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Die Blut-Hirn-Schranke und die Blut-Hirn-Schranke verhindern, dass biotherapeutische Wirkstoffe ihre Ziele im Zentralnervensystem erreichen, und behindern so eine wirksame Behandlung neurologischer Erkrankungen.Um neue Gehirntransporter in vivo zu entdecken, führten wir eine T7-Phagenpeptidbibliothek ein und sammelten seriell Blut und Liquor (CSF) unter Verwendung eines kanülierten, bewussten großen Poolmodells von Ratten.Spezifische Phagenklone waren nach vier Selektionsrunden stark im CSF angereichert.Tests einzelner Kandidatenpeptide ergaben eine mehr als 1000-fache Anreicherung im Liquor.Die Bioaktivität der peptidvermittelten Abgabe an das Gehirn wurde durch eine 40-prozentige Reduzierung des Amyloid-β-Spiegels in der Liquor cerebrospinalis unter Verwendung eines BACE1-Peptidinhibitors bestätigt, der mit dem identifizierten neuen Transitpeptid verknüpft war.Diese Ergebnisse legen nahe, dass die durch In-vivo-Phagenselektionsmethoden identifizierten Peptide nützliche Vehikel für die systemische Abgabe von Makromolekülen an das Gehirn mit therapeutischer Wirkung sein könnten.
Die Forschung zur zielgerichteten Therapie des Zentralnervensystems (ZNS) konzentrierte sich weitgehend auf die Identifizierung optimierter Medikamente und Wirkstoffe, die auf das Zentralnervensystem (ZNS) abzielende Eigenschaften aufweisen, wobei weniger Aufwand auf die Entdeckung der Mechanismen gerichtet wurde, die die aktive Medikamentenabgabe an das Gehirn steuern.Dies beginnt sich jetzt zu ändern, da die Verabreichung von Medikamenten, insbesondere von großen Molekülen, ein integraler Bestandteil der modernen neurowissenschaftlichen Medikamentenentwicklung ist.Die Umgebung des Zentralnervensystems ist durch das zerebrovaskuläre Barrieresystem, bestehend aus der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​und der Blut-Hirn-Schranke (BCBB)1, gut geschützt, was die Abgabe von Arzneimitteln an das Gehirn erschwert1,2.Es wird geschätzt, dass fast alle Arzneimittel mit großen Molekülen und mehr als 98 % der Arzneimittel mit kleinen Molekülen aus dem Gehirn ausgeschieden werden3.Deshalb ist es sehr wichtig, neue Gehirntransportsysteme zu identifizieren, die eine effiziente und spezifische Abgabe therapeutischer Medikamente an das ZNS ermöglichen 4,5.Allerdings bieten die BHS und die BCSFB auch eine ausgezeichnete Möglichkeit für die Medikamentenverabreichung, da sie über das ausgedehnte Gefäßsystem alle Strukturen des Gehirns durchdringen und in diese eindringen.Daher basieren die aktuellen Bemühungen, nicht-invasive Methoden zur Abgabe an das Gehirn zu nutzen, größtenteils auf dem Mechanismus des rezeptorvermittelten Transports (PMT) unter Verwendung des endogenen BBB6-Rezeptors.Trotz der jüngsten wichtigen Fortschritte bei der Nutzung des Transferrinrezeptorwegs7,8 ist die weitere Entwicklung neuer Abgabesysteme mit verbesserten Eigenschaften erforderlich.Zu diesem Zweck bestand unser Ziel darin, Peptide zu identifizieren, die in der Lage sind, den CSF-Transport zu vermitteln, da sie prinzipiell dazu verwendet werden könnten, Makromoleküle an das ZNS zu transportieren oder neue Rezeptorwege zu eröffnen.Insbesondere spezifische Rezeptoren und Transporter des zerebrovaskulären Systems (BBB und BSCFB) können als potenzielle Ziele für die aktive und spezifische Abgabe biotherapeutischer Arzneimittel dienen.Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) ist ein sekretorisches Produkt des Plexus choroideus (CS) und steht über den Subarachnoidalraum und den Ventrikelraum in direktem Kontakt mit der interstitiellen Flüssigkeit des Gehirns4.Kürzlich wurde gezeigt, dass die Subarachnoidalflüssigkeit übermäßig in das Interstitium des Gehirns diffundiert9.Wir hoffen, über diesen Subarachnoidalzuflusstrakt oder direkt über die BHS Zugang zum Parenchymraum zu erhalten.Um dies zu erreichen, haben wir eine robuste In-vivo-Phagenselektionsstrategie implementiert, die idealerweise Peptide identifiziert, die über einen dieser beiden unterschiedlichen Wege transportiert werden.
Wir beschreiben nun eine sequentielle In-vivo-Phagen-Display-Screening-Methode mit CSF-Probenahme in Verbindung mit Hochdurchsatzsequenzierung (HTS), um erste Selektionsrunden mit der höchsten Bibliotheksvielfalt zu überwachen.Das Screening wurde an wachen Ratten mit einer dauerhaft implantierten großen Zisternenkanüle (CM) durchgeführt, um eine Blutkontamination zu vermeiden.Wichtig ist, dass bei diesem Ansatz sowohl Gehirn-Targeting als auch Peptide mit Transportaktivität über die zerebrovaskuläre Barriere ausgewählt werden.Wir verwendeten T7-Phagen aufgrund ihrer geringen Größe (~60 nm)10 und vermuteten, dass sie für den Transport von Vesikeln geeignet sind, die eine transzelluläre Durchquerung der Endothel- und/oder Epithel-Medulla-Barriere ermöglichen.Nach vier Panning-Runden wurden Phagenpopulationen isoliert, die in vivo eine starke CSF-Anreicherung und zerebrale Mikrogefäßassoziation zeigten.Wichtig ist, dass wir unsere Ergebnisse bestätigen konnten, indem wir zeigten, dass die bevorzugten und chemisch synthetisierten besten Peptidkandidaten in der Lage sind, Proteinfracht in die Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit zu transportieren.Zunächst wurden die pharmakodynamischen Wirkungen des ZNS durch die Kombination eines führenden Transitpeptids mit einem Inhibitor des BACE1-Peptids ermittelt.Neben dem Nachweis, dass funktionelle In-vivo-Screening-Strategien neuartige Hirntransportpeptide als wirksame Proteinfrachtträger identifizieren können, gehen wir davon aus, dass ähnliche funktionelle Selektionsansätze auch bei der Identifizierung neuer Hirntransportwege wichtig werden.
Basierend auf Plaque-bildenden Einheiten (PFU) wurde nach dem Schritt der Phagenverpackung eine Bibliothek zufälliger 12-mer linearer T7-Phagenpeptide mit einer Diversität von etwa 109 entworfen und erstellt (siehe Materialien und Methoden).Es ist wichtig zu beachten, dass wir diese Bibliothek vor dem In-vivo-Panning sorgfältig analysiert haben.Die PCR-Amplifikation von Phagenbibliotheksproben unter Verwendung modifizierter Primer erzeugte Amplifikate, die direkt auf HTS anwendbar waren (ergänzende Abbildung 1a).Aufgrund a) HTS11-Sequenzierungsfehlern, b) Auswirkungen auf die Qualität der Primer (NNK) 1–12 und c) des Vorhandenseins von Wildtyp-Phagen (wt) (Skelettinserts) in der Standby-Bibliothek wurde ein Sequenzfilterverfahren implementiert, um nur verifizierte Sequenzinformationen zu extrahieren (ergänzende Abbildung 1b).Diese Filterschritte gelten für alle HTS-Sequenzierungsbibliotheken.Für die Standardbibliothek wurden insgesamt 233.868 Lesevorgänge erzielt, von denen 39 % die Filterkriterien erfüllten und für die Bibliotheksanalyse und -auswahl für nachfolgende Runden verwendet wurden (ergänzende Abbildung 1c–e).Bei den Lesevorgängen handelte es sich überwiegend um Vielfache einer Länge von 3 Basenpaaren mit einem Peak bei 36 Nukleotiden (ergänzende Abbildung 1c), was das Bibliotheksdesign (NNK) 1–12 bestätigte.Bemerkenswerterweise enthielten etwa 11 % der Bibliotheksmitglieder ein 12-dimensionales Wildtyp-(wt)-Rückgrat-PAGISRELVDKL-Insert und fast die Hälfte der Sequenzen (49 %) enthielten Insertionen oder Deletionen.Das HTS der Bibliotheksbibliothek bestätigte die hohe Vielfalt der Peptide in der Bibliothek: Mehr als 81 % der Peptidsequenzen wurden nur einmal gefunden und nur 1,5 % kamen in ≥4 Kopien vor (ergänzende Abbildung 2a).Die Häufigkeiten der Aminosäuren (aa) an allen 12 Positionen im Repertoire korrelierten gut mit den Häufigkeiten, die für die Anzahl der vom degenerierten NKK-Repertoire erzeugten Codons erwartet wurden (ergänzende Abbildung 2b).Die beobachtete Häufigkeit der von diesen Inserts kodierten AA-Reste korrelierte gut mit der berechneten Häufigkeit (r = 0, 893) (ergänzende Abbildung 2c).Die Vorbereitung von Phagenbibliotheken zur Injektion umfasst die Schritte der Amplifikation und Entfernung von Endotoxin.Es wurde zuvor gezeigt, dass dies möglicherweise die Vielfalt der Phagenbibliotheken verringert12,13.Daher sequenzierten wir eine plattenamplifizierte Phagenbibliothek, die einer Endotoxinentfernung unterzogen worden war, und verglichen sie mit der Originalbibliothek, um die Häufigkeit von AA abzuschätzen.Es wurde eine starke Korrelation (r = 0,995) zwischen dem ursprünglichen Pool und dem amplifizierten und gereinigten Pool beobachtet (ergänzende Abbildung 2d), was darauf hinweist, dass die Konkurrenz zwischen auf Platten mit T7-Phagen amplifizierten Klonen keine größere Verzerrung verursachte.Dieser Vergleich basiert auf der Häufigkeit von Tripeptidmotiven in jeder Bibliothek, da die Vielfalt der Bibliotheken (~109) selbst mit HTS nicht vollständig erfasst werden kann.Die Frequenzanalyse von aa an jeder Position ergab eine kleine positionsabhängige Verzerrung in den letzten drei Positionen des eingegebenen Repertoires (ergänzende Abbildung 2e).Zusammenfassend kamen wir zu dem Schluss, dass die Qualität und Diversität der Bibliothek akzeptabel waren und aufgrund der Amplifikation und Vorbereitung der Phagenbibliotheken zwischen mehreren Selektionsrunden nur geringfügige Veränderungen in der Diversität beobachtet wurden.
