Спасибо за посещение Nature.com. Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS. Для наилучшего опыта мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Кроме того, для обеспечения постоянной поддержки мы показываем сайт без стилей и JavaScript.
Отображает карусель из трех слайдов одновременно. Используйте кнопки «Предыдущий» и «Следующий», чтобы перемещаться по трем слайдам одновременно, или используйте кнопки слайдера в конце, чтобы перемещаться по трем слайдам одновременно.
Гематоэнцефалический барьер и гематоэнцефалический барьер не позволяют биотерапевтическим агентам достигать своих целей в центральной нервной системе, тем самым препятствуя эффективному лечению неврологических заболеваний. Чтобы обнаружить новые транспортеры мозга in vivo, мы ввели пептидную библиотеку фага T7 и серийно собирали кровь и спинномозговую жидкость (СМЖ) с использованием канюлированной сознательной модели большого пула крыс. Конкретные фаговые клоны были сильно обогащены в СМЖ после четырех раундов отбора. Тестирование отдельных пептидов-кандидатов выявило более чем 1000-кратное обогащение в СМЖ. Биоактивность опосредованной пептидами доставки в мозг была подтверждена 40%-ным снижением уровня амилоида-β в спинномозговой жидкости с использованием ингибитора пептида BACE1, связанного с идентифицированным новым транзитным пептидом. Эти результаты свидетельствуют о том, что пептиды, идентифицированные методами отбора фагов in vivo, могут быть полезными средствами для системной доставки макромолекул в мозг с терапевтическим эффектом.
Исследования таргетной терапии центральной нервной системы (ЦНС) в основном были сосредоточены на выявлении оптимизированных препаратов и агентов, которые проявляют свойства, нацеленные на ЦНС, с меньшими усилиями по обнаружению механизмов, которые управляют активной доставкой лекарств в мозг. Это начинает меняться сейчас, поскольку доставка лекарств, особенно крупных молекул, является неотъемлемой частью современной разработки лекарств в нейронауке. Окружающая среда центральной нервной системы хорошо защищена цереброваскулярной барьерной системой, состоящей из гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и гематоэнцефалического барьера (ГЭББ)1, что затрудняет доставку лекарств в мозг1,2. По оценкам, почти все препараты с большими молекулами и более 98% препаратов с малыми молекулами выводятся из мозга3. Вот почему очень важно выявить новые транспортные системы мозга, которые обеспечивают эффективную и специфическую доставку терапевтических препаратов в ЦНС4,5. Однако ГЭБ и BCSFB также представляют собой прекрасную возможность для доставки лекарств, поскольку они проникают и попадают во все структуры мозга через его обширную сосудистую сеть. Таким образом, текущие усилия по использованию неинвазивных методов доставки в мозг в значительной степени основаны на механизме рецептор-опосредованного транспорта (PMT) с использованием эндогенного рецептора BBB6. Несмотря на недавние ключевые достижения с использованием пути рецептора трансферрина7,8, требуется дальнейшая разработка новых систем доставки с улучшенными свойствами. Для этого нашей целью было выявление пептидов, способных опосредовать транспорт СМЖ, поскольку они в принципе могли бы использоваться для доставки макромолекул в ЦНС или для открытия новых рецепторных путей. В частности, специфические рецепторы и транспортеры цереброваскулярной системы (ГЭБ и BSCFB) могут служить потенциальными мишенями для активной и специфической доставки биотерапевтических препаратов. Спинномозговая жидкость (СМЖ) является секреторным продуктом сосудистого сплетения (СС) и находится в прямом контакте с интерстициальной жидкостью мозга через субарахноидальное пространство и желудочковое пространство4. Недавно было показано, что субарахноидальная спинномозговая жидкость чрезмерно диффундирует в интерстиций мозга9. Мы надеемся получить доступ к паренхиматозному пространству, используя этот субарахноидальный приточный тракт или напрямую через ГЭБ. Чтобы добиться этого, мы внедрили надежную стратегию отбора фагов in vivo, которая идеально идентифицирует пептиды, транспортируемые любым из этих двух различных путей.
Теперь мы описываем последовательный метод скрининга фагового дисплея in vivo с отбором образцов СМЖ в сочетании с высокопроизводительным секвенированием (HTS) для мониторинга начальных раундов отбора с самым высоким разнообразием библиотеки. Скрининг проводился на сознательных крысах с постоянно имплантированной большой канюлей цистерны (CM), чтобы избежать загрязнения крови. Важно отметить, что этот подход выбирает как пептиды, нацеленные на мозг, так и пептиды с транспортной активностью через цереброваскулярный барьер. Мы использовали фаги T7 из-за их небольшого размера (~60 нм)10 и предположили, что они подходят для транспортировки везикул, которые позволяют трансцеллюлярно пересекать эндотелиальный и/или эпителиально-медуллярный барьер. После четырех раундов пэннинга были выделены популяции фагов, показывающие сильное обогащение СМЖ in vivo и ассоциацию с микрососудами мозга. Важно, что мы смогли подтвердить наши выводы, продемонстрировав, что предпочтительные и химически синтезированные лучшие кандидатные пептиды способны транспортировать белковый груз в спинномозговую жидкость. Во-первых, фармакодинамические эффекты ЦНС были установлены путем объединения ведущего транзитного пептида с ингибитором пептида BACE1. В дополнение к демонстрации того, что стратегии функционального скрининга in vivo могут идентифицировать новые транспортные пептиды мозга как эффективные переносчики белкового груза, мы ожидаем, что аналогичные подходы к функциональному отбору также станут важными для идентификации новых путей мозгового транспорта.
На основе бляшкообразующих единиц (PFU) после этапа упаковки фага была разработана и создана библиотека случайных 12-мерных линейных пептидов фага T7 с разнообразием приблизительно 109 (см. Материалы и методы). Важно отметить, что мы тщательно проанализировали эту библиотеку перед in vivo пэннингом. ПЦР-амплификация образцов фаговой библиотеки с использованием модифицированных праймеров генерировала ампликоны, которые были напрямую применимы к HTS (дополнительный рис. 1a). Из-за a) ошибок секвенирования HTS11, b) влияния на качество праймеров (NNK)1-12 и c) присутствия фага дикого типа (wt) (скелетные вставки) в резервной библиотеке была реализована процедура фильтрации последовательностей для извлечения только проверенной информации о последовательностях (дополнительный рис. 1b). Эти этапы фильтрации применяются ко всем библиотекам секвенирования HTS. Для стандартной библиотеки было получено в общей сложности 233 868 прочтений, из которых 39% прошли критерии фильтрации и были использованы для анализа библиотеки и отбора для последующих раундов (Дополнительный рисунок 1c–e). Чтения были преимущественно кратны 3 парам оснований в длину с пиком при 36 нуклеотидах (Дополнительный рисунок 1c), что подтверждает дизайн библиотеки (NNK) 1-12. Примечательно, что приблизительно 11% членов библиотеки содержали 12-мерную вставку остова PAGISRELVDKL дикого типа (wt), и почти половина последовательностей (49%) содержали вставки или делеции. HTS библиотеки библиотеки подтвердил высокое разнообразие пептидов в библиотеке: более 81% пептидных последовательностей были обнаружены только один раз и только 1,5% встречались в ≥4 копиях (Дополнительный рисунок 2a). Частоты аминокислот (аа) во всех 12 позициях в репертуаре хорошо коррелировали с частотами, ожидаемыми для числа кодонов, генерируемых вырожденным репертуаром NKK (Дополнительный рис. 2b). Наблюдаемая частота остатков аа, кодируемых этими вставками, хорошо коррелировала с рассчитанной частотой (r = 0,893) (Дополнительный рис. 2c). Подготовка фаговых библиотек для инъекции включает этапы амплификации и удаления эндотоксина. Ранее было показано, что это потенциально снижает разнообразие фаговых библиотек12,13. Поэтому мы секвенировали фаговую библиотеку, амплифицированную на планшете, которая подверглась удалению эндотоксина, и сравнили ее с исходной библиотекой, чтобы оценить частоту АА. Сильная корреляция (r = 0,995) наблюдалась между исходным пулом и амплифицированным и очищенным пулом (Дополнительный рис. 2d), что указывает на то, что конкуренция между клонами, амплифицированными на планшетах с использованием фага T7, не вызывала серьезного смещения. Это сравнение основано на частоте трипептидных мотивов в каждой библиотеке, поскольку разнообразие библиотек (~109) не может быть полностью охвачено даже с помощью HTS. Анализ частоты аминокислот в каждой позиции выявил небольшое позиционно-зависимое смещение в последних трех позициях введенного репертуара (Дополнительный рис. 2e). В заключение мы пришли к выводу, что качество и разнообразие библиотеки были приемлемыми, и наблюдались только незначительные изменения в разнообразии из-за амплификации и подготовки фаговых библиотек между несколькими раундами отбора.
