Благодарим вас за посещение сайта Nature.com. Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновленную версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Кроме того, для обеспечения постоянной поддержки мы отображаем сайт без стилей и JavaScript.
Отображает карусель из трех слайдов одновременно. Используйте кнопки «Предыдущий» и «Следующий», чтобы переключаться между тремя слайдами за раз, или используйте ползунки в конце, чтобы переключаться между тремя слайдами за раз.
Гематоэнцефалический барьер и гематоэнцефалический барьер препятствуют достижению биотерапевтическими препаратами своих мишеней в центральной нервной системе, тем самым затрудняя эффективное лечение неврологических заболеваний. Для обнаружения новых транспортеров в головном мозге in vivo мы использовали библиотеку пептидов фага Т7 и последовательно собирали образцы крови и спинномозговой жидкости (СМЖ) с помощью модели крыс с большим пулом канюлированных сосудов. Специфические фаговые клоны были значительно обогащены в СМЖ после четырех раундов селекции. Тестирование отдельных пептидов-кандидатов показало более чем 1000-кратное обогащение в СМЖ. Биологическая активность пептид-опосредованной доставки в головной мозг была подтверждена 40%-ным снижением уровня амилоида-β в спинномозговой жидкости с использованием пептидного ингибитора BACE1, связанного с идентифицированным новым транзитным пептидом. Эти результаты позволяют предположить, что пептиды, идентифицированные методами селекции фагов in vivo, могут быть полезными носителями для системной доставки макромолекул в головной мозг с терапевтическим эффектом.
Исследования в области таргетной терапии центральной нервной системы (ЦНС) в основном были сосредоточены на выявлении оптимизированных лекарств и агентов, обладающих свойствами, направленными на ЦНС, при этом меньше внимания уделялось изучению механизмов, обеспечивающих активную доставку лекарств в мозг. Сейчас ситуация начинает меняться, поскольку доставка лекарств, особенно крупных молекул, является неотъемлемой частью современной разработки лекарств в нейробиологии. Окружающая среда центральной нервной системы хорошо защищена цереброваскулярным барьером, состоящим из гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и гематоэнцефалического барьера (ГЭБ)¹, что затрудняет доставку лекарств в мозг¹,². По оценкам, почти все лекарственные препараты с крупными молекулами и более 98% препаратов с малыми молекулами выводятся из мозга³. Поэтому крайне важно выявить новые системы транспорта в мозг, обеспечивающие эффективную и специфическую доставку терапевтических препаратов в ЦНС⁴,⁵. Однако ГЭБ и ГЭБ также предоставляют отличную возможность для доставки лекарств, поскольку они проникают во все структуры мозга через его обширную сосудистую сеть. Таким образом, современные усилия по использованию неинвазивных методов доставки в мозг в значительной степени основаны на механизме рецептор-опосредованного транспорта (PMT) с использованием эндогенного рецептора ГЭБ6. Несмотря на недавние ключевые достижения в использовании пути рецептора трансферрина7,8, необходима дальнейшая разработка новых систем доставки с улучшенными свойствами. С этой целью мы поставили перед собой задачу идентифицировать пептиды, способные опосредовать транспорт спинномозговой жидкости (СМЖ), поскольку в принципе их можно было бы использовать для доставки макромолекул в ЦНС или для открытия новых рецепторных путей. В частности, специфические рецепторы и транспортеры цереброваскулярной системы (ГЭБ и BSCFB) могут служить потенциальными мишенями для активной и специфической доставки биотерапевтических препаратов. Спинномозговая жидкость (СМЖ) является секреторным продуктом сосудистого сплетения (СС) и находится в непосредственном контакте с интерстициальной жидкостью головного мозга через субарахноидальное и желудочковое пространства4. Недавно было показано, что субарахноидальная спинномозговая жидкость чрезмерно диффундирует в интерстиций головного мозга⁹. Мы надеемся получить доступ к паренхиматозному пространству, используя этот субарахноидальный приток или непосредственно через гематоэнцефалический барьер. Для достижения этой цели мы внедрили надежную стратегию селекции фагов in vivo, которая в идеале позволяет идентифицировать пептиды, транспортируемые любым из этих двух различных путей.
В данной работе мы описываем метод последовательного скрининга in vivo с использованием фагового дисплея и отбора проб спинномозговой жидкости (СМЖ) в сочетании с высокопроизводительным секвенированием (ВПС) для мониторинга начальных этапов отбора с наибольшим разнообразием библиотеки. Скрининг проводился на бодрствующих крысах с постоянно имплантированной канюлей большой цистерны (КЦ) для предотвращения загрязнения кровью. Важно отметить, что этот подход позволяет отбирать как пептиды, нацеленные на головной мозг, так и пептиды с транспортной активностью через цереброваскулярный барьер. Мы использовали фаги Т7 из-за их небольшого размера (~60 нм)10 и предположили, что они подходят для транспорта везикул, обеспечивающих трансцеллюлярное пересечение эндотелиального и/или эпителиально-медуллярного барьера. После четырех раундов отбора были выделены популяции фагов, демонстрирующие сильное обогащение СМЖ in vivo и ассоциацию с церебральными микрососудами. Важно отметить, что мы смогли подтвердить наши результаты, продемонстрировав, что предпочтительные и химически синтезированные лучшие кандидаты-пептиды способны транспортировать белковый груз в спинномозговую жидкость. Во-первых, фармакодинамические эффекты в ЦНС были установлены путем сочетания ведущего транзитного пептида с ингибитором пептида BACE1. Помимо демонстрации того, что стратегии функционального скрининга in vivo могут выявлять новые транспортные пептиды головного мозга в качестве эффективных переносчиков белкового груза, мы ожидаем, что аналогичные подходы к функциональному отбору также станут важными для выявления новых путей транспорта в головном мозге.
На основе бляшкообразующих единиц (БОЕ) после этапа упаковки фага была разработана и создана библиотека случайных 12-мерных линейных пептидов фага Т7 с разнообразием приблизительно 109 (см. Материалы и методы). Важно отметить, что мы тщательно проанализировали эту библиотеку перед in vivo скринингом. ПЦР-амплификация образцов фаговой библиотеки с использованием модифицированных праймеров позволила получить ампликоны, непосредственно применимые для высокопроизводительного скрининга (ВПС) (дополнительный рис. 1a). Из-за а) ошибок секвенирования HTS11, б) влияния на качество праймеров (NNK)1-12 и в) присутствия фага дикого типа (wt) (скелетные вставки) в резервной библиотеке была реализована процедура фильтрации последовательностей для извлечения только проверенной информации о последовательности (дополнительный рис. 1b). Эти этапы фильтрации применяются ко всем библиотекам секвенирования ВПС. Для стандартной библиотеки было получено в общей сложности 233 868 прочтений, из которых 39% прошли критерии фильтрации и были использованы для анализа библиотеки и отбора для последующих раундов (дополнительный рисунок 1c–e). Прочтения преимущественно имели длину, кратную 3 парам оснований, с пиком на уровне 36 нуклеотидов (дополнительный рисунок 1c), что подтверждает дизайн библиотеки (NNK) 1-12. Примечательно, что приблизительно 11% членов библиотеки содержали 12-мерную вставку PAGISRELVDKL дикого типа (wt), и почти половина последовательностей (49%) содержала вставки или делеции. Высокопроизводительное секвенирование библиотеки подтвердило высокое разнообразие пептидов в библиотеке: более 81% пептидных последовательностей были обнаружены только один раз, и только 1,5% встречались в ≥4 копиях (дополнительный рисунок 2a). Частота встречаемости аминокислот (аа) во всех 12 позициях репертуара хорошо коррелировала с ожидаемой частотой для количества кодонов, генерируемых вырожденным репертуаром NKK (дополнительный рис. 2b). Наблюдаемая частота аминокислотных остатков, кодируемых этими вставками, хорошо коррелировала с рассчитанной частотой (r = 0,893) (дополнительный рис. 2c). Подготовка фаговых библиотек для инъекции включает этапы амплификации и удаления эндотоксина. Ранее было показано, что это потенциально снижает разнообразие фаговых библиотек12,13. Поэтому мы секвенировали амплифицированную на планшете фаговую библиотеку, из которой был удален эндотоксин, и сравнили ее с исходной библиотекой, чтобы оценить частоту встречаемости аминокислот. Была обнаружена сильная корреляция (r = 0,995) между исходным пулом и амплифицированным и очищенным пулом (дополнительный рис. 2d), что указывает на то, что конкуренция между клонами, амплифицированными на чашках Петри с использованием фага Т7, не вызвала существенного смещения. Это сравнение основано на частоте трипептидных мотивов в каждой библиотеке, поскольку разнообразие библиотек (~109) не может быть полностью учтено даже с помощью ВТСП. Анализ частоты аминокислот в каждой позиции выявил небольшое позиционно-зависимое смещение в последних трех позициях введенного репертуара (дополнительный рис. 2e). В заключение мы пришли к выводу, что качество и разнообразие библиотеки были приемлемыми, и наблюдались лишь незначительные изменения в разнообразии, связанные с амплификацией и подготовкой фаговых библиотек между несколькими раундами селекции.
