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La barriera emato-encefalica impedisce agli agenti bioterapeutici di raggiungere i loro bersagli nel sistema nervoso centrale, ostacolando così un trattamento efficace delle malattie neurologiche. Per scoprire nuovi trasportatori cerebrali in vivo, abbiamo introdotto una libreria di peptidi del fago T7 e raccolto in serie sangue e liquido cerebrospinale (CSF) utilizzando un modello di ratto cosciente con ampio pool di sangue e cannula. Cloni fagici specifici sono stati altamente arricchiti nel CSF dopo quattro cicli di selezione. Il test dei singoli peptidi candidati ha rivelato un arricchimento di oltre 1000 volte nel CSF. La bioattività del rilascio mediato da peptidi al cervello è stata confermata da una riduzione del 40% del livello di beta-amiloide nel liquido cerebrospinale utilizzando un inibitore peptidico di BACE1 legato al nuovo peptide di transito identificato. Questi risultati suggeriscono che i peptidi identificati mediante metodi di selezione fagica in vivo potrebbero essere utili veicoli per il rilascio sistemico di macromolecole al cervello con effetto terapeutico.
La ricerca sulle terapie mirate al sistema nervoso centrale (SNC) si è concentrata in gran parte sull'identificazione di farmaci e agenti ottimizzati che mostrano proprietà di targeting del SNC, dedicando meno attenzione alla scoperta dei meccanismi che guidano il rilascio attivo dei farmaci al cervello. Questa situazione sta iniziando a cambiare, poiché il rilascio di farmaci, soprattutto di macromolecole, è parte integrante dello sviluppo di farmaci neuroscientifici moderni. L'ambiente del sistema nervoso centrale è ben protetto dal sistema di barriera cerebrovascolare, costituito dalla barriera emato-encefalica (BEE) e dalla barriera emato-encefalica (BEE)¹, il che rende difficile il rilascio di farmaci al cervello¹,². Si stima che quasi tutti i farmaci a macromolecole e oltre il 98% dei farmaci a piccole molecole vengano eliminati dal cervello³. Per questo motivo è molto importante identificare nuovi sistemi di trasporto cerebrale che consentano un rilascio efficiente e specifico di farmaci terapeutici al SNC⁴,⁵. Tuttavia, la BEE e la BEE rappresentano anche un'ottima opportunità per il rilascio di farmaci, poiché penetrano e raggiungono tutte le strutture del cervello attraverso la sua estesa vascolarizzazione. Pertanto, gli attuali sforzi per utilizzare metodi di somministrazione non invasivi al cervello si basano in gran parte sul meccanismo di trasporto mediato da recettori (PMT) utilizzando il recettore endogeno BBB6. Nonostante i recenti progressi chiave che utilizzano la via del recettore della transferrina7,8, è necessario un ulteriore sviluppo di nuovi sistemi di somministrazione con proprietà migliorate. A tal fine, il nostro obiettivo era identificare peptidi in grado di mediare il trasporto nel liquido cerebrospinale (CSF), poiché potrebbero in linea di principio essere utilizzati per veicolare macromolecole al SNC o per aprire nuove vie recettoriali. In particolare, recettori e trasportatori specifici del sistema cerebrovascolare (BBB e BSCFB) possono fungere da potenziali bersagli per la somministrazione attiva e specifica di farmaci bioterapeutici. Il liquido cerebrospinale (CSF) è un prodotto di secrezione del plesso coroideo (CS) ed è a diretto contatto con il liquido interstiziale del cervello attraverso lo spazio subaracnoideo e lo spazio ventricolare4. Recentemente è stato dimostrato che il liquido cerebrospinale subaracnoideo diffonde eccessivamente nell'interstizio cerebrale⁹. Speriamo di poter accedere allo spazio parenchimale utilizzando questo flusso subaracnoideo o direttamente attraverso la barriera emato-encefalica. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo implementato una robusta strategia di selezione fagica in vivo che idealmente identifica i peptidi trasportati da una di queste due vie distinte.
Descriviamo ora un metodo di screening sequenziale in vivo con visualizzazione di fagi, utilizzando il prelievo di liquido cerebrospinale (CSF) e il sequenziamento ad alto rendimento (HTS) per monitorare i cicli di selezione iniziali con la maggiore diversità della libreria. Lo screening è stato eseguito su ratti coscienti con una cannula impiantata permanentemente nella cisterna di grandi dimensioni (CM) per evitare la contaminazione ematica. È importante sottolineare che questo approccio seleziona sia peptidi con targeting cerebrale sia peptidi con attività di trasporto attraverso la barriera cerebrovascolare. Abbiamo utilizzato fagi T7 a causa delle loro piccole dimensioni (~60 nm)10 e abbiamo ipotizzato che siano adatti al trasporto di vescicole che consentono l'attraversamento transcellulare della barriera endoteliale e/o epiteliale-midollare. Dopo quattro cicli di panning, sono state isolate popolazioni di fagi che mostravano un forte arricchimento in vivo nel CSF e un'associazione con i microvasi cerebrali. È importante notare che siamo stati in grado di confermare i nostri risultati dimostrando che i peptidi candidati migliori, sintetizzati chimicamente, sono in grado di trasportare il carico proteico nel liquido cerebrospinale. In primo luogo, gli effetti farmacodinamici sul SNC sono stati stabiliti combinando un peptide di transito principale con un inibitore del peptide BACE1. Oltre a dimostrare che le strategie di screening funzionale in vivo possono identificare nuovi peptidi di trasporto cerebrale come efficaci trasportatori di carico proteico, prevediamo che approcci di selezione funzionale simili diventeranno importanti anche per l'identificazione di nuove vie di trasporto cerebrale.
Sulla base delle unità formanti placca (PFU), dopo la fase di confezionamento dei fagi, è stata progettata e creata una libreria di peptidi lineari casuali di fagi T7 a 12 basi con una diversità di circa 10⁹ (vedere Materiali e Metodi). È importante notare che abbiamo analizzato attentamente questa libreria prima del panning in vivo. L'amplificazione PCR dei campioni della libreria di fagi utilizzando primer modificati ha generato ampliconi direttamente applicabili all'HTS (Figura supplementare 1a). A causa di a) errori di sequenziamento HTS11, b) impatto sulla qualità dei primer (NNK)1-12 e c) presenza di fagi wild-type (wt) (inserti dello scheletro) nella libreria di riserva, è stata implementata una procedura di filtraggio delle sequenze per estrarre solo le informazioni di sequenza verificate (Figura supplementare 1b). Queste fasi di filtraggio si applicano a tutte le librerie di sequenziamento HTS. Per la libreria standard, sono state ottenute in totale 233.868 letture, di cui il 39% ha superato i criteri di filtraggio ed è stato utilizzato per l'analisi della libreria e la selezione per i cicli successivi (Figura supplementare 1c-e). Le letture erano prevalentemente multiple di 3 paia di basi in lunghezza con un picco a 36 nucleotidi (Figura supplementare 1c), confermando il design della libreria (NNK) 1-12. In particolare, circa l'11% dei membri della libreria conteneva un inserto PAGISRELVDKL di tipo selvatico (wt) a 12 dimensioni e quasi la metà delle sequenze (49%) conteneva inserzioni o delezioni. L'HTS della libreria ha confermato l'elevata diversità dei peptidi nella libreria: più dell'81% delle sequenze peptidiche è stato trovato una sola volta e solo l'1,5% è comparso in ≥4 copie (Figura supplementare 2a). Le frequenze degli amminoacidi (aa) in tutte le 12 posizioni del repertorio correlavano bene con le frequenze attese per il numero di codoni generati dal repertorio NKK degenerato (Figura supplementare 2b). La frequenza osservata dei residui aa codificati da questi inserti correlava bene con la frequenza calcolata (r = 0,893) (Figura supplementare 2c). La preparazione delle librerie di fagi per l'iniezione include le fasi di amplificazione e rimozione dell'endotossina. È stato precedentemente dimostrato che ciò può potenzialmente ridurre la diversità delle librerie di fagi12,13. Pertanto, abbiamo sequenziato una libreria di fagi amplificata su piastra che era stata sottoposta a rimozione dell'endotossina e l'abbiamo confrontata con la libreria originale per stimare la frequenza degli AA. È stata osservata una forte correlazione (r = 0,995) tra il pool originale e il pool amplificato e purificato (Figura supplementare 2d), indicando che la competizione tra i cloni amplificati su piastre utilizzando il fago T7 non ha causato un bias significativo. Questo confronto si basa sulla frequenza dei motivi tripeptidici in ciascuna libreria, poiché la diversità delle librerie (~109) non può essere catturata completamente nemmeno con HTS. L'analisi della frequenza degli aa in ciascuna posizione ha rivelato una piccola distorsione dipendente dalla posizione nelle ultime tre posizioni del repertorio inserito (Figura supplementare 2e). In conclusione, abbiamo concluso che la qualità e la diversità della libreria erano accettabili e sono state osservate solo piccole variazioni nella diversità dovute all'amplificazione e alla preparazione delle librerie fagiche tra diversi cicli di selezione.