Eine serielle Liquorprobenahme kann durch chirurgisches Implantieren einer Kanüle in das CM von Ratten bei Bewusstsein durchgeführt werden, um die Identifizierung von T7-Phagen zu erleichtern, die intravenös (iv) über die BHS und/oder BCSFB injiziert werden (Abb. 1a-b).In den ersten drei Runden der In-vivo-Selektion verwendeten wir zwei unabhängige Selektionsarme (Arme A und B) (Abb. 1c).Wir haben die Stringenz der Selektion schrittweise erhöht, indem wir die Gesamtmenge der in den ersten drei Selektionsrunden eingeführten Phagen verringert haben.Für die vierte Panning-Runde haben wir Proben aus den Zweigen A und B kombiniert und drei zusätzliche unabhängige Auswahlen durchgeführt.Um die In-vivo-Eigenschaften von T7-Phagenpartikeln in diesem Modell zu untersuchen, wurden Ratten Wildtyp-Phagen (PAGISRELVDKL-Master-Insert) über die Schwanzvene injiziert.Die Gewinnung von Phagen aus Liquor und Blut zu verschiedenen Zeitpunkten zeigte, dass relativ kleine ikosaedrische T7-Phagen eine schnelle anfängliche Clearance-Phase aus dem Blutkompartiment aufwiesen (ergänzende Abbildung 3).Basierend auf den verabreichten Titern und dem Blutvolumen der Ratten haben wir berechnet, dass nur etwa 1 Gew.-% vorhanden sind.Phagen aus der verabreichten Dosis wurden 10 Minuten nach der intravenösen Injektion im Blut nachgewiesen.Nach diesem anfänglichen schnellen Rückgang wurde eine langsamere primäre Clearance mit einer Halbwertszeit von 27,7 Minuten gemessen.Wichtig ist, dass nur sehr wenige Phagen aus dem CSF-Kompartiment gewonnen wurden, was auf einen geringen Hintergrund für die Migration von Wildtyp-Phagen in das CSF-Kompartiment hinweist (ergänzende Abbildung 3).Im Durchschnitt wurden über den gesamten Probenahmezeitraum (0–250 Minuten) nur etwa 1 x 10–3 % der T7-Phagentiter im Blut und 4 x 10–8 % der ursprünglich infundierten Phagen in der Liquor cerebrospinalis nachgewiesen.Bemerkenswert ist, dass die Halbwertszeit (25,7 Minuten) des Wildtyp-Phagen in der Liquor cerebrospinalis der im Blut beobachteten ähnelte.Diese Daten zeigen, dass die Barriere, die das CSF-Kompartiment vom Blut trennt, bei Ratten mit CM-Kanüle intakt ist, was die In-vivo-Selektion von Phagenbibliotheken ermöglicht, um Klone zu identifizieren, die leicht vom Blut in das CSF-Kompartiment transportiert werden können.
(a) Einrichtung einer Methode zur erneuten Probenahme von Liquor (CSF) aus einem großen Pool.(b) Diagramm, das die zelluläre Lage der Barriere des Zentralnervensystems (ZNS) und die Auswahlstrategie zur Identifizierung von Peptiden zeigt, die die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​und die Blut-Hirn-Schranke überwinden.(c) Flussdiagramm für das In-vivo-Phagen-Display-Screening.In jeder Selektionsrunde wurden Phagen (Tieridentifikatoren innerhalb der Pfeile) intravenös injiziert.Zwei unabhängige Alternativzweige (A, B) werden bis zur 4. Auswahlrunde getrennt geführt.Für die Selektionsrunden 3 und 4 wurde jeder aus CSF extrahierte Phagenklon manuell sequenziert.(d) Kinetik der aus Blut (rote Kreise) und Liquor (grüne Dreiecke) isolierten Phagen während der ersten Selektionsrunde bei zwei kanülierten Ratten nach intravenöser Injektion der T7-Peptidbibliothek (2 x 1012 Phagen/Tier).Blaue Quadrate geben die durchschnittliche anfängliche Phagenkonzentration im Blut an, berechnet aus der Menge der injizierten Phagen unter Berücksichtigung des gesamten Blutvolumens.Die schwarzen Quadrate geben den Schnittpunkt der aus Blutphagenkonzentrationen extrapolierten y-Linie an.(e,f) Stellen Sie die relative Häufigkeit und Verteilung aller möglichen überlappenden Tripeptidmotive im Peptid dar.Angezeigt wird die Anzahl der in 1000 Lesungen gefundenen Motive.Deutlich (p < 0,001) angereicherte Motive werden mit roten Punkten markiert.(e) Korrelations-Streudiagramm, das die relative Häufigkeit des Tripeptidmotivs der injizierten Bibliothek mit aus Blut stammenden Phagen der Tiere Nr. 1.1 und Nr. 1.2 vergleicht.(f) Korrelations-Streudiagramm zum Vergleich der relativen Häufigkeiten der in Blut und Liquor isolierten tierischen Phagen-Tripeptidmotive Nr. 1.1 und Nr. 1.2.(g, h) Sequenz-ID-Darstellung von mit Blut angereicherten Phagen (g) im Vergleich zu injizierten Bibliotheken und von mit CSF angereicherten Phagen (h) im Vergleich zu Blut nach einer Runde der In-vivo-Selektion bei beiden Tieren.Die Größe des Ein-Buchstaben-Codes gibt an, wie oft diese Aminosäure an dieser Position vorkommt.Grün = polar, lila = neutral, blau = basisch, rot = sauer und schwarz = hydrophobe Aminosäuren.Abbildung 1a, b wurde von Eduard Urich entworfen und hergestellt.
