Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез чикләнгән CSS ярдәме булган браузер версиясен кулланасыз. Иң яхшы тәҗрибә өчен, без сезгә яңартылган браузер кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'да туры килүчәнлек режимын сүндерегез). Моннан тыш, даими ярдәмне тәэмин итү өчен, без сайтны стильләрсез һәм JavaScriptсыз күрсәтәбез.
Берьюлы өч слайдтан торган карусель күрсәтә. Берьюлы өч слайд аша күчү өчен "Алдагы" һәм "Киләсе" төймәләрен кулланыгыз, яисә берьюлы өч слайд аша күчү өчен ахырдагы слайдер төймәләрен кулланыгыз.
Гематоэнцефалик һәм гематоэнцефалик барьер биотерапик агентларның үзәк нерв системасындагы максатларына ирешүенә комачаулый, шуның белән неврологик авыруларны нәтиҗәле дәвалауга комачаулый. Яңа баш мие транспортерларын in vivo ачу өчен, без T7 фаг пептид китапханәсен керттек һәм кан һәм баш мие сыекчасын (БМС) тычканнарның каннуляцияләнгән зур пул моделен кулланып серияләп җыйдык. Дүрт тур сайлаудан соң, аерым фаг клоннары БМС белән югары дәрәҗәдә баетылган. Аерым кандидат пептидларны сынау БМСның 1000 тапкырдан артык баюын күрсәтте. Баш миенә пептид аша җиткерүнең биоактивлыгы ачыкланган яңа транзит пептиды белән бәйләнгән BACE1 пептид ингибиторын кулланып, баш мие сыекчасындагы амилоид-β дәрәҗәсенең 40% ка кимүе белән расланды. Бу нәтиҗәләр in vivo фаг сайлау ысуллары белән ачыкланган пептидларның макромолекулаларны баш миенә системалы җиткерү өчен файдалы чаралар булырга мөмкинлеген күрсәтә, бу терапевтик эффект бирә.
Үзәк нерв системасы (ҮНС) максатчан терапиясен тикшерү, нигездә, ҮНСка юнәлтелгән үзлекләр күрсәтүче оптимальләштерелгән препаратларны һәм агентларны ачыклауга юнәлтелгән, баш миенә актив препаратлар китерү механизмнарын ачуга азрак көч куелган. Хәзерге вакытта бу үзгәрә башлый, чөнки препаратлар китерү, бигрәк тә зур молекулалар, заманча нейрофән препаратларын эшләүнең аерылгысыз өлеше. Үзәк нерв системасы мохите кан-баш мие барьеры (ГББ) һәм кан-баш мие барьерыннан (ГББ) торган цереброваскуляр барьер системасы белән яхшы сакланган1,2, бу даруларны баш миенә җиткерүне катлауландыра1,2. Зур молекулалы препаратларның барысы да диярлек һәм кечкенә молекулалы препаратларның 98% тан артыгы баш миеннән чыгарыла дип исәпләнә3. Шуңа күрә ҮНСка терапевтик препаратларны нәтиҗәле һәм специфик җиткерүне тәэмин итүче яңа ми транспорт системаларын ачыклау бик мөһим4,5. Ләкин, ГББ һәм ГБББ да даруларны җиткерү өчен бик яхшы мөмкинлек бирә, чөнки алар баш миенең барлык структураларына аның киң кан тамырлары аша үтеп керәләр. Шулай итеп, баш миенә инвазив булмаган ысулларны куллану буенча хәзерге тырышлыклар, нигездә, эндоген BBB6 рецепторын кулланып, рецептор аша транспортлау (PMT) механизмына нигезләнгән. Трансферрин рецепторы юлын куллануда соңгы вакыттагы төп казанышларга карамастан7,8, яхшыртылган үзлекләргә ия яңа транспорт системаларын алга таба эшләү кирәк. Моның өчен безнең максатыбыз - CSF транспортын арадашлый алырлык пептидларны ачыклау иде, чөнки алар, принципиаль рәвештә, CNSка макромолекулаларны җиткерү яки яңа рецептор юлларын ачу өчен кулланылырга мөмкин. Аерым алганда, баш мие кан тамырлары системасының специфик рецепторлары һәм транспортерлары (BBB һәм BSCFB) биотерапевтик препаратларны актив һәм специфик җиткерү өчен потенциаль максатлар булып хезмәт итә ала. Баш мие сыекчасы (CSF) - хориоид плексусының (CS) секретор продукты һәм субарахноидаль киңлек һәм карынчык киңлеге аша баш миенең интерстициаль сыекчасы белән турыдан-туры бәйләнештә була4. Күптән түгел субарахноидаль баш мие сыекчасы баш миенең интерстициаль киңлегенә артык күп таралуы күрсәтелде9. Без паренхималь киңлеккә бу субарахноидаль керү юлын кулланып яки турыдан-туры МЭБ аша керергә өметләнәбез. Моңа ирешү өчен, без бу ике төрле юлның берсе белән ташыла торган пептидларны идеаль рәвештә ачыклый торган ныклы in vivo фаг сайлау стратегиясен гамәлгә ашырдык.
Хәзер без иң югары китапханә төрлелеге белән башлангыч сайлау турларын күзәтү өчен югары үткәрүчәнлекле секвенирлау (HTS) белән берлектә CSF үрнәкләрен алу белән in vivo фаг дисплей скринингы ысулын тасвирлыйбыз. Скрининг кан пычрануын булдырмас өчен даими рәвештә имплантацияләнгән зур цистерна (CM) канюлясы булган аңлы тычканнарда үткәрелде. Иң мөһиме, бу ысул мигә юнәлтелгән һәм цереброваскуляр киртә аша транспорт активлыгы булган пептидларны сайлый. Без T7 фагларын кечкенә зурлыклары (~60 нм) аркасында кулландык10 һәм аларның эндотелиаль һәм/яки эпителиаль-медулла киртәсен трансклеткалы кичү мөмкинлеге бирә торган везикулаларны ташу өчен яраклы булуын тәкъдим иттек. Дүрт тур паннингтан соң, in vivo CSF ​​баету һәм церебраль микротамырлар ассоциациясе күрсәткән фаг популяцияләре аерып алынды. Иң мөһиме, без өстенлекле һәм химик яктан синтезланган иң яхшы кандидат пептидларның аксым йөкләрен цереброспиналь сыекчага ташый алуын күрсәтеп, ачышларыбызны раслый алдык. Беренчедән, Үзәк Нерв Системасының фармакодинамик йогынтысы BACE1 пептиды ингибиторы белән алдынгы транзит пептидын берләштереп билгеләнде. In vivo функциональ скрининг стратегияләре яңа баш мие транспорты пептидларын нәтиҗәле аксым йөк ташучылар буларак билгели алуын күрсәтүдән тыш, без охшаш функциональ сайлау ысулларының яңа баш мие транспорты юлларын билгеләүдә дә мөһим роль уйнавын көтәбез.
Бляшка формалаштыручы берәмлекләргә (PFU) нигезләнеп, фаг төргәкләү этабыннан соң, якынча 109 төрлелеккә ия булган очраклы 12-мер сызыклы T7 фаг пептидлары китапханәсе эшләнде һәм булдырылды (Материаллар һәм методларны карагыз). Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, без in vivo панировкалау алдыннан бу китапханәне җентекләп анализладык. Модификацияләнгән праймерлар кулланып фаг китапханәсе үрнәкләрен ПЦР көчәйтү HTS өчен турыдан-туры кулланыла торган ампликоннар тудырды (Өстәмә 1a рәсем). А) HTS11 секвенирлау хаталары, б) праймерларның (NNK)1-12 сыйфатына йогынты, һәм в) резерв китапханәсендә кыргый типтагы (wt) фагларның (скелет өстәмәләре) булуы аркасында, тикшерелгән секвенирлау мәгълүматын гына алу өчен секвенирлау фильтрлау процедурасы гамәлгә ашырылды (Өстәмә 1b рәсем). Бу фильтрлау адымнары барлык HTS секвенирлау китапханәләренә дә кагыла. Стандарт китапханә өчен барлыгы 233 868 уку алынган, шуларның 39% фильтр критерийларын узган һәм китапханә анализы һәм киләсе турлар өчен сайлау өчен кулланылган (Өстәмә 1c–e рәсем). Укулар, нигездә, озынлыгы 3 нигез парының күпләтелгән саны булган, пигы 36 нуклеотидта булган (Өстәмә 1c рәсем), бу китапханә дизайнын (NNK) 1-12 раслый. Шунысы игътибарга лаек, китапханә әгъзаларының якынча 11% ында 12 үлчәмле кыргый типтагы (wt) төп структуралы PAGISRELVDKL кертмәсе булган, һәм эзлеклелекләрнең яртысы диярлек (49%) кертмәләрне яки бетерүләрне үз эченә алган. Китапханә китапханәсенең HTSы китапханәдә пептидларның югары төрлелеген раслаган: пептид эзлеклелекләренең 81% тан артыгы бер тапкыр гына табылган һәм нибары 1,5% ы ≥4 күчермәдә булган (Өстәмә 2a рәсем). Репертуардагы барлык 12 позициядә дә аминокислоталарның (aa) ешлыклары дегенерацияләнгән NKK репертуары тарафыннан барлыкка китерелгән кодоннар саны өчен көтелгән ешлыклар белән яхшы корреляцияләнгән (Өстәмә 2b рәсем). Бу кертмәләр белән кодланган AA калдыкларының күзәтелгән ешлыгы исәпләнгән ешлык белән яхшы корреляцияләнгән (r = 0,893) (Өстәмә 2c рәсем). Фаг китапханәләрен инъекциягә әзерләү эндотоксинны көчәйтү һәм бетерү этапларын үз эченә ала. Бу элек фаг китапханәләренең төрлелеген киметүе күрсәтелгән иде12,13. Шуңа күрә без эндотоксинны бетерүдән үткән пластинка белән көчәйтелгән фаг китапханәсен секвенирладык һәм аны AA ешлыгын бәяләү өчен оригиналь китапханә белән чагыштырдык. Оригиналь пул һәм көчәйтелгән һәм чистартылган пул арасында көчле корреляция (r = 0,995) күзәтелде (Өстәмә 2d рәсем), бу T7 фагын кулланып пластинкаларда көчәйтелгән клоннар арасындагы көндәшлекнең зур тайпылышлар тудырмавын күрсәтә. Бу чагыштыру һәр китапханәдә трипептид мотивларының ешлыгына нигезләнгән, чөнки китапханәләрнең төрлелеген (~109) хәтта HTS белән дә тулысынча чагылдырып булмый. Һәр позициядә аа ешлыгын анализлау кертелгән репертуарның соңгы өч позициясендә позициягә бәйле кечкенә тайпылышны ачыклады (Өстәмә 2e рәсем). Йомгаклап әйткәндә, без китапханәнең сыйфаты һәм төрлелеге кабул ителә торган һәм берничә сайлау турлары арасында фаг китапханәләрен көчәйтү һәм әзерләү аркасында төрлелектә кечкенә үзгәрешләр генә күзәтелгән дигән нәтиҗәгә килдек.
