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Die Blut-Hirn-Schranke und die Blut-Hirn-Schranke verhindern, dass Biotherapeutika ihre Ziele im zentralen Nervensystem erreichen, und behindern so die wirksame Behandlung neurologischer Erkrankungen. Um neue Gehirntransporter in vivo zu entdecken, führten wir eine T7-Phagenpeptidbibliothek ein und sammelten seriell Blut und Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) mithilfe eines kanülierten, wachen Rattenmodells mit großem Pool. Spezifische Phagenklone waren nach vier Selektionsrunden in CSF stark angereichert. Tests einzelner Kandidatenpeptide ergaben eine über 1000-fache Anreicherung in CSF. Die Bioaktivität der peptidvermittelten Verabreichung an das Gehirn wurde durch eine 40%ige Reduktion des Amyloid-β-Spiegels in der Zerebrospinalflüssigkeit unter Verwendung eines BACE1-Peptidinhibitors, der an das identifizierte neue Transitpeptid gekoppelt war, bestätigt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die durch In-vivo-Phagenselektionsmethoden identifizierten Peptide nützliche Vehikel für die systemische Verabreichung von Makromolekülen an das Gehirn mit therapeutischer Wirkung sein könnten.
Die Forschung zu zielgerichteten Therapien für das zentrale Nervensystem (ZNS) konzentrierte sich bislang weitgehend auf die Identifizierung optimierter Medikamente und Wirkstoffe mit ZNS-spezifischen Eigenschaften. Weniger Beachtung fand die Erforschung der Mechanismen, die den aktiven Medikamententransport ins Gehirn steuern. Dies beginnt sich nun zu ändern, da der Medikamententransport, insbesondere von großmolekularen Substanzen, ein integraler Bestandteil der modernen neurowissenschaftlichen Arzneimittelentwicklung ist. Das zentrale Nervensystem ist durch das zerebrovaskuläre Barrieresystem, bestehend aus der Blut-Hirn-Schranke (BHS) und der Blut-Hirn-Schranke (BCBB), gut geschützt1, was den Medikamententransport ins Gehirn erschwert1,2. Schätzungsweise werden fast alle großmolekularen Medikamente und über 98 % der kleinmolekularen Medikamente aus dem Gehirn eliminiert3. Deshalb ist die Identifizierung neuer Gehirntransportsysteme, die einen effizienten und spezifischen Transport von Therapeutika ins ZNS ermöglichen, so wichtig4,5. Allerdings bieten auch die BHS und die BCSFB hervorragende Möglichkeiten für den Medikamententransport, da sie über das ausgedehnte Gefäßsystem des Gehirns in alle Strukturen des Gehirns eindringen. Die aktuellen Bemühungen um nicht-invasive Verabreichungsmethoden im Gehirn basieren daher weitgehend auf dem Mechanismus des rezeptorvermittelten Transports (PMT) über den endogenen BBB6-Rezeptor. Trotz der jüngsten Fortschritte bei der Nutzung des Transferrinrezeptor-Signalwegs7,8 ist die Weiterentwicklung neuer Verabreichungssysteme mit verbesserten Eigenschaften erforderlich. Unser Ziel war es daher, Peptide zu identifizieren, die den Liquortransport vermitteln können, da diese prinzipiell zum Transport von Makromolekülen ins ZNS oder zur Erschließung neuer Rezeptorwege eingesetzt werden könnten. Insbesondere spezifische Rezeptoren und Transporter des zerebrovaskulären Systems (BBB und BSCFB) können als potenzielle Ziele für die aktive und spezifische Verabreichung von Biotherapeutika dienen. Liquor cerebrospinalis (CSF) ist ein Sekretionsprodukt des Plexus choroideus (CS) und steht über den Subarachnoidalraum und den Ventrikelraum in direktem Kontakt mit der interstitiellen Flüssigkeit des Gehirns4. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass subarachnoidale Liquor cerebrospinalis übermäßig in das Interstitium des Gehirns diffundiert9. Wir hoffen, den Parenchymraum über diesen subarachnoidalen Zuflusstrakt oder direkt über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu erreichen. Zu diesem Zweck haben wir eine robuste In-vivo-Phagenselektionsstrategie implementiert, die idealerweise Peptide identifiziert, die über einen dieser beiden unterschiedlichen Wege transportiert werden.
Wir beschreiben nun eine sequenzielle In-vivo-Phagendisplay-Screeningmethode mit Liquorprobenentnahme und Hochdurchsatzsequenzierung (HTS), um erste Selektionsrunden mit der höchsten Bibliotheksdiversität zu überwachen. Das Screening wurde an wachen Ratten mit einer permanent implantierten großen Zisternenkanüle (CM) durchgeführt, um eine Blutkontamination zu vermeiden. Wichtig ist, dass dieser Ansatz sowohl auf das Gehirn abzielende Peptide als auch Peptide mit Transportaktivität über die zerebrovaskuläre Barriere selektiert. Wir verwendeten T7-Phagen aufgrund ihrer geringen Größe (~60 nm)10 und schlugen vor, dass sie für den Transport von Vesikeln geeignet sind, die eine transzelluläre Überwindung der endothelialen und/oder epithelialen-medullären Barriere ermöglichen. Nach vier Panning-Runden wurden Phagenpopulationen isoliert, die eine starke In-vivo-Liquoranreicherung und zerebrale Mikrogefäßassoziation zeigten. Wichtig ist, dass wir unsere Ergebnisse bestätigen konnten, indem wir zeigten, dass die bevorzugten und chemisch synthetisierten besten Kandidatenpeptide in der Lage sind, Proteinfracht in die Zerebrospinalflüssigkeit zu transportieren. Zunächst wurden die pharmakodynamischen Effekte des ZNS durch die Kombination eines führenden Transitpeptids mit einem Inhibitor des BACE1-Peptids nachgewiesen. Neben dem Nachweis, dass funktionelle In-vivo-Screening-Strategien neue Transportpeptide im Gehirn als effektive Proteinfrachtträger identifizieren können, erwarten wir, dass ähnliche funktionelle Selektionsmethoden auch bei der Identifizierung neuer Transportwege im Gehirn an Bedeutung gewinnen werden.
Auf der Grundlage von Plaque-bildenden Einheiten (PFU) wurde nach dem Phagenverpackungsschritt eine Bibliothek aus zufälligen linearen 12-mer T7-Phagenpeptiden mit einer Diversität von ca. 109 entworfen und erstellt (siehe Materialien und Methoden). Es ist wichtig anzumerken, dass wir diese Bibliothek vor dem In-vivo-Panning sorgfältig analysiert haben. Durch PCR-Amplifikation von Proben der Phagenbibliothek mit modifizierten Primern wurden Amplicons erzeugt, die direkt auf HTS anwendbar waren (Ergänzende Abb. 1a). Aufgrund von a) HTS11-Sequenzierungsfehlern, b) Auswirkungen auf die Qualität der Primer (NNK)1-12 und c) des Vorhandenseins von Wildtyp-(wt)-Phagen (Skelett-Inserts) in der Standby-Bibliothek wurde ein Sequenzfilterverfahren implementiert, um nur verifizierte Sequenzinformationen zu extrahieren (Ergänzende Abb. 1b). Diese Filterschritte gelten für alle HTS-Sequenzierungsbibliotheken. Für die Standardbibliothek wurden insgesamt 233.868 Reads erhalten, von denen 39 % die Filterkriterien erfüllten und für die Bibliotheksanalyse und -auswahl für nachfolgende Runden verwendet wurden (Ergänzende Abbildung 1c–e). Die Reads waren überwiegend ein Vielfaches von 3 Basenpaaren lang mit einem Maximum bei 36 Nukleotiden (Ergänzende Abbildung 1c), was das Bibliotheksdesign (NNK) 1-12 bestätigte. Bemerkenswerterweise enthielten ungefähr 11 % der Bibliotheksmitglieder ein 12-dimensionales PAGISRELVDKL-Insert im Wildtyp-Backbone (wt), und fast die Hälfte der Sequenzen (49 %) enthielt Insertionen oder Deletionen. Das HTS der Bibliothek bestätigte die hohe Diversität der Peptide in der Bibliothek: Mehr als 81 % der Peptidsequenzen wurden nur einmal gefunden und nur 1,5 % kamen in ≥4 Kopien vor (Ergänzende Abbildung 2a). Die Häufigkeiten der Aminosäuren (aa) an allen 12 Positionen im Repertoire korrelierten gut mit den erwarteten Häufigkeiten für die Anzahl der vom degenerierten NKK-Repertoire erzeugten Codons (Ergänzende Abb. 2b). Die beobachtete Häufigkeit der von diesen Inserts kodierten aa-Reste korrelierte gut mit der berechneten Häufigkeit (r = 0,893) (Ergänzende Abb. 2c). Die Vorbereitung von Phagenbibliotheken für die Injektion umfasst die Schritte der Amplifikation und Entfernung von Endotoxin. Es wurde bereits gezeigt, dass dies die Diversität von Phagenbibliotheken potenziell reduzieren kann12,13. Daher sequenzierten wir eine plattenamplifizierte Phagenbibliothek, aus der das Endotoxin entfernt worden war, und verglichen sie mit der Originalbibliothek, um die Häufigkeit der AA zu schätzen. Es wurde eine starke Korrelation (r = 0,995) zwischen dem Originalpool und dem amplifizierten und gereinigten Pool beobachtet (Ergänzende Abb. 2d), Dieser Vergleich basiert auf der Häufigkeit von Tripeptidmotiven in jeder Bibliothek, da die Diversität der Bibliotheken (~109) selbst mit HTS nicht vollständig erfasst werden kann. Die Häufigkeitsanalyse der Aminosäuren an jeder Position ergab eine geringe positionsabhängige Abweichung an den letzten drei Positionen des eingegebenen Repertoires (Ergänzende Abbildung 2e). Zusammenfassend kamen wir zu dem Schluss, dass Qualität und Diversität der Bibliothek akzeptabel waren und nur geringfügige Diversitätsänderungen aufgrund der Amplifikation und Vorbereitung der Phagenbibliotheken zwischen mehreren Selektionsrunden beobachtet wurden.
