Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Користите верзија на прелистувач со ограничена CSS поддршка. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Дополнително, за да обезбедиме континуирана поддршка, ја прикажуваме страницата без стилови и JavaScript.
Прикажува вртелешка од три слајдови одеднаш. Користете ги копчињата „Претходно“ и „Следно“ за да се движите низ три слајдови одеднаш или користете ги лизгачките копчиња на крајот за да се движите низ три слајдови одеднаш.
Крвно-мозочната бариера и крвно-мозочната бариера ги спречуваат биотерапевтските агенси да ги достигнат своите цели во централниот нервен систем, со што го попречуваат ефикасното лекување на невролошки заболувања. За да откриеме нови транспортери на мозокот in vivo, воведовме библиотека на Т7 фаг пептиди и сериски собравме крв и цереброспинална течност (CSF) користејќи канулиран свесен модел на голем базен на стаорци. Специфичните клонови на фаги беа високо збогатени во CSF по четири рунди на селекција. Тестирањето на поединечни кандидат пептиди откри повеќе од 1000-кратно збогатување во CSF. Биоактивноста на испораката посредувана од пептид до мозокот беше потврдена со 40% намалување на нивото на амилоид-β во цереброспиналната течност користејќи инхибитор на BACE1 пептид поврзан со идентификуваниот нов транзитен пептид. Овие резултати сугерираат дека пептидите идентификувани со методи на селекција на фаги in vivo може да бидат корисни средства за системска испорака на макромолекули до мозокот со терапевтски ефект.
Истражувањата за насочена терапија на централниот нервен систем (ЦНС) во голема мера се фокусираа на идентификување на оптимизирани лекови и агенси кои покажуваат својства насочени кон ЦНС, со помалку напор за откривање на механизмите што го поттикнуваат активното доставување на лекови до мозокот. Ова почнува да се менува сега, бидејќи доставувањето лекови, особено големите молекули, е составен дел од развојот на лекови во современата невронаука. Околината на централниот нервен систем е добро заштитена од цереброваскуларниот бариера систем, кој се состои од крвно-мозочната бариера (КМБ) и крвно-мозочната бариера (КМББ)1, што го отежнува доставувањето лекови до мозокот1,2. Се проценува дека речиси сите лекови со големи молекули и повеќе од 98% од лековите со мали молекули се елиминираат од мозокот3. Затоа е многу важно да се идентификуваат нови системи за транспорт на мозокот кои обезбедуваат ефикасна и специфична достава на терапевтски лекови до ЦНС4,5. Сепак, БМБ и БЦСФБ исто така претставуваат одлична можност за достава на лекови бидејќи тие продираат и влегуваат во сите структури на мозокот преку неговата широка васкулатура. Според тоа, сегашните напори за користење на неинвазивни методи на испорака до мозокот во голема мера се базираат на механизмот на транспорт посредуван од рецептори (PMT) со користење на ендогениот BBB6 рецептор. И покрај неодамнешните клучни достигнувања во користењето на патеката на трансферинскиот рецептор7,8, потребен е понатамошен развој на нови системи за испорака со подобрени својства. За таа цел, нашата цел беше да идентификуваме пептиди способни да посредуваат во транспортот на цереброспиналната течност (CSF), бидејќи тие во принцип би можеле да се користат за испорака на макромолекули до ЦНС или за отворање нови рецепторски патишта. Особено, специфичните рецептори и транспортери на цереброваскуларниот систем (BBB и BSCFB) можат да послужат како потенцијални цели за активна и специфична испорака на биотерапевтски лекови. Цереброспиналната течност (CSF) е секреторен производ на хороидниот плексус (CS) и е во директен контакт со интерстицијалната течност на мозокот преку субарахноидалниот простор и вентрикуларниот простор4. Неодамна е покажано дека субарахноидната цереброспинална течност дифундира прекумерно во интерстициумот на мозокот9. Се надеваме дека ќе пристапиме до паренхимниот простор користејќи го овој субарахноиден приливен тракт или директно преку крвно-мозочната бариера. За да го постигнеме ова, имплементиравме робусна стратегија за селекција на фаги in vivo која идеално ги идентификува пептидите транспортирани преку кој било од овие два различни патишта.
Сега опишуваме метод на секвенцијален скрининг на фажен приказ in vivo со земање примероци од цереброспиналната течност (CSF) заедно со секвенционирање со висок проток (HTS) за да се следат почетните рунди на селекција со највисока разновидност на библиотеката. Скринингот беше извршен на свесни стаорци со трајно имплантирана канула со голема цистерна (CM) за да се избегне контаминација на крвта. Важно е да се напомене дека овој пристап избира и таргетирани кон мозокот и пептиди со транспортна активност низ цереброваскуларната бариера. Користевме T7 фаги поради нивната мала големина (~60 nm)10 и сугериравме дека тие се погодни за транспорт на везикули кои овозможуваат трансцелуларно преминување на ендотелната и/или епително-медуларната бариера. По четири рунди на панинг, популациите на фаги беа изолирани покажувајќи силно збогатување на CSF in vivo и асоцијација на церебрални микросадови. Важно е да се потврди дека бевме во можност да ги потврдиме нашите наоди со демонстрирање дека претпочитаните и хемиски синтетизирани најдобри кандидатски пептиди се способни да транспортираат протеински товар во цереброспиналната течност. Прво, фармакодинамичките ефекти на ЦНС беа утврдени со комбинирање на водечки транзитен пептид со инхибитор на пептидот BACE1. Покрај тоа што покажуваме дека стратегиите за функционален скрининг in vivo можат да идентификуваат нови пептиди за транспорт на мозокот како ефикасни носители на протеински товар, очекуваме слични пристапи за функционална селекција да станат важни и во идентификувањето на нови патишта за транспорт на мозокот.
Врз основа на единици за формирање плаки (PFU), по чекорот на пакување на фагот, беше дизајнирана и создадена библиотека од случајни 12-мерни линеарни T7 фаг пептиди со разновидност од приближно 109 (видете Материјали и методи). Важно е да се напомене дека внимателно ја анализиравме оваа библиотека пред in vivo панинг. PCR амплификацијата на примероци од фаг библиотека со употреба на модифицирани прајмери ​​генерираше ампликони кои беа директно применливи за HTS (Дополнителна слика 1a). Поради а) грешки во секвенционирањето на HTS11, б) влијание врз квалитетот на прајмерите (NNK)1-12 и в) присуството на фаг од див тип (wt) (вметнувања на скелетот) во резервната библиотека, беше имплементирана постапка за филтрирање на секвенци за да се извлечат само потврдени информации за секвенци (Дополнителна слика 1b). Овие чекори на филтрирање се однесуваат на сите HTS библиотеки за секвенционирање. За стандардната библиотека, беа добиени вкупно 233.868 читања, од кои 39% ги поминаа критериумите за филтрирање и беа користени за анализа и селекција на библиотеката за последователни рунди (Дополнителна слика 1c–e). Читањата беа претежно множители од 3 базни парови во должина со врв на 36 нуклеотиди (Дополнителна слика 1c), потврдувајќи го дизајнот на библиотеката (NNK) 1-12. Имено, приближно 11% од членовите на библиотеката содржеа 12-димензионален вметнат PAGISRELVDKL во основата на див тип (wt), а речиси половина од секвенците (49%) содржеа вметнувања или делеции. HTS на библиотеката ја потврди големата разновидност на пептиди во библиотеката: повеќе од 81% од пептидните секвенци беа пронајдени само еднаш и само 1,5% се појавија во ≥4 копии (Дополнителна слика 2a). Фреквенциите на аминокиселините (aa) на сите 12 позиции во репертоарот добро корелираа со очекуваните фреквенции за бројот на кодони генерирани од дегенерираниот NKK репертоар (Дополнителна слика 2b). Набљудуваната фреквенција на aa остатоци кодирани од овие вметнувања добро корелираше со пресметаната фреквенција (r = 0,893) (Дополнителна слика 2c). Подготовката на фаг библиотеките за инјектирање ги вклучува чекорите на амплификација и отстранување на ендотоксин. Претходно е покажано дека ова потенцијално ја намалува разновидноста на фаг библиотеките12,13. Затоа, секвенциониравме фаг библиотека амплифицирана на плоча која била подложена на отстранување на ендотоксин и ја споредивме со оригиналната библиотека за да ја процениме фреквенцијата на AA. Беше забележана силна корелација (r = 0,995) помеѓу оригиналниот базен и амплифицираниот и прочистен базен (Дополнителна слика 2d), што укажува дека конкуренцијата помеѓу клоновите амплифицирани на плочи со употреба на T7 фаг не предизвикала голема пристрасност. Оваа споредба се базира на фреквенцијата на трипептидните мотиви во секоја библиотека, бидејќи разновидноста на библиотеките (~109) не може целосно да се долови дури ни со HTS. Анализата на фреквенцијата на aa на секоја позиција откри мала пристрасност зависна од позицијата во последните три позиции од внесениот репертоар (Дополнителна слика 2e). Како заклучок, заклучивме дека квалитетот и разновидноста на библиотеката се прифатливи и беа забележани само мали промени во разновидноста поради амплификацијата и подготовката на фаг библиотеките помеѓу неколку рунди на селекција.
