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Die Blut-Hirn-Schranke verhindert, dass biotherapeutische Wirkstoffe ihre Zielstrukturen im zentralen Nervensystem erreichen und behindert somit die effektive Behandlung neurologischer Erkrankungen. Um neue Hirntransporter in vivo zu entdecken, führten wir eine T7-Phagen-Peptidbibliothek ein und sammelten seriell Blut und Liquor (CSF) in einem kanülierten, wachen Rattenmodell mit großem Pool. Spezifische Phagenklone waren nach vier Selektionsrunden im Liquor stark angereichert. Die Untersuchung einzelner Kandidatenpeptide ergab eine mehr als 1000-fache Anreicherung im Liquor. Die Bioaktivität der Peptid-vermittelten Verabreichung ins Gehirn wurde durch eine 40%ige Reduktion des Amyloid-β-Spiegels im Liquor bestätigt. Hierfür wurde ein BACE1-Peptidinhibitor verwendet, der an das identifizierte neue Transitpeptid gekoppelt war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die mittels In-vivo-Phagenselektion identifizierten Peptide als nützliche Vehikel für die systemische Verabreichung von Makromolekülen ins Gehirn mit therapeutischer Wirkung dienen könnten.
Die Forschung im Bereich der zielgerichteten Therapie des zentralen Nervensystems (ZNS) konzentrierte sich bisher vorwiegend auf die Identifizierung optimierter Wirkstoffe mit ZNS-spezifischen Eigenschaften, während die Mechanismen der aktiven Wirkstoffabgabe an das Gehirn weniger Beachtung fanden. Dies ändert sich nun, da die Wirkstoffabgabe, insbesondere von großen Molekülen, ein integraler Bestandteil der modernen neurowissenschaftlichen Arzneimittelentwicklung ist. Das zentrale Nervensystem ist durch das zerebrovaskuläre Barrieresystem, bestehend aus der Blut-Hirn-Schranke (BHS) und der Blut-Hirn-Schranke (BHS), gut geschützt¹, was die Wirkstoffabgabe an das Gehirn erschwert^1,2. Schätzungen zufolge werden nahezu alle großen und über 98 % der kleinen Moleküle aus dem Gehirn eliminiert³. Daher ist die Identifizierung neuer Transportsysteme für das Gehirn, die eine effiziente und spezifische Abgabe von Therapeutika an das ZNS ermöglichen, von großer Bedeutung^4,5. Gleichzeitig bieten die BHS und die BHS auch eine hervorragende Möglichkeit für die Wirkstoffabgabe, da sie über das ausgedehnte Gefäßsystem des Gehirns alle Hirnstrukturen durchdringen und erreichen können. Die aktuellen Bemühungen um nicht-invasive Methoden zur Wirkstoffverabreichung an das Gehirn basieren daher größtenteils auf dem Mechanismus des rezeptorvermittelten Transports (PMT) unter Verwendung des endogenen Blut-Hirn-Schranken-Rezeptors (BHS)⁶. Trotz jüngster wichtiger Fortschritte durch den Transferrinrezeptor-Signalweg^7,8 ist die Weiterentwicklung neuer Verabreichungssysteme mit verbesserten Eigenschaften erforderlich. Ziel unserer Studie war es daher, Peptide zu identifizieren, die den Transport in die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) vermitteln können, da diese prinzipiell für die Verabreichung von Makromolekülen an das zentrale Nervensystem (ZNS) oder zur Erschließung neuer Rezeptorwege genutzt werden könnten. Insbesondere spezifische Rezeptoren und Transporter des zerebrovaskulären Systems (BHS und Blut-Hirn-Schranken-Transporter) können als potenzielle Zielstrukturen für die aktive und gezielte Verabreichung biotherapeutischer Wirkstoffe dienen. Die Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) ist ein Sekretionsprodukt des Plexus choroideus (CS) und steht über den Subarachnoidalraum und den Ventrikelraum in direktem Kontakt mit der interstitiellen Flüssigkeit des Gehirns⁴. Kürzlich wurde gezeigt, dass subarachnoidale Zerebrospinalflüssigkeit übermäßig in das Interstitium des Gehirns diffundiert⁹. Wir hoffen, den Parenchymraum über diesen subarachnoidalen Zuflusstrakt oder direkt über die Blut-Hirn-Schranke zu erreichen. Um dies zu realisieren, haben wir eine robuste In-vivo-Phagenselektionsstrategie implementiert, die idealerweise Peptide identifiziert, die über einen dieser beiden unterschiedlichen Transportwege transportiert werden.
Wir beschreiben eine sequentielle In-vivo-Phagen-Display-Screening-Methode mit Liquorprobenentnahme in Kombination mit Hochdurchsatzsequenzierung (HTS) zur Überwachung der ersten Selektionsrunden mit der höchsten Bibliotheksdiversität. Das Screening wurde an wachen Ratten mit einer permanent implantierten großen Zisternenkanüle (CM-Kanüle) durchgeführt, um eine Blutkontamination zu vermeiden. Dieser Ansatz selektiert sowohl Peptide mit Zielgenauigkeit für das Gehirn als auch solche mit Transportaktivität über die zerebrovaskuläre Barriere. Wir verwendeten T7-Phagen aufgrund ihrer geringen Größe (~60 nm)¹⁰ und vermuteten, dass sie für den Transport von Vesikeln geeignet sind, die den transzellulären Übertritt der Endothel- und/oder Epithel-Medulla-Barriere ermöglichen. Nach vier Selektionsrunden wurden Phagenpopulationen isoliert, die eine starke In-vivo-Anreicherung im Liquor und eine Assoziation mit zerebralen Mikrogefäßen zeigten. Wir konnten unsere Ergebnisse bestätigen, indem wir nachwiesen, dass die bevorzugten und chemisch synthetisierten vielversprechendsten Kandidatenpeptide Proteinfracht in den Liquor transportieren können. Zunächst wurden die pharmakodynamischen Effekte im ZNS durch die Kombination eines führenden Transitpeptids mit einem Inhibitor des BACE1-Peptids untersucht. Neben dem Nachweis, dass In-vivo-Screeningstrategien neuartige Hirntransportpeptide als effektive Proteintransporter identifizieren können, erwarten wir, dass ähnliche funktionelle Selektionsansätze auch bei der Identifizierung neuer Hirntransportwege an Bedeutung gewinnen werden.
Basierend auf plaquebildenden Einheiten (PFU) wurde nach der Phagenverpackung eine Bibliothek zufälliger, linearer 12-mer-T7-Phagenpeptide mit einer Diversität von ca. 10⁹ entworfen und erstellt (siehe Material und Methoden). Diese Bibliothek wurde vor dem In-vivo-Panning sorgfältig analysiert. Die PCR-Amplifikation von Phagenbibliotheksproben mit modifizierten Primern erzeugte Amplifikate, die direkt für das Hochdurchsatzsequenzierungs-System (HTS) verwendet werden konnten (Abb. S1a). Aufgrund von a) Sequenzierungsfehlern im HTS11-System, b) Auswirkungen auf die Qualität der Primer (NNK)1–12 und c) dem Vorhandensein von Wildtyp-Phagen (Skelett-Inserts) in der Standby-Bibliothek wurde ein Sequenzfilterverfahren implementiert, um nur verifizierte Sequenzinformationen zu extrahieren (Abb. S1b). Diese Filterschritte gelten für alle HTS-Sequenzierungsbibliotheken. Für die Standardbibliothek wurden insgesamt 233.868 Reads generiert, von denen 39 % die Filterkriterien erfüllten und für die Bibliotheksanalyse und -selektion in den nachfolgenden Runden verwendet wurden (Ergänzende Abbildung 1c–e). Die Reads waren überwiegend Vielfache von 3 Basenpaaren lang, mit einem Maximum bei 36 Nukleotiden (Ergänzende Abbildung 1c), was das Bibliotheksdesign (NNK) 1-12 bestätigte. Bemerkenswerterweise enthielten etwa 11 % der Bibliothekselemente ein 12-dimensionales Wildtyp-Backbone (wt) mit der Sequenz PAGISRELVDKL, und fast die Hälfte der Sequenzen (49 %) wies Insertionen oder Deletionen auf. Die Hochdurchsatzsequenzierung (HTS) der Bibliothek bestätigte die hohe Diversität der Peptide: Mehr als 81 % der Peptidsequenzen wurden nur einmal gefunden, und nur 1,5 % traten in ≥4 Kopien auf (Ergänzende Abbildung 2a). Die Häufigkeiten der Aminosäuren (AS) an allen 12 Positionen des Repertoires korrelierten gut mit den für die Anzahl der durch das degenerierte NKK-Repertoire generierten Codons erwarteten Häufigkeiten (Abb. S2b). Die beobachtete Häufigkeit der durch diese Inserts kodierten Aminosäurereste korrelierte gut mit der berechneten Häufigkeit (r = 0,893) (Abb. S2c). Die Präparation von Phagenbibliotheken für die Injektion umfasst die Schritte der Amplifikation und der Endotoxinentfernung. Es wurde bereits gezeigt, dass dies die Diversität von Phagenbibliotheken potenziell verringern kann^12,13. Daher sequenzierten wir eine mittels Plattenamplifikation hergestellte und endotoxinfreie Phagenbibliothek und verglichen sie mit der ursprünglichen Bibliothek, um die Häufigkeit der Aminosäuren zu bestimmen. Zwischen dem ursprünglichen Pool und dem amplifizierten und gereinigten Pool wurde eine starke Korrelation (r = 0,995) beobachtet (Abb. S2d), was darauf hindeutet, dass die Konkurrenz zwischen den mittels T7-Phagen auf Platten amplifizierten Klonen keine wesentliche Verzerrung verursachte. Dieser Vergleich basiert auf der Häufigkeit von Tripeptidmotiven in den einzelnen Bibliotheken, da die Diversität der Bibliotheken (~10⁹) selbst mit HTS nicht vollständig erfasst werden kann. Die Häufigkeitsanalyse der Aminosäuren an jeder Position zeigte eine geringe positionsabhängige Häufung in den letzten drei Positionen des eingegebenen Repertoires (Abb. S2e). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Qualität und Diversität der Bibliothek akzeptabel waren und nur geringfügige Veränderungen der Diversität durch die Amplifikation und Präparation der Phagenbibliotheken zwischen mehreren Selektionsrunden beobachtet wurden.
