Grazzi talli żort Nature.com.Qed tuża verżjoni tal-browser b'appoġġ limitat CSS.Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer).Barra minn hekk, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Juri karużell ta' tliet slides f'daqqa.Uża l-buttuni Preċedenti u Li jmiss biex timxi minn tliet slides kull darba, jew uża l-buttuni slider fl-aħħar biex timxi minn tliet slides kull darba.
Il-barriera tad-demm-moħħ u l-barriera tad-demm-moħħ jipprevjenu aġenti bijoterapewtiċi milli jilħqu l-miri tagħhom fis-sistema nervuża ċentrali, u b'hekk ixekklu t-trattament effettiv ta 'mard newroloġiku.Biex niskopru trasportaturi ġodda tal-moħħ in vivo, daħħalna librerija tal-peptidi tal-fagi T7 u nġabru serjament demm u fluwidu ċerebrospinali (CSF) bl-użu ta 'mudell ta' firien konxju kannulat ta 'pool kbir.Kloni tal-fagi speċifiċi ġew arrikkit ħafna fis-CSF wara erba 'rawnds ta' għażla.L-ittestjar ta 'peptidi kandidati individwali żvela arrikkiment ta' aktar minn 1000 darba fis-CSF.Il-bijoattività tal-kunsinna medjata mill-peptide lejn il-moħħ ġiet ikkonfermata bi tnaqqis ta '40% fil-livell ta' amyloid-β fil-fluwidu ċerebrospinali bl-użu ta 'inibitur tal-peptide BACE1 marbut mal-peptide ta' transitu ġdid identifikat.Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-peptidi identifikati minn metodi ta 'selezzjoni tal-fagi in vivo jistgħu jkunu mezzi utli għall-kunsinna sistemika ta' makromolekuli fil-moħħ b'effett terapewtiku.
Ir-riċerka tat-terapija mmirata lejn is-sistema nervuża ċentrali (CNS) ffukat fil-biċċa l-kbira fuq l-identifikazzjoni ta 'drogi u aġenti ottimizzati li juru proprjetajiet ta' mira tas-CNS, b'inqas sforz biex jiskopru l-mekkaniżmi li jmexxu l-kunsinna attiva tad-droga fil-moħħ.Dan qed jibda jinbidel issa peress li l-kunsinna tad-droga, speċjalment molekuli kbar, hija parti integrali mill-iżvilupp modern tad-droga fin-newroxjenza.L-ambjent tas-sistema nervuża ċentrali huwa protett sew mis-sistema tal-barriera ċerebrovaskulari, li tikkonsisti mill-barriera tad-demm u l-moħħ (BBB) ​​​​u l-barriera tad-demm u l-moħħ (BCBB)1, li jagħmilha ta 'sfida biex iwasslu d-drogi lill-moħħ1,2.Huwa stmat li kważi l-mediċini ta 'molekula kbira kollha u aktar minn 98% ta' drogi ta 'molekula żgħar huma eliminati mill-moħħ3.Huwa għalhekk li huwa importanti ħafna li jiġu identifikati sistemi ġodda ta 'trasport tal-moħħ li jipprovdu kunsinna effiċjenti u speċifika ta' mediċini terapewtiċi lis-CNS 4,5.Madankollu, il-BBB u l-BCSFB jippreżentaw ukoll opportunità eċċellenti għall-kunsinna tad-droga peress li jippenetraw u jidħlu fl-istrutturi kollha tal-moħħ permezz tal-vaskulatura estensiva tiegħu.Għalhekk, l-isforzi attwali biex jintużaw metodi mhux invażivi ta 'kunsinna lill-moħħ huma fil-biċċa l-kbira bbażati fuq il-mekkaniżmu ta' trasport medjat mir-riċettur (PMT) li juża r-riċettur BBB6 endoġenu.Minkejja l-avvanzi ewlenin riċenti bl-użu tal-mogħdija tar-riċettur tat-transferin7,8, huwa meħtieġ aktar żvilupp ta 'sistemi ta' konsenja ġodda bi proprjetajiet imtejba.Għal dan il-għan, l-għan tagħna kien li nidentifikaw peptidi li kapaċi jimmedjaw it-trasport tas-CSF, peress li fil-prinċipju jistgħu jintużaw biex iwasslu makromolekuli lis-CNS jew biex jiftħu mogħdijiet ġodda tar-riċetturi.B'mod partikolari, riċetturi u trasportaturi speċifiċi tas-sistema ċerebrovaskulari (BBB u BSCFB) jistgħu jservu bħala miri potenzjali għall-kunsinna attiva u speċifika ta' mediċini bijoterapewtiċi.Il-fluwidu ċerebrospinali (CSF) huwa prodott sekretorju tal-plexus tal-korojde (CS) u huwa f'kuntatt dirett mal-fluwidu interstizjali tal-moħħ permezz tal-ispazju subarachnoid u l-ispazju ventrikulari4.Riċentement intwera li l-fluwidu ċerebrospinali subarachnoid jinfirex b'mod eċċessiv fl-interstizju tal-moħħ9.Nittamaw li naċċessaw l-ispazju parenkimali billi tuża din il-passaġġ ta 'influss subarachnoid jew direttament permezz tal-BBB.Biex jinkiseb dan, implimentajna strateġija robusta ta 'għażla tal-fagi in vivo li idealment tidentifika peptidi trasportati minn waħda minn dawn iż-żewġ mogħdijiet distinti.
Issa niddeskrivu metodu ta 'screening sekwenzjali tal-wiri tal-fagi in vivo b'kampjunar ta' CSF flimkien ma 'sekwenzjar ta' throughput għoli (HTS) biex tissorvelja rawnds ta 'għażla inizjali bl-ogħla diversità tal-librerija.L-iskrinjar sar fuq firien konxji b'kannula taċ-ċisterna kbira (CM) impjantata b'mod permanenti biex tiġi evitata l-kontaminazzjoni tad-demm.Importanti, dan l-approċċ jagħżel kemm l-immirar tal-moħħ kif ukoll peptidi b'attività ta 'trasport tul il-barriera ċerebrovaskulari.Aħna użajna phages T7 minħabba d-daqs żgħir tagħhom (~ 60 nm)10 u ssuġġeriejna li huma adattati għat-trasport ta 'vesicles li jippermettu qsim transċellulari tal-barriera endoteljali u/jew epiteljali-medulla.Wara erba 'rawnds ta' panning, il-popolazzjonijiet tal-fagi ġew iżolati u wrew arrikkiment qawwi in vivo tas-CSF u assoċjazzjoni tal-mikrobastimenti ċerebrali.Importanti, stajna nikkonfermaw is-sejbiet tagħna billi nuru li l-aħjar peptidi kandidati preferuti u sintetizzati kimikament huma kapaċi jittrasportaw merkanzija ta 'proteina fil-fluwidu ċerebrospinali.L-ewwel, l-effetti farmakodinamiċi tas-CNS ġew stabbiliti billi tgħaqqad peptide ta 'transitu ewlieni ma' inibitur tal-peptide BACE1.Minbarra li juri li strateġiji ta 'screening funzjonali in vivo jistgħu jidentifikaw peptidi ġodda tat-trasport tal-moħħ bħala trasportaturi effettivi tal-merkanzija tal-proteini, nistennew li approċċi simili ta' għażla funzjonali jsiru importanti wkoll fl-identifikazzjoni ta 'mogħdijiet ġodda ta' trasport tal-moħħ.
Ibbażat fuq unitajiet li jiffurmaw plakka (PFU), wara l-pass tal-ippakkjar tal-fagi, ġiet iddisinjata u maħluqa librerija ta 'peptidi phage T7 lineari każwali 12-mer b'diversità ta' madwar 109 (ara Materjali u Metodi).Huwa importanti li wieħed jinnota li aħna analizzat bir-reqqa din il-librerija qabel panning in vivo.L-amplifikazzjoni tal-PCR ta 'kampjuni tal-librerija tal-fagi bl-użu ta' primers modifikati ġġenerat amplicons li kienu direttament applikabbli għal HTS (Fig. 1a Supplimentari).Minħabba a) żbalji ta 'sekwenzjar HTS11, b) impatt fuq il-kwalità tal-primers (NNK) 1-12, u c) il-preżenza ta' phage tat-tip selvaġġ (wt) (inserzjonijiet skeletri) fil-librerija standby, ġiet implimentata proċedura ta 'filtrazzjoni ta' sekwenza biex tiġi estratta biss informazzjoni ta 'sekwenza verifikata (Figura 1b Supplimentari).Dawn il-passi tal-filtru japplikaw għal-libreriji kollha tas-sekwenzjar HTS.Għal-librerija standard, inkisbu total ta '233,868 qari, li minnhom 39% għaddew mill-kriterji tal-filtru u ntużaw għall-analiżi u l-għażla tal-libreriji għal rawnds sussegwenti (Figura Supplimentari 1c–e).Il-qari kienu prinċipalment multipli ta 'pari ta' bażi 3 fit-tul b'quċċata f'36 nukleotide (Figura Supplimentari 1c), li tikkonferma d-disinn tal-librerija (NNK) 1-12.Notevolment, madwar 11% tal-membri tal-librerija kien fihom inserzjoni tas-sinsla PAGISRELVDKL tat-tip selvaġġ (wt) 12-dimensjonali, u kważi nofs is-sekwenzi (49%) kien fihom inserzjonijiet jew tħassir.L-HTS tal-librerija tal-librerija kkonferma d-diversità għolja ta 'peptidi fil-librerija: aktar minn 81% tas-sekwenzi tal-peptidi nstabu darba biss u 1.5% biss seħħew f'kopji ≥4 (Figura 2a Supplimentari).Il-frekwenzi ta 'aċidi amminiċi (aa) fit-12-il pożizzjoni kollha fir-repertorju kkorrelataw tajjeb mal-frekwenzi mistennija għan-numru ta' kodoni ġġenerati mir-repertorju NKK deġenerat (Fig. 2b Supplimentari).Il-frekwenza osservata tar-residwi aa kodifikati minn dawn l-inserzjonijiet kienet korrelata sew mal-frekwenza kkalkulata (r = 0.893) (Figura Supplimentari 2c).Il-preparazzjoni tal-libreriji tal-fagi għall-injezzjoni tinkludi l-passi tal-amplifikazzjoni u t-tneħħija tal-endotossina.Dan preċedentement intwera li potenzjalment inaqqas id-diversità tal-libreriji tal-fagi12,13.Għalhekk, aħna sekwenzajna librerija tal-fagi amplifikata bil-pjanċa li kienet għaddiet minn tneħħija ta 'endotossini u qabbilha mal-librerija oriġinali biex nistmaw il-frekwenza ta' AA.Ġiet osservata korrelazzjoni qawwija (r = 0.995) bejn il-ġabra oriġinali u l-ġabra amplifikata u purifikata (Fig. 2d Supplimentari), li tindika li l-kompetizzjoni bejn kloni amplifikati fuq pjanċi bl-użu ta 'T7 phage ma kkawżax bias maġġuri.Dan il-paragun huwa bbażat fuq il-frekwenza ta 'motifi ta' tripeptide f'kull librerija, peress li d-diversità tal-libreriji (~ 109) ma tistax tinqabad bis-sħiħ anke b'HTS.L-analiżi tal-frekwenza ta 'aa f'kull pożizzjoni żvelat preġudizzju żgħir li jiddependi mill-pożizzjoni fl-aħħar tliet pożizzjonijiet tar-repertorju mdaħħal (Figura Supplimentari 2e).Bħala konklużjoni, aħna kkonkludejna li l-kwalità u d-diversità tal-librerija kienu aċċettabbli u ġew osservati biss bidliet żgħar fid-diversità minħabba l-amplifikazzjoni u l-preparazzjoni tal-libreriji tal-fagi bejn diversi rawnds ta 'għażla.