Die serielle Entnahme von Liquorproben kann durch die chirurgische Implantation einer Kanüle in den CM von wachen Ratten erfolgen, um die Identifizierung von intravenös (iv) über die Blut-Hirn-Schranke und/oder den Basalgangliengang (BCSFB) injizierten T7-Phagen zu erleichtern (Abb. 1a-b). In den ersten drei Runden der In-vivo-Selektion verwendeten wir zwei unabhängige Selektionsarme (Arme A und B) (Abb. 1c). Wir erhöhten die Stringenz der Selektion schrittweise, indem wir die Gesamtmenge der in den ersten drei Selektionsrunden eingeführten Phagen verringerten. Für die vierte Panning-Runde kombinierten wir Proben aus den Armen A und B und führten drei weitere unabhängige Selektionen durch. Um die In-vivo-Eigenschaften von T7-Phagenpartikeln in diesem Modell zu untersuchen, wurde Ratten Wildtyp-Phagen (PAGISRELVDKL-Master-Insert) über die Schwanzvene injiziert. Die Wiederfindung von Phagen aus Liquor und Blut zu verschiedenen Zeitpunkten zeigte, dass relativ kleine ikosaedrische T7-Phagen eine schnelle initiale Clearance-Phase aus dem Blutkompartiment aufwiesen (Ergänzende Abb. 3). Anhand der verabreichten Titer und des Blutvolumens der Ratten berechneten wir, dass 10 Minuten nach der intravenösen Injektion lediglich etwa 1 % (Gew.) Phagen der verabreichten Dosis im Blut nachweisbar waren. Nach diesem anfänglichen schnellen Abfall wurde eine langsamere primäre Clearance mit einer Halbwertszeit von 27,7 Minuten gemessen. Wichtig ist, dass nur sehr wenige Phagen aus dem Liquor cerebrospinalis gefunden wurden, was auf eine geringe Hintergrundmigration von Wildtyp-Phagen in den Liquor cerebrospinalis hindeutet (Ergänzende Abbildung 3). Im Durchschnitt wurden über den gesamten Probenahmezeitraum (0–250 Min.) nur etwa 1 x 10-3 % Titer von T7-Phagen im Blut und 4 x 10-8 % der ursprünglich infundierten Phagen in der Zerebrospinalflüssigkeit nachgewiesen. Bemerkenswerterweise war die Halbwertszeit (25,7 Min.) von Wildtyp-Phagen in der Zerebrospinalflüssigkeit ähnlich der im Blut beobachteten. Diese Daten zeigen, dass die Barriere, die das CSF-Kompartiment vom Blut trennt, bei mit CM-Kanülen behandelten Ratten intakt ist, was eine In-vivo-Selektion von Phagenbibliotheken ermöglicht, um Klone zu identifizieren, die leicht vom Blut in das CSF-Kompartiment transportiert werden.
(a) Einrichten einer Methode zur erneuten Entnahme von Liquor cerebrospinalis (CSF) aus einem großen Pool. (b) Diagramm, das die zelluläre Position der Schranke des zentralen Nervensystems (ZNS) und die Selektionsstrategie zeigt, die verwendet wird, um Peptide zu identifizieren, die die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​und die Blut-Hirn-Schranke überwinden. (c) Flussdiagramm des In-vivo-Phagendisplay-Screenings. In jeder Selektionsrunde wurden Phagen (Tierkennungen innerhalb der Pfeile) intravenös injiziert. Zwei unabhängige alternative Zweige (A, B) werden bis zur 4. Selektionsrunde separat aufbewahrt. Für die Selektionsrunden 3 und 4 wurde jeder aus CSF extrahierte Phagenklon manuell sequenziert. (d) Kinetik von Phagen, die während der ersten Selektionsrunde aus Blut (rote Kreise) und Liquor cerebrospinalis (grüne Dreiecke) isoliert wurden, bei zwei kanülierten Ratten nach intravenöser Injektion der T7-Peptidbibliothek (2 x 1012 Phagen/Tier). Blaue Quadrate zeigen die durchschnittliche Anfangskonzentration von Phagen im Blut an, berechnet aus der Menge der injizierten Phagen unter Berücksichtigung des Gesamtblutvolumens. Die schwarzen Quadrate zeigen den Schnittpunkt der y-Linie an, die aus den Phagenkonzentrationen im Blut extrapoliert wurde. (e,f) Stellen die relative Häufigkeit und Verteilung aller möglichen überlappenden Tripeptidmotive dar, die im Peptid gefunden wurden. Angezeigt wird die Anzahl der in 1000 Messungen gefundenen Motive. Signifikant (p < 0,001) angereicherte Motive sind mit roten Punkten markiert. (e) Korrelationsstreudiagramm, das die relative Häufigkeit des Tripeptidmotivs der injizierten Bibliothek mit aus Blut gewonnenen Phagen der Tiere Nr. 1.1 und Nr. 1.2 vergleicht. (f) Korrelationsstreudiagramm, das die relativen Häufigkeiten der aus Blut und Zerebrospinalflüssigkeit isolierten tierischen Phagen-Tripeptidmotive Nr. 1.1 und Nr. 1.2 vergleicht. (g, h) Sequenz-ID-Darstellung von in Blut angereicherten Phagen (g) gegenüber injizierten Bibliotheken und von in Liquor angereicherten Phagen (h) gegenüber Blut nach einer In-vivo-Selektionsrunde in beiden Tieren. Die Größe des Ein-Buchstaben-Codes gibt an, wie häufig die jeweilige Aminosäure an dieser Position vorkommt. Grün = polar, violett = neutral, blau = basisch, rot = sauer und schwarz = hydrophobe Aminosäuren. Abbildung 1a, b wurde von Eduard Urich entworfen und erstellt.
