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O lo'o fa'aalia ai se fa'asologa o ata e tolu i le taimi e tasi. Fa'aaoga fa'amau Muamua ma le Sosoo e fa'ase'e ai i ata e tolu i le taimi e tasi, pe fa'aaoga fa'amau ata i le pito i tua e fa'ase'e ai i ata e tolu i le taimi e tasi.
O le pa puipui o le toto-fai'ai ma le pa puipui o le toto-fai'ai e taofia ai vaila'au fa'aolaola mai le o'o atu i a latou sini i le faiga tutotonu o neula, ma fa'alavelaveina ai le togafitiga lelei o fa'ama'i neula. Ina ia maua ni mea fou e feavea'i ai le fai'ai i totonu o le tino ola, na matou fa'alauiloaina ai se faletusi peptide phage T7 ma aoina fa'asolosolo le toto ma le vai o le cerebrospinal (CSF) e fa'aaoga ai se fa'ata'ita'iga tele o le vaita'ele o isumu ua fa'apipi'iina i totonu o le tino. O ni phage clones fa'apitoa na matua fa'amauoa i le CSF ina ua mae'a ta'amilosaga e fa o le filifiliga. O su'ega o peptides ta'ito'atasi na fa'aalia ai le sili atu i le 1000-fold o le fa'amauoa i le CSF. O le bioactivity o le tu'uina atu o le peptide i le fai'ai na fa'amaonia e ala i le 40% fa'aitiitia o le maualuga o le amyloid-β i le vai o le cerebrospinal e fa'aaoga ai se BACE1 peptide inhibitor e feso'ota'i ma le peptide fou ua fa'ailoa mai. O nei taunu'uga e fa'ailoa mai ai o peptides ua fa'ailoa mai e auala o le filifiliga o le phage i totonu o le tino ola atonu o ni auala aoga mo le tu'uina atu o macromolecules i le fai'ai ma se aafiaga fa'amalolo.
O suʻesuʻega faʻapitoa mo togafitiga faʻapitoa o le CNS ua taulaʻi tele i le faʻailoaina o vailaʻau ma sui e faʻaalia ai uiga faʻapitoa o le CNS, faʻatasi ai ma le itiiti o taumafaiga i le sailia o auala e faʻatino ai le tuʻuina atu o vailaʻau i le faiʻai. Ua amata ona suia lenei mea i le taimi nei ona o le tuʻuina atu o vailaʻau, aemaise lava molelaʻau tetele, o se vaega taua o le atinaʻeina o vailaʻau faʻaonaponei o le neuroscience. O le siosiomaga o le ogatotonu o le neula ua puipuia lelei e le faiga o le cerebrovascular barrier, e aofia ai le blood-brain barrier (BBB) ​​​​ma le blood-brain barrier (BCBB)1, ma faigata ai ona tuʻuina atu vailaʻau i le faiʻai1,2. Ua fuafuaina e toetoe lava o vailaʻau molelaʻau tetele uma ma le silia ma le 98% o vailaʻau molelaʻau laiti e aveeseina mai le faiʻai3. O le mafuaʻaga lea e taua tele ai le faʻailoaina o faiga fou o felauaiga i le faiʻai e tuʻuina atu ai vailaʻau faʻapitoa ma lelei i le CNS 4,5. Peitaʻi, o le BBB ma le BCSFB e tuʻuina atu ai foʻi se avanoa sili mo le tuʻuina atu o vailaʻau aʻo latou ulu atu ma ulufale atu i fausaga uma o le faiʻai e ala i ona alatoto tetele. O le mea lea, o taumafaiga o loʻo iai nei e faʻaaoga ai auala e le afaina ai le tuʻuina atu i le faiʻai e tele lava ina faʻavae i luga o le faiga o le felauaiga e faʻaaogaina e le receptor (PMT) e faʻaaoga ai le endogenous BBB6 receptor. E ui i alualu i luma taua talu ai nei e faʻaaoga ai le auala o le transferrin receptor7,8, e manaʻomia le atinaʻeina atili o faiga fou e tuʻuina atu ai ma meatotino faʻaleleia. Mo lenei faʻamoemoe, o la matou sini o le faʻailoaina lea o peptides e mafai ona faʻatautaia le felauaiga o le CSF, aua e mafai ona faʻaaogaina i le mataupu faavae e tuʻuina atu ai macromolecules i le CNS poʻo le tatalaina o auala fou o le receptor. Ae maise lava, o receptors ma transporters faʻapitoa o le cerebrovascular system (BBB ma BSCFB) e mafai ona avea ma sini mo le tuʻuina atu o vailaʻau faʻapitoa ma faʻapitoa. O le Cerebrospinal fluid (CSF) o se oloa secretory o le choroid plexus (CS) ma e fesoʻotaʻi tuusaʻo ma le interstitial fluid o le faiʻai e ala i le subarachnoid space ma le ventricular space4. Talu ai nei ua faʻaalia ai o le subarachnoid cerebrospinal fluid e sosolo tele i totonu o le interstitium o le faiʻai9. Matou te faʻamoemoe e maua le avanoa parenchymal e faʻaaoga ai lenei subarachnoid inflow tract poʻo le tuusaʻo e ala i le BBB. Ina ia ausia lenei mea, na matou faʻatinoina se fuafuaga malosi e filifili ai phage in vivo e faʻailoa lelei ai peptides o loʻo feaveaʻiina e se tasi o nei auala eseese e lua.
Matou te faʻamatalaina nei se metotia o le suʻesuʻeina o le faʻaaliga o le phage i totonu o le vivo faʻatasi ai ma le faʻataʻitaʻiga o le CSF faʻatasi ai ma le faʻasologa maualuga o le throughput (HTS) e mataʻituina ai taʻamilosaga filifilia muamua ma le tele o le eseesega o le faletusi. Sa faia le suʻesuʻega i luga o isumu ua iloa lelei ma se cannula tele o le cisterna (CM) ua faʻapipiʻiina tumau e aloese ai mai le faʻaleagaina o le toto. O le mea taua, o lenei auala e filifilia ai le faʻatatauina o le faiʻai ma peptides e iai le gaioiga felauaiga i luga o le pa puipui o le cerebrovascular. Sa matou faʻaaogaina phages T7 ona o lo latou laʻititi (~60 nm)10 ma fautuaina e talafeagai mo le felauaiga o vesicles e mafai ai ona sopoʻia le endothelial ma/poʻo le epithelial-medulla barrier. Ina ua maeʻa taʻamilosaga e fa o le panning, na vavaeʻeseina ai vaega o phage e faʻaalia ai le malosi o le faʻaleleia atili o le CSF i totonu o le vivo ma le fesoʻotaʻiga o le cerebral microvessel. O le mea taua, sa mafai ona matou faʻamaonia a matou sailiga e ala i le faʻaalia o peptides sili ona lelei e sili ona fiafia i ai ma faʻasolosolo faʻakemikolo e mafai ona felauaiga le uta o porotini i totonu o le vai cerebrospinal. Muamua, o aafiaga faʻapitoa o le CNS na faʻatuina e ala i le tuʻufaʻatasia o se peptide transit taʻimua ma se inhibitor o le peptide BACE1. I le faʻaopoopoga i le faʻaalia o auala suʻesuʻe galuega faatino in vivo e mafai ona faʻailoa ai peptides fou o felauaiga o le faiʻai e avea ma avega lelei o porotini, matou te faʻamoemoe o auala faʻapitoa e filifili ai galuega faatino o le a taua foi i le faʻailoaina o auala fou o felauaiga o le faiʻai.
