Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używasz przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS. Aby zapewnić najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Ponadto, aby zapewnić ciągłą obsługę, wyświetlamy witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Wyświetla karuzelę trzech slajdów jednocześnie. Użyj przycisków Poprzedni i Następny, aby przewijać trzy slajdy naraz, lub przycisków suwaka na końcu, aby przewijać trzy slajdy naraz.
Bariera krew-mózg i bariera krew-mózg uniemożliwiają środkom bioterapeutycznym dotarcie do ich celów w ośrodkowym układzie nerwowym, utrudniając tym samym skuteczne leczenie chorób neurologicznych. Aby odkryć nowe transportery mózgowe in vivo, wprowadziliśmy bibliotekę peptydów fagowych T7 i seryjnie pobieraliśmy krew i płyn mózgowo-rdzeniowy (PMR) za pomocą kaniulowanego modelu dużej puli świadomych szczurów. Specyficzne klony fagowe były silnie wzbogacone w PMR po czterech rundach selekcji. Testowanie poszczególnych kandydackich peptydów wykazało ponad 1000-krotne wzbogacenie w PMR. Bioaktywność pośredniczonego peptydem dostarczania do mózgu została potwierdzona 40% redukcją poziomu β-amyloidu w płynie mózgowo-rdzeniowym za pomocą inhibitora peptydu BACE1 sprzężonego ze zidentyfikowanym nowym peptydem tranzytowym. Wyniki te wskazują, że peptydy zidentyfikowane metodą selekcji fagów in vivo mogą być użytecznymi nośnikami do systemowego dostarczania makrocząsteczek do mózgu, wykazując działanie terapeutyczne.
Badania nad terapią celowaną ośrodkowego układu nerwowego (OUN) koncentrowały się głównie na identyfikacji zoptymalizowanych leków i substancji czynnych, które wykazują właściwości ukierunkowane na OUN, a mniej na odkrywaniu mechanizmów odpowiedzialnych za aktywne dostarczanie leków do mózgu. Sytuacja ta zaczyna się zmieniać, ponieważ dostarczanie leków, zwłaszcza dużych cząsteczek, stanowi integralną część rozwoju nowoczesnych leków neuronaukowych. Środowisko OUN jest dobrze chronione przez system barier naczyniowo-mózgowych, składający się z bariery krew-mózg (BBB) ​​i bariery krew-mózg (BCBB)1, co utrudnia dostarczanie leków do mózgu1,2. Szacuje się, że niemal wszystkie leki wielkocząsteczkowe i ponad 98% leków małocząsteczkowych jest eliminowanych z mózgu3. Dlatego niezwykle ważne jest zidentyfikowanie nowych systemów transportu mózgowego, które zapewnią efektywne i specyficzne dostarczanie leków terapeutycznych do OUN4,5. Jednak BBB i BCSFB stwarzają również doskonałą możliwość dostarczania leków, ponieważ przenikają i wnikają do wszystkich struktur mózgu poprzez jego rozległe naczynia krwionośne. Zatem obecne wysiłki mające na celu wykorzystanie nieinwazyjnych metod dostarczania leków do mózgu opierają się w dużej mierze na mechanizmie transportu receptorowego (PMT) z wykorzystaniem endogennego receptora BBB6. Pomimo ostatnich kluczowych postępów w wykorzystaniu szlaku receptora transferyny7,8, konieczny jest dalszy rozwój nowych systemów dostarczania leków o ulepszonych właściwościach. W tym celu naszym celem była identyfikacja peptydów zdolnych do pośredniczenia w transporcie płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), ponieważ mogłyby one w zasadzie być wykorzystane do dostarczania makrocząsteczek do ośrodkowego układu nerwowego lub do otwierania nowych szlaków receptorowych. W szczególności, specyficzne receptory i transportery układu naczyniowo-mózgowego (BBB i BSCFB) mogą służyć jako potencjalne cele dla aktywnego i specyficznego dostarczania leków bioterapeutycznych. Płyn mózgowo-rdzeniowy (PMR) jest produktem wydzielniczym splotu naczyniówkowego (CS) i pozostaje w bezpośrednim kontakcie z płynem śródmiąższowym mózgu poprzez przestrzeń podpajęczynówkową i komorową4. Ostatnio wykazano, że płyn podpajęczynówkowy mózgowo-rdzeniowy nadmiernie dyfunduje do śródmiąższu mózgu9. Mamy nadzieję na dostęp do przestrzeni miąższowej za pomocą tej podpajęczynówkowej drogi napływu lub bezpośrednio przez BBB. Aby to osiągnąć, wdrożyliśmy solidną strategię selekcji fagów in vivo, która idealnie identyfikuje peptydy transportowane przez jedną z tych dwóch odrębnych ścieżek.
Opisujemy sekwencyjną metodę przesiewową ekspozycji fagowej in vivo z pobieraniem próbek płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR) połączoną z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (HTS) w celu monitorowania początkowych rund selekcji o największej różnorodności bibliotek. Przesiew przeprowadzono na przytomnych szczurach z trwale wszczepioną kaniulą do dużej cysterny (CM), aby uniknąć zanieczyszczenia krwi. Co ważne, to podejście pozwala na selekcję zarówno peptydów ukierunkowanych na mózg, jak i peptydów o aktywności transportowej przez barierę naczyniowo-mózgową. Użyliśmy fagów T7 ze względu na ich niewielki rozmiar (~60 nm)10 i zasugerowaliśmy, że nadają się one do transportu pęcherzyków, które umożliwiają transkomórkowe przekraczanie bariery śródbłonkowej i/lub nabłonkowo-rdzeniowej. Po czterech rundach przesiewu wyizolowano populacje fagów wykazujące silne wzbogacenie płynu mózgowo-rdzeniowego in vivo i asocjację z mikronaczyniami mózgowymi. Co ważne, udało nam się potwierdzić nasze odkrycia, wykazując, że preferowane i chemicznie syntetyzowane peptydy będące najlepszymi kandydatami są zdolne do transportu ładunku białkowego do płynu mózgowo-rdzeniowego. Po pierwsze, wykazano farmakodynamiczne działanie OUN poprzez połączenie wiodącego peptydu transportowego z inhibitorem peptydu BACE1. Oprócz wykazania, że ​​strategie badań przesiewowych in vivo pozwalają na identyfikację nowych peptydów transportowych w mózgu jako skutecznych nośników ładunku białkowego, spodziewamy się, że podobne podejścia do selekcji funkcjonalnej również nabiorą znaczenia w identyfikacji nowych szlaków transportu w mózgu.
Na podstawie jednostek tworzących łysinki (PFU), po etapie pakowania fagów, zaprojektowano i stworzono bibliotekę losowych 12-merowych liniowych peptydów fagowych T7 o zróżnicowaniu około 109 (patrz Materiały i metody). Należy zauważyć, że bibliotekę tę dokładnie przeanalizowaliśmy przed przeprowadzeniem selekcji in vivo. Amplifikacja PCR próbek biblioteki fagowej z użyciem zmodyfikowanych starterów wygenerowała amplikony, które były bezpośrednio adekwatne do HTS (Rys. uzupełniający 1a). Ze względu na a) błędy sekwencjonowania HTS11, b) wpływ na jakość starterów (NNK)1-12 oraz c) obecność faga dzikiego typu (wt) (wstawki szkieletowe) w bibliotece rezerwowej, wdrożono procedurę filtrowania sekwencji w celu wyodrębnienia wyłącznie zweryfikowanych informacji o sekwencji (Rys. uzupełniający 1b). Te kroki filtrowania mają zastosowanie do wszystkich bibliotek sekwencjonowania HTS. W przypadku biblioteki standardowej uzyskano łącznie 233 868 odczytów, z których 39% spełniło kryteria filtrowania i zostało wykorzystanych do analizy biblioteki oraz selekcji w kolejnych rundach (Rysunek uzupełniający 1c–e). Odczyty były przeważnie wielokrotnościami długości 3 par zasad, ze szczytem przy 36 nukleotydach (Rysunek uzupełniający 1c), co potwierdza projekt biblioteki (NNK) 1-12. Co godne uwagi, około 11% członków biblioteki zawierało 12-wymiarową wstawkę PAGISRELVDKL szkieletu dzikiego typu (wt), a prawie połowa sekwencji (49%) zawierała insercje lub delecje. Analiza HTS biblioteki potwierdziła dużą różnorodność peptydów w bibliotece: ponad 81% sekwencji peptydowych znaleziono tylko raz, a tylko 1,5% wystąpiło w ≥4 kopiach (Rysunek uzupełniający 2a). Częstotliwości aminokwasów (aa) we wszystkich 12 pozycjach w repertuarze dobrze korelowały z częstościami oczekiwanymi dla liczby kodonów generowanych przez zdegenerowany repertuar NKK (Rys. uzupełniający 2b). Obserwowana częstość reszt aminokwasowych kodowanych przez te inserty dobrze korelowała z częstością obliczoną (r = 0,893) (Rys. uzupełniający 2c). Przygotowanie bibliotek fagowych do iniekcji obejmuje etapy amplifikacji i usunięcia endotoksyny. Wykazano wcześniej, że potencjalnie zmniejsza to różnorodność bibliotek fagowych12,13. Dlatego też zsekwencjonowaliśmy bibliotekę fagową amplifikowaną na płytce, która przeszła proces usuwania endotoksyny i porównaliśmy ją z oryginalną biblioteką w celu oszacowania częstości AA. Zaobserwowano silną korelację (r = 0,995) między oryginalną pulą a pulą amplifikowaną i oczyszczoną (Rys. uzupełniający 2d), co wskazuje, że konkurencja między klonami amplifikowanymi na płytkach z użyciem faga T7 nie powodowała dużego odchylenia. Porównanie to opiera się na częstości występowania motywów tripeptydowych w każdej bibliotece, ponieważ różnorodności bibliotek (~109) nie można w pełni uchwycić nawet za pomocą HTS. Analiza częstości występowania aminokwasów w każdej pozycji ujawniła niewielkie odchylenie zależne od pozycji w trzech ostatnich pozycjach wprowadzonego repertuaru (rys. uzupełniający 2e). Podsumowując, doszliśmy do wniosku, że jakość i różnorodność biblioteki były akceptowalne, a zaobserwowano jedynie niewielkie zmiany w różnorodności wynikające z amplifikacji i przygotowania bibliotek fagowych pomiędzy kolejnymi rundami selekcji.
