan CSF (data henteu ditingalikeun), anu tiasa aya hubunganana sareng géométri permukaan anu ditampilkeun tina kapsid T7.Sistem T7 anu kami anggo nunjukkeun 5-15 salinan unggal péptida per partikel fag.IHC dipigawé dina calon klon fag kalungguhan nyuntik intravenously kana cortex cerebral beurit (Suplemén Gbr. 8).Data nunjukkeun yén sahenteuna tilu klon (No. 2002, No. 2009 sareng No. 2077) berinteraksi sareng BBB.Tetep ditetepkeun naha interaksi BBB ieu nyababkeun akumulasi CSF atanapi gerakan klon ieu langsung ka BCSFB.Anu penting, kami nunjukkeun yén péptida anu dipilih nahan kapasitas angkutan CSF nalika disintésis sareng kabeungkeut kana kargo protéin.Beungkeutan péptida biotinilasi N-terminal ka SA dasarna ngulang hasil anu dicandak ku klon fag masing-masing dina getih sareng cairan cerebrospinal (Gbr. 3e).Tungtungna, kami nunjukkeun yén kalungguhan péptida #2077 tiasa ngamajukeun tindakan otak tina inhibitor péptida biotinylated of BACE1 conjugated ka SA, ngabalukarkeun épék pharmacodynamic diucapkeun dina SSP ku nyata ngurangan tingkat Abeta40 di CSF (Gbr. 4).Kami henteu tiasa ngaidentipikasi homolog naon waé dina pangkalan data ku ngalaksanakeun panéangan homologi urutan péptida sadaya hits.Kadé dicatet yén ukuran perpustakaan T7 kira 109, bari ukuran perpustakaan teoritis pikeun 12-mers 4 x 1015. Kituna, urang ngan dipilih fraksi leutik spasi diversity tina perpustakaan péptida 12-mer, nu bisa hartosna yén péptida leuwih dioptimalkeun bisa diidentipikasi ku evaluating spasi tina runtuyan padeukeut ieu.Hypothetically, salah sahiji alesan naha urang teu manggihan homologs alam péptida ieu bisa jadi deselection salila évolusi pikeun nyegah asupna uncontrolled tina motif péptida tangtu kana uteuk.
Dihijikeun, hasil kami nyayogikeun dasar pikeun padamelan anu bakal datang pikeun ngaidentipikasi sareng ciri sistem transportasi halangan cerebrovascular in vivo sacara langkung rinci.Setélan dasar tina metoda ieu dumasar kana strategi seleksi fungsional anu henteu ngan ukur ngaidentipikasi klon anu gaduh sipat mengikat vaskular cerebral, tapi ogé kalebet léngkah kritis dimana klon anu suksés gaduh kagiatan intrinsik pikeun nyebrang halangan biologis dina vivo kana kompartemen SSP.nyaéta pikeun ngajelaskeun mékanisme transportasi péptida ieu sareng karesepna pikeun ngariung kana mikrovaskulatur khusus pikeun daérah otak.Ieu bisa ngakibatkeun kapanggihna jalur anyar pikeun angkutan BBB jeung reséptor.Kami ngarepkeun yén péptida anu diidéntifikasi tiasa langsung ngabeungkeut reséptor cerebrovaskular atanapi ka ligan sirkulasi anu diangkut ngaliwatan BBB atanapi BCSFB.Vektor péptida sareng kagiatan transportasi CSF anu kapanggih dina karya ieu bakal ditalungtik deui.Kami ayeuna nalungtik spésifisitas otak péptida ieu pikeun kamampuan pikeun meuntas BBB sareng / atanapi BCSFB.Péptida anyar ieu bakal jadi alat anu pohara berharga pikeun poténsi kapanggihna reséptor atawa jalur anyar jeung pikeun ngembangkeun platform kacida éfisiénna anyar pikeun pangiriman makromolekul, kayaning biologics, kana uteuk.