Wir injizierten eine Phagenpeptidbibliothek in zwei CM-Instrumentenratten (Klassen A und B) und isolierten Phagen aus Liquor und Blut (Abbildung 1d).Die anfängliche schnelle Clearance der Bibliothek war im Vergleich zum Wildtyp-Phagen weniger ausgeprägt.Die mittlere Halbwertszeit der injizierten Bibliothek betrug bei beiden Tieren 24,8 Minuten im Blut, ähnlich wie bei Wildtyp-Phagen, und 38,5 Minuten im Liquor.Blut- und Liquor-Phagenproben von jedem Tier wurden einer HTS unterzogen und alle identifizierten Peptide wurden auf das Vorhandensein eines kurzen Tripeptidmotivs analysiert.Tripeptidmotive wurden ausgewählt, weil sie eine minimale Grundlage für die Strukturbildung und Peptid-Protein-Wechselwirkungen bieten14,15.Wir fanden eine gute Korrelation in der Motivverteilung zwischen der injizierten Phagenbibliothek und den aus dem Blut beider Tiere extrahierten Klonen (Abb. 1e).Die Daten deuten darauf hin, dass die Zusammensetzung der Bibliothek im Blutkompartiment nur geringfügig angereichert ist.Aminosäurehäufigkeiten und Konsensussequenzen wurden an jeder Position mithilfe einer Anpassung der Weblogo16-Software weiter analysiert.Interessanterweise fanden wir eine starke Anreicherung der Glycinrückstände im Blut (Abb. 1g).Beim Vergleich von Blut mit aus CSF ausgewählten Klonen wurde eine starke Selektion und eine gewisse Deselektion von Motiven beobachtet (Abb. 1f), und bestimmte Aminosäuren waren bevorzugt an vorbestimmten Positionen im 12-Mitglied vorhanden (Abb. 1h).Bemerkenswerterweise unterschieden sich einzelne Tiere signifikant in der Liquor cerebrospinalis, wohingegen bei beiden Tieren eine Anreicherung von Glycin im Blut beobachtet wurde (ergänzende Abbildung 4a – j).Nach strenger Filterung der Sequenzdaten in der Liquor cerebrospinalis der Tiere Nr. 1.1 und Nr. 1.2 wurden insgesamt 964 bzw. 420 einzigartige 12-mer-Peptide erhalten (ergänzende Abbildung 1d – e).Die isolierten Phagenklone wurden amplifiziert und einer zweiten Runde der In-vivo-Selektion unterzogen.Aus der zweiten Selektionsrunde extrahierte Phagen wurden bei jedem Tier einer HTS unterzogen und alle identifizierten Peptide wurden als Eingabe für ein Motiverkennungsprogramm verwendet, um das Auftreten von Tripeptidmotiven zu analysieren (Abb. 2a, b, ef).Im Vergleich zum ersten Zyklus des aus CSF gewonnenen Phagen beobachteten wir eine weitere Selektion und Deselektion vieler Motive im CSF in den Zweigen A und B (Abb. 2).Ein Netzwerkidentifikationsalgorithmus wurde angewendet, um festzustellen, ob sie unterschiedliche Muster konsistenter Reihenfolge darstellten.Es wurde eine deutliche Ähnlichkeit zwischen den durch CSF gewonnenen 12-dimensionalen Sequenzen in der alternativen Gruppe A (Abb. 2c, d) und der Gruppe B (Abb. 2g, h) beobachtet.Die gepoolte Analyse in jedem Zweig ergab unterschiedliche Selektionsprofile für 12-mer-Peptide (ergänzende Abbildung 5c, d) und einen Anstieg des CSF/Bluttiter-Verhältnisses im Laufe der Zeit für gepoolte Klone nach der zweiten Selektionsrunde im Vergleich zur ersten Selektionsrunde (ergänzende Abb. 5e).).
Anreicherung von Motiven und Peptiden in der Liquor cerebrospinalis durch zwei aufeinanderfolgende Runden der funktionellen Phagen-Display-Selektion in vivo.
Alle aus der ersten Runde jedes Tieres (Tiere Nr. 1.1 und Nr. 1.2) gewonnenen Liquor-Phagen wurden gepoolt, amplifiziert, HT-sequenziert und zusammen (2 x 1010 Phagen/Tier) 2 Ratten mit SM-Kanüle (Nr. 1.1 → Nr.) erneut injiziert.2.1 und 2.2, 1.2 → 2.3 und 2.4).(a,b,e,f) Korrelations-Streudiagramme zum Vergleich der relativen Häufigkeit von Tripeptidmotiven aller CSF-abgeleiteten Phagen in der ersten und zweiten Selektionsrunde.Relative Häufigkeit und Verteilung von Motiven, die alle möglichen überlappenden Tripeptide darstellen, die in Peptiden in beiden Orientierungen vorkommen.Angezeigt wird die Anzahl der in 1000 Lesungen gefundenen Motive.Motive, die in einer der verglichenen Bibliotheken signifikant (p < 0,001) ausgewählt oder ausgeschlossen wurden, werden mit roten Punkten hervorgehoben.(c, d, g, h) Sequenzlogodarstellung aller CSF-reichen 12 Aminosäuren langen Sequenzen basierend auf Runden 2 und 1 der In-vivo-Selektion.Die Größe des Ein-Buchstaben-Codes gibt an, wie oft diese Aminosäure an dieser Position vorkommt.Zur Darstellung des Logos wird die Häufigkeit der aus einzelnen Tieren extrahierten CSF-Sequenzen zwischen zwei Auswahlrunden verglichen und die angereicherten Sequenzen in der zweiten Runde angezeigt: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 und (h) #1.2–#2.4.Die am stärksten angereicherten Aminosäuren an einer bestimmten Position in (c, d) Tieren Nr.2.1 und Nr.2.2 oder (g, h) bei Tieren Nr.2.3 und nein.2.4 sind farbig dargestellt.Grün = polar, lila = neutral, blau = basisch, rot = sauer und schwarz = hydrophobe Aminosäuren.
Nach der dritten Selektionsrunde identifizierten wir 124 einzigartige Peptidsequenzen (Nr. 3.1 und Nr. 3.2) aus 332 CSF-rekonstituierten Phagenklonen, die aus zwei Tieren isoliert wurden (ergänzende Abbildung 6a).Die Sequenz LGSVS (18,7 %) hatte den höchsten relativen Anteil, gefolgt von den Wildtyp-Inserts PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) und SARGSWREIVSLS (2,2 %).In der letzten vierten Runde haben wir zwei unabhängig ausgewählte Zweige von drei verschiedenen Tieren zusammengefasst (Abb. 1c).Von den 925 aus CSF gewonnenen sequenzierten Phagenklonen fanden wir in der vierten Runde 64 einzigartige Peptidsequenzen (ergänzende Abbildung 6b), unter denen der relative Anteil an Wildtyp-Phagen auf 0, 8% sank.Die häufigsten CSF-Klone in der vierten Runde waren LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) und RLSSVDSDLSGC (3, 2 %).%).Der Längenbereich der ausgewählten Peptide ist auf Nukleotidinsertionen/-deletionen oder vorzeitige Stoppcodons in den Bibliotheksprimern zurückzuführen, wenn degenerierte Codons für das NNK-Bibliotheksdesign verwendet werden.Vorzeitige Stoppcodons erzeugen kürzere Peptide und werden ausgewählt, weil sie das günstige aa-Motiv enthalten.Längere Peptide können durch Insertionen/Deletionen in den Primern der synthetischen Bibliotheken entstehen.Dadurch wird das entworfene Stoppcodon außerhalb des Rahmens positioniert und gelesen, bis stromabwärts ein neues Stoppcodon erscheint.Im Allgemeinen haben wir die Anreicherungsfaktoren für alle vier Auswahlrunden berechnet, indem wir die Eingabedaten mit den Stichprobenausgabedaten verglichen haben.Für die erste Screening-Runde verwendeten wir Wildtyp-Phagentiter als unspezifische Hintergrundreferenz.Interessanterweise war die negative Phagenselektion im ersten CSF-Zyklus sehr stark, jedoch nicht im Blut (Abb. 3a), was möglicherweise auf die geringe Wahrscheinlichkeit einer passiven Diffusion der meisten Mitglieder der Peptidbibliothek in das CSF-Kompartiment zurückzuführen ist oder relative Phagen tendenziell effizienter aus dem Blutkreislauf zurückgehalten oder entfernt werden als Bakteriophagen.In der zweiten Panning-Runde wurde jedoch in beiden Kladen eine starke Phagenselektion im Liquor beobachtet, was darauf hindeutet, dass die vorherige Runde mit Phagen angereichert war, die Peptide präsentierten, die die Liquor-Aufnahme fördern (Abb. 3a).Auch hier ohne nennenswerte Blutanreicherung.Auch in der dritten und vierten Runde waren die Phagenklone deutlich im CSF angereichert.Beim Vergleich der relativen Häufigkeit jeder einzelnen Peptidsequenz zwischen den letzten beiden Selektionsrunden stellten wir fest, dass die Sequenzen in der vierten Selektionsrunde noch stärker angereichert waren (Abb. 3b).Aus allen 64 einzigartigen Peptidsequenzen wurden unter Verwendung beider Peptidorientierungen insgesamt 931 Tripeptidmotive extrahiert.Die am stärksten angereicherten Motive in der vierten Runde wurden im Vergleich zur injizierten Bibliothek über alle Runden hinweg genauer auf ihre Anreicherungsprofile untersucht (Grenzwert: 10 % Anreicherung) (ergänzende Abbildung 6c).Allgemeine Auswahlmuster zeigten, dass die meisten der untersuchten Motive in allen vorherigen Runden beider Auswahlzweige angereichert wurden.Einige Motive (z. B. SGL, VSG, LGS GSV) stammten jedoch überwiegend aus der alternativen Gruppe A, während andere (z. B. FGW, RTN, WGF, NTR) in der alternativen Gruppe B angereichert waren.
Validierung des CSF-Transports von CSF-angereicherten Phagen-präsentierten Peptiden und biotinylierten Leader-Peptiden, die an Streptavidin-Nutzlasten konjugiert sind.
