Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. Məhdud CSS dəstəyi olan brauzer versiyasından istifadə edirsiniz. Ən yaxşı təcrübə üçün yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyinizi (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq Rejimini deaktiv etməyinizi) tövsiyə edirik. Bundan əlavə, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı stillər və JavaScript olmadan göstəririk.
Eyni anda üç slayddan ibarət karuseli göstərir. Bir anda üç slayd arasında hərəkət etmək üçün Əvvəlki və Növbəti düymələrindən, yaxud bir anda üç slayd arasında hərəkət etmək üçün sonundakı sürgü düymələrindən istifadə edin.
Qan-beyin baryeri və qan-beyin baryeri bioterapevtik agentlərin mərkəzi sinir sistemindəki hədəflərinə çatmasının qarşısını alır və bununla da nevroloji xəstəliklərin effektiv müalicəsinə mane olur. Yeni beyin daşıyıcılarını in vivo kəşf etmək üçün T7 faq peptid kitabxanasını təqdim etdik və siçovulların kanülləşdirilmiş şüurlu böyük hovuz modelini istifadə edərək ardıcıl olaraq qan və onurğa beyni mayesini (OBM) topladıq. Dörd raund seçimdən sonra spesifik faq klonları OBM ilə yüksək dərəcədə zənginləşdirildi. Fərdi namizəd peptidlərin sınaqdan keçirilməsi OBM-də 1000 dəfədən çox zənginləşmə aşkar etdi. Peptid vasitəçiliyi ilə beyinə çatdırılmanın bioaktivliyi, müəyyən edilmiş yeni tranzit peptidi ilə əlaqəli BACE1 peptid inhibitorundan istifadə edərək onurğa beyni mayesində amiloid-β səviyyəsində 40% azalma ilə təsdiqləndi. Bu nəticələr göstərir ki, in vivo faq seçim metodları ilə müəyyən edilmiş peptidlər makromolekulların beyinə terapevtik təsir göstərən sistemli çatdırılması üçün faydalı vasitələr ola bilər.
Mərkəzi sinir sistemi (MSS) hədəf terapiyası tədqiqatları əsasən MSS-i hədəf alan xüsusiyyətlər nümayiş etdirən optimallaşdırılmış dərmanların və agentlərin müəyyən edilməsinə yönəlmişdir və beyinə aktiv dərman çatdırılmasını təmin edən mexanizmləri kəşf etməyə daha az səy göstərilmişdir. Dərman çatdırılması, xüsusən də böyük molekullar müasir nevrologiya dərmanlarının inkişafının ayrılmaz hissəsi olduğundan, bu, indi dəyişməyə başlayır. Mərkəzi sinir sisteminin mühiti qan-beyin baryeri (BBB) ​​və qan-beyin baryeri (BCBB)1-dən ibarət olan beyin-damar baryeri sistemi ilə yaxşı qorunur və bu da dərmanların beyinə çatdırılmasını çətinləşdirir1,2. Demək olar ki, bütün böyük molekullu dərmanların və kiçik molekullu dərmanların 98%-dən çoxunun beyindən xaric edildiyi təxmin edilir3. Buna görə də terapevtik dərmanların MSS-ə səmərəli və spesifik çatdırılmasını təmin edən yeni beyin nəqliyyat sistemlərini müəyyən etmək çox vacibdir4,5. Bununla belə, BBB və BCSFB də geniş damar sistemi vasitəsilə beynin bütün strukturlarına nüfuz edərək daxil olduqları üçün dərman çatdırılması üçün əla fürsət təqdim edir. Beləliklə, beyinə qeyri-invaziv çatdırılma metodlarından istifadə etmək üçün hazırkı səylər əsasən endogen BBB6 reseptorundan istifadə edərək reseptor vasitəçiliyi ilə daşınma (PMT) mexanizminə əsaslanır. Transferrin reseptor yolundan istifadə etməklə bağlı son əsas irəliləyişlərə baxmayaraq7,8, təkmilləşdirilmiş xüsusiyyətlərə malik yeni çatdırılma sistemlərinin daha da inkişaf etdirilməsi tələb olunur. Bu məqsədlə məqsədimiz CSF daşınmasını vasitəçilik edə bilən peptidləri müəyyən etmək idi, çünki onlar prinsipcə makromolekulları MSS-ə çatdırmaq və ya yeni reseptor yollarını açmaq üçün istifadə edilə bilər. Xüsusilə, beyin-damar sisteminin spesifik reseptorları və daşıyıcıları (BBB və BSCFB) bioterapevtik dərmanların aktiv və spesifik çatdırılması üçün potensial hədəflər kimi xidmət edə bilər. Onurğa-beyin mayesi (BBM) xoroid pleksusunun (CS) sekretor məhsuludur və subaraxnoid boşluq və mədəcik boşluğu vasitəsilə beynin interstisial mayesi ilə birbaşa təmasdadır4. Bu yaxınlarda subaraxnoid onurğa-beyin mayesinin beynin interstisial boşluğuna həddindən artıq yayıldığı göstərilmişdir9. Ümid edirik ki, parenximal boşluğa bu subaraxnoid axın yolundan və ya birbaşa BBB vasitəsilə daxil ola bilərik. Buna nail olmaq üçün bu iki fərqli yolun hər hansı biri ilə daşınan peptidləri ideal şəkildə müəyyən edən güclü in vivo faq seçim strategiyası tətbiq etdik.
İndi ən yüksək kitabxana müxtəlifliyi ilə ilkin seçim turlarını izləmək üçün yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığı (HTS) ilə birlikdə CSF nümunəsi ilə ardıcıl in vivo faj displey skrininq metodunu təsvir edirik. Skrininq qan çirklənməsinin qarşısını almaq üçün daimi olaraq implantasiya edilmiş böyük sisterna (CM) kanüllü şüurlu siçovullar üzərində aparılmışdır. Əhəmiyyətli olan odur ki, bu yanaşma həm beyin hədəfləməsini, həm də beyin-damar baryerindən nəqliyyat aktivliyinə malik peptidləri seçir. Kiçik ölçülərinə (~60 nm)10 görə T7 faqlarından istifadə etdik və endotel və/və ya epitelial-medulla baryerinin hüceyrədaxili keçidinə imkan verən veziküllərin daşınması üçün uyğun olduqlarını irəli sürdük. Dörd raund panningdən sonra güclü in vivo CSF ​​zənginləşməsi və beyin mikrodamar assosiasiyası göstərən faj populyasiyaları təcrid edildi. Əhəmiyyətli olan odur ki, üstünlük verilən və kimyəvi cəhətdən sintez edilmiş ən yaxşı namizəd peptidlərin protein yükünü beyin-onurğa mayesinə daşıya bildiyini nümayiş etdirərək tapıntılarımızı təsdiqləyə bildik. Əvvəlcə, MSS-in farmakodinamik təsirləri aparıcı tranzit peptidi BACE1 peptidinin inhibitoru ilə birləşdirilməklə müəyyən edilmişdir. In vivo funksional skrininq strategiyalarının yeni beyin nəqliyyatı peptidlərini effektiv protein yük daşıyıcıları kimi müəyyən edə biləcəyini nümayiş etdirməklə yanaşı, oxşar funksional seçim yanaşmalarının da yeni beyin nəqliyyatı yollarının müəyyən edilməsində vacib olacağını gözləyirik.
Lövhə əmələ gətirən vahidlərə (PFU) əsaslanaraq, faq qablaşdırma mərhələsindən sonra, təxminən 109 müxtəlifliyə malik təsadüfi 12-mer xətti T7 faq peptidlərindən ibarət kitabxana dizayn edilmiş və yaradılmışdır (bax: Materiallar və Metodlar). Qeyd etmək vacibdir ki, in vivo panningdən əvvəl bu kitabxananı diqqətlə təhlil etmişik. Modifikasiya edilmiş praymerlərdən istifadə edərək faq kitabxanası nümunələrinin PCR gücləndirilməsi HTS-ə birbaşa tətbiq olunan amplikonlar yaratdı (Əlavə Şəkil 1a). a) HTS11 ardıcıllıq səhvləri, b) praymerlərin (NNK)1-12 keyfiyyətinə təsiri və c) gözləmə kitabxanasında vəhşi tipli (çəki) faqın (skelet əlavələri) olması səbəbindən yalnız təsdiqlənmiş ardıcıllıq məlumatlarını çıxarmaq üçün ardıcıllıq filtrləmə proseduru tətbiq edilmişdir (Əlavə Şəkil 1b). Bu filtr addımları bütün HTS ardıcıllıq kitabxanalarına tətbiq olunur. Standart kitabxana üçün cəmi 233.868 oxunuş əldə edildi, bunlardan 39%-i filtr meyarlarından keçdi və sonrakı turlar üçün kitabxana təhlili və seçimi üçün istifadə edildi (Əlavə Şəkil 1c–e). Oxunmalar əsasən 36 nukleotiddə zirvəsi olan 3 əsas cütün çoxluqları idi (Əlavə Şəkil 1c), bu da kitabxana dizaynını (NNK) 1-12 təsdiqləyir. Qeyd etmək lazımdır ki, kitabxana üzvlərinin təxminən 11%-i 12 ölçülü vəhşi tipli (çəki) onurğa PAGISRELVDKL əlavəsinə malik idi və ardıcıllıqların demək olar ki, yarısı (49%) əlavələr və ya silinmələr ehtiva edirdi. Kitabxana kitabxanasının HTS-i kitabxanadakı peptidlərin yüksək müxtəlifliyini təsdiqlədi: peptid ardıcıllıqlarının 81%-dən çoxu yalnız bir dəfə tapıldı və yalnız 1,5%-i ≥4 nüsxədə meydana gəldi (Əlavə Şəkil 2a). Repertuardakı bütün 12 mövqedəki amin turşularının (aa) tezlikləri degenerasiya olunmuş NKK repertuarı tərəfindən yaradılan kodonların sayı üçün gözlənilən tezliklərlə yaxşı korrelyasiya göstərdi (Əlavə Şəkil 2b). Bu əlavələr tərəfindən kodlanan aa qalıqlarının müşahidə edilən tezliyi hesablanmış tezliklə yaxşı korrelyasiya göstərdi (r = 0.893) (Əlavə Şəkil 2c). Faq kitabxanalarının inyeksiya üçün hazırlanması endotoksinin gücləndirilməsi və çıxarılması mərhələlərini əhatə edir. Bunun əvvəllər faq kitabxanalarının müxtəlifliyini potensial olaraq azaltdığı göstərilmişdir12,13. Buna görə də, endotoksinin çıxarılmasına məruz qalmış lövhə ilə gücləndirilmiş faq kitabxanasını ardıcıllıqla təyin etdik və AA tezliyini qiymətləndirmək üçün onu orijinal kitabxana ilə müqayisə etdik. Orijinal hovuz ilə gücləndirilmiş və təmizlənmiş hovuz arasında güclü bir korrelyasiya (r = 0.995) müşahidə edildi (Əlavə Şəkil 2d), bu da T7 faqından istifadə edərək lövhələrdə gücləndirilmiş klonlar arasında rəqabətin böyük qərəzliliyə səbəb olmadığını göstərir. Bu müqayisə hər bir kitabxanada tripeptid motivlərinin tezliyinə əsaslanır, çünki kitabxanaların müxtəlifliyi (~109) hətta HTS ilə belə tam şəkildə əks oluna bilmir. Hər mövqedə aa-nın tezlik təhlili daxil edilmiş repertuarın son üç mövqeyində kiçik bir mövqedən asılı qərəzlilik aşkar etdi (Əlavə Şəkil 2e). Nəticədə, kitabxananın keyfiyyətinin və müxtəlifliyinin məqbul olduğu və bir neçə seçim mərhələsi arasında faq kitabxanalarının gücləndirilməsi və hazırlanması səbəbindən müxtəliflikdə yalnız kiçik dəyişikliklərin müşahidə edildiyi qənaətinə gəldik.