Сериско земање примероци од цереброспинална течност може да се изврши со хируршко имплантирање на канила во CM на свесни стаорци за да се олесни идентификацијата на T7 фаг инјектиран интравенозно (iv) преку крвно-мозочната бариера и/или BCSFB (Сл. 1a-b). Користевме две независни селективни гранки (гранки А и Б) во првите три рунди на in vivo селекција (Сл. 1c). Постепено ја зголемивме строгоста на селекцијата со намалување на вкупната количина на фаг воведен во првите три рунди на селекција. За четвртата рунда на панинг, комбиниравме примероци од гранките А и Б и извршивме три дополнителни независни селекции. За да ги проучиме in vivo својствата на честичките од T7 фаг во овој модел, фаг од див тип (PAGISRELVDKL главен инсерт) беше инјектиран кај стаорци преку опашката вена. Обновувањето на фагите од цереброспиналната течност и крвта во различни временски точки покажа дека релативно малите T7 икосаедрални фаги имале брза почетна фаза на чистење од крвниот оддел (Дополнителна слика 3). Врз основа на администрираните титри и волуменот на крвта на стаорците, пресметавме дека само приближно 1% теж. Фагот од администрираната доза беше откриен во крвта 10 минути по интравенската инјекција. По ова почетно брзо опаѓање, беше измерен побавен примарен клиренс со полуживот од 27,7 минути. Важно е да се напомене дека само многу малку фаги беа извадени од цереброспиналната течност, што укажува на ниска позадина за миграција на фаги од див тип во цереброспиналната течност (Дополнителна слика 3). Во просек, само околу 1 x 10-3% титри на T7 фаг во крвта и 4 x 10-8% од првично инфузираните фаги беа откриени во цереброспиналната течност во текот на целиот период на земање примероци (0-250 мин). Имено, полуживотот (25,7 мин) на фаг од див тип во цереброспиналната течност беше сличен на оној забележан во крвта. Овие податоци покажуваат дека бариерата што го одделува цереброспиналната течност од крвта е недопрена кај стаорци со CM канулација, овозможувајќи in vivo селекција на библиотеки на фаги за да се идентификуваат клонови кои лесно се транспортираат од крвта во цереброспиналната течност.
(a) Поставување метод за повторно земање примероци од цереброспиналната течност (CSF) од голем базен. (b) Дијаграм што ја прикажува клеточната локација на бариерата на централниот нервен систем (CNS) и стратегијата за селекција што се користи за идентификување на пептиди што ја преминуваат крвно-мозочната бариера (BBB) ​​​​и крвно-мозочната бариера. (c) Дијаграм на тек на скрининг на приказ на фаги in vivo. Во секоја рунда на селекција, фагите (идентификатори на животните во стрелките) беа инјектирани интравенозно. Две независни алтернативни гранки (A, B) се чуваат одделно до 4-тата рунда на селекција. За рундите на селекција 3 и 4, секој клон на фаг извлечен од CSF беше рачно секвенциониран. (d) Кинетика на фаг изолиран од крв (црвени кругови) и цереброспинална течност (зелени триаголници) за време на првата рунда на селекција кај два канулирани стаорци по интравенска инјекција на библиотеката на пептиди T7 (2 x 1012 фаги/животно). Сините квадрати ја означуваат просечната почетна концентрација на фаг во крвта, пресметана од количината на инјектиран фаг, земајќи го предвид вкупниот волумен на крв. Црните квадрати ја означуваат точката на пресек на y линијата екстраполирана од концентрациите на фаги во крвта. (e,f) Претставете ја релативната фреквенција и дистрибуција на сите можни преклопувачки трипептидни мотиви пронајдени во пептидот. Прикажан е бројот на мотиви пронајдени во 1000 отчитувања. Значајно (p < 0,001) збогатените мотиви се означени со црвени точки. (e) Графикон на корелација на расејување што ја споредува релативната фреквенција на трипептидниот мотив на инјектираната библиотека со фаг добиен од крв од животни #1.1 и #1.2. (f) Графикон на корелација на расејување што ги споредува релативните фреквенции на мотивите на трипептидни животински фаг #1.1 и #1.2 изолирани во крв и цереброспинална течност. (g, h) Претставување на ID на секвенцата на фаг збогатен во крв (g) наспроти инјектирани библиотеки и фаг збогатен во цереброспинална течност (h) наспроти крв по круг на in vivo селекција кај двете животни. Големината на кодот од една буква покажува колку често таа аминокиселина се јавува на таа позиција. Зелена = поларна, виолетова = неутрална, сина = базна, црвена = кисела и црна = хидрофобни аминокиселини. Слика 1а, б е дизајнирана и произведена од Едуард Урих.
