Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තූතියි. ඔබ සීමිත CSS සහායක් සහිත බ්‍රව්සර් අනුවාදයක් භාවිතා කරයි. හොඳම අත්දැකීම සඳහා, යාවත්කාලීන කළ බ්‍රව්සරයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා මාදිලිය අක්‍රීය කරන්න). ඊට අමතරව, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි විලාස සහ JavaScript නොමැතිව අඩවිය පෙන්වමු.
එකවර ස්ලයිඩ තුනක කැරොසලයක් පෙන්වයි. එකවර ස්ලයිඩ තුනක් හරහා ගමන් කිරීමට පෙර සහ ඊළඟ බොත්තම් භාවිතා කරන්න, නැතහොත් අවසානයේ ඇති ස්ලයිඩර් බොත්තම් භාවිතා කර එකවර ස්ලයිඩ තුනක් හරහා ගමන් කරන්න.
රුධිර-මොළයේ බාධකය සහ රුධිර-මොළයේ බාධකය ජෛව චිකිත්සක කාරක මධ්‍යම ස්නායු පද්ධතියේ ඔවුන්ගේ ඉලක්ක කරා ළඟා වීම වළක්වන අතර එමඟින් ස්නායු රෝග සඳහා ඵලදායී ප්‍රතිකාර සඳහා බාධා කරයි. නව මොළයේ ප්‍රවාහකයන් in vivo සොයා ගැනීම සඳහා, අපි T7 phage peptide පුස්තකාලයක් හඳුන්වා දුන් අතර මීයන්ගේ කැනියුලේටඩ් සවිඥානික විශාල තටාක ආකෘතියක් භාවිතා කරමින් අනුක්‍රමිකව එකතු කරන ලද රුධිරය සහ මස්තිෂ්ක තරලය (CSF) හඳුන්වා දුන්නෙමු. තේරීමේ වට හතරකින් පසු නිශ්චිත phage ක්ලෝන CSF හි බෙහෙවින් පොහොසත් කරන ලදී. තනි අපේක්ෂක පෙප්ටයිඩ පරීක්ෂා කිරීමෙන් CSF හි 1000 ගුණයකට වඩා පොහොසත් වීමක් අනාවරණය විය. මොළයට පෙප්ටයිඩ-මැදිහත් වූ බෙදාහැරීමේ ජෛව ක්‍රියාකාරීත්වය හඳුනාගත් නව සංක්‍රාන්ති පෙප්ටයිඩයට සම්බන්ධ BACE1 පෙප්ටයිඩ නිෂේධකයක් භාවිතා කරමින් මස්තිෂ්ක තරලයේ ඇමයිලොයිඩ්-β මට්ටම 40% කින් අඩු කිරීමෙන් තහවුරු විය. මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ in vivo phage තේරීමේ ක්‍රම මගින් හඳුනාගත් පෙප්ටයිඩ චිකිත්සක බලපෑමක් සහිත මොළයට සාර්ව අණු පද්ධතිමය වශයෙන් ලබා දීම සඳහා ප්‍රයෝජනවත් වාහන විය හැකි බවයි.
මධ්‍යම ස්නායු පද්ධතිය (CNS) ඉලක්ක කරගත් චිකිත්සක පර්යේෂණ බොහෝ දුරට අවධානය යොමු කර ඇත්තේ CNS ඉලක්ක කරගත් ගුණාංග ප්‍රදර්ශනය කරන ප්‍රශස්ත ඖෂධ සහ නියෝජිතයන් හඳුනා ගැනීම කෙරෙහි වන අතර, මොළයට ක්‍රියාකාරී ඖෂධ බෙදා හැරීම මෙහෙයවන යාන්ත්‍රණයන් සොයා ගැනීම කෙරෙහි අඩු උත්සාහයක් දරයි. ඖෂධ බෙදා හැරීම, විශේෂයෙන් විශාල අණු, නූතන ස්නායු විද්‍යා ඖෂධ සංවර්ධනයේ අනිවාර්ය අංගයක් වන බැවින් මෙය දැන් වෙනස් වීමට පටන් ගෙන තිබේ. මධ්‍යම ස්නායු පද්ධතියේ පරිසරය රුධිර-මොළයේ බාධකය (BBB) ​​සහ රුධිර-මොළයේ බාධකය (BCBB)1 වලින් සමන්විත මස්තිෂ්ක වාහිනී බාධක පද්ධතිය මගින් හොඳින් ආරක්ෂා කර ඇති අතර එමඟින් මොළයට ඖෂධ ලබා දීම අභියෝගාත්මක වේ1,2. විශාල අණු ඖෂධ සියල්ලම පාහේ සහ කුඩා අණු ඖෂධවලින් 98% කට වඩා මොළයෙන් ඉවත් කරනු ලබන බව ඇස්තමේන්තු කර ඇත3. CNS 4,5 වෙත චිකිත්සක ඖෂධ කාර්යක්ෂමව සහ නිශ්චිතව ලබා දෙන නව මොළයේ ප්‍රවාහන පද්ධති හඳුනා ගැනීම ඉතා වැදගත් වන්නේ එබැවිනි. කෙසේ වෙතත්, BBB සහ BCSFB එහි පුළුල් සනාල පද්ධතිය හරහා මොළයේ සියලුම ව්‍යුහයන්ට විනිවිද ගොස් ඇතුළු වන විට ඖෂධ බෙදා හැරීම සඳහා විශිෂ්ට අවස්ථාවක් ද ඉදිරිපත් කරයි. මේ අනුව, මොළයට බෙදා හැරීමේ ආක්‍රමණශීලී නොවන ක්‍රම භාවිතා කිරීමේ වත්මන් උත්සාහයන් බොහෝ දුරට පදනම් වී ඇත්තේ අන්තරාසර්ග BBB6 ප්‍රතිග්‍රාහකය භාවිතා කරමින් ප්‍රතිග්‍රාහක-මැදිහත් ප්‍රවාහන (PMT) යාන්ත්‍රණය මත ය. ට්‍රාන්ස්ෆෙරින් ප්‍රතිග්‍රාහක මාර්ගය භාවිතා කරමින් මෑත කාලීන ප්‍රධාන දියුණුව තිබියදීත්7,8, වැඩිදියුණු කළ ගුණාංග සහිත නව බෙදා හැරීමේ පද්ධති තවදුරටත් සංවර්ධනය කිරීම අවශ්‍ය වේ. මේ සඳහා, අපගේ ඉලක්කය වූයේ CSF ප්‍රවාහනයට මැදිහත් විය හැකි පෙප්ටයිඩ හඳුනා ගැනීමයි, මන්ද ඒවා ප්‍රතිපත්තිමය වශයෙන් CNS වෙත සාර්ව අණු ලබා දීමට හෝ නව ප්‍රතිග්‍රාහක මාර්ග විවෘත කිරීමට භාවිතා කළ හැකිය. විශේෂයෙන්, මස්තිෂ්ක වාහිනී පද්ධතියේ (BBB සහ BSCFB) නිශ්චිත ප්‍රතිග්‍රාහක සහ ප්‍රවාහකයන් ජෛව චිකිත්සක ඖෂධවල ක්‍රියාකාරී සහ නිශ්චිත බෙදා හැරීම සඳහා විභව ඉලක්ක ලෙස සේවය කළ හැකිය. මස්තිෂ්ක තරලය (CSF) යනු කොරොයිඩ් ප්ලෙක්සස් (CS) හි ස්‍රාවය කරන නිෂ්පාදනයක් වන අතර එය උපඅරක්නොයිඩ් අවකාශය සහ කශේරුකා අවකාශය හරහා මොළයේ අන්තර් අන්තරාල තරලය සමඟ සෘජුව සම්බන්ධ වේ4. මෑතකදී උපඅරක්නොයිඩ් මස්තිෂ්ක තරලය මොළයේ අන්තර් අන්තරාලයට අධික ලෙස විසරණය වන බව පෙන්වා දී ඇත9. මෙම උපඅරක්නොයිඩ් ප්‍රවාහ මාර්ගය භාවිතයෙන් හෝ BBB හරහා කෙලින්ම පාරෙන්චිමල් අවකාශයට ප්‍රවේශ වීමට අපි බලාපොරොත්තු වෙමු. මෙය සාක්ෂාත් කර ගැනීම සඳහා, මෙම වෙනස් මාර්ග දෙකෙන් එකක් මගින් ප්‍රවාහනය කරන පෙප්ටයිඩ ඉතා මැනවින් හඳුනා ගන්නා ශක්තිමත් ඉන් විවෝ ෆේජ් තේරීමේ උපාය මාර්ගයක් අපි ක්‍රියාත්මක කළෙමු.
ඉහළම පුස්තකාල විවිධත්වයක් සහිත මූලික තේරීම් වට නිරීක්ෂණය කිරීම සඳහා CSF සාම්පල ලබා ගැනීම සමඟ ඉහළ ප්‍රතිදාන අනුක්‍රමික (HTS) සමඟ අනුක්‍රමික in vivo phage සංදර්ශක පරීක්ෂණ ක්‍රමයක් අපි දැන් විස්තර කරමු. රුධිර දූෂණය වළක්වා ගැනීම සඳහා ස්ථිරවම බද්ධ කරන ලද විශාල සිස්ටර්නා (CM) කැනියුලාවක් සහිත සවිඥානික මීයන් මත පරීක්ෂාව සිදු කරන ලදී. වැදගත් ලෙස, මෙම ප්‍රවේශය මස්තිෂ්ක වාහිනී බාධකය හරහා ප්‍රවාහන ක්‍රියාකාරකම් සහිත මොළය ඉලක්ක කරගත් සහ පෙප්ටයිඩ යන දෙකම තෝරා ගනී. ඒවායේ කුඩා ප්‍රමාණය (~60 nm)10 නිසා අපි T7 phages භාවිතා කළ අතර එන්ඩොතලියල් සහ/හෝ එපිටිලියල්-මෙඩුල්ලා බාධකයේ අන්තර් සෛලීය හරස් කිරීමට ඉඩ සලසන වෙසිලි ප්‍රවාහනය සඳහා ඒවා සුදුසු බව යෝජනා කළෙමු. පෑන් කිරීමේ වට හතරකින් පසු, phage ජනගහනය හුදකලා කරන ලද්දේ ශක්තිමත් in vivo CSF ​​පොහොසත් කිරීම සහ මස්තිෂ්ක ක්ෂුද්‍ර වාහිනී සම්බන්ධතාවයක් පෙන්නුම් කරමිනි. වැදගත් ලෙස, කැමති සහ රසායනිකව සංස්ලේෂණය කරන ලද හොඳම අපේක්ෂක පෙප්ටයිඩ මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළට ප්‍රෝටීන් භාණ්ඩ ප්‍රවාහනය කිරීමට හැකි බව පෙන්නුම් කිරීමෙන් අපගේ සොයාගැනීම් තහවුරු කිරීමට අපට හැකි විය. පළමුව, ප්‍රමුඛ සංක්‍රාන්ති පෙප්ටයිඩයක් BACE1 පෙප්ටයිඩයේ නිෂේධකයක් සමඟ ඒකාබද්ධ කිරීමෙන් CNS හි ඖෂධීය ගතික බලපෑම් ස්ථාපිත කරන ලදී. in vivo ක්‍රියාකාරී පරීක්ෂණ උපාය මාර්ග මගින් ඵලදායී ප්‍රෝටීන් භාණ්ඩ වාහකයන් ලෙස නව මොළයේ ප්‍රවාහන පෙප්ටයිඩ හඳුනාගත හැකි බව පෙන්නුම් කිරීමට අමතරව, නව මොළයේ ප්‍රවාහන මාර්ග හඳුනා ගැනීමේදී සමාන ක්‍රියාකාරී තේරීම් ප්‍රවේශයන් ද වැදගත් වනු ඇතැයි අපි අපේක්ෂා කරමු.
