תודה שביקרת ב-Nature.com.אתה משתמש בגרסת דפדפן עם תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בנוסף, כדי להבטיח תמיכה שוטפת, אנו מציגים את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
מציג קרוסלה של שלוש שקופיות בבת אחת.השתמש בלחצנים 'הקודם' וה'הבא' כדי לעבור בין שלוש שקופיות בכל פעם, או השתמש בלחצני המחוון שבקצה כדי לעבור בין שלוש שקופיות בכל פעם.
מחסום הדם-מוח ומחסום הדם-מוח מונעים מגורמים ביו-תרפיים להגיע ליעדיהם במערכת העצבים המרכזית, ובכך מעכבים טיפול יעיל במחלות נוירולוגיות.כדי לגלות מעבירי מוח חדשים in vivo, הצגנו ספריית פפטיד פאג'י T7 ואספו באופן סדרתי דם ונוזל מוחי (CSF) באמצעות מודל מאגר מודע עם צינורות של חולדות.שיבוטי פאג ספציפיים הועשרו מאוד ב-CSF לאחר ארבעה סבבי בחירה.בדיקה של פפטידים מועמדים בודדים גילתה יותר מפי 1000 העשרה ב-CSF.הפעילות הביו-אקטיבית של המסירה המתווכת בפפטיד למוח אושרה על ידי ירידה של 40% ברמת העמילואיד-β בנוזל השדרה באמצעות מעכב פפטיד BACE1 המקושר לפפטיד המעבר החדש שזוהה.תוצאות אלו מצביעות על כך שהפפטידים שזוהו על ידי שיטות בחירת פאגים in vivo עשויים להיות כלי עזר שימושיים לאספקה ​​מערכתית של מקרומולקולות למוח עם השפעה טיפולית.
מחקר טיפול ממוקד למערכת העצבים המרכזית (CNS) התמקד במידה רבה בזיהוי תרופות וסוכנים מותאמים המציגים תכונות מכוונות למערכת העצבים המרכזית, עם פחות מאמץ בגילוי המנגנונים המניעים העברת תרופות פעילה למוח.זה מתחיל להשתנות כעת מכיוון שהעברת תרופות, במיוחד מולקולות גדולות, היא חלק בלתי נפרד מפיתוח תרופות מודרניות במדעי המוח.הסביבה של מערכת העצבים המרכזית מוגנת היטב על ידי מערכת מחסום כלי הדם המוחיים, המורכבת ממחסום הדם-מוח (BBB) ​​וממחסום הדם-מוח (BCBB)1, מה שהופך את זה למאתגר להעביר תרופות למוח1,2.ההערכה היא שכמעט כל התרופות מולקולות גדולות ויותר מ-98% מהתרופות מולקולות קטנות מסולקות מהמוח3.לכן חשוב מאוד לזהות מערכות הובלה מוחיות חדשות המספקות אספקה ​​יעילה וספציפית של תרופות טיפוליות למערכת העצבים המרכזית 4,5.עם זאת, ה-BBB ו-BCSFB גם מציגים הזדמנות מצוינת לאספקת תרופות כאשר הם חודרים וחודרים לכל מבני המוח דרך כלי הדם הנרחבים שלו.לפיכך, המאמצים הנוכחיים להשתמש בשיטות לא פולשניות של מסירה למוח מבוססים במידה רבה על מנגנון ההובלה באמצעות קולטן (PMT) באמצעות הקולטן האנדוגני BBB6.למרות התקדמות מפתח אחרונה בשימוש במסלול קולטן טרנספרין7,8, נדרש פיתוח נוסף של מערכות מסירה חדשות עם תכונות משופרות.לשם כך, המטרה שלנו הייתה לזהות פפטידים המסוגלים לתווך הובלה של CSF, מכיוון שהם יכולים לשמש באופן עקרוני להעברת מקרומולקולות ל-CNS או לפתיחת מסלולי קולטן חדשים.בפרט, קולטנים וטרנספורטרים ספציפיים של המערכת המוחית (BBB ו-BSCFB) יכולים לשמש מטרות פוטנציאליות לאספקה ​​פעילה וספציפית של תרופות ביו-תרפיות.נוזל מוחי (CSF) הוא תוצר הפרשה של מקלעת choroid (CS) ונמצא במגע ישיר עם הנוזל הבין-תאי של המוח דרך החלל התת-עכבישי וחלל החדר4.לאחרונה הוכח כי נוזל מוחי תת-עכבישי מתפזר בצורה מוגזמת לאינטרסטיטיום של המוח9.אנו מקווים לגשת למרחב הפרנכימלי באמצעות מערכת זרימה תת-עכבישית זו או ישירות דרך BBB.כדי להשיג זאת, יישמנו אסטרטגיית בחירת פאגים חזקה in vivo המזהה באופן אידיאלי פפטידים המועברים על ידי אחד משני המסלולים הנבדלים הללו.
כעת אנו מתארים שיטת הקרנת תצוגת פאגים רציפה in vivo עם דגימת CSF יחד עם רצף תפוקה גבוהה (HTS) כדי לפקח על סבבי בחירה ראשוניים עם מגוון הספריות הגבוה ביותר.ההקרנה בוצעה על חולדות בהכרה עם צינורית מים גדולה שהושתלה לצמיתות (CM) כדי למנוע זיהום דם.חשוב לציין, גישה זו בוחרת הן מיקוד למוח והן פפטידים עם פעילות הובלה על פני המחסום המוחי.השתמשנו בפאג'ים T7 בשל גודלם הקטן (~60 ננומטר)10 והצענו שהם מתאימים להובלה של שלפוחיות המאפשרות מעבר בין תאי של מחסום האנדותל ו/או האפיתל-מדולה.לאחר ארבעה סבבים של panning, בודדו אוכלוסיות פאג'ים שהראו העשרה חזקה של CSF in vivo וקשר מיקרו-כלי מוח.חשוב לציין, הצלחנו לאשר את הממצאים שלנו על ידי הדגמה שהפפטידים המועמדים הטובים ביותר המועדפים והמסונתזים כימית מסוגלים להעביר מטען חלבון לתוך נוזל המוח.ראשית, ההשפעות הפרמקודינמיות של מערכת העצבים המרכזית נקבעו על ידי שילוב של פפטיד מעבר מוביל עם מעכב של פפטיד BACE1.בנוסף להדגמה כי אסטרטגיות סקר פונקציונליות in vivo יכולות לזהות פפטידים חדשניים להובלת מוח כנשאי מטען חלבון יעילים, אנו מצפים שגישות בחירה פונקציונליות דומות יהפכו חשובות גם בזיהוי מסלולי הובלה מוחיים חדשים.
בהתבסס על יחידות יוצרות פלאק (PFU), לאחר שלב אריזת הפאג, תוכננה ונוצרה ספרייה של פפטידים ליניאריים מסוג T7 אקראיים של 12-מר עם מגוון של כ-109 (ראה חומרים ושיטות).חשוב לציין שניחנו בקפידה את הספרייה הזו לפני תנועות in vivo.הגברה של PCR של דגימות ספריית פאג באמצעות פריימרים מותאמים יצרו אמפליקונים שהיו ישימים ישירות ל-HTS (איור משלים. 1a).עקב א) שגיאות רצף HTS11, ב) השפעה על איכות הפריימרים (NNK)1-12, ו-ג) נוכחות של פאג מסוג פראי (wt) (תוספות שלד) בספריית ההמתנה, יושם הליך סינון רצף כדי לחלץ מידע רצף מאומת בלבד (איור משלים. 1b).שלבי סינון אלו חלים על כל ספריות רצף HTS.עבור הספרייה הסטנדרטית, התקבלו סך של 233,868 קריאות, מתוכם 39% עברו את קריטריוני הסינון ושימשו לניתוח ובחירה של ספרייה לסבבים הבאים (איור משלים 1c–e).הקראות היו בעיקר כפולות של 3 זוגות בסיסים באורך עם שיא של 36 נוקלאוטידים (איור משלים 1c), המאששים את עיצוב הספרייה (NNK) 1-12.יש לציין שכ-11% מחברי הספרייה הכילו 12 מימדי עמוד שדרה PAGISRELVDKL, וכמעט מחצית מהרצפים (49%) הכילו הוספות או מחיקות.ה-HTS של ספריית הספרייה אישר את המגוון הגבוה של פפטידים בספרייה: יותר מ-81% מרצפי הפפטידים נמצאו פעם אחת בלבד ורק 1.5% התרחשו ב-≥4 עותקים (איור משלים 2a).התדרים של חומצות אמינו (aa) בכל 12 המיקומים ברפרטואר תאמו היטב את התדרים הצפויים למספר הקודונים שנוצרו על ידי רפרטואר NKK המנוון (איור משלים 2b).התדירות הנצפית של שאריות aa המקודדות על ידי תוספות אלה תואמה היטב את התדירות המחושבת (r = 0.893) (איור משלים. 2c).הכנת ספריות הפאג להזרקה כוללת את שלבי ההגברה וההסרה של אנדוטוקסין.זה כבר הוכח בעבר כמפחית את המגוון של ספריות הפאג'12,13.לכן, רצפנו ספריית פאג' מוגברת בצלחת שעברה הסרת אנדוטוקסין והשווינו אותה עם הספרייה המקורית כדי להעריך את התדירות של AA.מתאם חזק (r = 0.995) נצפה בין הבריכה המקורית לבין הבריכה המוגברת והמטוהרת (איור משלים. 2d), המצביע על כך שהתחרות בין שיבוטים שהוגברו על צלחות באמצעות פאג T7 לא גרמה להטיה גדולה.השוואה זו מבוססת על התדירות של מוטיבים טריפפטידים בכל ספריה, מכיוון שלא ניתן ללכוד את מגוון הספריות (~109) במלואו אפילו עם HTS.ניתוח תדרים של aa בכל עמדה גילה הטיה קטנה תלוית מיקום בשלושת העמדות האחרונות של הרפרטואר שנכנס (איור משלים. 2e).לסיכום, הגענו למסקנה שהאיכות והגיוון של הספרייה היו מקובלים ונצפו רק שינויים קלים בגיוון עקב הגברה והכנה של ספריות פאג'ים בין מספר סבבי בחירה.
