Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. CSS euskarri mugatua duen arakatzailearen bertsio bat erabiltzen ari zara. Esperientzia onena lortzeko, arakatzaile eguneratu bat erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea). Gainera, etengabeko laguntza bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScriptik gabe erakusten dugu.
Hiru diapositiba aldi berean dituen karrusel bat erakusten du. Erabili Aurrekoa eta Hurrengoa botoiak hiru diapositiba aldi berean mugitzeko, edo erabili amaierako graduatzaile botoiak hiru diapositiba aldi berean mugitzeko.
Odol-garun hesia eta odol-garun hesia direla eta, agente bioterapikoek nerbio-sistema zentralean dituzten helburuak lortzea eragozten da, eta, horrela, gaixotasun neurologikoen tratamendu eraginkorra oztopatzen da. In vivo garuneko garraiatzaile berriak aurkitzeko, T7 fagoako peptidoen liburutegi bat sartu genuen eta odola eta likido zefalorrakideoa (LZE) serieka bildu genituen arratoien multzo kontziente handi kanulatu bat erabiliz. Fagoako klon espezifikoak LZEan aberastu ziren lau txandako hautaketa-txandaren ondoren. Banakako hautagai peptidoen probek LZEan 1000 aldiz baino gehiagoko aberastasuna erakutsi zuten. Peptidoen bidez garunera bidaltzeko bioaktibitatea berretsi zen, likido zefalorrakideoan amiloide-β maila % 40 murriztu baitzen, identifikatutako igarotze-peptido berriarekin lotutako BACE1 peptido inhibitzaile bat erabiliz. Emaitza hauek iradokitzen dute in vivo fagoen hautaketa-metodoen bidez identifikatutako peptidoak ibilgailu erabilgarriak izan daitezkeela makromolekulak garunera modu sistemikoan bidaltzeko, efektu terapeutikoa dutenak.
Nerbio-sistema zentralera (NSZ) zuzendutako terapia-ikerketak, neurri handi batean, NZZra zuzendutako propietateak dituzten sendagai eta agente optimizatuak identifikatzera bideratu du arreta, garunera sendagaien bidalketa aktiboa bultzatzen duten mekanismoak aurkitzeko ahalegin txikiagoa eginez. Hori aldatzen hasi da orain, sendagaien bidalketa, batez ere molekula handiena, neurozientzia modernoaren sendagaien garapenaren zati bat baita. Nerbio-sistema zentraleko ingurunea ondo babestuta dago garuneko hodien hesi-sistemak, odol-garuneko hesiak (BBB) ​​eta odol-garuneko hesiak (BCBB)1 osatzen dutenak, eta horrek zaildu egiten du sendagaiak garunera bidaltzea1,2. Kalkulatzen da molekula handiko ia sendagai guztiak eta molekula txikiko sendagaien % 98 baino gehiago garunetik ezabatzen direla3. Horregatik da oso garrantzitsua garuneko garraio-sistema berriak identifikatzea, sendagai terapeutikoak NZZra modu eraginkor eta espezifikoan bidaltzen dituztenak4,5. Hala ere, BBBak eta BCSFBak aukera bikaina eskaintzen dute sendagaiak emateko, garuneko egitura guztietan sartzen baitira bere baskulatura zabalaren bidez. Beraz, garunera bidaltzeko metodo ez-inbaditzaileak erabiltzeko egungo ahaleginak, neurri handi batean, BBB6 hartzaile endogenoa erabiliz hartzaileen bidezko garraioaren (PMT) mekanismoan oinarritzen dira. Transferrina hartzaileen bidea erabiliz egindako aurrerapen garrantzitsuak izan arren7,8, propietate hobetuak dituzten bidalketa-sistema berriak garatzea beharrezkoa da. Horretarako, gure helburua LKE garraioa bitartekatzeko gai diren peptidoak identifikatzea izan zen, printzipioz makromolekulak NSZra bidaltzeko edo hartzaile-bide berriak irekitzeko erabil baitaitezke. Bereziki, sistema zerebrobaskularreko hartzaile eta garraiatzaile espezifikoek (BBB eta BSCFB) bioterapeutikoen bidalketa aktibo eta espezifikorako helburu potentzial gisa balio dezakete. Bizkor-muineko likidoa (LZE) koroide plexuaren (CS) jariatze-produktu bat da eta garuneko likido interstizialarekin kontaktu zuzenean dago subaraknoide espazioaren eta bentrikulu-espazioaren bidez4. Duela gutxi frogatu da subaraknoideko biziko muineko likidoa gehiegi barreiatzen dela garuneko interstiziora9. Subaraknoideko sarrera-bide hau erabiliz edo zuzenean BBBaren bidez parenkima-espaziora sartzea espero dugu. Horretarako, in vivo fagoen hautaketa-estrategia sendo bat ezarri dugu, bi bide desberdin hauetako edozeinek garraiatutako peptidoak idealki identifikatzen dituena.
Orain, in vivo fagoak bistaratzeko bahetze-metodo sekuentzial bat deskribatzen dugu, LKE laginketa eta sekuentziazio handiko errendimenduarekin (HTS) batera erabiliz, liburutegi-dibertsitate handiena duten hasierako hautaketa-txandak kontrolatzeko. Bahetzea arratoi kontzienteetan egin zen, zisterna handi (CM) kanula finko bat zutenean, odolaren kutsadura saihesteko. Garrantzitsua da, ikuspegi honek garunera zuzendutakoak eta peptidoak hautatzen dituela, bai zerebrobaskular hesiaren zehar garraio-jarduera dutenak. T7 fagoak erabili genituen haien tamaina txikiagatik (~60 nm)10 eta iradoki genuen egokiak direla endotelio- eta/edo epitelio-muin-hesiaren zeharkaldi transzelularra ahalbidetzen duten besikula garraiatzeko. Lau txandako azterketa egin ondoren, fago-populazioak isolatu ziren, LKE aberaste sendoa eta garuneko mikrohodien elkartea erakutsiz. Garrantzitsua da, gure aurkikuntzak berretsi ahal izan genituela, hobetsi eta kimikoki sintetizatutako peptido onenak proteina-karga likido zefalorrakideora garraiatzeko gai direla erakutsiz. Lehenik eta behin, NSZren efektu farmakodinamikoak ezarri ziren, trantsizio-peptido nagusi bat BACE1 peptidoaren inhibitzaile batekin konbinatuz. In vivo funtzionalitate-bahetze estrategiek garuneko garraio-peptido berriak proteina-zama-garraiatzaile eraginkor gisa identifikatu ditzaketela frogatzeaz gain, espero dugu antzeko funtzionalitate-hautaketa-metodoak ere garrantzitsuak izatea garuneko garraio-bide berriak identifikatzeko.
Plaka eratzen duten unitateetan (PFU) oinarrituta, fagoak paketatzeko urratsaren ondoren, gutxi gorabehera 109 dibertsitatea zuen 12-mero lineal ausazko T7 fago peptidoen liburutegi bat diseinatu eta sortu zen (ikus Materialak eta Metodoak). Garrantzitsua da kontuan izatea liburutegi hau arretaz aztertu genuela in vivo panning-a egin aurretik. Aldatutako primerrak erabiliz fagoako liburutegiko laginen PCR anplifikazioan HTS-ri zuzenean aplikagarriak ziren amplikonak sortu ziren (1a irudi osagarria). a) HTS11 sekuentziazio erroreak, b) primerren (NNK)1-12 kalitatean izandako eragina, eta c) liburutegi erreserbatuan basoko fagoaren (wt) presentzia (eskeleto txertaketak), sekuentzia iragazketa prozedura bat ezarri zen egiaztatutako sekuentzia informazioa soilik ateratzeko (1b irudi osagarria). Iragazki urrats hauek HTS sekuentziazio liburutegi guztiei aplikatzen zaizkie. Liburutegi estandarrarentzat, guztira 233.868 irakurketa lortu ziren, eta horietatik % 39k iragazki irizpideak gainditu zituzten eta liburutegiaren analisi eta ondorengo txandetarako hautaketarako erabili ziren (1c-e irudi osagarria). Irakurketak nagusiki 3 base-pareren multiploak ziren, 36 nukleotidoko gailurra zutelarik (1c irudi osagarria), liburutegiaren diseinua (NNK) 1-12 baieztatuz. Aipagarria da liburutegiko kideen % 11 inguruk 12 dimentsioko mota basatiko (wt) bizkarrezurreko PAGISRELVDKL txertaketa bat zutela, eta sekuentzien ia erdiak (% 49) txertaketak edo ezabaketak zituztela. Liburutegiaren HTS-ak liburutegiko peptidoen dibertsitate handia berretsi zuen: peptido sekuentzien % 81 baino gehiago behin bakarrik aurkitu ziren eta % 1,5 bakarrik gertatu ziren ≥4 kopiatan (2a irudi osagarria). Errepertorioko 12 posizioetako aminoazidoen (aa) maiztasunak ondo korrelazionatu ziren NKK errepertorio endekatuak sortutako kodon kopururako espero ziren maiztasunekin (2b irudi osagarria). Txertaketa hauek kodetutako aa hondarren behatutako maiztasuna ondo korrelazionatu zen kalkulatutako maiztasunarekin (r = 0,893) (2c irudi osagarria). Injekziorako fago liburutegiak prestatzeak endotoxina anplifikatzeko eta kentzeko urratsak barne hartzen ditu. Aurretik frogatu da honek fago liburutegien dibertsitatea murrizten duela potentzialki12,13. Hori dela eta, endotoxina kendu zitzaion plaka-anplifikatutako fago liburutegi bat sekuentziatu genuen eta jatorrizko liburutegiarekin alderatu genuen AAren maiztasuna kalkulatzeko. Korrelazio sendo bat (r = 0,995) ikusi zen jatorrizko multzoaren eta anplifikatu eta purifikatutako multzoaren artean (2d irudi osagarria), eta horrek adierazten du T7 fagoa erabiliz plaketan anplifikatutako klonen arteko lehiak ez zuela alborapen handirik eragin. Konparazio hau liburutegi bakoitzeko tripeptido motiboen maiztasunean oinarritzen da, liburutegien dibertsitatea (~109) ezin baita guztiz jaso HTSrekin ere. Posizio bakoitzean aa-ren maiztasun-analisiak posizioaren araberako alborapen txiki bat agerian utzi zuen sartutako errepertorioaren azken hiru posizioetan (2e irudi osagarria). Ondorioz, ondorioztatu genuen liburutegiaren kalitatea eta dibertsitatea onargarriak zirela eta dibertsitatean aldaketa txikiak baino ez zirela ikusi hainbat hautaketa-txanden artean fago liburutegiak anplifikatzearen eta prestatzearen ondorioz.