Seriyalı beyin-onurğa mayesi nümunəsi, BBB və/və ya BCSFB vasitəsilə venadaxili (iv) yeridilən T7 faqının müəyyən edilməsini asanlaşdırmaq üçün şüurlu siçovulların CM-nə cərrahi yolla bir kanül implantasiyası ilə həyata keçirilə bilər (Şəkil 1a-b). İn vivo seçimin ilk üç mərhələsində iki müstəqil seçim qolundan (A və B qolları) istifadə etdik (Şəkil 1c). Seçimin ilk üç mərhələsində yeridilən faqın ümumi miqdarını azaltmaqla seçimin sərtliyini tədricən artırdıq. Panningin dördüncü mərhələsi üçün A və B budaqlarından nümunələri birləşdirdik və üç əlavə müstəqil seçim apardıq. Bu modeldə T7 faq hissəciklərinin in vivo xüsusiyyətlərini öyrənmək üçün quyruq venası vasitəsilə siçovullara vəhşi tipli faq (PAGISRELVDKL master insert) yeridildi. Müxtəlif zaman nöqtələrində faqların beyin-onurğa mayesindən və qandan çıxarılması göstərdi ki, nisbətən kiçik T7 ikosahedral faqlar qan bölməsindən sürətli ilkin təmizlənmə mərhələsinə malikdir (Əlavə Şəkil 3). Siçovulların titrlərinə və qan həcminə əsasən, venadaxili inyeksiyadan 10 dəqiqə sonra qanda qəbul edilən dozadan yalnız təxminən 1% çəki faqının aşkar edildiyini hesabladıq. Bu ilkin sürətli azalmadan sonra, 27,7 dəqiqəlik yarımparçalanma dövrü ilə daha yavaş ilkin klirens ölçüldü. Əhəmiyyətli olan odur ki, OBM bölməsindən yalnız çox az sayda faq götürüldü ki, bu da vəhşi tip faqların OBM bölməsinə miqrasiyası üçün aşağı fon olduğunu göstərir (Əlavə Şəkil 3). Orta hesabla, bütün nümunə götürmə müddəti (0-250 dəq) ərzində onurğa beyni mayesində qanda T7 faqının yalnız təxminən 1 x 10-3% titri və ilkin infuziya edilmiş faqların 4 x 10-8% -i aşkar edildi. Xüsusilə, onurğa beyni mayesindəki vəhşi tip faqın yarımparçalanma dövrü (25,7 dəq) qanda müşahidə edilənə bənzəyirdi. Bu məlumatlar göstərir ki, CM-kanüllü siçovullarda CSF bölməsini qandan ayıran baryer toxunulmazdır və bu da qandan CSF bölməsinə asanlıqla daşınan klonları müəyyən etmək üçün faq kitabxanalarının in vivo seçiminə imkan verir.
(a) Böyük bir hovuzdan beyin-onurğa mayesinin (BOS) təkrar nümunə götürülməsi üçün bir metodun qurulması. (b) Mərkəzi sinir sistemi (MSS) baryerinin hüceyrə yerini və qan-beyin baryerini (QBB) və qan-beyin baryerini keçən peptidləri müəyyən etmək üçün istifadə edilən seçim strategiyasını göstərən diaqram. (c) In vivo faj displeyinin skrininq axın sxemi. Seçimin hər mərhələsində fajlar (oxların içərisindəki heyvan identifikatorları) venadaxili yeridildi. Seçimin 4-cü mərhələsinə qədər iki müstəqil alternativ budaq (A, B) ayrı saxlanılır. Seçim 3 və 4-cü mərhələləri üçün BOS-dan çıxarılan hər bir faj klonu əl ilə ardıcıllıqla düzülmüşdür. (d) T7 peptid kitabxanasının (2 x 1012 faj/heyvan) venadaxili yeridilməsindən sonra iki kanüllü siçovulda ilk seçim mərhələsi zamanı qandan (qırmızı dairələr) və beyin-onurğa mayesindən (yaşıl üçbucaqlar) təcrid olunmuş fajın kinetikası. Mavi kvadratlar qanda faqın orta ilkin konsentrasiyasını göstərir, ümumi qan həcmi nəzərə alınmaqla vurulan faqın miqdarından hesablanır. Qara kvadratlar qanda faqın konsentrasiyalarından ekstrapolyasiya edilmiş y xəttinin kəsişmə nöqtəsini göstərir. (e,f) Peptiddə tapılan bütün mümkün üst-üstə düşən tripeptid motivlərinin nisbi tezliyini və paylanmasını təqdim edin. 1000 oxunuşda tapılan motivlərin sayı göstərilir. Əhəmiyyətli dərəcədə (p < 0,001) zənginləşdirilmiş motivlər qırmızı nöqtələrlə işarələnmişdir. (e) Vurulan kitabxananın tripeptid motivinin nisbi tezliyini 1.1 və 1.2 heyvanlardan qanla əldə edilən faqla müqayisə edən korrelyasiya səpələnmə qrafiki. (f) Qanda və onurğa beyni mayesində təcrid olunmuş 1.1 və 1.2 heyvan faq tripeptid motivlərinin nisbi tezliyini müqayisə edən korrelyasiya səpələnmə qrafiki. (g, h) Hər iki heyvanda in vivo seleksiya mərhələsindən sonra qanla zənginləşdirilmiş faqın (g) inyeksiya edilmiş kitabxanalara və CSF ilə zənginləşdirilmiş faqın (h) qana qarşı ardıcıllıq ID təmsilçiliyi. Bir hərfli kodun ölçüsü həmin amin turşusunun həmin mövqedə nə qədər tez-tez baş verdiyini göstərir. Yaşıl = polyar, bənövşəyi = neytral, mavi = əsas, qırmızı = turşu və qara = hidrofob amin turşuları. Şəkil 1a, b Eduard Urich tərəfindən dizayn edilmiş və istehsal edilmişdir.