ඵලක සාදන ඒකක (PFU) මත පදනම්ව, phage ඇසුරුම් පියවරෙන් පසු, ආසන්න වශයෙන් 109 ක විවිධත්වයක් සහිත අහඹු 12-mer රේඛීය T7 phage පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයක් නිර්මාණය කර නිර්මාණය කරන ලදී (ද්‍රව්‍ය සහ ක්‍රම බලන්න). in vivo panning කිරීමට පෙර අපි මෙම පුස්තකාලය ප්‍රවේශමෙන් විශ්ලේෂණය කළ බව සැලකිල්ලට ගැනීම වැදගත්ය. වෙනස් කරන ලද ප්‍රයිමර් භාවිතා කරමින් phage පුස්තකාල සාම්පලවල PCR විස්තාරණය HTS සඳහා සෘජුවම අදාළ වන ඇම්ප්ලිකන් ජනනය කළේය (පරිපූරක රූපය 1a). a) HTS11 අනුක්‍රමික දෝෂ, b) ප්‍රයිමර්වල ගුණාත්මකභාවය කෙරෙහි බලපෑම (NNK)1-12, සහ c) ස්ටෑන්ඩ්බයි පුස්තකාලයේ වල්-වර්ගයේ (wt) phage (ඇටසැකිලි ඇතුළු කිරීම්) තිබීම හේතුවෙන්, සත්‍යාපිත අනුක්‍රමික තොරතුරු පමණක් උපුටා ගැනීම සඳහා අනුක්‍රමික පෙරහන් ක්‍රියා පටිපාටියක් ක්‍රියාත්මක කරන ලදී (පරිපූරක රූපය 1b). මෙම පෙරහන් පියවර සියලුම HTS අනුක්‍රමික පුස්තකාල සඳහා අදාළ වේ. සම්මත පුස්තකාලය සඳහා, මුළු කියවීම් 233,868 ක් ලබා ගන්නා ලද අතර, ඉන් 39% ක් පෙරහන් නිර්ණායක සමත් වූ අතර පුස්තකාල විශ්ලේෂණය සහ පසුකාලීන වට සඳහා තේරීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී (පරිපූරක රූපය 1c-e). කියවීම් ප්‍රධාන වශයෙන් පාදක යුගල 3 ක දිගින් ගුණාකාර වූ අතර උපරිමය නියුක්ලියෝටයිඩ 36 ක් විය (පරිපූරක රූපය 1c), පුස්තකාල සැලසුම (NNK) 1-12 තහවුරු කළේය. සැලකිය යුතු ලෙස, පුස්තකාල සාමාජිකයින්ගෙන් ආසන්න වශයෙන් 11% ක් 12-මාන වල්-වර්ගයේ (wt) කොඳු නාරටිය PAGISRELVDKL ඇතුළු කිරීමක් අඩංගු වූ අතර, අනුපිළිවෙලින් අඩකට ආසන්න ප්‍රමාණයක් (49%) ඇතුළත් කිරීම් හෝ මකාදැමීම් අඩංගු විය. පුස්තකාල පුස්තකාලයේ HTS පුස්තකාලයේ පෙප්ටයිඩවල ඉහළ විවිධත්වය තහවුරු කළේය: පෙප්ටයිඩ අනුපිළිවෙලින් 81% කට වඩා එක් වරක් පමණක් හමු වූ අතර පිටපත් ≥4 කින් 1.5% ක් පමණක් සිදු විය (පරිපූරක රූපය 2a). රෙපරිපෝටරයේ ස්ථාන 12 කම ඇමයිනෝ අම්ල (aa) සංඛ්‍යාත, පිරිහුණු NKK රෙපරිපෝටරය මගින් ජනනය කරන ලද කෝඩෝන ගණන සඳහා අපේක්ෂිත සංඛ්‍යාත සමඟ හොඳින් සහසම්බන්ධ විය (පරිපූරක රූපය 2b). මෙම ඇතුළු කිරීම් මගින් කේතනය කරන ලද aa අපද්‍රව්‍යවල නිරීක්ෂණය කරන ලද සංඛ්‍යාතය ගණනය කළ සංඛ්‍යාතය (r = 0.893) සමඟ හොඳින් සහසම්බන්ධ විය (පරිපූරක රූපය 2c). එන්නත් කිරීම සඳහා ෆේජ් පුස්තකාල සකස් කිරීම සඳහා එන්ඩොටොක්සින් විස්තාරණය කිරීමේ සහ ඉවත් කිරීමේ පියවර ඇතුළත් වේ. මෙය ෆේජ් පුස්තකාලවල විවිධත්වය අඩු කිරීමට විභවයක් ඇති බව මීට පෙර පෙන්වා දී ඇත12,13. එබැවින්, අපි එන්ඩොටොක්සින් ඉවත් කිරීමට භාජනය වූ තහඩු-විස්තාරණය කරන ලද ෆේජ් පුස්තකාලයක් අනුක්‍රමණය කර AA හි සංඛ්‍යාතය ඇස්තමේන්තු කිරීම සඳහා මුල් පුස්තකාලය සමඟ සංසන්දනය කළෙමු. මුල් තටාකය සහ විස්තාරණය කරන ලද සහ පිරිසිදු කරන ලද තටාකය අතර ශක්තිමත් සහසම්බන්ධයක් (r = 0.995) නිරීක්ෂණය කරන ලද අතර, T7 ෆේජ් භාවිතා කරමින් තහඩු මත විස්තාරණය කරන ලද ක්ලෝන අතර තරඟය ප්‍රධාන පක්ෂග්‍රාහීත්වයක් ඇති නොකළ බව පෙන්නුම් කරයි. මෙම සංසන්දනය පදනම් වී ඇත්තේ එක් එක් පුස්තකාලයේ ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තරවල සංඛ්‍යාතය මත ය, මන්ද පුස්තකාලවල විවිධත්වය (~109) HTS සමඟ පවා සම්පූර්ණයෙන්ම ග්‍රහණය කර ගත නොහැකි බැවිනි. සෑම ස්ථානයකම aa හි සංඛ්‍යාත විශ්ලේෂණය මඟින් ඇතුළත් කළ ප්‍රතිපෝෂණයේ අවසාන ස්ථාන තුනෙහි කුඩා ස්ථාන-යැපෙන පක්ෂග්‍රාහීත්වයක් අනාවරණය විය (පරිපූරක රූපය 2e). නිගමනය කිරීමේදී, පුස්තකාලයේ ගුණාත්මකභාවය සහ විවිධත්වය පිළිගත හැකි බවත්, තේරීමේ වට කිහිපයක් අතර ෆේජ් පුස්තකාල විස්තාරණය කිරීම සහ සකස් කිරීම හේතුවෙන් විවිධත්වයේ සුළු වෙනස්කම් පමණක් නිරීක්ෂණය වූ බවත් අපි නිගමනය කළෙමු.
BBB සහ/හෝ BCSFB හරහා අභ්‍යන්තරව එන්නත් කරන ලද T7 phage හඳුනා ගැනීම පහසු කිරීම සඳහා සවිඥානික මීයන්ගේ CM තුළට ශල්‍යකර්මයෙන් කැනියුලාවක් බද්ධ කිරීමෙන් අනුක්‍රමික මස්තිෂ්ක තරල සාම්පල ලබා ගැනීම සිදු කළ හැකිය (රූපය 1a-b). අපි in vivo තේරීමේ පළමු වට තුනේදී ස්වාධීන තේරීම් අත් දෙකක් (අත් A සහ ​​B) භාවිතා කළෙමු (රූපය 1c). තේරීමේ පළමු වට තුනේදී හඳුන්වා දුන් මුළු phage ප්‍රමාණය අඩු කිරීමෙන් අපි තේරීමේ තද බව ක්‍රමයෙන් වැඩි කළෙමු. සිව්වන වටයේ පෑන් කිරීම සඳහා, අපි A සහ ​​B ශාඛා වලින් සාම්පල ඒකාබද්ධ කර අතිරේක ස්වාධීන තේරීම් තුනක් සිදු කළෙමු. මෙම ආකෘතියේ T7 phage අංශු වල in vivo ගුණාංග අධ්‍යයනය කිරීම සඳහා, වල්-වර්ගයේ phage (PAGISRELVDKL මාස්ටර් ඇතුළු කිරීම) වලිග නහර හරහා මීයන්ට එන්නත් කරන ලදී. විවිධ කාල ලක්ෂ්‍යවලදී මස්තිෂ්ක තරලයෙන් සහ රුධිරයෙන් phages නැවත ලබා ගැනීමෙන් පෙන්නුම් කළේ සාපේක්ෂව කුඩා T7 අයිකොසහෙඩ්‍රල් phages රුධිර මැදිරියෙන් වේගවත් ආරම්භක නිෂ්කාශන අවධියක් ඇති බවයි (පරිපූරක රූපය 3). පරිපාලනය කරන ලද ටයිටර සහ මීයන්ගේ රුධිර පරිමාව මත පදනම්ව, එන්නත් කිරීමෙන් මිනිත්තු 10 කට පසු රුධිරයේ පරිපාලනය කරන ලද මාත්‍රාවෙන් 1% wt. phage පමණක් අනාවරණය වූ බව අපි ගණනය කළෙමු. මෙම ආරම්භක වේගවත් පරිහානියෙන් පසුව, මිනිත්තු 27.7 ක අර්ධ ආයු කාලයක් සහිතව මන්දගාමී ප්‍රාථමික නිෂ්කාශනයක් මනිනු ලැබීය. වැදගත් වන්නේ, CSF මැදිරියෙන් ලබා ගන්නා ලද්දේ ඉතා සුළු ෆේජ් ප්‍රමාණයක් පමණක් වන අතර, එය CSF මැදිරියට වල් වර්ගයේ ෆේජ් සංක්‍රමණය සඳහා අඩු පසුබිමක් පෙන්නුම් කරයි (පරිපූරක රූපය 3). සාමාන්‍යයෙන්, රුධිරයේ T7 ෆේජ් හි ටයිටර 1 x 10-3% ක් සහ මුලින් එන්නත් කරන ලද ෆේජ් වලින් 4 x 10-8% ක් පමණක් මුළු සාම්පල කාලය තුළම (මිනිත්තු 0-250) මස්තිෂ්ක තරලයේ අනාවරණය විය. සැලකිය යුතු ලෙස, මස්තිෂ්ක තරලයේ වල් වර්ගයේ ෆේජ් හි අර්ධ ආයු කාලය (මිනිත්තු 25.7) රුධිරයේ නිරීක්ෂණය කළ ප්‍රමාණයට සමාන විය. මෙම දත්ත මගින් පෙන්නුම් කරන්නේ CM-කැනියුලේටඩ් මීයන් තුළ CSF මැදිරිය රුධිරයෙන් වෙන් කරන බාධකය නොවෙනස්ව පවතින බවත්, එමඟින් රුධිරයෙන් CSF මැදිරියට පහසුවෙන් ප්‍රවාහනය කළ හැකි ක්ලෝන හඳුනා ගැනීමට phage පුස්තකාලවල සජීවී තේරීමට ඉඩ සලසන බවත්ය.
(අ) විශාල තටාකයකින් මස්තිෂ්ක තරලය (CSF) නැවත සාම්පල ලබා ගැනීම සඳහා ක්‍රමයක් සැකසීම. (ආ) මධ්‍යම ස්නායු පද්ධතියේ (CNS) බාධකයේ සෛලීය පිහිටීම සහ රුධිර-මොළයේ බාධකය (BBB) ​​සහ රුධිර-මොළයේ බාධකය හරහා ගමන් කරන පෙප්ටයිඩ හඳුනා ගැනීමට භාවිතා කරන තේරීම් උපාය මාර්ගය පෙන්වන රූප සටහන. (ඇ) vivo phage සංදර්ශක පරීක්ෂණ ගැලීම් සටහන. තේරීමේ සෑම වටයකම, phages (ඊතල තුළ සත්ව හඳුනාගැනීම්) අභ්‍යන්තරව එන්නත් කරන ලදී. ස්වාධීන විකල්ප ශාඛා දෙකක් (A, B) තේරීමේ 4 වන වටය දක්වා වෙන වෙනම තබා ඇත. තේරීමේ 3 සහ 4 වට සඳහා, CSF වෙතින් ලබාගත් සෑම phage ක්ලෝනයක්ම අතින් අනුපිළිවෙලට සකස් කරන ලදී. (ඈ) T7 පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයේ (2 x 1012 phages/සත්ව) අභ්‍යන්තර එන්නත් කිරීමෙන් පසු කැනියුලේටඩ් මීයන් දෙදෙනෙකු තුළ පළමු වටයේ තේරීමේදී රුධිරයෙන් (රතු කව) සහ මස්තිෂ්ක තරලයෙන් (කොළ ත්‍රිකෝණ) හුදකලා වූ phage හි චාලක විද්‍යාව. නිල් කොටු මඟින් රුධිරයේ ඇති ෆේජ් වල සාමාන්‍ය ආරම්භක සාන්ද්‍රණය පෙන්නුම් කරයි, එන්නත් කරන ලද ෆේජ් ප්‍රමාණයෙන් ගණනය කර, මුළු රුධිර පරිමාව සැලකිල්ලට ගනී. කළු කොටු මඟින් රුධිර ෆේජ් සාන්ද්‍රණයන්ගෙන් නිස්සාරණය කරන ලද y රේඛාවේ ඡේදනය වන ලක්ෂ්‍යය දක්වයි. (e,f) පෙප්ටයිඩයේ ඇති විය හැකි සියලුම අතිච්ඡාදනය වන ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තරවල සාපේක්ෂ සංඛ්‍යාතය සහ ව්‍යාප්තිය ඉදිරිපත් කරන්න. කියවීම් 1000 කින් සොයාගත් චේතනා ගණන පෙන්වා ඇත. සැලකිය යුතු ලෙස (p < 0.001) පොහොසත් චේතනා රතු තිත් වලින් සලකුණු කර ඇත. (e) එන්නත් කරන ලද පුස්තකාලයේ ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තරයේ සාපේක්ෂ සංඛ්‍යාතය සතුන්ගෙන් රුධිරයෙන් ලබාගත් ෆේජ් සමඟ සංසන්දනය කරන සහසම්බන්ධතා විසිරුම් කුමන්ත්‍රණය #1.1 සහ #1.2. (f) රුධිරයේ සහ මස්තිෂ්ක තරලයේ හුදකලා වූ සත්ව ෆේජ් ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තර #1.1 සහ #1.2 හි සාපේක්ෂ සංඛ්‍යාත සංසන්දනය කරන සහසම්බන්ධතා විසිරුම් කුමන්ත්‍රණය. (g, h) සතුන් දෙදෙනා තුළම in vivo තේරීමේ වටයකින් පසු රුධිරයෙන් පොහොසත් වූ ෆේජ් (g) එදිරිව එන්නත් කරන ලද පුස්තකාල සහ CSF (h) එදිරිව රුධිරයෙහි අනුක්‍රමික හැඳුනුම්පත නිරූපණය. එක් අකුරක කේතයේ ප්‍රමාණයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ එම ඇමයිනෝ අම්ලය එම ස්ථානයේ කොපමණ වාරයක් සිදුවේද යන්නයි. කොළ = ධ්‍රැවීය, දම් = උදාසීන, නිල් = මූලික, රතු = ආම්ලික සහ කළු = ජලභීතික ඇමයිනෝ අම්ල. රූපය 1a, b නිර්මාණය කර නිෂ්පාදනය කරන ලද්දේ එඩ්වඩ් උරිච් විසිනි.