Аңлы тычканнарның CM-на канюляны хирургик юл белән имплантацияләү юлы белән серияле баш мие сыекчасы сынамасын алырга мөмкин, бу BBB һәм/яки BCSFB аша вена эченә кертелгән T7 фагын ачыклауны җиңеләйтә (iv) (1a-b рәсем). Без in vivo сайлауның беренче өч этабында ике бәйсез сайлау кулын (A һәм B куллары) кулландык (1c рәсем). Без сайлауның беренче өч этабында кертелгән фагның гомуми күләмен киметү юлы белән сайлауның катгыйлыгын әкренләп арттырдык. Паннингның дүртенче этабы өчен без A һәм B тармакларыннан үрнәкләрне берләштердек һәм өч өстәмә бәйсез сайлау үткәрдек. Бу модельдә T7 фаг кисәкчәләренең in vivo үзлекләрен өйрәнү өчен, кыргый типтагы фаг (PAGISRELVDKL төп кертү) тычканнарга койрык венасы аша кертелде. Фагларның баш мие сыекчасыннан һәм каннан төрле вакыт нокталарында алынуы чагыштырмача кечкенә T7 икосаэдр фагларының кан бүлегеннән тиз башлангыч чистарту фазасына ия булуын күрсәтте (Өстәмә 3 нче рәсем). Күселәрнең титрларына һәм кан күләменә нигезләнеп, без венага инъекциядән соң 10 минуттан соң кан эчендә кулланылган дозадан якынча 1% авырлыктагы фагның гына ачыкланганын исәпләдек. Бу башлангыч тиз кимүдән соң, беренчел клиренсның акрынрак булуы һәм 27,7 минут ярым-аерылу чоры белән үлчәнүе күзәтелде. Иң мөһиме, CSF бүлегеннән бик аз фаглар гына алынды, бу CSF бүлегенә кыргый типтагы фагларның миграциясе өчен түбән фон булуын күрсәтә (Өстәмә 3 нче рәсем). Уртача алганда, бөтен үрнәк алу чорында (0-250 мин) арка мие сыекчасында кандагы Т7 фагының якынча 1 х 10-3% титрлары һәм башта кертелгән фагларның 4 х 10-8% титрлары гына ачыкланды. Шунысы игътибарга лаек, кыргый типтагы фагның арка мие сыекчасындагы ярым-аерылу чоры (25,7 мин) канда күзәтелгәнгә охшаш иде. Бу мәгълүматлар CM-каннуляцияләнгән тычканнарда CSF бүлеген каннан аерып торган киртәнең бөтен булуын күрсәтә, бу фаг китапханәләрен in vivo сайлау ярдәмендә каннан CSF бүлегенә җиңел күчерелә торган клоннарны ачыкларга мөмкинлек бирә.
(а) Зур бассейннан арка-ми сыекчасын (CSF) кабаттан алу ысулын билгеләү. (б) Үзәк нерв системасы (CNS) киртәсенең күзәнәк урнашуын һәм кан-баш мие барьерын (GBB) һәм кан-баш мие барьерын кисеп үтүче пептидларны ачыклау өчен кулланылган сайлау стратегиясен күрсәтүче диаграмма. (в) In vivo фаг дисплей скрининг блок-схемасы. Сайлап алуның һәр этабында фаглар (уклар эчендәге хайван идентификаторлары) вена эченә кертелде. 4 нче сайлау этабына кадәр ике бәйсез альтернатив тармак (A, B) аерым тотыла. 3 һәм 4 нче сайлау этаплары өчен CSFтан алынган һәр фаг клоны кул белән секвенирланды. (г) T7 пептид китапханәсен (2 x 1012 фаг/хайван) вена эченә керткәннән соң, ике канюляцияләнгән тычканга беренче сайлау этабында каннан (кызыл түгәрәкләр) һәм арка-ми сыекчасыннан (яшел өчпочмаклар) аерылган фаг кинетикасы. Зәңгәр квадратлар кандагы фагның уртача башлангыч концентрациясен күрсәтә, ул инъекцияләнгән фаг күләменнән исәпләнә, гомуми кан күләмен исәпкә алып. Кара квадратлар кандагы фаг концентрацияләреннән экстраполяцияләнгән y сызыгының кисешү ноктасын күрсәтә. (e,f) Пептидта табылган барлык мөмкин булган капланучы трипептид мотивларының чагыштырма ешлыгын һәм бүленешен күрсәтегез. 1000 укуда табылган мотивлар саны күрсәтелгән. Күренекле рәвештә (p < 0,001) байытылган мотивлар кызыл нокталар белән билгеләнгән. (e) Инъекцияләнгән китапханәнең трипептид мотивының чагыштырма ешлыгын 1.1 һәм 1.2 хайваннардан каннан алынган фаг белән чагыштыручы корреляция таралу графигы. (f) Канда һәм арка мие сыекчасында изоляцияләнгән 1.1 һәм 1.2 хайваннар фагының трипептид мотивларының чагыштырма ешлыгын чагыштыручы корреляция таралу графигы. (g, h) Ике хайванда да in vivo сайлаудан соң кан белән баетылган фагның (g) инъекцияләнгән китапханәләргә һәм CSF белән баетылган фагның (h) кан белән чагыштырмача эзлеклелек ID күрсәткече. Бер хәрефле кодның зурлыгы бу аминокислота шул урында ни дәрәҗәдә еш очрый икәнен күрсәтә. Яшел = поляр, шәмәхә = нейтраль, зәңгәр = төп, кызыл = кислоталы һәм кара = гидрофоб аминокислоталар. 1a, b рәсемнәрен Эдуард Урих эшләгән һәм җитештергән.
