Matur nuwun sampun ngunjungi Nature.com. Panjenengan ngginakaken versi browser kanthi dhukungan CSS winates. Kanggo pengalaman paling apik, disaranake panjenengan ngginakaken browser ingkang sampun dianyari (utawi mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer). Salajengipun, kangge njamin dhukungan ingkang terus-terusan, kita nampilaken situs tanpa gaya lan JavaScript.
Nampilake korsel telung slide sekaligus. Gunakake tombol Sadurunge lan Sabanjure kanggo pindhah ing telung slide sekaligus, utawa gunakake tombol slider ing pungkasan kanggo pindhah ing telung slide sekaligus.
Hambatan getih-otak lan penghalang getih-otak nyegah agen bioterapeutik tekan target ing sistem saraf pusat, saengga ngalangi perawatan penyakit neurologis sing efektif. Kanggo nemokake transporter otak anyar in vivo, kita ngenalake perpustakaan peptida fag T7 lan nglumpukake getih lan cairan serebrospinal (CSF) kanthi serial nggunakake model kolam renang gedhe sing sadar sing dikanulasi saka tikus. Klon fag tartamtu diperkaya banget ing CSF sawise patang puteran seleksi. Tes peptida kandidat individu nuduhake luwih saka 1000 kali lipat pengayaan ing CSF. Bioaktivitas pangiriman sing dimediasi peptida menyang otak dikonfirmasi kanthi pengurangan 40% ing tingkat amiloid-β ing cairan serebrospinal nggunakake inhibitor peptida BACE1 sing ana gandhengane karo peptida transit anyar sing diidentifikasi. Asil kasebut nuduhake yen peptida sing diidentifikasi dening metode pemilihan fag in vivo bisa dadi kendaraan sing migunani kanggo pangiriman makromolekul sistemik menyang otak kanthi efek terapeutik.
Riset terapi sing ditargetake ing sistem saraf pusat (SSP) umume fokus ing identifikasi obat lan agen sing dioptimalake sing nuduhake sifat target SSP, kanthi luwih sithik gaweyan kanggo nemokake mekanisme sing ndorong pangiriman obat aktif menyang otak. Iki wiwit owah saiki amarga pangiriman obat, utamane molekul gedhe, minangka bagean integral saka pangembangan obat neurosains modern. Lingkungan sistem saraf pusat dilindhungi kanthi apik dening sistem alangan serebrovaskular, sing kasusun saka alangan getih-otak (BBB) ​​​​lan alangan getih-otak (BCBB)1, saengga angel ngirim obat menyang otak1,2. Diperkirakan meh kabeh obat molekul gedhe lan luwih saka 98% obat molekul cilik diilangi saka otak3. Pramila penting banget kanggo ngenali sistem transportasi otak anyar sing nyedhiyakake pangiriman obat terapeutik sing efisien lan spesifik menyang SSP4,5. Nanging, BBB lan BCSFB uga menehi kesempatan sing apik kanggo pangiriman obat nalika nembus lan mlebu kabeh struktur otak liwat vaskularisasi sing ekstensif. Dadi, upaya saiki kanggo nggunakake metode pangiriman non-invasif menyang otak umume adhedhasar mekanisme transportasi sing dimediasi reseptor (PMT) nggunakake reseptor BBB6 endogen. Senadyan kemajuan penting anyar nggunakake jalur reseptor transferrin7,8, pangembangan luwih lanjut saka sistem pangiriman anyar kanthi sifat sing luwih apik dibutuhake. Kanggo tujuan iki, tujuan kita yaiku kanggo ngenali peptida sing bisa ngatur transportasi CSF, amarga prinsip kasebut bisa digunakake kanggo ngirim makromolekul menyang SSP utawa kanggo mbukak jalur reseptor anyar. Utamane, reseptor lan transporter spesifik sistem serebrovaskular (BBB lan BSCFB) bisa dadi target potensial kanggo pangiriman obat bioterapeutik aktif lan spesifik. Cairan serebrospinal (CSF) minangka produk sekretori saka pleksus koroid (CS) lan ana ing kontak langsung karo cairan interstitial otak liwat ruang subarachnoid lan ruang ventrikel4. Bubar wis dituduhake yen cairan serebrospinal subarachnoid nyebar banget menyang interstitium otak9. Kita ngarep-arep bisa ngakses ruang parenkim nggunakake saluran aliran subarachnoid iki utawa langsung liwat BBB. Kanggo nggayuh iki, kita ngetrapake strategi pemilihan fag in vivo sing kuat sing ideal kanggo ngenali peptida sing diangkut dening salah siji saka rong jalur sing beda iki.
Saiki kita njlèntrèhaké metode skrining tampilan fag in vivo sekuensial kanthi sampling CSF sing digabungake karo sekuensing throughput dhuwur (HTS) kanggo ngawasi babak seleksi awal kanthi keragaman perpustakaan paling dhuwur. Skrining ditindakake ing tikus sadar kanthi kanula cisterna gedhe (CM) sing ditanam permanen kanggo nyegah kontaminasi getih. Sing penting, pendekatan iki milih target otak lan peptida kanthi aktivitas transportasi ngliwati alangan serebrovaskular. Kita nggunakake fag T7 amarga ukurane cilik (~60 nm)10 lan menehi saran manawa cocog kanggo transportasi vesikel sing ngidini nyebrang transselular saka alangan endotel lan/utawa epitel-medula. Sawise patang babak panning, populasi fag diisolasi sing nuduhake pengayaan CSF in vivo sing kuwat lan asosiasi pembuluh darah serebral. Sing penting, kita bisa ngonfirmasi temuan kanthi nduduhake manawa peptida kandidat paling apik sing disenengi lan disintesis sacara kimia bisa ngeterake kargo protein menyang cairan serebrospinal. Kaping pisanan, efek farmakodinamik saka SSP ditetepake kanthi nggabungake peptida transit utama karo inhibitor peptida BACE1. Saliyané nduduhaké yèn strategi skrining fungsional in vivo bisa ngidhèntifikasi peptida transportasi otak anyar minangka pembawa kargo protein sing efektif, kita ngarepaké pendekatan seleksi fungsional sing padha uga dadi penting kanggo ngidhèntifikasi jalur transportasi otak anyar.
Adhedhasar unit pembentuk plak (PFU), sawise langkah pengemasan fag, perpustakaan peptida fag T7 linier 12-mer acak kanthi maneka warna kira-kira 109 dirancang lan digawe (waca Bahan lan Metode). Penting kanggo dicathet yen kita nganalisa perpustakaan iki kanthi teliti sadurunge panning in vivo. Amplifikasi PCR sampel perpustakaan fag nggunakake primer sing dimodifikasi ngasilake amplikon sing langsung ditrapake kanggo HTS (Gambar Tambahan 1a). Amarga a) kesalahan sekuensing HTS11, b) dampak marang kualitas primer (NNK)1-12, lan c) anané fag tipe liar (wt) (sisipan kerangka) ing perpustakaan siaga, prosedur penyaringan urutan ditindakake kanggo ngekstrak mung informasi urutan sing diverifikasi (Gambar Tambahan 1b). Langkah-langkah filter iki ditrapake kanggo kabeh perpustakaan sekuensing HTS. Kanggo perpustakaan standar, total 233.868 bacaan dipikolehi, sing 39% lulus kriteria filter lan digunakake kanggo analisis perpustakaan lan pilihan kanggo babak sabanjure (Gambar Tambahan 1c-e). Wacan kasebut umume kelipatan saka 3 pasangan basa kanthi dawa puncak ing 36 nukleotida (Gambar Tambahan 1c), sing ngonfirmasi desain perpustakaan (NNK) 1-12. Khususé, kira-kira 11% anggota perpustakaan ngemot sisipan PAGISRELVDKL backbone tipe liar (wt) 12 dimensi, lan meh setengah saka urutan (49%) ngemot sisipan utawa delesi. HTS saka perpustakaan perpustakaan ngonfirmasi keragaman peptida sing dhuwur ing perpustakaan: luwih saka 81% urutan peptida mung ditemokake sapisan lan mung 1,5% kedadeyan ing ≥4 salinan (Gambar Tambahan 2a). Frekuensi asam amino (aa) ing kabeh 12 posisi ing repertoar berkorelasi apik karo frekuensi sing diarepake kanggo jumlah kodon sing diasilake dening repertoar NKK sing degenerasi (Gambar Tambahan 2b). Frekuensi residu aa sing diamati sing dikodekake dening sisipan iki berkorelasi apik karo frekuensi sing diitung (r = 0,893) (Gambar Tambahan 2c). Persiapan perpustakaan fag kanggo injeksi kalebu langkah-langkah amplifikasi lan mbusak endotoksin. Iki wis dituduhake sadurunge bisa nyuda keragaman perpustakaan fag12,13. Mulane, kita ngurut perpustakaan fag sing diamplifikasi piring sing wis ngalami penghapusan endotoksin lan mbandhingake karo perpustakaan asli kanggo ngira frekuensi AA. Korelasi sing kuwat (r = 0,995) diamati antarane blumbang asli lan blumbang sing diamplifikasi lan dimurnèkaké (Gambar Tambahan 2d), sing nuduhake yen kompetisi antarane klon sing diamplifikasi ing piring nggunakake fag T7 ora nyebabake bias utama. Perbandingan iki adhedhasar frekuensi motif tripeptida ing saben perpustakaan, amarga keragaman perpustakaan (~109) ora bisa ditangkap kanthi lengkap sanajan nganggo HTS. Analisis frekuensi aa ing saben posisi nuduhake bias gumantung posisi cilik ing telung posisi pungkasan saka repertoar sing dilebokake (Gambar Tambahan 2e). Kesimpulane, kita nyimpulake yen kualitas lan keragaman perpustakaan bisa ditampa lan mung owah-owahan cilik ing keragaman sing diamati amarga amplifikasi lan persiapan perpustakaan fag antarane sawetara babak seleksi.