E faʻavae i luga o iunite faʻatulagaina o le plaque (PFU), ina ua maeʻa le laʻasaga o le afifiina o le phage, na mamanuina ma fatuina ai se faletusi o peptides phage T7 linear 12-mer faʻafuaseʻi ma le eseesega e tusa ma le 109 (tagai i Meafaitino ma Metotia). E taua le maitauina na matou iloiloina ma le faʻaeteete lenei faletusi aʻo leʻi faia le in vivo panning. O le faʻateleina o le PCR o faʻataʻitaʻiga o le faletusi o le phage e faʻaaoga ai primers ua suia na faia ai amplicons na faʻatatau saʻo i le HTS (Ata Faʻaopoopo 1a). Ona o le a) sese o le faʻasologa o le HTS11, b) aʻafiaga i le lelei o primers (NNK)1-12, ma le c) le i ai o le wild-type (wt) phage (skeleton inserts) i le faletusi tumau, na faʻatinoina ai se faiga faʻamama faʻasologa e aveese ai naʻo faʻamatalaga faʻasologa ua faʻamaonia (Ata Faʻaopoopo 1b). O nei laʻasaga faʻamama e faʻatatau i faletusi faʻasologa uma o le HTS. Mo le faletusi masani, e 233,868 faitauga na maua, lea e 39% na pasia ai le faʻatulagaina o le faʻamama ma na faʻaaogaina mo le auʻiliʻiliga o le faletusi ma le filifilia mo taʻamilosaga mulimuli ane (Ata Faʻaopoopo 1c–e). O faitauga e tele lava ina fa'ateleina o paga fa'avae e 3 le umi ma le tumutumuga i le 36 nucleotides (Ata Fa'aopoopo 1c), e fa'amaonia ai le mamanu o le faletusi (NNK) 1-12. E taua tele, e tusa ma le 11% o tagata o le faletusi o lo'o i ai se fa'aopoopoga PAGISRELVDKL 12-dimensional wild-type (wt), ma toetoe lava o le afa o fa'asologa (49%) o lo'o i ai fa'aopoopoga po'o tapeina. Na fa'amaonia e le HTS o le faletusi o le faletusi le tele o le eseesega o peptides i le faletusi: e silia ma le 81% o fa'asologa peptide na maua fa'atasi ma na'o le 1.5% na tupu i le ≥4 kopi (Ata Fa'aopoopo 2a). O le tele o amino acids (aa) i tulaga uma e 12 i le repertoire e feso'ota'i lelei ma le tele o fa'amoemoega mo le aofa'i o codons na gaosia e le repertoire NKK ua fa'aleagaina (Ata Fa'aopoopo 2b). O le tele o aa residues na matauina na fa'ailoa mai e nei fa'aopoopoga e feso'ota'i lelei ma le tele o le fuafuaina (r = 0.893) (Ata Fa'aopoopo 2c). O le sauniuniga o faletusi phage mo le tuiina e aofia ai laasaga o le faʻateleina ma le aveeseina o le endotoxin. Ua faʻaalia muamua lenei mea e ono faʻaitiitia ai le eseesega o faletusi phage12,13. O le mea lea, na matou faʻasologaina ai se faletusi phage ua faʻateleina le plate lea na aveeseina le endotoxin ma faʻatusatusa i le faletusi muamua e faʻatatau ai le tele o le AA. O se fesoʻotaʻiga malosi (r = 0.995) na matauina i le va o le vaitaʻele muamua ma le vaitaʻele ua faʻateleina ma faʻamamaina (Ata Faʻaopoopo 2d), o loʻo faʻaalia ai o le tauvaga i le va o clones ua faʻateleina i luga o plates e faʻaaoga ai le T7 phage e leʻi mafua ai le faʻaituau tele. O lenei faʻatusatusaga e faʻavae i luga o le tele o motif tripeptide i faletusi taʻitasi, talu ai o le eseesega o faletusi (~109) e le mafai ona puʻeina atoatoa e tusa lava pe i ai le HTS. O le suʻesuʻega o le tele o le aa i tulaga taʻitasi na faʻaalia ai se faʻaituau laʻititi e faʻalagolago i le tulaga i tulaga mulimuli e tolu o le repertoire na ulufale i ai (Ata Faʻaopoopo 2e). I le faʻaiʻuga, na matou faʻaiʻuina ai o le lelei ma le eseesega o le faletusi sa taliaina ma naʻo ni suiga laiti i le eseesega na matauina ona o le faʻateleina ma le sauniuniga o faletusi phage i le va o ni nai taʻamilosaga o filifiliga.
E mafai ona faia le fa'asologa o le su'esu'ega o le vai o le cerebrospinal e ala i le fa'apipi'iina o se cannula i totonu o le CM o isumu ua iloa le mea moni e fa'afaigofie ai le iloa o le T7 phage na tuiina i le uaua (iv) e ala i le BBB ma/po'o le BCSFB (Ata 1a-b). Na matou fa'aogaina ni vaega se lua e filifili tuto'atasi (vaega A ma le B) i ta'amilosaga muamua e tolu o le filifiliga i totonu o le tino (Ata 1c). Na matou fa'ateleina malie le faigata o le filifiliga e ala i le fa'aitiitia o le aofa'i atoa o le phage na fa'aofiina i ta'amilosaga muamua e tolu o le filifiliga. Mo le ta'amilosaga lona fa o le panning, na matou tu'ufa'atasia ai fa'ata'ita'iga mai lala A ma le B ma fa'atino ni filifiliga tuto'atasi se tolu. Mo le su'esu'eina o meatotino i totonu o le tino o vaega o le T7 phage i lenei fa'ata'ita'iga, na tuiina ai le wild-type phage (PAGISRELVDKL master insert) i totonu o isumu e ala i le vein o le si'usi'u. O le toe maua mai o phages mai le vai o le cerebrospinal ma le toto i taimi eseese na fa'aalia ai o phages T7 icosahedral laiti e vave ona vave ona aveese mai le vaega o le toto (Ata Fa'aopoopo 3). E faʻavae i luga o titers na tuʻuina atu ma le aofaʻi o le toto o isumu, na matou fuafuaina e naʻo le tusa ma le 1% wt. phage mai le tui na tuʻuina atu na iloa i le toto i le 10 minute talu ona tuiina i le uaua. Ina ua maeʻa lenei faʻaitiitia vave muamua, na fuaina ai se faʻamamaina muamua e lemu ma le afa-ola e 27.7 minute. O le mea taua, e naʻo ni nai phages na maua mai le vaega o le CSF, o loʻo faʻaalia ai se talaaga maualalo mo le femalagaʻiga o phage wild-type i totonu o le vaega o le CSF (Ata Faʻaopoopo 3). I le averesi, e naʻo le tusa ma le 1 x 10-3% titers o le T7 phage i le toto ma le 4 x 10-8% o phages na muamua faʻaofiina na iloa i le vai cerebrospinal i le vaitaimi atoa o le faʻataʻitaʻiga (0-250 min). E maitauina, o le afa-ola (25.7 min) o le phage wild-type i le vai cerebrospinal e tutusa ma le mea na matauina i le toto. O nei faʻamaumauga e faʻaalia ai o loʻo lelei pea le pa puipui e vavaeʻese ai le vaega o le CSF mai le toto i isumu ua faʻaaogaina le CM, ma mafai ai ona filifilia in vivo o faletusi o phage e faʻailoa ai clones e faigofie ona feaveaʻi mai le toto i totonu o le vaega o le CSF.
(a) Fa'atulagaina o se metotia mo le toe fa'ata'ita'iina o le vai o le cerebrospinal (CSF) mai se vaita'ele tele. (b) Ata o lo'o fa'aalia ai le tulaga o le sela o le pa puipui o le faiga tutotonu o neula (CNS) ma le fuafuaga filifilia e fa'aaogaina e fa'ailoa ai peptides e sopo'ia le pa puipui o le toto-fai'ai (BBB) ​​​​ma le pa puipui o le toto-fai'ai. (c) Siata tafe o le fa'aaliga o le phage in vivo. I ta'amilosaga ta'itasi o le filifiliga, o phages (fa'ailoga o manu i totonu o aū) na tuiina i le uaua. E lua lala tuto'atasi eseese (A, B) e teuina eseese se'ia o'o i le ta'amilosaga lona 4 o le filifiliga. Mo ta'amilosaga filifiliga 3 ma le 4, o phage clone ta'itasi na aveese mai le CSF na fa'asologaina lima. (d) Kinetics o phage na vavae'ese mai le toto (li'o mumu) ma le vai o le cerebrospinal (tafatolu lanumeamata) i le taimi o le ta'amilosaga muamua o le filifiliga i isumu e lua na fa'apipi'iina i le uaua ina ua uma ona tuiina i le uaua o le faletusi peptide T7 (2 x 1012 phages/manu). O sikuea lanumoana e faʻaalia ai le averesi o le maualuga muamua o le phage i le toto, e fuafuaina mai le aofaʻi o le phage na tuiina, ma amanaʻia ai le aofaʻi atoa o le toto. O sikuea uliuli e faʻaalia ai le tulaga o le feiloaʻiga o le laina y na faʻaopoopoina mai le maualuga o le phage i le toto. (e,f) Tuʻuina atu le tele o taimi ma le tufatufaina o motif tripeptide uma e mafai ona fefiloi o loʻo maua i le peptide. O loʻo faʻaalia le aofaʻi o motif na maua i le 1000 faitauga. O le mea taua (p < 0.001) o motif faʻamauoa ua faʻailogaina i togitogi mumu. (e) Correlation scatterplot e faʻatusatusa ai le tele o taimi o le motif tripeptide o le faletusi tuiina ma le phage e maua mai le toto mai manu #1.1 ma le #1.2. (f) Correlation scatterplot e faʻatusatusa ai le tele o taimi o motif tripeptide phage manu #1.1 ma le #1.2 na vavaeʻeseina i le toto ma le vai cerebrospinal. (g, h) Faʻatusa o le Sequence ID o le phage ua faʻamauoa i le toto (g) e faʻatusatusa i faletusi tuiina ma le phage ua faʻamauoa i le CSF (h) e faʻatusatusa i le toto pe a uma se taʻamilosaga o filifiliga in vivo i manu uma e lua. O le telē o le mataitusi e tasi e faʻaalia ai le tele o taimi e tupu ai le amino acid i lea tulaga. Lanumeamata = polar, violē = neutral, lanumoana = base, mumu = acidic ma uliuli = hydrophobic amino acids. O le Ata 1a, b na mamanuina ma gaosia e Eduard Urich.