Il campionamento seriale del liquido cerebrospinale può essere eseguito impiantando chirurgicamente una cannula nel CM di ratti coscienti per facilitare l'identificazione del fago T7 iniettato per via endovenosa (e.v.) attraverso la BBB e/o la BCSFB (Fig. 1a-b). Abbiamo utilizzato due bracci di selezione indipendenti (bracci A e B) nei primi tre cicli di selezione in vivo (Fig. 1c). Abbiamo gradualmente aumentato la severità della selezione diminuendo la quantità totale di fago introdotta nei primi tre cicli di selezione. Per il quarto ciclo di panning, abbiamo combinato i campioni dei rami A e B ed eseguito tre ulteriori selezioni indipendenti. Per studiare le proprietà in vivo delle particelle del fago T7 in questo modello, il fago di tipo selvatico (inserto master PAGISRELVDKL) è stato iniettato nei ratti attraverso la vena caudale. Il recupero dei fagi dal liquido cerebrospinale e dal sangue in diversi momenti ha mostrato che i fagi icosaedrici T7, relativamente piccoli, presentavano una rapida fase di eliminazione iniziale dal compartimento ematico (Figura supplementare 3). In base ai titoli somministrati e al volume ematico dei ratti, abbiamo calcolato che solo circa l'1% in peso di fagi della dose somministrata veniva rilevato nel sangue 10 minuti dopo l'iniezione endovenosa. Dopo questo rapido declino iniziale, è stata misurata un'eliminazione primaria più lenta con un'emivita di 27,7 minuti. È importante sottolineare che solo pochissimi fagi sono stati recuperati dal compartimento del liquido cerebrospinale, indicando un basso livello di migrazione di fagi di tipo selvatico nel compartimento del liquido cerebrospinale (Figura supplementare 3). In media, solo circa 1 x 10⁻³% di titoli di fagi T7 nel sangue e 4 x 10⁻⁸% dei fagi inizialmente infusi sono stati rilevati nel liquido cerebrospinale durante l'intero periodo di campionamento (0-250 min). In particolare, l'emivita (25,7 min) del fago di tipo selvatico nel liquido cerebrospinale era simile a quella osservata nel sangue. Questi dati dimostrano che la barriera che separa il compartimento del liquido cerebrospinale dal sangue è intatta nei ratti con cannula CM, consentendo la selezione in vivo di librerie di fagi per identificare i cloni che vengono facilmente trasportati dal sangue al compartimento del liquido cerebrospinale.
(a) Impostazione di un metodo per il ricampionamento del liquido cerebrospinale (CSF) da un ampio pool. (b) Diagramma che mostra la localizzazione cellulare della barriera del sistema nervoso centrale (SNC) e la strategia di selezione utilizzata per identificare i peptidi che attraversano la barriera emato-encefalica (BBB). (c) Diagramma di flusso dello screening del phage display in vivo. In ogni ciclo di selezione, i fagi (identificativi degli animali all'interno delle frecce) sono stati iniettati per via endovenosa. Due rami alternativi indipendenti (A, B) sono mantenuti separatamente fino al quarto ciclo di selezione. Per i cicli di selezione 3 e 4, ogni clone di fago estratto dal CSF è stato sequenziato manualmente. (d) Cinetica dei fagi isolati dal sangue (cerchi rossi) e dal liquido cerebrospinale (triangoli verdi) durante il primo ciclo di selezione in due ratti cannulati dopo l'iniezione endovenosa della libreria di peptidi T7 (2 x 10¹² fagi/animale). I quadrati blu indicano la concentrazione iniziale media di fagi nel sangue, calcolata dalla quantità di fagi iniettati, tenendo conto del volume totale di sangue. I quadrati neri indicano il punto di intersezione della linea y estrapolata dalle concentrazioni di fagi nel sangue. (e,f) Presentano la frequenza relativa e la distribuzione di tutti i possibili motivi tripeptidici sovrapposti trovati nel peptide. Viene mostrato il numero di motivi trovati in 1000 letture. I motivi significativamente (p < 0,001) arricchiti sono contrassegnati da punti rossi. (e) Grafico a dispersione di correlazione che confronta la frequenza relativa del motivo tripeptidico della libreria iniettata con i fagi derivati ​​dal sangue degli animali n. 1.1 e n. 1.2. (f) Grafico a dispersione di correlazione che confronta le frequenze relative dei motivi tripeptidici dei fagi animali n. 1.1 e n. 1.2 isolati nel sangue e nel liquido cerebrospinale. (g, h) Rappresentazione dell'ID di sequenza dei fagi arricchiti nel sangue (g) rispetto alle librerie iniettate e dei fagi arricchiti nel liquido cerebrospinale (h) rispetto al sangue dopo un ciclo di selezione in vivo in entrambi gli animali. La dimensione del codice a una lettera indica la frequenza con cui quell'amminoacido si presenta in quella posizione. Verde = polare, viola = neutro, blu = basico, rosso = acido e nero = idrofobico. La Figura 1a, b è stata progettata e realizzata da Eduard Urich.
Abbiamo iniettato una libreria di peptidi fagici in due ratti CM (cladi A e B) e isolato i fagi dal liquido cerebrospinale e dal sangue (Figura 1d). La rapida eliminazione iniziale della libreria è risultata meno pronunciata rispetto al fago di tipo selvatico. L'emivita media della libreria iniettata in entrambi gli animali è stata di 24,8 minuti nel sangue, simile a quella del fago di tipo selvatico, e di 38,5 minuti nel liquido cerebrospinale. Campioni di fagi nel sangue e nel liquido cerebrospinale di ciascun animale sono stati sottoposti a HTS e tutti i peptidi identificati sono stati analizzati per la presenza di un breve motivo tripeptidico. I motivi tripeptidici sono stati scelti perché forniscono una base minima per la formazione della struttura e le interazioni peptide-proteina14,15. Abbiamo riscontrato una buona correlazione nella distribuzione dei motivi tra la libreria di fagi iniettata e i cloni estratti dal sangue di entrambi gli animali (Fig. 1e). I dati indicano che la composizione della libreria è solo marginalmente arricchita nel compartimento ematico. Le frequenze degli amminoacidi e le sequenze consenso sono state ulteriormente analizzate in ciascuna posizione utilizzando un adattamento del software Weblogo16. È interessante notare che abbiamo riscontrato un forte arricchimento nei residui di glicina nel sangue (Fig. 1g). Quando il sangue è stato confrontato con i cloni selezionati dal liquido cerebrospinale, è stata osservata una forte selezione e una certa deselezione di motivi (Fig. 1f), e alcuni amminoacidi erano presenti preferenzialmente in posizioni predeterminate nel peptide a 12 membri (Fig. 1h). In particolare, i singoli animali differivano significativamente nel liquido cerebrospinale, mentre l'arricchimento di glicina nel sangue è stato osservato in entrambi gli animali (Figura supplementare 4a-j). Dopo un rigoroso filtraggio dei dati di sequenza nel liquido cerebrospinale degli animali n. 1.1 e n. 1.2, sono stati ottenuti un totale di 964 e 420 peptidi unici a 12 amminoacidi (Figura supplementare 1d-e). I cloni fagici isolati sono stati amplificati e sottoposti a un secondo ciclo di selezione in vivo. I fagi estratti dal secondo ciclo di selezione sono stati sottoposti ad HTS in ciascun animale e tutti i peptidi identificati sono stati utilizzati come input per un programma di riconoscimento di motivi per analizzare la presenza di motivi tripeptidici (Fig. 2a, b, ef). Rispetto al primo ciclo dei fagi recuperati dal CSF, abbiamo osservato un'ulteriore selezione e deselezione di molti motivi nel CSF nei rami A e B (Fig. 2). È stato applicato un algoritmo di identificazione di rete per determinare se rappresentassero diversi modelli di sequenza coerente. È stata osservata una chiara somiglianza tra le sequenze a 12 dimensioni recuperate dal CSF nel clade alternativo A (Fig. 2c, d) e nel clade B (Fig. 2g, h). L'analisi in pool in ciascun ramo ha rivelato diversi profili di selezione per i peptidi a 12 amminoacidi (Fig. supplementare 5c,d) e un aumento nel rapporto titolo CSF/sangue nel tempo per i cloni in pool dopo il secondo ciclo di selezione rispetto al primo ciclo di selezione (Fig. supplementare 5e).