It-teħid ta 'kampjuni ta' fluwidu ċerebrospinali serjali jista 'jsir billi tiġi impjantata kirurġikament kannula fis-CM ta' firien konxji biex tiffaċilita l-identifikazzjoni ta 'fagi T7 injettat ġol-vina (iv) permezz tal-BBB u/jew BCSFB (Fig. 1a-b).Aħna użajna żewġ fergħat ta 'għażla indipendenti (armi A u B) fl-ewwel tliet rawnds ta' għażla in vivo (Fig. 1c).Aħna gradwalment żidna l-istrettezza tal-għażla billi naqqas l-ammont totali ta 'phage introdott fl-ewwel tliet rawnds ta' għażla.Għar-raba 'rawnd ta' panning, għaqqadna kampjuni mill-fergħat A u B u wettaqna tliet selezzjonijiet indipendenti addizzjonali.Biex jiġu studjati l-proprjetajiet in vivo tal-partiċelli tal-fagi T7 f'dan il-mudell, il-fagi tat-tip selvaġġ (PAGISRELVDKL master insert) ġie injettat fil-firien permezz tal-vina tad-denb.L-irkupru ta 'phages minn fluwidu ċerebrospinali u demm f'punti ta' ħin differenti wera li l-fagi icosahedral T7 relattivament żgħar kellhom fażi ta 'tneħħija inizjali mgħaġġla mill-kompartiment tad-demm (Fig. Supplimentari 3).Ibbażat fuq it-titri amministrati u l-volum tad-demm tal-firien, aħna kkalkulajna li madwar 1% wt biss.phage mid-doża mogħtija nstabet fid-demm 10 minuti wara injezzjoni ġol-vini.Wara dan it-tnaqqis rapidu inizjali, tkejjel tneħħija primarja aktar bil-mod b'half-life ta' 27.7 minuta.Importanti, ftit biss phages ġew irkuprati mill-kompartiment tas-CSF, li jindika sfond baxx għall-migrazzjoni tal-fagi tat-tip selvaġġ fil-kompartiment tas-CSF (Figura Supplimentari 3).Bħala medja, biss madwar 1 x 10-3% titers ta 'T7 phage fid-demm u 4 x 10-8% ta' fagi infużi inizjalment ġew skoperti fil-fluwidu ċerebrospinali matul il-perjodu kollu ta 'kampjunar (0-250 min).Notevolment, il-half-life (25.7 min) tal-fagi tat-tip selvaġġ fil-fluwidu ċerebrospinali kienet simili għal dik osservata fid-demm.Din id-dejta turi li l-barriera li tissepara l-kompartiment tas-CSF mid-demm hija intatta fil-firien kanulati b'CM, li tippermetti għażla in vivo ta 'libreriji tal-fagi biex jidentifikaw kloni li huma trasportati faċilment mid-demm fil-kompartiment tas-CSF.
(a) It-twaqqif ta' metodu biex jerġa' jittieħed kampjun tal-fluwidu ċerebrospinali (CSF) minn pool kbir.(b) Dijagramma li turi l-post ċellulari tal-barriera tas-sistema nervuża ċentrali (CNS) u l-istrateġija tal-għażla użata biex jiġu identifikati peptidi li jaqsmu l-barriera tad-demm-moħħ (BBB) ​​​​u l-barriera tad-demm-moħħ.(c) In vivo phage display screening flowchart.F'kull rawnd ta 'għażla, phages (identifikaturi tal-annimali ġewwa l-vleġeġ) ġew injettati ġol-vini.Żewġ fergħat alternattivi indipendenti (A, B) jinżammu separatament sal-4 rawnd tal-għażla.Għar-rawnds tal-għażla 3 u 4, kull klonu phage estratt minn CSF ġie sekwenzat manwalment.(d) Kinetika ta 'fagi iżolat mid-demm (ċrieki ħomor) u fluwidu ċerebrospinali (trijangoli ħodor) matul l-ewwel rawnd ta' għażla f'żewġ firien kanulati wara injezzjoni ġol-vini tal-librerija tal-peptidi T7 (2 x 1012 phages/annimal).Kwadri blu jindikaw il-konċentrazzjoni inizjali medja tal-fagi fid-demm, ikkalkulat mill-ammont ta 'fagi injettat, b'kont meħud tal-volum totali tad-demm.Il-kwadri suwed jindikaw il-punt ta' intersezzjoni tal-linja y estrapolata mill-konċentrazzjonijiet tal-fagi tad-demm.(e,f) Ippreżenta l-frekwenza relattiva u d-distribuzzjoni tal-motifi tripeptidi li jikkoinċidu kollha possibbli misjuba fil-peptide.In-numru ta' motivi misjuba f'1000 qari huwa muri.B'mod sinifikanti (p <0.001) motivi arrikkit huma mmarkati b'tikek ħomor.(e) Scatterplot ta 'korrelazzjoni li tqabbel il-frekwenza relattiva tal-motif tripeptide tal-librerija injettata ma' phage derivat mid-demm minn annimali #1.1 u #1.2.(f) Scatterplot ta 'korrelazzjoni li tqabbel il-frekwenzi relattivi tal-motifi tal-tripeptide tal-fagi tal-annimali #1.1 u #1.2 iżolati fid-demm u l-fluwidu ċerebrospinali.(g, h) Rappreżentazzjoni ID tas-sekwenza ta 'fagi arrikkit fid-demm (g) kontra libreriji injettati u fagi arrikkit f'CSF (h) kontra demm wara rawnd ta' għażla in vivo fiż-żewġ annimali.Id-daqs tal-kodiċi b'ittra waħda jindika kemm-il darba dak l-aċidu amminiku jseħħ f'dik il-pożizzjoni.Aħdar = polari, vjola = newtrali, blu = bażiku, aħmar = aċiduż u iswed = aċidi amminiċi idrofobiċi.Il-Figura 1a, b kienet iddisinjata u prodotta minn Eduard Urich.