Wir injizierten zwei CM-Instrumentratten (Klade A und B) eine Phagenpeptidbibliothek und isolierten Phagen aus der Zerebrospinalflüssigkeit und dem Blut (Abbildung 1d). Die anfängliche schnelle Clearance der Bibliothek war im Vergleich zum Wildtyp-Phagen weniger ausgeprägt. Die mittlere Halbwertszeit der injizierten Bibliothek betrug bei beiden Tieren 24,8 Minuten im Blut, ähnlich wie beim Wildtyp-Phagen, und 38,5 Minuten in der Zerebrospinalflüssigkeit. Blut- und Zerebrospinalflüssigkeitsphagenproben jedes Tiers wurden einem HTS unterzogen und alle identifizierten Peptide auf das Vorhandensein eines kurzen Tripeptidmotivs analysiert. Tripeptidmotive wurden gewählt, weil sie eine minimale Basis für Strukturbildung und Peptid-Protein-Interaktionen bieten14,15. Wir fanden eine gute Korrelation in der Verteilung der Motive zwischen der injizierten Phagenbibliothek und den aus dem Blut beider Tiere extrahierten Klonen (Abb. 1e). Die Daten deuten darauf hin, dass die Zusammensetzung der Bibliothek im Blutkompartiment nur geringfügig angereichert ist. Aminosäurefrequenzen und Konsensussequenzen wurden an jeder Position mithilfe einer Adaption der Software Weblogo16 weiter analysiert. Interessanterweise stellten wir eine starke Anreicherung von Glycinresten im Blut fest (Abb. 1g). Beim Vergleich von Blut mit Klonen aus der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) zeigte sich eine starke Selektion und teilweise Deselektion von Motiven (Abb. 1f), und bestimmte Aminosäuren waren bevorzugt an vorbestimmten Positionen im 12-Mer-Molekül vorhanden (Abb. 1h). Bemerkenswerterweise unterschieden sich einzelne Tiere signifikant im Liquor, während bei beiden Tieren eine Anreicherung von Blutglycin beobachtet wurde (Ergänzende Abb. 4a–j). Nach strenger Filterung der Sequenzdaten im Liquor der Tiere Nr. 1.1 und Nr. 1.2 wurden insgesamt 964 bzw. 420 einzigartige 12-Mer-Peptide erhalten (Ergänzende Abb. 1d–e). Die isolierten Phagenklone wurden amplifiziert und einer zweiten Runde der In-vivo-Selektion unterzogen. In der zweiten Selektionsrunde extrahierte Phagen wurden in jedem Tier einem HTS unterzogen und alle identifizierten Peptide dienten als Input für ein Motiverkennungsprogramm zur Analyse des Vorkommens von Tripeptidmotiven (Abb. 2a, b, ef). Verglichen mit dem ersten Zyklus der aus der Zerebrospinalflüssigkeit gewonnenen Phagen beobachteten wir in den Zweigen A und B eine weitere Selektion und De-Selektion vieler Motive in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) (Abb. 2). Mithilfe eines Netzwerkidentifikationsalgorithmus wurde ermittelt, ob sie unterschiedliche Muster konsistenter Sequenzen darstellten. Es wurde eine deutliche Ähnlichkeit zwischen den per CSF gewonnenen 12-dimensionalen Sequenzen im alternativen Klade A (Abb. 2c, d) und Klade B (Abb. 2g, h) beobachtet. Die zusammengefasste Analyse in jedem Zweig ergab unterschiedliche Selektionsprofile für 12-mer-Peptide (Ergänzende Abb. 5c, d) und einen Anstieg des CSF/Bluttiter-Verhältnisses im Zeitverlauf für gepoolte Klone nach der zweiten Selektionsrunde im Vergleich zur ersten Selektionsrunde (Ergänzende Abb. 5e).
Anreicherung von Motiven und Peptiden in der Zerebrospinalflüssigkeit durch zwei aufeinanderfolgende Runden der funktionellen Phagendisplay-Selektion in vivo.
Alle aus der Zerebrospinalflüssigkeit gewonnenen Phagen aus der ersten Runde jedes Tieres (Tiere Nr. 1.1 und Nr. 1.2) wurden gepoolt, amplifiziert, HT-sequenziert und zusammen (2 x 1010 Phagen/Tier) 2 mit SM-Kanülen operierten Ratten (Nr. 1.1 → Nr. 2.1 und 2.2, 1.2 → 2.3 und 2.4) erneut injiziert. (a, b, e, f) Korrelations-Streudiagramme, die die relative Häufigkeit von Tripeptidmotiven aller aus der Zerebrospinalflüssigkeit gewonnenen Phagen in der ersten und zweiten Selektionsrunde vergleichen. Relative Häufigkeit und Verteilung von Motiven, die alle möglichen überlappenden Tripeptide darstellen, die in Peptiden beider Orientierungen gefunden wurden. Angezeigt wird die Anzahl der in 1000 Lesungen gefundenen Motive. Motive, die in einer der verglichenen Bibliotheken signifikant (p < 0,001) selektiert oder ausgeschlossen wurden, sind mit roten Punkten hervorgehoben. (c, d, g, h) Sequenzlogo-Darstellung aller CSF-reichen 12 Aminosäuren langen Sequenzen basierend auf den Runden 2 und 1 der In-vivo-Selektion. Die Größe des Ein-Buchstaben-Codes gibt an, wie oft diese Aminosäure an dieser Position vorkommt. Zur Darstellung des Logos wird die Häufigkeit der aus einzelnen Tieren zwischen zwei Selektionsrunden extrahierten CSF-Sequenzen verglichen und die angereicherten Sequenzen der zweiten Runde werden dargestellt: (c) Nr. 1.1–Nr. 2.1 (d) Nr. 1.1–Nr. 2.2 (g) Nr. 1.2–Nr. 2.3 und (h) Nr. 1.2–Nr. 2.4. Die am stärksten angereicherten Aminosäuren an einer bestimmten Position bei (c, d) den Tieren Nr. 2.1 und Nr. 2.2 oder (g, h) den Tieren Nr. 2.3 und Nr. 2.4 werden farbig dargestellt. Grün = polare, violett = neutrale, blau = basische, rot = saure und schwarz = hydrophobe Aminosäuren.
Nach der dritten Selektionsrunde identifizierten wir 124 einzigartige Peptidsequenzen (Nr. 3.1 und Nr. 3.2) aus 332 aus CSF rekonstituierten Phagenklonen, die aus zwei Tieren isoliert wurden (Ergänzende Abb. 6a). Die Sequenz LGSVS (18,7 %) hatte den höchsten relativen Anteil, gefolgt von den Wildtyp-Inserts PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) und SARGSWREIVSLS (2,2 %). In der abschließenden vierten Runde fassten wir zwei unabhängig voneinander ausgewählte Zweige aus drei verschiedenen Tieren zusammen (Abb. 1c). Von den 925 sequenzierten Phagenklonen, die aus CSF gewonnen wurden, fanden wir in der vierten Runde 64 einzigartige Peptidsequenzen (Ergänzende Abb. 6b), unter denen der relative Anteil der Wildtyp-Phagen auf 0,8 % sank. Die häufigsten CSF-Klone in der vierten Runde waren LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) und RLSSVDSDLSGC (3,2 %). Der Längenbereich der ausgewählten Peptide ist auf Nukleotidinsertionen/-deletionen oder vorzeitige Stopcodons in den Bibliotheksprimern zurückzuführen, wenn degenerierte Codons für das NNK-Bibliotheksdesign verwendet werden. Vorzeitige Stopcodons erzeugen kürzere Peptide und werden ausgewählt, weil sie das günstige aa-Motiv enthalten. Längere Peptide können aus Insertionen/Deletionen in den Primern der synthetischen Bibliotheken resultieren. Dadurch wird das entworfene Stopcodon außerhalb des Rahmens positioniert und gelesen, bis stromabwärts ein neues Stopcodon erscheint. Im Allgemeinen berechneten wir Anreicherungsfaktoren für alle vier Selektionsrunden, indem wir die Eingabedaten mit den Ausgabedaten der Proben verglichen. Für die erste Screeningrunde verwendeten wir Wildtyp-Phagentiter als unspezifische Hintergrundreferenz. Interessanterweise war die negative Phagenselektion im ersten Liquorzyklus sehr stark, jedoch nicht im Blut (Abb. 3a). Dies könnte an der geringen Wahrscheinlichkeit der passiven Diffusion der meisten Mitglieder der Peptidbibliothek in das Liquorkompartiment liegen oder daran, dass relative Phagen tendenziell effizienter im Blutkreislauf zurückgehalten oder entfernt werden als Bakteriophagen. In der zweiten Panningrunde wurde jedoch in beiden Kladen eine starke Phagenselektion im Liquor beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die vorherige Runde reich an Phagen war, die Peptide präsentierten, die die Liquoraufnahme fördern (Abb. 3a). Auch hier erfolgte keine signifikante Blutanreicherung. Auch in der dritten und vierten Runde waren die Phagenklone im Liquor signifikant angereichert. Beim Vergleich der relativen Häufigkeit jeder einzelnen Peptidsequenz zwischen den letzten beiden Selektionsrunden stellten wir fest, dass die Sequenzen in der vierten Selektionsrunde noch stärker angereichert waren (Abb. 3b). Insgesamt wurden 931 Tripeptidmotive aus allen 64 einzigartigen Peptidsequenzen unter Verwendung beider Peptidorientierungen extrahiert. Die am stärksten angereicherten Motive der vierten Runde wurden im Vergleich zur injizierten Bibliothek genauer auf ihre Anreicherungsprofile über alle Runden hinweg untersucht (Cut-off: 10 % Anreicherung) (Ergänzende Abb. 6c). Allgemeine Selektionsmuster zeigten, dass die meisten der untersuchten Motive in allen vorherigen Runden beider Selektionszweige angereichert wurden. Einige Motive (z. B. SGL, VSG, LGS GSV) stammten jedoch überwiegend aus der alternativen Klade A, während andere (z. B. FGW, RTN, WGF, NTR) in der alternativen Klade B angereichert waren.
Validierung des CSF-Transports von CSF-angereicherten Phagen-Display-Peptiden und biotinylierten Leader-Peptiden, die an Streptavidin-Nutzlasten konjugiert sind.