Arricchimento di motivi e peptidi nel liquido cerebrospinale mediante due cicli successivi di selezione funzionale in vivo tramite display fagico.
Tutti i fagi del liquido cerebrospinale recuperati dal primo ciclo di ciascun animale (animali n. 1.1 e n. 1.2) sono stati raggruppati, amplificati, sequenziati ad alto rendimento e reiniettati insieme (2 x 1010 fagi/animale) 2 ratti con cannula SM (n. 1.1 → n. 2.1 e 2.2, 1.2 → 2.3 e 2.4). (a,b,e,f) Grafici a dispersione di correlazione che confrontano la frequenza relativa dei motivi tripeptidici di tutti i fagi derivati ​​dal CSF nel primo e nel secondo ciclo di selezione. Frequenza relativa e distribuzione dei motivi che rappresentano tutti i possibili tripeptidi sovrapposti trovati nei peptidi in entrambi gli orientamenti. Viene mostrato il numero di motivi trovati in 1000 letture. I motivi che sono stati significativamente (p < 0,001) selezionati o esclusi in una delle librerie confrontate sono evidenziati con punti rossi. (c, d, g, h) Rappresentazione del logo di sequenza di tutte le sequenze di 12 aminoacidi ricche nel liquido cerebrospinale (CSF) basate sui round 2 e 1 di selezione in vivo. La dimensione del codice a una lettera indica la frequenza con cui quell'aminoacido si presenta in quella posizione. Per rappresentare il logo, viene confrontata la frequenza delle sequenze di CSF estratte da singoli animali tra due round di selezione e vengono mostrate le sequenze arricchite nel secondo round: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 e (h) #1.2–#2.4. Gli aminoacidi più arricchiti in una data posizione negli animali n. 2.1 e n. 2.2 (c, d) o negli animali n. 2.3 e n. 2.4 (g, h) sono mostrati a colori. Verde = polare, viola = neutro, blu = basico, rosso = acido e nero = idrofobico.
Dopo il terzo ciclo di selezione, abbiamo identificato 124 sequenze peptidiche uniche (#3.1 e #3.2) da 332 cloni fagici ricostituiti dal liquido cerebrospinale isolati da due animali (Figura supplementare 6a). La sequenza LGSVS (18,7%) presentava la proporzione relativa più alta, seguita dagli inserti di tipo selvatico PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) e SARGSWREIVSLS (2,2%). Nel quarto e ultimo ciclo, abbiamo unito due rami selezionati indipendentemente da tre animali diversi (Figura 1c). Dei 925 cloni fagici sequenziati recuperati dal liquido cerebrospinale, nel quarto ciclo abbiamo trovato 64 sequenze peptidiche uniche (Figura supplementare 6b), tra le quali la proporzione relativa di fagi di tipo selvatico è scesa allo 0,8%. I cloni CSF più comuni nel quarto round erano LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) e RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). L'intervallo di lunghezza dei peptidi selezionati è dovuto a inserzioni/delezioni di nucleotidi o codoni di stop prematuri nei primer della libreria quando si utilizzano codoni degenerati per la progettazione della libreria NNK. I codoni di stop prematuri generano peptidi più corti e vengono selezionati perché contengono il motivo aa favorevole. Peptidi più lunghi possono derivare da inserzioni/delezioni nei primer delle librerie sintetiche. Questo posiziona il codone di stop progettato fuori dal frame e lo legge finché non appare un nuovo codone di stop a valle. In generale, abbiamo calcolato i fattori di arricchimento per tutti e quattro i round di selezione confrontando i dati di input con i dati di output del campione. Per il primo ciclo di screening, abbiamo utilizzato i titoli di fagi di tipo selvatico come riferimento di fondo non specifico. È interessante notare che la selezione negativa dei fagi è stata molto forte nel primo ciclo del liquido cerebrospinale (CSF), ma non nel sangue (Fig. 3a), il che potrebbe essere dovuto alla bassa probabilità di diffusione passiva della maggior parte dei membri della libreria di peptidi nel compartimento del CSF o al fatto che i fagi relativi tendono ad essere trattenuti o rimossi dal flusso sanguigno in modo più efficiente rispetto ai batteriofagi. Tuttavia, nel secondo ciclo di panning, è stata osservata una forte selezione di fagi nel CSF in entrambi i cladi, suggerendo che il ciclo precedente era arricchito di fagi che presentavano peptidi che promuovono l'assorbimento nel CSF (Fig. 3a). Anche in questo caso, senza un significativo arricchimento nel sangue. Anche nel terzo e quarto ciclo, i cloni di fagi sono risultati significativamente arricchiti nel CSF. Confrontando la frequenza relativa di ciascuna sequenza peptidica unica tra gli ultimi due cicli di selezione, abbiamo scoperto che le sequenze erano ancora più arricchite nel quarto ciclo di selezione (Fig. 3b). Sono stati estratti in totale 931 motivi tripeptidici da tutte le 64 sequenze peptidiche uniche utilizzando entrambi gli orientamenti dei peptidi. I motivi più arricchiti nel quarto round sono stati esaminati più attentamente per i loro profili di arricchimento in tutti i round rispetto alla libreria iniettata (cut-off: 10% di arricchimento) (Figura supplementare 6c). I modelli generali di selezione hanno mostrato che la maggior parte dei motivi studiati erano arricchiti in tutti i round precedenti di entrambi i rami di selezione. Tuttavia, alcuni motivi (ad esempio SGL, VSG, LGS GSV) provenivano prevalentemente dal clade alternativo A, mentre altri (ad esempio FGW, RTN, WGF, NTR) erano arricchiti nel clade alternativo B.
Validazione del trasporto nel liquido cerebrospinale (CSF) di peptidi esposti su fagi e arricchiti in CSF, e di peptidi leader biotinilati coniugati a carichi utili di streptavidina.