Pobieranie seryjnych próbek płynu mózgowo-rdzeniowego można wykonać poprzez chirurgiczne wszczepienie kaniuli do żyły głównej dolnej (CM) przytomnych szczurów, aby ułatwić identyfikację faga T7 wstrzykniętego dożylnie (iv) przez BBB i/lub BCSFB (ryc. 1a-b). W pierwszych trzech rundach selekcji in vivo użyliśmy dwóch niezależnych ramion selekcji (ramion A i B) (ryc. 1c). Stopniowo zwiększaliśmy rygorystyczność selekcji, zmniejszając całkowitą ilość faga wprowadzonego w pierwszych trzech rundach selekcji. W czwartej rundzie przeszukiwania połączyliśmy próbki z gałęzi A i B i przeprowadziliśmy trzy dodatkowe niezależne selekcje. Aby zbadać właściwości in vivo cząstek faga T7 w tym modelu, faga dzikiego typu (wstawka główna PAGISRELVDKL) wstrzyknięto szczurom do żyły ogonowej. Odzyskiwanie fagów z płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi w różnych punktach czasowych wykazało, że stosunkowo małe fagi ikozaedryczne T7 miały szybką początkową fazę klirensu z przedziału krwi (Rys. uzupełniający 3). Na podstawie podanych miana i objętości krwi szczurów obliczyliśmy, że tylko około 1% masy faga z podanej dawki zostało wykryte we krwi 10 minut po wstrzyknięciu dożylnym. Po tym początkowym szybkim spadku, zmierzono wolniejszy klirens pierwotny z okresem półtrwania wynoszącym 27,7 minuty. Co ważne, tylko bardzo niewiele fagów zostało odzyskanych z przedziału płynu mózgowo-rdzeniowego, co wskazuje na niskie tło migracji fagów typu dzikiego do przedziału płynu mózgowo-rdzeniowego (Rys. uzupełniający 3). Średnio, w całym okresie pobierania próbek (0-250 min) wykryto tylko około 1 x 10-3% miana faga T7 we krwi i 4 x 10-8% początkowo podanych fagów. Co istotne, okres półtrwania (25,7 min) faga dzikiego typu w płynie mózgowo-rdzeniowym był podobny do obserwowanego we krwi. Dane te dowodzą, że bariera oddzielająca płyn mózgowo-rdzeniowy od krwi jest nienaruszona u szczurów z kaniulą CM, co umożliwia selekcję bibliotek fagowych in vivo w celu identyfikacji klonów, które łatwo przenoszą się z krwi do płynu mózgowo-rdzeniowego.
(a) Przygotowanie metody ponownego pobierania próbek płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR) z dużej puli. (b) Diagram przedstawiający lokalizację komórkową bariery ośrodkowego układu nerwowego (OUN) oraz strategię selekcji zastosowaną do identyfikacji peptydów przekraczających barierę krew-mózg (BBB) ​​i krew-mózg. (c) Schemat blokowy badania przesiewowego z wykorzystaniem ekspozycji fagowej in vivo. W każdej rundzie selekcji fagi (identyfikatory zwierząt wewnątrz strzałek) wstrzykiwano dożylnie. Dwie niezależne, alternatywne gałęzie (A, B) były przechowywane oddzielnie do czwartej rundy selekcji. W rundach 3 i 4, każdy klon faga wyekstrahowany z PMR został sekwencjonowany ręcznie. (d) Kinetyka faga wyizolowanego z krwi (czerwone kółka) i płynu mózgowo-rdzeniowego (zielone trójkąty) podczas pierwszej rundy selekcji u dwóch szczurów z kaniulą po dożylnym wstrzyknięciu biblioteki peptydów T7 (2 x 1012 fagów/zwierzę). Niebieskie kwadraty wskazują średnie początkowe stężenie faga we krwi, obliczone na podstawie ilości wstrzykniętego faga, biorąc pod uwagę całkowitą objętość krwi. Czarne kwadraty wskazują punkt przecięcia linii y ekstrapolowanej ze stężeń faga we krwi. (e, f) Przedstaw względną częstość i rozkład wszystkich możliwych nakładających się motywów tripeptydowych znalezionych w peptydzie. Przedstawiono liczbę motywów znalezionych w 1000 odczytach. Istotnie (p < 0,001) wzbogacone motywy oznaczono czerwonymi kropkami. (e) Wykres korelacji porównujący względną częstość występowania motywu tripeptydowego wstrzykniętej biblioteki z fagiem pochodzącym z krwi zwierząt nr 1.1 i 1.2. (f) Wykres korelacji porównujący względne częstości występowania motywów tripeptydowych fagów zwierzęcych nr 1.1 i 1.2 wyizolowanych z krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego. (g, h) Reprezentacja identyfikatora sekwencji faga wzbogaconego we krwi (g) w porównaniu z bibliotekami wstrzykniętymi oraz faga wzbogaconego w płynie mózgowo-rdzeniowym (h) w porównaniu z krwią po rundzie selekcji in vivo u obu zwierząt. Rozmiar jednoliterowego kodu wskazuje, jak często dany aminokwas występuje w danej pozycji. Zielony = polarny, fioletowy = obojętny, niebieski = zasadowy, czerwony = kwaśny i czarny = hydrofobowy aminokwas. Rysunek 1a, b został zaprojektowany i wykonany przez Eduarda Uricha.
