Spas ji bo serdana Nature.com. Hûn guhertoyek gerokê bi piştgiriya CSS-ê ya sînorkirî bikar tînin. Ji bo ezmûna çêtirîn, em pêşniyar dikin ku hûn gerokek nûvekirî bikar bînin (an jî Moda Lihevhatinê di Internet Explorer-ê de neçalak bikin). Wekî din, ji bo misogerkirina piştgiriya domdar, em malperê bê şêwaz û JavaScript nîşan didin.
Karûselek ji sê slaytan di carekê de nîşan dide. Bişkokên Berê û Paşê bikar bînin da ku hûn di carekê de di nav sê slaytan de bigerin, an jî bişkokên slaytê yên li dawiyê bikar bînin da ku hûn di carekê de di nav sê slaytan de bigerin.
Astengiya xwîn-mejî û astengiya xwîn-mejî rê li ber ajanên biyoterapî digirin ku bigihîjin armancên xwe di pergala demarî ya navendî de, bi vî awayî dermankirina bi bandor a nexweşiyên neurolojîk asteng dikin. Ji bo kifşkirina veguhezkarên nû yên mejî di vivo de, me pirtûkxaneyek peptîdê ya faja T7 danasîn û bi karanîna modelek hewza mezin a hişmend a kanulkirî ya mişkan bi rêzefîlm xwîn û şilava mejî-hestiyê (CSF) berhev kirin. Klonên fajê yên taybetî piştî çar dorên hilbijartinê di CSF de pir dewlemend bûn. Ceribandina peptîdên namzed ên ferdî ji 1000 qat zêdetir dewlemendkirina CSF eşkere kir. Biyoaktîvîteya radestkirina bi navbeynkariya peptîdê bo mejî bi kêmkirina 40% di asta amîloîd-β de di şilava mejî-hestiyê de bi karanîna astengkerek peptîda BACE1 ku bi peptîda transîtê ya nû ya hatî destnîşankirin ve girêdayî ye, hate piştrast kirin. Ev encam nîşan didin ku peptîdên ku bi rêbazên hilbijartina faja di vivo de hatine destnîşankirin dikarin bibin wesayîtên bikêr ji bo radestkirina sîstemîk a makromolekulan bo mejî bi bandorek dermankirinê.
Lêkolînên terapiya hedefgirtî ya pergala demarî ya navendî (CNS) bi piranî li ser destnîşankirina derman û ajanên çêtirkirî yên ku taybetmendiyên hedefgirtî yên CNS nîşan didin, bi kêmtir hewildan li ser kifşkirina mekanîzmayên ku radestkirina çalak a dermanan ber bi mêjî ve dimeşînin, sekinîne. Ev niha dest pê dike ku biguhere ji ber ku radestkirina dermanan, nemaze molekulên mezin, beşek yekgirtî ya pêşkeftina dermanên neurozanistî ya nûjen e. Jîngeha pergala demarî ya navendî ji hêla pergala astengiya serebrovaskuler ve, ku ji astengiya xwîn-mejî (BBB) ​​​​û astengiya xwîn-mejî (BCBB)1 pêk tê, baş tê parastin, ku radestkirina dermanan ber bi mêjî ve dijwar dike1,2. Tê texmîn kirin ku hema hema hemî dermanên molekulên mezin û ji% 98 zêdetir dermanên molekulên piçûk ji mêjî têne derxistin3. Ji ber vê yekê pir girîng e ku pergalên veguhastina mêjî yên nû werin destnîşankirin ku radestkirina bi bandor û taybetî ya dermanên dermankirinê ji CNS re peyda dikin 4,5. Lêbelê, BBB û BCSFB di heman demê de ji bo radestkirina dermanan derfetek hêja pêşkêş dikin ji ber ku ew bi rêya damarên wê yên berfireh dikevin nav hemî avahiyên mêjî û dikevin nav wan. Ji ber vê yekê, hewildanên heyî yên ji bo bikaranîna rêbazên ne-dagirker ên radestkirina mêjî bi piranî li ser mekanîzmaya veguhastina bi navbeynkariya reseptorê (PMT) bi karanîna reseptora BBB6 ya endojîn e. Tevî pêşketinên girîng ên vê dawiyê bi karanîna rêça reseptora transferrîn7,8, pêşveçûna bêtir a pergalên radestkirina nû bi taybetmendiyên çêtirkirî hewce ye. Ji bo vê armancê, armanca me ew bû ku em peptîdên ku dikarin veguhastina CSF navbeynkariyê bikin nas bikin, ji ber ku ew di prensîbê de dikarin ji bo radestkirina makromolekulan ji CNS re an jî ji bo vekirina rêyên reseptorên nû werin bikar anîn. Bi taybetî, reseptorên taybetî û veguhezkarên pergala serebrospinal (BBB û BSCFB) dikarin wekî hedefên potansiyel ji bo radestkirina çalak û taybetî ya dermanên biyoterapî xizmet bikin. Şileya serebrospinal (CSF) berhemek veşartî ya pleksusa koroid (CS) ye û bi rêya qada subarachnoid û qada ventrikuler4 bi şileya navberî ya mêjî re di têkiliyê de ye. Di demên dawî de hatiye nîşandan ku şileya serebrospinal a subarachnoid bi zêdeyî di nav navbera mêjî de belav dibe9. Em hêvî dikin ku bi karanîna vê rêça herikîna subaraknoid an rasterast bi rêya BBB-ê bigihîjin qada parenşîmal. Ji bo vê yekê, me stratejiyek hilbijartina fajê ya di vivo de ya xurt bicîh anî ku bi awayekî îdeal peptîdên ku ji hêla yek ji van her du rêyên cuda ve têne veguhastin destnîşan dike.