Без ике CM инструмент тычканына (А һәм В кладлары) фаг пептид китапханәсен керттек һәм фагны баш мие сыекчасыннан һәм каннан аерып алдык (1d рәсем). Китапханәнең башлангыч тиз чистартылуы кыргый типтагы фаг белән чагыштырганда азрак сизелде. Ике хайванда да кертелгән китапханәнең уртача яртылаш таркалу вакыты кан эчендә 24,8 минут, кыргый типтагы фагка охшаган, һәм CSFта 38,5 минут тәшкил итте. Һәр хайванның кан һәм баш мие сыекчасы фаг үрнәкләре HTSка дучар ителде һәм ачыкланган барлык пептидлар да кыска трипептид мотивы булу-булмавын тикшерелде. Трипептид мотивлары сайланды, чөнки алар структура формалашуы һәм пептид-аксым үзара бәйләнеше өчен минималь нигез бирә14,15. Без кертелгән фаг китапханәсе һәм ике хайванның да каныннан алынган клоннар арасында мотивлар бүленешендә яхшы корреляция таптык (1e рәсем). Мәгълүматлар китапханә составының кан бүлегендә аз гына баетылганлыгын күрсәтә. Аминокислота ешлыклары һәм консенсус эзлеклелеге һәр позициядә Weblogo16 программасының адаптациясен кулланып анализланды. Кызыклысы шунда ки, без кан глицин калдыкларында көчле баюны ачыкладык (1g рәсем). Канны CSFтан сайланган клоннар белән чагыштырганда, көчле сайлау һәм мотивларның кайбер сайланмавы күзәтелде (1f рәсем), һәм кайбер аминокислоталар 12 әгъзалы генезда алдан билгеләнгән позицияләрдә өстенлекле рәвештә бар иде (1h рәсем). Аерым хайваннарның арка мие сыекчасында аермалар сизелерлек иде, ә кан глицинына баю ике хайванда да күзәтелде (Өстәмә 4a–j рәсем). 1.1 һәм 1.2 хайваннарның арка мие сыекчасындагы эзлеклелек мәгълүматларын катгый фильтрлаганнан соң, барлыгы 964 һәм 420 уникаль 12-мер пептидлары алынды (Өстәмә 1d–e рәсем). Аерым алынган фаг клоннары көчәйтелде һәм in vivo сайлауның икенче этабына дучар ителде. Икенче тур сайлаудан алынган фаг һәр хайванда HTSка дучар ителде һәм ачыкланган барлык пептидлар трипептид мотивларының барлыкка килүен анализлау өчен мотив тану программасына керү буларак кулланылды (2a, b, ef рәсемнәре). CSFтан алынган фагның беренче циклы белән чагыштырганда, без A һәм B тармакларындагы CSFта күп мотивларның алга таба сайлануын һәм сайланмавын күзәттек (2 нче рәсем). Аларның төрле эзлеклелек үрнәкләрен күрсәтүен билгеләү өчен челтәр идентификацияләү алгоритмы кулланылды. Альтернатив A кладында (2c, d рәсемнәре) һәм B кладында CSF тарафыннан алынган 12 үлчәмле эзлеклелекләр арасында ачык охшашлык күзәтелде (2g, h рәсемнәре). Һәр тармактагы берләштерелгән анализ 12-мер пептидлары өчен төрле сайлау профильләрен күрсәтте (Өстәмә 5c, d рәсемнәре) һәм икенче тур сайлаудан соң берләштерелгән клоннар өчен беренче тур сайлау белән чагыштырганда вакыт узу белән CSF/кан титрлары нисбәте артуын күрсәтте (Өстәмә 5e рәсемнәре).
In vivo функциональ фаг дисплей сайлауның ике рәттән туры килүе белән арка мие сыекчасындагы мотивларны һәм пептидларны баету.
Һәр хайванның беренче раундыннан алынган барлык баш мие сыекчасы фаглары (№1.1 һәм №1.2 хайваннар) берләштерелде, көчәйтелде, HT-эзлекле итеп билгеләнде һәм бергә кабат инъекцияләнде (2 x 1010 фаг/хайван). 2 SM канюляцияләнгән тычканга (№1.1 → №). 2.1 һәм 2.2, 1.2 → 2.3 һәм 2.4). (a,b,e,f) Беренче һәм икенче сайлау раундларында барлык CSF-тан алынган фагларның трипептид мотивларының чагыштырмача ешлыгын чагыштыручы корреляция таралу графигы. Ике юнәлештә дә пептидларда табылган барлык мөмкин булган капланучы трипептидларны күрсәтүче мотивларның чагыштырмача ешлыгы һәм таралышы. 1000 укуда табылган мотивлар саны күрсәтелгән. Чагыштырылган китапханәләрнең берсендә мөһим дәрәҗәдә сайланган яки чыгарылган мотивлар (p < 0.001) кызыл нокталар белән билгеләнгән. (c, d, g, h) In vivo сайлауның 2 һәм 1 нче турларына нигезләнгән барлык CSFка бай 12 аминокислота озын эзлеклелекләренең эзлеклелек логотибы күрсәтелеше. Бер хәрефле кодның зурлыгы бу аминокислота шул позициядә ни дәрәҗәдә еш очрый икәнен күрсәтә. Логотипны күрсәтү өчен, ике сайлау турлары арасында аерым хайваннардан алынган CSF эзлеклелекләренең ешлыгы чагыштырыла һәм икенче турдагы баетылган эзлеклелекләр күрсәтелә: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 һәм (h) #1.2–#2.4. (c, d) 2.1 һәм 2.2 нче хайваннарда яки (g, h) 2.3 һәм 2.4 нче хайваннарда билгеле бер позициядә иң күп баетылган аминокислоталар төсле күрсәтелгән. Яшел = поляр, шәмәхә = нейтраль, зәңгәр = төп, кызыл = кислоталы һәм кара = гидрофоб аминокислоталар.
Өченче сайлау этабыннан соң, без ике хайваннан аерылган 332 CSF белән торгызылган фаг клоннарыннан 124 уникаль пептид эзлеклелеген (#3.1 һәм #3.2) ачыкладык (6a өстәмә рәсем). LGSVS эзлеклелеге (18.7%) иң югары чагыштырма пропорциягә ия булды, аннан соң PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) һәм SARGSWREIVSLS (2.2%) кыргый типтагы кертмәләр килде. Соңгы дүртенче турда без өч аерым хайваннан ике бәйсез сайланган тармакны берләштердек (1c рәсем). CSFтан алынган 925 секвенцияләнгән фаг клоныннан дүртенче турда без 64 ​​уникаль пептид эзлеклелеген таптык (6b өстәмә рәсем), алар арасында кыргый типтагы фагның чагыштырма пропорциясе 0.8% ка кадәр төште. Дүртенче турда иң еш очрый торган CSF клоннары LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSLNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) һәм RLSSVDSDLSGC (3, 2%) булды. %)). Сайланган пептидларның озынлык диапазоны NNK китапханәсе дизайны өчен дегенератив кодоннар кулланылганда китапханә праймерларындагы нуклеотидлар кертү/бетерү яки вакытыннан алда туктау кодоннары белән бәйле. Вакытыннан алда туктау кодоннары кыскарак пептидлар барлыкка китерә һәм аларда уңай AA мотивы булганга күрә сайлана. Озынрак пептидлар синтетик китапханәләр праймерларындагы кертү/бетерү нәтиҗәсендә килеп чыгарга мөмкин. Бу эшләнгән туктау кодонын кадрдан тыш урнаштыра һәм аны яңа туктау кодоны барлыкка килгәнче укый. Гомумән алганда, без барлык дүрт сайлау турлары өчен дә баету коэффициентларын керү мәгълүматларын үрнәк чыгару мәгълүматлары белән чагыштырып исәпләдек. Скринингның беренче этабында без специфик булмаган фон белешмәсе буларак кыргый типтагы фаг титрларын кулландык. Кызыклысы шунда ки, беренче CSF циклында тискәре фаг сайлавы бик көчле булды, ләкин канга түгел (3a рәсем), бу пептид китапханәсенең күпчелек әгъзаларының CSF бүлегенә пассив диффузиясенең түбән ихтималы белән бәйле булырга мөмкин, яки чагыштырма фаглар бактериофагларга караганда кан агымыннан нәтиҗәлерәк сакланырга яки чыгарылырга омтыла. Ләкин, паннингның икенче этабында ике кладта да CSFта фагларның көчле сайланышы күзәтелде, бу алдагы этапта CSF сеңүен стимуллаштыручы пептидлар күрсәтүче фаглар белән баетылганлыгын күрсәтә (3a рәсем). Тагын бер тапкыр, канның күпләп баюы булмаган. Шулай ук ​​өченче һәм дүртенче этапларда фаг клоннары CSF белән шактый баетылган. Соңгы ике этап арасындагы һәр уникаль пептид эзлеклелегенең чагыштырма ешлыгын чагыштырып, без дүртенче этапта эзлеклелекләрнең тагын да байрак булуын ачыкладык (3b рәсем). Пептид юнәлешләрен кулланып, барлык 64 уникаль пептид эзлеклелегеннән барлыгы 931 трипептид мотивы алынды. Дүртенче турда иң баетылган мотивлар, кертелгән китапханә белән чагыштырганда, барлык турларда да баету профильләре өчен җентекләбрәк тикшерелде (чик: 10% баету) (Өстәмә 6c рәсем). Сайлап алуның гомуми үрнәкләре күрсәткәнчә, өйрәнелгән мотивларның күбесе ике сайлап алу тармагының да алдагы барлык турларында да баетылган. Ләкин, кайбер мотивлар (мәсәлән, SGL, VSG, LGS GSV), нигездә, альтернатив А кладыннан, ә калганнары (мәсәлән, FGW, RTN, WGF, NTR) альтернатив В кладында баетылган.
Стрептавидин йөкләнешенә кушылган CSF белән баетылган фаг белән күрсәтелгән пептидларның һәм биотинилланган лидер пептидларының CSF транспортын тикшерү.