(a) Rapporti di arricchimento calcolati in tutti e quattro i round (R1-R4) sulla base dei titoli di fagi iniettati (input = I) (PFU) e dei titoli di fagi determinati nel liquido cerebrospinale (output = O). I fattori di arricchimento per gli ultimi tre round (R2-R4) sono stati calcolati confrontandoli con il round precedente e il primo round (R1) con i dati di peso. Le barre vuote rappresentano il liquido cerebrospinale, le barre ombreggiate rappresentano il plasma. (***p<0,001, basato sul test t di Student). (b) Elenco dei peptidi fagici più abbondanti, classificati in base alla loro proporzione relativa rispetto a tutti i fagi raccolti nel liquido cerebrospinale dopo il round 4 di selezione. I sei cloni fagici più comuni sono evidenziati a colori, numerati e i loro fattori di arricchimento tra i round 3 e 4 di selezione (riquadri). (c,d) I sei cloni fagici più arricchiti, le librerie di peptidi fagici vuoti e parentali del round 4 sono stati analizzati individualmente in un modello di campionamento del liquido cerebrospinale. Campioni di CSF e sangue sono stati raccolti nei punti temporali indicati. (c) Quantità uguali di 6 cloni fagici candidati (2 x 1010 fagi/animali), fagi vuoti (#1779) (2 x 1010 fagi/animali) e librerie di peptidi fagici stock (2 x 1012 fagi/animali) Iniettare almeno 3 CM viene somministrato all'animale cannulato separatamente tramite la vena caudale. Viene mostrata la farmacocinetica nel CSF di ciascun clone fagico iniettato e libreria di peptidi fagici nel tempo. (d) mostra il rapporto CSF/sangue medio per tutti i fagi recuperati/mL nel tempo di campionamento. (e) Quattro peptidi leader sintetici e un controllo casuale sono stati legati con biotina alla streptavidina attraverso il loro N-terminale (display tetramerico) seguito da iniezione (vena caudale iv, 10 mg di streptavidina/kg). Almeno tre ratti intubati (N = 3). ). I campioni di CSF sono stati raccolti nei punti temporali indicati e le concentrazioni di streptavidina sono state misurate mediante ELISA anti-streptavidina nel CSF (nd = non rilevato). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, basato sul test ANOVA). (f) Confronto della sequenza aminoacidica del clone di peptide fagico più arricchito #2002 (viola) con altri cloni di peptide fagico selezionati dal 4° ciclo di selezione. I frammenti di aminoacidi identici e simili sono codificati a colori.
Tra tutti i fagi arricchiti nel quarto ciclo (Fig. 3b), sei cloni candidati sono stati selezionati per ulteriori analisi individuali nel modello di campionamento del liquido cerebrospinale (CSF). Quantità uguali di sei fagi candidati, fagi vuoti (senza inserto) e librerie di peptidi profagici sono state iniettate in tre animali CM cannulati e la farmacocinetica è stata determinata mediante analisi del CSF (Fig. 3c) e del sangue (Figura supplementare 7). Tutti i cloni fagici testati hanno raggiunto il compartimento del CSF a un livello da 10 a 1000 volte superiore rispetto al fago di controllo vuoto (#1779). Ad esempio, i cloni #2020 e #2077 presentavano titoli nel CSF circa 1000 volte superiori rispetto al fago di controllo. Il profilo farmacocinetico di ciascun peptide selezionato è differente, ma tutti mostrano un'elevata capacità di raggiungere il CSF. Abbiamo osservato una diminuzione costante nel tempo per i cloni #1903 e #2011, mentre per i cloni #2077, #2002 e #2009 un aumento durante i primi 10 minuti potrebbe indicare un trasporto attivo, ma necessita di verifica. I cloni #2020, #2002 e #2077 si sono stabilizzati a livelli elevati, mentre la concentrazione nel liquido cerebrospinale (CSF) del clone #2009 è diminuita lentamente dopo l'aumento iniziale. Abbiamo quindi confrontato la frequenza relativa di ciascun candidato nel CSF con la sua concentrazione nel sangue (Fig. 3d). La correlazione del titolo medio di ciascun candidato nel CSF con il suo titolo nel sangue in tutti i tempi di campionamento ha mostrato che tre dei sei candidati erano significativamente arricchiti nel CSF ematico. È interessante notare che il clone #2077 ha mostrato una maggiore stabilità nel sangue (Figura supplementare 7). Per confermare che i peptidi stessi siano in grado di trasportare attivamente carichi diversi dalle particelle fagiche nel compartimento del liquido cerebrospinale (CSF), abbiamo sintetizzato quattro peptidi leader derivatizzati con biotina all'estremità N-terminale, dove i peptidi si legano alla particella fagica. I peptidi biotinilati (n. 2002, 2009, 2020 e 2077) sono stati coniugati con streptavidina (SA) per ottenere forme multimeriche che imitano in qualche modo la geometria del fago. Questo formato ci ha anche permesso di misurare l'esposizione alla SA nel sangue e nel liquido cerebrospinale come peptidi proteici trasportatori di carico. È importante sottolineare che i dati relativi al fago potevano spesso essere riprodotti quando i peptidi sintetici venivano somministrati in questo formato coniugato con SA (Fig. 3e). I peptidi randomizzati presentavano una minore esposizione iniziale e una più rapida eliminazione dal CSF, con livelli non rilevabili entro 48 ore. Per comprendere meglio i percorsi di rilascio di questi cloni di fagi peptidici nello spazio del liquido cerebrospinale (CSF), abbiamo analizzato la localizzazione dei singoli peptidi fagici utilizzando l'immunohistochimica (IHC) per rilevare direttamente le particelle fagiche 1 ora dopo l'iniezione endovenosa in vivo. In particolare, i cloni #2002, #2077 e #2009 sono stati rilevati da una forte colorazione nei capillari cerebrali, mentre il fago di controllo (#1779) e il clone #2020 non sono stati rilevati (Figura supplementare 8). Ciò suggerisce che questi peptidi contribuiscono all'effetto sul cervello proprio attraversando la barriera emato-encefalica (BBB). Ulteriori analisi dettagliate sono necessarie per verificare questa ipotesi, poiché potrebbe essere coinvolta anche la via BSCFB. Confrontando la sequenza aminoacidica del clone più arricchito (#2002) con altri peptidi selezionati, si è notato che alcuni di essi presentano estensioni aminoacidiche simili, il che potrebbe indicare un meccanismo di trasporto simile (Fig. 3f).
Grazie al suo profilo plasmatico unico e al significativo aumento nel liquido cerebrospinale (CSF) nel tempo, il clone di fago display #2077 è stato ulteriormente studiato per un periodo più lungo di 48 ore ed è stato in grado di riprodurre il rapido aumento nel CSF osservato in associazione con livelli sostenuti di SA (Fig. 4a). Per quanto riguarda gli altri cloni di fago identificati, il #2077 ha mostrato una forte colorazione per i capillari cerebrali e una significativa colocalizzazione con la lectina, marcatore capillare, se osservato ad alta risoluzione e possibilmente una certa colorazione nello spazio parenchimale (Figura 4b). Per indagare se gli effetti farmacologici mediati da peptidi potessero essere ottenuti nel SNC, abbiamo condotto un esperimento in cui le versioni biotinilate di i) il peptide di transito #2077 e ii) il peptide inibitore di BACE1 sono state miscelate con SA in due rapporti diversi. Per una combinazione abbiamo utilizzato solo il peptide inibitore di BACE1 e per l'altra abbiamo utilizzato un rapporto 1:3 tra il peptide inibitore di BACE1 e il peptide #2077. Entrambi i campioni sono stati somministrati per via endovenosa e i livelli di peptide beta-amiloide 40 (Abeta40) nel sangue e nel liquido cerebrospinale sono stati misurati nel tempo. L'Abeta40 è stato misurato nel liquido cerebrospinale poiché riflette l'inibizione di BACE1 nel parenchima cerebrale. Come previsto, entrambi i complessi hanno ridotto significativamente i livelli ematici di Abeta40 (Fig. 4c, d). Tuttavia, solo i campioni contenenti una miscela del peptide n. 2077 e di un inibitore del peptide BACE1 coniugato a SA hanno causato una diminuzione significativa di Abeta40 nel liquido cerebrospinale (Fig. 4c). I dati mostrano che il peptide n. 2077 è in grado di trasportare la proteina SA da 60 kDa nel SNC e induce anche effetti farmacologici con inibitori del peptide BACE1 coniugati a SA.