Bizkor-muineko likidoaren laginketa seriatua egin daiteke arratoi kontzienteen CM-an kanula bat kirurgikoki txertatuz, BBB eta/edo BCSFB bidez zain barnetik (iv) injektatutako T7 fagoa identifikatzea errazteko (1a-b irudia). Bi hautaketa-beso independente erabili genituen (A eta B besoak) in vivo hautaketaren lehen hiru txandetan (1c irudia). Hautaketaren zorroztasuna pixkanaka handitu genuen hautaketaren lehen hiru txandetan sartutako fagoa kopuru osoa murriztuz. Laugarren hautaketa-txandan, A eta B adarreko laginak konbinatu eta hiru hautaketa independente gehigarri egin genituen. Modelo honetan T7 fagoa partikulen in vivo propietateak aztertzeko, fagoa basatia (PAGISRELVDKL master insert) injektatu zitzaien arratoiei isats-zainaren bidez. Bizkor-muineko likidotik eta odoletik fagoak denbora-puntu desberdinetan berreskuratzeak erakutsi zuen T7 ikosaedro-fagoak nahiko txikiek hasierako garbiketa-fase azkarra zutela odol-konpartimentutik (3. irudi osagarria). Administratutako tituluetan eta arratoien odol-bolumenean oinarrituta, kalkulatu genuen administratutako dosiaren % 1eko fagoa gutxi gorabehera bakarrik detektatu zela odolean zain barneko injekzioaren 10 minutura. Hasierako beherakada azkar honen ondoren, lehen mailako garbiketa motelagoa neurtu zen, 27,7 minutuko erdibizitzarekin. Garrantzitsua da, oso fago gutxi batzuk bakarrik berreskuratu zirela LKE konpartimentutik, eta horrek adierazten du motako fagoa LKE konpartimenturako migrazio-maila baxua dagoela (3. irudi osagarria). Batez beste, T7 fagoaren % 10-3 inguru eta hasieran infusioko fagoen % 4 x 10-8 baino ez ziren detektatu odolean, eta hasieran infusatutako fagoen % 10-8, berriz, likido zefalorrakideoan. Aipagarria da, motako fagoa gutxi gorabehera likido zefalorrakideoan, eta hori odolean ikusitakoaren antzekoa izan zela. Datu hauek erakusten dute LKE konpartimendua odoletik bereizten duen hesia osorik dagoela CM-kanulatutako arratoietan, eta horrek fago liburutegien in vivo hautaketa ahalbidetzen du odoletik LKE konpartimentura erraz garraiatzen diren klonak identifikatzeko.
(a) Multzo handi batetik likido zefalorrakideoa (LZE) berriro hartzeko metodo bat ezartzea. (b) Nerbio-sistema zentraleko (NSZ) hesiaren kokapen zelularra eta odol-garuneko hesia (BHE) eta odol-garuneko hesia zeharkatzen dituzten peptidoak identifikatzeko erabilitako hautaketa-estrategia erakusten duen diagrama. (c) In vivo fagoak erakusteko baheketa-fluxu-diagrama. Hautaketa-txanda bakoitzean, fagoak (gezien barruko animalien identifikatzaileak) zain barnetik injektatu ziren. Bi adar alternatibo independente (A, B) bereizita mantendu ziren hautaketa-txandara arte. 3. eta 4. hautaketa-txandetarako, LZEtik ateratako fagoako klon bakoitza eskuz sekuentziatu zen. (d) Odoletik (zirkulu gorriak) eta likido zefalorrakideotik (triangelu berdeak) isolatutako fagoako zinetika, bi arratoi kanulatutan, T7 peptido-liburutegia zain barnetik injektatu ondoren (2 x 1012 fagoak/animalia). Karratu urdinek odolean dagoen fagoaren hasierako batez besteko kontzentrazioa adierazten dute, injektatutako fago kopuruaren arabera kalkulatua, odol-bolumen osoa kontuan hartuta. Karratu beltzek odoleko fagoen kontzentrazioetatik estrapolatutako y lerroaren ebakidura-puntua adierazten dute. (e,f) Peptidoan aurkitutako tripeptido motibo gainjarri posible guztien maiztasun erlatiboa eta banaketa aurkezten dute. 1000 irakurketetan aurkitutako motiboen kopurua erakusten da. Esanguratsuki (p < 0,001) aberastutako motiboak puntu gorriekin markatuta daude. (e) Korrelazio-sakabanaketa-diagrama, injektatutako liburutegiaren tripeptido motiboaren maiztasun erlatiboa #1.1 eta #1.2 animalien odoletik eratorritako fagoarekin alderatzen duena. (f) Korrelazio-sakabanaketa-diagrama, odolean eta bizkarrezur-muineko likidoan isolatutako #1.1 eta #1.2 animalien fagoa tripeptido motiboen maiztasun erlatiboak alderatzen dituena. (g, h) Odolean aberastutako fagoa (g) injektatutako liburutegien eta LKEan aberastutako fagoa (h) odolean aberastutakoa sekuentziaren IDaren irudikapena, bi animalietan in vivo hautaketa-txanda baten ondoren. Letra bakarreko kodearen tamainak aminoazido hori posizio horretan zenbatetan agertzen den adierazten du. Berdea = polarra, morea = neutroa, urdina = basikoa, gorria = azidoa eta beltza = aminoazido hidrofoboak. 1a eta b irudiak Eduard Urichek diseinatu eta ekoitzi zituen.
