תודה שביקרתם באתר Nature.com. אתם משתמשים בגרסת דפדפן עם תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בנוסף, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, אנו מציגים את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
מציג קרוסלה של שלוש שקופיות בו זמנית. השתמשו בכפתורים הקודם והבא כדי לעבור בין שלוש שקופיות בו זמנית, או השתמשו בכפתורי המחוון בסוף כדי לעבור בין שלוש שקופיות בו זמנית.
מחסום הדם-מוח ומחסום הדם-מוח מונעים מחומרים ביו-רפואיים להגיע למטרותיהם במערכת העצבים המרכזית, ובכך מעכבים טיפול יעיל במחלות נוירולוגיות. כדי לגלות מובילי מוח חדשים in vivo, הצגנו ספריית פפטידים של פאג' T7 ואספנו דם ונוזל שדרתי (CSF) באופן סדרתי באמצעות מודל מאגר גדול מודע בצינוריות של חולדות. שיבוטי פאג'ים ספציפיים הועשרו מאוד ב-CSF לאחר ארבעה סבבי סלקציה. בדיקה של פפטידים מועמדים בודדים גילתה העשרה של יותר מפי 1000 ב-CSF. הפעילות הביולוגית של המסירה בתיווך פפטידים למוח אושרה על ידי הפחתה של 40% ברמת העמילואיד-β בנוזל השדרתי באמצעות מעכב פפטיד BACE1 המקושר לפפטיד המעבר החדש שזוהה. תוצאות אלו מצביעות על כך שהפפטידים שזוהו על ידי שיטות סלקציה של פאג'ים in vivo עשויים להיות כלי רכב שימושיים להעברה שיטתית של מקרומולקולות למוח עם אפקט טיפולי.
מחקר טיפול ממוקד במערכת העצבים המרכזית (CNS) התמקד בעיקר בזיהוי תרופות וחומרים אופטימליים המפגינים תכונות המכוונות ל-CNS, עם פחות מאמץ בגילוי המנגנונים המניעים מתן תרופות פעיל למוח. מצב זה מתחיל להשתנות כעת, שכן מתן תרופות, במיוחד מולקולות גדולות, הוא חלק בלתי נפרד מפיתוח תרופות מודרניות במדעי המוח. סביבת מערכת העצבים המרכזית מוגנת היטב על ידי מערכת המחסום הצרברווסקולרי, המורכבת ממחסום הדם-מוח (BBB) ​​וממחסום הדם-מוח (BCBB)1, מה שהופך את מתן התרופות למוח למאתגר1,2. ההערכה היא שכמעט כל התרופות בעלות המולקולות הגדולות ויותר מ-98% מהתרופות בעלות המולקולות הקטנות מסולקות מהמוח3. זו הסיבה שחשוב מאוד לזהות מערכות הובלה חדשות במוח המספקות מתן יעיל וספציפי של תרופות טיפוליות ל-CNS4,5. עם זאת, ה-BBB וה-BCSFB מציגים גם הזדמנות מצוינת למתן תרופות, שכן הן חודרות לכל מבני המוח דרך כלי הדם הנרחבים שלו. לפיכך, המאמצים הנוכחיים להשתמש בשיטות לא פולשניות להובלה למוח מבוססים במידה רבה על מנגנון ההובלה בתיווך קולטנים (PMT) באמצעות קולטן BBB6 אנדוגני. למרות ההתקדמות המרכזית האחרונה באמצעות מסלול קולטן הטרנספרין7,8, נדרש פיתוח נוסף של מערכות הובלה חדשות בעלות תכונות משופרות. לשם כך, מטרתנו הייתה לזהות פפטידים המסוגלים לתווך הובלת נוזלים שדרתיים (CSF), שכן ניתן להשתמש בהם באופן עקרוני להעברת מקרומולקולות למערכת העצבים המרכזית או לפתיחת מסלולי קולטן חדשים. בפרט, קולטנים ומובילים ספציפיים של מערכת כלי הדם המוחית (BBB ו-BSCFB) יכולים לשמש כמטרות פוטנציאליות להובלה פעילה וספציפית של תרופות ביו-תרפויטיות. נוזל מוחי שדרתי (CSF) הוא תוצר הפרשה של מקלעת הכורואיד (CS) ונמצא במגע ישיר עם הנוזל הבין-רצפטיאלי של המוח דרך החלל התת-עכבישי וחלל החדר4. לאחרונה הוכח שנוזל מוחי שדרתי תת-עכבישי מתפזר יתר על המידה לתוך האינטרסטיציום של המוח9. אנו מקווים לגשת לחלל הפרנכימלי באמצעות מערכת הזרימה הסאבארכנואידית הזו או ישירות דרך ה-BBB. לשם כך, יישמנו אסטרטגיית בחירת פאג'ים in vivo חזקה שמזהה באופן אידיאלי פפטידים המועברים על ידי אחד משני המסלולים הנפרדים הללו.
כעת אנו מתארים שיטת סינון רציפה של תצוגת פאג'ים in vivo (in vivo) עם דגימת CSF בשילוב עם ריצוף תפוקה גבוהה (HTS) כדי לנטר סבבי סריקה ראשוניים עם גיוון הספריות הגבוה ביותר. הסינון בוצע על חולדות בהכרה עם קנולה גדולה של ציסטרנה (CM) מושתלת לצמיתות כדי למנוע זיהום דם. חשוב לציין, גישה זו בוחרת הן פאג'ים המכוונים למוח והן פפטידים בעלי פעילות הובלה על פני מחסום כלי הדם המוחיים. השתמשנו בפאג'ים מסוג T7 בשל גודלם הקטן (~60 ננומטר)10 והצענו שהם מתאימים להובלת שלפוחיות המאפשרות מעבר בין תאים של מחסום האנדותל ו/או האפיתל-מדולה. לאחר ארבעה סבבי סריקה, בודדו אוכלוסיות פאג'ים שהראו העשרה חזקה של CSF in vivo וקשר בין מיקרו-כלי דם מוחיים. חשוב לציין, הצלחנו לאשר את ממצאינו על ידי הדגמה שהפפטידים המועדפים והמסונתזים כימית מסוגלים להעביר מטען חלבונים לנוזל השדרה. ראשית, ההשפעות הפרמקודינמיות של מערכת העצבים המרכזית נקבעו על ידי שילוב של פפטיד מעבר מוביל עם מעכב של פפטיד BACE1. בנוסף להוכחה שאסטרטגיות סינון פונקציונליות in vivo יכולות לזהות פפטידים חדשים להעברת מוח כנושאי מטען חלבון יעילים, אנו צופים שגישות דומות לברירה פונקציונלית יהפכו לחשובות גם בזיהוי מסלולי תחבורה חדשים במוח.
בהתבסס על יחידות יוצרות פלאק (PFU), לאחר שלב אריזת הפאג'ים, תוכננה ונוצרה ספרייה של פפטידים אקראיים של פאג' T7 ליניאריים 12-מריים עם גיוון של כ-109 (ראה חומרים ושיטות). חשוב לציין שניתחנו בקפידה ספרייה זו לפני שינוי רצף in vivo. הגברת PCR של דגימות ספריית פאג'ים באמצעות פריימרים שעברו שינוי יצרה אמפליקונים שהיו ישימים ישירות ל-HTS (איור משלים 1א). עקב א) שגיאות ריצוף HTS11, ב) השפעה על איכות הפריימרים (NNK)1-12, ו-ג) נוכחות של פאג' מסוג בר (wt) (תוספות שלד) בספריית המתנה, יושם הליך סינון רצפים כדי לחלץ רק מידע רצף מאומת (איור משלים 1ב). שלבי סינון אלה חלים על כל ספריות ריצוף HTS. עבור הספרייה הסטנדרטית, התקבלו סך של 233,868 קריאות, מתוכן 39% עברו את קריטריוני הסינון ושימשו לניתוח ספריות ובחירה לסבבים הבאים (איור משלים 1ג-ה). הקריאות היו בעיקר כפולות של 3 זוגות בסיסים באורך עם שיא של 36 נוקלאוטידים (איור משלים 1c), מה שאישר את תכנון הספרייה (NNK) 1-12. ראוי לציין, שכ-11% מחברי הספרייה הכילו תוסף PAGISRELVDKL בעל עמוד שדרה 12-ממדי מסוג בר (wt), וכמעט מחצית מהרצפים (49%) הכילו הוספות או מחיקות. בדיקת ה-HTS של ספריית הספרייה אישרה את המגוון הגבוה של פפטידים בספרייה: יותר מ-81% מרצפי הפפטידים נמצאו פעם אחת בלבד ורק 1.5% התרחשו ב-4 עותקים ומעלה (איור משלים 2a). תדירות חומצות האמינו (aa) בכל 12 המיקומים ברפרטואר תאמה היטב את התדירות הצפויה עבור מספר הקודונים שנוצרו על ידי רפרטואר ה-NKK המנוון (איור משלים 2b). התדירות הנצפית של שאריות aa המקודדות על ידי הוספות אלו תאמה היטב את התדירות המחושבת (r = 0.893) (איור משלים 2c). הכנת ספריות פאג'ים להזרקה כוללת את שלבי ההגברה והסרה של אנדוטוקסין. בעבר הוכח כי הדבר עלול להפחית את הגיוון של ספריות פאג'ים12,13. לכן, ריצפנו ספריית פאג'ים שהוגברה בצלחת שעברה הסרת אנדוטוקסין והשווינו אותה לספרייה המקורית כדי להעריך את תדירות ה-AA. נצפתה קורלציה חזקה (r = 0.995) בין המאגר המקורי למאגר המוגבר והמטוהר (איור משלים 2d), דבר המצביע על כך שתחרות בין שיבוטים שהוגברו על פלטות באמצעות פאג' T7 לא גרמה להטיה משמעותית. השוואה זו מבוססת על תדירות המוטיבים הטריפפטידיים בכל ספרייה, מכיוון שלא ניתן ללכוד במלואו את גיוון הספריות (~109) אפילו עם HTS. ניתוח תדירות של aa בכל מיקום גילה הטיה קטנה תלוית מיקום בשלושת המיקומים האחרונים של הרפרטואר שהוזן (איור משלים 2e). לסיכום, הסקנו כי האיכות והגיוון של הספרייה היו מקובלים ורק שינויים קלים בגיוון נצפו עקב הגברה והכנה של ספריות פאג'ים בין מספר סבבי בחירה.