Niha em rêbazek şopandina fajê ya di vivo ya rêzdar bi nimûnegirtina CSF bi rêzkirina rêjeya derbasbûnê ya bilind (HTS) re vedibêjin da ku tûrên hilbijartina destpêkê bi cûrbecûr pirtûkxaneyê ya herî bilind bişopînin. Şêwirandin li ser mişkên hişyar ên bi kanûla cisterna mezin (CM) ya bi domdarî hatî çandin hate kirin da ku ji qirêjbûna xwînê dûr bikevin. Ya girîng, ev nêzîkatî hem hedefgirtina mêjî û hem jî peptîdên bi çalakiya veguhastinê li seranserê astengiya serebrovaskuler hildibijêre. Me fajên T7 ji ber mezinahiya wan a piçûk (~60 nm)10 bikar anîn û pêşniyar kir ku ew ji bo veguhastina vezîkulên ku destûrê didin derbasbûna transhucreyî ya astengiya endotel û/an epîtel-medullayê guncan in. Piştî çar tûrên pankirinê, nifûsa fajan hatin veqetandin ku dewlemendkirina CSF ya di vivo de û têkiliya mîkrodamarên mejî nîşan dan. Ya girîng, em karîn dîtinên xwe bi nîşandana ku peptîdên namzed ên çêtirîn ên bijarte û bi kîmyewî hatine sentezkirin dikarin barkêşiya proteînê veguhezînin nav şilava serebrospinalê piştrast bikin. Pêşîn, bandorên farmakodînamîk ên CNS bi hevberkirina peptîdek veguhastinê ya pêşeng bi astengkerek peptîda BACE1 re hatin saz kirin. Ji bilî nîşandana ku stratejiyên ceribandina fonksiyonel ên in vivo dikarin peptîdên veguhastina mêjî yên nû wekî hilgirên barkêşiya proteînê yên bi bandor nas bikin, em hêvî dikin ku nêzîkatiyên hilbijartina fonksiyonel ên wekhev di destnîşankirina rêyên veguhastina mêjî yên nû de jî girîng bibin.
Li ser bingeha yekîneyên çêkirina plakê (PFU), piştî gava pakkirina fajê, pirtûkxaneyek ji peptîdên fajê T7 yên xêzikî yên 12-mer ên rasthatî bi cûrbecûrîyek nêzîkî 109 hate sêwirandin û afirandin (li Materyal û Rêbazan binêre). Girîng e ku were zanîn ku me ev pirtûkxane berî pankirina in vivo bi baldarî analîz kir. Amplifikasyona PCR ya nimûneyên pirtûkxaneya fajê bi karanîna primerên guherandî amplîkon çêkirin ku rasterast ji bo HTS-ê têne sepandin (Wêneya Pêvek 1a). Ji ber a) xeletiyên rêzkirina HTS11, b) bandora li ser kalîteya primeran (NNK)1-12, û c) hebûna fajê celebê kovî (wt) (insertên îskeletê) di pirtûkxaneya standby de, prosedurek fîlterkirina rêzê hate bicîh kirin da ku tenê agahdariya rêza piştrastkirî were derxistin (Wêneya Pêvek 1b). Ev gavên fîlterê ji bo hemî pirtûkxaneyên rêzkirina HTS derbas dibin. Ji bo pirtûkxaneya standard, bi tevahî 233,868 xwendin hatin bidestxistin, ku ji wan 39% pîvanên fîlterê derbas kirin û ji bo analîz û hilbijartina pirtûkxaneyê ji bo dorên paşîn hatin bikar anîn (Wêneya Pêvek 1c–e). Xwendin bi piranî pirjimarên 3 cotên bingehîn di dirêjahiyê de bûn bi lûtkeyek li 36 nukleotîdan (Wêneya Pêvek 1c), ku sêwirana pirtûkxaneyê (NNK) 1-12 piştrast kir. Bi taybetî, bi qasî 11% ji endamên pirtûkxaneyê têketinek PAGISRELVDKL ya stûna bingehîn a celebê kovî (wt) ya 12-alî dihewîne, û hema hema nîvê rêzikan (49%) têxistin an jêbirin dihewîne. HTS ya pirtûkxaneya pirtûkxaneyê cûrbecûrbûna bilind a peptîdan di pirtûkxaneyê de piştrast kir: ji 81% zêdetir rêzikên peptîd tenê carekê hatine dîtin û tenê 1,5% di ≥4 kopiyan de çêbûne (Wêneya Pêvek 2a). Frekansên asîdên amînî (aa) li hemî 12 pozîsyonên di repertuwarê de bi frekansên ku ji bo hejmara kodonên ku ji hêla repertuwara NKK ya dejeneratîf ve hatine çêkirin têne hêvî kirin re baş têkildar bûn (Wêneya Pêvek 2b). Frekansa çavdêrîkirî ya bermayiyên aa yên ku ji hêla van têxistinan ve hatine kodkirin bi frekansa hesabkirî (r = 0,893) re baş têkildar bû (Wêneya Pêvek 2c). Amadekirina pirtûkxaneyên fajê ji bo derzîkirinê gavên zêdekirin û rakirina endotoksînê dihewîne. Berê hatiye nîşandan ku ev yek potansiyel cihêrengiya pirtûkxaneyên fajê kêm dike12,13. Ji ber vê yekê, me pirtûkxaneyek fajê ya bi plakaya zêdekirî ku endotoksîn lê hatibû rakirin rêz kir û ji bo texmînkirina frekansa AAyê bi pirtûkxaneya orîjînal re berhev kir. Di navbera koma orîjînal û koma zêdekirî û paqijkirî de korelasyonek xurt (r = 0.995) hate dîtin (Wêneya Pêvek 2d), ku nîşan dide ku pêşbaziya di navbera klonên ku li ser plakayan bi karanîna faja T7 zêdekirî ne sedema xeletiyek mezin bû. Ev berhevdan li ser frekansa motîfên sêpeptîdê di her pirtûkxaneyê de ye, ji ber ku cihêrengiya pirtûkxaneyan (~109) nikare bi tevahî were girtin, tewra bi HTS jî. Analîza frekansê ya aa li her pozîsyonê xeletiyek piçûk a girêdayî pozîsyonê di sê pozîsyonên dawîn ên repertuwara têketinê de eşkere kir (Wêneya Pêvek 2e). Di encamê de, me encam da ku kalîte û cihêrengiya pirtûkxaneyê qebûlkirî bûn û tenê guhertinên piçûk di cihêrengiyê de ji ber zêdekirin û amadekirina pirtûkxaneyên fajê di navbera çend dorên hilbijartinê de hatin dîtin.