(a) Anreicherungsverhältnisse, berechnet in allen vier Runden (R1–R4), basierend auf injizierten (Input = I) Phagentitern (PFU) und bestimmten Phagentitern in der Zerebrospinalflüssigkeit (Output = O). Anreicherungsfaktoren für die letzten drei Runden (R2–R4) wurden durch Vergleich mit der vorherigen Runde und der ersten Runde (R1) mit Gewichtsdaten berechnet. Offene Balken stellen Zerebrospinalflüssigkeit dar, schattierte Balken stellen Plasma dar. (***p < 0,001, basierend auf Student's t-Test). (b) Liste der am häufigsten vorkommenden Phagenpeptide, geordnet nach ihrem relativen Anteil an allen in der Zerebrospinalflüssigkeit gesammelten Phagen nach Runde 4 der Selektion. Die sechs häufigsten Phagenklone sind farblich hervorgehoben, nummeriert und ihre Anreicherungsfaktoren zwischen den Runden 3 und 4 der Selektion sind angegeben (Einschübe). (c, d) Die sechs am stärksten angereicherten Phagenklone, leeren Phagen und parentalen Phagenpeptidbibliotheken aus Runde 4 wurden einzeln in einem CSF-Samplingmodell analysiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Liquor- und Blutproben entnommen. (c) Gleiche Mengen von 6 Kandidaten-Phagenklonen (2 x 1010 Phagen/Tiere), leeren Phagen (Nr. 1779) (2 x 1010 Phagen/Tiere) und Stamm-Phagenpeptidbibliotheken (2 x 1012 Phagen/Tiere). Dem kanülierten Tier werden mindestens 3 cm separat über die Schwanzvene injiziert. Die Liquor-Pharmakokinetik jedes injizierten Phagenklons und jeder Phagenpeptidbibliothek im Zeitverlauf ist dargestellt. (d) zeigt das durchschnittliche Liquor/Blut-Verhältnis für alle gewonnenen Phagen/ml über den Probenahmezeitraum. (e) Vier synthetische Leaderpeptide und ein verschlüsseltes Kontrollpeptid wurden über ihren N-Terminus mit Biotin an Streptavidin gebunden (Tetramer-Display), gefolgt von einer Injektion (Schwanzvene intravenös, 10 mg Streptavidin/kg). Mindestens drei intubierte Ratten (N = 3). ). Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Liquorproben entnommen und die Streptavidinkonzentrationen mittels Liquor-Anti-Streptavidin-ELISA gemessen (n. d. = nicht nachweisbar). (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, basierend auf ANOVA-Test). (f) Vergleich der Aminosäuresequenz des am stärksten angereicherten Phagenpeptidklons Nr. 2002 (lila) mit anderen selektierten Phagenpeptidklonen aus der vierten Selektionsrunde. Identische und ähnliche Aminosäurefragmente sind farblich gekennzeichnet.
Von allen angereicherten Phagen in der vierten Runde (Abb. 3b) wurden sechs Kandidatenklone für die weitere Einzelanalyse im CSF-Probenahmemodell ausgewählt. Gleiche Mengen von sechs Kandidatenphagen, leeren Phagen (ohne Insert) und Prophagen-Peptidbibliotheken wurden drei kanülierten CM-Tieren injiziert und die Pharmakokinetik wurde in CSF- (Abb. 3c) und Blutuntersuchungen (Ergänzende Abb. 7) bestimmt. Alle getesteten Phagenklone zielten 10- bis 1000-mal stärker auf das CSF-Kompartiment als der leere Kontrollphage (Nr. 1779). Beispielsweise hatten die Klone Nr. 2020 und Nr. 2077 etwa 1000-mal höhere CSF-Titer als Kontrollphagen. Das pharmakokinetische Profil jedes ausgewählten Peptids ist unterschiedlich, aber alle besitzen eine hohe CSF-Homing-Fähigkeit. Wir beobachteten einen stetigen Abfall im Zeitverlauf bei den Klonen #1903 und #2011, während bei den Klonen #2077, #2002 und #2009 ein Anstieg während der ersten 10 Minuten auf aktiven Transport hinweisen könnte, der jedoch überprüft werden muss. Die Klone #2020, #2002 und #2077 stabilisierten sich auf hohem Niveau, während die Liquorkonzentration von Klon #2009 nach dem anfänglichen Anstieg langsam abnahm. Anschließend verglichen wir die relative Häufigkeit jedes Liquorkandidaten mit seiner Blutkonzentration (Abb. 3d). Die Korrelation des mittleren Titers jedes Liquorkandidaten mit seinem Bluttiter zu allen Probenahmezeitpunkten zeigte, dass drei der sechs Kandidaten signifikant mit Liquor angereichert waren. Interessanterweise zeigte Klon #2077 eine höhere Blutstabilität (Ergänzende Abbildung 7). Um zu bestätigen, dass die Peptide selbst in der Lage sind, andere Fracht als Phagenpartikel aktiv in das Liquorkompartiment zu transportieren, synthetisierten wir vier Leaderpeptide, die am N-Terminus, wo die Peptide an die Phagenpartikel binden, mit Biotin derivatisiert waren. Biotinylierte Peptide (Nr. 2002, 2009, 2020 und 2077) wurden mit Streptavidin (SA) konjugiert, um multimere Formen zu erhalten, die die Phagengeometrie teilweise nachahmen. Dieses Format ermöglichte uns auch, die SA-Exposition in Blut und Liquor cerebrospinalis als Fracht transportierende Proteinpeptide zu messen. Wichtig ist, dass Phagendaten häufig reproduziert werden konnten, wenn synthetische Peptide in diesem SA-konjugierten Format verabreicht wurden (Abb. 3e). Die verschlüsselten Peptide wiesen eine geringere anfängliche Exposition und eine schnellere CSF-Clearance mit nicht nachweisbaren Werten innerhalb von 48 Stunden auf. Um Einblicke in die Transportwege dieser Peptidphagenklone in den CSF-Raum zu gewinnen, analysierten wir die Lokalisierung einzelner Phagenpeptidtreffer mittels Immunhistochemie (IHC), um Phagenpartikel 1 Stunde nach intravenöser Injektion in vivo direkt nachzuweisen. Bemerkenswerterweise konnten die Klone #2002, #2077 und #2009 durch starke Färbung in Hirnkapillaren nachgewiesen werden, während Kontrollphage (#1779) und Klon #2020 nicht nachgewiesen wurden (Ergänzende Abbildung 8). Dies deutet darauf hin, dass diese Peptide die Wirkung auf das Gehirn genau durch die Überquerung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) beeinflussen. Zur Überprüfung dieser Hypothese sind weitere detaillierte Analysen erforderlich, da auch der BSCFB-Transportweg beteiligt sein könnte. Beim Vergleich der Aminosäuresequenz des am stärksten angereicherten Klons (#2002) mit anderen ausgewählten Peptiden fiel auf, dass einige von ihnen ähnliche Aminosäureverlängerungen aufweisen, was auf einen ähnlichen Transportmechanismus hindeuten könnte (Abb. 3f).
Aufgrund seines einzigartigen Plasmaprofils und des signifikanten Anstiegs der Zerebrospinalflüssigkeit im Laufe der Zeit wurde der Phagendisplay-Klon Nr. 2077 über einen längeren Zeitraum von 48 Stunden weiter untersucht und konnte den schnellen Anstieg der Zerebrospinalflüssigkeit reproduzieren, der in Verbindung mit anhaltenden SA-Werten beobachtet wurde (Abb. 4a). Im Hinblick auf andere identifizierte Phagenklone zeigte Nr. 2077 eine starke Färbung der Hirnkapillaren und eine signifikante Kolokalisierung mit dem Kapillarmarker Lektin bei Betrachtung mit höherer Auflösung sowie möglicherweise eine gewisse Färbung im Parenchymraum (Abb. 4b). Um zu untersuchen, ob peptidvermittelte pharmakologische Wirkungen im ZNS erzielt werden können, führten wir ein Experiment durch, bei dem biotinylierte Versionen i) des Transitpeptids Nr. 2077 und ii) des BACE1-Inhibitorpeptids in zwei verschiedenen Verhältnissen mit SA gemischt wurden. Für eine Kombination verwendeten wir nur den BACE1-Peptidinhibitor und für die andere ein Verhältnis von 1:3 von BACE1-Peptidinhibitor zu Nr. 2077-Peptid. Beide Proben wurden intravenös verabreicht und die Konzentrationen von Beta-Amyloid-Peptid 40 (Abeta40) im Blut und in der Zerebrospinalflüssigkeit im Zeitverlauf gemessen. Abeta40 wurde in der Zerebrospinalflüssigkeit gemessen, da es die BACE1-Hemmung im Hirnparenchym widerspiegelt. Wie erwartet senkten beide Komplexe die Abeta40-Blutkonzentration signifikant (Abb. 4c, d). Allerdings führten nur Proben, die eine Mischung aus Peptid Nr. 2077 und einem an SA konjugierten Inhibitor des BACE1-Peptids enthielten, zu einer signifikanten Abnahme von Abeta40 in der Zerebrospinalflüssigkeit (Abb. 4c). Die Daten zeigen, dass Peptid Nr. 2077 das 60 kDa SA-Protein in das ZNS transportieren kann und auch mit SA-konjugierten Inhibitoren des BACE1-Peptids pharmakologische Effekte hervorruft.