Wstrzyknęliśmy bibliotekę peptydów fagowych dwóm szczurom z instrumentem CM (klady A i B) i wyizolowaliśmy faga z płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi (Rysunek 1d). Początkowe szybkie klirens biblioteki był mniej wyraźny w porównaniu z fagiem dzikiego typu. Średni okres półtrwania wstrzykniętej biblioteki u obu zwierząt wyniósł 24,8 minuty we krwi, podobnie jak w przypadku faga dzikiego typu, i 38,5 minuty w płynie mózgowo-rdzeniowym. Próbki fagów z krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego od każdego zwierzęcia poddano HTS, a wszystkie zidentyfikowane peptydy przeanalizowano pod kątem obecności krótkiego motywu tripeptydowego. Motywy tripeptydowe wybrano, ponieważ stanowią one minimalną podstawę do tworzenia struktury i interakcji peptyd-białko14,15. Stwierdziliśmy dobrą korelację w rozmieszczeniu motywów między wstrzykniętą biblioteką fagową a klonami wyekstrahowanymi z krwi obu zwierząt (Rysunek 1e). Dane wskazują, że skład biblioteki jest tylko nieznacznie wzbogacony w kompartmencie krwi. Częstotliwości aminokwasów i sekwencje konsensusowe analizowano dalej w każdej pozycji, wykorzystując adaptację oprogramowania Weblogo16. Co ciekawe, zaobserwowaliśmy silne wzbogacenie w reszty glicyny we krwi (ryc. 1g). Porównując krew z klonami wyselekcjonowanymi z płynu mózgowo-rdzeniowego, zaobserwowano silną selekcję i pewną deselekcję motywów (ryc. 1f), a niektóre aminokwasy były preferencyjnie obecne w predefiniowanych pozycjach w 12-członowym kodzie (ryc. 1h). Co istotne, poszczególne zwierzęta różniły się istotnie pod względem zawartości płynu mózgowo-rdzeniowego, podczas gdy wzbogacenie w glicynę we krwi zaobserwowano u obu zwierząt (Ryc. uzupełniająca 4a–j). Po rygorystycznej filtracji danych sekwencyjnych w płynie mózgowo-rdzeniowym zwierząt nr 1.1 i 1.2 uzyskano łącznie 964 i 420 unikalnych peptydów 12-merowych (Ryc. uzupełniająca 1d–e). Wyizolowane klony fagowe amplifikowano i poddano drugiej rundzie selekcji in vivo. Fagi wyekstrahowane z drugiej rundy selekcji poddano HTS u każdego zwierzęcia, a wszystkie zidentyfikowane peptydy wykorzystano jako dane wejściowe do programu rozpoznawania motywów w celu analizy występowania motywów tripeptydowych (rys. 2a, b, ef). W porównaniu z pierwszym cyklem faga odzyskanego z płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), zaobserwowaliśmy dalszą selekcję i deselekcję wielu motywów w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) w gałęziach A i B (rys. 2). Zastosowano algorytm identyfikacji sieci, aby określić, czy reprezentują one różne wzorce spójnej sekwencji. Zaobserwowano wyraźne podobieństwo między 12-wymiarowymi sekwencjami odzyskanymi przez płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) w alternatywnym kladzie A (rys. 2c, d) i kladzie B (rys. 2g, h). Połączona analiza w każdej gałęzi ujawniła różne profile selekcji dla peptydów 12-merowych (rys. uzupełniający 5c, d) i wzrost stosunku miana CSF/krwi w czasie dla połączonych klonów po drugiej rundzie selekcji w porównaniu z pierwszą rundą selekcji (rys. uzupełniający 5e). ).
Wzbogacanie motywów i peptydów w płynie mózgowo-rdzeniowym poprzez dwie kolejne rundy selekcji funkcjonalnej ekspozycji fagowej in vivo.
Wszystkie fagi płynu mózgowo-rdzeniowego odzyskane z pierwszej rundy każdego zwierzęcia (zwierzęta nr 1.1 i nr 1.2) zostały połączone, amplifikowane, sekwencjonowane HT i ponownie wstrzyknięte razem (2 x 1010 fagów/zwierzę) 2 szczurom z kaniulą SM (#1.1 → #). 2.1 i 2.2, 1.2 → 2.3 i 2.4). (a, b, e, f) Wykresy punktowe korelacji porównujące względną częstość motywów tripeptydowych wszystkich fagów pochodzących z płynu mózgowo-rdzeniowego w pierwszej i drugiej rundzie selekcji. Względna częstość i rozkład motywów reprezentujących wszystkie możliwe nakładające się tripeptydy znalezione w peptydach w obu orientacjach. Przedstawiono liczbę motywów znalezionych w 1000 odczytach. Motywy, które zostały istotnie (p < 0,001) wybrane lub wykluczone w jednej z porównywanych bibliotek, zaznaczono czerwonymi kropkami. (c, d, g, h) Reprezentacja logo sekwencji wszystkich bogatych w płyn mózgowo-rdzeniowy 12 aminokwasowych długich sekwencji w oparciu o rundy 2 i 1 selekcji in vivo. Rozmiar jednoliterowego kodu wskazuje, jak często dany aminokwas występuje w danej pozycji. Aby przedstawić logo, porównywana jest częstość sekwencji płynu mózgowo-rdzeniowego wyekstrahowanych od poszczególnych zwierząt pomiędzy dwiema rundami selekcji, a wzbogacone sekwencje w drugiej rundzie są pokazane: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 i (h) #1.2–#2.4. Najbardziej wzbogacone aminokwasy w danej pozycji u (c, d) zwierząt nr 2.1 i nr 2.2 lub (g, h) u zwierząt nr 2.3 i nr 2.4 są pokazane w kolorze. Zielony = polarny, fioletowy = obojętny, niebieski = zasadowy, czerwony = kwaśny i czarny = hydrofobowy aminokwasy.
Po trzeciej rundzie selekcji zidentyfikowaliśmy 124 unikalne sekwencje peptydowe (#3.1 i #3.2) z 332 klonów fagowych zrekonstruowanych w płynie mózgowo-rdzeniowym, wyizolowanych od dwóch zwierząt (Rys. uzupełniający 6a). Sekwencja LGSVS (18,7%) miała najwyższy względny udział, a następnie inserty typu dzikiego PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) i SARGSWREIVSLS (2,2%). W ostatniej, czwartej rundzie połączyliśmy dwie niezależnie wyselekcjonowane gałęzie od trzech różnych zwierząt (Rys. 1c). Spośród 925 zsekwencjonowanych klonów fagowych odzyskanych z płynu mózgowo-rdzeniowego, w czwartej rundzie znaleźliśmy 64 unikalne sekwencje peptydowe (Rys. uzupełniający 6b), wśród których względny udział fagów typu dzikiego spadł do 0,8%. Najczęstsze klony CSF w czwartej rundzie to LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) i RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). Zakres długości wybranych peptydów wynika z insercji/delecji nukleotydów lub przedwczesnych kodonów stop w starterach biblioteki przy użyciu zdegenerowanych kodonów do projektowania biblioteki NNK. Przedwczesne kodony stop generują krótsze peptydy i są wybierane, ponieważ zawierają korzystny motyw aminokwasów. Dłuższe peptydy mogą być wynikiem insercji/delecji w starterach bibliotek syntetycznych. To umieszcza zaprojektowany kodon stop poza ramką i odczytuje go, aż do pojawienia się nowego kodonu stop w dół. Ogólnie rzecz biorąc, obliczyliśmy współczynniki wzbogacenia dla wszystkich czterech rund selekcji, porównując dane wejściowe z danymi wyjściowymi próbki. W pierwszej rundzie przesiewu użyliśmy miana fagów dzikiego typu jako niespecyficznego odniesienia tła. Co ciekawe, negatywna selekcja fagów była bardzo silna w pierwszym cyklu płynu mózgowo-rdzeniowego, ale nie we krwi (ryc. 3a), co może wynikać z niskiego prawdopodobieństwa biernej dyfuzji większości członków biblioteki peptydów do przedziału płynu mózgowo-rdzeniowego lub pokrewne fagi mają tendencję do skuteczniejszego zatrzymywania lub usuwania z krwiobiegu niż bakteriofagi. Jednak w drugiej rundzie przeszukiwania, silna selekcja fagów w płynie mózgowo-rdzeniowym była obserwowana w obu kladach, co sugeruje, że poprzednia runda była wzbogacona w fagi prezentujące peptydy, które promują wychwyt płynu mózgowo-rdzeniowego (ryc. 3a). Ponownie, bez znaczącego wzbogacenia krwi. Również w trzeciej i czwartej rundzie klony fagów były znacząco wzbogacone w płynie mózgowo-rdzeniowym. Porównując względną częstość występowania każdej unikalnej sekwencji peptydowej pomiędzy dwiema ostatnimi rundami selekcji, stwierdziliśmy, że sekwencje były jeszcze bardziej wzbogacone w czwartej rundzie selekcji (ryc. 3b). Łącznie 931 motywów tripeptydowych zostało wyekstrahowanych ze wszystkich 64 unikalnych sekwencji peptydowych, przy użyciu obu orientacji peptydów. Najbardziej wzbogacone motywy w czwartej rundzie zostały dokładniej zbadane pod kątem ich profili wzbogacenia we wszystkich rundach w porównaniu z biblioteką wstrzykniętą (próg odcięcia: 10% wzbogacenia) (rys. uzupełniający 6c). Ogólne wzorce selekcji wykazały, że większość badanych motywów była wzbogacona we wszystkich poprzednich rundach obu gałęzi selekcji. Jednak niektóre motywy (np. SGL, VSG, LGS GSV) pochodziły głównie z alternatywnego kladu A, podczas gdy inne (np. FGW, RTN, WGF, NTR) były wzbogacone w alternatywnym kladzie B.
Walidacja transportu w płynie mózgowo-rdzeniowym wzbogaconych w płyn mózgowo-rdzeniowy peptydów eksponowanych na fagach oraz biotynylowanych peptydów liderowych sprzężonych z ładunkiem streptawidyny.
