Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз шектеулі CSS қолдауы бар браузер нұсқасын пайдаланып жатырсыз. Ең жақсы тәжірибе алу үшін жаңартылған браузерді пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Сонымен қатар, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильдерсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Бір уақытта үш слайдтан тұратын карусельді көрсетеді. Бір уақытта үш слайд арқылы жылжу үшін «Алдыңғы» және «Келесі» түймелерін пайдаланыңыз немесе бір уақытта үш слайд арқылы жылжу үшін соңындағы сырғытпа түймелерін пайдаланыңыз.
Қан-ми тосқауылы және қан-ми тосқауылы биотерапиялық агенттердің орталық жүйке жүйесіндегі мақсаттарына жетуіне кедергі келтіреді, осылайша неврологиялық ауруларды тиімді емдеуге кедергі келтіреді. In vivo жаңа ми тасымалдаушыларын табу үшін біз T7 фаг пептид кітапханасын енгіздік және егеуқұйрықтардың канюляцияланған саналы үлкен пул моделін қолдана отырып, қан мен жұлын-ми сұйықтығын (ЖМС) сериялық түрде жинадық. Төрт іріктеу раундынан кейін фаг клондары ЖМС-ке жоғары байытылған. Жеке кандидат пептидтерді сынау ЖМС-ке 1000 еседен астам байытуды көрсетті. Миға пептид арқылы жеткізілудің биоактивтілігі анықталған жаңа транзиттік пептидпен байланысты BACE1 пептид ингибиторын қолдана отырып, жұлын-ми сұйықтығындағы амилоид-β деңгейінің 40%-ға төмендеуімен расталды. Бұл нәтижелер in vivo фаг таңдау әдістерімен анықталған пептидтер макромолекулаларды миға терапиялық әсермен жүйелі түрде жеткізу үшін пайдалы құралдар болуы мүмкін екенін көрсетеді.
Орталық жүйке жүйесіне (ОЖЖ) бағытталған терапияны зерттеу негізінен ОЖЖ-ге бағытталған қасиеттерді көрсететін оңтайландырылған дәрілер мен агенттерді анықтауға бағытталған, ал миға белсенді дәрілік заттардың жеткізілуін басқаратын механизмдерді ашуға аз күш жұмсалады. Бұл қазір өзгере бастады, себебі дәрілік заттарды, әсіресе ірі молекулаларды жеткізу қазіргі заманғы нейроғылымдағы дәрілік заттарды әзірлеудің ажырамас бөлігі болып табылады. Орталық жүйке жүйесінің ортасы қан-ми тосқауылынан (ҚМБ) және қан-ми тосқауылынан (ҚМБ) тұратын цереброваскулярлық тосқауыл жүйесімен жақсы қорғалған1,2, бұл дәрілік заттарды миға жеткізуді қиындатады1,2. Мидан барлық дерлік ірі молекулалы дәрілер және 98%-дан астам ұсақ молекулалы дәрілер шығарылады деп есептеледі3. Сондықтан ОЖЖ-ге терапиялық дәрілік заттарды тиімді және нақты жеткізуді қамтамасыз ететін жаңа ми тасымалдау жүйелерін анықтау өте маңызды4,5. Дегенмен, ҚМБ және ҚМБ сонымен қатар дәрілік заттарды жеткізу үшін тамаша мүмкіндік береді, себебі олар мидың барлық құрылымдарына оның кең тамырлары арқылы еніп, енеді. Осылайша, миға жеткізудің инвазивті емес әдістерін қолдану бойынша қазіргі күш-жігер негізінен эндогенді BBB6 рецепторын пайдаланатын рецепторлық-арқылы тасымалдау (PMT) механизміне негізделген. Трансферрин рецепторлық жолын қолданудағы соңғы маңызды жетістіктерге қарамастан7,8, жақсартылған қасиеттері бар жаңа жеткізу жүйелерін одан әрі дамыту қажет. Осы мақсатта біздің мақсатымыз CSF тасымалдауын делдалдауға қабілетті пептидтерді анықтау болды, себебі оларды негізінен ОЖЖ-ге макромолекулаларды жеткізу немесе жаңа рецепторлық жолдарды ашу үшін пайдалануға болады. Атап айтқанда, цереброваскулярлық жүйенің нақты рецепторлары мен тасымалдаушылары (BBB және BSCFB) биотерапиялық препараттарды белсенді және нақты жеткізудің әлеуетті нысаналары ретінде қызмет ете алады. Цереброспинальды сұйықтық (ЖСЖ) - хориоидтық өрімнің (ХӨ) секреторлық өнімі және субарахноидальды кеңістік пен қарыншалық кеңістік арқылы мидың интерстициалды сұйықтығымен тікелей байланыста болады4. Жақында субарахноидальды цереброспинальды сұйықтық мидың интерстициальды қабатына шамадан тыс диффузияланатыны көрсетілді9. Біз паренхималық кеңістікке осы субарахноидальды ағын жолын пайдаланып немесе тікелей ГЭС арқылы қол жеткізуді үміттенеміз. Бұған қол жеткізу үшін біз осы екі түрлі жолдың кез келгені арқылы тасымалданатын пептидтерді идеалды түрде анықтайтын сенімді in vivo фаг таңдау стратегиясын енгіздік.
Енді біз бастапқы іріктеу раундтарын ең жоғары кітапханалық әртүрлілікпен бақылау үшін жоғары өткізу қабілеттілігін секвенирлеумен (ЖӨС) біріктірілген тізбекті in vivo фаг дисплей скрининг әдісін сипаттаймыз. Скрининг қанның ластануын болдырмау үшін тұрақты имплантацияланған үлкен цистерна (ЖЦ) канюлясы бар саналы егеуқұйрықтарға жүргізілді. Маңыздысы, бұл тәсіл миды нысанаға алуды және цереброваскулярлық тосқауыл арқылы тасымалдау белсенділігі бар пептидтерді таңдайды. Біз T7 фагтарын кішкентай өлшемдеріне (~60 нм)10 байланысты қолдандық және олардың эндотелий және/немесе эпителий-медулла тосқауылынан жасушааралық өтуге мүмкіндік беретін көпіршіктерді тасымалдауға жарамды екенін ұсындық. Панировканың төрт раундынан кейін, in vivo ЖӨС-тің байытылуы мен церебральды микротамырлық ассоциацияның күшті екенін көрсететін фаг популяциялары бөлініп алынды. Маңыздысы, біз таңдалған және химиялық синтезделген ең жақсы кандидат пептидтердің ақуыз жүктемесін цереброспинальды сұйықтыққа тасымалдай алатынын көрсету арқылы өз тұжырымдарымызды растай алдық. Біріншіден, ОЖЖ фармакодинамикалық әсерлері жетекші транзиттік пептидті BACE1 пептидінің ингибиторымен біріктіру арқылы анықталды. In vivo функционалды скрининг стратегиялары мидың жаңа тасымалдау пептидтерін тиімді ақуыз тасымалдаушылары ретінде анықтай алатынын көрсетумен қатар, біз ұқсас функционалды іріктеу тәсілдерінің мидың жаңа тасымалдау жолдарын анықтауда да маңызды болатынын күтеміз.
Бляшка түзуші бірліктерге (БҚБ) сүйене отырып, фагты орау кезеңінен кейін шамамен 109 әртүрлілігі бар кездейсоқ 12-мер сызықтық T7 фаг пептидтерінің кітапханасы жасалды және жасалды (Материалдар мен әдістерді қараңыз). In vivo панорамалау алдында біз бұл кітапхананы мұқият талдағанымызды атап өту маңызды. Модификацияланған праймерлерді қолдана отырып, фаг кітапханасының үлгілерін ПТР күшейту HTS-ке тікелей қолданылатын ампликондарды жасады (Қосымша 1a сурет). a) HTS11 секвенирлеу қателеріне, b) праймерлердің (NNK)1-12 сапасына әсеріне және c) күту кітапханасында жабайы типті (салмақтық) фагтың (қаңқа кірістірулерінің) болуына байланысты тек тексерілген тізбек ақпаратын алу үшін тізбекті сүзу процедурасы енгізілді (Қосымша 1b сурет). Бұл сүзу қадамдары барлық HTS секвенирлеу кітапханаларына қолданылады. Стандартты кітапхана үшін барлығы 233 868 оқу алынды, оның 39%-ы сүзгі критерийлерінен өтті және келесі раундтар үшін кітапхананы талдау және іріктеу үшін пайдаланылды (1c–e қосымша сурет). Оқулар негізінен ұзындығы 36 нуклеотидте шыңы бар 3 базалық жұптың еселіктері болды (1c қосымша сурет), бұл кітапхана дизайнын (NNK) 1-12 растайды. Атап айтқанда, кітапхана мүшелерінің шамамен 11%-ында 12 өлшемді жабайы типті (салмақтық) негізгі PAGISRELVDKL кірістірілген, ал тізбектердің жартысына жуығында (49%) кірістірулер немесе жоюлар болды. Кітапхана кітапханасының HTS кітапханадағы пептидтердің жоғары әртүрлілігін растады: пептидтік тізбектердің 81%-дан астамы тек бір рет табылды және тек 1,5%-ы ≥4 көшірмеде болды (2a қосымша сурет). Репертуардағы барлық 12 позициядағы аминқышқылдарының (aa) жиіліктері дегенеративті NKK репертуары тудырған кодондар саны үшін күтілетін жиіліктермен жақсы корреляцияланды (2b қосымша сурет). Осы кірістірулермен кодталған aa қалдықтарының байқалған жиілігі есептелген жиілікпен жақсы корреляцияланды (r = 0,893) (2c қосымша сурет). Фаг кітапханаларын инъекцияға дайындау эндотоксинді күшейту және жою қадамдарын қамтиды. Бұл бұрын фаг кітапханаларының әртүрлілігін азайтуы мүмкін екендігі көрсетілген12,13. Сондықтан, біз эндотоксинді жоюдан өткен пластинамен күшейтілген фаг кітапханасын секвенирледік және оны AA жиілігін бағалау үшін бастапқы кітапханамен салыстырдық. Бастапқы пул мен күшейтілген және тазартылған пул арасында күшті корреляция (r = 0,995) байқалды (2d қосымша сурет), бұл T7 фагын пайдаланып пластиналарда күшейтілген клондар арасындағы бәсекелестік үлкен ауытқуларды тудырмағанын көрсетеді. Бұл салыстыру әр кітапханадағы трипептидтік мотивтердің жиілігіне негізделген, себебі кітапханалардың әртүрлілігін (~109) HTS арқылы да толық қамту мүмкін емес. Әр позициядағы aa жиілігін талдау енгізілген репертуардың соңғы үш позициясында позицияға тәуелді шағын ауытқуды анықтады (қосымша 2e сурет). Қорытындылай келе, біз кітапхананың сапасы мен әртүрлілігі қолайлы және бірнеше іріктеу раундтары арасында фаг кітапханаларын күшейту мен дайындауға байланысты әртүрлілікте тек шағын өзгерістер байқалды деген қорытындыға келдік.