Cannulate cisterna ageung (CM) nganggo modifikasi tina metode anu dijelaskeun sateuacana.Beurit Wistar anu dibius (200-350 g) dipasang dina alat stereotaxic sareng incision median dilakukeun dina kulit sirah anu dicukur sareng disiapkeun sacara aseptik pikeun ngalaan tangkorak.Bor dua liang di wewengkon sash luhur jeung nyepetkeun screws ngaropéa dina liang.Liang tambahan dibor dina crest occipital gurat pikeun pituduh stereotactic tina cannula stainless steel kana CM.Larapkeun semén dental sabudeureun cannula jeung aman ku screws.Sanggeus poto-curing sarta hardening semén, tatu kulit ditutupan ku jahitan supramid 4/0.panempatan ditangtoskeun tina kanula dikonfirmasi ku leakage spontan cairan cerebrospinal (CSF).Cabut beurit tina alat stereotaxic, nampi perawatan paska operasi sareng manajemén nyeri anu pas, sareng ngantepkeunana pulih sahenteuna sahenteuna saminggu dugi tanda-tanda getih ditingali dina cairan cerebrospinal.Beurit Wistar (Crl:WI/Han) dicandak ti Charles River (Perancis).Sadaya beurit dijaga dina kaayaan khusus anu bebas patogén.Sadaya percobaan sato disatujuan ku Kantor Pangajaran sarta Palatihan Atikan Kota Basel, Swiss, sarta dipigawé luyu jeung Lisensi Sato No. 2474 (Assessment of Active Brain Transport ku Ngukur Tingkat Calon Terapi dina Cairan Cerebrospinal jeung Brain of Rat).
Gently tetep beurit sadar jeung CM cannula dina leungeun.Cabut Datura tina kanula sareng kumpulkeun 10 µl cairan cerebrospinal anu ngalir sacara spontan.Kusabab patency of cannula ieu pamustunganana compromised, ngan sampel cairan cerebrospinal jelas kalawan euweuh bukti kontaminasi getih atawa discoloration anu kaasup dina ulikan ieu.Dina paralel, kurang leuwih 10-20 μl getih dicokot tina incision leutik di ujung buntut kana tabung jeung heparin (Sigma-Aldrich).CSF sareng getih dikumpulkeun dina sababaraha waktos saatos suntikan intravena T7 phage.Kira-kira 5-10 μl cairan dipiceun saméméh unggal sampel CSF dikumpulkeun, nu pakait jeung volume maot tina catheter nu.
Perpustakaan dihasilkeun ngagunakeun vektor T7Select 10-3b sakumaha ditétélakeun dina manual sistem T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Sakeudeung, sisipan DNA 12-mer acak disintésis dina format ieu:
Kodon NNK digunakeun pikeun ngahindarkeun kodon eureun ganda sareng éksprési asam amino dina sisipan.N nyaéta rasio equimolar dicampur sacara manual unggal nukléotida, jeung K nyaéta rasio equimolar dicampur sacara manual tina nukléotida adénin jeung sitosin.Wewengkon terdampar tunggal dirobah jadi DNA terdampar ganda ku inkubasi salajengna jeung dNTP (Novagen) jeung énzim Klenow (New England Biolabs) dina panyangga Klenow (New England Biolabs) salila 3 jam dina 37 ° C.Saatos réaksi, DNA untaian ganda pulih ku présipitasi EtOH.DNA anu dihasilkeun dicerna ku énzim pangwatesan EcoRI jeung HindIII (duanana ti Roche).The dibeulah jeung dimurnikeun (QIAquick, Qiagen) sisipan (T4 ligase, New England Biolabs) ieu lajeng ligated di-pigura jadi véktor T7 pre-dibeulah sanggeus asam amino 348 tina gén kapsid 10B.Réaksi ligasi diinkubasi dina 16 ° C salami 18 jam sateuacan bungkusan in vitro.Bungkusan Phage in vitro dipigawé nurutkeun parentah disadiakeun kalawan T7Select 10-3b kloning kit (Novagen) jeung solusi bungkusan ieu amplified sakali pikeun lisis ngagunakeun Escherichia coli (BLT5615, Novagen).The lysates anu centrifuged, titrated sarta beku dina -80 ° C. salaku solusi stock gliserol.
