Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie brauseriversioon toetab piiratud CSS-i. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada ajakohast brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiimi). Lisaks kuvame saiti pideva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Kuvab korraga kolmest slaidist koosneva karusselli. Kolme slaidi korraga läbimiseks kasutage nuppe Eelmine ja Järgmine või kolme slaidi korraga läbimiseks lõpus olevaid liuguri nuppe.
Hematoentsefaalbarjäär ja hematoentsefaalbarjäär takistavad bioterapeutilistel ainetel kesknärvisüsteemis oma sihtmärkideni jõudmist, takistades seeläbi neuroloogiliste haiguste tõhusat ravi. Uute ajutransporterite avastamiseks in vivo tutvustasime T7 faagipeptiidide teeki ja kogusime järjestikku verd ja tserebrospinaalvedelikku (CSF), kasutades kanüülitud teadvusel olevat suurt rottide mudelit. Spetsiifilised faagikloonid olid pärast nelja valikuvooru CSF-is väga rikastatud. Individuaalsete kandidaatpeptiidide testimine näitas CSF-is enam kui 1000-kordset rikastumist. Peptiidi vahendatud ajju manustamise bioaktiivsust kinnitas amüloid-β taseme 40% vähenemine tserebrospinaalvedelikus, kasutades tuvastatud uudse transiitpeptiidiga seotud BACE1 peptiidi inhibiitorit. Need tulemused viitavad sellele, et in vivo faagiselektsioonimeetoditega tuvastatud peptiidid võivad olla kasulikud vehiikulid makromolekulide süsteemseks manustamiseks ajju terapeutilise toimega.
Kesknärvisüsteemi (KNS) sihipärase ravi uuringud on suures osas keskendunud optimeeritud ravimite ja ainete leidmisele, millel on KNS-i sihtivad omadused, väiksema vaevaga ajju aktiivse ravimite kohaletoimetamise mehhanismide avastamisele. See hakkab nüüd muutuma, kuna ravimite, eriti suurte molekulide manustamine on tänapäevase neuroteaduse ravimiarenduse lahutamatu osa. Kesknärvisüsteemi keskkond on hästi kaitstud tserebrovaskulaarse barjäärisüsteemiga, mis koosneb hematoentsefaalbarjäärist (BBB) ​​​​ja hematoentsefaalbarjäärist (BCBB)1, mistõttu on ravimite ajju toimetamine keeruline1,2. Hinnanguliselt elimineeritakse ajust peaaegu kõik suurmolekulaarsed ravimid ja üle 98% väikemolekulilistest ravimitest3. Seetõttu on väga oluline leida uusi aju transpordisüsteeme, mis tagavad terapeutiliste ravimite tõhusa ja spetsiifilise kohaletoimetamise KNS-i4,5. Samas pakuvad BBB ja BCSFB ka suurepärast võimalust ravimite kohaletoimetamiseks, kuna nad tungivad läbi ulatusliku veresoonkonna kõikidesse aju struktuuridesse ja sisenevad nendesse. Seega põhinevad praegused pingutused mitte-invasiivsete aju manustamise meetodite kasutamiseks suuresti retseptorvahendatud transpordi (PMT) mehhanismil, mis kasutab endogeenset BBB6 retseptorit. Vaatamata hiljutistele olulistele edusammudele transferriini retseptori raja kasutamisel7,8 on vaja edasi arendada uusi, paremate omadustega manustamissüsteeme. Sel eesmärgil oli meie eesmärk tuvastada peptiide, mis on võimelised vahendama tserebrospinaalvedelikku (CS) transporti, kuna neid saaks põhimõtteliselt kasutada makromolekulide toimetamiseks kesknärvisüsteemi või uute retseptorradade avamiseks. Eelkõige võivad tserebrovaskulaarsüsteemi spetsiifilised retseptorid ja transporterid (BBB ja BSCFB) olla potentsiaalseteks sihtmärkideks bioterapeutiliste ravimite aktiivseks ja spetsiifiliseks manustamiseks. Tserebrospinaalvedelik (CS) on koroidpõimiku (CS) sekretoorne produkt ja on otseses kontaktis aju interstitsiaalse vedelikuga läbi subarahnoidaalse ruumi ja vatsakeste ruumi4. Hiljuti on näidatud, et subarahnoidaalne tserebrospinaalvedelik difundeerub liigselt aju interstitsiumi9. Loodame parenhüümiruumi pääseda selle subarahnoidaalse sissevoolutee kaudu või otse läbi BBB. Selle saavutamiseks rakendasime robustse in vivo faagivaliku strateegia, mis ideaalis tuvastab peptiidid, mida transporditakse ükskõik kumma kahe erineva raja kaudu.
Kirjeldame nüüd järjestikust in vivo faagi kuvamise sõelumismeetodit, mis hõlmab tserebrospinaalvedelikus (CSF) proovide võtmist koos suure läbilaskevõimega sekveneerimisega (HTS), et jälgida esialgseid valikuringe suurima raamatukogu mitmekesisusega. Sõelumine viidi läbi teadvusel rottidel, kellele oli püsivalt implanteeritud suur tsisterna (CM) kanüül, et vältida vere saastumist. Oluline on see, et see lähenemisviis selekteerib nii aju sihtivaid kui ka peptiide, millel on transpordiaktiivsus läbi tserebrovaskulaarse barjääri. Kasutasime T7 faage nende väikese suuruse (~60 nm)10 tõttu ja pakkusime välja, et need sobivad vesiikulite transpordiks, mis võimaldavad endoteeli ja/või epiteeli-medulla barjääri transtsellulaarset ületamist. Pärast nelja sõelumisringi eraldati faagipopulatsioonid, mis näitasid tugevat in vivo CSF ​​rikastumist ja aju mikroveresoonte seost. Oluline on see, et suutsime oma tulemusi kinnitada, näidates, et eelistatud ja keemiliselt sünteesitud parimad kandidaatpeptiidid on võimelised transportima valgulasti tserebrospinaalvedelikku. Esiteks tehti kindlaks KNS-i farmakodünaamilised toimed, kombineerides juhtivat transiitpeptiidi BACE1 peptiidi inhibiitoriga. Lisaks sellele, et in vivo funktsionaalsed sõelumisstrateegiad suudavad tuvastada uudseid aju transpordipeptiide efektiivsete valgulastikandjatena, eeldame, et sarnased funktsionaalse valiku lähenemisviisid muutuvad oluliseks ka uute aju transpordiradade tuvastamisel.
Pärast faagi pakkimisetappi kavandati ja loodi naastu moodustavate ühikute (PFU) põhjal juhuslike 12-meersete lineaarsete T7 faagipeptiidide teek, mille mitmekesisus on ligikaudu 109 (vt Materjalid ja meetodid). Oluline on märkida, et enne in vivo panoraamimist analüüsisime seda teeki hoolikalt. Faagiteegi proovide PCR-amplifikatsioon modifitseeritud praimerite abil genereeris amplikone, mis olid otseselt HTS-ile rakendatavad (lisajoonis 1a). Tulenevalt a) HTS11 sekveneerimisvigadest, b) praimerite (NNK) 1-12 kvaliteedile avalduvast mõjust ja c) metsiktüüpi (wt) faagi (skeleti insertide) olemasolust ooterežiimis olevas teekis rakendati järjestuse filtreerimise protseduuri, et eraldada ainult kontrollitud järjestuse teave (lisajoonis 1b). Need filtreerimisetapid kehtivad kõigile HTS sekveneerimisteekidele. Standardteegi puhul saadi kokku 233 868 lugemist, millest 39% läbis filtreerimiskriteeriumid ja neid kasutati teeki analüüsimiseks ja valikuks järgnevateks voorudeks (lisajoonis 1c–e). Lugemised olid valdavalt 3 aluspaari pikkused kordsed, piigiga 36 nukleotiidi juures (lisajoonis 1c), mis kinnitas raamatukogu disaini (NNK) 1-12. Märkimisväärselt sisaldas ligikaudu 11% raamatukogu liikmetest 12-mõõtmelist metsiktüüpi (wt) selgroo PAGISRELVDKL inserti ja peaaegu pooled järjestustest (49%) sisaldasid insertsioone või deletsioone. Raamatukogu raamatukogu HTS kinnitas peptiidide suurt mitmekesisust raamatukogus: enam kui 81% peptiidjärjestustest leiti ainult üks kord ja ainult 1,5% esines ≥4 koopiana (lisajoonis 2a). Aminohapete (aa) sagedused repertuaari kõigis 12 positsioonis korreleerusid hästi degenereerunud NKK repertuaari poolt genereeritud koodonite arvu eeldatavate sagedustega (lisajoonis 2b). Nende insertide poolt kodeeritud aminohappejääkide täheldatud sagedus korreleerus hästi arvutatud sagedusega (r = 0,893) (lisajoonis 2c). Faagiraamatukogude ettevalmistamine süstimiseks hõlmab endotoksiini amplifikatsiooni ja eemaldamise etappe. Varem on näidatud, et see võib potentsiaalselt vähendada faagiraamatukogude mitmekesisust12,13. Seetõttu sekveneerisime plaadil amplifitseeritud faagiraamatukogu, millest oli eemaldatud endotoksiin, ja võrdlesime seda algse raamatukoguga, et hinnata aminohapete sagedust. Algse ja amplifitseeritud ning puhastatud kogumi vahel täheldati tugevat korrelatsiooni (r = 0,995) (lisajoonis 2d), mis näitab, et T7 faagi abil plaatidel amplifitseeritud kloonide vaheline konkurents ei põhjustanud olulist eelarvamust. See võrdlus põhineb tripeptiidmotiivide sagedusel igas raamatukogus, kuna raamatukogude mitmekesisust (~109) ei saa isegi HTS-iga täielikult tabada. Aminohapete sagedusanalüüs igas positsioonis näitas väikest positsioonist sõltuvat eelarvamust sisestatud repertuaari kolmes viimases positsioonis (lisajoonis 2e). Kokkuvõtteks jõudsime järeldusele, et raamatukogu kvaliteet ja mitmekesisus olid vastuvõetavad ning faagiraamatukogude amplifikatsiooni ja ettevalmistamise tõttu mitme valikuvooru vahel täheldati mitmekesisuses vaid väikeseid muutusi.
