Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Χρησιμοποιείτε μια έκδοση προγράμματος περιήγησης με περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη Λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Επιπλέον, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Εμφανίζει ένα καρουζέλ τριών διαφανειών ταυτόχρονα. Χρησιμοποιήστε τα κουμπιά Προηγούμενο και Επόμενο για να μετακινηθείτε σε τρεις διαφάνειες κάθε φορά ή χρησιμοποιήστε τα κουμπιά ρυθμιστικού στο τέλος για να μετακινηθείτε σε τρεις διαφάνειες κάθε φορά.
Ο αιματοεγκεφαλικός φραγμός και ο αιματοεγκεφαλικός φραγμός εμποδίζουν τους βιοθεραπευτικούς παράγοντες να φτάσουν στους στόχους τους στο κεντρικό νευρικό σύστημα, εμποδίζοντας έτσι την αποτελεσματική θεραπεία νευρολογικών ασθενειών. Για να ανακαλύψουμε νέους μεταφορείς εγκεφάλου in vivo, εισαγάγαμε μια βιβλιοθήκη πεπτιδίων φάγου T7 και συλλέξαμε σειριακά αίμα και εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο μεγάλης δεξαμενής αρουραίων με καθετήρα και συνείδηση. Συγκεκριμένοι κλώνοι φάγων εμπλουτίστηκαν σε μεγάλο βαθμό στο ΕΝΥ μετά από τέσσερις γύρους επιλογής. Η δοκιμή μεμονωμένων υποψήφιων πεπτιδίων αποκάλυψε περισσότερο από 1000 φορές εμπλουτισμό στο ΕΝΥ. Η βιοδραστικότητα της χορήγησης στον εγκέφαλο μέσω πεπτιδίων επιβεβαιώθηκε από μια μείωση κατά 40% στο επίπεδο της αμυλοειδούς-β στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό χρησιμοποιώντας έναν αναστολέα πεπτιδίου BACE1 συνδεδεμένο με το αναγνωρισμένο νέο πεπτίδιο μεταφοράς. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα πεπτίδια που αναγνωρίστηκαν με μεθόδους επιλογής φάγων in vivo μπορεί να είναι χρήσιμα οχήματα για συστηματική χορήγηση μακρομορίων στον εγκέφαλο με θεραπευτικό αποτέλεσμα.
Η έρευνα για τη στοχευμένη θεραπεία του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) έχει επικεντρωθεί σε μεγάλο βαθμό στον εντοπισμό βελτιστοποιημένων φαρμάκων και παραγόντων που εμφανίζουν ιδιότητες στόχευσης του ΚΝΣ, με λιγότερη προσπάθεια στην ανακάλυψη των μηχανισμών που οδηγούν στην ενεργό χορήγηση φαρμάκων στον εγκέφαλο. Αυτό αρχίζει να αλλάζει τώρα, καθώς η χορήγηση φαρμάκων, ιδιαίτερα μεγάλων μορίων, αποτελεί αναπόσπαστο μέρος της σύγχρονης νευροεπιστήμης για την ανάπτυξη φαρμάκων. Το περιβάλλον του κεντρικού νευρικού συστήματος προστατεύεται καλά από το εγκεφαλοαγγειακό σύστημα φραγμού, που αποτελείται από τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (ΑΕΦ) και τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (ΑΕΦΒ)1, καθιστώντας δύσκολη την χορήγηση φαρμάκων στον εγκέφαλο1,2. Εκτιμάται ότι σχεδόν όλα τα φάρμακα μεγάλων μορίων και περισσότερο από το 98% των φαρμάκων μικρών μορίων αποβάλλονται από τον εγκέφαλο3. Γι' αυτό είναι πολύ σημαντικό να εντοπιστούν νέα συστήματα μεταφοράς στον εγκέφαλο που παρέχουν αποτελεσματική και ειδική χορήγηση θεραπευτικών φαρμάκων στο ΚΝΣ4,5. Ωστόσο, ο ΑΕΦ και το BCSFB παρουσιάζουν επίσης μια εξαιρετική ευκαιρία για χορήγηση φαρμάκων καθώς διεισδύουν και εισέρχονται σε όλες τις δομές του εγκεφάλου μέσω του εκτεταμένου αγγειακού του συστήματος. Έτσι, οι τρέχουσες προσπάθειες για τη χρήση μη επεμβατικών μεθόδων χορήγησης στον εγκέφαλο βασίζονται σε μεγάλο βαθμό στον μηχανισμό της μεταφοράς μέσω υποδοχέα (PMT) χρησιμοποιώντας τον ενδογενή υποδοχέα BBB6. Παρά τις πρόσφατες βασικές εξελίξεις στη χρήση της οδού του υποδοχέα τρανσφερίνης7,8, απαιτείται περαιτέρω ανάπτυξη νέων συστημάτων χορήγησης με βελτιωμένες ιδιότητες. Για το σκοπό αυτό, ο στόχος μας ήταν να εντοπίσουμε πεπτίδια ικανά να μεσολαβήσουν στη μεταφορά ΕΝΥ, καθώς θα μπορούσαν κατ' αρχήν να χρησιμοποιηθούν για την χορήγηση μακρομορίων στο ΚΝΣ ή για το άνοιγμα νέων οδών υποδοχέων. Συγκεκριμένα, συγκεκριμένοι υποδοχείς και μεταφορείς του εγκεφαλοαγγειακού συστήματος (ΑΕΦ και BSCFB) μπορούν να χρησιμεύσουν ως πιθανοί στόχοι για την ενεργή και ειδική χορήγηση βιοθεραπευτικών φαρμάκων. Το εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) είναι ένα εκκριτικό προϊόν του χοριοειδούς πλέγματος (ΧΠ) και βρίσκεται σε άμεση επαφή με το διάμεσο υγρό του εγκεφάλου μέσω του υποαραχνοειδούς χώρου και του κοιλιακού χώρου4. Πρόσφατα έχει αποδειχθεί ότι το υποαραχνοειδές εγκεφαλονωτιαίο υγρό διαχέεται υπερβολικά στο διάμεσο χώρο του εγκεφάλου9. Ελπίζουμε να έχουμε πρόσβαση στον παρεγχυματικό χώρο χρησιμοποιώντας αυτήν την υποαραχνοειδή οδό εισροής ή απευθείας μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Για να το πετύχουμε αυτό, εφαρμόσαμε μια ισχυρή στρατηγική επιλογής φάγων in vivo που ιδανικά αναγνωρίζει πεπτίδια που μεταφέρονται μέσω οποιασδήποτε από αυτές τις δύο διακριτές οδούς.
Περιγράφουμε τώρα μια διαδοχική μέθοδο διαλογής in vivo εμφάνισης φάγων με δειγματοληψία ΕΝΥ σε συνδυασμό με αλληλούχιση υψηλής απόδοσης (HTS) για την παρακολούθηση των αρχικών γύρων επιλογής με την υψηλότερη ποικιλομορφία βιβλιοθήκης. Η διαλογή πραγματοποιήθηκε σε αρουραίους που είχαν τις αισθήσεις τους και είχαν μόνιμα εμφυτευμένη μεγάλη κάνουλα δεξαμενής (CM) για την αποφυγή μόλυνσης του αίματος. Είναι σημαντικό ότι αυτή η προσέγγιση επιλέγει τόσο πεπτίδια που στοχεύουν στον εγκέφαλο όσο και πεπτίδια με μεταφορική δραστηριότητα διαμέσου του εγκεφαλοαγγειακού φραγμού. Χρησιμοποιήσαμε φάγους T7 λόγω του μικρού τους μεγέθους (~60 nm)10 και υποδείξαμε ότι είναι κατάλληλοι για τη μεταφορά κυστιδίων που επιτρέπουν τη διακυτταρική διέλευση του ενδοθηλιακού ή/και επιθηλιακού-μυελικού φραγμού. Μετά από τέσσερις γύρους panning, απομονώθηκαν πληθυσμοί φάγων που παρουσίασαν ισχυρό εμπλουτισμό in vivo με ΕΝΥ και εγκεφαλική μικροαγγειακή σύνδεση. Είναι σημαντικό ότι καταφέραμε να επιβεβαιώσουμε τα ευρήματά μας αποδεικνύοντας ότι τα προτιμώμενα και χημικά συντεθειμένα καλύτερα υποψήφια πεπτίδια είναι σε θέση να μεταφέρουν πρωτεϊνικό φορτίο στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό. Πρώτον, οι φαρμακοδυναμικές επιδράσεις του ΚΝΣ τεκμηριώθηκαν συνδυάζοντας ένα κορυφαίο πεπτίδιο μεταφοράς με έναν αναστολέα του πεπτιδίου BACE1. Εκτός από την απόδειξη ότι οι στρατηγικές λειτουργικού ελέγχου in vivo μπορούν να αναγνωρίσουν νέα πεπτίδια μεταφοράς εγκεφάλου ως αποτελεσματικούς φορείς πρωτεϊνικού φορτίου, αναμένουμε ότι παρόμοιες προσεγγίσεις λειτουργικής επιλογής θα καταστούν επίσης σημαντικές στον εντοπισμό νέων οδών μεταφοράς εγκεφάλου.