(a) Anreicherungsverhältnisse, berechnet in allen vier Runden (R1-R4), basierend auf injizierten (Eingabe = I) Phagentitern (PFU) und bestimmten CSF-Phagentitern (Ausgabe = O).Die Anreicherungsfaktoren für die letzten drei Runden (R2-R4) wurden durch Vergleich mit der vorherigen Runde und der ersten Runde (R1) anhand von Gewichtsdaten berechnet.Offene Balken sind Liquor, schattierte Balken sind Plasma.(***p<0,001, basierend auf dem Student-t-Test).(b) Liste der am häufigsten vorkommenden Phagenpeptide, geordnet nach ihrem relativen Anteil an allen nach Runde 4 der Selektion im Liquor gesammelten Phagen.Die sechs häufigsten Phagenklone werden farblich hervorgehoben, nummeriert und ihre Anreicherungsfaktoren zwischen Runde 3 und 4 der Selektion (Einschübe) angegeben.(c,d) Die sechs am stärksten angereicherten Phagenklone, leeren Phagen und parentalen Phagenpeptidbibliotheken aus Runde 4 wurden einzeln in einem CSF-Probenahmemodell analysiert.Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Liquor- und Blutproben entnommen.(c) Gleiche Mengen von 6 Kandidaten-Phagenklonen (2 x 1010 Phagen/Tiere), leeren Phagen (#1779) (2 x 1010 Phagen/Tiere) und Stock-Phagenpeptidbibliotheken (2 x 1012 Phagen/Tiere). Injizieren Sie mindestens 3 CM und werden Sie dem kanülierten Tier separat über die Schwanzvene verabreicht.Die CSF-Pharmakokinetik jedes injizierten Phagenklons und jeder Phagenpeptidbibliothek im Zeitverlauf wird gezeigt.(d) zeigt das durchschnittliche CSF/Blut-Verhältnis für alle gewonnenen Phagen/ml über die Probenahmezeit.(e) Vier synthetische Leitpeptide und eine durcheinandergemischte Kontrolle wurden über ihren N-Terminus mit Biotin an Streptavidin gebunden (Tetramer-Anzeige), gefolgt von einer Injektion (Schwanzvene iv, 10 mg Streptavidin/kg).Mindestens drei intubierte Ratten (N = 3).).Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden CSF-Proben entnommen und die Streptavidin-Konzentrationen mittels CSF-Anti-Streptavidin-ELISA gemessen (nd = nicht nachgewiesen).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, basierend auf ANOVA-Test).(f) Vergleich der Aminosäuresequenz des am stärksten angereicherten Phagenpeptidklons #2002 (lila) mit anderen ausgewählten Phagenpeptidklonen aus der 4. Selektionsrunde.Identische und ähnliche Aminosäurefragmente sind farblich gekennzeichnet.
Von allen angereicherten Phagen in der vierten Runde (Abb. 3b) wurden sechs Kandidatenklone für die weitere Einzelanalyse im CSF-Probenahmemodell ausgewählt.Gleiche Mengen von sechs Kandidatenphagen-, leeren Phagen- (kein Insert) und Prophagenpeptidbibliotheken wurden in drei kanülierte CM-Tiere injiziert und die Pharmakokinetik wurde in CSF- (Abb. 3c) und Bluttests (ergänzende Abb. 7) bestimmt.Alle getesteten Phagenklone zielten auf das CSF-Kompartiment in einer Konzentration ab, die 10–1000 Mal höher war als die des leeren Kontrollphagen (#1779).Beispielsweise hatten die Klone Nr. 2020 und Nr. 2077 etwa 1000-mal höhere CSF-Titer als die Kontrollphagen.Das pharmakokinetische Profil jedes ausgewählten Peptids ist unterschiedlich, aber alle verfügen über eine hohe Liquor-Homing-Fähigkeit.Bei den Klonen Nr. 1903 und Nr. 2011 beobachteten wir einen konstanten Rückgang über die Zeit, während bei den Klonen Nr. 2077, Nr. 2002 und Nr. 2009 ein Anstieg während der ersten 10 Minuten auf einen aktiven Transport hindeuten könnte, der jedoch überprüft werden muss.Die Klone Nr. 2020, Nr. 2002 und Nr. 2077 stabilisierten sich auf hohen Niveaus, während die CSF-Konzentration von Klon Nr. 2009 nach dem anfänglichen Anstieg langsam abnahm.Anschließend verglichen wir die relative Häufigkeit jedes CSF-Kandidaten mit seiner Blutkonzentration (Abb. 3d).Die Korrelation des mittleren Titers jedes CSF-Kandidaten mit seinem Bluttiter zu allen Probenahmezeitpunkten zeigte, dass drei der sechs Kandidaten signifikant an Blut-CSF angereichert waren.Interessanterweise zeigte Klon Nr. 2077 eine höhere Blutstabilität (ergänzende Abbildung 7).Um zu bestätigen, dass die Peptide selbst in der Lage sind, andere Ladungen als Phagenpartikel aktiv in das CSF-Kompartiment zu transportieren, haben wir vier Leaderpeptide synthetisiert, die mit Biotin am N-Terminus derivatisiert sind, wo die Peptide an die Phagenpartikel binden.Biotinylierte Peptide (Nr. 2002, 2009, 2020 und 2077) wurden mit Streptavidin (SA) konjugiert, um multimere Formen zu erhalten, die die Phagengeometrie etwas nachahmen.Dieses Format ermöglichte es uns auch, die SA-Exposition im Blut und in der Liquor cerebrospinalis als frachttransportierende Proteinpeptide zu messen.Wichtig ist, dass Phagendaten häufig reproduziert werden konnten, wenn synthetische Peptide in diesem SA-konjugierten Format verabreicht wurden (Abb. 3e).Die gemischten Peptide hatten eine geringere anfängliche Exposition und eine schnellere CSF-Clearance mit nicht nachweisbaren Konzentrationen innerhalb von 48 Stunden.Um Einblick in die Transportwege dieser Peptid-Phagen-Klone in den CSF-Raum zu erhalten, haben wir die Lokalisierung einzelner Phagen-Peptid-Treffer mithilfe der Immunhistochemie (IHC) analysiert, um Phagen-Partikel eine Stunde nach der intravenösen Injektion in vivo direkt nachzuweisen.Insbesondere konnten die Klone Nr. 2002, Nr. 2077 und Nr. 2009 durch starke Färbung in Gehirnkapillaren nachgewiesen werden, während der Kontrollphage (Nr. 1779) und der Klon Nr. 2020 nicht nachgewiesen wurden (ergänzende Abbildung 8).Dies deutet darauf hin, dass diese Peptide gerade dadurch zur Wirkung auf das Gehirn beitragen, dass sie die Blut-Hirn-Schranke passieren.Um diese Hypothese zu testen, ist eine weitere detaillierte Analyse erforderlich, da möglicherweise auch die BSCFB-Route beteiligt ist.Beim Vergleich der Aminosäuresequenz des am stärksten angereicherten Klons (#2002) mit anderen ausgewählten Peptiden wurde festgestellt, dass einige von ihnen ähnliche Aminosäureverlängerungen aufweisen, was auf einen ähnlichen Transportmechanismus hinweisen könnte (Abb. 3f).
Aufgrund seines einzigartigen Plasmaprofils und des signifikanten Anstiegs der CSF im Laufe der Zeit wurde der Phagen-Display-Klon Nr. 2077 über einen längeren Zeitraum von 48 Stunden weiter untersucht und konnte den schnellen Anstieg der CSF reproduzieren, der im Zusammenhang mit anhaltenden SA-Werten beobachtet wurde (Abb. 4a).Was andere identifizierte Phagenklone betrifft, so zeigte #2077 eine starke Färbung der Gehirnkapillaren und zeigte bei Betrachtung mit höherer Auflösung eine signifikante Kolokalisation mit dem Kapillarmarker-Lektin sowie möglicherweise eine gewisse Färbung im Parenchymraum (Abbildung 4b).Um zu untersuchen, ob peptidvermittelte pharmakologische Wirkungen im ZNS erzielt werden können, führten wir ein Experiment durch, bei dem biotinylierte Versionen von i) dem #2077-Transitpeptid und ii) dem BACE1-Inhibitorpeptid mit SA in zwei verschiedenen Verhältnissen gemischt wurden.Für eine Kombination verwendeten wir nur den BACE1-Peptidinhibitor und für die andere verwendeten wir ein 1:3-Verhältnis von BACE1-Peptidinhibitor zu #2077-Peptid.Beide Proben wurden intravenös verabreicht und die Blut- und Liquorspiegel des Beta-Amyloid-Peptids 40 (Abeta40) wurden über die Zeit gemessen.Abeta40 wurde im Liquor gemessen, da es die BACE1-Hemmung im Gehirnparenchym widerspiegelt.Wie erwartet reduzierten beide Komplexe die Abeta40-Blutspiegel signifikant (Abb. 4c, d).Es können jedoch nur Proben verwendet werden, die eine Mischung aus Peptid Nr.2077 und ein an SA konjugierter Inhibitor des BACE1-Peptids verursachten einen signifikanten Rückgang von Abeta40 in der Liquor cerebrospinalis (Abb. 4c).Die Daten zeigen, dass Peptid Nr.2077 ist in der Lage, das 60 kDa große SA-Protein in das ZNS zu transportieren und löst außerdem pharmakologische Wirkungen mit SA-konjugierten Inhibitoren des BACE1-Peptids aus.