Tserebrospinaalvedeliku järjestikuste proovide võtmist saab teha teadvusel rottide tserebrospinaalvedelikku kirurgiliselt implanteerides kanüüli, et hõlbustada intravenoosselt (iv) BBB ja/või BCSFB kaudu süstitud T7 faagi tuvastamist (joonis 1a-b). In vivo selektsiooni esimeses kolmes voorus kasutasime kahte sõltumatut selektsiooniharu (harud A ja B) (joonis 1c). Suurendasime järk-järgult selektsiooni rangust, vähendades esimeses kolmes selektsioonivoorus sisse viidud faagi koguhulka. Neljandas panninguvoorus ühendasime harude A ja B proovid ning teostasime kolm täiendavat sõltumatut selektsiooni. T7 faagiosakeste in vivo omaduste uurimiseks selles mudelis süstiti rottidele sabaveeni kaudu metsiktüüpi faagi (PAGISRELVDKL master insert). Faagide eraldamine tserebrospinaalvedelikust ja verest erinevatel ajahetkedel näitas, et suhteliselt väikestel T7 ikosaeedrilistel faagidel oli kiire esialgne kliirensifaas verekambrist (lisajoonis 3). Manustatud tiitrite ja rottide veremahu põhjal arvutasime, et 10 minutit pärast intravenoosset süstimist tuvastati veres vaid umbes 1% manustatud annusest faagist. Pärast seda esialgset kiiret langust mõõdeti aeglasemat primaarset kliirensit poolväärtusajaga 27,7 minutit. Oluline on see, et tserebrospinaalvedelikust leiti vaid väga vähe faage, mis näitab metsiktüüpi faagi migratsiooni madalat tausta tserebrospinaalvedelikku (lisajoonis 3). Keskmiselt tuvastati kogu proovivõtuperioodi (0–250 min) jooksul veres vaid umbes 1 x 10-3% T7 faagi tiitreid ja 4 x 10-8% esialgselt infundeeritud faagidest tserebrospinaalvedelikus. Märkimisväärne on see, et metsiktüüpi faagi poolväärtusaeg (25,7 min) tserebrospinaalvedelikus oli sarnane veres täheldatuga. Need andmed näitavad, et CM-kanüülitud rottidel on tserebrospinaalvedeliku sektsiooni verest eraldav barjäär terve, mis võimaldab faagiraamatukogude in vivo selekteerimist, et tuvastada kloone, mis transporditakse verest tserebrospinaalvedeliku sektsiooni kergesti.
(a) Meetodi loomine tserebrospinaalvedeliku (CSF) uuesti proovivõtmiseks suurest kogusest. (b) Diagramm, mis näitab kesknärvisüsteemi (KNS) barjääri rakulist asukohta ja selektsioonistrateegiat, mida kasutatakse hematoentsefaalbarjääri (BBB) ​​ja hematoentsefaalbarjääri läbivate peptiidide tuvastamiseks. (c) In vivo faagi kuvamise skriiningu vooskeem. Igas selektsioonivoorus süstiti faagid (noolte sees olevad loomade identifikaatorid) intravenoosselt. Kaks sõltumatut alternatiivset haru (A, B) hoiti eraldi kuni 4. selektsioonivooruni. 3. ja 4. selektsioonivooru jaoks sekveneeriti iga CSF-ist ekstraheeritud faagi kloon käsitsi. (d) Verest (punased ringid) ja tserebrospinaalvedelikust (rohelised kolmnurgad) eraldatud faagi kineetika esimese selektsioonivooru ajal kahel kanüülitud rotil pärast T7 peptiiditeegi intravenoosset süstimist (2 x 1012 faagi/loom). Sinised ruudud näitavad faagi keskmist algkontsentratsiooni veres, mis on arvutatud süstitud faagi koguse põhjal, võttes arvesse vere kogumahtu. Mustad ruudud näitavad vere faagikontsentratsioonidest ekstrapoleeritud y-joone lõikepunkti. (e, f) Esitage peptiidis leiduvate kõigi võimalike kattuvate tripeptiidmotiivide suhteline sagedus ja jaotus. Näidatud on 1000 näidu põhjal leitud motiivide arv. Oluliselt (p < 0,001) rikastatud motiivid on tähistatud punaste täppidega. (e) Korrelatsiooni hajuvusdiagramm, mis võrdleb süstitud raamatukogu tripeptiidmotiivi suhtelist sagedust loomadelt nr 1.1 ja nr 1.2 saadud verest saadud faagiga. (f) Korrelatsiooni hajuvusdiagramm, mis võrdleb veres ja tserebrospinaalvedelikus eraldatud loomsete faagide tripeptiidmotiivide nr 1.1 ja nr 1.2 suhtelisi sagedusi. (g, h) Veres rikastatud faagi (g) ja süstitud raamatukogude ning tserebrospinaalvedelikus rikastatud faagi (h) ja vere järjestuse ID esitus pärast in vivo selektsiooni vooru mõlemas loomas. Ühetähelise koodi suurus näitab, kui sageli see aminohape selles positsioonis esineb. Roheline = polaarne, lilla = neutraalne, sinine = aluseline, punane = happeline ja must = hüdrofoobsed aminohapped. Joonise 1a, b kujundas ja valmistas Eduard Urich.