ניתן לבצע דגימה סדרתית של נוזל מוחי על ידי השתלה כירורגית של צינורית לתוך CM של חולדות בהכרה כדי להקל על זיהוי הפאג T7 המוזרק לווריד (iv) באמצעות BBB ו/או BCSFB (איור 1a-b).השתמשנו בשתי זרועות בחירה עצמאיות (זרועות A ו-B) בשלושת הסיבובים הראשונים של בחירה in vivo (איור 1c).הגדלנו בהדרגה את קשיחות הבחירה על ידי הקטנת הכמות הכוללת של הפאג'ים שהוכנסו בשלושת סבבי הבחירה הראשונים.לסיבוב ה-panning הרביעי, שילבנו דגימות מענפים A ו-B וביצענו שלוש בחירות עצמאיות נוספות.כדי לחקור את המאפיינים in vivo של חלקיקי הפאג T7 במודל זה, הוזרק פאג' מסוג פרא (הכנס מאסטר PAGISRELVDKL) לחולדות דרך וריד הזנב.התאוששות של פאג'ים מנוזל מוחי ודם בנקודות זמן שונות הראתה שלפאגים קטנים יחסית T7 icosahedral היה שלב פינוי ראשוני מהיר מתא הדם (איור משלים. 3).בהתבסס על הטיטרים שניתנו ונפח הדם של החולדות, חישבנו שרק כ-1% משקל.פאג' מהמנה הניתנת זוהה בדם 10 דקות לאחר ההזרקה לווריד.לאחר ירידה מהירה ראשונית זו, נמדד פינוי ראשוני איטי יותר עם זמן מחצית חיים של 27.7 דקות.חשוב לציין, רק מעט מאוד פאגים אוחזרו מתא ה-CSF, מה שמעיד על רקע נמוך לנדידת פאגים מסוג פרא לתוך תא ה-CSF (איור משלים. 3).בממוצע, רק כ-1 x 10-3% טיטר של פאג T7 בדם ו-4 x 10-8% של פאג'ים שהוכנסו לראשונה בנוזל המוח השדרתי במשך כל תקופת הדגימה (0-250 דקות).יש לציין כי זמן מחצית החיים (25.7 דקות) של פאג' מסוג פרא בנוזל השדרה היה דומה לזה שנצפה בדם.נתונים אלה מוכיחים שהמחסום המפריד בין תא CSF מהדם שלם בחולדות עם צינוריות CM, מה שמאפשר בחירה in vivo של ספריות פאגים לזהות שיבוטים המועברים בקלות מהדם אל תא CSF.
(א) הקמת שיטה לדגימה חוזרת של נוזל מוחי (CSF) מבריכה גדולה.(ב) תרשים המראה את המיקום התאי של מחסום מערכת העצבים המרכזית (CNS) ואת אסטרטגיית הבחירה המשמשת לזיהוי פפטידים החוצים את מחסום הדם-מוח (BBB) ​​ואת מחסום הדם-מוח.(ג) תרשים זרימה להקרנה של פאג'ים ב-vivo.בכל סבב בחירה, הוזרקו פאגים (מזהים של בעלי חיים בתוך החצים) לווריד.שני ענפים חלופיים עצמאיים (A, B) נשמרים בנפרד עד לסיבוב הבחירה הרביעי.עבור סבבי בחירה 3 ו-4, כל שיבוט פאג שהופק מ-CSF עבר רצף ידני.(ד) קינטיקה של פאג' מבודדת מדם (עיגולים אדומים) ונוזל מוחי (משולשים ירוקים) במהלך סבב הבחירה הראשון בשתי חולדות עם צינוריות לאחר הזרקה תוך ורידית של ספריית הפפטידים T7 (2 x 1012 פאגים/חיה).ריבועים כחולים מציינים את הריכוז ההתחלתי הממוצע של הפאג' בדם, מחושב מכמות הפאג' המוזרק, תוך התחשבות בנפח הדם הכולל.הריבועים השחורים מציינים את נקודת החיתוך של קו ה-y המובא מריכוזי הפאג' בדם.(ה,ו) הצג את התדירות וההפצה היחסית של כל המוטיבים הטריפפטידיים החופפים האפשריים שנמצאים בפפטיד.מוצג מספר המוטיבים שנמצאו ב-1000 קריאות.באופן מובהק (p < 0.001) מוטיבים מועשרים מסומנים בנקודות אדומות.(ה) תרשים פיזור מתאם המשווה את התדירות היחסית של מוטיב הטריפפטיד של הספרייה המוזרקת עם פאג' שמקורו בדם מבעלי חיים #1.1 ו-#1.2.(ו) תרשים פיזור מתאם המשווה את התדרים היחסיים של מוטיבים של טריפפטיד פאג'ים של בעלי חיים מס' 1.1 ו-#1.2 מבודדים בדם ובנוזל מוחי.(ז, ח) ייצוג מזהה רצף של פאג' מועשר בדם (ג) לעומת ספריות מוזרקות ופאג' מועשר ב-CSF (ח) לעומת דם לאחר סבב של בחירה in vivo בשתי החיות.גודל הקוד בן אות אחת מציין באיזו תדירות חומצת אמינו זו מופיעה במיקום זה.ירוק = קוטבי, סגול = ניטרלי, כחול = בסיסי, אדום = חומצי ושחור = חומצות אמינו הידרופוביות.איור 1a, b תוכנן ויוצר על ידי אדוארד אוריך.