Amplifikasi PCR langsung wewengkon variabel fag diamplifikasi dina kaldu atawa piring ngagunakeun proprietary 454 / Roche-amplicon fusi primers.Primer fusi maju ngandung runtuyan diapit wewengkon variabel (NNK) 12 (témplat-spésifik), GS FLX Titanium Adapter A, sarta runtuyan konci perpustakaan opat-basa (TCAG) (Suplemén Gambar 1a):
Primer fusi balik ogé ngandung biotin napel nangkep manik jeung GS FLX Titanium Adapter B diperlukeun pikeun amplifikasi klonal salila emulsion PCR:
The amplicons lajeng subjected kana 454 / Roche pyrosequencing nurutkeun protokol 454 GS-FLX Titanium.Pikeun urutan Sanger manual (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNA fag T7 diamplifikasi ku PCR sareng diurutkeun ku pasangan primer ieu:
Inserts tina plak individu anu subjected kana amplifikasi PCR maké Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (nurutkeun parentah produsén urang).Laksanakeun mimiti panas (10 mnt dina 95 °C) sareng 35 siklus dorongan (50 s dina 95 °C, 1 mnt dina 50 °C, sareng 1 mnt dina 72 °C).
Phage ti perpustakaan, phage tipe liar, phage disalametkeun tina CSF sareng getih, atanapi klon individu diamplifikasi dina Escherichia coli BL5615 dina kaldu TB (Sigma Aldrich) atanapi dina piring 500 cm2 (Thermo Scientific) salami 4 jam dina 37 ° C.Phage diekstraksi tina pelat ku cara ngumbah piring nganggo panyangga Tris-EDTA (Fluka Analytical) atanapi ku cara ngumpulkeun plak sareng tip pipette steril.Fag diisolasi tina supernatan kultur atanapi panyangga ékstraksi kalayan hiji puteran présipitasi poliétilén glikol (PEG 8000) (Promega) sareng ditunda deui dina panyangga Tris-EDTA.
The amplified phage ieu subjected kana 2-3 rounds panyabutan endotoxin ngagunakeun manik panyabutan endotoxin (Miltenyi Biotec) saméméh suntikan intravena (IV) (500 μl / sato).Dina babak kahiji, 2 × 1012 phages diwanohkeun;dina kadua, 2 × 1010 phages;dina rounds Pilihan katilu jeung kaopat, 2 × 109 phages per sato.Eusi phage dina CSF sareng sampel getih anu dikumpulkeun dina titik waktos anu dituduhkeun ditangtukeun ku cacah plak dumasar kana petunjuk produsén (manual sistem T7Select).Pamilihan phage dilakukeun ku suntikan intravena perpustakaan anu dimurnikeun kana urat buntut atanapi ku suntikan deui phage anu sasari tina CSF tina babak seleksi saméméhna, sareng panén anu salajengna dilakukeun dina 10 mnt, 30 mnt, 60 mnt, 90 mnt, 120 mnt, 180 mnt, sareng 240 mnt sampel masing-masing.Jumlahna aya opat babak panning in vivo dilakukeun dimana dua cabang anu dipilih disimpen sacara misah sareng dianalisis salami tilu babak seleksi munggaran.Kabéh inserts phage sasari tina CSF ti dua rounds mimiti seleksi ieu subjected kana 454 / Roche pyrosequencing, bari sakabeh clones sasari tina CSF ti dua rounds panungtungan seleksi anu sacara manual sequenced.Kabéh fag getih ti babak kahiji seleksi ogé subjected kana 454 / Roche pyrosequencing.Pikeun suntikan klon fag, fag dipilih diamplifikasi dina E. coli (BL5615) dina piring 500 cm2 dina suhu 37 ° C salami 4 jam.Klon anu dipilih sacara individu sareng diurutkeun sacara manual disebarkeun dina medium TB.Saatos ékstraksi fag, purifikasi sareng ngaleungitkeun éndotoksin (sapertos ditétélakeun di luhur), 2 × 1010 fag / sato dina 300 μl disuntik sacara intravena kana hiji urat buntut.