Последовательный забор спинномозговой жидкости можно проводить путем хирургической имплантации канюли в цереброспинальную мембрану бодрствующих крыс для облегчения идентификации фага Т7, введенного внутривенно (в/в) через гематоэнцефалический барьер и/или барьер между спинномозговой жидкостью и кровью (рис. 1a-b). В первых трех раундах селекции in vivo мы использовали два независимых селекционных рукава (руки A и B) (рис. 1c). Мы постепенно увеличивали жесткость селекции, уменьшая общее количество введенного фага в первых трех раундах селекции. Для четвертого раунда отбора мы объединили образцы из ветвей A и B и провели три дополнительных независимых отбора. Для изучения свойств частиц фага Т7 in vivo в этой модели крысам внутривенно через хвостовую вену вводили фаг дикого типа (мастер-вставка PAGISRELVDKL). Анализ выделения фагов из спинномозговой жидкости и крови в разные моменты времени показал, что относительно небольшие икосаэдрические фаги Т7 имели быструю начальную фазу выведения из крови (дополнительный рисунок 3). На основе введенных титров и объема крови крыс мы рассчитали, что через 10 минут после внутривенного введения в крови было обнаружено лишь приблизительно 1% по массе фага от введенной дозы. После этого первоначального быстрого снижения было измерено более медленное первичное выведение с периодом полураспада 27,7 минут. Важно отметить, что из спинномозговой жидкости было извлечено лишь очень небольшое количество фагов, что указывает на низкий фоновый уровень миграции фагов дикого типа в спинномозговую жидкость (дополнительный рисунок 3). В среднем, за весь период отбора проб (0-250 мин) в крови было обнаружено лишь около 1 x 10⁻³% титров фага Т7, а в спинномозговой жидкости — 4 x 10⁻⁸% от первоначально введенных фагов. Примечательно, что период полураспада (25,7 мин) фага дикого типа в спинномозговой жидкости был аналогичен периоду полураспада, наблюдаемому в крови. Эти данные демонстрируют, что барьер, разделяющий спинномозговую жидкость и кровь, остается неповрежденным у крыс с канюлированием CM, что позволяет проводить in vivo селекцию фаговых библиотек для идентификации клонов, которые легко транспортируются из крови в спинномозговую жидкость.
(a) Разработка метода повторного отбора проб спинномозговой жидкости (СМЖ) из большого пула. (b) Диаграмма, показывающая клеточное расположение барьера центральной нервной системы (ЦНС) и стратегию отбора, используемую для идентификации пептидов, пересекающих гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). (c) Блок-схема скрининга фагового дисплея in vivo. В каждом раунде отбора фаги (идентификаторы животных внутри стрелок) вводились внутривенно. Две независимые альтернативные ветви (A, B) сохранялись отдельно до 4-го раунда отбора. Для 3-го и 4-го раундов отбора каждый клон фага, выделенный из СМЖ, секвенировался вручную. (d) Кинетика фагов, выделенных из крови (красные круги) и спинномозговой жидкости (зеленые треугольники), во время первого раунда отбора у двух крыс с канюлями после внутривенного введения библиотеки пептидов Т7 (2 x 10¹² фагов/животное). Синие квадраты показывают среднюю начальную концентрацию фага в крови, рассчитанную на основе количества введенного фага с учетом общего объема крови. Черные квадраты указывают точку пересечения линии Y, экстраполированной из концентраций фагов в крови. (e,f) Представлены относительная частота и распределение всех возможных перекрывающихся трипептидных мотивов, обнаруженных в пептиде. Показано количество мотивов, обнаруженных в 1000 измерениях. Значимо (p < 0,001) обогащенные мотивы отмечены красными точками. (e) Диаграмма рассеяния корреляции, сравнивающая относительную частоту трипептидного мотива введенной библиотеки с фагами, полученными из крови животных № 1.1 и № 1.2. (f) Диаграмма рассеяния корреляции, сравнивающая относительные частоты трипептидных мотивов фагов животных № 1.1 и № 1.2, выделенных из крови и спинномозговой жидкости. (g, h) Идентификаторы последовательностей фагов, обогащенных в крови (g), по сравнению с библиотеками, полученными путем инъекции, и фагов, обогащенных в спинномозговой жидкости (h), по сравнению с кровью после раунда селекции in vivo у обоих животных. Размер однобуквенного кода указывает, как часто данная аминокислота встречается в этой позиции. Зеленый = полярные, фиолетовый = нейтральные, синий = основные, красный = кислые и черный = гидрофобные аминокислоты. Рисунок 1a, b разработан и создан Эдуардом Урихом.
