Grazzi talli żort Nature.com. Qed tuża verżjoni tal-browser b'appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibilità fl-Internet Explorer). Barra minn hekk, biex niżguraw appoġġ kontinwu, nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Juri karużell ta’ tliet slides f’daqqa. Uża l-buttuni Preċedenti u Li Jmiss biex timxi minn tliet slides kull darba, jew uża l-buttuni tas-slider fl-aħħar biex timxi minn tliet slides kull darba.
Il-barriera bejn id-demm u l-moħħ u l-barriera bejn id-demm u l-moħħ jipprevjenu lill-aġenti bijoterapewtiċi milli jilħqu l-miri tagħhom fis-sistema nervuża ċentrali, u b'hekk ifixklu t-trattament effettiv ta' mard newroloġiku. Biex niskopru trasportaturi ġodda tal-moħħ in vivo, introduċejna librerija ta' peptidi tal-faġi T7 u ġbarna serjalment demm u fluwidu ċerebrospinali (CSF) bl-użu ta' mudell ta' ġabra kbira konxja kannulata ta' firien. Kloni speċifiċi tal-faġi ġew arrikkiti ħafna fis-CSF wara erba' rawnds ta' għażla. L-ittestjar ta' peptidi kandidati individwali żvela arrikkiment ta' aktar minn 1000 darba fis-CSF. Il-bijoattività tal-kunsinna medjata mill-peptidi lill-moħħ ġiet ikkonfermata minn tnaqqis ta' 40% fil-livell ta' amilojde-β fil-fluwidu ċerebrospinali bl-użu ta' inibitur tal-peptidi BACE1 marbut mal-peptide ta' transitu ġdid identifikat. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-peptidi identifikati permezz ta' metodi ta' għażla tal-faġi in vivo jistgħu jkunu vetturi utli għall-kunsinna sistemika ta' makromolekuli lill-moħħ b'effett terapewtiku.
Ir-riċerka dwar it-terapija mmirata lejn is-sistema nervuża ċentrali (CNS) iffokat fil-biċċa l-kbira fuq l-identifikazzjoni ta' drogi u aġenti ottimizzati li juru proprjetajiet li jimmiraw lejn is-CNS, b'inqas sforz fuq l-iskoperta tal-mekkaniżmi li jmexxu l-kunsinna attiva tad-drogi lejn il-moħħ. Dan qed jibda jinbidel issa hekk kif il-kunsinna tad-drogi, speċjalment molekuli kbar, hija parti integrali mill-iżvilupp tad-drogi newroxjentifiċi moderni. L-ambjent tas-sistema nervuża ċentrali huwa protett sew mis-sistema ta' barriera ċerebrovaskulari, li tikkonsisti mill-barriera bejn id-demm u l-moħħ (BBB) ​​u l-barriera bejn id-demm u l-moħħ (BCBB)1, li tagħmilha diffiċli li d-drogi jitwasslu lejn il-moħħ1,2. Huwa stmat li kważi d-drogi kollha b'molekuli kbar u aktar minn 98% tad-drogi b'molekuli żgħar jiġu eliminati mill-moħħ3. Huwa għalhekk li huwa importanti ħafna li jiġu identifikati sistemi ġodda ta' trasport tal-moħħ li jipprovdu kunsinna effiċjenti u speċifika ta' drogi terapewtiċi lis-CNS 4,5. Madankollu, il-BBB u l-BCSFB jippreżentaw ukoll opportunità eċċellenti għall-kunsinna tad-drogi hekk kif jippenetraw u jidħlu fl-istrutturi kollha tal-moħħ permezz tal-vaskulatura estensiva tiegħu. Għalhekk, l-isforzi attwali biex jintużaw metodi mhux invażivi ta' kunsinna lill-moħħ huma fil-biċċa l-kbira bbażati fuq il-mekkaniżmu tat-trasport medjat mir-riċetturi (PMT) bl-użu tar-riċettur endoġenu BBB6. Minkejja l-avvanzi ewlenin reċenti bl-użu tal-mogħdija tar-riċettur tat-transferrin7,8, huwa meħtieġ aktar żvilupp ta' sistemi ġodda ta' kunsinna bi proprjetajiet imtejba. Għal dan il-għan, l-għan tagħna kien li nidentifikaw peptidi kapaċi li jimmedjaw it-trasport tas-CSF, peress li fil-prinċipju jistgħu jintużaw biex iwasslu makromolekuli lis-CNS jew biex jiftħu mogħdijiet ġodda ta' riċetturi. B'mod partikolari, riċetturi u trasportaturi speċifiċi tas-sistema ċerebrovaskulari (BBB u BSCFB) jistgħu jservu bħala miri potenzjali għall-kunsinna attiva u speċifika ta' drogi bijoterapewtiċi. Il-fluwidu ċerebrospinali (CSF) huwa prodott sekretorju tal-plexus koroidali (CS) u huwa f'kuntatt dirett mal-fluwidu interstizjali tal-moħħ permezz tal-ispazju subaraknojde u l-ispazju ventrikulari4. Riċentement intwera li l-fluwidu ċerebrospinali subaraknojde jinfirex eċċessivament fl-interstizju tal-moħħ9. Nittamaw li naċċessaw l-ispazju parenkimali billi nużaw dan il-passaġġ tad-dħul subaraknojdali jew direttament permezz tal-BBB. Biex niksbu dan, implimentajna strateġija robusta ta' selezzjoni tal-faġi in vivo li idealment tidentifika l-peptidi ttrasportati minn kwalunkwe minn dawn iż-żewġ mogħdijiet distinti.
Issa qed niddeskrivu metodu ta' skrining sekwenzjali in vivo tal-wiri tal-faġi b'kampjunar tas-CSF flimkien ma' sekwenzar b'rendiment għoli (HTS) biex nimmonitorjaw ir-rawnds inizjali tal-għażla bl-ogħla diversità tal-librerija. L-iskrinjar sar fuq firien konxji b'kannula ta' cisterna kbira (CM) impjantata b'mod permanenti biex tevita l-kontaminazzjoni tad-demm. Importanti, dan l-approċċ jagħżel kemm peptidi li jimmiraw il-moħħ kif ukoll peptidi b'attività ta' trasport tul il-barriera ċerebrovaskulari. Użajna faġi T7 minħabba d-daqs żgħir tagħhom (~60 nm)10 u ssuġġerejna li huma adattati għat-trasport ta' vesikuli li jippermettu qsim transċellulari tal-barriera endoteljali u/jew epiteljali-medulla. Wara erba' rawnds ta' panning, il-popolazzjonijiet tal-faġi ġew iżolati li wrew arrikkiment qawwi tas-CSF in vivo u assoċjazzjoni tal-mikrovini ċerebrali. Importanti, stajna nikkonfermaw is-sejbiet tagħna billi wrejna li l-peptidi kandidati l-aħjar preferuti u sintetizzati kimikament huma kapaċi jittrasportaw tagħbija ta' proteini fil-fluwidu ċerebrospinali. L-ewwel, l-effetti farmakodinamiċi tas-CNS ġew stabbiliti billi kkombinajna peptide ta' transitu ewlieni ma' inibitur tal-peptide BACE1. Minbarra li nuru li l-istrateġiji ta' skrinjar funzjonali in vivo jistgħu jidentifikaw peptidi ġodda tat-trasport tal-moħħ bħala trasportaturi effettivi tal-merkanzija tal-proteini, nistennew li approċċi simili ta' selezzjoni funzjonali jsiru importanti wkoll fl-identifikazzjoni ta' mogħdijiet ġodda tat-trasport tal-moħħ.
Abbażi ta' unitajiet li jiffurmaw plakka (PFU), wara l-pass tal-ippakkjar tal-faġi, ġiet iddisinjata u maħluqa librerija ta' peptidi tal-faġi T7 lineari ta' 12-mer każwali b'diversità ta' madwar 109 (ara Materjali u Metodi). Huwa importanti li wieħed jinnota li analizzajna din il-librerija bir-reqqa qabel il-panning in vivo. L-amplifikazzjoni PCR ta' kampjuni tal-librerija tal-faġi bl-użu ta' primers modifikati ġġenerat amplikoni li kienu direttament applikabbli għall-HTS (Fig. Supplimentari 1a). Minħabba a) żbalji fis-sekwenzar tal-HTS11, b) impatt fuq il-kwalità tal-primers (NNK)1-12, u c) il-preżenza ta' faġi tat-tip selvaġġ (wt) (inserzjonijiet skeletru) fil-librerija standby, ġiet implimentata proċedura ta' filtrazzjoni tas-sekwenza biex tiġi estratta biss informazzjoni verifikata dwar is-sekwenza (Fig. Supplimentari 1b). Dawn il-passi ta' filtrazzjoni japplikaw għal-libreriji kollha tas-sekwenzar tal-HTS. Għal-librerija standard, inkiseb total ta' 233,868 qari, li minnhom 39% għaddew mill-kriterji tal-filtru u ntużaw għall-analiżi u l-għażla tal-librerija għal rawnds sussegwenti (Figura Supplimentari 1c–e). Il-qari kien predominantement multipli ta' 3 pari ta' bażijiet fit-tul b'quċċata ta' 36 nukleotide (Fig. Supplimentari 1c), li jikkonferma d-disinn tal-librerija (NNK) 1-12. Ta' min jinnota li madwar 11% tal-membri tal-librerija kien fihom inserzjoni PAGISRELVDKL ta' 12-il dimensjoni tat-tip selvaġġ (wt), u kważi nofs is-sekwenzi (49%) kien fihom inserzjonijiet jew tħassir. L-HTS tal-librerija kkonferma d-diversità għolja tal-peptidi fil-librerija: aktar minn 81% tas-sekwenzi tal-peptidi nstabu darba biss u 1.5% biss seħħew f'≥4 kopji (Fig. Supplimentari 2a). Il-frekwenzi tal-aċidi amminiċi (aa) fit-12-il pożizzjoni kollha fir-repertorju kienu jikkorrelataw sew mal-frekwenzi mistennija għan-numru ta' kodoni ġġenerati mir-repertorju NKK deġenerat (Fig. Supplimentari 2b). Il-frekwenza osservata tar-residwi aa kkodifikati minn dawn l-inserzjonijiet kienet tikkorrelata sew mal-frekwenza kkalkulata (r = 0.893) (Fig. Supplimentari 2c). It-tħejjija tal-libreriji tal-faġi għall-injezzjoni tinkludi l-passi tal-amplifikazzjoni u t-tneħħija tal-endotossina. Dan intwera qabel li potenzjalment inaqqas id-diversità tal-libreriji tal-faġi12,13. Għalhekk, sekwenzajna librerija tal-faġi amplifikata fuq pjanċa li kienet għaddiet mit-tneħħija tal-endotossina u qabbilha mal-librerija oriġinali biex nistmaw il-frekwenza tal-AA. Ġiet osservata korrelazzjoni qawwija (r = 0.995) bejn il-ġabra oriġinali u l-ġabra amplifikata u purifikata (Fig. Supplimentari 2d), li tindika li l-kompetizzjoni bejn il-kloni amplifikati fuq pjanċi bl-użu tal-faġi T7 ma kkawżatx preġudizzju kbir. Dan it-tqabbil huwa bbażat fuq il-frekwenza tal-motivi tat-tripeptidi f'kull librerija, peress li d-diversità tal-libreriji (~109) ma tistax tinqabad kompletament anke bl-HTS. L-analiżi tal-frekwenza tal-aa f'kull pożizzjoni żvelat preġudizzju żgħir dipendenti fuq il-pożizzjoni fl-aħħar tliet pożizzjonijiet tar-repertorju mdaħħal (Fig. Supplimentari 2e). Bħala konklużjoni, ikkonkludejna li l-kwalità u d-diversità tal-librerija kienu aċċettabbli u ġew osservati biss bidliet żgħar fid-diversità minħabba l-amplifikazzjoni u t-tħejjija tal-libreriji tal-faġi bejn diversi rawnds ta' selezzjoni.
