Asante kwa kutembelea Nature.com. Unatumia toleo la kivinjari lenye usaidizi mdogo wa CSS. Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Utangamano katika Internet Explorer). Zaidi ya hayo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tunaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Huonyesha mzunguko wa slaidi tatu kwa wakati mmoja. Tumia vitufe vya Iliyotangulia na Inayofuata ili kupitia slaidi tatu kwa wakati mmoja, au tumia vitufe vya kutelezesha mwishoni ili kupitia slaidi tatu kwa wakati mmoja.
Kizuizi cha damu-ubongo na kizuizi cha damu-ubongo huzuia mawakala wa tiba ya kibiolojia kufikia malengo yao katika mfumo mkuu wa neva, na hivyo kuzuia matibabu madhubuti ya magonjwa ya neva. Ili kugundua visafirishaji vipya vya ubongo katika mwili, tulianzisha maktaba ya peptidi ya phaji ya T7 na damu iliyokusanywa mfululizo na maji ya ubongo (CSF) kwa kutumia mfumo wa panya wenye fahamu kubwa. Kloni maalum za phaji zilitajirishwa sana katika CSF baada ya raundi nne za uteuzi. Upimaji wa peptidi husika za kibinafsi ulionyesha utajiri wa zaidi ya mara 1000 katika CSF. Shughuli ya kibiolojia ya uwasilishaji unaosababishwa na peptidi kwenye ubongo ilithibitishwa na kupungua kwa 40% katika kiwango cha amiloidi-β katika maji ya ubongo kwa kutumia kizuizi cha peptidi ya BACE1 kilichounganishwa na peptidi mpya ya usafirishaji iliyotambuliwa. Matokeo haya yanaonyesha kwamba peptidi zilizotambuliwa na mbinu za uteuzi wa phaji katika mwili zinaweza kuwa njia muhimu kwa uwasilishaji wa kimfumo wa makromolekuli kwenye ubongo kwa athari ya matibabu.
Utafiti wa tiba inayolenga mfumo mkuu wa neva (CNS) umejikita zaidi katika kutambua dawa na mawakala walioboreshwa wanaoonyesha sifa zinazolenga CNS, huku juhudi ndogo zikipatikana katika kugundua mifumo inayoendesha utoaji wa dawa hai kwenye ubongo. Hii inaanza kubadilika sasa kwani utoaji wa dawa, haswa molekuli kubwa, ni sehemu muhimu ya maendeleo ya dawa za kisasa za neva. Mazingira ya mfumo mkuu wa neva yanalindwa vyema na mfumo wa kizuizi cha mishipa ya ubongo, unaojumuisha kizuizi cha damu-ubongo (BBB) ​​​​na kizuizi cha damu-ubongo (BCBB)1, na kufanya iwe vigumu kupeleka dawa kwenye ubongo1,2. Inakadiriwa kuwa karibu dawa zote kubwa za molekuli na zaidi ya 98% ya dawa ndogo za molekuli huondolewa kwenye ubongo3. Ndiyo maana ni muhimu sana kutambua mifumo mipya ya usafiri wa ubongo ambayo hutoa utoaji mzuri na maalum wa dawa za matibabu kwa CNS 4,5. Hata hivyo, BBB na BCSFB pia hutoa fursa nzuri ya kupeleka dawa zinapoingia na kuingia katika miundo yote ya ubongo kupitia mishipa yake mikubwa ya damu. Kwa hivyo, juhudi za sasa za kutumia mbinu zisizo vamizi za kufikisha kwenye ubongo zinategemea sana utaratibu wa usafirishaji unaosimamiwa na kipokezi (PMT) kwa kutumia kipokezi cha BBB6 cha ndani. Licha ya maendeleo muhimu ya hivi karibuni kwa kutumia njia ya kipokezi cha transferrin7,8, maendeleo zaidi ya mifumo mipya ya uwasilishaji yenye sifa zilizoboreshwa yanahitajika. Kwa lengo hili, lengo letu lilikuwa kutambua peptidi zenye uwezo wa kupatanisha usafirishaji wa CSF, kwani kimsingi zinaweza kutumika kufikisha makromolekuli kwa CNS au kufungua njia mpya za kipokezi. Hasa, vipokezi na wasafirishaji maalum wa mfumo wa mishipa ya ubongo (BBB na BSCFB) wanaweza kutumika kama malengo yanayowezekana ya uwasilishaji hai na maalum wa dawa za tiba ya kibiolojia. Maji ya ubongo (CSF) ni bidhaa ya usiri ya plexus ya koroid (CS) na inagusana moja kwa moja na maji ya ubongo kupitia nafasi ya chini ya araknoidi na nafasi ya ventrikali4. Hivi karibuni imeonyeshwa kuwa maji ya chini ya uraknoidi ya ubongo husambaa kupita kiasi kwenye sehemu ya kati ya ubongo9. Tunatumai kufikia nafasi ya parenchymal kwa kutumia njia hii ya kuingia ya subaraknoidi au moja kwa moja kupitia BBB. Ili kufanikisha hili, tulitekeleza mkakati thabiti wa uteuzi wa faji katika mwili ambao kwa hakika hutambua peptidi zinazosafirishwa na mojawapo ya njia hizi mbili tofauti.
Sasa tunaelezea mbinu ya uchunguzi wa mfululizo wa maonyesho ya phaji mwilini kwa kutumia sampuli ya CSF pamoja na mpangilio wa juu wa mtiririko (HTS) ili kufuatilia raundi za awali za uteuzi zenye utofauti mkubwa zaidi wa maktaba. Uchunguzi ulifanywa kwa panya walio na fahamu kwa kutumia kanula kubwa ya cisterna (CM) iliyopandikizwa kabisa ili kuepuka uchafuzi wa damu. Muhimu zaidi, mbinu hii huchagua kulenga ubongo na peptidi zenye shughuli za usafirishaji kwenye kizuizi cha mishipa ya ubongo. Tulitumia phaji za T7 kutokana na ukubwa wao mdogo (~60 nm)10 na kupendekeza kwamba zinafaa kwa usafirishaji wa vilengelenge vinavyoruhusu kuvuka kwa seli kwa kizuizi cha endothelial na/au epithelial-medulla. Baada ya raundi nne za kuzungusha, idadi ya phaji ilitengwa ikionyesha utajiri mkubwa wa CSF mwilini na uhusiano wa mishipa midogo ya ubongo. Muhimu zaidi, tuliweza kuthibitisha matokeo yetu kwa kuonyesha kwamba peptidi bora zinazopendekezwa na zilizotengenezwa kwa kemikali zinaweza kusafirisha shehena ya protini kwenye giligili ya ubongo. Kwanza, athari za kifamasia za CNS zilianzishwa kwa kuchanganya peptidi inayoongoza ya usafirishaji na kizuizi cha peptidi ya BACE1. Mbali na kuonyesha kwamba mikakati ya uchunguzi wa utendaji kazi wa mwilini inaweza kutambua peptidi mpya za usafirishaji wa ubongo kama wabebaji wa mizigo ya protini wenye ufanisi, tunatarajia mbinu kama hizo za uteuzi wa utendaji kazi pia kuwa muhimu katika kutambua njia mpya za usafirishaji wa ubongo.
Kulingana na vitengo vya kutengeneza jalada (PFU), baada ya hatua ya ufungashaji wa phaji, maktaba ya peptidi za phaji za T7 zenye mstari wa 12-mer zenye utofauti wa takriban 109 zilibuniwa na kuundwa (tazama Nyenzo na Mbinu). Ni muhimu kutambua kwamba tulichambua maktaba hii kwa uangalifu kabla ya kugeuza ndani ya mwili. Upanuzi wa PCR wa sampuli za maktaba ya phaji kwa kutumia primers zilizorekebishwa ulizalisha amplicons ambazo zilitumika moja kwa moja kwa HTS (Mchoro wa Nyongeza 1a). Kutokana na a) makosa ya mpangilio wa HTS11, b) athari kwenye ubora wa primers (NNK)1-12, na c) uwepo wa phaji ya aina ya porini (wt) (viingizo vya mifupa) katika maktaba ya kusubiri, utaratibu wa kuchuja mfuatano ulitekelezwa ili kutoa taarifa za mfuatano zilizothibitishwa pekee (Mchoro wa Nyongeza 1b). Hatua hizi za kichujio zinatumika kwa maktaba zote za mpangilio wa HTS. Kwa maktaba ya kawaida, jumla ya usomaji 233,868 ulipatikana, ambapo 39% kati yao walifaulu vigezo vya kichujio na kutumika kwa uchambuzi wa maktaba na uteuzi kwa raundi zilizofuata (Mchoro wa Nyongeza 1c–e). Usomaji huo ulikuwa mwingi wa jozi 3 za msingi zenye urefu wa kilele cha nyukleotidi 36 (Mchoro wa Nyongeza 1c), ukithibitisha muundo wa maktaba (NNK) 1-12. Ikumbukwe kwamba, takriban 11% ya wanachama wa maktaba walikuwa na kiingilio cha PAGISRELVDKL cha aina ya mwitu (wt) chenye vipimo 12, na karibu nusu ya mfuatano (49%) ulikuwa na viingilio au vifutaji. HTS ya maktaba ya maktaba ilithibitisha utofauti mkubwa wa peptidi katika maktaba: zaidi ya 81% ya mfuatano wa peptidi ulipatikana mara moja tu na ni 1.5% tu iliyotokea katika nakala ≥4 (Mchoro wa Nyongeza 2a). Masafa ya amino asidi (aa) katika nafasi zote 12 kwenye mkusanyiko yalihusiana vyema na masafa yanayotarajiwa kwa idadi ya kodoni zinazozalishwa na mkusanyiko wa NKK ulioharibika (Mchoro wa Nyongeza 2b). Masafa yaliyoonekana ya mabaki ya aa yaliyosimbwa na viingilio hivi yalihusiana vyema na masafa yaliyohesabiwa (r = 0.893) (Mchoro wa Nyongeza 2c). Maandalizi ya maktaba za phaji kwa ajili ya sindano yanajumuisha hatua za ukuzaji na kuondolewa kwa endotoxin. Hii imeonyeshwa hapo awali kupunguza utofauti wa maktaba za phaji12,13. Kwa hivyo, tulipanga maktaba ya phaji iliyokuzwa kwa sahani ambayo ilikuwa imeondolewa endotoxin na kuilinganisha na maktaba ya asili ili kukadiria masafa ya AA. Uwiano mkubwa (r = 0.995) ulionekana kati ya bwawa la asili na bwawa lililokuzwa na kusafishwa (Mchoro wa Nyongeza 2d), ikionyesha kwamba ushindani kati ya kloni zilizokuzwa kwenye sahani zinazotumia phaji ya T7 haukusababisha upendeleo mkubwa. Ulinganisho huu unategemea masafa ya motifu za tripeptidi katika kila maktaba, kwa kuwa utofauti wa maktaba (~109) hauwezi kunakiliwa kikamilifu hata kwa HTS. Uchambuzi wa masafa ya aa katika kila nafasi ulionyesha upendeleo mdogo unaotegemea nafasi katika nafasi tatu za mwisho za mkusanyiko ulioingizwa (Mchoro wa Nyongeza 2e). Kwa kumalizia, tulihitimisha kwamba ubora na utofauti wa maktaba ulikubalika na mabadiliko madogo tu katika utofauti yalionekana kutokana na ukuzaji na utayarishaji wa maktaba za faji kati ya raundi kadhaa za uteuzi.