Nimûnegirtina şileya mêjî ya serî dikare bi rêya çandina kanûlayekê bi emeliyatê di nav CM ya mişkên hişyar de were kirin da ku naskirina faja T7 ya ku bi rêya BBB û/an BCSFB bi rêya damarî (iv) hatiye derzîkirin hêsan bike (Wêne 1a-b). Me di sê tûrên pêşîn ên hilbijartina in vivo de du baskên hilbijartinê yên serbixwe (baskên A û B) bikar anîn (Wêne 1c). Me hêdî hêdî bi kêmkirina mîqdara giştî ya faja ku di sê tûrên pêşîn ên hilbijartinê de hatiye danîn, hişkiya hilbijartinê zêde kir. Ji bo tûra çaremîn a pankirinê, me nimûneyên ji şaxên A û B kirin yek û sê hilbijartinên serbixwe yên din pêk anîn. Ji bo lêkolîna taybetmendiyên in vivo yên perçeyên faja T7 di vê modelê de, faja celebê kovî (PAGISRELVDKL master insert) bi rêya damara dûvikê li mişkan hat derzîkirin. Vegerandina fajan ji şileya mêjî ya serî û xwînê di demên cûda de nîşan da ku fajên îkosahedral ên T7 yên nisbeten piçûk qonaxek paqijkirina destpêkê ya bilez ji beşa xwînê hebû (Wêneya Pêvek 3). Li gorî tîterên ku hatine dayîn û qebareya xwîna mişkan, me hesab kir ku tenê bi qasî 1% wt. Faj ji doza dayîn 10 deqîqe piştî derzîkirina damarî di xwînê de hate tespîtkirin. Piştî vê kêmbûna bilez a destpêkê, paqijkirinek seretayî ya hêdîtir bi nîv-jiyana 27.7 deqîqeyan hate pîvandin. Ya girîng ew e ku tenê pir kêm faj ji beşa CSF hatin derxistin, ku nîşan dide ku paşxaneyek kêm ji bo koçberiya fajên celebê kovî ber bi beşa CSF ve heye (Wêneya Pêvek 3). Bi navînî, tenê bi qasî 1 x 10-3% tîterên fajên T7 di xwînê de û 4 x 10-8% ji fajên destpêkê yên derzîkirî di şilava mêjî de di tevahiya dema nimûnegirtinê de (0-250 hûrdem) hatin tespîtkirin. Bi taybetî, nîv-jiyana (25.7 hûrdem) a fajên celebê kovî di şilava mêjî de dişibihe ya ku di xwînê de hate dîtin. Ev dane nîşan didin ku astengiya ku beşa CSF ji xwînê vediqetîne di mişkên CM-kanulkirî de saxlem e, ku dihêle ku di vivo de hilbijartina pirtûkxaneyên fajê ji bo destnîşankirina klonên ku bi hêsanî ji xwînê ber bi beşa CSF ve têne veguheztin.
(a) Sazkirina rêbazekê ji bo ji nû ve nimûnegirtina şileya mêjî-hesinî (CSF) ji hewzek mezin. (b) Diyagrama ku cihê hucreyî yê astengiya pergala demarî ya navendî (CNS) û stratejiya hilbijartinê ya ku ji bo destnîşankirina peptîdên ku ji astengiya xwîn-mejî (BBB) ​​û astengiya xwîn-mejî derbas dibin tê bikar anîn nîşan dide. (c) Nexşeya herikîna ceribandina pêşandana fajê ya in vivo. Di her gera hilbijartinê de, faj (nasnameyên heywanan di hundurê tîran de) bi damarî hatin derzîkirin. Du şaxên alternatîf ên serbixwe (A, B) heya gera 4-an a hilbijartinê ji hev cuda têne girtin. Ji bo gerên hilbijartinê 3 û 4, her klona fajê ya ji CSF-ê hatî derxistin bi destan hate rêzkirin. (d) Kînetîka fajê ku ji xwînê (çemberên sor) û şileya mêjî-hesinî (sêgoşeyên kesk) di gera yekem a hilbijartinê de di du mişkên kanulkirî de piştî derzîkirina damarî ya pirtûkxaneya peptîdê ya T7 (2 x 1012 faj/heywan) hatiye veqetandin. Çargoşeyên şîn rêjeya navînî ya destpêkê ya fajê di xwînê de nîşan didin, ku ji mîqdara faja derzîkirî, bi berçavgirtina qebareya tevahî ya xwînê, hatiye hesibandin. Çargoşeyên reş xala hevberdana xeta y nîşan didin ku ji konsantrasyonên fajên xwînê hatiye derxistin. (e,f) Frekans û belavbûna nisbî ya hemî motîfên sêpeptîd ên gengaz ên ku di peptîdê de têne dîtin, nîşan bidin. Hejmara motîfên ku di 1000 xwendinê de têne dîtin tê nîşandan. Motîfên dewlemendkirî yên bi girîngî (p < 0.001) bi xalên sor têne nîşankirin. (e) Nexşeya belavbûna korelasyonê ku frekansa nisbî ya motîfa sêpeptîd a pirtûkxaneya derzîkirî bi faja ji xwînê ji heywanên #1.1 û #1.2 hatî wergirtin re dide ber hev. (f) Nexşeya belavbûna korelasyonê ku frekansên nisbî yên motîfên sêpeptîd ên faja heywanan #1.1 û #1.2 yên ku di xwîn û şileya mêjî de hatine îzolekirin dide ber hev. (g, h) Nûneratiya IDya rêzê ya faja ku di xwînê de dewlemend bûye (g) li hember pirtûkxaneyên derzîkirî û faja ku di CSF de dewlemend bûye (h) li hember xwînê piştî gera hilbijartina in vivo di her du heywanan de. Mezinahiya koda yek-tîp nîşan dide ku ew asîda amînî çiqas caran di wê pozîsyonê de çêdibe. Kesk = qutbî, binefşî = bêalî, şîn = bingehîn, sor = asîdî û reş = asîdên amînî yên hîdrofobîk. Wêne 1a, b ji hêla Eduard Urich ve hatine sêwirandin û hilberandin.