Серийный отбор образцов спинномозговой жидкости может быть выполнен путем хирургической имплантации канюли в CM сознательных крыс для облегчения идентификации фага T7, введенного внутривенно (iv) через ГЭБ и/или BCSFB (рис. 1a-b). Мы использовали два независимых отборочных плеча (плечи A и B) в первых трех раундах отбора in vivo (рис. 1c). Мы постепенно увеличивали строгость отбора, уменьшая общее количество фага, введенного в первых трех раундах отбора. Для четвертого раунда пэннинга мы объединили образцы из ветвей A и B и провели три дополнительных независимых отбора. Для изучения свойств частиц фага T7 in vivo в этой модели фаг дикого типа (главная вставка PAGISRELVDKL) вводили крысам через хвостовую вену. Восстановление фагов из спинномозговой жидкости и крови в различные моменты времени показало, что относительно небольшие икосаэдрические фаги T7 имели быструю начальную фазу клиренса из отсека крови (Дополнительный рис. 3). На основании введенных титров и объема крови крыс мы подсчитали, что только приблизительно 1% веса фага от введенной дозы был обнаружен в крови через 10 минут после внутривенной инъекции. После этого начального быстрого снижения был измерен более медленный первичный клиренс с периодом полураспада 27,7 минут. Важно, что только очень мало фагов было извлечено из отсека СМЖ, что указывает на низкий фон для миграции фагов дикого типа в отсек СМЖ (Дополнительный рис. 3). В среднем только около 1 x 10-3% титров фага T7 в крови и 4 x 10-8% первоначально введенных фагов были обнаружены в спинномозговой жидкости за весь период отбора проб (0-250 мин). Примечательно, что период полураспада (25,7 мин) фага дикого типа в спинномозговой жидкости был аналогичен периоду полураспада в крови. Эти данные показывают, что барьер, разделяющий отсек СМЖ от крови, остается нетронутым у крыс с канюлированными СМ, ​​что позволяет проводить in vivo отбор фаговых библиотек для идентификации клонов, которые легко переносятся из крови в отсек СМЖ.
(a) Настройка метода повторного отбора спинномозговой жидкости (СМЖ) из большого пула. (b) Диаграмма, показывающая клеточное расположение барьера центральной нервной системы (ЦНС) и стратегию отбора, используемую для идентификации пептидов, пересекающих гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и гематоэнцефалический барьер. (c) Блок-схема скрининга фагового дисплея in vivo. В каждом раунде отбора фаги (идентификаторы животных внутри стрелок) вводились внутривенно. Две независимые альтернативные ветви (A, B) хранятся отдельно до 4-го раунда отбора. Для раундов отбора 3 и 4 каждый клон фага, извлеченный из СМЖ, был вручную секвенирован. (d) Кинетика фага, выделенного из крови (красные круги) и спинномозговой жидкости (зеленые треугольники) во время первого раунда отбора у двух канюлированных крыс после внутривенной инъекции библиотеки пептидов T7 (2 x 1012 фагов/животное). Синие квадраты указывают среднюю начальную концентрацию фага в крови, рассчитанную по количеству введенного фага с учетом общего объема крови. Черные квадраты указывают точку пересечения линии y, экстраполированной из концентраций фагов в крови. (e,f) Представляют относительную частоту и распределение всех возможных перекрывающихся трипептидных мотивов, обнаруженных в пептиде. Показано количество мотивов, обнаруженных в 1000 чтениях. Значительно (p < 0,001) обогащенные мотивы отмечены красными точками. (e) Диаграмма рассеяния корреляции, сравнивающая относительную частоту трипептидного мотива введенной библиотеки с фагом, полученным из крови животных № 1.1 и № 1.2. (f) Диаграмма рассеяния корреляции, сравнивающая относительные частоты трипептидных мотивов животных фагов № 1.1 и № 1.2, выделенных в крови и спинномозговой жидкости. (g, h) Представление идентификатора последовательности фага, обогащенного в крови (g), по сравнению с введенными библиотеками и фагом, обогащенным в спинномозговой жидкости (h), по сравнению с кровью после раунда отбора in vivo у обоих животных. Размер однобуквенного кода указывает, как часто эта аминокислота встречается в этой позиции. Зеленый = полярный, фиолетовый = нейтральный, синий = основной, красный = кислый и черный = гидрофобный аминокислоты. Рисунок 1a, b был разработан и создан Эдуардом Урихом.