ניתן לבצע דגימה סדרתית של נוזל מוחי שדרתי על ידי השתלת קנולה כירורגית לתוך תאי הדם של חולדות בהכרה כדי להקל על זיהוי פאג' T7 שהוזרק לווריד (iv) דרך ה-BBB ו/או ה-BCSFB (איור 1א'-ב'). השתמשנו בשתי זרועות סלקציה בלתי תלויות (זרועות A ו-B) בשלושת הסבבים הראשונים של סלקציה in vivo (איור 1ג'). הגברנו בהדרגה את חומרת הסלקציה על ידי הפחתת הכמות הכוללת של פאג' שהוכנסה בשלושת סבבי הסלקציה הראשונים. עבור הסבב הרביעי של סריקה, שילבנו דגימות מענפים A ו-B וביצענו שלוש סלקציות בלתי תלויות נוספות. כדי לחקור את התכונות in vivo של חלקיקי פאג' T7 במודל זה, פאג' מסוג בר (PAGISRELVDKL master insert) הוזרק לחולדות דרך וריד הזנב. שחזור פאג'ים מנוזל מוחי שדרתי ומדם בנקודות זמן שונות הראה כי פאג'ים איקוסהדרליים קטנים יחסית של T7 הראו שלב ניקוי ראשוני מהיר מתא הדם (איור משלים 3). בהתבסס על רמות הטיטר שחולדו ונפח הדם של החולדות, חישבנו שרק כ-1% ממשקל הפאג' מהמינון שניתן זוהה בדם 10 דקות לאחר ההזרקה תוך ורידית. לאחר ירידה ראשונית מהירה זו, נמדדה סילוק ראשוני איטי יותר עם זמן מחצית חיים של 27.7 דקות. חשוב לציין, שרק מעט מאוד פאג'ים נלקחו מתא ה-CSF, דבר המצביע על רקע נמוך לנדידת פאג'ים מסוג בר לתא ה-CSF (איור משלים 3). בממוצע, רק כ-1 x 10-3% טיטר של פאג' T7 בדם ו-4 x 10-8% מהפאג'ים שהוזרקו בתחילה זוהו בנוזל השדרה לאורך כל תקופת הדגימה (0-250 דקות). ראוי לציין, שזמן מחצית החיים (25.7 דקות) של פאג' מסוג בר בנוזל השדרה היה דומה לזה שנצפה בדם. נתונים אלה מראים כי המחסום המפריד בין תא ה-CSF לדם תקין בחולדות שעברו קנולציה CM, מה שמאפשר בחירה in vivo של ספריות פאג'ים לזיהוי שיבוטים המועברים בקלות מהדם לתא ה-CSF.
(א) הקמת שיטה לדגימה חוזרת של נוזל מוחי שדרתי (CSF) ממאגר גדול. (ב) תרשים המציג את המיקום התאי של מחסום מערכת העצבים המרכזית (CNS) ואת אסטרטגיית הברירה המשמשת לזיהוי פפטידים החוצים את מחסום הדם-מוח (BBB) ​​ואת מחסום הדם-מוח. (ג) תרשים זרימה של סינון תצוגת פאג'ים in vivo. בכל סבב של ברירה, פאג'ים (מזהי בעלי חיים בתוך החצים) הוזרקו לווריד. שני ענפים חלופיים עצמאיים (A, B) נשמרים בנפרד עד לסבב הרביעי של הברירה. עבור סבבי ברירה 3 ו-4, כל שיבוט פאג' שחולץ מ-CSF רוצף ידנית. (ד) קינטיקה של פאג' שבודד מדם (עיגולים אדומים) ומנוזל מוחי שדרתי (משולשים ירוקים) במהלך סבב הברירה הראשון בשתי חולדות עם קנולציה לאחר הזרקה לווריד של ספריית הפפטידים T7 (2 x 1012 פאג'ים/בעל חיים). ריבועים כחולים מציינים את הריכוז ההתחלתי הממוצע של פאג' בדם, המחושב מכמות הפאג' המוזרק, תוך התחשבות בנפח הדם הכולל. הריבועים השחורים מציינים את נקודת החיתוך של קו ה-y כפי שנלקח מריכוזי פאג'ים בדם. (e,f) מציגים את התדירות היחסית וההתפלגות של כל המוטיבים הטריפפטידיים החופפים האפשריים שנמצאו בפפטיד. מוצג מספר המוטיבים שנמצאו ב-1000 קריאות. באופן מובהק (p < 0.001) מסומנים מוטיבים מועשרים בנקודות אדומות. (e) תרשים פיזור קורלציה המשווה את התדירות היחסית של מוטיב הטריפפטיד של הספרייה המוזרקת עם פאג' שמקורו בדם מבעלי חיים #1.1 ו-#1.2. (f) תרשים פיזור קורלציה המשווה את התדירות היחסית של מוטיבים טריפפטידיים של פאג'ים מן החי #1.1 ו-#1.2 שבודדו בדם ובנוזל מוחי שדרתי. (g, h) ייצוג מזהה רצף של פאג' מועשר בדם (g) לעומת ספריות שהוזרקו ופאג' מועשר ב-CSF (h) לעומת דם לאחר סבב של ברירה in vivo בשתי בעלי החיים. גודל הקוד בן האות האחת מציין באיזו תדירות חומצת האמינו מופיעה במיקום זה. ירוק = קוטבי, סגול = ניטרלי, כחול = בסיסי, אדום = חומצי ושחור = חומצות אמינו הידרופוביות. איור 1א', 1ב' תוכנן ויוצר על ידי אדוארד אוריך.
הזרקנו ספריית פפטידים של פאג'ים לשתי חולדות CM Instrument (קליידים A ו-B) ובודדנו פאג' מנוזל מוחי שדרתי ודם (איור 1ד). הסילוק המהיר הראשוני של הספרייה היה פחות בולט בהשוואה לפאג' מהסוג הבר. זמן מחצית החיים הממוצע של הספרייה שהוזרקה בשתי החיות היה 24.8 דקות בדם, בדומה לפאג' מהסוג הבר, ו-38.5 דקות ב-CSF. דגימות פאג' מדם ונוזל מוחי שדרתי מכל חיה עברו HTS וכל הפפטידים שזוהו נותחו לנוכחות מוטיב טריפפטיד קצר. מוטיבים טריפפטידיים נבחרו מכיוון שהם מספקים בסיס מינימלי להיווצרות מבנה ולאינטראקציות פפטיד-חלבון14,15. מצאנו מתאם טוב בהתפלגות המוטיבים בין ספריית הפאג'ים שהוזרקה לבין שיבוטים שחולצו מדמם של שתי החיות (איור 1ה). הנתונים מצביעים על כך שהרכב הספרייה מועשר רק באופן שולי בתא הדם. תדירות חומצות אמינו ורצפי קונצנזוס נותחו עוד בכל מיקום באמצעות עיבוד של תוכנת Weblogo16. מעניין לציין, מצאנו העשרה חזקה בשאריות גליצין בדם (איור 1g). כאשר דם הושווה לשבטים שנבחרו מ-CSF, נצפתה סלקציה חזקה וחלק מהסלקציה של מוטיבים (איור 1f), וחומצות אמינו מסוימות היו נוכחות באופן מועדף במיקומים קבועים מראש בקבוצת 12 החברים (איור 1h). ראוי לציין, כי בעלי חיים בודדים היו שונים באופן משמעותי בנוזל השדרה, בעוד שנצפה העשרה בגליצין בדם בשתי בעלי החיים (איור משלים 4a-j). לאחר סינון קפדני של נתוני הרצף בנוזל השדרה של בעלי חיים #1.1 ו-#1.2, התקבלו סך של 964 ו-420 פפטידים ייחודיים בעלי 12 מר (איור משלים 1d-e). שיבוטי הפאג' המבודדים הוגברו ועברו סבב שני של סלקציה in vivo. פאג'ים שחולצו מהסבב השני של הסלקציה עברו HTS בכל בעל חיים וכל הפפטידים שזוהו שימשו כקלט לתוכנית זיהוי מוטיבים לניתוח הופעת מוטיבים טריפפטידיים (איור 2a, b, ef). בהשוואה למחזור הראשון של הפאג' שהוחזר מ-CSF, צפינו בברירה וביטול-ברירה נוספות של מוטיבים רבים ב-CSF בענפים A ו-B (איור 2). אלגוריתם זיהוי רשת יושם כדי לקבוע אם הם מייצגים דפוסים שונים של רצף עקבי. נצפתה דמיון ברור בין הרצפים ה-12-ממדיים שהוחזרו על ידי CSF בקלייד A חלופי (איור 2c, d) וקלייד B (איור 2g, h). הניתוח המאוחד בכל ענף גילה פרופילי ברירה שונים עבור פפטידים 12-מר (איור משלים 5c,d) ועלייה ביחס טיטר CSF/דם לאורך זמן עבור שיבוטים מאוחדים לאחר סבב הברירה השני בהשוואה לסבב הברירה הראשון (איור משלים 5e).