Sampling cairan serebrospinal serial bisa ditindakake kanthi cara operasi implan kanula menyang CM tikus sing sadar kanggo nggampangake identifikasi fag T7 sing diinjeksi sacara intravena (iv) liwat BBB lan/utawa BCSFB (Gambar 1a-b). Kita nggunakake rong lengen seleksi independen (lengen A lan B) ing telung babak pisanan seleksi in vivo (Gambar 1c). Kita mboko sithik nambah keketatan seleksi kanthi nyuda jumlah total fag sing dikenalake ing telung babak pisanan seleksi. Kanggo babak kaping papat panning, kita nggabungake sampel saka cabang A lan B lan nindakake telung pilihan independen tambahan. Kanggo nyinaoni sifat in vivo partikel fag T7 ing model iki, fag tipe liar (sisipan master PAGISRELVDKL) diinjeksi menyang tikus liwat vena buntut. Pamulihan fag saka cairan serebrospinal lan getih ing titik wektu sing beda nuduhake yen fag ikosahedral T7 sing relatif cilik duwe fase pembersihan awal sing cepet saka kompartemen getih (Gambar Tambahan 3). Adhedhasar titer sing diwenehake lan volume getih tikus, kita ngetung yen mung kira-kira 1% bobot fag saka dosis sing diwenehake sing dideteksi ing getih 10 menit sawise injeksi intravena. Sawise penurunan awal sing cepet iki, pembersihan primer sing luwih alon diukur kanthi umur paruh 27,7 menit. Sing penting, mung sawetara fag sing dijupuk saka kompartemen CSF, sing nuduhake latar mburi sing kurang kanggo migrasi fag tipe liar menyang kompartemen CSF (Gambar Tambahan 3). Rata-rata, mung kira-kira 1 x 10-3% titer fag T7 ing getih lan 4 x 10-8% saka fag sing diinfus wiwitane dideteksi ing cairan serebrospinal sajrone kabeh periode sampling (0-250 menit). Khususé, umur paruh (25,7 menit) fag tipe liar ing cairan serebrospinal padha karo sing diamati ing getih. Data iki nduduhake manawa alangan sing misahake kompartemen CSF saka getih isih utuh ing tikus sing dikanulasi CM, sing ngidini pemilihan perpustakaan fag in vivo kanggo ngenali klon sing gampang diangkut saka getih menyang kompartemen CSF.
(a) Nyetel metode kanggo njupuk maneh sampel cairan serebrospinal (CSF) saka blumbang gedhe. (b) Diagram sing nuduhake lokasi seluler alangan sistem saraf pusat (SSP) lan strategi seleksi sing digunakake kanggo ngenali peptida sing ngliwati alangan getih-otak (BBB) ​​​​lan alangan getih-otak. (c) Diagram alur skrining tampilan fag in vivo. Ing saben babak seleksi, fag (pengenal kewan ing njero panah) disuntikake kanthi intravena. Rong cabang alternatif independen (A, B) disimpen kanthi kapisah nganti babak seleksi kaping 4. Kanggo babak seleksi 3 lan 4, saben klon fag sing diekstrak saka CSF diurutake kanthi manual. (d) Kinetika fag sing diisolasi saka getih (bunderan abang) lan cairan serebrospinal (segitiga ijo) sajrone babak seleksi pertama ing rong tikus kanulasi sawise injeksi intravena saka perpustakaan peptida T7 (2 x 1012 fag/kewan). Kothak biru nuduhake konsentrasi awal rata-rata fag ing getih, diitung saka jumlah fag sing diinjeksi, kanthi nganggep total volume getih. Kothak ireng nuduhake titik persimpangan garis y sing diekstrapolasi saka konsentrasi fag getih. (e,f) Nampilake frekuensi relatif lan distribusi kabeh motif tripeptida sing tumpang tindih sing ditemokake ing peptida. Jumlah motif sing ditemokake ing 1000 bacaan dituduhake. Sacara signifikan (p < 0,001) motif sing diperkaya ditandhani nganggo titik abang. (e) Plot sebaran korelasi sing mbandhingake frekuensi relatif motif tripeptida saka perpustakaan sing diinjeksi karo fag sing asale saka getih saka kewan #1.1 lan #1.2. (f) Plot sebaran korelasi sing mbandhingake frekuensi relatif motif tripeptida fag kewan #1.1 lan #1.2 sing diisolasi ing getih lan cairan serebrospinal. (g, h) Representasi ID urutan fag sing diperkaya ing getih (g) versus perpustakaan sing diinjeksi lan fag sing diperkaya ing CSF (h) versus getih sawise puteran seleksi in vivo ing loro kewan kasebut. Ukuran kode siji huruf nuduhake sepira kerepe asam amino kasebut ana ing posisi kasebut. Ijo = polar, ungu = netral, biru = basa, abang = asam lan ireng = asam amino hidrofobik. Gambar 1a, b dirancang lan diprodhuksi dening Eduard Urich.