අපි CM උපකරණ මීයන් දෙදෙනෙකුට (ක්ලේඩ් A සහ ​​B) සහ මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළේ තරලයෙන් සහ රුධිරයෙන් හුදකලා ෆේජ් එන්නත් කළෙමු (රූපය 1d). පුස්තකාලයේ ආරම්භක වේගවත් නිෂ්කාශනය වල් වර්ගයේ ෆේජ් හා සසඳන විට අඩුවෙන් ප්‍රකාශ විය. සතුන් දෙදෙනාගේම එන්නත් කරන ලද පුස්තකාලයේ සාමාන්‍ය අර්ධ ආයු කාලය වල් වර්ගයේ ෆේජ් හා සමාන රුධිරයේ මිනිත්තු 24.8 ක් සහ CSF හි මිනිත්තු 38.5 කි. සෑම සතෙකුගෙන්ම රුධිරය සහ මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළේ තරල ෆේජ් සාම්පල HTS වලට භාජනය කරන ලද අතර කෙටි ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තරයක් තිබීම සඳහා හඳුනාගත් සියලුම පෙප්ටයිඩ විශ්ලේෂණය කරන ලදී. ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තර තෝරා ගනු ලැබුවේ ඒවා ව්‍යුහය ගොඩනැගීමට සහ පෙප්ටයිඩ-ප්‍රෝටීන් අන්තර්ක්‍රියා සඳහා අවම පදනමක් සපයන බැවිනි. එන්නත් කරන ලද ෆේජ් පුස්තකාලය සහ සතුන් දෙදෙනාගේම රුධිරයෙන් ලබාගත් ක්ලෝන අතර මෝස්තර බෙදා හැරීමේදී අපට හොඳ සහසම්බන්ධයක් හමු විය (රූපය 1e). දත්ත වලින් පෙන්නුම් කරන්නේ පුස්තකාලයේ සංයුතිය රුධිර මැදිරිය තුළ සුළු වශයෙන් පමණක් පොහොසත් වී ඇති බවයි. Weblogo16 මෘදුකාංගයේ අනුවර්තනයක් භාවිතා කරමින් එක් එක් ස්ථානයේ ඇමයිනෝ අම්ල සංඛ්‍යාත සහ එකඟතා අනුපිළිවෙල තවදුරටත් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. සිත්ගන්නා කරුණ නම්, රුධිර ග්ලයිසීන් අපද්‍රව්‍යවල ප්‍රබල පොහොසත් කිරීමක් අපට හමු විය (රූපය 1g). CSF වලින් තෝරාගත් ක්ලෝන සමඟ රුධිරය සංසන්දනය කළ විට, ශක්තිමත් තේරීමක් සහ චේතනාවන් තෝරා නොගැනීම නිරීක්ෂණය කරන ලදී (රූපය 1f), සහ සාමාජිකයින් 12 දෙනාගේ (රූපය 1h) පූර්ව නිශ්චිත ස්ථානවල ඇතැම් ඇමයිනෝ අම්ල මනාප ලෙස පැවතුනි. විශේෂයෙන්, තනි සතුන් මස්තිෂ්ක තරලයේ සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් වූ අතර, සතුන් දෙදෙනාගේම රුධිර ග්ලයිසීන් පොහොසත් කිරීම නිරීක්ෂණය කරන ලදී (පරිපූරක රූපය 4a-j). #1.1 සහ #1.2 සතුන්ගේ මස්තිෂ්ක තරලයේ අනුක්‍රමික දත්ත දැඩි ලෙස පෙරීමෙන් පසුව, අද්විතීය 12-mer පෙප්ටයිඩ 964 සහ 420 ක් ලබා ගන්නා ලදී (පරිපූරක රූපය 1d-e). හුදකලා වූ ෆේජ් ක්ලෝන විස්තාරණය කර දෙවන වටයේ in vivo තේරීමකට භාජනය කරන ලදී. දෙවන වටයේ තේරීමෙන් ලබාගත් Phage සෑම සතෙකු තුළම HTS වලට භාජනය කරන ලද අතර, හඳුනාගත් සියලුම පෙප්ටයිඩ, ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තර ඇතිවීම විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා මෝස්තර හඳුනාගැනීමේ වැඩසටහනකට ආදානයක් ලෙස භාවිතා කරන ලදී (රූපය 2a, b, ef). CSF වෙතින් ලබා ගන්නා ලද phage හි පළමු චක්‍රයට සාපේක්ෂව, A සහ ​​B ශාඛාවල CSF හි බොහෝ මෝස්තර තවදුරටත් තෝරා ගැනීම සහ තෝරා නොගැනීම අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (රූපය 2). ඒවා අනුකූල අනුපිළිවෙලෙහි විවිධ රටා නියෝජනය කරන්නේද යන්න තීරණය කිරීම සඳහා ජාල හඳුනාගැනීමේ ඇල්ගොරිතමයක් යොදන ලදී. විකල්ප ක්ලේඩ් A (රූපය 2c, d) සහ ක්ලේඩ් B (රූපය 2g, h) හි CSF විසින් නැවත ලබා ගන්නා ලද 12-මාන අනුපිළිවෙල අතර පැහැදිලි සමානකමක් නිරීක්ෂණය විය. එක් එක් ශාඛාවේ සංචිත විශ්ලේෂණය මඟින් 12-mer පෙප්ටයිඩ සඳහා විවිධ තේරීම් පැතිකඩ (පරිපූරක රූපය 5c, d) සහ තේරීමේ දෙවන වටයට සාපේක්ෂව දෙවන වටයෙන් පසු සංචිත ක්ලෝන සඳහා කාලයත් සමඟ CSF/රුධිර ටයිටර් අනුපාතයේ වැඩි වීමක් අනාවරණය විය (පරිපූරක රූපය 5e). ).
ක්‍රියාකාරී ෆේජ් සංදර්ශක තේරීමේ අනුප්‍රාප්තික වට දෙකක් මගින් මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළේ තරලයේ මෝස්තර සහ පෙප්ටයිඩ පොහොසත් කිරීම.
එක් එක් සතාගේ පළමු වටයෙන් (සතුන් #1.1 සහ #1.2) ලබාගත් සියලුම මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළේ තරල ෆේජ්, තටාකගත කර, විස්තාරණය කර, HT-අනුක්‍රමණය කර නැවත එන්නත් කරන ලදී (2 x 1010 ෆේජ්/සත්ව) 2 SM කැනියුලේටඩ් මීයන් (#1.1 → #). 2.1 සහ 2.2, 1.2 → 2.3 සහ 2.4). (a,b,e,f) පළමු සහ දෙවන තේරීම් වටවල සියලුම CSF-ව්‍යුත්පන්න ෆේජ් වල ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තරවල සාපේක්ෂ සංඛ්‍යාතය සංසන්දනය කරන සහසම්බන්ධතා විසිරුම් බිම්. දිශානති දෙකෙහිම පෙප්ටයිඩවල ඇති විය හැකි සියලුම අතිච්ඡාදනය වන ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ නියෝජනය කරන මෝස්තරවල සාපේක්ෂ සංඛ්‍යාතය සහ ව්‍යාප්තිය. කියවීම් 1000 කින් සොයාගත් මෝස්තර ගණන පෙන්වා ඇත. සංසන්දනය කරන ලද පුස්තකාලවලින් එකක තෝරාගත් හෝ බැහැර කරන ලද මෝස්තර සැලකිය යුතු ලෙස (p < 0.001) රතු තිත් වලින් ඉස්මතු කර ඇත. (c, d, g, h) in vivo තේරීමේ වට 2 සහ 1 මත පදනම් වූ සියලුම CSF-පොහොසත් ඇමයිනෝ අම්ල 12 දිගු අනුපිළිවෙලෙහි අනුක්‍රමික ලාංඡන නිරූපණය. එක් අකුරක කේතයේ ප්‍රමාණයෙන් පෙන්නුම් කරන්නේ එම ඇමයිනෝ අම්ලය එම ස්ථානයේ කොපමණ වාරයක් සිදුවේද යන්නයි. ලාංඡනය නිරූපණය කිරීම සඳහා, තේරීම් වට දෙකක් අතර තනි සතුන්ගෙන් ලබාගත් CSF අනුපිළිවෙලෙහි සංඛ්‍යාතය සංසන්දනය කර දෙවන වටයේ පොහොසත් අනුපිළිවෙල පෙන්වනු ලැබේ: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 සහ (h) #1.2–#2.4. සතුන් අංක 2.3 සහ අංක 2.4 හි (c, d) සතුන් අංක 2.1 සහ අංක 2.2 හෝ (g, h) හි දී ඇති ස්ථානයක ඇති වඩාත්ම පොහොසත් ඇමයිනෝ අම්ල වර්ණයෙන් දක්වා ඇත. කොළ = ධ්‍රැවීය, දම් = උදාසීන, නිල් = මූලික, රතු = ආම්ලික සහ කළු = ජලභීතික ඇමයිනෝ අම්ල.
තුන්වන වටයේ තේරීමෙන් පසුව, සතුන් දෙදෙනෙකුගෙන් හුදකලා කරන ලද CSF-ප්‍රතිනිර්මාණය කරන ලද ෆේජ් ක්ලෝන 332 කින් අද්විතීය පෙප්ටයිඩ අනුපිළිවෙලවල් 124 ක් (#3.1 සහ #3.2) අපි හඳුනා ගත්තෙමු (පරිපූරක රූපය 6a). LGSVS (18.7%) අනුපිළිවෙල ඉහළම සාපේක්ෂ අනුපාතයක් ඇති අතර, පසුව වල්-වර්ගයේ ඇතුළු කිරීම් PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) සහ SARGSWREIVSLS (2.2%) අනුගමනය කරන ලදී. අවසාන සිව්වන වටයේදී, අපි වෙනම සතුන් තිදෙනෙකුගෙන් ස්වාධීනව තෝරාගත් ශාඛා දෙකක් එකතු කළෙමු (රූපය 1c). CSF වෙතින් ලබා ගත් අනුක්‍රමික ෆේජ් ක්ලෝන 925 න්, සිව්වන වටයේදී අපට අද්විතීය පෙප්ටයිඩ අනුපිළිවෙලවල් 64 ක් හමු විය (පරිපූරක රූපය 6b), ඒ අතර වල්-වර්ගයේ ෆේජ් හි සාපේක්ෂ අනුපාතය 0.8% දක්වා පහත වැටුණි. සිව්වන වටයේ වඩාත් සුලභ CSF ක්ලෝන වූයේ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) සහ RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %). තෝරාගත් පෙප්ටයිඩවල දිග පරාසය NNK පුස්තකාල නිර්මාණය සඳහා පරිහානියට පත් කෝඩෝන භාවිතා කරන විට පුස්තකාල ප්‍රයිමර්වල නියුක්ලියෝටයිඩ ඇතුළු කිරීම්/මැකීම් හෝ නොමේරූ නැවතුම් කෝඩෝන නිසාය. නොමේරූ නැවතුම් කෝඩෝන කෙටි පෙප්ටයිඩ ජනනය කරන අතර ඒවා හිතකර aa චේතනාව අඩංගු බැවින් තෝරා ගනු ලැබේ. කෘතිම පුස්තකාලවල ප්‍රයිමර්වල ඇතුළත් කිරීම්/මැකීම් නිසා දිගු පෙප්ටයිඩ ඇති විය හැක. මෙය නිර්මාණය කරන ලද නැවතුම් කෝඩෝනය රාමුවෙන් පිටත ස්ථානගත කර නව නැවතුම් කෝඩෝනයක් පහළට දිස්වන තෙක් එය කියවයි. සාමාන්‍යයෙන්, අපි ආදාන දත්ත නියැදි ප්‍රතිදාන දත්ත සමඟ සංසන්දනය කිරීමෙන් තේරීම් වට හතර සඳහාම පොහොසත් කිරීමේ සාධක ගණනය කළෙමු. පළමු වටයේ පරීක්ෂාව සඳහා, අපි නිශ්චිත නොවන පසුබිම් යොමුවක් ලෙස වල්-වර්ගයේ ෆේජ් ටයිටර් භාවිතා කළෙමු. සිත්ගන්නා කරුණ නම්, පළමු CSF චක්‍රයේ දී සෘණ ෆේජ් තේරීම ඉතා ශක්තිමත් වූ නමුත් රුධිරයේ නොවේ (රූපය 3a), එය පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයේ බොහෝ සාමාජිකයින් CSF මැදිරියට හෝ සාපේක්ෂ ෆේජ් වලට නිෂ්ක්‍රීය විසරණය වීමේ අඩු සම්භාවිතාව නිසා විය හැකිය. බැක්ටීරියාෆේජ් වලට වඩා කාර්යක්ෂමව රඳවා තබා ගැනීමට හෝ රුධිර ප්‍රවාහයෙන් ඉවත් කිරීමට නැඹුරු වේ. කෙසේ වෙතත්, දෙවන වටයේ පෑන් කිරීමේදී, ක්ලේඩ් දෙකෙහිම CSF හි ෆේජ් වල ප්‍රබල තේරීමක් නිරීක්ෂණය කරන ලද අතර, එයින් ඇඟවෙන්නේ පෙර වටය CSF අවශෝෂණය ප්‍රවර්ධනය කරන පෙප්ටයිඩ ප්‍රදර්ශනය කරන ෆේජ් වලින් පොහොසත් කර ඇති බවයි (රූපය 3a). නැවතත්, සැලකිය යුතු රුධිර පොහොසත් කිරීමකින් තොරව. තුන්වන සහ සිව්වන වටවලදී, ෆේජ් ක්ලෝන CSF හි සැලකිය යුතු ලෙස පොහොසත් කරන ලදී. අවසාන තේරීමේ වට දෙක අතර එක් එක් අද්විතීය පෙප්ටයිඩ අනුපිළිවෙලෙහි සාපේක්ෂ සංඛ්‍යාතය සංසන්දනය කිරීමේදී, තේරීමේ සිව්වන වටයේදී අනුපිළිවෙල ඊටත් වඩා පොහොසත් වී ඇති බව අපට පෙනී ගියේය (රූපය 3b). පෙප්ටයිඩ දිශානති දෙකම භාවිතා කරමින් අද්විතීය පෙප්ටයිඩ අනුපිළිවෙලවල් 64 න් ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ මෝස්තර 931 ක් උපුටා ගන්නා ලදී. සිව්වන වටයේ වඩාත්ම පොහොසත් මෝස්තර, එන්නත් කරන ලද පුස්තකාලයට සාපේක්ෂව සියලුම වට හරහා ඒවායේ පොහොසත් කිරීමේ පැතිකඩ සඳහා වඩාත් සමීපව පරීක්ෂා කරන ලදී (කපා හැරීම: 10% පොහොසත් කිරීම) (පරිපූරක රූපය 6c). තේරීමේ සාමාන්‍ය රටා පෙන්නුම් කළේ අධ්‍යයනය කරන ලද චේතනාවන් බොහොමයක් තේරීම් ශාඛා දෙකෙහිම පෙර වටවල පොහොසත් කර ඇති බවයි. කෙසේ වෙතත්, සමහර චේතනාවන් (උදා: SGL, VSG, LGS GSV) ප්‍රධාන වශයෙන් විකල්ප ක්ලේඩ් A වලින් වන අතර අනෙක් ඒවා (උදා: FGW, RTN, WGF, NTR) විකල්ප ක්ලේඩ් B වලින් පොහොසත් කර ඇත.
ස්ට්‍රෙප්ටාවයිඩින් ගෙවීම් සමඟ සංයෝජිත CSF-පොහොසත් කළ phage-ප්‍රදර්ශනය කරන ලද පෙප්ටයිඩ සහ ජෛව ටයිනයිලේටඩ් නායක පෙප්ටයිඩ වල CSF ප්‍රවාහනය වලංගු කිරීම.