העשרת מוטיבים ופפטידים בנוזל השדרה על ידי שני סבבים עוקבים של בחירת תצוגת פאג'ים פונקציונלית in vivo.
כל הפאג'ים מנוזל השדרה שהוחזרו מהסיבוב הראשון של כל בעל חיים (בעלי חיים #1.1 ו-#1.2) אוחדו, הוגברו, עברו ריצוף HT והוזרקו מחדש יחד (2 x 1010 פאג'ים/בעל חיים) 2 חולדות עם קנולציה של SM (#1.1 → #). 2.1 ו-2.2, 1.2 → 2.3 ו-2.4). (א,ב,ה,ו) תרשימי פיזור קורלציה המשווים את התדירות היחסית של מוטיבים טריפפטידיים של כל הפאג'ים שמקורם ב-CSF בסבבי הבחירה הראשון והשני. תדירות יחסית והתפלגות של מוטיבים המייצגים את כל הטריפפטידים החופפים האפשריים שנמצאו בפפטידים בשני האוריינטציות. מוצג מספר המוטיבים שנמצאו ב-1000 קריאות. מוטיבים שנבחרו או נשללו באופן משמעותי (p < 0.001) באחת הספריות המושוות מסומנים בנקודות אדומות. (c, d, g, h) ייצוג לוגו רצף של כל הרצפים העשירים ב-CSF בני 12 חומצות אמינו, בהתבסס על סבבים 2 ו-1 של ברירה in vivo. גודל הקוד בן האות האחת מציין באיזו תדירות חומצת האמינו מופיעה במיקום זה. כדי לייצג את הלוגו, מושווה תדירות רצפי ה-CSF שחולצו מבעלי חיים בודדים בין שני סבבי ברירה, והרצפים המועשרים בסיבוב השני מוצגים: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ו-(h) #1.2–#2.4. חומצות האמינו המועשרות ביותר במיקום נתון ב-(c, d) בעלי חיים מס' 2.1 ו-2.2 או (g, h) בבעלי חיים מס' 2.3 ו-2.4 מוצגות בצבע. ירוק = פולארי, סגול = ניטרלי, כחול = בסיסי, אדום = חומצי ושחור = חומצות אמינו הידרופוביות.
לאחר סבב הסלקציה השלישי, זיהינו 124 רצפי פפטידים ייחודיים (#3.1 ו-#3.2) מ-332 שיבוטי פאג'ים משוחזרים מ-CSF שבודדו משתי חיות (איור משלים 6a). לרצף LGSVS (18.7%) היה השיעור היחסי הגבוה ביותר, ואחריו ה-inserts wild-type PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ו-SARGSWREIVSLS (2.2%). בסיבוב הרביעי האחרון, איחדנו שני ענפים שנבחרו באופן עצמאי משלושה חיות נפרדות (איור 1c). מתוך 925 שיבוטי הפאג'ים המרוצפים שהוחזרו מ-CSF, בסיבוב הרביעי מצאנו 64 רצפי פפטידים ייחודיים (איור משלים 6b), שביניהם השיעור היחסי של פאג'ים wild-type ירד ל-0.8%. שיבוטי ה-CSF הנפוצים ביותר בסיבוב הרביעי היו LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ו-RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %). טווח האורך של הפפטידים שנבחרו נובע מהכנסות/מחיקות של נוקלאוטידים או קודוני עצירה מוקדמים בפריימרים של הספרייה בעת שימוש בקודונים מנוונים לתכנון ספריית NNK. קודוני עצירה מוקדמים מייצרים פפטידים קצרים יותר ונבחרים משום שהם מכילים את המוטיב aa המועדף. פפטידים ארוכים יותר עשויים לנבוע מהכנסות/מחיקות בפריימרים של הספריות הסינתטיות. פעולה זו ממקמת את קודון העצירה שתוכנן מחוץ למסגרת וקוראת אותו עד להופעת קודון עצירה חדש במורד הזרם. באופן כללי, חישבנו גורמי העשרה עבור כל ארבעת סבבי הבחירה על ידי השוואת נתוני הקלט לנתוני הפלט של הדגימה. עבור הסיבוב הראשון של הסינון, השתמשנו בטיטרי פאג'ים מסוג בר כרקע לא ספציפי. מעניין לציין, שסלקציה שלילית של פאג'ים הייתה חזקה מאוד במחזור ה-CSF הראשון, אך לא בדם (איור 3א'), דבר שעשוי להיות בגלל הסבירות הנמוכה לדיפוזיה פסיבית של רוב חברי ספריית הפפטידים לתוך תא ה-CSF או שפאג'ים יחסיים נוטים להישמר או להסרה ביעילות רבה יותר מזרם הדם מאשר בקטריופאג'ים. עם זאת, בסבב השני של הסלקציה, נצפתה סלקציה חזקה של פאג'ים ב-CSF בשני הקלאדים, דבר המצביע על כך שהסבב הקודם היה מועשר בפאג'ים המציגים פפטידים המקדמים קליטת CSF (איור 3א'). שוב, ללא העשרה משמעותית בדם. גם בסבבים השלישי והרביעי, שיבוטי הפאג'ים הועשרו משמעותית ב-CSF. בהשוואה לתדירות היחסית של כל רצף פפטיד ייחודי בין שני סבבי הסלקציה האחרונים, מצאנו שהרצפים הועשרו אף יותר בסבב הסלקציה הרביעי (איור 3ב'). סך של 931 מוטיבים טריפפטידיים חולצו מכל 64 רצפי הפפטידים הייחודיים תוך שימוש בשני אוריינטציות הפפטיד. המוטיבים המועשרים ביותר בסיבוב הרביעי נבדקו מקרוב יותר עבור פרופילי העשרה שלהם בכל הסיבובים בהשוואה לספרייה שהוזרקה (סף: העשרה של 10%) (איור משלים 6c). דפוסי ברירה כלליים הראו שרוב המוטיבים שנחקרו הועשרו בכל הסיבובים הקודמים של שני ענפי הבחירה. עם זאת, חלק מהמוטיבים (למשל SGL, VSG, LGS GSV) הגיעו בעיקר מקלאד A חלופי, בעוד שאחרים (למשל FGW, RTN, WGF, NTR) הועשרו בקלאד B חלופי.
אימות של הובלת CSF של פפטידים מועשרים ב-CSF המוצגים בפאג'ים ופפטידים מובילים ביוטינילציה מצומדים למטעני סטרפטבידין.