Мы ввели фаговую пептидную библиотеку двум крысам с инструментом CM (клады A и B) и выделили фаг из спинномозговой жидкости и крови (рисунок 1d). Первоначальный быстрый клиренс библиотеки был менее выраженным по сравнению с фагом дикого типа. Средний период полураспада введенной библиотеки у обоих животных составил 24,8 минуты в крови, что аналогично фагу дикого типа, и 38,5 минут в СМЖ. Образцы фагов крови и спинномозговой жидкости от каждого животного были подвергнуты HTS, и все идентифицированные пептиды были проанализированы на наличие короткого трипептидного мотива. Трипептидные мотивы были выбраны, поскольку они обеспечивают минимальную основу для формирования структуры и пептидно-белковых взаимодействий14,15. Мы обнаружили хорошую корреляцию в распределении мотивов между введенной фаговой библиотекой и клонами, извлеченными из крови обоих животных (рисунок 1e). Данные указывают на то, что состав библиотеки лишь незначительно обогащен в отсеке крови. Частоты аминокислот и консенсусные последовательности были дополнительно проанализированы в каждой позиции с использованием адаптации программного обеспечения Weblogo16. Интересно, что мы обнаружили сильное обогащение остатков глицина в крови (рис. 1g). Когда кровь сравнивали с клонами, выбранными из СМЖ, наблюдался сильный отбор и некоторая отмена отбора мотивов (рис. 1f), и определенные аминокислоты предпочтительно присутствовали в предопределенных позициях в 12-членном (рис. 1h). Примечательно, что отдельные животные значительно различались в спинномозговой жидкости, тогда как обогащение глицина в крови наблюдалось у обоих животных (дополнительный рис. 4a–j). После строгой фильтрации данных о последовательностях в спинномозговой жидкости животных № 1.1 и № 1.2 было получено в общей сложности 964 и 420 уникальных 12-мерных пептидов (дополнительный рис. 1d–e). Изолированные фаговые клоны были амплифицированы и подвергнуты второму раунду отбора in vivo. Фаги, извлеченные из второго раунда отбора, были подвергнуты HTS у каждого животного, и все идентифицированные пептиды были использованы в качестве входных данных для программы распознавания мотивов для анализа появления трипептидных мотивов (рис. 2a, b, ef). По сравнению с первым циклом фага, извлеченного из CSF, мы наблюдали дальнейший отбор и отмену отбора многих мотивов в CSF в ветвях A и B (рис. 2). Алгоритм сетевой идентификации был применен для определения того, представляют ли они различные образцы последовательной последовательности. Было обнаружено явное сходство между 12-мерными последовательностями, извлеченными CSF в альтернативной кладе A (рис. 2c, d) и кладе B (рис. 2g, h). Объединенный анализ в каждой ветви выявил различные профили отбора для 12-мерных пептидов (Дополнительный рис. 5c, d) и увеличение соотношения титров СМЖ/кровь с течением времени для объединенных клонов после второго раунда отбора по сравнению с первым раундом отбора (Дополнительный рис. 5e).
Обогащение мотивов и пептидов в спинномозговой жидкости посредством двух последовательных раундов селекции функционального фагового дисплея in vivo.
Все фаги спинномозговой жидкости, полученные в первом раунде каждого животного (животные № 1.1 и № 1.2), были объединены, амплифицированы, секвенированы HT и повторно введены вместе (2 x 1010 фагов/животное) 2 крысам с канюляцией SM (№ 1.1 → №). 2.1 и 2.2, 1.2 → 2.3 и 2.4). (a,b,e,f) Диаграммы рассеяния корреляции, сравнивающие относительную частоту трипептидных мотивов всех фагов, полученных из СМЖ, в первом и втором раундах отбора. Относительная частота и распределение мотивов, представляющих все возможные перекрывающиеся трипептиды, обнаруженные в пептидах в обеих ориентациях. Показано количество мотивов, обнаруженных в 1000 прочтений. Мотивы, которые были значимо (p < 0,001) отобраны или исключены в одной из сравниваемых библиотек, выделены красными точками. (c, d, g, h) Представление логотипа последовательности всех богатых СМЖ последовательностей длиной 12 аминокислот на основе раундов 2 и 1 отбора in vivo. Размер однобуквенного кода указывает, как часто эта аминокислота встречается в этой позиции. Для представления логотипа сравнивается частота последовательностей СМЖ, извлеченных из отдельных животных между двумя раундами отбора, и показаны обогащенные последовательности во втором раунде: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 и (h) #1.2–#2.4. Наиболее обогащенные аминокислоты в данной позиции у (c, d) животных № 2.1 и № 2.2 или (g, h) у животных № 2.3 и № 2.4 показаны цветом. Зеленый = полярные, фиолетовый = нейтральные, синий = основные, красный = кислые и черный = гидрофобные аминокислоты.
После третьего раунда отбора мы идентифицировали 124 уникальные пептидные последовательности (#3.1 и #3.2) из ​​332 клонов фагов, реконструированных в СМЖ, выделенных из двух животных (Дополнительный рис. 6a). Последовательность LGSVS (18,7%) имела самую высокую относительную долю, за ней следовали вставки дикого типа PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) и SARGSWREIVSLS (2,2%). В последнем четвертом раунде мы объединили две независимо выбранные ветви от трех отдельных животных (рис. 1c). Из 925 секвенированных клонов фагов, выделенных из СМЖ, в четвертом раунде мы обнаружили 64 уникальные пептидные последовательности (Дополнительный рис. 6b), среди которых относительная доля фага дикого типа снизилась до 0,8%. Наиболее распространенными клонами CSF в четвертом раунде были LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) и RLSSVDSDLSGC (3,2%). %)). Диапазон длины выбранных пептидов обусловлен вставками/делециями нуклеотидов или преждевременными стоп-кодонами в праймерах библиотеки при использовании вырожденных кодонов для дизайна библиотеки NNK. Преждевременные стоп-кодоны генерируют более короткие пептиды и выбираются, поскольку они содержат благоприятный мотив aa. Более длинные пептиды могут быть результатом вставок/делеций в праймерах синтетических библиотек. Это помещает спроектированный стоп-кодон за пределы рамки и считывает его до тех пор, пока ниже по течению не появится новый стоп-кодон. В целом мы рассчитали факторы обогащения для всех четырех раундов отбора, сравнив входные данные с выходными данными образца. Для первого раунда скрининга мы использовали титры фагов дикого типа в качестве неспецифического фонового эталона. Интересно, что отрицательный отбор фагов был очень сильным в первом цикле СМЖ, но не в крови (рис. 3а), что может быть связано с низкой вероятностью пассивной диффузии большинства членов библиотеки пептидов в отсек СМЖ или с тем, что родственные фаги, как правило, более эффективно удерживаются или удаляются из кровотока, чем бактериофаги. Однако во втором раунде пэннинга сильный отбор фагов в СМЖ наблюдался в обеих кладах, что позволяет предположить, что предыдущий раунд был обогащен фагами, демонстрирующими пептиды, которые способствуют захвату СМЖ (рис. 3а). Опять же, без значительного обогащения кровью. Также в третьем и четвертом раундах клоны фагов были значительно обогащены в СМЖ. Сравнивая относительную частоту каждой уникальной пептидной последовательности между двумя последними раундами отбора, мы обнаружили, что последовательности были еще более обогащены в четвертом раунде отбора (рис. 3б). Всего было извлечено 931 трипептидных мотивов из всех 64 уникальных пептидных последовательностей с использованием обеих ориентаций пептидов. Наиболее обогащенные мотивы в четвертом раунде были более тщательно исследованы на предмет их профилей обогащения во всех раундах по сравнению с введенной библиотекой (отсечка: 10% обогащение) (Дополнительный рис. 6c). Общие закономерности отбора показали, что большинство изученных мотивов были обогащены во всех предыдущих раундах обеих ветвей отбора. Однако некоторые мотивы (например, SGL, VSG, LGS GSV) были преимущественно из альтернативной клады A, в то время как другие (например, FGW, RTN, WGF, NTR) были обогащены в альтернативной кладе B.
Проверка транспорта в спинномозговую жидкость пептидов, экспонированных на фагах, обогащенных спинномозговой жидкостью, и биотинилированных лидерных пептидов, конъюгированных с полезными грузами стрептавидина.