Мы ввели библиотеку фаговых пептидов двум крысам, использовавшим прибор CM (клады A и B), и выделили фаги из спинномозговой жидкости и крови (рис. 1d). Начальное быстрое выведение библиотеки было менее выраженным по сравнению с фагом дикого типа. Средний период полураспада введенной библиотеки у обоих животных составил 24,8 минуты в крови, что аналогично фагу дикого типа, и 38,5 минуты в спинномозговой жидкости. Образцы фагов из крови и спинномозговой жидкости каждого животного были подвергнуты высокопроизводительному скринингу (ВПС), и все идентифицированные пептиды были проанализированы на наличие короткого трипептидного мотива. Трипептидные мотивы были выбраны потому, что они обеспечивают минимальную основу для формирования структуры и взаимодействия пептид-белок14,15. Мы обнаружили хорошую корреляцию в распределении мотивов между введенной библиотекой фагов и клонами, выделенными из крови обоих животных (рис. 1e). Данные указывают на то, что состав библиотеки лишь незначительно обогащен в кровяном компартменте. Частоты аминокислот и консенсусные последовательности были дополнительно проанализированы в каждой позиции с использованием адаптированной версии программного обеспечения Weblogo16. Интересно, что мы обнаружили сильное обогащение остатками глицина в крови (рис. 1g). При сравнении крови с клонами, отобранными из спинномозговой жидкости, наблюдался сильный отбор и некоторый деселект мотивов (рис. 1f), а определенные аминокислоты преимущественно присутствовали в предопределенных позициях в 12-членном пептиде (рис. 1h). Примечательно, что отдельные животные значительно различались по составу спинномозговой жидкости, тогда как обогащение глицином в крови наблюдалось у обоих животных (дополнительные рис. 4a–j). После строгой фильтрации данных последовательности в спинномозговой жидкости животных № 1.1 и № 1.2 было получено в общей сложности 964 и 420 уникальных 12-мерных пептидов (дополнительные рис. 1d–e). Изолированные фаговые клоны были амплифицированы и подвергнуты второму раунду селекции in vivo. Фаги, выделенные во втором раунде селекции, были подвергнуты высокопроизводительному скринингу (ВПС) у каждого животного, и все идентифицированные пептиды были использованы в качестве входных данных для программы распознавания мотивов для анализа встречаемости трипептидных мотивов (рис. 2a, b, ef). По сравнению с первым циклом фагов, выделенных из спинномозговой жидкости (СМЖ), мы наблюдали дальнейшую селекцию и деселекцию многих мотивов в СМЖ в ветвях A и B (рис. 2). Был применен алгоритм идентификации сети для определения того, представляют ли они различные паттерны согласованной последовательности. Было обнаружено явное сходство между 12-мерными последовательностями, выделенными из СМЖ в альтернативной кладе A (рис. 2c, d) и кладе B (рис. 2g, h). Сводный анализ в каждой ветви выявил различные профили отбора для 12-мерных пептидов (дополнительный рис. 5c,d) и увеличение соотношения титра в спинномозговой жидкости и крови с течением времени для объединенных клонов после второго раунда отбора по сравнению с первым раундом отбора (дополнительный рис. 5e).
Обогащение мотивов и пептидов в спинномозговой жидкости путем двух последовательных раундов функционального отбора с помощью фагового дисплея in vivo.
Все фаги спинномозговой жидкости, выделенные из первого раунда каждого животного (животные № 1.1 и № 1.2), были объединены, амплифицированы, секвенированы методом HT и повторно введены вместе (2 x 10¹⁰ фагов/животное) двум крысам с канюлированными SM (№ 1.1 → № 2.1 и 2.2, 1.2 → 2.3 и 2.4). (a,b,e,f) Корреляционные диаграммы рассеяния, сравнивающие относительную частоту трипептидных мотивов всех фагов, полученных из спинномозговой жидкости, в первом и втором раундах отбора. Относительная частота и распределение мотивов, представляющих все возможные перекрывающиеся трипептиды, обнаруженные в пептидах в обеих ориентациях. Показано количество мотивов, обнаруженных в 1000 прочтений. Мотивы, которые были значительно (p < 0.001) отобраны или исключены в одной из сравниваемых библиотек, выделены красными точками. (c, d, g, h) Последовательность-логотип, представляющая все богатые CSF 12-аминокислотные последовательности, полученные в ходе 2-го и 1-го раундов отбора in vivo. Размер однобуквенного кода указывает, как часто эта аминокислота встречается в данной позиции. Для представления логотипа сравнивается частота последовательностей CSF, извлеченных из отдельных животных между двумя раундами отбора, и показаны обогащенные последовательности во втором раунде: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 и (h) #1.2–#2.4. Наиболее обогащенные аминокислоты в данной позиции у (c, d) животных № 2.1 и № 2.2 или (g, h) у животных № 2.3 и № 2.4 показаны цветом. Зеленый = полярные, фиолетовый = нейтральные, синий = основные, красный = кислые и черный = гидрофобные аминокислоты.
После третьего раунда отбора мы идентифицировали 124 уникальные пептидные последовательности (#3.1 и #3.2) из ​​332 клонов фагов, реконструированных из спинномозговой жидкости и выделенных от двух животных (дополнительный рис. 6a). Последовательность LGSVS (18,7%) имела наибольшую относительную долю, за ней следовали вставки дикого типа PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) и SARGSWREIVSLS (2,2%). В заключительном четвертом раунде мы объединили две независимо отобранные ветви от трех разных животных (рис. 1c). Из 925 секвенированных клонов фагов, выделенных из спинномозговой жидкости, в четвертом раунде мы обнаружили 64 уникальные пептидные последовательности (дополнительный рис. 6b), среди которых относительная доля фагов дикого типа снизилась до 0,8%. Наиболее распространенными клонами CSF в четвертом раунде были LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) и RLSSVDSDLSGC (3,2%). Диапазон длин выбранных пептидов обусловлен вставками/удалениями нуклеотидов или преждевременными стоп-кодонами в праймерах библиотеки при использовании вырожденных кодонов для разработки библиотеки NNK. Преждевременные стоп-кодоны генерируют более короткие пептиды и выбираются, поскольку содержат благоприятный аминокислотный мотив. Более длинные пептиды могут быть результатом вставок/удалений в праймерах синтетических библиотек. Это позиционирует разработанный стоп-кодон вне рамки считывания и считывает его до тех пор, пока ниже по течению не появится новый стоп-кодон. В целом, мы рассчитывали коэффициенты обогащения для всех четырех раундов отбора, сравнивая входные данные с выходными данными образцов. Для первого раунда скрининга мы использовали титры фагов дикого типа в качестве неспецифического фонового эталона. Интересно, что отрицательная селекция фагов была очень сильной в первом цикле отбора в ликворе, но не в крови (рис. 3а), что может быть связано с низкой вероятностью пассивной диффузии большинства членов пептидной библиотеки в ликвор или с тем, что фаги, как правило, более эффективно удерживаются или удаляются из кровотока, чем бактериофаги. Однако во втором раунде отбора наблюдалась сильная селекция фагов в ликворе в обеих кладах, что предполагает, что предыдущий раунд был обогащен фагами, демонстрирующими пептиды, способствующие поглощению ликвора (рис. 3а). Опять же, без значительного обогащения в крови. Также в третьем и четвертом раундах клоны фагов были значительно обогащены в ликворе. Сравнивая относительную частоту каждой уникальной последовательности пептидов между двумя последними раундами отбора, мы обнаружили, что последовательности были еще более обогащены в четвертом раунде отбора (рис. 3б). В общей сложности из всех 64 уникальных пептидных последовательностей было извлечено 931 трипептидный мотив с использованием обеих ориентаций пептидов. Наиболее обогащенные мотивы в четвертом раунде были более подробно изучены на предмет их профилей обогащения во всех раундах по сравнению с введенной библиотекой (пороговое значение: 10% обогащения) (дополнительный рис. 6c). Общие закономерности отбора показали, что большинство изученных мотивов были обогащены во всех предыдущих раундах обеих ветвей отбора. Однако некоторые мотивы (например, SGL, VSG, LGS GSV) преимущественно принадлежали к альтернативной кладе A, в то время как другие (например, FGW, RTN, WGF, NTR) были обогащены в альтернативной кладе B.
Проверка транспорта обогащенных в спинномозговой жидкости пептидов, экспрессируемых фагами, и биотинилированных лидерных пептидов, конъюгированных со стрептавидином, в спинномозговую жидкость.