Bi CM tresna-arratoietan (A eta B kladoak) fagoako peptido-liburutegi bat injektatu genien eta fagoako likido zefalorrakideotik eta odoletik isolatu genituen (1d irudia). Liburutegiaren hasierako garbiketa azkarra ez zen hain nabarmena izan fagoako mota basatiarekin alderatuta. Bi animalietan injektatutako liburutegiaren batez besteko erdibizitza 24,8 minutukoa izan zen odolean, fagoako mota basatiaren antzekoa, eta 38,5 minutukoa LKEan. Animalia bakoitzaren odoleko eta likido zefalorrakideoko fagoako laginak HTS bidez tratatu ziren eta identifikatutako peptido guztiak aztertu ziren tripeptido-motibo labur baten presentzia ikusteko. Tripeptido-motiboak aukeratu ziren egitura-eraketa eta peptido-proteina interakzioetarako oinarri minimoa eskaintzen dutelako14,15. Korrelazio ona aurkitu genuen injektatutako fagoako liburutegiaren eta bi animalien odoletik ateratako klonen artean (1e irudia). Datuek adierazten dute liburutegiaren konposizioa apur bat aberasten dela odol-konpartimentuan. Aminoazidoen maiztasunak eta adostasun-sekuentziak gehiago aztertu ziren posizio bakoitzean Weblogo16 softwarearen egokitzapen bat erabiliz. Interesgarria da odoleko glizina hondakinetan aberastasun handia aurkitu dugula (1g irudia). Odola LKEtik hautatutako klonekin alderatu zenean, hautaketa sendoa eta motiboen desehazkuntza batzuk ikusi ziren (1f irudia), eta aminoazido batzuk lehentasunez 12 kideko posizio zehatzetan zeuden (1h irudia). Aipagarria da, animalia bakoitzak nabarmen desberdintzen zuela bizkarrezur-muineko likidoan, eta odoleko glizina aberastasuna bi animalietan ikusi zela (4a-j irudi osagarria). 1.1 eta 1.2 animalien bizkarrezur-muineko likidoko sekuentzia-datuak zorrotz iragazi ondoren, guztira 964 eta 420 12-mero peptido bakar lortu ziren (1d-e irudi osagarria). Isolatutako fagoak anplifikatu eta in vivo hautaketa bigarren txanda baten menpe jarri ziren. Bigarren hautaketa txandatik ateratako fagoak HTS bidez tratatu ziren animalia bakoitzean, eta identifikatutako peptido guztiak motiboen ezagutza programa baten sarrera gisa erabili ziren tripeptido motiboen agerpena aztertzeko (2a, b, ef irudiak). LKEtik berreskuratutako fagoaren lehen zikloarekin alderatuta, A eta B adarretan LKEko motibo askoren hautaketa eta deselekzioa gehiago ikusi genituen (2. irudia). Sare identifikazio algoritmo bat aplikatu zen sekuentzia koherentearen eredu desberdinak ordezkatzen zituzten zehazteko. Antzekotasun argia ikusi zen A klado alternatiboan (2c eta d irudiak) eta B kladoan (2g eta h irudiak) LKEk berreskuratutako 12 dimentsioko sekuentzien artean. Adar bakoitzean egindako analisi metatuak hautaketa-profil desberdinak agerian utzi zituen 12-mero peptidoetarako (5c eta d irudi osagarriak) eta LKE/odol titru erlazioaren igoera denboran zehar klon metatuentzat bigarren hautaketa-txandaren ondoren, lehenengo hautaketa-txandarekin alderatuta (5e irudi osagarria).
Motiboen eta peptidoen aberastea zefalorrakideoko likidoan, in vivo fago funtzionalen bi txanda jarraian eginez.
Animalia bakoitzaren lehen txandatik (1.1 eta 1.2 animaliak) berreskuratutako likido zefalorrakideoko fagoak batu, anplifikatu, HT-sekuentziatu eta berriro injektatu ziren elkarrekin (2 x 1010 fago/animalia) 2 SM kanulatutako arratoietan (1.1 → #). 2.1 eta 2.2, 1.2 → 2.3 eta 2.4). (a,b,e,f) LKEtik eratorritako fago guztien tripeptido motiboen maiztasun erlatiboa alderatzen duten korrelazio-sakabanaketa-diagramak, lehenengo eta bigarren hautaketa-txandetan. Bi orientazioetan peptidoetan aurkitutako gainjarritako tripeptido posible guztiak adierazten dituzten motiboen maiztasun erlatiboa eta banaketa. 1000 irakurketetan aurkitutako motiboen kopurua erakusten da. Alderatu diren liburutegietako batean modu esanguratsuan (p < 0.001) hautatu edo baztertu diren motiboak puntu gorriekin nabarmenduta daude. (c, d, g, h) In vivo hautaketaren 2. eta 1. txandetan oinarritutako CSFz aberatsak diren 12 aminoazidoko sekuentzia luze guztien sekuentzia-logotipoaren irudikapena. Letra bakarreko kodearen tamainak aminoazido hori posizio horretan zenbatetan agertzen den adierazten du. Logotipoa irudikatzeko, bi hautaketa-txandaren artean animalia indibidualetatik ateratako CSF ​​sekuentzien maiztasuna alderatzen da eta bigarren txandako sekuentzia aberastuak erakusten dira: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 eta (h) #1.2–#2.4. (c, d) 2.1 eta 2.2 zenbakiko animalietan edo (g, h) 2.3 eta 2.4 zenbakiko animalietan posizio jakin batean aberastuen dauden aminoazidoak koloretan erakusten dira. Berdea = polarra, morea = neutroa, urdina = basikoa, gorria = azidoa eta beltza = aminoazido hidrofoboak.
Hirugarren hautaketa-txandaren ondoren, 124 peptido-sekuentzia bakarreko identifikatu genituen (#3.1 eta #3.2) bi animaliengandik isolatutako 332 CSF-berreraikitako fago-klonetatik (6a irudi osagarria). LGSVS sekuentziak (% 18,7) izan zuen proportzio erlatibo handiena, ondoren PAGISRELVDKL (% 8,2), MRWFFSHASQGR (% 3), DVAKVS (% 3), TWLFSLG (% 2,2) eta SARGSWREIVSLS (% 2,2) motako txertatzeek. Laugarren txandan, hiru animalia ezberdinetatik modu independentean hautatutako bi adar batu genituen (1c irudia). CSFtik berreskuratutako 925 fago-klon sekuentziatuetatik, laugarren txandan 64 peptido-sekuentzia bakarreko aurkitu genituen (6b irudi osagarria), eta horien artean fago basatiaren proportzio erlatiboa % 0,8ra jaitsi zen. Laugarren txandan CSF klon ohikoenak hauek izan ziren: LYVLHSRGLWGFKLAAALE (% 18), LGSVS (% 17), GFVRFRLSNTR (% 14), KVAWRVFSLFWK (% 7), SVHGV (% 5), GRPQKINGARVC (% 3,6) eta RLSSVDSDLSGC (% 3,2). Hautatutako peptidoen luzera-tartea nukleotidoen txertatze/ezabatzeengatik edo liburutegiko primerretan stop kodon goiztiarrek eragindakoa da, NNK liburutegiaren diseinurako kodon endekatuak erabiltzean. Stop kodon goiztiarrek peptido laburragoak sortzen dituzte eta hautatzen dira aa motibo faboragarria dutelako. Peptido luzeagoak liburutegi sintetikoen primerretan txertatze/ezabatzeengatik sor daitezke. Horrek diseinatutako stop kodona markoaren kanpoaldean kokatzen du eta irakurtzen du stop kodon berri bat agertu arte beherago. Oro har, lau hautaketa-txandetarako aberaste-faktoreak kalkulatu genituen sarrera-datuak laginaren irteera-datuekin alderatuz. Baheketaren lehen txandan, fago basatiaren tituluak erabili genituen erreferentzia ez-espezifiko gisa. Interesgarria da, fagoen hautaketa negatiboa oso indartsua izan zela LKEko lehen zikloan, baina ez odolean (3a irudia), agian peptido liburutegiko kide gehienek LKEko konpartimentuan pasiboki pasatzeko probabilitate txikia dutelako edo erlatiboak diren fagoak odoletik bakteriofagoak baino eraginkorrago atxiki edo kentzeko joera dutelako. Hala ere, bigarren birmoldaketa txandan, LKEko fagoen hautaketa sendoa ikusi zen bi kladoetan, eta horrek iradokitzen du aurreko txanda LKEko xurgapena sustatzen duten peptidoak erakusten dituzten fagoetan aberastu zela (3a irudia). Berriz ere, odolaren aberastasun nabarmenik gabe. Halaber, hirugarren eta laugarren txandetan, fago klonak nabarmen aberastu ziren LKEan. Azken bi hautaketa txandetan peptido sekuentzia bakar bakoitzaren maiztasun erlatiboa alderatuz, ikusi genuen sekuentziak are gehiago aberastu zirela laugarren hautaketa txandan (3b irudia). Guztira 931 tripeptido motibo erauzi ziren 64 peptido sekuentzia bakarretatik, bi peptido orientazioak erabiliz. Laugarren txandan aberastuen zeuden motiboek arreta handiagoz aztertu ziren txanda guztietan aberastasun-profilak, injektatutako liburutegiarekin alderatuta (muga: % 10eko aberastasuna) (6c irudi osagarria). Hautapen-eredu orokorrek erakutsi zuten aztertutako motibo gehienak bi hautaketa-adarretako aurreko txanda guztietan aberastu zirela. Hala ere, motibo batzuk (adibidez, SGL, VSG, LGS GSV) nagusiki A klado alternatibokoak ziren, eta beste batzuk (adibidez, FGW, RTN, WGF, NTR) B klado alternatiboan aberastu ziren.
Estreptabizina-kargekin konjugatutako CSFz aberastutako fago-erakustaldiko peptidoen eta biotinilatutako lider peptidoen CSF garraioaren baliozkotzea.