Na matou tuiina se faletusi peptide phage i totonu o isumu e lua o le CM instrument (clades A ma le B) ma vavae ese le phage mai le vai o le cerebrospinal ma le toto (Ata 1d). O le vave muamua o le faʻamamaina o le faletusi sa le tele sona iloga pe a faʻatusatusa i le phage wild-type. O le afa-ola o le averesi o le faletusi na tuiina i manu uma e lua e 24.8 minute i le toto, e tutusa ma le phage wild-type, ma le 38.5 minute i le CSF. O faʻataʻitaʻiga o le toto ma le vai o le cerebrospinal phage mai manu taʻitasi na faia i le HTS ma o peptide uma na faʻailoaina na suʻesuʻeina mo le i ai o se motif tripeptide pupuu. Na filifilia motif tripeptide ona latou te maua ai se faʻavae laʻititi mo le fausiaina o le fausaga ma fegalegaleaiga peptide-protein14,15. Na matou maua se fesoʻotaʻiga lelei i le tufatufaina o motif i le va o le faletusi phage na tuiina ma clones na aumaia mai le toto o manu uma e lua (Ata 1e). O faʻamaumauga e faʻaalia ai o le tuufaatasiga o le faletusi e naʻo sina tamaoaiga i le vaega o le toto. O le tele o amino acid ma le faʻasologa o le maliliega na toe suʻesuʻeina i tulaga taʻitasi e faʻaaoga ai se fetuunaiga o le polokalama Weblogo16. O le mea e ofo ai, na matou maua ai se fa'atamaoaiga malosi i toega o le glycine i le toto (Ata 1g). Ina ua fa'atusatusa le toto ma clones na filifilia mai le CSF, na matauina ai le filifiliga malosi ma nisi o le aveeseina o motifs (Ata 1f), ma o nisi amino acids na iai muamua i tulaga ua uma ona fuafuaina i le 12-member (Ata 1h). E taua tele, o manu ta'itasi e eseese tele i le vai o le cerebrospinal, ae o le fa'atamaoaigaina o le glycine i le toto na matauina i manu uma e lua (Ata Fa'aopoopo 4a–j). Ina ua mae'a le fa'amama malosi o fa'amaumauga o le fa'asologa i le vai o le cerebrospinal o manu #1.1 ma le #1.2, na maua ai le aofa'i o peptides tulaga ese e 964 ma le 420 12-mer (Ata Fa'aopoopo 1d–e). O phage clones na tu'ueseeseina na fa'ateleina ma faia i ai se ta'amilosaga lona lua o le filifiliga in vivo. O phage na aveese mai le ta'amilosaga lona lua o le filifiliga na faia i ai le HTS i manu ta'itasi ma o peptides uma na fa'ailoaina na fa'aaogaina o se mea e ulufale ai i se polokalame e iloa ai motifs e iloilo ai le tutupu mai o motifs tripeptide (Ata 2a, b, ef). Pe a faatusatusa i le taamilosaga muamua o le phage na toe maua mai le CSF, na matou matauina ai le filifilia atili ma le aveeseina o le tele o motif i le CSF i lala A ma le B (Ata 2). Na faaaogaina se algorithm o le faailoaina o feso'ota'iga e iloa ai pe o latou faatusaina ni mamanu eseese o le faasologa tutusa. Na matauina se tutusa manino i le va o faasologa 12-dimensional na toe maua mai e le CSF i le isi clade A (Ata 2c, d) ma le clade B (Ata 2g, h). O le auiliiliga tuufaatasi i lala taitasi na faaalia ai ni talaaga eseese o filifiliga mo peptides 12-mer (Ata Faaopoopo 5c,d) ma se faateleina o le fua faatatau o le CSF/toto titer i le aluga o taimi mo clones tuufaatasi ina ua mae'a le taamilosaga lona lua o le filifiliga pe a faatusatusa i le taamilosaga muamua o le filifiliga (Ata Faaopoopo 5e). ).
Fa'amauoa o motifs ma peptides i le cerebrospinal fluid e ala i ta'amilosaga e lua sosoo o le filifiliga o le fa'aaliga o le phage in vivo.
O phages uma o le vai o le cerebrospinal na toe maua mai le taamilosaga muamua o manu taʻitasi (manu #1.1 ma le #1.2) na faʻapotopotoina, faʻateleina, faʻasologa HT ma toe tuiina faʻatasi (2 x 1010 phages/manu) 2 SM cannulated isumu (#1.1 → #). 2.1 ma le 2.2, 1.2 → 2.3 ma le 2.4). (a,b,e,f) Correlation scatterplots e faʻatusatusa ai le tele o taimi o tripeptide motifs o CSF-derived phages uma i le taamilosaga muamua ma le lua o filifiliga. Tele taimi ma le tufatufaina o motifs o loʻo faʻatusalia ai tripeptides uma e mafai ona fefiloi o loʻo maua i peptides i itu uma e lua. O loʻo faʻaalia le aofaʻi o motifs na maua i le 1000 faitauga. O motifs na filifilia pe tuʻua i se tasi o faletusi na faʻatusatusaina ua faʻailogaina i togitogi mumu. (c, d, g, h) O le fa'atusa o le logo o le fa'asologa o fa'asologa uumi uma e 12 amino acid e mauoa i le CSF e fa'avae i luga o ta'amilosaga 2 ma le 1 o le filifiliga i totonu o le tino ola. O le tele o le mata'itusi e tasi e fa'ailoa mai ai le tele o taimi e tupu ai lena amino acid i lena tulaga. Mo le fa'atusaina o le logo, o le tele o fa'asologa o le CSF e maua mai manu ta'ito'atasi i le va o ta'amilosaga filifiliga e lua e fa'atusatusa ma o fa'asologa fa'amauoa i le ta'amilosaga lona lua o lo'o fa'aalia: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ma le (h) #1.2–#2.4. O amino acid e sili ona mauoa i se tulaga tu'uina atu i (c, d) manu numera 2.1 ma le numera 2.2 po'o le (g, h) i manu numera 2.3 ma le numera 2.4 o lo'o fa'aalia i le lanu. Lanumeamata = polar, violē = neutral, lanumoana = base, mumu = acidic ma uliuli = hydrophobic amino acids.
A maeʻa le taamilosaga lona tolu o le filifiliga, na matou faʻailoaina ai ni faʻasologa tulaga ese o peptide e 124 (#3.1 ma le #3.2) mai le 332 CSF-reconstituted phage clones na vavaeʻese mai manu e lua (Faʻaopoopoga Ata 6a). O le faʻasologa LGSVS (18.7%) na sili ona maualuga le fua faatatau, sosoo ai ma le wild-type inserts PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ma SARGSWREIVSLS (2.2%). I le faʻasologa mulimuli lona fa, na matou tuʻufaʻatasia ai ni lālā se lua na filifilia tutoʻatasi mai manu eseese e tolu (Ata 1c). Mai le 925 faʻasologa o phage clones na toe maua mai le CSF, i le faʻasologa lona fa na matou maua ai ni faʻasologa tulaga ese e 64 o peptide (Faʻaopoopoga Ata 6b), lea na paʻu ai le fua faatatau o le wild-type phage i le 0.8%. O CSF clones e sili ona taatele i le taamilosaga lona fa o LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ma le RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). O le umi o peptides ua filifilia e mafua mai i le fa'aofiina/ave'esea o nucleotide po'o ni stop codons vave i totonu o le library primers pe a fa'aogaina ni degenerate codons mo le mamanu o le NNK library. O stop codons vave e fa'atupuina ai ni peptides pupuu ma ua filifilia ona o lo'o i ai le aa motif lelei. O peptides uumi e ono mafua mai i le fa'aofiina/ave'esea i totonu o le primers o synthetic libraries. O lenei mea e tu'u ai le stop codon ua mamanuina i fafo atu o le fa'avaa ma faitauina se'ia o'o ina aliali mai se stop codon fou i lalo ifo. I se tulaga lautele, na matou fuafuaina ai ni fa'amauoa mo taamilosaga filifilia uma e fa e ala i le fa'atusatusaina o fa'amatalaga ulufale ma fa'amatalaga o le fa'ata'ita'iga. Mo le taamilosaga muamua o le su'esu'ega, na matou fa'aaogaina ai titers o le phage wild-type e fai ma fa'asinomaga e le fa'apitoa. O le mea e malie ai, o le filifiliga leaga o le phage sa matua malosi lava i le taamilosaga muamua o le CSF, ae le o le toto (Ata 3a), lea atonu e mafua mai i le maualalo o le avanoa o le fa'asalalauina o le tele o tagata o le faletusi peptide i totonu o le vaega o le CSF po'o phages fa'atatau e masani ona sili atu ona lelei le taofia pe aveese mai le toto nai lo bacteriophages. Peita'i, i le taamilosaga lona lua o le panning, na matauina ai le filifiliga malosi o phages i le CSF i clades uma e lua, ma fa'ailoa mai ai o le taamilosaga muamua sa fa'amauoaina i phages o lo'o fa'aalia ai peptides e fa'alauiloa ai le fa'aaogaina o le CSF (Ata 3a). E le'i fa'amauoaina tele fo'i le toto. I le taamilosaga lona tolu ma le fa fo'i, o phage clones sa fa'amauoaina tele i le CSF. I le fa'atusatusaina o le tele o taimi o fa'asologa ta'itasi o le peptide i le va o ta'amilosaga mulimuli e lua o le filifiliga, na matou iloa ai o fa'asologa sa sili atu ona fa'amauoaina i le taamilosaga lona fa o le filifiliga (Ata 3b). E 931 tripeptide motifs na maua mai fa'asologa peptide tulaga ese uma e 64 e fa'aaoga ai fa'atulagaga peptide uma e lua. O motifs sili ona tamaoaiga i le taamilosaga lona fa na sili atu ona suʻesuʻeina ma le totoʻa mo a latou faʻamatalaga faʻaleleia i taamilosaga uma pe a faʻatusatusa i le faletusi tuiina (tipi: 10% faʻaleleia) (Ata Faʻaopoopo 6c). O mamanu lautele o filifiliga na faʻaalia ai o le tele o motifs na suʻesuʻeina na faʻaleleia i taamilosaga muamua uma o vaega filifilia uma e lua. Peitaʻi, o nisi motifs (e pei o le SGL, VSG, LGS GSV) e tele lava ina mai le isi vaega A, ae o isi (e pei o le FGW, RTN, WGF, NTR) na faʻaleleia i le isi vaega B.
Fa'amaoniga o le felauaiga a le CSF o peptides e fa'aalia i le phage e fa'amauoa i le CSF ma peptides ta'ita'i biotinylated e feso'ota'i ma uta o le streptavidin.