(a) Барлык дүрт раундта да (R1-R4) инъекцияләнгән (керү = I) фаг (PFU) титрларына һәм билгеләнгән CSF фаг титрларына (чыгу = O) нигезләнеп исәпләнгән баету коэффициентлары. Соңгы өч раунд өчен баету коэффициентлары (R2-R4) авырлык мәгълүматлары белән алдагы раунд һәм беренче раунд (R1) белән чагыштырып исәпләнде. Ачык баганалар - цереброспиналь сыекча, күләгәле баганалар - плазма. (***p<0.001, Стьюдентның t-тестына нигезләнгән). (b) Иң күп таралган фаг пептидлары исемлеге, аларның 4 нче сайлау раундыннан соң CSFта җыелган барлык фагларга карата чагыштырма нисбәтенә карап рейтингка кертелгән. Иң еш очрый торган алты фаг клоны төсле, номерланган һәм 3 һәм 4 нче сайлау раундлары арасында аларның баету коэффициентлары күрсәтелгән (өстәмәләр). (c, d) 4 нче раундтан иң күп баетылган алты фаг клоны, буш фаг һәм ата-ана фаг пептид китапханәләре CSF үрнәк алу моделендә аерым анализланды. Күрсәтелгән вакыт нокталарында ми сыекчасы һәм кан үрнәкләре җыелды. (в) Тигез күләмдә 6 кандидат фаг клоны (2 x 1010 фаг/хайван), буш фаглар (#1779) (2 x 1010 фаг/хайван) һәм фаг пептид китапханәләре (2 x 1012 фаг/хайван) канюляцияләнгән хайванга кимендә 3 CM койрык венасы аша аерым кертелә. Һәр кертелгән фаг клоны һәм фаг пептид китапханәсенең вакыт узу белән ми сыекчасы фармакокинетикасы күрсәтелгән. (г) үрнәк алу вакыты эчендә барлык алынган фаглар/мл өчен уртача ми сыекчасы/кан нисбәтен күрсәтә. (д) Дүрт синтетик лидер пептиды һәм бер контроль пептид биотин белән стрептавидинга N-терминалы (тетрамер дисплейы) аша бәйләнгән, аннары инъекция ясалган (койрык венасы венасына, 10 мг стрептавидин/кг). Кимендә өч интубацияләнгән тычкан (N = 3). Күрсәтелгән вакыт нокталарында CSF үрнәкләре җыелды һәм стрептавидин концентрацияләре CSF антистрептавидин ELISA ярдәмендә үлчәнде (nd = ачыкланмады). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA тесты нигезендә). (f) Иң бай фаг пептид клоны #2002 (шәмәхә төстәге) аминокислота эзлеклелеген 4 нче сайлау турыннан сайланган башка фаг пептид клоннары белән чагыштыру. Бер үк һәм охшаш аминокислота фрагментлары төсләр белән кодланган.
Дүртенче турдагы барлык баетылган фаглардан (3б рәсем), CSF үрнәк алу моделендә өстәмә аерым анализ өчен алты кандидат клон сайланды. Өч канюляцияләнгән CM хайванына алты кандидат фаг, буш фаг (кертүсез) һәм профаг пептид китапханәләренең тигез күләмдә кертелде, һәм фармакокинетика CSF (3в рәсем) һәм кан (өстәмә 7 нче рәсем) анализларында билгеләнде. Сыналган барлык фаг клоннары да CSF бүлегенә буш контроль фагныкыннан (#1779) 10-1000 тапкыр югарырак дәрәҗәдә юнәлтелгән. Мәсәлән, #2020 һәм #2077 клоннары контроль фагныкыннан якынча 1000 тапкыр югарырак CSF титрларына ия иде. Сайланган һәр пептидның фармакокинетик профиле төрле, ләкин аларның барысы да CSF өйләшү сәләтенә ия. Без вакыт узу белән №1903 һәм №2011 клоннары өчен даими кимүне күзәттек, ә №2077, №2002 һәм №2009 клоннары өчен беренче 10 минут эчендә арту актив транспортны күрсәтергә мөмкин, ләкин моны тикшерергә кирәк. №2020, №2002 һәм №2077 клоннары югары дәрәҗәдә тотрыклыланды, ә №2009 клонының CSF концентрациясе башлангыч артудан соң әкренләп кимеде. Аннары без һәр CSF кандидатының чагыштырма ешлыгын аның кан концентрациясе белән чагыштырдык (3d рәсем). Һәр CSF кандидатының уртача титрының барлык үрнәк алу вакытларында аның кан титры белән корреляциясе алты кандидатның өчесе кан CSF белән шактый бай булуын күрсәтте. Кызыклысы шунда ки, №2077 клоны канның югарырак тотрыклылыгын күрсәтте (Өстәмә 7 нче рәсем). Пептидларның үзләренең CSF бүлегенә фаг кисәкчәләреннән тыш башка йөкләрне актив рәвештә ташый алуларын раслау өчен, без пептидлар фаг кисәкчәсенә тоташкан N-терминалда биотин белән алынган дүрт лидер пептидын синтезладык. Биотинланган пептидлар (2002, 2009, 2020 һәм 2077 номерлы) стрептавидин (SA) белән кушылып, фаг геометриясен бераз кабатлаган мультимер формалар алынды. Бу формат безгә шулай ук ​​кан һәм баш мие сыекчасындагы SA тәэсирен йөк ташучы аксым пептидлары буларак үлчәргә мөмкинлек бирде. Иң мөһиме, синтетик пептидлар бу SA белән конъюгацияләнгән форматта кулланылганда, фаг мәгълүматларын еш кына кабатларга мөмкин иде (3e рәсем). Кушылдырылган пептидларның башлангыч тәэсире азрак һәм баш мие сыекчасыннан 48 сәгать эчендә ачыкланмый торган дәрәҗәләр белән тизрәк чистарту булды. Бу пептид фаг клоннарының баш мие сыекчасына җиткерү юлларын аңлау өчен, без in vivo вена эченә инъекциядән соң 1 сәгатьтән соң фаг кисәкчәләрен турыдан-туры ачыклау өчен иммуногистохимия (IHC) кулланып, аерым фаг пептидлары тәэсирләренең локализациясен анализладык. Шунысы игътибарга лаек, #2002, #2077 һәм #2009 клоннарын ми капиллярларында көчле буяу ярдәмендә ачыкларга мөмкин, ә контроль фаг (#1779) һәм #2020 клоны ачыкланмаган (Өстәмә 8 нче рәсем). Бу пептидларның BBB аша үтеп, мигә йогынты ясауда өлеш кертүен күрсәтә. Бу гипотезаны тикшерү өчен өстәмә җентекле анализ кирәк, чөнки BSCFB юлы да катнашырга мөмкин. Иң бай клонның (#2002) аминокислота эзлеклелеген башка сайланган пептидлар белән чагыштырганда, аларның кайберләренең охшаш аминокислота киңәйтүләре булуы билгеләп үтелде, бу охшаш транспорт механизмын күрсәтергә мөмкин (3f рәсем).
Плазма профиле үзенчәлекле булуы һәм вакыт узу белән CSF күләменең сизелерлек артуы аркасында, №2077 фаг-дисплей клоны 48 сәгатьлек озынрак чорда өйрәнелде һәм SA дәрәҗәләренең тотрыклы булуы белән бәйле рәвештә күзәтелгән CSF күләменең тиз артуын кабатлый алды (4a рәсем). Башка ачыкланган фаг клоннарына килгәндә, №2077 ми капиллярлары өчен көчле буялган һәм югарырак ачыклыкта караганда капилляр маркер лектин белән колокализациянең сизелерлек булуын һәм, мөгаен, паренхималь киңлектә буялу булуын күрсәтте (4b рәсем). Үзәк нерв системасында пептидлар ярдәмендә фармакологик эффектлар алырга мөмкинме-юкмы икәнен тикшерү өчен, без эксперимент үткәрдек, анда i) №2077 транзит пептиды һәм ii) BACE1 ингибитор пептидының биотиниллаштырылган версияләре SA белән ике төрле нисбәттә кушылды. Бер комбинация өчен без бары тик BACE1 пептид ингибиторын гына кулландык, ә икенчесе өчен без BACE1 пептид ингибиторының №2077 пептидына 1:3 нисбәтен кулландык. Ике үрнәк тә вена эченә кертелде, һәм кан һәм баш мие сыекчасындагы бета-амилоид пептиды 40 (Abeta40) дәрәҗәләре вакыт узу белән үлчәнде. Abeta40 баш мие паренхимасында BACE1 ингибициясен чагылдырганлыктан, баш мие мускулында үлчәнде. Көтелгәнчә, ике комплекс та Abeta40ның кан дәрәҗәсен сизелерлек киметте (4c, d рәсемнәр). Ләкин, 2077 нче пептид һәм SA белән конъюгацияләнгән BACE1 пептиды ингибиторы катнашмасын үз эченә алган үрнәкләр генә баш мие сыекчасында Abeta40ның сизелерлек кимүенә китерде (4c рәсемнәр). Мәгълүматлар күрсәткәнчә, 2077 нче пептид 60 кДа SA аксымын үзәк нерв системасына күчерә ала, шулай ук ​​BACE1 пептидының SA белән конъюгацияләнгән ингибиторлары белән фармакологик эффектлар китереп чыгара.