Με βάση τις μονάδες σχηματισμού πλακών (PFU), μετά το βήμα συσκευασίας φάγων, σχεδιάστηκε και δημιουργήθηκε μια βιβλιοθήκη τυχαίων 12-μερών γραμμικών πεπτιδίων φάγου Τ7 με ποικιλομορφία περίπου 109 (βλ. Υλικά και Μέθοδοι). Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι αναλύσαμε προσεκτικά αυτήν τη βιβλιοθήκη πριν από την in vivo panning. Η ενίσχυση PCR δειγμάτων βιβλιοθήκης φάγων χρησιμοποιώντας τροποποιημένους εκκινητές δημιούργησε αμπλικόνια που ήταν άμεσα εφαρμόσιμα στο HTS (Συμπληρωματικό Σχήμα 1α). Λόγω α) σφαλμάτων αλληλούχισης HTS11, β) αντίκτυπου στην ποιότητα των εκκινητών (NNK)1-12 και γ) της παρουσίας φάγου άγριου τύπου (wt) (ένθετα σκελετού) στην αναμονή βιβλιοθήκη, εφαρμόστηκε μια διαδικασία φιλτραρίσματος αλληλουχίας για την εξαγωγή μόνο επαληθευμένων πληροφοριών αλληλουχίας (Συμπληρωματικό Σχήμα 1β). Αυτά τα βήματα φιλτραρίσματος ισχύουν για όλες τις βιβλιοθήκες αλληλούχισης HTS. Για την τυπική βιβλιοθήκη, ελήφθησαν συνολικά 233.868 αναγνώσεις, εκ των οποίων το 39% πέρασε τα κριτήρια φιλτραρίσματος και χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση και επιλογή βιβλιοθήκης για επόμενους γύρους (Συμπληρωματικό Σχήμα 1γ-ε). Οι αναγνώσεις ήταν κυρίως πολλαπλάσια 3 ζευγών βάσεων σε μήκος με κορυφή στα 36 νουκλεοτίδια (Συμπληρωματικό Σχήμα 1c), επιβεβαιώνοντας τον σχεδιασμό της βιβλιοθήκης (NNK) 1-12. Αξιοσημείωτα, περίπου το 11% των μελών της βιβλιοθήκης περιείχε ένα ένθετο PAGISRELVDKL 12-διάστατης ραχοκοκαλιάς άγριου τύπου (wt) και σχεδόν οι μισές από τις αλληλουχίες (49%) περιείχαν εισαγωγές ή διαγραφές. Το HTS της βιβλιοθήκης της βιβλιοθήκης επιβεβαίωσε την υψηλή ποικιλομορφία των πεπτιδίων στη βιβλιοθήκη: περισσότερο από το 81% των αλληλουχιών πεπτιδίων βρέθηκαν μόνο μία φορά και μόνο το 1,5% εμφανίστηκε σε ≥4 αντίγραφα (Συμπληρωματικό Σχήμα 2a). Οι συχνότητες των αμινοξέων (aa) και στις 12 θέσεις στο ρεπερτόριο συσχετίστηκαν καλά με τις αναμενόμενες συχνότητες για τον αριθμό των κωδικονίων που δημιουργήθηκαν από το εκφυλισμένο ρεπερτόριο NKK (Συμπληρωματικό Σχήμα 2b). Η παρατηρούμενη συχνότητα των υπολειμμάτων aa που κωδικοποιούνται από αυτά τα ένθετα συσχετίστηκε καλά με την υπολογισμένη συχνότητα (r = 0,893) (Συμπληρωματικό Σχήμα 2c). Η προετοιμασία βιβλιοθηκών φάγων για ένεση περιλαμβάνει τα βήματα ενίσχυσης και απομάκρυνσης της ενδοτοξίνης. Αυτό έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι μειώνει δυνητικά την ποικιλομορφία των βιβλιοθηκών φάγων12,13. Επομένως, προσδιορίσαμε την αλληλουχία μιας βιβλιοθήκης φάγων ενισχυμένης σε πλάκα που είχε υποβληθεί σε απομάκρυνση ενδοτοξίνης και τη συγκρίναμε με την αρχική βιβλιοθήκη για να εκτιμήσουμε τη συχνότητα του AA. Παρατηρήθηκε ισχυρή συσχέτιση (r = 0,995) μεταξύ της αρχικής ομάδας και της ενισχυμένης και καθαρισμένης ομάδας (Συμπληρωματικό Σχήμα 2δ), υποδεικνύοντας ότι ο ανταγωνισμός μεταξύ κλώνων που ενισχυθήκαν σε πλάκες χρησιμοποιώντας φάγο Τ7 δεν προκάλεσε σημαντική μεροληψία. Αυτή η σύγκριση βασίζεται στη συχνότητα των τριπεπτιδικών μοτίβων σε κάθε βιβλιοθήκη, καθώς η ποικιλομορφία των βιβλιοθηκών (~109) δεν μπορεί να καταγραφεί πλήρως ακόμη και με HTS. Η ανάλυση συχνότητας του aa σε κάθε θέση αποκάλυψε μια μικρή μεροληψία εξαρτώμενη από τη θέση στις τρεις τελευταίες θέσεις του εισαγόμενου ρεπερτορίου (Συμπληρωματικό Σχήμα 2ε). Συμπερασματικά, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η ποιότητα και η ποικιλομορφία της βιβλιοθήκης ήταν αποδεκτές και παρατηρήθηκαν μόνο μικρές αλλαγές στην ποικιλομορφία λόγω της ενίσχυσης και της προετοιμασίας βιβλιοθηκών φάγων μεταξύ αρκετών γύρων επιλογής.
Η σειριακή δειγματοληψία εγκεφαλονωτιαίου υγρού μπορεί να πραγματοποιηθεί με χειρουργική εμφύτευση μιας κάνουλας στο CM αρουραίων που έχουν τις αισθήσεις τους για να διευκολυνθεί η αναγνώριση του φάγου Τ7 που εγχύθηκε ενδοφλεβίως (iv) μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού ή/και του BCSFB (Εικ. 1a-b). Χρησιμοποιήσαμε δύο ανεξάρτητους βραχίονες επιλογής (βραχίονες Α και Β) στους πρώτους τρεις γύρους επιλογής in vivo (Εικ. 1c). Αυξήσαμε σταδιακά την αυστηρότητα της επιλογής μειώνοντας τη συνολική ποσότητα φάγου που εισήχθη στους πρώτους τρεις γύρους επιλογής. Για τον τέταρτο γύρο panning, συνδυάσαμε δείγματα από τους κλάδους Α και Β και πραγματοποιήσαμε τρεις επιπλέον ανεξάρτητες επιλογές. Για να μελετήσουμε τις in vivo ιδιότητες των σωματιδίων φάγου Τ7 σε αυτό το μοντέλο, εγχύθηκε φάγος άγριου τύπου (κύριο ένθετο PAGISRELVDKL) σε αρουραίους μέσω της ουραίας φλέβας. Η ανάκτηση φάγων από το εγκεφαλονωτιαίο υγρό και το αίμα σε διαφορετικά χρονικά σημεία έδειξε ότι σχετικά μικροί εικοσαεδρικοί φάγοι Τ7 είχαν μια ταχεία αρχική φάση κάθαρσης από το διαμέρισμα αίματος (Συμπληρωματικό Σχήμα 3). Με βάση τους τίτλους που χορηγήθηκαν και τον όγκο αίματος των αρουραίων, υπολογίσαμε ότι μόνο περίπου 1% κ.β. Ο φάγος από τη χορηγούμενη δόση ανιχνεύθηκε στο αίμα 10 λεπτά μετά την ενδοφλέβια ένεση. Μετά από αυτήν την αρχική ταχεία μείωση, μετρήθηκε μια βραδύτερη πρωτογενής κάθαρση με χρόνο ημιζωής 27,7 λεπτά. Σημαντικό είναι ότι μόνο πολύ λίγοι φάγοι ανακτήθηκαν από το διαμέρισμα του ΕΝΥ, υποδεικνύοντας ένα χαμηλό υπόβαθρο για μετανάστευση φάγων άγριου τύπου στο διαμέρισμα του ΕΝΥ (Συμπληρωματικό Σχήμα 3). Κατά μέσο όρο, μόνο περίπου 1 x 10-3% τίτλοι φάγου T7 στο αίμα και 4 x 10-8% των αρχικά εγχυμένων φάγων ανιχνεύθηκαν στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό καθ' όλη τη διάρκεια της περιόδου δειγματοληψίας (0-250 λεπτά). Αξίζει να σημειωθεί ότι ο χρόνος ημιζωής (25,7 λεπτά) του φάγου άγριου τύπου στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό ήταν παρόμοιος με αυτόν που παρατηρήθηκε στο αίμα. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι το φράγμα που χωρίζει το διαμέρισμα του ΕΝΥ από το αίμα είναι άθικτο σε αρουραίους με καθετήρα CM, επιτρέποντας την in vivo επιλογή βιβλιοθηκών φάγων για την αναγνώριση κλώνων που μεταφέρονται εύκολα από το αίμα στο διαμέρισμα του ΕΝΥ.
(α) Δημιουργία μεθόδου για την επαναδειγματοληψία εγκεφαλονωτιαίου υγρού (ΕΝΥ) από μια μεγάλη δεξαμενή. (β) Διάγραμμα που δείχνει την κυτταρική θέση του φραγμού του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) και τη στρατηγική επιλογής που χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση πεπτιδίων που διασχίζουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (ΑΕΦ) και τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. (γ) Διάγραμμα ροής διαλογής in vivo φάγων. Σε κάθε γύρο επιλογής, οι φάγοι (αναγνωριστικά ζώων μέσα στα βέλη) εγχύθηκαν ενδοφλεβίως. Δύο ανεξάρτητοι εναλλακτικοί κλάδοι (Α, Β) διατηρούνται ξεχωριστά μέχρι τον 4ο γύρο επιλογής. Για τους γύρους επιλογής 3 και 4, κάθε κλώνος φάγου που εξήχθη από το ΕΝΥ αλληλουχήθηκε χειροκίνητα. (δ) Κινητική φάγου που απομονώθηκε από αίμα (κόκκινοι κύκλοι) και εγκεφαλονωτιαίο υγρό (πράσινα τρίγωνα) κατά τη διάρκεια του πρώτου γύρου επιλογής σε δύο καθετηριασμένους αρουραίους μετά από ενδοφλέβια ένεση της βιβλιοθήκης πεπτιδίων Τ7 (2 x 1012 φάγοι/ζώο). Τα μπλε τετράγωνα υποδεικνύουν τη μέση αρχική συγκέντρωση φάγου στο αίμα, υπολογιζόμενη από την ποσότητα του εγχυμένου φάγου, λαμβάνοντας υπόψη τον συνολικό όγκο αίματος. Τα μαύρα τετράγωνα υποδεικνύουν το σημείο τομής της γραμμής y που προκύπτει από τις συγκεντρώσεις φάγων αίματος. (e,f) Παρουσιάστε τη σχετική συχνότητα και κατανομή όλων των πιθανών επικαλυπτόμενων τριπεπτιδικών μοτίβων που βρίσκονται στο πεπτίδιο. Εμφανίζεται ο αριθμός των μοτίβων που βρέθηκαν σε 1000 μετρήσεις. Τα σημαντικά (p < 0,001) εμπλουτισμένα μοτίβα σημειώνονται με κόκκινες κουκκίδες. (e) Διάγραμμα διασποράς συσχέτισης που συγκρίνει τη σχετική συχνότητα του τριπεπτιδικού μοτίβου της εγχυμένης βιβλιοθήκης με φάγο που προέρχεται από αίμα από ζώα #1.1 και #1.2. (f) Διάγραμμα διασποράς συσχέτισης που συγκρίνει τις σχετικές συχνότητες των τριπεπτιδικών μοτίβων ζωικού φάγου #1.1 και #1.2 που απομονώθηκαν στο αίμα και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό. (g, h) Αναπαράσταση αναγνωριστικού αλληλουχίας φάγου εμπλουτισμένου σε αίμα (g) έναντι εγχυμένων βιβλιοθηκών και φάγου εμπλουτισμένου σε ΕΝΥ (h) έναντι αίματος μετά από έναν γύρο επιλογής in vivo και στα δύο ζώα. Το μέγεθος του κωδικού ενός γράμματος υποδεικνύει πόσο συχνά εμφανίζεται αυτό το αμινοξύ σε αυτήν τη θέση. Πράσινο = πολικό, μωβ = ουδέτερο, μπλε = βασικό, κόκκινο = όξινο και μαύρο = υδρόφοβα αμινοξέα. Τα Σχήματα 1α, β σχεδιάστηκαν και κατασκευάστηκαν από τον Eduard Urich.