Injettajna librerija tal-peptidi tal-fagi f'żewġ firien tal-istrumenti CM (clades A u B) u fagi iżolati minn fluwidu ċerebrospinali u demm (Figura 1d).It-tneħħija rapida inizjali tal-librerija kienet inqas evidenti meta mqabbla mal-fagi tat-tip selvaġġ.Il-half-life medja tal-librerija injettata fiż-żewġ annimali kienet ta' 24.8 minuti fid-demm, simili għal phage tat-tip selvaġġ, u 38.5 minuti f'CSF.Kampjuni tal-fagi tad-demm u tal-fluwidu ċerebrospinali minn kull annimal ġew soġġetti għal HTS u l-peptidi identifikati kollha ġew analizzati għall-preżenza ta 'motif tripeptide qasir.Motivi ta 'tripeptide ġew magħżula minħabba li jipprovdu bażi minima għall-formazzjoni ta' l-istruttura u l-interazzjonijiet peptide-proteina14,15.Sibna korrelazzjoni tajba fid-distribuzzjoni ta 'motifi bejn il-librerija tal-fagi injettat u kloni estratti mid-demm taż-żewġ annimali (Fig. 1e).Id-dejta tindika li l-kompożizzjoni tal-librerija hija biss marġinalment arrikkita fil-kompartiment tad-demm.Il-frekwenzi tal-aċidi amminiċi u s-sekwenzi tal-kunsens ġew analizzati aktar f'kull pożizzjoni bl-użu ta 'adattament tas-softwer Weblogo16.Interessanti, sibna arrikkiment qawwi fir-residwi tal-gliċina fid-demm (Fig. 1g).Meta tqabbel id-demm ma 'kloni magħżula minn CSF, ġew osservati għażla qawwija u xi deselection ta' motifi (Fig. 1f), u ċerti aċidi amminiċi kienu preferenzjali preżenti f'pożizzjonijiet predeterminati fit-12-il membru (Fig. 1h).Notevolment, annimali individwali kienu differenti b'mod sinifikanti fil-fluwidu ċerebrospinali, filwaqt li l-arrikkiment tal-gliċina fid-demm kien osservat fiż-żewġ annimali (Fig. Supplimentari 4a-j).Wara filtrazzjoni stretti tad-dejta tas-sekwenza fil-fluwidu ċerebrospinali tal-annimali #1.1 u #1.2, inkisbu total ta '964 u 420 peptidi uniċi 12-mer (Fig. Supplimentari 1d-e).Il-kloni tal-fagi iżolati ġew amplifikati u suġġetti għat-tieni rawnd ta 'għażla in vivo.Phage estratt mit-tieni rawnd ta 'selezzjoni ġew soġġetti għal HTS f'kull annimal u l-peptidi identifikati kollha ntużaw bħala input għal programm ta' rikonoxximent tal-motif biex janalizzaw l-okkorrenza ta 'motifi tripeptide (Fig. 2a, b, ef).Meta mqabbel mal-ewwel ċiklu tal-phage rkuprat minn CSF, osservajna aktar għażla u deselection ta 'ħafna motifi f'CSF fil-fergħat A u B (Fig. 2).Ġie applikat algoritmu ta 'identifikazzjoni tan-netwerk biex jiddetermina jekk irrappreżentawx mudelli differenti ta' sekwenza konsistenti.Ġie osservat xebh ċar bejn is-sekwenzi 12-dimensjonali rkuprati minn CSF f'clade alternattiv A (Fig. 2c, d) u clade B (Fig. 2g, h).L-analiżi miġbura f'kull fergħa żvelat profili ta 'għażla differenti għal peptidi 12-mer (Figura Supplimentari 5c, d) u żieda fil-proporzjon tat-titer CSF/demm maż-żmien għal kloni miġbura wara t-tieni rawnd ta' għażla meta mqabbel mal-ewwel rawnd ta 'għażla (Fig. 5e Supplimentari).).
Arrikkiment ta 'motifi u peptidi fil-fluwidu ċerebrospinali b'żewġ rawnds suċċessivi ta' għażla ta 'wiri ta' fagi funzjonali in vivo.
Il-fagi kollha tal-fluwidu ċerebrospinali rkuprati mill-ewwel rawnd ta 'kull annimal (annimali #1.1 u #1.2) ġew miġbura, amplifikati, sekwenzati HT u injettati mill-ġdid flimkien (2 x 1010 phages/annimal) 2 SM firien kanulati (#1.1 → #).2.1 u 2.2, 1.2 → 2.3 u 2.4).(a,b,e,f) Scatterplots ta 'korrelazzjoni li jqabblu l-frekwenza relattiva ta' motivi tripeptide tal-fagi kollha derivati ​​minn CSF fl-ewwel u t-tieni rawnds ta 'għażla.Frekwenza relattiva u distribuzzjoni ta 'motifi li jirrappreżentaw il-tripeptidi li jikkoinċidu kollha possibbli misjuba fil-peptidi fiż-żewġ orjentazzjonijiet.In-numru ta' motivi misjuba f'1000 qari huwa muri.Motivi li kienu magħżula jew esklużi b'mod sinifikanti (p < 0.001) f'waħda mil-libreriji mqabbla huma enfasizzati b'tikek ħomor.(c, d, g, h) Rappreżentazzjoni tal-logo tas-sekwenza tas-sekwenzi twal kollha ta' 12-il aċidu amminiku b'ħafna CSF ibbażati fuq rawnds 2 u 1 ta' għażla in vivo.Id-daqs tal-kodiċi b'ittra waħda jindika kemm-il darba dak l-aċidu amminiku jseħħ f'dik il-pożizzjoni.Biex tirrappreżenta l-logo, il-frekwenza tas-sekwenzi CSF estratti minn annimali individwali bejn żewġ rawnds ta 'għażla hija mqabbla u s-sekwenzi arrikkit fit-tieni rawnd huma murija: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 u (h) #1.2–#2.4.L-aktar aċidi amminiċi arrikkit f'pożizzjoni partikolari f'(ċ, d) annimali Nru.2.1 u Nru.2.2 jew (g, h) fl-annimali Nru.2.3 u le.2.4 huma murija bil-kulur.Aħdar = polari, vjola = newtrali, blu = bażiku, aħmar = aċiduż u iswed = aċidi amminiċi idrofobiċi.
Wara t-tielet rawnd ta 'għażla, identifikajna 124 sekwenza ta' peptidi uniċi (#3.1 u #3.2) minn 332 kloni phage rikostitwiti bis-CSF iżolati minn żewġ annimali (Figura Supplimentari 6a).Is-sekwenza LGSVS (18.7%) kellha l-ogħla proporzjon relattiv, segwita mill-inserzjonijiet tat-tip selvaġġ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), u SARGSWREIVSLS (2.2%).Fir-raba 'rawnd finali, aħna ġabarna żewġ fergħat magħżula b'mod indipendenti minn tliet annimali separati (Fig. 1c).Mid-925 kloni tal-fagi sekwenzati rkuprati minn CSF, fir-raba 'rawnd sibna 64 sekwenza ta' peptidi uniċi (Fig. 6b Supplimentari), li fosthom il-proporzjon relattiv ta 'fagi tat-tip selvaġġ niżel għal 0.8%.L-aktar kloni CSF komuni fir-raba 'rawnd kienu LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) u RLSSVDSDLSGC (3, 2%).%)).Il-firxa tat-tul tal-peptidi magħżula hija dovuta għal inserzjonijiet/tħassir ta 'nukleotidi jew kodoni ta' waqfien prematur fil-primers tal-librerija meta jintużaw kodoni deġenerati għad-disinn tal-librerija NNK.Kodoni ta' waqfien prematur jiġġeneraw peptidi iqsar u jintgħażlu minħabba li fihom il-motiv aa favorevoli.Peptidi itwal jistgħu jirriżultaw minn inserzjonijiet/tħassir fil-primers tal-libreriji sintetiċi.Dan ipoġġi l-kodon tal-waqfien iddisinjat barra l-qafas u jaqrah sakemm jidher codon tal-waqfien ġdid 'l isfel.B'mod ġenerali, aħna kkalkulajna fatturi ta 'arrikkiment għall-erba' rawnds ta 'għażla billi qabblu d-dejta tal-input mad-dejta tal-output tal-kampjun.Għall-ewwel rawnd ta 'screening, użajna titri tal-fagi tat-tip selvaġġ bħala referenza ta' sfond mhux speċifika.Interessanti, l-għażla negattiva tal-fagi kienet qawwija ħafna fl-ewwel ċiklu CSF, iżda mhux fid-demm (Fig. 3a), li jista 'jkun minħabba l-probabbiltà baxxa ta' diffużjoni passiva tal-biċċa l-kbira tal-membri tal-librerija tal-peptidi fil-kompartiment tas-CSF jew il-fagi relattivi għandhom it-tendenza li jinżammu jew jitneħħew b'mod aktar effiċjenti mid-demm minn batterjofaġi.Madankollu, fit-tieni rawnd ta 'panning, ġiet osservata għażla qawwija ta' phages fis-CSF fiż-żewġ kladi, li tissuġġerixxi li r-rawnd ta 'qabel kien arrikkit f'phages li juru peptidi li jippromwovu l-assorbiment tas-CSF (Fig. 3a).Għal darb'oħra, mingħajr arrikkiment sinifikanti tad-demm.Ukoll fit-tielet u r-raba 'rawnds, il-kloni tal-fagi ġew arrikkit b'mod sinifikanti fis-CSF.Meta tqabbel il-frekwenza relattiva ta 'kull sekwenza ta' peptidi unika bejn l-aħħar żewġ rawnds ta 'għażla, sibna li s-sekwenzi kienu saħansitra aktar arrikkit fir-raba' rawnd ta 'għażla (Fig. 3b).Total ta '931 motiv tripeptide ġew estratti mill-64 sekwenza peptide unika kollha bl-użu taż-żewġ orjentazzjonijiet peptide.L-aktar motivi arrikkit fir-raba 'rawnd ġew eżaminati aktar mill-qrib għall-profili ta' arrikkiment tagħhom matul ir-rawnds kollha meta mqabbla mal-librerija injettata (cut-off: 10% arrikkiment) (Figura Supplimentari 6c).Ix-xejriet ġenerali tal-għażla wrew li ħafna mill-motivi studjati ġew arrikkit fir-rawnds preċedenti kollha taż-żewġ fergħat tal-għażla.Madankollu, xi motifi (eż. SGL, VSG, LGS GSV) kienu prinċipalment minn clade alternattiv A, filwaqt li oħrajn (eż. FGW, RTN, WGF, NTR) kienu arrikkit fil-clade alternattiv B.
Validazzjoni tat-trasport tas-CSF ta 'peptidi murija bil-fagi arrikkit bis-CSF u peptidi mexxej bijotinilati konjugati ma' payloads ta 'streptavidin.