(අ) එන්නත් කරන ලද (ආදාන = I) ෆේජ් (PFU) ටයිටර සහ තීරණය කරන ලද CSF ෆේජ් ටයිටර (ප්‍රතිදානය = O) මත පදනම්ව වට හතරේම (R1-R4) ගණනය කරන ලද පොහොසත් කිරීමේ අනුපාත. අවසාන වට තුන (R2-R4) සඳහා පොහොසත් කිරීමේ සාධක බර දත්ත සමඟ පෙර වටය සහ පළමු වටය (R1) සමඟ සංසන්දනය කිරීමෙන් ගණනය කරන ලදී. විවෘත තීරු යනු මස්තිෂ්ක තරලය වන අතර, සෙවන ලද තීරු ප්ලාස්මා වේ. (***p<0.001, ශිෂ්‍යයාගේ t-පරීක්ෂණය මත පදනම්ව). (ආ) තේරීමේ 4 වන වටයෙන් පසු CSF හි එකතු කරන ලද සියලුම ෆේජ් වලට සාපේක්ෂව ශ්‍රේණිගත කර ඇති වඩාත් බහුල ෆේජ් පෙප්ටයිඩ ලැයිස්තුව. වඩාත් සුලභ ෆේජ් ක්ලෝන හය වර්ණයෙන් ඉස්මතු කර ඇත, අංකනය කර ඇති අතර තේරීමේ 3 සහ 4 වට අතර ඒවායේ පොහොසත් කිරීමේ සාධක (ඇ,ඩී) 4 වන වටයේ සිට වඩාත් පොහොසත් ෆේජ් ක්ලෝන හය, හිස් ෆේජ් සහ මාපිය ෆේජ් පෙප්ටයිඩ පුස්තකාල CSF සාම්පල ආකෘතියකින් තනි තනිව විශ්ලේෂණය කරන ලදී. දක්වා ඇති කාල ලක්ෂ්‍යයන්හිදී CSF සහ රුධිර සාම්පල එකතු කරන ලදී. (ඇ) අපේක්ෂක ෆේජ් ක්ලෝන 6 ක සමාන ප්‍රමාණ (2 x 1010 ෆේජ්/සතුන්), හිස් ෆේජ් (#1779) (2 x 1010 ෆේජ්/සතුන්) සහ තොග ෆේජ් පෙප්ටයිඩ පුස්තකාල (2 x 1012 ෆේජ්/සතුන්) එන්නත් කරන්න අවම වශයෙන් CM 3 ක් වලිග නහරය හරහා කැනියුලේටඩ් සත්වයාට වෙන වෙනම පරිපාලනය කෙරේ. එන්නත් කරන ලද එක් එක් ෆේජ් ක්ලෝනයේ සහ ෆේජ් පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයේ CSF ඖෂධවේදය කාලයත් සමඟ පෙන්වා ඇත. (ඈ) සාම්පල ලබා ගත් කාලය තුළ සියලුම යථා තත්ත්වයට පත් වූ ෆේජ්/මිලි ලීටර් සඳහා සාමාන්‍ය CSF/රුධිර අනුපාතය පෙන්වයි. (ඉ) කෘතිම නායක පෙප්ටයිඩ හතරක් සහ එක් ස්ක්‍රැම්බල් පාලනයක් බයෝටින් සමඟ ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් සමඟ සම්බන්ධ කර ඇති අතර ඉන් පසුව එන්නත් කරන ලදී (වලිග නහර iv, 10 mg ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින්/කිලෝග්‍රෑම්). අවම වශයෙන් ඉන්ටියුබේටඩ් මීයන් තිදෙනෙකු (N = 3). දක්වා ඇති කාල ලක්ෂ්‍යයන්හිදී CSF සාම්පල එකතු කරන ලද අතර ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් සාන්ද්‍රණය CSF ප්‍රති-ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් ELISA මගින් මනිනු ලැබීය (nd = අනාවරණය වී නොමැත). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA පරීක්ෂණය මත පදනම්ව). (f) වඩාත්ම පොහොසත් ෆේජ් පෙප්ටයිඩ ක්ලෝනය #2002 (දම් පාට) ඇමයිනෝ අම්ල අනුපිළිවෙල 4 වන වටයේ තේරීමෙන් තෝරාගත් අනෙකුත් ෆේජ් පෙප්ටයිඩ ක්ලෝන සමඟ සංසන්දනය කිරීම. සමාන සහ සමාන ඇමයිනෝ අම්ල කොටස් වර්ණ-කේතනය කර ඇත.
සිව්වන වටයේ (රූපය 3b) සියලුම පොහොසත් ෆේජ් වලින්, CSF සාම්පල ආකෘතියේ තවදුරටත් තනි විශ්ලේෂණය සඳහා අපේක්ෂක ක්ලෝන හයක් තෝරා ගන්නා ලදී. කැනියුලේටඩ් CM සතුන් තිදෙනෙකුට අපේක්ෂක ෆේජ් හය, හිස් ෆේජ් (ඇතුළත් කිරීමක් නැත) සහ ප්‍රොෆේජ් පෙප්ටයිඩ පුස්තකාල සමාන ප්‍රමාණවලින් එන්නත් කරන ලද අතර, CSF (රූපය 3c) සහ රුධිරයේ (පරිපූරක රූපය 7) ඖෂධවේදය තීරණය කරන ලදී. පරීක්ෂා කරන ලද සියලුම ෆේජ් ක්ලෝන හිස් පාලන ෆේජ් (#1779) ට වඩා 10-1000 ගුණයකින් වැඩි මට්ටමක CSF මැදිරිය ඉලක්ක කර ගත්තේය. උදාහරණයක් ලෙස, ක්ලෝන #2020 සහ #2077 පාලක ෆේජ් වලට වඩා 1000 ගුණයකින් පමණ ඉහළ CSF ටයිටර් තිබුණි. තෝරාගත් සෑම පෙප්ටයිඩයකම ඖෂධීය පැතිකඩ වෙනස් වේ, නමුත් ඒ සියල්ලටම ඉහළ CSF හෝමිං හැකියාවක් ඇත. #1903 සහ #2011 ක්ලෝන සඳහා කාලයත් සමඟ නිරන්තර අඩුවීමක් අපි නිරීක්ෂණය කළ අතර, #2077, #2002 සහ #2009 ක්ලෝන සඳහා පළමු මිනිත්තු 10 තුළ වැඩිවීමක් ක්‍රියාකාරී ප්‍රවාහනය පෙන්නුම් කළ හැකි නමුත් සත්‍යාපනය කළ යුතුය. ක්ලෝන #2020, #2002 සහ #2077 ඉහළ මට්ටම්වලදී ස්ථාවර වූ අතර, ආරම්භක වැඩිවීමෙන් පසු ක්ලෝන #2009 හි CSF සාන්ද්‍රණය සෙමෙන් අඩු විය. ඉන්පසු අපි එක් එක් CSF අපේක්ෂකයාගේ සාපේක්ෂ සංඛ්‍යාතය එහි රුධිර සාන්ද්‍රණය සමඟ සංසන්දනය කළෙමු (රූපය 3d). සෑම සාම්පල කාලයකදීම එක් එක් CSF අපේක්ෂකයාගේ මධ්‍යන්‍ය ටයිටරය එහි රුධිර ටයිටරය සමඟ සහසම්බන්ධයෙන් පෙන්නුම් කළේ අපේක්ෂකයින් හය දෙනාගෙන් තිදෙනෙකු රුධිර CSF වලින් සැලකිය යුතු ලෙස පොහොසත් වී ඇති බවයි. සිත්ගන්නා කරුණ නම්, ක්ලෝන #2077 ඉහළ රුධිර ස්ථායිතාවයක් පෙන්නුම් කළේය (පරිපූරක රූපය 7). පෙප්ටයිඩ වලටම ෆේජ් අංශු හැර අනෙකුත් භාණ්ඩ CSF මැදිරියට ක්‍රියාකාරීව ප්‍රවාහනය කිරීමට හැකියාව ඇති බව තහවුරු කිරීම සඳහා, අපි ෆේජ් අංශුවට පෙප්ටයිඩ සම්බන්ධ වන N-පර්යන්තයේදී බයෝටින් සමඟ ව්‍යුත්පන්න කරන ලද නායක පෙප්ටයිඩ හතරක් සංස්ලේෂණය කළෙමු. බයෝටයිනයිලේටඩ් පෙප්ටයිඩ (අංක 2002, 2009, 2020 සහ 2077) ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් (SA) සමඟ සංයෝජන කර ෆේජ් ජ්‍යාමිතිය තරමක් අනුකරණය කරන බහු අවයවික ආකාර ලබා ගන්නා ලදී. මෙම ආකෘතිය මඟින් රුධිරයේ සහ මස්තිෂ්ක තරලයේ SA නිරාවරණය භාණ්ඩ ප්‍රවාහනය කරන ප්‍රෝටීන් පෙප්ටයිඩ ලෙස මැනීමට ද අපට ඉඩ සැලසීය. වැදගත් කරුණක් නම්, මෙම SA-සංයුක්ත ආකෘතියෙන් කෘතිම පෙප්ටයිඩ පරිපාලනය කළ විට බොහෝ විට ෆේජ් දත්ත ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කළ හැකිය (රූපය 3e). ස්ක්‍රැම්බල්ඩ් පෙප්ටයිඩවලට පැය 48ක් ඇතුළත හඳුනාගත නොහැකි මට්ටම් සමඟ අඩු ආරම්භක නිරාවරණයක් සහ වේගවත් CSF නිෂ්කාශනයක් තිබුණි. මෙම පෙප්ටයිඩ ෆේජ් ක්ලෝන CSF අවකාශයට බෙදා හැරීමේ මාර්ග පිළිබඳ අවබෝධයක් ලබා ගැනීම සඳහා, අපි vivo තුළ අභ්‍යන්තර එන්නත් කිරීමෙන් පැය 1කට පසු ෆේජ් අංශු සෘජුවම හඳුනා ගැනීම සඳහා ප්‍රතිශක්තිකරණ රසායන විද්‍යාව (IHC) භාවිතයෙන් තනි ෆේජ් පෙප්ටයිඩ පහරවල් දේශීයකරණය කිරීම විශ්ලේෂණය කළෙමු. සැලකිය යුතු කරුණක් නම්, ක්ලෝන #2002, #2077, සහ #2009 මොළයේ කේශනාලිකා වල ශක්තිමත් පැල්ලම් මගින් අනාවරණය කර ගත හැකි අතර, පාලන ෆේජ් (#1779) සහ ක්ලෝන #2020 අනාවරණය කර නොගන්නා ලදී (පරිපූරක රූපය 8). මෙයින් ඇඟවෙන්නේ මෙම පෙප්ටයිඩ BBB තරණය කිරීමෙන් මොළයට බලපෑමට දායක වන බවයි. BSCFB මාර්ගය ද සම්බන්ධ විය හැකි බැවින්, මෙම උපකල්පනය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා තවදුරටත් සවිස්තරාත්මක විශ්ලේෂණයක් අවශ්‍ය වේ. වඩාත්ම පොහොසත් ක්ලෝනයේ (#2002) ඇමයිනෝ අම්ල අනුපිළිවෙල අනෙකුත් තෝරාගත් පෙප්ටයිඩ සමඟ සංසන්දනය කිරීමේදී, ඒවායින් සමහරක් සමාන ඇමයිනෝ අම්ල දිගු ඇති බව සටහන් විය, එය සමාන ප්‍රවාහන යාන්ත්‍රණයක් පෙන්නුම් කළ හැකිය (රූපය 3f).
එහි අද්විතීය ප්ලාස්මා පැතිකඩ සහ කාලයත් සමඟ CSF හි සැලකිය යුතු වැඩි වීමක් හේතුවෙන්, phage display clone #2077 පැය 48 ක කාලයක් තුළ තවදුරටත් ගවේෂණය කරන ලද අතර තිරසාර SA මට්ටම් සමඟ සම්බන්ධව නිරීක්ෂණය කරන ලද CSF හි වේගවත් වැඩිවීම ප්‍රතිනිෂ්පාදනය කිරීමට හැකි විය (රූපය 4a). අනෙකුත් හඳුනාගත් phage ක්ලෝන සම්බන්ධයෙන්, #2077 මොළයේ කේශනාලිකා සඳහා දැඩි ලෙස පැල්ලම් කර ඇති අතර ඉහළ විභේදනයකින් බැලූ විට කේශනාලිකා සලකුණු ලෙක්ටින් සමඟ සැලකිය යුතු සම-ස්ථානගත කිරීමක් සහ සමහර විට parenchymal අවකාශයේ යම් පැල්ලම් ඇති බව පෙන්නුම් කළේය (රූපය 4b). CNS හි පෙප්ටයිඩ-මැදිහත් වූ ඖෂධීය බලපෑම් ලබා ගත හැකිද යන්න විමර්ශනය කිරීම සඳහා, අපි i) #2077 සංක්‍රාන්ති පෙප්ටයිඩයේ සහ ii) BACE1 නිෂේධක පෙප්ටයිඩයේ ජෛව-ටයිනයිලේටඩ් අනුවාදයන් SA සමඟ විවිධ අනුපාත දෙකකින් මිශ්‍ර කරන ලද අත්හදා බැලීමක් සිදු කළෙමු. එක් සංයෝජනයක් සඳහා අපි BACE1 පෙප්ටයිඩ නිෂේධකය පමණක් භාවිතා කළ අතර අනෙක සඳහා අපි BACE1 පෙප්ටයිඩ නිෂේධකයේ 1:3 අනුපාතයක් #2077 පෙප්ටයිඩයට භාවිතා කළෙමු. සාම්පල දෙකම අභ්‍යන්තරව පරිපාලනය කරන ලද අතර බීටා-ඇමිලොයිඩ් පෙප්ටයිඩ 40 (Abeta40) හි රුධිරයේ සහ මස්තිෂ්ක තරල මට්ටම් කාලයත් සමඟ මනිනු ලැබීය. Abeta40 මොළයේ පරෙන්චිමාවේ BACE1 නිෂේධනය පිළිබිඹු කරන බැවින් CSF හි මනිනු ලැබීය. අපේක්ෂා කළ පරිදි, සංකීර්ණ දෙකම Abeta40 හි රුධිර මට්ටම් සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කළේය (රූපය 4c, d). කෙසේ වෙතත්, පෙප්ටයිඩ අංක 2077 මිශ්‍රණයක් සහ SA සමඟ සංයෝජිත BACE1 පෙප්ටයිඩයේ නිෂේධකයක් අඩංගු සාම්පල පමණක් මස්තිෂ්ක තරලයේ Abeta40 හි සැලකිය යුතු අඩුවීමක් ඇති කළේය (රූපය 4c). දත්ත වලින් පෙනී යන්නේ පෙප්ටයිඩ අංක 2077 ට 60 kDa SA ප්‍රෝටීනය CNS වෙත ප්‍රවාහනය කිරීමට හැකි වන අතර BACE1 පෙප්ටයිඩයේ SA-සංයුක්ත නිෂේධක සමඟ ඖෂධීය බලපෑම් ඇති කරන බවයි.