(а) Кимендә өч CM-интубацияләнгән тычканнарда CSF пептиды #2077 (RLSSVDSDLSGC) һәм инъекциясез контроль фагының (#1779) озак вакытлы фармакокинетик профильләрен күрсәтүче T7 фагының клональ инъекциясе (2 × 10 фаг/хайван). (б) Фаг инъекцияләнгән тычканнарда (2 × 10 10 фаг/хайван) типик кортикаль микротамырларның конфокаль микроскопик сурәте #2077 пептиды һәм кан тамырларының (лектин) контр-буявын күрсәтә. Бу фаг клоннары 3 тычканга бирелде һәм перфузия алдыннан 1 сәгать әйләнештә калдырылды. Баш мие киселде һәм T7 фаг капсидына каршы поликлональ FITC-маркировкаланган антитәнчекләр белән буялды. Перфузиядән һәм аннан соң фиксациядән ун минут элек DyLight594-маркировкаланган лектин вена эченә кертелде. Капиллярлар һәм периваскуляр ми тукымалары куышлыгындагы микротамырлар һәм фагларның люмен ягының лектин буялуын (кызыл) күрсәтүче флуоресцент рәсемнәр. Шкала сызыгы 10 мкм га туры килә. (c, d) Биотинланган BACE1 ингибитор пептиды аерым яки биотинланган транзит пептиды #2077 белән берлектә стрептавидин белән тоташтырылган, аннары ким дигәндә өч канюляцияләнгән CM тычканына (10 мг стрептавидин/кг) вена эченә инъекция ясалган. BACE1 пептиды ингибиторы ярдәмендә Aβ40 кимүе күрсәтелгән вакыт нокталарында кандагы (кызыл) һәм цереброспиналь сыекчадагы (кызгылт сары) Aβ1-40 ELISA ярдәмендә үлчәнгән. Ачыкрак булсын өчен, графикта 100% масштабта нокталы сызык сызылган. (c) Стрептавидин белән дәваланган тычканнарның канында (кызыл өчпочмаклар) һәм арка мие сыекчасында (кызгылт сары өчпочмаклар) Aβ40 күләменең 3:1 нисбәтендә транзит пептид #2077 һәм BACE1 ингибитор пептиды белән конъюгацияләнгәндә процент кимүе. (d) Стрептавидин белән дәваланган тычканнарның канында Aβ40 күләменең (кызыл түгәрәкләр) һәм арка мие сыекчасында (кызгылт сары түгәрәкләр) процент кимүе, бары тик BACE1 ингибитор пептиды белән генә. Контроль төркемендә Aβ концентрациясе 420 пг/мл тәшкил иткән (стандарт тайпылыш = 101 пг/мл).
Фаг дисплейы биомедицина тикшеренүләренең берничә өлкәсендә уңышлы кулланылды17. Бу ысул in vivo кан тамырлары төрлелеген өйрәнү өчен18,19, шулай ук ​​баш мие кан тамырларына юнәлтелгән тикшеренүләр өчен20,21,22,23,24,25,26 кулланылды. Бу тикшеренүдә без бу сайлау ысулын куллануны баш мие кан тамырларына юнәлтелгән пептидларны турыдан-туры билгеләүгә генә түгел, ә кан-баш мие барьерын кичеп чыгу өчен актив транспорт үзлекләренә ия кандидатларны ачуга да киңәйттек. Хәзер без CM интубацияләнгән тычканнарда in vivo сайлау процедурасын эшләүне тасвирлыйбыз һәм аның CSF геминг үзлекләре булган пептидларны ачыклау мөмкинлеген күрсәтәбез. 12-мер очраклы пептидлар китапханәсен күрсәтүче T7 фагын кулланып, без T7 фагының кан-баш мие барьерына җайлашырлык кечкенә (диаметры якынча 60 нм)10 булуын, шуның белән турыдан-туры кан-баш мие барьерын яки хориоид плексусын кисеп үтүен күрсәтә алдык. Без канюляцияләнгән CM тычканнарыннан CSF җыюның in vivo функциональ скрининг ысулы яхшы контрольдә тотылуын һәм алынган фагның кан тамырларына бәйләнгән генә түгел, ә кан-баш мие барьеры аша транспортер булып та эшләвен күзәттек. Моннан тыш, бер үк вакытта кан җыеп һәм CSFка һәм каннан алынган фагларга HTS кулланып, без CSF сайлауга кан баюы яки сайлау турлары арасында киңәюгә яраклылык тәэсир итмәвен расладык. Ләкин, кан бүлеге сайлау процедурасының бер өлеше булып тора, чөнки CSF бүлегенә җитә алырлык фаглар мидә баету өчен кан агымында җитәрлек вакыт яшәп калырга һәм әйләнергә тиеш. Чимал CSF мәгълүматларыннан ышанычлы эзлеклелек мәгълүматын алу өчен, без анализ эш процессында платформага хас эзлеклелек хаталарына җайлаштырылган фильтрлар кулландык. Скрининг ысулына кинетик параметрларны кертү аша без кыргый типтагы T7 фагларының кандагы тиз фармакокинетикасын (t½ ~ 28 мин) расладык24, 27, 28 һәм шулай ук ​​аларның баш мие сыекчасындагы ярты гомерен (t½ ~ 26 мин) минутына билгеләдек. Кан һәм CSFдагы охшаш фармакокинетик профильләргә карамастан, CSFта фагның кан концентрациясенең нибары 0,001% ы гына ачыкланган, бу кыргый типтагы Т7 фагының кан-баш мие барьеры аша түбән мобильлеген күрсәтә. Бу эш in vivo паннинг стратегияләрен кулланганда, бигрәк тә кан әйләнешеннән тиз арада чыгарылган фаг системалары өчен, сайлауның беренче этабының мөһимлеген күрсәтә, чөнки CNS бүлегенә аз санлы клоннар гына җитә ала. Шулай итеп, беренче этапта китапханә төрлелегенең кимүе бик зур булды, чөнки бу бик катгый CSF моделендә чикләнгән сандагы клоннар гына җыелды. Бу in vivo паннинг стратегиясе берничә сайлау этабын үз эченә алды, мәсәлән, CSF бүлегендә актив туплану, кан бүлегендә клонның исән калуы һәм беренче 10 минут эчендә каннан Т7 фаг клоннарын тиз арада чыгару (1d рәсем һәм өстәмә 4M рәсем). Шулай итеп, беренче этаптан соң, CSFта төрле фаг клоннары ачыкланды, гәрчә аерым хайваннар өчен бер үк башлангыч пул кулланылса да. Бу күп санлы китапханә әгъзалары булган чыганак китапханәләре өчен күп катгый сайлау адымнары төрлелекнең сизелерлек кимүенә китерә дип фаразлый. Шуңа күрә очраклы вакыйгалар башлангыч сайлау процессының аерылгысыз өлешенә әйләнәчәк, нәтиҗәгә зур йогынты ясаячак. Башлангыч китапханәдәге күп клоннарның CSF баету омтылышы бик охшаш булгандыр. Ләкин, хәтта бер үк эксперименталь шартларда да, башлангыч пулдагы һәр конкрет клонның аз саны аркасында сайлау нәтиҗәләре аерылып торырга мөмкин.
CSF белән баетылган мотивлар кандагы мотивлардан аерылып тора. Кызыклысы шунда ки, без аерым хайваннарның канында глицинга бай пептидларга таба беренче күчүне күзәттек. (1g рәсем, Өстәмә 4e, 4f рәсемнәр). Глицинлы пептидларны үз эченә алган фаг тотрыклырак булырга һәм кан әйләнешеннән чыгару ихтималы азрак булырга мөмкин. Ләкин бу глицинга бай пептидлар цереброспиналь сыекча үрнәкләрендә табылмады, бу сайлап алынган китапханәләрнең ике төрле сайлау этабын узуын күрсәтә: берсе кан эчендә, икенчесе цереброспиналь сыекчада тупланырга мөмкинлек бирде. Дүртенче тур сайлау нәтиҗәсендә барлыкка килгән CSF белән баетылган клоннар киң сыналган. Аерым сыналган клоннарның барысы да диярлек буш контроль фаг белән чагыштырганда CSF белән баетылган дип расланган. Бер пептид (#2077) җентекләбрәк тикшерелгән. Ул башка тәэсирләргә караганда плазманың яртылаш таркалу чорын озаграк күрсәтте (3d рәсем һәм 7 нче өстәмә рәсем), һәм кызыклысы шунда ки, бу пептидта С-терминалында цистеин калдыгы бар иде. Күптән түгел пептидларга цистеин өстәү аларның фармакокинетик үзлекләрен альбумин 29 белән бәйләнешкә кереп яхшырта алачагы күрсәтелде. Бу хәзерге вакытта 2077 нче пептид өчен билгесез һәм өстәмә тикшеренүләр таләп итә. Кайбер пептидлар CSF баетуында валентлыкка бәйлелек күрсәттеләр (мәгълүматлар күрсәтелмәгән), бу T7 капсидының күрсәтелгән өслек геометриясе белән бәйле булырга мөмкин. Без кулланган T7 системасы һәр фаг кисәкчәсендә һәр пептидның 5-15 күчермәсен күрсәтте. IHC тычканнарның баш мие кабыгына вена эченә кертелгән кандидат-кургаш фаг клоннарында башкарылды (8 нче өстәмә рәсем). Мәгълүматлар ким дигәндә өч клонның (№ 2002, № 2009 һәм № 2077) BBB белән үзара бәйләнештә булуын күрсәтте. Бу BBB үзара бәйләнеше CSF туплануына яки бу клоннарның турыдан-туры BCSFBга күчүенә китерәме, әлегә ачыкланырга тиеш. Иң мөһиме, без сайланган пептидларның синтезланганда һәм аксым йөкенә бәйләнгәндә CSF транспорт сәләтен саклап калуын күрсәтәбез. N-терминаль биотинилланган пептидларның SA белән бәйләнеше, нигездә, кан һәм цереброспиналь сыекчадагы фаг клоннары белән алынган нәтиҗәләрне кабатлый (3e рәсем). Ниһаять, без #2077 кургаш пептиды SA белән конъюгацияләнгән BACE1 биотинилланган пептид ингибиторының ми эшчәнлеген стимуллаштыра алуын, CSFта Abeta40 дәрәҗәсен сизелерлек киметү юлы белән Үзәк Нерв Системасында ачык фармакодинамик эффектлар китереп чыгаруын күрсәтәбез (4 нче рәсем). Барлык хитларның пептид эзлеклелеге гомологиясен эзләү юлы белән без мәгълүмат базасында бернинди гомологны да ачыклый алмадык. Шунысын да билгеләп үтәргә кирәк, T7 китапханәсенең зурлыгы якынча 109, ә 12-мерлар өчен теоретик китапханә зурлыгы 4 х 1015. Шуңа күрә без 12-мер пептид китапханәсенең төрлелек киңлегенең кечкенә өлешен генә сайладык, бу билгеләнгән хитларның янәшә эзлеклелек киңлеген бәяләү юлы белән оптимальләштерелгән пептидларны ачыкларга мөмкин дигәнне аңлата ала. Гипотетик яктан, бу пептидларның табигый гомологларын тапмавыбызның бер сәбәбе, мигә билгеле бер пептид мотивларының контрольсез керүен булдырмас өчен, эволюция вакытында сайлауны бетерү булырга мөмкин.