(a) Proporzjonijiet ta' arrikkiment ikkalkulati fl-erba' rawnds kollha (R1-R4) ibbażati fuq titri injettati (input = I) phage (PFU) u titri determinati CSF phage (output = O).Fatturi ta 'arrikkiment għall-aħħar tliet rawnds (R2-R4) ġew ikkalkulati b'paragun mar-rawnd preċedenti u l-ewwel rawnd (R1) b'dejta tal-piż.Il-vireg miftuħa huma fluwidu ċerebrospinali, il-vireg sfumaturi huma plażma.(***p<0.001, ibbażat fuq it-test t ta' Student).(b) Lista tal-peptidi tal-fagi l-aktar abbundanti, ikklassifikati skont il-proporzjon relattiv tagħhom mal-fagi kollha miġbura f'CSF wara rawnd 4 tal-għażla.Is-sitt kloni phage l-aktar komuni huma enfasizzati bil-kulur, innumerati u l-fatturi ta 'arrikkiment tagħhom bejn ir-rawnds 3 u 4 tal-għażla (inserts).(c, d) Is-sitt kloni tal-fagi l-aktar arrikkit, il-libreriji tal-peptidi tal-fagi vojta u tal-ġenituri minn rawnd 4 ġew analizzati individwalment f'mudell ta 'kampjunar CSF.CSF u kampjuni tad-demm inġabru fil-punti taż-żmien indikati.(c) Ammonti ugwali ta' 6 kloni phage kandidati (2 x 1010 phages/annimali), phages vojta (#1779) (2 x 1010 phages/annimali) u libreriji ta' stock phage peptide (2 x 1012 phages/annimali) Injetta mill-inqas 3 CM separatament għall-annimali amministrati b'mod separat.Il-farmakokinetika tas-CSF ta' kull klonu tal-fagi injettat u librerija tal-peptidi tal-fagi maż-żmien hija murija.(d) juri l-proporzjon medju tas-CSF/demm għall-fagi/mL kollha rkuprati matul il-ħin tat-teħid tal-kampjuni.(e) Erba 'peptidi mexxej sintetiċi u kontroll scrambled wieħed kienu marbuta ma' bijotina għal streptavidin permezz tal-N-terminal tagħhom (wiri tetramer) segwit minn injezzjoni (vina tad-denb iv, 10 mg streptavidin / kg).Mill-inqas tliet firien intubati (N = 3).).Kampjuni tas-CSF inġabru fil-punti taż-żmien indikati u l-konċentrazzjonijiet ta 'streptavidin ġew imkejla permezz ta' ELISA anti-streptavidin CSF (nd = mhux skoperti).(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ibbażat fuq test ANOVA).(f) Tqabbil tas-sekwenza tal-aċidu amminiku tal-klonu tal-peptide tal-fagi l-aktar arrikkit #2002 (vjola) ma 'kloni oħra tal-peptidi tal-fagi magħżula mir-4 rawnd tal-għażla.Frammenti ta' aċidi amminiċi identiċi u simili huma kkodifikati bil-kulur.
Mill-phages arrikkit kollha fir-raba 'rawnd (Fig. 3b), sitt kloni kandidati ġew magħżula għal aktar analiżi individwali fil-mudell ta' kampjunar CSF.Ammonti ugwali ta 'sitt libreriji ta' fagi kandidati, fagi vojta (l-ebda inserzjoni) u prophage peptide ġew injettati fi tliet annimali CM kanulati, u l-farmakokinetika ġiet iddeterminata f'assaġġi CSF (Fig. 3c) u demm (Fig. 7 Supplimentari).Il-kloni kollha tal-fagi ttestjati immiraw il-kompartiment tas-CSF f'livell 10-1000 darba ogħla minn dak tal-fagi ta 'kontroll vojt (#1779).Pereżempju, il-kloni #2020 u #2077 kellhom madwar 1000 darba titri CSF ogħla mill-fagi ta 'kontroll.Il-profil farmakokinetiku ta 'kull peptide magħżul huwa differenti, iżda kollha kemm huma għandhom kapaċità għolja ta' homing CSF.Osservajna tnaqqis kostanti matul iż-żmien għall-kloni #1903 u #2011, filwaqt li għall-kloni #2077, #2002 u #2009 żieda matul l-ewwel 10 minuti tista’ tindika trasport attiv iżda jeħtieġ li tiġi vverifikata.Kloni #2020, #2002, u #2077 stabbilizzaw f'livelli għoljin, filwaqt li l-konċentrazzjoni CSF tal-klonu #2009 naqset bil-mod wara ż-żieda inizjali.Imbagħad qabbilna l-frekwenza relattiva ta 'kull kandidat CSF mal-konċentrazzjoni tad-demm tiegħu (Fig. 3d).Il-korrelazzjoni tat-titer medju ta' kull kandidat CSF mat-titer tad-demm tiegħu fil-ħinijiet kollha tat-teħid tal-kampjuni wriet li tlieta mis-sitt kandidati kienu arrikkit b'mod sinifikanti fis-CSF tad-demm.Interessanti, il-klonu #2077 wera stabbiltà ogħla tad-demm (Figura Supplimentari 7).Biex tikkonferma li l-peptidi nfushom huma kapaċi li jittrasportaw b'mod attiv merkanzija għajr partiċelli phage fil-kompartiment tas-CSF, aħna sintetizzati erba 'peptidi mexxej derivatizzati bil-bijotina fl-N-terminal fejn il-peptidi jehmu mal-partiċelli phage.Peptidi bijotinilati (nri 2002, 2009, 2020 u 2077) ġew konjugati ma 'streptavidin (SA) biex jinkisbu forom multimeriċi li jimitaw kemmxejn il-ġeometrija tal-fagi.Dan il-format ippermetta wkoll li nkejlu l-espożizzjoni SA fid-demm u l-fluwidu ċerebrospinali bħala peptidi tal-proteini li jittrasportaw il-merkanzija.Importanti, id-dejta tal-fagi spiss tista 'tiġi riprodotta meta peptidi sintetiċi ġew amministrati f'dan il-format konjugat SA (Fig. 3e).Il-peptidi scrambled kellhom inqas espożizzjoni inizjali u tneħħija aktar mgħaġġla tas-CSF b'livelli li ma jistgħux jinstabu fi żmien 48 siegħa.Biex tikseb għarfien dwar il-mogħdijiet ta 'konsenja ta' dawn il-kloni peptide phage fl-ispazju CSF, aħna analizzajna l-lokalizzazzjoni ta 'hits individwali ta' peptide phage bl-użu ta 'immunohistochemistry (IHC) biex tiskopri direttament partiċelli phage siegħa wara injezzjoni ġol-vini in vivo.Notevolment, kloni #2002, #2077, u #2009 setgħu jiġu skoperti permezz ta 'tbajja qawwija fil-kapillari tal-moħħ, filwaqt li l-fagi ta' kontroll (#1779) u l-klonu #2020 ma ġewx skoperti (Figura Supplimentari 8).Dan jissuġġerixxi li dawn il-peptidi jikkontribwixxu għall-effett fuq il-moħħ preċiżament billi jaqsmu l-BBB.Analiżi dettaljata ulterjuri hija meħtieġa biex tiġi ttestjata din l-ipoteżi, peress li r-rotta BSCFB tista 'tkun involuta wkoll.Meta tqabbel is-sekwenza ta 'aċidu amminiku tal-klonu l-aktar arrikkit (#2002) ma' peptidi magħżula oħra, ġie nnutat li xi wħud minnhom għandhom estensjonijiet simili ta 'aċidu amminiku, li jistgħu jindikaw mekkaniżmu ta' trasport simili (Fig. 3f).
Minħabba l-profil tal-plażma uniku tiegħu u ż-żieda sinifikanti fis-CSF maż-żmien, il-klonu tal-wiri tal-fagi #2077 ġie esplorat aktar fuq perjodu itwal ta '48 siegħa u kien kapaċi jirriproduċi ż-żieda mgħaġġla fis-CSF osservata f'assoċjazzjoni ma' livelli sostnuti ta 'SA (Fig. 4a).Rigward kloni phage identifikati oħra, #2077 imtebba b'mod qawwi għall-kapillari tal-moħħ u wera kolokalizzazzjoni sinifikanti ma 'lectin markatur kapillari meta jaraha b'riżoluzzjoni ogħla u possibilment xi tbajja fl-ispazju parenkimali (Figura 4b).Biex tinvestiga jekk setgħux jinkisbu effetti farmakoloġiċi medjati minn peptide fis-CNS, għamilna esperiment li fih verżjonijiet bijotinilati ta 'i) il-peptide ta' transitu #2077 u ii) il-peptide inibitur BACE1 tħalltu ma 'SA f'żewġ proporzjonijiet differenti.Għal kombinazzjoni waħda użajna biss l-inibitur tal-peptide BACE1 u għall-oħra użajna proporzjon ta '1:3 ta' inibitur tal-peptide BACE1 għal #2077 peptide.Iż-żewġ kampjuni ngħataw ġol-vini u l-livelli tad-demm u tal-fluwidu ċerebrospinali tal-peptide beta-amyloid 40 (Abeta40) ġew imkejla maż-żmien.Abeta40 tkejjel f'CSF peress li tirrifletti l-inibizzjoni ta' BACE1 fil-parenkima tal-moħħ.Kif mistenni, iż-żewġ kumplessi naqqsu b'mod sinifikanti l-livelli tad-demm ta 'Abeta40 (Fig. 4c, d).Madankollu, kampjuni biss li jkun fihom taħlita ta 'peptide nru.2077 u inibitur tal-peptide BACE1 konjugat ma 'SA kkawża tnaqqis sinifikanti f'Abeta40 fil-fluwidu ċerebrospinali (Fig. 4c).Id-dejta turi li l-peptide nru.2077 huwa kapaċi jittrasporta l-proteina SA 60 kDa fis-CNS u jinduċi wkoll effetti farmakoloġiċi b'inibituri konjugati SA tal-peptide BACE1.