Preprocessing jeung nyaring kualitatif data runtuyan.Data atah 454/Roche dirobih tina format peta stream standar binér (sff) ka format anu tiasa dibaca manusa Pearson (fasta) nganggo parangkat lunak ngajual.Ngolah salajengna tina runtuyan nukléotida dipigawé maké proprietary program C jeung skrip (unreleased software pakét) sakumaha ditétélakeun di handap.Analisis data primér ngawengku prosedur nyaring multi-tahap ketat.Pikeun nyaring kaluar maca nu teu ngandung 12mer sekuen DNA sisipan valid, éta dibaca sequentially Blok dimimitian labél (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), labél eureun (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) jeung sisipan tukang (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ngagunakeun global Needleman-Wunsch test.alignment ngamungkinkeun nepi ka 2 inconsistencies per alignment31.Ku alatan éta, maca tanpa ngamimitian jeung eureun tag jeung maca ngandung inserts tukang, ie, alignments nu ngaleuwihan jumlah diidinan mismatches, dikaluarkeun tina perpustakaan.Sedengkeun pikeun bacaan sésana, runtuyan DNA N-mer ngalegaan ti tanda mimiti na tungtung saméméh tanda eureun ieu excised tina urutan dibaca aslina tur salajengna diolah (hereinafter disebut "sisipan").Saatos tarjamahan sisipan, bagian saatos kodon eureun munggaran dina tungtung 5′ primer dipiceun tina sisipan.Sajaba ti éta, nukléotida ngarah kana kodon teu lengkep dina tungtung 3' tina primer ogé dihapus.Pikeun ngaluarkeun sisipan anu ngan ukur aya sekuen latar tukang, sisipan anu ditarjamahkeun dimimitian ku pola asam amino "PAG" ogé dipiceun.Péptida anu panjangna post-translasi kirang ti 3 asam amino dikaluarkeun tina perpustakaan.Tungtungna, miceun redundancy dina kolam renang sisipan jeung nangtukeun frékuénsi unggal sisipan unik.Hasil analisa ieu kalebet daptar sekuen nukléotida (sisipan) sareng frekuensi (baca)na (Gambar Tambahan 1c sareng 2).
Grup N-mer DNA inserts ku runtuyan kasaruaan: Pikeun ngaleungitkeun 454 / kasalahan sequencing Roche-spésifik (kayaning masalah sareng ekstensi homopolymer sequencing) jeung cabut redundancies kirang penting, saméméhna disaring N-mer DNA inserts runtuyan (inserts) diurutkeun dumasar kasaruaan.insertions (nepi ka 2 non-cocog basa diwenangkeun) ngagunakeun hiji algoritma iterative diartikeun kieu: insertions diurutkeun mimitina ku frékuénsi maranéhanana (pangluhurna ka panghandapna), sarta lamun aranjeunna sami, ku diurutkeun sekundér maranéhanana ku panjang (pangpanjangna ka shortest) ).Ku kituna, insertions pangseringna tur pangpanjangna nangtukeun kahiji "grup".Frékuénsi grup disetel ka frékuénsi konci.Lajeng, unggal sisipan sésana dina daptar diurutkeun ieu diusahakeun ditambahkeun kana grup ku pairwise Needleman-Wunsch alignment.Lamun jumlah nu teu cocog, sisipan, atawa ngahapus dina alignment teu ngaleuwihan ambang 2, sisipan ditambahkeun kana grup, sarta frékuénsi grup sakabéh ngaronjat ku sabaraha sering sisipan ditambahkeun.Inserts ditambahkeun kana grup ditandaan salaku dipaké tur kaasup ti processing salajengna.Lamun sekuen sisipan teu bisa ditambahkeun kana grup geus aya, sekuen sisipan dipaké pikeun nyieun grup anyar kalawan frékuénsi sisipan luyu tur ditandaan salaku dipaké.Iterasi réngsé nalika unggal sekuen sisipan parantos dianggo pikeun ngabentuk grup énggal atanapi tiasa kalebet kana grup anu parantos aya.Barina ogé, sisipan dikelompokeun nu diwangun ku nukléotida ahirna ditarjamahkeun kana runtuyan péptida (perpustakaan péptida).Hasil tina analisa ieu mangrupikeun sakumpulan sisipan sareng frékuénsi anu saluyu anu ngawangun jumlah bacaan anu padeukeut (Suplemén Gbr. 2).