Kampjunar serjali tal-fluwidu ċerebrospinali jista' jsir billi tiġi impjantata kirurġikament kannula fis-CM tal-firien konxji biex tiġi ffaċilitata l-identifikazzjoni tal-fagu T7 injettat ġol-vini (iv) permezz tal-BBB u/jew BCSFB (Fig. 1a-b). Użajna żewġ dirgħajn ta' selezzjoni indipendenti (dirgħajn A u B) fl-ewwel tliet rawnds ta' selezzjoni in vivo (Fig. 1c). Żidna gradwalment l-istrettezza tal-għażla billi naqqasna l-ammont totali ta' fagu introdott fl-ewwel tliet rawnds ta' selezzjoni. Għar-raba' rawnd ta' panning, għaqqadna kampjuni mill-fergħat A u B u wettaqna tliet selezzjonijiet indipendenti addizzjonali. Biex nistudjaw il-proprjetajiet in vivo tal-partiċelli tal-fagu T7 f'dan il-mudell, il-fagu tat-tip selvaġġ (inserzjoni ewlenija PAGISRELVDKL) ġie injettat fil-firien permezz tal-vina tad-denb. L-irkupru tal-fagi mil-fluwidu ċerebrospinali u d-demm f'punti ta' żmien differenti wera li l-fagi ikosaedriċi T7 relattivament żgħar kellhom fażi inizjali rapida ta' tneħħija mill-kompartiment tad-demm (Fig. Supplimentari 3). Abbażi tat-titri amministrati u l-volum tad-demm tal-firien, ikkalkulajna li madwar 1% biss bil-piż tal-faġ mid-doża amministrata ġie skopert fid-demm 10 minuti wara l-injezzjoni ġol-vini. Wara dan it-tnaqqis mgħaġġel inizjali, tkejjel tneħħija primarja aktar bil-mod b'half-life ta' 27.7 minuta. Importanti, ftit faġ biss ġew irkuprati mill-kompartiment tas-CSF, li jindika sfond baxx għall-migrazzjoni tal-faġ tat-tip selvaġġ fil-kompartiment tas-CSF (Fig. Supplimentari 3). Bħala medja, madwar 1 x 10-3% biss titri tal-faġ T7 fid-demm u 4 x 10-8% tal-faġ inizjalment infużi ġew skoperti fil-fluwidu ċerebrospinali matul il-perjodu kollu tat-teħid tal-kampjuni (0-250 min). Notevolment, il-half-life (25.7 min) tal-faġ tat-tip selvaġġ fil-fluwidu ċerebrospinali kien simili għal dak osservat fid-demm. Din id-dejta turi li l-barriera li tifred il-kompartiment tas-CSF mid-demm hija intatta fil-firien ikkannulati bis-CM, u b'hekk tippermetti l-għażla in vivo tal-libreriji tal-faġi biex jiġu identifikati kloni li jiġu ttrasportati faċilment mid-demm fil-kompartiment tas-CSF.
(a) Twaqqif ta' metodu għall-ġbir mill-ġdid ta' kampjuni tal-fluwidu ċerebrospinali (CSF) minn ġabra kbira. (b) Dijagramma li turi l-post ċellulari tal-barriera tas-sistema nervuża ċentrali (CNS) u l-istrateġija tal-għażla użata biex jiġu identifikati peptidi li jaqsmu l-barriera bejn id-demm u l-moħħ (BBB) ​​u l-barriera bejn id-demm u l-moħħ. (ċ) Ċart tal-fluss tal-iskrinjar tal-wiri tal-faġi in vivo. F'kull rawnd ta' għażla, il-faġi (identifikaturi tal-annimali ġewwa l-vleġeġ) ġew injettati ġol-vina. Żewġ fergħat alternattivi indipendenti (A, B) jinżammu separatament sal-4 rawnd ta' għażla. Għar-rawnds ta' għażla 3 u 4, kull klonu tal-faġi estratt mis-CSF ġie sekwenzat manwalment. (d) Kinetika tal-faġi iżolat mid-demm (ċrieki ħomor) u l-fluwidu ċerebrospinali (trijangoli ħodor) matul l-ewwel rawnd ta' għażla f'żewġ firien kannulati wara injezzjoni ġol-vina tal-librerija tal-peptidi T7 (2 x 1012 faġi/annimal). Kwadri blu jindikaw il-konċentrazzjoni inizjali medja tal-faġ fid-demm, ikkalkulata mill-ammont ta' faġ injettat, filwaqt li jitqies il-volum totali tad-demm. Il-kwadri suwed jindikaw il-punt ta' intersezzjoni tal-linja y estrapolata mill-konċentrazzjonijiet tal-faġ fid-demm. (e,f) Ippreżenta l-frekwenza u d-distribuzzjoni relattiva tal-motivi tripeptidiċi kollha possibbli li jikkoinċidu misjuba fil-peptid. In-numru ta' motivi misjuba f'1000 qari huwa muri. Motivi arrikkiti b'mod sinifikanti (p < 0.001) huma mmarkati b'tikek ħomor. (e) Scatterplot ta' korrelazzjoni li jqabbel il-frekwenza relattiva tal-motiv tat-tripeptid tal-librerija injettata mal-faġ derivat mid-demm mill-annimali #1.1 u #1.2. (f) Scatterplot ta' korrelazzjoni li jqabbel il-frekwenzi relattivi tal-motivi tripeptidiċi tal-faġ tal-annimali #1.1 u #1.2 iżolati fid-demm u l-fluwidu ċerebrospinali. (g, h) Rappreżentazzjoni tal-ID tas-sekwenza tal-faġ arrikkit fid-demm (g) kontra libreriji injettati u faġ arrikkit fis-CSF (h) kontra d-demm wara rawnd ta' selezzjoni in vivo fiż-żewġ annimali. Id-daqs tal-kodiċi ta’ ittra waħda jindika kemm-il darba dak l-aċidu amminiku jseħħ f’dik il-pożizzjoni. Aħdar = polari, vjola = newtrali, blu = bażiku, aħmar = aċiduż u iswed = aċidi amminiċi idrofobiċi. Il-Figura 1a, b ġiet iddisinjata u prodotta minn Eduard Urich.