Uchukuaji sampuli wa maji ya ubongo kwa mfululizo unaweza kufanywa kwa kupandikiza kanula kwenye CM ya panya wenye fahamu ili kurahisisha utambuzi wa phaji ya T7 iliyodungwa ndani ya mishipa (iv) kupitia BBB na/au BCSFB (Mchoro 1a-b). Tulitumia mikono miwili ya uteuzi huru (mikono A na B) katika raundi tatu za kwanza za uteuzi wa ndani ya mwili (Mchoro 1c). Tuliongeza polepole ugumu wa uteuzi kwa kupunguza jumla ya phaji iliyoletwa katika raundi tatu za kwanza za uteuzi. Kwa raundi ya nne ya upanuzi, tuliunganisha sampuli kutoka matawi A na B na kufanya uteuzi tatu wa ziada huru. Ili kusoma sifa za ndani ya mwili za chembe za phaji za T7 katika modeli hii, phaji ya aina ya mwitu (PAGISRELVDKL master insert) ilidungwa kwa panya kupitia mshipa wa mkia. Urejeshaji wa phaji kutoka kwa umajimaji wa ubongo na damu katika vipindi tofauti vya wakati ulionyesha kuwa phaji ndogo za icosahedral za T7 zilikuwa na awamu ya haraka ya uondoaji kutoka kwa sehemu ya damu (Mchoro wa Nyongeza 3). Kulingana na viwango vilivyotolewa na ujazo wa damu wa panya, tulihesabu kwamba takriban 1% tu ya uzito wa phaji kutoka kwa kipimo kilichotolewa ndio iliyogunduliwa kwenye damu dakika 10 baada ya sindano ya mishipa. Baada ya kupungua huku kwa kasi kwa awali, uwazi wa msingi wa polepole ulipimwa kwa nusu ya maisha ya dakika 27.7. Muhimu zaidi, ni faji chache sana zilizopatikana kutoka kwa sehemu ya CSF, ikionyesha msingi mdogo wa uhamiaji wa faji wa aina ya porini kwenye sehemu ya CSF (Mchoro wa Nyongeza wa 3). Kwa wastani, takriban 1 x 10-3% tu ya faji ya T7 kwenye damu na 4 x 10-8% ya faji zilizoingizwa awali ziligunduliwa kwenye giligili ya ubongo kwa kipindi chote cha sampuli (dakika 0-250). Ikumbukwe kwamba nusu ya maisha (dakika 25.7) ya faji wa aina ya porini katika giligili ya ubongo ilikuwa sawa na ile iliyoonekana kwenye damu. Takwimu hizi zinaonyesha kwamba kizuizi kinachotenganisha sehemu ya CSF kutoka kwa damu kiko sawa katika panya walio na CM-cannulated, na hivyo kuruhusu uteuzi wa maktaba za phage ndani ya mwili kutambua kloni zinazosafirishwa kwa urahisi kutoka kwa damu hadi sehemu ya CSF.
(a) Kuweka mbinu ya kuchukua tena sampuli ya maji ya ubongo (CSF) kutoka kwenye bwawa kubwa. (b) Mchoro unaoonyesha eneo la seli la kizuizi cha mfumo mkuu wa neva (CNS) na mkakati wa uteuzi unaotumika kutambua peptidi zinazovuka kizuizi cha damu-ubongo (BBB) ​​​​na kizuizi cha damu-ubongo. (c) Chati ya mtiririko wa uchunguzi wa onyesho la phaji mwilini. Katika kila raundi ya uteuzi, phaji (vitambulisho vya wanyama ndani ya mishale) vilidungwa kwa njia ya mishipa. Matawi mawili mbadala huru (A, B) huhifadhiwa kando hadi raundi ya 4 ya uteuzi. Kwa raundi ya uteuzi ya 3 na 4, kila kloni ya phaji iliyotolewa kutoka kwa CSF ilipangwa kwa mfuatano kwa mikono. (d) Kinetiki ya phaji iliyotengwa kutoka kwa damu (duara nyekundu) na maji ya ubongo (pembetatu za kijani) wakati wa raundi ya kwanza ya uteuzi katika panya wawili waliowekwa kwenye makopo baada ya sindano ya ndani ya mishipa ya maktaba ya peptidi ya T7 (phaji 2 x 1012/mnyama). Mraba wa bluu huonyesha wastani wa mkusanyiko wa awali wa faji katika damu, unaohesabiwa kutoka kwa kiasi cha faji iliyodungwa, kwa kuzingatia jumla ya ujazo wa damu. Mraba mweusi huonyesha sehemu ya makutano ya mstari wa y uliotolewa kutoka kwa viwango vya faji ya damu. (e,f) Wasilisha masafa na usambazaji wa motifu zote zinazowezekana za tripeptidi zinazoingiliana zinazopatikana katika peptidi. Idadi ya motifu zilizopatikana katika masomo 1000 imeonyeshwa. Muhimu (p < 0.001) motifu zilizoimarishwa zimewekwa alama na nukta nyekundu. (e) Mpangilio wa uwiano unaolinganisha masafa ya uwiano wa motifu ya tripeptidi ya maktaba iliyodungwa na faji inayotokana na damu kutoka kwa wanyama #1.1 na #1.2. (f) Mpangilio wa uwiano unaolinganisha masafa ya uwiano wa motifu ya faji ya wanyama #1.1 na #1.2 zilizotengwa katika damu na maji ya ubongo. (g, h) Uwakilishi wa Kitambulisho cha Mfuatano wa faji iliyotajiriwa katika damu (g) ​​dhidi ya maktaba zilizodungwa na faji iliyotajiriwa katika CSF (h) dhidi ya damu baada ya raundi ya uteuzi wa ndani ya mwili kwa wanyama wote wawili. Ukubwa wa msimbo wa herufi moja unaonyesha ni mara ngapi asidi amino hiyo hutokea katika nafasi hiyo. Kijani = polar, zambarau = neutral, bluu = basic, nyekundu = tindikali na nyeusi = hidrofobiki amino asidi. Mchoro 1a, b ulibuniwa na kutengenezwa na Eduard Urich.