Serielle Liquorproben können durch chirurgische Implantation einer Kanüle in das Zwerchfell wacher Ratten gewonnen werden, um die Identifizierung intravenös (i.v.) über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) und/oder die Blut-Liquor-Schranke (BLS) injizierter T7-Phagen zu erleichtern (Abb. 1a-b). In den ersten drei Runden der In-vivo-Selektion verwendeten wir zwei unabhängige Selektionsarme (Arm A und B) (Abb. 1c). Die Selektionsstrenge wurde schrittweise erhöht, indem die Gesamtmenge der in den ersten drei Runden eingebrachten Phagen reduziert wurde. In der vierten Selektionsrunde wurden Proben aus den Armen A und B kombiniert und drei weitere unabhängige Selektionen durchgeführt. Um die In-vivo-Eigenschaften von T7-Phagenpartikeln in diesem Modell zu untersuchen, wurde Ratten Wildtyp-Phage (PAGISRELVDKL-Masterinsert) über die Schwanzvene injiziert. Die Gewinnung von Phagen aus Liquor und Blut zu verschiedenen Zeitpunkten zeigte, dass relativ kleine ikosaedrische T7-Phagen eine schnelle initiale Clearance-Phase aus dem Blutkreislauf aufwiesen (Ergänzende Abb. 3). Basierend auf den verabreichten Titern und dem Blutvolumen der Ratten berechneten wir, dass 10 Minuten nach intravenöser Injektion nur noch etwa 1 Gew.-% der verabreichten Phagen im Blut nachweisbar waren. Nach diesem anfänglichen raschen Abfall wurde eine langsamere primäre Clearance mit einer Halbwertszeit von 27,7 Minuten gemessen. Bemerkenswerterweise wurden nur sehr wenige Phagen aus dem Liquorraum gewonnen, was auf eine geringe Hintergrundmigration von Wildtyp-Phagen in den Liquorraum hindeutet (Ergänzende Abb. 3). Im Durchschnitt wurden über den gesamten Untersuchungszeitraum (0–250 min) nur etwa 1 × 10⁻³ Titer von T7-Phagen im Blut und 4 × 10⁻⁸ % der initial infundierten Phagen im Liquor nachgewiesen. Die Halbwertszeit (25,7 min) der Wildtyp-Phagen im Liquorraum entsprach der im Blut. Diese Daten belegen, dass die Barriere, die den Liquorraum vom Blut trennt, bei CM-kanülierten Ratten intakt ist, was die In-vivo-Selektion von Phagenbibliotheken ermöglicht, um Klone zu identifizieren, die leicht aus dem Blut in den Liquorraum transportiert werden können.
(a) Entwicklung einer Methode zur erneuten Probenahme von Liquor cerebrospinalis (CSF) aus einem großen Pool. (b) Diagramm zur zellulären Lage der ZNS-Schranke und der Selektionsstrategie zur Identifizierung von Peptiden, die die Blut-Hirn-Schranke (BHS) überwinden. (c) Ablaufdiagramm des In-vivo-Phagen-Display-Screenings. In jeder Selektionsrunde wurden Phagen (Tierkennungen innerhalb der Pfeile) intravenös injiziert. Zwei unabhängige alternative Zweige (A, B) werden bis zur 4. Selektionsrunde getrennt geführt. In den Selektionsrunden 3 und 4 wurde jeder aus CSF extrahierte Phagenklon manuell sequenziert. (d) Kinetik der aus Blut (rote Kreise) und Liquor (grüne Dreiecke) isolierten Phagen während der ersten Selektionsrunde in zwei kanülierten Ratten nach intravenöser Injektion der T7-Peptidbibliothek (2 x 10¹² Phagen/Tier). Blaue Quadrate zeigen die durchschnittliche Ausgangskonzentration der Phagen im Blut an, berechnet aus der Menge der injizierten Phagen unter Berücksichtigung des Gesamtblutvolumens. Die schwarzen Quadrate markieren den Schnittpunkt der aus den Blutphagenkonzentrationen extrapolierten y-Achse. (e, f) Die relative Häufigkeit und Verteilung aller möglichen überlappenden Tripeptidmotive im Peptid werden dargestellt. Die Anzahl der in 1000 Messungen gefundenen Motive ist angegeben. Signifikant (p < 0,001) angereicherte Motive sind mit roten Punkten markiert. (e) Korrelationsdiagramm zum Vergleich der relativen Häufigkeit des Tripeptidmotivs der injizierten Bibliothek mit blutstämmigen Phagen der Tiere Nr. 1.1 und 1.2. (f) Korrelationsdiagramm zum Vergleich der relativen Häufigkeiten der Tripeptidmotive der Tierphagen Nr. 1.1 und 1.2, die in Blut und Liquor isoliert wurden. (g, h) Sequenz-ID-Darstellung von im Blut angereicherten Phagen (g) im Vergleich zu injizierten Bibliotheken und von im Liquor angereicherten Phagen (h) im Vergleich zu Blut nach einer Runde In-vivo-Selektion in beiden Tieren. Die Größe des Einbuchstabencodes gibt die Häufigkeit der jeweiligen Aminosäure an dieser Position an. Grün = polare, violette = neutrale, blaue = basische, rote = saure und schwarze = hydrophobe Aminosäuren. Abbildung 1a, b wurde von Eduard Urich entworfen und erstellt.