הזרקנו ספריית פפטיד פאג' לשתי חולדות מכשיר CM (קלידים A ו-B) ובודדנו פאג' מנוזל מוחי ודם (איור 1ד).הפינוי המהיר הראשוני של הספרייה היה פחות בולט בהשוואה לפאג מסוג פרא.זמן מחצית החיים הממוצע של הספרייה המוזרקת בשתי החיות היה 24.8 דקות בדם, בדומה לפאג' מסוג פרא, ו-38.5 דקות ב-CSF.דגימות פאג דם ונוזל השדרה מכל חיה עברו HTS וכל הפפטידים שזוהו נותחו עבור נוכחות של מוטיב טריפפטיד קצר.מוטיבים טריפפטידים נבחרו מכיוון שהם מספקים בסיס מינימלי ליצירת מבנה ואינטראקציות פפטיד-חלבון14,15.מצאנו מתאם טוב בהתפלגות המוטיבים בין ספריית הפאג המוזרקת לבין שיבוטים המופקים מדם של שתי החיות (איור 1ה).הנתונים מצביעים על כך שהרכב הספרייה מועשר רק באופן שולי בתא הדם.תדרים של חומצות אמינו ורצפי קונצנזוס נותחו עוד בכל מיקום באמצעות התאמה של תוכנת Weblogo16.מעניין שמצאנו העשרה חזקה בשאריות גליצין בדם (איור 1g).כאשר הדם הושווה עם שיבוטים שנבחרו מ-CSF, נצפתה סלקציה חזקה וסלקציה מסוימת של מוטיבים (איור 1f), וחומצות אמינו מסוימות היו נוכחות באופן מועדף במיקומים שנקבעו מראש ב-12 האיברים (איור 1h).יש לציין שבעלי חיים בודדים היו שונים באופן משמעותי בנוזל השדרה, בעוד שהעשרת גליצין בדם נצפתה בשתי החיות (איור משלים. 4a-j).לאחר סינון קפדני של נתוני רצף בנוזל השדרה של בעלי חיים מס' 1.1 ו-#1.2, התקבלו סך של 964 ו-420 פפטידים 12-מר ייחודיים (איור משלים. 1d-e).שיבוטי הפאג' המבודדים הוגברו ועברו סבב שני של בחירה in vivo.פאג'ים שהופקו מסבב הבחירה השני הועברו ל-HTS בכל חיה וכל הפפטידים שזוהו שימשו כקלט לתוכנית זיהוי מוטיבים לניתוח התרחשותם של מוטיבים טריפפטידים (איור 2a, b, ef).בהשוואה למחזור הראשון של הפאג שהתאושש מ-CSF, צפינו בבחירה ובביטול של מוטיבים רבים ב-CSF בענפים A ו-B (איור 2).אלגוריתם זיהוי רשת הוחל כדי לקבוע אם הם מייצגים דפוסים שונים של רצף עקבי.דמיון ברור נצפה בין הרצפים בני 12 הממדים ששוחזרו על ידי CSF בקלייד A חלופי (איור 2c, d) ו-Clade B (איור 2g, h).הניתוח המצטבר בכל ענף גילה פרופילי בחירה שונים לפפטידים 12-מר (איור משלים. 5c,d) ועלייה ביחס CSF/טיטר דם לאורך זמן עבור שיבוטים מאוחדים לאחר סבב הבחירה השני בהשוואה לסבב הראשון של הבחירה (איור משלים. 5e).).
העשרה של מוטיבים ופפטידים בנוזל השדרה על ידי שני סבבים רצופים של בחירת פאג תפקודי in vivo.
כל הפאג'ים של נוזל השדרה שהתאוששו מהסיבוב הראשון של כל חיה (חיות #1.1 ו-#1.2) אספו, הוגברו, עברו רצף HT והוזרקו יחד (2 x 1010 פאגים/חיה) 2 חולדות SM עם צינוריות (#1.1 → #).2.1 ו-2.2, 1.2 → 2.3 ו-2.4).(a,b,e,f) תרשימי פיזור מתאם המשווים את התדירות היחסית של מוטיבים טריפפטידים של כל הפאג'ים שמקורם ב-CSF בסבב הבחירה הראשון והשני.תדירות והפצה יחסית של מוטיבים המייצגים את כל הטריפפטידים החופפים האפשריים שנמצאו בפפטידים בשני הכיוונים.מוצג מספר המוטיבים שנמצאו ב-1000 קריאות.מוטיבים שנבחרו או לא נכללו באופן מובהק (p < 0.001) באחת מהספריות שהשוו, מודגשים בנקודות אדומות.(c, d, g, h) ייצוג לוגו רצף של כל הרצפים הארוכים של 12 חומצות אמינו עשירות ב-CSF המבוסס על סיבובים 2 ו-1 של בחירת in vivo.גודל הקוד בן אות אחת מציין באיזו תדירות חומצת אמינו זו מופיעה במיקום זה.כדי לייצג את הלוגו, משווים את התדירות של רצפי CSF שחולצו מבעלי חיים בודדים בין שני סבבי בחירה והרצפים המועשרים בסיבוב השני מוצגים: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ו-(h) #1.2–#2.4.חומצות האמינו המועשרות ביותר במיקום נתון בבעלי חיים (ג, ד) מס.2.1 ולא.2.2 או (ג, ח) בבעלי חיים מס'.2.3 ולא.2.4 מוצגים בצבע.ירוק = קוטבי, סגול = ניטרלי, כחול = בסיסי, אדום = חומצי ושחור = חומצות אמינו הידרופוביות.
לאחר סבב הבחירה השלישי, זיהינו 124 רצפי פפטידים ייחודיים (#3.1 ו-#3.2) מ-332 שיבוטים של פאג'ים משוחזרים ב-CSF שבודדו משתי בעלי חיים (איור משלים 6a).לרצף LGSVS (18.7%) היה השיעור היחסי הגבוה ביותר, ואחריו התוספים מסוג פרא PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) ו-SARGSWREIVSLS (2.2%).בסיבוב הרביעי האחרון, אספנו שני ענפים שנבחרו באופן עצמאי משלוש חיות נפרדות (איור 1c).מתוך 925 שיבוטי הפאג' ברצף שהתאוששו מ-CSF, בסיבוב הרביעי מצאנו 64 רצפי פפטידים ייחודיים (איור משלים 6b), ביניהם השיעור היחסי של פאג' מסוג פראי ירד ל-0.8%.שיבוטי CSF הנפוצים ביותר בסיבוב הרביעי היו LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ו-RLSVDSDLSGC (3, 2%).%)).טווח האורך של הפפטידים שנבחרו נובע מהחדרות/מחיקות של נוקלאוטידים או קודוני עצירה מוקדמים בפריימרים של הספרייה בעת שימוש בקודונים מנוונים לעיצוב ספריית NNK.קודוני עצירה מוקדמים יוצרים פפטידים קצרים יותר ונבחרים מכיוון שהם מכילים את מוטיב ה-aa המועדף.פפטידים ארוכים יותר עשויים לנבוע מהחדרות/מחיקות בפריימרים של הספריות הסינתטיות.זה מציב את קודון העצירה המעוצב מחוץ למסגרת וקורא אותו עד שיופיע קודון עצירה חדש במורד הזרם.באופן כללי, חישבנו גורמי העשרה עבור כל ארבעת סבבי הבחירה על ידי השוואת נתוני הקלט עם נתוני הפלט לדוגמה.עבור סבב ההקרנה הראשון, השתמשנו בטיטרים של פאג'ים מסוג פרא כהתייחסות רקע לא ספציפית.מעניין לציין כי בחירת פאג'ים שלילית הייתה חזקה מאוד במחזור ה-CSF הראשון, אך לא בדם (איור 3a), מה שעשוי לנבוע מהסבירות הנמוכה של דיפוזיה פסיבית של רוב חברי ספריית הפפטידים לתוך תא ה-CSF, או שפאגים קרובים נוטים להישמר או להסיר מזרם הדם בצורה יעילה יותר מאשר בקטריופאג'ים.עם זאת, בסבב השני של ה-panning, נצפתה בחירה חזקה של פאגים ב-CSF בשני הקלידים, מה שמצביע על כך שהסבב הקודם היה מועשר בפאג'ים המציגים פפטידים המקדמים ספיגת CSF (איור 3a).שוב, ללא העשרת דם משמעותית.גם בסבב השלישי והרביעי, שיבוטי הפאג' הועשרו באופן משמעותי ב-CSF.בהשוואת התדירות היחסית של כל רצף פפטיד ייחודי בין שני סבבי הבחירה האחרונים, מצאנו שהרצפים הועשרו עוד יותר בסבב הבחירה הרביעי (איור 3ב).סך של 931 מוטיבים טריפפטידים חולצו מכל 64 רצפי הפפטידים הייחודיים תוך שימוש בשתי כיווני הפפטידים.המוטיבים המועשרים ביותר בסיבוב הרביעי נבדקו מקרוב יותר עבור פרופילי ההעשרה שלהם בכל הסבבים בהשוואה לספרייה שהוזרקה (חתך: 10% העשרה) (איור משלים 6c).דפוסי בחירה כלליים הראו שרוב המניעים שנחקרו הועשרו בכל הסבבים הקודמים של שני ענפי הבחירה.עם זאת, מוטיבים מסוימים (כגון SGL, VSG, LGS GSV) היו בעיקר מ-Clade A חלופי, בעוד שאחרים (למשל FGW, RTN, WGF, NTR) הועשרו ב-Clade B חלופי.
אימות של הובלת CSF של פפטידים מועשרים בפאג'ים המוצגים ב-CSF ופפטידים מנהיגים ביוטיניליים המצומדים למטעני streptavidin.