(a) Klonale Injektion (2 × 10 Phagen/Tier) des T7-Phagen zeigt langfristige pharmakokinetische Profile des CSF-Peptids Nr. 2077 (RLSSVDSDLSGC) und des nicht injizierten Kontrollphagen (Nr. 1779) bei mindestens drei CM-intubierten Ratten. (b) Konfokalmikroskopische Aufnahme repräsentativer kortikaler Mikrogefäße bei Phagen-injizierten Ratten (2 × 10 10 Phagen/Tier) mit Gegenfärbung des Peptids Nr. 2077 und der Gefäße (Lektin). Diese Phagenklone wurden drei Ratten verabreicht und man ließ sie 1 Stunde zirkulieren, bevor sie perfundiert wurden. Die Gehirne wurden seziert und mit polyklonalen FITC-markierten Antikörpern gegen die T7-Phagenkapsid gefärbt. Zehn Minuten vor der Perfusion und anschließenden Fixierung wurde DyLight594-markiertes Lektin intravenös verabreicht. Fluoreszenzbilder zeigen die Lektinfärbung (rot) der luminalen Seite von Mikrogefäßen und Phagen (grün) im Lumen von Kapillaren und perivaskulärem Hirngewebe. Der Maßstab entspricht 10 µm. (c, d) Biotinyliertes BACE1-inhibitorisches Peptid allein oder in Kombination mit biotinyliertem Transitpeptid Nr. 2077 wurde an Streptavidin gekoppelt, gefolgt von einer intravenösen Injektion von mindestens drei kanülierten CM-Ratten (10 mg Streptavidin/kg). Die durch den BACE1-Peptidinhibitor vermittelte Reduktion von Aβ40 wurde mittels Aβ1-40-ELISA im Blut (rot) und in der Zerebrospinalflüssigkeit (orange) zu den angegebenen Zeitpunkten gemessen. Zur besseren Übersicht ist im Diagramm eine gepunktete Linie im Maßstab 100 % eingezeichnet. (c) Prozentuale Reduktion von Aβ40 im Blut (rote Dreiecke) und in der Zerebrospinalflüssigkeit (orange Dreiecke) bei Ratten, die mit Streptavidin, konjugiert mit Transitpeptid Nr. 2077 und BACE1-inhibitorischem Peptid im Verhältnis 3:1, behandelt wurden. (d) Prozentuale Reduktion von Aβ40 im Blut (rote Kreise) und in der Zerebrospinalflüssigkeit (orange Kreise) bei Ratten, die nur mit Streptavidin, gekoppelt mit einem BACE1-inhibitorischen Peptid, behandelt wurden. Die Aβ-Konzentration in der Kontrolle betrug 420 pg/ml (Standardabweichung = 101 pg/ml).
Phagen-Display wird bereits in mehreren Bereichen der biomedizinischen Forschung erfolgreich eingesetzt17. Diese Methode wurde für In-vivo-Studien zur vaskulären Diversität18,19 sowie für Studien mit zerebralen Gefäßen20,21,22,23,24,25,26 verwendet. In dieser Studie haben wir die Anwendung dieser Selektionsmethode nicht nur auf die direkte Identifizierung von Peptiden mit zerebralen Gefäßen ausgeweitet, sondern auch auf die Entdeckung von Kandidaten mit aktiven Transporteigenschaften zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke. Wir beschreiben nun die Entwicklung eines In-vivo-Selektionsverfahrens bei CM-intubierten Ratten und demonstrieren dessen Potenzial zur Identifizierung von Peptiden mit CSF-Homing-Eigenschaften. Mithilfe des T7-Phagen, der eine Bibliothek aus 12-mer-Zufallspeptiden präsentiert, konnten wir nachweisen, dass der T7-Phage klein genug ist (ungefähr 60 nm Durchmesser)10, um sich an die Blut-Hirn-Schranke anzupassen und somit die Blut-Hirn-Schranke oder den Plexus choroideus direkt zu überwinden. Wir stellten fest, dass die Gewinnung von Liquor aus kanülierten CM-Ratten eine gut kontrollierte Methode für funktionelles In-vivo-Screening darstellte und dass die extrahierten Phagen nicht nur an das Gefäßsystem banden, sondern auch als Transporter über die Blut-Hirn-Schranke fungierten. Durch die gleichzeitige Blutentnahme und die Anwendung von HTS auf Liquor und aus Blut gewonnene Phagen bestätigten wir zudem, dass unsere Liquorauswahl nicht von der Blutanreicherung oder der Expansionsfähigkeit zwischen den Selektionsrunden beeinflusst wurde. Das Blutkompartiment ist jedoch Teil des Selektionsverfahrens, da Phagen, die das Liquorkompartiment erreichen können, lange genug im Blutkreislauf überleben und zirkulieren müssen, um sich im Gehirn anzureichern. Um zuverlässige Sequenzinformationen aus den HTS-Rohdaten zu extrahieren, implementierten wir Filter, die an plattformspezifische Sequenzierungsfehler angepasst sind, in den Analyse-Workflow. Durch Einbeziehung kinetischer Parameter in die Screeningmethode bestätigten wir die schnelle Pharmakokinetik von Wildtyp-T7-Phagen (t½ ~ 28 Min.) im Blut24, 27, 28 und bestimmten auch ihre Halbwertszeit in der Zerebrospinalflüssigkeit (t½ ~ 26 Min. pro Minute). Trotz ähnlicher pharmakokinetischer Profile in Blut und Zerebrospinalflüssigkeit konnten nur 0,001 % der Blutkonzentration von Phagen in der Zerebrospinalflüssigkeit nachgewiesen werden, was auf eine geringe Hintergrundmobilität von Wildtyp-T7-Phagen über die Blut-Hirn-Schranke hindeutet. Diese Arbeit unterstreicht die Bedeutung der ersten Selektionsrunde bei der Verwendung von In-vivo-Panning-Strategien, insbesondere für Phagensysteme, die schnell aus dem Kreislauf entfernt werden, da nur wenige Klone das ZNS-Kompartiment erreichen können. Somit war in der ersten Runde die Verringerung der Bibliotheksdiversität sehr groß, da schließlich nur eine begrenzte Anzahl von Klonen in diesem sehr strengen Zerebrospinalflüssigkeitsmodell gesammelt wurde. Diese In-vivo-Panning-Strategie umfasste mehrere Selektionsschritte wie die aktive Anreicherung im Liquorraum, das Überleben der Klone im Blutraum und die schnelle Entfernung der T7-Phagenklone aus dem Blut innerhalb der ersten 10 Minuten (Abb. 1d und ergänzende Abb. 4M). Somit wurden nach der ersten Runde unterschiedliche Phagenklone im Liquor identifiziert, obwohl für die einzelnen Tiere derselbe Ausgangspool verwendet wurde. Dies deutet darauf hin, dass mehrere strenge Selektionsschritte für Quellbibliotheken mit einer großen Anzahl von Bibliotheksmitgliedern zu einer signifikanten Verringerung der Diversität führen. Daher werden Zufallsereignisse ein integraler Bestandteil des anfänglichen Selektionsprozesses und beeinflussen das Ergebnis stark. Es ist wahrscheinlich, dass viele der Klone in der ursprünglichen Bibliothek eine sehr ähnliche Neigung zur Anreicherung im Liquor hatten. Selbst unter denselben experimentellen Bedingungen können die Selektionsergebnisse jedoch aufgrund der geringen Anzahl der einzelnen Klone im Ausgangspool unterschiedlich ausfallen.