Инјектиравме библиотека на фажни пептиди во два CM инструментални стаорци (клади А и Б) и изолиравме фаг од цереброспинална течност и крв (Слика 1d). Почетното брзо чистење на библиотеката беше помалку изразено во споредба со фагот од див тип. Просечниот полуживот на инјектираната библиотека кај двете животни беше 24,8 минути во крвта, слично на фагот од див тип, и 38,5 минути во цереброспиналната течност. Примероците од фаг од крв и цереброспинална течност од секое животно беа подложени на HTS и сите идентификувани пептиди беа анализирани за присуство на краток трипептиден мотив. Трипептидните мотиви беа избрани затоа што тие обезбедуваат минимална основа за формирање на структура и интеракции пептид-протеин14,15. Најдовме добра корелација во распределбата на мотивите помеѓу инјектираната библиотека на фаг и клоновите извлечени од крвта на двете животни (Слика 1e). Податоците покажуваат дека составот на библиотеката е само маргинално збогатен во крвниот оддел. Фреквенциите на аминокиселините и консензусните секвенци беа дополнително анализирани на секоја позиција со помош на адаптација на софтверот Weblogo16. Интересно е што откривме силно збогатување на остатоците од глицин во крвта (Сл. 1g). Кога крвта беше споредена со клонови избрани од цереброспинална течност (CSF), беше забележана силна селекција и одредена деселекција на мотиви (Сл. 1f), а одредени аминокиселини беа преференцијално присутни на однапред одредени позиции во 12-члениот елемент (Сл. 1h). Имено, поединечните животни значително се разликуваа во цереброспиналната течност, додека збогатувањето со глицин во крвта беше забележано кај обете животни (Дополнителна слика 4a-j). По строго филтрирање на податоците за секвенцата во цереброспиналната течност на животните #1.1 и #1.2, беа добиени вкупно 964 и 420 уникатни 12-мерни пептиди (Дополнителна слика 1d-e). Изолираните клонови на фаг беа амплифицирани и подложени на втор круг на in vivo селекција. Фагот екстрахиран од вториот круг на селекција беше подложен на HTS кај секое животно и сите идентификувани пептиди беа користени како влез во програма за препознавање мотиви за да се анализира појавата на трипептидни мотиви (Сл. 2a, b, ef). Во споредба со првиот циклус на фагот обновен од цереброспиналната течност (CSF), забележавме понатамошна селекција и деселекција на многу мотиви во CSF во гранките А и Б (Сл. 2). Беше применет алгоритам за идентификација на мрежата за да се утврди дали тие претставуваат различни шеми на конзистентна секвенца. Беше забележана јасна сличност помеѓу 12-димензионалните секвенци обновени од CSF во алтернативната клада А (Сл. 2c, d) и кладата Б (Сл. 2g, h). Здружената анализа во секоја гранка откри различни профили на селекција за 12-мерни пептиди (Дополнителна слика 5c, d) и зголемување на односот титар CSF/крв со текот на времето за здружени клонови по втората рунда на селекција во споредба со првата рунда на селекција (Дополнителна слика 5e).
Збогатување на мотиви и пептиди во цереброспиналната течност со две последователни рунди на селекција на функционален фажен дисплеј in vivo.
Сите фаги од цереброспиналната течност добиени од првата рунда на секое животно (животни бр. 1.1 и бр. 1.2) беа споени, амплифицирани, HT-секвенционирани и повторно инјектирани заедно (2 x 1010 фаги/животно) 2 SM канулирани стаорци (бр. 1.1 → бр.). 2.1 и 2.2, 1.2 → 2.3 и 2.4). (a,b,e,f) Корелациски дијаграми на расејување што ја споредуваат релативната фреквенција на трипептидните мотиви на сите фаги добиени од CSF во првата и втората рунда на селекција. Прикажан е релативната фреквенција и дистрибуција на мотивите што ги претставуваат сите можни преклопувачки трипептиди пронајдени во пептидите во обете ориентации. Прикажан е бројот на мотиви пронајдени во 1000 читања. Мотивите што беа значително (p < 0.001) избрани или исклучени во една од споредените библиотеки се обележани со црвени точки. (c, d, g, h) Претставување на логото на секвенцата на сите секвенци долги од 12 аминокиселини богати со CSF врз основа на рунди 2 и 1 од in vivo селекцијата. Големината на кодот од една буква покажува колку често таа аминокиселина се појавува на таа позиција. За да се претстави логото, се споредува фреквенцијата на секвенците од CSF извлечени од поединечни животни помеѓу две рунди на селекција и се прикажани збогатените секвенци во втората рунда: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 и (h) #1.2–#2.4. Најзбогатените аминокиселини на дадена позиција кај (c, d) животни бр. 2.1 и бр. 2.2 или (g, h) кај животни бр. 2.3 и бр. 2.4 се прикажани во боја. Зелена = поларна, виолетова = неутрална, сина = базна, црвена = кисела и црна = хидрофобни аминокиселини.
По третата рунда на селекција, идентификувавме 124 уникатни пептидни секвенци (бр. 3.1 и бр. 3.2) од 332 клонови на фаг реконституирани во цереброспиналната течност (CSF) изолирани од две животни (Дополнителна слика 6а). Секвенцата LGSVS (18,7%) имаше највисок релативен процент, проследена од инсертите од див тип PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) и SARGSWREIVSLS (2,2%). Во последната четврта рунда, споивме две независно избрани гранки од три одделни животни (Сл. 1в). Од 925 секвенционирани клонови на фаг обновени од CSF, во четвртата рунда пронајдовме 64 уникатни пептидни секвенци (Дополнителна слика 6б), меѓу кои релативниот процент на фаг од див тип се намали на 0,8%. Најчестите клонови на CSF во четвртата рунда беа LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) и RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). Опсегот на должина на избраните пептиди се должи на вметнувања/бришења на нуклеотиди или предвремени стоп кодони во прајмерите на библиотеката при користење на дегенерирани кодони за дизајн на NNK библиотека. Предвремените стоп кодони генерираат пократки пептиди и се избрани затоа што содржат поволен aa мотив. Подолгите пептиди може да произлезат од вметнувања/бришења во прајмерите на синтетичките библиотеки. Ова го позиционира дизајнираниот стоп кодон надвор од рамката и го чита сè додека не се појави нов стоп кодон низводно. Општо земено, ги пресметавме факторите на збогатување за сите четири рунди на селекција со споредување на влезните податоци со излезните податоци од примерокот. За првата рунда на скрининг, користевме титри на фаги од див тип како неспецифична позадинска референца. Интересно е што негативната селекција на фаги беше многу силна во првиот циклус на цереброспиналната течност (CSF), но не и во крвта (Сл. 3а), што може да се должи на малата веројатност за пасивна дифузија на повеќето членови на пептидната библиотека во цереброспиналната течност или релативните фаги имаат тенденција да бидат поефикасно задржани или отстранети од крвотокот отколку бактериофагите. Сепак, во втората рунда на панинг, силна селекција на фаги во CSF беше забележана во двата клада, што сугерира дека претходната рунда беше збогатена со фаги кои прикажуваат пептиди кои го промовираат внесувањето на CSF (Сл. 3а). Повторно, без значително збогатување на крвта. Исто така, во третата и четвртата рунда, клоновите на фаги беа значително збогатени во CSF. Споредувајќи ја релативната фреквенција на секоја единствена пептидна секвенца помеѓу последните две рунди на селекција, откривме дека секвенците беа уште позбогатени во четвртата рунда на селекција (Сл. 3б). Вкупно 931 трипептидни мотиви беа екстрахирани од сите 64 единствени пептидни секвенци користејќи ги обете пептидни ориентации. Најзбогатените мотиви во четвртата рунда беа подетално испитани за нивните профили на збогатување во сите рунди во споредба со инјектираната библиотека (гранична вредност: 10% збогатување) (Дополнителна слика 6в). Општите модели на селекција покажаа дека повеќето од проучуваните мотиви беа збогатени во сите претходни рунди од обете гранки на селекција. Сепак, некои мотиви (на пр. SGL, VSG, LGS GSV) беа претежно од алтернативната клада А, додека други (на пр. FGW, RTN, WGF, NTR) беа збогатени во алтернативната клада Б.
Валидација на транспортот во цереброспиналната течност (CSF) на пептиди прикажани во фаг збогатени со CSF и биотинилирани водечки пептиди конјугирани со носивост на стрептавидин.