(א) יחסי העשרה מחושבים בכל ארבעת הסבבים (R1-R4) בהתבסס על טיטרים של פאג (PFU) שהוזרקו (קלט = I) וטיטרי פאג CSF שנקבעו (תפוקה = O).מקדמי העשרה עבור שלושת הסבבים האחרונים (R2-R4) חושבו בהשוואה לסבב הקודם ולסיבוב הראשון (R1) עם נתוני משקל.סורגים פתוחים הם נוזל מוחי, סורגים מוצלים הם פלזמה.(***p<0.001, מבוסס על מבחן t של הסטודנט).(ב) רשימה של פפטידי הפאג'ים הנפוצים ביותר, מדורגים לפי היחס היחסי שלהם לכל הפאג'ים שנאספו ב-CSF לאחר סבב 4 של הבחירה.ששת שיבוטי הפאג' הנפוצים ביותר מודגשים בצבע, ממוספרים וגורמי ההעשרה שלהם בין סבבים 3 ו-4 של הבחירה (הוספות).(ג, ד) ששת שיבוטי הפאג' המועשרים ביותר, ספריות הפאג' הפאג' הריקות וספריות הפאג' ההורה מסבב 4 נותחו בנפרד במודל דגימת CSF.דגימות CSF ודם נאספו בנקודות הזמן המצוינות.(ג) כמויות שוות של 6 שיבוטי פאג'ים מועמדים (2 x 1010 פאגים/בעלי חיים), פאגים ריקים (#1779) (2 x 1010 פאגים/בעלי חיים) וספריות פדג'ים מלאי פאג'ים (2 x 1012 פאגים/בעלי חיים) הזרקו לפחות 3 ס"מ הניתנים בזרבובית של החיה.מוצגת הפרמקוקינטיקה של CSF של כל שיבוט פאג וספריית פפטיד פאג המוזרקת לאורך זמן.(ד) מציג את יחס CSF/דם הממוצע עבור כל הפאג'ים/מ"ל שהתאוששו לאורך זמן הדגימה.(ה) ארבעה פפטידים מובילים סינתטיים ובקרה מקושקשת אחת נקשרו עם ביוטין ל-streptavidin דרך ה-N-terminus שלהם (תצוגת טטרמרים) ולאחר מכן הזרקה (וריד זנב iv, 10 מ"ג סטרפטאווידין/ק"ג).לפחות שלוש חולדות שעברו אינטובציה (N = 3).).דגימות CSF נאספו בנקודות הזמן המצוינות וריכוזי streptavidin נמדדו על ידי CSF anti-streptavidin ELISA (nd = לא זוהה).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, מבוסס על מבחן ANOVA).(ו) השוואה של רצף חומצות האמינו של שיבוט הפאג' פפטיד המועשר ביותר מס' 2002 (סגול) עם שיבוטים אחרים של פפטיד פאג'ים נבחרים מהסבב הרביעי של הבחירה.שברי חומצות אמינו זהים ודומים מקודדים בצבע.
מבין כל הפאג'ים המועשרים בסיבוב הרביעי (איור 3b), נבחרו שישה שיבוטים מועמדים לניתוח פרטני נוסף במודל הדגימה של CSF.כמויות שוות של שישה ספריות פאג מועמד, פאג ריק (ללא הוספה) וספריות פפטידים פרופג הוזרקו לשלוש חיות CM עם צינוריות, והפרמקוקינטיקה נקבעה במבחני CSF (איור 3c) ודם (איור משלים. 7).כל שיבוטי הפאג שנבדקו התמקדו בתא CSF ברמה הגבוהה פי 10-1000 מזו של פאג הבקרה הריק (#1779).לדוגמה, לשכפולים מס' 2020 ו-#2077 היו טיטרי CSF גבוהים פי 1000 מ-Page Control.הפרופיל הפרמקוקינטי של כל פפטיד שנבחר שונה, אך לכולם יש יכולת בות CSF גבוהה.ראינו ירידה מתמדת לאורך זמן עבור שיבוטים מס' 1903 ו-#2011, בעוד שבשיבוטים מס' 2077, מס' 2002 ו-#2009 עלייה במהלך 10 הדקות הראשונות עשויה להצביע על הובלה פעילה אך יש לאמת.שיבוטים #2020, #2002 ו-#2077 התייצבו ברמות גבוהות, בעוד שריכוז ה-CSF של שיבוט #2009 ירד באיטיות לאחר העלייה הראשונית.לאחר מכן השווינו את התדירות היחסית של כל מועמד CSF עם ריכוז הדם שלו (איור 3ד).המתאם של הטיטר הממוצע של כל מועמד CSF עם טיטר הדם שלו בכל זמני הדגימה הראה ששלושה מתוך ששת המועמדים היו מועשרים משמעותית ב-CSF בדם.באופן מעניין, שיבוט מס' 2077 הראה יציבות דם גבוהה יותר (איור משלים 7).כדי לאשר שהפפטידים עצמם מסוגלים להעביר באופן פעיל מטען שאינו חלקיקי פאג לתוך תא ה-CSF, סנתזנו ארבעה פפטידים מנהיגים המופקים עם ביוטין בקצה ה-N שבו הפפטידים מתחברים לחלקיק הפאג'.פפטידים ביוטינילטים (מס' 2002, 2009, 2020 ו-2077) היו מצומדים עם streptavidin (SA) כדי להשיג צורות מולטימריות המחקות במידת מה את גיאומטריית הפאג'.פורמט זה גם אפשר לנו למדוד את החשיפה ל-SA בדם ובנוזל השדרה כפפטידים חלבוניים המעבירים מטען.חשוב לציין, לעתים קרובות ניתן היה לשחזר נתוני פאג כאשר פפטידים סינתטיים ניתנו בפורמט מצומד SA (איור 3ה).לפפטידים המעורפלים הייתה פחות חשיפה ראשונית ופינוי מהיר יותר של CSF עם רמות בלתי ניתנות לזיהוי תוך 48 שעות.כדי לקבל תובנה לגבי מסלולי האספקה ​​של שיבוטי הפאג'ים הללו לחלל ה-CSF, ניתחנו את הלוקליזציה של פגיעות פדג'יות בודדות באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) כדי לזהות ישירות חלקיקי פאג שעה אחת לאחר הזרקה תוך ורידית in vivo.ניתן לציין שיבוטים מס' 2002, מס' 2077 ו-#2009 יכלו להתגלות על ידי צביעה חזקה בנימי המוח, בעוד שפאג בקרה (#1779) ושיבוט מס' 2020 לא זוהו (איור משלים 8).זה מצביע על כך שפפטידים אלו תורמים להשפעה על המוח בדיוק על ידי חציית ה-BBB.נדרש ניתוח מפורט נוסף כדי לבדוק השערה זו, מכיוון שמסלול ה-BSCFB עשוי להיות מעורב גם כן.כאשר השוו את רצף חומצות האמינו של המשובט המועשר ביותר (#2002) עם פפטידים נבחרים אחרים, צוין שלחלקם יש הרחבות חומצות אמינו דומות, מה שעשוי להעיד על מנגנון הובלה דומה (איור 3ו).
בשל פרופיל הפלזמה הייחודי שלו והעלייה המשמעותית ב-CSF לאורך זמן, שיבוט הצגת הפאג מס' 2077 נחקר עוד יותר על פני תקופה ארוכה יותר של 48 שעות והצליח לשחזר את העלייה המהירה ב-CSF שנצפה בקשר עם רמות SA מתמשכות (איור 4א).לגבי שיבוטים אחרים של פאג'ים מזוהים, #2077 צובע חזק עבור נימי מוח והראה קולקליזציה משמעותית עם לקטין סמן נימי כאשר נצפה ברזולוציה גבוהה יותר ואולי קצת צביעה בחלל הפרנכימלי (איור 4ב).כדי לחקור האם ניתן להשיג השפעות תרופתיות בתיווך פפטיד ב-CNS, ביצענו ניסוי שבו גרסאות ביוטיניל של i) פפטיד המעבר מס' 2077 ו-ii) הפפטיד מעכב BACE1 היו מעורבבים עם SA בשני יחסים שונים.עבור שילוב אחד השתמשנו רק במעכב הפפטיד BACE1 ובשני השתמשנו ביחס של 1:3 של מעכב פפטיד BACE1 לפפטיד #2077.שתי הדגימות ניתנו תוך ורידי ורמות בדם ונוזל השדרה של בטא עמילואיד פפטיד 40 (Abeta40) נמדדו לאורך זמן.Abeta40 נמדד ב-CSF מכיוון שהוא משקף עיכוב BACE1 בפרנכימה המוחית.כצפוי, שני הקומפלקסים הפחיתו משמעותית את רמות Abeta40 בדם (איור 4ג, ד).עם זאת, רק דגימות המכילות תערובת של פפטיד מס.2077 ומעכב של הפפטיד BACE1 המצומד ל-SA גרמו לירידה משמעותית ב-Abeta40 בנוזל השדרה (איור 4c).הנתונים מראים כי פפטיד מס.2077 מסוגל להעביר את חלבון ה-SA של 60 kDa לתוך מערכת העצבים המרכזית וגם משרה השפעות תרופתיות עם מעכבי SA-מצומדים של הפפטיד BACE1.