(a) Injezzjoni klonali (2 × 10 phages/annimal) ta 'fagi T7 li turi profili farmakokinetiċi fit-tul ta' CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) u fagi ta 'kontroll mhux injettat (#1779) f'mill-inqas tliet firien intubati CM.(b) Immaġni mikroskopika konfokali ta 'mikrobastimenti kortikali rappreżentattivi fil-firien injettati bil-fagi (2 × 10 10 phages/annimal) li turi kontrostaining ta' peptide #2077 u bastimenti (lectin).Dawn il-kloni tal-fagi ġew amministrati lil 3 firien u tħallew jiċċirkolaw għal siegħa qabel il-perfużjoni.L-imħuħ ġew imqassma u mtebbgħin b'antikorpi poliklonali ttikkettjati bil-FITC kontra l-kapsid tal-fagi T7.Għaxar minuti qabel il-perfużjoni u l-iffissar sussegwenti, lectin ittikkettat b'DyLight594 ingħatat ġol-vini.Immaġini fluworexxenti li juru tbajja tal-lectin (aħmar) tan-naħa luminali ta 'microvessels u phages (aħdar) fil-lumen ta' kapillari u tessut tal-moħħ perivaskulari.L-iskala tikkorrispondi għal 10 µm.(c, d) Il-peptide inibitorju BACE1 bijotinilat waħdu jew flimkien ma 'peptide ta' transitu bijotinilat #2077 kien akkoppjat ma 'streptavidin segwit minn injezzjoni ġol-vini ta' mill-inqas tliet firien CM kanulati (10 mg streptavidin/kg).It-tnaqqis medjat mill-inibitur tal-peptide BACE1 f'Aβ40 kien imkejjel minn Aβ1-40 ELISA fid-demm (aħmar) u fluwidu ċerebrospinali (oranġjo) fil-punti ta 'żmien indikati.Għal ċarezza aħjar, linja bit-tikek hija mfassla fuq il-graff fuq skala ta '100%.(c) Tnaqqis perċentwali f'Aβ40 fid-demm (trijangoli ħomor) u fluwidu ċerebrospinali (trijangoli oranġjo) fil-firien ittrattati bi streptavidin konjugat ma' peptide ta' transitu #2077 u peptide inibitorju BACE1 fi proporzjon 3:1.(d) Tnaqqis perċentwali fid-demm Aβ40 (ċrieki ħomor) u fluwidu ċerebrospinali (ċrieki oranġjo) ta 'firien ittrattati bi streptavidin akkoppjat ma' peptide inibitorju BACE1 biss.Il-konċentrazzjoni Aβ fil-kontroll kienet 420 pg/ml (devjazzjoni standard = 101 pg/ml).
Il-wiri tal-fagi ġie applikat b'suċċess f'diversi oqsma tar-riċerka bijomedika17.Dan il-metodu intuża għal studji in vivo tad-diversità vaskulari18,19 kif ukoll studji mmirati lejn il-bastimenti ċerebrali20,21,22,23,24,25,26.F'dan l-istudju, estendejna l-applikazzjoni ta 'dan il-metodu ta' għażla mhux biss għall-identifikazzjoni diretta ta 'peptidi li jimmiraw il-bastimenti ċerebrali, iżda wkoll għall-iskoperta ta' kandidati bi proprjetajiet ta 'trasport attiv biex jaqsmu l-barriera tad-demm-moħħ.Issa niddeskrivu l-iżvilupp ta 'proċedura ta' għażla in vivo fil-firien intubati CM u nuru l-potenzjal tagħha li tidentifika peptidi bi proprjetajiet ta 'homing CSF.Bl-użu tal-phage T7 li juri librerija ta 'peptidi każwali ta' 12-mer, stajna nuru li l-phage T7 huwa żgħir biżżejjed (madwar 60 nm fid-dijametru)10 biex jiġi adattat għall-barriera tad-demm-moħħ, u b'hekk jaqsam direttament il-barriera tad-demm-moħħ jew plexus tal-korojde.Aħna osservajna li l-ħsad tas-CSF minn firien CM kanulati kien metodu ta 'screening funzjonali in vivo ikkontrollat ​​tajjeb, u li l-phage estratt mhux biss marbut mal-vaskulatura iżda ħadem ukoll bħala trasportatur tul il-barriera tad-demm-moħħ.Barra minn hekk, billi fl-istess ħin niġbru d-demm u applikajna HTS għal CSF u fagi derivati ​​mid-demm, aħna kkonfermajna li l-għażla tagħna ta 'CSF ma kinitx influwenzata minn arrikkiment tad-demm jew kapaċità għall-espansjoni bejn rawnds ta' għażla.Madankollu, il-kompartiment tad-demm huwa parti mill-proċedura tal-għażla, peress li l-fagi li kapaċi jilħqu l-kompartiment tas-CSF għandhom jgħixu u jiċċirkolaw fid-demm għal żmien twil biżżejjed biex jarrikkixxu lilhom infushom fil-moħħ.Sabiex niġbdu informazzjoni ta 'sekwenza affidabbli minn dejta HTS mhux ipproċessata, implimentajna filtri adattati għal żbalji ta' sekwenzar speċifiċi għall-pjattaforma fil-fluss tax-xogħol tal-analiżi.Billi inkorporaw parametri kinetiċi fil-metodu ta 'screening, ikkonfermajna l-farmakokinetika rapida ta' fagi T7 tat-tip selvaġġ (t½ ~ 28 min) fid-demm24, 27, 28 u ddeterminajna wkoll il-half-life tagħhom fil-fluwidu ċerebrospinali (t½ ~ 26 min) kull minuta).Minkejja profili farmakokinetiċi simili fid-demm u fis-CSF, 0.001% biss tal-konċentrazzjoni tad-demm tal-fagi setgħet tiġi skoperta fis-CSF, li jindika mobilità baxxa fl-isfond tal-fagi T7 tat-tip selvaġġ tul il-barriera tad-demm-moħħ.Dan ix-xogħol jenfasizza l-importanza tal-ewwel rawnd ta 'għażla meta jintużaw strateġiji ta' panning in vivo, speċjalment għal sistemi phage li huma mneħħija malajr miċ-ċirkolazzjoni, peress li ftit kloni huma kapaċi jilħqu l-kompartiment tas-CNS.Għalhekk, fl-ewwel rawnd, it-tnaqqis fid-diversità tal-libreriji kien kbir ħafna, peress li eventwalment inġabru numru limitat biss ta 'kloni f'dan il-mudell CSF strett ħafna.Din l-istrateġija ta 'panning in vivo inkludiet diversi passi ta' għażla bħal akkumulazzjoni attiva fil-kompartiment tas-CSF, sopravivenza tal-kloni fil-kompartiment tad-demm, u tneħħija rapida ta 'kloni phage T7 mid-demm fl-ewwel 10 minuti (Fig. 1d u Supplimentari Fig. 4M).).Għalhekk, wara l-ewwel rawnd, ġew identifikati kloni phage differenti fis-CSF, għalkemm l-istess ġabra inizjali ntużat għal annimali individwali.Dan jissuġġerixxi li bosta passi stretti ta 'għażla għal libreriji sors b'numru kbir ta' membri tal-libreriji jirriżultaw fi tnaqqis sinifikanti fid-diversità.Għalhekk, avvenimenti każwali se jsiru parti integrali mill-proċess tal-għażla inizjali, u jinfluwenzaw ħafna r-riżultat.Huwa probabbli li ħafna mill-kloni fil-librerija oriġinali kellhom propensità ta 'arrikkiment tas-CSF simili ħafna.Madankollu, anke taħt l-istess kundizzjonijiet sperimentali, ir-riżultati tal-għażla jistgħu jvarjaw minħabba n-numru żgħir ta 'kull klonu partikolari fil-ġabra inizjali.
Il-motivi arrikkit fis-CSF huma differenti minn dawk fid-demm.Interessanti, aħna nnutaw l-ewwel bidla lejn peptidi sinjuri fil-gliċina fid-demm ta 'annimali individwali.(Fig. 1g, Figuri Supplimentari 4e, 4f).Il-fagi li jkun fihom il-peptidi tal-gliċina jistgħu jkunu aktar stabbli u inqas probabbli li jitneħħew miċ-ċirkolazzjoni.Madankollu, dawn il-peptidi b'ħafna glycine ma ġewx skoperti fil-kampjuni tal-fluwidu ċerebrospinali, li jissuġġerixxu li l-libreriji kkurati għaddew minn żewġ passi ta 'għażla differenti: wieħed fid-demm u ieħor permess jakkumula fil-fluwidu ċerebrospinali.Kloni arrikkit bis-CSF li jirriżultaw mir-raba' rawnd ta' għażla ġew ittestjati b'mod estensiv.Kważi l-kloni ttestjati individwalment kollha ġew ikkonfermati li huma arrikkit f'CSF meta mqabbla mal-fagi ta 'kontroll vojt.Wieħed peptide hit (#2077) ġie eżaminat f'aktar dettall.Wera half-life tal-plażma itwal meta mqabbla ma 'hits oħra (Figura 3d u Figura Supplimentari 7), u interessanti, dan il-peptide kien fih residwu ta' cysteine ​​fit-terminal C.Riċentement intwera li ż-żieda ta 'cysteine ​​​​ma' peptidi tista 'ttejjeb il-proprjetajiet farmakokinetiċi tagħhom billi torbot mal-albumina 29 .Dan bħalissa mhux magħruf għall-peptide #2077 u jeħtieġ aktar studju.Xi peptidi wrew dipendenza fuq valenza fl-arrikkiment tas-CSF (dejta mhux murija), li tista 'tkun relatata mal-ġeometrija tal-wiċċ murija tal-kapsid T7.Is-sistema T7 li użajna wriet 5-15-il kopja ta 'kull peptide għal kull partiċella tal-fagi.IHC twettqet fuq kloni kandidati tal-fagi taċ-ċomb injettati ġol-vini fil-kortiċi ċerebrali tal-firien (Fig. 8 Supplimentari).Id-dejta wriet li mill-inqas tliet kloni (Nru 2002, Nru 2009 u Nru 2077) interaġixxew mal-BBB.Għad irid jiġi determinat jekk din l-interazzjoni BBB tirriżultax fl-akkumulazzjoni ta 'CSF jew il-moviment ta' dawn il-kloni direttament lejn il-BCSFB.Importanti, nuru li l-peptidi magħżula jżommu l-kapaċità tat-trasport CSF tagħhom meta sintetizzati u marbuta mal-merkanzija tal-proteina.Ir-rabta ta 'peptidi bijotinilati N-terminali ma' SA essenzjalment tirrepeti r-riżultati miksuba bil-kloni tal-fagi rispettivi tagħhom fid-demm u l-fluwidu ċerebrospinali (Fig. 3e).Fl-aħħarnett, nuru li l-peptide taċ-ċomb #2077 huwa kapaċi jippromwovi l-azzjoni tal-moħħ ta 'inibitur ta' peptide bijotinilat ta 'BACE1 konjugat ma' SA, li jikkawża effetti farmakodinamiċi evidenti fis-CNS billi jnaqqas b'mod sinifikanti l-livelli ta 'Abeta40 fis-CSF (Fig. 4).Ma stajna nidentifikaw l-ebda omologu fid-database billi wettaqna tfittxija għall-omoloġija tas-sekwenza tal-peptidi tal-hits kollha.Huwa importanti li wieħed jinnota li d-daqs tal-librerija T7 huwa bejn wieħed u ieħor 109, filwaqt li d-daqs tal-librerija teoretiku għal 12-mers huwa 4 x 1015. Għalhekk, aħna għażilna biss frazzjoni żgħira tal-ispazju tad-diversità tal-librerija tal-peptidi 12-mer, li jista 'jfisser li peptidi aktar ottimizzati jistgħu jiġu identifikati billi evalwaw l-ispazju tas-sekwenza tal-hit maġenb dawn identifikati.Ipotetikament, waħda mir-raġunijiet għaliex ma sibna l-ebda omologu naturali ta 'dawn il-peptidi tista' tkun id-diżgħażla matul l-evoluzzjoni biex tipprevjeni d-dħul mhux ikkontrollat ​​ta 'ċerti motifi peptidi fil-moħħ.