Süstisime faagipeptiidi teeki kahele CM instrumentrotile (kladid A ja B) ning isoleerisime faagi tserebrospinaalvedelikust ja verest (joonis 1d). Teegi esialgne kiire kliirens oli metsiktüüpi faagiga võrreldes vähem väljendunud. Süstitud teeki keskmine poolväärtusaeg mõlemal loomal oli veres 24,8 minutit, mis oli sarnane metsiktüüpi faagiga, ja tserebrospinaalvedelikus 38,5 minutit. Mõlema looma vere- ja tserebrospinaalvedeliku faagiproovid allutati HTS-ile ja kõiki tuvastatud peptiide analüüsiti lühikese tripeptiidimotiivi olemasolu suhtes. Tripeptiidimotiivid valiti seetõttu, et need pakuvad minimaalset alust struktuuri moodustumiseks ja peptiid-valk interaktsioonideks14,15. Leidsime hea korrelatsiooni motiivide jaotuses süstitud faagiteegi ja mõlema looma verest ekstraheeritud kloonide vahel (joonis 1e). Andmed näitavad, et teeki koostis on verekambris vaid marginaalselt rikastatud. Aminohapete sagedusi ja konsensusjärjestusi analüüsiti igas positsioonis edasi, kasutades Weblogo16 tarkvara kohandust. Huvitaval kombel leidsime vere glütsiinijääkides tugeva rikastumise (joonis 1g). Kui verd võrreldi tserebrospinaalvedelikust valitud kloonidega, täheldati motiivide tugevat selektsiooni ja mõningast valiku puudumist (joonis 1f) ning teatud aminohapped esinesid eelistatavalt 12-liikmelise struktuuri etteantud positsioonidel (joonis 1h). Märkimisväärselt erinesid üksikud loomad tserebrospinaalvedeliku poolest oluliselt, samas kui vere glütsiini rikastumist täheldati mõlemal loomal (lisajoonis 4a–j). Pärast loomade nr 1.1 ja nr 1.2 tserebrospinaalvedeliku järjestusandmete ranget filtreerimist saadi kokku 964 ja 420 unikaalset 12-meerset peptiidi (lisajoonis 1d–e). Isoleeritud faagikloonid amplifitseeriti ja allutati teisele in vivo selektsioonivoorule. Teisest selektsioonivoorust ekstraheeritud faagid allutati iga looma puhul HTS-ile ja kõiki tuvastatud peptiide kasutati motiivide tuvastamise programmi sisendina, et analüüsida tripeptiidimotiivide esinemist (joonis 2a, b, ef). Võrreldes tserebrospinaalvedelikust (CSF) eraldatud faagi esimese tsükliga täheldasime CSF-is harudes A ja B paljude motiivide edasist selektsiooni ja selektsiooni puudumist (joonis 2). Võrgu identifitseerimise algoritmi rakendati, et teha kindlaks, kas need esindavad järjepideva järjestuse erinevaid mustreid. Alternatiivses klaadis A (joonis 2c, d) ja klaadis B (joonis 2g, h) CSF-iga eraldatud 12-mõõtmeliste järjestuste vahel täheldati selget sarnasust. Iga haru koondanalüüs näitas 12-meersete peptiidide erinevaid selektsiooniprofiile (lisajoonis 5c, d) ja CSF/vere tiitri suhte suurenemist aja jooksul koondatud kloonide puhul pärast teist selektsioonivooru võrreldes esimese selektsioonivooruga (lisajoonis 5e).
Motiivide ja peptiidide rikastamine tserebrospinaalvedelikus kahe järjestikuse in vivo funktsionaalse faagi kuvamise selektsiooni vooru abil.
Kõikide loomade (loomad nr 1.1 ja nr 1.2) esimesest voorust eraldatud tserebrospinaalvedeliku faagid ühendati, amplifitseeriti, HT-sekveneeriti ja süstiti koos uuesti (2 x 1010 faagi/loom) 2 SM kanüülitud rotile (#1.1 → #). 2.1 ja 2.2, 1.2 → 2.3 ja 2.4). (a, b, e, f) Korrelatsiooni hajuvusdiagrammid, mis võrdlevad kõigi tserebrospinaalvedelikust saadud faagide tripeptiidimotiivide suhtelist sagedust esimeses ja teises valikuvoorus. Motiivide suhteline sagedus ja jaotus, mis esindavad kõiki võimalikke kattuvaid tripeptiide, mida leidub peptiidides mõlemas orientatsioonis. Näidatud on 1000 lugemisel leitud motiivide arv. Punaste punktidega on esile tõstetud motiivid, mis olid ühes võrreldud raamatukogus oluliselt (p < 0,001) valitud või välistatud. (c, d, g, h) Järjestuse logo esitus kõikidest CSF-rikastest 12 aminohappe pikkustest järjestustest, mis põhinevad in vivo selektsiooni 2. ja 1. voorul. Ühetähelise koodi suurus näitab, kui sageli see aminohape selles positsioonis esineb. Logo esitamiseks võrreldakse üksikutelt loomadelt kahe selektsioonivooru vahel ekstraheeritud CSF-järjestuste sagedust ja näidatakse teise vooru rikastatud järjestusi: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ja (h) #1.2–#2.4. Värviliselt on näidatud loomade nr 2.1 ja nr 2.2 (c, d) või loomade nr 2.3 ja nr 2.4 (g, h) antud positsioonil kõige rikastatud aminohapped. Roheline = polaarne, lilla = neutraalne, sinine = aluseline, punane = happeline ja must = hüdrofoobsed aminohapped.
Pärast kolmandat valikuvooru tuvastasime kahelt loomalt eraldatud 332 CSF-is taastatud faagikloonist 124 unikaalset peptiidjärjestust (#3.1 ja #3.2) (lisajoonis 6a). Järjestusel LGSVS (18,7%) oli suurim suhteline osakaal, millele järgnesid metsiktüüpi insertid PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) ja SARGSWREIVSLS (2,2%). Viimases neljandas voorus ühendasime kaks sõltumatult valitud haru kolmelt eraldi loomalt (joonis 1c). CSF-ist eraldatud 925 sekveneeritud faagikloonist leidsime neljandas voorus 64 unikaalset peptiidjärjestust (lisajoonis 6b), mille hulgas metsiktüüpi faagi suhteline osakaal langes 0,8%-ni. Neljandas voorus olid kõige levinumad CSF-kloonid LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) ja RLSSVDSDLSGC (3,2%). Valitud peptiidide pikkusvahemik tuleneb nukleotiidide insertsioonidest/deletsioonidest või enneaegsetest stoppkoodonitest teeki praimerites, kui NNK teeki disainimisel kasutatakse degenereerunud koodoneid. Enneaegsed stoppkoodonid genereerivad lühemaid peptiide ja valitakse seetõttu, et need sisaldavad soodsat aminohappemotiivi. Pikemad peptiidid võivad tuleneda sünteetiliste teekide praimerite insertsioonidest/deletsioonidest. See asetab disainitud stoppkoodoni raamist väljapoole ja loeb seda, kuni uus stoppkoodon ilmub allavoolu. Üldiselt arvutasime kõigi nelja valikuvooru rikastustegurid, võrreldes sisendandmeid valimi väljundandmetega. Esimeses sõelumisvoorus kasutasime metsiktüüpi faagi tiitreid mittespetsiifilise taustavõrdlusena. Huvitaval kombel oli negatiivsete faagide selektsioon esimeses tserebrospinaalvedeliku tsüklis väga tugev, kuid mitte veres (joonis 3a), mis võib olla tingitud enamiku peptiiditeegi liikmete passiivse difusiooni väikesest tõenäosusest tserebrospinaalvedeliku sektsiooni või kipuvad suhtelised faagid vereringesse tõhusamalt kinni jääma või sealt eemaldatama kui bakteriofaagid. Teises sõelumisvoorus täheldati aga mõlemas klaadis tugevat faagide selektsiooni tserebrospinaalvedelikus, mis viitab sellele, et eelmine voor oli rikastatud faagidega, mis eksponeerisid peptiide, mis soodustavad tserebrospinaalvedeliku omastamist (joonis 3a). Jällegi, ilma olulise vere rikastumata. Ka kolmandas ja neljandas voorus olid faagikloonid tserebrospinaalvedelikus oluliselt rikastatud. Võrreldes iga unikaalse peptiidjärjestuse suhtelist sagedust kahe viimase selektsioonivooru vahel, leidsime, et järjestused olid neljandas selektsioonivoorus veelgi rikastatud (joonis 3b). Kõigist 64 unikaalsest peptiidjärjestusest ekstraheeriti kokku 931 tripeptiidimotiivi, kasutades mõlemat peptiidi orientatsiooni. Neljanda vooru enim rikastatud motiive uuriti lähemalt nende rikastusprofiilide osas kõigis voorudes võrreldes süstitud teekiga (piirväärtus: 10% rikastus) (lisajoonis 6c). Üldised valikumustrid näitasid, et enamik uuritud motiive oli rikastatud mõlema valikuharu kõigis eelnevates voorudes. Mõned motiivid (nt SGL, VSG, LGS GSV) pärinesid aga valdavalt alternatiivsest klaadist A, teised (nt FGW, RTN, WGF, NTR) aga alternatiivses klaadis B.
CSF-rikastatud faagiga kuvatud peptiidide ja streptavidiini kasuliku koormusega konjugeeritud biotinüleeritud juhtpeptiidide CSF-transpordi valideerimine.