Injettajna librerija ta' peptidi tal-faġi f'żewġ firien tal-istrument CM (kladi A u B) u iżolajna l-faġi mil-fluwidu ċerebrospinali u mid-demm (Figura 1d). It-tneħħija rapida inizjali tal-librerija kienet inqas evidenti meta mqabbla mal-faġi tat-tip selvaġġ. Il-half-life medja tal-librerija injettata fiż-żewġ annimali kienet ta' 24.8 minuta fid-demm, simili għall-faġi tat-tip selvaġġ, u 38.5 minuta fis-CSF. Kampjuni tad-demm u tal-fluwidu ċerebrospinali tal-faġi minn kull annimal ġew soġġetti għal HTS u l-peptidi kollha identifikati ġew analizzati għall-preżenza ta' motiv qasir ta' tripeptid. Intgħażlu motivi ta' tripeptid għax jipprovdu bażi minima għall-formazzjoni tal-istruttura u l-interazzjonijiet peptide-proteina14,15. Sibna korrelazzjoni tajba fid-distribuzzjoni tal-motivi bejn il-librerija tal-faġi injettata u l-kloni estratti mid-demm taż-żewġ annimali (Fig. 1e). Id-dejta tindika li l-kompożizzjoni tal-librerija hija arrikkita biss marġinalment fil-kompartiment tad-demm. Il-frekwenzi tal-aċidi amminiċi u s-sekwenzi ta' kunsens ġew analizzati aktar f'kull pożizzjoni bl-użu ta' adattament tas-softwer Weblogo16. Interessanti, sibna arrikkiment qawwi fir-residwi tal-gliċina fid-demm (Fig. 1g). Meta d-demm tqabbel ma' kloni magħżula mis-CSF, ġiet osservata għażla qawwija u xi tneħħija tal-għażla ta' motivi (Fig. 1f), u ċerti aċidi amminiċi kienu preferenzjalment preżenti f'pożizzjonijiet predeterminati fit-12-il membru (Fig. 1h). Notevolment, l-annimali individwali varjaw b'mod sinifikanti fil-fluwidu ċerebrospinali, filwaqt li l-arrikkiment tal-gliċina fid-demm ġie osservat fiż-żewġ annimali (Fig. Supplimentari 4a–j). Wara filtrazzjoni stretta tad-dejta tas-sekwenza fil-fluwidu ċerebrospinali tal-annimali #1.1 u #1.2, inkisbu total ta' 964 u 420 peptide uniku ta' 12-il mer (Fig. Supplimentari 1d–e). Il-kloni tal-faġi iżolati ġew amplifikati u soġġetti għal tieni rawnd ta' għażla in vivo. Il-faġi estratt mit-tieni rawnd ta' għażla ġie soġġett għal HTS f'kull annimal u l-peptidi kollha identifikati ntużaw bħala input għal programm ta' rikonoxximent ta' motivi biex jiġi analizzat l-okkorrenza ta' motivi ta' tripeptidi (Fig. 2a, b, ef). Meta mqabbel mal-ewwel ċiklu tal-faġ irkuprat mis-CSF, osservajna aktar għażla u degħażla ta' ħafna motivi fis-CSF fil-fergħat A u B (Fig. 2). Ġie applikat algoritmu ta' identifikazzjoni tan-netwerk biex jiġi determinat jekk jirrappreżentawx mudelli differenti ta' sekwenza konsistenti. Ġiet osservata similarità ċara bejn is-sekwenzi ta' 12-dimensjoni rkuprati mis-CSF fil-klad alternattiv A (Fig. 2c, d) u l-klad B (Fig. 2g, h). L-analiżi miġbura f'kull fergħa żvelat profili ta' għażla differenti għal peptidi ta' 12-mer (Fig. Supplimentari 5c,d) u żieda fil-proporzjon tat-titru CSF/demm maż-żmien għal kloni miġbura wara t-tieni rawnd ta' għażla meta mqabbel mal-ewwel rawnd ta' għażla (Fig. Supplimentari 5e). ).
Arrikkiment ta' motivi u peptidi fil-fluwidu ċerebrospinali permezz ta' żewġ rawnds suċċessivi ta' selezzjoni ta' wiri ta' faġi funzjonali in vivo.
Il-faġi kollha tal-fluwidu ċerebrospinali rkuprati mill-ewwel rawnd ta' kull annimal (annimali #1.1 u #1.2) ġew miġbura, amplifikati, sekwenzati bl-HT u injettati mill-ġdid flimkien (2 x 1010 faġi/annimal) 2 firien kannulati SM (#1.1 → #). 2.1 u 2.2, 1.2 → 2.3 u 2.4). (a,b,e,f) Scatterplots ta' korrelazzjoni li jqabblu l-frekwenza relattiva tal-motivi tat-tripeptidi tal-faġi kollha derivati ​​mis-CSF fl-ewwel u t-tieni rawnds ta' għażla. Frekwenza relattiva u distribuzzjoni tal-motivi li jirrappreżentaw it-tripeptidi kollha possibbli li jikkoinċidu misjuba fil-peptidi fiż-żewġ orjentazzjonijiet. In-numru ta' motivi misjuba f'1000 qari huwa muri. Il-motivi li ġew magħżula jew esklużi b'mod sinifikanti (p < 0.001) f'waħda mil-libreriji mqabbla huma enfasizzati b'tikek ħomor. (ċ, d, g, h) Rappreżentazzjoni tal-logo tas-sekwenza tas-sekwenzi twal kollha ta' 12-il aċidu amminiku rikki fis-CSF ibbażati fuq ir-rawnds 2 u 1 tal-għażla in vivo. Id-daqs tal-kodiċi ta' ittra waħda jindika kemm-il darba dak l-aċidu amminiku jseħħ f'dik il-pożizzjoni. Biex jiġi rappreżentat il-logo, il-frekwenza tas-sekwenzi tas-CSF estratti minn annimali individwali bejn żewġ rawnds tal-għażla hija mqabbla u s-sekwenzi arrikkiti fit-tieni rawnd huma murija: (ċ) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 u (h) #1.2–#2.4. L-aktar amino aċidi arrikkiti f'pożizzjoni partikolari fl-annimali (ċ, d) nru 2.1 u nru 2.2 jew (g, h) fl-annimali nru 2.3 u nru 2.4 huma murija bil-kulur. Aħdar = polari, vjola = newtrali, blu = bażiku, aħmar = aċiduż u iswed = amino aċidi idrofobiċi.
Wara t-tielet rawnd ta' selezzjoni, identifikajna 124 sekwenza peptidika unika (#3.1 u #3.2) minn 332 klonu tal-faġi rikostitwit mis-CSF iżolati minn żewġ annimali (Fig. Supplimentari 6a). Is-sekwenza LGSVS (18.7%) kellha l-ogħla proporzjon relattiv, segwita mill-inserzjonijiet tat-tip selvaġġ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), u SARGSWREIVSLS (2.2%). Fir-raba' rawnd finali, ġbarna flimkien żewġ fergħat magħżula b'mod indipendenti minn tliet annimali separati (Fig. 1c). Mid-925 klonu tal-faġi sekwenzat irkuprati mis-CSF, fir-raba' rawnd sibna 64 sekwenza peptidika unika (Fig. Supplimentari 6b), li fosthom il-proporzjon relattiv tal-faġi tat-tip selvaġġ niżel għal 0.8%. L-aktar kloni CSF komuni fir-raba' rawnd kienu LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) u RLSSVDSDLSGC (3.2%). Il-firxa tat-tul tal-peptidi magħżula hija dovuta għal inserzjonijiet/tħassir ta' nukleotidi jew kodons ta' waqfien prematuri fil-primers tal-librerija meta jintużaw kodons deġenerati għad-disinn tal-librerija NNK. Kodons ta' waqfien prematuri jiġġeneraw peptidi iqsar u jintgħażlu għax fihom il-motiv aa favorevoli. Peptidi itwal jistgħu jirriżultaw minn inserzjonijiet/tħassir fil-primers tal-libreriji sintetiċi. Dan ipoġġi l-kodon ta' waqfien iddisinjat barra l-qafas u jaqrah sakemm jidher kodon ta' waqfien ġdid 'l isfel. B'mod ġenerali, ikkalkulajna fatturi ta' arrikkiment għall-erba' rawnds ta' għażla billi qabbilna d-dejta tal-input mad-dejta tal-output tal-kampjun. Għall-ewwel rawnd ta' skrinjar, użajna titri ta' faġi tat-tip selvaġġ bħala referenza ta' sfond mhux speċifika. Interessanti, l-għażla negattiva tal-faġi kienet qawwija ħafna fl-ewwel ċiklu tas-CSF, iżda mhux fid-demm (Fig. 3a), li jista' jkun minħabba l-probabbiltà baxxa ta' diffużjoni passiva tal-biċċa l-kbira tal-membri tal-librerija tal-peptidi fil-kompartiment tas-CSF jew il-faġi relattivi għandhom it-tendenza li jinżammu jew jitneħħew mid-demm b'mod aktar effiċjenti milli l-batterjofaġi. Madankollu, fit-tieni rawnd ta' panning, ġiet osservata għażla qawwija ta' faġi fis-CSF fiż-żewġ kladi, li tissuġġerixxi li r-rawnd preċedenti kien arrikkit f'faġi li juru peptidi li jippromwovu l-assorbiment tas-CSF (Fig. 3a). Għal darb'oħra, mingħajr arrikkiment sinifikanti tad-demm. Ukoll fit-tielet u r-raba' rawnds, il-kloni tal-faġi ġew arrikkiti b'mod sinifikanti fis-CSF. Meta qabbilna l-frekwenza relattiva ta' kull sekwenza unika tal-peptidi bejn l-aħħar żewġ rawnds ta' għażla, sibna li s-sekwenzi kienu saħansitra aktar arrikkiti fir-raba' rawnd ta' għażla (Fig. 3b). Total ta' 931 motiv tripeptidiku ġew estratti mill-64 sekwenza unika tal-peptidi kollha bl-użu taż-żewġ orjentazzjonijiet tal-peptidi. L-aktar motivi arrikkiti fir-raba' rawnd ġew eżaminati aktar mill-qrib għall-profili ta' arrikkiment tagħhom fir-rawnds kollha meta mqabbla mal-librerija injettata (limitu: 10% arrikkiment) (Fig. Supplimentari 6c). Mudelli ġenerali ta' selezzjoni wrew li l-biċċa l-kbira tal-motivi studjati kienu arrikkiti fir-rawnds preċedenti kollha taż-żewġ fergħat ta' selezzjoni. Madankollu, xi motivi (eż. SGL, VSG, LGS GSV) kienu predominantement minn klad alternattiv A, filwaqt li oħrajn (eż. FGW, RTN, WGF, NTR) kienu arrikkiti fil-klad alternattiv B.
Validazzjoni tat-trasport tas-CSF ta' peptidi murija bil-faġi arrikkit bis-CSF u peptidi mexxejja bijotinilati konjugati ma' tagħbijiet ta' streptavidina.