(a) Коефициенти на збогатување пресметани во сите четири рунди (R1-R4) врз основа на инјектирани (влез = I) титри на фаг (PFU) и утврдени титри на фаг во цереброспиналната течност (CSF) (излез = O). Факторите на збогатување за последните три рунди (R2-R4) беа пресметани со споредба со претходната рунда и првата рунда (R1) со податоци за тежина. Отворените ленти се цереброспиналната течност, засенчените ленти се плазмата. (***p<0,001, врз основа на Студентовиот t-тест). (b) Список на најзастапени фажни пептиди, рангирани според нивниот релативен сооднос со сите фаги собрани во CSF по 4-та рунда на селекција. Шесте најчести клонови на фаг се обележани со боја, нумерирани и нивните фактори на збогатување помеѓу 3-та и 4-та рунда на селекција (вметни). (c,d) Шесте најзбогатени клонови на фаг, празни фагови и родителски библиотеки на фажни пептиди од 4-та рунда беа анализирани поединечно во модел на земање примероци од CSF. Примероците од CSF и крв беа собрани во наведените временски точки. (в) Еднакви количини од 6 кандидатски клонови на фаг (2 x 1010 фаги/животни), празни фаги (#1779) (2 x 1010 фаги/животни) и основни библиотеки на фаг пептиди (2 x 1012 фаги/животни). Инјектирајте најмалку 3 CM се администрираат на канулираното животно одделно преку опашната вена. Прикажана е фармакокинетиката на цереброспиналната течност (CSF) на секој инјектиран клон на фаг и библиотека на фаг пептиди со текот на времето. (г) го покажува просечниот однос CSF/крв за сите обновени фаги/mL во текот на времето на земање примероци. (д) Четири синтетички водечки пептиди и една измешана контрола беа поврзани со биотин со стрептавидин преку нивниот N-терминал (тетрамер дисплеј) проследено со инјекција (опашна вена iv, 10 mg стрептавидин/kg). Најмалку три интубирани стаорци (N = 3). ). Примероците од цереброспиналната течност (CSF) беа собрани во наведените временски точки, а концентрациите на стрептавидин беа мерени со ELISA анти-стрептавидин во CSF (nd = не е детектирано). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, врз основа на ANOVA тест). (f) Споредба на аминокиселинската секвенца на најзбогатениот клон на фаг пептид #2002 (виолетова) со други избрани клонови на фаг пептид од 4-тиот круг на селекција. Идентичните и слични фрагменти од аминокиселини се кодирани во боја.
Од сите збогатени фаги во четвртата рунда (сл. 3б), шест кандидатски клонови беа избрани за понатамошна индивидуална анализа во моделот на земање примероци од цереброспиналната течност (CSF). Еднакви количини од шест кандидатски фагови, празен фаг (без вметнување) и библиотеки на профаг пептиди беа инјектирани во три канулирани CM животни, а фармакокинетиката беше одредена во тестови во CSF (сл. 3в) и крв (Дополнителна слика 7). Сите тестирани клонови на фаг го таргетираа одделот во CSF на ниво 10-1000 пати повисоко од она на празниот контролен фаг (#1779). На пример, клоновите #2020 и #2077 имаа околу 1000 пати повисоки титри во CSF од контролниот фаг. Фармакокинетичкиот профил на секој избран пептид е различен, но сите тие имаат висока способност за хомирање во CSF. Забележавме постојано намалување со текот на времето за клоновите #1903 и #2011, додека за клоновите #2077, #2002 и #2009 зголемувањето во текот на првите 10 минути може да укажува на активен транспорт, но треба да се потврди. Клоновите #2020, #2002 и #2077 се стабилизираа на високи нивоа, додека концентрацијата во цереброспиналната течност на клонот #2009 полека се намали по почетното зголемување. Потоа ја споредивме релативната фреквенција на секој кандидат за цереброспинална течност со неговата концентрација во крвта (Сл. 3d). Корелацијата на средниот титар на секој кандидат за цереброспинална течност со неговиот титар во крвта во сите времиња на земање примероци покажа дека три од шесте кандидати беа значително збогатени со цереброспинална течност во крвта. Интересно е што клонот #2077 покажа поголема стабилност во крвта (Дополнителна слика 7). За да потврдиме дека самите пептиди се способни активно да транспортираат товар различен од честичките на фагот во одделот на цереброспиналната течност, синтетизиравме четири водечки пептиди дериватизирани со биотин на N-терминалот каде што пептидите се прикачуваат на честичката на фагот. Биотинилираните пептиди (бр. 2002, 2009, 2020 и 2077) беа конјугирани со стрептавидин (SA) за да се добијат мултимерни форми кои донекаде ја имитираат геометријата на фагот. Овој формат ни овозможи и да ја измериме изложеноста на SA во крвта и цереброспиналната течност како протеински пептиди за транспорт на товар. Важно е да се напомене дека податоците за фагот често можеа да се репродуцираат кога синтетичките пептиди беа администрирани во овој SA-конјугиран формат (Сл. 3e). Измешаните пептиди имаа помала почетна изложеност и побрз клиренс во цереброспиналната течност (CSF) со неоткриени нивоа во рок од 48 часа. За да добиеме увид во патиштата на испорака на овие пептидни фажни клонови во просторот на CSF, ја анализиравме локализацијата на индивидуалните погодоци на фажни пептиди користејќи имунохистохемија (IHC) за директно откривање на честички на фаг 1 час по интравенската инјекција in vivo. Имено, клоновите #2002, #2077 и #2009 можеа да се детектираат со силно боење во капиларите на мозокот, додека контролниот фаг (#1779) и клонот #2020 не беа детектирани (Дополнителна слика 8). Ова сугерира дека овие пептиди придонесуваат за ефектот врз мозокот токму со преминување на крвно-мозочната бариера. Потребна е понатамошна детална анализа за да се тестира оваа хипотеза, бидејќи може да биде вклучен и патот на BSCFB. При споредување на аминокиселинската секвенца на најзбогатениот клон (#2002) со други избрани пептиди, беше забележано дека некои од нив имаат слични аминокиселински екстензии, што може да укажува на сличен механизам на транспорт (Сл. 3f).
Поради својот уникатен плазматски профил и значителното зголемување на цереброспиналната течност (CSF) со текот на времето, клонот на фажен дисплеј #2077 беше дополнително истражен во подолг период од 48 часа и беше во можност да го репродуцира брзото зголемување на цереброспиналната течност забележано во врска со одржливи нивоа на SA (Сл. 4а). Во однос на другите идентификувани клонови на фаг, #2077 се обои силно за мозочни капилари и покажа значајна колокализација со капиларниот маркер лектин кога се гледаше со повисока резолуција и евентуално одредено боење во паренхимниот простор (Слика 4б). За да испитаме дали пептидно-посредуваните фармаколошки ефекти можат да се добијат во ЦНС, извршивме експеримент во кој биотинизирани верзии на i) транзитниот пептид #2077 и ii) инхибиторниот пептид на BACE1 беа измешани со SA во два различни соодноси. За едната комбинација го користевме само инхибиторот на пептид BACE1, а за другата користевме сооднос 1:3 на инхибиторот на пептид BACE1 и пептид #2077. И двата примерока беа администрирани интравенозно и нивоата на бета-амилоиден пептид 40 (Abeta40) во крвта и цереброспиналната течност беа мерени со текот на времето. Abeta40 беше измерен во цереброспиналната течност (CSF) бидејќи ја одразува инхибицијата на BACE1 во мозочниот паренхим. Како што се очекуваше, двата комплекса значително ги намалија нивоата на Abeta40 во крвта (Сл. 4c, d). Сепак, само примероците што содржат мешавина од пептид бр. 2077 и инхибитор на BACE1 пептид конјугиран со SA предизвикаа значително намалување на Abeta40 во цереброспиналната течност (Сл. 4c). Податоците покажуваат дека пептидот бр. 2077 е способен да го транспортира протеинот SA од 60 kDa во ЦНС, а исто така предизвикува фармаколошки ефекти со SA-конјугирани инхибитори на BACE1 пептид.