Meħuda flimkien, ir-riżultati tagħna jipprovdu bażi għal ħidma futura biex jiġu identifikati u kkaratterizzati s-sistemi tat-trasport tal-barriera ċerebrovaskulari in vivo f'aktar dettall.Is-setup bażiku ta 'dan il-metodu huwa bbażat fuq strateġija ta' għażla funzjonali li mhux biss tidentifika kloni bi proprjetajiet ta 'rbit vaskulari ċerebrali, iżda tinkludi wkoll pass kritiku li fih kloni ta' suċċess għandhom attività intrinsika biex jaqsmu l-ostakli bijoloġiċi in vivo fil-kompartiment tas-CNS.huwa li jiċċara l-mekkaniżmu tat-trasport ta 'dawn il-peptidi u l-preferenza tagħhom għall-irbit mal-mikrovaskulatura speċifika għar-reġjun tal-moħħ.Dan jista 'jwassal għall-iskoperta ta' mogħdijiet ġodda għat-trasport tal-BBB u r-riċetturi.Nistennew li l-peptidi identifikati jistgħu jorbtu direttament ma 'riċetturi ċerebrovaskulari jew ma' ligandi li jiċċirkolaw trasportati permezz tal-BBB jew BCSFB.Il-vetturi tal-peptidi b'attività tat-trasport tas-CSF skoperti f'dan ix-xogħol se jiġu investigati aktar.Bħalissa qed ninvestigaw l-ispeċifiċità tal-moħħ ta 'dawn il-peptidi għall-kapaċità tagħhom li jaqsmu l-BBB u/jew BCSFB.Dawn il-peptidi ġodda se jkunu għodod estremament siewja għall-iskoperta potenzjali ta 'riċetturi jew mogħdijiet ġodda u għall-iżvilupp ta' pjattaformi ġodda effiċjenti ħafna għall-kunsinna ta 'makromolekuli, bħal bijoloġiċi, lill-moħħ.
Kannula ċ-ċisterna kbira (CM) billi tuża modifika tal-metodu deskritt qabel.Firien Wistar anestetizzati (200-350 g) ġew immuntati fuq apparat stereotassiku u saret inċiżjoni medjana fuq il-qorriegħa mqaxxar u ppreparata b'mod asettiku biex tesponi l-kranju.Ħaffer żewġ toqob fiż-żona tas-sash ta 'fuq u waħħal il-viti tat-twaħħil fit-toqob.Toqba addizzjonali ġiet imtaqqba fil-crest oċċipitali laterali għal gwida sterjotattika ta 'kannula ta' l-istainless steel fis-CM.Applika siment dentali madwar il-kannula u waħħal bil-viti.Wara l-ikkurar bil-foto u t-twebbis tas-siment, il-ferita tal-ġilda ingħalqet b'sutura supramid 4/0.It-tqegħid tajjeb tal-kannula huwa kkonfermat minn tnixxija spontanja tal-fluwidu ċerebrospinali (CSF).Neħħi l-far mill-apparat sterjotassiku, irċievi kura xierqa wara l-operazzjoni u ġestjoni tal-uġigħ, u ħalliha tirkupra għal mill-inqas ġimgħa sakemm jiġu osservati sinjali tad-demm fil-fluwidu ċerebrospinali.Il-firien Wistar (Crl:WI/Han) inkisbu minn Charles River (Franza).Il-firien kollha nżammu taħt kundizzjonijiet speċifiċi ħielsa minn patoġeni.L-esperimenti kollha fuq l-annimali ġew approvati mill-Uffiċċju Veterinarju tal-Belt ta 'Basel, l-Isvizzera, u saru skont il-Liċenzja tal-Annimali Nru 2474 (Valutazzjoni tat-Trasport Attiv tal-Moħħ billi Tkejjel il-Livelli ta' Kandidati Terapewtiċi fil-Fluwidu Ċerebrospinali u l-Moħħ tal-Firien).
Bil-mod żomm il-far konxju bil-kannula CM fl-idejn.Neħħi Datura mill-kannula u iġbor 10 µl ta' fluwidu ċerebrospinali li jiċċirkola spontanjament.Peress li l-patency tal-kannula fl-aħħar mill-aħħar kienet kompromessa, f'dan l-istudju ġew inklużi biss kampjuni ċari ta 'fluwidu ċerebrospinali mingħajr l-ebda evidenza ta' kontaminazzjoni tad-demm jew telf ta 'kulur.B'mod parallel, bejn wieħed u ieħor 10-20 μl ta 'demm ittieħdu minn inċiżjoni żgħira fil-ponta tad-denb f'tubi bl-eparina (Sigma-Aldrich).Is-CSF u d-demm inġabru f'diversi ħinijiet wara injezzjoni ġol-vini ta' T7 phage.Madwar 5-10 μl ta 'fluwidu ġew mormija qabel ma nġabar kull kampjun CSF, li jikkorrispondi għall-volum mejjet tal-kateter.
Il-libreriji ġew iġġenerati bl-użu tal-vettur T7Select 10-3b kif deskritt fil-manwal tas-sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Fil-qosor, inserzjoni tad-DNA 12-mer bl-addoċċ ġiet sintetizzata fil-format li ġej:
Il-kodon NNK intuża biex jiġi evitat il-kodon ta 'waqfien doppju u l-espressjoni żejda tal-aċidu amminiku fl-inserzjoni.N huwa proporzjon ekwimolari mħallat manwalment ta 'kull nukleotide, u K huwa proporzjon ekwimolari mħallat manwalment ta' nukleotidi ta 'adenine u ċitosina.Reġjuni single stranded ġew konvertiti għal double stranded DNA b'aktar inkubazzjoni b'dNTP (Novagen) u enzima Klenow (New England Biolabs) f'Klenow buffer (New England Biolabs) għal 3 sigħat f'37 ° C.Wara r-reazzjoni, DNA double-stranded ġie rkuprat permezz ta 'preċipitazzjoni EtOH.Id-DNA li rriżulta ġie diġerit b'enzimi ta' restrizzjoni EcoRI u HindIII (it-tnejn minn Roche).L-inserzjoni mnaqqsa u purifikata (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) imbagħad ġiet imqabbda fil-qafas f'vettur T7 pre-cleaved wara l-aċidu amminiku 348 tal-ġene tal-kapsid 10B.Reazzjonijiet ta 'ligazzjoni ġew inkubati f'temperatura ta' 16 ° C għal 18-il siegħa qabel l-ippakkjar in vitro.L-ippakkjar tal-fagi in vitro sar skont l-istruzzjonijiet fornuti mal-kit ta’ klonazzjoni T7Select 10-3b (Novagen) u s-soluzzjoni tal-ippakkjar ġiet amplifikata darba għal liżi bl-użu ta’ Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Il-lysates ġew ċentrifugati, ittitrati u ffriżati f'-80 ° C bħala soluzzjoni stokk ta 'gliċerol.
Amplifikazzjoni diretta tal-PCR tar-reġjuni varjabbli tal-fagi amplifikati f'brodu jew pjanċa bl-użu ta' primers tal-fużjoni proprjetarji 454/Roche-amplicon.Il-primer tal-fużjoni 'l quddiem fih sekwenzi li jġorru r-reġjun varjabbli (NNK) 12 (speċifiku għall-mudell), GS FLX Titanium Adapter A, u sekwenza taċ-ċavetta tal-librerija b'erba' bażi (TCAG) (Figura Supplimentari 1a):
Il-primer tal-fużjoni inversa fih ukoll bijotina mwaħħla biex jaqbdu żibeġ u l-Adapter B tat-titanju GS FLX meħtieġ għall-amplifikazzjoni klonali waqt l-emulsjoni PCR:
L-amplicons imbagħad ġew soġġetti għal pyrosequencing 454/Roche skont il-protokoll tat-titanju 454 GS-FLX.Għas-sekwenzjar manwali Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), id-DNA tal-fagi T7 ġie amplifikat permezz tal-PCR u sekwenzat bil-pari primers li ġejjin:
Inserts minn plakki individwali ġew soġġetti għal amplifikazzjoni PCR bl-użu tal-Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur).Wettaq startjar sħun (10 min f'95 °C) u 35 ċiklu ta' spinta (50 s f'95 °C, 1 min f'50 °C, u 1 min f'72 °C).