(a) Коэффициенты обогащения, рассчитанные во всех четырех раундах (R1-R4) на основе введенных (вход = I) титров фагов (БОЕ) и определенных титров фагов в СМЖ (выход = O). Коэффициенты обогащения для последних трех раундов (R2-R4) были рассчитаны путем сравнения с предыдущим раундом и первым раундом (R1) с данными о весе. Открытые столбцы - спинномозговая жидкость, заштрихованные столбцы - плазма. (***p<0,001, на основе t-критерия Стьюдента). (b) Список наиболее распространенных фаговых пептидов, ранжированных в соответствии с их относительной долей ко всем фагам, собранным в СМЖ после 4-го раунда отбора. Шесть наиболее распространенных фаговых клонов выделены цветом, пронумерованы и их коэффициенты обогащения между 3-м и 4-м раундами отбора (вставки). (c,d) Шесть наиболее обогащенных фаговых клонов, пустой фаг и родительские библиотеки фаговых пептидов из раунда 4 были проанализированы индивидуально в модели отбора проб СМЖ. Образцы СМЖ и крови были собраны в указанные временные точки. (c) Равные количества 6 клонов фагов-кандидатов (2 x 1010 фагов/животное), пустых фагов (#1779) (2 x 1010 фагов/животное) и библиотек исходных фаговых пептидов (2 x 1012 фагов/животное) Инъекция не менее 3 CM вводится канюлированному животному отдельно через хвостовую вену. Показана фармакокинетика СМЖ каждого введенного фагового клона и библиотеки фаговых пептидов с течением времени. (d) показывает среднее соотношение СМЖ/кровь для всех восстановленных фагов/мл за время отбора проб. (e) Четыре синтетических лидерных пептида и один скремблированный контрольный были связаны биотином со стрептавидином через их N-конец (тетрамерный дисплей) с последующей инъекцией (хвостовая вена внутривенно, 10 мг стрептавидина/кг). По крайней мере три интубированных крысы (N = 3). ). Образцы СМЖ были собраны в указанные временные точки, и концентрации стрептавидина были измерены с помощью ИФА СМЖ против стрептавидина (nd = не обнаружено). (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, на основе теста ANOVA). (f) Сравнение аминокислотной последовательности наиболее обогащенного фагового пептидного клона # 2002 (фиолетовый) с другими выбранными фаговыми пептидными клонами из 4-го раунда отбора. Идентичные и похожие аминокислотные фрагменты имеют цветовую кодировку.
Из всех обогащенных фагов в четвертом раунде (рис. 3b) шесть клонов-кандидатов были отобраны для дальнейшего индивидуального анализа в модели отбора проб СМЖ. Равные количества шести библиотек фагов-кандидатов, пустых фагов (без вставки) и профаговых пептидных библиотек были введены трем канюлированным животным CM, и фармакокинетика была определена в анализах СМЖ (рис. 3c) и крови (дополнительный рис. 7). Все протестированные клоны фагов были нацелены на отсек СМЖ на уровне в 10-1000 раз выше, чем у пустого контрольного фага (#1779). Например, клоны #2020 и #2077 имели титры СМЖ примерно в 1000 раз выше, чем у контрольного фага. Фармакокинетический профиль каждого выбранного пептида отличается, но все они обладают высокой способностью к самонаведению в СМЖ. Мы наблюдали постоянное снижение с течением времени для клонов № 1903 и № 2011, в то время как для клонов № 2077, № 2002 и № 2009 увеличение в течение первых 10 минут может указывать на активный транспорт, но это необходимо проверить. Клоны № 2020, № 2002 и № 2077 стабилизировались на высоких уровнях, в то время как концентрация СМЖ клона № 2009 медленно снижалась после первоначального увеличения. Затем мы сравнили относительную частоту каждого кандидата СМЖ с его концентрацией в крови (рис. 3d). Корреляция среднего титра каждого кандидата СМЖ с его титром в крови во все моменты взятия проб показала, что три из шести кандидатов были значительно обогащены СМЖ в крови. Интересно, что клон № 2077 показал более высокую стабильность в крови (дополнительный рисунок 7). Чтобы подтвердить, что сами пептиды способны активно транспортировать груз, отличный от фаговых частиц, в отсек СМЖ, мы синтезировали четыре лидерных пептида, дериватизированных биотином на N-конце, где пептиды прикрепляются к фаговой частице. Биотинилированные пептиды (№№ 2002, 2009, 2020 и 2077) были конъюгированы со стрептавидином (SA) для получения мультимерных форм, несколько имитирующих геометрию фага. Этот формат также позволил нам измерить воздействие SA в крови и спинномозговой жидкости в качестве пептидов белков, транспортирующих груз. Важно, что данные по фагам часто можно было воспроизвести, когда синтетические пептиды вводились в этом формате, конъюгированном с SA (рис. 3e). Скремблированные пептиды имели меньшее начальное воздействие и более быстрое выведение из СМЖ с неопределяемыми уровнями в течение 48 часов. Чтобы получить представление о путях доставки этих пептидных фаговых клонов в пространство СМЖ, мы проанализировали локализацию отдельных фаговых пептидных хитов с помощью иммуногистохимии (ИГХ) для прямого обнаружения фаговых частиц через 1 час после внутривенной инъекции in vivo. В частности, клоны № 2002, № 2077 и № 2009 можно было обнаружить с помощью сильного окрашивания в капиллярах мозга, в то время как контрольный фаг (№ 1779) и клон № 2020 не были обнаружены (дополнительный рисунок 8). Это говорит о том, что эти пептиды способствуют воздействию на мозг именно путем пересечения ГЭБ. Для проверки этой гипотезы требуется дальнейший подробный анализ, поскольку также может быть задействован путь BSCFB. При сравнении аминокислотной последовательности наиболее обогащенного клона (№ 2002) с другими выбранными пептидами было отмечено, что некоторые из них имеют схожие аминокислотные расширения, что может указывать на схожий механизм транспорта (рис. 3f).
Благодаря своему уникальному плазменному профилю и значительному увеличению CSF с течением времени, клон фагового дисплея #2077 был дополнительно исследован в течение более длительного 48-часового периода и смог воспроизвести быстрое увеличение CSF, наблюдаемое в связи с устойчивыми уровнями SA (рис. 4a). Что касается других идентифицированных фаговых клонов, #2077 сильно окрашивался на мозговые капилляры и показал значительную колокализацию с капиллярным маркером лектином при просмотре с более высоким разрешением и, возможно, некоторое окрашивание в паренхиматозном пространстве (рис. 4b). Чтобы исследовать, могут ли быть получены пептидно-опосредованные фармакологические эффекты в ЦНС, мы провели эксперимент, в котором биотинилированные версии i) транзитного пептида #2077 и ii) пептида ингибитора BACE1 смешивали с SA в двух различных соотношениях. Для одной комбинации мы использовали только ингибитор пептида BACE1, а для другой — соотношение ингибитора пептида BACE1 к пептиду #2077 1:3. Оба образца вводились внутривенно, и уровни бета-амилоидного пептида 40 (Abeta40) в крови и спинномозговой жидкости измерялись с течением времени. Abeta40 измерялся в спинномозговой жидкости, поскольку он отражает ингибирование BACE1 в паренхиме мозга. Как и ожидалось, оба комплекса значительно снизили уровни Abeta40 в крови (рис. 4c, d). Однако только образцы, содержащие смесь пептида № 2077 и ингибитора пептида BACE1, конъюгированного с SA, вызвали значительное снижение Abeta40 в спинномозговой жидкости (рис. 4c). Данные показывают, что пептид № 2077 способен транспортировать белок SA 60 кДа в ЦНС, а также вызывает фармакологические эффекты с SA-конъюгированными ингибиторами пептида BACE1.