(අ) අවම වශයෙන් CM-ඉන්ටියුබේටඩ් මීයන් තිදෙනෙකු තුළ CSF පෙප්ටයිඩ #2077 (RLSSVDSDLSGC) සහ එන්නත් නොකළ පාලන ෆේජ් (#1779) හි දිගුකාලීන ඖෂධීය පැතිකඩ පෙන්වන T7 ෆේජ් හි ක්ලෝනල් එන්නත් කිරීම (2 × 10 ෆේජ්/සත්වයා). (ආ) ෆේජ්-එන්නත් කරන ලද මීයන් තුළ (2 × 10 ෆේජ්/සත්ව) නියෝජිත බාහික ක්ෂුද්‍ර වාහිනීවල කොන්ෆෝකල් අන්වීක්ෂීය රූපය, පෙප්ටයිඩ #2077 සහ යාත්රා (ලෙක්ටින්) ප්‍රති-පැල්ලම් කිරීම පෙන්වයි. මෙම ෆේජ් ක්ලෝන මීයන් 3 දෙනෙකුට ලබා දුන් අතර පර්ෆියුෂන් කිරීමට පෙර පැය 1 ක් සංසරණය වීමට ඉඩ දෙන ලදී. මොළය කොටස් කර T7 ෆේජ් කැප්සිඩයට එරෙහිව පොලික්ලෝනල් FITC-ලේබල් කරන ලද ප්‍රතිදේහ සමඟ පැල්ලම් කරන ලදී. පර්ෆියුෂන් කිරීමට සහ පසුව සවි කිරීමට මිනිත්තු දහයකට පෙර, DyLight594-ලේබල් කරන ලද ලෙක්ටින් අභ්‍යන්තරව පරිපාලනය කරන ලදී. කේශනාලිකා සහ පෙරිවාස්කියුලර් මොළයේ පටක වල ලුමෙන් හි ක්ෂුද්‍ර වාහිනී සහ ෆේජ් (කොළ) වල ලුමිනල් පැත්තේ ලෙක්ටින් පැල්ලම් (රතු) පෙන්වන ප්‍රතිදීප්ත රූප. පරිමාණ තීරුව 10 µm ට අනුරූප වේ. (c, d) බයෝටිනයිලේටඩ් BACE1 නිෂේධනීය පෙප්ටයිඩය තනිවම හෝ බයෝටිනයිලේටඩ් ට්‍රාන්ස්තිට් පෙප්ටයිඩය #2077 සමඟ ඒකාබද්ධව ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් සමඟ සම්බන්ධ කරන ලද අතර පසුව අවම වශයෙන් කැනියුලේටඩ් CM මීයන් තිදෙනෙකු (10 mg ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින්/kg) අභ්‍යන්තරව එන්නත් කරන ලදී. Aβ40 හි BACE1 පෙප්ටයිඩ නිෂේධක-මැදිහත් වූ අඩු කිරීම රුධිරයේ (රතු) සහ මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළේ (තැඹිලි) Aβ1-40 ELISA මගින් දක්වා ඇති කාල ලක්ෂ්‍යවලදී මනිනු ලැබීය. වඩා හොඳ පැහැදිලිකම සඳහා, 100% පරිමාණයකින් ප්‍රස්ථාරයේ තිත් රේඛාවක් අඳිනු ලැබේ. (ඇ) 3:1 අනුපාතයකින් ස්ට්‍රෙප්ටාවයිඩින් සමඟ ප්‍රතිකාර කළ මීයන් තුළ රුධිරයේ (රතු ත්‍රිකෝණ) සහ මස්තිෂ්ක සුෂුම්නා තරලයේ (තැඹිලි ත්‍රිකෝණ) Aβ40 ප්‍රතිශතයේ අඩුවීමක්, ප්‍රවාහන පෙප්ටයිඩ #2077 සහ BACE1 නිෂේධනීය පෙප්ටයිඩයට සංයෝජිතව තිබීම. (ඈ) ස්ට්‍රෙප්ටාවයිඩින් සමඟ ප්‍රතිකාර කළ මීයන් තුළ BACE1 නිෂේධනීය පෙප්ටයිඩයකට පමණක් සම්බන්ධ වී ඇති රුධිරයේ Aβ40 (රතු කව) සහ මස්තිෂ්ක සුෂුම්නා තරලයේ (තැඹිලි කව) ප්‍රතිශතයේ අඩුවීමක්. පාලනයේ Aβ සාන්ද්‍රණය 420 pg/ml (සම්මත අපගමනය = 101 pg/ml) විය.
ජෛව වෛද්‍ය පර්යේෂණ ක්ෂේත්‍ර කිහිපයකම Phage සංදර්ශකය සාර්ථකව යොදාගෙන ඇත17. මෙම ක්‍රමය in vivo සනාල විවිධත්ව අධ්‍යයනයන් සඳහා මෙන්ම මස්තිෂ්ක වාහිනී ඉලක්ක කරගත් අධ්‍යයනයන් සඳහා ද භාවිතා කර ඇත20,21,22,23,24,25,26. මෙම අධ්‍යයනයේ දී, අපි මෙම තේරීම් ක්‍රමයේ යෙදීම මස්තිෂ්ක වාහිනී ඉලක්ක කරගත් පෙප්ටයිඩ සෘජුවම හඳුනා ගැනීමට පමණක් නොව, රුධිර-මොළයේ බාධකය තරණය කිරීම සඳහා ක්‍රියාකාරී ප්‍රවාහන ගුණාංග ඇති අපේක්ෂකයින් සොයා ගැනීමට ද දීර්ඝ කළෙමු. CM ඉන්ටියුබේටඩ් මීයන් තුළ in vivo තේරීමේ ක්‍රියා පටිපාටියක වර්ධනය අපි දැන් විස්තර කරන අතර CSF හෝමිං ගුණාංග සහිත පෙප්ටයිඩ හඳුනා ගැනීමට එහි හැකියාව පෙන්නුම් කරමු. 12-mer අහඹු පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයක් ප්‍රදර්ශනය කරන T7 phage භාවිතා කරමින්, T7 phage රුධිර-මොළයේ බාධකයට අනුවර්තනය වීමට තරම් කුඩා (ආසන්න වශයෙන් 60 nm විෂ්කම්භය)10 බව අපට පෙන්නුම් කිරීමට හැකි වූ අතර එමඟින් රුධිර-මොළයේ බාධකය හෝ කොරොයිඩ් ප්ලෙක්සස් සෘජුවම තරණය කරයි. කැනියුලේටඩ් CM මීයන්ගෙන් CSF අස්වැන්න නෙළීම හොඳින් පාලනය කරන ලද in vivo ක්‍රියාකාරී පරීක්ෂණ ක්‍රමයක් බවත්, නිස්සාරණය කරන ලද phage රුධිර වාහිනී වලට බැඳී ඇතිවා පමණක් නොව, රුධිර-මොළයේ බාධකය හරහා ප්‍රවාහකයක් ලෙසද ක්‍රියා කරන බවත් අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු. තවද, එකවර රුධිරය එකතු කිරීමෙන් සහ CSF සහ රුධිරයෙන් ලබාගත් phages වලට HTS යෙදීමෙන්, අපගේ CSF තේරීම රුධිර පොහොසත් කිරීම හෝ තේරීමේ වට අතර ප්‍රසාරණය සඳහා යෝග්‍යතාවයෙන් බලපා නොමැති බව අපි තහවුරු කළෙමු. කෙසේ වෙතත්, CSF මැදිරියට ළඟා විය හැකි phages මොළයේ පොහොසත් වීමට ප්‍රමාණවත් කාලයක් රුධිර ප්‍රවාහයේ නොනැසී සංසරණය විය යුතු බැවින්, රුධිර මැදිරිය තේරීමේ ක්‍රියා පටිපාටියේ කොටසකි. අමු HTS දත්ත වලින් විශ්වාසදායක අනුක්‍රමික තොරතුරු උපුටා ගැනීම සඳහා, විශ්ලේෂණ වැඩ ප්‍රවාහයේ වේදිකා-විශේෂිත අනුක්‍රමික දෝෂ වලට අනුවර්තනය කරන ලද පෙරහන් අපි ක්‍රියාත්මක කළෙමු. පරීක්ෂණ ක්‍රමයට චාලක පරාමිතීන් ඇතුළත් කිරීමෙන්, රුධිරයේ වල්-වර්ගයේ T7 phages (t½ ~ 28 min) හි වේගවත් ඖෂධීය විද්‍යාව අපි තහවුරු කළෙමු24, 27, 28 සහ මිනිත්තුවකට මස්තිෂ්ක තරලයේ (t½ ~ 26 min) ඔවුන්ගේ අර්ධ ආයු කාලය තීරණය කළෙමු. රුධිරයේ සහ CSF හි සමාන ඖෂධීය පැතිකඩ තිබියදීත්, CSF හි phage හි රුධිර සාන්ද්‍රණයෙන් 0.001% ක් පමණක් අනාවරණය කර ගත හැකි වූ අතර, එය රුධිර-මොළයේ බාධකය හරහා වල්-වර්ගයේ T7 phage හි අඩු පසුබිම් සංචලතාව පෙන්නුම් කරයි. මෙම කාර්යය in vivo panning උපාය මාර්ග භාවිතා කරන විට පළමු වටයේ තේරීමේ වැදගත්කම ඉස්මතු කරයි, විශේෂයෙන් සංසරණයෙන් වේගයෙන් ඉවත් කරන phage පද්ධති සඳහා, CNS මැදිරියට ළඟා වීමට ක්ලෝන කිහිපයක් පමණක් හැකි බැවිනි. මේ අනුව, පළමු වටයේ දී, පුස්තකාල විවිධත්වය අඩු කිරීම ඉතා විශාල විය, මන්ද මෙම ඉතා දැඩි CSF ආකෘතියේ අවසානයේ සීමිත ක්ලෝන සංඛ්‍යාවක් පමණක් එකතු කරන ලදී. මෙම in vivo panning උපාය මාර්ගයට CSF මැදිරියේ ක්‍රියාකාරී සමුච්චය වීම, රුධිර මැදිරියේ ක්ලෝන පැවැත්ම සහ පළමු මිනිත්තු 10 තුළ රුධිරයෙන් T7 phage ක්ලෝන වේගයෙන් ඉවත් කිරීම වැනි තේරීම් පියවර කිහිපයක් ඇතුළත් විය (රූපය 1d සහ අතිරේක රූපය 4M). මේ අනුව, පළමු වටයෙන් පසු, CSF හි විවිධ phage ක්ලෝන හඳුනා ගන්නා ලදී, නමුත් එකම ආරම්භක තටාකය තනි සතුන් සඳහා භාවිතා කරන ලදී. මෙයින් ඇඟවෙන්නේ පුස්තකාල සාමාජිකයින් විශාල සංඛ්‍යාවක් සිටින මූලාශ්‍ර පුස්තකාල සඳහා බහු දැඩි තේරීම් පියවර විවිධත්වයේ සැලකිය යුතු අඩුවීමක් ඇති කරන බවයි. එබැවින්, අහඹු සිදුවීම් ආරම්භක තේරීම් ක්‍රියාවලියේ අනිවාර්ය අංගයක් බවට පත්වනු ඇති අතර එය ප්‍රතිඵලයට බෙහෙවින් බලපායි. මුල් පුස්තකාලයේ ඇති බොහෝ ක්ලෝන වලට ඉතා සමාන CSF පොහොසත් කිරීමේ ප්‍රවණතාවක් තිබූ බව පෙනේ. කෙසේ වෙතත්, එකම පර්යේෂණාත්මක තත්වයන් යටතේ වුවද, ආරම්භක සංචිතයේ එක් එක් විශේෂිත ක්ලෝනයේ කුඩා සංඛ්‍යාව හේතුවෙන් තේරීම් ප්‍රතිඵල වෙනස් විය හැකිය.
CSF වලින් පොහොසත් කරන ලද චේතනාවන් රුධිරයේ ඇති චේතනාවන්ට වඩා වෙනස් වේ. සිත්ගන්නා කරුණ නම්, තනි සතුන්ගේ රුධිරයේ ග්ලයිසීන් බහුල පෙප්ටයිඩ දෙසට පළමු මාරුව අපි සටහන් කළෙමු. (රූපය 1g, අතිරේක රූප 4e, 4f). ග්ලයිසීන් පෙප්ටයිඩ අඩංගු ෆේජ් වඩාත් ස්ථායී විය හැකි අතර සංසරණයෙන් ඉවත් කිරීමට ඇති ඉඩකඩ අඩුය. කෙසේ වෙතත්, මෙම ග්ලයිසීන් බහුල පෙප්ටයිඩ මස්තිෂ්ක තරල සාම්පලවල අනාවරණය නොවූ අතර, එයින් ඇඟවෙන්නේ මස්තිෂ්ක තරලයේ එක් පියවරක් සහ මස්තිෂ්ක තරලයේ තවත් එකක් එකතු වීමට ඉඩ දී ඇති බවයි. සිව්වන වටයේ තේරීමෙන් ලබාගත් CSF වලින් පොහොසත් කරන ලද ක්ලෝන පුළුල් ලෙස පරීක්ෂා කර ඇත. හිස් පාලන ෆේජ් හා සසඳන විට තනි තනිව පරීක්ෂා කරන ලද ක්ලෝන සියල්ලම පාහේ CSF වලින් පොහොසත් බව තහවුරු කරන ලදී. එක් පෙප්ටයිඩ පහරක් (#2077) වඩාත් විස්තරාත්මකව පරීක්ෂා කරන ලදී. අනෙකුත් පහරවල් හා සසඳන විට එය දිගු ප්ලාස්මා අර්ධ ආයු කාලයක් පෙන්නුම් කළේය (රූපය 3d සහ අතිරේක රූපය 7), සහ සිත්ගන්නා කරුණ නම්, මෙම පෙප්ටයිඩයේ C-පර්යන්තයේ සිස්ටීන් අවශේෂයක් අඩංගු විය. පෙප්ටයිඩ වලට සිස්ටීන් එකතු කිරීම ඇල්බියුමින් 29 සමඟ බන්ධනය වීමෙන් ඒවායේ ඖෂධීය ගුණාංග වැඩිදියුණු කළ හැකි බව මෑතකදී පෙන්වා දී ඇත. මෙය දැනට පෙප්ටයිඩ #2077 සඳහා නොදන්නා අතර වැඩිදුර අධ්‍යයනයක් අවශ්‍ය වේ. සමහර පෙප්ටයිඩ CSF පොහොසත් කිරීමේදී සංයුජතා-යැපීමක් පෙන්නුම් කළේය (දත්ත පෙන්වා නැත), එය T7 කැප්සිඩයේ ප්‍රදර්ශනය කරන ලද මතුපිට ජ්‍යාමිතියට සම්බන්ධ විය හැකිය. අප භාවිතා කළ T7 පද්ධතිය ෆේජ් අංශුවකට එක් එක් පෙප්ටයිඩයේ පිටපත් 5-15 ක් පෙන්නුම් කළේය. මීයන්ගේ මස්තිෂ්ක බාහිකයට අභ්‍යන්තරව එන්නත් කරන ලද අපේක්ෂක ඊයම් ෆේජ් ක්ලෝන මත IHC සිදු කරන ලදී (පරිපූරක රූපය 8). දත්තවලින් පෙන්නුම් කළේ අවම වශයෙන් ක්ලෝන තුනක් (අංක 2002, අංක 2009 සහ අංක 2077) BBB සමඟ අන්තර් ක්‍රියා කළ බවයි. මෙම BBB අන්තර්ක්‍රියාව CSF සමුච්චය වීමට හේතු වේද නැතහොත් මෙම ක්ලෝන සෘජුවම BCSFB වෙත චලනය වීමට හේතු වේද යන්න තීරණය කිරීමට ඉතිරිව ඇත. වැදගත් වන්නේ, තෝරාගත් පෙප්ටයිඩ සංස්ලේෂණය කර ප්‍රෝටීන් භාණ්ඩයට බැඳී ඇති විට ඒවායේ CSF ප්‍රවාහන ධාරිතාව රඳවා ගන්නා බවයි. N-පර්යන්ත බයෝටිනයිලේටඩ් පෙප්ටයිඩ SA වෙත බන්ධනය කිරීම රුධිරයේ සහ මස්තිෂ්ක තරලයේ අදාළ ෆේජ් ක්ලෝන සමඟ ලබාගත් ප්‍රතිඵල අත්‍යවශ්‍යයෙන්ම පුනරාවර්තනය කරයි (රූපය 3e). අවසාන වශයෙන්, ඊයම් පෙප්ටයිඩ #2077 SA සමඟ සංයෝජිත BACE1 හි බයෝටිනයිලේටඩ් පෙප්ටයිඩ නිෂේධකයක මොළයේ ක්‍රියාකාරිත්වය ප්‍රවර්ධනය කිරීමට සමත් වන බවත්, CSF හි Abeta40 මට්ටම් සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කිරීමෙන් CNS හි උච්චාරණය කරන ලද ඖෂධීය ගතික බලපෑම් ඇති කරන බවත් අපි පෙන්වමු (රූපය 4). සියලුම පහරවල් වල පෙප්ටයිඩ අනුක්‍රමික සමජාතීය සෙවීමක් සිදු කිරීමෙන් දත්ත සමුදායේ කිසිදු සමජාතීයතාවයක් හඳුනා ගැනීමට අපට නොහැකි විය. T7 පුස්තකාලයේ ප්‍රමාණය ආසන්න වශයෙන් 109 ක් වන අතර, 12-mer සඳහා න්‍යායාත්මක පුස්තකාල ප්‍රමාණය 4 x 1015 බව සැලකිල්ලට ගැනීම වැදගත්ය. එබැවින්, අපි 12-mer පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයේ විවිධත්ව අවකාශයෙන් කුඩා කොටසක් පමණක් තෝරා ගත්තෙමු, එයින් අදහස් කරන්නේ මෙම හඳුනාගත් පහරවල යාබද අනුක්‍රමික අවකාශය ඇගයීමෙන් වඩාත් ප්‍රශස්ත පෙප්ටයිඩ හඳුනාගත හැකි බවයි. උපකල්පිතව, මෙම පෙප්ටයිඩවල කිසිදු ස්වාභාවික සමජාතීයතාවයක් අපට හමු නොවීමට එක් හේතුවක් වන්නේ මොළයට ඇතැම් පෙප්ටයිඩ මෝස්තර පාලනයකින් තොරව ඇතුළු වීම වැළැක්වීම සඳහා පරිණාමය අතරතුර තේරීම ඉවත් කිරීමයි.