Εγχύσαμε μια βιβλιοθήκη πεπτιδίων φάγων σε δύο αρουραίους CM instrument (κλάδοι Α και Β) και απομονώσαμε φάγο από εγκεφαλονωτιαίο υγρό και αίμα (Σχήμα 1δ). Η αρχική ταχεία κάθαρση της βιβλιοθήκης ήταν λιγότερο έντονη σε σύγκριση με τον φάγο άγριου τύπου. Ο μέσος χρόνος ημιζωής της εγχυμένης βιβλιοθήκης και στα δύο ζώα ήταν 24,8 λεπτά στο αίμα, παρόμοιος με τον φάγο άγριου τύπου, και 38,5 λεπτά στο ΕΝΥ. Δείγματα φάγων αίματος και εγκεφαλονωτιαίου υγρού από κάθε ζώο υποβλήθηκαν σε HTS και όλα τα ταυτοποιημένα πεπτίδια αναλύθηκαν για την παρουσία ενός σύντομου τριπεπτιδικού μοτίβου. Τα τριπεπτιδικά μοτίβα επιλέχθηκαν επειδή παρέχουν μια ελάχιστη βάση για τον σχηματισμό δομής και τις αλληλεπιδράσεις πεπτιδίου-πρωτεΐνης14,15. Βρήκαμε μια καλή συσχέτιση στην κατανομή των μοτίβων μεταξύ της εγχυμένης βιβλιοθήκης φάγων και των κλώνων που εξήχθησαν από το αίμα και των δύο ζώων (Σχήμα 1ε). Τα δεδομένα δείχνουν ότι η σύνθεση της βιβλιοθήκης είναι μόνο οριακά εμπλουτισμένη στο διαμέρισμα του αίματος. Οι συχνότητες αμινοξέων και οι συναινετικές αλληλουχίες αναλύθηκαν περαιτέρω σε κάθε θέση χρησιμοποιώντας μια προσαρμογή του λογισμικού Weblogo16. Είναι ενδιαφέρον ότι διαπιστώσαμε ισχυρό εμπλουτισμό σε υπολείμματα γλυκίνης στο αίμα (Εικ. 1g). Όταν το αίμα συγκρίθηκε με κλώνους που επιλέχθηκαν από το ΕΝΥ, παρατηρήθηκε ισχυρή επιλογή και κάποια αποεπιλογή μοτίβων (Εικ. 1f) και ορισμένα αμινοξέα ήταν κατά προτίμηση παρόντα σε προκαθορισμένες θέσεις στο 12μελές (Εικ. 1h). Αξιοσημείωτα, τα μεμονωμένα ζώα διέφεραν σημαντικά στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό, ενώ παρατηρήθηκε εμπλουτισμός γλυκίνης στο αίμα και στα δύο ζώα (Συμπληρωματικό Σχήμα 4a-j). Μετά από αυστηρό φιλτράρισμα των δεδομένων αλληλουχίας στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό των ζώων #1.1 και #1.2, ελήφθησαν συνολικά 964 και 420 μοναδικά 12-μερή πεπτίδια (Συμπληρωματικό Σχήμα 1d-e). Οι απομονωμένοι κλώνοι φάγων ενισχύθηκαν και υποβλήθηκαν σε δεύτερο γύρο επιλογής in vivo. Οι φάγοι που εξήχθησαν από τον δεύτερο γύρο επιλογής υποβλήθηκαν σε HTS σε κάθε ζώο και όλα τα ταυτοποιημένα πεπτίδια χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος σε ένα πρόγραμμα αναγνώρισης μοτίβων για την ανάλυση της εμφάνισης τριπεπτιδικών μοτίβων (Εικ. 2a, b, ef). Σε σύγκριση με τον πρώτο κύκλο του φάγου που ανακτήθηκε από το ΕΝΥ, παρατηρήσαμε περαιτέρω επιλογή και αποεπιλογή πολλών μοτίβων στο ΕΝΥ στους κλάδους Α και Β (Εικ. 2). Εφαρμόστηκε ένας αλγόριθμος αναγνώρισης δικτύου για να προσδιοριστεί εάν αντιπροσώπευαν διαφορετικά πρότυπα συνεπούς αλληλουχίας. Παρατηρήθηκε σαφής ομοιότητα μεταξύ των 12-διάστατων αλληλουχιών που ανακτήθηκαν από το ΕΝΥ στον εναλλακτικό κλάδο Α (Εικ. 2c, d) και τον κλάδο Β (Εικ. 2g, h). Η συγκεντρωτική ανάλυση σε κάθε κλάδο αποκάλυψε διαφορετικά προφίλ επιλογής για τα 12-μερή πεπτίδια (Συμπληρωματικό Σχήμα 5c, d) και αύξηση στην αναλογία τίτλου ΕΝΥ/αίματος με την πάροδο του χρόνου για τους συγκεντρωμένους κλώνους μετά τον δεύτερο γύρο επιλογής σε σύγκριση με τον πρώτο γύρο επιλογής (Συμπληρωματικό Σχήμα 5e).
Εμπλουτισμός μοτίβων και πεπτιδίων στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό με δύο διαδοχικούς γύρους επιλογής λειτουργικής απεικόνισης φάγων in vivo.
Όλοι οι φάγοι εγκεφαλονωτιαίου υγρού που ανακτήθηκαν από τον πρώτο γύρο κάθε ζώου (ζώα #1.1 και #1.2) ομαδοποιήθηκαν, ενισχύθηκαν, προσδιορίστηκε η αλληλούχιση HT και επανεγχύθηκαν μαζί (2 x 1010 φάγοι/ζώο) 2 αρουραίοι με καθετήρα SM (#1.1 → #). 2.1 και 2.2, 1.2 → 2.3 και 2.4). (a,b,e,f) Διαγράμματα διασποράς συσχέτισης που συγκρίνουν τη σχετική συχνότητα των τριπεπτιδικών μοτίβων όλων των φάγων που προέρχονται από ΕΝΥ στον πρώτο και δεύτερο γύρο επιλογής. Η σχετική συχνότητα και κατανομή των μοτίβων που αντιπροσωπεύουν όλα τα πιθανά επικαλυπτόμενα τριπεπτίδια που βρέθηκαν στα πεπτίδια και στους δύο προσανατολισμούς. Εμφανίζεται ο αριθμός των μοτίβων που βρέθηκαν σε 1000 μετρήσεις. Τα μοτίβα που επιλέχθηκαν ή αποκλείστηκαν σημαντικά (p < 0.001) σε μία από τις συγκρινόμενες βιβλιοθήκες επισημαίνονται με κόκκινες κουκκίδες. (c, d, g, h) Αναπαράσταση λογότυπου αλληλουχίας όλων των αλληλουχιών 12 αμινοξέων πλούσιων σε ΕΝΥ με βάση τους γύρους 2 και 1 της in vivo επιλογής. Το μέγεθος του κωδικού ενός γράμματος υποδεικνύει πόσο συχνά εμφανίζεται αυτό το αμινοξύ σε αυτήν τη θέση. Για την αναπαράσταση του λογότυπου, συγκρίνεται η συχνότητα των αλληλουχιών ΕΝΥ που εξάγονται από μεμονωμένα ζώα μεταξύ δύο γύρων επιλογής και εμφανίζονται οι εμπλουτισμένες αλληλουχίες στον δεύτερο γύρο: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 και (h) #1.2–#2.4. Τα πιο εμπλουτισμένα αμινοξέα σε μια δεδομένη θέση στα (c, d) ζώα αρ. 2.1 και αρ. 2.2 ή (g, h) στα ζώα αρ. 2.3 και αρ. 2.4 εμφανίζονται έγχρωμα. Πράσινο = πολικό, μοβ = ουδέτερο, μπλε = βασικό, κόκκινο = όξινο και μαύρο = υδρόφοβα αμινοξέα.
Μετά τον τρίτο γύρο επιλογής, εντοπίσαμε 124 μοναδικές αλληλουχίες πεπτιδίων (#3.1 και #3.2) από 332 κλώνους φάγων που ανασυστάθηκαν σε ΕΝΥ και απομονώθηκαν από δύο ζώα (Συμπληρωματικό Σχήμα 6α). Η αλληλουχία LGSVS (18,7%) είχε την υψηλότερη σχετική αναλογία, ακολουθούμενη από τα ένθετα άγριου τύπου PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) και SARGSWREIVSLS (2,2%). Στον τελευταίο τέταρτο γύρο, συγκεντρώσαμε δύο ανεξάρτητα επιλεγμένους κλάδους από τρία ξεχωριστά ζώα (Σχήμα 1γ). Από τους 925 κλώνους φάγων που ανακτήθηκαν από ΕΝΥ, στον τέταρτο γύρο βρήκαμε 64 μοναδικές αλληλουχίες πεπτιδίων (Συμπληρωματικό Σχήμα 6β), μεταξύ των οποίων η σχετική αναλογία φάγων άγριου τύπου μειώθηκε στο 0,8%. Οι πιο συνηθισμένοι κλώνοι ΕΝΥ στον τέταρτο γύρο ήταν οι LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) και RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %). Το εύρος μήκους των επιλεγμένων πεπτιδίων οφείλεται σε εισαγωγές/διαγραφές νουκλεοτιδίων ή σε πρόωρα κωδικόνια λήξης στους εκκινητές της βιβλιοθήκης κατά τη χρήση εκφυλισμένων κωδικονίων για τον σχεδιασμό βιβλιοθήκης NNK. Τα πρόωρα κωδικόνια λήξης παράγουν βραχύτερα πεπτίδια και επιλέγονται επειδή περιέχουν το ευνοϊκό μοτίβο aa. Μεγαλύτερα πεπτίδια μπορεί να προκύψουν από εισαγωγές/διαγραφές στους εκκινητές των συνθετικών βιβλιοθηκών. Αυτό τοποθετεί το σχεδιασμένο κωδικόνιο λήξης εκτός του πλαισίου και το διαβάζει μέχρι να εμφανιστεί ένα νέο κωδικόνιο λήξης κατάντη. Γενικά, υπολογίσαμε τους συντελεστές εμπλουτισμού και για τους τέσσερις γύρους επιλογής συγκρίνοντας τα δεδομένα εισόδου με τα δεδομένα εξόδου του δείγματος. Για τον πρώτο γύρο διαλογής, χρησιμοποιήσαμε τίτλους φάγων άγριου τύπου ως μη ειδική αναφορά υποβάθρου. Είναι ενδιαφέρον ότι η αρνητική επιλογή φάγων ήταν πολύ ισχυρή στον πρώτο κύκλο ΕΝΥ, αλλά όχι στο αίμα (Εικ. 3α), κάτι που μπορεί να οφείλεται στη χαμηλή πιθανότητα παθητικής διάχυσης των περισσότερων μελών της βιβλιοθήκης πεπτιδίων στο διαμέρισμα ΕΝΥ ή οι σχετικοί φάγοι τείνουν να διατηρούνται ή να απομακρύνονται από την κυκλοφορία του αίματος πιο αποτελεσματικά από τους βακτηριοφάγους. Ωστόσο, στον δεύτερο γύρο διαλογής, παρατηρήθηκε ισχυρή επιλογή φάγων στο ΕΝΥ και στους δύο κλάδους, υποδηλώνοντας ότι ο προηγούμενος γύρος ήταν εμπλουτισμένος σε φάγους που εμφανίζουν πεπτίδια που προάγουν την πρόσληψη ΕΝΥ (Εικ. 3α). Και πάλι, χωρίς σημαντικό εμπλουτισμό με αίμα. Επίσης, στον τρίτο και τέταρτο γύρο, οι κλώνοι φάγων εμπλουτίστηκαν σημαντικά στο ΕΝΥ. Συγκρίνοντας τη σχετική συχνότητα κάθε μοναδικής αλληλουχίας πεπτιδίων μεταξύ των δύο τελευταίων γύρων επιλογής, διαπιστώσαμε ότι οι αλληλουχίες ήταν ακόμη πιο εμπλουτισμένες στον τέταρτο γύρο επιλογής (Εικ. 3β). Συνολικά 931 μοτίβα τριπεπτιδίων εξήχθησαν από όλες τις 64 μοναδικές αλληλουχίες πεπτιδίων χρησιμοποιώντας και τους δύο προσανατολισμούς πεπτιδίων. Τα πιο εμπλουτισμένα μοτίβα στον τέταρτο γύρο εξετάστηκαν πιο προσεκτικά για τα προφίλ εμπλουτισμού τους σε όλους τους γύρους σε σύγκριση με την εγχυμένη βιβλιοθήκη (αποκοπή: εμπλουτισμός 10%) (Συμπληρωματικό Σχήμα 6c). Τα γενικά πρότυπα επιλογής έδειξαν ότι τα περισσότερα από τα μελετηθέντα μοτίβα εμπλουτίστηκαν σε όλους τους προηγούμενους γύρους και των δύο κλάδων επιλογής. Ωστόσο, ορισμένα μοτίβα (π.χ. SGL, VSG, LGS GSV) προέρχονταν κυρίως από την εναλλακτική ομάδα Α, ενώ άλλα (π.χ. FGW, RTN, WGF, NTR) εμπλουτίστηκαν στην εναλλακτική ομάδα Β.
Επικύρωση της μεταφοράς στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) πεπτιδίων εμπλουτισμένων με φάγους που εμφανίζονται σε ΕΝΥ και βιοτινυλιωμένων πεπτιδίων-οδηγών συζευγμένων με φορτία στρεπταβιδίνης.