Biz iki CM alət siçanına (A və B qrupları) faq peptid kitabxanası yeritdik və faqı onurğa beyni mayesindən və qandan təcrid etdik (Şəkil 1d). Kitabxananın ilkin sürətli təmizlənməsi vəhşi tip faqla müqayisədə daha az nəzərə çarpırdı. Hər iki heyvanda yeridilən kitabxananın orta yarımparçalanma müddəti qanda vəhşi tip faqa bənzər şəkildə 24,8 dəqiqə, onurğa beyni mayesində isə 38,5 dəqiqə idi. Hər bir heyvandan alınan qan və onurğa beyni mayesi faq nümunələri HTS-ə məruz qaldı və müəyyən edilmiş bütün peptidlər qısa tripeptid motivinin mövcudluğuna görə təhlil edildi. Tripeptid motivləri seçildi, çünki onlar struktur əmələ gəlməsi və peptid-zülal qarşılıqlı təsirləri üçün minimal əsas təmin edir14,15. Yeridilən faq kitabxanası ilə hər iki heyvanın qanından çıxarılan klonlar arasında motivlərin paylanmasında yaxşı bir korrelyasiya tapdıq (Şəkil 1e). Məlumatlar kitabxananın tərkibinin qan bölməsində yalnız cüzi dərəcədə zənginləşdiyini göstərir. Amin turşusu tezlikləri və konsensus ardıcıllıqları Weblogo16 proqramının uyğunlaşmasından istifadə edərək hər mövqedə daha ətraflı təhlil edildi. Maraqlıdır ki, qan qlisin qalıqlarında güclü zənginləşmə aşkar etdik (Şəkil 1g). Qan CSF-dən seçilmiş klonlarla müqayisə edildikdə, güclü seçim və motivlərin bəzi deseleksiyası müşahidə edildi (Şəkil 1f) və müəyyən amin turşuları 12 üzvlü hüceyrədə əvvəlcədən müəyyən edilmiş mövqelərdə üstünlük təşkil edirdi (Şəkil 1h). Xüsusilə, fərdi heyvanlar onurğa beyin mayesində əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənirdi, halbuki hər iki heyvanda qan qlisin zənginləşməsi müşahidə edildi (Əlavə Şəkil 4a–j). 1.1 və 1.2 heyvanlarının onurğa beyin mayesindəki ardıcıllıq məlumatlarının ciddi şəkildə süzülməsindən sonra cəmi 964 və 420 unikal 12-mer peptid əldə edildi (Əlavə Şəkil 1d–e). İzolyasiya edilmiş faq klonları gücləndirildi və in vivo seçiminin ikinci mərhələsinə məruz qaldı. Seçimin ikinci mərhələsindən çıxarılan faqlar hər bir heyvanda HTS-ə məruz qaldı və müəyyən edilmiş bütün peptidlər tripeptid motivlərinin meydana gəlməsini təhlil etmək üçün motiv tanıma proqramına giriş kimi istifadə edildi (Şəkil 2a, b, ef). CSF-dən bərpa edilən faqın ilk dövrü ilə müqayisədə, A və B budaqlarında CSF-də bir çox motivlərin daha da seçilməsini və seçilməməsini müşahidə etdik (Şəkil 2). Onların ardıcıl ardıcıllığın fərqli nümunələrini təmsil edib-etmədiklərini müəyyən etmək üçün şəbəkə identifikasiya alqoritmi tətbiq edildi. Alternativ A kladında (Şəkil 2c, d) və B kladında (Şəkil 2g, h) CSF tərəfindən bərpa edilən 12 ölçülü ardıcıllıqlar arasında aydın oxşarlıq müşahidə edildi. Hər budaqda birləşdirilmiş təhlil 12-mer peptidlər üçün fərqli seçim profillərini (Əlavə Şəkil 5c, d) və ikinci seçim mərhələsindən sonra birləşdirilmiş klonlar üçün birinci seçim mərhələsi ilə müqayisədə zamanla CSF/qan titr nisbətində artım aşkar etdi (Əlavə Şəkil 5e).
Serebrospinal mayedəki motivlərin və peptidlərin in vivo funksional faj displey seçiminin iki ardıcıl mərhələsi ilə zənginləşdirilməsi.
Hər bir heyvanın (#1.1 və #1.2 heyvanları) ilk mərhələsindən bərpa edilən bütün beyin-onurğa mayesi faqları birləşdirildi, gücləndirildi, HT ardıcıllığı ilə təyin edildi və birlikdə yenidən yeridildi (2 x 1010 faq/heyvan) 2 SM kanülyasiya olunmuş siçovul (#1.1 → #). 2.1 və 2.2, 1.2 → 2.3 və 2.4). (a,b,e,f) Birinci və ikinci seçim mərhələlərində bütün CSF-dən əldə edilən faqların tripeptid motivlərinin nisbi tezliyini müqayisə edən korrelyasiya səpələnmə qrafikləri. Hər iki istiqamətdə peptidlərdə tapılan bütün mümkün üst-üstə düşən tripeptidləri təmsil edən motivlərin nisbi tezliyi və paylanması. 1000 oxunuşda tapılan motivlərin sayı göstərilir. Müqayisə edilən kitabxanalardan birində əhəmiyyətli dərəcədə (p < 0.001) seçilən və ya xaric edilən motivlər qırmızı nöqtələrlə vurğulanmışdır. (c, d, g, h) İn vivo seçimin 2 və 1-ci raundlarına əsaslanan bütün CSF ilə zəngin 12 amin turşusu uzun ardıcıllıqlarının ardıcıllıq loqosu təsviri. Bir hərfli kodun ölçüsü həmin amin turşusunun həmin mövqedə nə qədər tez-tez baş verdiyini göstərir. Loqonu təmsil etmək üçün iki seçim raundu arasında fərdi heyvanlardan çıxarılan CSF ardıcıllıqlarının tezliyi müqayisə edilir və ikinci raunddakı zənginləşdirilmiş ardıcıllıqlar göstərilir: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 və (h) #1.2–#2.4. (c, d) 2.1 və 2.2 nömrəli heyvanlarda və ya (g, h) 2.3 və 2.4 nömrəli heyvanlarda müəyyən bir mövqedə ən çox zənginləşdirilmiş amin turşuları rəngdə göstərilir. Yaşıl = qütb, bənövşəyi = neytral, mavi = əsas, qırmızı = turşu və qara = hidrofob amin turşuları.
Seçimin üçüncü mərhələsindən sonra iki heyvandan təcrid olunmuş 332 CSF-də bərpa olunmuş faq klonundan 124 unikal peptid ardıcıllığı (#3.1 və #3.2) müəyyən etdik (Əlavə Şəkil 6a). LGSVS ardıcıllığı (18.7%) ən yüksək nisbi nisbətə malik idi, ardınca vəhşi tipli əlavələr PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) və SARGSWREIVSLS (2.2%) gəlir. Son dördüncü mərhələdə üç ayrı heyvandan müstəqil olaraq seçilmiş iki budağı birləşdirdik (Şəkil 1c). CSF-dən bərpa edilmiş 925 ardıcıl faq klonundan dördüncü mərhələdə 64 unikal peptid ardıcıllığı tapdıq (Əlavə Şəkil 6b), bunların arasında vəhşi tipli faqın nisbi nisbəti 0.8%-ə düşdü. Dördüncü raundda ən çox rast gəlinən CSF klonları LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) və RLSSVDSDLSGC (3, 2%) idi. %)). Seçilmiş peptidlərin uzunluq diapazonu, NNK kitabxana dizaynı üçün degenerat kodonlardan istifadə edərkən kitabxana praymerlərində nukleotid daxiletmələri/silinmələri və ya vaxtından əvvəl stop kodonları ilə əlaqədardır. Vaxtından əvvəl stop kodonlar daha qısa peptidlər yaradır və əlverişli AA motivini ehtiva etdikləri üçün seçilir. Daha uzun peptidlər sintetik kitabxanaların praymerlərində daxiletmələr/silinmələr nəticəsində yarana bilər. Bu, dizayn edilmiş stop kodonunu çərçivənin xaricində yerləşdirir və aşağıda yeni bir stop kodon görünənə qədər oxuyur. Ümumiyyətlə, giriş məlumatlarını nümunə çıxış məlumatları ilə müqayisə edərək bütün dörd seçim raundu üçün zənginləşdirmə amillərini hesabladıq. Skrininqin birinci mərhələsi üçün qeyri-spesifik fon istinadı kimi vəhşi tipli faq titrlərindən istifadə etdik. Maraqlıdır ki, mənfi faq seçimi ilk OBM dövründə çox güclü idi, lakin qanda yox idi (Şəkil 3a), bu, peptid kitabxanasının əksər üzvlərinin OBM bölməsinə passiv diffuziya ehtimalının aşağı olması və ya nisbi faqların bakteriofaqlara nisbətən qan dövranından daha səmərəli şəkildə saxlanılması və ya xaric edilməsi ilə əlaqəli ola bilər. Lakin, panningin ikinci mərhələsində hər iki kladda OBM-də faqların güclü seçimi müşahidə edildi ki, bu da əvvəlki mərhələnin OBM-in mənimsənilməsini təşviq edən peptidlər nümayiş etdirən faqlarla zəngin olduğunu göstərir (Şəkil 3a). Yenə də əhəmiyyətli dərəcədə qan zənginləşdirməsi olmadan. Həmçinin üçüncü və dördüncü mərhələlərdə faq klonları OBM-də əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdi. Seçimin son iki mərhələsi arasındakı hər bir unikal peptid ardıcıllığının nisbi tezliyini müqayisə edərək, ardıcıllıqların seçimin dördüncü mərhələsində daha da zənginləşdiyini aşkar etdik (Şəkil 3b). Hər iki peptid istiqamətindən istifadə edərək bütün 64 unikal peptid ardıcıllığından cəmi 931 tripeptid motivi çıxarıldı. Dördüncü raundda ən çox zənginləşdirilmiş motivlər, yeridilmiş kitabxana ilə müqayisədə bütün raundlar üzrə zənginləşdirmə profillərinə görə daha yaxından araşdırıldı (məhdudiyyət: 10% zənginləşdirmə) (Əlavə Şəkil 6c). Seçimin ümumi nümunələri göstərdi ki, tədqiq olunan motivlərin əksəriyyəti hər iki seçim qolunun əvvəlki bütün raundlarında zənginləşdirilmişdir. Lakin bəzi motivlər (məsələn, SGL, VSG, LGS GSV) əsasən alternativ A kladasından, digərləri isə (məsələn, FGW, RTN, WGF, NTR) alternativ B kladasında zənginləşdirilmişdir.
Streptavidin yüklərinə konjuge edilmiş CSF ilə zənginləşdirilmiş faqla göstərilən peptidlərin və biotinləşdirilmiş lider peptidlərin CSF daşınmasının təsdiqlənməsi.