Tuliingiza maktaba ya peptidi ya phage ndani ya panya wawili wa vifaa vya CM (clades A na B) na phage iliyotengwa kutoka kwa umajimaji wa ubongo na damu (Mchoro 1d). Uondoaji wa haraka wa awali wa maktaba haukuwa dhahiri sana ikilinganishwa na phage ya aina ya porini. Wastani wa nusu ya maisha ya maktaba iliyoingizwa katika wanyama wote wawili ulikuwa dakika 24.8 kwenye damu, sawa na phage ya aina ya porini, na dakika 38.5 katika CSF. Sampuli za phage ya umajimaji wa ubongo na ubongo kutoka kwa kila mnyama zilifanyiwa HTS na peptidi zote zilizotambuliwa zilichambuliwa kwa uwepo wa motifu fupi ya tripeptidi. motifu za tripeptidi zilichaguliwa kwa sababu hutoa msingi mdogo wa uundaji wa muundo na mwingiliano wa peptidi-protini14,15. Tulipata uhusiano mzuri katika usambazaji wa motifu kati ya maktaba ya phage iliyoingizwa na kloni zilizotolewa kutoka kwa damu ya wanyama wote wawili (Mchoro 1e). Data inaonyesha kwamba muundo wa maktaba umetajiriwa kidogo tu katika sehemu ya damu. Masafa ya asidi ya amino na mfuatano wa makubaliano ulichambuliwa zaidi katika kila nafasi kwa kutumia marekebisho ya programu ya Weblogo16. Cha kufurahisha ni kwamba, tulipata utajiri mkubwa katika mabaki ya glycine ya damu (Mchoro 1g). Damu ilipolinganishwa na kloni zilizochaguliwa kutoka kwa CSF, uteuzi mkubwa na uteuzi fulani wa motifu ulizingatiwa (Mchoro 1f), na asidi fulani za amino zilikuwepo kwa upendeleo katika nafasi zilizopangwa mapema katika sehemu 12 (Mchoro 1h). Ikumbukwe kwamba wanyama binafsi walitofautiana kwa kiasi kikubwa katika umajimaji wa ubongo, ilhali utajiri wa glycine ya damu ulionekana katika wanyama wote wawili (Mchoro wa Nyongeza 4a–j). Baada ya kuchuja kwa ukali data ya mfuatano katika umajimaji wa ubongo wa wanyama #1.1 na #1.2, jumla ya peptidi 964 na 420 za kipekee za 12-mer zilipatikana (Mchoro wa Nyongeza 1d–e). Kloni za phaji zilizotengwa ziliongezwa na kufanyiwa raundi ya pili ya uteuzi wa ndani ya mwili. Faji zilizotolewa kutoka raundi ya pili ya uteuzi zilifanyiwa HTS katika kila mnyama na peptidi zote zilizotambuliwa zilitumika kama pembejeo kwenye programu ya utambuzi wa motifu ili kuchambua kutokea kwa motifu za tripeptidi (Mchoro 2a, b, ef). Ikilinganishwa na mzunguko wa kwanza wa faji iliyopatikana kutoka kwa CSF, tuliona uteuzi zaidi na kuondolewa kwa motifu nyingi katika CSF katika matawi A na B (Mchoro 2). Algorithm ya utambuzi wa mtandao ilitumika kubaini kama ziliwakilisha mifumo tofauti ya mlolongo thabiti. Kufanana wazi kulionekana kati ya mlolongo wa vipimo 12 uliopatikana na CSF katika clade mbadala A (Mchoro 2c, d) na clade B (Mchoro 2g, h). Uchambuzi wa pamoja katika kila tawi ulifunua wasifu tofauti wa uteuzi wa peptidi 12-mer (Mchoro wa Nyongeza 5c, d) na ongezeko la uwiano wa CSF/damu baada ya muda kwa clones zilizounganishwa baada ya raundi ya pili ya uteuzi ikilinganishwa na raundi ya kwanza ya uteuzi (Mchoro wa Nyongeza 5e).).
Uboreshaji wa motifu na peptidi katika umajimaji wa ubongo kwa raundi mbili mfululizo za uteuzi wa onyesho la faji linalofanya kazi mwilini.
Faji zote za maji ya ubongo zilizopatikana kutoka kwa raundi ya kwanza ya kila mnyama (wanyama #1.1 na #1.2) zilikusanywa, kukuzwa, kupangwa kwa HT na kudungwa tena pamoja (faji 2 x 1010/mnyama) Panya 2 waliowekwa kwenye makopo ya SM (#1.1 → #). 2.1 na 2.2, 1.2 → 2.3 na 2.4). (a,b,e,f) Vipimo vya ulinganifu vinavyolinganisha masafa ya motifu za tripeptidi za faji zote zinazotokana na CSF katika raundi ya kwanza na ya pili ya uteuzi. Masafa ya ulinganifu na usambazaji wa motifu zinazowakilisha tripeptidi zote zinazoweza kuingiliana zinazopatikana katika peptidi katika mwelekeo wote wawili. Idadi ya motifu zilizopatikana katika usomaji 1000 zinaonyeshwa. Motifu ambazo zilichaguliwa kwa kiasi kikubwa (p < 0.001) au kutengwa katika moja ya maktaba zilizolinganishwa zimeangaziwa kwa nukta nyekundu. (c, d, g, h) Uwakilishi wa nembo ya mfuatano wa mfuatano wa mfuatano wote mrefu wa asidi amino 12 zenye CSF kulingana na raundi ya 2 na 1 ya uteuzi wa ndani ya mwili. Ukubwa wa msimbo wa herufi moja unaonyesha ni mara ngapi asidi amino hiyo hutokea katika nafasi hiyo. Ili kuwakilisha nembo, masafa ya mfuatano wa CSF uliotolewa kutoka kwa wanyama binafsi kati ya raundi mbili za uteuzi hulinganishwa na mfuatano ulioboreshwa katika raundi ya pili unaonyeshwa: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 na (h) #1.2–#2.4. Asidi amino zilizotajirishwa zaidi katika nafasi fulani katika wanyama (c, d) nambari 2.1 na nambari 2.2 au (g, h) katika wanyama nambari 2.3 na nambari 2.4 zinaonyeshwa kwa rangi. Kijani = polar, zambarau = neutral, bluu = basic, nyekundu = tindikali na nyeusi = asidi amino haidrofobi.
Baada ya raundi ya tatu ya uteuzi, tulitambua mfuatano 124 wa kipekee wa peptidi (#3.1 na #3.2) kutoka kwa kloni 332 za faji zilizoundwa upya za CSF zilizotengwa kutoka kwa wanyama wawili (Mchoro wa Nyongeza 6a). Mfuatano wa LGSVS (18.7%) ulikuwa na uwiano wa juu zaidi, ukifuatiwa na viingilio vya aina ya porini PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), na SARGSWREIVSLS (2.2%). Katika raundi ya mwisho ya nne, tulikusanya matawi mawili yaliyochaguliwa kwa kujitegemea kutoka kwa wanyama watatu tofauti (Mchoro 1c). Kati ya kloni 925 za faji zilizopatikana kutoka kwa CSF, katika raundi ya nne tulipata mfuatano 64 wa kipekee wa peptidi (Mchoro wa Nyongeza 6b), kati ya hizo uwiano wa faji wa aina ya porini ulishuka hadi 0.8%. Kloni za kawaida za CSF katika raundi ya nne zilikuwa LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) na RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). Urefu wa peptidi zilizochaguliwa unatokana na uingizaji/ufutaji wa nyukleotidi au kodoni za kusimamisha mapema katika vitangulizi vya maktaba wakati wa kutumia kodoni zilizoharibika kwa muundo wa maktaba ya NNK. Kodoni za kusimamisha mapema hutoa peptidi fupi na huchaguliwa kwa sababu zina motifu nzuri ya aa. Peptidi ndefu zinaweza kutokana na uingizaji/ufutaji katika vitangulizi vya maktaba za sintetiki. Hii huweka kodoni ya kusimamisha iliyoundwa nje ya fremu na kuisoma hadi kodoni mpya ya kusimamisha ionekane chini. Kwa ujumla, tulihesabu vipengele vya uboreshaji kwa raundi zote nne za uteuzi kwa kulinganisha data ya ingizo na data ya matokeo ya sampuli. Kwa raundi ya kwanza ya uchunguzi, tulitumia titers za aina ya pori kama marejeleo yasiyo maalum ya usuli. Cha kufurahisha ni kwamba, uteuzi hasi wa fagi ulikuwa na nguvu sana katika mzunguko wa kwanza wa CSF, lakini sio katika damu (Mchoro 3a), ambayo inaweza kuwa kutokana na uwezekano mdogo wa uenezaji tulivu wa wanachama wengi wa maktaba ya peptidi kwenye sehemu ya CSF au fagi jamaa huwa huhifadhiwa au kuondolewa kwa ufanisi zaidi kutoka kwa damu kuliko bakteriofagi. Hata hivyo, katika raundi ya pili ya upanuaji, uteuzi mkubwa wa fagi katika CSF ulionekana katika makundi yote mawili, ikidokeza kwamba raundi iliyopita ilikuwa na utajiri katika fagi zinazoonyesha peptidi zinazokuza ufyonzaji wa CSF (Mchoro 3a). Tena, bila utajiri mkubwa wa damu. Pia katika raundi ya tatu na ya nne, kloni za fagi zilitajirishwa kwa kiasi kikubwa katika CSF. Kulinganisha masafa ya kila mfuatano wa kipekee wa peptidi kati ya raundi mbili za mwisho za uteuzi, tuligundua kuwa mfuatano huo ulikuwa na utajiri zaidi katika raundi ya nne ya uteuzi (Mchoro 3b). Jumla ya motifu 931 za peptidi zilitolewa kutoka kwa mfuatano wote 64 wa kipekee wa peptidi kwa kutumia mielekeo yote miwili ya peptidi. motifu zilizoimarishwa zaidi katika raundi ya nne zilichunguzwa kwa karibu zaidi kwa wasifu wao wa utajiri katika raundi zote ikilinganishwa na maktaba iliyoingizwa (mkata: utajiri wa 10%) (Mchoro wa Nyongeza 6c). Mifumo ya jumla ya uteuzi ilionyesha kuwa nia nyingi zilizosomwa ziliimarishwa katika raundi zote za awali za matawi yote mawili ya uteuzi. Hata hivyo, baadhi ya motifu (km SGL, VSG, LGS GSV) zilitokana zaidi na kladi mbadala A, huku zingine (km FGW, RTN, WGF, NTR) ziliimarishwa katika kladi mbadala B.
Uthibitishaji wa usafirishaji wa CSF wa peptidi zilizoonyeshwa kwa faji zilizoimarishwa na CSF na peptidi zinazoongoza zenye biotinili zilizounganishwa na mizigo ya streptavidin.