Fagi minn libreriji, fagi tat-tip selvaġġ, fagi salvati minn CSF u demm, jew kloni individwali ġew amplifikati f'Escherichia coli BL5615 f'brodu tat-TB (Sigma Aldrich) jew f'platti ta '500 cm2 (Thermo Scientific) għal 4 h f'37 ° C.Il-fagi ġew estratti mill-pjanċi billi tlaħlaħ il-pjanċi bil-buffer Tris-EDTA (Fluka Analytical) jew billi jinġabru l-plakki b'ponot sterili tal-pipetta.Phage ġew iżolati minn supernatant tal-kultura jew buffer ta 'estrazzjoni b'rawnd wieħed ta' preċipitazzjoni tal-polyethylene glycol (PEG 8000) (Promega) u sospiżi mill-ġdid f'buffer Tris-EDTA.
Il-phage amplifikat kien soġġett għal 2-3 rawnds ta 'tneħħija ta' endotossini bl-użu ta 'żibeġ ta' tneħħija ta 'endotossini (Miltenyi Biotec) qabel injezzjoni ġol-vini (IV) (500 μl/annimal).Fl-ewwel rawnd, ġew introdotti 2 × 1012 phages;fit-tieni, 2 × 1010 fagi;fit-tielet u r-raba 'rawnds ta' għażla, 2 × 109 phages għal kull annimal.Il-kontenut tal-fagi fis-CSF u l-kampjuni tad-demm miġbura fil-punti taż-żmien indikati ġew iddeterminati permezz tal-għadd tal-plakka skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur (manwal tas-sistema T7Select).L-għażla tal-fagi saret permezz ta 'injezzjoni ġol-vini ta' libreriji purifikati fil-vina tad-denb jew b'injezzjoni mill-ġdid ta 'fagi estratt minn CSF mir-rawnd ta' għażla preċedenti, u ħsad sussegwenti saru f'kampjuni ta '10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, u 240 min CSF u demm rispettivament.Saru total ta 'erba' rawnds ta 'panning in vivo li fihom iż-żewġ fergħat magħżula ġew maħżuna u analizzati separatament matul l-ewwel tliet rawnds ta' għażla.L-inserzjonijiet tal-fagi kollha estratti minn CSF mill-ewwel żewġ rawnds ta 'selezzjoni ġew soġġetti għal 454/Roche pyrosequencing, filwaqt li l-kloni kollha estratti minn CSF mill-aħħar żewġ rawnds ta' għażla ġew sekwenzati manwalment.Il-fagi tad-demm kollha mill-ewwel rawnd ta 'selezzjoni kienu wkoll soġġetti għal 454/Roche pyrosequencing.Għal injezzjoni ta 'kloni phage, phages magħżula ġew amplifikati f'E. coli (BL5615) fuq pjanċi ta' 500 cm2 f'37 ° C għal 4 sigħat.Kloni magħżula individwalment u sekwenzati manwalment ġew propagati f'medja tat-TB.Wara l-estrazzjoni tal-fagi, il-purifikazzjoni u t-tneħħija tal-endotossina (kif deskritt hawn fuq), 2 × 1010 fagi/annimal fi 300 μl ġew injettati ġol-vina ġo vina tad-denb waħda.
Preproċessar u filtrazzjoni kwalitattiva tad-dejta tas-sekwenza.Id-dejta mhux ipproċessata 454/Roche ġiet ikkonvertita minn format ta' mappa standard binarju (sff) għal format Pearson li jinqara mill-bniedem (fasta) bl-użu ta' softwer tal-bejjiegħ.Aktar ipproċessar tas-sekwenza tan-nukleotidi sar bl-użu ta 'programmi proprjetarji C u skripts (pakkett tas-softwer mhux rilaxxat) kif deskritt hawn taħt.L-analiżi tad-dejta primarja tinkludi proċeduri stretti ta 'filtrazzjoni f'diversi stadji.Biex jiġu ffiltrati qari li ma kienx fihom sekwenza valida tad-DNA ta 'inserzjoni ta' 12mer, il-qari ġew allinjati b'mod sekwenzjali biex jibdew it-tikketta (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), it-tikketta ta 'waqfien (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) u l-inserzjoni fl-isfond (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) bl-użu globali Needleman-Wunsch.allinjament li jippermetti sa 2 inkonsistenzi għal kull allinjament31.Għalhekk, il-qari mingħajr tikketti tal-bidu u l-waqfien u l-qari li kien fihom inserzjonijiet fl-isfond, jiġifieri, allinjamenti li jaqbżu n-numru permess ta' diskrepanzi, tneħħew mil-librerija.Fir-rigward tal-qari li jifdal, is-sekwenza tad-DNA N-mer li testendi mill-marka tal-bidu u tispiċċa qabel il-marka tal-waqfien ġiet imnaqqsa mis-sekwenza tal-qari oriġinali u pproċessata aktar (minn hawn 'il quddiem imsejħa "daħħal").Wara t-traduzzjoni tal-inserzjoni, il-porzjon wara l-ewwel stop codon fit-tarf 5′ tal-primer jitneħħa mill-inserit.Barra minn hekk, in-nukleotidi li jwasslu għal kodoni mhux kompluti fit-tarf 3′ tal-primer tneħħew ukoll.Biex jiġu esklużi inserzjonijiet li fihom biss sekwenzi fl-isfond, tneħħew ukoll inserzjonijiet tradotti li jibdew bil-mudell ta 'aċidu amminiku "PAG".Peptidi b'tul ta 'wara t-traduzzjoni ta' inqas minn 3 aċidi amminiċi tneħħew mil-librerija.Fl-aħħarnett, neħħi redundancy fil-pool ta 'inserzjoni u ddetermina l-frekwenza ta' kull inserzjoni unika.Ir-riżultati ta 'din l-analiżi inkludew lista ta' sekwenzi ta 'nukleotidi (inserzjonijiet) u l-frekwenzi (qari) tagħhom (Figuri Supplimentari 1c u 2).
Inserzjonijiet tad-DNA tal-grupp N-mer b'xebh ta 'sekwenza: Biex jiġu eliminati żbalji ta' sekwenzar speċifiċi għal 454/Roche (bħal problemi bl-estensjonijiet tas-sekwenzjar tal-omopolimeru) u tneħħi redundancies inqas importanti, inserzjonijiet (inserzjonijiet) tas-sekwenza tad-DNA N-mer iffiltrati qabel huma magħżula skond ix-xebh.inserzjonijiet (sa 2 bażijiet li ma jaqblux permessi) bl-użu ta' algoritmu iterattiv definit kif ġej: l-inserzjonijiet huma magħżula l-ewwel skond il-frekwenza tagħhom (mill-ogħla għall-inqas), u jekk huma l-istess, skont it-tip sekondarju tagħhom skont it-tul (l-itwal sal-iqsar) ).Għalhekk, l-aktar inserzjonijiet frekwenti u itwal jiddefinixxu l-ewwel "grupp".Il-frekwenza tal-grupp hija ssettjata għall-frekwenza ewlenija.Imbagħad, kull inserzjoni li fadal fil-lista magħżula ġiet ippruvata biex tiżdied mal-grupp permezz ta 'allinjament Needleman-Wunsch f'pari.Jekk in-numru ta 'nuqqas ta' tqabbil, inserzjonijiet, jew tħassir f'allinjament ma jaqbiżx limitu ta '2, inserzjoni hija miżjuda mal-grupp, u l-frekwenza ġenerali tal-grupp tiżdied b'kemm-il darba l-inserzjoni ġiet miżjuda.L-inserzjonijiet miżjuda ma' grupp huma mmarkati bħala użati u esklużi minn aktar proċessar.Jekk is-sekwenza tal-inserzjoni ma tistax tiżdied ma' grupp diġà eżistenti, is-sekwenza tal-inserzjoni tintuża biex jinħoloq grupp ġdid bil-frekwenza tal-inserzjoni xierqa u mmarkata kif użata.L-iterazzjoni tispiċċa meta kull sekwenza ta' inserzjoni jew tkun ġiet użata biex tifforma grupp ġdid jew tista' tiġi inkluża fi grupp diġà eżistenti.Wara kollox, inserzjonijiet raggruppati li jikkonsistu f'nukleotidi eventwalment jiġu tradotti f'sekwenzi ta 'peptidi (libreriji ta' peptidi).Ir-riżultat ta 'din l-analiżi huwa sett ta' inserzjonijiet u l-frekwenzi korrispondenti tagħhom li jiffurmaw in-numru ta 'qari konsekuttivi (Fig. 2 Supplimentari).
Ġenerazzjoni tal-Motif: Ibbażat fuq lista ta 'peptidi uniċi, inħolqot librerija li fiha l-mudelli kollha possibbli ta' aċidi amminiċi (aa) kif muri hawn taħt.Kull mudell possibbli ta 'tul 3 ġie estratt mill-peptide u l-mudell invers tiegħu ġie miżjud flimkien ma' librerija ta 'motif komuni li fiha l-mudelli kollha (tripeptidi).Libreriji ta' motivi ripetittivi ħafna ġew sekwenzati u tneħħew is-sensji.Imbagħad, għal kull tripeptide fil-librerija tal-motif, iċċekkajna għall-preżenza tiegħu fil-librerija billi tuża għodod komputazzjonali.F'dan il-każ, il-frekwenza tal-peptide li fih il-tripeptide tal-motif misjub hija miżjuda u assenjata lill-motif fil-librerija tal-motif ("numru ta 'motifi").Ir-riżultat tal-ġenerazzjoni tal-motif huwa firxa bidimensjonali li fiha l-okkorrenzi kollha ta 'tripeptides (motivi) u l-valuri rispettivi tagħhom, li huma n-numru ta' qari ta 'sekwenzjar li jirriżultaw fil-motif korrispondenti meta l-qari jiġu ffiltrati, raggruppati u tradotti.Metriċi kif deskritti fid-dettall hawn fuq.