(a) Zənginləşdirmə nisbətləri hər dörd mərhələdə (R1-R4) inyeksiya edilmiş (giriş = I) faq (PFU) titrlərinə və müəyyən edilmiş CSF faq titrlərinə (çıxış = O) əsasən hesablanmışdır. Son üç mərhələ üçün zənginləşdirmə amilləri (R2-R4) əvvəlki mərhələ və çəki məlumatları ilə birinci mərhələ (R1) ilə müqayisə yolu ilə hesablanmışdır. Açıq sütunlar onurğa beyni mayesidir, kölgəli sütunlar plazmadır. (***p<0.001, Student-in t-testinə əsasən). (b) Ən çox rast gəlinən faq peptidlərinin siyahısı, seçimin 4-cü mərhələsindən sonra CSF-də toplanan bütün faqlara nisbi nisbətlərinə görə sıralanmışdır. Ən çox rast gəlinən altı faq klonu rənglə vurğulanmış, nömrələnmiş və seçimin 3 və 4-cü mərhələləri arasında zənginləşdirmə amilləri göstərilmişdir (əlavələrdə). (c, d) 4-cü mərhələdən ən çox zənginləşdirilmiş altı faq klonu, boş faq və valideyn faq peptid kitabxanaları CSF nümunə modelində fərdi olaraq təhlil edilmişdir. Göstərilən vaxt nöqtələrində OBM və qan nümunələri toplanmışdır. (c) Bərabər miqdarda 6 namizəd faq klonu (2 x 1010 faq/heyvan), boş faqlar (#1779) (2 x 1010 faq/heyvan) və ehtiyat faq peptid kitabxanaları (2 x 1012 faq/heyvan) quyruq venası vasitəsilə ayrıca olaraq ən azı 3 CM inyeksiya edilir. Hər bir inyeksiya edilmiş faq klonunun və faq peptid kitabxanasının zamanla OBM farmakokinetikası göstərilir. (d) nümunə götürmə müddəti ərzində bütün bərpa olunmuş faqlar/ml üçün orta OBM/qan nisbətini göstərir. (e) Dörd sintetik lider peptid və bir qarışdırılmış nəzarət biotinlə streptavidinə N-terminalları (tetramer displeyi) vasitəsilə əlaqələndirilmiş və ardından inyeksiya (quyruq venası venası, 10 mq streptavidin/kq) aparılmışdır. Ən azı üç intubasiya edilmiş siçovul (N = 3). Göstərilən vaxt nöqtələrində CSF nümunələri toplandı və streptavidin konsentrasiyaları CSF anti-streptavidin ELISA ilə ölçüldü (nd = aşkarlanmadı). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA testinə əsasən). (f) Ən zənginləşdirilmiş faq peptid klonu #2002 (bənövşəyi)-nin amin turşusu ardıcıllığının 4-cü seçim mərhələsindən seçilmiş digər faq peptid klonları ilə müqayisəsi. Eyni və oxşar amin turşusu fraqmentləri rəng kodludur.
Dördüncü raundda (Şəkil 3b) zənginləşdirilmiş bütün faqlardan CSF nümunə modelində əlavə fərdi analiz üçün altı namizəd klon seçildi. Üç kanüllü CM heyvanına bərabər miqdarda altı namizəd faq, boş faq (əlavəsiz) və profaq peptid kitabxanası yeridildi və farmakokinetika CSF (Şəkil 3c) və qan (Əlavə Şəkil 7) analizlərində təyin edildi. Test edilmiş bütün faq klonları CSF bölməsini boş nəzarət faqından (#1779) 10-1000 dəfə yüksək səviyyədə hədəf aldı. Məsələn, #2020 və #2077 klonları nəzarət faqından təxminən 1000 dəfə yüksək CSF titrlərinə malik idi. Seçilmiş hər bir peptidin farmakokinetik profili fərqlidir, lakin hamısı yüksək CSF homing qabiliyyətinə malikdir. #1903 və #2011 klonları üçün zamanla sabit bir azalma müşahidə etdik, #2077, #2002 və #2009 klonları üçün isə ilk 10 dəqiqə ərzində artım aktiv daşınmanı göstərə bilər, lakin təsdiqlənməlidir. #2020, #2002 və #2077 klonları yüksək səviyyədə sabitləşdi, #2009 klonunun OBM konsentrasiyası isə ilkin artımdan sonra yavaş-yavaş azaldı. Daha sonra hər bir OBM namizədinin nisbi tezliyini onun qan konsentrasiyası ilə müqayisə etdik (Şəkil 3d). Bütün nümunə götürmə vaxtlarında hər bir OBM namizədinin orta titrinin onun qan titri ilə korrelyasiyası göstərdi ki, altı namizəddən üçündə qan OBM əhəmiyyətli dərəcədə zəngindir. Maraqlıdır ki, #2077 klonu daha yüksək qan stabilliyi göstərdi (Əlavə Şəkil 7). Peptidlərin özlərinin faq hissəciklərindən başqa yükü OBM bölməsinə aktiv şəkildə daşıya bildiyini təsdiqləmək üçün peptidlərin faq hissəciyinə birləşdiyi N-terminalda biotinlə törəmələnmiş dörd lider peptid sintez etdik. Biotinləşdirilmiş peptidlər (2002, 2009, 2020 və 2077 nömrəli) streptavidin (SA) ilə birləşdirilərək faq həndəsəsini təqlid edən multimerik formalar əldə edildi. Bu format həmçinin bizə qan və onurğa beyni mayesində SA-ya məruz qalmağı yük daşıyan zülal peptidləri kimi ölçməyə imkan verdi. Əhəmiyyətli olan odur ki, sintetik peptidlər bu SA-ya qoşulmuş formatda tətbiq edildikdə faq məlumatları tez-tez təkrarlana bilərdi (Şəkil 3e). Qarışdırılmış peptidlər daha az ilkin məruz qalma və daha sürətli CSF təmizlənməsi ilə 48 saat ərzində aşkarlanmayan səviyyələrə malik idi. Bu peptid faq klonlarının CSF məkanına çatdırılma yolları haqqında məlumat əldə etmək üçün, in vivo venadaxili inyeksiyadan 1 saat sonra faq hissəciklərini birbaşa aşkar etmək üçün immunohistokimya (IHC) istifadə edərək fərdi faq peptid zərbələrinin lokalizasiyasını təhlil etdik. Xüsusilə, #2002, #2077 və #2009 klonları beyin kapilyarlarında güclü boyanma ilə aşkar edilə bilər, nəzarət faqları (#1779) və #2020 klonları isə aşkar edilməmişdir (Əlavə Şəkil 8). Bu, bu peptidlərin BBB-ni keçməklə beyinə təsir göstərdiyini göstərir. Bu hipotezi yoxlamaq üçün əlavə ətraflı təhlil tələb olunur, çünki BSCFB yolu da iştirak edə bilər. Ən zənginləşdirilmiş klonun (#2002) amin turşusu ardıcıllığını digər seçilmiş peptidlərlə müqayisə edərkən, bəzilərinin oxşar amin turşusu uzantılarına malik olduğu və bu da oxşar nəqliyyat mexanizmini göstərə biləcəyi qeyd edildi (Şəkil 3f).
Unikal plazma profili və zamanla CSF-də əhəmiyyətli dərəcədə artım səbəbindən, faq displey klonu #2077 daha uzun 48 saatlıq bir müddət ərzində daha da araşdırıldı və davamlı SA səviyyələri ilə əlaqəli olaraq müşahidə edilən CSF-də sürətli artımı təkrarlaya bildi (Şəkil 4a). Müəyyən edilmiş digər faq klonlarına gəldikdə, #2077 beyin kapilyarları üçün güclü şəkildə boyandı və daha yüksək qətnamə ilə baxıldıqda kapilyar marker lektin ilə əhəmiyyətli kolokalizasiya və parenximal boşluqda ehtimal ki, bir qədər boyanma göstərdi (Şəkil 4b). Peptid vasitəçiliyi ilə farmakoloji təsirlərin MSS-də əldə edilə biləcəyini araşdırmaq üçün i) #2077 tranzit peptidi və ii) BACE1 inhibitor peptidinin biotinləşdirilmiş versiyalarının SA ilə iki fərqli nisbətdə qarışdırıldığı bir təcrübə apardıq. Bir kombinasiya üçün yalnız BACE1 peptid inhibitorundan, digəri üçün isə BACE1 peptid inhibitorunun #2077 peptidinə 1:3 nisbətindən istifadə etdik. Hər iki nümunə venadaxili olaraq yeridildi və qan və onurğa beyni mayesində beta-amiloid peptid 40 (Abeta40) səviyyələri zamanla ölçüldü. Abeta40 beyin parenximasında BACE1 inhibisiyasını əks etdirdiyi üçün onurğa beyni mayesində ölçüldü. Gözlənildiyi kimi, hər iki kompleks Abeta40-ın qan səviyyələrini əhəmiyyətli dərəcədə azaltdı (Şəkil 4c, d). Lakin, yalnız 2077 nömrəli peptid qarışığı və SA ilə birləşən BACE1 peptidinin inhibitoru olan nümunələr onurğa beyni mayesində Abeta40-ın əhəmiyyətli dərəcədə azalmasına səbəb oldu (Şəkil 4c). Məlumatlar göstərir ki, 2077 nömrəli peptid 60 kDa SA zülalını MSS-ə daşıya bilir və həmçinin BACE1 peptidinin SA ilə birləşən inhibitorları ilə farmakoloji təsirlər yaradır.