එකට ගත් කල, අපගේ ප්‍රතිඵල අනාගත කටයුතු සඳහා මස්තිෂ්ක සනාල බාධකයේ ප්‍රවාහන පද්ධති වඩාත් විස්තරාත්මකව හඳුනා ගැනීමට සහ සංලක්ෂිත කිරීමට පදනමක් සපයයි. මෙම ක්‍රමයේ මූලික සැකසුම පදනම් වී ඇත්තේ මස්තිෂ්ක සනාල බන්ධන ගුණාංග සහිත ක්ලෝන හඳුනා ගැනීම පමණක් නොව, සාර්ථක ක්ලෝන CNS මැදිරියට ජීව විද්‍යාත්මක බාධක තරණය කිරීම සඳහා අභ්‍යන්තර ක්‍රියාකාරකම් ඇති තීරණාත්මක පියවරක් ද ඇතුළත් වන ක්‍රියාකාරී තේරීම් උපාය මාර්ගයක් මත ය. මෙම පෙප්ටයිඩ ප්‍රවාහනය කිරීමේ යාන්ත්‍රණය සහ මොළයේ කලාපයට විශේෂිත වූ ක්ෂුද්‍ර සනාලයට බන්ධනය වීමට ඇති ඔවුන්ගේ මනාපය පැහැදිලි කිරීමයි. මෙය BBB සහ ප්‍රතිග්‍රාහක ප්‍රවාහනය සඳහා නව මාර්ග සොයා ගැනීමට හේතු විය හැක. හඳුනාගත් පෙප්ටයිඩ මස්තිෂ්ක සනාල ප්‍රතිග්‍රාහකවලට හෝ BBB හෝ BCSFB හරහා ප්‍රවාහනය කරන සංසරණ ලිගන්ඩ් වලට සෘජුවම බන්ධනය විය හැකි යැයි අපි අපේක්ෂා කරමු. මෙම කාර්යයේදී සොයාගත් CSF ප්‍රවාහන ක්‍රියාකාරකම් සහිත පෙප්ටයිඩ දෛශික තවදුරටත් විමර්ශනය කෙරේ. BBB සහ/හෝ BCSFB තරණය කිරීමේ හැකියාව සඳහා මෙම පෙප්ටයිඩවල මොළයේ විශේෂත්වය අපි දැනට විමර්ශනය කරමින් සිටිමු. මෙම නව පෙප්ටයිඩ නව ප්‍රතිග්‍රාහක හෝ මාර්ග සොයා ගැනීමේ විභවය සඳහා සහ ජීව විද්‍යාව වැනි සාර්ව අණු මොළයට ලබා දීම සඳහා නව ඉතා කාර්යක්ෂම වේදිකා සංවර්ධනය කිරීම සඳහා අතිශයින්ම වටිනා මෙවලම් වනු ඇත.
කලින් විස්තර කළ ක්‍රමයේ වෙනස් කිරීමක් භාවිතා කරමින් විශාල සිස්ටර්නා (CM) කැනියුලා කරන්න. නිර්වින්දනය කරන ලද විස්ටාර් මීයන් (ග්‍රෑම් 200-350) ස්ටීරියෝටැක්සික් උපකරණයක් මත සවි කර ඇති අතර හිස් කබල නිරාවරණය කිරීම සඳහා රැවුල කපන ලද සහ අසප්ටික් ලෙස සකස් කරන ලද හිස්කබල මත මධ්‍ය කැපීමක් සිදු කරන ලදී. ඉහළ සළුවේ ප්‍රදේශයේ සිදුරු දෙකක් විදින අතර සිදුරුවල සවි කරන ඉස්කුරුප්පු සවි කරන්න. CM තුළට මල නොබැඳෙන වානේ කැනියුලාවක ස්ටීරියෝටැක්ටික් මඟ පෙන්වීම සඳහා පාර්ශ්වික ඔක්සිපිටල් ලාංඡනයේ අමතර සිදුරක් විදින ලදී. කැනියුලාව වටා දන්ත සිමෙන්ති යොදන්න සහ ඉස්කුරුප්පු වලින් සුරක්ෂිත කරන්න. ඡායාරූප සුව කිරීම සහ සිමෙන්ති දැඩි කිරීමෙන් පසු, සමේ තුවාලය 4/0 සුප්‍රමිඩ් මැහුම් වලින් වසා දමන ලදී. මස්තිෂ්ක තරලය (CSF) ස්වයංසිද්ධව කාන්දු වීම මගින් කැනියුලාව නිසි ලෙස ස්ථානගත කිරීම තහවුරු වේ. ස්ටීරියෝටැක්සික් උපකරණයෙන් මීයා ඉවත් කරන්න, සුදුසු පශ්චාත් ශල්‍යකර්ම සත්කාර සහ වේදනා කළමනාකරණය ලබා ගන්න, සහ මස්තිෂ්ක තරලයේ රුධිරයේ සලකුණු නිරීක්ෂණය වන තෙක් අවම වශයෙන් සතියක්වත් එය යථා තත්ත්වයට පත් කිරීමට ඉඩ දෙන්න. විස්ටාර් මීයන් (Crl:WI/Han) චාල්ස් ගඟෙන් (ප්‍රංශය) ලබා ගන්නා ලදී. සියලුම මීයන් නිශ්චිත රෝග කාරක-නිදහස් තත්වයන් යටතේ තබා ඇත. සියලුම සත්ව අත්හදා බැලීම් ස්විට්සර්ලන්තයේ බාසල් නගරයේ පශු වෛද්‍ය කාර්යාලය විසින් අනුමත කරන ලද අතර සත්ව බලපත්‍ර අංක 2474 (මස්තිෂ්ක කොඳු ඇට පෙළේ තරලයේ සහ මීයාගේ මොළයේ චිකිත්සක අපේක්ෂකයින්ගේ මට්ටම් මැනීම මගින් ක්‍රියාකාරී මොළයේ ප්‍රවාහනය තක්සේරු කිරීම) ට අනුකූලව සිදු කරන ලදී.
සීඑම් කැනියුලාව අතේ තබාගෙන මීයා මෘදු ලෙස සිහියෙන් තබා ගන්න. කැනියුලාවෙන් ඩටුරා ඉවත් කර ස්වයංසිද්ධව ගලා යන මස්තිෂ්ක තරලයෙන් 10 µl එකතු කරන්න. කැනියුලාවේ පේටන්ට් බලපත්‍රය අවසානයේ අවදානමට ලක් වූ බැවින්, රුධිර දූෂණය හෝ දුර්වර්ණ වීම පිළිබඳ කිසිදු සාක්ෂියක් නොමැති පැහැදිලි මස්තිෂ්ක තරල සාම්පල පමණක් මෙම අධ්‍යයනයට ඇතුළත් කර ඇත. සමාන්තරව, වලිගයේ කෙළවරේ කුඩා කැපුමකින් හෙපටින් (සිග්මා-ඇල්ඩ්රිච්) සහිත නල වලට ආසන්න වශයෙන් 10-20 μl රුධිරය ලබා ගන්නා ලදී. T7 phage එන්නත් කිරීමෙන් පසු විවිධ කාලවලදී CSF සහ රුධිරය එකතු කරන ලදී. එක් එක් CSF සාම්පලය එකතු කිරීමට පෙර ආසන්න වශයෙන් 5-10 μl තරලයක් ඉවත දමන ලදී, එය කැතියේ මළ පරිමාවට අනුරූප වේ.
T7Select පද්ධති අත්පොතෙහි (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) විස්තර කර ඇති පරිදි T7Select 10-3b දෛශිකය භාවිතයෙන් පුස්තකාල ජනනය කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, අහඹු 12-mer DNA ඇතුළු කිරීමක් පහත ආකෘතියෙන් සංස්ලේෂණය කරන ලදී:
ඇතුළත් කිරීමේදී ද්විත්ව නැවතුම් කෝඩෝන සහ ඇමයිනෝ අම්ල අධික ප්‍රකාශනය වැළැක්වීම සඳහා NNK කෝඩෝනය භාවිතා කරන ලදී. N යනු එක් එක් නියුක්ලියෝටයිඩයේ අතින් මිශ්‍ර සමමෝලර් අනුපාතයක් වන අතර K යනු ඇඩිනීන් සහ සයිටොසීන් නියුක්ලියෝටයිඩවල අතින් මිශ්‍ර සමමෝලර් අනුපාතයකි. 37°C දී පැය 3 ක් ක්ලෙනෝ බෆරයේ (නිව් එංගලන්ත බයෝලැබ්ස්) dNTP (නොවැගන්) සහ ක්ලෙනෝ එන්සයිම (නිව් එංගලන්ත බයෝලැබ්ස්) සමඟ තවදුරටත් පුර්ව ලියාපදිංචි කිරීම මගින් තනි කෙඳි සහිත ප්‍රදේශ ද්විත්ව කෙඳි සහිත DNA බවට පරිවර්තනය කරන ලදී. ප්‍රතික්‍රියාවෙන් පසු, EtOH වර්ෂාපතනය මගින් ද්විත්ව කෙඳි සහිත DNA නැවත ලබා ගන්නා ලදී. ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ලැබුණු DNA සීමා කිරීමේ එන්සයිම EcoRI සහ HindIII (රෝචේ වෙතින්) සමඟ ජීර්ණය කරන ලදී. පසුව වෙන් කරන ලද සහ පිරිසිදු කරන ලද (QIAquick, Qiagen) ඇතුළු කිරීම (T4 ligase, New England Biolabs) 10B කැප්සිඩ් ජානයේ ඇමයිනෝ අම්ල 348 න් පසු පූර්ව-කැළැල් T7 දෛශිකයකට රාමුව තුළ බන්ධනය කරන ලදී. බන්ධන ප්‍රතික්‍රියා 16° C උෂ්ණත්වයකදී in vitro ඇසුරුම් කිරීමට පැය 18 කට පෙර පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. T7Select 10-3b ක්ලෝනකරණ කට්ටලය (Novagen) සමඟ සපයා ඇති උපදෙස් අනුව Phage ඇසුරුම් in vitro සිදු කරන ලද අතර Escherichia coli (BLT5615, Novagen) භාවිතයෙන් ලයිසිස් සඳහා ඇසුරුම් ද්‍රාවණය එක් වරක් විස්තාරණය කරන ලදී. ලයිසේට් කේන්ද්‍රාපසාරී කර, ටයිටේට් කර, ග්ලිසරෝල් තොග ද්‍රාවණයක් ලෙස -80° C උෂ්ණත්වයකදී ශීත කරන ලදී.
හිමිකාර 454/Roche-amplicon විලයන ප්‍රයිමර් භාවිතා කරමින් සුප් හොද්ද හෝ තහඩුව තුළ විස්තාරණය කරන ලද phage විචල්‍ය කලාපවල සෘජු PCR විස්තාරණය. ඉදිරි විලයන ප්‍රයිමරයේ විචල්‍ය කලාපය (NNK) 12 (සැකිලි-විශේෂිත), GS FLX ටයිටේනියම් ඇඩැප්ටරය A සහ ​​පාදක පුස්තකාල යතුරු අනුපිළිවෙලක් (TCAG) දෙපස ඇති අනුපිළිවෙලවල් අඩංගු වේ (පරිපූරක රූපය 1a):
ප්‍රතිලෝම විලයන ප්‍රයිමරයේ පබළු අල්ලා ගැනීම සඳහා සවි කර ඇති බයෝටින් සහ ඉමල්ෂන් PCR අතරතුර ක්ලෝන විස්තාරණය සඳහා අවශ්‍ය GS FLX ටයිටේනියම් ඇඩැප්ටරය B ද අඩංගු වේ:
ඉන්පසු ඇම්ප්ලිකොන් 454 GS-FLX ටයිටේනියම් ප්‍රොටෝකෝලය අනුව 454/Roche පයිරොසෙක්සින් කිරීමකට භාජනය කරන ලදී. අතින් සැන්ගර් අනුක්‍රමණය සඳහා (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA විශ්ලේෂකය), T7 phage DNA PCR මගින් විස්තාරණය කර පහත ප්‍රයිමර් යුගල සමඟ අනුපිළිවෙලට සකස් කරන ලදී:
තනි ඵලක වලින් ඇතුළු කිරීම් Roche Fast Start DNA Polymerase Kit භාවිතයෙන් PCR විස්තාරණයට ලක් කරන ලදී (නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව). උණුසුම් ආරම්භයක් (95 °C දී මිනිත්තු 10) සහ බූස්ට් චක්‍ර 35 ක් (95 °C දී තත්පර 50, 50 °C දී මිනිත්තු 1 සහ 72 °C දී මිනිත්තු 1) සිදු කරන්න.