Kita nyuntikake perpustakaan peptida fag menyang rong tikus instrumen CM (klade A lan B) lan fag sing diisolasi saka cairan serebrospinal lan getih (Gambar 1d). Pembersihan cepet awal perpustakaan kurang jelas dibandhingake karo fag tipe liar. Rata-rata paruh perpustakaan sing diinjeksi ing loro kewan kasebut yaiku 24,8 menit ing getih, padha karo fag tipe liar, lan 38,5 menit ing CSF. Sampel fag getih lan cairan serebrospinal saka saben kewan diwènèhi HTS lan kabeh peptida sing diidentifikasi dianalisis kanggo anané motif tripeptida cendhak. Motif tripeptida dipilih amarga nyedhiyakake basis minimal kanggo pembentukan struktur lan interaksi peptida-protein14,15. Kita nemokake korelasi sing apik ing distribusi motif antarane perpustakaan fag sing diinjeksi lan klon sing diekstrak saka getih loro kewan kasebut (Gambar 1e). Data nuduhake yen komposisi perpustakaan mung rada sugih ing kompartemen getih. Frekuensi asam amino lan urutan konsensus dianalisis luwih lanjut ing saben posisi nggunakake adaptasi piranti lunak Weblogo16. Menariknya, kita nemokake pengayaan sing kuwat ing residu glisin getih (Gambar 1g). Nalika getih dibandhingake karo klon sing dipilih saka CSF, seleksi sing kuwat lan sawetara deseleksi motif diamati (Gambar 1f), lan asam amino tartamtu luwih disenengi ana ing posisi sing wis ditemtokake ing 12 anggota (Gambar 1h). Khususé, kéwan individu beda-beda sacara signifikan ing cairan serebrospinal, dene pengayaan glisin getih diamati ing loro kéwan kasebut (Gambar Tambahan 4a-j). Sawise nyaring data urutan sing ketat ing cairan serebrospinal kéwan #1.1 lan #1.2, total 964 lan 420 peptida 12-mer unik dipikolehi (Gambar Tambahan 1d-e). Klon fag sing diisolasi diamplifikasi lan ditindakake babak kapindho seleksi in vivo. Fag sing diekstrak saka babak kapindho seleksi ditindakake HTS ing saben kéwan lan kabeh peptida sing diidentifikasi digunakake minangka input kanggo program pangenalan motif kanggo nganalisis kedadeyan motif tripeptida (Gambar 2a, b, ef). Dibandhingake karo siklus pertama fag sing dijupuk saka CSF, kita mirsani pemilihan lan deseleksi luwih lanjut saka akeh motif ing CSF ing cabang A lan B (Gambar 2). Algoritma identifikasi jaringan diterapake kanggo nemtokake manawa dheweke makili pola urutan sing konsisten. Kamiripan sing jelas diamati antarane urutan 12 dimensi sing dijupuk dening CSF ing clade alternatif A (Gambar 2c, d) lan clade B (Gambar 2g, h). Analisis gabungan ing saben cabang nuduhake profil pilihan sing beda kanggo peptida 12-mer (Gambar Tambahan 5c, d) lan peningkatan rasio titer CSF/getih sajrone wektu kanggo klon gabungan sawise babak pemilihan kapindho dibandhingake karo babak pemilihan pertama (Gambar Tambahan 5e).
Pengayaan motif lan peptida ing cairan serebrospinal kanthi rong puteran berturut-turut saka pilihan tampilan fag fungsional in vivo.
Kabeh fag cairan serebrospinal sing dijupuk saka babak pertama saben kewan (kewan #1.1 lan #1.2) dikumpulake, diamplifikasi, diurutake HT lan diinjeksi maneh bebarengan (2 x 1010 fag/kewan) 2 tikus kanulasi SM (#1.1 → #). 2.1 lan 2.2, 1.2 → 2.3 lan 2.4). (a,b,e,f) Sebaran plot korelasi sing mbandhingake frekuensi relatif motif tripeptida saka kabeh fag sing asale saka CSF ing babak pilihan pertama lan kapindho. Frekuensi relatif lan distribusi motif sing makili kabeh tripeptida sing tumpang tindih sing ditemokake ing peptida ing loro orientasi. Jumlah motif sing ditemokake ing 1000 bacaan dituduhake. Motif sing dipilih utawa diilangi kanthi signifikan (p < 0,001) ing salah sawijining perpustakaan sing dibandhingake disorot nganggo titik abang. (c, d, g, h) Representasi logo urutan saka kabeh urutan dawa 12 asam amino sing sugih CSF adhedhasar babak 2 lan 1 saka seleksi in vivo. Ukuran kode siji huruf nuduhake sepira kerepe asam amino kasebut kedadeyan ing posisi kasebut. Kanggo makili logo, frekuensi urutan CSF sing diekstrak saka kewan individu antarane rong babak seleksi dibandhingake lan urutan sing luwih sugih ing babak kapindho dituduhake: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 lan (h) #1.2–#2.4. Asam amino sing paling sugih ing posisi tartamtu ing (c, d) kewan no. 2.1 lan no. 2.2 utawa (g, h) ing kewan no. 2.3 lan no. 2.4 dituduhake kanthi warna. Ijo = polar, ungu = netral, biru = basa, abang = asam lan ireng = asam amino hidrofobik.
Sawisé babak seleksi kaping telu, kita ngidentifikasi 124 urutan peptida unik (#3.1 lan #3.2) saka 332 klon fag sing direkonstitusi CSF sing diisolasi saka rong kéwan (Gambar Tambahan 6a). Urutan LGSVS (18,7%) nduwèni proporsi relatif paling dhuwur, disusul karo sisipan tipe liar PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%), lan SARGSWREIVSLS (2,2%). Ing babak kaping papat pungkasan, kita nglumpukaké rong cabang sing dipilih kanthi independen saka telung kéwan sing kapisah (Gambar 1c). Saka 925 klon fag sing diurut sing dijupuk saka CSF, ing babak kaping papat kita nemokaké 64 urutan peptida unik (Gambar Tambahan 6b), ing antarané proporsi relatif fag tipe liar mudhun dadi 0,8%. Klon CSF sing paling umum ing babak kaping papat yaiku LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) lan RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). Rentang dawa peptida sing dipilih amarga penyisipan/penghapusan nukleotida utawa kodon stop prematur ing primer perpustakaan nalika nggunakake kodon degenerasi kanggo desain perpustakaan NNK. Kodon stop prematur ngasilake peptida sing luwih cendhek lan dipilih amarga ngemot motif aa sing disenengi. Peptida sing luwih dawa bisa uga asil saka penyisipan/penghapusan ing primer perpustakaan sintetik. Iki ndadekake kodon stop sing dirancang ana ing njaba pigura lan maca nganti kodon stop anyar katon ing sisih hilir. Umumé, kita ngetung faktor pengayaan kanggo kabeh papat babak pilihan kanthi mbandhingake data input karo data output sampel. Kanggo babak pertama skrining, kita nggunakake titer fag tipe liar minangka referensi latar mburi non-spesifik. Menariknya, pemilihan fag negatif kuwat banget ing siklus CSF pisanan, nanging ora ing getih (Gambar 3a), sing bisa uga amarga kemungkinan difusi pasif sing sithik saka sebagian besar anggota perpustakaan peptida menyang kompartemen CSF utawa fag relatif cenderung luwih efisien ditahan utawa dicopot saka aliran getih tinimbang bakteriofag. Nanging, ing babak kapindho panning, pemilihan fag sing kuwat ing CSF diamati ing loro clade, sing nuduhake yen babak sadurunge diperkaya ing fag sing nampilake peptida sing ningkatake serapan CSF (Gambar 3a). Maneh, tanpa pengayaan getih sing signifikan. Uga ing babak katelu lan kaping papat, klon fag diperkaya sacara signifikan ing CSF. Mbandhingake frekuensi relatif saben urutan peptida unik antarane rong babak pungkasan seleksi, kita nemokake yen urutan kasebut luwih diperkaya ing babak kaping papat seleksi (Gambar 3b). Total 931 motif tripeptida diekstrak saka kabeh 64 urutan peptida unik nggunakake loro orientasi peptida. Motif sing paling sugih ing babak kaping papat ditliti luwih rapet kanggo profil pengayaan ing kabeh babak dibandhingake karo perpustakaan sing diinjeksi (cut-off: pengayaan 10%) (Gambar Tambahan 6c). Pola pemilihan umum nuduhake yen umume motif sing ditliti sugih ing kabeh babak sadurunge saka loro cabang pemilihan. Nanging, sawetara motif (kayata SGL, VSG, LGS GSV) utamane saka klade alternatif A, dene liyane (kayata FGW, RTN, WGF, NTR) sugih ing klade alternatif B.
Validasi transportasi CSF saka peptida sing ditampilake fag sing diperkaya CSF lan peptida pimpinan biotinilasi sing dikonjugasi karo muatan streptavidin.