(a) Ən azı üç CM-intubasiya olunmuş siçovullarda CSF peptidi #2077 (RLSSVDSDLSGC) və inyeksiya edilməmiş nəzarət faqının (#1779) uzunmüddətli farmakokinetik profillərini göstərən T7 faqının klonal inyeksiyası (2 × 10 faq/heyvan). (b) Faq inyeksiya edilmiş siçovullarda (2 × 10 10 faq/heyvan) 2077 peptidi və damarlarının (lektin) əks-boyanmasını göstərən nümayəndəli kortikal mikrodamarların konfokal mikroskopik təsviri. Bu faq klonları 3 siçana vuruldu və perfuziyadan əvvəl 1 saat dövran etməyə icazə verildi. Beyinlər kəsildi və T7 faq kapsidinə qarşı poliklonal FITC ilə işarələnmiş antikorlarla boyandı. Perfuziyadan və sonrakı fiksasiyadan on dəqiqə əvvəl DyLight594 ilə işarələnmiş lektin venadaxili vuruldu. Kapilyarların və perivaskulyar beyin toxumasının lümenində mikrodamarların və faqların (yaşıl) lüminal tərəfinin lektin boyanmasını (qırmızı) göstərən flüoresan şəkillər. Ölçü zolağı 10 µm-ə uyğundur. (c, d) Biotinləşdirilmiş BACE1 inhibitor peptidi təkbaşına və ya biotinləşdirilmiş tranzit peptidi ilə birlikdə #2077 streptavidinə birləşdirildi və ardından ən azı üç kanülləşdirilmiş CM siçovuluna (10 mq streptavidin/kq) venadaxili inyeksiya edildi. BACE1 peptid inhibitoru vasitəçiliyi ilə Aβ40-da azalma göstərilən zaman nöqtələrində qanda (qırmızı) və onurğa beyni mayesində (narıncı) Aβ1-40 ELISA ilə ölçüldü. Daha aydınlıq üçün qrafikdə 100% miqyasda nöqtəli xətt çəkilib. (c) 3:1 nisbətində tranzit peptid #2077 və BACE1 inhibitor peptidi ilə konjuge edilmiş streptavidinlə müalicə olunmuş siçovullarda qanda (qırmızı üçbucaqlar) və onurğa beyni mayesində (narıncı üçbucaqlar) Aβ40-ın faiz azalması. (d) Yalnız BACE1 inhibitor peptidi ilə birləşdirilmiş streptavidinlə müalicə olunmuş siçovulların qanında Aβ40-ın (qırmızı dairələr) və onurğa beyni mayesində (narıncı dairələr) faiz azalması. Nəzarət qrupunda Aβ konsentrasiyası 420 pg/ml (standart sapma = 101 pg/ml) təşkil etmişdir.
Faq nümayişi biotibbi tədqiqatların bir neçə sahəsində uğurla tətbiq edilmişdir17. Bu metod in vivo damar müxtəlifliyi tədqiqatları18,19, eləcə də beyin damarlarını hədəf alan tədqiqatlar20,21,22,23,24,25,26 üçün istifadə edilmişdir. Bu tədqiqatda biz bu seçim metodunun tətbiqini yalnız beyin damarlarını hədəf alan peptidlərin birbaşa müəyyən edilməsinə deyil, həm də qan-beyin baryerini keçmək üçün aktiv nəqliyyat xüsusiyyətlərinə malik namizədlərin kəşfinə genişləndirdik. İndi biz CM intubasiya olunmuş siçovullarda in vivo seçim prosedurunun inkişafını təsvir edirik və onun CSF homing xüsusiyyətlərinə malik peptidləri müəyyən etmək potensialını nümayiş etdiririk. 12-mer təsadüfi peptid kitabxanasını göstərən T7 faqından istifadə edərək, biz T7 faqının qan-beyin baryerinə uyğunlaşmaq üçün kifayət qədər kiçik (təxminən 60 nm diametrdə)10 olduğunu və bununla da birbaşa qan-beyin baryerini və ya xoroid pleksusunu keçdiyini nümayiş etdirə bildik. Biz müşahidə etdik ki, kanülləşdirilmiş CM siçovullarından OBM yığımı yaxşı idarə olunan in vivo funksional skrininq metodudur və çıxarılan faq təkcə damar sisteminə bağlanmaqla yanaşı, həm də qan-beyin baryerindən keçən daşıyıcı kimi fəaliyyət göstərir. Bundan əlavə, eyni zamanda qan toplayaraq və OBM-ə və qandan əldə edilən faqlara HTS tətbiq etməklə, OBM seçimimizin qan zənginləşdirilməsindən və ya seçim turları arasında genişlənməyə yararlılığından təsirlənmədiyini təsdiqlədik. Lakin, qan bölməsi seçim prosedurunun bir hissəsidir, çünki OBM bölməsinə çata bilən faqlar beyində zənginləşmək üçün kifayət qədər uzun müddət yaşamalı və qan dövranında dövran etməlidirlər. Xam OBM məlumatlarından etibarlı ardıcıllıq məlumatlarını çıxarmaq üçün analiz iş axınında platformaya xas ardıcıllıq səhvlərinə uyğunlaşdırılmış filtrlər tətbiq etdik. Kinetik parametrləri skrininq metoduna daxil etməklə, qanda vəhşi tipli T7 faqlarının sürətli farmakokinetikasını (t½ ~ 28 dəq) təsdiqlədik24, 27, 28 və həmçinin onların beyin-onurğa mayesindəki yarımömrü (t½ ~ 26 dəq) dəqiqədə müəyyən etdik. Qanda və OBM-də oxşar farmakokinetik profillərə baxmayaraq, qanda faq konsentrasiyasının yalnız 0,001%-i OBM-də aşkar edilə bilər ki, bu da vəhşi tipli T7 faqının qan-beyin baryerindən aşağı fon hərəkətliliyini göstərir. Bu iş, xüsusilə də qan dövranından tez təmizlənən faq sistemləri üçün in vivo panning strategiyalarından istifadə edərkən birinci raund seçiminin vacibliyini vurğulayır, çünki az sayda klon MSS bölməsinə çata bilir. Beləliklə, birinci raundda kitabxana müxtəlifliyində azalma çox böyük idi, çünki bu çox sərt OBM modelində sonda yalnız məhdud sayda klon toplandı. Bu in vivo panning strategiyası OBM bölməsində aktiv toplanması, qan bölməsində klonun sağ qalması və ilk 10 dəqiqə ərzində qandan T7 faq klonlarının sürətli çıxarılması kimi bir neçə seçim addımını əhatə edirdi (Şəkil 1d və Əlavə Şəkil 4M). Beləliklə, birinci raunddan sonra OBM-də fərqli faq klonları müəyyən edildi, baxmayaraq ki, fərdi heyvanlar üçün eyni ilkin hovuz istifadə edilmişdir. Bu, çox sayda kitabxana üzvü olan mənbə kitabxanaları üçün çoxsaylı ciddi seçim addımlarının müxtəlifliyin əhəmiyyətli dərəcədə azalmasına səbəb olduğunu göstərir. Buna görə də, təsadüfi hadisələr nəticəyə böyük təsir göstərərək ilkin seçim prosesinin ayrılmaz hissəsinə çevriləcək. Çox güman ki, orijinal kitabxanadakı klonların çoxu çox oxşar CSF zənginləşdirmə meylinə malik idi. Lakin, eyni eksperimental şəraitdə belə, ilkin hovuzdakı hər bir konkret klonun sayının az olması səbəbindən seçim nəticələri fərqlənə bilər.
Onurğa-beyin mayesi ilə zənginləşdirilmiş motivlər qandakılardan fərqlənir. Maraqlıdır ki, fərdi heyvanların qanında qlisinlə zəngin peptidlərə doğru ilk dəyişikliyi qeyd etdik. (Şəkil 1g, Əlavə Şəkil 4e, 4f). Qlisin tərkibli faqlar daha sabit ola bilər və qan dövranından çıxarılma ehtimalı daha azdır. Lakin, bu qlisinlə zəngin peptidlər onurğa-beyin mayesi nümunələrində aşkar edilməmişdir ki, bu da seçilmiş kitabxanaların iki fərqli seçim mərhələsindən keçdiyini göstərir: biri qanda, digəri isə onurğa-beyin mayesində toplanmasına icazə verilmişdir. Seçimin dördüncü mərhələsindən yaranan onurğa-beyin mayesi ilə zənginləşdirilmiş klonlar geniş şəkildə sınaqdan keçirilmişdir. Fərdi sınaqdan keçirilmiş klonların demək olar ki, hamısının boş nəzarət faqları ilə müqayisədə onurğa-beyin mayesi ilə zənginləşdirildiyi təsdiqlənmişdir. Bir peptid vurulması (#2077) daha ətraflı araşdırılmışdır. Digər təsirlərlə müqayisədə plazma yarımparçalanma dövrü daha uzun idi (Şəkil 3d və Əlavə Şəkil 7) və maraqlıdır ki, bu peptid C-terminalında sistein qalığını ehtiva edirdi. Bu yaxınlarda peptidlərə sistein əlavə edilməsinin albumin 29-a bağlanaraq onların farmakokinetik xüsusiyyətlərini yaxşılaşdıra biləcəyi göstərilmişdir. Bu, hazırda 2077 nömrəli peptid üçün məlum deyil və əlavə tədqiqat tələb edir. Bəzi peptidlər CSF zənginləşməsində valentlik asılılığı göstərmişdir (məlumatlar göstərilməyib), bu da T7 kapsidinin göstərilən səth həndəsəsi ilə əlaqəli ola bilər. İstifadə etdiyimiz T7 sistemi hər faq hissəciyində hər peptidin 5-15 nüsxəsini göstərdi. İHC siçovulların beyin qabığına venadaxili yeridilən namizəd qurğuşun faq klonları üzərində aparılmışdır (Əlavə Şəkil 8). Məlumatlar göstərir ki, ən azı üç klon (№ 2002, № 2009 və № 2077) BBB ilə qarşılıqlı təsir göstərir. Bu BBB qarşılıqlı təsirinin CSF-nin toplanmasına və ya bu klonların birbaşa BCSFB-yə hərəkətinə səbəb olub-olmadığı hələ müəyyən edilməmişdir. Əhəmiyyətli olan odur ki, seçilmiş peptidlərin sintez edildikdə və zülal yükünə bağlandıqda CSF daşıma qabiliyyətini saxladığını göstəririk. N-terminal biotinləşdirilmiş peptidlərin SA-ya bağlanması, əsasən, qan və onurğa beyni mayesindəki müvafiq faq klonları ilə əldə edilən nəticələri təkrarlayır (Şəkil 3e). Nəhayət, göstəririk ki, qurğuşun peptid #2077, SA-ya konjuge edilmiş BACE1 biotinləşdirilmiş peptid inhibitorunun beyin təsirini təşviq edə bilir və CSF-də Abeta40 səviyyələrini əhəmiyyətli dərəcədə azaltmaqla MSS-də nəzərəçarpacaq farmakodinamik təsirlərə səbəb olur (Şəkil 4). Bütün hitlərin peptid ardıcıllığı homologiyası axtarışını apararaq verilənlər bazasında heç bir homolog müəyyən edə bilmədik. Qeyd etmək vacibdir ki, T7 kitabxanasının ölçüsü təxminən 109, 12-mers üçün nəzəri kitabxana ölçüsü isə 4 x 1015-dir. Buna görə də, biz 12-mer peptid kitabxanasının müxtəliflik fəzasının yalnız kiçik bir hissəsini seçdik ki, bu da müəyyən edilmiş hitlərin bitişik ardıcıllıq fəzasını qiymətləndirməklə daha optimallaşdırılmış peptidlərin müəyyən edilə biləcəyi anlamına gələ bilər. Hipotetik olaraq, bu peptidlərin təbii homologlarını tapmamağımızın səbəblərindən biri, müəyyən peptid motivlərinin beyinə nəzarətsiz daxil olmasının qarşısını almaq üçün təkamül zamanı seleksiyanın ləğv edilməsi ola bilər.