Normalizzazzjoni tan-numru ta' motifi u scatterplots korrispondenti: In-numru ta' motifi għal kull kampjun ġie normalizzat bl-użu
fejn ni huwa n-numru ta' qari li fihom is-suġġett i.Għalhekk, vi jirrappreżenta l-frekwenza perċentwali tal-qari (jew peptidi) li fihom motif i fil-kampjun.Il-valuri P għan-numru mhux normalizzat ta 'motifi ġew ikkalkulati bl-użu tat-test eżatt ta' Fisher.Rigward korelogrammi tan-numru ta 'motivi, il-korrelazzjonijiet ta' Spearman ġew ikkalkulati bl-użu tan-numru normalizzat ta 'motivi ma' R.
Biex jiġi viżwalizzat il-kontenut ta 'aċidi amminiċi f'kull pożizzjoni fil-librerija tal-peptidi, inħolqu logogrammi tal-web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).L-ewwel, il-kontenut ta 'aċidi amminiċi f'kull pożizzjoni tal-peptide 12-mer huwa maħżun f'matriċi 20 × 12.Imbagħad, sett ta '1000 peptide li jkun fih l-istess kontenut relattiv ta' aċidu amminiku f'kull pożizzjoni huwa ġġenerat f'format ta 'sekwenza fasta u pprovdut bħala input għall-web-logo 3, li jiġġenera rappreżentazzjoni grafika tal-kontenut relattiv ta' aċidu amminiku f'kull pożizzjoni.għal librerija ta' peptidi partikolari.Biex jiġu viżwalizzati settijiet ta 'dejta multidimensjonali, inħolqu mapep tas-sħana bl-użu ta' għodda żviluppata internament f'R (biosHeatmap, pakkett R li għad irid jinħareġ).Id-dendrogrammi ppreżentati fil-mapep tas-sħana ġew ikkalkulati bl-użu tal-metodu ta 'raggruppament ġerarkiku ta' Ward bil-metrika tad-distanza Ewklidjana.Għall-analiżi statistika tad-dejta tal-punteġġ tal-motif, il-valuri P għall-punteġġ mhux normalizzat ġew ikkalkulati bl-użu tat-test eżatt ta’ Fisher.Il-valuri P għal settijiet ta 'dejta oħra ġew ikkalkulati f'R bl-użu tat-test t ta' Student jew ANOVA.
Il-kloni tal-fagi magħżula u l-fagi mingħajr inserzjonijiet ġew injettati ġol-vina permezz tal-vina tad-denb (2 × 1010 fagi/annimal fi 300 μl PBS).Għaxar minuti qabel il-perfużjoni u l-iffissar sussegwenti, l-istess annimali ġew injettati ġol-vini b'100 μl ta 'lectin ittikkettat b'DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minuta wara l-injezzjoni tal-fagi, il-firien ġew imxerrda mill-qalb b'50 ml PBS segwit minn 50 ml 4% PFA/PBS.Kampjuni tal-moħħ ġew ukoll iffissati matul il-lejl f'4% PFA/PBS u mxarrba fi 30% sukrożju matul il-lejl f'4 ° C.Il-kampjuni huma flash iffriżati fit-taħlita OCT.Analiżi immunoistokimika ta’ kampjuni ffriżati saret f’temperatura tal-kamra fuq krijosezzjonijiet ta’ 30 µm imblukkati b’1% BSA u inkubati b’antikorpi poliklonali bit-tikketta FITC kontra T7 phage (Novus NB 600-376A) f’4 °C.Inkuba matul il-lejl.Fl-aħħarnett, is-sezzjonijiet ġew maħsula 3 darbiet b'PBS u eżaminati b'mikroskopju tal-laser konfokali (Leica TCS SP5).
Il-peptidi kollha b'purità minima ta '98% ġew sintetizzati minn GenScript USA, bijotinilati u lajofilizzati.Il-bijotina hija marbuta permezz ta' spacer triple glycine addizzjonali fl-N-terminal.Iċċekkja l-peptidi kollha billi tuża l-ispettrometrija tal-massa.
Streptavidin (Sigma S0677) tħallat b'eċċess ekwimolar ta '5 darbiet ta' peptide bijotinilat, peptide inibitorju BACE1 bijotinilat, jew kombinazzjoni (proporzjon 3:1) ta 'peptide inibitorju BACE1 bijotinilat u peptide inibitorju BACE1 f'5-10% DMSO/inkubat f'PBS.Siegħa f'temperatura ambjentali qabel l-injezzjoni.Peptidi konjugati bi streptavidin ġew injettati ġol-vini f'doża ta '10 mg/kg f'waħda mill-vini tad-denb tal-firien b'kavità ċerebrali.
Il-konċentrazzjoni tal-kumplessi streptavidin-peptide ġiet ivvalutata b'ELISA.Il-pjanċi tal-mikrotiter Nunc Maxisorp (Sigma) ġew miksija matul il-lejl f'4 ° C b'1.5 μg / ml antikorp tal-ġurdien kontra streptavidin (Thermo, MA1-20011).Wara l-imblukkar (buffer tal-imblukkar: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ġelatina, 1% BSA) f'temperatura tal-kamra għal sagħtejn, aħsel il-pjanċa b'0.05% Tween-20/PBS (wash buffer) għal 3 It-tieni, CSF u kampjuni tal-plażma ġew miżjuda ma 'buffers ta' plażma, 0. CSF 1:115).Il-pjanċa mbagħad ġiet inkubata matul il-lejl f'4 ° C b'antikorp ta 'skoperta (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Wara tliet stadji tal-ħasil, streptavidin ġie skopert permezz ta 'inkubazzjoni f'soluzzjoni ta' sottostrat TMB (Roche) sa 20 min.Wara li twaqqaf l-iżvilupp tal-kulur b'1M H2SO4, kejjel l-assorbiment f'450 nm.
Il-funzjoni tal-kumpless inibitur streptavidin-peptide-BACE1 ġiet ivvalutata minn Aβ(1-40) ELISA skont il-protokoll tal-manifattur (Wako, 294-64701).Fil-qosor, kampjuni CSF ġew dilwiti f'dilwent standard (1:23) u inkubati matul il-lejl f'4 ° C fi pjanċi ta '96-well miksija b'antikorp ta' qbid BNT77.Wara ħames stadji tal-ħasil, antikorp BA27 konjugat bl-HRP ġie miżjud u inkubat għal sagħtejn f'4° C., segwit minn ħames stadji tal-ħasil.Aβ (1-40) ġie skopert permezz ta 'inkubazzjoni f'soluzzjoni TMB għal 30 minuta f'temperatura tal-kamra.Wara li l-iżvilupp tal-kulur ikun twaqqaf b'soluzzjoni ta' waqfien, kejjel l-assorbiment f'450 nm.Kampjuni tal-plażma ġew soġġetti għal estrazzjoni ta 'fażi solida qabel Aβ(1-40) ELISA.Plażma ġiet miżjuda ma '0.2% DEA (Sigma) fi pjanċi 96-well u inkubati f'temperatura tal-kamra għal 30 minuta.Wara suċċessivament taħsel il-pjanċi SPE (Oasis, 186000679) bl-ilma u 100% metanol, kampjuni tal-plażma ġew miżjuda mal-pjanċi SPE u l-likwidu kollu tneħħa.Il-kampjuni ġew maħsula (l-ewwel b'5% metanol imbagħad 30% metanol) u elużi b'2% NH4OH/90% metanol.Wara t-tnixxif tal-eluat f'55 ° C għal 99 min f'kurrent kostanti N2, il-kampjuni tnaqqsu f'dilwenti standard u Aβ (1-40) tkejjel kif deskritt hawn fuq.
Kif tikkwota dan l-artiklu: Urich, E. et al.Konsenja tal-merkanzija lejn il-moħħ bl-użu ta' peptidi ta' transitu identifikati in vivo.ix-xjenza.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB u Moos T. Kunsinna ta 'drogi makromolekulari lill-moħħ bl-użu ta' terapija mmirata.Ġurnal ta 'Newrokimika 113, 1-13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., u Martinez-Martinez, P. Kunsinna ta 'mediċini peptidi u proteini madwar il-barriera tad-demm-moħħ.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Il-barriera tad-demm-moħħ: ostakolu fl-iżvilupp tad-droga tal-moħħ.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, u Byrd, A. Prospetti għal kunsinna mtejba tad-droga u mmirata lejn il-moħħ permezz tal-mogħdija tal-plexus choroid-CSF.Riċerka Farmaċewtika 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizzazzjoni ta 'bijofarmaċewtiċi bi żwiemel Trojan molekulari għall-kunsinna tal-moħħ.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021 / bc800148t (2008).
Pardridge, trasport tal-peptidi medjat mir-riċettur WM tul il-barriera tad-demm-moħħ.Endocr Rev 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Iżżid il-penetrazzjoni tal-moħħ u l-effikaċja ta 'antikorpi terapewtiċi bl-użu ta' shuttles molekulari monovalenti.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.It-trasport tar-riċettur ta' transferrin (TfR) jiddetermina l-assorbiment tal-moħħ ta' varjanti ta' affinità ta' antikorpi TfR.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).