Me pirtûkxaneyek peptîd a fajê xist nav du mişkên amûra CM (kladên A û B) û faj ji şilava mêjî-hesinî û xwînê veqetand (Wêne 1d). Paqijkirina bilez a destpêkê ya pirtûkxaneyê li gorî faja celebê kovî kêmtir diyar bû. Nîv-jiyana navînî ya pirtûkxaneya derzîkirî di her du heywanan de 24.8 hûrdem di xwînê de bû, dişibihe faja celebê kovî, û 38.5 hûrdem di CSF de. Nimûneyên fajên xwîn û şilava mêjî-hesinî ji her heywanekî ji bo HTS hatin derbas kirin û hemî peptîdên hatine destnîşankirin ji bo hebûna motîfek trîpeptîd a kurt hatin analîz kirin. Motîvên trîpeptîdê hatin hilbijartin ji ber ku ew bingehek hindik ji bo avakirina avahiyê û têkiliyên peptîd-proteîn peyda dikin14,15. Me di belavkirina motîfan de di navbera pirtûkxaneya faja derzîkirî û klonên ji xwîna her du heywanan hatine derxistin de têkiliyek baş dît (Wêne 1e). Daneyan nîşan didin ku pêkhateya pirtûkxaneyê di beşa xwînê de tenê bi rengek hindik dewlemend e. Frekansên asîdên amînî û rêzikên lihevkirinê di her pozîsyonê de bi karanîna adaptasyonek nermalava Weblogo16 bêtir hatin analîz kirin. Bi balkêşî, me dewlemendkirinek xurt di bermayiyên glîsînê yên xwînê de dît (Wêne 1g). Dema ku xwîn bi klonên ji CSF hatine hilbijartin re hate berhev kirin, hilbijartinek xurt û hin ji hilbijartina motîfan hatin dîtin (Wêne 1f), û hin asîdên amînî bi tercîhî li pozîsyonên pêşwext di 12-endamî de hebûn (Wêne 1h). Bi taybetî, heywanên ferdî di şilava mêjî-hesinî de bi girîngî ji hev cuda bûn, lê dewlemendkirina glîsînê ya xwînê di her du heywanan de hate dîtin (Wêne 4a-j ya Pêvek). Piştî fîlterkirina hişk a daneyên rêzê di şilava mêjî-hesinî ya heywanên #1.1 û #1.2 de, bi tevahî 964 û 420 peptîdên 12-mer ên bêhempa hatin bidestxistin (Wêne 1d-e ya Pêvek). Klonên fajê yên îzolekirî hatin zêdekirin û rastî gera duyemîn a hilbijartina in vivo hatin. Fajê ku ji gera duyemîn a hilbijartinê hatî derxistin di her heywanî de rastî HTS hat û hemî peptîdên naskirî wekî têketinek ji bo bernameyek naskirina motîf hatin bikar anîn da ku hebûna motîfên sêpeptîd analîz bikin (Wêne 2a, b, ef). Li gorî çerxa yekem a fajê ku ji CSF-ê hatiye wergirtin, me hilbijartin û nehilbijartina gelek motîfan di CSF-ê de di şaxên A û B de dît (Wêne 2). Algorîtmayek nasnameya torê hate sepandin da ku were destnîşankirin ka ew şêwazên cûda yên rêza domdar temsîl dikin an na. Di navbera rêzên 12-alî yên ku ji hêla CSF-ê ve di klad A-ya alternatîf de hatine wergirtin (Wêne 2c, d) û klad B-yê de (Wêne 2g, h) wekheviyek zelal hate dîtin. Analîza komkirî di her şaxê de profîlên hilbijartinê yên cûda ji bo peptîdên 12-mer (Wêneya Pêvek 5c, d) û zêdebûnek di rêjeya tîtera CSF/xwînê de bi demê re ji bo klonên komkirî piştî gera duyemîn a hilbijartinê li gorî gera yekem a hilbijartinê (Wêneya Pêvek 5e) eşkere kir.
Dewlemendkirina motîf û peptîdan di şilava mêjî-hestiyê de bi du dorên li pey hev ên hilbijartina pêşandana fagê ya fonksiyonel a in vivo.