Ми-жұлын сұйықтығының сериялық сынамасын алуды есі дұрыс егеуқұйрықтардың ми-жұлын сұйықтығына хирургиялық жолмен имплантациялау арқылы жүргізуге болады, бұл BBB және/немесе BCSFB арқылы көктамыр ішіне енгізілген T7 фагын анықтауды жеңілдетеді (1a-b сурет). Біз in vivo іріктеудің алғашқы үш раундында екі тәуелсіз іріктеу қолын (A және B қолдары) қолдандық (1c сурет). Біз іріктеудің алғашқы үш раундында енгізілген фагтың жалпы мөлшерін азайту арқылы іріктеудің қатаңдығын біртіндеп арттырдық. Паннингтің төртінші раундында біз A және B тармақтарынан алынған үлгілерді біріктіріп, үш қосымша тәуелсіз іріктеу жүргіздік. Бұл модельдегі T7 фаг бөлшектерінің in vivo қасиеттерін зерттеу үшін жабайы типті фаг (PAGISRELVDKL негізгі енгізілімі) құйрық венасы арқылы егеуқұйрықтарға енгізілді. Фагтардың ми-жұлын сұйықтығынан және қаннан әртүрлі уақыт нүктелерінде алынуы салыстырмалы түрде кішкентай T7 икосаэдрлік фагтарының қан бөлімінен бастапқы тазарту фазасы жылдам болғанын көрсетті (3-қосымша сурет). Егеуқұйрықтардың енгізілген титрлері мен қан көлеміне сүйене отырып, біз көктамыр ішіне енгізілгеннен кейін 10 минуттан кейін қанда енгізілген дозадан шамамен 1% салмақтық фаг анықталғанын есептедік. Бұл бастапқы тез төмендеуден кейін, бастапқы клиренстің баяулауы 27,7 минут жартылай ыдырау кезеңімен өлшенді. Маңыздысы, жұлын сұйықтығы бөлімінен өте аз фагтар алынды, бұл жабайы типтегі фагтардың жұлын сұйықтығына миграциясының төмен деңгейін көрсетеді (қосымша 3-сурет). Орташа есеппен, бүкіл іріктеу кезеңінде (0-250 мин) жұлын сұйықтығында қандағы Т7 фагының шамамен 1 x 10-3% титрі және бастапқыда енгізілген фагтардың 4 x 10-8% титрі анықталды. Атап айтқанда, жұлын сұйықтығындағы жабайы типтегі фагтың жартылай ыдырау кезеңі (25,7 мин) қанда байқалғанға ұқсас болды. Бұл деректер CM-канюляцияланған егеуқұйрықтарда CSF бөлімін қаннан бөліп тұратын тосқауылдың бүтін екенін көрсетеді, бұл қаннан CSF бөліміне оңай тасымалданатын клондарды анықтау үшін фаг кітапханаларын in vivo таңдауға мүмкіндік береді.
(a) Үлкен бассейннен жұлын-ми сұйықтығының (ЖС) қайта сынамасын алу әдісін орнату. (b) Орталық жүйке жүйесі (ЖЖ) тосқауылының жасушалық орналасуын және қан-ми тосқауылынан (ГББ) және қан-ми тосқауылынан өтетін пептидтерді анықтау үшін қолданылатын іріктеу стратегиясын көрсететін диаграмма. (c) In vivo фаг дисплейінің скринингтік блок-схемасы. Іріктеудің әрбір раундында фагтар (көрсеткілердің ішіндегі жануар идентификаторлары) көктамыр ішіне енгізілді. Екі тәуелсіз балама тармақ (A, B) іріктеудің 4-ші раундына дейін бөлек сақталады. 3 және 4 іріктеу раундтары үшін ЖС-тен алынған әрбір фаг клоны қолмен секвенирленді. (d) T7 пептидтік кітапханасын (2 x 1012 фаг/жануар) көктамыр ішіне енгізгеннен кейін екі канюляцияланған егеуқұйрықта іріктеудің бірінші раундында қаннан (қызыл шеңберлер) және жұлын-ми сұйықтығынан (жасыл үшбұрыштар) бөлініп алынған фагтың кинетикасы. Көк шаршылар қандағы фагтың орташа бастапқы концентрациясын көрсетеді, ол жалпы қан көлемін ескере отырып, енгізілген фаг мөлшерінен есептеледі. Қара шаршылар қандағы фаг концентрациясынан экстраполяцияланған y сызығының қиылысу нүктесін көрсетеді. (e,f) Пептидте табылған барлық мүмкін болатын қабаттасатын трипептидтік мотивтердің салыстырмалы жиілігі мен таралуын көрсетіңіз. 1000 оқуда табылған мотивтер саны көрсетілген. Айтарлықтай (p < 0,001) байытылған мотивтер қызыл нүктелермен белгіленген. (e) Инъекцияланған кітапхананың трипептидтік мотивінің салыстырмалы жиілігін №1.1 және №1.2 жануарлардан алынған фагпен салыстыратын корреляциялық шашыраңқылық графигі. (f) Қан мен жұлын-ми сұйықтығында оқшауланған №1.1 және №1.2 жануарлар фагының трипептидтік мотивтерінің салыстырмалы жиіліктерін салыстыратын корреляциялық шашыраңқылық графигі. (g, h) Екі жануарда да in vivo іріктеуден кейін қанға байытылған фагтың (g) инъекциялық кітапханалармен және жұлын сұйықтығымен байытылған фагтың (h) қанмен салыстырғандағы тізбектік идентификаторының көрінісі. Бір әріпті кодтың өлшемі сол аминқышқылының сол жерде қаншалықты жиі кездесетінін көрсетеді. Жасыл = полярлық, күлгін = бейтарап, көк = негізгі, қызыл = қышқылдық және қара = гидрофобты аминқышқылдары. 1a, b суреттерін Эдуард Урих жасап шығарған.