(a) Iniezione clonale (2 × 10 fagi/animale) del fago T7 che mostra i profili farmacocinetici a lungo termine del peptide CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) e del fago di controllo non iniettato (#1779) in almeno tre ratti intubati con CM. (b) Immagine al microscopio confocale di microvasi corticali rappresentativi in ​​ratti a cui è stato iniettato il fago (2 × 10 fagi/animale) che mostra la controcolorazione del peptide #2077 e dei vasi (lectina). Questi cloni di fago sono stati somministrati a 3 ratti e lasciati circolare per 1 ora prima della perfusione. I cervelli sono stati sezionati e colorati con anticorpi policlonali marcati con FITC contro il capside del fago T7. Dieci minuti prima della perfusione e della successiva fissazione, è stata somministrata per via endovenosa la lectina marcata con DyLight594. Immagini fluorescenti che mostrano la colorazione con lectina (rosso) del lato luminale dei microvasi e dei fagi (verde) nel lume dei capillari e del tessuto cerebrale perivascolare. La barra di scala corrisponde a 10 µm. (c, d) Il peptide inibitore di BACE1 biotinilato, da solo o in combinazione con il peptide di transito biotinilato #2077, è stato coniugato alla streptavidina, seguito da iniezione endovenosa di almeno tre ratti CM cannulati (10 mg di streptavidina/kg). La riduzione di Aβ40 mediata dall'inibitore peptidico di BACE1 è stata misurata mediante ELISA per Aβ1-40 nel sangue (rosso) e nel liquido cerebrospinale (arancione) nei punti temporali indicati. Per una maggiore chiarezza, sul grafico è tracciata una linea tratteggiata in scala 100%. (c) Riduzione percentuale di Aβ40 nel sangue (triangoli rossi) e nel liquido cerebrospinale (triangoli arancioni) in ratti trattati con streptavidina coniugata al peptide di transito n. 2077 e peptide inibitore di BACE1 in rapporto 3:1. (d) Riduzione percentuale di Aβ40 nel sangue (cerchi rossi) e nel liquido cerebrospinale (cerchi arancioni) di ratti trattati con streptavidina coniugata solo a un peptide inibitore di BACE1. La concentrazione di Aβ nel gruppo di controllo era di 420 pg/ml (deviazione standard = 101 pg/ml).
La tecnica del phage display è stata applicata con successo in diverse aree della ricerca biomedica17. Questo metodo è stato utilizzato per studi in vivo sulla diversità vascolare18,19, nonché per studi mirati ai vasi cerebrali20,21,22,23,24,25,26. In questo studio, abbiamo esteso l'applicazione di questo metodo di selezione non solo all'identificazione diretta di peptidi che si legano ai vasi cerebrali, ma anche alla scoperta di candidati con proprietà di trasporto attivo per attraversare la barriera emato-encefalica. Descriviamo ora lo sviluppo di una procedura di selezione in vivo in ratti intubati con CM e ne dimostriamo il potenziale per identificare peptidi con proprietà di homing nel liquido cerebrospinale (CSF). Utilizzando il fago T7 che presenta una libreria di peptidi casuali di 12-meri, siamo stati in grado di dimostrare che il fago T7 è sufficientemente piccolo (circa 60 nm di diametro)10 da adattarsi alla barriera emato-encefalica, attraversandola direttamente o attraversando il plesso coroideo. Abbiamo osservato che il prelievo di liquido cerebrospinale (CSF) da ratti CM cannulati rappresentava un metodo di screening funzionale in vivo ben controllato e che i fagi estratti non solo si legavano al sistema vascolare, ma fungevano anche da trasportatori attraverso la barriera emato-encefalica. Inoltre, raccogliendo simultaneamente il sangue e applicando l'analisi HTS (High-Throughput Sequencing) ai fagi derivati ​​dal CSF e dal sangue, abbiamo confermato che la nostra scelta del CSF non era influenzata dall'arricchimento nel sangue o dalla capacità di espansione tra i cicli di selezione. Tuttavia, il compartimento ematico fa parte della procedura di selezione, poiché i fagi in grado di raggiungere il compartimento del CSF devono sopravvivere e circolare nel flusso sanguigno abbastanza a lungo da arricchirsi nel cervello. Al fine di estrarre informazioni di sequenza affidabili dai dati HTS grezzi, abbiamo implementato filtri adattati agli errori di sequenziamento specifici della piattaforma nel flusso di lavoro di analisi. Incorporando parametri cinetici nel metodo di screening, abbiamo confermato la rapida farmacocinetica dei fagi T7 di tipo selvatico (t½ ~ 28 min) nel sangue24, 27, 28 e abbiamo anche determinato la loro emivita nel liquido cerebrospinale (t½ ~ 26 min) per minuto). Nonostante profili farmacocinetici simili nel sangue e nel liquido cerebrospinale, solo lo 0,001% della concentrazione ematica del fago poteva essere rilevato nel liquido cerebrospinale, indicando una bassa mobilità di base del fago T7 di tipo selvatico attraverso la barriera emato-encefalica. Questo lavoro evidenzia l'importanza del primo ciclo di selezione quando si utilizzano strategie di panning in vivo, soprattutto per i sistemi fagici che vengono rapidamente eliminati dalla circolazione, poiché pochi cloni sono in grado di raggiungere il compartimento del SNC. Pertanto, nel primo ciclo, la riduzione della diversità della libreria è stata molto grande, poiché solo un numero limitato di cloni è stato infine raccolto in questo modello di liquido cerebrospinale molto rigoroso. Questa strategia di panning in vivo includeva diverse fasi di selezione, come l'accumulo attivo nel compartimento del liquido cerebrospinale (CSF), la sopravvivenza del clone nel compartimento ematico e la rapida rimozione dei cloni del fago T7 dal sangue entro i primi 10 minuti (Fig. 1d e Figura supplementare 4M). Pertanto, dopo il primo ciclo, sono stati identificati diversi cloni fagici nel CSF, sebbene sia stato utilizzato lo stesso pool iniziale per i singoli animali. Ciò suggerisce che molteplici fasi di selezione rigorose per librerie di origine con un elevato numero di membri della libreria comportano una significativa riduzione della diversità. Di conseguenza, gli eventi casuali diventeranno parte integrante del processo di selezione iniziale, influenzando notevolmente il risultato. È probabile che molti dei cloni nella libreria originale avessero una propensione all'arricchimento nel CSF molto simile. Tuttavia, anche nelle stesse condizioni sperimentali, i risultati della selezione possono differire a causa del piccolo numero di ciascun particolare clone nel pool iniziale.