(a) Współczynniki wzbogacenia obliczone we wszystkich czterech rundach (R1-R4) na podstawie wstrzykniętych (wkład = I) mian faga (PFU) i określonych mian faga w płynie mózgowo-rdzeniowym (wyjście = O). Współczynniki wzbogacenia dla ostatnich trzech rund (R2-R4) obliczono poprzez porównanie z poprzednią rundą i pierwszą rundą (R1) z danymi wagowymi. Otwarte słupki oznaczają płyn mózgowo-rdzeniowy, zacienione słupki oznaczają osocze. (***p<0,001, na podstawie testu t-Studenta). (b) Lista najliczniejszych peptydów fagowych, uszeregowanych według ich względnego stosunku do wszystkich fagów zebranych w płynie mózgowo-rdzeniowym po 4. rundzie selekcji. Sześć najpowszechniejszych klonów fagowych wyróżniono kolorem, ponumerowano i podano ich współczynniki wzbogacenia pomiędzy rundami 3. i 4. selekcji (wstawki). (c,d) Sześć najbardziej wzbogaconych klonów fagowych, pustych fagów i bibliotek peptydów fagowych rodzicielskich z rundy 4 analizowano indywidualnie w modelu pobierania próbek płynu mózgowo-rdzeniowego. Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi pobrano we wskazanych punktach czasowych. (c) Równe ilości 6 kandydackich klonów fagowych (2 x 1010 fagów/zwierzę), pustych fagów (#1779) (2 x 1010 fagów/zwierzę) i bibliotek peptydów fagowych (2 x 1012 fagów/zwierzę) Wstrzyknąć co najmniej 3 CM do kaniulowanego zwierzęcia oddzielnie przez żyłę ogonową. Przedstawiono farmakokinetykę płynu mózgowo-rdzeniowego każdego wstrzykniętego klonu faga i biblioteki peptydów fagowych w czasie. (d) przedstawia średni stosunek płynu mózgowo-rdzeniowego do krwi dla wszystkich odzyskanych fagów/ml w czasie pobierania próbek. (e) Cztery syntetyczne peptydy liderowe i jeden wymieszany peptyd kontrolny połączono biotyną ze streptawidyną poprzez ich N-koniec (prezentacja tetrameru), a następnie wstrzyknięto (dożylnie do żyły ogonowej, 10 mg streptawidyny/kg). Co najmniej trzy zaintubowane szczury (N = 3). Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego pobrano we wskazanych punktach czasowych, a stężenia streptawidyny mierzono metodą ELISA anty-streptawidyna w płynie mózgowo-rdzeniowym (nd = nie wykryto). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, na podstawie testu ANOVA). (f) Porównanie sekwencji aminokwasowej najbardziej wzbogaconego klonu peptydu faga #2002 (fioletowy) z innymi wybranymi klonami peptydu faga z 4. rundy selekcji. Identyczne i podobne fragmenty aminokwasowe oznaczono kolorami.
Spośród wszystkich wzbogaconych fagów w czwartej rundzie (ryc. 3b) sześć klonów kandydujących wybrano do dalszej indywidualnej analizy w modelu pobierania próbek płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF). Trzem kaniulowatym zwierzętom CM wstrzyknięto równe ilości sześciu bibliotek fagów kandydujących, pustych fagów (bez insertu) i profagów, a farmakokinetykę określono w testach płynu mózgowo-rdzeniowego (ryc. 3c) i krwi (ryc. uzupełniająca 7). Wszystkie testowane klony fagów celowały w kompartment płynu mózgowo-rdzeniowego na poziomie 10–1000 razy wyższym niż pusty fag kontrolny (#1779). Na przykład klony #2020 i #2077 miały około 1000 razy wyższe miana w płynie mózgowo-rdzeniowym niż fag kontrolny. Profil farmakokinetyczny każdego wybranego peptydu jest inny, ale wszystkie z nich charakteryzują się wysoką zdolnością do namierzania płynu mózgowo-rdzeniowego. Zaobserwowaliśmy stały spadek stężenia w czasie dla klonów #1903 i #2011, podczas gdy w przypadku klonów #2077, #2002 i #2009 wzrost w ciągu pierwszych 10 minut może wskazywać na transport aktywny, ale wymaga to weryfikacji. Klony #2020, #2002 i #2077 ustabilizowały się na wysokim poziomie, podczas gdy stężenie w płynie mózgowo-rdzeniowym klonu #2009 powoli spadało po początkowym wzroście. Następnie porównaliśmy względną częstość występowania każdego kandydata w płynie mózgowo-rdzeniowym z jego stężeniem we krwi (ryc. 3d). Korelacja średniego miana każdego kandydata w płynie mózgowo-rdzeniowym z jego mianem we krwi we wszystkich momentach pobierania próbek wykazała, że ​​trzy z sześciu kandydatów były istotnie wzbogacone w płynie mózgowo-rdzeniowym. Co ciekawe, klon #2077 wykazał wyższą stabilność we krwi (Rysunek uzupełniający 7). Aby potwierdzić, że same peptydy są zdolne do aktywnego transportu ładunku innego niż cząsteczki faga do płynu mózgowo-rdzeniowego, zsyntetyzowaliśmy cztery peptydy liderowe derywatyzowane biotyną na N-końcu, w miejscu przyłączania peptydów do cząsteczki faga. Biotynylowane peptydy (nr 2002, 2009, 2020 i 2077) sprzężono ze streptawidyną (SA), uzyskując formy multimeryczne, w pewnym stopniu naśladujące geometrię faga. Ten format pozwolił nam również zmierzyć ekspozycję SA we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym jako peptydy białkowe transportujące ładunek. Co ważne, dane dotyczące fagów często można było odtworzyć, podając syntetyczne peptydy w tym formacie sprzężonym z SA (ryc. 3e). Peptydy o zmienionej strukturze charakteryzowały się mniejszą ekspozycją początkową i szybszym klirensem płynu mózgowo-rdzeniowego, z poziomami niewykrywalnymi w ciągu 48 godzin. Aby uzyskać wgląd w szlaki transportu tych klonów fagów peptydowych do płynu mózgowo-rdzeniowego, przeanalizowaliśmy lokalizację pojedynczych trafień peptydów fagowych za pomocą immunohistochemii (IHC) w celu bezpośredniego wykrycia cząstek faga 1 godzinę po dożylnym wstrzyknięciu in vivo. Co istotne, klony #2002, #2077 i #2009 można było wykryć za pomocą silnego barwienia w naczyniach włosowatych mózgu, podczas gdy fag kontrolny (#1779) i klon #2020 nie zostały wykryte (Rysunek uzupełniający 8). Sugeruje to, że peptydy te przyczyniają się do wpływu na mózg właśnie poprzez przekraczanie BBB. Wymagana jest dalsza szczegółowa analiza w celu sprawdzenia tej hipotezy, ponieważ szlak BSCFB może być również zaangażowany. Porównując sekwencję aminokwasów najbardziej wzbogaconego klonu (#2002) z innymi wybranymi peptydami, zauważono, że niektóre z nich mają podobne wydłużenia aminokwasów, co może wskazywać na podobny mechanizm transportu (Rys. 3f).
Ze względu na unikalny profil osocza i znaczący wzrost stężenia płynu mózgowo-rdzeniowego w czasie, klon #2077 z ekspozycją fagową był dalej badany przez dłuższy, 48-godzinny okres i był w stanie odtworzyć szybki wzrost stężenia płynu mózgowo-rdzeniowego obserwowany w połączeniu z utrzymującym się poziomem kwasu salicylowego (SA) (ryc. 4a). Wśród innych zidentyfikowanych klonów fagowych, #2077 silnie barwił się w naczyniach włosowatych mózgu i wykazywał istotną kolokalizację z markerem kapilarnym, lektyną, w wyższej rozdzielczości, a także prawdopodobnie pewne barwienie w przestrzeni miąższowej (ryc. 4b). Aby zbadać, czy możliwe jest uzyskanie efektów farmakologicznych zależnych od peptydów w ośrodkowym układzie nerwowym, przeprowadziliśmy eksperyment, w którym biotynylowane wersje i) peptydu tranzytowego #2077 i ii) peptydu inhibitora BACE1 zmieszano z SA w dwóch różnych proporcjach. W jednej kombinacji użyliśmy tylko inhibitora peptydu BACE1, a w drugiej inhibitora peptydu BACE1 w stosunku 1:3 do peptydu #2077. Obie próbki podano dożylnie, a następnie mierzono w czasie poziom peptydu beta-amyloidu 40 (Abeta40) we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym. Abeta40 mierzono w płynie mózgowo-rdzeniowym, ponieważ odzwierciedla on hamowanie BACE1 w miąższu mózgu. Zgodnie z oczekiwaniami, oba kompleksy znacząco obniżyły poziom Abeta40 we krwi (ryc. 4c, d). Jednak tylko próbki zawierające mieszaninę peptydu nr 2077 i inhibitora peptydu BACE1 sprzężonego z SA spowodowały istotny spadek poziomu Abeta40 w płynie mózgowo-rdzeniowym (ryc. 4c). Dane pokazują, że peptyd nr 2077 jest zdolny do transportu białka SA o masie cząsteczkowej 60 kDa do ośrodkowego układu nerwowego, a także wywołuje efekty farmakologiczne z inhibitorami peptydu BACE1 sprzężonymi z SA.