Hemû fajên şileya mejî-hestiyê yên ku ji gera yekem a her heywanî (heywanên #1.1 û #1.2) hatine wergirtin, hatine komkirin, amplîfîkasyonkirin, rêzkirina HT-ê û ji nû ve bi hev re hatine derzîkirin (2 x 1010 faj/heywan) 2 mişkên kanulkirî yên SM (#1.1 → #). 2.1 û 2.2, 1.2 → 2.3 û 2.4). (a,b,e,f) Nexşeyên belavbûna korelasyonê ku frekansa nisbî ya motîfên sêpeptîd ên hemî fajên ji CSF-ê hatine wergirtin di gera hilbijartinê ya yekem û duyemîn de didin ber hev. Frekansa nisbî û belavbûna motîfan ku hemî sêpeptîdên gengaz ên hevbeş ên ku di peptîdan de di her du arasteyan de têne dîtin temsîl dikin. Hejmara motîfên ku di 1000 xwendinê de hatine dîtin tê nîşandan. Motîfên ku di yek ji pirtûkxaneyên berawirdkirî de bi girîngî (p < 0.001) hatine hilbijartin an jî hatine derxistin bi xalên sor têne ronîkirin. (c, d, g, h) Nûneratiya logoya rêzê ya hemî rêzên dirêj ên 12 asîdên amînî yên dewlemend bi CSF li gorî tûrên 2 û 1 ên hilbijartina in vivo. Mezinahiya koda yek-tîp nîşan dide ku ew asîda amînî çiqas caran li wê pozîsyonê çêdibe. Ji bo temsîlkirina logoyê, frekansa rêzên CSF-ê yên ku ji heywanên ferdî di navbera du tûrên hilbijartinê de têne derxistin tê berhev kirin û rêzên dewlemendkirî di tûra duyemîn de têne nîşandan: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 û (h) #1.2–#2.4. Asîdên amînî yên herî dewlemendkirî li pozîsyonek diyarkirî di (c, d) heywanên hejmar 2.1 û hejmar 2.2 an (g, h) di heywanên hejmar 2.3 û hejmar 2.4 de bi rengîn têne nîşandan. Kesk = qutbî, binefşî = bêalî, şîn = bingehîn, sor = asîdî û reş = asîdên amînî yên hîdrofobîk.
Piştî gera sêyemîn a hilbijartinê, me 124 rêzikên peptîdê yên bêhempa (#3.1 û #3.2) ji 332 klonên fajê yên ji du heywanan veqetandî yên bi CSF-ê ve hatine çêkirin destnîşan kirin (Wêneya Pêvek 6a). Rêzeya LGSVS (%18.7) xwedî rêjeya nisbî ya herî bilind bû, piştre jî têxistinên celebê kovî PAGISRELVDKL (%8.2), MRWFFSHASQGR (%3), DVAKVS (%3), TWLFSLG (%2.2), û SARGSWREIVSLS (%2.2) hatin. Di gera çaremîn a dawîn de, me du şaxên serbixwe ji sê heywanên cuda berhev kirin (Wêne 1c). Ji 925 klonên fajê yên rêzkirî yên ji CSF-ê hatine wergirtin, di gera çaremîn de me 64 rêzikên peptîdê yên bêhempa dîtin (Wêneya Pêvek 6b), ku di nav wan de rêjeya nisbî ya fajê celebê kovî daket% 0.8. Klonên CSF yên herî gelemperî di gera çaremîn de LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) û RLSSVDSDLSGC (3, 2%) bûn. %). Rêzeya dirêjahiya peptîdên bijartî ji ber danîn/jêbirina nukleotîd an kodonên rawestandina pêşwext di primerên pirtûkxaneyê de ye dema ku kodonên dejeneratîf ji bo sêwirana pirtûkxaneya NNK têne bikar anîn. Kodonên rawestandina pêşwext peptîdên kurttir çêdikin û ji ber ku ew motîfa aa ya guncan dihewînin têne hilbijartin. Peptîdên dirêjtir dikarin ji danîn/jêbirinê di primerên pirtûkxaneyên sentetîk de çêbibin. Ev kodona rawestandina sêwirandî li derveyî çarçoveyê bicîh dike û wê dixwîne heya ku kodonek rawestandina nû li jêr xuya bibe. Bi gelemperî, me faktorên dewlemendkirinê ji bo her çar gerên hilbijartinê bi berhevkirina daneyên têketinê bi daneyên derketina nimûneyê hesab kirin. Ji bo gera yekem a lêkolînê, me tîterên fajên cureyê kovî wekî referansa paşîn a ne-taybetî bikar anîn. Bi balkêşî, hilbijartina fajên neyînî di çerxa yekem a CSF de pir xurt bû, lê ne di xwînê de (Wêne 3a), ku dibe ku ji ber îhtîmala kêm a belavbûna pasîf a piraniya endamên pirtûkxaneya peptîdê di nav beşa CSF de be an jî fajên têkildar bi bandortir ji bakteriyofajan têne parastin an jêbirin. Lêbelê, di gera duyemîn a panningê de, hilbijartinek xurt a fajên di CSF de di her du kladan de hate dîtin, ku ev yek nîşan dide ku gera berê di fajên ku peptîdên ku kişandina CSF pêşve dixin nîşan didin de dewlemend bû (Wêne 3a). Dîsa, bêyî dewlemendkirina girîng a xwînê. Her weha di gerên sêyemîn û çaremîn de, klonên fajê di CSF de bi girîngî dewlemend bûn. Bi berhevkirina frekansa têkildar a her rêza peptîdê ya bêhempa di navbera du gerên dawîn ên hilbijartinê de, me dît ku rêz di gera çaremîn a hilbijartinê de hîn dewlemendtir bûn (Wêne 3b). Bi tevahî 931 motîfên sêpeptîd ji hemî 64 rêzên peptîdê yên bêhempa bi karanîna her du arasteyên peptîdê hatin derxistin. Motîfên herî dewlemendkirî di gera çaremîn de ji bo profîlên dewlemendkirina wan li seranserê hemî geran li gorî pirtûkxaneya derzîkirî (qutbûn: dewlemendkirina 10%) ji nêz ve hatin lêkolîn kirin (Wêneya Pêvek 6c). Şêweyên giştî yên hilbijartinê nîşan dan ku piraniya motîfên lêkolînkirî di hemî gerên berê yên her du şaxên hilbijartinê de dewlemend bûne. Lêbelê, hin motîf (mînak SGL, VSG, LGS GSV) bi piranî ji koma alternatîf A bûn, hinên din (mînak FGW, RTN, WGF, NTR) di koma alternatîf B de dewlemend bûn.
Tesdîqkirina veguhastina CSF ya peptîdên nîşankirî yên faj ên dewlemendkirî yên CSF û peptîdên rêber ên biyotînkirî yên ku bi barên streptavidin ve girêdayî ne.