Ümumilikdə, nəticələrimiz in vivo serebrovaskulyar baryerin nəqliyyat sistemlərini daha ətraflı şəkildə müəyyən etmək və xarakterizə etmək üçün gələcək işlər üçün əsas yaradır. Bu metodun əsas quruluşu yalnız beyin damar bağlama xüsusiyyətlərinə malik klonları müəyyən etməklə yanaşı, həm də uğurlu klonların in vivo bioloji baryerləri MSS bölməsinə keçmək üçün daxili aktivliyə malik olduğu vacib bir addımı da əhatə edən funksional seçim strategiyasına əsaslanır. Bu peptidlərin daşınma mexanizmini və beyin bölgəsinə xas olan mikrovaskulyar sistemə bağlanma üstünlüklərini aydınlaşdırmaqdır. Bu, BBB və reseptorların daşınması üçün yeni yolların kəşfinə səbəb ola bilər. Müəyyən edilmiş peptidlərin birbaşa beyin damar reseptorlarına və ya BBB və ya BCSFB vasitəsilə daşınan dövran edən ligandlara bağlana biləcəyini gözləyirik. Bu işdə aşkar edilmiş CSF daşıma aktivliyinə malik peptid vektorları daha da araşdırılacaq. Hal-hazırda bu peptidlərin BBB və/və ya BCSFB-dən keçmə qabiliyyətinə görə beyin spesifikliyini araşdırırıq. Bu yeni peptidlər yeni reseptorların və ya yolların potensial kəşfi və bioloji preparatlar kimi makromolekulların beyinə çatdırılması üçün yeni yüksək səmərəli platformaların inkişafı üçün son dərəcə dəyərli vasitələr olacaq.
Əvvəllər təsvir edilmiş metodun modifikasiyasından istifadə edərək böyük sisternanı (BS) kanülləşdirin. Anesteziya edilmiş Wistar siçovulları (200-350 q) stereotaksik aparata quraşdırılmış və kəlləni göstərmək üçün qırxılmış və aseptik şəkildə hazırlanmış baş dərisi üzərində orta kəsik edilmişdir. Üst kəmər sahəsində iki deşik açın və deşiklərdəki fiksasiya vintlərini bərkidin. Paslanmayan polad kanülün BS-yə stereotaktik istiqamətləndirilməsi üçün yan oksipital qılıncıda əlavə bir deşik açılmışdır. Kanülün ətrafına diş sementi çəkin və vintlərlə bərkidin. Fotobərkitmədən və sement sərtləşməsindən sonra dəri yarası 4/0 supramid tikişlə bağlanmışdır. Kanülün düzgün yerləşdirilməsi onurğa-beyin mayesinin (BBM) spontan sızması ilə təsdiqlənir. Siçovulu stereotaksik aparatdan çıxarın, əməliyyatdan sonrakı müvafiq qayğı və ağrı idarəçiliyi alın və onurğa-beyin mayesində qan əlamətləri müşahidə olunana qədər ən azı bir həftə sağalmasına icazə verin. Wistar siçovulları (Crl:WI/Han) Charles River (Fransa) şirkətindən əldə edilmişdir. Bütün siçovullar müəyyən patogenlərdən azad şəraitdə saxlanılmışdır. Bütün heyvan təcrübələri İsveçrənin Bazel şəhərinin Baytarlıq İdarəsi tərəfindən təsdiq edilmiş və 2474 nömrəli Heyvan Lisenziyasına (Siçovulların onurğa beyni mayesində və beynində terapevtik namizədlərin səviyyələrini ölçməklə aktiv beyin daşınmasının qiymətləndirilməsi) uyğun olaraq aparılmışdır.
Əlinizdə CM kanülü ilə siçovulu ehtiyatla huşunda saxlayın. Daturanı kanülündən çıxarın və 10 µl spontan axan onurğa beyni mayesi toplayın. Kanülün keçiriciliyi nəticədə pozulduğundan, bu tədqiqata yalnız qan çirklənməsi və ya rəng dəyişikliyi əlamətləri olmayan şəffaf onurğa beyni mayesi nümunələri daxil edilmişdir. Paralel olaraq, quyruğun ucundakı kiçik bir kəsikdən təxminən 10-20 µl qan heparin (Sigma-Aldrich) olan borulara götürülmüşdür. T7 faqının venadaxili yeridilməsindən sonra müxtəlif vaxt nöqtələrində onurğa beyni mayesi və qan toplanmışdır. Hər bir onurğa beyni mayesi nümunəsi toplanmazdan əvvəl təxminən 5-10 µl maye atılmışdır ki, bu da kateterin ölü həcminə uyğundur.
Kitabxanalar, T7Select sistem təlimatında təsvir edildiyi kimi (Novagen, Rosenberg və b., InNovations 6, 1-6, 1996) T7Select 10-3b vektorundan istifadə etməklə yaradılıb. Qısaca desək, təsadüfi 12-mer DNT əlavəsi aşağıdakı formatda sintez edilib:
NNK kodonu, əlavədə ikiqat stop kodonlarının və amin turşusunun həddindən artıq ifadəsinin qarşısını almaq üçün istifadə edilmişdir. N hər bir nukleotidin əl ilə qarışdırılmış ekvimolyar nisbətidir və K adenin və sitozin nukleotidlərinin əl ilə qarışdırılmış ekvimolyar nisbətidir. Tək zəncirli bölgələr, 37°C-də 3 saat ərzində Klenow buferində (New England Biolabs) dNTP (Novagen) və Klenow fermenti (New England Biolabs) ilə əlavə inkubasiya yolu ilə iki zəncirli DNT-yə çevrilmişdir. Reaksiyadan sonra iki zəncirli DNT EtOH çöküntüsü ilə bərpa edilmişdir. Nəticədə yaranan DNT, EcoRI və HindIII (hər ikisi Roche-dan) restriksiya fermentləri ilə həzm edilmişdir. Parçalanmış və təmizlənmiş (QIAquick, Qiagen) əlavə (T4 ligase, New England Biolabs) daha sonra 10B kapsid geninin 348 amin turşusundan sonra əvvəlcədən parçalanmış T7 vektoruna çərçivə daxilində bağlanmışdır. Liqasiya reaksiyaları in vitro qablaşdırmadan əvvəl 16°C-də 18 saat inkubasiya edildi. In vitro faq qablaşdırması T7Select 10-3b klonlama dəsti (Novagen) ilə birlikdə verilən təlimatlara uyğun olaraq həyata keçirildi və qablaşdırma məhlulu Escherichia coli (BLT5615, Novagen) istifadə edərək lizisə bir dəfə amplifikasiya edildi. Lizatlar santrifüj edildi, titrləndi və -80°C-də qliserolun ehtiyat məhlulu kimi donduruldu.
Xüsusi 454/Roche-amplicon füzyon praymerlərindən istifadə edərək bulyonda və ya boşqabda gücləndirilmiş faj dəyişən bölgələrinin birbaşa PZR gücləndirilməsi. İrəli füzyon praymeri dəyişən bölgəni (NNK) 12 (şablona xas), GS FLX Titan Adapter A-nı və dörd əsaslı kitabxana açar ardıcıllığını (TCAG) əhatə edən ardıcıllıqları ehtiva edir (Əlavə Şəkil 1a):
Tərs birləşmə primeri həmçinin tutucu muncuqlara bərkidilmiş biotin və emulsiya PCR zamanı klonal gücləndirmə üçün tələb olunan GS FLX Titan Adapter B-ni ehtiva edir:
Daha sonra amplikonlar 454 GS-FLX Titanium protokoluna uyğun olaraq 454/Roche pirosekvensiyasına məruz qaldı. Əl ilə Sanger ardıcıllığı üçün (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNT Analyzer), T7 faq DNT-si PCR ilə gücləndirildi və aşağıdakı praymer cütləri ilə ardıcıllıqla təyin edildi:
Fərdi lövhələrdən alınan əlavələr Roche Fast Start DNT Polimeraza Dəsti istifadə edərək (istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq) PCR gücləndirilməsinə məruz qaldı. İsti başlanğıc (95 °C-də 10 dəq) və 35 gücləndirmə dövrü (95 °C-də 50 s, 50 °C-də 1 dəq və 72 °C-də 1 dəq) həyata keçirin.