(א) הזרקה משובטית (2 × 10 פאגים/חיה) של פאג T7 המציגה פרופילים פרמקוקינטיים ארוכי טווח של פפטיד CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) ופאג בקרה לא מוזרק (#1779) בלפחות שלוש חולדות שעברו אינטובציה ב-CM.(ב) תמונה מיקרוסקופית קונפוקלית של כלי קליפת מוח מייצגים בחולדות שהוזרקו בפאג' (2 × 10 10 פאגים/חיה) המציגה צביעה נגדית של פפטיד מס' 2077 וכלי דם (לקטין).שיבוטי הפאג' הללו ניתנו ל-3 חולדות והורשו להסתובב במשך שעה אחת לפני הזילוף.מוחות נחתכו ונצבעו בנוגדנים פוליקלונליים המסומנים ב-FITC נגד קפסיד הפאג T7.עשר דקות לפני הזילוף והקיבוע שלאחר מכן, לקטין המסומן DyLight594 ניתן לווריד.תמונות פלורסנט המציגות צביעת לקטין (אדום) של הצד הלומינלי של מיקרו-כלים ופאג'ים (ירוק) בלומן של נימים ורקמת המוח הפריווסקולרית.סרגל קנה המידה מתאים ל-10 מיקרומטר.(ג, ד) פפטיד מעכב BACE1 ביוטיניל לבד או בשילוב עם פפטיד מעבר ביוטיניל מס' 2077 הוצמד ל-streptavidin ואחריו הזרקה תוך ורידית של לפחות שלוש חולדות CM עם צינוריות (10 מ"ג streptavidin/ק"ג).הפחתה בתיווך מעכבי פפטיד BACE1 ב-Aβ40 נמדדה על ידי Aβ1-40 ELISA בדם (אדום) ובנוזל מוחי (כתום) בנקודות הזמן המצוינות.לבהירות טובה יותר, קו מקווקו מצויר על הגרף בקנה מידה של 100%.(ג) הפחתה באחוזים ב-Aβ40 בדם (משולשים אדומים) ובנוזל השדרה (משולשים כתומים) בחולדות שטופלו ב-streptavidin המצומד ל-Transit peptide #2077 ו-BACE1 inhibitory peptide ביחס של 3:1.(ד) הפחתה באחוזים בדם Aβ40 (עיגולים אדומים) ובנוזל השדרה (עיגולים כתומים) של חולדות שטופלו ב-streptavidin בשילוב עם פפטיד מעכב BACE1 בלבד.ריכוז Aβ בביקורת היה 420 pg/ml (סטיית תקן = 101 pg/ml).
תצוגת פאגים יושמה בהצלחה במספר תחומים של מחקר ביו-רפואי17.שיטה זו שימשה למחקרי גיוון כלי דם in vivo18,19 וכן למחקרים המכוונים לכלי מוח 20,21,22,23,24,25,26.במחקר זה, הרחבנו את היישום של שיטת בחירה זו לא רק לזיהוי ישיר של פפטידים המכוונים לכלי מוח, אלא גם לגילוי של מועמדים בעלי תכונות הובלה אקטיביות לחצות את מחסום הדם-מוח.כעת אנו מתארים את הפיתוח של הליך בחירה in vivo בחולדות שעברו אינטובציה CM ומדגים את הפוטנציאל שלו לזהות פפטידים עם תכונות ביות CSF.באמצעות הפאג T7 המציג ספרייה של פפטידים אקראיים של 12 מרים, הצלחנו להדגים שהפאג T7 קטן מספיק (בקירוב 60 ננומטר בקוטר)10 כדי להיות מותאם למחסום הדם-מוח, ובכך לחצות ישירות את מחסום הדם-מוח או מקלעת הכורואיד.ראינו שקצירת CSF מחולדות CM עם צינוריות הייתה שיטת סקר תפקודית in vivo מבוקרת היטב, וכי הפאג המופק לא רק נקשר לכלי הדם אלא גם תפקד כטרנספורטר על פני מחסום הדם-מוח.יתר על כן, על ידי איסוף דם בו-זמנית והחלת HTS על CSF ופאג'ים שמקורם בדם, אישרנו שהבחירה שלנו ב-CSF לא הושפעה מהעשרת דם או כושר התרחבות בין סבבי הבחירה.עם זאת, תא הדם הוא חלק מהליך הבחירה, שכן פאגים המסוגלים להגיע לתא ה-CSF חייבים לשרוד ולהסתובב בזרם הדם מספיק זמן כדי להעשיר את עצמם במוח.על מנת לחלץ מידע רצף מהימן מנתוני HTS גולמיים, הטמענו מסננים המותאמים לשגיאות רצף ספציפיות לפלטפורמה בזרימת העבודה של הניתוח.על ידי שילוב פרמטרים קינטיים בשיטת ההקרנה, אישרנו את הפרמקוקינטיקה המהירה של פאג'ים מסוג T7 (t½ ~ 28 דקות) בדם 24, 27, 28 וכן קבענו את זמן מחצית החיים שלהם בנוזל השדרה (t½ ~ 26 דקות) לדקה).למרות פרופילים פרמקוקינטיים דומים בדם וב-CSF, ניתן היה לזהות רק 0.001% מריכוז הפאג' בדם ב-CSF, מה שמעיד על ניידות רקע נמוכה של פאג מסוג T7 על פני מחסום הדם-מוח.עבודה זו מדגישה את החשיבות של סבב הבחירה הראשון בעת ​​שימוש באסטרטגיות פאן in vivo, במיוחד עבור מערכות פאג'ים שמתנקות במהירות מהמחזור, מכיוון שמעט שיבוטים מסוגלים להגיע לתא CNS.לפיכך, בסיבוב הראשון, ההפחתה בגיוון הספרייה הייתה גדולה מאוד, מכיוון שרק מספר מצומצם של שיבוטים נאסף בסופו של דבר במודל CSF קפדני מאוד זה.אסטרטגיית צילום ב-vivo זו כללה מספר שלבי בחירה כגון הצטברות פעילה בתא ה-CSF, הישרדות שיבוטים בתא הדם והסרה מהירה של שיבוטי פאג T7 מהדם בתוך 10 הדקות הראשונות (איור 1ד ואיור משלים 4M).).לפיכך, לאחר הסיבוב הראשון, זוהו שיבוטי פאג'ים שונים ב-CSF, אם כי אותו מאגר ראשוני שימש עבור בעלי חיים בודדים.זה מצביע על כך שמספר שלבי בחירה קפדניים עבור ספריות מקור עם מספר גדול של חברי ספרייה מביאים להפחתה משמעותית בגיוון.לכן, אירועים אקראיים יהפכו לחלק בלתי נפרד מתהליך הבחירה הראשוני, וישפיעו רבות על התוצאה.סביר להניח שלרבים מהשיבוטים בספרייה המקורית הייתה נטייה דומה מאוד להעשרת CSF.עם זאת, אפילו באותם תנאי ניסוי, תוצאות הבחירה עשויות להיות שונות בשל המספר הקטן של כל שיבוט מסוים במאגר הראשוני.