Wir injizierten zwei CM-Instrument-Ratten (Klade A und B) eine Phagenpeptidbibliothek und isolierten Phagen aus Liquor und Blut (Abb. 1d). Die anfängliche schnelle Clearance der Bibliothek war im Vergleich zum Wildtyp-Phagen weniger ausgeprägt. Die mittlere Halbwertszeit der injizierten Bibliothek betrug bei beiden Tieren 24,8 Minuten im Blut, ähnlich dem Wildtyp-Phagen, und 38,5 Minuten im Liquor. Blut- und Liquorproben beider Tiere wurden einem Hochdurchsatz-Screening (HTS) unterzogen, und alle identifizierten Peptide wurden auf das Vorhandensein eines kurzen Tripeptidmotivs analysiert. Tripeptidmotive wurden gewählt, da sie eine minimale Grundlage für die Strukturbildung und Peptid-Protein-Interaktionen bieten^14,15. Wir fanden eine gute Korrelation in der Verteilung der Motive zwischen der injizierten Phagenbibliothek und den aus dem Blut beider Tiere extrahierten Klonen (Abb. 1e). Die Daten deuten darauf hin, dass die Bibliothek im Blutkompartiment nur geringfügig angereichert ist. Aminosäurehäufigkeiten und Konsensussequenzen wurden an jeder Position mithilfe einer angepassten Version der Software Weblogo16 weiter analysiert. Interessanterweise fanden wir eine starke Anreicherung von Glycinresten im Blut (Abb. 1g). Beim Vergleich von Blut mit aus Liquor selektierten Klonen zeigte sich eine starke Selektion und teilweise Deselektion von Motiven (Abb. 1f), und bestimmte Aminosäuren waren bevorzugt an vorbestimmten Positionen im 12-mer-Peptid vorhanden (Abb. 1h). Bemerkenswerterweise unterschieden sich die einzelnen Tiere signifikant im Liquor, während im Blut bei beiden Tieren eine Glycinanreicherung beobachtet wurde (Abb. S4a–j). Nach strenger Filterung der Sequenzdaten im Liquor der Tiere 1.1 und 1.2 wurden insgesamt 964 bzw. 420 einzigartige 12-mer-Peptide erhalten (Abb. S1d–e). Die isolierten Phagenklone wurden amplifiziert und einer zweiten Runde der In-vivo-Selektion unterzogen. Die aus der zweiten Selektionsrunde extrahierten Phagen wurden in jedem Tier einem Hochdurchsatz-Screening (HTS) unterzogen. Alle identifizierten Peptide dienten als Input für ein Motiverkennungsprogramm zur Analyse des Vorkommens von Tripeptidmotiven (Abb. 2a, b, ef). Im Vergleich zum ersten Zyklus der aus dem Liquor gewonnenen Phagen beobachteten wir in den Zweigen A und B eine weitere Selektion und Deselektion zahlreicher Motive im Liquor (Abb. 2). Mithilfe eines Netzwerk-Identifizierungsalgorithmus wurde untersucht, ob diese unterschiedliche Muster konsistenter Sequenzen repräsentieren. Zwischen den aus dem Liquor gewonnenen 12-dimensionalen Sequenzen der alternativen Klade A (Abb. 2c, d) und Klade B (Abb. 2g, h) zeigte sich eine deutliche Ähnlichkeit. Die gepoolte Analyse in jedem Zweig ergab unterschiedliche Selektionsprofile für 12-mer-Peptide (Abb. S5c, d) sowie einen Anstieg des Liquor/Blut-Titerverhältnisses im Zeitverlauf für gepoolte Klone nach der zweiten Selektionsrunde im Vergleich zur ersten Selektionsrunde (Abb. S5e).
Anreicherung von Motiven und Peptiden in der Zerebrospinalflüssigkeit durch zwei aufeinanderfolgende Runden funktioneller Phagen-Display-Selektion in vivo.
Alle aus der ersten Selektionsrunde jedes Tieres (Tiere Nr. 1.1 und 1.2) gewonnenen Phagen aus der Zerebrospinalflüssigkeit wurden gepoolt, amplifiziert, HT-sequenziert und gemeinsam (2 x 10¹⁰ Phagen/Tier) zwei SM-kanülierten Ratten (Nr. 1.1 → Nr. 2.1 und 2.2, Nr. 1.2 → 2.3 und 2.4) reinjiziert. (a, b, e, f) Korrelationsdiagramme vergleichen die relative Häufigkeit von Tripeptidmotiven aller aus der Zerebrospinalflüssigkeit stammenden Phagen in der ersten und zweiten Selektionsrunde. Dargestellt sind die relative Häufigkeit und Verteilung von Motiven, die alle möglichen überlappenden Tripeptide in Peptiden beider Orientierungen repräsentieren. Die Anzahl der in 1000 Lesungen gefundenen Motive ist angegeben. Motive, die in einer der verglichenen Bibliotheken signifikant (p < 0,001) selektiert oder ausgeschlossen wurden, sind rot markiert. (c, d, g, h) Sequenzlogo-Darstellung aller CSF-reichen, 12 Aminosäuren langen Sequenzen basierend auf Runde 2 und 1 der In-vivo-Selektion. Die Größe des Einbuchstabencodes gibt die Häufigkeit der jeweiligen Aminosäure an der entsprechenden Position an. Zur Darstellung des Logos wird die Häufigkeit der aus einzelnen Tieren extrahierten CSF-Sequenzen zwischen zwei Selektionsrunden verglichen. Die in der zweiten Runde angereicherten Sequenzen sind dargestellt: (c) #1.1–#2.1, (d) #1.1–#2.2, (g) #1.2–#2.3 und (h) #1.2–#2.4. Die am häufigsten angereicherten Aminosäuren an einer bestimmten Position in (c, d) Tieren Nr. 2.1 und 2.2 bzw. (g, h) Tieren Nr. 2.3 und 2.4 sind farblich hervorgehoben. Grün = polar, violett = neutral, blau = basisch, rot = sauer und schwarz = hydrophob.
Nach der dritten Selektionsrunde identifizierten wir 124 einzigartige Peptidsequenzen (Nr. 3.1 und 3.2) aus 332 aus Liquor rekonstituierten Phagenklonen, die von zwei Tieren isoliert wurden (Abb. S6a). Die Sequenz LGSVS (18,7 %) wies den höchsten relativen Anteil auf, gefolgt von den Wildtyp-Inserts PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) und SARGSWREIVSLS (2,2 %). In der vierten und abschließenden Runde vereinigten wir zwei unabhängig selektierte Linien von drei verschiedenen Tieren (Abb. 1c). Von den 925 aus Liquor gewonnenen sequenzierten Phagenklonen fanden wir in der vierten Runde 64 einzigartige Peptidsequenzen (Abb. S6b), wobei der relative Anteil der Wildtyp-Phagen auf 0,8 % sank. Die häufigsten CSF-Klone in der vierten Runde waren LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) und RLSSVDSDLSGC (3,2 %). Die Längenspanne der ausgewählten Peptide ist auf Nukleotideinfügungen/-deletionen oder vorzeitige Stoppcodons in den Bibliothekprimern zurückzuführen, die bei der Verwendung degenerierter Codons für das NNK-Bibliotheksdesign entstehen. Vorzeitige Stoppcodons führen zu kürzeren Peptiden und werden aufgrund des günstigen Aminosäuremotivs ausgewählt. Längere Peptide können durch Einfügungen/Deletionen in den Primern der synthetischen Bibliotheken entstehen. Dadurch wird das designte Stoppcodon außerhalb des Leserasters positioniert und so lange abgelesen, bis ein neues Stoppcodon stromabwärts auftritt. Generell berechneten wir die Anreicherungsfaktoren für alle vier Selektionsrunden durch Vergleich der Eingangsdaten mit den Ausgabedaten der Proben. Für die erste Screening-Runde verwendeten wir Wildtyp-Phagentiter als unspezifische Hintergrundreferenz. Interessanterweise war die negative Phagenselektion im ersten Liquorzyklus sehr stark, nicht jedoch im Blut (Abb. 3a). Dies könnte auf die geringe Wahrscheinlichkeit der passiven Diffusion der meisten Mitglieder der Peptidbibliothek in den Liquorraum zurückzuführen sein oder darauf, dass relative Phagen im Vergleich zu Bakteriophagen effizienter im Blutkreislauf zurückgehalten oder aus diesem entfernt werden. In der zweiten Selektionsrunde wurde jedoch in beiden Kladen eine starke Selektion von Phagen im Liquor beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die vorherige Runde mit Phagen angereichert war, die Peptide exprimieren, welche die Liquoraufnahme fördern (Abb. 3a). Auch hier zeigte sich keine signifikante Anreicherung im Blut. Auch in der dritten und vierten Runde waren die Phagenklone im Liquor signifikant angereichert. Beim Vergleich der relativen Häufigkeit jeder einzelnen Peptidsequenz zwischen den letzten beiden Selektionsrunden stellten wir fest, dass die Sequenzen in der vierten Selektionsrunde noch stärker angereichert waren (Abb. 3b). Insgesamt wurden 931 Tripeptidmotive aus allen 64 einzigartigen Peptidsequenzen unter Verwendung beider Peptidorientierungen extrahiert. Die in der vierten Runde am stärksten angereicherten Motive wurden hinsichtlich ihrer Anreicherungsprofile über alle Runden hinweg im Vergleich zur injizierten Bibliothek genauer untersucht (Cut-off: 10 % Anreicherung) (Ergänzende Abb. 6c). Die allgemeinen Selektionsmuster zeigten, dass die meisten der untersuchten Motive in allen vorherigen Runden beider Selektionszweige angereichert waren. Einige Motive (z. B. SGL, VSG, LGS, GSV) stammten jedoch überwiegend aus der alternativen Klade A, während andere (z. B. FGW, RTN, WGF, NTR) in der alternativen Klade B angereichert waren.
Validierung des CSF-Transports von CSF-angereicherten, phagenpräsentierten Peptiden und biotinylierten Leader-Peptiden, die an Streptavidin-Nutzlasten konjugiert sind.