Die in der Zerebrospinalflüssigkeit angereicherten Motive unterscheiden sich von denen im Blut. Interessanterweise stellten wir die erste Verschiebung hin zu glycinreichen Peptiden im Blut einzelner Tiere fest (Abb. 1g, ergänzende Abb. 4e, 4f). Phagen mit Glycinpeptiden sind möglicherweise stabiler und werden weniger leicht aus dem Kreislauf genommen. Diese glycinreichen Peptide wurden jedoch in den Proben der Zerebrospinalflüssigkeit nicht nachgewiesen. Dies legt nahe, dass die kuratierten Bibliotheken zwei verschiedene Selektionsschritte durchlaufen haben: einen im Blut und einen weiteren, der sich in der Zerebrospinalflüssigkeit anreicherte. CSF-angereicherte Klone aus der vierten Selektionsrunde wurden ausgiebig getestet. Es wurde bestätigt, dass fast alle der einzeln getesteten Klone im Vergleich zu leeren Kontrollphagen in der Zerebrospinalflüssigkeit angereichert waren. Ein Peptidtreffer (Nr. 2077) wurde genauer untersucht. Es zeigte eine längere Plasmahalbwertszeit im Vergleich zu anderen Treffern (Abbildung 3d und ergänzende Abbildung 7), und interessanterweise enthielt dieses Peptid einen Cysteinrest am C-Terminus. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Zugabe von Cystein zu Peptiden deren pharmakokinetische Eigenschaften durch Bindung an Albumin 29 verbessern kann. Dies ist für Peptid Nr. 2077 derzeit nicht bekannt und bedarf weiterer Studien. Einige Peptide zeigten eine Valenzabhängigkeit bei der CSF-Anreicherung (Daten nicht gezeigt), die mit der angezeigten Oberflächengeometrie des T7-Kapsids zusammenhängen könnte. Das von uns verwendete T7-System zeigte 5–15 Kopien jedes Peptids pro Phagenpartikel. IHC wurde an Kandidaten-Leitphagenklonen durchgeführt, die intravenös in die Großhirnrinde von Ratten injiziert wurden (Ergänzende Abbildung 8). Die Daten zeigten, dass mindestens drei Klone (Nr. 2002, Nr. 2009 und Nr. 2077) mit der BBB interagierten. Es bleibt zu bestimmen, ob diese BBB-Interaktion zur Ansammlung von CSF oder zur direkten Bewegung dieser Klone zur BCSFB führt. Wichtig ist, dass wir zeigen, dass die ausgewählten Peptide ihre CSF-Transportkapazität behalten, wenn sie synthetisiert und an die Proteinfracht gebunden werden. Die Bindung N-terminal biotinylierter Peptide an SA wiederholt im Wesentlichen die Ergebnisse, die mit ihren entsprechenden Phagenklonen in Blut und Zerebrospinalflüssigkeit erhalten wurden (Abb. 3e). Schließlich zeigen wir, dass das Leitpeptid Nr. 2077 die Gehirnaktivität eines an SA konjugierten biotinylierten Peptidinhibitors von BACE1 fördern kann, was ausgeprägte pharmakodynamische Effekte im ZNS verursacht, indem es die Abeta40-Spiegel in der CSF signifikant senkt (Abb. 4). Wir konnten in der Datenbank keine Homologen identifizieren, selbst indem wir eine Peptidsequenz-Homologiesuche für alle Treffer durchführten. Es ist wichtig zu beachten, dass die Größe der T7-Bibliothek etwa 109 beträgt, während die theoretische Bibliotheksgröße für 12-Mere 4 x 1015 beträgt. Daher haben wir nur einen kleinen Teil des Diversitätsraums der 12-Mer-Peptidbibliothek ausgewählt. Dies könnte bedeuten, dass durch die Auswertung des angrenzenden Sequenzraums dieser identifizierten Treffer optimiertere Peptide identifiziert werden können. Hypothetisch könnte einer der Gründe, warum wir keine natürlichen Homologe dieser Peptide gefunden haben, eine Deselektion während der Evolution sein, um den unkontrollierten Eintritt bestimmter Peptidmotive in das Gehirn zu verhindern.
Zusammengefasst bilden unsere Ergebnisse die Grundlage für zukünftige Arbeiten zur detaillierteren Identifizierung und Charakterisierung der Transportsysteme der zerebrovaskulären Barriere in vivo. Der grundlegende Aufbau dieser Methode basiert auf einer funktionellen Selektionsstrategie, die nicht nur Klone mit zerebralvaskulären Bindungseigenschaften identifiziert, sondern auch einen kritischen Schritt umfasst, in dem erfolgreiche Klone über eine intrinsische Aktivität verfügen, um biologische Barrieren in vivo in das ZNS-Kompartiment zu überwinden. Ziel ist die Aufklärung des Transportmechanismus dieser Peptide und ihrer bevorzugten Bindung an die für die Hirnregion spezifische Mikrovaskulatur. Dies könnte zur Entdeckung neuer Transportwege der BHS und von Rezeptoren führen. Wir erwarten, dass die identifizierten Peptide direkt an zerebrovaskuläre Rezeptoren oder an zirkulierende Liganden binden können, die durch die BHS oder BCSFB transportiert werden. Die in dieser Arbeit entdeckten Peptidvektoren mit CSF-Transportaktivität werden weiter untersucht. Wir untersuchen derzeit die Hirnspezifität dieser Peptide hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die BHS und/oder BCSFB zu überwinden. Diese neuen Peptide werden äußerst wertvolle Werkzeuge für die potenzielle Entdeckung neuer Rezeptoren oder Signalwege und für die Entwicklung neuer hocheffizienter Plattformen für die Abgabe von Makromolekülen, wie beispielsweise Biologika, an das Gehirn sein.
Kanülieren Sie die große Zisterne (CM) mit einer Modifikation der zuvor beschriebenen Methode. Narkosefreie Wistar-Ratten (200–350 g) wurden auf ein Stereotaxie-Gerät montiert. Über der rasierten und aseptisch vorbereiteten Kopfhaut wurde eine mediane Inzision vorgenommen, um den Schädel freizulegen. Im Bereich der oberen Schädelhälfte wurden zwei Löcher gebohrt und die Befestigungsschrauben darin befestigt. Ein zusätzliches Loch wurde in den lateralen Hinterhauptkamm gebohrt, um eine Edelstahlkanüle stereotaktisch in die CM einzuführen. Tragen Sie Zahnzement um die Kanüle auf und befestigen Sie ihn mit Schrauben. Nach der Lichthärtung und Zementverfestigung wurde die Hautwunde mit 4/0 Supramid-Naht verschlossen. Die korrekte Platzierung der Kanüle wird durch spontanes Austreten von Liquor cerebrospinalis (CSF) bestätigt. Nehmen Sie die Ratte vom Stereotaxie-Gerät, erhalten Sie eine angemessene postoperative Versorgung und Schmerztherapie und lassen Sie sie mindestens eine Woche lang genesen, bis Anzeichen von Blut im Liquor cerebrospinalis sichtbar werden. Wistar-Ratten (Crl:WI/Han) wurden von Charles River (Frankreich) bezogen. Alle Ratten wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Alle Tierversuche wurden vom Veterinäramt der Stadt Basel, Schweiz, genehmigt und gemäß der Tierlizenz Nr. 2474 (Bewertung des aktiven Hirntransports durch Messung der Konzentration therapeutischer Kandidaten in der Zerebrospinalflüssigkeit und im Gehirn von Ratten) durchgeführt.
Halten Sie die Ratte vorsichtig mit der CM-Kanüle in der Hand bei Bewusstsein. Entfernen Sie Datura aus der Kanüle und sammeln Sie 10 µl spontan fließende Zerebrospinalflüssigkeit. Da die Durchgängigkeit der Kanüle letztendlich beeinträchtigt war, wurden in diese Studie nur klare Zerebrospinalflüssigkeitsproben ohne Anzeichen von Blutkontamination oder Verfärbung einbezogen. Parallel dazu wurden ca. 10–20 µl Blut aus einer kleinen Inzision an der Schwanzspitze in Röhrchen mit Heparin (Sigma-Aldrich) entnommen. CSF und Blut wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach intravenöser Injektion von T7-Phagen gesammelt. Vor jeder CSF-Probe wurden ca. 5–10 µl Flüssigkeit verworfen, was dem Totvolumen des Katheters entspricht.
Die Bibliotheken wurden mit dem Vektor T7Select 10-3b gemäß der Beschreibung im T7Select-Systemhandbuch (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) generiert. Kurz gesagt wurde ein zufälliges 12-mer-DNA-Insert im folgenden Format synthetisiert:
Das NNK-Codon wurde verwendet, um doppelte Stoppcodons und eine Überexpression von Aminosäuren im Insert zu vermeiden. N ist ein manuell gemischtes äquimolares Verhältnis jedes Nukleotids und K ist ein manuell gemischtes äquimolares Verhältnis von Adenin- und Cytosin-Nukleotiden. Einzelsträngige Bereiche wurden durch weitere Inkubation mit dNTP (Novagen) und Klenow-Enzym (New England Biolabs) in Klenow-Puffer (New England Biolabs) für 3 Stunden bei 37 °C in doppelsträngige DNA umgewandelt. Nach der Reaktion wurde doppelsträngige DNA durch EtOH-Fällung gewonnen. Die resultierende DNA wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII (beide von Roche) verdaut. Das gespaltene und gereinigte (QIAquick, Qiagen) Insert (T4-Ligase, New England Biolabs) wurde dann im Leseraster in einen vorgespaltenen T7-Vektor nach Aminosäure 348 des 10B-Kapsidgens ligiert. Die Ligationsreaktionen wurden vor der In-vitro-Verpackung 18 Stunden bei 16 °C inkubiert. Die In-vitro-Verpackung der Phagen erfolgte gemäß den Anweisungen des T7Select 10-3b-Klonierungskits (Novagen). Die Verpackungslösung wurde einmalig mit Escherichia coli (BLT5615, Novagen) bis zur Lyse amplifiziert. Die Lysate wurden zentrifugiert, titriert und als Glycerin-Stammlösung bei -80 °C eingefroren.