(א) יחסי העשרה שחושבו בכל ארבעת הסבבים (R1-R4) בהתבסס על טיטרי פאג'ים (קלט = I) (PFU) שהוזרקו וטיטרי פאג'ים שנקבעו ב-CSF (פלט = O). גורמי העשרה עבור שלושת הסבבים האחרונים (R2-R4) חושבו על ידי השוואה לסיבוב הקודם ולסיבוב הראשון (R1) עם נתוני משקל. הפסים הפתוחים הם נוזל השדרה, הפסים המוצללים הם פלזמה. (***p<0.001, בהתבסס על מבחן t של סטודנט). (ב) רשימה של פפטידים של פאג'ים הנפוצים ביותר, מדורגים לפי יחסם לכל הפאג'ים שנאספו ב-CSF לאחר סבב 4 של הבחירה. ששת שיבוטי הפאג'ים הנפוצים ביותר מודגשים בצבע, ממוספרים וגורמי העשרה שלהם בין סבבים 3 ו-4 של הבחירה (תצלומים מוכנסים). (ג,ד) ששת שיבוטי הפאג'ים המועשרים ביותר, פאג'ים ריקים וספריות פפטידים של פאג'ים הוריים מסבב 4 נותחו בנפרד במודל דגימה של CSF. דגימות CSF ודם נאספו בנקודות הזמן שצוינו. (ג) כמויות שוות של 6 שיבוטי פאג'ים מועמדים (2 x 1010 פאג'ים/בעלי חיים), פאג'ים ריקים (#1779) (2 x 1010 פאג'ים/בעלי חיים) וספריות פפטידים של פאג'ים מלאי (2 x 1012 פאג'ים/בעלי חיים). יש להזריק לפחות 3 CM לחיה שעברה קנולציה בנפרד דרך וריד הזנב. מוצגת הפרמקוקינטיקה של ה-CSF של כל שיבוט פאג' וספריית פפטידים של פאג'ים שהוזרק לאורך זמן. (ד) מציג את יחס ה-CSF/דם הממוצע עבור כל הפאג'ים/מ"ל שהוחזרו לאורך זמן הדגימה. (ה) ארבעה פפטידים מובילים סינתטיים וקבוצת בקרה מעורבבת אחת נקשרו עם ביוטין לסטרפטבידין דרך הקצה ה-N שלהם (תצוגת טטרמר) ולאחר מכן הזרקה (וריד הזנב תוך ורידי, 10 מ"ג סטרפטבידין/ק"ג). לפחות שלוש חולדות שעברו אינטובציה (N = 3). דגימות CSF נאספו בנקודות הזמן שצוינו וריכוזי הסטרפטבידין נמדדו על ידי ELISA של CSF אנטי-סטרפטבידין (nd = לא זוהה). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, בהתבסס על מבחן ANOVA). (ו) השוואה של רצף חומצות האמינו של שיבוט פפטיד הפאג' המועשר ביותר #2002 (סגול) עם שיבוטי פפטיד פאג' אחרים שנבחרו מסבב הבחירה הרביעי. שברי חומצות אמינו זהים ודומים מקודדים בצבע.
מבין כל הפאג'ים המועשרים בסיבוב הרביעי (איור 3ב'), נבחרו שישה שיבוטים מועמדים לניתוח נוסף בנפרד במודל דגימת CSF. כמויות שוות של שש ספריות פפטידים של פאג'ים מועמדים, פאג'ים ריקים (ללא הוספה) ופרופאג'ים הוזרקו לשלושה בעלי חיים מסוג CM שעברו קנולציה, והפרמקוקינטיקה נקבעה בבדיקות CSF (איור 3ג') ודם (איור משלים 7). כל שיבוטי הפאג'ים שנבדקו כיוונו לתא ה-CSF ברמה גבוהה פי 10-1000 מזו של פאג' הביקורת הריק (#1779). לדוגמה, לשיבונים #2020 ו-#2077 היו טיטרי CSF גבוהים פי 1000 בערך בהשוואה לפאג' הביקורת. הפרופיל הפרמקוקינטי של כל פפטיד שנבחר שונה, אך לכולם יכולת התבייתות CSF גבוהה. צפינו בירידה מתמדת לאורך זמן עבור שיבוטים #1903 ו-#2011, בעוד שעבור שיבוטים #2077, #2002 ו-#2009 עלייה במהלך 10 הדקות הראשונות עשויה להצביע על הובלה אקטיבית אך יש לאמת זאת. שיבוטים #2020, #2002 ו-#2077 התייצבו ברמות גבוהות, בעוד שריכוז הנוזל הוויסות-שדרתי (CSF) של שיבוט #2009 ירד באיטיות לאחר העלייה הראשונית. לאחר מכן השווינו את התדירות היחסית של כל מועמד ל-CSF עם ריכוזו בדם (איור 3ד). המתאם של הטיטר הממוצע של כל מועמד ל-CSF עם טיטר הדם שלו בכל זמני הדגימה הראה ששלושה מתוך ששת המועמדים היו עשירים משמעותית ב-CSF בדם. מעניין לציין, שיבוט #2077 הראה יציבות דם גבוהה יותר (איור משלים 7). כדי לאשר שהפפטידים עצמם מסוגלים להעביר באופן פעיל מטען שאינו חלקיקי פאג' לתא ה-CSF, סינתזנו ארבעה פפטידים מובילים שעברו נגזרות עם ביוטין בקצה ה-N שבו הפפטידים נצמדים לחלקיק הפאג'. פפטידים ביוטינילטיביים (מס' 2002, 2009, 2020 ו-2077) עברו מצומדות עם סטרפטבידין (SA) כדי לקבל צורות מולטימריות המחקות במידה מסוימת את הגיאומטריה של פאג'ים. פורמט זה גם אפשר לנו למדוד את החשיפה ל-SA בדם ובנוזל השדרה כפפטידים של חלבונים להובלת מטען. חשוב לציין, נתוני פאג'ים ניתנו לעתים קרובות לשחזור כאשר פפטידים סינתטיים ניתנו בפורמט מצומד ל-SA זה (איור 3e). לפפטידים המעורבבים הייתה חשיפה ראשונית נמוכה יותר וסילוק מהיר יותר של נוזל השדרה (CSF) עם רמות בלתי ניתנות לגילוי תוך 48 שעות. כדי לקבל תובנה לגבי מסלולי ההעברה של שיבוטי פאג'ים פפטידיים אלה לחלל ה-CSF, ניתחנו את המיקום של פגיעות פפטיד פאג' בודדות באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) כדי לזהות ישירות חלקיקי פאג' שעה לאחר הזרקה תוך ורידית in vivo. ראוי לציין כי ניתן היה לזהות את השיבוטים #2002, #2077 ו-#2009 על ידי צביעה חזקה בנימי המוח, בעוד שפאג' הביקורת (#1779) ושיבוט #2020 לא זוהו (איור משלים 8). ממצא זה מצביע על כך שפפטידים אלו תורמים להשפעה על המוח דווקא על ידי חציית ה-BBB. נדרש ניתוח מפורט נוסף כדי לבחון השערה זו, מכיוון שגם נתיב BSCFB עשוי להיות מעורב. כאשר משווים את רצף חומצות האמינו של השיבוט המועשר ביותר (#2002) עם פפטידים נבחרים אחרים, צוין כי לחלקם יש שלוחות חומצות אמינו דומות, דבר שעשוי להצביע על מנגנון הובלה דומה (איור 3f).
בשל פרופיל הפלזמה הייחודי שלו והעלייה המשמעותית ב-CSF לאורך זמן, שיבוט תצוגת הפאג' #2077 נחקר לעומק במשך תקופה ארוכה יותר של 48 שעות והצליח לשחזר את העלייה המהירה ב-CSF שנצפתה בקשר לרמות SA מתמשכות (איור 4א'). באשר לשיבוטי פאג' אחרים שזוהו, #2077 נצבע חזק עבור נימים במוח והראה קולוקליזציה משמעותית עם סמן לקטין נימי כאשר נצפה ברזולוציה גבוהה יותר וייתכן שגם צביעה מסוימת בחלל הפרנכימלי (איור 4ב'). כדי לבדוק האם ניתן להשיג השפעות פרמקולוגיות בתיווך פפטידים במערכת העצבים המרכזית, ביצענו ניסוי שבו גרסאות ביוטינילציה של i) פפטיד המעבר #2077 ו-ii) פפטיד מעכב BACE1 עורבבו עם SA בשני יחסים שונים. עבור שילוב אחד השתמשנו רק במעכב הפפטיד BACE1 ועבור השני השתמשנו ביחס של 1:3 של מעכב פפטיד BACE1 לפפטיד #2077. שתי הדגימות ניתנו לווריד ונמדדו רמות בטא-עמילואיד פפטיד 40 (Abeta40) בדם ובנוזל השדרה לאורך זמן. Abeta40 נמדד ב-CSF מכיוון שהוא משקף עיכוב BACE1 בפרנכימה של המוח. כצפוי, שני הקומפלקסים הפחיתו משמעותית את רמות Abeta40 בדם (איור 4c, d). עם זאת, רק דגימות המכילות תערובת של פפטיד מס' 2077 ומעכב של פפטיד BACE1 מצומד ל-SA גרמו לירידה משמעותית ב-Abeta40 בנוזל השדרה (איור 4c). הנתונים מראים שפפטיד מס' 2077 מסוגל להעביר את חלבון SA במשקל 60 kDa לתוך מערכת העצבים המרכזית וגם גורם להשפעות פרמקולוגיות עם מעכבים מצומדים ל-SA של פפטיד BACE1.