(a) Коэффициенты обогащения, рассчитанные во всех четырех раундах (R1-R4) на основе введенных (вход = I) титров фагов (PFU) и определенных титров фагов в спинномозговой жидкости (выход = O). Коэффициенты обогащения для последних трех раундов (R2-R4) были рассчитаны путем сравнения с предыдущим раундом и первым раундом (R1) с данными о весе. Открытые столбцы — спинномозговая жидкость, затененные столбцы — плазма. (***p<0,001, на основе t-критерия Стьюдента). (b) Список наиболее распространенных фаговых пептидов, ранжированных в соответствии с их относительной долей ко всем фагам, собранным в спинномозговой жидкости после 4-го раунда селекции. Шесть наиболее распространенных фаговых клонов выделены цветом, пронумерованы и указаны их коэффициенты обогащения между 3-м и 4-м раундами селекции (вставки). (c,d) Шесть наиболее обогащенных фаговых клонов, пустые фаговые и родительские фаговые пептидные библиотеки из 4-го раунда были проанализированы по отдельности в модели отбора проб спинномозговой жидкости (СМЖ). Образцы СМЖ и крови были собраны в указанные моменты времени. (c) Равные количества 6 кандидатных фаговых клонов (2 x 10¹⁰ фагов/животное), пустых фагов (#1779) (2 x 10¹⁰ фагов/животное) и исходных фаговых пептидных библиотек (2 x 10¹² фагов/животное) были введены животному с канюлей отдельно через хвостовую вену. Показана фармакокинетика СМЖ каждого введенного фагового клона и фаговой пептидной библиотеки с течением времени. (d) показывает среднее соотношение СМЖ/кровь для всех обнаруженных фагов/мл за время отбора проб. (e) Четыре синтетических лидерных пептида и один контрольный пептид с измененной последовательностью были связаны биотином со стрептавидином через их N-конец (тетрамерный дисплей), после чего проводилась инъекция (внутривенно в хвостовую вену, 10 мг стрептавидина/кг). Не менее трех интубированных крыс (N = 3). Образцы спинномозговой жидкости (СМЖ) собирали в указанные моменты времени, и концентрацию стрептавидина измеряли методом ИФА с антистрептавидином в СМЖ (nd = не обнаружено). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, на основе теста ANOVA). (f) Сравнение аминокислотной последовательности наиболее обогащенного клона фагового пептида № 2002 (фиолетовый) с другими отобранными клонами фаговых пептидов из 4-го раунда отбора. Идентичные и сходные аминокислотные фрагменты обозначены цветом.
Из всех обогащенных фагов в четвертом раунде (рис. 3b) шесть клонов-кандидатов были отобраны для дальнейшего индивидуального анализа в модели отбора проб ликвора. Равные количества шести библиотек фагов-кандидатов, пустых фагов (без вставки) и пептидов профагов были введены трем животным с канюлированными миелоидными лейкемиями, и была определена фармакокинетика в ликворе (рис. 3c) и крови (дополнительный рис. 7). Все протестированные клоны фагов нацеливались на ликвор на уровне в 10-1000 раз выше, чем у пустого контрольного фага (#1779). Например, клоны #2020 и #2077 имели примерно в 1000 раз более высокие титры в ликворе, чем контрольный фаг. Фармакокинетический профиль каждого выбранного пептида различен, но все они обладают высокой способностью к направленному воздействию на ликвор. Мы наблюдали постоянное снижение концентрации с течением времени для клонов № 1903 и № 2011, в то время как для клонов № 2077, № 2002 и № 2009 увеличение в течение первых 10 минут может указывать на активный транспорт, но требует подтверждения. Концентрации клонов № 2020, № 2002 и № 2077 стабилизировались на высоком уровне, в то время как концентрация клона № 2009 в спинномозговой жидкости медленно снижалась после первоначального увеличения. Затем мы сравнили относительную частоту каждого кандидата в спинномозговой жидкости с его концентрацией в крови (рис. 3d). Корреляция среднего титра каждого кандидата в спинномозговой жидкости с его титром в крови во все моменты времени отбора проб показала, что три из шести кандидатов были значительно обогащены в спинномозговой жидкости крови. Интересно, что клон № 2077 показал более высокую стабильность в крови (дополнительный рисунок 7). Чтобы подтвердить способность самих пептидов активно транспортировать в спинномозговую жидкость груз, отличный от фаговых частиц, мы синтезировали четыре лидерных пептида, модифицированных биотином на N-конце, где пептиды присоединяются к фаговой частице. Биотинилированные пептиды (№№ 2002, 2009, 2020 и 2077) были конъюгированы со стрептавидином (SA) для получения мультимерных форм, в некоторой степени имитирующих геометрию фага. Этот формат также позволил нам измерить экспозицию SA в крови и спинномозговой жидкости в качестве белковых пептидов, транспортирующих груз. Важно отметить, что данные по фагам часто воспроизводились при введении синтетических пептидов в этом формате, конъюгированном с SA (рис. 3e). Перемешанные пептиды имели меньшую начальную экспозицию и более быстрое выведение из спинномозговой жидкости с неопределяемым уровнем в течение 48 часов. Для получения представления о путях доставки этих пептидных фаговых клонов в пространство спинномозговой жидкости мы проанализировали локализацию отдельных фаговых пептидов с помощью иммуногистохимии (ИГХ) для непосредственного обнаружения фаговых частиц через 1 час после внутривенного введения in vivo. Примечательно, что клоны № 2002, № 2077 и № 2009 были обнаружены по интенсивному окрашиванию в капиллярах головного мозга, в то время как контрольный фаг (№ 1779) и клон № 2020 не были обнаружены (дополнительный рисунок 8). Это предполагает, что эти пептиды способствуют воздействию на мозг именно за счет пересечения гематоэнцефалического барьера. Для проверки этой гипотезы необходим дальнейший подробный анализ, поскольку может быть задействован и путь BSCFB. При сравнении аминокислотной последовательности наиболее обогащенного клона (№ 2002) с другими выбранными пептидами было отмечено, что некоторые из них имеют схожие аминокислотные расширения, что может указывать на схожий механизм транспорта (рис. 3f).
Благодаря уникальному профилю плазмы и значительному увеличению уровня ликвора с течением времени, клон фагового дисплея #2077 был дополнительно исследован в течение более длительного 48-часового периода и смог воспроизвести быстрое увеличение уровня ликвора, наблюдаемое в связи с устойчивым уровнем SA (рис. 4a). Что касается других идентифицированных клонов фагов, #2077 сильно окрашивал капилляры головного мозга и демонстрировал значительную колокализацию с лектином-маркером капилляров при просмотре с более высоким разрешением, а также, возможно, некоторое окрашивание в паренхимальном пространстве (рис. 4b). Чтобы исследовать, можно ли получить опосредованные пептидами фармакологические эффекты в ЦНС, мы провели эксперимент, в котором биотинилированные версии i) транзитного пептида #2077 и ii) пептида-ингибитора BACE1 смешивали с SA в двух разных соотношениях. Для одной комбинации мы использовали только пептид-ингибитор BACE1, а для другой — соотношение 1:3 пептида-ингибитора BACE1 к пептиду #2077. Оба образца вводились внутривенно, и уровни бета-амилоидного пептида 40 (Aβ40) в крови и спинномозговой жидкости измерялись с течением времени. Уровень Aβ40 измерялся в спинномозговой жидкости, поскольку он отражает ингибирование BACE1 в паренхиме головного мозга. Как и ожидалось, оба комплекса значительно снижали уровни Aβ40 в крови (рис. 4c, d). Однако только образцы, содержащие смесь пептида № 2077 и ингибитора пептида BACE1, конъюгированного с SA, вызывали значительное снижение уровня Aβ40 в спинномозговой жидкости (рис. 4c). Данные показывают, что пептид № 2077 способен транспортировать белок SA с молекулярной массой 60 кДа в ЦНС, а также вызывает фармакологические эффекты с конъюгированными с SA ингибиторами пептида BACE1.