(α) Οι λόγοι εμπλουτισμού υπολογίστηκαν και στους τέσσερις γύρους (R1-R4) με βάση τους τίτλους εγχυμένου (είσοδος = I) φάγου (PFU) και τους προσδιορισμένους τίτλους φάγου ΕΝΥ (έξοδος = O). Οι συντελεστές εμπλουτισμού για τους τρεις τελευταίους γύρους (R2-R4) υπολογίστηκαν σε σύγκριση με τον προηγούμενο γύρο και τον πρώτο γύρο (R1) με δεδομένα βάρους. Οι ανοιχτές γραμμές είναι το εγκεφαλονωτιαίο υγρό, οι σκιασμένες γραμμές είναι το πλάσμα. (***p<0,001, με βάση το t-test του Student). (β) Λίστα των πιο άφθονων πεπτιδίων φάγου, καταταγμένων σύμφωνα με τη σχετική τους αναλογία προς όλους τους φάγους που συλλέχθηκαν στο ΕΝΥ μετά τον 4ο γύρο επιλογής. Οι έξι πιο συνηθισμένοι κλώνοι φάγου επισημαίνονται με χρώμα, αριθμούνται και οι συντελεστές εμπλουτισμού τους μεταξύ των γύρων 3 και 4 επιλογής (ένθετα). (γ,δ) Οι έξι πιο εμπλουτισμένοι κλώνοι φάγου, οι κενές βιβλιοθήκες φάγου και οι γονικές βιβλιοθήκες πεπτιδίων φάγου από τον 4ο γύρο αναλύθηκαν ξεχωριστά σε ένα μοντέλο δειγματοληψίας ΕΝΥ. Δείγματα ΕΝΥ και αίματος συλλέχθηκαν στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. (γ) Ίσες ποσότητες 6 υποψήφιων κλώνων φάγων (2 x 1010 φάγοι/ζώα), κενών φάγων (#1779) (2 x 1010 φάγοι/ζώα) και βιβλιοθηκών πεπτιδίων φάγων (2 x 1012 φάγοι/ζώα). Χορηγούνται τουλάχιστον 3 CM στο καθετηριασμένο ζώο ξεχωριστά μέσω της ουραίας φλέβας. Εμφανίζεται η φαρμακοκινητική του ΕΝΥ κάθε ενεσίμου κλώνου φάγου και βιβλιοθήκης πεπτιδίων φάγων με την πάροδο του χρόνου. (δ) δείχνει τη μέση αναλογία ΕΝΥ/αίματος για όλους τους ανακτημένους φάγους/mL κατά τη διάρκεια του χρόνου δειγματοληψίας. (ε) Τέσσερα συνθετικά πεπτίδια-οδηγοί και ένα ανακατεμένο μάρτυρα συνδέθηκαν με βιοτίνη με στρεπταβιδίνη μέσω του Ν-τελικού άκρου τους (τετραμερής απεικόνιση) ακολουθούμενη από ένεση (ουραία φλέβα ενδοφλεβίως, 10 mg στρεπταβιδίνης/kg). Τουλάχιστον τρεις διασωληνωμένοι αρουραίοι (N = 3). ). Δείγματα ΕΝΥ συλλέχθηκαν στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία και οι συγκεντρώσεις στρεπταβιδίνης μετρήθηκαν με ELISA αντι-στρεπταβιδίνης ΕΝΥ (nd = δεν ανιχνεύθηκε). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, με βάση τη δοκιμή ANOVA). (στ) Σύγκριση της αλληλουχίας αμινοξέων του πιο εμπλουτισμένου κλώνου πεπτιδίου φάγου #2002 (μωβ) με άλλους επιλεγμένους κλώνους πεπτιδίου φάγου από τον 4ο γύρο επιλογής. Τα πανομοιότυπα και παρόμοια θραύσματα αμινοξέων έχουν χρωματική κωδικοποίηση.
Από όλους τους εμπλουτισμένους φάγους στον τέταρτο γύρο (Εικ. 3b), επιλέχθηκαν έξι υποψήφιοι κλώνοι για περαιτέρω ατομική ανάλυση στο μοντέλο δειγματοληψίας ΕΝΥ. Ίσες ποσότητες έξι βιβλιοθηκών υποψήφιων φάγων, κενών φάγων (χωρίς ένθετο) και προφάγων πεπτιδίων εγχύθηκαν σε τρία ζώα CM με καθετήρα και η φαρμακοκινητική προσδιορίστηκε σε δοκιμασίες ΕΝΥ (Εικ. 3c) και αίματος (Συμπληρωματικό Σχήμα 7). Όλοι οι κλώνοι φάγων που εξετάστηκαν στόχευσαν το διαμέρισμα ΕΝΥ σε επίπεδο 10-1000 φορές υψηλότερο από αυτό του κενού φάγου ελέγχου (#1779). Για παράδειγμα, οι κλώνοι #2020 και #2077 είχαν περίπου 1000 φορές υψηλότερους τίτλους ΕΝΥ από τον φάγο ελέγχου. Το φαρμακοκινητικό προφίλ κάθε επιλεγμένου πεπτιδίου είναι διαφορετικό, αλλά όλοι τους έχουν υψηλή ικανότητα οριοθέτησης ΕΝΥ. Παρατηρήσαμε μια σταθερή μείωση με την πάροδο του χρόνου για τους κλώνους #1903 και #2011, ενώ για τους κλώνους #2077, #2002 και #2009 μια αύξηση κατά τα πρώτα 10 λεπτά μπορεί να υποδηλώνει ενεργή μεταφορά, αλλά πρέπει να επαληθευτεί. Οι κλώνοι #2020, #2002 και #2077 σταθεροποιήθηκαν σε υψηλά επίπεδα, ενώ η συγκέντρωση στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό του κλώνου #2009 μειώθηκε αργά μετά την αρχική αύξηση. Στη συνέχεια, συγκρίναμε τη σχετική συχνότητα κάθε υποψηφίου στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό με τη συγκέντρωσή του στο αίμα (Εικ. 3δ). Η συσχέτιση του μέσου τίτλου κάθε υποψηφίου στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό με τον τίτλο στο αίμα του σε όλους τους χρόνους δειγματοληψίας έδειξε ότι τρεις από τους έξι υποψηφίους ήταν σημαντικά εμπλουτισμένοι σε εγκεφαλονωτιαίο υγρό στο αίμα. Είναι ενδιαφέρον ότι ο κλώνος #2077 έδειξε υψηλότερη σταθερότητα στο αίμα (Συμπληρωματικό Σχήμα 7). Για να επιβεβαιώσουμε ότι τα ίδια τα πεπτίδια είναι ικανά να μεταφέρουν ενεργά φορτίο εκτός από σωματίδια φάγου στο διαμέρισμα του εγκεφαλονωτιαίου υγρού, συνθέσαμε τέσσερα πεπτίδια-οδηγούς που παράγονται με βιοτίνη στο Ν-τελικό άκρο όπου τα πεπτίδια προσκολλώνται στο σωματίδιο του φάγου. Τα βιοτινυλιωμένα πεπτίδια (αριθ. 2002, 2009, 2020 και 2077) συζεύχθηκαν με στρεπταβιδίνη (SA) για να ληφθούν πολυμερείς μορφές που μιμούνται κάπως τη γεωμετρία του φάγου. Αυτή η μορφή μας επέτρεψε επίσης να μετρήσουμε την έκθεση σε SA στο αίμα και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό ως πρωτεϊνικά πεπτίδια μεταφοράς φορτίου. Είναι σημαντικό ότι τα δεδομένα φάγων μπορούσαν συχνά να αναπαραχθούν όταν χορηγήθηκαν συνθετικά πεπτίδια σε αυτή τη συζευγμένη με SA μορφή (Εικ. 3ε). Τα ανακατεμένα πεπτίδια είχαν μικρότερη αρχική έκθεση και ταχύτερη κάθαρση στο ΕΝΥ με μη ανιχνεύσιμα επίπεδα εντός 48 ωρών. Για να κατανοήσουμε τις οδούς χορήγησης αυτών των κλώνων πεπτιδίων φάγων στον χώρο του ΕΝΥ, αναλύσαμε τον εντοπισμό μεμονωμένων χτυπημάτων πεπτιδίων φάγων χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία (IHC) για την άμεση ανίχνευση σωματιδίων φάγου 1 ώρα μετά την ενδοφλέβια ένεση in vivo. Αξιοσημείωτα, οι κλώνοι #2002, #2077 και #2009 μπορούσαν να ανιχνευθούν με ισχυρή χρώση σε τριχοειδή αγγεία του εγκεφάλου, ενώ ο φάγος ελέγχου (#1779) και ο κλώνος #2020 δεν ανιχνεύθηκαν (Συμπληρωματικό Σχήμα 8). Αυτό υποδηλώνει ότι αυτά τα πεπτίδια συμβάλλουν στην επίδραση στον εγκέφαλο ακριβώς διασχίζοντας τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. Απαιτείται περαιτέρω λεπτομερής ανάλυση για να δοκιμαστεί αυτή η υπόθεση, καθώς μπορεί επίσης να εμπλέκεται η οδός BSCFB. Κατά τη σύγκριση της αλληλουχίας αμινοξέων του πιο εμπλουτισμένου κλώνου (#2002) με άλλα επιλεγμένα πεπτίδια, παρατηρήθηκε ότι ορισμένα από αυτά έχουν παρόμοιες επεκτάσεις αμινοξέων, γεγονός που μπορεί να υποδηλώνει έναν παρόμοιο μηχανισμό μεταφοράς (Εικ. 3f).
Λόγω του μοναδικού προφίλ πλάσματος και της σημαντικής αύξησης του ΕΝΥ με την πάροδο του χρόνου, ο κλώνος εμφάνισης φάγων #2077 διερευνήθηκε περαιτέρω σε μια μεγαλύτερη περίοδο 48 ωρών και ήταν σε θέση να αναπαράγει την ταχεία αύξηση του ΕΝΥ που παρατηρήθηκε σε συνδυασμό με τα διατηρούμενα επίπεδα SA (Εικ. 4α). Όσον αφορά άλλους ταυτοποιημένους κλώνους φάγων, ο #2077 χρωματίστηκε έντονα για τριχοειδή αγγεία του εγκεφάλου και έδειξε σημαντική συσσωμάτωση με λεκτίνη τριχοειδούς δείκτη όταν εξετάστηκε σε υψηλότερη ανάλυση και πιθανώς κάποια χρώση στον παρεγχυματικό χώρο (Εικόνα 4β). Για να διερευνήσουμε εάν οι φαρμακολογικές επιδράσεις που προκαλούνται από πεπτίδια θα μπορούσαν να ληφθούν στο ΚΝΣ, πραγματοποιήσαμε ένα πείραμα στο οποίο βιοτινυλιωμένες εκδοχές i) του πεπτιδίου μετάβασης #2077 και ii) του πεπτιδίου αναστολέα BACE1 αναμίχθηκαν με SA σε δύο διαφορετικές αναλογίες. Για τον έναν συνδυασμό χρησιμοποιήσαμε μόνο τον αναστολέα πεπτιδίου BACE1 και για τον άλλο χρησιμοποιήσαμε αναλογία 1:3 αναστολέα πεπτιδίου BACE1 προς πεπτίδιο #2077. Και τα δύο δείγματα χορηγήθηκαν ενδοφλεβίως και τα επίπεδα του βήτα-αμυλοειδούς πεπτιδίου 40 (Abeta40) στο αίμα και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό μετρήθηκαν με την πάροδο του χρόνου. Η Abeta40 μετρήθηκε στο ΕΝΥ καθώς αντανακλά την αναστολή του BACE1 στο εγκεφαλικό παρέγχυμα. Όπως αναμενόταν, και τα δύο σύμπλοκα μείωσαν σημαντικά τα επίπεδα του Abeta40 στο αίμα (Εικ. 4c, d). Ωστόσο, μόνο δείγματα που περιείχαν ένα μείγμα πεπτιδίου αρ. 2077 και ενός αναστολέα του πεπτιδίου BACE1 συζευγμένου με SA προκάλεσαν σημαντική μείωση του Abeta40 στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (Εικ. 4c). Τα δεδομένα δείχνουν ότι το πεπτίδιο αρ. 2077 είναι ικανό να μεταφέρει την πρωτεΐνη SA 60 kDa στο ΚΝΣ και επίσης προκαλεί φαρμακολογικές επιδράσεις με αναστολείς του πεπτιδίου BACE1 συζευγμένους με SA.