(a) Die Anreicherungsfaktoren wurden in allen vier Runden (R1–R4) anhand der injizierten (Input = I) Phagentiter (PFU) und der im Liquor bestimmten Phagentiter (Output = O) berechnet. Die Anreicherungsfaktoren der letzten drei Runden (R2–R4) wurden durch Vergleich mit der vorherigen Runde und der ersten Runde (R1) unter Berücksichtigung der Gewichtsdaten ermittelt. Offene Balken repräsentieren Liquor, schattierte Balken Plasma. (***p < 0,001, basierend auf dem t-Test nach Student). (b) Liste der häufigsten Phagenpeptide, geordnet nach ihrem relativen Anteil an allen im Liquor nach Runde 4 gesammelten Phagen. Die sechs häufigsten Phagenklone sind farblich hervorgehoben und nummeriert. Ihre Anreicherungsfaktoren zwischen Runde 3 und 4 sind in den Einblendungen dargestellt. (c, d) Die sechs am stärksten angereicherten Phagenklone sowie leere Phagen- und Elternphagenpeptidbibliotheken aus Runde 4 wurden einzeln in einem Liquor-Probenahmemodell analysiert. Liquor- und Blutproben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen. (c) Gleiche Mengen von 6 Kandidaten-Phagenklonen (2 x 10¹⁰ Phagen/Tier), leeren Phagen (#1779) (2 x 10¹⁰ Phagen/Tier) und Phagenpeptidbibliotheken (2 x 10¹² Phagen/Tier) wurden dem kanülierten Tier separat über die Schwanzvene injiziert. Die Liquor-Pharmakokinetik jedes injizierten Phagenklons und jeder Phagenpeptidbibliothek im Zeitverlauf ist dargestellt. (d) zeigt das durchschnittliche Liquor/Blut-Verhältnis aller gewonnenen Phagen/ml über den Probenahmezeitraum. (e) Vier synthetische Leaderpeptide und ein Kontrollpeptid (scrambled) wurden über ihren N-Terminus mittels Biotin an Streptavidin gekoppelt (Tetramer-Display) und anschließend intravenös (Schwanzvene, 10 mg Streptavidin/kg) injiziert. Mindestens drei intubierte Ratten (N = 3) wurden untersucht. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Liquorproben entnommen und die Streptavidinkonzentrationen mittels Liquor-Anti-Streptavidin-ELISA bestimmt (nd = nicht nachweisbar). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, basierend auf dem ANOVA-Test). (f) Vergleich der Aminosäuresequenz des am stärksten angereicherten Phagenpeptidklons Nr. 2002 (lila) mit anderen ausgewählten Phagenpeptidklonen aus der 4. Selektionsrunde. Identische und ähnliche Aminosäurefragmente sind farblich gekennzeichnet.
Von allen angereicherten Phagen der vierten Runde (Abb. 3b) wurden sechs Kandidatenklone für weitere Einzelanalysen im Liquor-Probenmodell ausgewählt. Gleiche Mengen der sechs Kandidatenphagen, leerer Phagen (ohne Insert) und Prophagen-Peptidbibliotheken wurden in drei kanülierte CM-Tiere injiziert, und die Pharmakokinetik wurde in Liquor (Abb. 3c) und Blut (Ergänzende Abb. 7) bestimmt. Alle getesteten Phagenklone reicherten sich im Liquor cerebrospinalis (CSF) 10- bis 1000-mal stärker an als der leere Kontrollphage (#1779). Beispielsweise wiesen die Klone #2020 und #2077 etwa 1000-mal höhere CSF-Titer als der Kontrollphage auf. Das pharmakokinetische Profil jedes ausgewählten Peptids ist unterschiedlich, aber alle zeigen eine hohe CSF-Homing-Fähigkeit. Wir beobachteten einen kontinuierlichen Abfall der Konzentrationen der Klone #1903 und #2011 über die Zeit. Bei den Klonen #2077, #2002 und #2009 deutete ein Anstieg in den ersten 10 Minuten möglicherweise auf einen aktiven Transport hin, muss aber noch bestätigt werden. Die Klone #2020, #2002 und #2077 stabilisierten sich auf hohem Niveau, während die Konzentration des Klons #2009 im Liquor nach dem anfänglichen Anstieg langsam abnahm. Anschließend verglichen wir die relative Häufigkeit jedes Liquor-Kandidaten mit seiner Blutkonzentration (Abb. 3d). Die Korrelation des mittleren Titers jedes Liquor-Kandidaten mit seinem Bluttiter zu allen Messzeitpunkten zeigte, dass drei der sechs Kandidaten im Blut-Liquor signifikant angereichert waren. Interessanterweise wies Klon #2077 eine höhere Stabilität im Blut auf (Ergänzende Abbildung 7). Um zu bestätigen, dass die Peptide selbst in der Lage sind, neben Phagenpartikeln auch andere Fracht in den Liquorraum zu transportieren, synthetisierten wir vier Leaderpeptide, die am N-Terminus, der Bindungsstelle der Peptide an das Phagenpartikel, mit Biotin derivatisiert wurden. Biotinylierte Peptide (Nr. 2002, 2009, 2020 und 2077) wurden mit Streptavidin (SA) konjugiert, um multimere Formen zu erhalten, die die Geometrie von Phagen teilweise nachahmen. Dieses Format ermöglichte es uns auch, die SA-Exposition in Blut und Liquor als Fracht transportierende Proteinpeptide zu messen. Wichtig ist, dass die Phagendaten häufig reproduziert werden konnten, wenn synthetische Peptide in diesem SA-konjugierten Format verabreicht wurden (Abb. 3e). Die Kontrollpeptide zeigten eine geringere initiale Exposition und eine schnellere Clearance aus dem Liquor mit nicht nachweisbaren Konzentrationen innerhalb von 48 Stunden. Um Einblicke in die Transportwege dieser Peptid-Phagenklone in den Liquorraum zu gewinnen, analysierten wir die Lokalisation einzelner Phagenpeptide mittels Immunhistochemie (IHC), um Phagenpartikel 1 Stunde nach intravenöser Injektion in vivo direkt nachzuweisen. Bemerkenswerterweise konnten die Klone #2002, #2077 und #2009 durch starke Anfärbung in Hirnkapillaren nachgewiesen werden, während der Kontrollphage (#1779) und Klon #2020 nicht detektiert wurden (Ergänzende Abbildung 8). Dies deutet darauf hin, dass diese Peptide durch Überwindung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu ihrer Wirkung im Gehirn beitragen. Um diese Hypothese zu überprüfen, sind weitere detaillierte Analysen erforderlich, da möglicherweise auch der BSCFB-Transportweg beteiligt ist. Beim Vergleich der Aminosäuresequenz des am stärksten angereicherten Klons (#2002) mit anderen ausgewählten Peptiden fiel auf, dass einige ähnliche Aminosäureverlängerungen aufweisen, was auf einen ähnlichen Transportmechanismus hindeuten könnte (Abb. 3f).
Aufgrund seines einzigartigen Plasmaprofils und des signifikanten Anstiegs der Liquorkonzentration im Zeitverlauf wurde der Phagen-Display-Klon #2077 über einen längeren Zeitraum von 48 Stunden weiter untersucht und konnte den raschen Anstieg der Liquorkonzentration, der in Verbindung mit anhaltenden SA-Spiegeln beobachtet wurde, reproduzieren (Abb. 4a). Im Vergleich zu anderen identifizierten Phagenklonen zeigte #2077 eine starke Anfärbung der Hirnkapillaren und eine signifikante Kolokalisation mit dem Kapillarmarker Lektin bei höherer Auflösung sowie möglicherweise eine Anfärbung im Parenchym (Abb. 4b). Um zu untersuchen, ob Peptid-vermittelte pharmakologische Effekte im ZNS erzielt werden können, führten wir ein Experiment durch, in dem biotinylierte Versionen von i) dem Transitpeptid #2077 und ii) dem BACE1-Inhibitor-Peptid in zwei verschiedenen Verhältnissen mit SA gemischt wurden. Für eine Kombination verwendeten wir nur den BACE1-Peptidinhibitor, für die andere ein Verhältnis von 1:3 zwischen BACE1-Peptidinhibitor und #2077-Peptid. Beide Proben wurden intravenös verabreicht und die Konzentrationen von Beta-Amyloid-Peptid 40 (Aβ40) in Blut und Liquor über einen bestimmten Zeitraum gemessen. Aβ40 wurde im Liquor bestimmt, da es die BACE1-Hemmung im Hirnparenchym widerspiegelt. Wie erwartet, reduzierten beide Komplexe die Aβ40-Konzentration im Blut signifikant (Abb. 4c, d). Jedoch bewirkten nur Proben, die eine Mischung aus Peptid Nr. 2077 und einem an SA konjugierten BACE1-Peptidinhibitor enthielten, eine signifikante Abnahme von Aβ40 im Liquor (Abb. 4c). Die Daten zeigen, dass Peptid Nr. 2077 das 60 kDa große SA-Protein in das ZNS transportieren kann und in Kombination mit SA-konjugierten BACE1-Peptidinhibitoren pharmakologische Effekte induziert.