(א) הזרקה שבטית (2 × 10 פאג'ים/בעל חיים) של פאג' T7 המציגה פרופילים פרמקוקינטיים ארוכי טווח של פפטיד CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) ופאג' בקרה שלא הוזרק (#1779) בלפחות שלוש חולדות שעברו אינטובציה של CM. (ב) תמונה מיקרוסקופית קונפוקלית של כלי דם קורטיקליים מייצגים בחולדות שהוזרקו לפאג' (2 × 10 10 פאג'ים/בעל חיים) המציגה צביעה נגדית של פפטיד #2077 וכלי דם (לקטין). שיבוטי פאג' אלה ניתנו ל-3 חולדות והורשו להסתובב במשך שעה לפני זילוח. המוחות נחתכו ונצבעו בנוגדנים פוליקלונליים המסומנים ב-FITC כנגד קפסיד פאג' T7. עשר דקות לפני זילוח וקיבוע לאחר מכן, לקטין המסומן ב-DyLight594 ניתן לווריד. תמונות פלואורסצנטיות המציגות צביעת לקטין (אדום) של הצד הלומינלי של כלי דם ופאג'ים (ירוק) בלומן של נימים ורקמת מוח סביב כלי הדם. סרגל קנה המידה מתאים ל-10 מיקרומטר. (ג, ד) פפטיד מעכב BACE1 שעבר ביוטינילציה לבד או בשילוב עם פפטיד מעבר ביוטינילציה מס' 2077 חובר לסטרפטבידין ולאחר מכן הוזרק תוך ורידי של לפחות שלוש חולדות CM שעברו קנולציה (10 מ"ג סטרפטבידין/ק"ג). ירידה ב-Aβ40 בתיווך מעכב פפטיד BACE1 נמדדה על ידי בדיקת Aβ1-40 ELISA בדם (אדום) ובנוזל שדרתי (כתום) בנקודות הזמן המצוינות. לבהירות טובה יותר, מצויר קו מקווקו בגרף בסולם של 100%. (ג) אחוז ירידה ב-Aβ40 בדם (משולשים אדומים) ובנוזל שדרתי (משולשים כתומים) בחולדות שטופלו בסטרפטבידין מצומד לפפטיד מעבר מס' 2077 ולפפטיד מעכב BACE1 ביחס של 3:1. (ד) אחוז הירידה ב-Aβ40 בדם (עיגולים אדומים) ובנוזל השדרה (עיגולים כתומים) של חולדות שטופלו בסטרפטבידין בשילוב עם פפטיד מעכב BACE1 בלבד. ריכוז ה-Aβ בקבוצת הביקורת היה 420 פיקוגרם/מ"ל (סטיית תקן = 101 פיקוגרם/מ"ל).
תצוגת פאג'ים יושמה בהצלחה במספר תחומים של מחקר ביו-רפואי17. שיטה זו שימשה למחקרי גיוון כלי דם in vivo18,19 כמו גם למחקרים המכוונים לכלי דם מוחיים20,21,22,23,24,25,26. במחקר זה, הרחבנו את יישום שיטת הברירה הזו לא רק לזיהוי ישיר של פפטידים המכוונים לכלי דם מוחיים, אלא גם לגילוי מועמדים בעלי תכונות הובלה אקטיביות לחצות את מחסום הדם-מוח. כעת אנו מתארים את פיתוח הליך הברירה in vivo בחולדות שעברו אינטובציה של CM ומדגימים את הפוטנציאל שלו לזהות פפטידים בעלי תכונות התאמת תאים ל-CSF. באמצעות פאג' T7 המציג ספרייה של פפטידים אקראיים של 12 מר, הצלחנו להדגים כי פאג' T7 קטן מספיק (קוטר של כ-60 ננומטר)10 כדי להתאים אותו למחסום הדם-מוח, ובכך לחצות ישירות את מחסום הדם-מוח או מקלעת הדם. צפינו כי איסוף נוזל שדרתי (CSF) מחולדות CM שעברו קנולציה הייתה שיטת סינון פונקציונלית מבוקרת היטב in vivo, וכי הפאג' שחולץ לא רק נקשר לכלי הדם אלא גם תפקד כטרנספורטר מעבר למחסום הדם-מוח. יתר על כן, על ידי איסוף דם בו זמנית ויישום HTS על CSF ופאג'ים שמקורם בדם, אישרנו כי בחירת ה-CSF שלנו לא הושפעה מהעשרת הדם או מההתאמה להתפשטות בין סבבי סלקציה. עם זאת, תא הדם הוא חלק מהליך הסלקציה, מכיוון שפאג'ים המסוגלים להגיע לתא ה-CSF חייבים לשרוד ולהסתובב בזרם הדם מספיק זמן כדי להעשיר את עצמם במוח. על מנת לחלץ מידע אמין על רצף מנתוני HTS גולמיים, יישמנו מסננים המותאמים לשגיאות ריצוף ספציפיות לפלטפורמה בתהליך העבודה של הניתוח. על ידי שילוב פרמטרים קינטיים בשיטת הסינון, אישרנו את הפרמקוקינטיקה המהירה של פאג'ים מסוג T7 בר (t½ ~ 28 דקות) בדם24, 27, 28 וגם קבענו את זמן מחצית החיים שלהם בנוזל השדרה (t½ ~ 26 דקות) לדקה). למרות פרופילים פרמקוקינטיים דומים בדם וב-CSF, רק 0.001% מריכוז הפאג'ים בדם ניתן היה לזהות ב-CSF, דבר המצביע על ניידות רקע נמוכה של פאג' T7 מסוג בר על פני מחסום הדם-מוח. עבודה זו מדגישה את חשיבות הסבב הראשון של הברירה בעת שימוש באסטרטגיות צילום שטח in vivo, במיוחד עבור מערכות פאג'ים שמנוקות במהירות מהמחזור הדם, מכיוון שמעט שיבוטים מסוגלים להגיע לתא מערכת העצבים המרכזית. לפיכך, בסבב הראשון, ההפחתה בגיוון הספרייה הייתה גדולה מאוד, מכיוון שרק מספר מוגבל של שיבוטים נאסף בסופו של דבר במודל CSF קפדני מאוד זה. אסטרטגיית צילום שטח in vivo זו כללה מספר שלבי ברירה כגון הצטברות פעילה בתא CSF, הישרדות שיבוטים בתא הדם והסרה מהירה של שיבוטי פאג'ים T7 מהדם בתוך 10 הדקות הראשונות (איור 1ד ואיור משלים 4M). לפיכך, לאחר הסבב הראשון, זוהו שיבוטי פאג'ים שונים ב-CSF, למרות שאותו מאגר התחלתי שימש עבור בעלי חיים בודדים. ממצא זה מצביע על כך שצעדי בחירה קפדניים מרובים עבור ספריות מקור עם מספר רב של חברי ספרייה גורמים להפחתה משמעותית בגיוון. לכן, אירועים אקראיים יהפכו לחלק בלתי נפרד מתהליך הבחירה הראשוני, וישפיעו רבות על התוצאה. סביר להניח שלרבים מהשיבוטים בספרייה המקורית הייתה נטייה דומה מאוד להעשרת נוזלים שדרתיים (CSF). עם זאת, אפילו באותם תנאי ניסוי, תוצאות הבחירה עשויות להיות שונות עקב המספר הקטן של כל שיבוט מסוים במאגר הראשוני.