(a) Rikastussuhted, mis arvutati kõigis neljas voorus (R1-R4) süstitud (sisend = I) faagi (PFU) tiitrite ja määratud tserebrospinaalvedeliku (CSF) faagi tiitrite (väljund = O) põhjal. Viimase kolme vooru (R2-R4) rikastustegurid arvutati võrreldes eelmise vooru ja esimese vooruga (R1) kaaluandmetega. Tühjad tulbad on tserebrospinaalvedelik, varjutatud tulbad on plasma. (***p<0,001, põhineb Studendi t-testil). (b) Kõige arvukamate faagipeptiidide loend, mis on järjestatud vastavalt nende suhtelisele osakaalule kõigist tserebrospinaalvedelikus pärast 4. valikuvooru kogutud faagidest. Kuus kõige levinumat faagiklooni on esile tõstetud värviga ja nummerdatud ning nende rikastustegurid 3. ja 4. valikuvooru vahel (vahetükid). (c, d) 4. vooru kuut kõige rikastatud faagiklooni, tühja faagi ja vanemfaagipeptiidide teeki analüüsiti eraldi CSF proovivõtumudelis. CSF ja vereproovid koguti näidatud ajahetkedel. (c) Võrdsed kogused 6 kandidaatfaagi klooni (2 x 1010 faagi/loom), tühje faage (#1779) (2 x 1010 faagi/loom) ja varufaagipeptiidi teeke (2 x 1012 faagi/loom). Kanüülitud loomale süstitakse sabaveeni kaudu eraldi vähemalt 3 CM-i. Näidatud on iga süstitud faagiklooni ja faagipeptiidi teeki tserebrospinaalvedeliku (CSF) farmakokineetika aja jooksul. (d) näitab kõigi taastatud faagide/ml keskmist CSF/veri suhet proovivõtuaja jooksul. (e) Neli sünteetilist juhtpeptiidi ja üks segatud kontrollpeptiid seoti biotiiniga streptavidiiniga läbi nende N-otsa (tetrameeride kuvamine), millele järgnes süstimine (sabaveeni i.v., 10 mg streptavidiini/kg). Vähemalt kolm intubeeritud rotti (N = 3). CSF proovid koguti näidatud ajahetkedel ja streptavidiini kontsentratsioonid mõõdeti CSF anti-streptavidiini ELISA abil (nd = mitte tuvastatud). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ANOVA testi põhjal). (f) Kõige rikastatud faagipeptiidi klooni #2002 (lilla) aminohappejärjestuse võrdlus teiste valitud faagipeptiidi kloonidega 4. valikuvoorust. Identsed ja sarnased aminohappefragmendid on värvikodeeritud.
Kõigist neljanda vooru rikastatud faagidest (joonis 3b) valiti edasiseks individuaalseks analüüsiks CSF-i valimimudelis kuus kandidaatklooni. Kolmele kanüülitud CM-loomale süstiti võrdsed kogused kuut kandidaatfaagi, tühja faagi (ilma inserdita) ja profaagpeptiidide teeki ning farmakokineetikat määrati CSF-i (joonis 3c) ja vere (lisajoonis 7) testides. Kõik testitud faagikloonid sihtisid CSF-i sektsiooni tasemel, mis oli 10–1000 korda kõrgem kui tühja kontrollfaagi (#1779) tiiter. Näiteks kloonidel #2020 ja #2077 olid umbes 1000 korda kõrgemad CSF-i tiitrid kui kontrollfaagil. Iga valitud peptiidi farmakokineetiline profiil on erinev, kuid neil kõigil on kõrge CSF-i suunamisvõime. Täheldasime kloonide #1903 ja #2011 puhul aja jooksul pidevat langust, samas kui kloonide #2077, #2002 ja #2009 puhul võib esimese 10 minuti jooksul suurenemine viidata aktiivsele transpordile, kuid see vajab kinnitamist. Kloonid #2020, #2002 ja #2077 stabiliseerusid kõrgel tasemel, samas kui klooni #2009 tserebrospinaalvedeliku kontsentratsioon vähenes pärast esialgset suurenemist aeglaselt. Seejärel võrdlesime iga tserebrospinaalvedeliku kandidaadi suhtelist sagedust selle verekontsentratsiooniga (joonis 3d). Iga tserebrospinaalvedeliku kandidaadi keskmise tiitri korrelatsioon selle veretiitriga kõigil proovivõtuaegadel näitas, et kolmel kuuest kandidaadist olid vere tserebrospinaalvedelikus oluliselt rohkem kontsentratsiooni. Huvitaval kombel näitas kloon #2077 suuremat vere stabiilsust (lisajoonis 7). Et kinnitada, et peptiidid ise on võimelised aktiivselt transportima tserebrospinaalvedeliku sektsiooni ka muid aineid peale faagiosakeste, sünteesisime neli juhtpeptiidi, mis olid derivatiseeritud biotiiniga N-otsas, kus peptiidid kinnituvad faagiosakesele. Biotinüülitud peptiidid (nr 2002, 2009, 2020 ja 2077) konjugeeriti streptavidiiniga (SA), et saada multimeerseid vorme, mis mõnevõrra jäljendavad faagi geomeetriat. See formaat võimaldas meil mõõta ka SA ekspositsiooni veres ja tserebrospinaalvedelikus lasti transportivate valgupeptiididena. Oluline on see, et faagiandmeid oli sageli võimalik reprodutseerida, kui sünteetilisi peptiide manustati selles SA-konjugeeritud formaadis (joonis 3e). Segatud peptiididel oli väiksem esialgne ekspositsioon ja kiirem tserebrospinaalvedelikust eritumine, kusjuures 48 tunni jooksul oli tase tuvastamatu. Et saada ülevaade nende peptiidfaagi kloonide tserebrospinaalvedelikku toimetamise radadest, analüüsisime üksikute faagipeptiidide tabamuste lokaliseerimist immunohistokeemia (IHC) abil, et tuvastada faagiosakesi otse 1 tund pärast intravenoosset süstimist in vivo. Tähelepanuväärselt oli kloonid nr 2002, nr 2077 ja nr 2009 tuvastatavad aju kapillaarides tugeva värvumisega, samas kui kontrollfaagi (nr 1779) ja klooni nr 2020 ei tuvastatud (lisajoonis 8). See viitab sellele, et need peptiidid aitavad kaasa aju mõjule just BBB läbimise kaudu. Selle hüpoteesi kontrollimiseks on vaja täiendavat üksikasjalikku analüüsi, kuna võib olla kaasatud ka BSCFB rada. Kõige rikastatud klooni (#2002) aminohappejärjestuse võrdlemisel teiste valitud peptiididega täheldati, et mõnel neist on sarnased aminohappelised pikendused, mis võivad viidata sarnasele transpordimehhanismile (joonis 3f).
Tänu oma ainulaadsele plasmaprofiilile ja tserebrospinaalvedelikus (CSF) aja jooksul toimunud olulisele suurenemisele uuriti faagiekspressiooni klooni #2077 pikema 48-tunnise perioodi jooksul ning see suutis reprodutseerida püsiva SA tasemega seotud CSF kiiret suurenemist (joonis 4a). Teiste tuvastatud faagikloonide osas värvus #2077 tugevalt aju kapillaaride suhtes ja näitas suurema eraldusvõimega vaatlemisel märkimisväärset kolokalisatsiooni kapillaarmarkeri lektiiniga ning võimalik, et ka mõningast värvumist parenhüümiruumis (joonis 4b). Et uurida, kas KNS-is on võimalik saavutada peptiidide vahendatud farmakoloogilisi toimeid, viisime läbi katse, milles i) transiidpeptiidi #2077 ja ii) BACE1 inhibiitorpeptiidi biotinüleeritud versioonid segati SA-ga kahes erinevas vahekorras. Ühe kombinatsiooni puhul kasutasime ainult BACE1 peptiidi inhibiitorit ja teise puhul BACE1 peptiidi inhibiitori ja #2077 peptiidi suhet 1:3. Mõlemad proovid manustati intravenoosselt ning beeta-amüloidpeptiidi 40 (Abeta40) taset veres ja tserebrospinaalvedelikus mõõdeti aja jooksul. Abeta40 sisaldus mõõdeti tserebrospinaalvedelikus (CSF), kuna see peegeldab BACE1 inhibeerimist aju parenhüümis. Nagu oodatud, vähendasid mõlemad kompleksid oluliselt Abeta40 taset veres (joonis 4c, d). Kuid ainult proovid, mis sisaldasid peptiidi nr 2077 ja SA-ga konjugeeritud BACE1 peptiidi inhibiitori segu, põhjustasid Abeta40 olulise vähenemise tserebrospinaalvedelikus (joonis 4c). Andmed näitavad, et peptiid nr 2077 on võimeline transportima 60 kDa SA valku KNS-i ja kutsub esile ka farmakoloogilisi toimeid BACE1 peptiidi SA-konjugeeritud inhibiitoritega.