(a) Fua fa'atatau o le fa'amauoa na fuafuaina i ta'amilosaga uma e fa (R1-R4) e fa'atatau i luga o le tui (input = I) phage (PFU) titers ma le fuafuaina o le CSF phage titers (output = O). O mea e fa'amauoa ai mo ta'amilosaga mulimuli e tolu (R2-R4) na fuafuaina e ala i le fa'atusatusaga ma le ta'amilosaga muamua ma le ta'amilosaga muamua (R1) fa'atasi ai ma fa'amatalaga mamafa. O pa tatala o le cerebrospinal fluid, o pa valivali o le plasma. (***p<0.001, e fa'atatau i le Student's t-test). (b) Lisi o peptides phage e sili ona tele, fa'atulagaina e tusa ai ma lo latou fua fa'atatau i phages uma na aoina i le CSF ina ua mae'a le ta'amilosaga 4 o le filifiliga. O clones phage e ono e sili ona taatele o lo'o fa'ailoaina i lanu, fa'anumeraina ma a latou mea e fa'amauoa ai i le va o ta'amilosaga 3 ma le 4 o le filifiliga (insets). (c,d) O clones phage e ono e sili ona fa'amauoa, phage gaogao ma faletusi peptide phage matua mai le ta'amilosaga 4 na su'esu'eina ta'itasi i se fa'ata'ita'iga fa'ata'ita'iga CSF. O fa'ata'ita'iga CSF ma le toto na aoina i taimi na fa'ailoa mai. (c) Aofa'i tutusa o le 6 sui tauva o phage clones (2 x 1010 phages/manu), phages gaogao (#1779) (2 x 1010 phages/manu) ma faleoloa peptide phage (2 x 1012 phages/manu) O le tui e le itiiti ifo i le 3 CM e tu'uina atu i le manu ua fa'apipi'iina eseese e ala i le vein si'usi'u. O lo'o fa'aalia le pharmacokinetics o le CSF o phage clone ta'itasi ma le phage peptide library i le aluga o taimi. (d) o lo'o fa'aalia ai le averesi o le CSF/toto fua faatatau mo phages/mL uma na toe maua i le taimi o le fa'ata'ita'iga. (e) E fa synthetic leader peptides ma le tasi le scrambled control na fa'afeso'ota'i ma le biotin i le streptavidin e ala i la latou N-terminus (tetramer display) sosoo ai ma le tui (tail vein iv, 10 mg streptavidin/kg). E le itiiti ifo i le tolu isumu ua fa'apipi'iina i totonu o le paipa (N = 3). ). Sa aoina fa'ata'ita'iga o le CSF i taimi atofaina ma fuaina le maualuga o le streptavidin e ala i le CSF anti-streptavidin ELISA (nd = e le'i iloa). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, e fa'atatau i le suega ANOVA). (f) Fa'atusatusaga o le fa'asologa o amino acid o le phage peptide clone #2002 (lanu violē) sili ona fa'amauoa ma isi phage peptide clones ua filifilia mai le ta'amilosaga lona 4 o le filifiliga. O fasi amino acid tutusa ma tutusa ua fa'ailogaina i lanu.
Mai phages uma ua fa'amauoa i le ta'amilosaga lona fa (Ata 3b), e ono sui tauva clones na filifilia mo nisi su'esu'ega ta'ito'atasi i le fa'ata'ita'iga o le CSF sampler. E tutusa le aofa'i o sui tauva phage e ono, phage gaogao (leai se mea e fa'aofi) ma prophage peptide libraries na tuiina i totonu o manu CM e tolu na fa'apipi'iina i le cannulated, ma na fuafuaina pharmacokinetics i le CSF (Ata 3c) ma le toto (Fa'aopoopoga Ata 7) assays. O phage clones uma na fa'ata'ita'iina na fa'atatau i le vaega o le CSF i le tulaga e 10-1000 taimi e maualuga atu nai lo le phage pulea gaogao (#1779). Mo se fa'ata'ita'iga, o clones #2020 ma le #2077 e tusa ma le 1000 taimi e maualuga atu ai le CSF titers nai lo le phage pulea. E eseese le pharmacokinetic profile o peptide ta'itasi na filifilia, ae o i latou uma e iai le CSF homing ability maualuga. Na matou matauina se faʻaitiitia faifai pea i le aluga o taimi mo clones #1903 ma le #2011, ae mo clones #2077, #2002 ma le #2009 o se faʻaopoopoga i le 10 minute muamua atonu e faʻaalia ai le felauaiga malosi ae e manaʻomia ona faʻamaonia. O Clones #2020, #2002, ma le #2077 na mautu i tulaga maualuga, ae o le maualuga o le CSF o le clone #2009 na faʻaitiitia malie ina ua maeʻa le faʻateleina muamua. Ona matou faʻatusatusa lea o le tele o taimi o sui taʻitasi o le CSF ma lona maualuga i le toto (Ata 3d). O le fesoʻotaʻiga o le averesi o le titer o sui taʻitasi o le CSF ma lona titer toto i taimi uma o faʻataʻitaʻiga na faʻaalia ai e tolu o sui e ono na matua faʻamauoa i le CSF toto. O le mea e malie ai, o le clone #2077 na faʻaalia ai le maualuga o le mautu o le toto (Ata Faʻaopoopo 7). Ina ia faʻamaonia o peptides lava ia e mafai ona felauaiga malosi avega e ese mai i vaega o le phage i totonu o le potu o le CSF, na matou faʻapipiʻiina ai peptides taʻitaʻi e fa na maua mai i le biotin i le N-terminus lea e pipii ai peptides i le vaega o le phage. O peptides biotinylated (numera 2002, 2009, 2020 ma le 2077) na fa'apipi'i fa'atasi ma le streptavidin (SA) e maua ai ni foliga multimeric e fa'ata'ita'i ai le geometry o le phage. O lenei fa'atulagaga na mafai ai fo'i ona matou fuaina le fa'aalia o le SA i le toto ma le vai o le cerebrospinal e pei o ni peptides porotini e feavea'i uta. O le mea taua, e masani ona mafai ona toe gaosia fa'amaumauga o le phage pe a fa'atinoina peptides fa'apitoa i lenei fa'atulagaga SA-conjugated (Ata 3e). O peptides fa'afefiloi e itiiti le fa'aalia muamua ma vave le fa'amamaina o le CSF ma tulaga e le mafai ona iloa i totonu ole 48 itula. Ina ia maua se malamalamaga i auala e tu'uina atu ai nei peptide phage clones i totonu o le CSF space, na matou iloiloina le nofoaga o tagata ta'ito'atasi e a'afia ai le phage peptide e fa'aaoga ai le immunohistochemistry (IHC) e iloa sa'o ai vaega o le phage i le 1 itula talu ona tuiina i totonu o le uaua i totonu o le tino. E tāua tele, o clones #2002, #2077, ma le #2009 e mafai ona iloa e ala i le vali malosi i totonu o alatoto o le faiʻai, ae o le control phage (#1779) ma le clone #2020 e leʻi iloa (Ata Faaopoopo 8). O lenei mea e faʻaalia ai o nei peptides e fesoasoani i le aafiaga i le faiʻai e ala tonu lava i le sopoia o le BBB. E manaʻomia nisi suʻesuʻega auiliili e faʻataʻitaʻi ai lenei manatu, aua e ono aʻafia ai foʻi le auala BSCFB. A faʻatusatusa le faʻasologa o amino acid o le clone sili ona faʻamauoa (#2002) ma isi peptides ua filifilia, na matauina ai o nisi o ia mea e tutusa le faʻaopoopoga o amino acid, lea e ono faʻaalia ai se auala tutusa o felauaiga (Ata 3f).
Ona o lona tulaga tulaga ese o le plasma ma le faʻateleina tele o le CSF i le aluga o taimi, na suʻesuʻeina atili ai le phage display clone #2077 i se vaitaimi umi e 48 itula ma mafai ona toe gaosia le faʻateleina vave o le CSF na matauina i le fesoʻotaʻiga ma le maualuga o le SA (Ata 4a). E tusa ai ma isi phage clones ua faʻailoaina, na valiina malosi le #2077 mo capillaries o le faiʻai ma faʻaalia ai le colocalization taua ma le capillary marker lectin pe a vaʻaia i se maualuga maualuga ma atonu o nisi vali i le parenchymal space (Ata 4b). Ina ia suʻesuʻeina pe mafai ona maua ni aafiaga faʻafomaʻi e faʻaosofia e le peptide i le CNS, na matou faia ai se faʻataʻitaʻiga lea na faʻafefiloi ai faʻataʻitaʻiga biotinylated o le i) le #2077 transit peptide ma le ii) le BACE1 inhibitor peptide ma le SA i ni fua faatatau se lua. Mo le tasi tuʻufaʻatasiga na matou faʻaaogaina naʻo le BACE1 peptide inhibitor ma mo le isi na matou faʻaaogaina le 1:3 ratio o le BACE1 peptide inhibitor i le #2077 peptide. Sa tu'uina atu fa'ata'ita'iga uma e lua i le alatoto ma fuaina le maualuga o le beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) i le toto ma le vai o le fai'ai i le aluga o taimi. Sa fuaina le Abeta40 i le CSF aua e atagia ai le taofia o le BACE1 i le parenchyma o le fai'ai. E pei ona fa'amoemoeina, o fa'aputuga uma e lua na fa'aitiitia ai le maualuga o le toto o le Abeta40 (Ata 4c, d). Peita'i, na'o fa'ata'ita'iga o lo'o i ai le fa'afefiloi o le peptide numera 2077 ma se inhibitor o le peptide BACE1 ua fa'apipi'i i le SA na mafua ai le fa'aitiitia tele o le Abeta40 i le vai o le fai'ai i le fai'ai (Ata 4c). O fa'amaumauga o lo'o fa'aalia ai e mafai e le peptide numera 2077 ona feavea'i le porotini 60 kDa SA i totonu o le CNS ma fa'aosofia ai fo'i a'afiaga fa'afoma'i i inhibitors SA-conjugated o le peptide BACE1.