I motivi arricchiti nel liquido cerebrospinale (CSF) differiscono da quelli presenti nel sangue. È interessante notare che abbiamo osservato il primo spostamento verso peptidi ricchi di glicina nel sangue dei singoli animali (Fig. 1g, Figure supplementari 4e, 4f). I fagi contenenti peptidi di glicina potrebbero essere più stabili e meno propensi a essere rimossi dalla circolazione. Tuttavia, questi peptidi ricchi di glicina non sono stati rilevati nei campioni di liquido cerebrospinale, suggerendo che le librerie selezionate abbiano subito due diverse fasi di selezione: una nel sangue e un'altra in cui è stato permesso loro di accumularsi nel liquido cerebrospinale. I cloni arricchiti nel CSF risultanti dal quarto ciclo di selezione sono stati ampiamente testati. Quasi tutti i cloni testati individualmente sono risultati arricchiti nel CSF rispetto al fago di controllo. Un peptide (#2077) è stato esaminato più in dettaglio. Ha mostrato un'emivita plasmatica più lunga rispetto ad altri composti (Figura 3d e Figura supplementare 7) e, cosa interessante, questo peptide conteneva un residuo di cisteina all'estremità C-terminale. È stato recentemente dimostrato che l'aggiunta di cisteina ai peptidi può migliorarne le proprietà farmacocinetiche legandosi all'albumina 29. Questo aspetto è attualmente sconosciuto per il peptide n. 2077 e richiede ulteriori studi. Alcuni peptidi hanno mostrato una dipendenza dalla valenza nell'arricchimento nel liquido cerebrospinale (dati non mostrati), che potrebbe essere correlata alla geometria superficiale del capside T7. Il sistema T7 da noi utilizzato presentava 5-15 copie di ciascun peptide per particella fagica. L'immunoistochimica è stata eseguita su cloni fagici candidati iniettati per via endovenosa nella corteccia cerebrale dei ratti (Figura supplementare 8). I dati hanno mostrato che almeno tre cloni (n. 2002, n. 2009 e n. 2077) interagivano con la barriera emato-encefalica. Resta da determinare se questa interazione con la BBB porti all'accumulo di CSF o al movimento di questi cloni direttamente verso la BCSFB. È importante sottolineare che dimostriamo che i peptidi selezionati mantengono la loro capacità di trasporto nel CSF quando sintetizzati e legati al carico proteico. Il legame dei peptidi biotinilati N-terminali a SA ripete essenzialmente i risultati ottenuti con i rispettivi cloni fagici nel sangue e nel liquido cerebrospinale (Fig. 3e). Infine, dimostriamo che il peptide principale #2077 è in grado di promuovere l'azione cerebrale di un inibitore peptidico biotinilato di BACE1 coniugato a SA, causando pronunciati effetti farmacodinamici nel SNC riducendo significativamente i livelli di Abeta40 nel CSF (Fig. 4). Non siamo stati in grado di identificare alcun omologo nel database eseguendo una ricerca di omologia di sequenza peptidica di tutti i risultati. È importante notare che la dimensione della libreria T7 è di circa 109, mentre la dimensione teorica della libreria per i 12-meri è di 4 x 10¹⁵. Pertanto, abbiamo selezionato solo una piccola frazione dello spazio di diversità della libreria di peptidi 12-meri, il che potrebbe significare che è possibile identificare peptidi più ottimizzati valutando lo spazio di sequenza adiacente a questi risultati identificati. Ipoteticamente, una delle ragioni per cui non abbiamo trovato omologhi naturali di questi peptidi potrebbe essere la deselezione durante l'evoluzione per impedire l'ingresso incontrollato di determinati motivi peptidici nel cervello.
Nel complesso, i nostri risultati forniscono una base per futuri studi volti a identificare e caratterizzare in modo più dettagliato i sistemi di trasporto della barriera cerebrovascolare in vivo. L'impostazione di base di questo metodo si fonda su una strategia di selezione funzionale che non solo identifica cloni con proprietà di legame vascolare cerebrale, ma include anche una fase critica in cui i cloni di successo presentano un'attività intrinseca per attraversare le barriere biologiche in vivo e raggiungere il compartimento del SNC. L'obiettivo è quello di chiarire il meccanismo di trasporto di questi peptidi e la loro preferenza per il legame con la microvascolatura specifica della regione cerebrale. Ciò potrebbe portare alla scoperta di nuove vie di trasporto attraverso la BBB e i recettori. Prevediamo che i peptidi identificati possano legarsi direttamente ai recettori cerebrovascolari o ai ligandi circolanti trasportati attraverso la BBB o la barriera emato-encefalica. I vettori peptidici con attività di trasporto nel liquido cerebrospinale scoperti in questo lavoro saranno ulteriormente studiati. Stiamo attualmente indagando la specificità cerebrale di questi peptidi per la loro capacità di attraversare la BBB e/o la barriera emato-encefalica. Questi nuovi peptidi saranno strumenti estremamente preziosi per la potenziale scoperta di nuovi recettori o vie metaboliche e per lo sviluppo di nuove piattaforme altamente efficienti per la somministrazione di macromolecole, come i farmaci biologici, al cervello.
Cannulare la grande cisterna (CM) utilizzando una modifica del metodo precedentemente descritto. Ratti Wistar anestetizzati (200-350 g) sono stati posizionati su un apparato stereotassico e un'incisione mediana è stata praticata sul cuoio capelluto rasato e preparato in modo asettico per esporre il cranio. Sono stati praticati due fori nella zona della fascia occipitale superiore e le viti di fissaggio sono state inserite nei fori. Un ulteriore foro è stato praticato nella cresta occipitale laterale per la guida stereotassica di una cannula in acciaio inossidabile nella CM. Applicare cemento dentale attorno alla cannula e fissarla con viti. Dopo la fotopolimerizzazione e l'indurimento del cemento, la ferita cutanea è stata chiusa con una sutura in supramid 4/0. Il corretto posizionamento della cannula è confermato dalla fuoriuscita spontanea di liquido cerebrospinale (CSF). Rimuovere il ratto dall'apparato stereotassico, somministrargli le cure post-operatorie e la gestione del dolore appropriate e lasciarlo recuperare per almeno una settimana fino a quando non si osservano segni di sangue nel liquido cerebrospinale. Ratti Wistar (Crl:WI/Han) sono stati ottenuti da Charles River (Francia). Tutti i ratti sono stati mantenuti in condizioni prive di patogeni specifici. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Ufficio Veterinario della città di Basilea, Svizzera, e sono stati condotti in conformità con l'Autorizzazione per Animali n. 2474 (Valutazione del trasporto attivo cerebrale mediante la misurazione dei livelli di candidati terapeutici nel liquido cerebrospinale e nel cervello del ratto).
Mantenere delicatamente il ratto cosciente tenendo la cannula CM in mano. Rimuovere Datura dalla cannula e raccogliere 10 µl di liquido cerebrospinale (CSF) che fuoriesce spontaneamente. Poiché la pervietà della cannula è risultata compromessa, in questo studio sono stati inclusi solo campioni di CSF limpido, privi di contaminazione ematica o alterazioni di colore. Parallelamente, sono stati prelevati circa 10-20 μl di sangue da una piccola incisione all'estremità della coda, in provette contenenti eparina (Sigma-Aldrich). Il CSF e il sangue sono stati raccolti in diversi momenti dopo l'iniezione endovenosa del fago T7. Prima di ogni prelievo di CSF, sono stati scartati circa 5-10 μl di liquido, corrispondenti al volume morto del catetere.
Le librerie sono state generate utilizzando il vettore T7Select 10-3b come descritto nel manuale del sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). In breve, è stato sintetizzato un inserto di DNA casuale di 12 basi nel seguente formato:
Il codone NNK è stato utilizzato per evitare doppi codoni di stop e la sovraespressione di amminoacidi nell'inserto. N è un rapporto equimolare di ciascun nucleotide miscelato manualmente e K è un rapporto equimolare di nucleotidi di adenina e citosina miscelati manualmente. Le regioni a singolo filamento sono state convertite in DNA a doppio filamento mediante ulteriore incubazione con dNTP (Novagen) ed enzima Klenow (New England Biolabs) in tampone Klenow (New England Biolabs) per 3 ore a 37°C. Dopo la reazione, il DNA a doppio filamento è stato recuperato mediante precipitazione con etanolo. Il DNA risultante è stato digerito con gli enzimi di restrizione EcoRI e HindIII (entrambi di Roche). L'inserto clivato e purificato (QIAquick, Qiagen) (ligasi T4, New England Biolabs) è stato quindi ligato in fase in un vettore T7 pre-clivato dopo l'amminoacido 348 del gene del capside 10B. Le reazioni di ligazione sono state incubate a 16 °C per 18 ore prima del confezionamento in vitro. Il confezionamento del fago in vitro è stato eseguito secondo le istruzioni fornite con il kit di clonazione T7Select 10-3b (Novagen) e la soluzione di confezionamento è stata amplificata una volta fino alla lisi utilizzando Escherichia coli (BLT5615, Novagen). I lisati sono stati centrifugati, titolati e congelati a -80 °C come soluzione madre di glicerolo.