(a) Uwiano wa uboreshaji uliohesabiwa katika raundi zote nne (R1-R4) kulingana na viwango vya sindano (pembejeo = I) za phaji (PFU) na viwango vya CSF vya phaji vilivyobainishwa (matokeo = O). Vipengele vya uboreshaji kwa raundi tatu za mwisho (R2-R4) vilihesabiwa kwa kulinganisha na raundi iliyopita na raundi ya kwanza (R1) kwa data ya uzito. Vipande vilivyo wazi ni maji ya ubongo, vipande vilivyotiwa kivuli ni plasma. (***p<0.001, kulingana na jaribio la t la Mwanafunzi). (b) Orodha ya peptidi za phaji zilizo nyingi zaidi, zilizopangwa kulingana na uwiano wao wa jamaa na phaji zote zilizokusanywa katika CSF baada ya raundi ya 4 ya uteuzi. Kloni sita za phaji zinazojulikana zaidi zimeangaziwa kwa rangi, nambari na vipengele vyao vya uboreshaji kati ya raundi ya 3 na 4 ya uteuzi (vipande). (c,d) Kloni sita za phaji zilizoimarishwa zaidi, maktaba tupu za phaji na peptidi ya wazazi ya phaji kutoka raundi ya 4 zilichambuliwa kivyake katika modeli ya sampuli ya CSF. Sampuli za CSF na damu zilikusanywa katika vipindi vya wakati vilivyoonyeshwa. (c) Kiasi sawa cha kloni 6 za faji zinazohitajika (faji/wanyama 2 x 1010), faji tupu (#1779) (faji/wanyama 2 x 1010) na maktaba za peptidi ya faji (faji/wanyama 2 x 1012) Choma angalau CM 3 kwa mnyama aliyewekwa kwenye kano kando kupitia mshipa wa mkia. Famakonetiki ya CSF ya kila kloni ya faji iliyodungwa na maktaba ya peptidi ya faji baada ya muda imeonyeshwa. (d) inaonyesha wastani wa uwiano wa CSF/damu kwa faji/mL zote zilizopatikana kwa muda wa sampuli. (e) Peptidi nne za kiongozi za sintetiki na udhibiti mmoja uliochanganywa ziliunganishwa na biotini na streptavidini kupitia N-terminus yao (onyesho la tetramer) ikifuatiwa na sindano (mshipa wa mkia iv, 10 mg streptavidin/kg). Angalau panya watatu walioingizwa kwenye mirija ya kupitisha damu (N = 3).). Sampuli za CSF zilikusanywa katika vipindi vilivyoonyeshwa na viwango vya streptavidin vilipimwa kwa kutumia CSF anti-streptavidin ELISA (na = haijagunduliwa). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, kulingana na jaribio la ANOVA). (f) Ulinganisho wa mfuatano wa amino asidi ya kloni ya peptidi ya faji iliyotajiriwa zaidi #2002 (zambarau) na kloni zingine za peptidi ya faji zilizochaguliwa kutoka raundi ya 4 ya uteuzi. Vipande vya amino asidi zinazofanana na zinazofanana vimepakwa rangi.
Kati ya phaji zote zilizoimarishwa katika raundi ya nne (Mchoro 3b), kloni sita zilizopendekezwa zilichaguliwa kwa ajili ya uchambuzi zaidi wa kibinafsi katika modeli ya sampuli ya CSF. Kiasi sawa cha phaji sita zilizopendekezwa, phaji tupu (isiyo na kiingilio) na maktaba za peptidi ya prophaji ziliingizwa kwenye wanyama watatu wa CM waliowekwa kwenye makopo, na pharmacokinetics ziliamuliwa katika majaribio ya CSF (Mchoro 3c) na damu (Mchoro wa Nyongeza 7). Kloni zote za phaji zilizojaribiwa zililenga sehemu ya CSF kwa kiwango cha mara 10-1000 zaidi kuliko kile cha phaji tupu ya kudhibiti (#1779). Kwa mfano, kloni #2020 na #2077 zilikuwa na takriban mara 1000 ya CSF kuliko phaji ya kudhibiti. Wasifu wa pharmacokinetic wa kila peptidi iliyochaguliwa ni tofauti, lakini zote zina uwezo wa juu wa CSF wa kurudi nyumbani. Tuliona kupungua mara kwa mara baada ya muda kwa nakala #1903 na #2011, huku kwa nakala #2077, #2002 na #2009 ongezeko wakati wa dakika 10 za kwanza linaweza kuonyesha usafiri unaofanya kazi lakini linahitaji kuthibitishwa. Kloni #2020, #2002, na #2077 zilitulia katika viwango vya juu, huku mkusanyiko wa CSF wa nakala #2009 ukipungua polepole baada ya ongezeko la awali. Kisha tulilinganisha masafa ya kila mgombea wa CSF na mkusanyiko wake wa damu (Mchoro 3d). Uwiano wa wastani wa kila mgombea wa CSF na kiwango chake cha damu wakati wote wa sampuli ulionyesha kuwa watatu kati ya wagombea sita walikuwa wametajiriwa kwa kiasi kikubwa katika CSF ya damu. Cha kufurahisha, nakala #2077 ilionyesha utulivu wa juu wa damu (Mchoro wa Nyongeza 7). Ili kuthibitisha kwamba peptidi zenyewe zina uwezo wa kusafirisha mizigo zaidi ya chembe za faji kwenye sehemu ya CSF, tulitengeneza peptidi nne kuu zilizotokana na biotini kwenye sehemu ya N-terminal ambapo peptidi hushikamana na chembe ya faji. Peptidi zilizo na biotinili (nambari 2002, 2009, 2020 na 2077) ziliunganishwa na streptavidin (SA) ili kupata umbo la multimeric linaloiga jiometri ya faji. Umbizo hili pia lilituruhusu kupima mfiduo wa SA katika damu na maji ya ubongo kama peptidi za protini zinazosafirisha mizigo. Muhimu zaidi, data ya faji mara nyingi ingeweza kuzalishwa tena wakati peptidi za sintetiki zilitolewa katika umbizo hili lililounganishwa na SA (Mchoro 3e). Peptidi zilizochanganyika zilikuwa na mfiduo mdogo wa awali na uwazi wa haraka wa CSF na viwango visivyoonekana ndani ya saa 48. Ili kupata ufahamu kuhusu njia za uwasilishaji wa kloni hizi za faji za peptidi kwenye nafasi ya CSF, tulichambua ujanibishaji wa vijiti vya peptidi za faji za kibinafsi kwa kutumia immunohistochemistry (IHC) ili kugundua moja kwa moja chembe za faji saa 1 baada ya sindano ya ndani ya mishipa mwilini. Ikumbukwe kwamba, kloni #2002, #2077, na #2009 zinaweza kugunduliwa kwa kuchafua sana kwenye kapilari za ubongo, huku kidhibiti cha faji (#1779) na kloni #2020 hazikugunduliwa (Mchoro wa Nyongeza 8). Hii inaonyesha kwamba peptidi hizi huchangia athari kwenye ubongo haswa kwa kuvuka BBB. Uchambuzi zaidi wa kina unahitajika ili kujaribu dhana hii, kwani njia ya BSCFB inaweza pia kuhusika. Wakati wa kulinganisha mfuatano wa asidi amino wa kloni iliyotajiriwa zaidi (#2002) na peptidi zingine zilizochaguliwa, ilibainika kuwa baadhi yao wana viendelezi sawa vya asidi amino, ambavyo vinaweza kuonyesha utaratibu sawa wa usafirishaji (Mchoro 3f).
Kutokana na wasifu wake wa kipekee wa plasma na ongezeko kubwa la CSF baada ya muda, kloni ya onyesho la phaji #2077 ilichunguzwa zaidi kwa kipindi kirefu cha saa 48 na iliweza kuzaa ongezeko la haraka la CSF lililoonekana kuhusiana na viwango vya SA vilivyoendelea (Mchoro 4a). Kuhusu kloni zingine za phaji zilizotambuliwa, #2077 ilibadilika rangi kwa nguvu kwa kapilari za ubongo na ilionyesha ujanibishaji mkubwa wa rangi na lektini ya alama ya kapilari inapotazamwa kwa ubora wa juu na labda madoa fulani katika nafasi ya parenchymal (Mchoro 4b). Ili kuchunguza kama athari za kifamasia zinazosababishwa na peptidi zinaweza kupatikana katika CNS, tulifanya jaribio ambalo matoleo ya biotinili ya i) peptidi ya usafiri ya #2077 na ii) peptidi ya kizuizi cha BACE1 yalichanganywa na SA kwa uwiano mbili tofauti. Kwa mchanganyiko mmoja tulitumia kizuizi cha peptidi ya BACE1 pekee na kwa mwingine tulitumia uwiano wa 1:3 wa kizuizi cha peptidi ya BACE1 kwa peptidi ya #2077. Sampuli zote mbili zilitolewa kwa njia ya mishipa na viwango vya damu na maji ya ubongo ya peptidi ya beta-amiloidi 40 (Abeta40) vilipimwa baada ya muda. Abeta40 ilipimwa katika CSF kwani inaonyesha kizuizi cha BACE1 katika parenchyma ya ubongo. Kama ilivyotarajiwa, tata zote mbili zilipunguza kwa kiasi kikubwa viwango vya damu vya Abeta40 (Mchoro 4c, d). Hata hivyo, sampuli pekee zenye mchanganyiko wa peptidi nambari 2077 na kizuizi cha peptidi ya BACE1 iliyounganishwa na SA zilisababisha kupungua kwa kiasi kikubwa kwa Abeta40 katika maji ya ubongo (Mchoro 4c). Data inaonyesha kwamba peptidi nambari 2077 inaweza kusafirisha protini ya 60 kDa SA hadi kwenye CNS na pia husababisha athari za kifamasia kwa kutumia vizuizi vilivyounganishwa na SA vya peptidi ya BACE1.