Біз екі CM аспаптық егеуқұйрықтарына (А және В кладтары) фаг пептидтік кітапханасын енгіздік және фагты жұлын-ми сұйықтығы мен қаннан бөліп алдық (1d-сурет). Кітапхананың бастапқы жылдам тазартылуы жабайы типті фагпен салыстырғанда онша байқалмады. Екі жануарда да енгізілген кітапхананың орташа жартылай ыдырау кезеңі қанда 24,8 минутты құрады, бұл жабайы типті фагқа ұқсас, ал жұлын-ми сұйықтығында 38,5 минут болды. Әрбір жануардан алынған қан мен жұлын-ми сұйықтығының фаг үлгілері HTS-ке ұшырады және анықталған барлық пептидтер қысқа трипептидтік мотивтің болуына талданды. Трипептидтік мотивтер құрылымның қалыптасуы мен пептид-ақуыз өзара әрекеттесуі үшін минималды негіз беретіндіктен таңдалды14,15. Біз енгізілген фаг кітапханасы мен екі жануардың қанынан алынған клондар арасындағы мотивтердің таралуында жақсы корреляция таптық (1e-сурет). Деректер кітапхана құрамының қан бөлімінде аз ғана байытылғанын көрсетеді. Аминқышқылдарының жиілігі мен консенсус тізбектері Weblogo16 бағдарламалық жасақтамасының бейімделуін пайдаланып әр позицияда одан әрі талданды. Қызығы, біз қандағы глицин қалдықтарының күшті байытылғанын анықтадық (1g-сурет). Қанды CSF-тен таңдалған клондармен салыстырған кезде, күшті іріктеу және мотивтердің кейбір іріктеуден бас тартуы байқалды (1f-сурет), ал кейбір аминқышқылдары 12 мүшелі жасушада алдын ала анықталған позицияларда басымдықпен болды (1h-сурет). Айта кету керек, жеке жануарлардың жұлын-ми сұйықтығында айтарлықтай айырмашылықтары болды, ал қандағы глициннің байытылғаны екі жануарда да байқалды (4a–j қосымша сурет). №1.1 және №1.2 жануарлардың жұлын-ми сұйықтығындағы тізбек деректерін қатаң сүзгіден өткізгеннен кейін барлығы 964 және 420 бірегей 12-мер пептидтері алынды (1d–e қосымша сурет). Бөлінген фаг клондары күшейтіліп, in vivo іріктеудің екінші кезеңіне ұшырады. Іріктеудің екінші кезеңінен алынған фаг әрбір жануарда HTS-ке ұшырады және анықталған барлық пептидтер трипептидтік мотивтердің пайда болуын талдау үшін мотивтерді тану бағдарламасына кіріс ретінде пайдаланылды (2a, b, ef сурет). Жұлын сұйықтығынан алынған фагтың бірінші циклімен салыстырғанда, біз А және В тармақтарында жұлын сұйықтығындағы көптеген мотивтердің одан әрі іріктелуі мен іріктелмеуі байқалды (2-сурет). Олардың тұрақты тізбектің әртүрлі үлгілерін білдіретінін анықтау үшін желілік идентификация алгоритмі қолданылды. Балама А кладында (2c, d сурет) және В кладында (2g, h сурет) жұлын сұйықтығымен қалпына келтірілген 12 өлшемді тізбектер арасында айқын ұқсастық байқалды. Әрбір тармақтағы біріктірілген талдау 12-мер пептидтері үшін әртүрлі іріктеу профильдерін (қосымша 5c, d сурет) және іріктеудің екінші кезеңінен кейін біріктірілген клондар үшін іріктеудің бірінші кезеңімен салыстырғанда уақыт өте келе жұлын сұйықтығы/қан титрінің қатынасының артуын анықтады (қосымша 5e сурет).
In vivo функционалды фаг дисплейін таңдаудың екі қатарынан раунд арқылы жұлын-ми сұйықтығындағы мотивтер мен пептидтерді байыту.
Әрбір жануардың (№1.1 және №1.2 жануарлар) бірінші раундынан алынған барлық жұлын-ми сұйықтығының фагтары біріктіріліп, күшейтіліп, HT-реттеліп, бірге қайта енгізілді (2 x 1010 фаг/жануар) 2 SM канюляцияланған егеуқұйрық (№1.1 → #). 2.1 және 2.2, 1.2 → 2.3 және 2.4). (a,b,e,f) Бірінші және екінші іріктеу раундтарындағы барлық жұлын-ми сұйықтығынан алынған фагтардың трипептидтік мотивтерінің салыстырмалы жиілігін салыстыратын корреляциялық шашыраңқылық графигтері. Екі бағыттағы пептидтерде кездесетін барлық мүмкін болатын қабаттасатын трипептидтерді білдіретін мотивтердің салыстырмалы жиілігі мен таралуы. 1000 оқуда табылған мотивтер саны көрсетілген. Салыстырылған кітапханалардың бірінде айтарлықтай таңдалған немесе алынып тасталған мотивтер (p < 0.001) қызыл нүктелермен белгіленген. (c, d, g, h) In vivo іріктеудің 2 және 1 раундтарына негізделген барлық CSF-ке бай 12 аминқышқылының ұзын тізбектерінің тізбек логотипінің көрінісі. Бір әріпті кодтың өлшемі сол аминқышқылының сол позицияда қаншалықты жиі кездесетінін көрсетеді. Логотипті көрсету үшін екі іріктеу раунды арасында жеке жануарлардан алынған CSF тізбектерінің жиілігі салыстырылады және екінші раундтағы байытылған тізбектер көрсетіледі: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 және (h) #1.2–#2.4. (c, d) №2.1 және №2.2 жануарларындағы немесе (g, h) №2.3 және №2.4 жануарларындағы берілген позициядағы ең байытылған аминқышқылдары түрлі-түсті көрсетілген. Жасыл = полярлық, күлгін = бейтарап, көк = негізгі, қызыл = қышқыл және қара = гидрофобты аминқышқылдары.
Іріктеудің үшінші раундынан кейін біз екі жануардан бөлініп алынған 332 CSF-қалпына келтірілген фаг клондарынан 124 бірегей пептидтік тізбекті (#3.1 және #3.2) анықтадық (қосымша 6a сурет). LGSVS тізбегі (18,7%) ең жоғары салыстырмалы үлеске ие болды, одан кейін жабайы типті кірістірулер PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) және SARGSWREIVSLS (2,2%). Соңғы төртінші раундта біз үш бөлек жануардан екі тәуелсіз таңдалған бұтақты біріктірдік (1c сурет). CSF-тен қалпына келтірілген 925 тізбекті фаг клондарының ішінен төртінші раундта біз 64 бірегей пептидтік тізбекті таптық (қосымша 6b сурет), олардың ішінде жабайы типті фагтың салыстырмалы үлесі 0,8%-ға дейін төмендеді. Төртінші раундта ең көп таралған CSF клондары LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSLNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) және RLSSVDSDLSGC (3, 2%) болды. %)). Таңдалған пептидтердің ұзындық диапазоны NNK кітапханасын жобалау үшін дегенерацияланған кодондарды пайдаланған кезде кітапхана праймерлеріндегі нуклеотидтік енгізулер/жоюларға немесе мерзімінен бұрын тоқтату кодондарына байланысты. Мерзімінен бұрын тоқтату кодондары қысқа пептидтерді тудырады және оларда қолайлы AA мотиві болғандықтан таңдалады. Ұзын пептидтер синтетикалық кітапханалардың праймерлеріндегі енгізулер/жоюлар нәтижесінде пайда болуы мүмкін. Бұл жобаланған тоқтату кодонын кадрдың сыртына орналастырады және оны төменде жаңа тоқтату кодоны пайда болғанша оқиды. Жалпы, біз кіріс деректерін үлгі шығыс деректерімен салыстыру арқылы барлық төрт іріктеу раундтары үшін байыту коэффициенттерін есептедік. Скринингтің бірінші раундында біз жабайы типті фаг титрлерін арнайы емес фондық сілтеме ретінде қолдандық. Қызығы, бірінші CSF циклінде теріс фаг таңдауы өте күшті болды, бірақ қанда болмады (3a-сурет), бұл пептид кітапханасының көптеген мүшелерінің CSF бөліміне пассивті диффузиясының төмен ықтималдығына немесе салыстырмалы фагтардың бактериофагтарға қарағанда қан ағымынан тиімдірек сақталуына немесе жойылуына байланысты болуы мүмкін. Дегенмен, паннингтің екінші раундында екі кладада да CSF-те фагтардың күшті таңдалуы байқалды, бұл алдыңғы раундтың CSF сіңуін ынталандыратын пептидтерді көрсететін фагтарға бай болғанын көрсетеді (3a-сурет). Тағы да, қанның айтарлықтай байытылуынсыз. Сондай-ақ, үшінші және төртінші раундтарда фаг клондары CSF-ке айтарлықтай байытылған. Соңғы екі таңдау раундтары арасындағы әрбір бірегей пептидтік тізбектің салыстырмалы жиілігін салыстыра отырып, біз тізбектердің төртінші таңдау раундында одан да байытылғанын анықтадық (3b-сурет). Барлық 64 бірегей пептидтік тізбектен екі пептидтік бағытты қолдана отырып, барлығы 931 трипептидтік мотив алынды. Төртінші раундтағы ең байытылған мотивтер енгізілген кітапханамен салыстырғанда барлық раундтардағы байыту профильдері үшін мұқият зерттелді (шектеу: 10% байыту) (Қосымша 6c-сурет). Іріктеудің жалпы үлгілері зерттелген мотивтердің көпшілігі екі іріктеу тармағының алдыңғы барлық раундтарында байытылғанын көрсетті. Дегенмен, кейбір мотивтер (мысалы, SGL, VSG, LGS GSV) негізінен балама А кладынан, ал басқалары (мысалы, FGW, RTN, WGF, NTR) балама В кладында байытылған.
Стрептавидиннің пайдалы жүктемелерімен конъюгацияланған CSF-пен байытылған фагпен көрсетілген пептидтер мен биотинилденген жетекші пептидтердің CSF тасымалын тексеру.