(a) Rêjeyên dewlemendkirinê yên ku di her çar doran de (R1-R4) li gorî tîterên fajê yên derzîkirî (têketin = I) û tîterên fajê yên CSF yên diyarkirî (derketin = O) hatine hesabkirin. Faktorên dewlemendkirinê ji bo sê dorên dawîn (R2-R4) bi berhevdana bi dora berê û dora yekem (R1) re bi daneyên giraniyê hatine hesabkirin. Barên vekirî şileya mêjî ne, barên tarîkirî plazma ne. (***p<0.001, li gorî testa t ya Xwendekar). (b) Lîsteya peptîdên fajê yên herî zêde, li gorî rêjeya wan a nisbî ya hemî fajên ku di CSF de piştî dora 4-an a hilbijartinê hatine berhevkirin, rêzkirî ye. Şeş klonên fajê yên herî gelemperî bi rengîn, hejmarkirî û faktorên dewlemendkirina wan di navbera dorên 3 û 4-an ên hilbijartinê de (inset) hatine ronîkirin. (c,d) Şeş klonên fajê yên herî dewlemend, fajê vala û pirtûkxaneyên peptîdên fajê yên dêûbav ji dora 4-an bi ferdî di modela nimûnegirtina CSF de hatin analîzkirin. Nimûneyên CSF û xwînê di demên diyarkirî de hatin berhevkirin. (c) Mîqdarên wekhev ên 6 klonên fajê yên namzet (2 x 1010 faj/ajal), fajên vala (#1779) (2 x 1010 faj/ajal) û pirtûkxaneyên peptîdên fajê yên stok (2 x 1012 faj/ajal) Bi kêmî ve 3 CM bi rêya damara dûvikê veqetandî ji ajalê kanulkirî re tê derzîkirin. Farmakokînetîka CSF ya her klona fajê ya derzîkirî û pirtûkxaneya peptîdê ya fajê di demê re tê nîşandan. (d) rêjeya navînî ya CSF/xwînê ji bo hemî fajên vegerandî/mL di dema nimûnegirtinê de nîşan dide. (e) Çar peptîdên rêberê sentetîk û kontrolek tevlihev bi bîotînê bi rêya N-termînusa wan ve bi streptavidin ve hatin girêdan (nîşandana tetramer) û dûv re derzîkirin (damara dûvikê iv, 10 mg streptavidin/kg). Bi kêmî ve sê mişkên entubasyonkirî (N = 3). ). Nimûneyên CSF di demên diyarkirî de hatin berhevkirin û konsantrasyonên streptavidin bi ELISA ya dij-streptavidin a CSF hatin pîvandin (nd = nehat tespîtkirin). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, li gorî testa ANOVA). (f) Berawirdkirina rêza asîda amînî ya klona peptîda fajê ya herî dewlemendkirî #2002 (mor) bi klonên peptîda fajê yên din ên bijartî ji gera 4-an a hilbijartinê. Parçeyên asîda amînî yên wekhev û yên dişibin hev bi kodên rengîn têne nîşankirin.
Ji hemû fajên dewlemendkirî di gera çaremîn de (Wêne 3b), şeş klonên namzed ji bo analîza ferdî ya bêtir di modela nimûneya CSF de hatin hilbijartin. Mîqdarên wekhev ên şeş fajên namzed, faja vala (bêyî têxistin) û pirtûkxaneyên peptîdên profaj di sê heywanên CM yên kanulkirî de hatin derzîkirin, û farmakokînetîk di ceribandinên CSF (Wêne 3c) û xwînê (Wêne 7 ya Pêvek) de hatin destnîşankirin. Hemû klonên fajên ku hatine ceribandin, beşa CSF di astek 10-1000 carî ji ya faja kontrolê ya vala (#1779) bilindtir de hedef girtin. Mînakî, klonên #2020 û #2077 bi qasî 1000 carî tîterên CSF ji faja kontrolê bilindtir bûn. Profîla farmakokînetîk a her peptîda bijartî cûda ye, lê hemî wan xwedî şiyana xwerêveberiya CSF ya bilind in. Me ji bo klonên #1903 û #2011 kêmbûnek domdar bi demê re dît, lê ji bo klonên #2077, #2002 û #2009 zêdebûnek di 10 hûrdemên pêşîn de dibe ku veguhestina çalak nîşan bide lê divê were verast kirin. Klonên #2020, #2002, û #2077 di astên bilind de stabîl bûn, lê piştî zêdebûna destpêkê, konsantrasyona CSF ya klona #2009 hêdî hêdî kêm bû. Piştre me frekansa nisbî ya her namzetê CSF bi konsantrasyona xwîna wê re berawird kir (Wêne 3d). Têkiliya tîtra navînî ya her namzetê CSF bi tîtra xwîna wê re di hemî demên nimûnegirtinê de nîşan da ku sê ji şeş namzetan di CSF-ya xwînê de bi girîngî dewlemend bûne. Balkêş e ku klona #2077 stabîlîteya xwînê ya bilindtir nîşan da (Wêneya Pêvek 7). Ji bo piştrastkirina ku peptîd bi xwe dikarin barhilgirên ji bilî perçeyên fajê bi awayekî çalak veguhezînin nav beşa CSF, me çar peptîdên rêber ên ku bi biyotîn re li dawiya N-ê hatine derivatîzekirin sentez kirin ku peptîd bi perçeya fajê ve girêdayî ne. Peptîdên biyotînkirî (jimar 2002, 2009, 2020 û 2077) bi streptavidin (SA) re hatin konjugasyonkirin da ku formên piralî yên ku hinekî geometrîya fajê teqlîd dikin bi dest bixin. Ev format her wiha rê da me ku em rûbirûbûna SA di xwîn û şilava mêjî de wekî peptîdên proteîna veguhastina bar bipîvin. Ya girîng, daneyên fajê pir caran dikarin werin dubarekirin dema ku peptîdên sentetîk di vê formata SA-konjugasyonkirî de hatin rêvebirin (Wêne 3e). Peptîdên tevlihevkirî rûbirûbûna destpêkê kêmtir û paqijkirina CSF-ê ya zûtir bi astên nedîtbar di nav 48 demjimêran de hebûn. Ji bo ku em têgihîştinê li ser rêyên radestkirina van klonên fajê yên peptîdê nav qada CSF-ê bi dest bixin, me cîhê lêdanên peptîdên fajê yên takekesî bi karanîna îmmunohistokîmya (IHC) analîz kir da ku rasterast perçeyên fajê 1 demjimêr piştî derzîkirina damarî di vivo de tespît bikin. Bi taybetî, klonên #2002, #2077, û #2009 bi boyaxkirina bihêz di kapîlarên mêjî de hatin tespîtkirin, lê faja kontrolê (#1779) û klona #2020 nehatin tespîtkirin (Wêneya Pêvek 8). Ev yek nîşan dide ku ev peptîd bi derbasbûna BBB-ê bi rastî beşdarî bandora li ser mêjî dibin. Ji bo ceribandina vê hîpotezê analîzek berfirehtir hewce ye, ji ber ku dibe ku rêya BSCFB jî beşdar bibe. Dema ku rêza asîda amînî ya klona herî dewlemendkirî (#2002) bi peptîdên din ên bijartî re hate berhev kirin, hate dîtin ku hin ji wan xwedî dirêjkirinên asîda amînî yên wekhev in, ku dibe ku mekanîzmayek veguhastinê ya wekhev nîşan bide (Wêne 3f).