(α) Κλωνική έγχυση (2 × 10 φάγοι/ζώο) φάγου T7 που δείχνει μακροπρόθεσμα φαρμακοκινητικά προφίλ του πεπτιδίου #2077 στο ΕΝΥ (RLSSVDSDLSGC) και του μη εγχυμένου φάγου ελέγχου (#1779) σε τουλάχιστον τρεις διασωληνωμένους με CM αρουραίους. (β) Ομοεστιακή μικροσκοπική εικόνα αντιπροσωπευτικών μικροαγγείων του φλοιού σε αρουραίους στους οποίους εγχύθηκε φάγος (2 × 10 10 φάγοι/ζώο) που δείχνει αντίχρωση του πεπτιδίου #2077 και των αγγείων (λεκτίνη). Αυτοί οι κλώνοι φάγων χορηγήθηκαν σε 3 αρουραίους και αφέθηκαν να κυκλοφορήσουν για 1 ώρα πριν από την έγχυση. Οι εγκέφαλοι τομογραφήθηκαν και χρωματίστηκαν με πολυκλωνικά αντισώματα σημασμένα με FITC έναντι του καψιδίου του φάγου T7. Δέκα λεπτά πριν από την έγχυση και την επακόλουθη στερέωση, χορηγήθηκε ενδοφλεβίως λεκτίνη σημασμένη με DyLight594. Φθορίζουσες εικόνες που δείχνουν χρώση λεκτίνης (κόκκινη) της αυλικής πλευράς των μικροαγγείων και φάγων (πράσινη) στον αυλό των τριχοειδών αγγείων και του περιαγγειακού εγκεφαλικού ιστού. Η ράβδος κλίμακας αντιστοιχεί σε 10 µm. (c, d) Το βιοτινυλιωμένο ανασταλτικό πεπτίδιο BACE1 μόνο του ή σε συνδυασμό με το βιοτινυλιωμένο πεπτίδιο διέλευσης #2077 συζεύχθηκε με στρεπταβιδίνη ακολουθούμενη από ενδοφλέβια ένεση σε τουλάχιστον τρεις καθετηριασμένους αρουραίους CM (10 mg στρεπταβιδίνης/kg). Η μείωση του Aβ40 που προκαλείται από τον αναστολέα του πεπτιδίου BACE1 μετρήθηκε με ELISA Aβ1-40 στο αίμα (κόκκινο) και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (πορτοκαλί) στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Για καλύτερη σαφήνεια, σχεδιάζεται μια διακεκομμένη γραμμή στο γράφημα σε κλίμακα 100%. (c) Ποσοστιαία μείωση του Aβ40 στο αίμα (κόκκινα τρίγωνα) και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (πορτοκαλί τρίγωνα) σε αρουραίους που έλαβαν θεραπεία με στρεπταβιδίνη συζευγμένη με το πεπτίδιο διέλευσης #2077 και το ανασταλτικό πεπτίδιο BACE1 σε αναλογία 3:1. (δ) Ποσοστιαία μείωση του Aβ40 στο αίμα (κόκκινοι κύκλοι) και του εγκεφαλονωτιαίου υγρού (πορτοκαλί κύκλοι) σε αρουραίους που έλαβαν θεραπεία μόνο με στρεπταβιδίνη συζευγμένη με ένα ανασταλτικό πεπτίδιο BACE1. Η συγκέντρωση Aβ στον έλεγχο ήταν 420 pg/ml (τυπική απόκλιση = 101 pg/ml).
Η απεικόνιση φάγων έχει εφαρμοστεί με επιτυχία σε διάφορους τομείς της βιοϊατρικής έρευνας17. Αυτή η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί για μελέτες αγγειακής ποικιλομορφίας in vivo18,19 καθώς και για μελέτες που στοχεύουν εγκεφαλικά αγγεία20,21,22,23,24,25,26. Σε αυτή τη μελέτη, επεκτείναμε την εφαρμογή αυτής της μεθόδου επιλογής όχι μόνο στην άμεση αναγνώριση πεπτιδίων που στοχεύουν εγκεφαλικά αγγεία, αλλά και στην ανακάλυψη υποψηφίων με ιδιότητες ενεργούς μεταφοράς για να διαπεράσουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. Τώρα περιγράφουμε την ανάπτυξη μιας διαδικασίας επιλογής in vivo σε διασωληνωμένους αρουραίους με CM και καταδεικνύουμε τη δυνατότητά της να αναγνωρίζει πεπτίδια με ιδιότητες οριοθέτησης στο ΕΝΥ. Χρησιμοποιώντας τον φάγο T7 που εμφανίζει μια βιβλιοθήκη 12-μερών τυχαίων πεπτιδίων, καταφέραμε να αποδείξουμε ότι ο φάγος T7 είναι αρκετά μικρός (περίπου 60 nm σε διάμετρο)10 για να προσαρμοστεί στον αιματοεγκεφαλικό φραγμό, διασχίζοντας έτσι απευθείας τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό ή το χοριοειδές πλέγμα. Παρατηρήσαμε ότι η συλλογή ΕΝΥ από καθετηριασμένους αρουραίους CM ήταν μια καλά ελεγχόμενη μέθοδος λειτουργικής διαλογής in vivo και ότι ο εκχυλισμένος φάγος όχι μόνο συνδέθηκε με το αγγειακό σύστημα αλλά λειτούργησε επίσης ως μεταφορέας διαμέσου του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Επιπλέον, συλλέγοντας ταυτόχρονα αίμα και εφαρμόζοντας HTS στο ΕΝΥ και σε φάγους που προέρχονται από το αίμα, επιβεβαιώσαμε ότι η επιλογή μας του ΕΝΥ δεν επηρεάστηκε από τον εμπλουτισμό του αίματος ή την καταλληλότητα για επέκταση μεταξύ των γύρων επιλογής. Ωστόσο, το διαμέρισμα αίματος είναι μέρος της διαδικασίας επιλογής, καθώς οι φάγοι που είναι ικανοί να φτάσουν στο διαμέρισμα του ΕΝΥ πρέπει να επιβιώσουν και να κυκλοφορήσουν στην κυκλοφορία του αίματος για αρκετό καιρό ώστε να εμπλουτιστούν στον εγκέφαλο. Προκειμένου να εξαχθούν αξιόπιστες πληροφορίες αλληλουχίας από ακατέργαστα δεδομένα HTS, εφαρμόσαμε φίλτρα προσαρμοσμένα σε σφάλματα αλληλούχισης ειδικά για την πλατφόρμα στη ροή εργασίας ανάλυσης. Ενσωματώνοντας κινητικές παραμέτρους στη μέθοδο διαλογής, επιβεβαιώσαμε την ταχεία φαρμακοκινητική των φάγων T7 άγριου τύπου (t½ ~ 28 λεπτά) στο αίμα24, 27, 28 και επίσης προσδιορίσαμε τον χρόνο ημιζωής τους στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (t½ ~ 26 λεπτά) ανά λεπτό. Παρά τα παρόμοια φαρμακοκινητικά προφίλ στο αίμα και το ΕΝΥ, μόνο το 0,001% της συγκέντρωσης φάγων στο αίμα μπορούσε να ανιχνευθεί στο ΕΝΥ, υποδεικνύοντας χαμηλή κινητικότητα υποβάθρου του άγριου τύπου φάγου Τ7 διαμέσου του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Αυτή η εργασία υπογραμμίζει τη σημασία του πρώτου γύρου επιλογής κατά τη χρήση στρατηγικών panning in vivo, ειδικά για συστήματα φάγων που απομακρύνονται ταχέως από την κυκλοφορία, καθώς λίγοι κλώνοι είναι σε θέση να φτάσουν στο διαμέρισμα του ΚΝΣ. Έτσι, στον πρώτο γύρο, η μείωση της ποικιλομορφίας της βιβλιοθήκης ήταν πολύ μεγάλη, καθώς μόνο ένας περιορισμένος αριθμός κλώνων συλλέχθηκε τελικά σε αυτό το πολύ αυστηρό μοντέλο ΕΝΥ. Αυτή η στρατηγική panning in vivo περιελάμβανε διάφορα βήματα επιλογής, όπως η ενεργή συσσώρευση στο διαμέρισμα του ΕΝΥ, η επιβίωση του κλώνου στο διαμέρισμα του αίματος και η ταχεία απομάκρυνση των κλώνων φάγων Τ7 από το αίμα εντός των πρώτων 10 λεπτών (Εικ. 1δ και Συμπληρωματικό Σχήμα 4Μ). Έτσι, μετά τον πρώτο γύρο, διαφορετικοί κλώνοι φάγων ταυτοποιήθηκαν στο ΕΝΥ, αν και η ίδια αρχική ομάδα χρησιμοποιήθηκε για μεμονωμένα ζώα. Αυτό υποδηλώνει ότι τα πολλαπλά αυστηρά βήματα επιλογής για βιβλιοθήκες πηγής με μεγάλο αριθμό μελών βιβλιοθήκης οδηγούν σε σημαντική μείωση της ποικιλομορφίας. Επομένως, τυχαία συμβάντα θα γίνουν αναπόσπαστο μέρος της αρχικής διαδικασίας επιλογής, επηρεάζοντας σε μεγάλο βαθμό το αποτέλεσμα. Είναι πιθανό ότι πολλοί από τους κλώνους στην αρχική βιβλιοθήκη είχαν μια πολύ παρόμοια τάση εμπλουτισμού ΕΝΥ. Ωστόσο, ακόμη και υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες, τα αποτελέσματα επιλογής ενδέχεται να διαφέρουν λόγω του μικρού αριθμού κάθε συγκεκριμένου κλώνου στην αρχική ομάδα.