(a) Klonale Injektion (2 × 10 Phagen/Tier) von T7-Phagen, die langfristige pharmakokinetische Profile des CSF-Peptids #2077 (RLSSVDSDLSGC) und des nicht injizierten Kontrollphagen (#1779) bei mindestens drei CM-intubierten Ratten zeigt.(b) Konfokalmikroskopisches Bild repräsentativer kortikaler Mikrogefäße in Ratten, denen Phagen injiziert wurden (2 × 10 10 Phagen/Tier), das die Gegenfärbung von Peptid #2077 und Gefäßen (Lectin) zeigt.Diese Phagenklone wurden drei Ratten verabreicht und vor der Perfusion eine Stunde lang zirkulieren gelassen.Die Gehirne wurden geschnitten und mit polyklonalen FITC-markierten Antikörpern gegen das T7-Phagenkapsid gefärbt.Zehn Minuten vor der Perfusion und anschließenden Fixierung wurde DyLight594-markiertes Lektin intravenös verabreicht.Fluoreszenzbilder zeigen die Lektinfärbung (rot) der luminalen Seite von Mikrogefäßen und Phagen (grün) im Lumen von Kapillaren und perivaskulärem Hirngewebe.Der Maßstabsbalken entspricht 10 µm.(c, d) Biotinyliertes BACE1-Inhibitorpeptid allein oder in Kombination mit biotinyliertem Transitpeptid #2077 wurde an Streptavidin gekoppelt, gefolgt von einer intravenösen Injektion von mindestens drei kanülierten CM-Ratten (10 mg Streptavidin/kg).Die durch den BACE1-Peptidinhibitor vermittelte Reduktion von Aβ40 wurde durch Aβ1-40-ELISA in Blut (rot) und Liquor cerebrospinalis (orange) zu den angegebenen Zeitpunkten gemessen.Zur besseren Übersichtlichkeit ist in der Grafik eine gepunktete Linie im Maßstab 100 % eingezeichnet.(c) Prozentuale Reduzierung von Aβ40 im Blut (rote Dreiecke) und in der Liquor cerebrospinalis (orangefarbene Dreiecke) bei Ratten, die mit Streptavidin behandelt wurden, das an das Transitpeptid Nr. 2077 und das BACE1-Inhibitorpeptid im Verhältnis 3:1 konjugiert war.(d) Prozentuale Reduktion von Aβ40 im Blut (rote Kreise) und Liquor cerebrospinalis (orangefarbene Kreise) von Ratten, die nur mit Streptavidin in Verbindung mit einem BACE1-Inhibitorpeptid behandelt wurden.Die Aβ-Konzentration in der Kontrolle betrug 420 pg/ml (Standardabweichung = 101 pg/ml).
Phagen-Display wurde in mehreren Bereichen der biomedizinischen Forschung erfolgreich eingesetzt17.Diese Methode wurde für In-vivo-Studien zur Gefäßdiversität18,19 sowie für Studien, die auf Gehirngefäße abzielten,20,21,22,23,24,25,26 verwendet.In dieser Studie haben wir die Anwendung dieser Auswahlmethode nicht nur auf die direkte Identifizierung von Peptiden ausgeweitet, die auf Gehirngefäße abzielen, sondern auch auf die Entdeckung von Kandidaten mit aktiven Transporteigenschaften zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke.Wir beschreiben nun die Entwicklung eines In-vivo-Selektionsverfahrens bei CM-intubierten Ratten und demonstrieren dessen Potenzial zur Identifizierung von Peptiden mit CSF-Homing-Eigenschaften.Mithilfe des T7-Phagen, der eine Bibliothek von 12-mer-Zufallspeptiden präsentiert, konnten wir zeigen, dass der T7-Phage klein genug ist (ungefähr 60 nm im Durchmesser)10, um sich an die Blut-Hirn-Schranke anzupassen und dadurch direkt die Blut-Hirn-Schranke oder den Plexus choroideus zu überwinden.Wir beobachteten, dass die CSF-Ernte von kanülierten CM-Ratten eine gut kontrollierte In-vivo-Funktionsscreening-Methode war und dass der extrahierte Phagen nicht nur an das Gefäßsystem band, sondern auch als Transporter über die Blut-Hirn-Schranke fungierte.Darüber hinaus bestätigten wir durch die gleichzeitige Blutentnahme und Anwendung von HTS auf CSF und aus Blut gewonnene Phagen, dass unsere Wahl des CSF nicht durch die Blutanreicherung oder die Eignung für die Expansion zwischen den Selektionsrunden beeinflusst wurde.Allerdings ist das Blutkompartiment Teil des Auswahlverfahrens, da Phagen, die das Liquorkompartiment erreichen können, lange genug überleben und im Blutkreislauf zirkulieren müssen, um sich im Gehirn anzureichern.Um zuverlässige Sequenzinformationen aus HTS-Rohdaten zu extrahieren, haben wir Filter implementiert, die an plattformspezifische Sequenzierungsfehler im Analyseworkflow angepasst sind.Durch die Einbeziehung kinetischer Parameter in die Screening-Methode bestätigten wir die schnelle Pharmakokinetik von Wildtyp-T7-Phagen (t½ ~ 28 min) im Blut24, 27, 28 und bestimmten auch ihre Halbwertszeit in der Liquor cerebrospinalis (t½ ~ 26 min) pro Minute).Trotz ähnlicher pharmakokinetischer Profile in Blut und Liquor konnten im Liquor nur 0,001 % der Phagenkonzentration im Blut nachgewiesen werden, was auf eine geringe Hintergrundmobilität von Wildtyp-T7-Phagen über die Blut-Hirn-Schranke hindeutet.Diese Arbeit unterstreicht die Bedeutung der ersten Selektionsrunde bei der Verwendung von In-vivo-Panning-Strategien, insbesondere für Phagensysteme, die schnell aus dem Kreislauf entfernt werden, da nur wenige Klone in der Lage sind, das ZNS-Kompartiment zu erreichen.Daher war die Verringerung der Bibliotheksvielfalt in der ersten Runde sehr groß, da in diesem sehr strengen CSF-Modell letztendlich nur eine begrenzte Anzahl von Klonen gesammelt wurde.Diese In-vivo-Panning-Strategie umfasste mehrere Selektionsschritte wie die aktive Akkumulation im CSF-Kompartiment, das Überleben der Klone im Blutkompartiment und die schnelle Entfernung von T7-Phagenklonen aus dem Blut innerhalb der ersten 10 Minuten (Abb. 1d und ergänzende Abb. 4M).).Somit wurden nach der ersten Runde unterschiedliche Phagenklone im Liquor identifiziert, obwohl für einzelne Tiere derselbe Ausgangspool verwendet wurde.Dies deutet darauf hin, dass mehrere strenge Auswahlschritte für Quellbibliotheken mit einer großen Anzahl von Bibliotheksmitgliedern zu einer erheblichen Verringerung der Vielfalt führen.Daher werden zufällige Ereignisse zu einem integralen Bestandteil des anfänglichen Auswahlprozesses und haben großen Einfluss auf das Ergebnis.Es ist wahrscheinlich, dass viele der Klone in der ursprünglichen Bibliothek eine sehr ähnliche Neigung zur CSF-Anreicherung hatten.Selbst unter denselben Versuchsbedingungen können die Selektionsergebnisse jedoch aufgrund der geringen Anzahl jedes einzelnen Klons im anfänglichen Pool unterschiedlich sein.