המוטיבים המועשרים ב-CSF שונים מאלה שבדם.מעניין לציין את המעבר הראשון לעבר פפטידים עשירים בגליצין בדם של בעלי חיים בודדים.(איור 1g, איורים משלימים 4ה, 4ו).פאג' המכיל גליצין פפטידים עשוי להיות יציב יותר ופחות סביר שיוציאו מהמחזור.עם זאת, הפפטידים העשירים בגליצין לא זוהו בדגימות נוזל המוח, מה שמרמז על כך שהספריות שנאספו עברו שני שלבי בחירה שונים: אחד בדם ואחר הורשה להצטבר בנוזל השדרה.שיבוטים מועשרים ב-CSF שנוצרו מסבב הבחירה הרביעי נבדקו בהרחבה.כמעט כל השיבוטים שנבדקו בנפרד אושרו כמועשרים ב-CSF בהשוואה לפאג בקרה ריק.פגע פפטיד אחד (#2077) נבדק ביתר פירוט.זה הראה זמן מחצית חיים פלזמה ארוך יותר בהשוואה להיטים אחרים (איור 3d ואיור משלים 7), ומעניין, הפפטיד הזה הכיל שארית ציסטאין בקצה ה-C.לאחרונה הוכח שתוספת של ציסטאין לפפטידים יכולה לשפר את התכונות הפרמקוקינטיות שלהם על ידי קשירה לאלבומין 29 .זה לא ידוע כרגע עבור פפטיד #2077 ודורש מחקר נוסף.כמה פפטידים הראו תלות ערכיות בהעשרת CSF (נתונים לא מוצגים), אשר עשויה להיות קשורה לגיאומטריית פני השטח המוצגת של קפסיד T7.מערכת T7 בה השתמשנו הראתה 5-15 עותקים של כל פפטיד לכל חלקיק פאג'.IHC בוצע על שיבוטים מועמדים של פאג עופרת שהוזרקו תוך ורידי לקליפת המוח של חולדות (איור משלים. 8).הנתונים הראו שלפחות שלושה שיבוטים (מס' 2002, מס' 2009 ומספר 2077) קיימו אינטראקציה עם BBB.נותר לקבוע אם אינטראקציה זו של BBB גורמת להצטברות של CSF או לתנועה של שיבוטים אלה ישירות ל-BCSFB.חשוב לציין, אנו מראים שהפפטידים שנבחרו שומרים על יכולת הובלת CSF שלהם כאשר הם מסונתזים ונקשרים למטען החלבון.קשירה של פפטידים ביוטיניליים N-טרמינליים ל-SA חוזרת למעשה על התוצאות שהושגו עם שיבוטי הפאג' שלהם בדם ובנוזל השדרה (איור 3ה).לבסוף, אנו מראים כי פפטיד מוביל מס' 2077 מסוגל לקדם את פעולת המוח של מעכב פפטיד ביוטיניל של BACE1 המצומד ל-SA, וגורם להשפעות פרמקודינמיות בולטות ב-CNS על ידי הפחתה משמעותית של רמות Abeta40 ב-CSF (איור 4).לא הצלחנו לזהות הומולוגיות כלשהן במסד הנתונים על ידי ביצוע חיפוש הומולוגיה של רצף פפטיד של כל ההתאמות.חשוב לציין שגודל ספריית ה-T7 הוא בערך 109, בעוד שגודל הספרייה התיאורטי עבור 12-מרים הוא 4 x 1015. לכן, בחרנו רק חלק קטן ממרחב המגוון של ספריית הפפטידים של 12-מר, מה שעשוי לומר שניתן לזהות פפטידים אופטימליים יותר של רצפי ההיט המזוהים הללו על ידי הערכת רצף סמוך.באופן היפותטי, אחת הסיבות לכך שלא מצאנו הומולוגים טבעיים של פפטידים אלה עשויה להיות ביטול הבחירה במהלך האבולוציה כדי למנוע כניסה בלתי מבוקרת של מוטיבים פפטידים מסוימים למוח.
יחד, התוצאות שלנו מספקות בסיס לעבודה עתידית לזיהוי ואפיון מערכות התחבורה של המחסום המוחי-וסקולרי in vivo ביתר פירוט.ההגדרה הבסיסית של שיטה זו מבוססת על אסטרטגיית בחירה פונקציונלית שלא רק מזהה שיבוטים בעלי תכונות מחייבות כלי דם מוחיים, אלא גם כוללת שלב קריטי שבו לשבטים מוצלחים יש פעילות פנימית לחצות מחסומים ביולוגיים in vivo לתוך תא CNS.הוא להבהיר את מנגנון ההובלה של פפטידים אלה והעדפתם לקישור למיקרו-וסקולטור הספציפי לאזור המוח.זה עשוי להוביל לגילוי של מסלולים חדשים להובלת ה-BBB והקולטנים.אנו מצפים שהפפטידים שזוהו יכולים להיקשר ישירות לקולטנים מוחיים או לליגנדים במחזור המועברים דרך BBB או BCSFB.וקטורי הפפטיד עם פעילות הובלה של CSF שהתגלו בעבודה זו ייחקרו עוד יותר.אנו חוקרים כעת את הספציפיות המוחית של פפטידים אלה עבור יכולתם לחצות את BBB ו/או BCSFB.הפפטידים החדשים הללו יהיו כלים בעלי ערך רב לגילוי פוטנציאלי של קולטנים או מסלולים חדשים ולפיתוח של פלטפורמות יעילות במיוחד לאספקת מקרומולקולות, כגון תרופות ביולוגיות, למוח.
צור את הבור הגדול (CM) באמצעות שינוי של השיטה שתוארה קודם לכן.חולדות Wistar מורדמות (200-350 גרם) הותקנו על מנגנון סטריאוטקסי ובוצע חתך חציוני על הקרקפת המגולחת והערוכה בצורה אספפטית כדי לחשוף את הגולגולת.קדחו שני חורים באזור האבנט העליון והדקו את ברגי הקיבוע בחורים.חור נוסף נקדח בפסגה הצדדית של העורף להנחיה סטריאוטקטית של צינורית נירוסטה לתוך ה-CM.יש למרוח מלט דנטלי מסביב לצינורית ולהדק באמצעות ברגים.לאחר ריפוי צילום והתקשות מלט, פצע העור נסגר עם תפר סופרמיד 4/0.מיקום נכון של הצינורית מאושרת על ידי דליפה ספונטנית של נוזל מוחי (CSF).הסר את החולדה מהמנגנון הסטריאוטקסי, קבל טיפול מתאים לאחר ניתוח וטיפול בכאב, ואפשר לה להתאושש לפחות שבוע עד שנצפו סימני דם בנוזל השדרה.חולדות ויסטאר (Crl:WI/Han) הושגו מנהר צ'ארלס (צרפת).כל החולדות הוחזקו בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים.כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי המשרד הווטרינרי של העיר באזל, שוויץ, ובוצעו בהתאם לרישיון בעלי חיים מס' 2474 (הערכה של הובלת מוח פעילה על ידי מדידת רמות של מועמדים טיפוליים בנוזל השדרה המוחי ובמוח של חולדה).
שמור בעדינות את החולדה בהכרה עם צינורית CM ביד.הסר Datura מהצינורית ואסוף 10 μl של נוזל מוחי שזורם באופן ספונטני.מכיוון שבסופו של דבר פגישות הצינורית נפגעה, רק דגימות של נוזל מוחי שדרתי שקופות ללא עדות לזיהום דם או שינוי צבע נכללו במחקר זה.במקביל, כ-10-20 μl של דם נלקחו מחתך קטן בקצה הזנב לתוך צינורות עם הפרין (Sigma-Aldrich).CSF ודם נאספו בנקודות זמן שונות לאחר הזרקה תוך ורידית של פאג T7.בערך 5-10 μl של נוזל הושלך לפני כל דגימת CSF נאספה, התואם את הנפח המת של הצנתר.
ספריות נוצרו באמצעות וקטור T7Select 10-3b כמתואר במדריך למערכת T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).בקצרה, הוספת DNA אקראית של 12 מרים סונתזה בפורמט הבא:
קודון NNK שימש כדי למנוע קודונים עצירה כפולה וביטוי יתר של חומצות אמינו בהכנס.N הוא יחס אקווימולרי מעורב ידני של כל נוקלאוטיד, ו-K הוא יחס אקווימולרי מעורב ידני של נוקלאוטידים אדנין וציטוזין.אזורים בעלי גדילים בודדים הומרו ל-DNA כפול על ידי דגירה נוספת עם אנזים dNTP (Novagen) ואנזים Klenow (New England Biolabs) במאגר Klenow (New England Biolabs) למשך 3 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.לאחר התגובה, DNA דו-גדילי אוחזר על ידי משקעי EtOH.ה-DNA שהתקבל עוכל עם אנזימי ההגבלה EcoRI ו-HindIII (שניהם מ-Roche).התוספת המפוצלת והמטוהרת (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) נקשרה לאחר מכן בתוך המסגרת לתוך וקטור T7 מבוקע מראש לאחר חומצת אמינו 348 של הגן קפסיד 10B.תגובות קשירה הודגרו ב-16 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות לפני האריזה במבחנה.אריזת הפאג במבחנה בוצעה על פי ההוראות המסופקות עם ערכת השיבוט T7Select 10-3b (Novagen) ותמיסת האריזה הוגברה פעם אחת עד לתמוגה באמצעות Escherichia coli (BLT5615, Novagen).הליסאטים עברו צנטריפוגה, טיטרציה והוקפאו ב-80 מעלות צלזיוס כתמיסת מניות של גליצרול.