(a) Sindano ya Kloni (2 × 10 phaji/mnyama) ya T7 phaji inayoonyesha wasifu wa muda mrefu wa kifamasia wa peptidi ya CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) na phaji ya kudhibiti isiyodungwa (#1779) katika panya watatu walioingizwa kwenye CM. (b) Picha ya hadubini ya ndani ya mishipa midogo ya gamba inayowakilisha katika panya waliodungwa na phaji (2 × 10 10 phaji/mnyama) inayoonyesha urekebishaji wa peptidi #2077 na mishipa (lectin). Kloni hizi za phaji zilitolewa kwa panya 3 na kuruhusiwa kuzunguka kwa saa 1 kabla ya upitishaji. Ubongo uligawanywa na kupakwa rangi na kingamwili zenye lebo ya FITC dhidi ya kapsidi ya phaji ya T7. Dakika kumi kabla ya upitishaji na urekebishaji unaofuata, lectini yenye lebo ya DyLight594 ilitolewa kwa njia ya mishipa. Picha za mwangaza zinazoonyesha madoa ya lektini (nyekundu) ya upande wa mwanga wa mishipa midogo na faji (kijani) katika lumen ya kapilari na tishu za ubongo za pembeni mwa mishipa. Upau wa kipimo unalingana na µm 10. (c, d) Peptidi ya kuzuia BACE1 iliyo na biotinili pekee au pamoja na peptidi ya usafiri iliyo na biotinilili #2077 iliunganishwa na streptavidini ikifuatiwa na sindano ya mishipa ya angalau panya watatu wa CM walio na makopo (10 mg ya streptavidin/kg). Kupungua kwa Aβ40 kunakosababishwa na kizuizi cha peptidi ya BACE1 kulipimwa na Aβ1-40 ELISA katika damu (nyekundu) na umajimaji wa ubongo (machungwa) katika vipindi vilivyoonyeshwa. Kwa uwazi zaidi, mstari wenye nukta huchorwa kwenye grafu kwa kipimo cha 100%. (c) Kupungua kwa asilimia katika Aβ40 katika damu (pembetatu nyekundu) na umajimaji wa ubongo (pembetatu za chungwa) katika panya waliotibiwa na streptavidin iliyounganishwa na peptidi ya transit #2077 na peptidi ya kuzuia BACE1 katika uwiano wa 3:1. (d) Kupungua kwa asilimia katika damu Aβ40 (duara nyekundu) na umajimaji wa ubongo (duara za chungwa) za panya waliotibiwa na streptavidin pamoja na peptidi ya kuzuia BACE1 pekee. Kiwango cha Aβ katika udhibiti kilikuwa 420 pg/ml (mkengeuko wa kawaida = 101 pg/ml).
Onyesho la faji limetumika kwa mafanikio katika maeneo kadhaa ya utafiti wa kibiolojia17. Njia hii imetumika kwa tafiti za utofauti wa mishipa ya damu mwilini18,19 pamoja na tafiti zinazolenga mishipa ya ubongo20,21,22,23,24,25,26. Katika utafiti huu, tulipanua matumizi ya njia hii ya uteuzi sio tu kwa utambuzi wa moja kwa moja wa peptidi zinazolenga mishipa ya ubongo, lakini pia kwa ugunduzi wa wagombea wenye sifa za usafiri zinazofanya kazi ili kuvuka kizuizi cha damu-ubongo. Sasa tunaelezea maendeleo ya utaratibu wa uteuzi wa ndani ya mwili kwa panya walioingizwa kwenye CM na kuonyesha uwezo wake wa kutambua peptidi zenye sifa za CSF homing. Kwa kutumia faji ya T7 inayoonyesha maktaba ya peptidi nasibu za 12-mer, tuliweza kuonyesha kwamba faji ya T7 ni ndogo ya kutosha (takriban 60 nm kwa kipenyo)10 ili kubadilishwa na kizuizi cha damu-ubongo, na hivyo kuvuka moja kwa moja kizuizi cha damu-ubongo au plexus ya koroid. Tuligundua kuwa uvunaji wa CSF kutoka kwa panya wa CM waliowekwa kwenye makopo ulikuwa mbinu ya uchunguzi wa utendaji kazi iliyodhibitiwa vizuri, na kwamba faji iliyotolewa haikufungamana tu na mishipa ya damu lakini pia ilifanya kazi kama kisafirisha kupitia kizuizi cha damu-ubongo. Zaidi ya hayo, kwa kukusanya damu na kutumia HTS kwa CSF na faji zinazotokana na damu kwa wakati mmoja, tulithibitisha kwamba uchaguzi wetu wa CSF haukuathiriwa na uboreshaji wa damu au uthabiti wa upanuzi kati ya raundi za uteuzi. Hata hivyo, sehemu ya damu ni sehemu ya utaratibu wa uteuzi, kwa kuwa faji zinazoweza kufikia sehemu ya CSF lazima ziishi na kuzunguka katika damu kwa muda wa kutosha kujitajirisha katika ubongo. Ili kutoa taarifa za mfuatano wa kuaminika kutoka kwa data ghafi ya HTS, tulitekeleza vichujio vilivyorekebishwa kwa makosa maalum ya mpangilio katika mtiririko wa kazi wa uchambuzi. Kwa kuingiza vigezo vya kinetiki katika njia ya uchunguzi, tulithibitisha pharmacokinetics ya haraka ya faji za T7 za aina ya porini (t½ ~ dakika 28) katika damu24, 27, 28 na pia tukaamua nusu ya maisha yao katika maji ya ubongo (t½ ~ dakika 26) kwa dakika). Licha ya wasifu sawa wa kifamasia katika damu na CSF, ni 0.001% tu ya mkusanyiko wa faji katika damu uliweza kugunduliwa katika CSF, ikionyesha uhamaji mdogo wa nyuma wa faji ya T7 ya aina ya mwitu kupitia kizuizi cha damu-ubongo. Kazi hii inaangazia umuhimu wa raundi ya kwanza ya uteuzi wakati wa kutumia mikakati ya kuchuja katika mwili, haswa kwa mifumo ya faji ambayo huondolewa haraka kutoka kwa mzunguko wa damu, kwani faji chache zinaweza kufikia sehemu ya CNS. Kwa hivyo, katika raundi ya kwanza, kupungua kwa utofauti wa maktaba kulikuwa kubwa sana, kwani ni idadi ndogo tu ya faji zilizokusanywa hatimaye katika modeli hii kali sana ya CSF. Mkakati huu wa kuchuja katika mwili ulijumuisha hatua kadhaa za uteuzi kama vile mkusanyiko hai katika sehemu ya CSF, kuishi kwa faji katika sehemu ya damu, na kuondolewa haraka kwa faji za faji za T7 kutoka kwa damu ndani ya dakika 10 za kwanza (Mchoro 1d na Mchoro wa Nyongeza 4M). ). Kwa hivyo, baada ya raundi ya kwanza, faji tofauti zilitambuliwa katika CSF, ingawa bwawa moja la awali lilitumika kwa wanyama binafsi. Hii inaonyesha kwamba hatua nyingi kali za uteuzi kwa maktaba chanzo zenye idadi kubwa ya wanachama wa maktaba husababisha kupungua kwa utofauti. Kwa hivyo, matukio ya nasibu yatakuwa sehemu muhimu ya mchakato wa uteuzi wa awali, na kuathiri sana matokeo. Inawezekana kwamba nakala nyingi katika maktaba ya awali zilikuwa na mwelekeo sawa wa uboreshaji wa CSF. Hata hivyo, hata chini ya hali sawa za majaribio, matokeo ya uteuzi yanaweza kutofautiana kutokana na idadi ndogo ya kila nakala maalum katika kundi la awali.