(a) Клональная инъекция (2 × 10 фагов/животное) фага Т7, демонстрирующая долгосрочные фармакокинетические профили пептида CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) и неинъецированного контрольного фага (#1779) как минимум у трех крыс, интубированных КТ. (b) Конфокальное микроскопическое изображение репрезентативных кортикальных микрососудов у крыс, которым был введен фаг (2 × 10 10 фагов/животное), демонстрирующее контрастное окрашивание пептида #2077 и сосудов (лектин). Эти клоны фагов были введены 3 крысам и циркулировали в течение 1 часа перед перфузией. Мозг был разрезан и окрашен поликлональными FITC-мечеными антителами против капсида фага Т7. За десять минут до перфузии и последующей фиксации внутривенно вводили лектин, меченный DyLight594. Флуоресцентные изображения, показывающие окрашивание лектином (красный) просветной стороны микрососудов и фагов (зеленый) в просвете капилляров и периваскулярной ткани головного мозга. Масштабная линейка соответствует 10 мкм. (c, d) Биотинилированный ингибиторный пептид BACE1 отдельно или в комбинации с биотинилированным транзитным пептидом № 2077 был связан со стрептавидином с последующей внутривенной инъекцией не менее чем трем канюлированным крысам CM (10 мг стрептавидина/кг). Снижение уровня Aβ40, опосредованное пептидным ингибитором BACE1, измерялось методом ИФА Aβ1-40 в крови (красный) и спинномозговой жидкости (оранжевый) в указанные моменты времени. Для большей наглядности на графике проведена пунктирная линия в масштабе 100%. (c) Процентное снижение уровня Aβ40 в крови (красные треугольники) и спинномозговой жидкости (оранжевые треугольники) у крыс, получавших стрептавидин, конъюгированный с транзитным пептидом № 2077 и ингибиторным пептидом BACE1 в соотношении 3:1. (d) Процентное снижение уровня Aβ40 в крови (красные кружки) и спинномозговой жидкости (оранжевые кружки) у крыс, получавших только стрептавидин, связанный с ингибиторным пептидом BACE1. Концентрация Aβ в контрольной группе составляла 420 пг/мл (стандартное отклонение = 101 пг/мл).
Фаговый дисплей успешно применяется в нескольких областях биомедицинских исследований17. Этот метод использовался для исследований разнообразия сосудов in vivo18,19, а также для исследований, направленных на церебральные сосуды20,21,22,23,24,25,26. В данном исследовании мы расширили применение этого метода селекции не только для прямой идентификации пептидов, нацеленных на церебральные сосуды, но и для обнаружения кандидатов со свойствами активного транспорта, позволяющими пересекать гематоэнцефалический барьер. В данной работе мы описываем разработку процедуры селекции in vivo на крысах с интубацией церебральной макулярной сети и демонстрируем ее потенциал для идентификации пептидов со свойствами направленного транспорта в спинномозговую жидкость. Используя фаг Т7, отображающий библиотеку случайных 12-мерных пептидов, мы смогли продемонстрировать, что фаг Т7 достаточно мал (приблизительно 60 нм в диаметре)10, чтобы адаптироваться к гематоэнцефалическому барьеру, тем самым напрямую пересекая гематоэнцефалический барьер или сосудистое сплетение. Мы обнаружили, что забор спинномозговой жидкости (СМЖ) у крыс с канюлированной миелоидной лейкемией является хорошо контролируемым методом функционального скрининга in vivo, и что выделенные фаги не только связываются с сосудистой системой, но и функционируют как переносчики через гематоэнцефалический барьер. Более того, одновременно собирая кровь и применяя высокопроизводительный скрининг (ВПС) к фагам, полученным из СМЖ и крови, мы подтвердили, что наш выбор СМЖ не зависел от обогащения кровью или пригодности к размножению между раундами селекции. Однако кровяное компартмент является частью процедуры селекции, поскольку фаги, способные достичь компартмента СМЖ, должны выживать и циркулировать в кровотоке достаточно долго, чтобы обогатиться в головном мозге. Для извлечения достоверной информации о последовательности из необработанных данных ВПС мы внедрили в рабочий процесс анализа фильтры, адаптированные к специфическим для платформы ошибкам секвенирования. Включив кинетические параметры в метод скрининга, мы подтвердили быструю фармакокинетику фагов дикого типа Т7 (t½ ~ 28 мин) в крови24, 27, 28, а также определили их период полураспада в спинномозговой жидкости (t½ ~ 26 мин в минуту). Несмотря на схожие фармакокинетические профили в крови и спинномозговой жидкости, в спинномозговой жидкости было обнаружено лишь 0,001% концентрации фага в крови, что указывает на низкую фоновую подвижность фага дикого типа Т7 через гематоэнцефалический барьер. Эта работа подчеркивает важность первого раунда селекции при использовании стратегий скрининга in vivo, особенно для фаговых систем, которые быстро выводятся из кровообращения, поскольку лишь немногие клоны способны достичь ЦНС. Таким образом, на первом раунде снижение разнообразия библиотеки было очень значительным, поскольку в этой очень строгой модели спинномозговой жидкости в конечном итоге было собрано лишь ограниченное количество клонов. Эта стратегия отбора in vivo включала несколько этапов селекции, таких как активное накопление в спинномозговой жидкости, выживание клонов в крови и быстрое удаление клонов фага Т7 из крови в течение первых 10 минут (рис. 1d и дополнительный рис. 4M). Таким образом, после первого раунда в спинномозговой жидкости были идентифицированы различные клоны фага, хотя для отдельных животных использовался один и тот же исходный пул. Это говорит о том, что многократные строгие этапы селекции исходных библиотек с большим количеством членов библиотеки приводят к значительному снижению разнообразия. Следовательно, случайные события станут неотъемлемой частью процесса первоначальной селекции, существенно влияя на результат. Вероятно, многие клоны в исходной библиотеке имели очень схожую склонность к обогащению в спинномозговой жидкости. Однако даже при одинаковых экспериментальных условиях результаты селекции могут различаться из-за небольшого количества каждого конкретного клона в исходном пуле.