המוטיבים המועשרים ב-CSF שונים מאלה שבדם. מעניין לציין, כי שמנו לב למעבר הראשון לכיוון פפטידים עשירים בגליצין בדם של בעלי חיים בודדים (איור 1g, איורים משלימים 4e, 4f). פאג'ים המכילים פפטידים של גליצין עשויים להיות יציבים יותר ופחות סבירים שיוצאו מהמחזור. עם זאת, פפטידים עשירים בגליצין אלה לא זוהו בדגימות נוזל השדרה, דבר המצביע על כך שהספריות שנאספו עברו שני שלבי סלקציה שונים: אחד בדם ואחר שהורשה להצטבר בנוזל השדרה. שיבוטים מועשרים ב-CSF כתוצאה מסבב הסלקציה הרביעי נבדקו בהרחבה. כמעט כל השיבוטים שנבדקו בנפרד אושרו כמועשרים ב-CSF בהשוואה לפאג' בקרה ריק. פגיעה פפטידית אחת (#2077) נבדקה ביתר פירוט. היא הראתה זמן מחצית חיים ארוך יותר בפלזמה בהשוואה לפגיעות אחרות (איור 3d ואיור משלים 7), ומעניין לציין, פפטיד זה הכיל שארית ציסטאין בקצה C. לאחרונה הוכח כי הוספת ציסטאין לפפטידים יכולה לשפר את התכונות הפרמקוקינטיות שלהם על ידי קשירה לאלבומין 29. כרגע זה אינו ידוע עבור פפטיד מס' 2077 ודורש מחקר נוסף. חלק מהפפטידים הראו תלות בערכיות בהעשרת CSF (נתונים לא מוצגים), דבר שעשוי להיות קשור לגיאומטריית פני השטח המוצגת של קפסיד T7. מערכת ה-T7 בה השתמשנו הראתה 5-15 עותקים של כל פפטיד לכל חלקיק פאג'. בדיקת IHC בוצעה על שיבוטי פאג' מובילים מועמדים שהוזרקו לווריד לקליפת המוח של חולדות (איור משלים 8). הנתונים הראו שלפחות שלושה שיבוטים (מס' 2002, מס' 2009 ומס' 2077) קיימו אינטראקציה עם ה-BBB. נותר לקבוע האם אינטראקציה זו של BBB גורמת להצטברות של CSF או לתנועה של שיבוטים אלה ישירות ל-BCSFB. חשוב לציין, אנו מראים כי הפפטידים שנבחרו שומרים על יכולת הובלת ה-CSF שלהם כאשר הם מסונתזים ונקשרים למטען החלבון. קישור של פפטידים ביוטינילציה N-טרמינליים ל-SA חוזר למעשה על התוצאות שהתקבלו עם שיבוטי הפאג' שלהם בדם ובנוזל השדרה (איור 3e). לבסוף, אנו מראים כי פפטיד מוביל #2077 מסוגל לקדם את פעולת המוח של מעכב פפטיד ביוטינילציה של BACE1 מצומד ל-SA, וגורם להשפעות פרמקודינמיות בולטות במערכת העצבים המרכזית על ידי הפחתה משמעותית של רמות Abeta40 ב-CSF (איור 4). לא הצלחנו לזהות הומולוגים במסד הנתונים על ידי ביצוע חיפוש הומולוגי של רצף פפטידים של כל ההתאמות. חשוב לציין שגודל ספריית T7 הוא כ-109, בעוד שגודל הספרייה התיאורטי עבור 12-מר הוא 4 x 1015. לכן, בחרנו רק חלק קטן ממרחב הגיוון של ספריית פפטידים 12-מר, מה שעשוי אומר שניתן לזהות פפטידים אופטימליים יותר על ידי הערכת מרחב הרצף הסמוך של ההתאמות שזוהו. באופן היפותטי, אחת הסיבות לכך שלא מצאנו הומולוגים טבעיים של פפטידים אלה עשויה להיות ביטול ברירה במהלך האבולוציה כדי למנוע כניסה בלתי מבוקרת של מוטיבים פפטידיים מסוימים למוח.
לסיכום, תוצאותינו מספקות בסיס לעבודה עתידית לזיהוי ואפיון מערכות ההובלה של מחסום כלי הדם המוחיים in vivo ביתר פירוט. המבנה הבסיסי של שיטה זו מבוסס על אסטרטגיית ברירה פונקציונלית אשר לא רק מזהה שיבוטים בעלי תכונות קישור לכלי דם מוחיים, אלא גם כולל שלב קריטי שבו לשיבוטים מוצלחים יש פעילות פנימית לחצות מחסומים ביולוגיים in vivo לתוך תא מערכת העצבים המרכזית. מטרת השיטה היא להבהיר את מנגנון ההובלה של פפטידים אלה ואת העדפתם להיקשר למיקרו-וסקולטורה הספציפיים לאזור המוח. דבר זה עשוי להוביל לגילוי מסלולים חדשים להובלת ה-BBB והקולטנים. אנו מצפים שהפפטידים שזוהו יוכלו להיקשר ישירות לקולטנים מוחיים או לליגנדים במחזור הדם המועברים דרך ה-BBB או ה-BCSFB. וקטורי הפפטידים בעלי פעילות הובלת CSF שהתגלו בעבודה זו ייחקרו עוד. אנו חוקרים כעת את הספציפיות למוח של פפטידים אלה מבחינת יכולתם לחצות את ה-BBB ו/או ה-BCSFB. פפטידים חדשים אלה יהיו כלים בעלי ערך רב לגילוי פוטנציאלי של קולטנים או מסלולים חדשים ולפיתוח פלטפורמות חדשות ויעילות ביותר להעברת מקרומולקולות, כגון תרופות ביולוגיות, למוח.
קנולציה של ציסטרנה גדולה (CM) באמצעות שינוי של השיטה שתוארה קודם לכן. חולדות ויסטאר מורדמות (200-350 גרם) הורכבו על מנגנון סטריאוטקסי ונעשה חתך אמצעי מעל הקרקפת המגולחת והוכנה באופן אספטי כדי לחשוף את הגולגולת. קדחו שני חורים באזור החלק העליון והדקו את ברגי הקיבוע בחורים. נקדח חור נוסף בקצה העורף הצידי לצורך הנחיה סטריאוטקטית של קנולה מפלדת אל-חלד לתוך ה-CM. מרחו צמנט דנטלי סביב הקנולה ואבטחו בעזרת ברגים. לאחר ריפוי פוטוגרפי והתקשות צמנט, פצע העור נסגר בתפר סופרמיד 4/0. מיקום נכון של הקנולה אושר על ידי דליפה ספונטנית של נוזל מוחי שדרתי (CSF). הוציאו את החולדה מהמנגנון הסטריאוטקסי, קבלו טיפול לאחר הניתוח וניהול כאב מתאימים, ואפשרו לה להתאושש לפחות שבוע עד שייצפו סימני דם בנוזל מוחי שדרתי. חולדות ויסטאר (Crl:WI/Han) התקבלו מצ'ארלס ריבר (צרפת). כל החולדות הוחזקו בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי המשרד הווטרינרי של העיר באזל, שוויץ, ובוצעו בהתאם לרישיון בעלי חיים מס' 2474 (הערכת הובלת מוח פעילה על ידי מדידת רמות של מועמדים טיפוליים בנוזל השדרה ובמוח של חולדה).
שמרו בעדינות על החולדה בהכרה כשקנולת ה-CM ביד. הוציאו את הדטורה מהקנולה ואספו 10 מיקרוליטר של נוזל מוחי שדרתי הזורם באופן ספונטני. מאחר ופתיחות הקנולה נפגעה בסופו של דבר, נכללו במחקר זה רק דגימות נוזל מוחי שדרתי שקופות ללא עדות לזיהום דם או שינוי צבע. במקביל, נלקחו כ-10-20 מיקרוליטר של דם מחתך קטן בקצה הזנב לתוך צינורות עם הפרין (Sigma-Aldrich). נוזל מוחי שדרתי ודם נאספו בנקודות זמן שונות לאחר הזרקה תוך ורידית של פאג' T7. כ-5-10 מיקרוליטר של נוזל הושלכו לפני כל דגימת נוזל מוחי שדרתי נאספה, התואם את הנפח המת של הקטטר.
ספריות נוצרו באמצעות וקטור T7Select 10-3b כמתואר במדריך מערכת T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). בקצרה, סונתז תוסף DNA אקראי של 12 מר בפורמט הבא:
קודון NNK שימש כדי למנוע קודוני עצירה כפולים וביטוי יתר של חומצות אמינו בתוסף. N הוא יחס אקווימולרי שמעורבב ידנית של כל נוקלאוטיד, ו-K הוא יחס אקווימולרי שמעורבב ידנית של נוקלאוטידים של אדנין וציטוזין. אזורים חד-גדיליים הומרו ל-DNA כפול-גדילי על ידי אינקובציה נוספת עם dNTP (Novagen) ואנזים Klenow (New England Biolabs) בבופר Klenow (New England Biolabs) למשך 3 שעות ב-37°C. לאחר התגובה, DNA כפול-גדילי הוצא על ידי שיקוע EtOH. ה-DNA שנוצר עוכל עם אנזימי ההגבלה EcoRI ו-HindIII (שניהם מ-Roche). התוסף המבוקע והמטוהר (QIAquick, Qiagen) (ליגאז T4, New England Biolabs) נקשר לאחר מכן בתוך המסגרת לווקטור T7 שעבר ביקוע מראש לאחר חומצת אמינו 348 של גן הקפסיד 10B. תגובות הקשירה הודגרו ב-16°C למשך 18 שעות לפני אריזה במבחנה. אריזת פאג'ים במבחנה בוצעה בהתאם להוראות המצורפות לערכת השיבוט T7Select 10-3b (Novagen) ותמיסת האריזה הוגברה פעם אחת לליזיס באמצעות Escherichia coli (BLT5615, Novagen). הליזטים עברו צנטריפוגה, טיטרציה והוקפאו ב-80°C- כתמיסת מלאי של גליצרול.