Motifu zilizotajiriwa katika CSF hutofautiana na zile zilizo kwenye damu. Cha kufurahisha, tulibaini mabadiliko ya kwanza kuelekea peptidi zenye glycine nyingi katika damu ya wanyama binafsi. (Mchoro 1g, Michoro ya Nyongeza. 4e, 4f). Peptidi za glycine zenye faji zinaweza kuwa imara zaidi na haziwezi kuondolewa kwenye mzunguko wa damu. Hata hivyo, peptidi hizi zenye glycine nyingi hazikugunduliwa katika sampuli za maji ya ubongo, ikidokeza kwamba maktaba zilizochaguliwa zilipitia hatua mbili tofauti za uteuzi: moja katika damu na nyingine iliruhusiwa kujikusanya katika maji ya ubongo. Kloni zilizotajiriwa na CSF zinazotokana na raundi ya nne ya uteuzi zimejaribiwa kwa kina. Karibu kloni zote zilizojaribiwa kibinafsi zilithibitishwa kuwa zimetajiriwa katika CSF ikilinganishwa na phaji tupu ya kudhibiti. Mguso mmoja wa peptidi (#2077) ulichunguzwa kwa undani zaidi. Ilionyesha nusu ya maisha marefu ya plasma ikilinganishwa na miguso mingine (Mchoro 3d na Mchoro wa Nyongeza 7), na cha kufurahisha, peptidi hii ilikuwa na mabaki ya cysteine ​​​​kwenye C-terminal. Hivi majuzi imeonyeshwa kuwa kuongezwa kwa cysteine ​​\u2002 \u2003d kwenye peptidi kunaweza kuboresha sifa zao za kifamasia kwa kujifunga kwenye albumin 29. Hii kwa sasa haijulikani kwa peptidi #2077 na inahitaji utafiti zaidi. Baadhi ya peptidi zilionyesha utegemezi wa valensi katika uboreshaji wa CSF (data haijaonyeshwa), ambayo inaweza kuhusishwa na jiometri ya uso iliyoonyeshwa ya kapsidi ya T7. Mfumo wa T7 tuliotumia ulionyesha nakala 5-15 za kila peptidi kwa kila chembe ya phaji. IHC ilifanywa kwenye kloni za lead phaji zinazohitajika zilizoingizwa ndani ya mishipa kwenye gamba la ubongo la panya (Mchoro wa Nyongeza 8). Data ilionyesha kuwa angalau kloni tatu (Na. 2002, Na. 2009 na Na. 2077) ziliingiliana na BBB. Bado haijabainika ikiwa mwingiliano huu wa BBB husababisha mkusanyiko wa CSF au harakati za kloni hizi moja kwa moja hadi BCSFB. Muhimu zaidi, tunaonyesha kwamba peptidi zilizochaguliwa huhifadhi uwezo wao wa usafirishaji wa CSF zinapotengenezwa na kufungwa kwenye mzigo wa protini. Kufungamana kwa peptidi za biotinili za N-terminal na SA kimsingi hurudia matokeo yaliyopatikana na kloni zao za faji katika damu na maji ya ubongo (Mchoro 3e). Hatimaye, tunaonyesha kwamba peptidi ya risasi #2077 inaweza kukuza utendaji wa ubongo wa kizuizi cha peptidi ya biotinili cha BACE1 kilichounganishwa na SA, na kusababisha athari kali za kifamasia katika CNS kwa kupunguza kwa kiasi kikubwa viwango vya Abeta40 katika CSF (Mchoro 4). Hatukuweza kutambua homologues zozote katika hifadhidata kwa kufanya utafutaji wa homolojia wa mfuatano wa peptidi wa hits zote. Ni muhimu kutambua kwamba ukubwa wa maktaba ya T7 ni takriban 109, huku ukubwa wa maktaba ya kinadharia kwa 12-mers ni 4 x 1015. Kwa hivyo, tulichagua sehemu ndogo tu ya nafasi ya utofauti wa maktaba ya peptidi ya 12-mer, ambayo inaweza kumaanisha kwamba peptidi zilizoboreshwa zaidi zinaweza kutambuliwa kwa kutathmini nafasi ya mfuatano iliyo karibu ya hits hizi zilizotambuliwa. Kinadharia, moja ya sababu kwa nini hatujapata homologues yoyote ya asili ya peptidi hizi inaweza kuwa ni kutochagua wakati wa mageuzi ili kuzuia kuingia bila kudhibitiwa kwa motifu fulani za peptidi kwenye ubongo.
Kwa pamoja, matokeo yetu yanatoa msingi wa kazi ya baadaye ili kutambua na kuainisha mifumo ya usafirishaji wa kizuizi cha mishipa ya ubongo katika mwili kwa undani zaidi. Mpangilio wa msingi wa njia hii unategemea mkakati wa uteuzi unaofanya kazi ambao sio tu hutambua clones zenye sifa za kufungamana na mishipa ya ubongo, lakini pia unajumuisha hatua muhimu ambayo clones zilizofanikiwa zina shughuli za ndani za kuvuka vikwazo vya kibiolojia katika mwili katika mwili hadi kwenye sehemu ya CNS. Ni kufafanua utaratibu wa usafirishaji wa peptidi hizi na upendeleo wao wa kufungamana na mikrovaskulature maalum kwa eneo la ubongo. Hii inaweza kusababisha ugunduzi wa njia mpya za usafirishaji wa BBB na vipokezi. Tunatarajia kwamba peptidi zilizotambuliwa zinaweza kufungamana moja kwa moja na vipokezi vya mishipa ya ubongo au kwa ligandi zinazozunguka zinazosafirishwa kupitia BBB au BCSFB. Vekta za peptidi zenye shughuli za usafirishaji wa CSF zilizogunduliwa katika kazi hii zitachunguzwa zaidi. Kwa sasa tunachunguza umaalumu wa ubongo wa peptidi hizi kwa uwezo wao wa kuvuka BBB na/au BCSFB. Peptidi hizi mpya zitakuwa zana muhimu sana kwa ugunduzi unaowezekana wa vipokezi au njia mpya na kwa ajili ya ukuzaji wa majukwaa mapya yenye ufanisi mkubwa kwa ajili ya uwasilishaji wa makromolekuli, kama vile biolojia, kwa ubongo.
Piga chungu kwenye kisima kikubwa cha ubongo (CM) kwa kutumia marekebisho ya mbinu iliyoelezwa hapo awali. Panya wa Wistar walio na ganzi (200-350 g) waliwekwa kwenye kifaa cha stereotaxic na mkato wa wastani ulifanywa juu ya kichwa kilichonyolewa na kilichoandaliwa bila kuua vijidudu ili kufichua fuvu. Toboa mashimo mawili katika eneo la ukanda wa juu na funga skrubu za kurekebisha kwenye mashimo. Shimo la ziada lilitobolewa kwenye sehemu ya juu ya oksipitali kwa ajili ya mwongozo wa stereotaxic wa cannula ya chuma cha pua kwenye CM. Paka saruji ya meno kuzunguka cannula na uifunge kwa skrubu. Baada ya kuponywa kwa picha na kuimarishwa kwa saruji, jeraha la ngozi lilifungwa kwa mshono wa 4/0 supramid. Uwekaji sahihi wa cannula unathibitishwa na uvujaji wa ghafla wa maji ya ubongo (CSF). Mtoe panya kutoka kwenye kifaa cha stereotaxic, pata huduma inayofaa baada ya upasuaji na udhibiti wa maumivu, na umruhusu apone kwa angalau wiki moja hadi dalili za damu zionekane kwenye maji ya ubongo. Panya wa Wistar (Crl:WI/Han) walipatikana kutoka Charles River (Ufaransa). Panya wote waliwekwa chini ya hali maalum zisizo na vijidudu. Majaribio yote ya wanyama yaliidhinishwa na Ofisi ya Mifugo ya Jiji la Basel, Uswizi, na yalifanywa kwa mujibu wa Leseni ya Wanyama Nambari 2474 (Tathmini ya Usafirishaji wa Ubongo Amilifu kwa Kupima Viwango vya Wagombea wa Tiba katika Majimaji ya Uti wa Mgongo na Ubongo wa Panya).
Mweke panya katika hali ya tahadhari kwa upole huku kanula ya CM ikiwa mkononi. Ondoa Datura kutoka kwenye kanula na kukusanya µl 10 za maji ya ubongo yanayotiririka yenyewe. Kwa kuwa uwazi wa kanula hatimaye uliathiriwa, ni sampuli za maji ya ubongo zilizo wazi pekee bila ushahidi wa uchafuzi wa damu au kubadilika rangi zilijumuishwa katika utafiti huu. Sambamba na hilo, takriban μl 10-20 za damu zilichukuliwa kutoka kwa mkato mdogo kwenye ncha ya mkia hadi kwenye mirija yenye heparini (Sigma-Aldrich). CSF na damu zilikusanywa katika vipindi tofauti baada ya sindano ya ndani ya mishipa ya phaji ya T7. Takriban μl 5-10 za maji zilitupwa kabla ya kila sampuli ya CSF kukusanywa, ambayo inalingana na ujazo uliokufa wa katheta.
Maktaba zilitengenezwa kwa kutumia vekta ya T7Select 10-3b kama ilivyoelezwa katika mwongozo wa mfumo wa T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Kwa kifupi, kiingilio cha nasibu cha DNA cha 12-mer kilitengenezwa katika umbizo lifuatalo:
Kodoni ya NNK ilitumika kuepuka kodoni mbili zinazosimama na usemi mwingi wa asidi amino kwenye kiingilio. N ni uwiano wa usawa uliochanganywa kwa mkono wa kila nyukleotidi, na K ni uwiano wa usawa uliochanganywa kwa mkono wa adenini na nyukleotidi za saitosini. Maeneo moja yaliyokwama yalibadilishwa kuwa DNA mbili zilizokwama kwa kuingizwa zaidi na dNTP (Novagen) na kimeng'enya cha Klenow (New England Biolabs) katika Klenow buffer (New England Biolabs) kwa saa 3 kwa 37°C. Baada ya mmenyuko, DNA yenye nyuzi mbili ilipatikana kwa mvua ya EtOH. DNA iliyotokana ilimeng'enywa na vimeng'enya vya kizuizi EcoRI na HindIII (vyote kutoka Roche). Kiingilio kilichopasuka na kusafishwa (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) kisha kiliunganishwa ndani ya fremu kwenye vekta ya T7 iliyopasuka kabla baada ya asidi amino 348 ya jeni la kapsidi 10B. Athari za kuunganisha ziliwekwa kwenye 16°C. kwa saa 18 kabla ya kifungashio cha ndani ya vitro. Ufungashaji wa phage ndani ya vitro ulifanywa kulingana na maagizo yaliyotolewa na kifaa cha uundaji wa kloning cha T7Select 10-3b (Novagen) na suluhisho la ufungaji liliongezwa mara moja ili lisike kwa kutumia Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lisaiti ziliwekwa kwenye centrifuge, zikawekwa kwenye tit na kugandishwa kwa -80° C. kama suluhisho la glycerol.