Τα μοτίβα που εμπλουτίστηκαν σε ΕΝΥ διαφέρουν από αυτά στο αίμα. Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε την πρώτη μετατόπιση προς πεπτίδια πλούσια σε γλυκίνη στο αίμα μεμονωμένων ζώων. (Εικ. 1g, Συμπληρωματικά Σχήματα 4e, 4f). Οι φάγοι που περιέχουν πεπτίδια γλυκίνης μπορεί να είναι πιο σταθεροί και λιγότερο πιθανό να απομακρυνθούν από την κυκλοφορία. Ωστόσο, αυτά τα πεπτίδια πλούσια σε γλυκίνη δεν ανιχνεύθηκαν στα δείγματα εγκεφαλονωτιαίου υγρού, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι επιμελημένες βιβλιοθήκες πέρασαν από δύο διαφορετικά στάδια επιλογής: ένα στο αίμα και ένα άλλο αφέθηκε να συσσωρευτεί στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό. Οι εμπλουτισμένοι με ΕΝΥ κλώνοι που προέκυψαν από τον τέταρτο γύρο επιλογής έχουν δοκιμαστεί εκτενώς. Σχεδόν όλοι οι μεμονωμένοι κλώνοι που εξετάστηκαν επιβεβαιώθηκαν ότι ήταν εμπλουτισμένοι σε ΕΝΥ σε σύγκριση με τον φάγο ελέγχου κενού. Ένα πεπτιδικό αποτέλεσμα (#2077) εξετάστηκε λεπτομερέστερα. Έδειξε μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής στο πλάσμα σε σύγκριση με άλλα αποτελέσματα (Σχήμα 3d και Συμπληρωματικό Σχήμα 7) και, ενδιαφέροντως, αυτό το πεπτίδιο περιείχε ένα υπόλειμμα κυστεΐνης στο C-τελικό άκρο. Πρόσφατα έχει αποδειχθεί ότι η προσθήκη κυστεΐνης σε πεπτίδια μπορεί να βελτιώσει τις φαρμακοκινητικές τους ιδιότητες μέσω σύνδεσης με την αλβουμίνη 29. Αυτό είναι προς το παρόν άγνωστο για το πεπτίδιο #2077 και απαιτεί περαιτέρω μελέτη. Ορισμένα πεπτίδια έδειξαν μια εξάρτηση από το σθένος στον εμπλουτισμό του ΕΝΥ (δεδομένα δεν εμφανίζονται), η οποία μπορεί να σχετίζεται με την εμφανιζόμενη γεωμετρία επιφάνειας του καψιδίου Τ7. Το σύστημα Τ7 που χρησιμοποιήσαμε έδειξε 5-15 αντίγραφα κάθε πεπτιδίου ανά σωματίδιο φάγου. Η IHC πραγματοποιήθηκε σε υποψήφιους κλώνους φάγων-οδηγών που εγχύθηκαν ενδοφλεβίως στον εγκεφαλικό φλοιό αρουραίων (Συμπληρωματικό Σχήμα 8). Τα δεδομένα έδειξαν ότι τουλάχιστον τρεις κλώνοι (Αρ. 2002, Αρ. 2009 και Αρ. 2077) αλληλεπίδρασαν με το αιματοεγκεφαλικό φραγμό (BBB). Απομένει να προσδιοριστεί εάν αυτή η αλληλεπίδραση BBB έχει ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση ΕΝΥ ή την μετακίνηση αυτών των κλώνων απευθείας στο BCSFB. Σημαντικό είναι ότι δείχνουμε ότι τα επιλεγμένα πεπτίδια διατηρούν την ικανότητα μεταφοράς ΕΝΥ όταν συντίθενται και συνδέονται με το πρωτεϊνικό φορτίο. Η σύνδεση των Ν-τελικών βιοτινυλιωμένων πεπτιδίων με το SA ουσιαστικά επαναλαμβάνει τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με τους αντίστοιχους κλώνους φάγων τους στο αίμα και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό (Εικ. 3ε). Τέλος, δείχνουμε ότι το κύριο πεπτίδιο #2077 είναι ικανό να προάγει την εγκεφαλική δράση ενός αναστολέα βιοτινυλιωμένου πεπτιδίου του BACE1 συζευγμένου με SA, προκαλώντας έντονες φαρμακοδυναμικές επιδράσεις στο ΚΝΣ μειώνοντας σημαντικά τα επίπεδα Abeta40 στο ΕΝΥ (Εικ. 4). Δεν μπορέσαμε να εντοπίσουμε κανένα ομόλογο στη βάση δεδομένων πραγματοποιώντας αναζήτηση ομολογίας αλληλουχίας πεπτιδίων σε όλα τα αποτελέσματα. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι το μέγεθος της βιβλιοθήκης T7 είναι περίπου 109, ενώ το θεωρητικό μέγεθος της βιβλιοθήκης για τα 12-μερή είναι 4 x 1015. Επομένως, επιλέξαμε μόνο ένα μικρό κλάσμα του χώρου ποικιλομορφίας της βιβλιοθήκης 12-μερών πεπτιδίων, πράγμα που μπορεί να σημαίνει ότι μπορούν να αναγνωριστούν πιο βελτιστοποιημένα πεπτίδια αξιολογώντας τον παρακείμενο χώρο αλληλουχίας αυτών των αναγνωρισμένων αποτελεσμάτων. Υποθετικά, ένας από τους λόγους για τους οποίους δεν έχουμε βρει φυσικά ομόλογα αυτών των πεπτιδίων μπορεί να είναι η αποεπιλογή κατά τη διάρκεια της εξέλιξης για να αποτραπεί η ανεξέλεγκτη είσοδος ορισμένων πεπτιδικών μοτίβων στον εγκέφαλο.
Συνολικά, τα αποτελέσματά μας παρέχουν τη βάση για μελλοντική εργασία για την αναγνώριση και τον χαρακτηρισμό των συστημάτων μεταφοράς του εγκεφαλοαγγειακού φραγμού in vivo με μεγαλύτερη λεπτομέρεια. Η βασική ρύθμιση αυτής της μεθόδου βασίζεται σε μια στρατηγική λειτουργικής επιλογής που όχι μόνο αναγνωρίζει κλώνους με ιδιότητες δέσμευσης εγκεφαλικών αγγείων, αλλά περιλαμβάνει επίσης ένα κρίσιμο βήμα στο οποίο οι επιτυχημένοι κλώνοι έχουν εγγενή δραστηριότητα να διασχίζουν βιολογικά εμπόδια in vivo στο διαμέρισμα του ΚΝΣ. Είναι η διευκρίνιση του μηχανισμού μεταφοράς αυτών των πεπτιδίων και της προτίμησής τους για δέσμευση στο μικροαγγειακό σύστημα που είναι ειδικό για την περιοχή του εγκεφάλου. Αυτό μπορεί να οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων οδών για τη μεταφορά του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και των υποδοχέων. Αναμένουμε ότι τα αναγνωρισμένα πεπτίδια μπορούν να συνδεθούν άμεσα με εγκεφαλοαγγειακούς υποδοχείς ή με κυκλοφορούντες συνδέτες που μεταφέρονται μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού ή του BCSFB. Οι πεπτιδικοί φορείς με δραστηριότητα μεταφοράς στο ΕΝΥ που ανακαλύφθηκαν σε αυτή την εργασία θα διερευνηθούν περαιτέρω. Αυτή τη στιγμή διερευνούμε την εγκεφαλική εξειδίκευση αυτών των πεπτιδίων για την ικανότητά τους να διασχίζουν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό ή/και το BCSFB. Αυτά τα νέα πεπτίδια θα αποτελέσουν εξαιρετικά πολύτιμα εργαλεία για την πιθανή ανακάλυψη νέων υποδοχέων ή οδών και για την ανάπτυξη νέων, εξαιρετικά αποτελεσματικών πλατφορμών για την παροχή μακρομορίων, όπως βιολογικών, στον εγκέφαλο.
Διασωληνώστε τη μεγάλη δεξαμενή (CM) χρησιμοποιώντας μια τροποποίηση της προηγουμένως περιγραφείσας μεθόδου. Αναισθητοποιημένοι αρουραίοι Wistar (200-350 g) τοποθετήθηκαν σε στερεοταξική συσκευή και έγινε μια μέση τομή πάνω από το ξυρισμένο και ασηπτικά προετοιμασμένο τριχωτό της κεφαλής για να αποκαλυφθεί το κρανίο. Ανοίξτε δύο οπές στην περιοχή του άνω φύλλου και στερεώστε τις βίδες στερέωσης στις οπές. Μια επιπλέον οπή ανοιχθηκε στην πλάγια ινιακή ακρολοφία για στερεοτακτική καθοδήγηση μιας κάνουλας από ανοξείδωτο χάλυβα στην CM. Εφαρμόστε οδοντιατρικό τσιμέντο γύρω από την κάνουλα και στερεώστε την με βίδες. Μετά τη φωτοπολυμερισμό και τη σκλήρυνση με τσιμέντο, το δερματικό τραύμα κλείστηκε με ράμμα supramid 4/0. Η σωστή τοποθέτηση της κάνουλας επιβεβαιώνεται από αυθόρμητη διαρροή εγκεφαλονωτιαίου υγρού (CSF). Αφαιρέστε τον αρουραίο από τη στερεοταξική συσκευή, λάβετε κατάλληλη μετεγχειρητική φροντίδα και διαχείριση του πόνου και αφήστε τον να αναρρώσει για τουλάχιστον μία εβδομάδα μέχρι να παρατηρηθούν σημάδια αίματος στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό. Αρουραίοι Wistar (Crl:WI/Han) ελήφθησαν από το Charles River (Γαλλία). Όλοι οι αρουραίοι διατηρήθηκαν υπό συγκεκριμένες συνθήκες απαλλαγμένες από παθογόνα. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από το Κτηνιατρικό Γραφείο της πόλης της Βασιλείας, στην Ελβετία, και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με την Άδεια Ζώων Αρ. 2474 (Αξιολόγηση της Ενεργού Εγκεφαλικής Μεταφοράς με Μέτρηση Επιπέδων Θεραπευτικών Υποψήφιων στο Εγκεφαλονωτιαίο Υγρό και τον Εγκέφαλο του Αρουραίου).
Κρατήστε απαλά τον αρουραίο σε εγρήγορση με την κάνουλα CM στο χέρι. Αφαιρέστε το Datura από την κάνουλα και συλλέξτε 10 µl αυθόρμητης ροής εγκεφαλονωτιαίου υγρού. Δεδομένου ότι η βατότητα της κάνουλας τελικά διακυβεύτηκε, σε αυτή τη μελέτη συμπεριλήφθηκαν μόνο διαυγή δείγματα εγκεφαλονωτιαίου υγρού χωρίς ενδείξεις μόλυνσης ή αποχρωματισμού αίματος. Παράλληλα, ελήφθησαν περίπου 10-20 μl αίματος από μια μικρή τομή στην άκρη της ουράς σε σωλήνες με ηπαρίνη (Sigma-Aldrich). Το εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) και το αίμα συλλέχθηκαν σε διάφορα χρονικά σημεία μετά από ενδοφλέβια ένεση φάγου Τ7. Περίπου 5-10 μl υγρού απορρίφθηκαν πριν από τη συλλογή κάθε δείγματος ΕΝΥ, το οποίο αντιστοιχεί στον νεκρό όγκο του καθετήρα.
Οι βιβλιοθήκες δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας τον φορέα T7Select 10-3b όπως περιγράφεται στο εγχειρίδιο συστήματος T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Εν συντομία, συντέθηκε ένα τυχαίο ένθετο 12-μερούς DNA στην ακόλουθη μορφή:
Το κωδικόνιο NNK χρησιμοποιήθηκε για την αποφυγή διπλών κωδικονίων τερματισμού και υπερέκφρασης αμινοξέων στο ένθετο. Το N είναι μια χειροκίνητα αναμεμειγμένη ισομοριακή αναλογία κάθε νουκλεοτιδίου και το K είναι μια χειροκίνητα αναμεμειγμένη ισομοριακή αναλογία νουκλεοτιδίων αδενίνης και κυτοσίνης. Οι μονόκλωνες περιοχές μετατράπηκαν σε δίκλωνο DNA με περαιτέρω επώαση με dNTP (Novagen) και ένζυμο Klenow (New England Biolabs) σε ρυθμιστικό διάλυμα Klenow (New England Biolabs) για 3 ώρες στους 37°C. Μετά την αντίδραση, το δίκλωνο DNA ανακτήθηκε με καθίζηση EtOH. Το προκύπτον DNA υποβλήθηκε σε πέψη με ένζυμα περιορισμού EcoRI και HindIII (και τα δύο από τη Roche). Το διασπασμένο και καθαρισμένο ένθετο (QIAquick, Qiagen) (λιγάση Τ4, New England Biolabs) στη συνέχεια συνδέθηκε εντός πλαισίου σε έναν προ-διασπασμένο φορέα Τ7 μετά το αμινοξύ 348 του γονιδίου καψιδίου 10Β. Οι αντιδράσεις σύνδεσης επωάστηκαν στους 16°C για 18 ώρες πριν από τη συσκευασία in vitro. Η συσκευασία φάγων in vitro πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται με το κιτ κλωνοποίησης T7Select 10-3b (Novagen) και το διάλυμα συσκευασίας ενισχύθηκε μία φορά μέχρι λύσης χρησιμοποιώντας Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Τα λύματα φυγοκεντρήθηκαν, τιτλοδοτήθηκαν και καταψύχθηκαν στους -80°C ως μητρικό διάλυμα γλυκερόλης.