(a) T7 faagi klonaalne süstimine (2 × 1010 faagi/loom), mis näitab CSF peptiidi #2077 (RLSSVDSDLSGC) ja süstimata kontrollfaagi (#1779) pikaajalisi farmakokineetilisi profiile vähemalt kolmel CM-intubeeritud rotil. (b) Faagiga süstitud rottide (2 × 1010 faagi/loom) representatiivsete kortikaalsete mikroveresoonte konfokaalne mikroskoopiline pilt, mis näitab peptiidi #2077 ja veresoonte (lektiini) kontrastvärvimist. Neid faagikloone manustati 3 rotile ja lasti enne perfusiooni 1 tund tsirkuleerida. Ajud lõigati sektsioonideks ja värviti polüklonaalsete FITC-märgistatud antikehadega T7 faagi kapsiidi vastu. Kümme minutit enne perfusiooni ja järgnevat fikseerimist manustati intravenoosselt DyLight594-märgistatud lektiini. Fluorestseeruvad pildid, mis näitavad mikroveresoonte luminaalse külje lektiini värvumist (punane) ja faagide (roheline) värvumist kapillaaride ja perivaskulaarse ajukoe valendikus. Skaalariba vastab 10 µm-le. (c, d) Biotinüleeritud BACE1 inhibeeriv peptiid üksi või kombinatsioonis biotinüleeritud transiidpeptiidiga #2077 sidestati streptavidiiniga, millele järgnes vähemalt kolme kanüleeritud CM roti intravenoosne süstimine (10 mg streptavidiini/kg). BACE1 peptiidi inhibiitori vahendatud Aβ40 vähenemist mõõdeti Aβ1-40 ELISA abil veres (punane) ja tserebrospinaalvedelikus (oranž) näidatud ajahetkedel. Parema selguse huvides on graafikule joonistatud punktiirjoon skaalal 100%. (c) Aβ40 protsentuaalne vähenemine veres (punased kolmnurgad) ja tserebrospinaalvedelikus (oranžid kolmnurgad) rottidel, keda raviti transiidpeptiidiga #2077 konjugeeritud streptavidiini ja BACE1 inhibeeriva peptiidiga vahekorras 3:1. (d) Ainult BACE1 inhibeeriva peptiidiga seotud streptavidiiniga ravitud rottide vere Aβ40 (punased ringid) ja tserebrospinaalvedelikus (oranžid ringid) vähenemine. Aβ kontsentratsioon kontrollgrupis oli 420 pg/ml (standardhälve = 101 pg/ml).
Faagi kuvamist on edukalt rakendatud mitmes biomeditsiiniliste uuringute valdkonnas17. Seda meetodit on kasutatud in vivo veresoonte mitmekesisuse uuringutes18,19 ja ka ajuveresoontele suunatud uuringutes20,21,22,23,24,25,26. Selles uuringus laiendasime selle selektsioonimeetodi rakendamist mitte ainult ajuveresoontele suunatud peptiidide otsesele identifitseerimisele, vaid ka kandidaatide avastamisele, millel on aktiivsed transpordiomadused hematoentsefaalbarjääri ületamiseks. Nüüd kirjeldame in vivo selektsiooniprotseduuri väljatöötamist CM intubeeritud rottidel ja demonstreerime selle potentsiaali tuvastada peptiide, millel on CSF-i suunamisomadused. Kasutades T7 faagi, mis kuvab 12-meersete juhuslike peptiidide teeki, suutsime näidata, et T7 faag on piisavalt väike (läbimõõduga umbes 60 nm),10 et kohanduda hematoentsefaalbarjääriga, ületades seeläbi otse hematoentsefaalbarjääri või soonkesta põimiku. Täheldasime, et kanüülitud CM-rottidelt tserebrospinaalvedeliku (CSF) kogumine oli hästi kontrollitud in vivo funktsionaalne skriiningmeetod ning et ekstraheeritud faag mitte ainult ei seondunud veresoonkonnaga, vaid toimis ka transporterina üle hematoentsefaalbarjääri. Lisaks, kogudes samaaegselt verd ja rakendades tserebrospinaalvedelikule ja verest saadud faagidele HTS-i, kinnitasime, et meie CSF-i valikut ei mõjutanud vere rikastumine ega sobivus laienemiseks valikuvoorude vahel. Verekamber on aga osa valikuprotseduurist, kuna CSF-kambrisse jõudvad faagid peavad ellu jääma ja vereringes ringlema piisavalt kaua, et ajus rikastuda. Usaldusväärse järjestusteabe saamiseks HTS-i toorandmetest rakendasime analüüsi töövoogu filtreid, mis on kohandatud platvormispetsiifiliste sekveneerimisvigadega. Kineetiliste parameetrite lisamisega skriiningmeetodisse kinnitasime metsiktüüpi T7 faagide kiiret farmakokineetikat (t½ ~ 28 min) veres24, 27, 28 ja määrasime ka nende poolväärtusaja tserebrospinaalvedelikus (t½ ~ 26 min) minutis). Vaatamata sarnastele farmakokineetilistele profiilidele veres ja tserebrospinaalvedelikus (CSF), oli tserebrospinaalvedelikus (CSF) tuvastatav vaid 0,001% faagi kontsentratsioonist veres, mis näitab metsiktüüpi T7 faagi madalat taustmobiilsust üle hematoentsefaalbarjääri. See töö rõhutab esimese valikuvooru olulisust in vivo sõelumisstrateegiate kasutamisel, eriti faagisüsteemide puhul, mis eemaldatakse vereringest kiiresti, kuna vähesed kloonid suudavad jõuda KNS-i sektsiooni. Seega oli esimeses voorus raamatukogu mitmekesisuse vähenemine väga suur, kuna selles väga ranges CSF-mudelis koguti lõpuks vaid piiratud arv kloone. See in vivo sõelumisstrateegia hõlmas mitmeid valikuetappe, nagu aktiivne akumuleerumine CSF-sektsioonis, klooni ellujäämine veresektsioonis ja T7 faagi kloonide kiire eemaldamine verest esimese 10 minuti jooksul (joonis 1d ja täiendav joonis 4M). Seega identifitseeriti pärast esimest vooru CSF-is erinevad faagikloonid, kuigi üksikute loomade puhul kasutati sama algset kogumit. See viitab sellele, et mitu ranget valikuvooru suure hulga raamatukogu liikmetega allikaraamatukogude puhul põhjustavad mitmekesisuse olulist vähenemist. Seega saavad juhuslikest sündmustest lahutamatu osa esialgsest valikuprotsessist, mis mõjutavad tulemust oluliselt. On tõenäoline, et paljudel algse raamatukogu kloonidel oli väga sarnane tserebrospinaalvedelikus (CSF) rikastumiskalduvus. Kuid isegi samades katsetingimustes võivad valiku tulemused erineda iga konkreetse klooni väikese arvu tõttu esialgses kogumis.