පුස්තකාලවලින් ලබාගත් ෆේජ්, වල්-වර්ගයේ ෆේජ්, CSF සහ රුධිරයෙන් බේරාගත් ෆේජ් හෝ තනි ක්ලෝන, TB සුප් හොද්ද (සිග්මා ඇල්ඩ්‍රිච්) තුළ Escherichia coli BL5615 හි හෝ 500 cm2 දීසි (Thermo Scientific) තුළ පැය 4 ක් 37°C දී විස්තාරණය කරන ලදී. Tris-EDTA බෆරය (Fluka Analytical) සමඟ තහඩු සේදීමෙන් හෝ විෂබීජහරණය කළ පයිප්පෙට් ඉඟි සමඟ සමරු ඵලක එකතු කිරීමෙන් තහඩු වලින් ෆේජ් නිස්සාරණය කරන ලදී. පොලිඑතිලීන් ග්ලයිකෝල් (PEG 8000) වර්ෂාපතනය (Promega) එක් වටයකින් සංස්කෘතික සුපිරි හෝ නිස්සාරණ බෆරයෙන් ෆේජ් හුදකලා කර Tris-EDTA බෆරයේ නැවත සවි කරන ලදී.
එන්ඩොටොක්සින් ඉවත් කිරීමේ පබළු (මිල්ටෙනි බයෝටෙක්) භාවිතයෙන් එන්ඩොටොක්සින් ඉවත් කිරීමේ වට 2-3 කට භාජනය කරන ලද විස්තාරිත ෆේජ්, අභ්‍යන්තර (IV) එන්නත් කිරීමට පෙර (සත්ව 500 μl) එන්ඩොටොක්සින් ඉවත් කිරීමේ පබළු (මිල්ටෙනි බයෝටෙක්) භාවිතා කරන ලදී. පළමු වටයේදී, ෆේජ් 2×1012 ක් හඳුන්වා දෙන ලදී; දෙවනුව, ෆේජ් 2×1010; තුන්වන සහ සිව්වන තේරීම් වටවලදී, සතෙකුට ෆේජ් 2×109 ක්. CSF සහ රුධිර සාම්පලවල ෆේජ් අන්තර්ගතය නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව සමරු ඵලක ගණනය කිරීම මගින් තීරණය කරන ලදී (T7Select පද්ධති අත්පොත). පිරිසිදු කළ පුස්තකාල වලිග නහරයට අභ්‍යන්තරව එන්නත් කිරීමෙන් හෝ පෙර තේරීම් වටයෙන් CSF වලින් ලබාගත් ෆේජ් නැවත එන්නත් කිරීමෙන් ෆේජ් තේරීම සිදු කරන ලද අතර, පසුව අස්වැන්න පිළිවෙලින් CSF සහ රුධිර සාම්පල විනාඩි 10, විනාඩි 30, විනාඩි 60, විනාඩි 90, විනාඩි 120, විනාඩි 180 සහ විනාඩි 240 කින් සිදු කරන ලදී. පළමු තේරීම් වට තුනේදී තෝරාගත් ශාඛා දෙක වෙන වෙනම ගබඩා කර විශ්ලේෂණය කරන ලද in vivo panning වට හතරක් පවත්වන ලදී. තේරීමේ පළමු වට දෙකෙන් CSF වෙතින් ලබාගත් සියලුම phage ඇතුළු කිරීම් 454/Roche pyrosequencing වලට භාජනය කරන ලද අතර, අවසාන තේරීම් වට දෙකෙන් CSF වෙතින් ලබාගත් සියලුම ක්ලෝන අතින් අනුපිළිවෙලට සකස් කරන ලදී. තේරීමේ පළමු වටයේ සියලුම රුධිර phages ද 454/Roche pyrosequencing වලට භාජනය කරන ලදී. phage ක්ලෝන එන්නත් කිරීම සඳහා, තෝරාගත් phages E. coli (BL5615) හි 500 cm2 තහඩු මත පැය 4 ක් 37°C දී විස්තාරණය කරන ලදී. තනි තනිව තෝරාගත් සහ අතින් අනුපිළිවෙලට සකස් කරන ලද ක්ලෝන TB මාධ්‍යයෙන් ප්‍රචාරණය කරන ලදී. phage නිස්සාරණයෙන් පසු, එන්ඩොටොක්සින් පිරිසිදු කිරීම සහ ඉවත් කිරීම (ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි), 300 μl හි 2×1010 phages/සත්වයා එක් වලිග නහරයකට එන්නත් කරන ලදී.
අනුක්‍රමික දත්තවල පූර්ව සැකසුම් කිරීම සහ ගුණාත්මක පෙරහන් කිරීම. Raw 454/Roche දත්ත ද්විමය සම්මත ප්‍රවාහ සිතියම් ආකෘතියකින් (sff) සිට පියර්සන් මානව කියවිය හැකි ආකෘතියකට (fasta) වෙළෙන්දා මෘදුකාංග භාවිතයෙන් පරිවර්තනය කරන ලදී. පහත විස්තර කර ඇති පරිදි හිමිකාර C වැඩසටහන් සහ ස්ක්‍රිප්ට් (නිකුත් නොකළ මෘදුකාංග පැකේජය) භාවිතයෙන් නියුක්ලියෝටයිඩ අනුක්‍රමය තවදුරටත් සැකසීම සිදු කරන ලදී. ප්‍රාථමික දත්ත විශ්ලේෂණයට දැඩි බහු-අදියර පෙරහන් ක්‍රියා පටිපාටි ඇතුළත් වේ. වලංගු 12mer ඇතුළු කිරීමේ DNA අනුපිළිවෙලක් අඩංගු නොවූ කියවීම් පෙරහන් කිරීම සඳහා, ගෝලීය Needleman-Wunsch පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් කියවීම් ආරම්භක ලේබලය (GTGATGTCGGGATCCGAATTC), නැවතුම් ලේබලය (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) සහ පසුබිම් ඇතුළු කිරීම (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) වෙත අනුපිළිවෙලින් පෙළගස්වන ලදී. පෙළගැස්මකට නොගැලපීම් 2ක් දක්වා ඉඩ දෙන පෙළගැස්ම31. එබැවින්, ආරම්භක සහ නැවතුම් ටැග් නොමැතිව කියවීම් සහ පසුබිම් ඇතුළු කිරීම් අඩංගු කියවීම්, එනම්, අවසර ලත් නොගැලපීම් ගණන ඉක්මවා යන පෙළගැස්ම, පුස්තකාලයෙන් ඉවත් කරන ලදී. ඉතිරි කියවීම් සම්බන්ධයෙන් ගත් කල, ආරම්භක සලකුණෙන් විහිදෙන සහ නැවතුම් සලකුණට පෙර අවසන් වන N-mer DNA අනුපිළිවෙල මුල් කියවීමේ අනුපිළිවෙලින් ඉවත් කර තවදුරටත් සකසන ලදී (මෙතැන් සිට "ඇතුළු කිරීම" ලෙස හැඳින්වේ). ඇතුළු කිරීම පරිවර්තනය කිරීමෙන් පසු, ප්‍රාථමිකයේ 5′ කෙළවරේ පළමු නැවතුම් කෝඩෝනයෙන් පසු කොටස ඇතුළු කිරීමෙන් ඉවත් කරනු ලැබේ. ඊට අමතරව, ප්‍රාථමිකයේ 3′ කෙළවරේ අසම්පූර්ණ කෝඩෝන වලට මඟ පාදන නියුක්ලියෝටයිඩ ද ඉවත් කරන ලදී. පසුබිම් අනුපිළිවෙලවල් පමණක් අඩංගු ඇතුළු කිරීම් බැහැර කිරීම සඳහා, ඇමයිනෝ අම්ල රටාව "PAG" සමඟ ආරම්භ වන පරිවර්තන ඇතුළු කිරීම් ද ඉවත් කරන ලදී. ඇමයිනෝ අම්ල 3 ට අඩු පශ්චාත් පරිවර්තන දිගක් සහිත පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයෙන් ඉවත් කරන ලදී. අවසාන වශයෙන්, ඇතුළු කිරීමේ තටාකයේ අතිරික්තතාවය ඉවත් කර එක් එක් අද්විතීය ඇතුළු කිරීමේ සංඛ්‍යාතය තීරණය කරන්න. මෙම විශ්ලේෂණයේ ප්‍රතිඵලවලට නියුක්ලියෝටයිඩ අනුපිළිවෙල (ඇතුළු කිරීම්) ලැයිස්තුවක් සහ ඒවායේ (කියවූ) සංඛ්‍යාත (පරිපූරක රූප 1c සහ 2) ඇතුළත් විය.
අනුක්‍රමික සමානතාවය අනුව N-mer DNA ඇතුළු කිරීම් කාණ්ඩය: 454/Roche-විශේෂිත අනුක්‍රමික දෝෂ (සමජාතීය පොලිමර් දිගු කිරීමේ ගැටළු වැනි) ඉවත් කිරීමට සහ අඩු වැදගත් අතිරික්තයන් ඉවත් කිරීමට, කලින් පෙරහන් කරන ලද N-mer DNA අනුක්‍රමික ඇතුළු කිරීම් (ඇතුළු කිරීම්) සමානතාවය අනුව වර්ග කරනු ලැබේ. පහත පරිදි අර්ථ දක්වා ඇති පුනරාවර්තන ඇල්ගොරිතමයක් භාවිතා කරමින් ඇතුළත් කිරීම් (නොගැලපෙන පාද 2ක් දක්වා අවසර දී ඇත): ඇතුළත් කිරීම් පළමුව ඒවායේ සංඛ්‍යාතය අනුව (ඉහළම සිට පහළම දක්වා) වර්ග කරනු ලබන අතර, ඒවා සමාන නම්, ඒවායේ ද්විතියික දිග අනුව වර්ග කරනු ලැබේ (දිගම සිට කෙටිම දක්වා). මේ අනුව, වඩාත් නිතර සහ දිගම ඇතුළත් කිරීම් පළමු “කණ්ඩායම” අර්ථ දක්වයි. කණ්ඩායම් සංඛ්‍යාතය යතුරු සංඛ්‍යාතයට සකසා ඇත. ඉන්පසු, වර්ග කළ ලැයිස්තුවේ ඉතිරිව ඇති සෑම ඇතුළත් කිරීමක්ම යුගල වශයෙන් Needleman-Wunsch පෙළගැස්ම මගින් කණ්ඩායමට එක් කිරීමට උත්සාහ කරන ලදී. පෙළගැස්මක නොගැලපීම්, ඇතුළත් කිරීම් හෝ මකාදැමීම් ගණන 2 ක සීමාවක් නොඉක්මවන්නේ නම්, ඇතුළත් කිරීමක් කණ්ඩායමට එකතු කරනු ලබන අතර, ඇතුළත් කිරීම කොපමණ වාරයක් එකතු කළේද යන්නෙන් සමස්ත කණ්ඩායම් සංඛ්‍යාතය වැඩි වේ. කණ්ඩායමකට එකතු කරන ලද ඇතුළු කිරීම් භාවිතා කළ ලෙස සලකුණු කර තවදුරටත් සැකසීමෙන් බැහැර කරනු ලැබේ. ඇතුළත් කිරීමේ අනුපිළිවෙල දැනටමත් පවතින කණ්ඩායමකට එකතු කළ නොහැකි නම්, ඇතුළත් කිරීමේ අනුපිළිවෙල සුදුසු ඇතුළත් කිරීමේ සංඛ්‍යාතය සහිත නව කණ්ඩායමක් නිර්මාණය කිරීමට භාවිතා කරන අතර භාවිතා කළ ලෙස සලකුණු කරනු ලැබේ. එක් එක් ඇතුළත් කිරීමේ අනුපිළිවෙල නව කණ්ඩායමක් සෑදීමට භාවිතා කර ඇති විට හෝ දැනටමත් පවතින කණ්ඩායමකට ඇතුළත් කළ හැකි විට පුනරාවර්තනය අවසන් වේ. සියල්ලට පසු, නියුක්ලියෝටයිඩ වලින් සමන්විත කාණ්ඩගත ඇතුළු කිරීම් අවසානයේ පෙප්ටයිඩ අනුපිළිවෙලට (පෙප්ටයිඩ පුස්තකාල) පරිවර්තනය කරනු ලැබේ. මෙම විශ්ලේෂණයේ ප්‍රතිඵලය වන්නේ අඛණ්ඩ කියවීම් ගණන සෑදෙන ඇතුළත් කිරීම් සමූහයක් සහ ඒවාට අනුරූප සංඛ්‍යාත (පරිපූරක රූපය 2).
චේතන උත්පාදනය: අද්විතීය පෙප්ටයිඩ ලැයිස්තුවක් මත පදනම්ව, පහත දැක්වෙන පරිදි සියලුම හැකි ඇමයිනෝ අම්ල රටා (aa) අඩංගු පුස්තකාලයක් නිර්මාණය කරන ලදී. දිග 3 ක සෑම විය හැකි රටාවක්ම පෙප්ටයිඩයෙන් උපුටා ගන්නා ලද අතර එහි ප්‍රතිලෝම රටාව සියලුම රටා (ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ) අඩංගු පොදු චේතන පුස්තකාලයක් සමඟ එකතු කරන ලදී. ඉතා පුනරාවර්තන චේතනාවේ පුස්තකාල අනුක්‍රමණය කර අතිරික්තතාවය ඉවත් කරන ලදී. ඉන්පසු, චේතනාවේ පුස්තකාලයේ ඇති සෑම ට්‍රයිපෙප්ටයිඩයක් සඳහාම, අපි පරිගණක මෙවලම් භාවිතයෙන් පුස්තකාලයේ එහි පැවැත්ම පරීක්ෂා කළෙමු. මෙම අවස්ථාවෙහිදී, සොයාගත් චේතනාවේ ට්‍රයිපෙප්ටයිඩය අඩංගු පෙප්ටයිඩයේ සංඛ්‍යාතය එකතු කර චේතනාවේ පුස්තකාලයේ චේතනාවට පවරනු ලැබේ ("චේතනාවේ ගණන"). චේතනාවේ ප්‍රතිඵලය ට්‍රයිපෙප්ටයිඩ (චේතනාවේ) සියලුම සිදුවීම් සහ ඒවායේ අදාළ අගයන් අඩංගු ද්විමාන අරාවකි, ඒවා කියවීම් පෙරීම, කාණ්ඩගත කිරීම සහ පරිවර්තනය කිරීමේදී අනුරූප චේතනාවේ ප්‍රතිඵලයක් වන අනුක්‍රමික කියවීම් ගණන වේ. ඉහත විස්තරාත්මකව විස්තර කර ඇති පරිදි මිනුම්.