(a) Клональная инъекция (2 × 10 фагов/животное) фага T7, показывающая долгосрочные фармакокинетические профили пептида CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) и неинъецированного контрольного фага (#1779) по крайней мере у трех крыс с интубацией CM. (b) Конфокальное микроскопическое изображение репрезентативных кортикальных микрососудов у крыс с инъекцией фага (2 × 10 10 фагов/животное), показывающее контрастное окрашивание пептида #2077 и сосудов (лектина). Эти клоны фага вводили 3 крысам и позволяли циркулировать в течение 1 часа перед перфузией. Мозг разрезали и окрашивали поликлональными антителами, меченными FITC, против капсида фага T7. За десять минут до перфузии и последующей фиксации внутривенно вводили лектин, меченный DyLight594. Флуоресцентные изображения, показывающие окрашивание лектином (красный) люминальной стороны микрососудов и фагов (зеленый) в просвете капилляров и периваскулярной ткани мозга. Масштабная линейка соответствует 10 мкм. (c, d) Биотинилированный ингибирующий пептид BACE1 отдельно или в сочетании с биотинилированным транзитным пептидом #2077 был связан со стрептавидином с последующей внутривенной инъекцией по крайней мере трем канюлированным крысам CM (10 мг стрептавидина/кг). Снижение Aβ40, опосредованное ингибитором пептида BACE1, измерялось с помощью ИФА Aβ1-40 в крови (красный) и спинномозговой жидкости (оранжевый) в указанные временные точки. Для большей ясности на графике нанесена пунктирная линия в масштабе 100%. (c) Процентное снижение Aβ40 в крови (красные треугольники) и спинномозговой жидкости (оранжевые треугольники) у крыс, получавших стрептавидин, конъюгированный с транзитным пептидом #2077 и ингибиторным пептидом BACE1 в соотношении 3:1. (d) Процентное снижение Aβ40 в крови (красные круги) и спинномозговой жидкости (оранжевые круги) у крыс, получавших стрептавидин, связанный только с ингибиторным пептидом BACE1. Концентрация Aβ в контроле составила 420 пг/мл (стандартное отклонение = 101 пг/мл).
Фаговый дисплей успешно применялся в нескольких областях биомедицинских исследований17. Этот метод использовался для исследований сосудистого разнообразия in vivo18,19, а также для исследований, нацеленных на мозговые сосуды20,21,22,23,24,25,26. В этом исследовании мы расширили применение этого метода отбора не только для прямой идентификации пептидов, нацеленных на мозговые сосуды, но и для обнаружения кандидатов с активными транспортными свойствами для пересечения гематоэнцефалического барьера. Теперь мы описываем разработку процедуры отбора in vivo на интубированных крысах с СМ и демонстрируем ее потенциал для идентификации пептидов со свойствами хоминга в СМЖ. Используя фаг T7, отображающий библиотеку 12-мерных случайных пептидов, мы смогли продемонстрировать, что фаг T7 достаточно мал (приблизительно 60 нм в диаметре)10, чтобы адаптироваться к гематоэнцефалическому барьеру, тем самым напрямую пересекая гематоэнцефалический барьер или сосудистое сплетение. Мы наблюдали, что сбор СМЖ у канюлированных крыс CM был хорошо контролируемым методом функционального скрининга in vivo, и что извлеченный фаг не только связывался с сосудистой системой, но и функционировал как транспортер через гематоэнцефалический барьер. Кроме того, одновременно собирая кровь и применяя HTS к СМЖ и полученным из крови фагам, мы подтвердили, что наш выбор СМЖ не был обусловлен обогащением крови или пригодностью к расширению между раундами отбора. Однако отсек крови является частью процедуры отбора, поскольку фаги, способные достичь отсека СМЖ, должны выживать и циркулировать в кровотоке достаточно долго, чтобы обогатиться в мозге. Чтобы извлечь надежную информацию о последовательности из необработанных данных HTS, мы внедрили фильтры, адаптированные к ошибкам секвенирования, специфичным для платформы, в рабочем процессе анализа. Включив кинетические параметры в метод скрининга, мы подтвердили быструю фармакокинетику фагов T7 дикого типа (t½ ~ 28 мин) в крови24, 27, 28, а также определили их период полураспада в спинномозговой жидкости (t½ ~ 26 мин) в минуту. Несмотря на схожие фармакокинетические профили в крови и спинномозговой жидкости, только 0,001% концентрации фага в крови можно было обнаружить в спинномозговой жидкости, что указывает на низкую фоновую подвижность фага T7 дикого типа через гематоэнцефалический барьер. Эта работа подчеркивает важность первого раунда отбора при использовании стратегий пэннинга in vivo, особенно для фаговых систем, которые быстро выводятся из кровообращения, поскольку лишь немногие клоны способны достичь компартмента ЦНС. Таким образом, в первом раунде снижение разнообразия библиотеки было очень большим, поскольку в конечном итоге в этой очень строгой модели спинномозговой жидкости было собрано только ограниченное количество клонов. Эта стратегия пэннинга in vivo включала несколько этапов отбора, таких как активное накопление в отсеке СМЖ, выживание клона в отсеке крови и быстрое удаление клонов фага T7 из крови в течение первых 10 минут (рис. 1d и дополнительный рис. 4M). ). Таким образом, после первого раунда в СМЖ были идентифицированы различные фаговые клоны, хотя для отдельных животных использовался один и тот же исходный пул. Это говорит о том, что множественные строгие этапы отбора для исходных библиотек с большим количеством членов библиотеки приводят к значительному снижению разнообразия. Поэтому случайные события станут неотъемлемой частью первоначального процесса отбора, значительно влияя на результат. Вероятно, что многие клоны в исходной библиотеке имели очень похожую склонность к обогащению СМЖ. Однако даже при одинаковых экспериментальных условиях результаты отбора могут отличаться из-за небольшого количества каждого конкретного клона в исходном пуле.