(a) Proporzjonijiet ta' arrikkiment ikkalkulati fl-erba' rawnds kollha (R1-R4) ibbażati fuq titri tal-faġi (PFU) injettati (input = I) u titri tal-faġi tas-CSF determinati (output = O). Il-fatturi ta' arrikkiment għall-aħħar tliet rawnds (R2-R4) ġew ikkalkulati bi tqabbil mar-rawnd preċedenti u l-ewwel rawnd (R1) bid-dejta tal-piż. Il-vireg miftuħa huma l-fluwidu ċerebrospinali, il-vireg dellija huma l-plażma. (***p<0.001, ibbażat fuq it-test-t ta' Student). (b) Lista tal-peptidi tal-faġi l-aktar abbundanti, ikklassifikati skont il-proporzjon relattiv tagħhom għall-faġi kollha miġbura fis-CSF wara r-rawnd 4 tal-għażla. Is-sitt kloni tal-faġi l-aktar komuni huma enfasizzati bil-kulur, innumerati u l-fatturi ta' arrikkiment tagħhom bejn ir-rawnds 3 u 4 tal-għażla (insets). (c,d) Is-sitt kloni tal-faġi l-aktar arrikkiti, il-libreriji tal-peptidi tal-faġi vojta u tal-faġi ġenituri mir-rawnd 4 ġew analizzati individwalment f'mudell ta' teħid ta' kampjuni tas-CSF. Kampjuni tas-CSF u tad-demm inġabru fil-ħinijiet indikati. (ċ) Ammonti ugwali ta' 6 kloni tal-faġi kandidati (2 x 1010 faġi/annimali), faġi vojta (#1779) (2 x 1010 faġi/annimali) u libreriji tal-peptidi tal-faġi stokk (2 x 1012 faġi/annimali) Injetta mill-inqas 3 CM jingħata lill-annimal ikkannulat separatament permezz tal-vina tad-denb. Il-farmakokinetika tas-CSF ta' kull klonu tal-faġi injettat u librerija tal-peptidi tal-faġi maż-żmien hija murija. (d) juri l-proporzjon medju tas-CSF/demm għall-faġi/mL kollha rkuprati matul il-ħin tal-kampjunar. (e) Erba' peptidi mexxej sintetiċi u kontroll imħallat wieħed ġew marbuta mal-bijotina mal-streptavidina permezz tat-tarf N tagħhom (wiri tetramer) segwit minn injezzjoni (vina tad-denb iv, 10 mg streptavidina/kg). Mill-inqas tliet firien intubati (N = 3). ). Kampjuni tas-CSF inġabru fil-ħinijiet indikati u l-konċentrazzjonijiet ta' streptavidin tkejlu permezz ta' ELISA tas-CSF anti-streptavidin (nd = mhux skopert). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ibbażat fuq it-test ANOVA). (f) Paragun tas-sekwenza tal-aċidi amminiċi tal-klonu tal-peptid tal-faġi l-aktar arrikkit #2002 (vjola) ma' kloni oħra tal-peptid tal-faġi magħżula mir-4 rawnd tal-għażla. Frammenti ta' aċidi amminiċi identiċi u simili huma kkodifikati bil-kulur.
Mill-faġi arrikkiti kollha fir-raba' rawnd (Fig. 3b), sitt kloni kandidati ntgħażlu għal aktar analiżi individwali fil-mudell ta' teħid ta' kampjuni tas-CSF. Ammonti ugwali ta' sitt libreriji ta' faġi kandidati, faġi vojt (mingħajr inserzjoni) u peptidi tal-profaġi ġew injettati fi tliet annimali CM kannulati, u l-farmakokinetika ġiet determinata f'assaġġi tas-CSF (Fig. 3c) u tad-demm (Fig. Supplimentari 7). Il-kloni kollha tal-faġi ttestjati mmirati lejn il-kompartiment tas-CSF f'livell 10-1000 darba ogħla minn dak tal-faġi ta' kontroll vojt (#1779). Pereżempju, il-kloni #2020 u #2077 kellhom titri tas-CSF madwar 1000 darba ogħla mill-faġi ta' kontroll. Il-profil farmakokinetiku ta' kull peptid magħżul huwa differenti, iżda kollha kemm huma għandhom kapaċità għolja ta' ritorn lejn is-CSF. Osservajna tnaqqis kostanti maż-żmien għall-kloni #1903 u #2011, filwaqt li għall-kloni #2077, #2002 u #2009 żieda matul l-ewwel 10 minuti tista' tindika trasport attiv iżda teħtieġ li tiġi vverifikata. Il-kloni #2020, #2002, u #2077 stabbilizzaw ruħhom f'livelli għoljin, filwaqt li l-konċentrazzjoni tas-CSF tal-klonu #2009 naqset bil-mod wara ż-żieda inizjali. Imbagħad qabbilna l-frekwenza relattiva ta' kull kandidat tas-CSF mal-konċentrazzjoni tiegħu fid-demm (Fig. 3d). Il-korrelazzjoni tat-titru medju ta' kull kandidat tas-CSF mat-titru fid-demm tiegħu fil-ħinijiet kollha tat-teħid tal-kampjuni wriet li tlieta mis-sitt kandidati kienu arrikkiti b'mod sinifikanti fis-CSF fid-demm. Interessanti, il-klonu #2077 wera stabbiltà ogħla fid-demm (Figura Supplimentari 7). Biex nikkonfermaw li l-peptidi nfushom huma kapaċi jittrasportaw b'mod attiv merkanzija għajr partiċelli tal-faġi fil-kompartiment tas-CSF, sintetizzajna erba' peptidi ewlenin derivatizzati bil-bijotina fit-tarf N fejn il-peptidi jeħlu mal-partiċella tal-faġi. Peptidi bijotinilati (nri. 2002, 2009, 2020 u 2077) ġew konjugati ma' streptavidina (SA) biex jinkisbu forom multimeriċi li jimitaw xi ftit il-ġeometrija tal-faġi. Dan il-format ippermettielna wkoll li nkejlu l-espożizzjoni għall-SA fid-demm u fil-fluwidu ċerebrospinali bħala peptidi tal-proteini li jittrasportaw il-merkanzija. Importanti, id-dejta tal-faġi spiss setgħet tiġi riprodotta meta peptidi sintetiċi ngħataw f'dan il-format konjugat mal-SA (Fig. 3e). Il-peptidi mħallta kellhom inqas espożizzjoni inizjali u tneħħija aktar mgħaġġla tas-CSF b'livelli li ma jistgħux jiġu skoperti fi żmien 48 siegħa. Biex niksbu għarfien dwar il-mogħdijiet tal-kunsinna ta' dawn il-kloni tal-faġi peptidiċi fl-ispazju tas-CSF, analizzajna l-lokalizzazzjoni ta' hits individwali tal-peptidi tal-faġi bl-użu tal-immunoistokimika (IHC) biex niskopru direttament partiċelli tal-faġi siegħa wara injezzjoni ġol-vini in vivo. Ta' min jinnota li l-kloni #2002, #2077, u #2009 setgħu jiġu skoperti permezz ta' tebgħa qawwija fil-kapillari tal-moħħ, filwaqt li l-faġju ta' kontroll (#1779) u l-klonu #2020 ma ġewx skoperti (Figura Supplimentari 8). Dan jissuġġerixxi li dawn il-peptidi jikkontribwixxu għall-effett fuq il-moħħ preċiżament billi jaqsmu l-BBB. Hija meħtieġa aktar analiżi dettaljata biex tiġi ttestjata din l-ipoteżi, peress li r-rotta BSCFB tista' tkun involuta wkoll. Meta tqabbel is-sekwenza tal-aċidi amminiċi tal-klonu l-aktar arrikkit (#2002) ma' peptidi oħra magħżula, ġie nnutat li xi wħud minnhom għandhom estensjonijiet simili tal-aċidi amminiċi, li jistgħu jindikaw mekkaniżmu ta' trasport simili (Fig. 3f).
Minħabba l-profil uniku tiegħu fil-plażma u ż-żieda sinifikanti fis-CSF maż-żmien, il-klonu tal-wiri tal-faġi #2077 ġie esplorat aktar fuq perjodu itwal ta' 48 siegħa u kien kapaċi jirriproduċi ż-żieda rapida fis-CSF osservata f'assoċjazzjoni ma' livelli sostnuti ta' SA (Fig. 4a). Rigward kloni oħra tal-faġi identifikati, #2077 żebgħa b'mod qawwi għall-kapillari tal-moħħ u wera kolokalizzazzjoni sinifikanti bil-lectin tal-markatur kapillari meta deher b'riżoluzzjoni ogħla u possibilment xi tebgħa fl-ispazju parenkimali (Figura 4b). Biex ninvestigaw jekk effetti farmakoloġiċi medjati mill-peptidi jistgħux jinkisbu fis-CNS, wettaqna esperiment li fih verżjonijiet bijotinilati ta' i) il-peptid tat-transitu #2077 u ii) il-peptid tal-inibitur BACE1 tħalltu ma' SA f'żewġ proporzjonijiet differenti. Għal kombinazzjoni waħda użajna biss l-inibitur tal-peptid BACE1 u għall-oħra użajna proporzjon ta' 1:3 tal-inibitur tal-peptid BACE1 għall-peptid #2077. Iż-żewġ kampjuni ngħataw ġol-vina u l-livelli tad-demm u tal-fluwidu ċerebrospinali tal-beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) tkejlu maż-żmien. Abeta40 tkejjel fis-CSF peress li jirrifletti l-inibizzjoni tal-BACE1 fil-parenkima tal-moħħ. Kif mistenni, iż-żewġ kumplessi naqqsu b'mod sinifikanti l-livelli tad-demm ta' Abeta40 (Fig. 4c, d). Madankollu, kampjuni biss li fihom taħlita tal-peptide nru 2077 u inibitur tal-peptide BACE1 konjugat ma' SA kkawżaw tnaqqis sinifikanti f'Abeta40 fil-fluwidu ċerebrospinali (Fig. 4c). Id-dejta turi li l-peptide nru 2077 huwa kapaċi jittrasporta l-proteina SA ta' 60 kDa fis-CNS u jikkaġuna wkoll effetti farmakoloġiċi b'inibituri konjugati ma' SA tal-peptide BACE1.