(a) Клонална инјекција (2 × 10 фаги/животно) на T7 фаг што покажува долгорочни фармакокинетски профили на CSF пептид #2077 (RLSSVDSDLSGC) и неинјектиран контролен фаг (#1779) кај најмалку три CM-интубирани стаорци. (b) Конфокална микроскопска слика на репрезентативни кортикални микросадови кај стаорци инјектирани со фаг (2 × 10 10 фаги/животно) што покажува контрабоење на пептид #2077 и крвни садови (лектин). Овие клонови на фаг беа администрирани на 3 стаорци и им беше дозволено да циркулираат 1 час пред перфузија. Мозоците беа пресечени и обоени со поликлонални FITC-обележани антитела против капсидот на T7 фаг. Десет минути пред перфузијата и последователната фиксација, лектин обележан со DyLight594 беше администриран интравенозно. Флуоресцентни слики што прикажуваат лектинско боење (црвена) на луминалната страна на микросадовите и фагите (зелена) во луменот на капиларите и периваскуларното мозочно ткиво. Скалата одговара на 10 µm. (c, d) Биотинилиран BACE1 инхибиторен пептид сам или во комбинација со биотинилиран транзитен пептид #2077 беше поврзан со стрептавидин, проследено со интравенска инјекција на најмалку три канулирани CM стаорци (10 mg стрептавидин/kg). Намалувањето на Aβ40 посредувано од инхибиторот на BACE1 пептид беше измерено со Aβ1-40 ELISA во крв (црвена) и цереброспинална течност (портокалова) во наведените временски точки. За поголема јасност, на графиконот е нацртана испрекината линија на скала од 100%. (c) Процент на намалување на Aβ40 во крвта (црвени триаголници) и цереброспиналната течност (портокалови триаголници) кај стаорци третирани со стрептавидин конјугиран со транзитен пептид #2077 и BACE1 инхибиторен пептид во сооднос 3:1. (d) Процентно намалување на Aβ40 во крвта (црвени кругови) и цереброспинална течност (портокалови кругови) кај стаорци третирани само со стрептавидин поврзан со BACE1 инхибиторен пептид. Концентрацијата на Aβ кај контролата беше 420 pg/ml (стандардна девијација = 101 pg/ml).
Фажниот приказ е успешно применет во неколку области на биомедицински истражувања17. Овој метод е користен за in vivo студии за васкуларна разновидност18,19, како и за студии насочени кон церебрални крвни садови20,21,22,23,24,25,26. Во оваа студија, ја проширивме примената на овој метод на селекција не само на директна идентификација на пептиди насочени кон церебралните крвни садови, туку и на откривање на кандидати со активни транспортни својства за преминување на крвно-мозочната бариера. Сега го опишуваме развојот на in vivo постапка на селекција кај CM интубирани стаорци и го демонстрираме нејзиниот потенцијал за идентификување на пептиди со својства за хомирање во цереброспиналната течност. Користејќи го T7 фагот што прикажува библиотека од 12-мерни случајни пептиди, бевме во можност да покажеме дека T7 фагот е доволно мал (приближно 60 nm во дијаметар)10 за да се прилагоди на крвно-мозочната бариера, со што директно ја преминува крвно-мозочната бариера или хороидниот плексус. Забележавме дека собирањето на цереброспинална течност (CSF) од канулирани CM стаорци е добро контролиран метод на функционален скрининг in vivo и дека екстрахираниот фаг не само што се врзува за васкулатурата, туку функционира и како транспортер низ крвно-мозочната бариера. Понатаму, со истовремено собирање крв и примена на HTS (хидроцефалоцелуларна течност) на CSF и фаги добиени од крв, потврдивме дека нашиот избор на CSF не е под влијание на збогатувањето на крвта или способноста за експанзија помеѓу рундите на селекција. Сепак, крвниот дел е дел од постапката на селекција, бидејќи фагите способни да стигнат до CSF делот мора да преживеат и да циркулираат во крвотокот доволно долго за да се збогатат во мозокот. За да извлечеме сигурни информации за секвенцата од суровите HTS податоци, имплементиравме филтри прилагодени на грешките во секвенционирањето специфични за платформата во работниот тек на анализа. Со вклучување на кинетички параметри во методот на скрининг, ја потврдивме брзата фармакокинетика на T7 фагите од див тип (t½ ~ 28 мин) во крвта24, 27, 28, а исто така го одредивме и нивниот полуживот во цереброспиналната течност (t½ ~ 26 мин) во минута). И покрај сличните фармакокинетски профили во крвта и цереброспиналната течност, само 0,001% од концентрацијата на фаг во крвта може да се открие во цереброспиналната течност, што укажува на ниска подвижност на фагот од див тип Т7 низ крвно-мозочната бариера. Оваа работа ја истакнува важноста на првата рунда на селекција при користење на стратегии за панинг in vivo, особено за фажни системи кои брзо се чистат од циркулацијата, бидејќи малку клонови се во можност да стигнат до ЦНС одделот. Така, во првата рунда, намалувањето на разновидноста на библиотеката беше многу големо, бидејќи само ограничен број клонови на крајот беа собрани во овој многу строг модел на цереброспиналната течност. Оваа стратегија за панинг in vivo вклучуваше неколку чекори на селекција, како што се активна акумулација во цереброспиналната течност, преживување на клоновите во крвниот оддел и брзо отстранување на клоновите на фагот Т7 од крвта во првите 10 минути (Сл. 1d и Дополнителна слика 4M). Така, по првата рунда, различни клонови на фаг беа идентификувани во цереброспиналната течност, иако истиот почетен базен беше користен за поединечни животни. Ова укажува дека повеќекратните строги чекори за селекција за изворни библиотеки со голем број членови на библиотеката резултираат со значително намалување на разновидноста. Затоа, случајните настани ќе станат составен дел од почетниот процес на селекција, во голема мера влијаејќи на резултатот. Веројатно е дека многу од клоновите во оригиналната библиотека имале многу слична склоност кон збогатување на цереброспиналната течност (CSF). Сепак, дури и под исти експериментални услови, резултатите од селекцијата може да се разликуваат поради малиот број на секој конкретен клон во почетниот пул.
Мотивите збогатени во цереброспиналната течност (CSF) се разликуваат од оние во крвта. Интересно е што го забележавме првото поместување кон пептиди богати со глицин во крвта на поединечни животни. (Сл. 1g, Дополнителни слики 4e, 4f). Фагот што содржи глицински пептиди може да биде постабилен и со помала веројатност да се отстрани од циркулацијата. Сепак, овие пептиди богати со глицин не беа откриени во примероците од цереброспиналната течност, што сугерира дека курираните библиотеки поминале низ два различни чекори на селекција: еден во крвта, а друг на кој му е дозволено да се акумулира во цереброспиналната течност. Клоновите збогатени со CSF што произлегуваат од четвртиот круг на селекција се опширно тестирани. Речиси сите индивидуално тестирани клонови беа потврдени дека се збогатени во CSF во споредба со слепиот контролен фаг. Еден хит на пептид (#2077) беше испитан подетално. Тој покажа подолг полуживот во плазмата во споредба со другите хитови (Слика 3d и Дополнителна слика 7), и интересно е што овој пептид содржеше остаток од цистеин на C-терминалот. Неодамна е покажано дека додавањето на цистеин во пептидите може да ги подобри нивните фармакокинетски својства со врзување за албумин 29. Ова моментално е непознато за пептидот #2077 и бара понатамошно проучување. Некои пептиди покажаа валентна зависност во збогатувањето на цереброспиналната течност (податоците не се прикажани), што може да биде поврзано со прикажаната површинска геометрија на капсидот Т7. Системот Т7 што го користевме покажа 5-15 копии од секој пептид по честичка од фаг. IHC беше извршена на кандидатски клонови на водечки фаг инјектирани интравенозно во церебралниот кортекс на стаорци (Дополнителна слика 8). Податоците покажаа дека најмалку три клонови (бр. 2002, бр. 2009 и бр. 2077) комуницирале со крвно-мозочната бариера. Останува да се утврди дали оваа интеракција на крвно-мозочната бариера резултира со акумулација на цереброспинална течност или директно движење на овие клонови во BCSFB. Важно е да покажеме дека избраните пептиди го задржуваат својот капацитет за транспорт во цереброспиналната течност кога се синтетизираат и се врзуваат за протеинскиот товар. Врзувањето на N-терминалните биотинилирани пептиди за SA во суштина ги повторува резултатите добиени со нивните соодветни фажни клонови во крвта и цереброспиналната течност (Сл. 3e). Конечно, покажуваме дека водечкиот пептид #2077 е способен да го промовира мозочното дејство на биотинилираниот пептид инхибитор на BACE1 конјугиран со SA, предизвикувајќи изразени фармакодинамски ефекти во ЦНС со значително намалување на нивоата на Abeta40 во цереброспиналната течност (Сл. 4). Не бевме во можност да идентификуваме хомологи во базата на податоци со извршување на пребарување на хомологија на пептидна секвенца на сите резултати. Важно е да се напомене дека големината на библиотеката T7 е приближно 109, додека теоретската големина на библиотеката за 12-мерни пептиди е 4 x 1015. Затоа, избравме само мал дел од просторот за разновидност на библиотеката на 12-мерни пептиди, што може да значи дека пооптимизирани пептиди можат да се идентификуваат со евалуација на соседниот секвенциски простор на овие идентификувани резултати. Хипотетички, една од причините зошто не сме пронашле никакви природни хомологи на овие пептиди може да биде деселекцијата за време на еволуцијата за да се спречи неконтролирано влегување на одредени пептидни мотиви во мозокот.