הגברה ישירה של PCR של אזורי פאג' משתנים המוגברים במרק או בצלחת באמצעות פריימרים היתוך קנייניים של 454/Roche-amplicon.פריימר היתוך קדימה מכיל רצפים שמאגפים את האזור המשתנה (NNK) 12 (ספציפי לתבנית), מתאם GS FLX Titanium A ורצף מפתחות ספרייה של ארבעה בסיסים (TCAG) (איור משלים 1a):
פריימר היתוך הפוך מכיל גם ביוטין המחובר לחרוזים ללכידת ואת מתאם GS FLX Titanium B הנדרש להגברה משובטית במהלך PCR תחליב:
לאחר מכן, האמפליקונים עברו 454/Roche pyrosequencing לפי פרוטוקול 454 GS-FLX Titanium.עבור ריצוף ידני של Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ה-DNA הפאג T7 הוגבר על ידי PCR ורצף עם צמדי הפריימרים הבאים:
תוספות מפלאקים בודדים הועברו להגברת PCR באמצעות ערכת Roche Fast Start DNA Polymerase (לפי הוראות היצרן).בצע התחלה חמה (10 דקות ב-95 מעלות צלזיוס) ו-35 מחזורי חיזוק (50 שניות ב-95 מעלות צלזיוס, דקה אחת ב-50 מעלות צלזיוס ודקה אחת ב-72 מעלות צלזיוס).
פאג מספריות, פאג מסוג פרא, פאג שניצל מ-CSF ודם, או שיבוטים בודדים הוגברו ב-Escherichia coli BL5615 במרק שחפת (Sigma Aldrich) או בכלים של 500 ס"מ (Thermo Scientific) למשך 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.הפאג' חולצו מהצלחות על ידי שטיפת הצלחות עם חיץ Tris-EDTA (Fluka Analytical) או על ידי איסוף הפלאק עם קצות פיפטה סטריליות.הפאג' בודדו מסופרנטנט תרבית או ממאגר מיצוי עם סיבוב אחד של משקעים של פוליאתילן גליקול (PEG 8000) (Promega) והוקפאו מחדש במאגר Tris-EDTA.
הפאג המוגבר עבר 2-3 סבבים של הסרת אנדוטוקסין באמצעות חרוזים להסרת אנדוטוקסין (Miltenyi Biotec) לפני הזרקה תוך ורידית (IV) (500 μl/חיה).בסיבוב הראשון הוצגו 2×1012 פאג'ים;בשני, 2×1010 פאגים;בסבב הבחירה השלישי והרביעי, 2×109 פאגים לכל חיה.תכולת הפאג' ב-CSF ובדגימות דם שנאספו בנקודות הזמן המצוינות נקבעה על ידי ספירת פלאק לפי הוראות היצרן (מדריך למערכת T7Select).בחירת הפאז' בוצעה על ידי הזרקה תוך ורידי של ספריות מטוהרות לווריד הזנב או על ידי הזרקה חוזרת של פאג' המופק מ-CSF מסבב הבחירה הקודם, והקצירים הבאים בוצעו לאחר 10 דקות, 30 דקות, 60 דקות, 90 דקות, 120 דקות, 180 דקות ודגימות CSF ו-240 דקות בהתאמה.סה"כ נערכו ארבעה סבבים של panning in vivo שבהם שני הענפים שנבחרו אוחסנו ונותחו בנפרד במהלך שלושת סבבי הבחירה הראשונים.כל תוספי הפאג שהופקו מ-CSF משני סבבי הבחירה הראשונים עברו 454/Roche pyrosequencing, בעוד שכל השיבוטים שחולצו מ-CSF משני סבבי הבחירה האחרונים עברו רצף ידני.כל פגי הדם מהסבב הראשון של הבחירה עברו גם 454/Roche pyrosequencing.להזרקת שיבוטים של פאג'ים, פאגים נבחרים הוגברו ב-E. coli (BL5615) על צלחות של 500 ס"מ ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.שיבוטים שנבחרו בנפרד וברצף ידני הופצו במדיום שחפת.לאחר מיצוי פאג'ים, טיהור והסרה של אנדוטוקסין (כמתואר לעיל), הוזרקו 2×1010 פאגים/חיה ב-300 μl לווריד לווריד זנב אחד.
עיבוד מקדים וסינון איכותי של נתוני רצף.נתוני 454/Roche גולמיים הומרו מפורמט מפת זרם סטנדרטי בינארי (sff) לפורמט קריא אנושי של Pearson (fasta) באמצעות תוכנת הספק.עיבוד נוסף של רצף הנוקלאוטידים בוצע באמצעות תוכניות C קנייניות וסקריפטים (חבילת תוכנה שלא פורסמה) כמתואר להלן.ניתוח הנתונים העיקריים כולל נהלי סינון רב-שלביים קפדניים.כדי לסנן קריאות שלא הכילו רצף DNA תקף של 12mer, הקריאות יושרו ברצף לתווית התחלה (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), תווית עצירה (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) והכנסת רקע (CCCTGCAGGGAATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) באמצעות מבחן Needleman-Wunsch העולמי.יישור המאפשר עד 2 אי עקביות לכל יישור31.לכן, קריאה ללא תגי התחלה ועצירה וקריאות המכילות תוספות רקע, כלומר יישורים החורגים מהמספר המותר של אי-התאמה, הוסרו מהספרייה.באשר לקריאות הנותרות, רצף ה-N-mer DNA המשתרע מסימון ההתחלה ומסתיים לפני סימן העצירה נכרת מרצף הקריאה המקורי ועובד בהמשך (להלן "הוספה").לאחר תרגום ההוספה, החלק שאחרי קודון העצירה הראשון בקצה 5′ של הפריימר מוסר מההוספה.בנוסף, נוקלאוטידים המובילים לקודונים לא שלמים בקצה 3′ של הפריימר הוסרו גם הם.כדי לא לכלול תוספות המכילות רק רצפי רקע, הוסרו גם תוספות מתורגמות שמתחילות בדפוס חומצות האמינו "PAG".פפטידים עם אורך שלאחר תרגום של פחות מ-3 חומצות אמינו הוסרו מהספרייה.לבסוף, הסר יתירות במאגר ההוספה וקבע את התדירות של כל הוספה ייחודית.התוצאות של ניתוח זה כללו רשימה של רצפי נוקלאוטידים (תוספות) והתדרים (הקריאה) שלהם (איורים משלימים 1c ו-2).
קבץ הוספת N-mer DNA לפי דמיון ברצף: כדי לחסל שגיאות רצף ספציפיות ל-454/Roche (כגון בעיות ברצף הרחבות הומפולימרים) ולהסיר יתירות פחות חשובות, תוספות רצף N-mer שסוננו בעבר (תוספות) ממוינות לפי דמיון.הוספות (עד 2 בסיסים לא תואמים מותרים) באמצעות אלגוריתם איטרטיבי המוגדר באופן הבא: הוספות ממוינות תחילה לפי התדירות שלהן (מהגבוהה לנמוכה), ואם הן זהות, לפי המיון המשני שלהן לפי אורך (מהארוך לקצר) ).לפיכך, ההוספות השכיחות והארוכות ביותר מגדירות את ה"קבוצה" הראשונה.תדר הקבוצה מוגדר לתדר המפתח.לאחר מכן, כל הוספה שנותרה ברשימה הממוינת נוסתה להתווסף לקבוצה על ידי יישור Nedleman-Wunsch בזוגיות.אם מספר חוסר ההתאמות, ההוספות או המחיקות ביישור אינו עולה על סף של 2, הוספה מתווספת לקבוצה, ותדירות הקבוצה הכוללת גדלה לפי התדירות שבה הוספה ההכנסה.תוספות שנוספו לקבוצה מסומנות כמשמשות ואינן נכללות בעיבוד נוסף.אם לא ניתן להוסיף את רצף ההוספה לקבוצה שכבר קיימת, רצף ההוספה משמש ליצירת קבוצה חדשה בתדירות ההוספה המתאימה ומסומן כמשמש.האיטרציה מסתיימת כאשר כל רצף הוספה שימש ליצירת קבוצה חדשה או שניתן לכלול אותה בקבוצה שכבר קיימת.אחרי הכל, תוספות מקובצות המורכבות מנוקלאוטידים מתורגמות בסופו של דבר לרצפי פפטידים (ספריות פפטידים).התוצאה של ניתוח זה היא קבוצה של הוספות והתדרים התואמים שלהן המרכיבים את מספר הקריאות הרצופות (איור משלים 2).