Мотивы, обогащенные в спинномозговой жидкости, отличаются от мотивов в крови. Интересно, что мы отметили первый сдвиг в сторону пептидов, богатых глицином, в крови отдельных животных (рис. 1g, дополнительные рис. 4e, 4f). Фаги, содержащие пептиды глицина, могут быть более стабильными и менее склонными к выведению из кровообращения. Однако эти пептиды, богатые глицином, не были обнаружены в образцах спинномозговой жидкости, что предполагает, что отобранные библиотеки прошли два разных этапа селекции: один в крови, а другой – путем накопления в спинномозговой жидкости. Обогащенные в спинномозговой жидкости клоны, полученные в результате четвертого раунда селекции, были тщательно протестированы. Почти все индивидуально протестированные клоны подтвердили свое обогащение в спинномозговой жидкости по сравнению с контрольным фагом. Один пептидный фрагмент (#2077) был исследован более подробно. Он продемонстрировал более длительный период полураспада в плазме по сравнению с другими обнаруженными соединениями (рисунок 3d и дополнительный рисунок 7), и, что интересно, этот пептид содержал остаток цистеина на С-конце. Недавно было показано, что добавление цистеина к пептидам может улучшить их фармакокинетические свойства за счет связывания с альбумином 29. В настоящее время это неизвестно для пептида № 2077 и требует дальнейшего изучения. Некоторые пептиды показали зависимость от валентности при обогащении спинномозговой жидкости (данные не показаны), что может быть связано с отображаемой геометрией поверхности капсида Т7. Используемая нами система Т7 показала 5-15 копий каждого пептида на фаговую частицу. Иммуногистохимическое исследование было проведено на клонах потенциальных фагов, введенных внутривенно в кору головного мозга крыс (дополнительный рисунок 8). Полученные данные показали, что по меньшей мере три клона (№ 2002, № 2009 и № 2077) взаимодействовали с ГЭБ. Остается определить, приводит ли это взаимодействие с ГЭБ к накоплению спинномозговой жидкости или к перемещению этих клонов непосредственно в гематоэнцефалический барьер. Важно отметить, что мы показали, что выбранные пептиды сохраняют свою способность к транспорту спинномозговой жидкости после синтеза и связывания с белковым грузом. Связывание N-концевых биотинилированных пептидов с SA по существу повторяет результаты, полученные с соответствующими фаговыми клонами в крови и спинномозговой жидкости (рис. 3e). Наконец, мы показали, что ведущий пептид № 2077 способен усиливать действие биотинилированного пептидного ингибитора BACE1, конъюгированного с SA, в головном мозге, вызывая выраженные фармакодинамические эффекты в ЦНС за счет значительного снижения уровня Abeta40 в спинномозговой жидкости (рис. 4). Нам не удалось идентифицировать какие-либо гомологи в базе данных путем поиска гомологии последовательностей пептидов по всем совпадениям. Важно отметить, что размер библиотеки T7 составляет приблизительно 10⁹, тогда как теоретический размер библиотеки для 12-меров равен 4 х 10¹⁵. Поэтому мы выбрали лишь небольшую часть пространства разнообразия библиотеки 12-мерных пептидов, что может означать, что более оптимизированные пептиды могут быть идентифицированы путем оценки смежного пространства последовательностей этих идентифицированных совпадений. Гипотетически, одной из причин, по которой мы не обнаружили никаких природных гомологов этих пептидов, может быть деселекция в процессе эволюции, предотвращающая неконтролируемое проникновение определенных пептидных мотивов в мозг.
В совокупности наши результаты обеспечивают основу для дальнейшей работы по более детальному выявлению и характеристике транспортных систем цереброваскулярного барьера in vivo. Базовая схема этого метода основана на стратегии функционального отбора, которая не только идентифицирует клоны со свойствами связывания с церебральными сосудами, но и включает в себя критически важный этап, на котором успешные клоны обладают внутренней активностью для преодоления биологических барьеров in vivo в ЦНС. Цель состоит в том, чтобы выяснить механизм транспорта этих пептидов и их предпочтительное связывание с микрососудами, специфичными для области мозга. Это может привести к открытию новых путей транспорта через ГЭБ и рецепторы. Мы ожидаем, что идентифицированные пептиды могут напрямую связываться с цереброваскулярными рецепторами или с циркулирующими лигандами, транспортируемыми через ГЭБ или гематоэнцефалический барьер. Обнаруженные в этой работе пептидные векторы с транспортной активностью в спинномозговой жидкости будут дополнительно исследованы. В настоящее время мы изучаем специфичность этих пептидов для мозга в отношении их способности преодолевать ГЭБ и/или гематоэнцефалический барьер. Эти новые пептиды станут чрезвычайно ценными инструментами для потенциального открытия новых рецепторов или сигнальных путей, а также для разработки новых высокоэффективных платформ для доставки макромолекул, таких как биопрепараты, в мозг.
Для канюлирования большой цистерны (БЦ) использовали модифицированный ранее описанный метод. Анестезированных крыс Вистар (200-350 г) устанавливали на стереотаксический аппарат, после чего на выбритой и асептически обработанной коже головы делали срединный разрез для обнажения черепа. В области верхней части черепа сверлили два отверстия и вставляли в них фиксирующие винты. Дополнительное отверстие сверлили в латеральном затылочном гребне для стереотаксического введения канюли из нержавеющей стали в БЦ. Вокруг канюли наносили стоматологический цемент и фиксировали винтами. После фотополимеризации и затвердевания цемента кожную рану закрывали швом 4/0. Правильность установки канюли подтверждали спонтанной утечкой спинномозговой жидкости (СМЖ). Извлечь крысу из стереотаксического аппарата, обеспечить ей надлежащий послеоперационный уход и обезболивание, а также дать ей восстановиться в течение как минимум одной недели, пока в спинномозговой жидкости не появятся признаки крови. Крысы породы Вистар (Crl:WI/Han) были получены от компании Charles River (Франция). Все крысы содержались в условиях, свободных от специфических патогенов. Все эксперименты на животных были одобрены Ветеринарным управлением города Базеля, Швейцария, и проводились в соответствии с лицензией на использование животных № 2474 (Оценка активного транспорта в головном мозге путем измерения уровней терапевтических кандидатов в спинномозговой жидкости и головном мозге крысы).
Осторожно удерживайте крысу в сознании, держа в руке канюлю для церебральной микрофлоры. Извлеките дурман из канюли и соберите 10 мкл спонтанно текущей спинномозговой жидкости. Поскольку проходимость канюли в конечном итоге была нарушена, в это исследование были включены только прозрачные образцы спинномозговой жидкости без признаков загрязнения кровью или изменения цвета. Параллельно, примерно 10–20 мкл крови брали через небольшой разрез на кончике хвоста в пробирки с гепарином (Sigma-Aldrich). Спинномозговую жидкость и кровь собирали в различные моменты времени после внутривенного введения фага Т7. Примерно 5–10 мкл жидкости удаляли перед сбором каждого образца спинномозговой жидкости, что соответствует мертвому объему катетера.
Библиотеки были созданы с использованием вектора T7Select 10-3b, как описано в руководстве по системе T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Вкратце, случайная 12-мерная ДНК-вставка была синтезирована в следующем формате:
Кодон NNK использовался для предотвращения образования двойных стоп-кодонов и избыточной экспрессии аминокислот во вставке. N — это эквимолярное соотношение каждого нуклеотида, смешанного вручную, а K — эквимолярное соотношение нуклеотидов аденина и цитозина, смешанных вручную. Одноцепочечные участки были преобразованы в двухцепочечную ДНК путем дополнительной инкубации с dNTP (Novagen) и ферментом Кленова (New England Biolabs) в буфере Кленова (New England Biolabs) в течение 3 часов при 37°C. После реакции двухцепочечная ДНК была выделена путем осаждения этанолом. Полученная ДНК была расщеплена рестрикционными ферментами EcoRI и HindIII (оба от Roche). Расщепленная и очищенная (QIAquick, Qiagen) вставка (лигаза T4, New England Biolabs) затем была лигирована в рамке считывания в предварительно расщепленный вектор T7 после аминокислоты 348 гена капсида 10B. Реакции лигирования инкубировали при 16°C в течение 18 часов перед упаковкой in vitro. Упаковку фагов in vitro проводили в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору для клонирования T7Select 10-3b (Novagen), а упаковочный раствор однократно амплифицировали до лизиса с использованием Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Лизаты центрифугировали, титровали и замораживали при -80°C в виде исходного раствора глицерина.
Прямая ПЦР-амплификация вариабельных регионов фага, амплифицированных в бульоне или на планшете, с использованием запатентованных гибридных праймеров 454/Roche-amplicon. Прямой гибридный праймер содержит последовательности, фланкирующие вариабельный регион (NNK) 12 (специфичный для матрицы), адаптер GS FLX Titanium A и четырехнуклеотидную ключевую последовательность библиотеки (TCAG) (дополнительный рисунок 1a):
Обратный праймер для слияния также содержит биотин, прикрепленный к захватывающим шарикам, и титановый адаптер GS FLX B, необходимый для клональной амплификации во время эмульсионной ПЦР:
Затем ампликоны подвергали пиросеквенированию на приборе 454/Roche в соответствии с протоколом 454 GS-FLX Titanium. Для ручного секвенирования по Сэнгеру (анализатор ДНК Applied Biosystems Hitachi 3730 xl) ДНК фага Т7 амплифицировали методом ПЦР и секвенировали с использованием следующих пар праймеров:
Вставки из отдельных бляшек подвергали ПЦР-амплификации с использованием набора Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (в соответствии с инструкциями производителя). Проводили горячий старт (10 мин при 95 °C) и 35 циклов усиления (50 с при 95 °C, 1 мин при 50 °C и 1 мин при 72 °C).