(a) Барлық төрт раундта (R1-R4) инъекцияланған (кіріс = I) фаг (PFU) титрлеріне және анықталған CSF фаг титрлеріне (шығыс = O) негізделген байыту коэффициенттері есептелді. Соңғы үш раунд үшін байыту коэффициенттері (R2-R4) салмақ деректерімен алдыңғы раундпен және бірінші раундпен (R1) салыстыру арқылы есептелді. Ашық жолақтар - жұлын сұйықтығы, көлеңкеленген жолақтар - плазма. (***p<0,001, Стьюденттің t-тесті негізінде). (b) 4-ші іріктеу раундынан кейін CSF-те жиналған барлық фагтарға қатысты үлесіне қарай ең көп таралған фаг пептидтерінің тізімі. 3 және 4-ші іріктеу раундтары арасындағы түспен белгіленген, нөмірленген және олардың байыту коэффициенттері көрсетілген (кірістер). (c,d) 4-раундтағы ең көп байытылған алты фаг клоны, бос фаг және ата-аналық фаг пептид кітапханалары CSF іріктеу моделінде жеке талданды. Көрсетілген уақыт нүктелерінде жұлын сұйықтығы мен қан үлгілері алынды. (c) 6 кандидат фаг клонының (2 x 1010 фаг/жануар), бос фагтардың (#1779) (2 x 1010 фаг/жануар) және қордағы фаг пептид кітапханаларының (2 x 1012 фаг/жануар) тең мөлшері. Құйрық венасы арқылы канюляцияланған жануарға кемінде 3 CM инъекциясы жасалады. Әрбір енгізілген фаг клоны мен фаг пептид кітапханасының уақыт бойынша жұлын сұйықтығының фармакокинетикасы көрсетілген. (d) сынама алу уақытындағы барлық қалпына келтірілген фагтар/мл үшін орташа жұлын сұйықтығы/қан қатынасын көрсетеді. (e) Төрт синтетикалық жетекші пептид және бір аралас бақылау биотинмен стрептавидинге N-терминалы (тетрамер дисплейі) арқылы байланыстырылды, содан кейін инъекция жасалды (құйрық венасы көктамыр ішіне, 10 мг стрептавидин/кг). Кемінде үш интубацияланған егеуқұйрық (N = 3). Жұлын сұйықтығының үлгілері көрсетілген уақыт нүктелерінде жиналды және стрептавидин концентрациясы жұлын сұйықтығына қарсы стрептавидин ELISA арқылы өлшенді (nd = анықталмады). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ANOVA сынағына негізделген). (f) Ең байытылған фаг пептидті клонының №2002 (күлгін) аминқышқылдық тізбегін іріктеудің 4-ші раундынан алынған басқа таңдалған фаг пептидті клондарымен салыстыру. Бірдей және ұқсас аминқышқылдық фрагменттері түспен кодталған.
Төртінші раундтағы барлық байытылған фагтардың ішінен (3b-сурет), CSF іріктеу моделінде әрі қарай жеке талдау үшін алты кандидат клон таңдалды. Үш канюляцияланған CM жануарларына алты кандидат фаг, бос фаг (енгізусіз) және профаг пептид кітапханаларының тең мөлшері енгізілді, ал фармакокинетикасы CSF (3c-сурет) және қан (қосымша 7-сурет) талдауларында анықталды. Сыналған барлық фаг клондары CSF бөлімін бос бақылау фагына (#1779) қарағанда 10-1000 есе жоғары деңгейде нысанаға алды. Мысалы, #2020 және #2077 клондарында CSF титрлері бақылау фагына қарағанда шамамен 1000 есе жоғары болды. Әрбір таңдалған пептидтің фармакокинетикалық профилі әртүрлі, бірақ олардың барлығында CSF-ті орналастыру қабілеті жоғары. Біз #1903 және #2011 клондары үшін уақыт өте келе тұрақты төмендеуді байқадық, ал #2077, #2002 және #2009 клондары үшін алғашқы 10 минут ішінде арту белсенді тасымалдауды көрсетуі мүмкін, бірақ оны тексеру қажет. #2020, #2002 және #2077 клондары жоғары деңгейде тұрақтанды, ал #2009 клонының CSF концентрациясы бастапқы артудан кейін баяу төмендеді. Содан кейін біз әрбір CSF кандидатының салыстырмалы жиілігін оның қандағы концентрациясымен салыстырдық (3d-сурет). Барлық іріктеу уақыттарында әрбір CSF кандидатының орташа титрінің оның қан титрімен корреляциясы алты кандидаттың үшеуінде қан CSF айтарлықтай байытылғанын көрсетті. Қызығы, #2077 клоны қанның жоғары тұрақтылығын көрсетті (7-қосымша сурет). Пептидтердің өздері CSF бөліміне фаг бөлшектерінен басқа жүктерді белсенді түрде тасымалдай алатынын растау үшін біз пептидтер фаг бөлшекке бекітілетін N-терминалында биотинмен туындыланған төрт жетекші пептидті синтездедік. Биотинделген пептидтер (№ 2002, 2009, 2020 және 2077) стрептавидинмен (SA) конъюгацияланып, фаг геометриясын біршама имитациялайтын мультимерлі формалар алынды. Бұл формат бізге қан мен жұлын-ми сұйықтығындағы SA әсерін жүк тасымалдайтын ақуыз пептидтері ретінде өлшеуге мүмкіндік берді. Маңыздысы, синтетикалық пептидтер осы SA-конъюгацияланған форматта енгізілген кезде фаг деректерін жиі қайталауға болады (3e-сурет). Аралас пептидтердің бастапқы әсері аз болды және 48 сағат ішінде анықталмайтын деңгейлері бар CSF клиренсі жылдамдады. Бұл пептидті фаг клондарының CSF кеңістігіне жеткізу жолдарын түсіну үшін біз in vivo көктамыр ішіне енгізгеннен кейін 1 сағаттан кейін фаг бөлшектерін тікелей анықтау үшін иммуногистохимияны (IHC) қолдана отырып, жеке фаг пептидтерінің әсер етуінің локализациясын талдадық. Атап айтқанда, #2002, #2077 және #2009 клондарын ми капиллярларындағы күшті бояу арқылы анықтауға болады, ал бақылау фагы (#1779) және #2020 клоны анықталмады (қосымша 8-сурет). Бұл пептидтердің миға әсер етуіне BBB арқылы дәл өту арқылы үлес қосатынын көрсетеді. Бұл гипотезаны тексеру үшін қосымша егжей-тегжейлі талдау қажет, себебі BSCFB жолы да қатысуы мүмкін. Ең байытылған клонның (#2002) аминқышқылдық тізбегін басқа таңдалған пептидтермен салыстырған кезде, олардың кейбіреулерінің ұқсас аминқышқылдық кеңейтімдері бар екені байқалды, бұл ұқсас тасымалдау механизмін көрсетуі мүмкін (3f-сурет).
Бірегей плазмалық профиліне және уақыт өте келе CSF-тің айтарлықтай өсуіне байланысты, №2077 фаг-дисплей клоны 48 сағаттық ұзақ уақыт бойы одан әрі зерттелді және SA деңгейінің тұрақтылығымен байланысты байқалған CSF-тің тез өсуін қайталай алды (4a-сурет). Анықталған басқа фаг клондарына келетін болсақ, №2077 ми капиллярлары үшін қатты боялған және жоғары ажыратымдылықта қараған кезде капиллярлық маркер лектинімен айтарлықтай колокализацияны және паренхималық кеңістікте біраз бояуды көрсетті (4b-сурет). Пептид арқылы жүзеге асырылатын фармакологиялық әсерлерді ОЖЖ-де алуға болатынын зерттеу үшін біз i) №2077 транзиттік пептидінің және ii) BACE1 ингибиторы пептидінің биотинделген нұсқалары SA-мен екі түрлі қатынаста араласқан эксперимент жүргіздік. Бір комбинация үшін біз тек BACE1 пептид ингибиторын қолдандық, ал екіншісі үшін BACE1 пептид ингибиторының №2077 пептидіне 1:3 қатынасын қолдандық. Екі үлгі де көктамыр ішіне енгізілді және уақыт өте келе қан мен жұлын-ми сұйықтығындағы бета-амилоидты пептид 40 (Abeta40) деңгейі өлшенді. Abeta40 ми паренхимасында BACE1 тежелуін көрсететіндіктен, жұлын-ми сұйықтығында өлшенді. Күтілгендей, екі кешен де Abeta40 қан деңгейін айтарлықтай төмендетті (4c, d сурет). Дегенмен, тек 2077 пептид қоспасы мен SA-мен конъюгацияланған BACE1 пептидінің ингибиторын қамтитын үлгілер ғана жұлын-ми сұйықтығында Abeta40 деңгейінің айтарлықтай төмендеуіне әкелді (4c сурет). Деректер 2077 пептидінің 60 кДа SA ақуын ОЖЖ-ге тасымалдай алатынын және сонымен қатар BACE1 пептидінің SA-мен конъюгацияланған ингибиторларымен фармакологиялық әсер ететінін көрсетеді.