(a) Rasio pengayaan sing diitung ing kabeh papat babak (R1-R4) adhedhasar titer fag sing diinjeksi (input = I) (PFU) lan titer fag CSF sing ditemtokake (output = O). Faktor pengayaan kanggo telung babak pungkasan (R2-R4) diitung kanthi mbandhingake karo babak sadurunge lan babak pertama (R1) kanthi data bobot. Batang sing mbukak yaiku cairan serebrospinal, batang sing diarsir yaiku plasma. (***p<0,001, adhedhasar uji-t Student). (b) Dhaptar peptida fag sing paling akeh, diurut miturut proporsi relatif marang kabeh fag sing diklumpukake ing CSF sawise babak 4 seleksi. Enem klon fag sing paling umum disorot nganggo warna, diwenehi nomer lan faktor pengayaan antarane babak 3 lan 4 seleksi (sisipan). (c,d) Enem klon fag sing paling diperkaya, perpustakaan peptida fag kosong lan fag parental saka babak 4 dianalisis kanthi individu ing model sampling CSF. Sampel CSF lan getih diklumpukake ing titik wektu sing dituduhake. (c) Jumlah sing padha saka 6 calon klon fag (2 x 1010 fag/kewan), fag kosong (#1779) (2 x 1010 fag/kewan) lan perpustakaan peptida fag stok (2 x 1012 fag/kewan) Injeksi paling ora 3 CM diwenehake menyang kewan sing dikanulasi kanthi kapisah liwat vena buntut. Farmakokinetik CSF saka saben klon fag sing diinjeksi lan perpustakaan peptida fag sajrone wektu dituduhake. (d) nuduhake rasio CSF/getih rata-rata kanggo kabeh fag/mL sing dipulihake sajrone wektu sampling. (e) Papat peptida pimpinan sintetik lan siji kontrol acak digandhengake karo biotin menyang streptavidin liwat N-terminus (tampilan tetramer) banjur injeksi (vena buntut iv, 10 mg streptavidin/kg). Paling ora telung tikus sing diintubasi (N = 3). ). Sampel CSF dikumpulake ing titik wektu sing dituduhake lan konsentrasi streptavidin diukur nganggo CSF ​​anti-streptavidin ELISA (nd = ora dideteksi). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, adhedhasar tes ANOVA). (f) Perbandingan urutan asam amino saka klon peptida fag sing paling sugih #2002 (ungu) karo klon peptida fag liyane sing dipilih saka babak pemilihan kaping 4. Fragmen asam amino sing identik lan padha diwenehi kode warna.
Saka kabeh fag sing diperkaya ing babak kaping papat (Gambar 3b), enem calon klon dipilih kanggo analisis individu luwih lanjut ing model sampling CSF. Jumlah sing padha saka enem calon perpustakaan peptida fag, fag kosong (tanpa sisipan) lan profag diinjeksi menyang telung kewan CM sing dikanulasi, lan farmakokinetik ditemtokake ing uji CSF (Gambar 3c) lan getih (Gambar Tambahan 7). Kabeh klon fag sing dites nargetake kompartemen CSF ing level 10-1000 kali luwih dhuwur tinimbang fag kontrol kosong (#1779). Contone, klon #2020 lan #2077 duwe titer CSF udakara 1000 kali luwih dhuwur tinimbang fag kontrol. Profil farmakokinetik saben peptida sing dipilih beda, nanging kabeh duwe kemampuan homing CSF sing dhuwur. Kita mirsani penurunan sing tetep sajrone wektu kanggo klon #1903 lan #2011, dene kanggo klon #2077, #2002 lan #2009, peningkatan sajrone 10 menit pisanan bisa uga nuduhake transportasi aktif nanging kudu diverifikasi. Klon #2020, #2002, lan #2077 stabil ing tingkat sing dhuwur, dene konsentrasi CSF klon #2009 alon-alon mudhun sawise kenaikan awal. Kita banjur mbandhingake frekuensi relatif saben kandidat CSF karo konsentrasi getihe (Gambar 3d). Korelasi titer rata-rata saben kandidat CSF karo titer getihe ing kabeh wektu sampling nuduhake yen telu saka enem kandidat kasebut nduweni CSF getih sing akeh banget. Menariknya, klon #2077 nuduhake stabilitas getih sing luwih dhuwur (Gambar Tambahan 7). Kanggo ngonfirmasi manawa peptida kasebut dhewe bisa aktif ngangkut kargo liyane saka partikel fag menyang kompartemen CSF, kita nyintesis papat peptida pimpinan sing diderivatisasi karo biotin ing N-terminus ing ngendi peptida nempel ing partikel fag. Peptida biotinilasi (no. 2002, 2009, 2020 lan 2077) dikonjugasi karo streptavidin (SA) kanggo entuk bentuk multimerik sing rada niru geometri fag. Format iki uga ngidini kita ngukur paparan SA ing getih lan cairan serebrospinal minangka peptida protein pengangkut kargo. Sing penting, data fag asring bisa direproduksi nalika peptida sintetik diwenehake ing format konjugasi SA iki (Gambar 3e). Peptida sing diacak duwe paparan awal sing luwih sithik lan pembersihan CSF sing luwih cepet kanthi tingkat sing ora bisa dideteksi sajrone 48 jam. Kanggo entuk wawasan babagan jalur pangiriman klon fag peptida iki menyang ruang CSF, kita nganalisa lokalisasi hit peptida fag individu nggunakake imunohistokimia (IHC) kanggo ndeteksi langsung partikel fag 1 jam sawise injeksi intravena in vivo. Khususé, klon #2002, #2077, lan #2009 bisa dideteksi kanthi pewarnaan sing kuwat ing kapiler otak, dene fag kontrol (#1779) lan klon #2020 ora dideteksi (Gambar Tambahan 8). Iki nuduhake yen peptida kasebut nyumbang efek ing otak kanthi tepat kanthi nyebrang BBB. Analisis rinci luwih lanjut dibutuhake kanggo nguji hipotesis iki, amarga rute BSCFB uga bisa digunakake. Nalika mbandhingake urutan asam amino saka klon sing paling sugih (#2002) karo peptida liyane sing dipilih, dicathet yen sawetara duwe ekstensi asam amino sing padha, sing bisa nuduhake mekanisme transportasi sing padha (Gambar 3f).
Amarga profil plasma sing unik lan peningkatan CSF sing signifikan sajrone wektu, klon tampilan fag #2077 dieksplorasi luwih lanjut sajrone periode 48 jam sing luwih suwe lan bisa ngasilake peningkatan CSF sing cepet sing diamati gegayutan karo tingkat SA sing lestari (Gambar 4a). Babagan klon fag liyane sing diidentifikasi, #2077 diwarnai kanthi kuat kanggo kapiler otak lan nuduhake kolokalisasi sing signifikan karo lektin penanda kapiler nalika dideleng kanthi resolusi sing luwih dhuwur lan bisa uga sawetara pewarnaan ing ruang parenkim (Gambar 4b). Kanggo nyelidiki apa efek farmakologis sing dimediasi peptida bisa dipikolehi ing SSP, kita nindakake eksperimen ing ngendi versi biotinilasi saka i) peptida transit #2077 lan ii) peptida inhibitor BACE1 dicampur karo SA kanthi rong rasio sing beda. Kanggo siji kombinasi, kita mung nggunakake inhibitor peptida BACE1 lan kanggo liyane, kita nggunakake rasio 1:3 inhibitor peptida BACE1 kanggo peptida #2077. Kaloro sampel kasebut diwenehake kanthi intravena lan tingkat getih lan cairan serebrospinal saka peptida beta-amiloid 40 (Abeta40) diukur sajrone wektu. Abeta40 diukur ing CSF amarga nggambarake inhibisi BACE1 ing parenkim otak. Kaya sing dikarepake, kaloro kompleks kasebut nyuda tingkat getih Abeta40 kanthi signifikan (Gambar 4c, d). Nanging, mung sampel sing ngemot campuran peptida no. 2077 lan inhibitor peptida BACE1 sing dikonjugasi karo SA sing nyebabake penurunan Abeta40 sing signifikan ing cairan serebrospinal (Gambar 4c). Data nuduhake yen peptida no. 2077 bisa ngeterake protein SA 60 kDa menyang SSP lan uga nyebabake efek farmakologis karo inhibitor konjugasi SA saka peptida BACE1.