(a) Klonale Injektion (2 × 10¹⁰ Phagen/Tier) des T7-Phagen, die Langzeit-Pharmakokinetikprofile des CSF-Peptids Nr. 2077 (RLSSVDSDLSGC) und des nicht injizierten Kontrollphagen (Nr. 1779) in mindestens drei CM-intubierten Ratten zeigt. (b) Konfokalmikroskopische Aufnahme repräsentativer kortikaler Mikrogefäße in mit Phagen injizierten Ratten (2 × 10¹⁰ Phagen/Tier), die die Gegenfärbung von Peptid Nr. 2077 und Gefäßen (Lektin) zeigt. Diese Phagenklone wurden drei Ratten verabreicht und zirkulierten eine Stunde lang vor der Perfusion. Die Gehirne wurden geschnitten und mit polyklonalen FITC-markierten Antikörpern gegen das T7-Phagenkapsid gefärbt. Zehn Minuten vor der Perfusion und der anschließenden Fixierung wurde DyLight594-markiertes Lektin intravenös verabreicht. Fluoreszenzaufnahmen zeigen die Lektinfärbung (rot) der luminalen Seite von Mikrogefäßen und Phagen (grün) im Lumen von Kapillaren und perivaskulärem Hirngewebe. Der Maßstabsbalken entspricht 10 µm. (c, d) Biotinyliertes BACE1-Inhibitorpeptid wurde allein oder in Kombination mit biotinyliertem Transitpeptid #2077 an Streptavidin gekoppelt und anschließend mindestens drei kanülierten CM-Ratten intravenös injiziert (10 mg Streptavidin/kg). Die durch den BACE1-Peptidinhibitor vermittelte Reduktion von Aβ40 wurde mittels Aβ1-40-ELISA in Blut (rot) und Liquor (orange) zu den angegebenen Zeitpunkten gemessen. Zur besseren Übersicht ist eine gestrichelte Linie im Diagramm bei 100 % eingezeichnet. (c) Prozentuale Reduktion von Aβ40 im Blut (rote Dreiecke) und im Liquor (orange Dreiecke) von Ratten, die mit Streptavidin, konjugiert an das Transitpeptid Nr. 2077 und ein BACE1-inhibitorisches Peptid im Verhältnis 3:1, behandelt wurden. (d) Prozentuale Reduktion von Aβ40 im Blut (rote Kreise) und im Liquor (orange Kreise) von Ratten, die ausschließlich mit Streptavidin, gekoppelt an ein BACE1-inhibitorisches Peptid, behandelt wurden. Die Aβ-Konzentration in der Kontrollgruppe betrug 420 pg/ml (Standardabweichung = 101 pg/ml).
Phagen-Display wurde bereits erfolgreich in verschiedenen Bereichen der biomedizinischen Forschung eingesetzt¹⁷. Diese Methode wurde für In-vivo-Studien zur vaskulären Diversität^18,19 sowie für Studien zu zerebralen Gefäßen^{20,21,22,23,24,25,26} verwendet. In der vorliegenden Studie haben wir die Anwendung dieser Selektionsmethode erweitert, um nicht nur Peptide, die auf zerebrale Gefäße abzielen, direkt zu identifizieren, sondern auch Kandidaten mit aktiven Transporteigenschaften zum Überwinden der Blut-Hirn-Schranke zu finden. Wir beschreiben die Entwicklung eines In-vivo-Selektionsverfahrens an CM-intubierten Ratten und demonstrieren dessen Potenzial zur Identifizierung von Peptiden mit CSF-Homing-Eigenschaften. Mithilfe des T7-Phagen, der eine Bibliothek von 12-mer-Randompeptiden präsentiert, konnten wir zeigen, dass der T7-Phage klein genug ist (ca. 60 nm Durchmesser)¹⁰, um sich an die Blut-Hirn-Schranke anzupassen und somit diese oder den Plexus choroideus direkt zu passieren. Wir beobachteten, dass die Gewinnung von Liquor cerebrospinalis (CSF) aus kanülierten CM-Ratten eine gut kontrollierte Methode für das funktionelle Screening in vivo darstellt und dass die extrahierten Phagen nicht nur an die Blutgefäße binden, sondern auch als Transporter durch die Blut-Hirn-Schranke fungieren. Durch die gleichzeitige Blutentnahme und die Anwendung von Hochdurchsatzsequenzierung (HTS) auf CSF- und blutstämmige Phagen bestätigten wir, dass unsere Wahl des CSF nicht durch eine Anreicherung im Blut oder die Expansionsfähigkeit zwischen den Selektionsrunden beeinflusst wurde. Das Blutkompartiment ist jedoch Teil des Selektionsprozesses, da Phagen, die den CSF erreichen können, lange genug im Blutkreislauf überleben und zirkulieren müssen, um sich im Gehirn anzureichern. Um zuverlässige Sequenzinformationen aus den Rohdaten der HTS zu gewinnen, implementierten wir Filter, die an plattformspezifische Sequenzierungsfehler im Analyse-Workflow angepasst sind. Durch die Einbeziehung kinetischer Parameter in die Screening-Methode bestätigten wir die schnelle Pharmakokinetik von Wildtyp-T7-Phagen (t½ ~ 28 min) im Blut^24,27,28 und bestimmten zudem ihre Halbwertszeit im Liquor (t½ ~ 26 min). Trotz ähnlicher pharmakokinetischer Profile in Blut und Liquor konnten nur 0,001 % der Blutkonzentration an Phagen im Liquor nachgewiesen werden, was auf eine geringe Hintergrundmobilität von Wildtyp-T7-Phagen über die Blut-Hirn-Schranke hindeutet. Diese Arbeit unterstreicht die Bedeutung der ersten Selektionsrunde bei der Anwendung von In-vivo-Panning-Strategien, insbesondere für Phagensysteme, die schnell aus dem Blutkreislauf eliminiert werden, da nur wenige Klone das ZNS erreichen. Daher war die Reduktion der Bibliotheksdiversität in der ersten Runde sehr groß, da in diesem strengen Liquormodell letztendlich nur eine begrenzte Anzahl von Klonen gewonnen werden konnte. Diese In-vivo-Selektionsstrategie umfasste mehrere Selektionsschritte, wie die aktive Akkumulation im Liquor cerebrospinalis (CSF), das Überleben von Klonen im Blut und die schnelle Entfernung von T7-Phagenklonen aus dem Blut innerhalb der ersten 10 Minuten (Abb. 1d und Abb. S4M). Nach der ersten Runde wurden daher unterschiedliche Phagenklone im CSF identifiziert, obwohl für jedes Tier derselbe Ausgangspool verwendet wurde. Dies deutet darauf hin, dass mehrere strenge Selektionsschritte für Quellbibliotheken mit einer großen Anzahl an Mitgliedern zu einer signifikanten Reduktion der Diversität führen. Zufällige Ereignisse werden somit zu einem integralen Bestandteil des anfänglichen Selektionsprozesses und beeinflussen das Ergebnis maßgeblich. Es ist wahrscheinlich, dass viele Klone der ursprünglichen Bibliothek eine sehr ähnliche Anreicherungsneigung im CSF aufwiesen. Selbst unter gleichen experimentellen Bedingungen können die Selektionsergebnisse jedoch aufgrund der geringen Anzahl jedes einzelnen Klons im Ausgangspool variieren.