(a) Tui fa'a-clonal (2 × 10 phages/manu) o le T7 phage o lo'o fa'aalia ai le pharmacokinetic profiles mo se taimi umi o le CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) ma le phage pulea e le'i tuiina (#1779) i le itiiti ifo ma le tolu isumu CM-intubated. (b) Ata microscopic confocal o cortical microvessels fa'atusa i isumu tuiina phage (2 × 10 10 phages/manu) o lo'o fa'aalia ai le counterstaining o le peptide #2077 ma va'a (lectin). O nei phage clones na tu'uina atu i isumu e 3 ma tu'u e feoa'i mo le 1 itula a'o le'i fa'asusuina. Na vaevaeina fai'ai ma valivali i polyclonal FITC-labeled antibodies e fa'asaga i le T7 phage capsid. I le sefulu minute a'o le'i fa'asusuina ma le fa'amautu mulimuli ane, na tu'uina atu le DyLight594-labeled lectin i le intravenous. O ata o le fluorescent o loʻo faʻaalia ai le valivali lectin (mumu) o le itu luminal o microvessels ma phages (lanumeamata) i le lumen o capillaries ma le perivascular brain tissue. O le scale bar e tutusa ma le 10 µm. (c, d) O le peptide inhibitory BACE1 biotinylated na o ia pe faʻatasi ma le biotinylated transit peptide #2077 na faʻapipiʻiina i le streptavidin sosoo ai ma le tui intravenous o le itiiti ifo ma le tolu cannulated CM rats (10 mg streptavidin/kg). O le faʻaitiitia o le BACE1 peptide inhibitor-mediated i le Aβ40 na fuaina e le Aβ1-40 ELISA i le toto (mumu) ma le cerebrospinal fluid (lanu moli) i taimi ua faʻaalia. Mo se manino atili, o se laina togitogi ua tusia i luga o le kalafi i le fua o le 100%. (c) Fa'aitiitia o le pasene o le Aβ40 i le toto (tafatolu mumu) ma le vai o le cerebrospinal (tafatolu moli) i isumu na togafitia i le streptavidin ua fa'apipi'i i le transit peptide #2077 ma le peptide fa'asaina o le BACE1 i le fua fa'atatau 3:1. (d) Fa'aitiitia o le pasene o le Aβ40 i le toto (li'o mumu) ma le vai o le cerebrospinal (li'o moli) o isumu na togafitia i le streptavidin ua fa'apipi'i i se peptide fa'asaina o le BACE1. O le maualuga o le Aβ i le vaega fa'atonutonu e 420 pg/ml (tulaga masani = 101 pg/ml).
Ua faʻaaogaina ma le manuia le faʻaalia o le phage i le tele o vaega o suʻesuʻega faʻafomaʻi17. O lenei metotia ua faʻaaogaina mo suʻesuʻega eseese o alatoto i totonu o le tino18,19 faʻapea foʻi ma suʻesuʻega e faʻatatau i alatoto o le faiʻai20,21,22,23,24,25,26. I lenei suʻesuʻega, na matou faʻalauteleina ai le faʻaaogaina o lenei metotia filifilia e le gata i le faʻailoaina tuusaʻo o peptides e faʻatatau i alatoto o le faiʻai, ae faʻapea foʻi i le mauaina o sui tauva e iai meatotino felauaʻi e sopoʻia ai le pa puipui o le toto ma le faiʻai. O lea ua matou faʻamatalaina le atinaʻeina o se faiga filifiliga i totonu o le tino i isumu CM intubated ma faʻaalia lona gafatia e faʻailoa ai peptides e iai meatotino CSF ​​homing. Faʻaaogaina le T7 phage o loʻo faʻaalia ai se faletusi o peptides faʻafuaseʻi 12-mer, na mafai ai ona matou faʻaalia o le T7 phage e lava lona laʻititi (pe tusa ma le 60 nm le lautele)10 e fetuʻunaʻi ai i le pa puipui o le toto ma le faiʻai, ma o lea e sopoʻia tuusaʻo ai le pa puipui o le toto ma le faiʻai poʻo le choroid plexus. Na matou matauina o le seleseleina o le CSF mai isumu CM ua fa'a'ofuina o se metotia su'esu'ega lelei i totonu o le tino ola, ma o le phage ua aveeseina e le gata ina fusifusia i le vasculature ae na galue foi o se avefe'au i luga o le pa puipui o le toto-fai'ai. E le gata i lea, i le aoina fa'atasi o le toto ma le fa'aogaina o le HTS i le CSF ​​ma phages e maua mai i le toto, na matou fa'amaonia ai o la matou filifiliga o le CSF e le'i a'afia i le fa'amauoa o le toto po'o le agava'a mo le fa'alauteleina i le va o ta'amilosaga o filifiliga. Peita'i, o le vaega o le toto o se vaega o le faiga o filifiliga, talu ai o phages e mafai ona o'o atu i le vaega o le CSF e tatau ona ola ma feoa'i i totonu o le toto mo se taimi umi e fa'amauoa ai i latou lava i le fai'ai. Ina ia maua mai fa'amatalaga fa'asologa fa'atuatuaina mai fa'amatalaga mata o le HTS, na matou fa'atinoina ai ni faamama ua fetu'una'i i mea sese fa'asologa fa'apitoa i le faiga o su'esu'ega. I le fa'aofiina o parakalafa kinetic i le metotia su'esu'e, na matou fa'amaonia ai le vave o le pharmacokinetics o phages T7 ituaiga vao (t½ ~ 28 min) i le toto24, 27, 28 ma fa'amauina foi lo latou afa-ola i le vai cerebrospinal (t½ ~ 26 min) i le minute). E ui i le tutusa o faʻamatalaga o le pharmacokinetic i le toto ma le CSF, ae naʻo le 0.001% o le maualuga o le phage i le toto na mafai ona iloa i le CSF, o loʻo faʻaalia ai le maualalo o le gaioiga o le wild-type T7 phage i luga o le pa puipui o le toto-faiʻai. O lenei galuega e faʻamamafaina ai le taua o le taamilosaga muamua o le filifiliga pe a faʻaaogaina fuafuaga faʻataʻitaʻi in vivo, aemaise lava mo faiga o phage e vave ona faʻamama mai le tafega, aua e naʻo ni nai clones e mafai ona oʻo atu i le vaega o le CNS. O le mea lea, i le taamilosaga muamua, o le faʻaitiitia o le eseesega o faletusi sa matua tele lava, aua e naʻo se numera faʻatapulaʻa o clones na mulimuli ane aoina i lenei faʻataʻitaʻiga CSF matua faigata lava. O lenei fuafuaga faʻataʻitaʻi in vivo na aofia ai le tele o laʻasaga o le filifiliga e pei o le faʻaputuga malosi i le vaega o le CSF, le ola o le clone i le vaega o le toto, ma le vave aveeseina o T7 phage clones mai le toto i totonu o le 10 minute muamua (Ata 1d ma le Ata Faʻaopoopo 4M). ). O lea la, ina ua maeʻa le taamilosaga muamua, na faʻailoaina ai clones phage eseese i le CSF, e ui lava o le vaitaele muamua lava e tasi na faʻaaogaina mo manu taʻitasi. O lenei mea e faʻaalia ai o le tele o laʻasaga filifilia faʻapitoa mo faletusi punaoa e toʻatele tagata o le faletusi e mafua ai le faʻaitiitia tele o le eseesega. O le mea lea, o mea tutupu faʻafuaseʻi o le a avea ma vaega taua o le faiga muamua o le filifiliga, ma e matua aʻafia ai le iʻuga. E foliga mai o le tele o clones i le faletusi muamua sa i ai se uiga tutusa o le faʻaleleia atili o le CSF. Peitaʻi, e tusa lava pe i lalo o tulaga faʻataʻitaʻi tutusa, e ono eseese iʻuga o le filifiliga ona o le laʻititi o le numera o clone taʻitasi i le vaitaʻele muamua.