(a) Injezzjoni klonali (2 × 10 faġi/annimal) ta' faġ T7 li turi profili farmakokinetiċi fit-tul tal-peptid CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) u faġ ta' kontroll mhux injettat (#1779) f'mill-inqas tliet firien intubati b'CM. (b) Immaġni mikroskopika konfokali ta' mikrovini kortikali rappreżentattivi fi firien injettati bil-faġ (2 × 10 10 faġi/annimal) li turi kontra-tebgħa tal-peptid #2077 u vini (lectin). Dawn il-kloni tal-faġ ingħataw lil 3 firien u tħallew jiċċirkolaw għal siegħa qabel il-perfużjoni. L-imħuħ ġew sezzjonati u mtebbgħin b'antikorpi poliklonali mmarkati b'FITC kontra l-kapsid tal-faġ T7. Għaxar minuti qabel il-perfużjoni u l-iffissar sussegwenti, lectin immarkat b'DyLight594 ingħata ġol-vini. Stampi fluworexxenti li juru tbajja' tal-lectin (aħmar) tan-naħa luminali tal-mikrovini u l-faġi (aħdar) fil-lumen tal-kapillari u t-tessut perivaskulari tal-moħħ. L-iskala tikkorrispondi għal 10 µm. (c, d) Il-peptid inibitorju bijotinilat BACE1 waħdu jew flimkien mal-peptid ta' transitu bijotinilat #2077 ġie akkoppjat ma' streptavidina segwit minn injezzjoni ġol-vini ta' mill-inqas tliet firien CM kannulati (10 mg streptavidina/kg). It-tnaqqis fl-Aβ40 medjat mill-inibitur tal-peptid BACE1 tkejjel permezz ta' Aβ1-40 ELISA fid-demm (aħmar) u fil-fluwidu ċerebrospinali (oranġjo) fil-punti ta' żmien indikati. Għal ċarezza aħjar, linja bit-tikek hija mpinġija fuq il-graff fuq skala ta' 100%. (ċ) Tnaqqis perċentwali fl-Aβ40 fid-demm (trijangoli ħomor) u fil-fluwidu ċerebrospinali (trijangoli oranġjo) fil-firien ittrattati bi streptavidina konjugata ma' transit peptide #2077 u peptide inibitorju BACE1 fi proporzjon ta' 3:1. (d) Tnaqqis perċentwali fl-Aβ40 fid-demm (ċrieki ħomor) u fil-fluwidu ċerebrospinali (ċrieki oranġjo) tal-firien ittrattati bi streptavidina akkoppjata ma' peptide inibitorju BACE1 biss. Il-konċentrazzjoni ta' Aβ fil-kontroll kienet ta' 420 pg/ml (devjazzjoni standard = 101 pg/ml).
Il-wiri tal-faġi ġie applikat b'suċċess f'diversi oqsma tar-riċerka bijomedika17. Dan il-metodu ntuża għal studji in vivo dwar id-diversità vaskulari18,19 kif ukoll studji mmirati lejn vini ċerebrali20,21,22,23,24,25,26. F'dan l-istudju, estendejna l-applikazzjoni ta' dan il-metodu ta' selezzjoni mhux biss għall-identifikazzjoni diretta ta' peptidi li jimmiraw lejn vini ċerebrali, iżda wkoll għall-iskoperta ta' kandidati bi proprjetajiet ta' trasport attiv biex jaqsmu l-barriera bejn id-demm u l-moħħ. Issa niddeskrivu l-iżvilupp ta' proċedura ta' selezzjoni in vivo fi firien intubati CM u nuru l-potenzjal tagħha li tidentifika peptidi bi proprjetajiet ta' homing tas-CSF. Bl-użu tal-faġi T7 li juri librerija ta' peptidi każwali ta' 12-mer, stajna nuru li l-faġi T7 huwa żgħir biżżejjed (madwar 60 nm fid-dijametru)10 biex jiġi adattat għall-barriera bejn id-demm u l-moħħ, u b'hekk jaqsam direttament il-barriera bejn id-demm u l-moħħ jew il-plexus koroidali. Osservajna li l-ġbir tas-CSF minn firien CM kannulati kien metodu ta' skrinjar funzjonali in vivo kkontrollat ​​sew, u li l-faġ estratt mhux biss ingħaqad mal-vaskulatura iżda wkoll iffunzjona bħala trasportatur tul il-barriera bejn id-demm u l-moħħ. Barra minn hekk, billi ġbarna d-demm u applikajna HTS simultanjament għas-CSF u l-faġijiet derivati ​​mid-demm, ikkonfermajna li l-għażla tagħna tas-CSF ma kinitx influwenzata mill-arrikkiment tad-demm jew l-idoneità għall-espansjoni bejn ir-rawnds ta' selezzjoni. Madankollu, il-kompartiment tad-demm huwa parti mill-proċedura ta' selezzjoni, peress li l-faġijiet kapaċi jilħqu l-kompartiment tas-CSF iridu jgħixu u jiċċirkolaw fid-demm għal żmien twil biżżejjed biex jarrikkixxu lilhom infushom fil-moħħ. Sabiex tiġi estratta informazzjoni affidabbli dwar is-sekwenza mid-dejta mhux ipproċessata tal-HTS, implimentajna filtri adattati għal żbalji ta' sekwenzjar speċifiċi għall-pjattaforma fil-fluss tax-xogħol tal-analiżi. Billi inkorporajna parametri kinetiċi fil-metodu ta' skrinjar, ikkonfermajna l-farmakokinetika rapida tal-faġijiet T7 tat-tip selvaġġ (t½ ~ 28 min) fid-demm24, 27, 28 u ddeterminajna wkoll il-half-life tagħhom fil-fluwidu ċerebrospinali (t½ ~ 26 min) kull minuta). Minkejja profili farmakokinetiċi simili fid-demm u s-CSF, 0.001% biss tal-konċentrazzjoni tal-faġ fid-demm setgħet tiġi skoperta fis-CSF, li jindika mobilità baxxa fl-isfond tal-faġ T7 tat-tip selvaġġ tul il-barriera bejn id-demm u l-moħħ. Dan ix-xogħol jenfasizza l-importanza tal-ewwel rawnd ta' selezzjoni meta jintużaw strateġiji ta' panning in vivo, speċjalment għal sistemi ta' faġ li jitneħħew malajr miċ-ċirkolazzjoni, peress li ftit kloni jistgħu jilħqu l-kompartiment tas-CNS. Għalhekk, fl-ewwel rawnd, it-tnaqqis fid-diversità tal-librerija kien kbir ħafna, peress li numru limitat biss ta' kloni eventwalment inġabru f'dan il-mudell strett ħafna tas-CSF. Din l-istrateġija ta' panning in vivo inkludiet diversi passi ta' selezzjoni bħall-akkumulazzjoni attiva fil-kompartiment tas-CSF, is-sopravivenza tal-kloni fil-kompartiment tad-demm, u t-tneħħija rapida tal-kloni tal-faġ T7 mid-demm fl-ewwel 10 minuti (Fig. 1d u Fig. Supplimentari 4M). Għalhekk, wara l-ewwel rawnd, ġew identifikati kloni ta' faġ differenti fis-CSF, għalkemm l-istess ġabra inizjali ntużat għal annimali individwali. Dan jissuġġerixxi li passi multipli ta' selezzjoni stretta għal libreriji sors b'għadd kbir ta' membri tal-librerija jirriżultaw fi tnaqqis sinifikanti fid-diversità. Għalhekk, avvenimenti każwali jsiru parti integrali mill-proċess ta' selezzjoni inizjali, u jinfluwenzaw ħafna r-riżultat. X'aktarx li ħafna mill-kloni fil-librerija oriġinali kellhom propensità ta' arrikkiment tas-CSF simili ħafna. Madankollu, anke taħt l-istess kundizzjonijiet sperimentali, ir-riżultati tal-għażla jistgħu jvarjaw minħabba l-għadd żgħir ta' kull klonu partikolari fil-ġabra inizjali.
Il-motivi arrikkiti fis-CSF huma differenti minn dawk fid-demm. Interessanti, innutajna l-ewwel bidla lejn peptidi rikki fil-gliċina fid-demm ta' annimali individwali. (Fig. 1g, Figuri Supplimentari 4e, 4f). Il-faġju li fih peptidi tal-gliċina jista' jkun aktar stabbli u anqas probabbli li jitneħħa miċ-ċirkolazzjoni. Madankollu, dawn il-peptidi rikki fil-gliċina ma nstabux fil-kampjuni tal-fluwidu ċerebrospinali, li jissuġġerixxi li l-libreriji kkurati għaddew minn żewġ passi ta' selezzjoni differenti: wieħed fid-demm u ieħor permess li jakkumula fil-fluwidu ċerebrospinali. Il-kloni arrikkiti bis-CSF li rriżultaw mir-raba' rawnd ta' selezzjoni ġew ittestjati b'mod estensiv. Kważi l-kloni kollha ttestjati individwalment ġew ikkonfermati li huma arrikkiti fis-CSF meta mqabbla mal-faġju ta' kontroll vojt. Peptide wieħed milqut (#2077) ġie eżaminat f'aktar dettall. Wera half-life itwal fil-plażma meta mqabbel ma' riżultati oħra (Figura 3d u Figura Supplimentari 7), u interessanti, dan il-peptide kien fih residwu ta' ċisteina fit-tarf C. Riċentement intwera li ż-żieda ta' cysteine ​​​​mal-peptidi tista' ttejjeb il-proprjetajiet farmakokinetiċi tagħhom billi torbot mal-albumina 29. Dan bħalissa mhux magħruf għall-peptide #2077 u jeħtieġ aktar studju. Xi peptidi wrew dipendenza mill-valenza fl-arrikkiment tas-CSF (dejta mhux murija), li tista' tkun relatata mal-ġeometrija tal-wiċċ murija tal-kapsid T7. Is-sistema T7 li użajna wriet 5-15 kopja ta' kull peptide għal kull partiċella tal-faġ. L-IHC twettqet fuq kloni tal-faġ ewlieni kandidati injettati ġol-vina fil-kortiċi ċerebrali tal-firien (Fig. Supplimentari 8). Id-dejta wriet li mill-inqas tliet kloni (Nru 2002, Nru 2009 u Nru 2077) interagixxew mal-BBB. Għad irid jiġi determinat jekk din l-interazzjoni tal-BBB tirriżultax fl-akkumulazzjoni tas-CSF jew fil-moviment ta' dawn il-kloni direttament lejn il-BCSFB. Importanti, nuru li l-peptidi magħżula jżommu l-kapaċità tat-trasport tas-CSF tagħhom meta jiġu sintetizzati u marbuta mal-merkanzija tal-proteini. L-irbit ta' peptidi bijotinilati N-terminali ma' SA essenzjalment jirrepeti r-riżultati miksuba bil-kloni tal-faġi rispettivi tagħhom fid-demm u l-fluwidu ċerebrospinali (Fig. 3e). Fl-aħħarnett, nuru li l-peptide ewlieni #2077 huwa kapaċi jippromwovi l-azzjoni fil-moħħ ta' inibitur tal-peptidi bijotinilat ta' BACE1 konjugat ma' SA, u jikkawża effetti farmakodinamiċi qawwija fis-CNS billi jnaqqas b'mod sinifikanti l-livelli ta' Abeta40 fis-CSF (Fig. 4). Ma stajniex nidentifikaw xi omoloġi fid-database billi wettaqna tfittxija ta' omoloġija tas-sekwenza tal-peptidi tal-hits kollha. Huwa importanti li wieħed jinnota li d-daqs tal-librerija T7 huwa madwar 109, filwaqt li d-daqs teoretiku tal-librerija għal 12-mers huwa 4 x 1015. Għalhekk, għażilna biss frazzjoni żgħira tal-ispazju tad-diversità tal-librerija tal-peptidi 12-mer, li jista' jfisser li peptidi aktar ottimizzati jistgħu jiġu identifikati billi jiġi evalwat l-ispazju tas-sekwenza biswit ta' dawn il-hits identifikati. Ipotetikament, waħda mir-raġunijiet għaliex ma sibna l-ebda omologi naturali ta' dawn il-peptidi tista' tkun id-deselezzjoni matul l-evoluzzjoni biex tipprevjeni d-dħul bla kontroll ta' ċerti motivi peptidiċi fil-moħħ.