(a) Lau txandetan kalkulatutako aberaste-erlazioak (R1-R4), injektatutako (sarrera = I) fagoak (PFU) tituluetan eta zehaztutako LKEko fagoak tituluetan (irteera = O) oinarrituta. Azken hiru txandetako aberaste-faktoreak (R2-R4) aurreko txandarekin eta lehenengo txandarekin (R1) pisu-datuekin alderatuz kalkulatu ziren. Barra irekiak bizkarrezur-muineko likidoa dira, itzalpeko barrak plasma. (***p<0,001, Student-en t-testean oinarrituta). (b) Fagoako peptido ugarienen zerrenda, 4. hautaketa-txandaren ondoren LKEan bildutako fago guztiekiko duten proportzio erlatiboaren arabera sailkatuta. Sei fagoako klon ohikoenak kolorez nabarmenduta daude, zenbakituta eta 3. eta 4. hautaketa-txandaren arteko aberaste-faktoreak dituzte (txertatuak). (c,d) 4. txandako sei fagoako klon aberastuenak, fagoako hutsak eta gurasoen fagoako peptido liburutegiak banan-banan aztertu ziren LKEko laginketa-eredu batean. LKE eta odol laginak adierazitako denbora-puntuetan bildu ziren. (c) 6 hautagai fagoako klon (2 x 1010 fagoak/animaliak), fagoako hutsak (#1779) (2 x 1010 fagoak/animaliak) eta stock fagoako peptido liburutegiak (2 x 1012 fagoak/animaliak) kantitate berdinak injektatu. Gutxienez 3 CM eman zaizkio kanulatutako animaliari, bereizita, isats-zainaren bidez. Injektatutako fagoako klon eta fagoako peptido liburutegi bakoitzaren LKE farmakokinetika denboran zehar erakusten da. (d) Berreskuratutako fagoako/ml guztien LKE/odol erlazioaren batez bestekoa erakusten da laginketa-denboran zehar. (e) Lau lider peptido sintetiko eta kontrol nahasi bat biotinarekin lotu ziren estreptabidinara haien N-muturraren bidez (tetrameroaren bistaratzea), eta ondoren injekzioa egin zen (isats-zaina iv, 10 mg estreptabidina/kg). Gutxienez hiru arratoi intubatu (N = 3). ). LKE laginak adierazitako denbora-puntuetan bildu ziren eta estreptabidina kontzentrazioak LKE anti-estreptabidina ELISA bidez neurtu ziren (nd = ez da detektatu). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ANOVA proban oinarrituta). (f) 2002 (morea) fago peptido klon aberastuenaren aminoazido sekuentziaren eta 4. hautaketa-txandako beste fago peptido klon hautatuen arteko konparaketa. Aminoazido zati berdinak eta antzekoak kolorez kodetuta daude.
Laugarren txandan aberastutako fago guztien artean (3b irudia), sei klon hautagai hautatu ziren LKE laginketa ereduan banakako analisi gehiago egiteko. Sei fago hautagai, fago huts (txertatu gabe) eta profago peptido liburutegi kantitate berdinak injektatu zitzaizkien hiru CM animalia kanulatuetan, eta farmakokinetika LKE (3c irudia) eta odol (7. irudi osagarria) analisietan zehaztu zen. Probatutako fago klon guztiek LKE konpartimentua kontrol fago hutsaren (#1779) maila baino 10-1000 aldiz handiagoa izan zuten. Adibidez, #2020 eta #2077 klonek LKE tituluak kontrol fagoak baino 1000 aldiz handiagoak izan zituzten. Hautatutako peptido bakoitzaren farmakokinetiko profila desberdina da, baina guztiek LKEra itzultzeko gaitasun handia dute. #1903 eta #2011 klonetan denboran zehar etengabeko jaitsiera ikusi genuen, eta #2077, #2002 eta #2009 klonetan, berriz, lehenengo 10 minutuetan igoera batek garraio aktiboa adieraz dezake, baina egiaztatu behar da. #2020, #2002 eta #2077 klonak maila altuetan egonkortu ziren, eta #2009 kloneko LKEren kontzentrazioa poliki-poliki jaitsi zen hasierako igoeraren ondoren. Ondoren, LKE hautagai bakoitzaren maiztasun erlatiboa odoleko kontzentrazioarekin alderatu genuen (3d irudia). LKE hautagai bakoitzaren batez besteko tituluaren eta odoleko tituluaren arteko korrelazioak laginketa-denbora guztietan erakutsi zuen sei hautagaietatik hiruk odoleko LKEan aberastu zirela nabarmen. Interesgarria da, #2077 klonak odol-egonkortasun handiagoa erakutsi zuela (7. irudi osagarria). Peptidoek beraiek gai direla LKE konpartimentura fago-partikulak ez diren beste zama batzuk aktiboki garraiatzeko, lau lider peptido sintetizatu genituen, biotinarekin deribatuta, peptidoak fago-partikulari lotzen zaizkion N-muturrean. Biotinilatutako peptidoak (2002, 2009, 2020 eta 2077 zk.) estreptabidinaz (SA) konjugatu ziren, fagoak dituzten geometriak imitatzen zituzten forma multimerikoak lortzeko. Formatu honek, gainera, SAren esposizioa odolean eta bizkarrezur-muineko likidoan neurtzea ahalbidetu zigun, karga garraiatzen duten proteina peptido gisa. Garrantzitsua da, fagoak dituzten datuak askotan erreproduzitu ahal izatea peptido sintetikoak SA-konjugatutako formatu honetan administratzen zirenean (3e irudia). Nahasitako peptidoek hasierako esposizio txikiagoa izan zuten eta LKEko garbiketa azkarragoa izan zuten, 48 orduko epean maila detektatu ezinik. Fagoak dituzten peptido klon hauen LKEko espazioan duten banaketa bideei buruzko informazioa lortzeko, fagoak dituzten peptidoen banakako kokapena aztertu genuen immunohistokimika (IHC) erabiliz, in vivo zain barneko injekzioaren ondoren ordubete igaro ondoren fagoak dituzten partikulak zuzenean detektatzeko. Azpimarratzekoa da #2002, #2077 eta #2009 klonak detektatu ahal izan zirela garuneko kapilarretan tindaketa sendoaren bidez, kontrol-fagoa (#1779) eta #2020 klona, ​​berriz, ez zirela detektatu (8. irudi osagarria). Horrek iradokitzen du peptido hauek garuneko efektuan laguntzen dutela zehazki BBB zeharkatuz. Hipotesi hau probatzeko analisi zehatzagoa behar da, BSCFB bidea ere inplikatuta egon baitaiteke. Klon aberastuenaren (#2002) aminoazidoen sekuentzia hautatutako beste peptido batzuekin alderatzean, ikusi zen horietako batzuek aminoazidoen luzapen antzekoak dituztela, eta horrek garraio-mekanismo antzekoa adieraz dezakeela (3f irudia).
Bere plasma-profil bereziari eta denboran zehar LKEren igoera nabarmenari esker, #2077 fago-erakustaldi klona 48 orduko epean gehiago aztertu zen eta SA maila mantenduekin lotuta behatutako LKEren igoera azkarra erreproduzitu ahal izan zuen (4a irudia). Identifikatutako beste fago-klonei dagokienez, #2077ak garuneko kapilarrei tindaketa sendoa egin zien eta kapilar markatzaile lektinarekin kolokalizazio esanguratsua erakutsi zuen bereizmen handiagoan ikusita, eta baliteke parenkima-espazioan tindaketa batzuk egotea (4b irudia). Peptidoek bitartekatutako efektu farmakologikoak NSZn lor zitezkeen ikertzeko, esperimentu bat egin genuen, non i) #2077 trantsizio-peptidoaren eta ii) BACE1 inhibitzaile peptidoaren bertsio biotinilatuak SArekin nahastu ziren bi proportzio desberdinetan. Konbinazio baterako BACE1 peptido inhibitzailea bakarrik erabili genuen eta besterako BACE1 peptido inhibitzailearen eta #2077 peptidoaren arteko 1:3 proportzioa erabili genuen. Bi laginak zain barnetik eman ziren eta beta-amiloide peptido 40 (Abeta40) odoleko eta bizkarrezur-muineko likidoko mailak denboran zehar neurtu ziren. Abeta40 LZNn neurtu zen, garuneko parenkiman BACE1 inhibizioa islatzen baitu. Espero bezala, bi konplexuek nabarmen murriztu zuten Abeta40 odoleko mailak (4c eta d irudiak). Hala ere, 2077 peptidoaren eta SArekin konjugatutako BACE1 peptidoaren inhibitzaile baten nahasketa zuten laginetan bakarrik eragin zen Abeta40 nabarmen jaistea bizkarrezur-muineko likidoan (4c irudia). Datuek erakusten dute 2077 peptidoak 60 kDa-ko SA proteina NSZra garraiatzeko gai dela eta efektu farmakologikoak ere eragiten dituela BACE1 peptidoaren SArekin konjugatutako inhibitzaileekin.