Kitabxanalardan, vəhşi tipli faqlardan, beyin mayesindən və qandan xilas edilmiş faqlardan və ya fərdi klonlardan əldə edilən faqlar, Escherichia coli BL5615-də vərəm bulyonunda (Sigma Aldrich) və ya 500 sm2 qablarda (Thermo Scientific) 37°C-də 4 saat ərzində gücləndirilmişdir. Faqlar lövhələrdən Tris-EDTA buferi (Fluka Analytical) ilə yaxalanaraq və ya lövhələri steril pipet ucları ilə toplayaraq çıxarılmışdır. Faqlar bir dövr polietilen qlikol (PEG 8000) çöküntüsü (Promega) ilə mədəniyyət supernatantından və ya ekstraksiya buferindən təcrid olunmuş və Tris-EDTA buferində yenidən suspenziya edilmişdir.
Gücləndirilmiş faq, venadaxili (IV) inyeksiyadan (500 μl/heyvan) əvvəl endotoksin təmizləmə muncuqlarından (Miltenyi Biotec) istifadə edərək 2-3 mərhələli endotoksin təmizlənməsinə məruz qaldı. Birinci mərhələdə 2×1012 faq; ikinci mərhələdə 2×1010 faq; üçüncü və dördüncü seçim mərhələlərində hər heyvan üçün 2×109 faq daxil edildi. Göstərilən vaxt nöqtələrində toplanan OBM və qan nümunələrində faq tərkibi istehsalçının təlimatlarına (T7Select sistem təlimatı) uyğun olaraq lövhə sayımı ilə müəyyən edildi. Faq seçimi təmizlənmiş kitabxanaların quyruq venasına venadaxili yeridilməsi və ya əvvəlki seçim mərhələsindən OBM-dən çıxarılan faqın yenidən yeridilməsi ilə həyata keçirildi və sonrakı yığımlar müvafiq olaraq OBM və qan nümunələrində 10 dəqiqə, 30 dəqiqə, 60 dəqiqə, 90 dəqiqə, 120 dəqiqə, 180 dəqiqə və 240 dəqiqə ərzində aparıldı. Seçilmiş iki budağın ayrıca saxlanıldığı və ilk üç seçim mərhələsində təhlil edildiyi cəmi dörd in vivo panning mərhələsi aparıldı. İlk iki seçim mərhələsindən CSF-dən çıxarılan bütün faq əlavələri 454/Roche pirosekvensiyasına məruz qaldı, son iki seçim mərhələsindən CSF-dən çıxarılan bütün klonlar isə əl ilə ardıcıllıqla düzüldü. Seçmə mərhələsindən bütün qan faqları da 454/Roche pirosekvensiyasına məruz qaldı. Faq klonlarının inyeksiyası üçün seçilmiş faqlar 500 sm2 lövhələrdə E. coli (BL5615)-də 37°C-də 4 saat ərzində gücləndirildi. Fərdi olaraq seçilmiş və əl ilə ardıcıllıqla düzülmüş klonlar TB mühitində çoxaldıldı. Faq ekstraksiyasından, təmizlənməsindən və endotoksinin çıxarılmasından sonra (yuxarıda təsvir edildiyi kimi), 300 μl-də 2×1010 faq/heyvan bir quyruq venasına venadaxili yeridildi.
Ardıcıllıq məlumatlarının əvvəlcədən işlənməsi və keyfiyyətcə süzgəcdən keçirilməsi. Xam 454/Roche məlumatları satıcı proqram təminatından istifadə edərək ikili standart axın xəritəsi formatından (sff) Pearson insan tərəfindən oxuna bilən formatına (fasta) çevrildi. Nukleotid ardıcıllığının sonrakı işlənməsi aşağıda təsvir edildiyi kimi xüsusi C proqramları və skriptləri (buraxılmamış proqram paketi) istifadə edilərək həyata keçirildi. İlkin məlumatların təhlili ciddi çoxmərhələli süzgəc prosedurlarını əhatə edir. Etibarlı 12mer əlavə DNT ardıcıllığı olmayan oxunuşları süzgəcdən keçirmək üçün oxunuşlar qlobal Needleman-Wunsch testindən istifadə edərək başlanğıc etiketinə (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), dayanma etiketinə (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) və arxa plan əlavəsinə (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) ardıcıl olaraq uyğunlaşdırıldı. uyğunlaşdırma hər uyğunlaşdırma üçün 2-yə qədər uyğunsuzluğa imkan verir31. Buna görə də, başlanğıc və dayanma etiketləri olmayan oxunuşlar və arxa plan əlavələri olan oxunuşlar, yəni icazə verilən uyğunsuzluq sayını aşan uyğunlaşdırmalar kitabxanadan silindi. Qalan oxunuşlara gəldikdə isə, başlanğıc nişanından başlayaraq dayanma nişanı orijinal oxunuş ardıcıllığından çıxarılıb daha da işlənməzdən əvvəl bitən N-mer DNT ardıcıllığı (bundan sonra "əlavə" adlandırılacaq) əlavədən sonra, praymerin 5' ucundakı ilk dayanma kodonundan sonrakı hissə əlavədən çıxarılır. Bundan əlavə, praymerin 3' ucundakı natamam kodonlara aparan nukleotidlər də çıxarıldı. Yalnız fon ardıcıllıqlarını ehtiva edən əlavələri istisna etmək üçün "PAG" amin turşusu nümunəsi ilə başlayan tərcümə olunmuş əlavələr də çıxarıldı. Kitabxanadan translyasiyadan sonrakı uzunluğu 3 amin turşusundan az olan peptidlər çıxarıldı. Nəhayət, əlavə hovuzundakı artıqlığı çıxarın və hər bir unikal əlavənin tezliyini təyin edin. Bu analizin nəticələrinə nukleotid ardıcıllıqlarının (əlavələrin) siyahısı və onların (oxunma) tezlikləri daxil idi (Əlavə Şəkillər 1c və 2).
Ardıcıllıq oxşarlığına görə N-mer DNT qrupu əlavələri: 454/Roş-spesifik ardıcıllıq səhvlərini (məsələn, homopolimer uzantılarının ardıcıllığı ilə bağlı problemlər) aradan qaldırmaq və daha az əhəmiyyətli artıqlıqları aradan qaldırmaq üçün əvvəllər filtrlənmiş N-mer DNT ardıcıllığı əlavələri (əlavələri) oxşarlığa görə sıralanır. əlavələr (2-yə qədər uyğun olmayan əsasa icazə verilir) aşağıdakı kimi təyin olunmuş təkrarlanan alqoritmdən istifadə edərək: əlavələr əvvəlcə tezliyinə görə (ən yüksəkdən ən aşağıya), eynidirsə, uzunluğuna görə ikinci dərəcəli çeşidlənməsinə görə (ən uzundan ən qısaya) sıralanır. Beləliklə, ən tez-tez və ən uzun əlavələr ilk "qrupu" təyin edir. Qrup tezliyi açar tezliyinə təyin olunur. Daha sonra, sıralanmış siyahıda qalan hər bir əlavə cütlüklü Needleman-Wunsch uyğunlaşdırması ilə qrupa əlavə edilməyə çalışıldı. Uyğunlaşdırmada uyğunsuzluqların, əlavələrin və ya silinmələrin sayı 2 həddini keçməzsə, qrupa bir əlavə əlavə edilir və ümumi qrup tezliyi əlavənin nə qədər tez-tez əlavə olunduğuna görə artır. Qrupa əlavə edilmiş əlavələr istifadə edilmiş kimi qeyd olunur və sonrakı emaldan xaric edilir. Əgər əlavə ardıcıllığı artıq mövcud olan qrupa əlavə edilə bilmirsə, əlavə ardıcıllığı müvafiq əlavə tezliyinə malik yeni bir qrup yaratmaq üçün istifadə olunur və istifadə edildiyi kimi qeyd olunur. Təkrarlama hər bir əlavə ardıcıllığı ya yeni bir qrup yaratmaq üçün istifadə edildikdə, ya da artıq mövcud olan bir qrupa daxil edilə bildikdə başa çatır. Axı, nukleotidlərdən ibarət qruplaşdırılmış əlavələr nəticədə peptid ardıcıllıqlarına (peptid kitabxanaları) çevrilir. Bu analizin nəticəsi ardıcıl oxunuşların sayını təşkil edən əlavələr dəsti və onlara uyğun tezliklərdir (Əlavə Şəkil 2).
Motiv Generasiyası: Unikal peptidlərin siyahısına əsasən, aşağıda göstərildiyi kimi bütün mümkün amin turşusu nümunələrini (aa) ehtiva edən bir kitabxana yaradıldı. Uzunluğu 3 olan hər bir mümkün nümunə peptiddən çıxarıldı və onun tərs nümunəsi bütün nümunələri (tripeptidlər) ehtiva edən ortaq bir motiv kitabxanası ilə birlikdə əlavə edildi. Yüksək təkrarlanan motivlərin kitabxanaları ardıcıllıqla düzüldü və artıqlıq aradan qaldırıldı. Daha sonra, motiv kitabxanasındakı hər bir tripeptid üçün hesablama vasitələrindən istifadə edərək kitabxanada mövcudluğunu yoxladıq. Bu halda, tapılan motiv tripeptidini ehtiva edən peptidin tezliyi əlavə edilir və motiv kitabxanasındakı motivə təyin edilir ("motivlərin sayı"). Motiv generasiyasının nəticəsi, tripeptidlərin (motivlərin) bütün meydana gəlmələrini və onların müvafiq dəyərlərini ehtiva edən ikiölçülü bir massivdir, bunlar oxunuşlar süzüldükdə, qruplaşdırıldıqda və tərcümə edildikdə müvafiq motivlə nəticələnən ardıcıllıq oxunuşlarının sayıdır. Yuxarıda ətraflı təsvir edildiyi kimi metriklər.