Die im Liquor angereicherten Motive unterscheiden sich von denen im Blut.Interessanterweise stellten wir die erste Verschiebung hin zu glycinreichen Peptiden im Blut einzelner Tiere fest.(Abb. 1g, ergänzende Abb. 4e, 4f).Phagen, die Glycinpeptide enthalten, sind möglicherweise stabiler und werden weniger wahrscheinlich aus dem Verkehr gezogen.Diese glycinreichen Peptide wurden jedoch in den Liquorproben nicht nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die kuratierten Bibliotheken zwei verschiedene Selektionsschritte durchliefen: einen im Blut und einen anderen, der sich in der Liquor cerebrospinalis anreichern konnte.CSF-angereicherte Klone aus der vierten Selektionsrunde wurden ausführlich getestet.Bei fast allen einzeln getesteten Klonen wurde bestätigt, dass sie im Vergleich zum Blindkontrollphagen mit CSF angereichert waren.Ein Peptidhit (#2077) wurde genauer untersucht.Es zeigte eine längere Plasmahalbwertszeit im Vergleich zu anderen Treffern (Abbildung 3d und ergänzende Abbildung 7), und interessanterweise enthielt dieses Peptid einen Cysteinrest am C-Terminus.Kürzlich wurde gezeigt, dass der Zusatz von Cystein zu Peptiden deren pharmakokinetische Eigenschaften durch Bindung an Albumin verbessern kann 29 .Dies ist derzeit für Peptid Nr. 2077 nicht bekannt und bedarf weiterer Untersuchungen.Einige Peptide zeigten eine Valenzabhängigkeit bei der CSF-Anreicherung (Daten nicht gezeigt), die möglicherweise mit der angezeigten Oberflächengeometrie des T7-Kapsids zusammenhängt.Das von uns verwendete T7-System zeigte 5–15 Kopien jedes Peptids pro Phagenpartikel.IHC wurde an potenziellen Leitphagenklonen durchgeführt, die intravenös in die Großhirnrinde von Ratten injiziert wurden (ergänzende Abbildung 8).Die Daten zeigten, dass mindestens drei Klone (Nr. 2002, Nr. 2009 und Nr. 2077) mit der BBB interagierten.Es bleibt zu bestimmen, ob diese BHS-Interaktion zur Akkumulation von CSF oder zur Bewegung dieser Klone direkt zum BCSFB führt.Wichtig ist, dass wir zeigen, dass die ausgewählten Peptide ihre CSF-Transportkapazität behalten, wenn sie synthetisiert und an die Proteinfracht gebunden werden.Die Bindung von N-terminalen biotinylierten Peptiden an SA wiederholt im Wesentlichen die Ergebnisse, die mit ihren jeweiligen Phagenklonen im Blut und in der Liquor cerebrospinalis erzielt wurden (Abb. 3e).Schließlich zeigen wir, dass das Leitpeptid Nr. 2077 in der Lage ist, die Gehirnwirkung eines an SA konjugierten biotinylierten Peptidinhibitors von BACE1 zu fördern, was ausgeprägte pharmakodynamische Wirkungen im ZNS hervorruft, indem es die Abeta40-Spiegel im Liquor signifikant senkt (Abb. 4).Wir konnten keine Homologen in der Datenbank identifizieren, indem wir eine Peptidsequenz-Homologiesuche aller Treffer durchführten.Es ist wichtig zu beachten, dass die Größe der T7-Bibliothek ungefähr 109 beträgt, während die theoretische Bibliotheksgröße für 12-mere 4 x 1015 beträgt. Daher haben wir nur einen kleinen Bruchteil des Diversitätsraums der 12-mer-Peptidbibliothek ausgewählt, was bedeuten kann, dass optimiertere Peptide durch Auswertung des angrenzenden Sequenzraums dieser identifizierten Treffer identifiziert werden können.Hypothetisch könnte einer der Gründe, warum wir keine natürlichen Homologen dieser Peptide gefunden haben, die Abwahl während der Evolution sein, um den unkontrollierten Eintritt bestimmter Peptidmotive in das Gehirn zu verhindern.
Zusammengenommen bilden unsere Ergebnisse eine Grundlage für zukünftige Arbeiten zur detaillierteren Identifizierung und Charakterisierung der Transportsysteme der zerebrovaskulären Barriere in vivo.Der Grundaufbau dieser Methode basiert auf einer funktionellen Selektionsstrategie, die nicht nur Klone mit zerebralen Gefäßbindungseigenschaften identifiziert, sondern auch einen entscheidenden Schritt umfasst, bei dem erfolgreiche Klone über eine intrinsische Aktivität verfügen, um biologische Barrieren in vivo in das ZNS-Kompartiment zu überwinden.Ziel ist es, den Transportmechanismus dieser Peptide und ihre bevorzugte Bindung an das für die Gehirnregion spezifische Mikrogefäßsystem aufzuklären.Dies könnte zur Entdeckung neuer Wege für den Transport der BHS und der Rezeptoren führen.Wir gehen davon aus, dass die identifizierten Peptide direkt an zerebrovaskuläre Rezeptoren oder an zirkulierende Liganden binden können, die durch die BHS oder BCSFB transportiert werden.Die in dieser Arbeit entdeckten Peptidvektoren mit CSF-Transportaktivität werden weiter untersucht.Wir untersuchen derzeit die Gehirnspezifität dieser Peptide hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die BHS und/oder BCSFB zu passieren.Diese neuen Peptide werden äußerst wertvolle Werkzeuge für die potenzielle Entdeckung neuer Rezeptoren oder Signalwege und für die Entwicklung neuer hocheffizienter Plattformen für die Abgabe von Makromolekülen wie Biologika an das Gehirn sein.
Kanülieren Sie die große Zisterne (CM) mit einer Modifikation der zuvor beschriebenen Methode.Anästhesierte Wistar-Ratten (200–350 g) wurden auf einen stereotaktischen Apparat montiert und über der rasierten und aseptisch vorbereiteten Kopfhaut wurde ein mittlerer Einschnitt vorgenommen, um den Schädel freizulegen.Bohren Sie im Bereich des oberen Flügels zwei Löcher und befestigen Sie die Befestigungsschrauben in den Löchern.Zur stereotaktischen Führung einer Edelstahlkanüle in den CM wurde ein zusätzliches Loch in den lateralen Hinterhauptkamm gebohrt.Zahnzement um die Kanüle auftragen und mit Schrauben befestigen.Nach der Photohärtung und dem Aushärten des Zements wurde die Hautwunde mit 4/0 Supramid-Naht verschlossen.Die korrekte Platzierung der Kanüle wird durch den spontanen Austritt von Liquor (Liquor cerebrospinalis) bestätigt.Entfernen Sie die Ratte aus dem stereotaktischen Apparat, erhalten Sie eine angemessene postoperative Pflege und Schmerzbehandlung und lassen Sie sie sich mindestens eine Woche lang erholen, bis Anzeichen von Blut in der Liquor cerebrospinalis beobachtet werden.Wistar-Ratten (Crl:WI/Han) wurden von Charles River (Frankreich) erhalten.Alle Ratten wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten.Alle Tierversuche wurden vom Veterinäramt der Stadt Basel, Schweiz, genehmigt und gemäß der Tierlizenz Nr. 2474 (Bewertung des aktiven Gehirntransports durch Messung der Konzentration therapeutischer Kandidaten in der Cerebrospinalflüssigkeit und im Gehirn von Ratten) durchgeführt.
Halten Sie die Ratte vorsichtig mit der CM-Kanüle in der Hand bei Bewusstsein.Entfernen Sie Datura aus der Kanüle und sammeln Sie 10 µl spontan fließende Liquor cerebrospinalis.Da die Durchgängigkeit der Kanüle letztendlich beeinträchtigt war, wurden in diese Studie nur klare Liquorproben ohne Anzeichen einer Blutkontamination oder Verfärbung einbezogen.Parallel dazu wurden etwa 10–20 μl Blut aus einem kleinen Einschnitt an der Schwanzspitze in Röhrchen mit Heparin (Sigma-Aldrich) entnommen.CSF und Blut wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der intravenösen Injektion des T7-Phagen gesammelt.Vor der Entnahme jeder CSF-Probe wurden etwa 5–10 μl Flüssigkeit verworfen, was dem Totvolumen des Katheters entspricht.
Bibliotheken wurden mit dem T7Select 10-3b-Vektor generiert, wie im T7Select-Systemhandbuch beschrieben (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Kurz gesagt wurde ein zufälliges 12-mer-DNA-Insert im folgenden Format synthetisiert:
Das NNK-Codon wurde verwendet, um Doppelstoppcodons und eine Überexpression von Aminosäuren im Insert zu vermeiden.N ist ein manuell gemischtes äquimolares Verhältnis jedes Nukleotids und K ist ein manuell gemischtes äquimolares Verhältnis von Adenin- und Cytosin-Nukleotiden.Einzelsträngige Regionen wurden durch weitere Inkubation mit dNTP (Novagen) und Klenow-Enzym (New England Biolabs) in Klenow-Puffer (New England Biolabs) für 3 Stunden bei 37 °C in doppelsträngige DNA umgewandelt.Nach der Reaktion wurde doppelsträngige DNA durch EtOH-Fällung gewonnen.Die resultierende DNA wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII (beide von Roche) verdaut.Das gespaltene und gereinigte (QIAquick, Qiagen) Insert (T4-Ligase, New England Biolabs) wurde dann im Leseraster nach Aminosäure 348 des 10B-Kapsidgens in einen vorgespaltenen T7-Vektor ligiert.Die Ligationsreaktionen wurden vor der In-vitro-Verpackung 18 Stunden lang bei 16°C inkubiert.Die In-vitro-Phagenverpackung erfolgte gemäß den Anweisungen des T7Select 10-3b-Klonierungskits (Novagen) und die Verpackungslösung wurde einmal bis zur Lyse unter Verwendung von Escherichia coli (BLT5615, Novagen) amplifiziert.Die Lysate wurden zentrifugiert, titriert und bei –80°C als Glycerin-Stammlösung eingefroren.