Meħuda flimkien, ir-riżultati tagħna jipprovdu bażi għal xogħol futur biex jiġu identifikati u kkaratterizzati s-sistemi ta' trasport tal-barriera ċerebrovaskulari in vivo f'aktar dettall. L-istruttura bażika ta' dan il-metodu hija bbażata fuq strateġija ta' selezzjoni funzjonali li mhux biss tidentifika kloni bi proprjetajiet ta' rbit vaskulari ċerebrali, iżda tinkludi wkoll pass kritiku fejn kloni ta' suċċess ikollhom attività intrinsika biex jaqsmu l-ostakli bijoloġiċi in vivo fil-kompartiment tas-CNS. L-għan huwa li jiġi ċċarat il-mekkaniżmu tat-trasport ta' dawn il-peptidi u l-preferenza tagħhom għall-irbit mal-mikrovaskulatura speċifika għar-reġjun tal-moħħ. Dan jista' jwassal għall-iskoperta ta' mogħdijiet ġodda għat-trasport tal-BBB u r-riċetturi. Nistennew li l-peptidi identifikati jistgħu jorbtu direttament mar-riċetturi ċerebrovaskulari jew ma' ligandi li jiċċirkolaw ittrasportati permezz tal-BBB jew il-BCSFB. Il-vetturi peptidiċi b'attività ta' trasport tas-CSF skoperti f'dan ix-xogħol se jiġu investigati aktar. Bħalissa qed ninvestigaw l-ispeċifiċità tal-moħħ ta' dawn il-peptidi għall-abbiltà tagħhom li jaqsmu l-BBB u/jew il-BCSFB. Dawn il-peptidi ġodda se jkunu għodod estremament siewja għall-iskoperta potenzjali ta’ riċetturi jew mogħdijiet ġodda u għall-iżvilupp ta’ pjattaformi ġodda effiċjenti ħafna għall-kunsinna ta’ makromolekuli, bħal bijoloġiċi, lill-moħħ.
Ikkanula ċ-ċisterna l-kbira (CM) billi tuża modifika tal-metodu deskritt qabel. Firien Wistar anestetizzati (200-350 g) ġew immuntati fuq apparat stereotassiku u saret inċiżjoni medjana fuq il-qorriegħa mqaxxra u ppreparata asettikament biex tesponi l-kranju. Ħaffer żewġ toqob fiż-żona tal-parti ta' fuq tal-kanna u waħħal il-viti tat-twaħħil fit-toqob. Toqba addizzjonali ġiet imtaqqba fil-kresta oċċipitali laterali għall-gwida stereotattika ta' kannula tal-istainless steel fis-CM. Applika siment dentali madwar il-kannula u waħħalha bil-viti. Wara l-foto-kura u t-twebbis tas-siment, il-ferita tal-ġilda ngħalqet b'sutura supramid 4/0. It-tqegħid xieraq tal-kannula huwa kkonfermat minn tnixxija spontanja ta' fluwidu ċerebrospinali (CSF). Neħħi l-far mill-apparat stereotassiku, irċievi kura postoperattiva u mmaniġġjar tal-uġigħ xierqa, u ħallih jirkupra għal mill-inqas ġimgħa sakemm jiġu osservati sinjali ta' demm fil-fluwidu ċerebrospinali. Il-firien Wistar (Crl:WI/Han) inkisbu minn Charles River (Franza). Il-firien kollha nżammu taħt kundizzjonijiet speċifiċi ħielsa minn patoġeni. L-esperimenti kollha fuq l-annimali ġew approvati mill-Uffiċċju Veterinarju tal-Belt ta' Basel, l-Iżvizzera, u twettqu skont il-Liċenzja tal-Annimali Nru. 2474 (Valutazzjoni tat-Trasport Attiv tal-Moħħ billi Jitkejlu l-Livelli ta' Kandidati Terapewtiċi fil-Fluwidu Ċerebrospinali u l-Moħħ tal-Firien).
Żomm il-far konxju bil-mod bil-kannula CM f'idejk. Neħħi d-Datura mill-kannula u iġbor 10 µl ta' fluwidu ċerebrospinali li jiċċirkola spontanjament. Peress li l-permeabilità tal-kannula fl-aħħar mill-aħħar ġiet kompromessa, f'dan l-istudju ġew inklużi biss kampjuni ċari ta' fluwidu ċerebrospinali mingħajr evidenza ta' kontaminazzjoni tad-demm jew tibdil fil-kulur. B'mod parallel, madwar 10–20 μl ta' demm ittieħdu minn inċiżjoni żgħira fil-ponta tad-denb f'tubi bl-eparina (Sigma-Aldrich). Is-CSF u d-demm inġabru f'diversi punti ta' żmien wara injezzjoni ġol-vini tal-fagu T7. Madwar 5–10 μl ta' fluwidu tneħħew qabel ma nġabar kull kampjun tas-CSF, li jikkorrispondi għall-volum mejjet tal-kateter.
Il-libreriji ġew iġġenerati bl-użu tal-vettur T7Select 10-3b kif deskritt fil-manwal tas-sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Fil-qosor, inserzjoni każwali tad-DNA ta' 12-il mer ġiet sintetizzata fil-format li ġej:
Il-kodon NNK intuża biex jiġu evitati kodons doppji ta' waqfien u espressjoni żejda ta' amino acid fl-inserit. N huwa proporzjon ekwimolari mħallat manwalment ta' kull nukleotide, u K huwa proporzjon ekwimolari mħallat manwalment ta' nukleotidi ta' adenina u ċitosina. Reġjuni b'fergħa waħda ġew konvertiti għal DNA b'fergħa doppja permezz ta' aktar inkubazzjoni b'dNTP (Novagen) u enzima Klenow (New England Biolabs) f'buffer Klenow (New England Biolabs) għal 3 sigħat f'37°C. Wara r-reazzjoni, DNA b'fergħa doppja ġie rkuprat permezz ta' preċipitazzjoni bl-EtOH. Id-DNA li rriżulta ġie diġerit bl-enzimi ta' restrizzjoni EcoRI u HindIII (it-tnejn minn Roche). L-inserit maqsum u purifikat (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) imbagħad ġie ligat fil-qafas f'vettur T7 maqsum minn qabel wara l-amino acid 348 tal-ġene tal-kapsid 10B. Ir-reazzjonijiet ta' ligazzjoni ġew inkubati f'16°C għal 18-il siegħa qabel l-ippakkjar in vitro. L-ippakkjar tal-faġi in vitro twettaq skont l-istruzzjonijiet fornuti mal-kit tal-klonazzjoni T7Select 10-3b (Novagen) u s-soluzzjoni tal-ippakkjar ġiet amplifikata darba għal-liżi bl-użu ta' Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Il-lisati ġew ċentrifugati, ittrati u ffriżati f'-80°C bħala soluzzjoni stokk ta' gliċerol.
Amplifikazzjoni diretta tal-PCR tar-reġjuni varjabbli tal-faġi amplifikati fil-brodu jew pjanċa bl-użu ta' primers ta' fużjoni 454/Roche-amplicon proprjetarji. Il-primer ta' fużjoni 'l quddiem fih sekwenzi li jdawru r-reġjun varjabbli (NNK) 12 (speċifiku għat-template), GS FLX Titanium Adapter A, u sekwenza ewlenija tal-librerija b'erba' bażijiet (TCAG) (Figura Supplimentari 1a):
Il-primer tal-fużjoni inversa fih ukoll bijotina mwaħħla ma' żibeġ tal-qbid u l-GS FLX Titanium Adapter B meħtieġ għall-amplifikazzjoni klonali waqt il-PCR tal-emulsjoni:
L-amplikoni mbagħad ġew soġġetti għal pirosekwenzar 454/Roche skont il-protokoll 454 GS-FLX Titanium. Għas-sekwenzar manwali ta' Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), id-DNA tal-faġi T7 ġie amplifikat permezz ta' PCR u sekwenzat bil-pari ta' primers li ġejjin:
L-inserzjonijiet minn plakki individwali ġew soġġetti għal amplifikazzjoni tal-PCR bl-użu tar-Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur). Agħmel hot start (10 min f'95 °C) u 35 ċiklu ta' spinta (50 s f'95 °C, 1 min f'50 °C, u 1 min f'72 °C).