Άμεση ενίσχυση PCR μεταβλητών περιοχών φάγων που ενισχυθούν σε ζωμό ή πλάκα χρησιμοποιώντας ιδιόκτητους εκκινητές σύντηξης 454/Roche-amplicon. Ο εκκινητής πρόσθιας σύντηξης περιέχει αλληλουχίες που πλαισιώνουν την μεταβλητή περιοχή (NNK) 12 (ειδική για το πρότυπο), τον προσαρμογέα τιτανίου GS FLX A και μια αλληλουχία κλειδιού βιβλιοθήκης τεσσάρων βάσεων (TCAG) (Συμπληρωματικό Σχήμα 1α):
Ο εκκινητής αντίστροφης σύντηξης περιέχει επίσης βιοτίνη προσαρτημένη σε σφαιρίδια σύλληψης και τον προσαρμογέα τιτανίου GS FLX Titanium Adapter B που απαιτείται για την κλωνική ενίσχυση κατά τη διάρκεια της PCR γαλακτώματος:
Τα αμπλικόνια υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε πυροαλληλούχιση 454/Roche σύμφωνα με το πρωτόκολλο 454 GS-FLX Titanium. Για χειροκίνητη αλληλούχιση Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), το DNA του φάγου T7 ενισχύθηκε με PCR και αλληλουχήθηκε με τα ακόλουθα ζεύγη εκκινητών:
Τα ένθετα από μεμονωμένες πλάκες υποβλήθηκαν σε ενίσχυση PCR χρησιμοποιώντας το κιτ Roche Fast Start DNA Polymerase (σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή). Εκτελέστε μια θερμή εκκίνηση (10 λεπτά στους 95 °C) και 35 κύκλους ενίσχυσης (50 δευτερόλεπτα στους 95 °C, 1 λεπτό στους 50 °C και 1 λεπτό στους 72 °C).
Φάγοι από βιβλιοθήκες, φάγοι άγριου τύπου, φάγοι που διασώθηκαν από ΕΝΥ και αίμα ή μεμονωμένοι κλώνοι ενισχύθηκαν σε Escherichia coli BL5615 σε ζωμό TB (Sigma Aldrich) ή σε τρυβλία 500 cm2 (Thermo Scientific) για 4 ώρες στους 37°C. Οι φάγοι εκχυλίστηκαν από τις πλάκες ξεπλένοντας τις πλάκες με ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA (Fluka Analytical) ή συλλέγοντας τις πλάκες με αποστειρωμένες άκρες πιπέτας. Οι φάγοι απομονώθηκαν από το υπερκείμενο καλλιέργειας ή το ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης με έναν γύρο καθίζησης πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG 8000) (Promega) και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA.
Ο ενισχυμένος φάγος υποβλήθηκε σε 2-3 γύρους απομάκρυνσης ενδοτοξίνης χρησιμοποιώντας σφαιρίδια απομάκρυνσης ενδοτοξίνης (Miltenyi Biotec) πριν από την ενδοφλέβια (IV) ένεση (500 μl/ζώο). Στον πρώτο γύρο, εισήχθησαν 2×1012 φάγοι. στον δεύτερο, 2×1010 φάγοι. στον τρίτο και τέταρτο γύρο επιλογής, 2×109 φάγοι ανά ζώο. Η περιεκτικότητα σε φάγους στο ΕΝΥ και στα δείγματα αίματος που συλλέχθηκαν στα αναφερόμενα χρονικά σημεία προσδιορίστηκε με καταμέτρηση πλακών σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (εγχειρίδιο συστήματος T7Select). Η επιλογή φάγων πραγματοποιήθηκε με ενδοφλέβια ένεση καθαρισμένων βιβλιοθηκών στην ουραία φλέβα ή με επανέγχυση φάγου που εξήχθη από το ΕΝΥ από τον προηγούμενο γύρο επιλογής και οι επακόλουθες συλλογές πραγματοποιήθηκαν στα 10 λεπτά, 30 λεπτά, 60 λεπτά, 90 λεπτά, 120 λεπτά, 180 λεπτά και 240 λεπτά αντίστοιχα σε δείγματα ΕΝΥ και αίματος. Διεξήχθησαν συνολικά τέσσερις γύροι in vivo panning, στους οποίους οι δύο επιλεγμένοι κλάδοι αποθηκεύτηκαν ξεχωριστά και αναλύθηκαν κατά τη διάρκεια των τριών πρώτων γύρων επιλογής. Όλα τα ένθετα φάγων που εξήχθησαν από το ΕΝΥ από τους δύο πρώτους γύρους επιλογής υποβλήθηκαν σε πυροαλληλούχιση 454/Roche, ενώ όλοι οι κλώνοι που εξήχθησαν από το ΕΝΥ από τους δύο τελευταίους γύρους επιλογής υποβλήθηκαν σε χειροκίνητη αλληλούχιση. Όλοι οι φάγοι αίματος από τον πρώτο γύρο επιλογής υποβλήθηκαν επίσης σε πυροαλληλούχιση 454/Roche. Για την έγχυση κλώνων φάγων, οι επιλεγμένοι φάγοι ενισχύθηκαν σε E. coli (BL5615) σε πλάκες 500 cm2 στους 37°C για 4 ώρες. Οι κλώνοι που επιλέχθηκαν ξεχωριστά και αλληλουχήθηκαν χειροκίνητα πολλαπλασιάστηκαν σε μέσο TB. Μετά την εκχύλιση φάγων, τον καθαρισμό και την απομάκρυνση της ενδοτοξίνης (όπως περιγράφεται παραπάνω), 2×1010 φάγοι/ζώο σε 300 μl εγχύθηκαν ενδοφλεβίως σε μία ουραία φλέβα.
Προεπεξεργασία και ποιοτικό φιλτράρισμα δεδομένων αλληλουχίας. Τα ακατέργαστα δεδομένα 454/Roche μετατράπηκαν από μια δυαδική τυποποιημένη μορφή χάρτη ροής (sff) σε μια μορφή Pearson αναγνώσιμη από τον άνθρωπο (fasta) χρησιμοποιώντας λογισμικό του προμηθευτή. Περαιτέρω επεξεργασία της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ιδιόκτητα προγράμματα και σενάρια C (ακυκλοφόρητο πακέτο λογισμικού) όπως περιγράφεται παρακάτω. Η ανάλυση των πρωτογενών δεδομένων περιλαμβάνει αυστηρές διαδικασίες φιλτραρίσματος πολλαπλών σταδίων. Για να φιλτραριστούν οι αναγνώσεις που δεν περιείχαν μια έγκυρη αλληλουχία DNA ενθέματος 12μερούς, οι αναγνώσεις ευθυγραμμίστηκαν διαδοχικά με την ετικέτα έναρξης (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), την ετικέτα λήξης (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) και το ένθετο φόντου (CCCTGCAGGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) χρησιμοποιώντας τη συνολική δοκιμή Needleman-Wunsch. Η ευθυγράμμιση επιτρέπει έως και 2 ασυνέπειες ανά ευθυγράμμιση31. Επομένως, οι αναγνώσεις χωρίς ετικέτες έναρξης και λήξης και οι αναγνώσεις που περιέχουν ένθετα φόντου, δηλαδή, ευθυγραμμίσεις που υπερβαίνουν τον επιτρεπόμενο αριθμό αναντιστοιχιών, αφαιρέθηκαν από τη βιβλιοθήκη. Όσον αφορά τις υπόλοιπες αναγνώσεις, η αλληλουχία N-mer DNA που εκτείνεται από το σημάδι έναρξης και τελειώνει πριν από το σημάδι λήξης αφαιρέθηκε από την αρχική αλληλουχία ανάγνωσης και υποβλήθηκε σε περαιτέρω επεξεργασία (εφεξής αναφέρεται ως «ένθετο»). Μετά τη μετάφραση του ενθέματος, το τμήμα μετά το πρώτο κωδικόνιο λήξης στο άκρο 5' του εκκινητή αφαιρείται από το ένθετο. Επιπλέον, αφαιρέθηκαν επίσης τα νουκλεοτίδια που οδηγούν σε ατελή κωδικόνια στο άκρο 3' του εκκινητή. Για να αποκλειστούν τα ένθετα που περιέχουν μόνο αλληλουχίες υποβάθρου, αφαιρέθηκαν επίσης τα μεταφρασμένα ένθετα που ξεκινούν με το πρότυπο αμινοξέων «PAG». Πεπτίδια με μετα-μεταφραστικό μήκος μικρότερο από 3 αμινοξέα αφαιρέθηκαν από τη βιβλιοθήκη. Τέλος, αφαιρέθηκε ο πλεονασμός στην ομάδα ενθέτων και προσδιορίστηκε η συχνότητα κάθε μοναδικού ενθέτου. Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης περιελάμβαναν μια λίστα αλληλουχιών νουκλεοτιδίων (ένθετα) και τις συχνότητες (ανάγνωσής) τους (Συμπληρωματικά Σχήματα 1c και 2).
Εισαγωγές DNA ομάδας N-mer κατά ομοιότητα αλληλουχίας: Για την εξάλειψη σφαλμάτων αλληλούχισης ειδικά για το 454/Roche (όπως προβλήματα με την αλληλούχιση επεκτάσεων ομοπολυμερούς) και την αφαίρεση λιγότερο σημαντικών πλεονασμάτων, οι προηγουμένως φιλτραρισμένες εισαγωγές αλληλουχίας DNA N-mer (εισαγωγές) ταξινομούνται κατά ομοιότητα. Εισαγωγές (επιτρέπονται έως 2 μη ταιριαστές βάσεις) χρησιμοποιώντας έναν επαναληπτικό αλγόριθμο που ορίζεται ως εξής: οι εισαγωγές ταξινομούνται πρώτα κατά τη συχνότητά τους (από την υψηλότερη στη χαμηλότερη) και, εάν είναι ίδιες, κατά τη δευτερεύουσα, ταξινομούνται κατά μήκος (από τη μεγαλύτερη στη μικρότερη). Έτσι, οι πιο συχνές και μεγαλύτερες εισαγωγές ορίζουν την πρώτη «ομάδα». Η συχνότητα της ομάδας ορίζεται στη συχνότητα κλειδιού. Στη συνέχεια, κάθε εισαγωγή που απομένει στην ταξινομημένη λίστα επιχειρήθηκε να προστεθεί στην ομάδα με ζεύγη ευθυγράμμισης Needleman-Wunsch. Εάν ο αριθμός των αναντιστοιχιών, εισαγωγών ή διαγραφών σε μια ευθυγράμμιση δεν υπερβαίνει το όριο του 2, προστίθεται μια εισαγωγή στην ομάδα και η συνολική συχνότητα της ομάδας αυξάνεται κατά τη συχνότητα προσθήκης της εισαγωγής. Τα ένθετα που προστίθενται σε μια ομάδα επισημαίνονται ως χρησιμοποιημένα και εξαιρούνται από περαιτέρω επεξεργασία. Εάν η αλληλουχία εισαγωγής δεν μπορεί να προστεθεί σε μια ήδη υπάρχουσα ομάδα, η αλληλουχία εισαγωγής χρησιμοποιείται για τη δημιουργία μιας νέας ομάδας με την κατάλληλη συχνότητα εισαγωγής και επισημαίνεται ως χρησιμοποιημένη. Η επανάληψη τελειώνει όταν κάθε αλληλουχία εισαγωγής έχει είτε χρησιμοποιηθεί για να σχηματίσει μια νέα ομάδα είτε μπορεί να συμπεριληφθεί σε μια ήδη υπάρχουσα ομάδα. Άλλωστε, τα ομαδοποιημένα ένθετα που αποτελούνται από νουκλεοτίδια τελικά μεταφράζονται σε αλληλουχίες πεπτιδίων (βιβλιοθήκες πεπτιδίων). Το αποτέλεσμα αυτής της ανάλυσης είναι ένα σύνολο εισαγωγών και οι αντίστοιχες συχνότητές τους που αποτελούν τον αριθμό των διαδοχικών αναγνώσεων (Συμπληρωματικό Σχήμα 2).