Бергәләп караганда, безнең нәтиҗәләр in vivo цереброваскуляр киртәнең транспорт системаларын җентекләбрәк ачыклау һәм характерлау буенча киләчәк эшләр өчен нигез булып тора. Бу методның төп корылмасы функциональ сайлау стратегиясенә нигезләнгән, ул церебраль кан тамырлары бәйләнеш үзенчәлекләре булган клоннарны гына түгел, ә уңышлы клоннарның in vivo CNS бүлегенә биологик киртәләрне үтеп керү өчен эчке активлыкка ия ​​булуларының мөһим адымын да үз эченә ала. Бу пептидларның транспорт механизмын һәм аларның ми өлкәсенә хас микроваскуляр системага бәйләнешкә өстенлек бирүен ачыклау. Бу BBB һәм рецепторларны транспортлау өчен яңа юллар ачуга китерергә мөмкин. Без ачыкланган пептидларның турыдан-туры цереброваскуляр рецепторларга яки BBB яки BCSFB аша ташылган әйләнештәге лигандларга бәйләнешкә керә алуын көтәбез. Бу эштә табылган CSF транспорт активлыгы булган пептид векторлары алга таба тикшереләчәк. Хәзерге вакытта без бу пептидларның BBB һәм/яки BCSFB аша үтү сәләтен тикшерү өчен ми спецификасын тикшерәбез. Бу яңа пептидлар яңа рецепторларны яки юлларны ачу һәм биологик препаратлар кебек макромолекулаларны мигә җиткерү өчен яңа югары нәтиҗәле платформалар эшләү өчен бик кыйммәтле кораллар булачак.
Зур цистернаны (ЗЦ) элек тасвирланган ысулны үзгәртеп, канюлялагыз. Анестезияләнгән Вистар тычканнары (200-350 г) стереотаксик аппаратка урнаштырылды һәм баш сөяген ачу өчен кырылган һәм асептик яктан әзерләнгән баш тиресе өстендә уртача кисем ясалды. Өске каеш өлкәсендә ике тишек бораулагыз һәм тишекләрдәге ныгыту винтларын беркетегез. Дат басмас корыч канюляны ЗЦга стереотаксик юнәлеш бирү өчен ян-яктагы өске кабырга өстәмә тишек борауланды. Канюля тирәсенә теш цементын сөртегез һәм винтлар белән ныгытыгыз. Фотокатырганнан һәм цемент катырганнан соң, тире ярасы 4/0 супрамид тегү белән ябылды. Канюляның дөрес урнашуы арка-ми сыекчасының (БМС) үзеннән-үзе агып чыгуы белән раслана. Тычканны стереотаксик аппараттан алыгыз, операциядән соң тиешле ярдәм һәм авыртуны басу алыгыз, һәм арка-ми сыекчасында кан билгеләре күзәтелгәнче, аңа ким дигәндә бер атна торгызырга рөхсәт итегез. Вистар тычканнары (Crl:WI/Han) Чарльз-Ривердан (Франция) алынган. Барлык тычканнар да билгеле бер патогеннардан азат шартларда тотылган. Барлык хайваннар белән үткәрелгән экспериментлар Швейцариянең Базель шәһәренең Ветеринария идарәсе тарафыннан расланган һәм 2474 нче Хайваннар лицензиясе нигезендә башкарылган (Тычканның баш мие сыекчасында һәм баш миендә терапевтик кандидатларның дәрәҗәсен үлчәү юлы белән минең актив транспортын бәяләү).
Кулыгызда CM канюлясы белән тычканны сак кына аңында тотыгыз. Daturaны канюлядан алыгыз һәм 10 мкл үзеннән-үзе агып торган баш мие сыекчасы җыегыз. Канюляның үткәрүчәнлеге ахыр чиктә бозылганлыктан, бу тикшеренүгә кан пычрануы яки төсе үзгәрүе билгеләре булмаган үтә күренмәле баш мие сыекчасы үрнәкләре генә кертелде. Параллель рәвештә, койрык очындагы кечкенә кисемнән якынча 10–20 мкл кан гепарин (Sigma-Aldrich) белән пробиркаларга алынды. Т7 фагын вена эченә керткәннән соң төрле вакыт нокталарында баш мие сыекчасы һәм кан җыелды. Һәр баш мие сыекчасы үрнәге җыелганчы якынча 5–10 мкл сыекча чыгарылды, бу катетерның үле күләменә туры килә.
Китапханәләр T7Select системасы кулланмасында тасвирланганча T7Select 10-3b векторы ярдәмендә булдырылды (Novagen, Rosenberg һ.б., InNovations 6, 1-6, 1996). Кыскасы, очраклы 12-мерлы ДНК кертмәсе түбәндәге форматта синтезланды:
NNK кодоны икеләтә тукталыш кодоннарын һәм өстәмәдә аминокислота артык экспрессиясен булдырмас өчен кулланылды. N - һәр нуклеотидның кул белән кушылган эквимоляр нисбәте, ә K - аденин һәм цитозин нуклеотидларының кул белән кушылган эквимоляр нисбәте. Бер чылбырлы өлкәләр dNTP (Novagen) һәм Klenow ферменты (New England Biolabs) белән Klenow буферында (New England Biolabs) 37°C температурада 3 сәгать инкубацияләү юлы белән икеләтә чылбырлы ДНКга әйләндерелде. Реакциядән соң, икеләтә чылбырлы ДНК EtOH чүп-чар белән алынды. Нәтиҗәдә барлыкка килгән ДНК EcoRI һәм HindIII рестрикция ферментлары (икесе дә Roche'тан) белән эшкәртелде. Киселгән һәм чистартылган (QIAquick, Qiagen) өстәмә (T4 лигаза, New England Biolabs) аннары 10B капсид генының 348 аминокислотасыннан соң алдан киселгән T7 векторына рамка эчендә бәйләнде. Лигация реакцияләре in vitro төргәкләү алдыннан 16°C температурада 18 сәгать инкубацияләнде. In vitro фаг төргәкләү T7Select 10-3b клонлаштыру комплекты (Novagen) белән бирелгән күрсәтмәләргә туры китереп башкарылды һәм төргәкләү эремәсе Escherichia coli (BLT5615, Novagen) кулланып лизислау өчен бер тапкыр көчәйтелде. Лизатлар центрифугаланды, титрланды һәм -80°C температурада глицеринның төп эремәсе буларак туңдырылды.
Фаг үзгәрүчән өлкәләренең туры ПЦР көчәйтелүе, шулпада яки пластинада махсус 454/Roche-amplicon кушылу праймерларын кулланып. Алга кушылу праймеры үзгәрүчән өлкәнең (NNK) 12 (шаблонга хас), GS FLX титан адаптеры A һәм дүрт нигезле китапханә ачкычлары эзлеклелеген (TCAG) үз эченә ала (Өстәмә 1a рәсем):
Кире кушылу праймеры шулай ук ​​тоту бөртекләренә беркетелгән биотинны һәм эмульсия ПЦР вакытында клональ көчәйтү өчен кирәкле GS FLX титан адаптеры Bны үз эченә ала:
Аннары ампликоннар 454 GS-FLX Titanium протоколы буенча 454/Roche пиросеквенсиясенә дучар ителде. Кул белән Sanger секвенсиясе өчен (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl ДНК анализаторы), T7 фаг ДНКсы ПЦР ярдәмендә көчәйтелде һәм түбәндәге праймер парлары белән секвенсияләнде:
Аерым бляшкалардан кертелгән пластиналар Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп) кулланып ПЦР көчәйтүенә дучар ителде. Кайнар старт (95 °C температурада 10 минут) һәм 35 көчәйтү циклын башкарыгыз (95 °C температурада 50 секунд, 50 °C температурада 1 минут һәм 72 °C температурада 1 минут).