Фаги из библиотек, фаги дикого типа, фаги, выделенные из спинномозговой жидкости и крови, или отдельные клоны амплифицировали в Escherichia coli BL5615 в бульоне TB (Sigma Aldrich) или в чашках Петри объемом 500 см² (Thermo Scientific) в течение 4 часов при 37°C. Фаги экстрагировали из чашек путем промывания их буфером Tris-EDTA (Fluka Analytical) или путем сбора бляшек стерильными наконечниками пипеток. Фаги выделяли из культуральной жидкости или экстракционного буфера с помощью однократного осаждения полиэтиленгликолем (PEG 8000) (Promega) и ресуспендировали в буфере Tris-EDTA.
Амплифицированный фаг подвергали 2-3 раундам удаления эндотоксина с использованием гранул для удаления эндотоксина (Miltenyi Biotec) перед внутривенным (ВВ) введением (500 мкл/животное). В первом раунде вводили 2×10¹² фагов; во втором — 2×10¹⁰ фагов; в третьем и четвертом раундах селекции — 2×10⁹ фагов на животное. Содержание фагов в образцах спинномозговой жидкости и крови, собранных в указанные моменты времени, определяли методом подсчета бляшек в соответствии с инструкциями производителя (руководство по системе T7Select). Селекцию фагов проводили путем внутривенного введения очищенных библиотек в хвостовую вену или путем повторного введения фагов, выделенных из спинномозговой жидкости из предыдущего раунда селекции, а последующие сборы проводили через 10 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 180 мин и 240 мин соответственно в образцах спинномозговой жидкости и крови. В общей сложности было проведено четыре раунда отбора in vivo, в ходе которых две выбранные ветви хранились и анализировались отдельно в течение первых трех раундов отбора. Все фаговые вставки, выделенные из спинномозговой жидкости (СМЖ) из первых двух раундов отбора, были подвергнуты пиросеквенированию 454/Roche, в то время как все клоны, выделенные из СМЖ из последних двух раундов отбора, были секвенированы вручную. Все фаги крови из первого раунда отбора также были подвергнуты пиросеквенированию 454/Roche. Для инъекции фаговых клонов отобранные фаги амплифицировали в E. coli (BL5615) на чашках Петри площадью 500 см2 при 37°C в течение 4 часов. Индивидуально отобранные и секвенированные вручную клоны размножали в среде TB. После экстракции фагов, очистки и удаления эндотоксина (как описано выше) 2×10¹⁰ фагов/животное в 300 мкл вводили внутривенно в одну хвостовую вену.
Предварительная обработка и качественная фильтрация данных последовательности. Исходные данные 454/Roche были преобразованы из бинарного стандартного формата карты потока (sff) в удобочитаемый формат Пирсона (fasta) с использованием программного обеспечения поставщика. Дальнейшая обработка нуклеотидной последовательности проводилась с использованием собственных программ и скриптов на языке C (неопубликованный программный пакет), как описано ниже. Анализ первичных данных включает строгие многоступенчатые процедуры фильтрации. Для отфильтровывания прочтений, не содержащих допустимую 12-мерную вставку ДНК, прочтения последовательно выравнивались по начальной метке (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), конечной метке (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) и фоновой вставке (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) с использованием глобального теста Нидлмана-Вунша. Выравнивание допускало до 2 несоответствий на одно выравнивание31. Таким образом, из библиотеки были удалены последовательности без стартовых и стоп-тегов, а также последовательности, содержащие фоновые вставки, то есть выравнивания, превышающие допустимое количество несовпадений. Что касается оставшихся последовательностей, то из исходной последовательности последовательности была вырезана N-мерная ДНК-последовательность, простирающаяся от стартовой метки и заканчивающаяся перед стоп-меткой, и подвергнута дальнейшей обработке (далее именуемая «вставка»). После трансляции вставки из нее удаляется участок после первого стоп-кодона на 5'-конце праймера. Кроме того, были удалены нуклеотиды, приводящие к неполным кодонам на 3'-конце праймера. Для исключения вставок, содержащих только фоновые последовательности, были также удалены транслированные вставки, начинающиеся с аминокислотного паттерна «PAG». Из библиотеки были удалены пептиды с посттрансляционной длиной менее 3 аминокислот. Наконец, была устранена избыточность в пуле вставок и определена частота каждой уникальной вставки. Результаты этого анализа включали список нуклеотидных последовательностей (вставок) и частоту их (чтений) (дополнительные рисунки 1c и 2).
Группировка N-мерных ДНК-вставок по сходству последовательностей: Для исключения ошибок секвенирования, специфичных для 454/Roche (таких как проблемы с секвенированием гомополимерных расширений), и удаления менее важных избыточностей, ранее отфильтрованные N-мерные ДНК-вставки (вставки) сортируются по сходству. Вставки (допускается до 2 несовпадающих оснований) сортируются с использованием итеративного алгоритма, определенного следующим образом: вставки сначала сортируются по их частоте (от наибольшей к наименьшей), а если они одинаковы, то по их вторичной сортировке по длине (от самой длинной к самой короткой). Таким образом, наиболее часто встречающиеся и самые длинные вставки определяют первую «группу». Частота группы устанавливается равной частоте ключа. Затем каждая оставшаяся в отсортированном списке вставка пытается быть добавлена ​​в группу путем попарного выравнивания Нидлмана-Вунша. Если количество несовпадений, вставок или удалений в выравнивании не превышает пороговое значение 2, вставка добавляется в группу, а общая частота группы увеличивается на то, как часто была добавлена ​​вставка. Вставки, добавленные в группу, помечаются как использованные и исключаются из дальнейшей обработки. Если последовательность вставки не может быть добавлена ​​в уже существующую группу, она используется для создания новой группы с соответствующей частотой вставок и помечается как использованная. Итерация завершается, когда каждая последовательность вставки либо использована для формирования новой группы, либо может быть включена в уже существующую группу. В конце концов, сгруппированные вставки, состоящие из нуклеотидов, в конечном итоге транслируются в пептидные последовательности (пептидные библиотеки). Результатом этого анализа является набор вставок и соответствующих им частот, которые составляют количество последовательных прочтений (дополнительный рисунок 2).
Генерация мотивов: На основе списка уникальных пептидов была создана библиотека, содержащая все возможные аминокислотные последовательности (аа), как показано ниже. Каждая возможная последовательность длиной 3 была извлечена из пептида, и к ней была добавлена ​​его инверсная последовательность, а также общая библиотека мотивов, содержащая все последовательности (трипептиды). Библиотеки высокоповторяющихся мотивов были секвенированы, и избыточность была удалена. Затем для каждого трипептида в библиотеке мотивов мы проверяли его наличие в библиотеке с помощью вычислительных инструментов. В этом случае частота пептида, содержащего найденный трипептид мотива, добавляется и присваивается мотиву в библиотеке мотивов («количество мотивов»). Результатом генерации мотивов является двумерный массив, содержащий все вхождения трипептидов (мотивов) и их соответствующие значения, которые представляют собой количество прочтений секвенирования, приводящих к соответствующему мотиву после фильтрации, группировки и трансляции прочтений. Метрики описаны подробно выше.