Direkte PCR-Amplifikation variabler Phagenregionen, die in Brühe oder Platte unter Verwendung proprietärer 454/Roche-Amplicon-Fusionsprimer amplifiziert wurden.Der Vorwärtsfusionsprimer enthält Sequenzen, die die variable Region (NNK) 12 (vorlagenspezifisch), den GS FLX Titanium Adapter A und eine vierbasige Bibliotheksschlüsselsequenz (TCAG) flankieren (ergänzende Abbildung 1a):
Der Reverse-Fusion-Primer enthält außerdem an Capture-Beads gebundenes Biotin und den GS FLX Titanium Adapter B, der für die klonale Amplifikation während der Emulsions-PCR erforderlich ist:
Die Amplikons wurden dann einer 454/Roche-Pyrosequenzierung gemäß dem 454 GS-FLX Titanium-Protokoll unterzogen.Für die manuelle Sanger-Sequenzierung (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) wurde T7-Phagen-DNA durch PCR amplifiziert und mit den folgenden Primerpaaren sequenziert:
Inserts aus einzelnen Plaques wurden einer PCR-Amplifikation mit dem Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (gemäß den Anweisungen des Herstellers) unterzogen.Führen Sie einen Heißstart (10 Min. bei 95 °C) und 35 Boost-Zyklen (50 s bei 95 °C, 1 Min. bei 50 °C und 1 Min. bei 72 °C) durch.
Phagen aus Bibliotheken, Wildtyp-Phagen, aus Liquor und Blut gerettete Phagen oder einzelne Klone wurden in Escherichia coli BL5615 in TB-Brühe (Sigma Aldrich) oder in 500-cm2-Schalen (Thermo Scientific) 4 Stunden lang bei 37 °C amplifiziert.Phagen wurden aus den Platten extrahiert, indem die Platten mit Tris-EDTA-Puffer (Fluka Analytical) gespült wurden oder die Plaques mit sterilen Pipettenspitzen gesammelt wurden.Phagen wurden aus Kulturüberstand oder Extraktionspuffer mit einer Runde Polyethylenglykol (PEG 8000)-Fällung (Promega) isoliert und in Tris-EDTA-Puffer resuspendiert.
Der amplifizierte Phagen wurde vor der intravenösen (IV) Injektion (500 μl/Tier) 2–3 Runden der Endotoxinentfernung unter Verwendung von Endotoxinentfernungskügelchen (Miltenyi Biotec) unterzogen.In der ersten Runde wurden 2×1012 Phagen eingeführt;im zweiten 2×1010 Phagen;in der dritten und vierten Selektionsrunde 2×109 Phagen pro Tier.Der Phagengehalt in CSF- und Blutproben, die zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen wurden, wurde durch Plaquezählung gemäß den Anweisungen des Herstellers (T7Select-Systemhandbuch) bestimmt.Die Phagenselektion erfolgte durch intravenöse Injektion gereinigter Bibliotheken in die Schwanzvene oder durch erneute Injektion von aus CSF aus der vorherigen Selektionsrunde extrahierten Phagen. Die nachfolgenden Ernten erfolgten jeweils nach 10 Minuten, 30 Minuten, 60 Minuten, 90 Minuten, 120 Minuten, 180 Minuten und 240 Minuten aus CSF- und Blutproben.Insgesamt wurden vier In-vivo-Panning-Runden durchgeführt, bei denen die beiden ausgewählten Zweige während der ersten drei Selektionsrunden getrennt gespeichert und analysiert wurden.Alle aus CSF der ersten beiden Selektionsrunden extrahierten Phageninserts wurden einer 454/Roche-Pyrosequenzierung unterzogen, während alle aus CSF der letzten beiden Selektionsrunden extrahierten Klone manuell sequenziert wurden.Alle Blutphagen aus der ersten Selektionsrunde wurden auch einer 454/Roche-Pyrosequenzierung unterzogen.Zur Injektion von Phagenklonen wurden ausgewählte Phagen in E. coli (BL5615) auf 500-cm2-Platten bei 37 °C 4 Stunden lang amplifiziert.Individuell ausgewählte und manuell sequenzierte Klone wurden in TB-Medium vermehrt.Nach Phagenextraktion, Reinigung und Entfernung von Endotoxin (wie oben beschrieben) wurden 2 × 1010 Phagen/Tier in 300 μl intravenös in eine Schwanzvene injiziert.
Vorverarbeitung und qualitative Filterung von Sequenzdaten.Die Rohdaten von 454/Roche wurden mithilfe von Herstellersoftware von einem binären Standard-Stream-Map-Format (SFF) in ein für Menschen lesbares Pearson-Format (Fasta) konvertiert.Die weitere Verarbeitung der Nukleotidsequenz wurde mit proprietären C-Programmen und Skripten (unveröffentlichtes Softwarepaket) wie unten beschrieben durchgeführt.Die Analyse der Primärdaten umfasst strenge mehrstufige Filterverfahren.Um Lesevorgänge herauszufiltern, die keine gültige 12mer-Insert-DNA-Sequenz enthielten, wurden die Lesevorgänge mithilfe des globalen Needleman-Wunsch-Tests nacheinander auf Startmarkierung (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), Stoppmarkierung (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) und Hintergrundeinfügung (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ausgerichtet.Ausrichtung, die bis zu 2 Inkonsistenzen pro Ausrichtung zulässt31.Daher wurden Lesevorgänge ohne Start- und Stopp-Tags und Lesevorgänge mit Hintergrundeinfügungen, also Ausrichtungen, die die zulässige Anzahl an Nichtübereinstimmungen überschreiten, aus der Bibliothek entfernt.Was die verbleibenden Lesevorgänge betrifft, so wurde die N-mer-DNA-Sequenz, die von der Startmarke reichte und vor der Stoppmarke endete, aus der ursprünglichen Lesesequenz herausgeschnitten und weiterverarbeitet (im Folgenden als „Einfügung“ bezeichnet).Nach der Translation des Inserts wird der Teil nach dem ersten Stoppcodon am 5'-Ende des Primers aus dem Insert entfernt.Darüber hinaus wurden auch Nukleotide entfernt, die zu unvollständigen Codons am 3'-Ende des Primers führten.Um Inserts auszuschließen, die nur Hintergrundsequenzen enthalten, wurden auch translatierte Inserts entfernt, die mit dem Aminosäuremuster „PAG“ beginnen.Peptide mit einer posttranslationalen Länge von weniger als 3 Aminosäuren wurden aus der Bibliothek entfernt.Entfernen Sie abschließend die Redundanz im Einfügungspool und bestimmen Sie die Häufigkeit jeder einzelnen Einfügung.Die Ergebnisse dieser Analyse umfassten eine Liste von Nukleotidsequenzen (Inserts) und deren (Lese-)Häufigkeiten (Ergänzende Abbildungen 1c und 2).
Gruppieren Sie N-mer-DNA-Inserts nach Sequenzähnlichkeit: Um 454/Roche-spezifische Sequenzierungsfehler (z. B. Probleme bei der Sequenzierung von Homopolymerverlängerungen) zu beseitigen und weniger wichtige Redundanzen zu entfernen, werden zuvor gefilterte N-mer-DNA-Sequenzinserts (Inserts) nach Ähnlichkeit sortiert.Einfügungen (bis zu 2 nicht übereinstimmende Basen zulässig) mithilfe eines iterativen Algorithmus, der wie folgt definiert ist: Einfügungen werden zuerst nach ihrer Häufigkeit (von der höchsten zur niedrigsten) und, wenn sie gleich sind, nach ihrer sekundären Sortierung nach Länge (von der längsten zur kürzesten) sortiert.Somit definieren die häufigsten und längsten Einfügungen die erste „Gruppe“.Die Gruppenfrequenz wird auf die Schlüsselfrequenz eingestellt.Anschließend wurde versucht, jede in der sortierten Liste verbleibende Einfügung durch paarweise Needleman-Wunsch-Ausrichtung zur Gruppe hinzuzufügen.Wenn die Anzahl der Nichtübereinstimmungen, Einfügungen oder Löschungen in einem Alignment einen Schwellenwert von 2 nicht überschreitet, wird der Gruppe eine Einfügung hinzugefügt und die Gesamtgruppenhäufigkeit wird um die Häufigkeit erhöht, mit der die Einfügung hinzugefügt wurde.Zu einer Gruppe hinzugefügte Beilagen werden als verwendet markiert und von der weiteren Bearbeitung ausgeschlossen.Kann die Einfügesequenz nicht zu einer bereits bestehenden Gruppe hinzugefügt werden, wird anhand der Einfügesequenz eine neue Gruppe mit der entsprechenden Einfügehäufigkeit erstellt und als verwendet markiert.Die Iteration endet, wenn jede Einfügungssequenz entweder zur Bildung einer neuen Gruppe verwendet wurde oder in eine bereits bestehende Gruppe aufgenommen werden kann.Schließlich werden gruppierte Inserts, die aus Nukleotiden bestehen, schließlich in Peptidsequenzen (Peptidbibliotheken) übersetzt.Das Ergebnis dieser Analyse ist eine Reihe von Einfügungen und ihren entsprechenden Häufigkeiten, die die Anzahl aufeinanderfolgender Lesevorgänge ausmachen (ergänzende Abbildung 2).