(a) T7 fagoaren injekzio klonala (2 × 10 fagoak/animalia), CSF peptido #2077 (RLSSVDSDLSGC) eta injektatu gabeko kontrol fagoa (#1779) gutxienez hiru CM-intubatu arratoietan farmakokinetika-profil luzeak erakusten dituena. (b) Fagoak injektatutako arratoietan (2 × 10 10 fagoak/animalia) kortex-mikrohodien irudi mikroskopiko konfokala, #2077 peptidoaren eta hodien (lektina) kontra-tintura erakusten duena. Fagoak klon hauek 3 arratoiri eman zitzaizkien eta ordubetez zirkulatzen utzi ziren perfusioa egin aurretik. Garunak sekzionatu eta T7 fagoaren kapsidaren aurkako FITC markatutako antigorputz poliklonalekin tindatu ziren. Perfusioa eta ondorengo finkapena baino hamar minutu lehenago, DyLight594 markatutako lektina zain barnetik eman zen. Irudi fluoreszenteak, mikrohodien eta fagoen alde luminaleko lektinaren tindaketa (gorria) erakusten dutenak, kapilar-hodien lumenean eta garuneko ehun peribaskularrean. Eskala-barra 10 µm-ri dagokio. (c, d) Biotinilatutako BACE1 inhibitzaile peptidoa, bakarrik edo biotinilatutako #2077 trantsizio-peptidoarekin konbinatuta, estreptabidinari akoplatu zitzaion, eta ondoren gutxienez hiru CM arratoi kanulatuei zain barneko injekzioa eman zitzaien (10 mg estreptabidina/kg). BACE1 peptidoaren inhibitzaileak eragindako Aβ40-ren murrizketa Aβ1-40 ELISA bidez neurtu zen odolean (gorria) eta bizkarrezur-muineko likidoan (laranja) adierazitako denbora-puntuetan. Argitasun hobea lortzeko, puntu-lerro bat marraztu da grafikoan % 100eko eskalan. (c) 2077 trantsizio-peptidoarekin eta BACE1 inhibitzaile-peptidoarekin 3:1 proportzioan konjugatutako estreptavidinaz tratatutako arratoietan Aβ40-ren ehuneko murrizketa odolean (triangelu gorriak) eta bizkarrezur-muineko likidoan (triangelu laranjak). (d) BACE1 inhibitzaile-peptido batekin akoplatutako estreptavidinaz soilik tratatutako arratoien odoleko Aβ40-ren (zirkulu gorriak) eta bizkarrezur-muineko likidoan (zirkulu laranjak) ehuneko murrizketa. Kontrol-taldean Aβ-ren kontzentrazioa 420 pg/ml izan zen (desbideratze estandarra = 101 pg/ml).
Fagoen bistaratze-metodoa arrakastaz aplikatu da ikerketa biomedikoaren hainbat arlotan17. Metodo hau in vivo baskular aniztasuneko ikerketetarako erabili da18,19, baita garuneko hodiak helburu dituzten ikerketetarako ere20,21,22,23,24,25,26. Ikerketa honetan, hautaketa-metodo honen aplikazioa ez dugu garuneko hodiak helburu dituzten peptidoen identifikazio zuzenera bakarrik zabaldu, baita odol-garuneko hesia zeharkatzeko garraio aktiboko propietateak dituzten hautagaiak aurkitzeko ere. Orain, CM intubatutako arratoietan in vivo hautaketa-prozedura baten garapena deskribatzen dugu eta LKEren etxeratze-propietateak dituzten peptidoak identifikatzeko duen potentziala erakusten dugu. 12-mero ausazko peptidoen liburutegi bat erakusten duen T7 fagoa erabiliz, frogatu ahal izan genuen T7 fagoa nahikoa txikia dela (gutxi gorabehera 60 nm-ko diametroa)10 odol-garuneko hesira egokitzeko, eta horrela odol-garuneko hesia edo koroide-plexua zuzenean zeharkatzeko. Ikusi genuen kanulatutako CM arratoietatik LKE biltzea in vivo funtzionalki ondo kontrolatutako bahetze-metodoa zela, eta ateratako fagoak ez zuela baskulatura lotzen bakarrik, baizik eta odol-garun hesia zeharkatzen duen garraiatzaile gisa ere funtzionatzen zuela. Gainera, odola bildu eta LKEri eta odoletik eratorritako fagoei aldi berean aplikatuz, baieztatu genuen LKEaren aukeraketa ez zegoela odolaren aberasteak edo hautaketa-txandaren arteko hedapenerako egokitasunak eraginik. Hala ere, odol-konpartimentua hautaketa-prozeduraren parte da, LKE konpartimentura iristeko gai diren fagoak odolean bizirik iraun eta zirkulatu behar baitute garunean aberasteko adina denbora. HTS datu gordinetatik sekuentzia-informazio fidagarria ateratzeko, plataforma espezifikoen sekuentziazio-erroreetara egokitutako iragazkiak ezarri genituen analisi-fluxuan. Parametro zinetikoak bahetze-metodoan sartuz, T7 fago basatien farmakokinetika azkarra baieztatu genuen (t½ ~ 28 min) odolean24, 27, 28 eta baita haien erdibizitza zehaztu ere bizkarrezur-muineko likidoan (t½ ~ 26 min) minutuko. Odolean eta LKEan farmakokinetika-profil antzekoak izan arren, fagoaren odol-kontzentrazioaren % 0,001 baino ez zen detektatu LKEan, eta horrek T7 fago basatiaren mugikortasun txikia adierazten du odol-garuneko hesia zeharkatuz. Lan honek lehen hautaketa-txandaren garrantzia azpimarratzen du in vivo panning estrategiak erabiltzean, batez ere zirkulaziotik azkar kentzen diren fago sistemetarako, klon gutxi baitira gai NSZ konpartimentura iristeko. Beraz, lehen txandan, liburutegiaren dibertsitatearen murrizketa oso handia izan zen, azkenean klon kopuru mugatu bat baino ez baitzen bildu LKE eredu oso zorrotz honetan. In vivo panning estrategia honek hainbat hautaketa-urrats barne hartu zituen, hala nola LKE konpartimentuan metaketa aktiboa, klonen biziraupena odol-konpartimentuan eta T7 fago klonak odoletik azkar kentzea lehen 10 minutuetan (1d irudia eta 4M irudi osagarria). Horrela, lehen txandaren ondoren, fago klon desberdinak identifikatu ziren LKEan, nahiz eta hasierako multzo bera erabili zen animalia bakoitzarentzat. Horrek iradokitzen du liburutegi-kide kopuru handia duten iturburu-liburutegietarako hautaketa-urrats zorrotz anitzek dibertsitatea nabarmen murrizten dutela. Beraz, ausazko gertaerak hasierako hautaketa-prozesuaren parte izango dira, emaitzan eragin handia izango dutelarik. Litekeena da jatorrizko liburutegiko klon askok CSF aberasteko joera oso antzekoa izatea. Hala ere, baldintza esperimental berdinetan ere, hautaketa-emaitzak desberdinak izan daitezke hasierako multzoan klon bakoitzaren kopuru txikia dela eta.
LKEan aberastutako motiboak odolean daudenetatik desberdinak dira. Interesgarria da, glizinaz aberatsak diren peptidoen lehen aldaketa ikusi dugula animalia bakoitzaren odolean. (1g irudia, 4e eta 4f irudi osagarriak). Glizina peptidoak dituzten fagoak egonkorragoak izan daitezke eta zirkulaziotik ateratzeko aukera gutxiago dute. Hala ere, glizinaz aberatsak diren peptido hauek ez dira detektatu bizkarrezur-muineko likidoaren laginetan, eta horrek iradokitzen du liburutegi zainduek bi hautaketa-urrats desberdin igaro zituztela: bat odolean eta beste bat bizkarrezur-muineko likidoan metatzen utzi. Laugarren hautaketa-txandatik sortutako LKEan aberastutako klonak sakonki probatu dira. Banaka probatutako klon ia guztiak LKEan aberastuta zeudela baieztatu zen kontrol-fagoa hutsarekin alderatuta. Peptido-asmakizun bat (#2077) xehetasun gehiagorekin aztertu zen. Plasmako erdibizitza luzeagoa erakutsi zuen beste asmakizunekin alderatuta (3d irudia eta 7. irudi osagarria), eta interesgarria da, peptido honek zisteina-hondakin bat zuela C-muturrean. Duela gutxi frogatu da zisteina peptidoei gehitzeak haien propietate farmakokinetikoak hobetu ditzakeela albumina 29ri lotuz. Hau ezezaguna da oraingoz 2077 peptidoarentzat eta ikerketa gehiago behar ditu. Peptido batzuek balentzia-mendekotasuna erakutsi zuten LKE aberastean (datuak ez dira erakusten), eta hori T7 kapsidaren gainazaleko geometria erakutsiarekin erlazionatuta egon daiteke. Erabili dugun T7 sistemak peptido bakoitzaren 5-15 kopia erakutsi zituen fago partikula bakoitzeko. IHC arratoien garuneko kortexean zain barnetik injektatutako fago klon hautagaietan egin zen (8. irudi osagarria). Datuek erakutsi zuten gutxienez hiru klonek (2002 zk., 2009 zk. eta 2077 zk.) BBBarekin elkarreragin zutela. Zehaztu behar da BBBaren elkarreragin honek LKE metatzea eragiten duen edo klon horiek zuzenean BCSFBra mugitzea eragiten duen. Garrantzitsua da erakusten dugula hautatutako peptidoek LKE garraiatzeko gaitasuna mantentzen dutela sintetizatu eta proteina kargari lotzen zaizkionean. N-terminal biotinilatutako peptidoen SA-ri lotzeak funtsean errepikatzen ditu dagokien fago klonekin odolean eta bizkarrezur-muineko likidoan lortutako emaitzak (3e irudia). Azkenik, erakusten dugu 2077 peptido nagusiak SA-ri konjugatutako BACE1-en biotinilatutako peptido inhibitzaile baten garuneko ekintza sustatzeko gai dela, NSZ-n efektu farmakodinamiko nabarmenak eraginez, LZB-ko Abeta40 mailak nabarmen murriztuz (4. irudia). Ez genuen homologorik identifikatu datu-basean, emaitza guztien peptido sekuentzia homologia bilaketa bat eginez. Garrantzitsua da kontuan izatea T7 liburutegiaren tamaina gutxi gorabehera 109 dela, eta 12-meroen liburutegiaren tamaina teorikoa, berriz, 4 x 1015 dela. Beraz, 12-meroen peptido liburutegiaren dibertsitate espazioaren zati txiki bat bakarrik hautatu dugu, eta horrek esan dezake peptido optimizatuagoak identifikatu daitezkeela identifikatutako emaitza horien ondoko sekuentzia espazioa ebaluatuz. Hipotetikoki, peptido hauen homologo naturalik aurkitu ez izanaren arrazoietako bat eboluzioan zehar egindako deselekzioa izan daiteke, peptido motibo batzuk garunean kontrolik gabe sartzea saihesteko.