චේතනා ගණන සහ අනුරූප විසිරුම් කොටස් සාමාන්‍යකරණය කිරීම: එක් එක් නියැදිය සඳහා චේතනා ගණන සාමාන්‍යකරණය කරන ලද්දේ
මෙහි ni යනු මාතෘකාව අඩංගු කියවීම් ගණනයි i. මේ අනුව, vi යනු නියැදියේ චේතනාව i අඩංගු කියවීම්වල (හෝ පෙප්ටයිඩ) ප්‍රතිශත සංඛ්‍යාතය නියෝජනය කරයි. සාමාන්‍යකරණය නොකළ චේතනා ගණන සඳහා P-අගය ගණනය කරනු ලැබුවේ ෆිෂර්ගේ නිශ්චිත පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් ය. චේතනා ගණනේ සහසම්බන්ධතා සම්බන්ධයෙන්, ස්පියර්මන්ගේ සහසම්බන්ධතා R සමඟ සාමාන්‍යකරණය කළ චේතනා ගණන භාවිතා කර ගණනය කරන ලදී.
පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයේ සෑම ස්ථානයකම ඇමයිනෝ අම්ලවල අන්තර්ගතය දෘශ්‍යමාන කිරීම සඳහා, වෙබ් ලෝගෝග්‍රෑම් 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) නිර්මාණය කරන ලදී. පළමුව, 12-mer පෙප්ටයිඩයේ සෑම ස්ථානයකම ඇමයිනෝ අම්ලවල අන්තර්ගතය 20×12 අනුකෘතියක ගබඩා කෙරේ. ඉන්පසුව, සෑම ස්ථානයකම එකම සාපේක්ෂ ඇමයිනෝ අම්ල අන්තර්ගතය අඩංගු පෙප්ටයිඩ 1000 ක කට්ටලයක් ෆාස්ටා-අනුක්‍රමික ආකෘතියෙන් ජනනය කර වෙබ්-ලාගෝ 3 වෙත ආදානයක් ලෙස සපයනු ලැබේ, එමඟින් සෑම ස්ථානයකම සාපේක්ෂ ඇමයිනෝ අම්ල අන්තර්ගතයේ චිත්‍රක නිරූපණයක් ජනනය වේ. දී ඇති පෙප්ටයිඩ පුස්තකාලයක් සඳහා. බහුමාන දත්ත කට්ටල දෘශ්‍යමාන කිරීම සඳහා, R හි අභ්‍යන්තරව සංවර්ධනය කරන ලද මෙවලමක් භාවිතයෙන් තාප සිතියම් නිර්මාණය කරන ලදී (biosHeatmap, තවමත් නිකුත් කර නොමැති R පැකේජයක්). තාප සිතියම්වල ඉදිරිපත් කරන ලද ඩෙන්ඩ්‍රොග්‍රෑම් ගණනය කරන ලද්දේ යුක්ලීඩියානු දුර මෙට්‍රික් සමඟ වෝඩ්ගේ ධූරාවලි පොකුරු ක්‍රමය භාවිතා කරමිනි. චේතනා ලකුණු දත්තවල සංඛ්‍යානමය විශ්ලේෂණය සඳහා, අසාමාන්‍ය ලකුණු සඳහා P අගයන් ෆිෂර්ගේ නිශ්චිත පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් ගණනය කරන ලදී. අනෙකුත් දත්ත කට්ටල සඳහා P-අගය R හි ගණනය කරන ලද්දේ ශිෂ්‍යයාගේ t-පරීක්ෂණය හෝ ANOVA භාවිතා කරමිනි.
තෝරාගත් ෆේජ් ක්ලෝන සහ ඇතුළු කිරීම් නොමැති ෆේජ් වලිග නහරය හරහා අභ්‍යන්තරව එන්නත් කරන ලදී (300 μl PBS හි 2×1010 ෆේජ්/සත්වයා). පර්ෆියුෂන් කිරීමට සහ පසුව සවි කිරීමට මිනිත්තු දහයකට පෙර, එම සතුන්ට 100 μl DyLight594-ලේබල් කරන ලද ලෙක්ටින් (Vector Laboratories Inc., DL-1177) අභ්‍යන්තරව එන්නත් කරන ලදී. ෆේජ් එන්නත් කිරීමෙන් මිනිත්තු 60 කට පසු, මීයන්ට හදවත හරහා 50 ml PBS සමඟින් සහ 50 ml 4% PFA/PBS සමඟින් සිදුරු කරන ලදී. මොළයේ සාම්පල අතිරේකව 4% PFA/PBS හි එක රැයකින් සවි කර 4°C හි එක රැයකින් 30% සුක්‍රෝස් හි පොඟවා ඇත. සාම්පල OCT මිශ්‍රණයේ ෆ්ලෑෂ් කැටි කර ඇත. කාමර උෂ්ණත්වයේ දී ශීත කළ සාම්පලවල ප්‍රතිශක්තිකරණ රසායනික විශ්ලේෂණය 1% BSA සමඟ අවහිර කර 4 °C දී T7 phage (Novus NB 600-376A) ට එරෙහිව පොලික්ලෝනල් FITC-ලේබල් කරන ලද ප්‍රතිදේහ සමඟ ඉන්කියුබේට් කරන ලද 30 µm ක්‍රයෝසෙක්ෂන් මත සිදු කරන ලදී. එක රැයකින් ඉන්කියුබේට් කරන්න. අවසාන වශයෙන්, කොටස් PBS සමඟ 3 වතාවක් සෝදා, කොන්ෆෝකල් ලේසර් අන්වීක්ෂයකින් (Leica TCS SP5) පරීක්ෂා කරන ලදී.
අවම සංශුද්ධතාවය 98% ක් සහිත සියලුම පෙප්ටයිඩ GenScript USA විසින් සංස්ලේෂණය කර, බයෝටයිනයිලේටඩ් කර ලයොෆයිලීකරණය කරන ලදී. බයෝටින් N-පර්යන්තයේ අතිරේක ත්‍රිත්ව ග්ලයිසීන් අවකාශකයක් හරහා බන්ධනය වේ. ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය භාවිතයෙන් සියලුම පෙප්ටයිඩ පරීක්ෂා කරන්න.
ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් (සිග්මා S0677) 5-10% DMSO/PBS හි පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කරන ලද 5-10% ක බයෝටිනයිලේටඩ් පෙප්ටයිඩයක සමාන මොලාර් අතිරික්තයක්, බයෝටිනයිලේටඩ් BACE1 නිෂේධනීය පෙප්ටයිඩයක් හෝ බයෝටිනයිලේටඩ් BACE1 නිෂේධනීය පෙප්ටයිඩයක සහ BACE1 නිෂේධනීය පෙප්ටයිඩයක සංයෝජනයක් (3:1 අනුපාතය) සමඟ මිශ්‍ර කරන ලදී. එන්නත් කිරීමට පෙර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 1 ක්. මස්තිෂ්ක කුහරයක් සහිත මීයන්ගේ වලිග නහර වලින් එකකට ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින්-සංයුක්ත පෙප්ටයිඩ 10 mg/kg මාත්‍රාවකින් අභ්‍යන්තරව එන්නත් කරන ලදී.
ස්ට්‍රෙප්ටාවයිඩින්-පෙප්ටයිඩ සංකීර්ණවල සාන්ද්‍රණය ELISA විසින් තක්සේරු කරන ලදී. නන්ක් මැක්සිසෝර්ප් මයික්‍රොටයිටර් තහඩු (සිග්මා) එක රැයකින් 4°C දී 1.5 μg/ml මූසික ප්‍රති-ස්ට්‍රෙප්ටාවයිඩින් ප්‍රතිදේහයෙන් (තාප, MA1-20011) ආලේප කරන ලදී. කාමර උෂ්ණත්වයේ දී පැය 2 ක් අවහිර කිරීමෙන් පසු (අවහිර කිරීමේ බෆරය: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ජෙලටින්, 1% BSA), තහඩුව 0.05% Tween-20/PBS (වොෂ් බෆරය) සමඟ සෝදන්න. තත්පර 3 ක් සඳහා, CSF සහ ප්ලාස්මා සාම්පල අවහිර කිරීමේ බෆරයෙන් (ප්ලාස්මා 1:10,000, CSF 1:115) තනුක කළ ළිංවලට එකතු කරන ලදී. පසුව තහඩුව එක රැයකින් 4°C දී හඳුනාගැනීමේ ප්‍රතිදේහයෙන් (1 μg/ml, ප්‍රති-ස්ට්‍රෙප්ටාවයිඩින්-HRP, නවස් NB120-7239) පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. සේදීමේ පියවර තුනකට පසු, TMB උපස්ථර ද්‍රාවණයක (රෝචේ) විනාඩි 20ක් දක්වා පුර්ව ලියාපදිංචි කිරීමෙන් ස්ට්‍රෙප්ටාවිඩින් අනාවරණය විය. 1M H2SO4 සමඟ වර්ණ වර්ධනය නැවැත්වීමෙන් පසු, 450 nm දී අවශෝෂණය මැන බලන්න.
නිෂ්පාදකයාගේ ප්‍රොටෝකෝලය අනුව (Wako, 294-64701) ස්ට්‍රෙප්ටවිඩින්-පෙප්ටයිඩ-BACE1 නිෂේධක සංකීර්ණයේ ක්‍රියාකාරිත්වය Aβ(1-40) ELISA විසින් තක්සේරු කරන ලදී. කෙටියෙන් කිවහොත්, CSF සාම්පල සම්මත තනුකකාරකයක (1:23) තනුක කර BNT77 ග්‍රහණ ප්‍රතිදේහයෙන් ආලේප කරන ලද 96-ළිං තහඩු වල 4°C දී එක රැයකින් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. සේදීමේ පියවර පහකට පසු, HRP-සංයුක්ත BA27 ප්‍රතිදේහය එකතු කර 4°C දී පැය 2 ක් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. ඉන්පසු සේදීමේ පියවර පහක් අනුගමනය කරන ලදී. කාමර උෂ්ණත්වයේ දී මිනිත්තු 30 ක් TMB ද්‍රාවණයේ පුර්ව ලියාපදිංචි කිරීමෙන් Aβ(1–40) අනාවරණය විය. නැවතුම් ද්‍රාවණය සමඟ වර්ණ සංවර්ධනය නැවැත්වීමෙන් පසු, 450 nm දී අවශෝෂණය මැන බලන්න. Aβ(1–40) ELISA ට පෙර ප්ලාස්මා සාම්පල ඝන අවධි නිස්සාරණයකට භාජනය කරන ලදී. ප්ලාස්මා 96-ළිං තහඩු වල 0.2% DEA (සිග්මා) ට එකතු කර කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 30 ක් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. SPE තහඩු (Oasis, 186000679) ජලය සහ 100% මෙතනෝල් සමඟ අඛණ්ඩව සේදීමෙන් පසු, ප්ලාස්මා සාම්පල SPE තහඩු වලට එකතු කරන ලද අතර සියලුම ද්‍රව ඉවත් කරන ලදී. සාම්පල සෝදා (පළමුව 5% මෙතනෝල් සමඟ පසුව 30% මෙතනෝල් සමඟ) සහ 2% NH4OH/90% මෙතනෝල් සමඟ ඉවත් කරන ලදී. නියත N2 ධාරාවකින් මිනිත්තු 99 ක් සඳහා 55°C දී එලියුටේට් වියළීමෙන් පසු, සාම්පල සම්මත තනුකවල අඩු කරන ලද අතර ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි Aβ(1–40) මනිනු ලැබීය.
මෙම ලිපිය උපුටා දක්වන්නේ කෙසේද: යූරිච්, ඊ. සහ තවත් අය. සජීවීව හඳුනාගත් සංක්‍රාන්ති පෙප්ටයිඩ භාවිතයෙන් මොළයට භාණ්ඩ බෙදා හැරීම. විද්‍යාව. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
ලිඛෝටා ජේ., ස්ක්ජොරින්ග් ටී., තොම්සන් එල්බී සහ මූස් ටී. ඉලක්කගත චිකිත්සාව භාවිතයෙන් මොළයට සාර්ව අණුක ඖෂධ ලබා දීම. ස්නායු රසායන විද්‍යාව පිළිබඳ සඟරාව 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
බ්‍රස්න්ජෙවික්, අයි., ස්ටයින්බුෂ්, එච්ඩබ්ලිව්, ෂ්මිට්ස්, සී., සහ මාර්ටිනෙස්-මාටිනෙස්, පී. රුධිර-මොළයේ බාධකය හරහා පෙප්ටයිඩ සහ ප්‍රෝටීන් ඖෂධ ලබා දීම. ප්‍රොග් නියුරෝබියෝල් 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
පාර්ඩ්‍රිජ්, ඩබ්ලිව්.එම්. රුධිර-මොළයේ බාධකය: මොළයේ ඖෂධ සංවර්ධනයේ බාධකයක්. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
ජොහැන්සන්, කේඊ, ඩන්කන්, ජේඒ, ස්ටෝපා, ඊජී, සහ බර්ඩ්, ඒ. කොරොයිඩ් ප්ලෙක්සස්-සීඑස්එෆ් මාර්ගය හරහා මොළයට ඖෂධ ලබා දීම සහ ඉලක්ක කිරීම වැඩිදියුණු කිරීමේ අපේක්ෂාවන්. ඖෂධ පර්යේෂණ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
පාර්ඩ්‍රිජ්, WM මොළය ලබා දීම සඳහා අණුක ට්‍රෝජන් අශ්වයන් සමඟ ජෛව ඖෂධ නවීකරණය කිරීම. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
පාර්ඩ්‍රිජ්, රුධිර-මොළයේ බාධකය හරහා WM ප්‍රතිග්‍රාහක-මැදිහත් වූ පෙප්ටයිඩ ප්‍රවාහනය. එන්ඩොක්ර් Rev. 7, 314–330 (1986).
නියෝවෝනර්, ජේ. සහ තවත් අය. ඒකසංයුජ අණුක ෂටල භාවිතයෙන් මොළයේ විනිවිද යාම සහ චිකිත්සක ප්‍රතිදේහවල කාර්යක්ෂමතාව වැඩි කිරීම. නියුරෝන 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
බියන්-ලී, එන්. සහ තවත් අය. ට්‍රාන්ස්ෆෙරින් ප්‍රතිග්‍රාහක (TfR) ප්‍රවාහනය මගින් TfR ප්‍රතිදේහවල ඇෆිනිටි ප්‍රභේද මොළයේ අවශෝෂණය තීරණය කරයි. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).