Земени заедно, нашите резултати даваат основа за идна работа за подетално идентификување и карактеризирање на транспортните системи на цереброваскуларната бариера in vivo. Основната поставеност на овој метод се базира на стратегија за функционална селекција која не само што идентификува клонови со својства на врзување на цереброваскуларните садови, туку вклучува и критичен чекор во кој успешните клонови имаат интринзична активност за преминување на биолошките бариери in vivo во одделот на ЦНС. Е да се разјасни механизмот на транспорт на овие пептиди и нивната преференција за врзување за микроциркулацијата специфична за мозочниот регион. Ова може да доведе до откривање на нови патишта за транспорт на крвно-мозочната бариера и рецепторите. Очекуваме дека идентификуваните пептиди можат директно да се врзат за цереброваскуларните рецептори или за циркулирачките лиганди транспортирани преку крвно-мозочната бариера или BCSFB. Пептидните вектори со активност на транспорт во цереброспиналната течност откриени во оваа работа ќе бидат дополнително истражени. Моментално ја истражуваме мозочната специфичност на овие пептиди за нивната способност да го преминат крвно-мозочната бариера и/или BCSFB. Овие нови пептиди ќе бидат исклучително вредни алатки за потенцијално откривање на нови рецептори или патишта и за развој на нови високо ефикасни платформи за испорака на макромолекули, како што се биолошките лекови, до мозокот.
Канулирајте ја големата цистерна (ЦМ) користејќи модификација на претходно опишаниот метод. Анестезираните стаорци Вистар (200-350 g) беа монтирани на стереотаксичен апарат и беше направен среден засек над избричениот и асептички подготвен скалп за да се открие черепот. Издупчете две дупки во пределот на горниот појас и зацврстете ги завртките за фиксирање во дупките. Дополнителна дупка беше издупчена во латералниот окципитален гребен за стереотактичко водење на канила од не'рѓосувачки челик во ЦМ. Нанесете забен цемент околу канилата и прицврстете ја со завртки. По фотостврднувањето и стврднувањето со цемент, раната на кожата беше затворена со супрамид 4/0 шев. Правилното поставување на канилата се потврдува со спонтано истекување на цереброспинална течност (ЦМ). Отстранете го стаорецот од стереотаксичниот апарат, добијте соодветна постоперативна нега и справување со болката и оставете го да се опорави најмалку една недела додека не се забележат знаци на крв во цереброспиналната течност. Стаорците Вистар (Crl:WI/Han) беа добиени од Чарлс Ривер (Франција). Сите стаорци биле чувани во специфични услови без патогени. Сите експерименти со животни биле одобрени од Ветеринарната служба на градот Базел, Швајцарија, и биле извршени во согласност со Лиценцата за животни бр. 2474 (Проценка на активниот мозочен транспорт со мерење на нивоата на терапевтски кандидати во цереброспиналната течност и мозокот на стаорец).
Нежно држете го стаорецот свесен со CM канилата во рака. Извадете ја Datura од канилата и соберете 10 µl спонтано течечка цереброспинална течност. Бидејќи проодноста на канилата на крајот беше нарушена, во оваа студија беа вклучени само бистри примероци од цереброспинална течност без докази за контаминација на крв или промена на бојата. Паралелно, приближно 10-20 μl крв беше земена од мал засек на врвот на опашката во епрувети со хепарин (Sigma-Aldrich). Цереброспиналната течност (CSF) и крвта беа собрани во различни временски точки по интравенска инјекција на T7 фаг. Приближно 5-10 μl течност беше фрлена пред да се собере секој примерок од CSF, што одговара на мртвиот волумен на катетерот.
Библиотеките беа генерирани со користење на векторот T7Select 10-3b како што е опишано во упатството за системот T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Накратко, беше синтетизиран случаен 12-мерен ДНК вметнат дел во следниот формат:
NNK кодонот беше употребен за да се избегнат двојни стоп кодони и прекумерна експресија на аминокиселини во вметнатото. N е рачно измешан еквимоларен однос на секој нуклеотид, а K е рачно измешан еквимоларен однос на аденински и цитозински нуклеотиди. Едноверижните региони беа конвертирани во двоверижна ДНК со понатамошна инкубација со dNTP (Novagen) и ензим Klenow (New England Biolabs) во пуфер Klenow (New England Biolabs) 3 часа на 37°C. По реакцијата, двоверижната ДНК беше обновена со таложење на EtOH. Добиената ДНК беше разградена со рестрикциски ензими EcoRI и HindIII (двата од Roche). Раскинатиот и прочистен (QIAquick, Qiagen) вметнат (T4 лигаза, New England Biolabs) потоа беше лигиран во рамка во претходно раскинат T7 вектор по аминокиселината 348 од генот за капсид 10B. Реакциите на лигација беа инкубирани на 16°C 18 часа пред in vitro пакувањето. Пакувањето на фагот in vitro беше извршено според упатствата испорачани со комплетот за клонирање T7Select 10-3b (Novagen) и растворот за пакување беше амплифициран еднаш до лиза со употреба на Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Лизатите беа центрифугирани, титрирани и замрзнати на -80°C како основен раствор на глицерол.
Директна PCR амплификација на варијабилни региони на фаг амплифицирани во супа или плоча со користење на патентирани прајмери ​​за фузија 454/Roche-amplicon. Прајмерот за напредна фузија содржи секвенци што го опкружуваат варијабилниот регион (NNK) 12 (специфичен за шаблонот), GS FLX титаниум адаптер А и секвенца на клучеви од библиотека со четири бази (TCAG) (Дополнителна слика 1а):
Прајмерот за обратна фузија исто така содржи биотин прикачен за заробување на перли и GS FLX титаниум адаптер B потребен за клонска амплификација за време на емулзиска PCR:
Потоа ампликоните беа подложени на пиросеквенционирање 454/Roche според протоколот 454 GS-FLX Titanium. За рачно секвенционирање на Сангер (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ДНК-та на фагот T7 беше амплифицирана со PCR и секвенционирана со следните парови прајмери:
Вметнувањата од поединечни плаки беа подложени на PCR амплификација со помош на комплетот Roche Fast Start DNA Polymerase (според упатствата на производителот). Извршете топол старт (10 мин на 95 °C) и 35 циклуси на засилување (50 s на 95 °C, 1 мин на 50 °C и 1 мин на 72 °C).