E ese le mamanu o loʻo faʻamauoa i le CSF mai i latou o loʻo i le toto. O le mea e malie ai, na matou matauina le suiga muamua agai i peptides e mauoa i le glycine i le toto o manu taʻitasi. (Ata 1g, Ata Faʻaopoopo. 4e, 4f). O peptides o loʻo i ai le phage glycine atonu e sili atu ona mautu ma e itiiti le ono aveeseina mai le tafe toto. Peitaʻi, o nei peptides e mauoa i le glycine e leʻi iloa i faʻataʻitaʻiga o le vai o le cerebrospinal, ma faʻaalia ai o faletusi na filifilia na ui atu i ni laʻasaga se lua eseese o le filifiliga: o le tasi i le toto ma le isi na faʻatagaina e faʻaputu i le vai o le cerebrospinal. O clones e faʻamauoa i le CSF na mafua mai i le fa o le taʻamilosaga o le filifiliga ua uma ona faʻataʻitaʻiina ma le loloto. Toetoe lava o clones uma na faʻataʻitaʻiina taʻitasi na faʻamaonia e mauoa i le CSF pe a faʻatusatusa i le blank control phage. E tasi le peptide hit (#2077) na suʻesuʻeina auiliili. Na faʻaalia ai se afa-ola umi o le plasma pe a faʻatusatusa i isi hits (Ata 3d ma le Ata Faʻaopoopo 7), ma le mea e malie ai, o lenei peptide o loʻo i ai se cysteine ​​​​residue i le C-terminus. Ua faʻaalia talu ai nei o le faʻaopoopoina o le cysteine ​​​​i peptides e mafai ona faʻaleleia atili ai a latou meatotino pharmacokinetic e ala i le fusifusia i le albumin 29. E le o iloa lenei mea i le taimi nei mo le peptide #2077 ma e manaʻomia nisi suʻesuʻega. O nisi peptides na faʻaalia ai le faʻalagolago i le valence i le faʻamalosia o le CSF (e leʻi faʻaalia faʻamatalaga), lea atonu e fesoʻotaʻi ma le geometry o luga o le T7 capsid. O le faiga T7 na matou faʻaaogaina na faʻaalia ai le 5-15 kopi o peptide taʻitasi i le vaega phage. Na faia le IHC i luga o sui tauva taʻitaʻi phage clones na tuiina i totonu o le cerebral cortex o isumu (Faʻaopoopoga Ata 8). O faʻamatalaga na faʻaalia ai e le itiiti ifo ma le tolu clones (Numera 2002, Numera 2009 ma le Numera 2077) na fegalegaleai ma le BBB. E tatau ona iloa pe o lenei fegalegaleaiga a le BBB e mafua ai le faʻaputuina o le CSF poʻo le feʻaveaʻi saʻo o nei clones i le BCSFB. O le mea taua, matou te faʻaalia o peptides ua filifilia e taofia lo latou gafatia e feaveaʻi ai le CSF pe a faʻapipiʻiina ma fusifusia i le uta o le porotini. O le fusifusia o peptides biotinylated N-terminal i le SA e toe faia ai taunuuga na maua ma a latou phage clones i le toto ma le cerebrospinal fluid (Ata 3e). Mulimuli ane, matou te faʻaalia o le lead peptide #2077 e mafai ona faʻalauiloa le gaioiga a le faiʻai o se biotinylated peptide inhibitor o le BACE1 ua faʻapipiʻi i le SA, ma mafua ai ni aafiaga faʻapitoa i le CNS e ala i le faʻaitiitia tele o le maualuga o le Abeta40 i le CSF (Ata 4). Matou te leʻi mafai ona faʻailoaina ni homologues i le faʻamaumauga e ala i le faia o se suʻesuʻega homology o le faʻasologa o le peptide o osofaʻiga uma. E taua le maitauina o le tele o le faletusi T7 e tusa ma le 109, ae o le tele o le faletusi faʻateorē mo le 12-mers e 4 x 1015. O le mea lea, na matou filifilia naʻo se vaega itiiti o le avanoa eseese o le faletusi peptide 12-mer, lea e ono faʻaalia ai o peptides sili atu ona faʻaleleia e mafai ona faʻailoaina e ala i le iloiloina o le avanoa faʻasologa lata ane o nei osofaʻiga ua faʻailoaina. I se fa'ata'ita'iga, o se tasi o mafua'aga matou te le'i maua ai ni mea tutusa fa'alenatura o nei peptides atonu o le aveeseina o le filifiliga i le taimi o le evolusione e puipuia ai le ulufale le pulea o nisi o peptide motifs i totonu o le fai'ai.
A tuufaatasia, o a matou taunuuga e maua ai se faavae mo galuega i le lumanai e faailoa ma faamatala auiliili ai faiga o felauaiga o le pa puipui o le faiʻai i totonu o le tino ola. O le faatulagaga autu o lenei metotia e faavae i luga o se fuafuaga filifiliga galue e le gata ina faailoa ai clones e iai uiga e fusifusia ai le faiʻai, ae aofia ai foi se laasaga taua lea e iai ai le gaioiga totino a clones manuia e sopoia ai pa puipui ola i totonu o le tino ola i totonu o le vaega o le CNS. o le faamaninoina lea o le faiga o felauaiga o nei peptides ma lo latou fiafia i le fusifusia i le microvasculature e patino i le vaega o le faiʻai. Atonu e taitai atu ai i le mauaina o auala fou mo le felauaiga o le BBB ma receptors. Matou te faamoemoe o peptides ua faailoa mai e mafai ona fusifusia saʻo i receptors o le faiʻai po o ligands o loo feoaʻi solo e feaveaia e ala i le BBB po o le BCSFB. O peptide vectors ma le gaioiga o felauaiga a le CSF o loo maua i lenei galuega o le a suesueina atili. O loo matou suesueina nei le faapitoa o le faiʻai o nei peptides mo lo latou gafatia e sopoia le BBB ma/po o le BCSFB. O nei peptide fou o le a avea ma meafaigaluega taua tele mo le ono maua o ni mea fou e tali atu ai lagona poʻo ni auala fou ma mo le atinaʻeina o ni faʻavae fou e sili ona lelei mo le tuʻuina atu o macromolecules, e pei o meaola, i le faiʻai.
Fa'a'ofu le cisterna tele (CM) e fa'aaoga ai se suiga o le metotia na fa'amatalaina muamua. O isumu Wistar ua fa'amoe (200-350 g) sa fa'apipi'i i luga o se masini stereotaxic ma faia se tipi ogatotonu i luga o le pa'u ulu ua sele ma saunia fa'amamāina ina ia fa'aalia ai le ulupo'o. Eli ni pu se lua i le vaega o le sash pito i luga ma fa'amau fa'amau sikulima i totonu o pu. Eli se isi pu i le pito i tua o le occipital mo le ta'ita'iga stereotactic o se cannula u'amea e le gaoia i totonu o le CM. Fa'apipi'i le sima nifo i tafatafa o le cannula ma fa'amau i sikulima. A mae'a ona fa'ama'a'aina ma fa'ama'a'a le sima, ona tapuni lea o le manu'a o le pa'u i le su'i 4/0 supramid. O le tu'uina sa'o o le cannula e fa'amaonia e ala i le tafe fa'afuase'i o le vai cerebrospinal (CSF). Ave'ese le isumu mai le masini stereotaxic, maua le tausiga talafeagai pe a uma le taotoga ma le puleaina o le tiga, ma tu'u ia toe malosi mo le itiiti ifo ma le tasi le vaiaso se'ia o'o ina va'aia fa'ailoga o le toto i le vai cerebrospinal. O isumu Wistar (Crl:WI/Han) na maua mai Charles River (Falani). Sa tausia isumu uma i lalo o tulaga faapitoa e aunoa ma ni siama. O faʻataʻitaʻiga uma i manu sa faʻamaonia e le Ofisa o Manu a le Aai o Basel, Sueteselani, ma sa faia e tusa ai ma le Laisene Manu Nu. 2474 (Iloiloga o Felauaiga Malosi o le Faiʻai e ala i le Fuaina o Tulaga o Sui Taumafa i le Suavai Cerebrospinal ma le Faiʻai o le Isumu).
Ia fa'aeteete le isumu ia iloa lelei a'o uuina le CM cannula. Ave'ese le Datura mai le cannula ma aoina mai le 10 µl o le vai cerebrospinal e tafe fa'afuase'i. Talu ai na iu lava ina fa'aleagaina le avanoa o le cannula, na'o fa'ata'ita'iga manino o le vai cerebrospinal e leai se fa'amaoniga o le pisia o le toto po'o le suia o lanu na aofia ai i lenei su'esu'ega. I le taimi lava e tasi, e tusa ma le 10–20 μl o le toto na aveina mai se tama'i tipi i le pito o le si'usi'u i totonu o paipa e iai le heparin (Sigma-Aldrich). Na aoina le CSF ma le toto i taimi eseese ina ua uma ona tuiina i totonu o le uaua le T7 phage. E tusa ma le 5–10 μl o le vai na lafoa'i a'o le'i aoina mai fa'ata'ita'iga CSF ta'itasi, lea e tutusa ma le aofa'i ua mate o le catheter.
Sa fa'atupuina faletusi e fa'aaoga ai le vector T7Select 10-3b e pei ona fa'amatalaina i le tusi lesona a le T7Select system (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). I se faapuupuuga, o se fa'aopoopoga DNA 12-mer fa'afuase'i sa fa'aputuina i le fa'atulagaga lenei:
Sa fa'aaogaina le NNK codon e 'alo 'ese ai mai le double stop codons ma le amino acid overexpression i totonu o le insert. O le N o se fua fa'atatau equimolar ua palu fa'atasi ma lima o nucleotide ta'itasi, ma o le K o se fua fa'atatau equimolar ua palu fa'atasi ma lima o le adenine ma le cytosine nucleotides. O vaega e tasi le manoa na liua i le DNA e lua manoa e ala i le fa'asusuina atili ma le dNTP (Novagen) ma le Klenow enzyme (New England Biolabs) i totonu o le Klenow buffer (New England Biolabs) mo le 3 itula i le 37°C. Ina ua mae'a le tali atu, sa toe maua mai le DNA e lua manoa e ala i le EtOH precipitation. O le DNA na maua na fa'asusuina i le restriction enzymes EcoRI ma le HindIII (uma mai Roche). O le insert ua tipiina ma fa'amamāina (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) ona fa'apipi'i lea i totonu o le fa'avaa i totonu o se T7 vector ua tipiina muamua ina ua mae'a le amino acid 348 o le 10B capsid gene. O tali fa'apipi'i na fa'asusuina i le 16°C mo le 18 itula a'o le'i fa'apipi'iina i totonu o le vitro. Sa faia le afifiina o phage i totonu o le vitro e tusa ai ma faatonuga na tuuina atu faatasi ma le T7Select 10-3b cloning kit (Novagen) ma sa faateleina faatasi le vailaau afifiina seia oo ina lysis e faaaoga ai le Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Sa centrifuged ia lysates, titrated ma faa'aisa i le -80° C. e fai ma vailaau masani o le glycerol.