Die im Liquor angereicherten Motive unterscheiden sich von denen im Blut. Interessanterweise beobachteten wir die erste Verschiebung hin zu glycinreichen Peptiden im Blut einzelner Tiere (Abb. 1g, Ergänzende Abb. 4e, 4f). Phagen mit glycinreichen Peptiden könnten stabiler sein und werden seltener aus dem Blutkreislauf entfernt. Diese glycinreichen Peptide wurden jedoch in den Liquorproben nicht nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die kuratierten Bibliotheken zwei verschiedene Selektionsschritte durchlaufen haben: einen im Blut und einen weiteren, bei dem sie sich im Liquor anreichern konnten. Die aus der vierten Selektionsrunde resultierenden, im Liquor angereicherten Klone wurden umfassend getestet. Nahezu alle einzeln getesteten Klone zeigten eine Anreicherung im Liquor im Vergleich zu Kontrollphagen. Ein Peptid-Hit (#2077) wurde genauer untersucht. Es zeigte eine längere Plasmahalbwertszeit im Vergleich zu anderen Treffern (Abbildung 3d und Ergänzende Abbildung 7). Interessanterweise enthielt dieses Peptid einen Cysteinrest am C-Terminus. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Anlagerung von Cystein an Peptide deren pharmakokinetische Eigenschaften durch Bindung an Albumin verbessern kann²⁹. Dies ist für Peptid Nr. 2077 derzeit unbekannt und bedarf weiterer Untersuchungen. Einige Peptide zeigten eine Valenzabhängigkeit der Anreicherung im Liquor (Daten nicht gezeigt), die mit der Oberflächengeometrie des T7-Kapsids zusammenhängen könnte. Das von uns verwendete T7-System zeigte 5–15 Kopien jedes Peptids pro Phagenpartikel. An Kandidaten-Leitphagenklonen, die intravenös in die Großhirnrinde von Ratten injiziert wurden, wurde eine Immunhistochemie (IHC) durchgeführt (Ergänzende Abbildung 8). Die Daten zeigten, dass mindestens drei Klone (Nr. 2002, Nr. 2009 und Nr. 2077) mit der Blut-Hirn-Schranke interagierten. Es bleibt zu klären, ob diese Interaktion mit der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zur Akkumulation von Liquor cerebrospinalis (CSF) oder zum direkten Transport dieser Klone in die Blut-Liquor-Schranke (BLS) führt. Wichtig ist, dass die ausgewählten Peptide ihre CSF-Transportkapazität nach der Synthese und der Bindung an die Proteinfracht beibehalten. Die Bindung N-terminal biotinylierter Peptide an SA reproduziert im Wesentlichen die Ergebnisse, die mit ihren jeweiligen Phagenklonen in Blut und Liquor cerebrospinalis erzielt wurden (Abb. 3e). Schließlich zeigen wir, dass das Leitpeptid #2077 die Wirkung eines biotinylierten Peptidinhibitors von BACE1, der an SA konjugiert ist, im Gehirn verstärken kann und ausgeprägte pharmakodynamische Effekte im ZNS durch eine signifikante Reduktion der Aβ40-Konzentration im Liquor bewirkt (Abb. 4). Durch eine Peptidsequenzhomologiesuche aller Treffer in der Datenbank konnten wir keine Homologen identifizieren. Es ist wichtig zu beachten, dass die T7-Bibliothek etwa 10⁹ Einträge umfasst, während die theoretische Bibliotheksgröße für 12-mere 4 × 10¹⁵ beträgt. Daher haben wir nur einen kleinen Teil des Diversitätsraums der 12-mer-Peptidbibliothek ausgewählt. Dies könnte bedeuten, dass durch die Analyse des angrenzenden Sequenzraums der identifizierten Treffer weitere optimierte Peptide gefunden werden können. Hypothetisch könnte einer der Gründe, warum wir keine natürlichen Homologen dieser Peptide gefunden haben, in einer Deselektion im Laufe der Evolution liegen, die den unkontrollierten Eintritt bestimmter Peptidmotive in das Gehirn verhindern soll.
Zusammengenommen bilden unsere Ergebnisse die Grundlage für zukünftige Arbeiten zur detaillierteren Identifizierung und Charakterisierung der Transportsysteme der zerebrovaskulären Barriere in vivo. Das grundlegende Prinzip dieser Methode basiert auf einer funktionellen Selektionsstrategie, die nicht nur Klone mit zerebrovaskulären Bindungseigenschaften identifiziert, sondern auch einen entscheidenden Schritt beinhaltet: Erfolgreiche Klone besitzen die intrinsische Fähigkeit, biologische Barrieren in vivo in das ZNS zu überwinden. Ziel ist es, den Transportmechanismus dieser Peptide und ihre Bindungspräferenz für die hirnspezifische Mikrovaskulatur aufzuklären. Dies könnte zur Entdeckung neuer Transportwege für die Blut-Hirn-Schranke (BHS) und Rezeptoren führen. Wir gehen davon aus, dass die identifizierten Peptide direkt an zerebrovaskuläre Rezeptoren oder an zirkulierende Liganden binden können, die die BHS oder die Blut-Liquor-Schranke (BLS) passieren. Die in dieser Arbeit entdeckten Peptidvektoren mit Liquor-Transportaktivität werden weiter untersucht. Derzeit erforschen wir die Hirnspezifität dieser Peptide hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die BHS und/oder die BLS zu überwinden. Diese neuen Peptide werden äußerst wertvolle Werkzeuge für die potenzielle Entdeckung neuer Rezeptoren oder Signalwege und für die Entwicklung neuer, hocheffizienter Plattformen für die Verabreichung von Makromolekülen, wie z. B. Biologika, an das Gehirn sein.
Die große Zisterne (CM) wurde mithilfe einer modifizierten, bereits beschriebenen Methode kanüliert. Anästhesierte Wistar-Ratten (200–350 g) wurden in einen Stereotaxieapparat eingespannt. Über der rasierten und aseptisch vorbereiteten Kopfhaut wurde ein medianer Schnitt durchgeführt, um den Schädel freizulegen. Im Bereich des oberen Schienbeins wurden zwei Löcher gebohrt und die Fixierschrauben eingesetzt. Ein zusätzliches Loch wurde in den lateralen Hinterhauptkamm gebohrt, um eine Edelstahlkanüle stereotaktisch in die CM einzuführen. Zahnzement wurde um die Kanüle aufgetragen und mit Schrauben fixiert. Nach Lichthärtung und Aushärtung des Zements wurde die Hautwunde mit einer 4/0-Supramidnaht verschlossen. Die korrekte Lage der Kanüle wurde durch spontanen Liquorverlust bestätigt. Die Ratte wurde aus dem Stereotaxieapparat entfernt, erhielt eine angemessene postoperative Versorgung und Schmerztherapie und erholte sich mindestens eine Woche lang, bis keine Blutspuren im Liquor mehr nachweisbar waren. Wistar-Ratten (Crl:WI/Han) wurden von Charles River (Frankreich) bezogen. Alle Ratten wurden unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen gehalten. Sämtliche Tierversuche wurden vom Veterinäramt der Stadt Basel, Schweiz, genehmigt und gemäß der Tierversuchsgenehmigung Nr. 2474 (Beurteilung des aktiven Hirntransports durch Messung der Konzentrationen therapeutischer Kandidaten in der Zerebrospinalflüssigkeit und im Gehirn von Ratten) durchgeführt.
Die Ratte wurde vorsichtig bei Bewusstsein gehalten, während die CM-Kanüle in der Hand gehalten wurde. Stechapfel (Datura) wurde von der Kanüle entfernt und 10 µl spontan fließender Liquor entnommen. Da die Durchgängigkeit der Kanüle letztendlich beeinträchtigt war, wurden in dieser Studie nur klare Liquorproben ohne Anzeichen von Blutbeimengungen oder Verfärbungen berücksichtigt. Parallel dazu wurden ca. 10–20 µl Blut über einen kleinen Schnitt an der Schwanzspitze in Heparin-Röhrchen (Sigma-Aldrich) entnommen. Liquor und Blut wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach intravenöser Injektion von T7-Phagen entnommen. Vor jeder Liquorprobenentnahme wurden ca. 5–10 µl Flüssigkeit verworfen, was dem Totvolumen des Katheters entspricht.
Die Bibliotheken wurden unter Verwendung des T7Select 10-3b-Vektors gemäß der Beschreibung im Handbuch des T7Select-Systems (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) erstellt. Kurz gesagt, wurde ein zufälliges 12-mer-DNA-Insert im folgenden Format synthetisiert:
Um doppelte Stoppcodons und eine Überexpression von Aminosäuren im Insert zu vermeiden, wurde das NNK-Codon verwendet. N ist ein manuell gemischtes äquimolares Verhältnis der einzelnen Nukleotide, und K ist ein manuell gemischtes äquimolares Verhältnis von Adenin- und Cytosin-Nukleotiden. Einzelsträngige Bereiche wurden durch weitere Inkubation mit dNTPs (Novagen) und Klenow-Enzym (New England Biolabs) in Klenow-Puffer (New England Biolabs) für 3 Stunden bei 37 °C in doppelsträngige DNA umgewandelt. Nach der Reaktion wurde die doppelsträngige DNA durch Ethanolpräzipitation gewonnen. Die resultierende DNA wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII (beide von Roche) verdaut. Das gespaltene und gereinigte (QIAquick, Qiagen) Insert (T4-Ligase, New England Biolabs) wurde anschließend in den Leserahmen eines vorgespaltenen T7-Vektors nach Aminosäure 348 des 10B-Kapsidgens ligiert. Die Ligationsansätze wurden vor der In-vitro-Verpackung 18 Stunden bei 16 °C inkubiert. Die Phagenverpackung in vitro erfolgte gemäß der Anleitung des T7Select 10-3b Klonierungskits (Novagen). Die Verpackungslösung wurde einmalig amplifiziert und anschließend mit Escherichia coli (BLT5615, Novagen) lysiert. Die Lysate wurden zentrifugiert, titriert und als Glycerin-Stammlösung bei -80 °C eingefroren.