Generasi Motif: Dumasar daptar péptida unik, perpustakaan dijieun ngandung sakabéh mungkin pola asam amino (aa) sakumaha ditémbongkeun di handap ieu.Unggal pola mungkin tina panjangna 3 ieu sasari tina péptida jeung pola tibalik na ditambahkeun babarengan jeung perpustakaan motif umum ngandung sakabéh pola (tripeptides).Perpustakaan tina motif anu repetitive pisan diurutkeun sareng redundansi dihapus.Teras, pikeun unggal tripeptida dina perpustakaan motif, urang pariksa ayana di perpustakaan nganggo alat komputasi.Dina hal ieu, frékuénsi péptida ngandung tripeptida motif kapanggih ditambahkeun jeung ditugaskeun ka motif dina perpustakaan motif ("Jumlah motif").Hasil generasi motif nyaéta susunan dua diménsi anu ngandung sakabéh kajadian tripéptida (motif) jeung nilaina masing-masing, nya éta jumlah runtuyan bacaan anu ngahasilkeun motif anu luyu nalika bacaan disaring, dikelompokeun, jeung ditarjamahkeun.Métrik sakumaha anu dijelaskeun sacara rinci di luhur.
Normalisasi jumlah motif jeung scatterplots pakait: Jumlah motif pikeun tiap sampel dinormalisasi ngagunakeun
dimana ni nyaéta jumlah bacaan anu ngandung topik i.Ku kituna, vi ngagambarkeun persentase frékuénsi bacaan (atawa péptida) ngandung motif i dina sampel.P-nilai pikeun jumlah non-dinormalisasi motif diitung ngagunakeun uji pasti Fisher.Ngeunaan correlograms tina jumlah motif, korelasi Spearman diitung nganggo jumlah motif anu dinormalisasi sareng R.
Pikeun ngabayangkeun eusi asam amino dina unggal posisi dina perpustakaan péptida, logogram wéb 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) dijieun.Kahiji, eusi asam amino dina unggal posisi péptida 12-mer disimpen dina matriks 20 × 12.Saterusna, susunan 1000 péptida ngandung eusi asam amino relatif sarua dina unggal posisi dihasilkeun dina format fasta-urutan jeung disadiakeun salaku input ka web-logo 3, nu dibangkitkeun ngagambarkeun grafis eusi asam amino relatif dina unggal posisi.pikeun perpustakaan péptida dibikeun.Pikeun visualize datasets multidimensional, peta panas dijieun maké alat dikembangkeun internal dina basa Sunda (biosHeatmap, pakét Sunda acan-to-be-dileupaskeun).The dendrograms dibere dina peta panas diitung ngagunakeun métode clustering hirarki Ward urang jeung métrik jarak Euclidean.Pikeun analisis statistik data skor motif, nilai P pikeun skor unnormalized diitung ngagunakeun uji pasti Fisher.P-nilai pikeun datasets séjén diitung dina basa Sunda ngagunakeun Student's t-test atanapi ANOVA.
Klon fag sareng fag anu dipilih tanpa sisipan disuntik sacara intravena ngalangkungan urat buntut (2 × 1010 fag / sato dina 300 μl PBS).Sapuluh menit sateuacan perfusi sareng fiksasi salajengna, sato anu sami disuntik sacara intravena sareng 100 μl lektin anu dilabélan DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 menit sanggeus suntik phage, beurit anu perfused ngaliwatan jantung kalawan 50 ml PBS dituturkeun ku 50 ml 4% PFA / PBS.Sampel otak ogé dibenerkeun sapeuting dina 4% PFA / PBS sareng direndam dina 30% sukrosa sapeuting dina 4 ° C.Sampel anu flash beku dina campuran Oct.Analisis imunohistokimia sampel beku dipigawé dina suhu kamar dina 30 µm cryosections diblokir ku 1% BSA sarta inkubasi ku polyclonal FITC-dilabélan antibodi ngalawan T7 phage (Novus NB 600-376A) dina 4 °C.Inkubasi sapeuting.Tungtungna, bagian anu dikumbah 3 kali kalawan PBS sarta nalungtik ku mikroskop laser confocal (Leica TCS SP5).
Sadaya péptida kalayan kamurnian minimum 98% disintésis ku GenScript USA, dibiotinilasi sareng diliofilisasi.Biotin dibeungkeut ku spacer triple glycine tambahan dina N-terminus.Pariksa sadaya péptida nganggo spéktrometri massa.
Streptavidin (Sigma S0677) dicampurkeun jeung kaleuwihan equimolar 5-melu péptida biotinilasi, péptida inhibitory BACE1 biotinilasi, atawa kombinasi (rasio 3: 1) péptida inhibitory BACE1 biotinilated jeung péptida inhibitory BACE1 dina 5-10% DMSO/incubated dina PBSO.1 jam dina suhu kamar sateuacan suntikan.Péptida konjugasi Streptavidin disuntik sacara intravena dina dosis 10 mg / kg kana salah sahiji urat buntut beurit anu ngagaduhan rongga cerebral.