Motivgenerierung: Basierend auf einer Liste einzigartiger Peptide wurde eine Bibliothek erstellt, die alle möglichen Aminosäuremuster (aa) enthält, wie unten gezeigt.Jedes mögliche Muster der Länge 3 wurde aus dem Peptid extrahiert und sein inverses Muster zusammen mit einer gemeinsamen Motivbibliothek, die alle Muster (Tripeptide) enthielt, hinzugefügt.Bibliotheken mit sich stark wiederholenden Motiven wurden sequenziert und Redundanzen entfernt.Dann überprüften wir für jedes Tripeptid in der Motivbibliothek mithilfe von Computertools, ob es in der Bibliothek vorhanden ist.In diesem Fall wird die Häufigkeit des Peptids, das das gefundene Motivtripeptid enthält, addiert und dem Motiv in der Motivbibliothek zugeordnet („Anzahl der Motive“).Das Ergebnis der Motivgenerierung ist ein zweidimensionales Array, das alle Vorkommen von Tripeptiden (Motiven) und ihre jeweiligen Werte enthält. Dabei handelt es sich um die Anzahl der Sequenzierungslesevorgänge, die zum entsprechenden Motiv führen, wenn die Lesevorgänge gefiltert, gruppiert und übersetzt werden.Metriken wie oben ausführlich beschrieben.
Normalisierung der Anzahl der Motive und entsprechender Streudiagramme: Die Anzahl der Motive für jede Probe wurde mit normalisiert
Dabei ist ni die Anzahl der Lesevorgänge, die das Thema i enthalten.Somit stellt vi die prozentuale Häufigkeit von Lesevorgängen (oder Peptiden) dar, die das Motiv i in der Probe enthalten.P-Werte für die nicht normalisierte Anzahl von Motiven wurden mithilfe des exakten Fisher-Tests berechnet.Bezüglich der Korrelogramme der Anzahl der Motive wurden Spearmans Korrelationen anhand der normalisierten Anzahl der Motive mit R berechnet.
Um den Gehalt an Aminosäuren an jeder Position in der Peptidbibliothek zu visualisieren, wurden Weblogogramme 32, 33 (http://weblogo. threeplusone.com) erstellt.Zunächst wird der Gehalt an Aminosäuren an jeder Position des 12-mer-Peptids in einer 20×12-Matrix gespeichert.Anschließend wird ein Satz von 1000 Peptiden, die an jeder Position den gleichen relativen Aminosäuregehalt enthalten, im Fasta-Sequenzformat generiert und als Eingabe für Web-Logo 3 bereitgestellt, das eine grafische Darstellung des relativen Aminosäuregehalts an jeder Position generiert.für eine gegebene Peptidbibliothek.Zur Visualisierung mehrdimensionaler Datensätze wurden Heatmaps mit einem intern entwickelten Tool in R (biosHeatmap, ein noch zu veröffentlichendes R-Paket) erstellt.Die in den Wärmekarten dargestellten Dendrogramme wurden mithilfe der hierarchischen Clustering-Methode von Ward mit der euklidischen Distanzmetrik berechnet.Zur statistischen Analyse der Motivbewertungsdaten wurden P-Werte für die nicht normalisierte Bewertung mithilfe des exakten Fisher-Tests berechnet.P-Werte für andere Datensätze wurden in R mithilfe des Student-t-Tests oder der ANOVA berechnet.
Ausgewählte Phagenklone und Phagen ohne Inserts wurden intravenös über die Schwanzvene injiziert (2 × 1010 Phagen/Tier in 300 μl PBS).Zehn Minuten vor der Perfusion und anschließenden Fixierung wurden denselben Tieren 100 μl DyLight594-markiertes Lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177) intravenös injiziert.60 Minuten nach der Phageninjektion wurde den Ratten 50 ml PBS, gefolgt von 50 ml 4 % PFA/PBS, durch das Herz perfundiert.Gehirnproben wurden zusätzlich über Nacht in 4 % PFA/PBS fixiert und über Nacht bei 4 °C in 30 % Saccharose eingeweicht.Die Proben werden in der OCT-Mischung schockgefroren.Die immunhistochemische Analyse gefrorener Proben wurde bei Raumtemperatur an 30-µm-Kryoschnitten durchgeführt, die mit 1 % BSA blockiert und mit polyklonalen FITC-markierten Antikörpern gegen T7-Phagen (Novus NB 600-376A) bei 4 °C inkubiert wurden.Über Nacht inkubieren.Abschließend wurden die Schnitte dreimal mit PBS gewaschen und mit einem konfokalen Lasermikroskop (Leica TCS SP5) untersucht.
Alle Peptide mit einer Mindestreinheit von 98 % wurden von GenScript USA synthetisiert, biotinyliert und lyophilisiert.Biotin wird über einen zusätzlichen dreifachen Glycin-Spacer am N-Terminus gebunden.Überprüfen Sie alle Peptide mittels Massenspektrometrie.
Streptavidin (Sigma S0677) wurde mit einem 5-fach äquimolaren Überschuss an biotinyliertem Peptid, biotinyliertem BACE1-inhibitorischem Peptid oder einer Kombination (3:1-Verhältnis) aus biotinyliertem BACE1-inhibitorischem Peptid und BACE1-inhibitorischem Peptid in 5–10 % DMSO gemischt/in PBS inkubiert.1 Stunde bei Raumtemperatur vor der Injektion.Streptavidin-konjugierte Peptide wurden intravenös in einer Dosis von 10 mg/kg in eine der Schwanzvenen von Ratten mit einer Gehirnhöhle injiziert.
Die Konzentration der Streptavidin-Peptid-Komplexe wurde mittels ELISA bestimmt.Nunc Maxisorp-Mikrotiterplatten (Sigma) wurden über Nacht bei 4 °C mit 1,5 μg/ml Maus-Anti-Streptavidin-Antikörper (Thermo, MA1-20011) beschichtet.Nach dem Blockieren (Blockierungspuffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % Gelatine, 1 % BSA) bei Raumtemperatur für 2 Stunden, Waschen der Platte mit 0,05 % Tween-20/PBS (Waschpuffer) für 3 Sekunden. CSF- und Plasmaproben wurden in die mit Blockierungspuffer (Plasma 1:10.000, CSF 1:115) verdünnten Vertiefungen gegeben ).Anschließend wurde die Platte über Nacht bei 4 °C mit Detektionsantikörper (1 μg/ml, Anti-Streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) inkubiert.Nach drei Waschschritten wurde Streptavidin durch Inkubation in TMB-Substratlösung (Roche) für bis zu 20 Minuten nachgewiesen.Nachdem Sie die Farbentwicklung mit 1 M H2SO4 gestoppt haben, messen Sie die Absorption bei 450 nm.
Die Funktion des Streptavidin-Peptid-BACE1-Inhibitor-Komplexes wurde durch Aβ(1-40) ELISA gemäß dem Protokoll des Herstellers (Wako, 294-64701) bewertet.Kurz gesagt, CSF-Proben wurden in Standardverdünnungsmittel (1:23) verdünnt und über Nacht bei 4 °C in Platten mit 96 Vertiefungen inkubiert, die mit dem Fängerantikörper BNT77 beschichtet waren.Nach fünf Waschschritten wurde HRP-konjugierter BA27-Antikörper zugegeben und für 2 Stunden bei 4°C inkubiert, gefolgt von fünf Waschschritten.Aβ(1–40) wurde durch 30-minütige Inkubation in TMB-Lösung bei Raumtemperatur nachgewiesen.Nachdem die Farbentwicklung mit Stopplösung gestoppt wurde, messen Sie die Absorption bei 450 nm.Plasmaproben wurden vor dem Aβ(1–40)-ELISA einer Festphasenextraktion unterzogen.Plasma wurde zu 0,2 % DEA (Sigma) in 96-Well-Platten gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.Nach sukzessivem Waschen der SPE-Platten (Oasis, 186000679) mit Wasser und 100 % Methanol wurden Plasmaproben zu den SPE-Platten gegeben und die gesamte Flüssigkeit entfernt.Die Proben wurden gewaschen (zuerst mit 5 % Methanol, dann mit 30 % Methanol) und mit 2 % NH4OH/90 % Methanol eluiert.Nach dem Trocknen des Eluats bei 55 °C für 99 Minuten bei konstantem N2-Strom wurden die Proben in Standardverdünnungsmitteln reduziert und Aβ(1–40) wie oben beschrieben gemessen.
Zitierweise für diesen Artikel: Urich, E. et al.Frachttransport zum Gehirn mithilfe von in vivo identifizierten Transitpeptiden.die Wissenschaft.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
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