Фаг од библиотеки, фаг од див тип, фаг спасен од цереброспинална течност и крв или поединечни клонови беа амплифицирани во Escherichia coli BL5615 во TB супа (Sigma Aldrich) или во садови од 500 cm2 (Thermo Scientific) во тек на 4 часа на 37°C. Фагот беше екстрахиран од плочите со плакнење на плочите со Tris-EDTA пуфер (Fluka Analytical) или со собирање на плаките со стерилни врвови на пипета. Фагот беше изолиран од супернатантот на културата или пуферот за екстракција со една рунда преципитација на полиетилен гликол (PEG 8000) (Promega) и ресуспендиран во Tris-EDTA пуфер.
Амплифицираниот фаг беше подложен на 2-3 рунди на отстранување на ендотоксин со употреба на зрна за отстранување на ендотоксин (Miltenyi Biotec) пред интравенска (IV) инјекција (500 μl/животно). Во првата рунда, беа воведени 2×1012 фаги; во втората, 2×1010 фаги; во третата и четвртата рунда на селекција, 2×109 фаги по животно. Содржината на фаг во цереброспиналната течност (CSF) и примероците од крв собрани во наведените временски точки беше одредена со броење на плаки според упатствата на производителот (прирачник за системот T7Select). Селекцијата на фаг беше извршена со интравенска инјекција на прочистени библиотеки во опашката или со повторна инјекција на фаг екстрахиран од CSF од претходната рунда на селекција, а последователните собирања беа извршени на 10 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 180 мин и 240 мин, соодветно, на примероци од CSF и крв. Вкупно четири рунди на in vivo панинг беа спроведени во кои двете избрани гранки беа одделно складирани и анализирани во текот на првите три рунди на селекција. Сите фажни инсерти екстрахирани од цереброспиналната течност (CSF) од првите два рунди на селекција беа подложени на пиросеквенционирање со 454/Roche, додека сите клонови екстрахирани од CSF од последните два рунди на селекција беа рачно секвенционирани. Сите крвни фаги од првиот круг на селекција беа исто така подложени на пиросеквенционирање со 454/Roche. За инјектирање на фажни клонови, избраните фаги беа амплифицирани во E. coli (BL5615) на плочи од 500 cm2 на 37°C во тек на 4 часа. Индивидуално избраните и рачно секвенционираните клонови беа размножени во TB медиум. По екстракција на фагот, прочистување и отстранување на ендотоксинот (како што е опишано погоре), 2×1010 фаги/животно во 300 μl беа инјектирани интравенозно во една опашка вена.
Претходна обработка и квалитативно филтрирање на податоците за секвенцата. Суровите податоци од 454/Roche беа конвертирани од бинарен стандарден формат на мапа на поток (sff) во формат читлив за луѓе од Pearson (fasta) со користење на софтвер од продавачот. Понатамошната обработка на нуклеотидната секвенца беше извршена со користење на сопствени C програми и скрипти (необјавен софтверски пакет) како што е опишано подолу. Анализата на примарните податоци вклучува строги процедури за филтрирање во повеќе фази. За да се филтрираат читањата што не содржеа валидна 12-мерна ДНК секвенца на вметнување, читањата беа секвенцијално усогласени со почетна етикета (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), стоп етикета (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) и позадинска етикета (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) со користење на глобалниот Needleman-Wunsch тест. Усогласувањето дозволува до 2 недоследности по усогласување31. Затоа, читањата без ознаки за почеток и крај и читањата што содржат позадински вметнувања, т.е. усогласувањата што го надминуваат дозволениот број на несовпаѓања, беа отстранети од библиотеката. Што се однесува до преостанатите читања, N-мерната ДНК секвенца што се протега од почетната ознака и завршува пред стоп ознаката беше отстранета од оригиналната секвенца за читање и понатаму обработена (во понатамошниот текст „вметнување“). По транслацијата на вметнувањето, делот по првиот стоп кодон на 5' крајот на прајмерот е отстранет од вметнувањето. Покрај тоа, нуклеотидите што водат до нецелосни кодони на 3' крајот на прајмерот исто така беа отстранети. За да се исклучат вметнувањата што содржат само позадински секвенци, транслираните вметнувања што започнуваат со аминокиселинскиот модел „PAG“ исто така беа отстранети. Пептидите со пост-транслациона должина помала од 3 аминокиселини беа отстранети од библиотеката. Конечно, отстранете ја вишокот во базенот на вметнувања и одредете ја фреквенцијата на секој уникатен вметнувач. Резултатите од оваа анализа вклучуваа список на нуклеотидни секвенци (вметнувања) и нивните (читачки) фреквенции (Дополнителни слики 1c и 2).
Вметнувања на групна N-мер ДНК според сличноста на секвенцата: За да се елиминираат грешките во секвенционирањето специфични за 454/Roche (како што се проблеми со секвенционирање на хомополимерни екстензии) и да се отстранат помалку важните редундантности, претходно филтрираните вметнувања на секвенца на N-мер ДНК (вметнувања) се сортирани според сличноста. Вметнувања (дозволени се до 2 несовпаѓачки бази) со користење на итеративен алгоритам дефиниран на следниов начин: вметнувањата се сортираат прво според нивната фреквенција (од највисока до најниска), а ако се исти, според нивната секундарна (сортирај по должина (од најдолга до најкратка)). Така, најчестите и најдолгите вметнувања ја дефинираат првата „група“. Фреквенцијата на групата е поставена на клучната фреквенција. Потоа, секое вметнување што останува во сортираната листа се обиде да се додаде во групата со парно порамнување на Нидлман-Вунш. Ако бројот на несовпаѓања, вметнувања или бришења во порамнувањето не надминува праг од 2, се додава вметнување во групата, а вкупната фреквенција на групата се зголемува за тоа колку често е додадено вметнувањето. Вметнувањата додадени во група се означуваат како употребени и се исклучуваат од понатамошна обработка. Ако вметнатата секвенца не може да се додаде на веќе постоечка група, вметнатата секвенца се користи за креирање нова група со соодветна фреквенција на вметнување и се означува како употребена. Итерацијата завршува кога секоја вметната секвенца е искористена за формирање нова група или може да се вклучи во веќе постоечка група. Впрочем, групираните вметнувања што се состојат од нуклеотиди на крајот се преведуваат во пептидни секвенци (пептидни библиотеки). Резултатот од оваа анализа е збир на вметнувања и нивните соодветни фреквенции што го сочинуваат бројот на последователни читања (Дополнителна слика 2).
Генерирање мотив: Врз основа на листа на уникатни пептиди, беше креирана библиотека што ги содржи сите можни шеми на аминокиселини (aa) како што е прикажано подолу. Секој можен шем со должина 3 беше извлечен од пептидот и неговиот инверзен шем беше додаден заедно со заедничка библиотека на мотиви што ги содржи сите шеми (трипептиди). Библиотеките со многу повторувачки мотиви беа секвенционирани и отстранета е редундантноста. Потоа, за секој трипептид во библиотеката на мотиви, проверивме за негово присуство во библиотеката користејќи пресметковни алатки. Во овој случај, фреквенцијата на пептидот што го содржи пронајдениот трипептид на мотив се додава и му се доделува на мотивот во библиотеката на мотиви („број на мотиви“). Резултатот од генерирањето на мотиви е дводимензионален низ што ги содржи сите појавувања на трипептиди (мотиви) и нивните соодветни вредности, кои се бројот на читања на секвенционирање што резултираат со соодветниот мотив кога читањата се филтрираат, групираат и преведуваат. Метрики како што е детално опишано погоре.