Gure emaitzek, oro har, etorkizuneko lanetarako oinarri bat eskaintzen dute, in vivo garuneko baskular-hesiaren garraio-sistemak xehetasun gehiagorekin identifikatu eta karakterizatzeko. Metodo honen oinarrizko konfigurazioa hautaketa funtzionalaren estrategia batean oinarritzen da, eta horrek ez ditu soilik garuneko baskular-hesiaren lotura-propietateak dituzten klonak identifikatzen, baizik eta urrats kritiko bat ere barne hartzen du, non klon arrakastatsuek in vivo hesi biologikoak zeharkatzeko jarduera intrintsekoa duten NSZ konpartimentuan sartzeko. Helburua peptido hauen garraio-mekanismoa eta garuneko eskualde espezifikoari lotutako mikrobaskulatura lotzeko duten lehentasuna argitzea da. Horrek BHE eta errezeptoreak garraiatzeko bide berriak aurkitzera eraman dezake. Espero dugu identifikatutako peptidoek zuzenean lotu ahal izango direla errezeptore zerebrobaskularrei edo BHE edo BCSFB bidez garraiatutako zirkulazioan dauden ligandoei. Lan honetan aurkitutako LKE garraio-jarduera duten peptido bektoreak gehiago ikertuko dira. Gaur egun, peptido hauen garuneko espezifikotasuna ikertzen ari gara BHE eta/edo BCSFB zeharkatzeko duten gaitasunari dagokionez. Peptido berri hauek oso tresna baliotsuak izango dira hartzaile edo bide berriak aurkitzeko eta makromolekulak, hala nola biologikoak, garunera eramateko plataforma eraginkor berriak garatzeko.
Kanulatu zisterna handia (CM) aurretik deskribatutako metodoaren aldaketa bat erabiliz. Anesteziatutako Wistar arratoiak (200-350 g) estereotaxia aparatu batean jarri ziren eta ebaki ertain bat egin zen bizarra moztu eta aseptikoki prestatutako buru-azalaren gainean, burezurra agerian uzteko. Zulatu bi zulo goiko gerrikoan eta lotu finkatze-torlojuak zuloetan. Beste zulo bat zulatu zen alboko okzipital-gandorrean altzairu herdoilgaitzezko kanula bat CM-n estereotaktikoki gidatzeko. Jarri hortz-zementua kanularen inguruan eta finkatu torlojuekin. Foto-sendotu eta zementua gogortu ondoren, azaleko zauria 4/0 supramid jostura batekin itxi zen. Kanularen kokapen egokia baieztatzen da bizkarrezur-muineko likidoaren (LZE) isuri espontaneoaren bidez. Atera arratoia estereotaxia aparatutik, jaso ebakuntza osteko arreta egokia eta mina kudeatzeko, eta utzi gutxienez astebetez sendatzen, bizkarrezur-muineko likidoan odol zantzuak ikusi arte. Wistar arratoiak (Crl:WI/Han) Charles River-etik (Frantzia) lortu ziren. Arratoi guztiak patogenorik gabeko baldintza espezifikoetan mantendu ziren. Animaliekin egindako esperimentu guztiak Basileako (Suitza) Hiriko Albaitaritza Bulegoak onartu zituen, eta 2474 zenbakidun Animalien Lizentziaren arabera egin ziren (Garuneko Garraio Aktiboaren Ebaluazioa, Arratoien Bizkor-muineko Likidoan eta Garunean Hautagai Terapeutikoen Mailak Neurtuz).
Mantendu arratoia kontziente astiro CM kanula eskuan duela. Kendu Datura kanulatik eta bildu 10 µl likido zefalorrakideo espontaneoki isurtzen denetik. Kanularen iragazkortasuna azkenean arriskuan jarri zenez, odol-kutsaduraren edo koloreztatzearen zantzurik gabeko likido zefalorrakideoaren lagin gardenak baino ez ziren sartu ikerketa honetan. Aldi berean, 10-20 μl odol inguru hartu ziren isatsaren puntan zegoen ebaki txiki batetik heparina zuten hodietara (Sigma-Aldrich). LKE eta odola bildu ziren T7 fagoa zain barneko injekzioaren ondoren hainbat unetan. Gutxi gorabehera 5-10 μl fluido baztertu ziren LKE lagin bakoitza bildu aurretik, eta hori kateterraren bolumen hilari dagokio.
Liburutegiak T7Select 10-3b bektorea erabiliz sortu ziren, T7Select sistemaren eskuliburuan deskribatzen den bezala (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Laburbilduz, 12 mer-eko DNA txertaketa ausazko bat sintetizatu zen formatu honetan:
NNK kodona erabili zen stop kodon bikoitzak eta txertatutako aminoazidoen gehiegizko adierazpena saihesteko. N nukleotido bakoitzaren eskuz nahastutako proportzio ekuimolarra da, eta K adenina eta zitosina nukleotidoen eskuz nahastutako proportzio ekuimolarra. Kate bakarreko eskualdeak DNA bikoitz bihurtu ziren dNTP (Novagen) eta Klenow entzimarekin (New England Biolabs) Klenow bufferrean (New England Biolabs) 3 orduz 37 °C-tan inkubatuz. Erreakzioaren ondoren, DNA bikoitza berreskuratu zen EtOH prezipitazio bidez. Sortutako DNA EcoRI eta HindIII murrizketa-entzimekin digeritu zen (biak Roche-koak). Ondoren, zatitutako eta purifikatutako (QIAquick, Qiagen) txertatutako materiala (T4 ligasa, New England Biolabs) marko barruan lotu zen aurrez zatitutako T7 bektore batean, 10B kapside genearen 348. aminoazidoaren ondoren. Ligadura-erreakzioak 16 °C-tan inkubatu ziren 18 orduz in vitro ontziratu aurretik. In vitro fagoen ontziratzea T7Select 10-3b klonazio kitarekin (Novagen) emandako argibideen arabera egin zen eta ontziratze-soluzioa behin anplifikatu zen lisiraino Escherichia coli (BLT5615, Novagen) erabiliz. Lisatuak zentrifugatu, titratu eta -80 °C-tan izoztu ziren glizerolaren stock soluzio gisa.
PCR zuzeneko anplifikazioa saldan edo plakan anplifikatutako fagoen eskualde aldakorrak 454/Roche-amplikon fusio primer jabedunak erabiliz. Aurrerako fusio primerrak eskualde aldakorraren (NNK) 12 (txantiloi-espezifikoa), GS FLX Titanium Adapter A eta lau baseko liburutegiko gako-sekuentzia (TCAG) alboetan dauden sekuentziak ditu (1a irudi osagarria):
Alderantzizko fusio-primerrak biotina ere badu harrapaketa-aleei lotuta, eta emultsio-PCRan zehar anplifikazio klonalerako beharrezkoa den GS FLX Titanium Adapter B:
Amplikonak 454/Roche pirosekuentziaziora eraman ziren 454 GS-FLX Titanium protokoloaren arabera. Sanger sekuentziazio manualerako (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 fagoaren DNA PCR bidez anplifikatu eta sekuentziatu zen primer bikote hauekin:
Plaka indibidualetatik ateratako txertaketak PCR anplifikaziora eraman ziren Roche Fast Start DNA Polymerase Kit erabiliz (fabrikatzailearen argibideen arabera). Abiarazte beroa egin (10 min 95 °C-tan) eta 35 indartze ziklo (50 s 95 °C-tan, 1 min 50 °C-tan eta 1 min 72 °C-tan).