(a) Wstrzyknięcie klonalne (2 × 10 fagów/zwierzę) faga T7, prezentujące długoterminowe profile farmakokinetyczne peptydu CSF nr 2077 (RLSSVDSDLSGC) i niewstrzykniętego faga kontrolnego (#1779) u co najmniej trzech szczurów intubowanych metodą CM. (b) Obraz mikroskopowy konfokalny reprezentatywnych mikronaczyń korowych u szczurów, którym wstrzyknięto faga (2 × 10 10 fagów/zwierzę), ukazujący kontrastowe barwienie peptydu nr 2077 i naczyń (lektyny). Te klony fagowe podano 3 szczurom i pozostawiono do krążenia na 1 godzinę przed perfuzją. Mózgi pocięto na skrawki i zabarwiono poliklonalnymi przeciwciałami znakowanymi FITC przeciwko kapsydowi faga T7. Dziesięć minut przed perfuzją i późniejszym utrwaleniem podano dożylnie lektynę znakowaną DyLight594. Obrazy fluorescencyjne przedstawiające barwienie lektyną (kolor czerwony) strony światła mikronaczyń i fagów (kolor zielony) w świetle naczyń włosowatych i okołonaczyniowej tkanki mózgowej. Skala odpowiada 10 µm. (c, d) Biotynylowany peptyd hamujący BACE1, sam lub w połączeniu z biotynylowanym peptydem tranzytowym nr 2077, sprzężono ze streptawidyną, a następnie podano dożylnie co najmniej trzem szczurom CM z założonymi kaniulami (10 mg streptawidyny/kg). Redukcję Aβ40 za pośrednictwem inhibitora peptydu BACE1 mierzono metodą ELISA dla Aβ1-40 we krwi (kolor czerwony) i płynie mózgowo-rdzeniowym (kolor pomarańczowy) we wskazanych punktach czasowych. Dla lepszej przejrzystości na wykresie zaznaczono linię przerywaną w skali 100%. (c) Procentowa redukcja stężenia Aβ40 we krwi (czerwone trójkąty) i płynie mózgowo-rdzeniowym (pomarańczowe trójkąty) u szczurów leczonych streptawidyną sprzężoną z peptydem tranzytowym nr 2077 i peptydem hamującym BACE1 w stosunku 3:1. (d) Procentowa redukcja stężenia Aβ40 we krwi (czerwone kółka) i płynie mózgowo-rdzeniowym (pomarańczowe kółka) u szczurów leczonych wyłącznie streptawidyną sprzężoną z peptydem hamującym BACE1. Stężenie Aβ w grupie kontrolnej wynosiło 420 pg/ml (odchylenie standardowe = 101 pg/ml).
Ekspresja fagowa została z powodzeniem zastosowana w kilku obszarach badań biomedycznych17. Metodę tę wykorzystano w badaniach in vivo nad różnorodnością naczyń krwionośnych18,19, a także w badaniach ukierunkowanych na naczynia mózgowe20,21,22,23,24,25,26. W niniejszym badaniu rozszerzyliśmy zastosowanie tej metody selekcji nie tylko na bezpośrednią identyfikację peptydów ukierunkowanych na naczynia mózgowe, ale także na odkrycie kandydatów o właściwościach aktywnego transportu, zdolnych do przekraczania bariery krew-mózg. Obecnie opisujemy opracowanie procedury selekcji in vivo u intubowanych szczurów CM i wykazujemy jej potencjał do identyfikacji peptydów o właściwościach homingu w płynie mózgowo-rdzeniowym. Wykorzystując faga T7 eksponującego bibliotekę 12-merowych losowych peptydów, byliśmy w stanie wykazać, że fag T7 jest wystarczająco mały (średnica około 60 nm)10, aby zaadaptować się do bariery krew-mózg, a tym samym bezpośrednio przekroczyć barierę krew-mózg lub splot naczyniówkowy. Zaobserwowaliśmy, że pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) od kaniulowanych szczurów CM było dobrze kontrolowaną metodą badań przesiewowych in vivo, a wyekstrahowany fag nie tylko wiązał się z naczyniami krwionośnymi, ale także funkcjonował jako transporter przez barierę krew-mózg. Co więcej, poprzez jednoczesne pobranie krwi i zastosowanie HTS do płynu mózgowo-rdzeniowego i fagów pochodzących z krwi, potwierdziliśmy, że nasz wybór płynu mózgowo-rdzeniowego nie był uzależniony od wzbogacenia krwi ani zdolności do ekspansji pomiędzy rundami selekcji. Komora krwi jest jednak częścią procedury selekcji, ponieważ fagi zdolne do dotarcia do komory płynu mózgowo-rdzeniowego muszą przetrwać i krążyć w krwiobiegu wystarczająco długo, aby wzbogacić się w mózgu. Aby uzyskać wiarygodne informacje o sekwencji z surowych danych HTS, wdrożyliśmy filtry dostosowane do błędów sekwencjonowania specyficznych dla danej platformy w procesie analizy. Poprzez włączenie parametrów kinetycznych do metody przesiewowej, potwierdziliśmy szybką farmakokinetykę fagów T7 typu dzikiego (t½ ~ 28 min) we krwi24, 27, 28, a także określiliśmy ich okres półtrwania w płynie mózgowo-rdzeniowym (t½ ~ 26 min) na minutę). Pomimo podobnych profili farmakokinetycznych we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym, tylko 0,001% stężenia faga we krwi można było wykryć w płynie mózgowo-rdzeniowym, co wskazuje na niską mobilność tła faga T7 typu dzikiego przez barierę krew-mózg. Niniejsza praca podkreśla znaczenie pierwszej rundy selekcji przy stosowaniu strategii panningu in vivo, szczególnie w przypadku układów fagowych, które są szybko usuwane z krążenia, ponieważ niewiele klonów jest w stanie dotrzeć do kompartmentu OUN. Zatem w pierwszej rundzie redukcja różnorodności biblioteki była bardzo duża, ponieważ ostatecznie zebrano tylko ograniczoną liczbę klonów w tym bardzo rygorystycznym modelu płynu mózgowo-rdzeniowego. Ta strategia selekcji in vivo obejmowała kilka etapów selekcji, takich jak aktywna akumulacja w przedziale płynu mózgowo-rdzeniowego, przeżycie klonów w przedziale krwi i szybkie usuwanie klonów fagów T7 z krwi w ciągu pierwszych 10 minut (Rys. 1d i Rys. uzupełniający 4M). ). Tak więc, po pierwszej rundzie, zidentyfikowano różne klony fagów w płynie mózgowo-rdzeniowym, chociaż ta sama początkowa pula została użyta dla poszczególnych zwierząt. Sugeruje to, że wiele ścisłych etapów selekcji dla bibliotek źródłowych z dużą liczbą członków biblioteki skutkuje znaczną redukcją różnorodności. Dlatego zdarzenia losowe staną się integralną częścią początkowego procesu selekcji, znacząco wpływając na wynik. Jest prawdopodobne, że wiele klonów w oryginalnej bibliotece miało bardzo podobną skłonność do wzbogacania płynu mózgowo-rdzeniowego. Jednak nawet w tych samych warunkach eksperymentalnych wyniki selekcji mogą się różnić ze względu na małą liczbę każdego konkretnego klonu w początkowej puli.