(a) Injeksi klonal (2 × 10 fag/kewan) saka fag T7 sing nuduhake profil farmakokinetik jangka panjang saka peptida CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) lan fag kontrol sing ora disuntik (#1779) ing paling ora telung tikus sing diintubasi CM. (b) Gambar mikroskopis confocal saka pembuluh mikro kortikal sing representatif ing tikus sing disuntik fag (2 × 10 10 fag/kewan) sing nuduhake pewarnaan kontra peptida #2077 lan pembuluh (lektin). Klon fag iki diwenehake marang 3 tikus lan diidini sirkulasi sajrone 1 jam sadurunge perfusi. Otak dipotong lan diwernani nganggo antibodi berlabel FITC poliklonal nglawan kapsid fag T7. Sepuluh menit sadurunge perfusi lan fiksasi sabanjure, lektin berlabel DyLight594 diwenehake kanthi intravena. Gambar fluoresen sing nuduhake pewarnaan lektin (abang) saka sisih luminal pembuluh mikro lan fag (ijo) ing lumen kapiler lan jaringan otak perivaskular. Bar skala cocog karo 10 µm. (c, d) Peptida penghambat BACE1 biotinilasi dhewe utawa dikombinasikake karo peptida transit biotinilasi #2077 digandhengake karo streptavidin banjur injeksi intravena paling ora telung tikus CM kanulasi (10 mg streptavidin/kg). Reduksi sing dimediasi inhibitor peptida BACE1 ing Aβ40 diukur dening Aβ1-40 ELISA ing getih (abang) lan cairan serebrospinal (oranye) ing titik wektu sing dituduhake. Kanggo kajelasan sing luwih apik, garis putus-putus digambar ing grafik kanthi skala 100%. (c) Persentase pangurangan Aβ40 ing getih (segitiga abang) lan cairan serebrospinal (segitiga oranye) ing tikus sing diobati nganggo streptavidin sing dikonjugasi karo peptida transit #2077 lan peptida penghambat BACE1 kanthi rasio 3:1. (d) Persentase pangurangan ing getih Aβ40 (bunderan abang) lan cairan serebrospinal (bunderan oranye) tikus sing diobati nganggo streptavidin sing digandhengake karo peptida penghambat BACE1 wae. Konsentrasi Aβ ing kontrol yaiku 420 pg/ml (standar deviasi = 101 pg/ml).
Tampilan fag wis kasil diterapake ing sawetara bidang riset biomedis17. Metode iki wis digunakake kanggo studi keragaman vaskular in vivo18,19 uga studi sing nargetake pembuluh serebral20,21,22,23,24,25,26. Ing panliten iki, kita ngembangake aplikasi metode seleksi iki ora mung kanggo identifikasi langsung peptida sing nargetake pembuluh serebral, nanging uga kanggo panemuan calon kanthi sifat transportasi aktif kanggo ngliwati alangan getih-otak. Saiki kita njlentrehake pangembangan prosedur seleksi in vivo ing tikus sing diintubasi CM lan nduduhake potensine kanggo ngenali peptida kanthi sifat homing CSF. Nggunakake fag T7 sing nampilake perpustakaan peptida acak 12-mer, kita bisa nduduhake manawa fag T7 cukup cilik (diameter kira-kira 60 nm)10 kanggo diadaptasi karo alangan getih-otak, saengga langsung ngliwati alangan getih-otak utawa pleksus koroid. Kita mirsani manawa panen CSF saka tikus CM sing dikanulasi minangka metode skrining fungsional in vivo sing dikontrol kanthi apik, lan fag sing diekstrak ora mung kaiket karo vaskularisasi nanging uga berfungsi minangka transporter ngliwati alangan getih-otak. Salajengipun, kanthi ngumpulake getih lan ngetrapake HTS menyang CSF lan fag sing asale saka getih, kita ngonfirmasi manawa pilihan CSF kita ora dipengaruhi dening pengayaan getih utawa kebugaran kanggo ekspansi antarane babak seleksi. Nanging, kompartemen getih minangka bagean saka prosedur seleksi, amarga fag sing bisa tekan kompartemen CSF kudu urip lan sirkulasi ing aliran getih cukup suwe kanggo ngayahi awake dhewe ing otak. Kanggo njupuk informasi urutan sing dipercaya saka data HTS mentah, kita ngetrapake filter sing diadaptasi kanggo kesalahan sekuensing khusus platform ing alur kerja analisis. Kanthi nggabungake parameter kinetik menyang metode skrining, kita ngonfirmasi farmakokinetik cepet saka fag T7 tipe liar (t½ ~ 28 menit) ing getih24, 27, 28 lan uga nemtokake wektu paruh ing cairan serebrospinal (t½ ~ 26 menit) saben menit). Senajan profil farmakokinetik sing padha ing getih lan CSF, mung 0,001% konsentrasi fag ing getih sing bisa dideteksi ing CSF, sing nuduhake mobilitas latar mburi fag T7 tipe liar sing kurang ing alangan getih-otak. Karya iki nyoroti pentinge babak pertama seleksi nalika nggunakake strategi panning in vivo, utamane kanggo sistem fag sing cepet diresiki saka sirkulasi, amarga sawetara klon bisa tekan kompartemen SSP. Dadi, ing babak pertama, pangurangan keragaman perpustakaan gedhe banget, amarga mung sawetara klon sing pungkasane dikumpulake ing model CSF sing ketat banget iki. Strategi panning in vivo iki kalebu sawetara langkah seleksi kayata akumulasi aktif ing kompartemen CSF, kaslametan klon ing kompartemen getih, lan mbusak klon fag T7 kanthi cepet saka getih sajrone 10 menit pertama (Gambar 1d lan Gambar Tambahan 4M). Dadi, sawise babak pertama, klon fag sing beda diidentifikasi ing CSF, sanajan blumbang awal sing padha digunakake kanggo kewan individu. Iki nuduhake yen pirang-pirang langkah seleksi ketat kanggo perpustakaan sumber kanthi jumlah anggota perpustakaan sing akeh nyebabake pengurangan keragaman sing signifikan. Mulane, kedadeyan acak bakal dadi bagean integral saka proses seleksi awal, sing banget mengaruhi asil kasebut. Kamungkinan akeh klon ing perpustakaan asli duwe kecenderungan pengayaan CSF sing meh padha. Nanging, sanajan ing kahanan eksperimen sing padha, asil seleksi bisa beda amarga jumlah saben klon tartamtu sing sithik ing blumbang awal.
Motif-motif sing sugih ing CSF beda karo sing ana ing getih. Menariknya, kita nyathet owah-owahan pertama menyang peptida sing sugih glisin ing getih kewan individu. (Gambar 1g, Gambar Tambahan 4e, 4f). Fag sing ngemot peptida glisin bisa uga luwih stabil lan kurang cenderung dicopot saka sirkulasi. Nanging, peptida sing sugih glisin iki ora dideteksi ing sampel cairan serebrospinal, sing nuduhake yen perpustakaan sing dikuratori ngliwati rong langkah seleksi sing beda: siji ing getih lan liyane diidini nglumpuk ing cairan serebrospinal. Klon sing sugih CSF sing diasilake saka babak seleksi kaping papat wis diuji sacara ekstensif. Meh kabeh klon sing diuji kanthi individu dikonfirmasi sugih ing CSF dibandhingake karo fag kontrol kosong. Siji pukulan peptida (#2077) ditliti kanthi luwih rinci. Iki nuduhake umur paruh plasma sing luwih dawa dibandhingake karo pukulan liyane (Gambar 3d lan Gambar Tambahan 7), lan sing menarik, peptida iki ngemot residu sistein ing C-terminus. Bubar iki wis dituduhake manawa tambahan sistein menyang peptida bisa ningkatake sifat farmakokinetik kanthi ngiket albumin 29. Iki saiki durung dingerteni kanggo peptida #2077 lan mbutuhake panliten luwih lanjut. Sawetara peptida nuduhake katergantungan valensi ing pengayaan CSF (data ora ditampilake), sing bisa uga ana gandhengane karo geometri permukaan kapsid T7 sing ditampilake. Sistem T7 sing digunakake nuduhake 5-15 salinan saben peptida saben partikel fag. IHC ditindakake ing calon klon fag utama sing disuntikake kanthi intravena menyang korteks serebral tikus (Gambar Tambahan 8). Data nuduhake yen paling ora telung klon (No. 2002, No. 2009 lan No. 2077) berinteraksi karo BBB. Isih kudu ditemtokake apa interaksi BBB iki nyebabake akumulasi CSF utawa gerakan klon kasebut langsung menyang BCSFB. Sing penting, kita nuduhake manawa peptida sing dipilih njaga kapasitas transportasi CSF nalika disintesis lan kaiket karo kargo protein. Ikatan peptida biotinilasi N-terminal menyang SA sejatine mbaleni asil sing dipikolehi karo klon fag masing-masing ing getih lan cairan serebrospinal (Gambar 3e). Pungkasan, kita nuduhake yen peptida timbal #2077 bisa ningkatake aksi otak saka inhibitor peptida biotinilasi BACE1 sing dikonjugasi karo SA, nyebabake efek farmakodinamik sing jelas ing SSP kanthi nyuda tingkat Abeta40 ing CSF kanthi signifikan (Gambar 4). Kita ora bisa ngenali homolog ing basis data kanthi nindakake telusuran homologi urutan peptida saka kabeh hit. Penting kanggo dicathet yen ukuran perpustakaan T7 kira-kira 109, dene ukuran perpustakaan teoretis kanggo 12-mers yaiku 4 x 1015. Mulane, kita mung milih sebagian cilik saka ruang keragaman perpustakaan peptida 12-mer, sing bisa uga tegese peptida sing luwih optimal bisa diidentifikasi kanthi ngevaluasi ruang urutan sing jejer saka hit sing diidentifikasi iki. Sacara hipotesis, salah sawijining alesan kenapa kita durung nemokake homolog alami saka peptida kasebut yaiku deseleksi sajrone evolusi kanggo nyegah mlebune motif peptida tartamtu sing ora terkendali menyang otak.