Direkte PCR-Amplifikation von variablen Phagenregionen, die in Bouillon oder auf Platten amplifiziert wurden, unter Verwendung proprietärer 454/Roche-Amplicon-Fusionsprimer. Der Vorwärts-Fusionsprimer enthält Sequenzen, die die variable Region (NNK) 12 (templatespezifisch), den GS FLX Titanium Adapter A und eine vier Basen lange Schlüsselsequenz der Bibliothek (TCAG) flankieren (Ergänzende Abbildung 1a):
Der Reverse-Fusion-Primer enthält außerdem an Capture-Beads gebundenes Biotin und den für die klonale Amplifikation während der Emulsions-PCR erforderlichen GS FLX Titanium Adapter B:
Die Amplifikate wurden anschließend gemäß dem 454 GS-FLX Titanium-Protokoll einer Pyrosequenzierung mit dem 454/Roche-System unterzogen. Für die manuelle Sanger-Sequenzierung (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) wurde T7-Phagen-DNA mittels PCR amplifiziert und mit den folgenden Primerpaaren sequenziert:
Die Inserts einzelner Plaques wurden mittels PCR unter Verwendung des Roche Fast Start DNA-Polymerase-Kits (gemäß den Anweisungen des Herstellers) amplifiziert. Es wurde ein Hot-Start (10 min bei 95 °C) und 35 Boost-Zyklen (50 s bei 95 °C, 1 min bei 50 °C und 1 min bei 72 °C) durchgeführt.
Phagen aus Bibliotheken, Wildtyp-Phagen, aus Liquor und Blut isolierte Phagen oder einzelne Klone wurden in Escherichia coli BL5615 in TB-Bouillon (Sigma Aldrich) oder in 500-cm²-Schalen (Thermo Scientific) für 4 h bei 37 °C amplifiziert. Die Phagen wurden durch Spülen der Platten mit Tris-EDTA-Puffer (Fluka Analytical) oder durch Abnehmen der Plaques mit sterilen Pipettenspitzen extrahiert. Die Phagen wurden aus dem Kulturüberstand oder Extraktionspuffer mittels einer Polyethylenglykol-Präzipitation (PEG 8000, Promega) isoliert und in Tris-EDTA-Puffer resuspendiert.
Die amplifizierten Phagen wurden vor der intravenösen (i.v.) Injektion (500 μl/Tier) zwei bis drei Zyklen lang mittels Endotoxin-Entfernungsbeads (Miltenyi Biotec) von Endotoxin befreit. Im ersten Zyklus wurden 2 × 10¹² Phagen, im zweiten 2 × 10¹⁰ Phagen und im dritten und vierten Selektionszyklus jeweils 2 × 10⁹ Phagen pro Tier injiziert. Der Phagengehalt in den zu den angegebenen Zeitpunkten entnommenen Liquor- und Blutproben wurde mittels Plaquezählung gemäß den Herstellerangaben (Handbuch des T7Select-Systems) bestimmt. Die Phagenselektion erfolgte durch intravenöse Injektion gereinigter Bibliotheken in die Schwanzvene oder durch Re-Injektion von Phagen aus dem Liquor des vorherigen Selektionszyklus. Die Phagenentnahmen erfolgten nach 10, 30, 60, 90, 120, 180 und 240 Minuten (Liquor- und Blutproben). Insgesamt wurden vier Runden In-vivo-Panning durchgeführt, wobei die beiden ausgewählten Linien während der ersten drei Selektionsrunden separat gelagert und analysiert wurden. Alle aus dem Liquor der ersten beiden Selektionsrunden extrahierten Phageninserts wurden einer 454/Roche-Pyrosequenzierung unterzogen, während alle aus dem Liquor der letzten beiden Selektionsrunden extrahierten Klone manuell sequenziert wurden. Alle Blutphagen der ersten Selektionsrunde wurden ebenfalls einer 454/Roche-Pyrosequenzierung unterzogen. Für die Injektion der Phagenklone wurden ausgewählte Phagen in E. coli (BL5615) auf 500 cm² großen Agarplatten 4 Stunden lang bei 37 °C amplifiziert. Einzeln ausgewählte und manuell sequenzierte Klone wurden in TB-Medium vermehrt. Nach Phagenextraktion, -reinigung und Endotoxinentfernung (wie oben beschrieben) wurden 2 × 10¹⁰ Phagen pro Tier in 300 μl intravenös in eine Schwanzvene injiziert.
Vorverarbeitung und qualitative Filterung der Sequenzdaten. Die Rohdaten (454/Roche) wurden mithilfe der Herstellersoftware vom binären Standard Stream Map Format (SFF) in das Pearson Human Readable Format (FASTA) konvertiert. Die weitere Verarbeitung der Nukleotidsequenz erfolgte mit proprietären C-Programmen und -Skripten (unveröffentlichtes Softwarepaket), wie unten beschrieben. Die Analyse der Primärdaten umfasste strenge, mehrstufige Filterverfahren. Um Reads ohne gültige 12mer-Insert-DNA-Sequenz auszusortieren, wurden die Reads sequenziell mit dem Start- (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), Stopp- (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) und Hintergrund-Insert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) mittels des globalen Needleman-Wunsch-Tests aligniert. Dabei waren bis zu zwei Inkonsistenzen pro Alignment zulässig.³¹ Reads ohne Start- und Stopp-Tags sowie Reads mit Hintergrund-Inserts, d. h. Alignments mit mehr als der zulässigen Anzahl an Fehlpaarungen, wurden aus der Bibliothek entfernt. Die verbleibenden Sequenzen wurden wie folgt verarbeitet: Die N-mer-DNA-Sequenz, die sich vom Startpunkt bis vor den Stopppunkt erstreckte, wurde aus der ursprünglichen Sequenz ausgeschnitten und weiterverarbeitet (im Folgenden als „Insert“ bezeichnet). Nach der Translation des Inserts wurde der Abschnitt nach dem ersten Stoppcodon am 5′-Ende des Primers entfernt. Zusätzlich wurden Nukleotide entfernt, die zu unvollständigen Codons am 3′-Ende des Primers führten. Um Inserts auszuschließen, die ausschließlich Hintergrundsequenzen enthielten, wurden auch übersetzte Inserts entfernt, die mit dem Aminosäuremuster „PAG“ begannen. Peptide mit einer posttranslationalen Länge von weniger als drei Aminosäuren wurden aus der Bibliothek entfernt. Abschließend wurden Redundanzen im Insert-Pool entfernt und die Häufigkeit jedes einzelnen Inserts bestimmt. Die Ergebnisse dieser Analyse umfassten eine Liste von Nukleotidsequenzen (Inserts) und deren Häufigkeiten (siehe Abbildungen 1c und 2 im Anhang).
Gruppierung von N-mer-DNA-Inserts nach Sequenzähnlichkeit: Um 454/Roche-spezifische Sequenzierungsfehler (z. B. Probleme mit der Sequenzierung von Homopolymer-Extensionen) zu eliminieren und weniger wichtige Redundanzen zu entfernen, werden zuvor gefilterte N-mer-DNA-Sequenz-Inserts (Inserts) nach Ähnlichkeit sortiert. Dabei werden Insertionen (bis zu 2 nicht übereinstimmende Basen sind zulässig) mithilfe eines iterativen Algorithmus sortiert. Zunächst werden die Insertionen nach ihrer Häufigkeit (höchste absteigende) und, falls sie identisch sind, nach ihrer Länge (längste absteigende) sortiert. Die häufigsten und längsten Insertionen bilden die erste „Gruppe“. Die Gruppenhäufigkeit wird auf die Schlüsselhäufigkeit gesetzt. Anschließend wird versucht, jede verbleibende Insertion in der sortierten Liste durch paarweises Needleman-Wunsch-Alignment der Gruppe hinzuzufügen. Überschreitet die Anzahl der Fehlpaarungen, Insertionen oder Deletionen in einem Alignment einen Schwellenwert von 2 nicht, wird eine Insertion der Gruppe hinzugefügt und die Gesamtgruppenhäufigkeit entsprechend erhöht. Eingefügte Sequenzen werden als verwendet markiert und von der weiteren Verarbeitung ausgeschlossen. Kann die Sequenz keiner bestehenden Gruppe hinzugefügt werden, wird sie zur Erstellung einer neuen Gruppe mit der entsprechenden Einfügungshäufigkeit verwendet und ebenfalls als verwendet markiert. Die Iteration endet, sobald jede Einfügungssequenz entweder zur Bildung einer neuen Gruppe verwendet oder einer bestehenden Gruppe zugeordnet werden konnte. Schließlich werden die gruppierten Nukleotidsequenzen in Peptidsequenzen (Peptidbibliotheken) übersetzt. Das Ergebnis dieser Analyse ist eine Menge von Einfügungen und ihren jeweiligen Häufigkeiten, die die Anzahl der aufeinanderfolgenden Lesevorgänge ergeben (Ergänzende Abb. 2).