Faġi minn libreriji, faġi tat-tip selvaġġ, faġi salvati mis-CSF u mid-demm, jew kloni individwali ġew amplifikati f'Escherichia coli BL5615 f'brodu tat-TB (Sigma Aldrich) jew fi platti ta' 500 cm2 (Thermo Scientific) għal 4 sigħat f'37°C. Il-faġi ġew estratti mill-pjanċi billi tlaħalħu l-pjanċi b'buffer Tris-EDTA (Fluka Analytical) jew billi nġabru l-plakki b'ponot sterili tal-pipetti. Il-faġi ġew iżolati mis-supernatant tal-kultura jew minn buffer ta' estrazzjoni b'rawnd wieħed ta' preċipitazzjoni tal-polietilen glikol (PEG 8000) (Promega) u sospiżi mill-ġdid f'buffer Tris-EDTA.
Il-faġ amplifikat ġie soġġett għal 2-3 rawnds ta’ tneħħija ta’ endotossini bl-użu ta’ żibeġ għat-tneħħija ta’ endotossini (Miltenyi Biotec) qabel l-injezzjoni ġol-vini (IV) (500 μl/annimal). Fl-ewwel rawnd, ġew introdotti 2×1012 faġ; fit-tieni, 2×1010 faġ; fit-tielet u r-raba’ rawnds ta’ selezzjoni, 2×109 faġ għal kull annimal. Il-kontenut tal-faġ fis-CSF u l-kampjuni tad-demm miġbura fil-punti ta’ żmien indikati ġie determinat permezz tal-għadd tal-plakka skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur (manwal tas-sistema T7Select). L-għażla tal-faġ twettqet permezz ta’ injezzjoni ġol-vini ta’ libreriji purifikati fil-vina tad-denb jew permezz ta’ injezzjoni mill-ġdid ta’ faġ estratt mis-CSF mir-rawnd ta’ selezzjoni preċedenti, u l-ħsad sussegwenti sar wara 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min, u 240 min rispettivament kampjuni tas-CSF u tad-demm. Saru total ta' erba' rawnds ta' panning in vivo fejn iż-żewġ fergħat magħżula nħażnu separatament u ġew analizzati matul l-ewwel tliet rawnds ta' selezzjoni. L-inserzjonijiet kollha tal-faġi estratti mis-CSF mill-ewwel żewġ rawnds ta' selezzjoni ġew soġġetti għal pirosekwenzar 454/Roche, filwaqt li l-kloni kollha estratti mis-CSF mill-aħħar żewġ rawnds ta' selezzjoni ġew sekwenzati manwalment. Il-faġi tad-demm kollha mill-ewwel rawnd ta' selezzjoni ġew soġġetti wkoll għal pirosekwenzar 454/Roche. Għall-injezzjoni tal-kloni tal-faġi, il-faġi magħżula ġew amplifikati f'E. coli (BL5615) fuq pjanċi ta' 500 cm2 f'37°C għal 4 sigħat. Kloni magħżula individwalment u sekwenzati manwalment ġew propagati f'mezz TB. Wara l-estrazzjoni tal-faġi, il-purifikazzjoni u t-tneħħija tal-endotossina (kif deskritt hawn fuq), 2×1010 faġi/annimal fi 300 μl ġew injettati ġol-vina f'vina waħda tad-denb.
Preproċessar u filtrazzjoni kwalitattiva tad-dejta tas-sekwenza. Id-dejta mhux ipproċessata 454/Roche ġiet konvertita minn format binarju standard ta' mappa tal-fluss (sff) għal format li jinqara mill-bniedem ta' Pearson (fasta) bl-użu ta' softwer tal-bejjiegħ. Aktar ipproċessar tas-sekwenza tan-nukleotidi twettaq bl-użu ta' programmi u skripts proprjetarji C (pakkett ta' softwer mhux rilaxxat) kif deskritt hawn taħt. L-analiżi tad-dejta primarja tinkludi proċeduri stretti ta' filtrazzjoni f'diversi stadji. Biex jiġu ffiltrati l-qari li ma kienx fih sekwenza valida ta' DNA b'inserzjoni ta' 12-il mer, il-qari ġie allinjat sekwenzjalment mat-tikketta tal-bidu (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), it-tikketta tal-waqfien (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) u l-inserzjoni tal-isfond (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) bl-użu tat-test globali ta' Needleman-Wunsch. Allinjament li jippermetti sa 2 inkonsistenzi għal kull allinjament31. Għalhekk, qari mingħajr tikketti tal-bidu u tal-waqfien u qari li fih inserzjonijiet tal-isfond, jiġifieri, allinjamenti li jaqbżu n-numru permess ta' żbalji fl-approssimazzjoni, tneħħew mil-librerija. Fir-rigward tal-qari li fadal, is-sekwenza tad-DNA N-mer li testendi mill-marka tal-bidu u tispiċċa qabel il-marka tal-waqfien ġiet eċiża mis-sekwenza oriġinali tal-qari u pproċessata aktar (minn hawn 'il quddiem imsejħa "inserzjoni"). Wara t-traduzzjoni tal-inserzjoni, il-porzjon wara l-ewwel kodon tal-waqfien fit-tarf 5′ tal-primer jitneħħa mill-inserzjoni. Barra minn hekk, in-nukleotidi li jwasslu għal kodons mhux kompluti fit-tarf 3′ tal-primer tneħħew ukoll. Biex jiġu esklużi l-inserzjonijiet li fihom biss sekwenzi tal-isfond, l-inserzjonijiet tradotti li jibdew bil-mudell tal-aċidu amminiċi "PAG" tneħħew ukoll. Il-peptidi b'tul post-traduzzjonali ta' inqas minn 3 aċidi amminiċi tneħħew mil-librerija. Fl-aħħarnett, neħħi r-redundanza fil-ġabra tal-inserzjonijiet u ddetermina l-frekwenza ta' kull inserzjoni unika. Ir-riżultati ta' din l-analiżi inkludew lista ta' sekwenzi ta' nukleotidi (inserzjonijiet) u l-frekwenzi (tal-qari) tagħhom (Figuri Supplimentari 1c u 2).
Inserzjonijiet tad-DNA N-mer tal-grupp skont ix-xebh fis-sekwenza: Biex jiġu eliminati żbalji fis-sekwenzar speċifiċi għal 454/Roche (bħal problemi b'estensjonijiet ta' omopolimeri tas-sekwenzar) u jitneħħew redundanzajiet inqas importanti, l-inserzjonijiet (inserzjonijiet) tas-sekwenza tad-DNA N-mer iffiltrati qabel huma magħżula skont ix-xebh. inserzjonijiet (sa 2 bażijiet li ma jaqblux huma permessi) bl-użu ta' algoritmu iterattiv definit kif ġej: l-inserzjonijiet huma magħżula l-ewwel skont il-frekwenza tagħhom (l-ogħla għall-inqas), u jekk huma l-istess, skont it-tqassim sekondarju tagħhom skont it-tul (l-itwal għall-iqsar)). Għalhekk, l-aktar inserzjonijiet frekwenti u l-itwal jiddefinixxu l-ewwel "grupp". Il-frekwenza tal-grupp hija ssettjata għall-frekwenza ewlenija. Imbagħad, kull inserzjoni li tibqa' fil-lista magħżula ġiet ippruvata biex tiżdied mal-grupp permezz ta' allinjament Needleman-Wunsch f'pari. Jekk in-numru ta' nuqqas ta' qbil, inserzjonijiet, jew tħassir f'allinjament ma jaqbiżx limitu ta' 2, inserzjoni tiżdied mal-grupp, u l-frekwenza ġenerali tal-grupp tiżdied b'kemm-il darba ġiet miżjuda l-inserzjoni. L-inserzjonijiet miżjuda ma' grupp huma mmarkati bħala użati u esklużi minn aktar ipproċessar. Jekk is-sekwenza tal-inserzjoni ma tistax tiżdied ma' grupp diġà eżistenti, is-sekwenza tal-inserzjoni tintuża biex toħloq grupp ġdid bil-frekwenza tal-inserzjoni xierqa u mmarkata bħala użata. L-iterazzjoni tintemm meta kull sekwenza ta' inserzjoni tkun jew intużat biex tifforma grupp ġdid jew tista' tiġi inkluża fi grupp diġà eżistenti. Wara kollox, l-inserzjonijiet miġbura li jikkonsistu minn nukleotidi eventwalment jiġu tradotti f'sekwenzi ta' peptidi (libreriji ta' peptidi). Ir-riżultat ta' din l-analiżi huwa sett ta' inserzjonijiet u l-frekwenzi korrispondenti tagħhom li jiffurmaw in-numru ta' qari konsekuttiv (Fig. Supplimentari 2).
Ġenerazzjoni ta' Motivi: Abbażi ta' lista ta' peptidi uniċi, inħolqot librerija li fiha l-mudelli kollha possibbli ta' aċidi amminiċi (aa) kif muri hawn taħt. Kull mudell possibbli ta' tul 3 ġie estratt mill-peptid u l-mudell invers tiegħu ġie miżjud flimkien ma' librerija ta' motivi komuni li fiha l-mudelli kollha (tripeptidi). Libreriji ta' motivi ripetittivi ħafna ġew sekwenzati u r-redundanza tneħħiet. Imbagħad, għal kull tripeptide fil-librerija tal-motivi, ivverifikajna l-preżenza tiegħu fil-librerija bl-użu ta' għodod komputazzjonali. F'dan il-każ, il-frekwenza tal-peptide li fih it-tripeptide tal-motiv misjub hija miżjuda u assenjata lill-motiv fil-librerija tal-motivi ("numru ta' motivi"). Ir-riżultat tal-ġenerazzjoni tal-motivi huwa firxa bidimensjonali li fiha l-okkorrenzi kollha tat-tripeptidi (motivi) u l-valuri rispettivi tagħhom, li huma n-numru ta' qari ta' sekwenzar li jirriżulta fil-motiv korrispondenti meta l-qari jiġi ffiltrat, miġbur, u tradott. Metriċi kif deskritt fid-dettall hawn fuq.