Motivlərin və müvafiq səpələnmə qrafiklərinin sayının normallaşdırılması: Hər nümunə üçün motivlərin sayı istifadə edilərək normallaşdırılıb
burada ni, i mövzusunu ehtiva edən oxumaların sayıdır. Beləliklə, vi, nümunədə i motivini ehtiva edən oxumaların (və ya peptidlərin) faiz tezliyini təmsil edir. Normallaşdırılmamış motiv sayı üçün P-dəyərləri Fişerin dəqiq testindən istifadə etməklə hesablanmışdır. Motiv sayının korreloqramlarına gəldikdə, Spirmanın korrelyasiyaları R ilə normallaşdırılmış motiv sayından istifadə etməklə hesablanmışdır.
Peptid kitabxanasındakı hər mövqedəki amin turşularının tərkibini vizuallaşdırmaq üçün 32, 33 veb loqoqramları (http://weblogo.threeplusone.com) yaradıldı. Əvvəlcə 12-mer peptidin hər mövqeyindəki amin turşularının tərkibi 20×12 matrisdə saxlanılır. Daha sonra, hər mövqedə eyni nisbi amin turşusu tərkibini ehtiva edən 1000 peptid dəsti fasta-ardıcıllıq formatında yaradılır və verilən peptid kitabxanası üçün hər mövqedəki nisbi amin turşusu tərkibinin qrafik təsvirini yaradan veb-loqo 3-ə giriş kimi təqdim olunur. Çoxölçülü məlumat dəstlərini vizuallaşdırmaq üçün istilik xəritələri R-də daxili olaraq hazırlanmış bir vasitə (biosHeatmap, hələ buraxılmamış R paketi) istifadə edilərək yaradıldı. İstilik xəritələrində təqdim olunan dendroqramlar, Evklid məsafə metrikası ilə Ward-ın iyerarxik klasterləşdirmə metodu ilə hesablanmışdır. Motiv qiymətləndirmə məlumatlarının statistik təhlili üçün normallaşdırılmamış qiymətləndirmə üçün P dəyərləri Fişerin dəqiq testi ilə hesablanmışdır. Digər məlumat dəstləri üçün P-dəyərləri R-də Tələbənin t-testi və ya ANOVA istifadə edilərək hesablanmışdır.
Seçilmiş faq klonları və əlavəsiz faqlar quyruq venası vasitəsilə venadaxili yeridildi (300 μl PBS-də 2×1010 faq/heyvan). Perfuziyadan və sonrakı fiksasiyadan on dəqiqə əvvəl eyni heyvanlara venadaxili 100 μl DyLight594 ilə işarələnmiş lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177) yeridildi. Faq yeridildikdən 60 dəqiqə sonra siçovullara ürəkdən 50 ml PBS, ardınca 50 ml 4% PFA/PBS ilə perfuziya edildi. Beyin nümunələri əlavə olaraq 4% PFA/PBS-də bir gecə fiksasiya edildi və 4°C-də bir gecə 30% saxarozada isladıldı. Nümunələr OCT qarışığında ani dondurulur. Dondurulmuş nümunələrin immunohistokimyəvi analizi otaq temperaturunda 1% BSA ilə bloklanmış və 4 °C-də T7 faqına (Novus NB 600-376A) qarşı poliklonal FITC ilə işarələnmiş antikorlarla inkubasiya edilmiş 30 µm krioseksiyalar üzərində aparılmışdır. Bir gecə inkubasiya edin. Nəhayət, kəsiklər PBS ilə 3 dəfə yuyulmuş və konfokal lazer mikroskopu (Leica TCS SP5) ilə müayinə edilmişdir.
Minimum 98% təmizliyə malik bütün peptidlər GenScript USA tərəfindən sintez edilmiş, biotinləşdirilmiş və liofilizə edilmişdir. Biotin N-terminalında əlavə üçqat qlisin aralayıcısı vasitəsilə bağlanır. Kütlə spektrometriyasından istifadə edərək bütün peptidləri yoxlayın.
Streptavidin (Sigma S0677) biotinləşdirilmiş peptidin 5 qat ekvimolyar artıqlığı, biotinləşdirilmiş BACE1 inhibitor peptidi və ya biotinləşdirilmiş BACE1 inhibitor peptidi və BACE1 inhibitor peptidin 5-10% DMSO-da kombinasiyası (3:1 nisbəti) ilə qarışdırılmış/PBS-də inkubasiya edilmişdir. İnyeksiyadan 1 saat əvvəl otaq temperaturunda. Streptavidinlə birləşdirilmiş peptidlər beyin boşluğu olan siçovulların quyruq venalarından birinə 10 mq/kq dozada venadaxili yeridilmişdir.
Streptavidin-peptid komplekslərinin konsentrasiyası ELISA ilə qiymətləndirilmişdir. Nunc Maxisorp mikrotitr lövhələri (Sigma) 4°C-də gecə boyu 1,5 μg/ml siçan anti-streptavidin antikoru (Thermo, MA1-20011) ilə örtülmüşdür. Bloklamadan sonra (bloklama buferi: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% jelatin, 1% BSA) otaq temperaturunda 2 saat ərzində lövhəni 0,05% Tween-20/PBS (yuma buferi) ilə 3 saniyə ərzində yuyun, CSF və plazma nümunələri bloklama buferi (plazma 1:10,000, CSF 1:115) ilə seyreltilmiş quyulara əlavə edilmişdir. Daha sonra lövhə 4°C-də gecə ərzində aşkarlama antikoru (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) ilə inkubasiya edilmişdir. Üç yuma mərhələsindən sonra streptavidin TMB substrat məhlulunda (Roche) 20 dəqiqəyə qədər inkubasiya yolu ilə aşkar edildi. 1M H2SO4 ilə rəng inkişafını dayandırdıqdan sonra 450 nm-də absorbsiyanı ölçün.
Streptavidin-peptid-BACE1 inhibitor kompleksinin funksiyası istehsalçının protokoluna (Wako, 294-64701) uyğun olaraq Aβ(1-40) ELISA ilə qiymətləndirilmişdir. Qısaca desək, CSF nümunələri standart durulaşdırıcıda (1:23) durulaşdırılmış və BNT77 tutma antikoru ilə örtülmüş 96 quyulu lövhələrdə 4°C-də bir gecə inkubasiya edilmişdir. Beş yuma mərhələsindən sonra HRP ilə birləşdirilmiş BA27 antikoru əlavə edilmiş və 4°C-də 2 saat inkubasiya edilmiş, ardınca isə beş yuma mərhələsi keçirilmişdir. Aβ(1–40) otaq temperaturunda 30 dəqiqə TMB məhlulunda inkubasiya yolu ilə aşkar edilmişdir. Rəng inkişafı dayanacaq məhlulu ilə dayandırıldıqdan sonra 450 nm-də absorbsiyanı ölçün. Plazma nümunələri Aβ(1–40) ELISA-dan əvvəl bərk fazalı ekstraksiyaya məruz qalmışdır. Plazma 96 quyulu lövhələrdə 0,2% DEA (Sigma) əlavə edilmiş və otaq temperaturunda 30 dəqiqə inkubasiya edilmişdir. SPE lövhələri (Oasis, 186000679) ardıcıl olaraq su və 100% metanol ilə yuyulduqdan sonra plazma nümunələri SPE lövhələrinə əlavə edildi və bütün maye çıxarıldı. Nümunələr yuyuldu (əvvəlcə 5% metanol, sonra 30% metanol ilə) və 2% NH4OH/90% metanol ilə eluasiya edildi. Eluat 55°C-də sabit N2 cərəyanında 99 dəqiqə qurudulduqdan sonra nümunələr standart durulaşdırıcılarda reduksiya edildi və Aβ(1–40) yuxarıda təsvir edildiyi kimi ölçüldü.
Bu məqaləyə necə istinad etmək olar: Urich, E. və b. İn vivo şəraitdə müəyyən edilmiş tranzit peptidlərdən istifadə edərək beyinə yük çatdırılması. elm. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB və Moos T. Hədəflənmiş terapiya istifadə edərək beyinə makromolekulyar dərmanların çatdırılması. Neyrokimya jurnalı 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. və Martinez-Martinez, P. Peptid və protein dərmanlarının qan-beyin baryerindən keçməsi. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Qan-beyin baryeri: beyin dərmanlarının hazırlanmasında maneə. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG və Byrd, A. Dərmanların xoroid pleksus-CSF yolu vasitəsilə beyinə çatdırılmasının və hədəflənməsinin yaxşılaşdırılması perspektivləri. Əczaçılıq Tədqiqatları 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Beyin çatdırılması üçün molekulyar Troya atları ilə biofarmasevtik preparatların modernləşdirilməsi. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM reseptor vasitəçiliyi ilə qan-beyin baryeri vasitəsilə peptid daşınması. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. və b. Monovalent molekulyar servolardan istifadə edərək terapevtik antikorların beyinə nüfuz etməsini və effektivliyini artırın. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. və b. Transferrin reseptorunun (TfR) daşınması TfR antikorlarının affinlik variantlarının beynin mənimsənilməsini təyin edir. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).