Digabungake, asil panaliten iki nyedhiyakake dhasar kanggo karya ing mangsa ngarep kanggo ngenali lan menehi ciri sistem transportasi alangan serebrovaskular in vivo kanthi luwih rinci. Persiapan dhasar metode iki adhedhasar strategi seleksi fungsional sing ora mung ngenali klon kanthi sifat pengikatan vaskular serebral, nanging uga kalebu langkah kritis ing ngendi klon sing sukses duwe aktivitas intrinsik kanggo nyebrang alangan biologis in vivo menyang kompartemen SSP. yaiku kanggo njlentrehake mekanisme transportasi peptida kasebut lan pilihan kanggo ngiket menyang mikrovaskular khusus kanggo wilayah otak. Iki bisa nyebabake panemuan jalur anyar kanggo transportasi BBB lan reseptor. Kita ngarepake yen peptida sing diidentifikasi bisa langsung ngiket menyang reseptor serebrovaskular utawa menyang ligan sirkulasi sing diangkut liwat BBB utawa BCSFB. Vektor peptida kanthi aktivitas transportasi CSF sing ditemokake ing karya iki bakal diselidiki luwih lanjut. Saiki kita lagi nyelidiki spesifisitas otak peptida kasebut kanggo kemampuane nyebrang BBB lan/utawa BCSFB. Peptida anyar iki bakal dadi alat sing penting banget kanggo panemuan reseptor utawa jalur anyar lan kanggo pangembangan platform anyar sing efisien banget kanggo pangiriman makromolekul, kayata biologis, menyang otak.
Kanulasi cisterna gedhe (CM) nggunakake modifikasi saka metode sing diterangake sadurunge. Tikus Wistar sing dibius (200-350 g) dipasang ing piranti stereotaksik lan sayatan median digawe ing kulit sirah sing wis dicukur lan disiapake kanthi aseptik kanggo mbukak tengkorak. Bor rong bolongan ing area selempang ndhuwur lan pasang sekrup pengikat ing bolongan kasebut. Bolongan tambahan dibor ing puncak oksipital lateral kanggo pandhuan stereotaktik kanula stainless steel menyang CM. Olesake semen gigi ing sekitar kanula lan amanake nganggo sekrup. Sawise photo-curing lan pengerasan semen, tatu kulit ditutup nganggo jahitan supramid 4/0. Penempatan kanula sing tepat dikonfirmasi kanthi kebocoran spontan cairan serebrospinal (CSF). Copot tikus saka piranti stereotaksik, tampa perawatan pasca operasi lan manajemen nyeri sing cocog, lan supaya bisa pulih paling ora seminggu nganti tandha-tandha getih diamati ing cairan serebrospinal. Tikus Wistar (Crl:WI/Han) dijupuk saka Charles River (Prancis). Kabeh tikus dijaga ing kahanan bebas patogen tartamtu. Kabeh eksperimen kewan wis disetujoni dening Kantor Dokter Hewan Kutha Basel, Swiss, lan ditindakake miturut Lisensi Hewan No. 2474 (Penilaian Transportasi Otak Aktif kanthi Ngukur Tingkat Calon Terapeutik ing Cairan Serebrospinal lan Otak Tikus).
Jaga supaya tikus tetep sadar kanthi alon-alon nalika nyekel kanula CM. Copot Datura saka kanula lan kumpulake 10 µl cairan serebrospinal sing mili kanthi spontan. Amarga patensi kanula pungkasane rusak, mung sampel cairan serebrospinal sing bening tanpa bukti kontaminasi getih utawa perubahan warna sing dilebokake ing panliten iki. Bebarengan karo iku, kira-kira 10-20 μl getih dijupuk saka sayatan cilik ing pucuk buntut menyang tabung nganggo heparin (Sigma-Aldrich). CSF lan getih dikumpulake ing macem-macem titik wektu sawise injeksi intravena fag T7. Kira-kira 5-10 μl cairan dibuwang sadurunge saben sampel CSF dikumpulake, sing cocog karo volume kateter sing mati.
Pustaka digawe nggunakake vektor T7Select 10-3b kaya sing diterangake ing manual sistem T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Cekakipun, sisipan DNA 12-mer acak disintesis kanthi format ing ngisor iki:
Kodon NNK digunakake kanggo nyegah kodon double stop lan ekspresi asam amino sing berlebihan ing sisipan. N minangka rasio equimolar sing dicampur kanthi manual saka saben nukleotida, lan K minangka rasio equimolar sing dicampur kanthi manual saka nukleotida adenin lan sitosin. Wilayah untaian tunggal diowahi dadi DNA untaian ganda kanthi inkubasi luwih lanjut karo dNTP (Novagen) lan enzim Klenow (New England Biolabs) ing buffer Klenow (New England Biolabs) sajrone 3 jam ing suhu 37°C. Sawise reaksi, DNA untaian ganda ditemokake kanthi presipitasi EtOH. DNA sing diasilake dicerna nganggo enzim restriksi EcoRI lan HindIII (loro-lorone saka Roche). Sisipan sing dibelah lan dimurnèkaké (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) banjur diligasi ing pigura menyang vektor T7 sing wis dibelah sawise asam amino 348 saka gen kapsid 10B. Reaksi ligasi diinkubasi ing suhu 16°C sajrone 18 jam sadurunge kemasan in vitro. Pengemasan fag in vitro ditindakake miturut pandhuan sing diwenehake karo kit kloning T7Select 10-3b (Novagen) lan larutan pengemasan diamplifikasi sapisan kanggo lisis nggunakake Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lisat disentrifugasi, dititrasi lan dibekukan ing suhu -80° C minangka larutan stok gliserol.
Amplifikasi PCR langsung saka wilayah variabel fag sing diamplifikasi ing duduh kaldu utawa piring nggunakake primer fusi 454/Roche-amplicon sing dipatenake. Primer fusi maju ngemot urutan sing ngapit wilayah variabel (NNK) 12 (spesifik template), GS FLX Titanium Adapter A, lan urutan kunci perpustakaan papat basis (TCAG) (Gambar Tambahan 1a):
Primer fusi terbalik uga ngandhut biotin sing dipasang ing manik-manik penangkap lan GS FLX Titanium Adapter B sing dibutuhake kanggo amplifikasi klonal sajrone PCR emulsi:
Amplikon-amplikon kasebut banjur diurutake nganggo pirosekuensing 454/Roche miturut protokol Titanium 454 GS-FLX. Kanggo sekuensing Sanger manual (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNA fag T7 diamplifikasi nganggo PCR lan diurut nganggo pasangan primer ing ngisor iki:
Sisipan saka plak individu diamplifikasi PCR nggunakake Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (miturut pandhuan pabrikan). Lakoni wiwitan panas (10 menit ing 95 °C) lan 35 siklus boost (50 detik ing 95 °C, 1 menit ing 50 °C, lan 1 menit ing 72 °C).