Китапханәләрдән алынган фаглар, кыргый типтагы фаглар, CSF һәм каннан коткарылган фаглар, яки аерым клоннар Escherichia coli BL5615 бактериясендә туберкулез шулпасында (Sigma Aldrich) яки 500 см2 савытларда (Thermo Scientific) 37°C температурада 4 сәгать дәвамында көчәйтелде. Фаглар пластиналардан Tris-EDTA буферы (Fluka Analytical) белән чайкап яки стериль пипетка очлары белән бляшкаларны җыеп алынды. Фаглар культура өслегеннән яки экстракция буферыннан бер тапкыр полиэтиленгликоль (PEG 8000) чөкмәсе (Promega) белән аерылды һәм Tris-EDTA буферында яңадан эретелде.
Көчәйтелгән фаг вена эченә (вена эченә) инъекция ясау алдыннан (500 мкл/хайванга) эндотоксинны бетерү өчен 2-3 тур эндотоксинны бетерүгә дучар ителде (Miltenyi Biotec). Беренче турда 2 × 1012 фаг кертелде; икенчесендә 2 × 1010 фаг; өченче һәм дүртенче сайлау турларында һәр хайванга 2 × 109 фаг кертелде. Күрсәтелгән вакыт нокталарында җыелган ми мускулындагы һәм кан үрнәкләрендәге фаг күләме җитештерүче күрсәтмәләренә (T7Select системасы кулланмасы) туры китереп бляшкаларны санау юлы белән билгеләнде. Фагны сайлау койрык венасына чистартылган китапханәләрне вена эченә кертү яки алдагы сайлау турыннан ми мускулыннан алынган фагны кабат кертү юлы белән башкарылды, ә аннан соңгы җыюлар 10 минут, 30 минут, 60 минут, 90 минут, 120 минут, 180 минут һәм 240 минуттан соң ми мускулы һәм кан үрнәкләре белән башкарылды. Барлыгы дүрт тапкыр in vivo паннинг үткәрелде, анда сайланган ике тармак аерым сакланды һәм беренче өч сайлау этабында анализланды. Беренче ике сайлау этабыннан CSFтан алынган барлык фаг кертмәләре 454/Roche пиросеквенсиясенә дучар ителде, ә соңгы ике сайлау этабыннан CSFтан алынган барлык клоннар кул белән секвенсияләнде. Беренче сайлау этабыннан алынган барлык кан фаглары да 454/Roche пиросеквенсиясенә дучар ителде. Фаг клоннарын кертү өчен, сайланган фаглар E. coli (BL5615) эчендә 500 см2 пластиналарда 37°C температурада 4 сәгать дәвамында көчәйтелде. Аерым сайланган һәм кул белән секвенсияләнгән клоннар TB мохитендә үрчетелде. Фагларны экстракцияләгәннән, чистартканнан һәм эндотоксинны чыгарганнан соң (югарыда тасвирланганча), бер койрык венасына 300 мкл да 2 × 1010 фаг/хайван венасы кертелде.
Эзлеклелек мәгълүматларын алдан эшкәртү һәм сыйфатлы фильтрлау. Чимал 454/Roche мәгълүматлары җитештерүче программа тәэминаты ярдәмендә икелекле стандарт агым картасы форматыннан (sff) Pearson кеше укый алырлык форматына (fasta) үзгәртелде. Нуклеотидлар эзлеклелеген алга таба эшкәртү түбәндә тасвирланганча, C программалары һәм скриптлары (чыгарылмаган программа тәэминаты пакеты) ярдәмендә башкарылды. Беренчел мәгълүматларны анализлау катгый күп баскычлы фильтрлау процедураларын үз эченә ала. Дөрес 12мерлы кертелгән ДНК эзлеклелеген үз эченә алмаган укуларны фильтрлау өчен, укулар башлангыч ярлыкка (GTGATGTCGGGGGATCCGAATTCT), туктату ярлыгына (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) һәм фон кертмәсенә (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) глобаль Needleman-Wunsch тесты ярдәмендә эзлекле рәвештә тигезләнде. тигезләү һәр тигезләүгә 2гә кадәр каршылык күрсәтергә мөмкинлек бирде31. Шуңа күрә, башлангыч һәм туктату теглары булмаган укулар һәм фон кертмәләрен үз эченә алган укулар, ягъни рөхсәт ителгән туры килмәүләр санынан арткан тигезләүләр китапханәдән бетерелде. Калган укуларга килгәндә, башлангыч билгедән сузылган һәм туктау билгесе башлангыч уку эзлеклелегеннән алынганчы тәмамланган N-мер ДНК эзлеклелеге һәм аннан соң ул башлангыч уку эзлеклелегеннән аерылган һәм аннары эшкәртелгән (алга таба "кертү" дип атала). Кертүне күчергәннән соң, праймерның 5' очындагы беренче туктату кодоныннан соңгы өлеш кертмәдән алына. Моннан тыш, праймерның 3' очындагы тулы булмаган кодоннарга китерә торган нуклеотидлар да алына. Фон эзлеклелекләрен генә үз эченә алган кертмәләрне чыгару өчен, "PAG" аминокислота үрнәге белән башланган тәрҗемә кертмәләре дә алына. Китапханәдән трансляциядән соңгы озынлыгы 3 аминокислотадан ким булган пептидлар алына. Ниһаять, кертмә пулындагы артыклыкны бетерегез һәм һәр уникаль кертмәнең ешлыгын билгеләгез. Бу анализ нәтиҗәләренә нуклеотид эзлеклелекләре (кертүләр) һәм аларның (уку) ешлыклары исемлеге керә (1c һәм 2 өстәмә рәсемнәр).
N-mer ДНК төркеменең өстәмәләре эзлеклелек охшашлыгы буенча: 454/Рошка хас секвенирлау хаталарын (мәсәлән, гомополимер киңәйтүләрен секвенирлау белән бәйле проблемалар) бетерү һәм мөһим булмаган артыклыкларны бетерү өчен, элек фильтрланган N-mer ДНКсы эзлеклелеге өстәмәләре (өстәмәләр) охшашлык буенча сортлана. Өстәмәләр (2гә кадәр туры килмәгән нигез рөхсәт ителә) түбәндәгечә билгеләнгән итератив алгоритм ярдәмендә: өстәүләр башта ешлыгы буенча сортлана (иң югарысыннан иң түбәненә кадәр), ә алар бер үк булса, озынлыгы буенча икенчел сортлау буенча (иң озыныннан иң кыскасына кадәр)). Шулай итеп, иң еш һәм иң озын өстәмәләр беренче "төркемне" билгели. Төркем ешлыгы төп ешлыкка билгеләнә. Аннары, сортланган исемлектә калган һәр өстәмәне парлы Нидлман-Вунш тигезләве ярдәмендә төркемгә өстәргә тырыштылар. Әгәр тигезләүдәге туры килмәүләр, өстәмәләр яки бетерүләр саны 2 чигеннән артмаса, төркемгә өстәмә өстәлә, һәм гомуми төркем ешлыгы өстәмәнең ничә тапкыр өстәлүенә карап арта. Төркемгә өстәлгән өстәмәләр кулланылган дип билгеләнә һәм алга таба эшкәртүдән чыгарыла. Әгәр кертү эзлеклелеген инде булган төркемгә өстәп булмаса, кертү эзлеклелеге тиешле кертү ешлыгы белән яңа төркем булдыру өчен кулланыла һәм кулланылган дип билгеләнә. Итерация һәр кертү эзлеклелеге я яңа төркем булдыру өчен кулланылганда, я инде булган төркемгә кертелгәндә тәмамлана. Ни дисәң дә, нуклеотидлардан торган төркемләнгән кертүләр ахыр чиктә пептид эзлеклелекләренә (пептид китапханәләренә) тәрҗемә ителә. Бу анализ нәтиҗәсе - бер-бер артлы укулар санын тәшкил итүче кертүләр җыелмасы һәм аларга туры килә торган ешлыклар (Өстәмә 2 нче рәсем).
Мотив генерациясе: Уникаль пептидлар исемлеге нигезендә, түбәндә күрсәтелгәнчә, барлык мөмкин булган аминокислота үрнәкләрен (aa) үз эченә алган китапханә төзелде. 3 озынлыктагы һәр мөмкин булган үрнәк пептидтан алынды һәм аның кире үрнәге барлык үрнәкләрне (трипептидларны) үз эченә алган уртак мотив китапханәсе белән бергә өстәлде. Бик кабатланучы мотивлар китапханәләре секвенирланды һәм артыклык бетерелде. Аннары, мотив китапханәсендәге һәр трипептид өчен, без исәпләү кораллары ярдәмендә аның китапханәдә булуын тикшердек. Бу очракта, табылган мотив трипептидын үз эченә алган пептидның ешлыгы өстәлә һәм мотив китапханәсендәге мотивка билгеләнә ("мотивлар саны"). Мотив генерациясе нәтиҗәсе - трипептидларның (мотивларның) барлык очракларын һәм аларның тиешле кыйммәтләрен үз эченә алган ике үлчәмле массив, алар укулар фильтрланганда, төркемләнгәндә һәм тәрҗемә ителгәндә тиешле мотивка китерә торган секвенирлау укулары саны. Метрикалар югарыда җентекләп тасвирланганча.