Нормализация количества мотивов и соответствующие диаграммы рассеяния: количество мотивов для каждого образца было нормализовано с использованием
где ni — количество прочтений, содержащих тему i. Таким образом, vi представляет собой процентную частоту прочтений (или пептидов), содержащих мотив i в выборке. Значения p для ненормализованного числа мотивов были рассчитаны с использованием точного теста Фишера. Что касается коррелограмм числа мотивов, корреляции Спирмена были рассчитаны с использованием нормализованного числа мотивов с помощью R.
Для визуализации содержания аминокислот в каждой позиции в пептидной библиотеке были созданы веб-логограммы 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Сначала содержание аминокислот в каждой позиции 12-мерного пептида сохраняется в матрице 20×12. Затем генерируется набор из 1000 пептидов, содержащих одинаковое относительное содержание аминокислот в каждой позиции, в формате fasta-sequence и предоставляется в качестве входных данных для веб-логограммы 3, которая генерирует графическое представление относительного содержания аминокислот в каждой позиции для заданной пептидной библиотеки. Для визуализации многомерных наборов данных были созданы тепловые карты с использованием разработанного внутри компании инструмента в R (biosHeatmap, еще не выпущенный пакет R). Дендрограммы, представленные на тепловых картах, были рассчитаны с использованием метода иерархической кластеризации Уорда с евклидовой метрикой расстояния. Для статистического анализа данных оценки мотивов значения P для ненормализованных оценок рассчитывались с использованием точного теста Фишера. Значения P для других наборов данных рассчитывались в R с использованием t-критерия Стьюдента или дисперсионного анализа (ANOVA).
Выбранные клоны фагов и фаги без вставок вводили внутривенно через хвостовую вену (2×10¹⁰ фагов/животное в 300 мкл PBS). За десять минут до перфузии и последующей фиксации тем же животным внутривенно вводили 100 мкл лектина, меченного DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Через 60 минут после инъекции фагов крыс перфузировали через сердце 50 мл PBS, а затем 50 мл 4% PFA/PBS. Образцы мозга дополнительно фиксировали в течение ночи в 4% PFA/PBS и выдерживали в 30% растворе сахарозы в течение ночи при 4°C. Образцы быстро замораживали в смеси OCT. Иммуногистохимический анализ замороженных образцов проводили при комнатной температуре на криосрезах толщиной 30 мкм, блокированных 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) и инкубированных с поликлональными FITC-мечеными антителами против фага Т7 (Novus NB 600-376A) при 4 °C. Инкубацию проводили в течение ночи. Наконец, срезы трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и исследовали с помощью конфокального лазерного микроскопа (Leica TCS SP5).
Все пептиды с минимальной чистотой 98% были синтезированы компанией GenScript USA, биотинилированы и лиофилизированы. Биотин связан через дополнительный тройной глициновый спейсер на N-конце. Все пептиды проверены с помощью масс-спектрометрии.
Стрептавидин (Sigma S0677) смешивали с пятикратным эквимолярным избытком биотинилированного пептида, биотинилированного ингибиторного пептида BACE1 или комбинации (в соотношении 3:1) биотинилированного ингибиторного пептида BACE1 и ингибиторного пептида BACE1 в 5–10% ДМСО/инкубировали в фосфатно-солевом буфере (PBS). Выдержку проводили в течение 1 часа при комнатной температуре перед инъекцией. Конъюгированные со стрептавидином пептиды вводили внутривенно в дозе 10 мг/кг в одну из хвостовых вен крыс с мозговой полостью.
Концентрацию комплексов стрептавидин-пептид оценивали методом ИФА. Микротитровальные планшеты Nunc Maxisorp (Sigma) покрывали в течение ночи при 4°C 1,5 мкг/мл мышиными антителами против стрептавидина (Thermo, MA1-20011). После блокирования (блокирующий буфер: 140 нМ NaCl, 5 мМ EDTA, 0,05% NP40, 0,25% желатина, 1% BSA) при комнатной температуре в течение 2 часов, планшет промывали 0,05% раствором Tween-20/PBS (промывочный буфер) в течение 3 часов. Затем в лунки добавляли образцы спинномозговой жидкости и плазмы, разведенные блокирующим буфером (плазма 1:10 000, спинномозговая жидкость 1:115). Затем планшет инкубировали в течение ночи при 4°C с детектирующим антителом (1 мкг/мл, антистрептавидин-HRP, Novus NB120-7239). После трех этапов промывки стрептавидин детектировали путем инкубации в растворе субстрата TMB (Roche) в течение до 20 минут. После остановки развития окраски с помощью 1М H2SO4 измеряли поглощение при 450 нм.
Функцию комплекса стрептавидин-пептид-ингибитор BACE1 оценивали с помощью ИФА Aβ(1-40) в соответствии с протоколом производителя (Wako, 294-64701). Вкратце, образцы спинномозговой жидкости разбавляли стандартным разбавителем (1:23) и инкубировали в течение ночи при 4°C в 96-луночных планшетах, покрытых захватывающим антителом BNT77. После пяти этапов промывки добавляли конъюгированное с HRP антитело BA27 и инкубировали в течение 2 часов при 4°C, после чего проводили пять этапов промывки. Aβ(1–40) определяли путем инкубации в растворе TMB в течение 30 минут при комнатной температуре. После остановки развития окраски стоп-раствором измеряли абсорбцию при 450 нм. Образцы плазмы подвергали твердофазной экстракции перед ИФА Aβ(1–40). Плазму добавляли в 96-луночные планшеты с 0,2% DEA (Sigma) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. После последовательной промывки планшетов для твердофазной экстракции (SPE) (Oasis, 186000679) водой и 100% метанолом, образцы плазмы добавляли в планшеты SPE, и всю жидкость удаляли. Образцы промывали (сначала 5% метанолом, затем 30% метанолом) и элюировали 2% NH4OH/90% метанолом. После высушивания элюата при 55°C в течение 99 минут при постоянном токе N2 образцы восстанавливали в стандартных разбавителях, и Aβ(1–40) измеряли, как описано выше.
Как цитировать эту статью: Урих, Э. и др. Доставка груза в мозг с использованием транзитных пептидов, идентифицированных in vivo. The Science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Лихота Й., Скьорринге Т., Томсен Л.Б. и Моос Т. Доставка макромолекулярных препаратов в мозг с использованием таргетной терапии. Журнал нейрохимии 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Брасньевич, И., Штайнбуш, Х.В., Шмитц, К., и Мартинес-Мартинес, П. Доставка пептидных и белковых препаратов через гематоэнцефалический барьер. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардридж, У.М. Гематоэнцефалический барьер: узкое место в разработке лекарств для лечения заболеваний головного мозга. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Йохансон, К.Е., Дункан, Дж.А., Стопа, Э.Г. и Берд, А. Перспективы улучшения доставки и направленного воздействия лекарственных препаратов на головной мозг через сосудистое сплетение-ликворный путь. Фармацевтические исследования 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардридж, У.М. Модернизация биофармацевтических препаратов с помощью молекулярных троянских коней для доставки в мозг. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардридж, Транспорт пептидов через гематоэнцефалический барьер, опосредованный рецепторами белого вещества. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Нивонер, Дж. и др. Повышение проникновения в мозг и эффективности терапевтических антител с помощью моновалентных молекулярных челноков. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Бьен-Ли, Н. и др. Транспорт рецептора трансферрина (TfR) определяет поглощение мозгом аффинных вариантов антител к TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).