הגברה ישירה של אזורים משתנים של פאג'ים שהוגברו במרק או בצלחת באמצעות פריימרים קנייניים של היתוך 454/Roche-amplicon. פריימר ההיתוך הקדמי מכיל רצפים המקיפים את האזור המשתנה (NNK) 12 (ספציפי לתבנית), מתאם טיטניום A של GS FLX, ורצף מפתחות ספרייה בעל ארבעה בסיסים (TCAG) (איור משלים 1a):
הפריימר להיתוך הפוך מכיל גם ביוטין המחובר לחרוזי לכידה ול-GS FLX Titanium Adapter B הנדרש להגברה קלונלית במהלך PCR אמולסיה:
לאחר מכן, האמפליקונים עברו ריצוף פירו 454/Roche לפי פרוטוקול 454 GS-FLX Titanium. עבור ריצוף ידני של סנגר (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNA של פאג' T7 הוגבר באמצעות PCR ורוצף עם זוגות הפריימרים הבאים:
תוסף פלאקים בודדים עברו הגברה באמצעות PCR באמצעות ערכת Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (בהתאם להוראות היצרן). בצע אתחול חם (10 דקות ב-95 מעלות צלזיוס) ו-35 מחזורי דחיפה (50 שניות ב-95 מעלות צלזיוס, דקה אחת ב-50 מעלות צלזיוס ודקה אחת ב-72 מעלות צלזיוס).
פאג'ים מספריות, פאג'ים מסוג בר, פאג'ים שחולצו מ-CSF ודם, או שיבוטים בודדים הוגברו ב-Escherichia coli BL5615 במרק שחפת (Sigma Aldrich) או בצלחות בגודל 500 סמ"ר (Thermo Scientific) למשך 4 שעות ב-37°C. הפאג'ים חולצו מהצלחות על ידי שטיפת הצלחות עם בופר Tris-EDTA (Fluka Analytical) או על ידי איסוף הפלאקים בעזרת קצוות פיפטה סטרילית. הפאג'ים בודדו מסופרנטנט תרבית או בופר מיצוי עם סבב אחד של משקעי פוליאתילן גליקול (PEG 8000) (Promega) והושעו מחדש בבופר Tris-EDTA.
הפאג' המוגבר עבר 2-3 סבבים של הסרת אנדוטוקסינים באמצעות חרוזי הסרת אנדוטוקסינים (Miltenyi Biotec) לפני הזרקה תוך ורידית (IV) (500 מיקרוליטר/בעל חיים). בסבב הראשון הוכנסו 2×1012 פאג'ים; בשני, 2×1010 פאג'ים; בסבבי הבחירה השלישי והרביעי, 2×109 פאג'ים לכל בעל חיים. תכולת הפאג'ים בדגימות CSF ודם שנאספו בנקודות הזמן המצוינות נקבעה על ידי ספירת פלאק בהתאם להוראות היצרן (מדריך מערכת T7Select). בחירת הפאג'ים בוצעה על ידי הזרקה תוך ורידית של ספריות מטוהרות לווריד הזנב או על ידי הזרקה חוזרת של פאג' שחולץ מ-CSF מסבב הבחירה הקודם, וקטיפים נוספים בוצעו לאחר 10 דקות, 30 דקות, 60 דקות, 90 דקות, 120 דקות, 180 דקות ו-240 דקות בהתאמה בדגימות CSF ודם. בסך הכל נערכו ארבעה סבבים של סריקה in vivo, בהם שני הענפים שנבחרו אוחסנו ונותחו בנפרד במהלך שלושת סבבי הברירה הראשונים. כל תוספות הפאג'ים שחולצו מ-CSF משני סבבי הברירה הראשונים עברו ריצוף פירו 454/Roche, בעוד שכל השיבוטים שחולצו מ-CSF משני סבבי הברירה האחרונים עברו ריצוף ידני. כל פאג'י הדם מסבב הברירה הראשון עברו גם הם ריצוף פירו 454/Roche. לצורך הזרקת שיבוטי פאג'ים, פאג'ים שנבחרו הוגברו ב-E. coli (BL5615) על פלטות של 500 סמ"ר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. שיבוטים שנבחרו בנפרד וריצופו ידנית גודלו במדיום שחפת. לאחר מיצוי פאג'ים, טיהור והסרת אנדוטוקסין (כמתואר לעיל), 2×1010 פאג'ים/בעל חיים ב-300 מיקרוליטר הוזרקו לווריד זנב אחד.
עיבוד מקדים וסינון איכותני של נתוני רצף. נתוני 454/Roche הגולמיים הומרו מפורמט בינארי סטנדרטי של מפת זרם (sff) לפורמט קריא של פירסון (fasta) באמצעות תוכנת ספק. עיבוד נוסף של רצף הנוקלאוטידים בוצע באמצעות תוכנות C וסקריפטים קנייניים (חבילת תוכנה שלא פורסמה) כמתואר להלן. ניתוח הנתונים הראשוניים כולל הליכי סינון רב-שלביים קפדניים. כדי לסנן קריאות שלא הכילו רצף DNA 12mer חוקי, הקריאות יושרו ברצף לתווית התחלה (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), תווית עצירה (TAAGCTTGGGCCGCACTCGAGTA) ותווית רקע (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) באמצעות מבחן Needleman-Wunsch הגלובלי. יישור המאפשר עד 2 חוסר עקביות לכל יישור. לכן, קריאות ללא תגי התחלה וסיום וקריאות המכילות תווית רקע, כלומר, יישורים שחורגים ממספר חוסר ההתאמות המותר, הוסרו מהספרייה. באשר לקריאות הנותרות, רצף ה-DNA של ה-N-mer המשתרע מסמן ההתחלה ומסתיים לפני סמן העצירה נכרת מרצף הקריאה המקורי ועובר עיבוד נוסף (להלן "הכנסה"). לאחר תרגום הכנס, החלק שאחרי קודון העצירה הראשון בקצה 5' של הפריימר הוסר מהכנס. בנוסף, הוסרו גם נוקלאוטידים המובילים לקודונים לא שלמים בקצה 3' של הפריימר. כדי לא לכלול כנסים המכילים רק רצפי רקע, הוסרו גם כנסים מתורגמים המתחילים בתבנית חומצות האמינו "PAG". פפטידים באורך פוסט-תרגום של פחות מ-3 חומצות אמינו הוסרו מהספרייה. לבסוף, הוסרו יתירות במאגר הכנסים וקבעו את התדירות של כל כנס ייחודי. תוצאות ניתוח זה כללו רשימה של רצפי נוקלאוטידים (כנסים) ותדירותם (הקריאה) (איורים משלימים 1c ו-2).
קבוצות של מוספות DNA מסוג N-mer לפי דמיון ברצף: כדי למנוע שגיאות ריצוף ספציפיות ל-454/Roche (כגון בעיות בריצוף הרחבות הומופולימר) ולהסיר יתירות פחות חשובות, מוספות רצף DNA מסוג N-mer (מוספות) שסוננו מראש ממוינות לפי דמיון. מוספות (מותר עד 2 בסיסים שאינם תואמים) באמצעות אלגוריתם איטרטיבי המוגדר כדלקמן: מוספות ממוינות תחילה לפי תדירותן (מהגבוה לנמוך), ואם הן זהות, לפי מיון משני לפי אורך (הארוך לקצר ביותר). לפיכך, ההוספות השכיחות והארוכות ביותר מגדירות את ה"קבוצה" הראשונה. תדירות הקבוצה מוגדרת לתדירות המפתח. לאחר מכן, כל מוספה שנותרה ברשימה הממוינת ניסתה להתווסף לקבוצה באמצעות יישור זוגי של Needleman-Wunsch. אם מספר אי-ההתאמות, ההוספות או המחיקות ביישור אינו עולה על סף של 2, מוספה מתווספת לקבוצה, ותדירות הקבוצה הכוללת מוגדלת בתדירות הוספת ההוספה. מוספות שנוספו לקבוצה מסומנות כמשומשות ואינן נכללות בעיבוד נוסף. אם לא ניתן להוסיף את רצף ההכנסה לקבוצה קיימת, רצף ההכנסה משמש ליצירת קבוצה חדשה עם תדירות ההכנסה המתאימה ומסומן כ"בשימוש". האיטרציה מסתיימת כאשר כל רצף הכנסה שימש ליצירת קבוצה חדשה או שניתן לכלול אותו בקבוצה קיימת. אחרי הכל, הכנסה מקובצת המורכבת מנוקלאוטידים מתורגמת בסופו של דבר לרצפי פפטידים (ספריות פפטידים). תוצאת הניתוח היא קבוצה של הכנסה והתדרים המתאימים לה המרכיבים את מספר הקריאות הרציפות (איור משלים 2).
יצירת מוטיבים: בהתבסס על רשימה של פפטידים ייחודיים, נוצרה ספרייה המכילה את כל דפוסי חומצות האמינו האפשריים (aa) כפי שמוצג להלן. כל תבנית אפשרית באורך 3 חולצה מהפפטיד והתבנית ההפוכה שלה נוספה יחד עם ספריית מוטיבים משותפת המכילה את כל התבניות (טריפפטידים). ספריות של מוטיבים שחוזרים על עצמם מאוד רוצפו והוסרו יתירות. לאחר מכן, עבור כל טריפפטיד בספריית המוטיבים, בדקנו את נוכחותו בספרייה באמצעות כלי חישוב. במקרה זה, תדירות הפפטיד המכיל את הטריפפטיד המוטיב שנמצא מתווספת ומשויכת למוטיב בספריית המוטיבים ("מספר מוטיבים"). תוצאת יצירת המוטיבים היא מערך דו-ממדי המכיל את כל המופעים של טריפפטידים (מוטיבים) ואת הערכים המתאימים שלהם, שהם מספר קריאות הריצוף שמובילות למוטיב המתאים כאשר הקריאות מסוננות, מקובצות ומתורגמות. מדדים כמתואר בפירוט לעיל.