Мотивлар санын һәм аларга туры килә торган чәчелү графигын нормальләштерү: Һәр үрнәк өчен мотивлар саны кулланып нормальләштерелде
монда ni - i темасын үз эченә алган укулар саны. Шулай итеп, vi үрнәктә i мотивын үз эченә алган укуларның (яки пептидларның) процент ешлыгын күрсәтә. Нормальләштерелмәгән мотивлар саны өчен P-кыйммәтләре Фишерның төгәл тесты ярдәмендә исәпләнде. Мотивлар санының коррелограммаларына килгәндә, Спирман корреляцияләре R белән нормальләштерелгән мотивлар саны ярдәмендә исәпләнде.
Пептид китапханәсендәге һәр позициядәге аминокислоталар эчтәлеген күз алдына китерү өчен, 32, 33 веб-логограммалары (http://weblogo.threeplusone.com) төзелде. Башта, 12-мер пептидының һәр позициясендәге аминокислоталар эчтәлеге 20×12 матрицада саклана. Аннары, һәр позициядә бер үк чагыштырма аминокислота эчтәлеген үз эченә алган 1000 пептид җыелмасы fasta-sequence форматында генерацияләнә һәм web-logo 3кә керү буларак бирелә, ул бирелгән пептид китапханәсе өчен һәр позициядәге чагыштырма аминокислота эчтәлегенең график күренешен булдыра. Күп үлчәмле мәгълүматлар җыелмаларын күз алдына китерү өчен, җылылык карталары R эчендә эшләнгән корал ярдәмендә төзелде (biosHeatmap, әлегә чыгарылмаган R пакеты). Җылылык карталарында күрсәтелгән дендрограммалар Уордның иерархик кластерлаштыру ысулы белән Евклид ераклык метрикасы ярдәмендә исәпләнде. Мотив балллау мәгълүматларының статистик анализы өчен, нормальләштерелмәгән балллау өчен P кыйммәтләре Фишерның төгәл тесты ярдәмендә исәпләнде. Башка мәгълүмат җыелмалары өчен P-кыйммәтләре R системасында Студентның t-тест яки ANOVA кулланып исәпләнгән.
Сайланган фаг клоннары һәм кертмәләре булмаган фаглар койрык венасына вена эченә кертелде (2 × 1010 фаг/хайванга 300 мкл PBS'та). Перфузиягә һәм аннан соң фиксацияләүгә ун минут кала, шул ук хайваннарга вена эченә 100 мкл DyLight594 белән билгеләнгән лектин кертелде (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Фаг кертелгәннән соң 60 минуттан соң, тычканнарга йөрәк аша 50 мл PBS, аннары 50 мл 4% PFA/PBS кертелде. Баш мие үрнәкләре өстәмә рәвештә 4% PFA/PBS'та төнлә фиксацияләнде һәм 4°C температурада төнлә 30% сахарозада чылатылды. Үрнәкләр OCT катнашмасында тиз туңдырыла. Туңдырылган үрнәкләрнең иммуногистохимик анализы бүлмә температурасында 30 мкм криосекцияләрдә 1% BSA белән блокланган һәм 4 °C температурада T7 фагына (Novus NB 600-376A) каршы поликлональ FITC белән билгеләнгән антитәнчекләр белән инкубацияләнгән. Төнлә инкубацияләгез. Ахырда, кисемтәләр PBS белән 3 тапкыр юылды һәм конфокаль лазер микроскобы (Leica TCS SP5) белән тикшерелде.
Минималь сафлыгы 98% булган барлык пептидлар GenScript USA тарафыннан синтезланган, биотинланган һәм лиофилизацияләнгән. Биотин N-терминалында өстәмә өчләтә глицин аралыгы аша бәйләнгән. Барлык пептидларны масса-спектрометрия ярдәмендә тикшерегез.
Стрептавидин (Sigma S0677) биотинилләштерелгән пептидның 5 тапкыр артык эквимоляр артыклыгы, биотинилләштерелгән BACE1 ингибитор пептиды яки биотинилләштерелгән BACE1 ингибитор пептиды һәм BACE1 ингибитор пептиды комбинациясе (3:1 нисбәте) белән 5–10% DMSOда кушылды/PBSта инкубацияләнде. Инъекциядән 1 сәгать элек бүлмә температурасында. Стрептавидин белән конъюгацияләнгән пептидлар баш мие куышлыгы булган тычканнарның койрык веналарының берсенә 10 мг/кг дозада вена эченә кертелде.
Стрептавидин-пептид комплексларының концентрациясе ELISA ярдәмендә бәяләнде. Nunc Maxisorp микротитр пластиналары (Sigma) 4°C температурада төнлә 1,5 мкг/мл тычкан антистрептавидин антитәнчеге (Thermo, MA1-20011) белән капланды. Блоклаганнан соң (блоклаучы буфер: 140 нМ NaCL, 5 мМ EDTA, 0,05% NP40, 0,25% желатин, 1% BSA) бүлмә температурасында 2 сәгать дәвамында, пластинаны 0,05% Tween-20/PBS (юу буферы) белән 3 секунд дәвамында юыгыз, CSF һәм плазма үрнәкләре блоклаучы буфер белән суюлтылган коеларга өстәлде (плазма 1:10,000, CSF 1:115). Аннары пластина 4°C температурада төнлә детектор антитәнчеге (1 мкг/мл, антистрептавидин-HRP, Novus NB120-7239) белән инкубацияләнде. Өч юу этабыннан соң, стрептавидин TMB субстрат эремәсендә (Roche) 20 минутка кадәр инкубацияләү юлы белән ачыкланды. 1M H2SO4 белән төс үсешен туктатканнан соң, 450 нм да абсорбцияне үлчәгез.
Стрептавидин-пептид-BACE1 ингибитор комплексының функциясе җитештерүче протоколына (Wako, 294-64701) туры китереп, Aβ(1-40) ELISA ярдәмендә бәяләнде. Кыскасы, CSF үрнәкләре стандарт эреткечтә (1:23) сыекландырылды һәм BNT77 тоту антитәнчеге белән капланган 96 коелы пластиналарда 4°C температурада төнлә инкубацияләнде. Биш юу этабыннан соң, HRP белән конъюгацияләнгән BA27 антитәнчеге өстәлде һәм 4°C температурада 2 сәгать инкубацияләнде, аннары биш юу этабы башкарылды. Aβ(1–40) TMB эремәсендә бүлмә температурасында 30 минут инкубацияләү юлы белән ачыкланды. Төс үсеше туктатылган эремә белән туктатылганнан соң, 450 нм да абсорбцияне үлчәгез. Плазма үрнәкләре Aβ(1–40) ELISA алдыннан каты фазалы экстракциягә дучар ителде. Плазма 96 коелы пластиналарда 0,2% DEA (Sigma) белән кушылды һәм бүлмә температурасында 30 минут инкубацияләнде. SPE пластиналарын (Oasis, 186000679) су һәм 100% метанол белән бер-бер артлы юганнан соң, плазма үрнәкләре SPE пластиналарына өстәлде һәм барлык сыеклык алынды. Үрнәкләр юылды (башта 5% метанол, аннары 30% метанол белән) һәм 2% NH4OH/90% метанол белән элюцияләнде. Элюатны 55°C температурада даими N2 тогында 99 минут киптергәннән соң, үрнәкләр стандарт эреткечләрдә киметелде һәм Aβ(1–40) югарыда тасвирланганча үлчәнде.
Бу мәкаләгә ничек сылтама ясарга: Урих, Э. һ.б. In vivo ачыкланган транзит пептидлар ярдәмендә мигә йөк ташу. фән. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Лихота Дж., Скьорринге Т., Томсен Л.Б. һәм Мус Т. Макромолекуляр препаратларны максатчан терапия ярдәмендә баш миенә җиткерү. Нейрохимия журналы 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Брасневич, И., Штайнбуш, Х.В., Шмиц, К., һәм Мартинес-Мартинес, П. Пептид һәм аксым препаратларын кан-баш мие барьеры аша җиткерү. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардридж, ВМ. Гематоэнцефалитик барьер: ми препаратларын эшләүдәге киртә. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Йохансон, К.Е., Дункан, ДЖ.А., Стопа, Э.Г. һәм Берд, А. Даруларны хориоид плексус-CSF юлы аша мигә җиткерүне һәм максатчан рәвештә юнәлтүне яхшырту перспективалары. Фармацевтика тикшеренүләре 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардридж, ВМ. Биофармацевтика препаратларын мигә җиткерү өчен молекуляр троян атлары белән модернизацияләү. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардридж, WM рецепторлары аша пептидларның кан-баш мие барьеры аша ташылуы. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Нивунер, Дж. һ.б. Бер валентлы молекуляр шаттллар кулланып, мигә үтеп керүне һәм терапевтик антитәнчекләрнең нәтиҗәлелеген арттырыгыз. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Биен-Ли, Н. һ.б. Трансферрин рецепторы (TfR) транспорты TfR антитәнчекләренең аффинитет вариантларының ми тарафыннан үзләштерелүен билгели. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).