Fa'ateleina sa'o o le PCR o vaega fesuisuia'i o le phage ua fa'ateleina i totonu o le broth po'o le plate e fa'aaoga ai le 454/Roche-amplicon fusion primers fa'apitoa. O le forward fusion primer o lo'o i ai fa'asologa e fa'asaga i le vaega fesuisuia'i (NNK) 12 (fa'apitoa mo le template), GS FLX Titanium Adapter A, ma se fa'asologa autu o le four-base library (TCAG) (Ata Fa'aopoopo 1a):
O le reverse fusion primer e aofia ai fo'i le biotin e fa'apipi'i i le capture beads ma le GS FLX Titanium Adapter B e mana'omia mo le clonal amplification i le taimi o le emulsion PCR:
Ona faia lea o le 454/Roche pyrosequencing i amplicons e tusa ai ma le 454 GS-FLX Titanium protocol. Mo le fa'asologa lima o Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), na fa'ateleina le T7 phage DNA e ala i le PCR ma fa'asologaina i paga primer nei:
O mea ua fa'aofi mai ni palasitika ta'itasi na faia i ai le fa'ateleina o le PCR e fa'aaoga ai le Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (e tusa ai ma fa'atonuga a le kamupani gaosi oloa). Fa'atino se amataga vevela (10 minute i le 95 °C) ma le 35 ta'amilosaga fa'amalosi (50 sekone i le 95 °C, 1 minute i le 50 °C, ma le 1 minute i le 72 °C).
O phage mai faletusi, phage wild-type, phage na lavea'iina mai le CSF ma le toto, po'o ni clones ta'itasi na fa'ateleina i le Escherichia coli BL5615 i le supo TB (Sigma Aldrich) po'o i totonu o ipu 500 cm2 (Thermo Scientific) mo le 4 itula i le 37°C. Na aveeseina phage mai ipu e ala i le fufuluina o ipu i le Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical) po'o le aoina o plaques i pito pipette sterile. Na vavaeeseina phage mai le supernatant culture po'o le extraction buffer i le tasi le taamilosaga o le polyethylene glycol (PEG 8000) precipitation (Promega) ma toe fa'asusu i totonu o le Tris-EDTA buffer.
O le phage ua fa'ateleina na faia i ai le 2-3 taamilosaga o le aveeseina o endotoxin e fa'aaoga ai ni beads e aveese ai endotoxin (Miltenyi Biotec) a'o le'i tuiina i le intravenous (IV) (500 μl/manu). I le taamilosaga muamua, na fa'aofiina ai phages e 2 × 1012; i le lona lua, phages e 2 × 1010; i le taamilosaga lona tolu ma le fa o filifiliga, 2 × 109 phages i le manu. O le aofa'i o phage i totonu o le CSF ma fa'ata'ita'iga o le toto na aoina i taimi atofaina na fuafuaina e ala i le faitauina o le plaque e tusa ai ma fa'atonuga a le kamupani gaosi oloa (tusi lesona a le T7Select system). O le filifilia o phage na faia e ala i le tuiina i totonu o le intravenous o faletusi ua fa'amamaina i totonu o le vein si'usi'u po'o le toe tuiina o phage na aveese mai le CSF mai le taamilosaga filifiliga muamua, ma o seleselega mulimuli ane na faia i le 10 minute, 30 minute, 60 minute, 90 minute, 120 minute, 180 minute, ma le 240 minute fa'asolosolo o fa'ata'ita'iga o le CSF ma le toto. E fa taamilosaga o le in vivo panning na faia lea na teuina eseese ai ma iloiloina ai lala e lua na filifilia i taamilosaga muamua e tolu o le filifiliga. O fa'aopoopoga phage uma na aveese mai le CSF mai taamilosaga muamua e lua o le filifiliga na faia i le 454/Roche pyrosequencing, a'o clones uma na aveese mai le CSF mai taamilosaga mulimuli e lua o le filifiliga na fa'asologaina lima. O phages toto uma mai le taamilosaga muamua o le filifiliga na faia foi i le 454/Roche pyrosequencing. Mo le tuiina o phages clones, o phages na filifilia na fa'ateleina i le E. coli (BL5615) i luga o le 500 cm2 plates i le 37°C mo le 4 itula. O clones na filifilia ta'itasi ma fa'asologaina lima na fa'asalalauina i le TB medium. A mae'a le aveeseina o phage, fa'amamāina ma ave'esea le endotoxin (e pei ona fa'amatalaina i luga), 2 × 1010 phages/manu i le 300 μl na tuiina i le intravenous i totonu o le tasi vein tail.
Fa'agasologa muamua ma le fa'amamāina lelei o fa'amaumauga o le fa'asologa. O fa'amaumauga mata 454/Roche na liua mai se fa'atulagaga fa'afanua masani fa'alua (sff) i se fa'atulagaga faitau a tagata Pearson (fasta) e fa'aaoga ai le polokalama fa'atau oloa. O le fa'agasologa atili o le fa'asologa o le nucleotide na faia e fa'aaoga ai polokalama C ma tusitusiga fa'apitoa (afifi polokalama e le'i fa'alauiloaina) e pei ona fa'amatalaina i lalo. O le au'ili'iliga o fa'amaumauga autu e aofia ai faiga fa'amamāina fa'apitoa e tele-vaega. Ina ia fa'amamāina faitauga e le'i i ai se fa'asologa DNA fa'apipi'i 12mer aoga, o faitauga na fa'atulagaina fa'asolosolo i le fa'ailoga amata (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), fa'ailoga taofi (TAAGCTTGCGGCGCCACTCGAGTA) ma le fa'apipi'i tua (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGAC) e fa'aaoga ai le su'ega Needleman-Wunsch i le lalolagi atoa. fa'atulagaina e mafai ai ona o'o atu i le 2 le le tutusa i fa'atulagaga ta'itasi31. O le mea lea, o faitauga e aunoa ma pine amata ma taofi ma faitauga o lo'o i ai fa'apipi'i tua, i.e., fa'atulagaina e sili atu i le aofa'i fa'atagaina o le le fetaui, na ave'esea mai le faletusi. A o isi faitauga o totoe, o le faasologa o le N-mer DNA e amata mai le faailoga amata ma faaiuina a o lei oo i le faailoga taofi na aveeseina mai le faasologa muamua o le faitauga ma toe faagasoloina (o le a taua i lalo o le "insert"). A maeʻa le faaliliuga o le insert, o le vaega pe a uma le codon taofi muamua i le pito 5′ o le primer e aveese mai le insert. E le gata i lea, o nucleotides e tau atu i codons e le atoatoa i le pito 3′ o le primer na aveeseina foi. Ina ia aveese inserts o loʻo i ai naʻo faasologa o talaaga, o inserts ua faaliliuina e amata i le mamanu amino acid "PAG" na aveeseina foi. O peptides e itiiti ifo i le 3 amino acid le umi pe a uma le faaliliuga na aveeseina mai le faletusi. I le iuga, aveese le toe faʻaopoopoina i le vaitaele insert ma fuafua le tele o taimi o insert tulaga ese taitasi. O taunuuga o lenei auiliiliga na aofia ai se lisi o faasologa o nucleotide (inserts) ma a latou tele (faitau) (Ata Faaopoopo 1c ma le 2).
Fa'aopoopoga DNA o le Vaega N-mer e ala i le tutusa o le fa'asologa: Ina ia aveese mea sese o le fa'asologa fa'apitoa 454/Roche (e pei o fa'afitauli i fa'aopoopoga homopolymer fa'asologa) ma aveese mea e le taua tele, o fa'aopoopoga o le fa'asologa o le DNA N-mer ua uma ona fa'amamaina (fa'atagaina e o'o atu i le 2 fa'avae e le fetaui) e fa'aaoga ai se algorithm fa'asolosolo ua fa'amatalaina e pei ona taua i lalo: o fa'aopoopoga e fa'avasega muamua e ala i lo latou taimi (maualuga i le maualalo), ma afai e tutusa, e ala i lo latou fa'avasega lona lua e ala i le umi (umi i le pu'upu'u)). O lea la, o fa'aopoopoga e sili ona soo ma umi e fa'amatalaina ai le "vaega" muamua. O le taimi o le vaega e setiina i le taimi autu. Ona, o fa'aopoopoga ta'itasi o totoe i le lisi ua fa'avasegaina na taumafai e fa'aopoopo i le vaega e ala i le fa'atulagaina o Needleman-Wunsch. Afai o le aofa'i o mea e le fetaui, fa'aopoopoga, po'o mea e tapeina i se fa'atulagaina e le sili atu i le 2, e fa'aopoopo se fa'aopoopoga i le vaega, ma o le taimi atoa o le vaega e fa'ateleina e ala i le tele o taimi na fa'aopoopo ai le fa'aopoopoga. O fa'aopoopoga na fa'aopoopo i se vaega e fa'ailogaina o lo'o fa'aaogaina ma e le aofia ai mai le fa'agasologa atili. Afai e le mafai ona fa'aopoopo le fa'asologa o mea fa'aofi i se vaega ua uma ona iai, e fa'aaoga le fa'asologa o mea fa'aofi e fausia ai se vaega fou ma le taimi talafeagai e fa'aofi ai ma fa'ailogaina ua fa'aaogaina. E muta le fa'asologa pe a fa'aaoga fa'asologa ta'itasi o mea fa'aofi e fausia ai se vaega fou pe mafai fo'i ona aofia i se vaega ua uma ona iai. Aua, o mea fa'aofi ua fa'aputuina e aofia ai nucleotides e iu lava ina fa'aliliuina i ni fa'asologa o peptide (faletusi peptide). O le i'uga o lenei au'ili'iliga o se seti o mea fa'aofi ma a latou taimi talafeagai e fa'aputu ai le aofa'i o faitauga fa'asolosolo (Ata Fa'aopoopo 2).