נרמול מספר המוטיבים ותרשימי פיזור תואמים: מספר המוטיבים עבור כל דגימה נורמל באמצעות
כאשר ni הוא מספר הקריאות המכילות את נושא i. לכן, vi מייצג את אחוז התדירות של הקריאות (או פפטידים) המכילים מוטיב i במדגם. ערכי P עבור מספר המוטיבים הלא מנורמל חושבו באמצעות המבחן המדויק של פישר. בנוגע לקורלוגרמות של מספר המוטיבים, המתאמים של ספירמן חושבו באמצעות מספר המוטיבים המנורמל עם R.
כדי להציג את תכולת חומצות האמינו בכל מיקום בספריית הפפטידים, נוצרו לוגוגרמות אינטרנט 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). ראשית, תכולת חומצות האמינו בכל מיקום של פפטיד 12-מר מאוחסנת במטריצה ​​של 20×12. לאחר מכן, קבוצה של 1000 פפטידים המכילים את אותה תכולת חומצות אמינו יחסית בכל מיקום נוצרת בפורמט fasta-sequence ומסופקת כקלט ללוגו אינטרנט 3, אשר מייצרת ייצוג גרפי של תכולת חומצות האמינו היחסית בכל מיקום עבור ספריית פפטידים נתונה. כדי להציג מערכי נתונים רב-ממדיים, נוצרו מפות חום באמצעות כלי שפותח באופן פנימי ב-R (biosHeatmap, חבילת R שטרם פורסמה). הדנדרוגרמות המוצגות במפות החום חושבו באמצעות שיטת האשכול ההיררכית של וורד עם מדד המרחק האוקלידי. לצורך ניתוח סטטיסטי של נתוני ניקוד מוטיבים, ערכי P עבור ניקוד לא מנורמל חושבו באמצעות מבחן פישר המדויק. ערכי P עבור מערכי נתונים אחרים חושבו ב-R באמצעות מבחן t של סטודנט או ANOVA.
שיבוטי פאג'ים ופאג'ים ללא תוספות הוזרקו לווריד דרך וריד הזנב (2×1010 פאג'ים/בעל חיים ב-300 מיקרוליטר PBS). עשר דקות לפני הזרמת הפאג'ים וקיבועם לאחר מכן, אותם בעלי חיים הוזרקו לווריד 100 מיקרוליטר של לקטין מסומן ב-DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 דקות לאחר הזרקת הפאג'ים, חולדות עברו זילוח דרך הלב עם 50 מ"ל PBS ולאחר מכן 50 מ"ל 4% PFA/PBS. דגימות מוח קובעו בנוסף למשך הלילה ב-4% PFA/PBS והושרו ב-30% סוכרוז למשך הלילה ב-4°C. הדגימות הוקפאו במהירות בתערובת OCT. ניתוח אימונוהיסטוכימי של דגימות קפואות בוצע בטמפרטורת החדר על חתכים קריוגניים של 30 מיקרומטר שנחסמו ב-1% BSA והודגרו עם נוגדנים פוליקלונליים מסומנים ב-FITC כנגד פאג' T7 (Novus NB 600-376A) ב-4°C. דגירה למשך הלילה. לבסוף, החתכים נשטפו 3 פעמים עם PBS ונבדקו באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי (Leica TCS SP5).
כל הפפטידים בעלי טוהר מינימלי של 98% סונתזו על ידי GenScript USA, עברו ביוטינילציה ועברו ליופיליזציה. ביוטין נקשר באמצעות מרווח גליצין משולש נוסף בקצה ה-N. בדקו את כל הפפטידים באמצעות ספקטרומטריית מסות.
סטרפטבידין (Sigma S0677) עורבב עם עודף אקווימולרי פי 5 של פפטיד ביוטיניל, פפטיד מעכב BACE1 ביוטיניל, או שילוב (יחס 3:1) של פפטיד מעכב BACE1 ביוטיניל ופפטיד מעכב BACE1 ב-5-10% DMSO/מודגר ב-PBS. שעה בטמפרטורת החדר לפני ההזרקה. פפטידים מצומדים לסטרפטבידין הוזרקו לווריד במינון של 10 מ"ג/ק"ג לאחד מוורידי הזנב של חולדות עם חלל מוחי.
ריכוז קומפלקסי הסטרפטבידין-פפטיד הוערך באמצעות ELISA. פלטות מיקרוטיטר Nunc Maxisorp (Sigma) צופו למשך הלילה ב-4°C עם נוגדן עכבר אנטי-סטרפטבידין בריכוז 1.5 מיקרוגרם/מ"ל (Thermo, MA1-20011). לאחר חסימה (בופר חסימה: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ג'לטין, 1% BSA) בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, שטפו את הצלחת עם 0.05% Tween-20/PBS (בופר שטיפה) למשך 3 שניות, ודגימות CSF ופלזמה נוספו לבאות מדוללות בבופר חסימה (פלזמה 1:10,000, CSF 1:115). לאחר מכן הודגרו הפלאטה למשך הלילה ב-4°C עם נוגדן גילוי (1 מיקרוגרם/מ"ל, אנטי-סטרפטבידין-HRP, Novus NB120-7239). לאחר שלושה שלבי שטיפה, זוהה סטרפטבידין על ידי דגירה בתמיסת סובסטרט TMB (Roche) למשך עד 20 דקות. לאחר הפסקת פיתוח הצבע עם 1M H2SO4, מדדו את הבליעה ב-450 ננומטר.
תפקוד הקומפלקס מעכב הסטרפטבידין-פפטיד-BACE1 הוערך באמצעות בדיקת Aβ(1-40) ELISA בהתאם לפרוטוקול היצרן (Wako, 294-64701). בקצרה, דגימות CSF דוללו במדלל סטנדרטי (1:23) והודגרו למשך הלילה ב-4°C בצלחות 96 בארות מצופות בנוגדן לכידה BNT77. לאחר חמישה שלבי שטיפה, נוסף נוגדן BA27 מצומד ל-HRP והודגרו במשך שעתיים ב-4°C, ולאחר מכן חמישה שלבי שטיפה. Aβ(1-40) זוהה על ידי דגירה בתמיסת TMB למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר עצירת פיתוח הצבע באמצעות תמיסת עצירה, מדדו את הספיגה ב-450 ננומטר. דגימות הפלזמה עברו מיצוי פאזה מוצקה לפני בדיקת Aβ(1-40) ELISA. הפלזמה נוספה ל-0.2% DEA (Sigma) בצלחות 96 בארות והודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר שטיפה רצופה של לוחות ה-SPE (Oasis, 186000679) במים וב-100% מתנול, דגימות פלזמה נוספו ללוחות ה-SPE וכל הנוזלים הוסרו. הדגימות נשטפו (תחילה עם 5% מתנול ולאחר מכן עם 30% מתנול) ועברו אלציה עם 2% NH4OH/90% מתנול. לאחר ייבוש האלואט ב-55°C למשך 99 דקות בזרם N2 קבוע, הדגימות עברו צמצום במדללים סטנדרטיים ו-Aβ(1–40) נמדד כמתואר לעיל.
כיצד לצטט מאמר זה: אוריך, א. ואחרים. העברת מטען למוח באמצעות פפטידים של מעבר שזוהו in vivo. המדע. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB and Moos T. מתן תרופות מקרומולקולריות למוח באמצעות טיפול ממוקד. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
ברסנייביץ', א., שטיינבוש, ה.וו., שמיץ, ק., ומרטינז-מרטינז, פ. העברת תרופות פפטידיות וחלבון דרך מחסום הדם-מוח. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
פרדרידג', WM מחסום הדם-מוח: צוואר בקבוק בפיתוח תרופות למוח. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, and Byrd, A. סיכויים לשיפור אספקת תרופות ומיקוד למוח דרך מסלול מקלעת הכורואיד-CSF. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
פרדרידג', WM מודרניזציה של תרופות ביולוגיות בעזרת סוסי טרויאנים מולקולריים להעברה למוח. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
פרדרידג', הובלת פפטידים בתיווך קולטני WM דרך מחסום הדם-מוח. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. הגברת חדירת המוח ויעילותם של נוגדנים טיפוליים באמצעות מעבורות מולקולריות חד-ערכיות. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. הובלת קולטן טרנספרין (TfR) קובעת את קליטת המוח של וריאנטים זיקניים של נוגדני TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).