Мотивы, обогащенные в спинномозговой жидкости, отличаются от мотивов в крови. Интересно, что мы отметили первый сдвиг в сторону пептидов, богатых глицином, в крови отдельных животных. (Рис. 1g, Дополнительные рис. 4e, 4f). Фаг, содержащий пептиды глицина, может быть более стабильным и с меньшей вероятностью будет выведен из циркуляции. Однако эти пептиды, богатые глицином, не были обнаружены в образцах спинномозговой жидкости, что позволяет предположить, что курируемые библиотеки прошли два разных этапа отбора: один в крови и другой, которому позволили накопиться в спинномозговой жидкости. Клоны, обогащенные спинномозговой жидкостью, полученные в результате четвертого раунда отбора, были тщательно протестированы. Было подтверждено, что почти все индивидуально протестированные клоны были обогащены в спинномозговой жидкости по сравнению с пустым контрольным фагом. Один пептидный хит (#2077) был исследован более подробно. Он показал более длительный период полураспада в плазме по сравнению с другими хитами (рисунок 3d и дополнительный рисунок 7), и, что интересно, этот пептид содержал остаток цистеина на С-конце. Недавно было показано, что добавление цистеина к пептидам может улучшить их фармакокинетические свойства путем связывания с альбумином 29. В настоящее время это неизвестно для пептида № 2077 и требует дальнейшего изучения. Некоторые пептиды показали зависимость от валентности в обогащении СМЖ (данные не показаны), что может быть связано с отображаемой геометрией поверхности капсида T7. Система T7, которую мы использовали, показала 5-15 копий каждого пептида на частицу фага. IHC была проведена на клонах фагов-кандидатов, введенных внутривенно в кору головного мозга крыс (дополнительный рисунок 8). Данные показали, что по крайней мере три клона (№ 2002, № 2009 и № 2077) взаимодействовали с ГЭБ. Остается определить, приводит ли это взаимодействие с ГЭБ к накоплению СМЖ или перемещению этих клонов непосредственно в BCSFB. Важно то, что мы показываем, что выбранные пептиды сохраняют свою транспортную способность СМЖ при синтезе и связывании с белковым грузом. Связывание N-концевых биотинилированных пептидов с SA по сути повторяет результаты, полученные с их соответствующими фаговыми клонами в крови и спинномозговой жидкости (рис. 3e). Наконец, мы показываем, что ведущий пептид № 2077 способен усиливать мозговое действие биотинилированного пептидного ингибитора BACE1, конъюгированного с SA, вызывая выраженные фармакодинамические эффекты в ЦНС за счет значительного снижения уровней Abeta40 в СМЖ (рис. 4). Мы не смогли идентифицировать какие-либо гомологи в базе данных, выполнив поиск гомологии пептидной последовательности всех совпадений. Важно отметить, что размер библиотеки T7 составляет приблизительно 109, тогда как теоретический размер библиотеки для 12-меров составляет 4 x 1015. Таким образом, мы выбрали только небольшую часть пространства разнообразия библиотеки пептидов 12-меров, что может означать, что более оптимизированные пептиды могут быть идентифицированы путем оценки смежного пространства последовательностей этих идентифицированных хитов. Гипотетически, одной из причин, по которой мы не нашли никаких природных гомологов этих пептидов, может быть деселекция в ходе эволюции для предотвращения неконтролируемого проникновения определенных пептидных мотивов в мозг.
В совокупности наши результаты дают основу для будущей работы по более детальной идентификации и характеристике транспортных систем цереброваскулярного барьера in vivo. Основная установка этого метода основана на функциональной стратегии отбора, которая не только идентифицирует клоны со свойствами связывания с церебральными сосудами, но также включает критический шаг, на котором успешные клоны обладают внутренней активностью для пересечения биологических барьеров in vivo в компартмент ЦНС. заключается в выяснении механизма транспорта этих пептидов и их предпочтения связывания с микрососудами, специфичными для области мозга. Это может привести к открытию новых путей для транспорта ГЭБ и рецепторов. Мы ожидаем, что идентифицированные пептиды могут напрямую связываться с цереброваскулярными рецепторами или с циркулирующими лигандами, транспортируемыми через ГЭБ или BCSFB. Пептидные векторы с транспортной активностью СМЖ, обнаруженные в этой работе, будут дополнительно исследованы. В настоящее время мы изучаем специфичность этих пептидов для мозга на предмет их способности пересекать ГЭБ и/или BCSFB. Эти новые пептиды станут чрезвычайно ценными инструментами для потенциального открытия новых рецепторов или путей, а также для разработки новых высокоэффективных платформ для доставки макромолекул, таких как биологические препараты, в мозг.
Канюлируйте большую цистерну (БЦ) с использованием модификации ранее описанного метода. Анестезированных крыс Wistar (200-350 г) устанавливали на стереотаксический аппарат и делали срединный разрез по выбритой и асептически подготовленной коже головы, чтобы обнажить череп. Просверлите два отверстия в области верхней створки и закрепите в отверстиях фиксирующие винты. Дополнительное отверстие было просверлено в латеральном затылочном гребне для стереотаксического наведения канюли из нержавеющей стали в БЦ. Нанесите стоматологический цемент вокруг канюли и закрепите винтами. После фотоотверждения и затвердевания цемента кожная рана была закрыта швом 4/0 supramid. Правильное размещение канюли подтверждается спонтанным истечением спинномозговой жидкости (СМЖ). Извлеките крысу из стереотаксического аппарата, обеспечьте ей соответствующий послеоперационный уход и обезболивание и дайте ей восстановиться в течение как минимум одной недели, пока в спинномозговой жидкости не появятся признаки крови. Крысы Wistar (Crl:WI/Han) были получены из Charles River (Франция). Все крысы содержались в особых условиях, свободных от патогенов. Все эксперименты на животных были одобрены Ветеринарным управлением города Базель, Швейцария, и проводились в соответствии с Лицензией на животных № 2474 (Оценка активного транспорта в мозг путем измерения уровней терапевтических кандидатов в спинномозговой жидкости и мозге крысы).
Осторожно поддерживайте сознание крысы с канюлей CM в руке. Удалите дурман из канюли и соберите 10 мкл спонтанно текущей спинномозговой жидкости. Поскольку проходимость канюли была в конечном итоге нарушена, в это исследование были включены только чистые образцы спинномозговой жидкости без признаков загрязнения кровью или изменения цвета. Параллельно с этим из небольшого разреза на кончике хвоста брали примерно 10–20 мкл крови в пробирки с гепарином (Sigma-Aldrich). СМЖ и кровь собирали в различные моменты времени после внутривенной инъекции фага T7. Перед каждым сбором образца СМЖ сбрасывали примерно 5–10 мкл жидкости, что соответствует мертвому объему катетера.
Библиотеки были созданы с использованием вектора T7Select 10-3b, как описано в руководстве по системе T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Вкратце, случайная 12-мерная ДНК-вставка была синтезирована в следующем формате:
Кодон NNK использовался для избежания двойных стоп-кодонов и сверхэкспрессии аминокислот во вставке. N — это вручную смешанное эквимолярное соотношение каждого нуклеотида, а K — вручную смешанное эквимолярное соотношение нуклеотидов аденина и цитозина. Одноцепочечные регионы были преобразованы в двухцепочечную ДНК путем дальнейшей инкубации с dNTP (Novagen) и ферментом Кленова (New England Biolabs) в буфере Кленова (New England Biolabs) в течение 3 часов при 37°C. После реакции двухцепочечная ДНК была восстановлена ​​осаждением EtOH. Полученная ДНК была переварена рестриктазами EcoRI и HindIII (оба от Roche). Затем расщепленная и очищенная (QIAquick, Qiagen) вставка (лигаза T4, New England Biolabs) была лигирована в рамке считывания в предварительно расщепленный вектор T7 после аминокислоты 348 гена капсида 10B. Реакции лигирования инкубировали при 16° C в течение 18 часов перед упаковкой in vitro. Упаковку фага in vitro проводили в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору для клонирования T7Select 10-3b (Novagen), а упаковочный раствор амплифицировали один раз до лизиса с использованием Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Лизаты центрифугировали, титровали и замораживали при -80° C в качестве исходного раствора глицерина.
Прямая ПЦР-амплификация вариабельных областей фага, амплифицированных в бульоне или планшете с использованием фирменных праймеров слияния 454/Roche-amplicon. Прямой праймер слияния содержит последовательности, фланкирующие вариабельную область (NNK) 12 (специфичные для матрицы), адаптер GS FLX Titanium A и ключевую последовательность библиотеки из четырех оснований (TCAG) (Дополнительный рисунок 1a):
Праймер обратного слияния также содержит биотин, прикрепленный к захватывающим гранулам, и титановый адаптер GS FLX B, необходимый для клональной амплификации во время эмульсионной ПЦР:
Затем ампликоны подвергали пиросеквенированию 454/Roche в соответствии с протоколом 454 GS-FLX Titanium. Для ручного секвенирования по Сэнгеру (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) ДНК фага Т7 амплифицировали с помощью ПЦР и секвенировали со следующими парами праймеров:
Вставки из отдельных бляшек подвергали ПЦР-амплификации с использованием набора Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (согласно инструкции производителя). Выполняли горячий старт (10 мин при 95 °C) и 35 циклов усиления (50 с при 95 °C, 1 мин при 50 °C и 1 мин при 72 °C).