Motywy wzbogacone w płynie mózgowo-rdzeniowym (PMR) różnią się od motywów we krwi. Co ciekawe, zaobserwowaliśmy pierwsze przesunięcie w kierunku peptydów bogatych w glicynę we krwi poszczególnych zwierząt (Ryc. 1g, Rys. uzupełniające 4e, 4f). Peptydy fagowe zawierające glicynę mogą być bardziej stabilne i rzadziej usuwane z krążenia. Jednakże, tych bogatych w glicynę peptydów nie wykryto w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego, co sugeruje, że wyselekcjonowane biblioteki przeszły dwa różne etapy selekcji: jeden we krwi, a drugi, w którym pozwolono im się gromadzić w płynie mózgowo-rdzeniowym. Klony wzbogacone w PMR powstałe w czwartej rundzie selekcji zostały gruntownie przetestowane. Potwierdzono, że prawie wszystkie indywidualnie testowane klony były wzbogacone w PMR w porównaniu z fagiem kontrolnym (ślepa próba). Jeden trafiony peptyd (#2077) został zbadany bardziej szczegółowo. Wykazywał dłuższy okres półtrwania w osoczu w porównaniu z innymi trafieniami (Rysunek 3d i Rysunek uzupełniający 7) i co ciekawe, ten peptyd zawierał resztę cysteiny na C-końcu. Niedawno wykazano, że dodanie cysteiny do peptydów może poprawić ich właściwości farmakokinetyczne poprzez wiązanie się z albuminą 29. Obecnie nie jest to znane w przypadku peptydu #2077 i wymaga dalszych badań. Niektóre peptydy wykazywały zależność walencji od wzbogacenia płynu mózgowo-rdzeniowego (dane nieprzedstawione), co może być związane z prezentowaną geometrią powierzchni kapsydu T7. System T7, którego używaliśmy, wykazywał 5-15 kopii każdego peptydu na cząsteczkę faga. IHC przeprowadzono na kandydackich klonach faga wiodącego wstrzykniętych dożylnie do kory mózgowej szczurów (Rysunek uzupełniający 8). Dane wykazały, że co najmniej trzy klony (nr 2002, nr 2009 i nr 2077) oddziaływały z BBB. Pozostaje do ustalenia, czy ta interakcja BBB skutkuje akumulacją płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), czy też przemieszczaniem się tych klonów bezpośrednio do BCSFB. Co ważne, wykazaliśmy, że wybrane peptydy zachowują swoją zdolność transportu w CSF po syntezie i związaniu z białkiem. Wiązanie N-końcowych biotynylowanych peptydów z SA zasadniczo powtarza wyniki uzyskane z odpowiednimi klonami fagowymi we krwi i płynie mózgowo-rdzeniowym (ryc. 3e). Wreszcie, wykazaliśmy, że peptyd wiodący nr 2077 jest w stanie promować działanie na mózg biotynylowanego inhibitora peptydowego BACE1 sprzężonego z SA, powodując wyraźne efekty farmakodynamiczne w OUN poprzez znaczące obniżenie poziomu Abeta40 w płynie mózgowo-rdzeniowym (ryc. 4). Nie udało nam się zidentyfikować żadnych homologów w bazie danych, przeprowadzając przeszukiwanie homologii sekwencji peptydów we wszystkich trafieniach. Należy zauważyć, że rozmiar biblioteki T7 wynosi około 109, podczas gdy teoretyczny rozmiar biblioteki dla 12-merów wynosi 4 x 1015. W związku z tym wybraliśmy jedynie niewielką część przestrzeni różnorodności biblioteki peptydów 12-merowych, co może oznaczać, że bardziej zoptymalizowane peptydy można zidentyfikować poprzez ocenę przestrzeni sekwencji sąsiadujących tych zidentyfikowanych trafień. Hipotetycznie, jednym z powodów, dla których nie znaleźliśmy żadnych naturalnych homologów tych peptydów, może być deselekcja w trakcie ewolucji, mająca na celu zapobieganie niekontrolowanemu przedostawaniu się niektórych motywów peptydowych do mózgu.
Podsumowując, nasze wyniki stanowią podstawę do dalszych prac nad identyfikacją i bardziej szczegółową charakterystyką systemów transportu bariery naczyniowo-mózgowej in vivo. Podstawowa koncepcja tej metody opiera się na strategii selekcji funkcjonalnej, która nie tylko identyfikuje klony posiadające właściwości wiązania się z naczyniami mózgowymi, ale także obejmuje kluczowy etap, w którym udane klony wykazują wewnętrzną aktywność w przekraczaniu barier biologicznych in vivo do ośrodkowego układu nerwowego. Celem jest wyjaśnienie mechanizmu transportu tych peptydów i ich preferencji w zakresie wiązania się z mikronaczyniami specyficznymi dla danego obszaru mózgu. Może to doprowadzić do odkrycia nowych szlaków transportu BBB i receptorów. Oczekujemy, że zidentyfikowane peptydy mogą wiązać się bezpośrednio z receptorami naczyniowo-mózgowymi lub z krążącymi ligandami transportowanymi przez BBB lub BCSFB. Wektory peptydowe o aktywności transportującej w płynie mózgowo-rdzeniowym, odkryte w tej pracy, będą przedmiotem dalszych badań. Obecnie badamy specyficzność mózgową tych peptydów pod kątem ich zdolności do przekraczania BBB i/lub BCSFB. Te nowe peptydy będą niezwykle cennym narzędziem umożliwiającym odkrywanie nowych receptorów lub ścieżek oraz opracowywanie nowych, wysoce wydajnych platform do dostarczania makrocząsteczek, np. leków biologicznych, do mózgu.
Kaniulacja dużego zbiornika (CM) przy użyciu modyfikacji wcześniej opisanej metody. Znieczulone szczury Wistar (200-350 g) umieszczono na aparacie stereotaktycznym, a na ogolonej i aseptycznie przygotowanej skórze głowy wykonano nacięcie pośrodkowe, aby odsłonić czaszkę. Wywiercono dwa otwory w okolicy górnego pasa i przykręcono w nich śruby mocujące. Dodatkowy otwór wywiercono w bocznym grzebieniu potylicznym w celu stereotaktycznego wprowadzenia kaniuli ze stali nierdzewnej do CM. Nałożono cement stomatologiczny wokół kaniuli i zabezpieczono śrubami. Po fotopolimeryzacji i stwardnieniu cementu ranę skórną zamknięto szwem supramidowym 4/0. Prawidłowe umieszczenie kaniuli potwierdza samoistny wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR). Wyjąć szczura z aparatu stereotaktycznego, zapewnić mu odpowiednią opiekę pooperacyjną i leczenie przeciwbólowe oraz pozwolić mu na rekonwalescencję przez co najmniej tydzień, aż do zaobserwowania oznak krwi w płynie mózgowo-rdzeniowym. Szczury Wistar (Crl:WI/Han) pozyskano z Charles River (Francja). Wszystkie szczury były przetrzymywane w określonych warunkach wolnych od patogenów. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Urząd Weterynaryjny Miasta Bazylea w Szwajcarii i przeprowadzone zgodnie z licencją na zwierzęta nr 2474 (Ocena aktywnego transportu mózgowego poprzez pomiar poziomów kandydatów terapeutycznych w płynie mózgowo-rdzeniowym i mózgu szczura).
Delikatnie utrzymuj szczura przytomnego, trzymając kaniulę CM w dłoni. Wyjmij Daturę z kaniuli i pobierz 10 µl spontanicznie płynącego płynu mózgowo-rdzeniowego. Ponieważ drożność kaniuli została ostatecznie naruszona, do badania włączono wyłącznie czyste próbki płynu mózgowo-rdzeniowego bez śladów zanieczyszczenia krwią lub przebarwienia. Równocześnie pobrano około 10–20 µl krwi z małego nacięcia na końcu ogona do probówek z heparyną (Sigma-Aldrich). Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) i krew pobierano w różnych punktach czasowych po dożylnym wstrzyknięciu faga T7. Przed pobraniem każdej próbki płynu mózgowo-rdzeniowego odlano około 5–10 µl płynu, co odpowiada objętości martwej cewnika.
Biblioteki wygenerowano przy użyciu wektora T7Select 10-3b, zgodnie z opisem w instrukcji systemu T7Select (Novagen, Rosenberg i in., InNovations 6, 1-6, 1996). W skrócie, losowy, 12-merowy insert DNA zsyntetyzowano w następującym formacie:
Kodon NNK został użyty w celu uniknięcia podwójnych kodonów stop i nadmiernej ekspresji aminokwasów we wstawce. N to ręcznie mieszany stosunek ekwimolarny każdego nukleotydu, a K to ręcznie mieszany stosunek ekwimolarny nukleotydów adeniny i cytozyny. Regiony jednoniciowe przekształcono w dwuniciowe DNA poprzez dalszą inkubację z dNTP (Novagen) i enzymem Klenowa (New England Biolabs) w buforze Klenowa (New England Biolabs) przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Po reakcji dwuniciowe DNA odzyskano przez wytrącanie EtOH. Powstałe DNA strawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i HindIII (oba firmy Roche). Pociętą i oczyszczoną (QIAquick, Qiagen) wstawkę (ligaza T4, New England Biolabs) zligowano w ramce do wstępnie przeciętego wektora T7 po aminokwasie 348 genu kapsydu 10B. Reakcje ligacji inkubowano w temperaturze 16°C przez 18 godzin przed pakowaniem in vitro. Pakowanie fagów in vitro przeprowadzono zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu do klonowania T7Select 10-3b (Novagen), a roztwór pakujący amplifikowano jednokrotnie do lizy z użyciem Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lizaty odwirowano, miareczkowano i zamrożono w temperaturze -80°C jako roztwór macierzysty glicerolu.