Liburutegietako fagoak, fagoak basatiak, LKEtik eta odoletik erreskatatutako fagoak edo banakako klonak Escherichia coli BL5615-en anplifikatu ziren TB saldan (Sigma Aldrich) edo 500 cm2-ko plaketan (Thermo Scientific) 4 orduz 37 °C-tan. Fagoak plaketatik erauzi ziren plakak Tris-EDTA bufferrean (Fluka Analytical) garbituz edo plakak pipeta puntak esterilak erabiliz bilduz. Fagoak kultura-gainjariotik edo erauzketa-bufferretik isolatu ziren polietilen glikolaren (PEG 8000) prezipitazio-txanda batekin (Promega) eta Tris-EDTA bufferrean berriro eseki ziren.
Anplifikatutako fagoa 2-3 txandatan kendu zen endotoxina, endotoxinak kentzeko aleak erabiliz (Miltenyi Biotec), zain barneko (IV) injekzioa eman aurretik (500 μl/animalia). Lehenengo txandan, 2×1012 fagoak sartu ziren; bigarrenean, 2×1010 fagoak; hirugarren eta laugarren hautaketa-txandetan, 2×109 fagoak animalia bakoitzeko. Adierazitako denbora-puntuetan bildutako LKE eta odol-laginen fagoak plaka-zenbaketaren bidez zehaztu ziren, fabrikatzailearen argibideen arabera (T7Select sistemaren eskuliburua). Fagoak hautatzea liburutegi purifikatuak isats-zainera zain barneko injekzio bidez edo aurreko hautaketa-txandatik LKEtik ateratako fagoak berriro injekzio bidez egin ziren, eta ondorengo bilketak 10 minutu, 30 minutu, 60 minutu, 90 minutu, 120 minutu, 180 minutu eta 240 minututan egin ziren, hurrenez hurren, LKE eta odol laginen kasuan. Guztira lau in vivo panning txanda egin ziren, eta bertan hautatutako bi adarrak bereizita gorde eta aztertu ziren lehen hiru hautaketa txandetan. Lehen bi hautaketa txandetatik CSFtik ateratako fago txertatze guztiak 454/Roche pirosekuentziazioa jasan zuten, eta azken bi hautaketa txandetatik CSFtik ateratako klon guztiak eskuz sekuentziatu ziren. Lehen hautaketa txandako odol-fago guztiak ere 454/Roche pirosekuentziazioa jasan zuten. Fago klonak injektatzeko, hautatutako fagoak E. coli-n (BL5615) anplifikatu ziren 500 cm2-ko plaketan 37 °C-tan 4 orduz. Banaka hautatutako eta eskuz sekuentziatutako klonak TB medioan hedatu ziren. Fagoak erauzi, purifikatu eta endotoxina kendu ondoren (goian deskribatu bezala), 2×1010 fago/animalia 300 μl-tan zain barnetik injektatu ziren isats-zain batean.
Sekuentzia-datuen aurreprozesamendua eta iragazketa kualitatiboa. 454/Roche datu gordinak mapa-fluxu estandar bitar batetik (sff) Pearson gizakiek irakur dezaketen formatura (fasta) bihurtu ziren saltzailearen softwarea erabiliz. Nukleotido-sekuentziaren prozesamendu gehiago C programa eta script jabedunak erabiliz egin zen (argitaratu gabeko software paketea), behean deskribatzen den bezala. Lehen mailako datuen analisiak iragazketa-prozedura zorrotzak barne hartzen ditu etapa anitzekoetan. 12 mer txertatze-DNA sekuentzia baliozkorik ez zuten irakurketak iragazteko, irakurketak sekuentzialki lerrokatu ziren hasierako etiketarekin (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), amaierako etiketarekin (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) eta atzeko planoko txertatzearekin (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) Needleman-Wunsch proba globala erabiliz. Lerrokatzeak lerrokatze bakoitzeko 2 inkoherentzia onartzen ditu31. Beraz, hasierako eta amaierako etiketarik gabeko irakurketak eta atzeko planoko txertatzeak dituzten irakurketak, hau da, desadostasun kopuru baimendua gainditzen duten lerrokatzeak, liburutegitik kendu ziren. Gainerako irakurketei dagokienez, hasiera markatik eta amaiera markaren aurretik amaitzen den N-mero DNA sekuentzia jatorrizko irakurketa sekuentziatik moztu eta gehiago prozesatu zen (aurrerantzean "txertatu"). Txertatuaren itzulpenaren ondoren, primerraren 5' muturrean dagoen lehen stop kodonaren ondorengo zatia txertatutik kentzen da. Horrez gain, primerraren 3' muturrean kodon osatugabeetara eramaten duten nukleotidoak ere kendu ziren. Atzeko planoko sekuentziak soilik zituzten txertaketak baztertzeko, "PAG" aminoazido ereduarekin hasten diren itzulitako txertaketak ere kendu ziren. 3 aminoazido baino gutxiagoko itzulpen osteko luzera zuten peptidoak liburutegitik kendu ziren. Azkenik, txertatze multzoko erredundantzia kendu eta txertatze bakoitzaren maiztasuna zehaztu. Analisiaren emaitzek nukleotido sekuentzien (txertaketen) zerrenda bat eta haien (irakurketa) maiztasunak barne hartu zituzten (1c eta 2 irudi osagarriak).
N-mero DNA txertaketak sekuentzia-antzekotasunaren arabera taldekatzea: 454/Roche-ren sekuentziazio-errore espezifikoak (homopolimeroen luzapenen sekuentziazioarekin arazoak, adibidez) eta garrantzi gutxiagoko erredundantziak kentzeko, aurretik iragazitako N-mero DNA sekuentzia txertaketak (txertaketak) antzekotasunaren arabera ordenatzen dira. txertaketak (gehienez 2 base ez-bat etor daitezke) honela definitutako algoritmo iteratibo bat erabiliz: txertaketak lehenik maiztasunaren arabera ordenatzen dira (handienetik txikienera), eta berdinak badira, bigarren mailako ordenazioaren arabera luzeraren arabera (luzenetik laburrenera)). Horrela, txertaketa maizenek eta luzeenek lehen "taldea" definitzen dute. Talde-maiztasuna gako-maiztasunera ezartzen da. Ondoren, ordenatutako zerrendan geratzen den txertaketa bakoitza taldera gehitzen saiatu zen bikoteka Needleman-Wunsch lerrokatze bidez. Lerrokatze bateko desadostasunen, txertaketen edo ezabaketen kopuruak 2ko atalasea gainditzen ez badu, txertaketa bat gehitzen zaio taldera, eta talde-maiztasun orokorra txertaketa zenbat aldiz gehitu den arabera handitzen da. Talde bati gehitzen zaizkion txertaketak erabilitzat markatzen dira eta prozesamendu gehiagotik kanpo uzten dira. Txertatze-sekuentzia ezin bada dagoeneko existitzen den talde bati gehitu, txertatze-sekuentzia hori erabiltzen da txertatze-maiztasun egokiarekin talde berri bat sortzeko eta erabilitako gisa markatzeko. Iterazioa amaitzen da txertatze-sekuentzia bakoitza talde berri bat osatzeko erabili denean edo dagoeneko existitzen den talde batean sar daitekeenean. Azken finean, nukleotidoz osatutako txertatze multzokatuak peptido-sekuentzietan (peptido-liburutegietan) itzultzen dira azkenean. Analisiaren emaitza txertatze-multzo bat eta dagokien maiztasunak dira, irakurketa jarraituen kopurua osatzen dutenak (2. irudi osagarria).
Motiboen Sorkuntza: Peptido bakarren zerrenda batean oinarrituta, behean erakusten den bezala aminoazido-eredu (aa) posible guztiak dituen liburutegi bat sortu zen. 3 luzerako eredu posible bakoitza peptidotik atera zen eta bere alderantzizko eredua gehitu zen, eredu guztiak (tripeptidoak) dituen motibo-liburutegi komun batekin batera. Oso errepikakorrak diren motiboen liburutegiak sekuentziatu ziren eta erredundantzia kendu zen. Ondoren, motibo-liburutegiko tripeptido bakoitzerako, liburutegian duen presentzia egiaztatu genuen tresna konputazionalak erabiliz. Kasu honetan, aurkitutako motibo-tripeptidoa duen peptidoaren maiztasuna gehitu eta motibo-liburutegiko motiboari esleitzen zaio (“motibo kopurua”). Motiboen sorreraren emaitza tripeptidoen (motiboen) agerpen guztiak eta haien balioak dituen bi dimentsioko matrizea da, hau da, irakurketak iragazi, taldekatu eta itzuli direnean dagokion motiboa ematen duten sekuentziazio-irakurketa kopurua. Metrikak goian zehatz-mehatz deskribatutako moduan.