יצירת מוטיבים: בהתבסס על רשימה של פפטידים ייחודיים, נוצרה ספרייה המכילה את כל דפוסי חומצות האמינו האפשריות (aa) כפי שמוצג להלן.כל דפוס אפשרי באורך 3 חולץ מהפפטיד והתבנית ההפוכה שלו נוספה יחד עם ספריית מוטיבים משותפת המכילה את כל הדפוסים (טריפפטידים).ספריות של מוטיבים שחוזרים על עצמם רוכזו והיתירות הוסרה.לאחר מכן, עבור כל טריפפטיד בספריית המוטיבים, בדקנו את נוכחותו בספרייה באמצעות כלים חישוביים.במקרה זה, התדירות של הפפטיד המכיל את הטריפפטיד המוטיב המצוי מתווספת ומוקצה למוטיב בספריית המוטיבים ("מספר המוטיבים").התוצאה של יצירת המוטיבים היא מערך דו מימדי המכיל את כל המופעים של טריפפטידים (מוטיבים) והערכים שלהם, שהם מספר קריאות הרצף שמביאות למוטיב המקביל כאשר הקריאות מסוננים, מקובצים ומתורגמים.מדדים כמתואר בפירוט למעלה.
נורמליזציה של מספר המוטיבים ותבניות הפיזור המתאימות: מספר המוטיבים עבור כל דגימה נורמלו באמצעות
כאשר ni הוא מספר הקריאות המכילות נושא i.לפיכך, vi מייצג את אחוז התדירות של קריאות (או פפטידים) המכילים מוטיב i במדגם.ערכי P עבור המספר הלא מנורמל של מוטיבים חושבו באמצעות המבחן המדויק של פישר.לגבי קורלוגרמות של מספר המניעים, המתאמים של ספירמן חושבו באמצעות המספר המנורמל של המניעים עם R.
כדי להמחיש את התוכן של חומצות אמינו בכל מיקום בספריית הפפטידים, נוצרו לוגוגרמות אינטרנט 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).ראשית, התוכן של חומצות אמינו בכל מיקום של הפפטיד 12-mer מאוחסן במטריקס של 20×12.לאחר מכן, קבוצה של 1000 פפטידים המכילה את אותה תכולת חומצות אמינו בכל עמדה נוצרת בפורמט של רצף מהיר ומסופקת כקלט ל-web-logo 3, אשר יוצר ייצוג גרפי של תכולת חומצות האמינו היחסית בכל מיקום.עבור ספריית פפטידים נתונה.כדי להמחיש מערכי נתונים רב מימדיים, מפות חום נוצרו באמצעות כלי שפותח פנימי ב-R (biosHeatmap, חבילת R שטרם שוחררה).הדנדרוגרמות המוצגות במפות החום חושבו באמצעות שיטת האשכולות ההיררכית של וורד עם מדד המרחק האוקלידי.לניתוח סטטיסטי של נתוני ניקוד המוטיב, ערכי P עבור ניקוד לא מנורמל חושבו באמצעות המבחן המדויק של פישר.ערכי P עבור מערכי נתונים אחרים חושבו ב-R באמצעות מבחן t של Student או ANOVA.
שיבוטים ופאג'ים נבחרים ללא תוספות הוזרקו לווריד דרך וריד הזנב (2×1010 פאגים/חיה ב-300 μl PBS).עשר דקות לפני הזילוף והקיבוע שלאחר מכן, לאותן החיות הוזרקו לווריד 100 μl של לקטין המסומן DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 דקות לאחר הזרקת הפאג, חולדות הוזרמו דרך הלב עם 50 מ"ל PBS ואחריו 50 מ"ל 4% PFA/PBS.דגימות מוח נקבעו בנוסף ללילה ב-4% PFA/PBS והושרו ב-30% סוכרוז למשך הלילה ב-4°C.הדגימות מוקפאות במהירות בתערובת ה-OCT.אנליזה אימונוהיסטוכימית של דגימות קפואות בוצעה בטמפרטורת החדר בחתכים של 30 מיקרומטר חסומים ב-1% BSA והודגרו עם נוגדנים פולקלונליים המסומנים ב-FITC נגד פאג T7 (Novus NB 600-376A) ב-4 מעלות צלזיוס.דגירה לילה.לבסוף, החתכים נשטפו 3 פעמים עם PBS ונבדקו במיקרוסקופ לייזר קונפוקאלי (Leica TCS SP5).
כל הפפטידים עם טוהר מינימלי של 98% סונתזו על ידי GenScript USA, עברו ביוטיניל והופכו בליופילציה.ביוטין נקשר באמצעות מרווח גליצין משולש נוסף בקצה ה-N.בדוק את כל הפפטידים באמצעות ספקטרומטריית מסה.
Streptavidin (Sigma S0677) מעורבב עם עודף שווה-מולרי פי 5 של פפטיד ביוטיניל, פפטיד מעכב BACE1 ביו-טיניל, או שילוב (יחס 3:1) של פפטיד מעכב BACE1 ביו-טיניל ופפטיד מעכב BACE1 ב-5-10% PSOBS/10.שעה אחת בטמפרטורת החדר לפני ההזרקה.פפטידים מצומדים ל-Streptavidin הוזרקו לווריד במינון של 10 מ"ג/ק"ג לאחד מוורידי הזנב של חולדות עם חלל מוחי.
הריכוז של קומפלקסים של streptavidin-peptide הוערך על ידי ELISA.צלחות מיקרוטיטר Nunc Maxisorp (Sigma) צופו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם 1.5 מיקרוגרם/מ"ל עכבר נוגדן אנטי-streptavidin (Thermo, MA1-20011).לאחר חסימה (חיץ חוסם: 140 ננומטר NaCL, 5 מ"מ EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ג'לטין, 1% BSA) בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, שטפו את הצלחת עם 0.05% Tween-20/PBS (חיץ כביסה) למשך 3 שניות, נוספו דגימות CSF חוסמות היטב, CSF ו-0ma חוסם היטב: CSF 0,0ma דגימות חיץ 0. SF 1:115).לאחר מכן הצלחת הודגרה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם נוגדן זיהוי (1 מיקרוגרם/מ"ל, אנטי-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).לאחר שלושה שלבי שטיפה, סטרפטווידין זוהה על ידי דגירה בתמיסת מצע TMB (Roche) למשך עד 20 דקות.לאחר הפסקת פיתוח הצבע עם 1M H2SO4, מדוד את הספיגה ב-450 ננומטר.
התפקוד של קומפלקס מעכבי streptavidin-peptide-BACE1 הוערך על ידי Aβ(1-40) ELISA לפי פרוטוקול היצרן (Wako, 294-64701).בקצרה, דגימות CSF דוללו בדילול סטנדרטי (1:23) והודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בצלחות של 96 בארים מצופות נוגדן לכידת BNT77.לאחר חמישה שלבי כביסה, הוסף נוגדן BA27 מצומד ב-HRP והודגרה במשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן חמישה שלבי כביסה.Aβ(1-40) זוהה על ידי דגירה בתמיסת TMB למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר שפיתוח הצבע הופסק עם תמיסת עצור, מדוד את הספיגה ב-450 ננומטר.דגימות פלזמה עברו מיצוי פאזה מוצקה לפני Aβ(1-40) ELISA.פלזמה נוספה ל-0.2% DEA (Sigma) בצלחות 96-בארים והודגרה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.לאחר שטיפת צלחות SPE ברציפות (Oasis, 186000679) במים וב-100% מתנול, נוספו דגימות פלזמה לצלחות SPE וכל הנוזל הוסר.דגימות נשטפו (תחילה עם 5% מתנול ואז 30% מתנול) ונחטפו עם 2% NH4OH/90% מתנול.לאחר ייבוש ה-eluate ב-55°C למשך 99 דקות בזרם N2 קבוע, הדגימות הופחתו במדללים סטנדרטיים ו-Aβ(1-40) נמדד כמתואר לעיל.
כיצד לצטט מאמר זה: Urich, E. et al.משלוח מטען למוח באמצעות פפטידים מעבר שזוהו in vivo.המדע.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ו-Moos T. משלוח תרופות מקרומולקולריות למוח באמצעות טיפול ממוקד.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., and Martinez-Martinez, P. משלוח של תרופות פפטידים וחלבונים על פני מחסום הדם-מוח.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM מחסום הדם-מוח: צוואר בקבוק בפיתוח תרופות במוח.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, ובירד, A. סיכויים לשיפור מתן תרופות ומיקוד למוח דרך מסלול מקלעת ה-choroid plexus-CSF.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM מודרניזציה של ביו-פרמצבטיקה עם סוסים טרויאניים מולקולריים לאספקת מוח.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
פארדרידג', הובלה של פפטיד בתיווך קולטן WM על פני מחסום הדם-מוח.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.הגבר את חדירת המוח ואת היעילות של נוגדנים טיפוליים באמצעות מעבורות מולקולריות חד ערכיות.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.הובלה של קולטן טרנספרין (TfR) קובעת את קליטת המוח של גרסאות זיקה של נוגדני TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).