Normalizzazzjoni tan-numru ta' motivi u l-isparġimenti korrispondenti: In-numru ta' motivi għal kull kampjun ġie normalizzat bl-użu ta'
Fejn ni huwa n-numru ta' qari li fih is-suġġett i. Għalhekk, vi jirrappreżenta l-perċentwal tal-frekwenza tal-qari (jew peptidi) li fihom il-motiv i fil-kampjun. Il-valuri P għan-numru mhux normalizzat ta' motivi ġew ikkalkulati bl-użu tat-test eżatt ta' Fisher. Rigward il-korrelogrammi tan-numru ta' motivi, il-korrelazzjonijiet ta' Spearman ġew ikkalkulati bl-użu tan-numru normalizzat ta' motivi b'R.
Biex jiġi viżwalizzat il-kontenut tal-aċidi amminiċi f'kull pożizzjoni fil-librerija tal-peptidi, inħolqu l-logogrammi tal-web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). L-ewwel, il-kontenut tal-aċidi amminiċi f'kull pożizzjoni tal-peptid ta' 12-il mer huwa maħżun f'matriċi ta' 20×12. Imbagħad, sett ta' 1000 peptid li fihom l-istess kontenut relattiv tal-aċidu amminiċi f'kull pożizzjoni huwa ġġenerat fil-format ta' fasta-sequence u pprovdut bħala input għal web-logo 3, li jiġġenera rappreżentazzjoni grafika tal-kontenut relattiv tal-aċidu amminiċi f'kull pożizzjoni għal librerija tal-peptidi partikolari. Biex jiġu viżwalizzati settijiet ta' dejta multidimensjonali, inħolqu mapep tas-sħana bl-użu ta' għodda żviluppata internament f'R (biosHeatmap, pakkett R li għadu ma ġiex rilaxxat). Id-dendrogrammi ppreżentati fil-mapep tas-sħana ġew ikkalkulati bl-użu tal-metodu ta' raggruppament ġerarkiku ta' Ward bil-metrika tad-distanza Euclidean. Għall-analiżi statistika tad-dejta tal-punteġġ tal-motivi, il-valuri P għall-punteġġ mhux normalizzat ġew ikkalkulati bl-użu tat-test eżatt ta' Fisher. Il-valuri P għal settijiet ta' dejta oħra ġew ikkalkulati f'R bl-użu tat-test t ta' Student jew ANOVA.
Kloni tal-faġi magħżula u faġi mingħajr inserzjonijiet ġew injettati ġol-vina permezz tal-vina tad-denb (2×1010 faġi/annimal fi 300 μl PBS). Għaxar minuti qabel il-perfużjoni u l-iffissar sussegwenti, l-istess annimali ġew injettati ġol-vina b'100 μl ta' leċina mmarkata b'DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minuta wara l-injezzjoni tal-faġi, il-firien ġew perfużi mill-qalb b'50 ml PBS segwit minn 50 ml 4% PFA/PBS. Il-kampjuni tal-moħħ ġew iffissati wkoll matul il-lejl f'4% PFA/PBS u mxarrba fi 30% sukrożju matul il-lejl f'4°C. Il-kampjuni huma ffriżati malajr fit-taħlita tal-OCT. Analiżi immunoistokimika ta' kampjuni ffriżati twettqet f'temperatura tal-kamra fuq krijosezzjonijiet ta' 30 µm imblukkati b'1% BSA u inkubati b'antikorpi poliklonali mmarkati b'FITC kontra l-fagu T7 (Novus NB 600-376A) f'4 °C. Inkuba matul il-lejl. Fl-aħħar, is-sezzjonijiet inħaslu 3 darbiet bil-PBS u ġew eżaminati b'mikroskopju konfokali bil-lejżer (Leica TCS SP5).
Il-peptidi kollha b'purità minima ta' 98% ġew sintetizzati minn GenScript USA, bijotinilati u lijofilizzati. Il-bijotina hija marbuta permezz ta' spacer triplu tal-gliċina fit-tarf N. Iċċekkja l-peptidi kollha bl-użu ta' spettrometrija tal-massa.
Streptavidin (Sigma S0677) tħallat ma' eċċess ekwimolari ta' 5 darbiet ta' peptid bijotinilat, peptid inibitorju BACE1 bijotinilat, jew kombinazzjoni (proporzjon 3:1) ta' peptid inibitorju BACE1 bijotinilat u peptid inibitorju BACE1 f'5–10% DMSO/inkubat f'PBS. Siegħa f'temperatura tal-kamra qabel l-injezzjoni. Peptidi konjugati ma' Streptavidin ġew injettati ġol-vina b'doża ta' 10 mg/kg f'waħda mill-vini tad-denb tal-firien b'kavità ċerebrali.
Il-konċentrazzjoni tal-kumplessjonijiet streptavidin-peptide ġiet ivvalutata permezz ta' ELISA. Pjanċi tal-mikrotitrazzjoni Nunc Maxisorp (Sigma) ġew miksija matul il-lejl f'4°C b'1.5 μg/ml antikorp tal-ġrieden anti-streptavidin (Thermo, MA1-20011). Wara l-imblukkar (buffer tal-imblukkar: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ġelatina, 1% BSA) f'temperatura tal-kamra għal sagħtejn, aħsel il-pjanċa b'0.05% Tween-20/PBS (buffer tal-ħasil) għal 3 sekondi, kampjuni ta' CSF u plażma ġew miżjuda ma' bjar dilwiti b'buffer tal-imblukkar (plażma 1:10,000, CSF 1:115). Il-pjanċa mbagħad ġiet inkubata matul il-lejl f'4°C b'antikorp ta' skoperta (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Wara tliet stadji ta' ħasil, l-istreptavidina ġiet skoperta permezz ta' inkubazzjoni f'soluzzjoni ta' sottostrat TMB (Roche) għal massimu ta' 20 minuta. Wara li twaqqaf l-iżvilupp tal-kulur b'1M H2SO4, kejjel l-assorbenza f'450 nm.
Il-funzjoni tal-kumpless ta' inibitur streptavidin-peptide-BACE1 ġiet ivvalutata permezz ta' Aβ(1-40) ELISA skont il-protokoll tal-manifattur (Wako, 294-64701). Fil-qosor, il-kampjuni tas-CSF ġew dilwiti f'dilwent standard (1:23) u inkubati matul il-lejl f'4°C fi pjanċi ta' 96-bir miksija b'antikorp ta' qbid BNT77. Wara ħames passi ta' ħasil, ġie miżjud antikorp BA27 konjugat ma' HRP u inkubat għal sagħtejn f'4°C, segwit minn ħames passi ta' ħasil. Aβ(1–40) ġie skopert permezz ta' inkubazzjoni f'soluzzjoni TMB għal 30 minuta f'temperatura tal-kamra. Wara li l-iżvilupp tal-kulur ikun twaqqaf b'soluzzjoni ta' waqfien, kejjel l-assorbenza f'450 nm. Il-kampjuni tal-plażma ġew soġġetti għal estrazzjoni ta' fażi solida qabel Aβ(1–40) ELISA. Il-plażma ġiet miżjuda ma' 0.2% DEA (Sigma) fi pjanċi ta' 96-bir u inkubata f'temperatura tal-kamra għal 30 minuta. Wara li l-pjanċi SPE (Oasis, 186000679) inħaslu suċċessivament bl-ilma u 100% metanol, il-kampjuni tal-plażma ġew miżjuda mal-pjanċi SPE u l-likwidu kollu tneħħa. Il-kampjuni nħaslu (l-ewwel b'5% metanol imbagħad 30% metanol) u ġew elużi b'2% NH4OH/90% metanol. Wara li l-eluat nixxef f'55°C għal 99 minuta b'kurrent kostanti ta' N2, il-kampjuni tnaqqsu f'dilwenti standard u Aβ(1–40) ġie mkejjel kif deskritt hawn fuq.
Kif tiċċita dan l-artiklu: Urich, E. et al. Kunsinna tal-merkanzija lejn il-moħħ bl-użu ta' peptidi ta' transitu identifikati in vivo. ix-xjenza. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB u Moos T. Twassil ta' drogi makromolekulari lill-moħħ bl-użu ta' terapija mmirata. Ġurnal tan-Newrokimika 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., u Martinez-Martinez, P. Twassil ta' drogi peptidiċi u proteini minn naħa għall-oħra tal-barriera bejn id-demm u l-moħħ. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Il-barriera bejn id-demm u l-moħħ: ostaklu fl-iżvilupp ta' mediċini għall-moħħ. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, u Byrd, A. Prospetti għal kunsinna mtejba tal-mediċini u mmirati lejn il-moħħ permezz tal-mogħdija tal-plexus tal-korojde-CSF. Riċerka Farmaċewtika 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizzazzjoni tal-bijofarmaċewtiċi b'żwiemel Trojani molekulari għall-kunsinna fil-moħħ. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, Trasport ta' peptidi medjat mir-riċetturi WM minn naħa għall-oħra tal-barriera bejn id-demm u l-moħħ. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Żid il-penetrazzjoni fil-moħħ u l-effikaċja ta' antikorpi terapewtiċi bl-użu ta' shuttles molekulari monovalenti. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. It-trasport tar-riċettur tat-transferrin (TfR) jiddetermina l-assorbiment mill-moħħ ta' varjanti ta' affinità ta' antikorpi TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).