Фаги из библиотек, дикие фаги, фаги, извлеченные из спинномозговой жидкости и крови, или отдельные клоны амплифицировали в Escherichia coli BL5615 в бульоне TB (Sigma Aldrich) или в чашках 500 см2 (Thermo Scientific) в течение 4 ч при 37°C. Фаги извлекали из пластин путем промывания пластин буфером Tris-EDTA (Fluka Analytical) или путем сбора бляшек стерильными наконечниками пипеток. Фаги выделяли из культурального супернатанта или буфера экстракции с помощью одного раунда осаждения полиэтиленгликолем (PEG 8000) (Promega) и ресуспендировали в буфере Tris-EDTA.
Амплифицированный фаг подвергался 2-3 раундам удаления эндотоксина с использованием гранул для удаления эндотоксина (Miltenyi Biotec) перед внутривенной (IV) инъекцией (500 мкл/животное). В первом раунде вводили 2×1012 фагов; во втором — 2×1010 фагов; в третьем и четвертом раундах отбора — 2×109 фагов на животное. Содержание фагов в образцах спинномозговой жидкости и крови, собранных в указанные временные точки, определяли путем подсчета бляшек в соответствии с инструкциями производителя (руководство по системе T7Select). Отбор фагов проводили путем внутривенной инъекции очищенных библиотек в хвостовую вену или путем повторной инъекции фага, извлеченного из спинномозговой жидкости из предыдущего раунда отбора, а последующие сборы проводили через 10 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 180 мин и 240 мин соответственно для образцов спинномозговой жидкости и крови. Всего было проведено четыре раунда пэннинга in vivo, в которых две выбранные ветви хранились отдельно и анализировались в течение первых трех раундов отбора. Все фаговые вставки, извлеченные из СМЖ в первых двух раундах отбора, были подвергнуты пиросеквенированию 454/Roche, в то время как все клоны, извлеченные из СМЖ в последних двух раундах отбора, были секвенированы вручную. Все кровяные фаги из первого раунда отбора также были подвергнуты пиросеквенированию 454/Roche. Для инъекции фаговых клонов выбранные фаги были амплифицированы в E. coli (BL5615) на пластинах площадью 500 см2 при 37 °C в течение 4 часов. Индивидуально отобранные и вручную секвенированные клоны были размножены в среде TB. После экстракции фагов, очистки и удаления эндотоксина (как описано выше) 2×1010 фагов/животное в 300 мкл были введены внутривенно в одну хвостовую вену.
Предварительная обработка и качественная фильтрация данных о последовательностях. Необработанные данные 454/Roche были преобразованы из двоичного стандартного формата потоковой карты (sff) в формат Pearson, удобный для чтения человеком (fasta), с использованием программного обеспечения поставщика. Дальнейшая обработка нуклеотидной последовательности была выполнена с использованием фирменных программ и скриптов на языке C (невыпущенный пакет программного обеспечения), как описано ниже. Анализ первичных данных включает строгие многоступенчатые процедуры фильтрации. Чтобы отфильтровать считывания, которые не содержали допустимую последовательность ДНК-вставки 12mer, считывания были последовательно выровнены по начальной метке (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), стоп-метке (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) и фоновой вставке (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) с использованием глобального теста Нидлмана-Вунша. выравнивание, допускающее до 2 несоответствий на выравнивание31. Поэтому чтения без стартовых и стоповых меток и чтения, содержащие фоновые вставки, т. е. выравнивания, превышающие допустимое количество несовпадений, были удалены из библиотеки. Что касается оставшихся чтений, последовательность ДНК N-мера, простирающаяся от стартовой метки и заканчивающаяся перед стоповой меткой, была вырезана из исходной последовательности чтения и дополнительно обработана (далее именуется «вставка»). После трансляции вставки часть после первого стоп-кодона на 5′ конце праймера удаляется из вставки. Кроме того, нуклеотиды, приводящие к неполным кодонам на 3′ конце праймера, также были удалены. Чтобы исключить вставки, содержащие только фоновые последовательности, были также удалены транслированные вставки, начинающиеся с аминокислотного паттерна «PAG». Пептиды с посттрансляционной длиной менее 3 аминокислот были удалены из библиотеки. Наконец, удалите избыточность в пуле вставок и определите частоту каждой уникальной вставки. Результаты этого анализа включали список нуклеотидных последовательностей (вставок) и их (чтений) частот (дополнительные рисунки 1c и 2).
Группировка вставок N-мерной ДНК по сходству последовательностей: Чтобы устранить ошибки секвенирования, специфичные для 454/Roche (например, проблемы с секвенированием гомополимерных расширений), и удалить менее важные избыточности, ранее отфильтрованные вставки последовательности N-мерной ДНК (вставки) сортируются по сходству. вставок (допускается до 2 несовпадающих оснований) с использованием итеративного алгоритма, определенного следующим образом: вставки сортируются сначала по их частоте (от самой высокой к самой низкой), а если они одинаковы, то по их вторичной сортировке по длине (от самой длинной к самой короткой) ). Таким образом, наиболее частые и самые длинные вставки определяют первую «группу». Частота группы устанавливается на ключевую частоту. Затем каждая вставка, оставшаяся в отсортированном списке, была попытана быть добавлена ​​в группу путем попарного выравнивания Нидлмана-Вунша. Если количество несовпадений, вставок или делеций в выравнивании не превышает порогового значения 2, вставка добавляется в группу, а общая частота группы увеличивается на то, как часто добавлялась вставка. Вставки, добавленные в группу, помечаются как используемые и исключаются из дальнейшей обработки. Если последовательность вставки не может быть добавлена ​​в уже существующую группу, последовательность вставки используется для создания новой группы с соответствующей частотой вставки и помечается как используемая. Итерация заканчивается, когда каждая последовательность вставки либо была использована для формирования новой группы, либо может быть включена в уже существующую группу. В конце концов, сгруппированные вставки, состоящие из нуклеотидов, в конечном итоге транслируются в пептидные последовательности (пептидные библиотеки). Результатом этого анализа является набор вставок и соответствующих им частот, которые составляют число последовательных прочтений (Дополнительный рис. 2).
Генерация мотивов: на основе списка уникальных пептидов была создана библиотека, содержащая все возможные паттерны аминокислот (aa), как показано ниже. Каждый возможный паттерн длиной 3 был извлечен из пептида, и его обратный паттерн был добавлен вместе с общей библиотекой мотивов, содержащей все паттерны (трипептиды). Библиотеки высокоповторяющихся мотивов были секвенированы, а избыточность удалена. Затем для каждого трипептида в библиотеке мотивов мы проверили его наличие в библиотеке с помощью вычислительных инструментов. В этом случае частота пептида, содержащего найденный трипептид мотива, добавляется и назначается мотиву в библиотеке мотивов («количество мотивов»). Результатом генерации мотивов является двумерный массив, содержащий все вхождения трипептидов (мотивов) и их соответствующие значения, которые представляют собой количество прочтений секвенирования, которые приводят к соответствующему мотиву, когда прочтения фильтруются, группируются и транслируются. Метрики, как подробно описано выше.