Tserebrospinaalvedelikus (CSF) rikastatud motiivid erinevad veres leiduvatest. Huvitaval kombel täheldasime esimest nihet glütsiinirikaste peptiidide suunas üksikute loomade veres. (Joonis 1g, lisajoonised 4e, 4f). Glütsiinipeptiide sisaldavad faagid võivad olla stabiilsemad ja väiksema tõenäosusega vereringest välja langeda. Neid glütsiinirikkaid peptiide tserebrospinaalvedeliku proovides aga ei tuvastatud, mis viitab sellele, et kureeritud teegid läbisid kaks erinevat selektsioonietappi: üks veres ja teine ​​lasti akumuleeruda tserebrospinaalvedelikus. Neljanda selektsioonivooru tulemusel saadud CSF-rikastatud kloone on põhjalikult testitud. Peaaegu kõik individuaalselt testitud kloonid osutusid CSF-is rikastatud võrreldes tühja kontrollfaagiga. Ühte peptiidi tabamust (#2077) uuriti üksikasjalikumalt. See näitas pikemat plasma poolväärtusaega võrreldes teiste tabamustega (joonis 3d ja lisajoonis 7) ning huvitaval kombel sisaldas see peptiid C-otsas tsüsteiinijääki. Hiljuti on näidatud, et tsüsteiini lisamine peptiididele võib parandada nende farmakokineetilisi omadusi, seondudes albumiiniga 29. See on peptiidi #2077 puhul praegu teadmata ja vajab edasist uurimist. Mõned peptiidid näitasid CSF-i rikastamisel valentsist sõltuvust (andmeid pole esitatud), mis võib olla seotud T7 kapsiidi kuvatava pinnageomeetriaga. Meie kasutatud T7 süsteem näitas iga peptiidi 5-15 koopiat faagiosakese kohta. IHC viidi läbi rottide ajukoorde intravenoosselt süstitud kandidaat-juhtfaagi kloonidega (lisajoonis 8). Andmed näitasid, et vähemalt kolm klooni (nr 2002, nr 2009 ja nr 2077) interakteerusid BBB-ga. Jääb veel kindlaks teha, kas see BBB interaktsioon põhjustab CSF-i akumuleerumist või nende kloonide liikumist otse BCSFB-sse. Oluline on see, et näitame, et valitud peptiidid säilitavad oma CSF-i transpordivõime sünteesimisel ja valgulastiga seondumisel. N-terminaalsete biotinüleeritud peptiidide seondumine SA-ga kordab sisuliselt tulemusi, mis saadi vastavate faagikloonidega veres ja tserebrospinaalvedelikus (joonis 3e). Lõpuks näitame, et juhtpeptiid #2077 on võimeline soodustama SA-ga konjugeeritud BACE1 biotinüleeritud peptiidi inhibiitori ajutegevust, põhjustades KNS-is väljendunud farmakodünaamilisi efekte, vähendades oluliselt Abeta40 taset tserebrospinaalvedelikus (joonis 4). Peptiidjärjestuse homoloogiaotsingu abil ei õnnestunud meil andmebaasis tuvastada ühtegi homoloogi, tehes kõigi tabamuste põhjal otsingu. Oluline on märkida, et T7 teegi suurus on ligikaudu 109, samas kui 12-meeride teoreetiline teegi suurus on 4 x 1015. Seetõttu valisime 12-meeride peptiiditeegi mitmekesisusruumist vaid väikese osa, mis võib tähendada, et nende tuvastatud tabamuste külgneva järjestusruumi hindamise abil saab tuvastada optimeeritumaid peptiide. Hüpoteetiliselt võib üks põhjus, miks me pole leidnud nende peptiidide looduslikke homolooge, olla evolutsiooni käigus toimunud valiku puudumine, et vältida teatud peptiidimotiivide kontrollimatut sisenemist ajju.
Kokkuvõttes pakuvad meie tulemused aluse edasiseks tööks, et in vivo tserebrovaskulaarse barjääri transpordisüsteeme üksikasjalikumalt tuvastada ja iseloomustada. Selle meetodi põhiline ülesehitus põhineb funktsionaalsel valikustrateegial, mis mitte ainult ei tuvasta tserebrovaskulaarsete sidumisomadustega kloone, vaid hõlmab ka kriitilist etappi, kus edukatel kloonidel on sisemine aktiivsus bioloogiliste barjääride ületamiseks in vivo KNS-i sektsiooni. Eesmärk on selgitada nende peptiidide transpordimehhanismi ja nende eelistust seonduda aju piirkonna spetsiifilise mikrovaskulatuuriga. See võib viia uute radade avastamiseni BBB ja retseptorite transpordiks. Eeldame, et tuvastatud peptiidid saavad otseselt seonduda tserebrovaskulaarsete retseptoritega või ringlevate ligandidega, mida transporditakse läbi BBB või BCSFB. Selles töös avastatud CSF transpordiaktiivsusega peptiidivektoreid uuritakse edasi. Praegu uurime nende peptiidide aju spetsiifilisust nende võime osas läbida BBB ja/või BCSFB. Need uued peptiidid on äärmiselt väärtuslikud tööriistad uute retseptorite või radade potentsiaalseks avastamiseks ja uute ülitõhusate platvormide väljatöötamiseks makromolekulide, näiteks bioloogiliste ravimite, ajju toimetamiseks.
Suurde tsisternasse (CM) kanüüliti eelnevalt kirjeldatud meetodi modifikatsiooni abil. Anesteesia all olevad Wistari rotid (200–350 g) paigutati stereotaksiaalsele aparaadile ja raseeritud ning aseptiliselt ettevalmistatud peanahale tehti keskmine sisselõige, et paljastada kolju. Puuriti ülemise vöö piirkonda kaks auku ja kinnitati kinnituskruvid aukudesse. Roostevabast terasest kanüüli stereotaktiliseks juhtimiseks CM-i puuriti täiendav auk lateraalsesse kuklaluuharja. Kanti kanüüli ümber hambatsementi ja kinnitati kruvidega. Pärast fotokõvastamist ja tsemendi kõvenemist suleti nahahaav 4/0 supramiidõmblusega. Kanüüli õiget paigutust kinnitati tserebrospinaalvedeliku (CSF) spontaanse lekkega. Rott eemaldati stereotaksilisest aparaadist, osutati sobivat operatsioonijärgset ravi ja valuvaigistust ning lasti tal vähemalt üks nädal taastuda, kuni tserebrospinaalvedelikus on täheldatud vere märke. Wistari rotid (Crl:WI/Han) saadi firmalt Charles River (Prantsusmaa). Kõiki rotte hoiti spetsiifilistes patogeenivabades tingimustes. Kõik loomkatsed kiitis heaks Baseli linna veterinaaramet Šveitsis ning need viidi läbi vastavalt loomalitsentsile nr 2474 (Aju aktiivse transpordi hindamine terapeutiliste kandidaatide taseme mõõtmise teel roti tserebrospinaalvedelikus ja ajus).
Hoidke rotti õrnalt teadvusel, hoides CM-kanüüli käes. Eemaldage Datura kanüülist ja koguge 10 µl spontaanselt voolavat tserebrospinaalvedelikku. Kuna kanüüli läbitavus oli lõpuks ohustatud, kaasati sellesse uuringusse ainult selged tserebrospinaalvedeliku proovid, millel ei olnud vere saastumise ega värvimuutuse märke. Paralleelselt võeti sabaotsa väikesest sisselõikest ligikaudu 10–20 μl verd hepariiniga (Sigma-Aldrich) katseklaasidesse. Tserebrospinaalvedelikku ja verd koguti erinevatel ajahetkedel pärast T7 faagi intravenoosset süstimist. Enne iga tserebrospinaalvedeliku proovi kogumist eemaldati ligikaudu 5–10 μl vedelikku, mis vastab kateetri surnud mahule.
Teegid genereeriti T7Select 10-3b vektori abil, nagu on kirjeldatud T7Select süsteemi käsiraamatus (Novagen, Rosenberg jt, InNovations 6, 1-6, 1996). Lühidalt, juhuslik 12-meerne DNA insert sünteesiti järgmises formaadis:
NNK koodonit kasutati topelt-stoppkoodonite ja aminohappe üleekspressiooni vältimiseks insertis. N on iga nukleotiidi käsitsi segatud ekvimolaarne suhe ja K on adeniini ja tsütosiini nukleotiidide käsitsi segatud ekvimolaarne suhe. Üheahelalised piirkonnad muundati kaheahelaliseks DNA-ks, inkubeerides neid edasi dNTP-ga (Novagen) ja Klenow ensüümiga (New England Biolabs) Klenow puhvris (New England Biolabs) 3 tundi temperatuuril 37 °C. Pärast reaktsiooni eraldati kaheahelaline DNA EtOH sadestamise teel. Saadud DNA lagundati restriktsioonensüümidega EcoRI ja HindIII (mõlemad Roche'ilt). Lõigatud ja puhastatud (QIAquick, Qiagen) insert (T4 ligaas, New England Biolabs) ligeeriti seejärel raamis eelnevalt lõigatud T7 vektorisse pärast 10B kapsiidi geeni aminohapet 348. Ligeerimisreaktsioone inkubeeriti enne in vitro pakendamist 18 tundi temperatuuril 16 °C. Faagi pakkimine in vitro viidi läbi vastavalt T7Select 10-3b kloonimiskomplektiga (Novagen) kaasasolevatele juhistele ja pakkimislahust amplifitseeriti üks kord lüüsini, kasutades Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lüsaadid tsentrifuugiti, tiitriti ja külmutati temperatuuril -80 °C glütserooli varulahusena.