Upanuzi wa moja kwa moja wa PCR wa maeneo yanayobadilika ya phage yaliyopanuliwa katika mchuzi au sahani kwa kutumia primers za kuunganisha za 454/Roche-amplicon. Primers za kuunganisha za mbele zina mfuatano unaozunguka eneo linalobadilika (NNK) 12 (maalum kwa kiolezo), Adapta ya Titanium ya GS FLX A, na mfuatano wa funguo za maktaba zenye besi nne (TCAG) (Mchoro wa Nyongeza 1a):
Kitangulizi cha kuunganisha kinyume pia kina biotini iliyounganishwa kwenye shanga za kunasa na Adapta ya Titanium ya GS FLX B inayohitajika kwa ukuzaji wa kloni wakati wa PCR ya emulsion:
Kisha amplikoni zilifanyiwa upimaji wa 454/Roche kulingana na itifaki ya Titanium ya 454 GS-FLX. Kwa upimaji wa Sanger kwa mikono (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNA ya phaji ya T7 iliongezwa kwa PCR na kupangwa kwa mpangilio na jozi zifuatazo za primer:
Viingizo kutoka kwa plaque za kibinafsi vilifanyiwa upandishaji wa PCR kwa kutumia Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (kulingana na maagizo ya mtengenezaji). Fanya mwanzo wa moto (dakika 10 kwa 95 °C) na mizunguko 35 ya kuongeza nguvu (sekunde 50 kwa 95 °C, dakika 1 kwa 50 °C, na dakika 1 kwa 72 °C).
Faji kutoka maktaba, faji aina ya porini, faji zilizookolewa kutoka kwa CSF na damu, au kloni za kibinafsi ziliongezwa katika Escherichia coli BL5615 katika mchuzi wa TB (Sigma Aldrich) au katika sahani za 500 cm2 (Thermo Scientific) kwa saa 4 kwa joto la 37°C. Faji zilitolewa kutoka kwenye sahani kwa kusuuza sahani kwa kutumia bafa ya Tris-EDTA (Fluka Analytical) au kwa kukusanya bamba kwa ncha za bomba tasa. Faji zilitengwa kutoka kwa supernatant ya kitamaduni au bafa ya uchimbaji kwa kutumia raundi moja ya precipitation ya polyethilini glikoli (PEG 8000) (Promega) na kusimamishwa tena katika bafa ya Tris-EDTA.
Faji iliyopanuliwa ilifanyiwa raundi 2-3 za kuondoa endotoxin kwa kutumia shanga za kuondoa endotoxin (Miltenyi Biotec) kabla ya sindano ya mishipa (IV) (500 μl/mnyama). Katika raundi ya kwanza, faji 2×1012 ziliingizwa; katika raundi ya pili, faji 2×1010; katika raundi ya tatu na ya nne ya uteuzi, faji 2×109 kwa kila mnyama. Kiwango cha faji katika CSF na sampuli za damu zilizokusanywa katika vipindi vilivyoonyeshwa kiliamuliwa kwa kuhesabu jalada kulingana na maagizo ya mtengenezaji (mwongozo wa mfumo wa T7Select). Uteuzi wa faji ulifanywa kwa sindano ya mishipa ya maktaba zilizosafishwa kwenye mshipa wa mkia au kwa kudungwa tena faji iliyotolewa kutoka CSF kutoka raundi ya awali ya uteuzi, na mavuno yaliyofuata yalifanywa kwa dakika 10, dakika 30, dakika 60, dakika 90, dakika 120, dakika 180, na dakika 240 mtawalia. Jumla ya raundi nne za upanuaji wa ndani ya mwili zilifanyika ambapo matawi mawili yaliyochaguliwa yalihifadhiwa na kuchanganuliwa tofauti wakati wa raundi tatu za kwanza za uteuzi. Viingilio vyote vya phaji vilivyotolewa kutoka kwa CSF kutoka raundi mbili za kwanza za uteuzi vilifanyiwa upanuaji wa 454/Roche, huku kloni zote zilizotolewa kutoka kwa CSF kutoka raundi mbili za mwisho za uteuzi zikipangwa kwa mfuatano kwa mikono. Faji zote za damu kutoka raundi ya kwanza ya uteuzi pia zilifanyiwa upanuaji wa 454/Roche. Kwa sindano ya kloni za phaji, faji zilizochaguliwa ziliongezwa katika E. coli (BL5615) kwenye sahani 500 cm2 kwa 37°C kwa saa 4. Kloni zilizochaguliwa kibinafsi na zilizopangwa kwa mikono zilienezwa katika njia ya TB. Baada ya uchimbaji wa phaji, utakaso na kuondolewa kwa endotoxin (kama ilivyoelezwa hapo juu), faji 2×1010/mnyama katika 300 μl ziliingizwa kwa njia ya mishipa kwenye mshipa mmoja wa mkia.
Uchakataji wa awali na uchujaji wa ubora wa data ya mfuatano. Data ghafi ya 454/Roche ilibadilishwa kutoka umbizo la ramani ya mkondo wa kawaida wa binary (sff) hadi umbizo linaloweza kusomwa na binadamu la Pearson (fasta) kwa kutumia programu ya muuzaji. Uchakataji zaidi wa mfuatano wa nyukleotidi ulifanywa kwa kutumia programu na hati za C za kibinafsi (kifurushi cha programu ambacho hakijatolewa) kama ilivyoelezwa hapa chini. Uchambuzi wa data ya msingi unajumuisha taratibu kali za uchujaji wa hatua nyingi. Ili kuchuja usomaji ambao haukuwa na mfuatano halali wa DNA ya kuingiza ya 12mer, usomaji ulipangwa kwa mpangilio wa lebo ya kuanza (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), lebo ya kusimamisha (TAAGCTTGCGGGCGCACTCGAGTA) na kiingilio cha usuli (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) kwa kutumia jaribio la kimataifa la Needleman-Wunsch. mpangilio unaoruhusu hadi kutofautiana 2 kwa kila mpangilio31. Kwa hivyo, usomaji bila lebo za kuanza na kusimamisha na usomaji ulio na viingilio vya usuli, yaani, ulinganifu unaozidi idadi inayoruhusiwa ya kutolingana, uliondolewa kwenye maktaba. Kuhusu usomaji uliobaki, mfuatano wa DNA ya N-mer unaoanzia alama ya mwanzo na kuishia kabla ya alama ya kusimamisha kutolewa kutoka kwa mfuatano wa awali wa usomaji na kusindika zaidi (hapa utajulikana kama "ingiza"). Baada ya kutafsiri kiingilio, sehemu baada ya kodoni ya kwanza ya kusimamisha kwenye ncha ya 5′ ya primer huondolewa kutoka kwa kiingilio. Kwa kuongezea, nyukleotidi zinazoongoza kwa kodoni zisizokamilika kwenye ncha ya 3′ ya primer pia ziliondolewa. Ili kuondoa viingilio vyenye mfuatano wa usuli pekee, viingilio vilivyotafsiriwa vinavyoanza na muundo wa amino asidi "PAG" pia viliondolewa. Peptidi zenye urefu wa baada ya kutafsiri wa chini ya amino asidi 3 ziliondolewa kutoka maktaba. Hatimaye, ondoa upungufu katika bwawa la kuingizwa na ubaini masafa ya kila kiingilio cha kipekee. Matokeo ya uchambuzi huu yalijumuisha orodha ya mfuatano wa nyukleotidi (viingilio) na masafa yao (ya kusoma) (Michoro ya Nyongeza 1c na 2).
Viingizo vya DNA vya Kundi N-mer kwa kufanana kwa mfuatano: Ili kuondoa makosa ya mpangilio maalum wa 454/Roche (kama vile matatizo ya upanuzi wa homopolymer ya mpangilio) na kuondoa upungufu usio muhimu sana, viingizo vya mfuatano wa DNA vya N-mer vilivyochujwa hapo awali (viingizo) hupangwa kwa viingizo vya kufanana. (hadi besi 2 zisizolingana zinaruhusiwa) kwa kutumia algoriti ya kurudia iliyofafanuliwa kama ifuatavyo: viingizo hupangwa kwanza kwa masafa yao (ya juu zaidi hadi ya chini kabisa), na ikiwa ni sawa, kwa mpangilio wao wa pili kwa urefu (mrefu zaidi hadi mfupi zaidi) ). Kwa hivyo, viingizo vya mara kwa mara na virefu zaidi hufafanua "kundi" la kwanza. Masafa ya kikundi yamewekwa kwenye masafa ya ufunguo. Kisha, kila kiingizo kilichobaki kwenye orodha iliyopangwa kilijaribu kuongezwa kwenye kikundi kwa mpangilio wa Needleman-Wunsch kwa jozi. Ikiwa idadi ya kutolingana, viingizo, au ufutaji katika mpangilio haizidi kizingiti cha 2, kiingizo huongezwa kwenye kikundi, na masafa ya jumla ya kikundi huongezeka kwa mara ambayo kiingizo kiliongezwa. Viingizo vilivyoongezwa kwenye kikundi huwekwa alama kama vilivyotumika na kutengwa kutoka kwa usindikaji zaidi. Ikiwa mfuatano wa kuingiza hauwezi kuongezwa kwenye kundi lililopo tayari, mfuatano wa kuingiza hutumika kuunda kundi jipya lenye masafa yanayofaa ya kuingiza na kuwekwa alama kama yametumika. Urudiaji huisha wakati kila mfuatano wa kuingiza umetumika kuunda kundi jipya au unaweza kujumuishwa katika kundi lililopo tayari. Baada ya yote, viingilio vilivyowekwa katika makundi vyenye nyukleotidi hatimaye hutafsiriwa kuwa mfuatano wa peptidi (maktaba ya peptidi). Matokeo ya uchambuzi huu ni seti ya viingilio na masafa yake yanayolingana ambayo yanaunda idadi ya usomaji mfululizo (Mchoro wa Nyongeza 2).