Fage saka perpustakaan, fage tipe liar, fage sing dislametake saka CSF lan getih, utawa klon individu diamplifikasi ing Escherichia coli BL5615 ing kaldu TB (Sigma Aldrich) utawa ing piring 500 cm2 (Thermo Scientific) sajrone 4 jam ing suhu 37°C. Fage diekstrak saka piring kanthi mbilas piring nganggo buffer Tris-EDTA (Fluka Analytical) utawa kanthi ngumpulake plak nganggo pucuk pipet steril. Fage diisolasi saka supernatan kultur utawa buffer ekstraksi nganggo siji bunderan presipitasi polietilen glikol (PEG 8000) (Promega) lan disuspensi maneh ing buffer Tris-EDTA.
Fag sing wis diamplifikasi diilangi endotoksin kaping 2-3 nganggo manik-manik penghilang endotoksin (Miltenyi Biotec) sadurunge injeksi intravena (IV) (500 μl/kewan). Ing babak pertama, 2 × 1012 fag dilebokake; ing babak kapindho, 2 × 1010 fag; ing babak seleksi katelu lan kaping papat, 2 × 109 fag saben kewan. Kandungan fag ing sampel CSF lan getih sing diklumpukake ing titik wektu sing dituduhake ditemtokake kanthi ngetung plak miturut pandhuan pabrikan (manual sistem T7Select). Seleksi fag ditindakake kanthi injeksi intravena saka perpustakaan sing dimurnèkaké menyang vena buntut utawa kanthi injeksi maneh fag sing diekstrak saka CSF saka babak seleksi sadurunge, lan panen sabanjure ditindakake ing 10 menit, 30 menit, 60 menit, 90 menit, 120 menit, 180 menit, lan 240 menit, masing-masing sampel CSF lan getih. Ana total patang babak panning in vivo sing ditindakake ing ngendi rong cabang sing dipilih disimpen lan dianalisis kanthi kapisah sajrone telung babak seleksi pisanan. Kabeh sisipan fag sing diekstrak saka CSF saka rong babak seleksi pisanan ditindakake pirosekuensing 454/Roche, dene kabeh klon sing diekstrak saka CSF saka rong babak seleksi pungkasan diurutake kanthi manual. Kabeh fag getih saka babak seleksi pisanan uga ditindakake pirosekuensing 454/Roche. Kanggo injeksi klon fag, fag sing dipilih diamplifikasi ing E. coli (BL5615) ing piring 500 cm2 ing suhu 37°C sajrone 4 jam. Klon sing dipilih lan diurutake kanthi manual disebarake ing medium TB. Sawise ekstraksi fag, pemurnian lan penghapusan endotoksin (kaya sing diterangake ing ndhuwur), 2 × 1010 fag/kewan ing 300 μl disuntikake kanthi intravena menyang siji vena buntut.
Pamrosesan awal lan panyaringan kualitatif data urutan. Data mentah 454/Roche diowahi saka format peta aliran standar biner (sff) dadi format sing bisa diwaca manungsa Pearson (fasta) nggunakake piranti lunak vendor. Pamrosesan luwih lanjut saka urutan nukleotida ditindakake nggunakake program lan skrip C sing dipatenake (paket piranti lunak sing durung dirilis) kaya sing diterangake ing ngisor iki. Analisis data utama kalebu prosedur panyaringan multi-tahap sing ketat. Kanggo nyaring bacaan sing ora ngemot urutan DNA sisipan 12mer sing valid, bacaan kasebut diselarasake kanthi runtut kanggo label wiwitan (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), label mandheg (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) lan sisipan latar mburi (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGAC) nggunakake tes Needleman-Wunsch global. alignment sing ngidini nganti 2 inkonsistensi saben alignment31. Mulane, bacaan tanpa tag wiwitan lan mandheg lan bacaan sing ngemot sisipan latar mburi, yaiku, alignment sing ngluwihi jumlah ketidakcocokan sing diidini, dibusak saka perpustakaan. Kanggo bacaan sing isih ana, urutan DNA N-mer sing wiwit saka tandha wiwitan lan pungkasan sadurunge tandha mandheg dicopot saka urutan bacaan asli lan diproses luwih lanjut (sabanjure diarani "sisipan"). Sawise terjemahan sisipan, bagean sawise kodon mandheg pertama ing ujung 5′ primer dicopot saka sisipan. Kajaba iku, nukleotida sing nyebabake kodon ora lengkap ing ujung 3′ primer uga dicopot. Kanggo ngilangi sisipan sing mung ngemot urutan latar mburi, sisipan sing diterjemahake sing diwiwiti kanthi pola asam amino "PAG" uga dicopot. Peptida kanthi dawa pasca-translasi kurang saka 3 asam amino dicopot saka perpustakaan. Pungkasan, mbusak redundansi ing blumbang sisipan lan nemtokake frekuensi saben sisipan unik. Asil analisis iki kalebu dhaptar urutan nukleotida (sisipan) lan frekuensi (dibaca) (Gambar Tambahan 1c lan 2).
Sisipan DNA Grup N-mer miturut kamiripan urutan: Kanggo ngilangi kesalahan sekuensing spesifik 454/Roche (kayata masalah karo ekstensi homopolimer sekuensing) lan mbusak redundansi sing kurang penting, sisipan urutan DNA N-mer sing wis disaring sadurunge (sisipan) diurutake miturut kamiripan. sisipan (nganti 2 basa sing ora cocog diidini) nggunakake algoritma iteratif sing ditetepake kaya ing ngisor iki: sisipan diurutake dhisik miturut frekuensi (saka paling dhuwur nganti paling endhek), lan yen padha, miturut urutan sekunder miturut dawa (paling dawa nganti paling cendhek)). Dadi, sisipan sing paling kerep lan paling dawa nemtokake "grup" pisanan. Frekuensi grup disetel menyang frekuensi kunci. Banjur, saben sisipan sing isih ana ing dhaptar sing diurutake dicoba ditambahake menyang grup kanthi penyelarasan Needleman-Wunsch pasangan. Yen jumlah ketidakcocokan, sisipan, utawa pambusakan ing penyelarasan ora ngluwihi ambang 2, sisipan ditambahake menyang grup, lan frekuensi grup sakabèhé ditambah kanthi sepira kerepe sisipan ditambahake. Sisipan sing ditambahake menyang grup ditandhani minangka digunakake lan ora kalebu ing proses luwih lanjut. Yen urutan sisipan ora bisa ditambahake menyang grup sing wis ana, urutan sisipan digunakake kanggo nggawe grup anyar kanthi frekuensi sisipan sing cocog lan ditandhani minangka digunakake. Iterasi rampung nalika saben urutan sisipan wis digunakake kanggo mbentuk grup anyar utawa bisa dilebokake ing grup sing wis ana. Sawise kabeh, sisipan sing dikelompokake sing kasusun saka nukleotida pungkasane diterjemahake dadi urutan peptida (perpustakaan peptida). Asil saka analisis iki yaiku sakumpulan sisipan lan frekuensi sing cocog sing mbentuk jumlah bacaan berturut-turut (Gambar Tambahan 2).