Puljongis või plaadil amplifitseeritud faagi varieeruvate piirkondade otsene PCR-amplifikatsioon, kasutades patenteeritud 454/Roche-amplikoni fusioonpraimereid. Edasine fusioonpraimer sisaldab järjestusi, mis külgnevad varieeruva piirkonnaga (NNK) 12 (matriitsispetsiifiline), GS FLX titaanadapteriga A ja neljaaluselise raamatukogu võtmejärjestusega (TCAG) (lisajoonis 1a):
Pöördfusioonpraimer sisaldab ka biotiini, mis on kinnitatud püüdmishelmeste külge, ja GS FLX titaanadapterit B, mis on vajalik klonaalseks amplifikatsiooniks emulsioon-PCR-i ajal:
Seejärel allutati amplikonid 454/Roche pürosekvenseerimisele vastavalt 454 GS-FLX Titanium protokollile. Manuaalseks Sangeri sekveneerimiseks (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) amplifitseeriti T7 faagi DNA PCR-i abil ja sekveneeriti järgmiste praimeripaaridega:
Individuaalsetelt naastudelt pärinevaid inserte PCR-amplifikatsiooni abil kasutati Roche Fast Start DNA polümeraasi komplekti (vastavalt tootja juhistele). Tehti kuumkäivitus (10 min temperatuuril 95 °C) ja 35 võimendustsüklit (50 s temperatuuril 95 °C, 1 min temperatuuril 50 °C ja 1 min temperatuuril 72 °C).
Faagid teekidelt, metsiktüüpi faag, tserebrospinaalvedelikust ja verest päästetud faag või individuaalsed kloonid amplifitseeriti Escherichia coli BL5615 bakteris TB puljongis (Sigma Aldrich) või 500 cm2 tassides (Thermo Scientific) 4 tundi temperatuuril 37 °C. Faagid ekstraheeriti plaatidelt, loputades plaate Tris-EDTA puhvriga (Fluka Analytical) või kogudes naastud steriilsete pipetiotstega. Faagid eraldati kultuuri supernatantist või ekstraheerimispuhvrist ühe polüetüleenglükooli (PEG 8000) sadestamise ringiga (Promega) ja resuspendeeriti Tris-EDTA puhvris.
Amplifitseeritud faag allutati 2-3 endotoksiini eemaldamise voorule, kasutades endotoksiini eemaldamise graanuleid (Miltenyi Biotec) enne intravenoosset (IV) süstimist (500 μl/loom). Esimeses voorus lisati 2 × 1012 faagi; teises voorus 2 × 1010 faagi; kolmandas ja neljandas selektsioonivoorus 2 × 109 faagi looma kohta. Näidatud ajahetkedel kogutud tserebrospinaalvedelikus ja vereproovides sisalduvate faagisisaldus määrati naastude loendamise teel vastavalt tootja juhistele (T7Select süsteemi kasutusjuhend). Faagi selektsioon viidi läbi puhastatud teekide intravenoosse süstimise teel sabaveeni või eelmisest selektsioonivoorust tserebrospinaalvedelikust ekstraheeritud faagi uuesti süstimise teel ning järgnevad kogumised viidi läbi vastavalt tserebrospinaalvedelikus ja vereproovides 10, 30, 60, 90, 120, 180 ja 240 minuti möödudes. Kokku viidi läbi neli in vivo sõelumisvooru, mille käigus kahte valitud haru säilitati ja analüüsiti eraldi esimese kolme selektsioonivooru jooksul. Kõik kahest esimesest selektsioonivoorust tserebrospinaalvedelikust ekstraheeritud faagi insertid sekveneeriti käsitsi, samas kui kahest viimasest selektsioonivoorust tserebrospinaalvedelikust ekstraheeritud kloonid sekveneeriti käsitsi. Kõik esimesest selektsioonivoorust pärinevad verefaagid sekveneeriti samuti 454/Roche abil. Faagikloonide süstimiseks amplifitseeriti valitud faagid E. colis (BL5615) 500 cm2 plaatidel temperatuuril 37 °C 4 tundi. Individuaalselt valitud ja käsitsi sekveneeritud kloonid paljundati TB-söötmes. Pärast faagi ekstraheerimist, puhastamist ja endotoksiini eemaldamist (nagu eespool kirjeldatud) süstiti intravenoosselt ühte sabaveeni 2 × 1010 faagi/looma kohta 300 μl-s.
Järjestusandmete eeltöötlus ja kvalitatiivne filtreerimine. Toores 454/Roche andmed teisendati binaarsest standardsest voogkaardi formaadist (sff) Pearsoni inimesele loetavaks vorminguks (fasta), kasutades tarnija tarkvara. Nukleotiidjärjestuse edasine töötlemine viidi läbi patenteeritud C-programmide ja skriptide (avaldamata tarkvarapakett) abil, nagu allpool kirjeldatud. Primaarandmete analüüs hõlmab rangeid mitmeastmelisi filtreerimisprotseduure. Kehtiva 12-meerse DNA inserdi järjestuseta lugemiste väljafiltreerimiseks joondati lugemised järjestikku algmärgise (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stoppmärgise (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ja taustainserdi (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) järgi, kasutades globaalset Needleman-Wunschi testi. Joondus lubas kuni 2 ebajärjekindlust joonduse kohta31. Seetõttu eemaldati teegist algus- ja stoppmärgenditeta lugemised ning taustainserte sisaldavad lugemised, st joondused, mis ületavad lubatud mittevastavuste arvu. Mis puutub ülejäänud lugemisjärjestusse, siis algsest lugemisjärjestusest eemaldati ja töödeldi edasi N-meer DNA järjestus, mis ulatus algusmärgist kuni stoppmärgini (edaspidi „insert“). Pärast inserdi translatsiooni eemaldatakse inserdist osa pärast praimeri 5'-otsas asuvat esimest stoppkoodonit. Lisaks eemaldati ka nukleotiidid, mis viisid praimeri 3'-otsas mittetäielike koodoniteni. Ainult taustjärjestusi sisaldavate insertide välistamiseks eemaldati ka transleeritud insertid, mis algavad aminohappemustriga „PAG“. Peptiidid, mille translatsioonijärgne pikkus oli alla 3 aminohappe, eemaldati teegist. Lõpuks eemaldati insertide kogumist redundantsus ja määrati iga unikaalse inserdi sagedus. Selle analüüsi tulemused hõlmasid nukleotiidjärjestuste (insertide) ja nende (lugemis)sageduste loendit (lisajoonised 1c ja 2).
N-meersete DNA insertsioonide rühmitamine järjestuse sarnasuse järgi: 454/Roche'i spetsiifiliste sekveneerimisvigade (näiteks homopolümeeride laienduste sekveneerimise probleemide) kõrvaldamiseks ja vähem oluliste koondamiste eemaldamiseks sorteeritakse eelnevalt filtreeritud N-meersete DNA järjestuste insertsioonid (inserdid) sarnasuse järgi. Insertsioonid (lubatud kuni 2 mittevastavat alust) sorteeritakse iteratiivse algoritmi abil, mis on defineeritud järgmiselt: insertsioonid sorteeritakse esmalt nende sageduse järgi (kõrgeimast madalaimani) ja kui need on samad, siis nende sekundaarse sortimise järgi pikkuse järgi (pikimast lühimani). Seega määratlevad kõige sagedasemad ja pikimad insertsioonid esimese "rühma". Rühma sagedus seatakse võtmesagedusele. Seejärel prooviti iga sorteeritud loendis allesjäänud insertsiooni lisada rühmale paarikaupa Needleman-Wunschi joondamisega. Kui mittevastavuste, insertsioonide või deletsioonide arv joonduses ei ületa läve 2, lisatakse rühmale insertsioon ja rühma üldist sagedust suurendatakse insertsiooni lisamise sageduse võrra. Rühma lisatud insertsioonid märgitakse kasutatuks ja jäetakse edasisest töötlemisest välja. Kui inserdijärjestust ei saa juba olemasolevasse rühma lisada, kasutatakse inserdijärjestust uue rühma loomiseks sobiva insertsioonisagedusega ja märgitakse see kasutatuks. Iteratsioon lõpeb siis, kui iga insertsioonijärjestust on kas kasutatud uue rühma moodustamiseks või selle saab lisada juba olemasolevasse rühma. Lõppude lõpuks transleeritakse nukleotiididest koosnevad rühmitatud inserdid lõpuks peptiidjärjestusteks (peptiiditeegid). Selle analüüsi tulemuseks on insertsioonide komplekt ja nende vastavad sagedused, mis moodustavad järjestikuste lugemiste arvu (lisajoonis 2).