Konsentrasi kompleks streptavidin-péptida ditaksir ku ELISA.Nunc Maxisorp microtiter piring (Sigma) anu coated sapeuting dina 4 ° C kalawan 1.5 μg / ml mouse anti-streptavidin antibodi (Thermo, MA1-20011).Saatos meungpeuk (blocking panyangga: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatin, 1% BSA) dina suhu kamar pikeun 2 jam, ngumbah piring jeung 0,05% Tween-20 / PBS (nyeuseuh panyangga) pikeun 3 Kadua, CSF na plasma buffer00 sampel ditambahkeun 0,050,000, 0,000. CSF 1:115).piring ieu lajeng inkubasi sapeuting di 4 ° C kalawan antibodi deteksi (1 μg / ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Saatos tilu léngkah cuci, streptavidin dideteksi ku inkubasi dina larutan substrat TMB (Roche) dugi ka 20 mnt.Saatos ngeureunkeun ngembangkeun warna sareng 1M H2SO4, ukur nyerep dina 450 nm.
Fungsi kompleks inhibitor streptavidin-péptida-BACE1 ditaksir ku Aβ(1-40) ELISA numutkeun protokol produsén (Wako, 294-64701).Sakeudeung, sampel CSF diluted dina diluent baku (1:23) jeung inkubasi sapeuting dina 4 ° C dina piring 96-sumur coated kalawan BNT77 capture antibodi.Saatos lima léngkah cuci, antibodi BA27 anu dikonjugasi HRP ditambah sareng diinkubasi salami 2 jam dina suhu 4 ° C, dituturkeun ku lima léngkah cuci.Aβ(1-40) dideteksi ku inkubasi dina larutan TMB salila 30 menit dina suhu kamar.Saatos ngembangkeun warna dieureunkeun ku solusi stop, ukur absorbance dina 450 nm.Sampel plasma ngalaman ékstraksi fase padet sateuacan Aβ (1-40) ELISA.Plasma ditambahkeun kana 0,2% DEA (Sigma) dina piring 96-sumur sarta diinkubasi dina suhu kamar salila 30 menit.Saatos berturut-turut ngumbah piring SPE (Oasis, 186000679) ku cai sareng 100% métanol, conto plasma ditambah kana piring SPE sareng sadaya cairan dipiceun.Sampel dikumbah (mimiti nganggo 5% métanol teras 30% métanol) sareng élusi sareng 2% NH4OH/90% métanol.Saatos drying eluate dina 55 ° C pikeun 99 mnt dina arus N2 konstan, sampel anu ngurangan di diluents baku sarta Aβ (1-40) ieu diukur sakumaha ditétélakeun di luhur.
Kumaha carana nyebatkeun artikel ieu: Urich, E. et al.Pangiriman kargo ka uteuk nganggo péptida transit anu diidentifikasi dina vivo.élmu.5, 14104;doi: 10.1038 / srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB jeung Moos T. Pangiriman ubar macromolecular kana uteuk ngagunakeun terapi sasaran.Journal of Neurochemistry 113, 1-13, 10.1111 / j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., sarta Martinez-Martinez, P. Pangiriman péptida jeung protéin ubar sakuliah panghalang getih-otak.Prog Neurobiol 87, 212-251, 10.1016 / j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM The halangan getih-otak: bottleneck dina ngembangkeun ubar otak.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, misalna, sarta Byrd, A. prospek pikeun ningkat pangiriman ubar na targeting kana uteuk via jalur choroid plexus-CSF.Panalungtikan Farmasi 22, 1011-1037, 10.1007 / s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisasi biofarmaseutikal sareng kuda Trojan molekular pikeun pangiriman otak.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021 / bc800148t (2008).
Pardridge, WM reséptor-dimédiasi angkutan péptida peuntas panghalang getih-otak.Endocr Wahyu 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Ningkatkeun penetrasi otak sareng efficacy antibodi terapeutik ngagunakeun shuttles molekular monovalent.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transpor reséptor Transferrin (TfR) nangtukeun uptake otak tina varian afinitas antibodi TfR.J Exp Med 211, 233-244, 10.1084 / jem.20131660 (2014).