(a) Кем дегенде үш CM-интубацияланған егеуқұйрықта CSF пептиді #2077 (RLSSVDSDLSGC) және инъекцияланбаған бақылау фагының (#1779) ұзақ мерзімді фармакокинетикалық профильдерін көрсететін T7 фагының клоналды инъекциясы (2 × 10 фаг/жануар). (b) Фагпен инъекцияланған егеуқұйрықтардағы (2 × 10 10 фаг/жануар) типтік кортикальды микротамырларының конфокальды микроскопиялық кескіні #2077 пептиді мен тамырларының (лектин) контра-боялуын көрсетеді. Бұл фаг клондары 3 егеуқұйрыққа енгізіліп, перфузия алдында 1 сағат бойы айналымға жіберілді. Милар кесіліп, T7 фаг капсидіне қарсы поликлоналды FITC-белгіленген антиденелермен боялды. Перфузиядан және кейінгі бекітуден он минут бұрын DyLight594-белгіленген лектин көктамыр ішіне енгізілді. Капиллярлар мен периваскулярлық ми тінінің қуысындағы микротамырлар мен фагтардың люмендік жағының (жасыл) лектинмен боялуын (қызыл) көрсететін флуоресцентті кескіндер. Шкала жолағы 10 мкм-ге сәйкес келеді. (c, d) Биотинделген BACE1 тежегіш пептиді жеке немесе биотинделген транзиттік пептидпен бірге #2077 стрептавидинмен біріктіріліп, содан кейін кем дегенде үш канюляцияланған CM егеуқұйрықтарына (10 мг стрептавидин/кг) көктамыр ішіне енгізілді. BACE1 пептиді тежегішінің көмегімен Aβ40-тың төмендеуі көрсетілген уақыт нүктелерінде қандағы (қызыл) және жұлын-ми сұйықтығындағы (қызғылт сары) Aβ1-40 ELISA арқылы өлшенді. Анықтығын арттыру үшін графикте 100% масштабта нүктелі сызық сызылған. (c) Стрептавидинмен емделген егеуқұйрықтардың қанындағы (қызыл үшбұрыштар) және жұлын-ми сұйықтығындағы (қызғылт сары үшбұрыштар) Aβ40 мөлшерінің 3:1 қатынасында транзиттік пептид №2077 және BACE1 тежегіш пептидімен конъюгацияланған кезде пайыздық төмендеуі. (d) Тек BACE1 тежегіш пептидімен байланысқан стрептавидинмен емделген егеуқұйрықтардың қанындағы Aβ40 (қызыл шеңберлер) және жұлын-ми сұйықтығындағы (қызғылт сары шеңберлер) мөлшерінің пайыздық төмендеуі. Бақылаудағы Aβ концентрациясы 420 пг/мл болды (стандартты ауытқу = 101 пг/мл).
Фаг дисплейі биомедициналық зерттеулердің бірнеше саласында сәтті қолданылды17. Бұл әдіс in vivo тамырлы әртүрлілікті зерттеуде18,19, сондай-ақ ми тамырларына бағытталған зерттеулерде20,21,22,23,24,25,26 қолданылды. Бұл зерттеуде біз бұл іріктеу әдісін қолдануды тек ми тамырларына бағытталған пептидтерді тікелей анықтауға ғана емес, сонымен қатар қан-ми тосқауылынан өту үшін белсенді тасымалдау қасиеттері бар кандидаттарды ашуға да кеңейттік. Енді біз CM интубацияланған егеуқұйрықтарда in vivo іріктеу процедурасының дамуын сипаттаймыз және оның CSF хостинг қасиеттері бар пептидтерді анықтау әлеуетін көрсетеміз. 12-мер кездейсоқ пептидтер кітапханасын көрсететін T7 фагын пайдаланып, біз T7 фагының қан-ми тосқауылына бейімделу үшін жеткілікті кішкентай екенін (диаметрі шамамен 60 нм)10 көрсете алдық, осылайша қан-ми тосқауылынан немесе хориоидтық плексустан тікелей өтеді. Біз канюляцияланған CM егеуқұйрықтарынан CSF жинаудың in vivo функционалды скрининг әдісі жақсы бақыланатынын және алынған фагтың тек тамыр жүйесіне ғана емес, сонымен қатар қан-ми тосқауылы арқылы тасымалдаушы ретінде де қызмет ететінін байқадық. Сонымен қатар, бір мезгілде қан жинау және CSF-ке және қаннан алынған фагтарға HTS қолдану арқылы біз CSF таңдауымызға қанның байытылуы немесе іріктеу раундтары арасындағы кеңеюге жарамдылық әсер етпегенін растадық. Дегенмен, қан бөлімі іріктеу процедурасының бөлігі болып табылады, себебі CSF бөліміне жете алатын фагтар мида байыту үшін қан ағымында жеткілікті ұзақ уақыт бойы өмір сүруі және айналымда болуы керек. Шикі SCF деректерінен сенімді тізбек ақпаратын алу үшін біз талдау жұмыс процесінде платформаға тән секвенирлеу қателеріне бейімделген сүзгілерді енгіздік. Скрининг әдісіне кинетикалық параметрлерді енгізу арқылы біз жабайы типті T7 фагтарының қандағы жылдам фармакокинетикасын (t½ ~ 28 мин) растадық24, 27, 28, сондай-ақ олардың ми-жұлын сұйықтығындағы жартылай ыдырау кезеңін (t½ ~ 26 мин) минутына анықтадық. Қан мен жұлын-ми сұйықтығындағы ұқсас фармакокинетикалық профильдерге қарамастан, жұлын-ми сұйықтығында фагтың қан концентрациясының тек 0,001%-ы анықталды, бұл жабайы типті Т7 фагының қан-ми тосқауылы арқылы төмен фондық қозғалғыштығын көрсетеді. Бұл жұмыс in vivo паннинг стратегияларын қолданған кезде, әсіресе қан айналымынан тез тазартылатын фаг жүйелері үшін бірінші іріктеу раундының маңыздылығын көрсетеді, себебі ОЖЖ бөліміне аз ғана клон жете алады. Осылайша, бірінші раундта кітапхана әртүрлілігінің азаюы өте үлкен болды, себебі бұл өте қатаң жұлын-ми сұйықтығы моделінде ақырында шектеулі сандағы клондар жиналды. Бұл in vivo паннинг стратегиясы жұлын-ми сұйықтығы бөлімінде белсенді жинақталу, қан бөлімінде клонның өмір сүруі және алғашқы 10 минут ішінде қаннан Т7 фаг клондарын тез алып тастау сияқты бірнеше іріктеу қадамдарын қамтыды (1d сурет және қосымша 4M сурет). Осылайша, бірінші раундтан кейін жұлын-ми сұйықтығында әртүрлі фаг клондары анықталды, дегенмен жеке жануарлар үшін бірдей бастапқы пул қолданылды. Бұл кітапхана мүшелерінің саны көп бастапқы кітапханалар үшін бірнеше қатаң іріктеу қадамдары әртүрліліктің айтарлықтай төмендеуіне әкелетінін көрсетеді. Сондықтан кездейсоқ оқиғалар бастапқы іріктеу процесінің ажырамас бөлігіне айналады, бұл нәтижеге үлкен әсер етеді. Бастапқы кітапханадағы көптеген клондардың CSF байытуға бейімділігі өте ұқсас болған болуы мүмкін. Дегенмен, тіпті бірдей эксперименттік жағдайларда да, бастапқы пулдағы әрбір нақты клонның санының аздығына байланысты іріктеу нәтижелері әртүрлі болуы мүмкін.
Жұлын сұйықтығына бай мотивтер қандағы мотивтерден ерекшеленеді. Бір қызығы, біз жеке жануарлардың қанында глицинге бай пептидтерге қарай алғашқы ауысуды байқадық. (1g-сурет, Қосымша 4e, 4f суреттер). Глицин пептидтері бар фаг тұрақтырақ болуы мүмкін және қан айналымынан шығарылу ықтималдығы аз. Дегенмен, бұл глицинге бай пептидтер жұлын-ми сұйықтығының үлгілерінде анықталмады, бұл жинақталған кітапханалардың екі түрлі іріктеу кезеңінен өткенін көрсетеді: бірі қанда, екіншісі жұлын-ми сұйықтығында жиналуға мүмкіндік берді. Төртінші іріктеу раундынан алынған жұлын-ми сұйықтығына бай клондар кеңінен тексерілді. Жеке тексерілген клондардың барлығы дерлік бос бақылау фагымен салыстырғанда жұлын сұйықтығына бай екені расталды. Бір пептидтің әсері (#2077) толығырақ зерттелді. Басқа әсерлермен салыстырғанда плазманың жартылай ыдырау кезеңі ұзағырақ болды (3d-сурет және 7-қосымша сурет), және қызығы, бұл пептидтің құрамында С-терминалында цистеин қалдығы болды. Жақында пептидтерге цистеин қосу олардың фармакокинетикалық қасиеттерін альбумин 29-мен байланысу арқылы жақсарта алатыны көрсетілді. Бұл қазіргі уақытта №2077 пептиді үшін белгісіз және қосымша зерттеуді қажет етеді. Кейбір пептидтер CSF байытылуының валенттілігін көрсетті (деректер көрсетілмеген), бұл T7 капсидінің көрсетілген беткі геометриясымен байланысты болуы мүмкін. Біз қолданған T7 жүйесі әрбір фаг бөлшегінде әрбір пептидтің 5-15 көшірмесін көрсетті. IHC егеуқұйрықтардың ми қыртысына көктамыр ішіне енгізілген кандидат қорғасын фаг клондарына жүргізілді (8-қосымша сурет). Деректер кем дегенде үш клонның (№2002, №2009 және №2077) BBB-мен әрекеттесетінін көрсетті. Бұл BBB өзара әрекеттесуі CSF жиналуына немесе бұл клондардың тікелей BCSFB-ге қозғалуына әкелетінін анықтау әлі де қажет. Маңыздысы, біз таңдалған пептидтердің синтезделген және ақуыз жүктемесіне байланысқан кезде CSF тасымалдау қабілетін сақтайтынын көрсетеміз. N-терминалды биотинилденген пептидтердің SA-ға байланысуы қандағы және жұлын-ми сұйықтығындағы тиісті фаг клондарымен алынған нәтижелерді қайталайды (3e-сурет). Соңында, біз қорғасын пептиді #2077 SA-ға конъюгацияланған BACE1 биотинилденген пептид ингибиторының ми әсерін күшейте алатынын, CSF-тегі Abeta40 деңгейін айтарлықтай төмендету арқылы ОЖЖ-де айқын фармакодинамикалық әсерлер тудыратынын көрсетеміз (4-сурет). Барлық хиттердің пептидтік тізбек гомологиясын іздеу арқылы дерекқордағы гомологтарды анықтай алмадық. T7 кітапханасының өлшемі шамамен 109 екенін, ал 12-мер үшін теориялық кітапхана өлшемі 4 x 1015 екенін ескеру маңызды. Сондықтан, біз 12-мер пептидтік кітапханасының әртүрлілік кеңістігінің тек аз ғана бөлігін таңдадық, бұл анықталған хиттердің көршілес тізбек кеңістігін бағалау арқылы оңтайландырылған пептидтерді анықтауға болатынын білдіруі мүмкін. Гипотетикалық тұрғыдан алғанда, бұл пептидтердің табиғи гомологтарын таппауымыздың себептерінің бірі эволюция кезінде миға белгілі бір пептидтік мотивтердің бақылаусыз енуіне жол бермеу үшін таңдалмау болуы мүмкін.