Amplificazione PCR diretta delle regioni variabili del fago amplificate in brodo o su piastra utilizzando primer di fusione proprietari 454/Roche-amplicon. Il primer di fusione forward contiene sequenze che fiancheggiano la regione variabile (NNK) 12 (specifica per il template), l'adattatore GS FLX Titanium A e una sequenza chiave di libreria a quattro basi (TCAG) (Figura supplementare 1a):
Il primer di fusione inversa contiene anche biotina legata alle microsfere di cattura e all'adattatore GS FLX Titanium B, necessario per l'amplificazione clonale durante la PCR in emulsione:
Gli ampliconi sono stati quindi sottoposti a pirosequenziamento 454/Roche secondo il protocollo 454 GS-FLX Titanium. Per il sequenziamento manuale di Sanger (analizzatore di DNA Applied Biosystems Hitachi 3730 xl), il DNA del fago T7 è stato amplificato tramite PCR e sequenziato con le seguenti coppie di primer:
Gli inserti delle singole placche sono stati sottoposti ad amplificazione PCR utilizzando il kit Roche Fast Start DNA Polymerase (secondo le istruzioni del produttore). Eseguire un hot start (10 min a 95 °C) e 35 cicli di boost (50 s a 95 °C, 1 min a 50 °C e 1 min a 72 °C).
I fagi provenienti da librerie, fagi di tipo selvatico, fagi recuperati da liquido cerebrospinale e sangue, o singoli cloni sono stati amplificati in Escherichia coli BL5615 in brodo TB (Sigma Aldrich) o in piastre da 500 cm2 (Thermo Scientific) per 4 ore a 37°C. I fagi sono stati estratti dalle piastre risciacquandole con tampone Tris-EDTA (Fluka Analytical) o raccogliendo le placche con punte di pipetta sterili. I fagi sono stati isolati dal supernatante di coltura o dal tampone di estrazione con un ciclo di precipitazione con polietilenglicole (PEG 8000) (Promega) e risospesi in tampone Tris-EDTA.
Il fago amplificato è stato sottoposto a 2-3 cicli di rimozione delle endotossine utilizzando microsfere per la rimozione delle endotossine (Miltenyi Biotec) prima dell'iniezione endovenosa (IV) (500 μl/animale). Nel primo ciclo sono stati introdotti 2×10¹² fagi; nel secondo, 2×10¹⁰ fagi; nel terzo e quarto ciclo di selezione, 2×10⁹ fagi per animale. Il contenuto di fagi nei campioni di liquido cerebrospinale (CSF) e di sangue raccolti nei punti temporali indicati è stato determinato mediante conteggio delle placche secondo le istruzioni del produttore (manuale del sistema T7Select). La selezione dei fagi è stata eseguita mediante iniezione endovenosa di librerie purificate nella vena caudale o mediante re-iniezione di fagi estratti dal CSF dal precedente ciclo di selezione, e i successivi prelievi sono stati effettuati rispettivamente a 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min e 240 min per i campioni di CSF e di sangue. Sono stati condotti complessivamente quattro cicli di panning in vivo, nei quali i due rami selezionati sono stati conservati e analizzati separatamente durante i primi tre cicli di selezione. Tutti gli inserti fagici estratti dal liquido cerebrospinale (CSF) dei primi due cicli di selezione sono stati sottoposti a pirosequenziamento 454/Roche, mentre tutti i cloni estratti dal CSF degli ultimi due cicli di selezione sono stati sequenziati manualmente. Anche tutti i fagi ematici del primo ciclo di selezione sono stati sottoposti a pirosequenziamento 454/Roche. Per l'iniezione dei cloni fagici, i fagi selezionati sono stati amplificati in E. coli (BL5615) su piastre da 500 cm2 a 37°C per 4 ore. I cloni selezionati individualmente e sequenziati manualmente sono stati propagati in terreno TB. Dopo l'estrazione, la purificazione e la rimozione dell'endotossina (come descritto sopra), 2×1010 fagi/animale in 300 μl sono stati iniettati per via endovenosa in una vena della coda.
Pre-elaborazione e filtraggio qualitativo dei dati di sequenza. I dati grezzi 454/Roche sono stati convertiti da un formato binario standard stream map (sff) a un formato leggibile dall'uomo Pearson (fasta) utilizzando il software del fornitore. L'ulteriore elaborazione della sequenza nucleotidica è stata eseguita utilizzando programmi e script C proprietari (pacchetto software non rilasciato) come descritto di seguito. L'analisi dei dati primari include rigorose procedure di filtraggio a più fasi. Per filtrare le letture che non contenevano una sequenza di DNA inserto 12mer valida, le letture sono state allineate sequenzialmente all'etichetta di inizio (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), all'etichetta di stop (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) e all'inserto di sfondo (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) utilizzando il test globale di Needleman-Wunsch. L'allineamento consente fino a 2 incongruenze per allineamento31. Pertanto, le letture senza tag di inizio e di stop e le letture contenenti inserti di sfondo, ovvero gli allineamenti che superano il numero consentito di mismatch, sono state rimosse dalla libreria. Per quanto riguarda le letture rimanenti, la sequenza di DNA N-mer che si estende dal marcatore di inizio e termina prima del marcatore di stop è stata escissa dalla sequenza di lettura originale e ulteriormente elaborata (di seguito denominata "inserto"). Dopo la traduzione dell'inserto, la porzione successiva al primo codone di stop all'estremità 5' del primer è stata rimossa dall'inserto. Inoltre, sono stati rimossi anche i nucleotidi che portano a codoni incompleti all'estremità 3' del primer. Per escludere gli inserti contenenti solo sequenze di sfondo, sono stati rimossi anche gli inserti tradotti che iniziano con il pattern di amminoacidi "PAG". I peptidi con una lunghezza post-traduzionale inferiore a 3 amminoacidi sono stati rimossi dalla libreria. Infine, è stata rimossa la ridondanza nel pool di inserti ed è stata determinata la frequenza di ciascun inserto univoco. I risultati di questa analisi includevano un elenco di sequenze nucleotidiche (inserti) e le loro frequenze (di lettura) (Figure supplementari 1c e 2).
Raggruppamento di inserti di DNA N-mer in base alla similarità di sequenza: per eliminare gli errori di sequenziamento specifici del 454/Roche (come i problemi con le estensioni di omopolimeri nel sequenziamento) e rimuovere le ridondanze meno importanti, gli inserti di sequenza di DNA N-mer precedentemente filtrati (inserti) vengono ordinati in base alla similarità. Gli inserti (fino a 2 basi non corrispondenti consentite) vengono ordinati utilizzando un algoritmo iterativo definito come segue: gli inserti vengono ordinati prima in base alla loro frequenza (dalla più alta alla più bassa) e, se sono uguali, in base alla loro lunghezza (dalla più lunga alla più corta). Pertanto, gli inserti più frequenti e più lunghi definiscono il primo "gruppo". La frequenza del gruppo viene impostata sulla frequenza chiave. Quindi, si è tentato di aggiungere al gruppo ogni inserto rimanente nell'elenco ordinato mediante allineamento a coppie Needleman-Wunsch. Se il numero di mismatch, inserti o delezioni in un allineamento non supera una soglia di 2, un inserto viene aggiunto al gruppo e la frequenza complessiva del gruppo viene aumentata della frequenza con cui l'inserto è stato aggiunto. Gli inserti aggiunti a un gruppo vengono contrassegnati come utilizzati ed esclusi da ulteriori elaborazioni. Se la sequenza dell'inserto non può essere aggiunta a un gruppo già esistente, viene utilizzata per creare un nuovo gruppo con la frequenza di inserto appropriata e contrassegnata come utilizzata. L'iterazione termina quando ogni sequenza di inserto è stata utilizzata per formare un nuovo gruppo o può essere inclusa in un gruppo già esistente. Infine, gli inserti raggruppati costituiti da nucleotidi vengono tradotti in sequenze peptidiche (librerie di peptidi). Il risultato di questa analisi è un insieme di inserti e le relative frequenze che costituiscono il numero di letture consecutive (Figura supplementare 2).