Direkte PCR-Amplifikation variabler Phagenregionen, amplifiziert in Brühe oder Platte, mit proprietären 454/Roche-Amplicon-Fusionsprimern. Der Vorwärts-Fusionsprimer enthält Sequenzen, die die variable Region (NNK) 12 (templatespezifisch), den GS FLX Titanium Adapter A und eine vierbasige Schlüsselsequenz der Bibliothek (TCAG) flankieren (Ergänzende Abbildung 1a):
Der Reverse-Fusion-Primer enthält außerdem an Capture-Beads gebundenes Biotin und den GS FLX Titanium Adapter B, der für die klonale Amplifikation während der Emulsions-PCR erforderlich ist:
Die Amplikons wurden anschließend einer 454/Roche-Pyrosequenzierung gemäß dem 454 GS-FLX Titanium-Protokoll unterzogen. Für die manuelle Sanger-Sequenzierung (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) wurde die T7-Phagen-DNA mittels PCR amplifiziert und mit den folgenden Primerpaaren sequenziert:
Inserts aus einzelnen Plaques wurden einer PCR-Amplifikation mit dem Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (gemäß den Anweisungen des Herstellers) unterzogen. Führen Sie einen Heißstart (10 Minuten bei 95 °C) und 35 Boost-Zyklen (50 Sekunden bei 95 °C, 1 Minute bei 50 °C und 1 Minute bei 72 °C) durch.
Phagen aus Bibliotheken, Wildtypphagen, aus CSF und Blut gewonnene Phagen oder einzelne Klone wurden in Escherichia coli BL5615 in TB-Bouillon (Sigma Aldrich) oder in 500 cm² großen Schalen (Thermo Scientific) 4 Stunden bei 37 °C amplifiziert. Die Phagen wurden von den Platten durch Spülen der Platten mit Tris-EDTA-Puffer (Fluka Analytical) oder durch Abtrennen der Plaques mit sterilen Pipettenspitzen extrahiert. Die Phagen wurden aus dem Kulturüberstand oder Extraktionspuffer mittels einer Polyethylenglykol-(PEG 8000)-Fällung (Promega) isoliert und in Tris-EDTA-Puffer resuspendiert.
Der amplifizierte Phage wurde vor der intravenösen (IV) Injektion (500 μl/Tier) 2–3 Runden einer Endotoxinentfernung mit Endotoxinentfernungsperlen (Miltenyi Biotec) unterzogen. In der ersten Runde wurden 2×1012 Phagen eingeführt, in der zweiten 2×1010 Phagen und in der dritten und vierten Selektionsrunde 2×109 Phagen pro Tier. Der Phagengehalt in den zu den angegebenen Zeitpunkten gesammelten Liquor- und Blutproben wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (T7Select-Systemhandbuch) durch Plaquezählung bestimmt. Die Phagenselektion wurde durch intravenöse Injektion gereinigter Bibliotheken in die Schwanzvene durchgeführt oder durch erneute Injektion von Phagen, die aus dem Liquor der vorherigen Selektionsrunde extrahiert wurden. Die nachfolgenden Ernten der Liquor- und Blutproben erfolgten nach 10, 30, 60, 90, 120, 180 und 240 Minuten. Es wurden insgesamt vier Runden In-vivo-Panning durchgeführt, wobei die beiden ausgewählten Zweige während der ersten drei Selektionsrunden separat gelagert und analysiert wurden. Alle aus der Zerebrospinalflüssigkeit extrahierten Phageninserts der ersten beiden Selektionsrunden wurden einer 454/Roche-Pyrosequenzierung unterzogen, während alle aus der Zerebrospinalflüssigkeit extrahierten Klone der letzten beiden Selektionsrunden manuell sequenziert wurden. Alle Blutphagen der ersten Selektionsrunde wurden ebenfalls einer 454/Roche-Pyrosequenzierung unterzogen. Zur Injektion der Phagenklone wurden die ausgewählten Phagen in E. coli (BL5615) auf 500 cm2-Platten 4 Stunden lang bei 37 °C amplifiziert. Einzeln ausgewählte und manuell sequenzierte Klone wurden in TB-Medium vermehrt. Nach der Phagenextraktion, Reinigung und Entfernung des Endotoxins (wie oben beschrieben) wurden 2 × 1010 Phagen/Tier in 300 μl intravenös in eine Schwanzvene injiziert.
Vorverarbeitung und qualitative Filterung von Sequenzdaten. Rohe 454/Roche-Daten wurden mithilfe von Herstellersoftware von einem binären Standard Stream Map-Format (sff) in ein für Menschen lesbares Pearson-Format (fasta) konvertiert. Die weitere Verarbeitung der Nukleotidsequenz wurde mithilfe von proprietären C-Programmen und Skripten (unveröffentlichtes Softwarepaket) durchgeführt, wie unten beschrieben. Die Analyse der Primärdaten umfasst strenge mehrstufige Filterverfahren. Um Reads herauszufiltern, die keine gültige 12mer-Insert-DNA-Sequenz enthielten, wurden die Reads mithilfe des globalen Needleman-Wunsch-Tests sequenziell auf Startlabel (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), Stoplabel (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) und Hintergrund-Insert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ausgerichtet. Dabei wurden bis zu 2 Inkonsistenzen pro Ausrichtung zugelassen31. Daher wurden Reads ohne Start- und Stop-Tags und Reads mit Hintergrund-Inserts, d. h. Ausrichtungen, die die zulässige Anzahl von Fehlpaarungen überschreiten, aus der Bibliothek entfernt. Was die verbleibenden Reads betrifft, wurde die N-mer-DNA-Sequenz, die von der Startmarkierung bis zur Stoppmarkierung reicht, aus der ursprünglichen Read-Sequenz herausgeschnitten und weiterverarbeitet (nachfolgend „Insert“ genannt). Nach der Translation des Inserts wurde der Abschnitt nach dem ersten Stoppcodon am 5'-Ende des Primers entfernt. Zusätzlich wurden Nukleotide, die zu unvollständigen Codons am 3'-Ende des Primers führten, entfernt. Um Inserts mit ausschließlich Hintergrundsequenzen auszuschließen, wurden auch translatierte Inserts entfernt, die mit dem Aminosäuremuster „PAG“ begannen. Peptide mit einer posttranslationalen Länge von weniger als drei Aminosäuren wurden aus der Bibliothek entfernt. Abschließend wurde die Redundanz im Insert-Pool entfernt und die Häufigkeit jedes einzelnen Inserts bestimmt. Die Ergebnisse dieser Analyse umfassten eine Liste der Nukleotidsequenzen (Inserts) und ihrer (Read-)Häufigkeiten (Ergänzende Abbildungen 1c und 2).
Gruppieren von N-mer-DNA-Inserts nach Sequenzähnlichkeit: Um 454/Roche-spezifische Sequenzierungsfehler (wie Probleme bei der Sequenzierung von Homopolymer-Erweiterungen) auszuschließen und weniger wichtige Redundanzen zu entfernen, werden zuvor gefilterte N-mer-DNA-Sequenz-Inserts (Inserts) nach Ähnlichkeit sortiert. Dabei wird ein iterativer Algorithmus verwendet, der wie folgt definiert ist: Insertionen werden zuerst nach ihrer Häufigkeit (von der höchsten zur niedrigsten) und, falls sie gleich sind, nach ihrer Länge (von der längsten zur kürzesten) sortiert. Somit definieren die häufigsten und längsten Insertionen die erste „Gruppe“. Die Gruppenhäufigkeit wird auf die Schlüsselhäufigkeit gesetzt. Dann wird versucht, jede in der sortierten Liste verbleibende Insertion durch paarweises Needleman-Wunsch-Alignment der Gruppe hinzuzufügen. Wenn die Anzahl der Fehlpaarungen, Insertionen oder Deletionen in einem Alignment einen Schwellenwert von 2 nicht überschreitet, wird eine Insertion der Gruppe hinzugefügt und die Gesamtgruppenhäufigkeit wird um die Häufigkeit erhöht, mit der die Insertion hinzugefügt wurde. Einer Gruppe hinzugefügte Inserts werden als verwendet markiert und von der weiteren Verarbeitung ausgeschlossen. Kann die Insertsequenz nicht zu einer bestehenden Gruppe hinzugefügt werden, wird die Insertsequenz zur Bildung einer neuen Gruppe mit der entsprechenden Inserthäufigkeit verwendet und als verwendet markiert. Die Iteration endet, wenn jede Insertsequenz entweder zur Bildung einer neuen Gruppe verwendet oder in eine bestehende Gruppe aufgenommen werden kann. Schließlich werden gruppierte Inserts, bestehend aus Nukleotiden, schließlich in Peptidsequenzen (Peptidbibliotheken) übersetzt. Das Ergebnis dieser Analyse ist eine Reihe von Insertionen und deren entsprechenden Häufigkeiten, die die Anzahl der aufeinanderfolgenden Reads ergeben (Ergänzende Abbildung 2).