Amplifikacja metodą bezpośredniej reakcji PCR regionów zmiennych faga amplifikowanych w bulionie lub na płytce z użyciem opatentowanych starterów fuzyjnych 454/Roche-amplicon. Starter fuzyjny do przodu zawiera sekwencje flankujące region zmienny (NNK) 12 (specyficzny dla matrycy), adapter tytanowy GS FLX A oraz czterozasadową sekwencję kluczową biblioteki (TCAG) (Rysunek uzupełniający 1a):
Starter do fuzji odwrotnej zawiera również biotynę przyłączoną do koralików wychwytujących oraz adapter tytanowy GS FLX B wymagany do amplifikacji klonalnej podczas emulsyjnej reakcji PCR:
Amplikony poddano następnie pirosekwencjonowaniu 454/Roche zgodnie z protokołem 454 GS-FLX Titanium. W przypadku ręcznego sekwencjonowania metodą Sangera (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNA faga T7 amplifikowano metodą PCR i sekwencjonowano z użyciem następujących par starterów:
Wstawki z pojedynczych płytek poddano amplifikacji PCR przy użyciu zestawu Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (zgodnie z instrukcją producenta). Wykonano gorący start (10 min w 95°C) i 35 cykli boost (50 s w 95°C, 1 min w 50°C i 1 min w 72°C).
Fagi z bibliotek, fagi dzikiego typu, fagi odzyskane z płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi lub pojedyncze klony namnażano w Escherichia coli BL5615 w bulionie TB (Sigma Aldrich) lub w szalkach o powierzchni 500 cm² (Thermo Scientific) przez 4 godziny w temperaturze 37°C. Fagi ekstrahowano z płytek poprzez płukanie płytek buforem Tris-EDTA (Fluka Analytical) lub zbieranie łysinek sterylnymi końcówkami pipet. Fagi izolowano z supernatantu hodowli lub buforu ekstrakcyjnego, stosując jedną rundę precypitacji glikolem polietylenowym (PEG 8000) (Promega) i zawieszano w buforze Tris-EDTA.
Amplifikowany fag został poddany 2-3 rundom usuwania endotoksyn za pomocą kulek do usuwania endotoksyn (Miltenyi Biotec) przed dożylnym (iv) wstrzyknięciem (500 μl/zwierzę). W pierwszej rundzie wprowadzono 2×1012 fagów; w drugiej – 2×1010 fagów; w trzeciej i czwartej rundzie selekcji – 2×109 fagów na zwierzę. Zawartość fagów w płynie mózgowo-rdzeniowym i próbkach krwi pobranych w wyznaczonych punktach czasowych określono metodą liczenia płytek zgodnie z instrukcją producenta (instrukcja systemu T7Select). Selekcję fagów przeprowadzono dożylną iniekcją oczyszczonych bibliotek do żyły ogonowej lub przez ponowne wstrzyknięcie faga wyekstrahowanego z płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR) z poprzedniej rundy selekcji, a kolejne zbiory przeprowadzono odpowiednio po 10, 30, 60, 90, 120, 180 i 240 minutach dla próbek płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi. Przeprowadzono łącznie cztery rundy płukania in vivo, w których dwie wybrane gałęzie były oddzielnie przechowywane i analizowane podczas pierwszych trzech rund selekcji. Wszystkie inserty fagowe wyekstrahowane z płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR) z pierwszych dwóch rund selekcji poddano pirosekwencjonowaniu 454/Roche, podczas gdy wszystkie klony wyekstrahowane z płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR) z ostatnich dwóch rund selekcji poddano sekwencjonowaniu ręcznemu. Wszystkie fagi krwi z pierwszej rundy selekcji poddano również pirosekwencjonowaniu 454/Roche. W celu wstrzyknięcia klonów fagowych, wybrane fagi amplifikowano w E. coli (BL5615) na płytkach o powierzchni 500 cm² w temperaturze 37°C przez 4 godziny. Indywidualnie wyselekcjonowane i ręcznie sekwencjonowane klony namnażano w podłożu TB. Po ekstrakcji fagów, oczyszczeniu i usunięciu endotoksyny (jak opisano powyżej), wstrzyknięto dożylnie 2×1010 fagów/zwierzę w 300 μl do jednej żyły ogonowej.
Wstępne przetwarzanie i jakościowe filtrowanie danych sekwencyjnych. Surowe dane 454/Roche zostały przekonwertowane z binarnego standardowego formatu mapy strumieniowej (sff) na czytelny dla człowieka format Pearsona (fasta) za pomocą oprogramowania producenta. Dalsze przetwarzanie sekwencji nukleotydowej przeprowadzono za pomocą zastrzeżonych programów i skryptów w języku C (niepublikowany pakiet oprogramowania), jak opisano poniżej. Analiza danych pierwotnych obejmuje rygorystyczne, wieloetapowe procedury filtrowania. Aby odfiltrować odczyty niezawierające prawidłowej sekwencji 12-merowej wstawki DNA, odczyty zostały sekwencyjnie wyrównane do znacznika startowego (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), znacznika stopowego (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) i wstawki tła (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) za pomocą globalnego testu Needlemana-Wunscha. wyrównanie dopuszcza do 2 niespójności na wyrównanie31. Dlatego odczyty bez znaczników start i stop oraz odczyty zawierające wstawki tła, tj. dopasowania przekraczające dozwoloną liczbę niezgodności, zostały usunięte z biblioteki. Jeśli chodzi o pozostałe odczyty, sekwencja DNA N-merowa rozciągająca się od znacznika start i kończąca się przed znacznikiem stop została wycięta z oryginalnej sekwencji odczytu i poddana dalszej obróbce (zwana dalej „wstawką”). Po translacji wstawki, część po pierwszym kodonie stop na końcu 5' startera jest usuwana z wstawki. Ponadto, usunięto również nukleotydy prowadzące do niekompletnych kodonów na końcu 3' startera. Aby wykluczyć wstawki zawierające jedynie sekwencje tła, usunięto również wstawki po translacji rozpoczynające się od wzorca aminokwasowego „PAG”. Peptydy o długości potranslacyjnej mniejszej niż 3 aminokwasy zostały usunięte z biblioteki. Na koniec usunięto redundancję w puli wstawek i określono częstość występowania każdej unikalnej wstawki. Wyniki tej analizy obejmowały listę sekwencji nukleotydowych (inserts) i ich częstości (odczyt) (rysunki uzupełniające 1c i 2).
Grupuj N-merowe wstawki DNA według podobieństwa sekwencji: Aby wyeliminować specyficzne dla 454/Roche błędy sekwencjonowania (takie jak problemy z sekwencjonowaniem rozszerzeń homopolimerowych) i usunąć mniej ważne redundancje, wcześniej odfiltrowane N-merowe wstawki sekwencji DNA (wstawki) są sortowane według podobieństwa. insercje (dozwolone do 2 niepasujących zasad) przy użyciu iteracyjnego algorytmu zdefiniowanego w następujący sposób: insercje są sortowane najpierw według ich częstości (od najwyższej do najniższej), a jeśli są takie same, według ich drugorzędnego sortowania według długości (od najdłuższej do najkrótszej)). Zatem najczęstsze i najdłuższe insercje definiują pierwszą „grupę”. Częstotliwość grupy jest ustawiana na częstotliwość kluczową. Następnie każdą insercję pozostałą na posortowanej liście próbowano dodać do grupy przez parami wyrównanie Needlemana-Wunscha. Jeśli liczba niezgodności, insercji lub delecji w dopasowaniu nie przekracza progu 2, insercja jest dodawana do grupy, a ogólna częstość występowania w grupie jest zwiększana o częstotliwość dodawania insercji. Insercje dodane do grupy są oznaczane jako użyte i wykluczane z dalszego przetwarzania. Jeśli sekwencji insercji nie można dodać do już istniejącej grupy, sekwencja insercji jest używana do utworzenia nowej grupy z odpowiednią częstością insercji i oznaczana jako użyta. Iteracja kończy się, gdy każda sekwencja insercji zostanie wykorzystana do utworzenia nowej grupy lub będzie mogła zostać włączona do już istniejącej grupy. Ostatecznie zgrupowane insercje składające się z nukleotydów są ostatecznie tłumaczone na sekwencje peptydowe (biblioteki peptydów). Wynikiem tej analizy jest zestaw insercji i odpowiadających im częstości, które składają się na liczbę kolejnych odczytów (Rys. uzupełniający 2).