Motivgenerierung: Aus einer Liste einzigartiger Peptide wurde eine Bibliothek mit allen möglichen Aminosäuremustern (AS) erstellt (siehe unten). Jedes mögliche Muster der Länge 3 wurde aus dem Peptid extrahiert und sein inverses Muster zusammen mit einer gemeinsamen Motivbibliothek, die alle Muster (Tripeptide) enthielt, hinzugefügt. Bibliotheken hochrepetitiver Motive wurden sequenziert und Redundanzen entfernt. Anschließend wurde für jedes Tripeptid in der Motivbibliothek mithilfe von Computerprogrammen dessen Vorkommen in der Bibliothek überprüft. In diesem Fall wurde die Häufigkeit des Peptids, das das gefundene Motiv-Tripeptid enthält, addiert und dem Motiv in der Motivbibliothek zugewiesen („Anzahl der Motive“). Das Ergebnis der Motivgenerierung ist ein zweidimensionales Array, das alle Vorkommen von Tripeptiden (Motiven) und ihre jeweiligen Werte enthält. Diese Werte entsprechen der Anzahl der Sequenzierungs-Reads, die nach Filterung, Gruppierung und Translation der Reads zum entsprechenden Motiv führen. Die Metriken wurden wie oben detailliert beschrieben verwendet.
Normalisierung der Anzahl der Motive und zugehörige Streudiagramme: Die Anzahl der Motive für jede Probe wurde normalisiert mithilfe von
Dabei ist ni die Anzahl der Reads, die das Thema i enthalten. vi repräsentiert somit die prozentuale Häufigkeit der Reads (oder Peptide), die das Motiv i in der Probe enthalten. Die p-Werte für die nicht normalisierte Anzahl der Motive wurden mittels Fisher-Exakt-Test berechnet. Die Spearman-Korrelationen der Motivanzahl wurden anhand der normalisierten Anzahl der Motive mit R berechnet.
Zur Visualisierung des Aminosäuregehalts an jeder Position der Peptidbibliothek wurden Web-Logogramme (http://weblogo.threeplusone.com) erstellt. Zunächst wird der Aminosäuregehalt an jeder Position des 12-mer-Peptids in einer 20×12-Matrix gespeichert. Anschließend wird ein Satz von 1000 Peptiden mit gleichem relativem Aminosäuregehalt an jeder Position im FASTA-Sequenzformat generiert und als Eingabe für Web-Logo 3 verwendet. Dieses generiert eine grafische Darstellung des relativen Aminosäuregehalts an jeder Position für die jeweilige Peptidbibliothek. Zur Visualisierung mehrdimensionaler Datensätze wurden Heatmaps mit einem intern entwickelten Tool in R (biosHeatmap, ein noch nicht veröffentlichtes R-Paket) erstellt. Die in den Heatmaps dargestellten Dendrogramme wurden mittels Ward-Clustering mit euklidischer Distanz berechnet. Für die statistische Analyse der Motiv-Scoring-Daten wurden die p-Werte für unnormalisierte Scoring-Daten mit dem Fisher-Exakt-Test berechnet. Die P-Werte für andere Datensätze wurden in R mittels Student's t-Test bzw. ANOVA berechnet.
Ausgewählte Phagenklone und Phagen ohne Insert wurden intravenös über die Schwanzvene injiziert (2 × 10¹⁰ Phagen/Tier in 300 μl PBS). Zehn Minuten vor der Perfusion und der anschließenden Fixierung erhielten dieselben Tiere eine intravenöse Injektion von 100 μl DyLight594-markiertem Lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 Minuten nach der Phageninjektion wurden die Ratten über das Herz mit 50 ml PBS und anschließend mit 50 ml 4% PFA/PBS perfundiert. Gehirnproben wurden zusätzlich über Nacht in 4% PFA/PBS fixiert und über Nacht bei 4 °C in 30%iger Saccharoselösung inkubiert. Die Proben wurden in der OCT-Mischung schockgefroren. Die immunhistochemische Analyse gefrorener Proben erfolgte bei Raumtemperatur an 30 µm dicken Kryoschnitten, die mit 1 % BSA blockiert und über Nacht bei 4 °C mit polyklonalen, FITC-markierten Antikörpern gegen T7-Phagen (Novus NB 600-376A) inkubiert wurden. Anschließend wurden die Schnitte dreimal mit PBS gewaschen und mit einem konfokalen Lasermikroskop (Leica TCS SP5) untersucht.
Alle Peptide mit einer Mindestreinheit von 98 % wurden von GenScript USA synthetisiert, biotinyliert und lyophilisiert. Biotin ist über einen zusätzlichen dreifachen Glycin-Spacer am N-Terminus gebunden. Alle Peptide wurden mittels Massenspektrometrie überprüft.
Streptavidin (Sigma S0677) wurde mit einem fünffachen äquimolaren Überschuss an biotinyliertem Peptid, biotinyliertem BACE1-inhibitorischem Peptid oder einer Kombination (3:1) aus biotinyliertem BACE1-inhibitorischem Peptid und BACE1-inhibitorischem Peptid in 5–10 % DMSO/PBS gemischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Streptavidin-konjugierten Peptide wurden Ratten mit Hirnhöhle in einer Dosis von 10 mg/kg intravenös in eine Schwanzvene injiziert.
Die Konzentration der Streptavidin-Peptid-Komplexe wurde mittels ELISA bestimmt. Nunc Maxisorp Mikrotiterplatten (Sigma) wurden über Nacht bei 4 °C mit 1,5 μg/ml Maus-Anti-Streptavidin-Antikörper (Thermo, MA1-20011) beschichtet. Nach zweistündiger Blockierung (Blockierungspuffer: 140 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % Gelatine, 1 % BSA) bei Raumtemperatur wurde die Platte 3 Sekunden lang mit 0,05 % Tween-20/PBS (Waschpuffer) gewaschen. Anschließend wurden Liquor- und Plasmaproben in die mit Blockierungspuffer verdünnten Vertiefungen pipettiert (Plasma 1:10.000, Liquor 1:115). Die Platte wurde anschließend über Nacht bei 4 °C mit Detektionsantikörper (1 μg/ml, Anti-Streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) inkubiert. Nach drei Waschschritten wurde Streptavidin durch Inkubation in TMB-Substratlösung (Roche) für bis zu 20 min nachgewiesen. Nach Stoppen der Farbentwicklung mit 1 M H₂SO₄ wurde die Absorption bei 450 nm gemessen.
Die Funktion des Streptavidin-Peptid-BACE1-Inhibitor-Komplexes wurde mittels Aβ(1–40)-ELISA gemäß Herstellerprotokoll (Wako, 294-64701) untersucht. Kurz gesagt, wurden Liquorproben in Standardverdünnungsmittel (1:23) verdünnt und über Nacht bei 4 °C in mit BNT77-Fängerantikörper beschichteten 96-Well-Platten inkubiert. Nach fünf Waschschritten wurde HRP-konjugierter BA27-Antikörper zugegeben und 2 Stunden bei 4 °C inkubiert, gefolgt von fünf weiteren Waschschritten. Aβ(1–40) wurde durch Inkubation in TMB-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur nachgewiesen. Nach Stoppen der Farbentwicklung mit Stopplösung wurde die Absorption bei 450 nm gemessen. Plasmaproben wurden vor dem Aβ(1–40)-ELISA einer Festphasenextraktion unterzogen. Plasma wurde in 96-Well-Platten zu 0,2 % DEA (Sigma) gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen der SPE-Platten (Oasis, 186000679) mit Wasser und 100 % Methanol wurden die Plasmaproben auf die SPE-Platten aufgetragen und die gesamte Flüssigkeit entfernt. Die Proben wurden gewaschen (zuerst mit 5 % Methanol, dann mit 30 % Methanol) und mit 2 % NH₄OH/90 % Methanol eluiert. Nach dem Trocknen des Eluats bei 55 °C für 99 min unter konstantem N₂-Strom wurden die Proben in Standardverdünnungsmitteln reduziert und Aβ(1–40) wie oben beschrieben gemessen.
So zitieren Sie diesen Artikel: Urich, E. et al. Cargo delivery to the brain using transit peptides identified in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
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