Жалпы алғанда, біздің нәтижелеріміз in vivo цереброваскулярлық тосқауылдың тасымалдау жүйелерін толығырақ анықтау және сипаттау бойынша болашақ жұмыстарға негіз болады. Бұл әдістің негізгі құрылымы тек ми тамырларының байланыс қасиеттері бар клондарды анықтап қана қоймай, сонымен қатар табысты клондардың in vivo биологиялық тосқауылдарды ОЖЖ бөліміне кесіп өту үшін ішкі белсенділігі бар маңызды қадамды қамтитын функционалдық іріктеу стратегиясына негізделген. Бұл пептидтердің тасымалдау механизмін және олардың ми аймағына тән микротамырмен байланысуға деген артықшылығын анықтау. Бұл BBB мен рецепторларды тасымалдаудың жаңа жолдарын ашуға әкелуі мүмкін. Біз анықталған пептидтер BBB немесе BCSFB арқылы тасымалданатын цереброваскулярлық рецепторларға немесе айналымдағы лигандтарға тікелей байланыса алады деп күтеміз. Бұл жұмыста анықталған CSF тасымалдау белсенділігі бар пептид векторлары одан әрі зерттеледі. Қазіргі уақытта біз бұл пептидтердің BBB және/немесе BCSFB арқылы өту қабілетіне қатысты ми ерекшелігін зерттеп жатырмыз. Бұл жаңа пептидтер жаңа рецепторларды немесе жолдарды ашу және биологиялық препараттар сияқты макромолекулаларды миға жеткізуге арналған жаңа жоғары тиімді платформаларды әзірлеу үшін өте құнды құралдар болады.
Бұрын сипатталған әдісті модификациялау арқылы үлкен цистернаны (ҮЦ) канюляциялаңыз. Анестезияланған Вистар егеуқұйрықтары (200-350 г) стереотаксикалық аппаратқа орнатылып, бас сүйегін ашу үшін қырылған және асептикалық түрде дайындалған бас сүйегінің үстінен медианалық кесік жасалды. Жоғарғы белдік аймағында екі тесік бұрғылап, тесіктерге бекіту бұрандаларын бекітіңіз. Тот баспайтын болаттан жасалған канюляны ҮЦ-ге стереотаксикалық бағыттау үшін бүйірлік желке жотасында қосымша тесік бұрғыланды. Канюляның айналасына тіс цементін жағып, бұрандалармен бекітіңіз. Фотоқабаттағаннан және цемент қатаюынан кейін тері жарасы 4/0 супрамидті тігіспен жабылды. Канюляның дұрыс орналасуы жұлын-ми сұйықтығының (ЖМС) өздігінен ағып кетуімен расталады. Егеуқұйрықты стереотаксикалық аппараттан шығарыңыз, операциядан кейінгі тиісті күтім мен ауырсынуды басқаруды алыңыз және жұлын-ми сұйықтығында қан белгілері байқалғанша кем дегенде бір апта бойы қалпына келуіне мүмкіндік беріңіз. Wistar егеуқұйрықтары (Crl:WI/Han) Чарльз Риверден (Франция) алынды. Барлық егеуқұйрықтар белгілі бір патогенсіз жағдайларда ұсталды. Барлық жануарларға жүргізілген тәжірибелер Швейцарияның Базель қаласының ветеринарлық басқармасымен мақұлданды және № 2474 жануарлар лицензиясына (егеуқұйрықтың жұлын сұйықтығы мен миындағы терапевтік кандидаттардың деңгейін өлшеу арқылы мидың белсенді тасымалдануын бағалау) сәйкес жүргізілді.
Егеуқұйрықты қолыңызда CM канюлясымен ақырын есінен тандырыңыз. Datura-ны канюлядан алып, өздігінен ағатын 10 мкл жұлын-ми сұйықтығын жинаңыз. Канюляның өткізгіштігі ақырында бұзылғандықтан, бұл зерттеуге қанның ластануы немесе түсінің өзгеруі белгілері жоқ мөлдір жұлын-ми сұйықтығының үлгілері ғана енгізілді. Сонымен қатар, құйрықтың ұшындағы кішкентай кесіктен шамамен 10-20 мкл қан гепарин (Sigma-Aldrich) бар түтікшелерге алынды. Т7 фагын көктамыр ішіне енгізгеннен кейін жұлын-ми сұйықтығы мен қан әртүрлі уақыт кезеңдерінде жиналды. Әрбір жұлын-ми сұйықтығының үлгісі жиналмас бұрын шамамен 5-10 мкл сұйықтық төгілді, бұл катетердің өлі көлеміне сәйкес келеді.
Кітапханалар T7Select жүйелік нұсқаулығында сипатталғандай (Novagen, Rosenberg және т.б., InNovations 6, 1-6, 1996) T7Select 10-3b векторын пайдаланып жасалды. Қысқаша айтқанда, кездейсоқ 12-мерлі ДНҚ кірістірілген жері келесі форматта синтезделді:
Қос тоқтау кодондары мен аминқышқылдарының артық экспрессиясын болдырмау үшін NNK кодоны қолданылды. N - әрбір нуклеотидтің қолмен араласқан эквимолярлық қатынасы, ал K - аденин мен цитозин нуклеотидтерінің қолмен араласқан эквимолярлық қатынасы. Бір тізбекті аймақтар dNTP (Novagen) және Klenow ферментімен (New England Biolabs) Klenow буферінде (New England Biolabs) 37°C температурада 3 сағат бойы инкубациялау арқылы қос тізбекті ДНҚ-ға айналдырылды. Реакциядан кейін қос тізбекті ДНҚ EtOH тұндыру арқылы қалпына келтірілді. Алынған ДНҚ EcoRI және HindIII рестрикциялық ферменттерімен (екеуі де Roche-тен) қорытылды. Бөлінген және тазартылған (QIAquick, Qiagen) ендіру (T4 лигаза, New England Biolabs) содан кейін 10B капсид генінің 348 аминқышқылынан кейін алдын ала бөлінген T7 векторына кадр ішінде лигатураланды. Байлау реакциялары in vitro қаптамаға дейін 16°C температурада 18 сағат бойы инкубацияланды. in vitro фаг қаптамасы T7Select 10-3b клондау жинағымен (Novagen) бірге берілген нұсқауларға сәйкес орындалды және қаптама ерітіндісі Escherichia coli (BLT5615, Novagen) көмегімен лизиске бір рет күшейтілді. Лизаттар центрифугаланды, титрленді және -80°C температурада глицериннің негізгі ерітіндісі ретінде мұздатылды.
Меншікті 454/Roche-amplicon біріктіру праймерлерін пайдаланып, сорпада немесе пластинада күшейтілген фаг айнымалы аймақтарының тікелей ПТР күшейтуі. Алға біріктіру праймерінде айнымалы аймақтың (NNK) 12 (үлгіге тән), GS FLX титан адаптері A және төрт базалық кітапхана кілт тізбегі (TCAG) бар (қосымша 1a сурет):
Кері біріктіру праймерінің құрамында сонымен қатар моншақтарды ұстап алуға бекітілген биотин және эмульсиялық ПТР кезінде клондық күшейту үшін қажетті GS FLX титан адаптері B бар:
Содан кейін ампликондар 454 GS-FLX Titanium хаттамасына сәйкес 454/Roche пиросеквенирлеуіне ұшырады. Sanger қолмен секвенирлеу үшін (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl ДНҚ анализаторы), T7 фаг ДНҚ ПТР арқылы күшейтілді және келесі праймер жұптарымен секвенирленді:
Жеке бляшкалардан алынған кірістірулер Roche Fast Start ДНҚ полимераза жинағын (өндіруші нұсқауларына сәйкес) пайдаланып ПТР күшейтуіне ұшырады. Ыстық іске қосуды (95 °C температурада 10 мин) және 35 күшейту циклін (95 °C температурада 50 с, 50 ​​°C температурада 1 мин және 72 °C температурада 1 мин) орындаңыз.