Motivgenerierung: Basierend auf einer Liste einzigartiger Peptide wurde eine Bibliothek mit allen möglichen Aminosäuremustern (aa) erstellt, wie unten dargestellt. Jedes mögliche Muster der Länge 3 wurde aus dem Peptid extrahiert und sein inverses Muster zusammen mit einer gemeinsamen Motivbibliothek mit allen Mustern (Tripeptiden) hinzugefügt. Bibliotheken mit stark repetitiven Motiven wurden sequenziert und Redundanzen entfernt. Anschließend wurde für jedes Tripeptid in der Motivbibliothek mithilfe von Computertools dessen Vorhandensein in der Bibliothek überprüft. In diesem Fall wurde die Häufigkeit des Peptids, das das gefundene Motiv-Tripeptid enthält, addiert und dem Motiv in der Motivbibliothek zugeordnet („Anzahl der Motive“). Das Ergebnis der Motivgenerierung ist ein zweidimensionales Array, das alle Vorkommen von Tripeptiden (Motiven) und ihre jeweiligen Werte enthält. Dies entspricht der Anzahl der Sequenzierungs-Reads, die nach Filterung, Gruppierung und Translation das entsprechende Motiv ergeben. Metriken wie oben ausführlich beschrieben.
Normalisierung der Anzahl der Motive und der entsprechenden Streudiagramme: Die Anzahl der Motive für jede Probe wurde normalisiert mit
Dabei ist ni die Anzahl der Reads mit Thema i. Somit stellt vi die prozentuale Häufigkeit von Reads (oder Peptiden) mit Motiv i in der Stichprobe dar. Die P-Werte für die nicht normalisierte Motivanzahl wurden mit dem exakten Fisher-Test berechnet. Für Korrelogramme der Motivanzahl wurden Spearmans Korrelationen unter Verwendung der normalisierten Motivanzahl mit R berechnet.
Um den Aminosäuregehalt an jeder Position in der Peptidbibliothek zu visualisieren, wurden die Web-Logogramme 32 und 33 (http://weblogo.threeplusone.com) erstellt. Zunächst wird der Aminosäuregehalt an jeder Position des 12-mer-Peptids in einer 20×12-Matrix gespeichert. Anschließend wird ein Satz von 1000 Peptiden mit demselben relativen Aminosäuregehalt an jeder Position im Fasta-Sequenzformat generiert und als Eingabe für Web-Logo 3 bereitgestellt, das eine grafische Darstellung des relativen Aminosäuregehalts an jeder Position für eine bestimmte Peptidbibliothek generiert. Um mehrdimensionale Datensätze zu visualisieren, wurden Heatmaps mit einem intern entwickelten Tool in R (biosHeatmap, ein noch nicht veröffentlichtes R-Paket) erstellt. Die in den Heatmaps dargestellten Dendrogramme wurden mit Wards hierarchischer Clustering-Methode mit der euklidischen Distanzmetrik berechnet. Für die statistische Analyse der Motiv-Scoring-Daten wurden P-Werte für das nicht normalisierte Scoring mit Fishers exaktem Test berechnet. P-Werte für andere Datensätze wurden in R mithilfe des Student-t-Tests oder der ANOVA berechnet.
Ausgewählte Phagenklone und Phagen ohne Inserts wurden intravenös über die Schwanzvene injiziert (2 × 1010 Phagen/Tier in 300 µl PBS). Zehn Minuten vor der Perfusion und anschließenden Fixierung erhielten dieselben Tiere 100 µl DyLight594-markiertes Lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177) intravenös injiziert. 60 Minuten nach der Phageninjektion wurden die Ratten durch das Herz mit 50 ml PBS und anschließend 50 ml 4%iger PFA/PBS perfundiert. Gehirnproben wurden zusätzlich über Nacht in 4%iger PFA/PBS fixiert und über Nacht bei 4 °C in 30%iger Saccharose eingeweicht. Die Proben wurden in der OCT-Mischung schockgefroren. Die immunhistochemische Analyse der gefrorenen Proben erfolgte bei Raumtemperatur an 30 µm dicken Kryoschnitten, die mit 1 % BSA blockiert und bei 4 °C mit polyklonalen FITC-markierten Antikörpern gegen den T7-Phagen (Novus NB 600-376A) inkubiert wurden. Die Inkubation erfolgte über Nacht. Anschließend wurden die Schnitte dreimal mit PBS gespült und mit einem konfokalen Lasermikroskop (Leica TCS SP5) untersucht.
Alle Peptide mit einer Mindestreinheit von 98 % wurden von GenScript USA synthetisiert, biotinyliert und lyophilisiert. Biotin ist über einen zusätzlichen dreifachen Glycin-Spacer am N-Terminus gebunden. Alle Peptide wurden mittels Massenspektrometrie überprüft.
Streptavidin (Sigma S0677) wurde mit einem fünffachen äquimolaren Überschuss an biotinyliertem Peptid, biotinyliertem BACE1-inhibitorischem Peptid oder einer Kombination (Verhältnis 3:1) aus biotinyliertem BACE1-inhibitorischem Peptid und BACE1-inhibitorischem Peptid in 5–10 % DMSO gemischt und in PBS inkubiert. Vor der Injektion wurde die Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Streptavidin-konjugierte Peptide wurden in einer Dosis von 10 mg/kg intravenös in eine der Schwanzvenen von Ratten mit Hirnhöhle injiziert.
Die Konzentration der Streptavidin-Peptid-Komplexe wurde mittels ELISA bestimmt. Nunc Maxisorp-Mikrotiterplatten (Sigma) wurden über Nacht bei 4 °C mit 1,5 μg/ml Maus-Anti-Streptavidin-Antikörper (Thermo, MA1-20011) beschichtet. Nach der Blockierung (Blockierungspuffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % Gelatine, 1 % BSA) bei Raumtemperatur für 2 Stunden wurde die Platte mit 0,05 % Tween-20/PBS (Waschpuffer) für 3 Sekunden gewaschen. Liquor- und Plasmaproben wurden in die mit Blockierungspuffer verdünnten Vertiefungen gegeben (Plasma 1:10.000, Liquor 1:115). Die Platte wurde anschließend über Nacht bei 4 °C mit Detektionsantikörper (1 μg/ml, Anti-Streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) inkubiert. Nach drei Waschschritten wurde Streptavidin durch Inkubation in TMB-Substratlösung (Roche) für bis zu 20 Minuten nachgewiesen. Nach dem Stoppen der Farbentwicklung mit 1 M H₂SO₄ wurde die Absorption bei 450 nm gemessen.
Die Funktion des Streptavidin-Peptid-BACE1-Inhibitorkomplexes wurde mittels Aβ(1–40)-ELISA gemäß Herstellerprotokoll (Wako, 294-64701) bestimmt. Liquorproben wurden in Standardverdünnung (1:23) verdünnt und über Nacht bei 4 °C in 96-Well-Platten, die mit dem BNT77-Capture-Antikörper beschichtet waren, inkubiert. Nach fünf Waschschritten wurde HRP-konjugierter BA27-Antikörper hinzugefügt und zwei Stunden bei 4 °C inkubiert, gefolgt von fünf Waschschritten. Aβ(1–40) wurde durch 30-minütige Inkubation in TMB-Lösung bei Raumtemperatur nachgewiesen. Nach Abbruch der Farbentwicklung mit Stopplösung wurde die Absorption bei 450 nm gemessen. Plasmaproben wurden vor dem Aβ(1–40)-ELISA einer Festphasenextraktion unterzogen. Plasma wurde zu 0,2 % DEA (Sigma) in 96-Well-Platten gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach sukzessivem Waschen der SPE-Platten (Oasis, 186000679) mit Wasser und 100 % Methanol wurden Plasmaproben zu den SPE-Platten gegeben und die gesamte Flüssigkeit entfernt. Die Proben wurden gewaschen (zuerst mit 5 % Methanol, dann mit 30 % Methanol) und mit 2 % NH₄OH/90 % Methanol eluiert. Nach dem Trocknen des Eluats bei 55 °C für 99 Minuten bei konstantem N₂-Strom wurden die Proben in Standardverdünnern reduziert und Aβ(1–40) wie oben beschrieben gemessen.
So zitieren Sie diesen Artikel: Urich, E. et al. Frachtlieferung zum Gehirn mithilfe von in vivo identifizierten Transitpeptiden. Die Wissenschaft. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
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