Generowanie motywów: Na podstawie listy unikatowych peptydów utworzono bibliotekę zawierającą wszystkie możliwe wzorce aminokwasów (aa), jak pokazano poniżej. Każdy możliwy wzorzec o długości 3 został wyodrębniony z peptydu, a jego odwrotny wzorzec został dodany wraz ze wspólną biblioteką motywów zawierającą wszystkie wzorce (tripeptydy). Biblioteki powtarzających się motywów zostały zsekwencjonowane i usunięte z nich zbędne elementy. Następnie, dla każdego tripeptydu w bibliotece motywów, sprawdzono jego obecność w bibliotece za pomocą narzędzi obliczeniowych. W tym przypadku, częstotliwość występowania peptydu zawierającego znaleziony tripeptyd motywu jest dodawana i przypisywana do motywu w bibliotece motywów („liczba motywów”). Wynikiem generowania motywów jest dwuwymiarowa tablica zawierająca wszystkie wystąpienia tripeptydów (motywów) i ich odpowiednie wartości, które są liczbą odczytów sekwencjonowania dających odpowiedni motyw po przefiltrowaniu, zgrupowaniu i translacji odczytów. Metryki opisano szczegółowo powyżej.
Normalizacja liczby motywów i odpowiadających im wykresów punktowych: Liczbę motywów dla każdej próbki znormalizowano przy użyciu
gdzie ni to liczba odczytów zawierających temat i. Zatem vi reprezentuje procentową częstość odczytów (lub peptydów) zawierających motyw i w próbce. Wartości p dla nienormalizowanej liczby motywów obliczono za pomocą dokładnego testu Fishera. W odniesieniu do korelogramów liczby motywów, korelacje Spearmana obliczono, używając znormalizowanej liczby motywów z R.
Aby zwizualizować zawartość aminokwasów w każdej pozycji biblioteki peptydów, stworzono logogramy internetowe 32 i 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Najpierw zawartość aminokwasów w każdej pozycji 12-merowego peptydu jest zapisywana w macierzy 20×12. Następnie generowany jest zestaw 1000 peptydów o tej samej względnej zawartości aminokwasów w każdej pozycji w formacie fasta-sequence i dostarczany jako dane wejściowe do logo internetowego 3, które generuje graficzną reprezentację względnej zawartości aminokwasów w każdej pozycji dla danej biblioteki peptydów. Aby zwizualizować wielowymiarowe zbiory danych, stworzono mapy cieplne za pomocą opracowanego wewnętrznie narzędzia w środowisku R (biosHeatmap, pakiet R, który nie został jeszcze wydany). Dendrogramy przedstawione na mapach cieplnych obliczono za pomocą metody hierarchicznego klasteryzacji Warda z wykorzystaniem euklidesowej metryki odległości. Do analizy statystycznej danych dotyczących punktacji motywów, wartości p dla punktacji nienormalizowanej obliczono za pomocą dokładnego testu Fishera. Wartości p dla innych zestawów danych obliczono w R za pomocą testu t-Studenta lub analizy wariancji (ANOVA).
Wybrane klony fagowe i fagi bez insertów wstrzykiwano dożylnie do żyły ogonowej (2×1010 fagów/zwierzę w 300 μl PBS). Dziesięć minut przed perfuzją i późniejszym utrwaleniem, tym samym zwierzętom wstrzyknięto dożylnie 100 μl lektyny znakowanej DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minut po wstrzyknięciu faga, szczury poddano perfuzji przez serce 50 ml PBS, a następnie 50 ml 4% PFA/PBS. Próbki mózgu dodatkowo utrwalano przez noc w 4% PFA/PBS i moczono w 30% sacharozie w temperaturze 4°C. Próbki zamrażano błyskawicznie w mieszaninie OCT. Analizę immunohistochemiczną zamrożonych próbek przeprowadzono w temperaturze pokojowej na krioskrawkach o grubości 30 µm, zablokowanych 1% roztworem BSA i inkubowanych z poliklonalnymi przeciwciałami znakowanymi FITC przeciwko fagowi T7 (Novus NB 600-376A) w temperaturze 4°C. Inkubowano przez noc. Na koniec skrawki przemyto 3-krotnie PBS i zbadano pod mikroskopem konfokalnym laserowym (Leica TCS SP5).
Wszystkie peptydy o minimalnej czystości 98% zostały zsyntetyzowane przez firmę GenScript USA, biotynylowane i liofilizowane. Biotyna jest wiązana poprzez dodatkowy potrójny glicynowy łącznik na N-końcu. Sprawdź wszystkie peptydy za pomocą spektrometrii masowej.
Streptawidynę (Sigma S0677) zmieszano z 5-krotnym nadmiarem ekwimolarnym biotynylowanego peptydu, biotynylowanego peptydu hamującego BACE1 lub kombinacji (stosunek 3:1) biotynylowanego peptydu hamującego BACE1 i peptydu hamującego BACE1 w 5–10% DMSO/inkubowano w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przed wstrzyknięciem. Peptydy sprzężone ze streptawidyną wstrzykiwano dożylnie w dawce 10 mg/kg do jednej z żył ogonowych szczurów z jamą mózgową.
Stężenie kompleksów streptawidyna-peptyd oceniano metodą ELISA. Płytki mikrotitracyjne Nunc Maxisorp (Sigma) powlekano przez noc w temperaturze 4°C mysim przeciwciałem anty-streptawidyna w stężeniu 1,5 μg/ml (Thermo, MA1-20011). Po blokowaniu (bufor blokujący: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% żelatyny, 1% BSA) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, płytkę przemywano 0,05% buforem do płukania Tween-20/PBS przez 3 sekundy. Do dołków rozcieńczonych buforem blokującym (osocze 1:10 000, CSF 1:115) dodawano próbki płynu mózgowo-rdzeniowego i osocza. Płytkę inkubowano następnie przez noc w temperaturze 4°C z przeciwciałem detekcyjnym (1 μg/ml, anty-streptawidyna-HRP, Novus NB120-7239). Po trzech etapach płukania, streptawidynę wykrywano poprzez inkubację w roztworze substratu TMB (Roche) przez maksymalnie 20 minut. Po zatrzymaniu reakcji barwnej 1M H2SO4, zmierzono absorbancję przy długości fali 450 nm.
Funkcję kompleksu streptawidyna-peptyd-inhibitor BACE1 oceniano za pomocą testu ELISA dla Aβ(1-40) zgodnie z protokołem producenta (Wako, 294-64701). W skrócie, próbki płynu mózgowo-rdzeniowego rozcieńczano w standardowym rozcieńczalniku (1:23) i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C w 96-dołkowych płytkach pokrytych przeciwciałem wychwytującym BNT77. Po pięciu etapach płukania dodano przeciwciało BA27 sprzężone z HRP i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 4°C, a następnie przeprowadzono pięć etapów płukania. Aβ(1-40) wykrywano poprzez inkubację w roztworze TMB przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po zatrzymaniu reakcji roztworem zatrzymującym, zmierzono absorbancję przy długości fali 450 nm. Próbki osocza poddano ekstrakcji do fazy stałej przed testem ELISA dla Aβ(1-40). Osocze dodano do 0,2% DEA (Sigma) na płytkach 96-dołkowych i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po kolejnym płukaniu płytek SPE (Oasis, 186000679) wodą i 100% metanolem, próbki osocza dodano do płytek SPE i usunięto cały płyn. Próbki płukano (najpierw 5% metanolem, a następnie 30% metanolem) i eluowano mieszaniną 2% NH4OH/90% metanolu. Po wysuszeniu eluatu w temperaturze 55°C przez 99 minut przy stałym natężeniu N2, próbki zredukowano w standardowych rozcieńczalnikach, a następnie zmierzono poziom Aβ(1–40) zgodnie z powyższym opisem.
Jak cytować ten artykuł: Urich, E. i in. Dostarczanie ładunku do mózgu z wykorzystaniem peptydów transportowych zidentyfikowanych in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB i Moos T. Dostarczanie leków makrocząsteczkowych do mózgu z wykorzystaniem terapii celowanej. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. i Martinez-Martinez, P. Dostarczanie leków peptydowych i białkowych przez barierę krew-mózg. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Bariera krew-mózg: wąskie gardło w rozwoju leków na mózg. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG i Byrd, A. Perspektywy lepszego dostarczania i kierowania leków do mózgu poprzez szlak splotu naczyniówkowego – płynu mózgowo-rdzeniowego. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizacja leków biologicznych z wykorzystaniem molekularnych koni trojańskich do transportu do mózgu. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, Transport peptydów przez barierę krew-mózg za pośrednictwem receptora WM. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. i in. Zwiększenie penetracji mózgu i skuteczności przeciwciał terapeutycznych przy użyciu monowalentnych wahadłowców molekularnych. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. i in. Transport receptora transferyny (TfR) determinuje wychwyt wariantów powinowactwa przeciwciał TfR przez mózg. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).