Нормализация количества мотивов и соответствующих диаграмм рассеяния: Количество мотивов для каждого образца было нормализовано с использованием
где ni — число прочтений, содержащих тему i. Таким образом, vi представляет собой процентную частоту прочтений (или пептидов), содержащих мотив i в образце. P-значения для ненормализованного числа мотивов рассчитывались с использованием точного теста Фишера. Что касается коррелограмм числа мотивов, корреляции Спирмена рассчитывались с использованием нормализованного числа мотивов с R.
Для визуализации содержания аминокислот в каждой позиции в пептидной библиотеке были созданы веб-логограммы 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Во-первых, содержание аминокислот в каждой позиции 12-мерного пептида сохраняется в матрице 20×12. Затем набор из 1000 пептидов, содержащих одинаковое относительное содержание аминокислот в каждой позиции, генерируется в формате fasta-sequence и предоставляется в качестве входных данных для web-logo 3, который генерирует графическое представление относительного содержания аминокислот в каждой позиции для данной пептидной библиотеки. Для визуализации многомерных наборов данных были созданы тепловые карты с использованием разработанного внутри компании инструмента в R (biosHeatmap, еще не выпущенный пакет R). Дендрограммы, представленные на тепловых картах, были рассчитаны с использованием иерархического метода кластеризации Уорда с метрикой евклидового расстояния. Для статистического анализа данных оценки мотивов значения P для ненормализованной оценки рассчитывались с использованием точного теста Фишера. Значения P для других наборов данных рассчитывались в R с использованием t-критерия Стьюдента или ANOVA.
Выбранные фаговые клоны и фаги без вставок вводили внутривенно через хвостовую вену (2×1010 фагов/животное в 300 мкл PBS). За десять минут до перфузии и последующей фиксации тем же животным внутривенно вводили 100 мкл лектина, меченого DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Через 60 минут после инъекции фага крысам проводили перфузию через сердце 50 мл PBS, а затем 50 мл 4% PFA/PBS. Образцы мозга дополнительно фиксировали в течение ночи в 4% PFA/PBS и замачивали в 30% сахарозе в течение ночи при 4°C. Образцы подвергали быстрой заморозке в смеси OCT. Иммуногистохимический анализ замороженных образцов проводили при комнатной температуре на 30 мкм криосрезах, заблокированных 1% BSA и инкубированных с поликлональными FITC-мечеными антителами против фага T7 (Novus NB 600-376A) при 4 °C. Инкубировали в течение ночи. Наконец, срезы промывали 3 раза PBS и исследовали с помощью конфокального лазерного микроскопа (Leica TCS SP5).
Все пептиды с минимальной чистотой 98% были синтезированы GenScript USA, биотинилированы и лиофилизированы. Биотин связан через дополнительный тройной глициновый спейсер на N-конце. Проверьте все пептиды с помощью масс-спектрометрии.
Стрептавидин (Sigma S0677) смешивали с 5-кратным эквимолярным избытком биотинилированного пептида, биотинилированного ингибиторного пептида BACE1 или комбинации (соотношение 3:1) биотинилированного ингибиторного пептида BACE1 и ингибиторного пептида BACE1 в 5–10% ДМСО/инкубировали в PBS. 1 час при комнатной температуре перед инъекцией. Конъюгированные со стрептавидином пептиды вводили внутривенно в дозе 10 мг/кг в одну из хвостовых вен крыс с мозговой полостью.
Концентрацию комплексов стрептавидин-пептид оценивали с помощью ИФА. Микротитровальные планшеты Nunc Maxisorp (Sigma) покрывали в течение ночи при 4°C антителом мыши к стрептавидину 1,5 мкг/мл (Thermo, MA1-20011). После блокирования (блокирующий буфер: 140 нМ NaCL, 5 мМ EDTA, 0,05% NP40, 0,25% желатина, 1% BSA) при комнатной температуре в течение 2 часов, промывали планшет 0,05% Tween-20/PBS (промывочный буфер) в течение 3 секунд, образцы СМЖ и плазмы добавляли в лунки, разбавленные блокирующим буфером (плазма 1:10 000, СМЖ 1:115). Затем планшет инкубировали в течение ночи при 4°C с антителом для обнаружения (1 мкг/мл, анти-стрептавидин-HRP, Novus NB120-7239). После трех этапов промывки стрептавидин обнаруживали путем инкубации в растворе субстрата TMB (Roche) в течение 20 мин. После остановки развития цвета с помощью 1M H2SO4 измерьте поглощение при 450 нм.
Функцию комплекса стрептавидин-пептид-ингибитор BACE1 оценивали с помощью ИФА Aβ(1-40) в соответствии с протоколом производителя (Wako, 294-64701). Вкратце, образцы СМЖ разводили в стандартном разбавителе (1:23) и инкубировали в течение ночи при 4°C в 96-луночных планшетах, покрытых антителом захвата BNT77. После пяти этапов промывки добавляли конъюгированное с HRP антитело BA27 и инкубировали в течение 2 часов при 4°C, после чего проводили пять этапов промывки. Aβ(1–40) обнаруживали путем инкубации в растворе TMB в течение 30 минут при комнатной температуре. После остановки развития окраски стоп-раствором измерьте поглощение при 450 нм. Образцы плазмы подвергали твердофазной экстракции перед ИФА Aβ(1–40). Плазму добавляли к 0,2% DEA (Sigma) в 96-луночных планшетах и ​​инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. После последовательной промывки планшетов SPE (Oasis, 186000679) водой и 100% метанолом образцы плазмы добавляли в планшеты SPE, и вся жидкость удалялась. Образцы промывали (сначала 5% метанолом, затем 30% метанолом) и элюировали 2% NH4OH/90% метанолом. После сушки элюата при 55°C в течение 99 минут при постоянном токе N2 образцы восстанавливали в стандартных разбавителях и измеряли Aβ(1–40), как описано выше.
Как цитировать эту статью: Урих, Э. и др. Доставка грузов в мозг с использованием транзитных пептидов, идентифицированных in vivo. Наука. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB и Moos T. Доставка макромолекулярных препаратов в мозг с помощью таргетной терапии. Журнал нейрохимии 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. и Martinez-Martinez, P. Доставка пептидных и белковых препаратов через гематоэнцефалический барьер. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардридж, В. М. Гематоэнцефалический барьер: узкое место в разработке лекарств для мозга. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Йохансон, К. Э., Дункан, Дж. А., Стопа, Э. Г. и Берд, А. Перспективы улучшенной доставки лекарств и нацеливания их на мозг через сосудистое сплетение-цереброспинальная жидкость. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардридж, В. М. Модернизация биофармацевтических препаратов с помощью молекулярных троянских коней для доставки в мозг. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардридж, WM рецептор-опосредованный транспорт пептидов через гематоэнцефалический барьер. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Нивонер, Дж. и др. Повышение проникновения в мозг и эффективности терапевтических антител с использованием моновалентных молекулярных челноков. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Транспорт рецептора трансферрина (TfR) определяет поглощение мозгом вариантов сродства антител TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).