Кітапханалардан алынған фагтар, жабайы типті фагтар, жұлын сұйықтығы мен қаннан құтқарылған фагтар немесе жеке клондар Escherichia coli BL5615 бактериясында туберкулез сорпасында (Sigma Aldrich) немесе 500 см2 ыдыста (Thermo Scientific) 37°C температурада 4 сағат бойы күшейтілді. Фагтар пластиналардан Tris-EDTA буферімен (Fluka Analytical) шайып немесе бляшкаларды стерильді пипетка ұштарымен жинау арқылы алынды. Фагтар дақылдың үстіңгі қабатынан немесе экстракция буферінен бір раунд полиэтиленгликоль (PEG 8000) тұндыруымен (Promega) бөлініп алынды және Tris-EDTA буферінде қайта суспензияланды.
Күшейтілген фаг көктамыр ішіне (IV) енгізу алдында (500 мкл/жануарға) эндотоксинді кетіру моншақтарын (Miltenyi Biotec) пайдаланып эндотоксинді кетірудің 2-3 раундынан өтті. Бірінші раундта 2×1012 фаг енгізілді; екіншісінде 2×1010 фаг; үшінші және төртінші іріктеу раундтарында әр жануарға 2×109 фаг енгізілді. Көрсетілген уақыт нүктелерінде жиналған жұлын сұйықтығындағы және қан үлгілеріндегі фаг мөлшері өндірушінің нұсқауларына сәйкес бляшкаларды санау арқылы анықталды (T7Select жүйелік нұсқаулығы). Фагты таңдау тазартылған кітапханаларды құйрық венасына көктамыр ішіне енгізу немесе алдыңғы іріктеу раундынан жұлын сұйықтығынан алынған фагты қайта енгізу арқылы жүзеге асырылды, ал кейінгі жинаулар тиісінше 10 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 180 мин және 240 мин аралықпен жұлын сұйықтығы мен қан үлгілерін алу арқылы жүргізілді. Барлығы төрт рет in vivo паннинг жүргізілді, онда таңдалған екі тармақ бөлек сақталып, алғашқы үш іріктеу кезеңінде талданды. Алғашқы екі іріктеу кезеңінен жұлын сұйықтығынан алынған барлық фаг кірістірулері 454/Roche пиросеквенирлеуіне ұшырады, ал соңғы екі іріктеу кезеңінен жұлын сұйықтығынан алынған барлық клондар қолмен секвенирленді. Бірінші іріктеу кезеңінен алынған барлық қан фагтары да 454/Roche пиросеквенирлеуіне ұшырады. Фаг клондарын енгізу үшін таңдалған фагтар E. coli (BL5615) ішінде 500 см2 пластиналарда 37°C температурада 4 сағат бойы күшейтілді. Жеке таңдалған және қолмен секвенирленген клондар туберкулез ортасында көбейтілді. Фагты экстракциялаудан, тазартудан және эндотоксинді алып тастаудан кейін (жоғарыда сипатталғандай), 300 мкл-дегі 2 × 1010 фаг/жануар бір құйрық венасына көктамыр ішіне енгізілді.
Тізбек деректерін алдын ала өңдеу және сапалық сүзгілеу. Шикі 454/Roche деректері жеткізушінің бағдарламалық жасақтамасын пайдаланып, екілік стандартты ағын картасы форматынан (sff) Pearson адам оқи алатын форматына (fasta) түрлендірілді. Нуклеотидтік тізбекті одан әрі өңдеу төменде сипатталғандай меншікті C бағдарламалары мен скрипттерін (шығарылмаған бағдарламалық жасақтама пакеті) пайдалану арқылы жүзеге асырылды. Бастапқы деректерді талдау қатаң көп сатылы сүзгілеу процедураларын қамтиды. Жарамды 12мер кірістіру ДНҚ тізбегін қамтымайтын оқуларды сүзгілеу үшін оқулар жаһандық Needleman-Wunsch сынағын қолдана отырып, бастапқы белгіге (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), тоқтату белгіге (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) және фондық кірістіруге (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) ретпен тураланды. туралау әрбір туралау үшін 2 сәйкессіздікке дейін мүмкіндік береді31. Сондықтан, бастау және тоқтату тегтері жоқ оқулар және фондық кірістірулерді қамтитын оқулар, яғни рұқсат етілген сәйкессіздіктер санынан асатын туралаулар кітапханадан жойылды. Қалған оқуларға келетін болсақ, бастапқы белгіден бастап тоқтау белгісі бастапқы оқу тізбегінен алынып тасталып, одан әрі өңделгенге дейін аяқталатын N-мер ДНҚ тізбегі (бұдан әрі «қосу» деп аталады). Қосуды аударғаннан кейін, праймердің 5' ұшындағы бірінші тоқтату кодонынан кейінгі бөлік кірістіруден алынады. Сонымен қатар, праймердің 3' ұшындағы толық емес кодондарға әкелетін нуклеотидтер де алынып тасталды. Тек фондық тізбектерді қамтитын кірістірулерді алып тастау үшін «PAG» аминқышқылдық үлгісінен басталатын аударылған кірістірулер де алынып тасталды. Кітапханадан трансляциядан кейінгі ұзындығы 3 аминқышқылынан аз пептидтер алынып тасталды. Соңында, кірістіру пулындағы артықтықты алып тастап, әрбір бірегей кірістіру жиілігін анықтаңыз. Бұл талдау нәтижелеріне нуклеотидтік тізбектердің (қосулардың) тізімі және олардың (оқылған) жиіліктері кірді (1c және 2 қосымша суреттер).
N-мер ДНҚ тобының кірістірулері тізбек ұқсастығы бойынша: 454/Рошқа тән секвенирлеу қателерін (мысалы, гомополимер кеңейтімдерін секвенирлеудегі мәселелер) жою және онша маңызды емес артықшылықты жою үшін бұрын сүзілген N-мер ДНҚ тізбек кірістірулері (кірістірулер) ұқсастық бойынша сұрыпталады. кірістірулер (2 сәйкес келмейтін негізге дейін рұқсат етіледі) келесідей анықталған итеративті алгоритмді қолдана отырып: кірістірулер алдымен жиілігі бойынша (ең жоғарыдан ең төменгісіне дейін), ал егер олар бірдей болса, ұзындығы бойынша екінші реттік сұрыптау бойынша (ең ұзыннан ең қысқасына дейін) сұрыпталады. Осылайша, ең жиі және ең ұзақ кірістірулер бірінші «топты» анықтайды. Топ жиілігі кілт жиілігіне орнатылады. Содан кейін сұрыпталған тізімде қалған әрбір кірістіру жұптық Нидлман-Вунш туралауы арқылы топқа қосуға тырысылды. Егер туралаудағы сәйкессіздіктер, кірістірулер немесе жоюлар саны 2 шегінен аспаса, топқа кірістіру қосылады және топтың жалпы жиілігі кірістіру қаншалықты жиі қосылғанына байланысты артады. Топқа қосылған кірістірулер пайдаланылған деп белгіленеді және одан әрі өңдеуден шығарылады. Егер кірістіру тізбегін бұрыннан бар топқа қосу мүмкін болмаса, кірістіру тізбегі тиісті кірістіру жиілігімен жаңа топ құру үшін пайдаланылады және пайдаланылған деп белгіленеді. Итерация әрбір кірістіру тізбегі жаңа топ құру үшін пайдаланылған кезде немесе бұрыннан бар топқа енгізілуі мүмкін болған кезде аяқталады. Өйткені, нуклеотидтерден тұратын топтастырылған кірістірулер ақырында пептидтік тізбектерге (пептидтік кітапханаларға) аударылады. Бұл талдаудың нәтижесі - тізбекті оқулар санын құрайтын кірістірулер жиынтығы және оларға сәйкес жиіліктер (2-қосымша сурет).
Мотив генерациясы: Бірегей пептидтер тізімі негізінде төменде көрсетілгендей барлық мүмкін аминқышқылдық үлгілерді (aa) қамтитын кітапхана жасалды. Ұзындығы 3 болатын әрбір мүмкін үлгі пептидтен алынып, оның кері үлгісі барлық үлгілерді (трипептидтерді) қамтитын ортақ мотив кітапханасымен бірге қосылды. Өте қайталанатын мотивтердің кітапханалары тізбектеліп, артықшылығы жойылды. Содан кейін, мотив кітапханасындағы әрбір трипептид үшін есептеу құралдарын пайдаланып кітапханада оның бар-жоғын тексердік. Бұл жағдайда табылған мотив трипептидін қамтитын пептидтің жиілігі қосылады және мотив кітапханасындағы мотивке тағайындалады («мотивтер саны»). Мотив генерациясының нәтижесі - трипептидтердің (мотивтердің) барлық кездесулерін және олардың сәйкес мәндерін қамтитын екі өлшемді массив, олар оқулар сүзілген, топтастырылған және аударылған кезде сәйкес мотивке әкелетін секвенирлеу оқуларының саны. Жоғарыда егжей-тегжейлі сипатталған метрика.