Generazione di motivi: Sulla base di un elenco di peptidi unici, è stata creata una libreria contenente tutti i possibili modelli di amminoacidi (aa) come mostrato di seguito. Ogni possibile modello di lunghezza 3 è stato estratto dal peptide e il suo modello inverso è stato aggiunto insieme a una libreria di motivi comuni contenente tutti i modelli (tripeptidi). Le librerie di motivi altamente ripetitivi sono state sequenziate e la ridondanza è stata rimossa. Quindi, per ogni tripeptide nella libreria di motivi, ne abbiamo verificato la presenza nella libreria utilizzando strumenti computazionali. In questo caso, la frequenza del peptide contenente il tripeptide del motivo trovato viene aggiunta e assegnata al motivo nella libreria di motivi ("numero di motivi"). Il risultato della generazione di motivi è un array bidimensionale contenente tutte le occorrenze di tripeptidi (motivi) e i rispettivi valori, che sono il numero di letture di sequenziamento che risultano nel motivo corrispondente quando le letture vengono filtrate, raggruppate e tradotte. Metriche come descritto in dettaglio sopra.
Normalizzazione del numero di motivi e dei relativi diagrammi a dispersione: Il numero di motivi per ciascun campione è stato normalizzato utilizzando
dove ni è il numero di letture contenenti l'argomento i. Pertanto, vi rappresenta la frequenza percentuale delle letture (o peptidi) contenenti il ​​motivo i nel campione. I valori p per il numero non normalizzato di motivi sono stati calcolati utilizzando il test esatto di Fisher. Per quanto riguarda i correlogrammi del numero di motivi, le correlazioni di Spearman sono state calcolate utilizzando il numero normalizzato di motivi con R.
Per visualizzare il contenuto di amminoacidi in ciascuna posizione nella libreria di peptidi, sono stati creati i logogrammi web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). In primo luogo, il contenuto di amminoacidi in ciascuna posizione del peptide di 12-meri viene memorizzato in una matrice 20×12. Quindi, un set di 1000 peptidi contenenti lo stesso contenuto relativo di amminoacidi in ciascuna posizione viene generato in formato fasta-sequence e fornito come input a web-logo 3, che genera una rappresentazione grafica del contenuto relativo di amminoacidi in ciascuna posizione per una data libreria di peptidi. Per visualizzare set di dati multidimensionali, sono state create mappe di calore utilizzando uno strumento sviluppato internamente in R (biosHeatmap, un pacchetto R non ancora rilasciato). I dendrogrammi presentati nelle mappe di calore sono stati calcolati utilizzando il metodo di clustering gerarchico di Ward con la metrica della distanza euclidea. Per l'analisi statistica dei dati di punteggio dei motivi, i valori P per il punteggio non normalizzato sono stati calcolati utilizzando il test esatto di Fisher. I valori P per gli altri set di dati sono stati calcolati in R utilizzando il test t di Student o l'ANOVA.
Cloni fagici selezionati e fagi senza inserti sono stati iniettati per via endovenosa nella vena caudale (2×10¹⁰ fagi/animale in 300 μl di PBS). Dieci minuti prima della perfusione e della successiva fissazione, agli stessi animali sono stati iniettati per via endovenosa 100 μl di lectina marcata con DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minuti dopo l'iniezione dei fagi, i ratti sono stati perfusi attraverso il cuore con 50 ml di PBS seguiti da 50 ml di PFA/PBS al 4%. I campioni di cervello sono stati inoltre fissati per una notte in PFA/PBS al 4% e immersi in saccarosio al 30% per una notte a 4°C. I campioni sono stati congelati rapidamente nella miscela OCT. L'analisi immunoistochimica dei campioni congelati è stata eseguita a temperatura ambiente su sezioni criostatiche di 30 µm bloccate con BSA all'1% e incubate con anticorpi policlonali marcati con FITC contro il fago T7 (Novus NB 600-376A) a 4 °C. Incubare per una notte. Infine, le sezioni sono state lavate 3 volte con PBS ed esaminate con un microscopio confocale a laser (Leica TCS SP5).
Tutti i peptidi, con una purezza minima del 98%, sono stati sintetizzati da GenScript USA, biotinilati e liofilizzati. La biotina è legata tramite un ulteriore spaziatore triplo di glicina all'estremità N-terminale. Tutti i peptidi sono stati analizzati mediante spettrometria di massa.
La streptavidina (Sigma S0677) è stata miscelata con un eccesso equimolare 5 volte maggiore di peptide biotinilato, peptide inibitore di BACE1 biotinilato o una combinazione (rapporto 3:1) di peptide inibitore di BACE1 biotinilato e peptide inibitore di BACE1 in DMSO al 5-10%/incubata in PBS. 1 ora a temperatura ambiente prima dell'iniezione. I peptidi coniugati con streptavidina sono stati iniettati per via endovenosa a una dose di 10 mg/kg in una delle vene della coda di ratti con cavità cerebrale.
La concentrazione dei complessi streptavidina-peptide è stata valutata mediante ELISA. Le piastre per microtitolazione Nunc Maxisorp (Sigma) sono state rivestite durante la notte a 4°C con 1,5 μg/ml di anticorpo anti-streptavidina di topo (Thermo, MA1-20011). Dopo il blocco (tampone di blocco: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatina, 1% BSA) a temperatura ambiente per 2 ore, lavare la piastra con 0,05% Tween-20/PBS (tampone di lavaggio) per 3 secondi, campioni di CSF e plasma sono stati aggiunti ai pozzetti diluiti con tampone di blocco (plasma 1:10.000, CSF 1:115). La piastra è stata quindi incubata per una notte a 4 °C con l'anticorpo di rilevamento (1 μg/ml, anti-streptavidina-HRP, Novus NB120-7239). Dopo tre lavaggi, la streptavidina è stata rilevata mediante incubazione in soluzione di substrato TMB (Roche) per un massimo di 20 minuti. Dopo aver interrotto lo sviluppo del colore con H2SO4 1M, è stata misurata l'assorbanza a 450 nm.
La funzione del complesso streptavidina-peptide-inibitore di BACE1 è stata valutata mediante ELISA per Aβ(1-40) secondo il protocollo del produttore (Wako, 294-64701). In breve, i campioni di CSF sono stati diluiti in diluente standard (1:23) e incubati per una notte a 4°C in piastre a 96 pozzetti rivestite con anticorpo di cattura BNT77. Dopo cinque lavaggi, è stato aggiunto l'anticorpo BA27 coniugato con HRP e incubato per 2 ore a 4°C, seguito da cinque lavaggi. L'Aβ(1-40) è stato rilevato mediante incubazione in soluzione TMB per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver interrotto lo sviluppo del colore con la soluzione di arresto, è stata misurata l'assorbanza a 450 nm. I campioni di plasma sono stati sottoposti a estrazione in fase solida prima dell'ELISA per Aβ(1-40). Il plasma è stato aggiunto a DEA allo 0,2% (Sigma) in piastre a 96 pozzetti e incubato a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo aver lavato successivamente le piastre SPE (Oasis, 186000679) con acqua e metanolo al 100%, i campioni di plasma sono stati aggiunti alle piastre SPE e tutto il liquido è stato rimosso. I campioni sono stati lavati (prima con metanolo al 5% e poi con metanolo al 30%) ed eluiti con NH4OH al 2%/metanolo al 90%. Dopo aver essiccato l'eluato a 55°C per 99 minuti a corrente di N2 costante, i campioni sono stati ridotti in diluenti standard e l'Aβ(1–40) è stato misurato come descritto sopra.
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