Tuputupu A'e o le Motif: E fa'avae i luga o se lisi o peptide tulaga ese, na faia ai se faletusi o lo'o i ai mamanu uma o amino acid (aa) e pei ona fa'aalia i lalo. O mamanu ta'itasi e mafai ona i ai le umi 3 na aveeseina mai le peptide ma fa'aopoopoina lona mamanu fa'afeagai fa'atasi ai ma se faletusi motif masani o lo'o i ai mamanu uma (tripeptides). O faletusi o motif e tele na toe fai na fa'asologaina ma aveese le toe fai. Ona, mo tripeptide ta'itasi i le faletusi motif, matou te siakiina lona i ai i le faletusi e fa'aaoga ai meafaigaluega fa'akomepiuta. I lenei tulaga, o le tele o le peptide o lo'o i ai le motif tripeptide na maua e fa'aopoopoina ma tu'uina atu i le motif i le faletusi motif ("numera o motifs"). O le taunuuga o le tuputupu a'e o motif o se fa'asologa lua-dimensional o lo'o i ai mea uma e tutupu i tripeptides (motifs) ma o latou tau, o le aofa'i lea o faitauga fa'asologa e i'u ai i le motif talafeagai pe a fa'amama, fa'aputuina, ma fa'aliliuina faitauga. Fuainumera e pei ona fa'amatalaina auiliili i luga.
Fa'atulagaina o le aofa'i o motif ma fa'asologa fa'asalalau talafeagai: O le aofa'i o motif mo fa'ata'ita'iga ta'itasi na fa'atulagaina e fa'aaoga ai
lea o le ni o le aofaʻi o faitauga o loʻo i ai le autu i. O lea la, o le vi o loʻo faʻatusalia ai le pasene o faitauga (poʻo peptides) o loʻo i ai le motif i i le faʻataʻitaʻiga. O tau-P mo le aofaʻi e le masani ai o motif na fuafuaina e faʻaaoga ai le suʻega saʻo a Fisher. E tusa ai ma correlograms o le aofaʻi o motif, o fesoʻotaʻiga a Spearman na fuafuaina e faʻaaoga ai le aofaʻi masani o motif ma le R.
Ina ia va'aia le anotusi o amino acids i tulaga ta'itasi i le faletusi peptide, na faia ai logograms upega tafa'ilagi 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Muamua, o anotusi o amino acids i tulaga ta'itasi o le peptide 12-mer e teuina i totonu o se matrix 20 × 12. Ona faia lea o se seti o peptides e 1000 o lo'o i ai le anotusi tutusa o amino acid i tulaga ta'itasi i le fa'atulagaga fasta-sequence ma tu'uina atu o se input i le web-logo 3, lea e faia ai se fa'atusa fa'ata'ita'i o le anotusi o amino acid i tulaga ta'itasi. mo se faletusi peptide ua tu'uina atu. Ina ia va'aia fa'amaumauga multidimensional, na faia ai fa'afanua vevela e fa'aaoga ai se meafaigaluega na atia'e i totonu i le R (biosHeatmap, o se afifi R e le'i fa'alauiloaina). O dendrograms o lo'o tu'uina atu i fa'afanua vevela na fuafuaina e fa'aaoga ai le metotia fa'aputuga fa'asolosolo a Ward ma le metric mamao Euclidean. Mo le au'ili'iliga fa'amaumauga o fa'amaumauga o motif, na fuafuaina ai tau P mo le togi e le'i fa'atulagaina e fa'aaoga ai le su'ega sa'o a Fisher. O P-values ​​​​mo isi faʻamaumauga na fuafuaina i le R e faʻaaoga ai le Student's t-test poʻo le ANOVA.
O phage clones ma phages ua filifilia e aunoa ma ni mea fa'apipi'i na tuiina i le alatoto e ala i le alatoto o le si'usi'u (2 × 1010 phages/manu i le 300 μl PBS). I le sefulu minute a'o le'i faia le perfusion ma le fa'amautuina mulimuli ane, o manu lava ia na tuiina i le alatoto i le 100 μl o le DyLight594-labeled lectin (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minute talu ona tuiina le phage, na fa'amamaina ai isumu i le fatu i le 50 ml PBS ona sosoo ai lea ma le 50 ml 4% PFA/PBS. Na fa'apipi'i fa'atasi fa'ata'ita'iga o le fai'ai i le po atoa i le 4% PFA/PBS ma fa'asusu i le 30% sucrose i le po atoa i le 4°C. O fa'ata'ita'iga ua fa'a'aisa vave i le paluga OCT. Sa faia le su'esu'ega fa'a-immunohistochemical o fa'ata'ita'iga fa'a'aisa i le vevela o le potu i luga o le 30 µm cryosections na poloka i le 1% BSA ma fa'afefiloi i polyclonal FITC-labeled antibodies e fa'asaga i le T7 phage (Novus NB 600-376A) i le 4 °C. Fa'afefiloi i le po atoa. Mulimuli ane, sa fufuluina vaega fa'atolu i le PBS ma su'esu'eina i se confocal laser microscope (Leica TCS SP5).
O peptide uma e itiiti ifo i le 98% le mama na fa'aputuina e le GenScript USA, fa'a-biotinylated ma fa'a-lyophilized. O le Biotin e fusifusia e ala i se isi triple glycine spacer i le N-terminus. Siaki peptide uma e fa'aaoga ai le mass spectrometry.
Sa palu faatasi le Streptavidin (Sigma S0677) ma se fa'aopoopoga e 5-fold equimolar o le peptide biotinylated, biotinylated BACE1 inhibitory peptide, po'o se tu'ufa'atasiga (3:1 ratio) o le biotinylated BACE1 inhibitory peptide ma le BACE1 inhibitory peptide i le 5–10% DMSO/fa'asusu i le PBS. 1 itula i le vevela o le potu a'o le'i tuiina. O peptides ua fa'apipi'i i le Streptavidin sa tuiina i le alatoto i le fua o le 10 mg/kg i totonu o se tasi o alatoto o le si'usi'u o isumu e iai se pu i le fai'ai.
Sa iloiloina le malosi o le streptavidin-peptide complexes e ala i le ELISA. O le Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) sa ufiufi i le po atoa i le 4°C i le 1.5 μg/ml mouse anti-streptavidin antibody (Thermo, MA1-20011). A maeʻa ona poloka (blocking buffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) i le vevela o le potu mo le 2 itula, fufulu le ipu i le 0.05% Tween-20/PBS (wash buffer) mo le 3 sekone, ona faaopoopo lea o faataitaiga o le CSF ma le plasma i totonu o vaieli ua faafefiloi i le blocking buffer (plasma 1:10,000, CSF 1:115). Ona fa'asusu lea o le ipu i le po atoa i le 4°C i le detection antibody (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). A maeʻa laʻasaga e tolu o le fufuluina, na iloa ai le streptavidin e ala i le faʻasusuina i totonu o le fofo TMB substrate (Roche) mo le 20 minute. A maeʻa ona taofi le atinaʻeina o lanu i le 1M H2SO4, fua le mitiia i le 450 nm.
O le galuega a le streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor complex sa iloiloina e ala i le Aβ(1-40) ELISA e tusa ai ma le protocol a le kamupani gaosi oloa (Wako, 294-64701). I se aotelega, o faʻataʻitaʻiga o le CSF sa faʻavaivaia i le diluent masani (1:23) ma faʻasusu i le po atoa i le 4°C i totonu o ipu 96-well ua ufiufi i le BNT77 capture antibody. A maeʻa laʻasaga e lima o le fufuluina, sa faʻaopoopoina le HRP-conjugated BA27 antibody ma faʻasusu mo le 2 itula i le 4°C., sosoo ai ma laʻasaga e lima o le fufuluina. Sa iloa le Aβ(1–40) e ala i le faʻasusuina i totonu o le TMB solution mo le 30 minute i le vevela o le potu. A maeʻa ona taofia le atinaʻeina o lanu i le stop solution, fua le absorbance i le 450 nm. O faʻataʻitaʻiga o le plasma sa faia i le solid phase extraction aʻo leʻi faia le Aβ(1–40) ELISA. Sa faʻaopoopoina le plasma i le 0.2% DEA (Sigma) i totonu o ipu 96-well ma faʻasusu i le vevela o le potu mo le 30 minute. A maeʻa ona fufuluina faʻasolosolo ia ipu SPE (Oasis, 186000679) i le vai ma le 100% methanol, ona faʻaopoopo lea o faʻataʻitaʻiga plasma i ipu SPE ma aveese uma le vai. Na fufuluina faʻataʻitaʻiga (muamua i le 5% methanol ona sosoo ai lea ma le 30% methanol) ma faʻamamāina i le 2% NH4OH/90% methanol. A maeʻa ona faʻamago le eluate i le 55°C mo le 99 minute i le tafe tumau o le N2, ona faʻaitiitia lea o faʻataʻitaʻiga i mea faʻamama masani ma fuaina le Aβ(1–40) e pei ona faʻamatalaina i luga.
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