Нормализација на бројот на мотиви и соодветните дијаграми на расејување: Бројот на мотиви за секој примерок беше нормализиран со користење на
каде што ni е бројот на читања што ја содржат темата i. Така, vi ја претставува процентната фреквенција на читања (или пептиди) што го содржат мотивот i во примерокот. P-вредностите за ненормализираниот број на мотиви беа пресметани со користење на Фишеровиот точен тест. Во однос на корелограмите на бројот на мотиви, Спирмановите корелации беа пресметани со користење на нормализираниот број на мотиви со R.
За да се визуелизира содржината на аминокиселините на секоја позиција во библиотеката на пептиди, беа креирани веб-логограми 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Прво, содржината на аминокиселините на секоја позиција на 12-мерниот пептид се складира во матрица од 20×12. Потоа, сет од 1000 пептиди што содржат иста релативна содржина на аминокиселини на секоја позиција се генерира во формат fasta-sequence и се доставува како влез во веб-логото 3, кое генерира графички приказ на релативната содржина на аминокиселини на секоја позиција за дадена библиотека на пептиди. За да се визуелизираат повеќедимензионални збирки на податоци, беа креирани топлински мапи со помош на внатрешно развиена алатка во R (biosHeatmap, R пакет што сè уште не е објавен). Дендрограмите презентирани во топлинските мапи беа пресметани со помош на методот на хиерархиско групирање на Вард со метриката на Евклидовото растојание. За статистичка анализа на податоците за бодување на мотиви, P вредностите за ненормализирано бодување беа пресметани со помош на точниот тест на Фишер. P-вредностите за други бази на податоци беа пресметани во R користејќи Студентов t-тест или ANOVA.
Одбрани клонови на фаг и фаги без вметнати делови беа инјектирани интравенозно преку опашката (2×1010 фаги/животно во 300 μl PBS). Десет минути пред перфузијата и последователната фиксација, на истите животни им беа инјектирани интравенозно 100 μl лектин обележан со DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 минути по инјектирањето на фагот, стаорците беа перфузирани низ срцето со 50 ml PBS проследено со 50 ml 4% PFA/PBS. Мозочните примероци беа дополнително фиксирани преку ноќ во 4% PFA/PBS и потопени во 30% сахароза преку ноќ на 4°C. Примероците се замрзнуваат брзо во OCT смесата. Имунохистохемиската анализа на замрзнатите примероци беше извршена на собна температура на криосекции од 30 µm блокирани со 1% BSA и инкубирани со поликлонални FITC-обележани антитела против T7 фаг (Novus NB 600-376A) на 4°C. Инкубирајте преку ноќ. Конечно, деловите беа измиени 3 пати со PBS и испитани со конфокален ласерски микроскоп (Leica TCS SP5).
Сите пептиди со минимална чистота од 98% беа синтетизирани од GenScript USA, биотинилирани и лиофилизирани. Биотинот е врзан преку дополнителен троен глицински дистанцер на N-терминалот. Проверете ги сите пептиди со масена спектрометрија.
Стрептавидин (Sigma S0677) беше измешан со 5-кратно еквимоларен вишок на биотинилиран пептид, биотинилиран BACE1 инхибиторен пептид или комбинација (сооднос 3:1) на биотинилиран BACE1 инхибиторен пептид и BACE1 инхибиторен пептид во 5-10% DMSO/инкубиран во PBS. 1 час на собна температура пред инјектирање. Стрептавидин-конјугирани пептиди беа инјектирани интравенозно во доза од 10 mg/kg во една од опашните вени на стаорци со церебрална празнина.
Концентрацијата на стрептавидин-пептидни комплекси беше оценета со ELISA. Микротитер плочите Nunc Maxisorp (Sigma) беа обложени преку ноќ на 4°C со 1,5 μg/ml глувчешко анти-стрептавидин антитело (Thermo, MA1-20011). По блокирањето (блокирачки пуфер: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% желатин, 1% BSA) на собна температура 2 часа, плочката се изми со 0,05% Tween-20/PBS (пуфер за миење) 3 секунди, примероци од цереброспинална течност (CSF) и плазма беа додадени во бунари разредени со блокирачки пуфер (плазма 1:10.000, CSF 1:115). Плочата потоа беше инкубирана преку ноќ на 4°C со детекциско антитело (1 μg/ml, анти-стрептавидин-HRP, Novus NB120-7239). По три чекори на миење, стрептавидинот беше детектиран со инкубација во раствор на супстрат TMB (Roche) до 20 минути. По запирањето на развојот на бојата со 1M H2SO4, измерете ја апсорпцијата на 450 nm.
Функцијата на комплексот стрептавидин-пептид-BACE1 инхибитор беше оценета со Aβ(1-40) ELISA според протоколот на производителот (Wako, 294-64701). Накратко, примероците од цереброспинална течност беа разредени во стандарден разредувач (1:23) и инкубирани преку ноќ на 4°C во плочи со 96 бунари обложени со антитело за заробување BNT77. По пет чекори на перење, беше додадено HRP-конјугирано BA27 антитело и инкубирано 2 часа на 4°C, по што следеа пет чекори на перење. Aβ(1–40) беше детектирано со инкубација во раствор TMB 30 минути на собна температура. Откако развојот на бојата ќе се запре со раствор за стопирање, измерете ја апсорпцијата на 450 nm. Примероците од плазма беа подложени на екстракција во цврста фаза пред Aβ(1–40) ELISA. Плазмата беше додадена во 0,2% DEA (Sigma) во плочи со 96 бунари и инкубирана на собна температура 30 минути. По последователно миење на SPE плочите (Oasis, 186000679) со вода и 100% метанол, плазма примероците беа додадени на SPE плочите и целата течност беше отстранета. Примероците беа измиени (прво со 5% метанол, а потоа со 30% метанол) и елуирани со 2% NH4OH/90% метанол. По сушењето на елуатот на 55°C во тек на 99 минути при константна струја на N2, примероците беа редуцирани во стандардни разредувачи и Aβ(1–40) беше измерено како што е опишано погоре.
Како да се цитира оваа статија: Урих, Е. и др. Достава на товар до мозокот со употреба на транзитни пептиди идентификувани in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Лихота Ј., Скјоринге Т., Томсен ЛБ и Мус Т. Достава на макромолекуларни лекови во мозокот со употреба на целна терапија. Весник за неврохемија 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Брашњевиќ, И., Штајнбуш, ХВ, Шмиц, К. и Мартинез-Мартинез, П. Достава на пептидни и протеински лекови преку крвно-мозочната бариера. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардриџ, ВМ Крвно-мозочната бариера: тесно грло во развојот на лекови во мозокот. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Јохансон, КЕ, Данкан, ЈА, Стопа, ЕГ и Берд, А. Перспективи за подобрена испорака на лекови и насочување кон мозокот преку патеката хороиден плексус-цереброспинална течност. Фармацевтски истражувања 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардриџ, ВМ Модернизација на биофармацевтски производи со молекуларни тројански коњи за испорака во мозокот. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардриџ, WM рецепторски посредуван пептиден транспорт низ крвно-мозочната бариера. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Зголемување на пенетрацијата во мозокот и ефикасноста на терапевтските антитела со употреба на моновалентни молекуларни шатлови. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Транспортот на трансферинскиот рецептор (TfR) го одредува внесувањето на афинитетните варијанти на TfR антителата во мозокот. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).