Generasi Motif: Adhedhasar dhaptar peptida unik, perpustakaan digawe sing ngemot kabeh pola asam amino (aa) sing bisa ditindakake kaya sing dituduhake ing ngisor iki. Saben pola sing bisa ditindakake kanthi dawa 3 diekstrak saka peptida lan pola kebalikane ditambahake bebarengan karo perpustakaan motif umum sing ngemot kabeh pola (tripeptida). Perpustakaan motif sing bola-bali banget diurutake lan redundansi dibusak. Banjur, kanggo saben tripeptida ing perpustakaan motif, kita mriksa anane ing perpustakaan nggunakake alat komputasi. Ing kasus iki, frekuensi peptida sing ngemot tripeptida motif sing ditemokake ditambahake lan ditugasake menyang motif ing perpustakaan motif ("cacah motif"). Asil saka generasi motif yaiku array rong dimensi sing ngemot kabeh kedadeyan tripeptida (motif) lan nilai masing-masing, yaiku jumlah bacaan sekuensing sing ngasilake motif sing cocog nalika bacaan disaring, dikelompokake, lan diterjemahake. Metrik kaya sing diterangake kanthi rinci ing ndhuwur.
Normalisasi cacahing motif lan scatterplot sing cocog: Cacahing motif kanggo saben sampel dinormalisasi nggunakake
ing ngendi ni minangka jumlah bacaan sing ngemot topik i. Dadi, vi makili persentase frekuensi bacaan (utawa peptida) sing ngemot motif i ing sampel. Nilai-P kanggo jumlah motif sing ora dinormalisasi diitung nggunakake uji pas Fisher. Babagan korelogram jumlah motif, korelasi Spearman diitung nggunakake jumlah motif sing dinormalisasi karo R.
Kanggo nggambarake isi asam amino ing saben posisi ing perpustakaan peptida, logogram web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) digawe. Kaping pisanan, isi asam amino ing saben posisi peptida 12-mer disimpen ing matriks 20 × 12. Banjur, sakumpulan 1000 peptida sing ngemot isi asam amino relatif sing padha ing saben posisi digawe ing format urutan fasta lan diwenehake minangka input menyang logo-web 3, sing ngasilake representasi grafis saka isi asam amino relatif ing saben posisi. kanggo perpustakaan peptida sing diwenehake. Kanggo nggambarake set data multidimensi, peta panas digawe nggunakake alat sing dikembangake sacara internal ing R (biosHeatmap, paket R sing durung dirilis). Dendrogram sing ditampilake ing peta panas diitung nggunakake metode kluster hierarkis Ward kanthi metrik jarak Euclidean. Kanggo analisis statistik data penilaian motif, nilai P kanggo penilaian sing ora dinormalisasi diitung nggunakake uji pas Fisher. Nilai-P kanggo set data liyane diitung ing R nggunakake uji-t Student utawa ANOVA.
Klon fag lan fag sing dipilih tanpa sisipan diinjeksi sacara intravena liwat vena buntut (2 × 1010 fag/kewan ing 300 μl PBS). Sepuluh menit sadurunge perfusi lan fiksasi sabanjure, kewan sing padha diinjeksi sacara intravena nganggo 100 μl lektin berlabel DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 menit sawise injeksi fag, tikus diperfusi liwat jantung nganggo 50 ml PBS diikuti karo 50 ml 4% PFA/PBS. Sampel otak uga difiksasi sewengi ing 4% PFA/PBS lan direndhem ing 30% sukrosa sewengi ing suhu 4°C. Sampel dibekukan cepet ing campuran OCT. Analisis imunohistokimia saka sampel beku ditindakake ing suhu kamar ing krioseksi 30 µm sing diblokir nganggo BSA 1% lan diinkubasi karo antibodi poliklonal sing diwenehi label FITC nglawan fag T7 (Novus NB 600-376A) ing suhu 4 °C. Inkubasi sewengi. Pungkasan, potongan kasebut dikumbah kaping 3 nganggo PBS lan ditliti nganggo mikroskop laser confocal (Leica TCS SP5).
Kabeh peptida kanthi kemurnian minimal 98% disintesis dening GenScript USA, dibiotinilasi lan diliofilisasi. Biotin diiket liwat spacer triple glisin tambahan ing N-terminus. Priksa kabeh peptida nggunakake spektrometri massa.
Streptavidin (Sigma S0677) dicampur karo peptida biotinilasi sing keluwihan ekuimolar 5 kali lipat, peptida inhibitor BACE1 biotinilasi, utawa kombinasi (rasio 3:1) peptida inhibitor BACE1 biotinilasi lan peptida inhibitor BACE1 ing 5-10% DMSO/diinkubasi ing PBS. 1 jam ing suhu kamar sadurunge injeksi. Peptida konjugasi streptavidin disuntikake kanthi intravena kanthi dosis 10 mg/kg menyang salah sawijining vena buntut tikus kanthi rongga serebral.
Konsentrasi kompleks streptavidin-peptida ditaksir nganggo ELISA. Plat mikrotiter Nunc Maxisorp (Sigma) dilapisi sewengi ing suhu 4°C nganggo antibodi anti-streptavidin tikus 1,5 μg/ml (Thermo, MA1-20011). Sawise diblokir (buffer pemblokir: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatin, 1% BSA) ing suhu kamar suwene 2 jam, wisuh piring nganggo 0,05% Tween-20/PBS (buffer cuci) suwene 3 detik, sampel CSF lan plasma ditambahake ing sumur sing diencerake nganggo buffer pemblokir (plasma 1:10.000, CSF 1:115). Plat kasebut banjur diinkubasi sewengi ing suhu 4°C nganggo antibodi deteksi (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Sawisé telung langkah pencucian, streptavidin dideteksi kanthi inkubasi ing larutan substrat TMB (Roche) nganti 20 menit. Sawisé mandhegaké perkembangan warna nganggo 1M H2SO4, ukur absorbansi ing 450 nm.
Fungsi kompleks inhibitor streptavidin-peptida-BACE1 ditaksir nganggo Aβ(1-40) ELISA miturut protokol pabrikan (Wako, 294-64701). Secara ringkes, sampel CSF diencerake ing pengencer standar (1:23) lan diinkubasi sewengi ing suhu 4°C ing piring 96-sumur sing dilapisi antibodi penangkap BNT77. Sawise limang langkah pencucian, antibodi BA27 konjugasi HRP ditambahake lan diinkubasi sajrone 2 jam ing suhu 4°C, banjur limang langkah pencucian. Aβ(1–40) dideteksi kanthi inkubasi ing larutan TMB sajrone 30 menit ing suhu kamar. Sawise perkembangan warna dihentikan nganggo larutan stop, ukur absorbansi ing 450 nm. Sampel plasma diekstraksi fase padat sadurunge Aβ(1–40) ELISA. Plasma ditambahake menyang 0,2% DEA (Sigma) ing piring 96-sumur lan diinkubasi ing suhu kamar sajrone 30 menit. Sawisé ngumbah piring SPE (Oasis, 186000679) nganggo banyu lan metanol 100% kanthi berturut-turut, sampel plasma ditambahake ing piring SPE lan kabeh cairan dicopot. Sampel dikumbah (pisanan nganggo metanol 5% banjur metanol 30%) lan dielusi nganggo metanol 2% NH4OH/90%. Sawisé eluat dikeringake ing suhu 55°C sajrone 99 menit kanthi arus N2 konstan, sampel direduksi ing pengencer standar lan Aβ(1–40) diukur kaya sing diterangake ing ndhuwur.
Cara ngutip artikel iki: Urich, E. et al. Pangiriman kargo menyang otak nggunakake peptida transit sing diidentifikasi in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB lan Moos T. Pangiriman obat makromolekul menyang otak nggunakake terapi sing ditargetake. Jurnal Neurokimia 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., lan Martinez-Martinez, P. Pangiriman obat peptida lan protein ngliwati alangan getih-otak. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Hambatan getih-otak: hambatan ing pangembangan obat otak. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, lan Byrd, A. Prospek kanggo ningkatake pangiriman obat lan penargetan menyang otak liwat jalur pleksus koroid-CSF. Riset Farmasi 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisasi biofarmasi nganggo jaran Trojan molekuler kanggo pangiriman otak. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, transportasi peptida sing dimediasi reseptor WM ngliwati alangan getih-otak. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Ningkatake penetrasi otak lan efektifitas antibodi terapeutik nggunakake pesawat ulang-alik molekuler monovalen. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transportasi reseptor transferrin (TfR) nemtokake serapan otak saka varian afinitas antibodi TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).