Ji ber profîla xwe ya plazmayê ya bêhempa û zêdebûna girîng a CSF-ê bi demê re, klona nîşandana fajê #2077 di heyamek dirêjtir a 48 demjimêran de bêtir hate lêkolîn kirin û karîbû zêdebûna bilez a CSF-ê ya ku bi asta SA-ya domdar ve girêdayî ye, dubare bike (Wêne 4a). Di derbarê klonên fajê yên din ên hatine destnîşankirin de, #2077 ji bo kapîlarên mêjî bi tundî boyax kir û dema ku bi çareseriya bilindtir hate dîtin, bi lektîna nîşankera kapîlar re hevcihbûnek girîng nîşan da û dibe ku hin boyaxkirin di qada parenkîmal de nîşan da (Wêne 4b). Ji bo lêkolînkirina ka bandorên farmakolojîk ên bi navbeynkariya peptîdê dikarin di CNS-ê de werin bidestxistin, me ceribandinek pêk anî ku tê de guhertoyên biyotînkirî yên i) peptîda transîtê #2077 û ii) peptîda astengkerê BACE1 bi SA re di du rêjeyên cûda de hatin tevlihev kirin. Ji bo yek kombînasyonê me tenê astengkerê peptîda BACE1 bikar anî û ji bo ya din me rêjeya 1:3 ya astengkerê peptîda BACE1 bi peptîda #2077 bikar anî. Her du nimûne bi damarî hatin dayîn û asta xwîn û şileya mêjî ya peptîda beta-amîloîd 40 (Abeta40) bi demê re hate pîvandin. Abeta40 di CSF de hate pîvandin ji ber ku ew astengkirina BACE1 di parenkîma mêjî de nîşan dide. Wekî ku tê hêvîkirin, her du kompleks asta Abeta40 di xwînê de bi girîngî kêm kirin (Wêne 4c, d). Lêbelê, tenê nimûneyên ku têkelê peptîda jimare 2077 û astengkerek peptîda BACE1 ya bi SA ve girêdayî dihewînin, bûn sedema kêmbûnek girîng a Abeta40 di şilava mêjî de (Wêne 4c). Daneyên nîşan didin ku peptîda jimare 2077 dikare proteîna SA ya 60 kDa veguhezîne CNS û her weha bandorên farmakolojîk bi astengkerên peptîda BACE1 yên bi SA ve girêdayî çêdike.
(a) Derzîkirina klonal (2 × 10 faj/ajal) ya faja T7 ku profîlên farmakokînetîk ên demdirêj ên peptîda CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) û faja kontrolê ya nederzîkirî (#1779) di herî kêm sê mişkên CM-entubasyonkirî de nîşan dide. (b) Wêneya mîkroskopîk a konfokal a mîkrodamarên kortîkal ên nûner di mişkên ku faj lê hatiye derzîkirin (2 × 10 10 faj/ajal) de ku boyaxkirina dijber a peptîda #2077 û damaran (lektîn) nîşan dide. Ev klonên fajê ji 3 mişkan re hatin dayîn û berî perfuzyonê 1 saet hiştin ku diherikin. Mejî hatin perçekirin û bi antîkorên polîklonal ên bi FITC-nîşankirî li dijî kapsîda faja T7 hatin boyaxkirin. Deh deqe berî perfuzyonê û fiksasyona paşê, lektîn bi DyLight594-nîşankirî bi damarî hate dayîn. Wêneyên floresan boyaxkirina lektînê (sor) a aliyê luminal ê mîkrodamaran û fajan (kesk) di lumena kapîler û tevna mêjî ya perîvaskuler de nîşan didin. Pîvana xêzê bi 10 µm re têkildar e. (c, d) Peptîda astengker a BACE1 ya biyotînkirî bi tena serê xwe an jî bi peptîda transîtê ya biyotînkirî #2077 bi streptavidin ve hate girêdan û dûv re bi kêmî ve sê mişkên CM yên kanulkirî (10 mg streptavidin/kg) hatin derzîkirin. Kêmkirina Aβ40 ya bi navbeynkariya astengkerê peptîda BACE1 bi ELISA ya Aβ1-40 di xwîn (sor) û şileya mêjî-hesinî (porteqalî) de di demên destnîşankirî de hate pîvandin. Ji bo zelaliyek çêtir, xêzek xalxalî li ser grafîkê bi pîvanek 100% hatiye xêzkirin. (c) Rêjeya kêmkirina Aβ40 di xwîn (sêgoşeyên sor) û şileya mêjî-hesinî (sêgoşeyên porteqalî) de di mişkên ku bi streptavidin ve girêdayî peptîda transîtê #2077 û peptîda astengker a BACE1 bi rêjeyek 3:1 hatine dermankirin. (d) Rêjeya kêmkirina Aβ40 di xwînê de (xelekên sor) û şileya mêjî-hesinî (xelekên porteqalî) ya mişkên ku tenê bi streptavidin ve girêdayî bi peptîdek astengker a BACE1 ve hatine dermankirin. Tewra Aβ di kontrolê de 420 pg/ml bû (devîasyona standard = 101 pg/ml).