Δημιουργία Μοτίβου: Με βάση μια λίστα μοναδικών πεπτιδίων, δημιουργήθηκε μια βιβλιοθήκη που περιέχει όλα τα πιθανά μοτίβα αμινοξέων (aa) όπως φαίνεται παρακάτω. Κάθε πιθανό μοτίβο μήκους 3 εξήχθη από το πεπτίδιο και το αντίστροφό του μοτίβο προστέθηκε μαζί με μια κοινή βιβλιοθήκη μοτίβων που περιέχει όλα τα μοτίβα (τριπεπτίδια). Οι βιβλιοθήκες εξαιρετικά επαναλαμβανόμενων μοτίβων αλληλουχήθηκαν και αφαιρέθηκε ο πλεονασμός. Στη συνέχεια, για κάθε τριπεπτίδιο στη βιβλιοθήκη μοτίβων, ελέγξαμε την παρουσία του στη βιβλιοθήκη χρησιμοποιώντας υπολογιστικά εργαλεία. Σε αυτήν την περίπτωση, η συχνότητα του πεπτιδίου που περιέχει το τριπεπτίδιο μοτίβου που βρέθηκε προστίθεται και αντιστοιχίζεται στο μοτίβο στη βιβλιοθήκη μοτίβων («αριθμός μοτίβων»). Το αποτέλεσμα της δημιουργίας μοτίβου είναι ένας δισδιάστατος πίνακας που περιέχει όλες τις εμφανίσεις τριπεπτιδίων (μοτίβων) και τις αντίστοιχες τιμές τους, οι οποίες είναι ο αριθμός των αναγνώσεων αλληλούχισης που έχουν ως αποτέλεσμα το αντίστοιχο μοτίβο όταν οι αναγνώσεις φιλτράρονται, ομαδοποιούνται και μεταφράζονται. Μετρήσεις όπως περιγράφονται λεπτομερώς παραπάνω.
Κανονικοποίηση του αριθμού των μοτίβων και των αντίστοιχων διαγραμμάτων διασποράς: Ο αριθμός των μοτίβων για κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας
όπου ni είναι ο αριθμός των αναγνώσεων που περιέχουν το θέμα i. Έτσι, το vi αντιπροσωπεύει την ποσοστιαία συχνότητα των αναγνώσεων (ή πεπτιδίων) που περιέχουν το μοτίβο i στο δείγμα. Οι τιμές P για τον μη κανονικοποιημένο αριθμό μοτίβων υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ Fisher. Όσον αφορά τα συσχετίσεις του αριθμού των μοτίβων, οι συσχετίσεις Spearman υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον κανονικοποιημένο αριθμό μοτίβων με R.
Για την οπτικοποίηση της περιεκτικότητας σε αμινοξέα σε κάθε θέση στη βιβλιοθήκη πεπτιδίων, δημιουργήθηκαν τα διαδικτυακά λογότυπα 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Αρχικά, η περιεκτικότητα σε αμινοξέα σε κάθε θέση του 12-μερούς πεπτιδίου αποθηκεύεται σε έναν πίνακα 20×12. Στη συνέχεια, ένα σύνολο 1000 πεπτιδίων που περιέχουν την ίδια σχετική περιεκτικότητα σε αμινοξέα σε κάθε θέση δημιουργείται σε μορφή fasta-sequence και παρέχεται ως είσοδος στο web-logo 3, το οποίο δημιουργεί μια γραφική αναπαράσταση της σχετικής περιεκτικότητας σε αμινοξέα σε κάθε θέση για μια δεδομένη βιβλιοθήκη πεπτιδίων. Για την οπτικοποίηση πολυδιάστατων συνόλων δεδομένων, δημιουργήθηκαν χάρτες θερμότητας χρησιμοποιώντας ένα εσωτερικά αναπτυγμένο εργαλείο στην R (biosHeatmap, ένα πακέτο R που δεν έχει κυκλοφορήσει ακόμη). Τα δενδρογράμματα που παρουσιάζονται στους χάρτες θερμότητας υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ιεραρχικής ομαδοποίησης του Ward με τη μετρική Ευκλείδειας απόστασης. Για στατιστική ανάλυση των δεδομένων βαθμολόγησης μοτίβων, οι τιμές P για μη κανονικοποιημένη βαθμολόγηση υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher. Οι τιμές P για άλλα σύνολα δεδομένων υπολογίστηκαν σε R χρησιμοποιώντας το t-test του Student ή ANOVA.
Επιλεγμένοι κλώνοι φάγων και φάγοι χωρίς ένθετα εγχύθηκαν ενδοφλεβίως μέσω της ουραίας φλέβας (2×1010 φάγοι/ζώο σε 300 μl PBS). Δέκα λεπτά πριν από την έγχυση και την επακόλουθη στερέωση, στα ίδια ζώα εγχύθηκαν ενδοφλεβίως 100 μl λεκτίνης επισημασμένης με DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 λεπτά μετά την έγχυση φάγων, οι αρουραίοι έλαβαν 50 ml PBS και στη συνέχεια 50 ml 4% PFA/PBS μέσω της καρδιάς. Δείγματα εγκεφάλου σταθεροποιήθηκαν επιπλέον όλη τη νύχτα σε 4% PFA/PBS και εμποτίστηκαν σε 30% σακχαρόζη όλη τη νύχτα στους 4°C. Τα δείγματα καταψύχονται στιγμιαία στο μείγμα OCT. Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση των κατεψυγμένων δειγμάτων πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου σε κρυοτομές 30 µm μπλοκαρισμένες με 1% BSA και επωασμένες με πολυκλωνικά αντισώματα επισημασμένα με FITC κατά του φάγου Τ7 (Novus NB 600-376A) στους 4°C. Επωάστε όλη τη νύχτα. Τέλος, οι τομές πλύθηκαν 3 φορές με PBS και εξετάστηκαν με ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ (Leica TCS SP5).
Όλα τα πεπτίδια με ελάχιστη καθαρότητα 98% συντέθηκαν από την GenScript USA, βιοτινυλιώθηκαν και λυοφιλοποιήθηκαν. Η βιοτίνη συνδέεται μέσω ενός επιπλέον τριπλού διαχωριστή γλυκίνης στο Ν-τελικό άκρο. Ελέγξτε όλα τα πεπτίδια χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας.
Η στρεπταβιδίνη (Sigma S0677) αναμίχθηκε με 5πλάσια ισομοριακή περίσσεια βιοτινυλιωμένου πεπτιδίου, βιοτινυλιωμένου ανασταλτικού πεπτιδίου BACE1 ή συνδυασμού (αναλογία 3:1) βιοτινυλιωμένου ανασταλτικού πεπτιδίου BACE1 και ανασταλτικού πεπτιδίου BACE1 σε 5-10% DMSO/επωάστηκε σε PBS. 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την ένεση. Τα συζευγμένα με στρεπταβιδίνη πεπτίδια εγχύθηκαν ενδοφλεβίως σε δόση 10 mg/kg σε μία από τις ουραίες φλέβες αρουραίων με εγκεφαλική κοιλότητα.
Η συγκέντρωση των συμπλόκων στρεπταβιδίνης-πεπτιδίου αξιολογήθηκε με ELISA. Πλάκες μικροτιτλοδότησης Nunc Maxisorp (Sigma) επικαλύφθηκαν όλη τη νύχτα στους 4°C με 1,5 μg/ml αντίσωμα ποντικού κατά της στρεπταβιδίνης (Thermo, MA1-20011). Μετά τον αποκλεισμό (ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% ζελατίνη, 1% BSA) σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες, πλύθηκε η πλάκα με 0,05% Tween-20/PBS (ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης) για 3 δευτερόλεπτα, δείγματα ΕΝΥ και πλάσματος προστέθηκαν σε φρεάτια αραιωμένα με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού (πλάσμα 1:10.000, CSF 1:115). Η πλάκα στη συνέχεια επωάστηκε όλη τη νύχτα στους 4°C με αντίσωμα ανίχνευσης (1 μg/ml, αντι-στρεπταβιδίνη-HRP, Novus NB120-7239). Μετά από τρία βήματα πλύσης, η στρεπταβιδίνη ανιχνεύθηκε με επώαση σε διάλυμα υποστρώματος TMB (Roche) για έως και 20 λεπτά. Μετά τη διακοπή της ανάπτυξης χρώματος με 1M H2SO4, μετρήστε την απορρόφηση στα 450 nm.
Η λειτουργία του συμπλόκου στρεπταβιδίνης-πεπτιδίου-αναστολέα BACE1 αξιολογήθηκε με ELISA Aβ(1-40) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Wako, 294-64701). Εν συντομία, δείγματα ΕΝΥ αραιώθηκαν σε πρότυπο αραιωτικό (1:23) και επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4°C σε πλάκες 96 φρεατίων επικαλυμμένες με αντίσωμα δέσμευσης BNT77. Μετά από πέντε βήματα πλύσης, προστέθηκε αντίσωμα BA27 συζευγμένο με HRP και επωάστηκε για 2 ώρες στους 4°C, ακολουθούμενο από πέντε βήματα πλύσης. Το Aβ(1–40) ανιχνεύθηκε με επώαση σε διάλυμα TMB για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αφού διακοπεί η ανάπτυξη χρώματος με διάλυμα διακοπής, μετρήστε την απορρόφηση στα 450 nm. Τα δείγματα πλάσματος υποβλήθηκαν σε εκχύλιση στερεάς φάσης πριν από την ELISA Aβ(1–40). Το πλάσμα προστέθηκε σε 0,2% DEA (Sigma) σε πλάκες 96 φρεατίων και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Μετά από διαδοχικό πλύσιμο των πλακών SPE (Oasis, 186000679) με νερό και 100% μεθανόλη, προστέθηκαν δείγματα πλάσματος στις πλάκες SPE και απομακρύνθηκε όλο το υγρό. Τα δείγματα πλύθηκαν (πρώτα με 5% μεθανόλη και στη συνέχεια με 30% μεθανόλη) και εκλούστηκαν με 2% NH4OH/90% μεθανόλη. Μετά από ξήρανση του εκλούσματος στους 55°C για 99 λεπτά με σταθερό ρεύμα N2, τα δείγματα ανάχθηκαν σε πρότυπα αραιωτικά και μετρήθηκε το Aβ(1–40) όπως περιγράφεται παραπάνω.
Πώς να αναφέρετε αυτό το άρθρο: Urich, E. et al. Παράδοση φορτίου στον εγκέφαλο χρησιμοποιώντας πεπτίδια διαμετακόμισης που εντοπίστηκαν in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB και Moos T. Χορήγηση μακρομοριακών φαρμάκων στον εγκέφαλο χρησιμοποιώντας στοχευμένη θεραπεία. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., και Martinez-Martinez, P. Χορήγηση πεπτιδικών και πρωτεϊνικών φαρμάκων διαμέσου του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Ο αιματοεγκεφαλικός φραγμός: ένα εμπόδιο στην ανάπτυξη φαρμάκων για τον εγκέφαλο. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, και Byrd, A. Προοπτικές για βελτιωμένη χορήγηση και στόχευση φαρμάκων στον εγκέφαλο μέσω της οδού χοριοειδούς πλέγματος-ΕΝΥ. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Εκσυγχρονισμός βιοφαρμακευτικών προϊόντων με μοριακούς δούρειους ίππους για χορήγηση στον εγκέφαλο. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, μεταφορά πεπτιδίων μέσω υποδοχέα WM διαμέσου του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Αύξηση της διείσδυσης στον εγκέφαλο και της αποτελεσματικότητας των θεραπευτικών αντισωμάτων χρησιμοποιώντας μονοσθενή μοριακά οχήματα. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Η μεταφορά του υποδοχέα τρανσφερίνης (TfR) καθορίζει την πρόσληψη από τον εγκέφαλο παραλλαγών συγγένειας των αντισωμάτων TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).