Uzalishaji wa Motif: Kulingana na orodha ya peptidi za kipekee, maktaba iliundwa ikiwa na mifumo yote inayowezekana ya amino asidi (aa) kama inavyoonyeshwa hapa chini. Kila muundo unaowezekana wa urefu wa 3 ulitolewa kutoka kwa peptidi na muundo wake kinyume uliongezwa pamoja na maktaba ya kawaida ya motif iliyo na mifumo yote (tripeptidi). Maktaba za motif zinazojirudia sana zilipangwa kwa mpangilio na urejelezaji uliondolewa. Kisha, kwa kila peptidi kwenye maktaba ya motif, tuliangalia uwepo wake kwenye maktaba kwa kutumia zana za kompyuta. Katika hali hii, masafa ya peptidi iliyo na tripeptidi ya motif iliyopatikana huongezwa na kupewa motif katika maktaba ya motif ("idadi ya motifs"). Matokeo ya uzalishaji wa motif ni safu ya pande mbili iliyo na matukio yote ya tripeptidi (motifs) na thamani zao husika, ambazo ni idadi ya usomaji wa mpangilio unaosababisha motif inayolingana wakati usomaji unachujwa, kupangwa kwa vikundi, na kutafsiriwa. Vipimo kama ilivyoelezwa kwa undani hapo juu.
Urekebishaji wa idadi ya motifu na michoro inayolingana: Idadi ya motifu kwa kila sampuli ilirekebishwa kwa kutumia
ambapo ni ni idadi ya usomaji ulio na mada i. Kwa hivyo, vi inawakilisha masafa ya asilimia ya usomaji (au peptidi) zilizo na motifu i katika sampuli. Thamani za P kwa idadi isiyo ya kawaida ya motifu zilihesabiwa kwa kutumia jaribio halisi la Fisher. Kuhusu ulinganifu wa idadi ya motifu, uhusiano wa Spearman ulihesabiwa kwa kutumia idadi ya kawaida ya motifu na R.
Ili kuibua maudhui ya amino asidi katika kila nafasi katika maktaba ya peptidi, nembo za wavuti 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ziliundwa. Kwanza, maudhui ya amino asidi katika kila nafasi ya peptidi ya 12-mer huhifadhiwa katika matrix ya 20×12. Kisha, seti ya peptidi 1000 zenye kiwango sawa cha amino asidi katika kila nafasi huzalishwa katika umbizo la mfuatano wa haraka na kutolewa kama pembejeo kwa nembo ya wavuti 3, ambayo hutoa uwakilishi wa picha wa kiwango cha amino asidi katika kila nafasi. kwa maktaba fulani ya peptidi. Ili kuibua seti za data zenye vipimo vingi, ramani za joto ziliundwa kwa kutumia zana iliyotengenezwa ndani katika R (biosHeatmap, kifurushi cha R ambacho hakijatolewa). Dendrogramu zilizowasilishwa katika ramani za joto zilihesabiwa kwa kutumia mbinu ya msongamano wa kihierarkia wa Ward kwa kutumia kipimo cha umbali cha Euclidean. Kwa uchanganuzi wa takwimu wa data ya alama za motifu, thamani za P kwa alama zisizo za kawaida zilihesabiwa kwa kutumia jaribio halisi la Fisher. Thamani za P kwa seti zingine za data zilihesabiwa katika R kwa kutumia jaribio la t la Mwanafunzi au ANOVA.
Viungo vilivyochaguliwa vya faji na faji bila viingilio vilidungwa kwa njia ya mishipa kupitia mshipa wa mkia (faji 2×1010/mnyama katika 300 μl PBS). Dakika kumi kabla ya upitishaji na uwekaji uliofuata, wanyama hao hao walidungwa kwa njia ya mishipa na 100 μl ya lectin yenye lebo ya DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Dakika 60 baada ya sindano ya faji, panya walidungwa kupitia moyo na 50 ml PBS ikifuatiwa na 50 ml 4% PFA/PBS. Sampuli za ubongo pia zilirekebishwa usiku kucha katika 4% PFA/PBS na kulowekwa katika 30% sucrose usiku kucha kwa 4°C. Sampuli hugandishwa kwa kasi kwenye mchanganyiko wa OCT. Uchambuzi wa kingamwili wa sampuli zilizogandishwa ulifanywa kwa joto la kawaida kwenye sehemu za cryosection za µm 30 zilizofungwa na 1% BSA na kuwekwa kingamwili zenye lebo ya FITC dhidi ya T7 phage (Novus NB 600-376A) kwa 4 °C. Ingia usiku kucha. Hatimaye, sehemu hizo zilioshwa mara 3 kwa PBS na kuchunguzwa kwa darubini ya leza ya confocal (Leica TCS SP5).
Peptidi zote zenye usafi wa chini wa 98% zilitengenezwa na GenScript USA, zikachanganywa na kibiolojia na kuchanganywa na lyofili. Biotini hufungwa kupitia nafasi ya ziada ya glycine mara tatu kwenye N-terminal. Angalia peptidi zote kwa kutumia spektrometri ya wingi.
Streptavidin (Sigma S0677) ilichanganywa na ziada ya mara 5 ya peptidi ya kibiotinili, peptidi ya kizuizi ya BACE1 iliyo kibiotinili, au mchanganyiko (uwiano wa 3:1) wa peptidi ya kizuizi ya BACE1 iliyo kibiotinili na peptidi ya kizuizi ya BACE1 katika 5–10% DMSO/iliyowekwa kwenye PBS. Saa 1 kwenye joto la kawaida kabla ya sindano. Peptidi zilizounganishwa na Streptavidin zilidungwa kwa njia ya mishipa kwa kipimo cha 10 mg/kg kwenye moja ya mishipa ya mkia ya panya wenye uwazi wa ubongo.
Mkusanyiko wa streptavidin-peptidi tata ulipimwa na ELISA. Sahani za Nunc Maxisorp microtiter (Sigma) zilifunikwa usiku kucha kwa 4°C na antibody ya panya ya 1.5 μg/ml anti-streptavidin (Thermo, MA1-20011). Baada ya kuzuia (kizuizi cha kuzuia: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) kwenye joto la kawaida kwa saa 2, osha sahani na 0.05% Tween-20/PBS (kizuizi cha kuosha) kwa sekunde 3, sampuli za CSF na plasma ziliongezwa kwenye visima vilivyopunguzwa na kizuizi cha kuzuia (plasma 1:10,000, CSF 1:115). Sahani kisha iliwekwa kwenye incubation usiku kucha kwa 4°C na antibody ya kugundua (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Baada ya hatua tatu za kuosha, streptavidin iligunduliwa kwa kuingizwa kwenye mchanganyiko wa substrate ya TMB (Roche) kwa hadi dakika 20. Baada ya kusimamisha ukuaji wa rangi kwa kutumia 1M H2SO4, pima unyonyaji kwa 450 nm.
Kazi ya mchanganyiko wa kizuizi cha streptavidin-peptide-BACE1 ilipimwa na Aβ(1-40) ELISA kulingana na itifaki ya mtengenezaji (Wako, 294-64701). Kwa kifupi, sampuli za CSF zilipunguzwa katika kiyeyusho cha kawaida (1:23) na kuwekwa kwenye incubator usiku kucha kwa 4°C katika sahani za visima 96 zilizofunikwa na kingamwili ya kukamata ya BNT77. Baada ya hatua tano za kuosha, kingamwili ya BA27 iliyounganishwa na HRP iliongezwa na kuwekwa kwenye incubator kwa saa 2 kwa 4°C, ikifuatiwa na hatua tano za kuosha. Aβ(1–40) iligunduliwa kwa kuingizwa kwenye myeyusho wa TMB kwa dakika 30 kwenye joto la kawaida. Baada ya ukuzaji wa rangi kusimamishwa na myeyusho wa kusimamisha, pima unyonyaji kwa 450 nm. Sampuli za plasma zilifanyiwa uchimbaji wa awamu ngumu kabla ya Aβ(1–40) ELISA. Plasma iliongezwa kwa 0.2% DEA (Sigma) katika sahani za visima 96 na kuwekwa kwenye joto la kawaida kwa dakika 30. Baada ya kuosha sahani za SPE mfululizo (Oasis, 186000679) kwa maji na methanoli 100%, sampuli za plasma ziliongezwa kwenye sahani za SPE na kioevu chote kiliondolewa. Sampuli zilioshwa (kwanza na methanoli 5% kisha methanoli 30%) na kuoshwa na methanoli 2% NH4OH/90%. Baada ya kukausha eluate kwa 55°C kwa dakika 99 kwa mkondo wa N2 usiobadilika, sampuli zilipunguzwa katika vimumunyisho vya kawaida na Aβ(1–40) ilipimwa kama ilivyoelezwa hapo juu.
Jinsi ya kunukuu makala haya: Urich, E. et al. Uwasilishaji wa mizigo kwenye ubongo kwa kutumia peptidi za usafirishaji zilizotambuliwa katika mwili. sayansi. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB na Moos T. Uwasilishaji wa dawa za makromolekuli kwenye ubongo kwa kutumia tiba inayolenga. Jarida la Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., na Martinez-Martinez, P. Uwasilishaji wa dawa za peptidi na protini kwenye kizuizi cha damu-ubongo. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Kizuizi cha damu-ubongo: kikwazo katika ukuaji wa dawa za ubongo. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, na Byrd, A. Matarajio ya uwasilishaji bora wa dawa na kulenga ubongo kupitia njia ya koroidi plexus-CSF. Utafiti wa Dawa 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Uboreshaji wa dawa za kibiolojia kwa kutumia farasi wa Trojan wa molekuli kwa ajili ya utoaji wa ubongo. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, usafirishaji wa peptidi unaosimamiwa na kipokezi cha WM kupitia kizuizi cha damu-ubongo. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Ongeza kupenya kwa ubongo na ufanisi wa kingamwili za matibabu kwa kutumia movaloli za monovalent. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Usafirishaji wa kipokezi cha Transferrin (TfR) huamua ufyonzaji wa ubongo wa aina za mshikamano wa kingamwili za TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).