Motiivide genereerimine: Unikaalsete peptiidide loendi põhjal loodi raamatukogu, mis sisaldab kõiki võimalikke aminohapete mustreid (aa), nagu allpool näidatud. Peptiidist ekstraheeriti iga võimalik muster pikkusega 3 ja lisati selle pöördmuster koos ühise motiivide koguga, mis sisaldas kõiki mustreid (tripeptiide). Väga korduvate motiivide kogud sekveneeriti ja redundantsus eemaldati. Seejärel kontrollisime iga motiivide kogu tripeptiidi olemasolu kogus arvutusvahendite abil. Sel juhul liideti leitud motiivi tripeptiidi sisaldava peptiidi sagedus ja määrati motiivi kogus olevale motiivile („motiivide arv“). Motiivide genereerimise tulemuseks on kahemõõtmeline massiiv, mis sisaldab kõiki tripeptiidide (motiivide) esinemisi ja nende vastavaid väärtusi, mis on sekveneerimislugemiste arv, mille tulemuseks on vastav motiiv, kui lugemised filtreeritakse, rühmitatakse ja transleeritakse. Mõõdikud on eespool üksikasjalikult kirjeldatud.
Motiivide arvu ja vastavate hajuvusdiagrammide normaliseerimine: Iga proovi motiivide arv normaliseeriti, kasutades
kus ni on teemat i sisaldavate lugemiste arv. Seega vi tähistab motiivi i sisaldavate lugemiste (või peptiidide) protsentuaalset sagedust valimis. Motiivide mittenormaliseeritud arvu P-väärtused arvutati Fisheri täpse testi abil. Motiivide arvu korrelogrammide osas arvutati Spearmani korrelatsioonid, kasutades normaliseeritud motiivide arvu R-iga.
Peptiiditeegi iga positsiooni aminohapete sisalduse visualiseerimiseks loodi veebilogogrammid 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Esmalt salvestatakse 12-meerse peptiidi iga positsiooni aminohapete sisaldus 20×12 maatriksisse. Seejärel genereeritakse fasta-järjestuse formaadis 1000 peptiidi komplekt, mis sisaldavad igas positsioonis sama suhtelist aminohapete sisaldust, ja edastatakse sisendina web-logo 3-le, mis genereerib antud peptiiditeegi iga positsiooni suhtelise aminohapete sisalduse graafilise esituse. Mitmemõõtmeliste andmestike visualiseerimiseks loodi soojuskaardid, kasutades R-is sisemiselt väljatöötatud tööriista (biosHeatmap, seni avaldamata R-pakett). Soojuskaartidel esitatud dendrogrammid arvutati Wardi hierarhilise klastrite meetodi abil, kasutades eukleidilise kauguse meetrikat. Motiivide hindamisandmete statistiliseks analüüsiks arvutati normaliseerimata hindamissüsteemi P-väärtused Fisheri täpse testi abil. Teiste andmekogumite P-väärtused arvutati R-is, kasutades Studenti t-testi või ANOVA-d.
Valitud faagikloonid ja insertideta faagid süstiti intravenoosselt sabaveeni (2 × 1010 faagi/loom 300 μl PBS-is). Kümme minutit enne perfusiooni ja järgnevat fikseerimist süstiti samadele loomadele intravenoosselt 100 μl DyLight594-märgistatud lektiini (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minutit pärast faagisüsti perfundeeriti rottidele läbi südame 50 ml PBS-i ja seejärel 50 ml 4% PFA/PBS-i. Ajuproove fikseeriti lisaks üleöö 4% PFA/PBS-is ja leotati 30% sahharoosis üleöö temperatuuril 4 °C. Proovid külmutati kiirkülmutusega OCT segus. Külmutatud proovide immunohistokeemiline analüüs viidi läbi toatemperatuuril 30 µm krüosektsioonidel, mis olid blokeeritud 1% BSA-ga ja inkubeeritud polüklonaalsete FITC-märgistatud antikehadega T7 faagi vastu (Novus NB 600-376A) temperatuuril 4 °C. Inkubeeriti üleöö. Lõpuks pesti sektsioone 3 korda PBS-iga ja uuriti konfokaalse lasermikroskoobiga (Leica TCS SP5).
Kõik peptiidid minimaalse puhtusega 98% sünteesiti GenScript USA poolt, biotinüleeriti ja lüofiliseeriti. Biotiin on seotud N-otsas täiendava kolmekordse glütsiini vahetüki kaudu. Kontrollige kõiki peptiide massispektromeetria abil.
Streptavidiin (Sigma S0677) segati 5-kordse ekvimolaarse liiaga biotinüleeritud peptiidi, biotinüleeritud BACE1 inhibeeriva peptiidi või biotinüleeritud BACE1 inhibeeriva peptiidi ja BACE1 inhibeeriva peptiidi kombinatsiooniga (suhe 3:1) 5–10% DMSO-s ja inkubeeriti PBS-is 1 tund toatemperatuuril enne süstimist. Streptavidiiniga konjugeeritud peptiide süstiti intravenoosselt annuses 10 mg/kg ajuõõnega rottide sabaveeni.
Streptavidiini-peptiidi komplekside kontsentratsiooni hinnati ELISA abil. Nunc Maxisorp mikrotiiterplaadid (Sigma) kaeti üleöö temperatuuril 4 °C 1,5 μg/ml hiire anti-streptavidiini antikehaga (Thermo, MA1-20011). Pärast blokeerimist (blokeerimispuhver: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% želatiin, 1% BSA) toatemperatuuril 2 tunni jooksul pesti plaati 0,05% Tween-20/PBS-iga (pesupuhver) 3 sekundi jooksul. CSF ja plasma proovid lisati blokeerimispuhvriga lahjendatud süvenditesse (plasma 1:10 000, CSF 1:115). Seejärel inkubeeriti plaati üleöö temperatuuril 4 °C detekteerimisantikehaga (1 μg/ml, anti-streptavidiin-HRP, Novus NB120-7239). Pärast kolme pesuetappi tuvastati streptavidiin inkubeerimise teel TMB substraadi lahuses (Roche) kuni 20 minutit. Pärast värvuse tekkimise peatamist 1M H2SO4-ga mõõtke neeldumist 450 nm juures.
Streptavidiin-peptiid-BACE1 inhibiitorkompleksi funktsiooni hinnati Aβ(1-40) ELISA abil vastavalt tootja protokollile (Wako, 294-64701). Lühidalt, CSF proovid lahjendati standardlahjendis (1:23) ja inkubeeriti üleöö temperatuuril 4 °C 96-süvendilistel plaatidel, mis olid kaetud BNT77 püüdmisantikehaga. Pärast viit pesemisetappi lisati HRP-konjugeeritud BA27 antikeha ja inkubeeriti 2 tundi temperatuuril 4 °C, millele järgnes viis pesemisetappi. Aβ(1-40) tuvastati inkubeerimisega TMB lahuses 30 minutit toatemperatuuril. Pärast värvuse tekkimise peatamist stopplahusega mõõdeti neeldumist 450 nm juures. Plasmaproovid ekstraheeriti tahkefaasiliselt enne Aβ(1-40) ELISA-d. Plasma lisati 0,2% DEA-le (Sigma) 96-süvendilistel plaatidel ja inkubeeriti toatemperatuuril 30 minutit. Pärast SPE plaatide (Oasis, 186000679) järjestikust pesemist vee ja 100% metanooliga lisati SPE plaatidele plasmaproovid ja kogu vedelik eemaldati. Proovid pesti (esmalt 5% metanooliga, seejärel 30% metanooliga) ja elueeriti 2% NH4OH/90% metanooliga. Pärast eluaadi kuivatamist temperatuuril 55 °C 99 minutit konstantse N2 voolu all redutseeriti proovid standardsetes lahjenduslahustes ja Aβ(1–40) mõõdeti eespool kirjeldatud viisil.
Kuidas seda artiklit tsiteerida: Urich, E. jt. Laosiseste ainete aju transportimine in vivo identifitseeritud transiitpeptiidide abil. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ja Moos T. Makromolekulaarsete ravimite manustamine ajju sihipärase ravi abil. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. ja Martinez-Martinez, P. Peptiid- ja valkravimite manustamine läbi hematoentsefaalbarjääri. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneumobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM. Hematoentsefaalbarjäär: aju ravimite väljatöötamise kitsaskoht. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG ja Byrd, A. Väljavaated ravimite paremaks manustamiseks ja sihtimiseks ajju soonkesta põimiku ja ajukelme vahelise raja kaudu. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM. Biofarmatseutiliste preparaatide moderniseerimine molekulaarsete Trooja hobuste abil ajju manustamiseks. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-retseptori vahendatud peptiidide transport läbi hematoentsefaalbarjääri. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. jt. Suurendage terapeutiliste antikehade aju läbitungivust ja efektiivsust monovalentsete molekulaarsete süstikute abil. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. jt. Transferriini retseptori (TfR) transport määrab TfR antikehade afiinsusvariantide omastamise ajus. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).