Motibo kopuruaren eta dagokien sakabanaketa-diagramen normalizazioa: Lagin bakoitzeko motibo kopurua normalizatu zen erabiliz
non ni i gaia duten irakurketa kopurua den. Beraz, vi-k laginaren i motiboa duten irakurketa (edo peptidoen) ehuneko maiztasuna adierazten du. Motibo kopuru ez-normalizatuaren P-balioak Fisherren proba zehatza erabiliz kalkulatu ziren. Motibo kopuruaren korrelogramei dagokienez, Spearman-en korrelazioak R-rekin motibo kopuru normalizatua erabiliz kalkulatu ziren.
Peptido liburutegiko posizio bakoitzeko aminoazidoen edukia bistaratzeko, 32, 33 web logogramak (http://weblogo.threeplusone.com) sortu ziren. Lehenik eta behin, 12-mero peptidoaren posizio bakoitzeko aminoazidoen edukia 20×12 matrize batean gordetzen da. Ondoren, posizio bakoitzean aminoazidoen eduki erlatibo bera duten 1000 peptidoko multzo bat sortzen da fasta-sequence formatuan eta sarrera gisa ematen zaio web-logo 3ri, eta honek peptido liburutegi jakin baterako posizio bakoitzeko aminoazidoen eduki erlatiboaren irudikapen grafikoa sortzen du. Dimentsio anitzeko datu-multzoak bistaratzeko, bero-mapak sortu ziren R-n barnean garatutako tresna bat erabiliz (biosHeatmap, oraindik argitaratu gabe dagoen R paketea). Bero-mapetan aurkeztutako dendrogramak Ward-en multzokatze hierarkikoko metodoa erabiliz kalkulatu ziren, distantzia euklidear metrikarekin. Motiboen puntuazio-datuen analisi estatistikorako, puntuazio ez-normalizaturako P balioak Fisher-en proba zehatza erabiliz kalkulatu ziren. Beste datu-multzoen P-balioak R-n kalkulatu ziren Student-en t-testa edo ANOVA erabiliz.
Hautatutako fagoako klonak eta txertaketarik gabeko fagoak zain barnetik injektatu ziren isats-zainaren bidez (2×1010 fago/animalia 300 μl PBS-tan). Perfusioa eta ondorengo finkapena baino hamar minutu lehenago, animalia berdinei 100 μl DyLight594 markatutako lektina injektatu zitzaien zain barnetik (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Fagoa injektatu eta 60 minutura, arratoiei bihotzean 50 ml PBS perfusatu zitzaien, eta ondoren 50 ml % 4 PFA/PBS. Garuneko laginak, gainera, gau osoan % 4 PFA/PBS-tan finkatu ziren eta gau osoan % 30 sakarosan busti ziren 4 °C-tan. Laginak OCT nahastean izoztu ziren. Izoztutako laginen immunohistologia-analisia giro-tenperaturan egin zen, %1 BSArekin blokeatutako 30 µm-ko kriosekzioetan, eta T7 fagoaren aurkako FITC markatutako antigorputz poliklonalekin (Novus NB 600-376A) inkubatu ziren 4 °C-tan. Gau osoan inkubatu. Azkenik, sekzioak 3 aldiz garbitu ziren PBSrekin eta mikroskopio laser konfokal batekin (Leica TCS SP5) aztertu ziren.
% 98ko gutxieneko purutasuna zuten peptido guztiak GenScript USA-k sintetizatu zituen, biotinizatu eta liofilizatu zituen. Biotina N-muturrean hirukoitz glizina tartekatzaile gehigarri baten bidez lotuta dago. Peptido guztiak masa-espektrometria erabiliz egiaztatu.
Estreptabidina (Sigma S0677) biotinilatutako peptidoaren, biotinilatutako BACE1 inhibitzaile peptidoaren edo biotinilatutako BACE1 inhibitzaile peptidoaren eta BACE1 inhibitzaile peptidoaren konbinazio baten (3:1 proportzioa) % 5-10 DMSO-tan nahastu zen/PBS-tan inkubatu zen. Ordubetez giro-tenperaturan injekzioa baino lehen. Estreptabidina-konjugatutako peptidoak zain barnetik injektatu ziren 10 mg/kg-ko dosian, garun-barrunbea zuten arratoien isats-zain batean.
Estreptavidina-peptido konplexuen kontzentrazioa ELISA bidez ebaluatu zen. Nunc Maxisorp mikrotitulu plakak (Sigma) gau osoan zehar estali ziren 4 °C-tan 1,5 μg/ml saguaren aurkako estreptavidina antigorputzarekin (Thermo, MA1-20011). Blokeatu ondoren (blokeatze bufferra: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, % 0,05 NP40, % 0,25 gelatina, % 1 BSA) giro-tenperaturan 2 orduz, garbitu plaka % 0,05 Tween-20/PBS-rekin (garbiketa bufferra) 3 segundoz, LKE eta plasma laginak blokeatze bufferrarekin diluitutako putzuetara gehitu ziren (plasma 1:10.000, LKE 1:115). Ondoren, plaka gau osoan zehar inkubatu zen 4 °C-tan detekzio antigorputzarekin (1 μg/ml, anti-estreptavidina-HRP, Novus NB120-7239). Hiru garbiketa-urrats egin ondoren, estreptabidina TMB substratu-soluzioan (Roche) 20 minutuz inkubatu zen. Kolorearen garapena 1M H2SO4-rekin gelditu ondoren, neurtu absortzioa 450 nm-tan.
Estreptavidina-peptido-BACE1 inhibitzaile konplexuaren funtzioa Aβ(1-40) ELISA bidez ebaluatu zen, fabrikatzailearen protokoloaren arabera (Wako, 294-64701). Laburbilduz, CSF laginak diluitu ziren disolbatzaile estandarrean (1:23) eta gau osoan inkubatu ziren 4 °C-tan, BNT77 harrapaketa-antigorputzarekin estalitako 96 putzuko plaketan. Bost garbiketa-urrats egin ondoren, HRP-konjugatutako BA27 antigorputza gehitu eta 2 orduz inkubatu zen 4 °C-tan, eta ondoren bost garbiketa-urrats egin ziren. Aβ(1–40) detektatu zen TMB disoluzioan 30 minutuz inkubatuz giro-tenperaturan. Kolorearen garapena geldiarazteko disoluzioarekin gelditu ondoren, neurtu xurgapena 450 nm-tan. Plasma laginak fase solidoko erauzketa jasan zuten Aβ(1–40) ELISA aurretik. Plasma % 0,2ko DEA (Sigma) gehitu zitzaion 96 putzuko plaketan eta giro-tenperaturan 30 minutuz inkubatu zen. SPE plakak (Oasis, 186000679) urarekin eta % 100eko metanolarekin bat-batean garbitu ondoren, plasma laginak SPE plaketara gehitu ziren eta likido guztia kendu zen. Laginak garbitu ziren (lehenengo % 5eko metanolarekin eta gero % 30eko metanolarekin) eta % 2ko NH4OH/% 90eko metanolarekin eluitu ziren. Eluatua 55 °C-tan 99 minutuz N2 korronte konstantean lehortu ondoren, laginak diluente estandarretan murriztu ziren eta Aβ(1–40) goian deskribatutako moduan neurtu zen.
Artikulu hau nola aipatu: Urich, E. et al. Garunera zama bidaltzea in vivo identifikatutako garraio-peptidoak erabiliz. zientzia. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB eta Moos T. Makromolekulen sendagaiak garunera bidaltzea terapia zuzendua erabiliz. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., eta Martinez-Martinez, P. Peptido eta proteina sendagaien odol-garuneko hesia zeharkatzea. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Garuneko odol-hesia: garuneko sendagaien garapenean oztopo bat. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, eta Byrd, A. Botiken administrazioa eta garunera bideratzea hobetzeko aukerak, koroide plexuaren eta LKEren arteko bidearen bidez. Farmazia Ikerketa 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Biofarmazeutikoen modernizazioa garunera eramateko Troiako zaldi molekularrak erabiliz. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM hartzaileak eragindako peptidoen garraioa odol-garuneko hesia zeharkatuz. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Antigorputz terapeutikoen garuneko sartzea eta eraginkortasuna handitzea molekula-transferentzia monobalenteak erabiliz. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transferrina hartzailearen (TfR) garraioak TfR antigorputzen afinitate aldaeren garuneko xurgapena zehazten du. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).