Мотивтер санын және сәйкес шашыраңқы диаграммаларды қалыпқа келтіру: Әрбір үлгі үшін мотивтер саны келесіні пайдаланып қалыпқа келтірілді
мұндағы ni - i тақырыбын қамтитын оқулар саны. Осылайша, vi үлгідегі i мотивін қамтитын оқулардың (немесе пептидтердің) пайыздық жиілігін білдіреді. Нормалданбаған мотивтер саны үшін P-мәндері Фишердің дәл сынағын қолдану арқылы есептелді. Мотивтер санының коррелограммаларына келетін болсақ, Спирман корреляциялары R бар нормаланған мотивтер санын қолдану арқылы есептелді.
Пептидтік кітапханадағы әрбір позициядағы аминқышқылдарының құрамын визуализациялау үшін 32, 33 веб-логограммалары (http://weblogo.threeplusone.com) жасалды. Алдымен, 12-мер пептидінің әрбір позициясындағы аминқышқылдарының құрамы 20×12 матрицада сақталады. Содан кейін, әр позицияда бірдей салыстырмалы аминқышқылының құрамы бар 1000 пептид жиынтығы fasta-sequence форматында жасалады және берілген пептидтік кітапхана үшін әр позициядағы салыстырмалы аминқышқылының құрамының графикалық көрінісін жасайтын 3-веб-логотипке кіріс ретінде беріледі. Көп өлшемді деректер жиынтықтарын визуализациялау үшін R ішіндегі ішкі әзірленген құралды (biosHeatmap, әлі шығарылмаған R пакеті) пайдаланып жылу карталары жасалды. Жылу карталарында ұсынылған дендрограммалар Уордтың иерархиялық кластерлеу әдісін пайдаланып, Евклидтік қашықтық метрикасымен есептелді. Мотивті бағалау деректерін статистикалық талдау үшін қалыпқа келтірілмеген бағалау үшін P мәндері Фишердің дәл сынағын пайдаланып есептелді. Басқа деректер жиынтықтары үшін P-мәндері R-де Стьюденттің t-тестін немесе ANOVA көмегімен есептелді.
Таңдалған фаг клондары мен қондырмалары жоқ фагтар құйрық венасы арқылы көктамыр ішіне енгізілді (2 × 1010 фаг/жануар 300 мкл PBS-те). Перфузиядан және кейінгі бекітуден он минут бұрын сол жануарларға көктамыр ішіне 100 мкл DyLight594-таңбаланған лектин (Vector Laboratories Inc., DL-1177) енгізілді. Фаг енгізілгеннен кейін 60 минуттан кейін егеуқұйрықтарға жүрек арқылы 50 мл PBS, содан кейін 50 мл 4% PFA/PBS енгізілді. Ми үлгілері қосымша 4% PFA/PBS-те түні бойы бекітіліп, 4°C температурада түні бойы 30% сахарозаға батырылды. Үлгілер OCT қоспасында тез мұздатылған күйінде сақталады. Мұздатылған үлгілердің иммуногистохимиялық талдауы бөлме температурасында 1% BSA-мен бөлінген және 4 °C температурада T7 фагына (Novus NB 600-376A) қарсы поликлоналды FITC-белгіленген антиденелермен инкубацияланған 30 мкм криосекцияларда жүргізілді. Түні бойы инкубациялаңыз. Соңында, кесінділер PBS-пен 3 рет жуылып, конфокальды лазерлік микроскоппен (Leica TCS SP5) зерттелді.
Тазалығы кемінде 98% болатын барлық пептидтер GenScript USA арқылы синтезделді, биотинилденді және лиофилизацияланды. Биотин N-терминалында қосымша үштік глицин аралық арқылы байланысады. Барлық пептидтерді масс-спектрометрияны пайдаланып тексеріңіз.
Стрептавидин (Sigma S0677) биотинделген пептидтің 5 есе эквимолярлық артық мөлшерімен, биотинделген BACE1 тежегіш пептидімен немесе биотинделген BACE1 тежегіш пептиді мен BACE1 тежегіш пептиді комбинациясымен (3:1 қатынасы) 5-10% DMSO-да араластырылды/PBS-те инкубацияланды. Инъекциядан 1 сағат бұрын бөлме температурасында. Стрептавидинмен конъюгацияланған пептидтер ми қуысы бар егеуқұйрықтардың құйрық веналарының біріне 10 мг/кг дозада көктамыр ішіне енгізілді.
Стрептавидин-пептидті кешендердің концентрациясы ELISA арқылы бағаланды. Nunc Maxisorp микротитрлі пластиналары (Sigma) 4°C температурада түні бойы 1,5 мкг/мл тышқанның стрептавидинге қарсы антиденесімен (Thermo, MA1-20011) жабылды. Блоктағаннан кейін (блоктау буфері: 140 нМ NaCL, 5 мМ EDTA, 0,05% NP40, 0,25% желатин, 1% BSA) бөлме температурасында 2 сағат бойы, пластинаны 0,05% Tween-20/PBS (жуу буфері) ерітіндісімен 3 секунд бойы жуыңыз, CSF және плазма үлгілері блоктау буферімен (плазма 1:10,000, CSF 1:115) сұйылтылған ұңғымаларға қосылды. Содан кейін пластина 4°C температурада түні бойы анықтау антиденесімен (1 мкг/мл, анти-стрептавидин-HRP, Novus NB120-7239) инкубацияланды. Үш жуу кезеңінен кейін стрептавидин TMB субстрат ерітіндісінде (Roche) 20 минутқа дейін инкубациялау арқылы анықталды. 1M H2SO4 көмегімен түстің дамуын тоқтатқаннан кейін, 450 нм толқын ұзындығындағы сіңірілімді өлшеңіз.
Стрептавидин-пептид-BACE1 ингибитор кешенінің қызметі өндірушінің хаттамасына сәйкес Aβ(1-40) ELISA арқылы бағаланды (Wako, 294-64701). Қысқаша айтқанда, CSF үлгілері стандартты еріткіште (1:23) сұйылтылып, BNT77 ұстау антиденесімен қапталған 96 ұңғылы пластиналарда 4°C температурада түні бойы инкубацияланды. Бес жуу кезеңінен кейін HRP-конъюгацияланған BA27 антиденесі қосылып, 4°C температурада 2 сағат инкубацияланды, содан кейін бес жуу кезеңі орындалды. Aβ(1–40) бөлме температурасында 30 минут бойы TMB ерітіндісінде инкубациялау арқылы анықталды. Түстің дамуы тоқтатылған ерітіндімен тоқтатылғаннан кейін, 450 нм толқын ұзындығында сіңірілуді өлшеңіз. Плазма үлгілері Aβ(1–40) ELISA алдында қатты фазалы экстракцияға ұшырады. Плазма 96 ұңғылы пластиналарда 0,2% DEA (Sigma) қосылып, бөлме температурасында 30 минут инкубацияланды. SPE пластиналарын (Oasis, 186000679) сумен және 100% метанолмен бірінен соң бірін жуғаннан кейін, плазма үлгілері SPE пластиналарына қосылды және барлық сұйықтық алынып тасталды. Үлгілер жуылды (алдымен 5% метанолмен, содан кейін 30% метанолмен) және 2% NH4OH/90% метанолмен элюцияланды. Элюатты 55°C температурада 99 минут бойы тұрақты N2 тогында кептіргеннен кейін, үлгілер стандартты еріткіштерде тотықсыздандырылды және Aβ(1–40) жоғарыда сипатталғандай өлшенді.
Бұл мақаланы қалай дәйексөз ретінде келтіруге болады: Урих, Э. және т.б. In vivo анықталған транзиттік пептидтерді пайдаланып миға жүк жеткізу. ғылым. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Лихота Дж., Скьорринге Т., Томсен Л.Б. және Мус Т. Макромолекулалық препараттарды мақсатты терапияны қолдана отырып, миға жеткізу. Нейрохимия журналы 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Брасневич, И., Штайнбуш, Х.В., Шмиц, К. және Мартинес-Мартинес, П. Пептидтік және ақуыздық препараттарды қан-ми тосқауылы арқылы жеткізу. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардридж, ВМ Қан-ми тосқауылы: миға арналған дәрі-дәрмектерді әзірлеудегі кедергі. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Йохансон, К.Е., Дункан, ДЖ.А., Стопа, Э.Г. және Берд, А. Хороидтық өрім-CSF жолы арқылы миға дәрілік заттарды жеткізуді және нысанаға алуды жақсарту перспективалары. Фармацевтикалық зерттеулер 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардридж, ВМ Миға жеткізу үшін молекулалық трояндық аттарды қолдана отырып, биофармацевтикалық препараттарды жаңғырту. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардридж, WM рецепторлары арқылы пептидтердің қан-ми тосқауылы арқылы тасымалдануы. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. және т.б. Моновалентті молекулалық шаттлдарды қолдану арқылы миға енуді және терапиялық антиденелердің тиімділігін арттыру. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Биен-Ли, Н. және т.б. Трансферрин рецепторының (TfR) тасымалдануы TfR антиденелерінің аффиндік нұсқаларының миға сіңуін анықтайды. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).