Nîşandana fajê di gelek warên lêkolînên biyomedikal de bi serkeftî hatiye sepandin17. Ev rêbaz ji bo lêkolînên cihêrengiya damarî yên in vivo18,19 û her weha lêkolînên ku damarên mejî hedef digirin20,21,22,23,24,25,26 hatiye bikar anîn. Di vê lêkolînê de, me sepandina vê rêbaza hilbijartinê ne tenê ji bo destnîşankirina rasterast a peptîdên ku damarên mejî hedef digirin, lê di heman demê de ji bo kifşkirina namzetên bi taybetmendiyên veguhastina çalak ji bo derbaskirina astengiya xwîn-mejî jî berfireh kir. Em niha pêşkeftina prosedurek hilbijartinê ya in vivo di mişkên CM yên entubasyonkirî de vedibêjin û potansiyela wê ya destnîşankirina peptîdên bi taybetmendiyên malê yên CSF nîşan didin. Bi karanîna faja T7 ku pirtûkxaneyek peptîdên rasthatî yên 12-mer nîşan dide, em karîn nîşan bidin ku faja T7 têra xwe piçûk e (bi qasî 60 nm di qûtra xwe de)10 ku bi astengiya xwîn-mejî re were adaptekirin, bi vî rengî rasterast ji astengiya xwîn-mejî an pleksusa koroîd derbas dibe. Me dît ku berhevkirina CSF ji mişkên CM yên kanulkirî rêbazek pişkinîna fonksiyonel a in vivo ya baş-kontrolkirî bû, û faja derxistî ne tenê bi damaran ve girêdide lê di heman demê de wekî veguhezkarek li seranserê astengiya xwîn-mejî jî kar dike. Wekî din, bi berhevkirina xwînê ya hevdem û sepandina HTS li ser CSF û fajên ji xwînê hatine wergirtin, me piştrast kir ku hilbijartina me ya CSF ji hêla dewlemendkirina xwînê an jî guncanbûna ji bo berfirehbûnê di navbera tûrên hilbijartinê de bandor nebûye. Lêbelê, beşa xwînê beşek ji prosedûra hilbijartinê ye, ji ber ku fajên ku dikarin bigihîjin beşa CSF divê di xwînê de têra xwe bijîn û diherikin da ku xwe di mejî de dewlemend bikin. Ji bo ku agahdariya rêza pêbawer ji daneyên HTS yên xav derxînin, me fîlterên ku ji bo xeletiyên rêza taybetî yên platformê di xebata analîzê de hatine adaptekirin bicîh anîn. Bi tevlêkirina parametreyên kînetîk di rêbaza pişkinînê de, me farmakokînetîka bilez a fajên T7 yên celebê kovî (t½ ~ 28 hûrdem) di xwînê de piştrast kir24, 27, 28 û her weha nîv-jiyana wan di şilava mêjî de (t½ ~ 26 hûrdem) diyar kir. Tevî profîlên farmakokînetîkî yên dişibin hev di xwîn û CSF de, tenê %0.001ê rêjeya fajê di xwînê de di CSF de dikare were tespît kirin, ku ev yek nîşan dide ku fajê T7 yê celebê kovî li seranserê astengiya xwîn-mejî kêm e. Ev xebat girîngiya gera yekem a hilbijartinê dema ku stratejiyên panningê yên in vivo têne bikar anîn, nemaze ji bo pergalên fajê yên ku bi lez ji gera xwînê têne paqij kirin, destnîşan dike, ji ber ku çend klon dikarin bigihîjin beşa CNS. Bi vî awayî, di gera yekem de, kêmbûna cihêrengiya pirtûkxaneyê pir mezin bû, ji ber ku tenê hejmareke sînorkirî ya klonan di dawiyê de di vê modela CSF ya pir hişk de hatin berhev kirin. Ev stratejiya panningê ya in vivo çend gavên hilbijartinê yên wekî kombûna çalak di beşa CSF de, saxmayîna klone di beşa xwînê de, û rakirina bilez a klonên fajê T7 ji xwînê di nav 10 hûrdemên pêşîn de vedihewîne (Wêne 1d û Wêneya Pêvek 4M). Bi vî awayî, piştî gera yekem, klonên fajê yên cûda di CSF de hatin nas kirin, her çend heman hewza destpêkê ji bo heywanên takekesî hate bikar anîn. Ev yek nîşan dide ku gelek gavên hilbijartinê yên hişk ji bo pirtûkxaneyên çavkaniyê yên bi hejmareke mezin ji endamên pirtûkxaneyê dibin sedema kêmbûneke girîng a cihêrengiyê. Ji ber vê yekê, bûyerên rasthatî dê bibin beşek yekgirtî ya pêvajoya hilbijartina destpêkê, ku bandorek mezin li ser encamê dike. Guman e ku gelek klonên di pirtûkxaneya orîjînal de meyla dewlemendkirina CSF-ê pir dişibin hev hebûn. Lêbelê, tewra di bin heman şert û mercên ceribandinê de jî, encamên hilbijartinê dikarin ji ber hejmara hindik a her klonek taybetî di hewza destpêkê de cûda bibin.
Motîfên ku di CSF de dewlemend bûne ji yên di xwînê de cuda ne. Bi balkêşî, me di xwîna heywanên takekesî de yekem guhertina ber bi peptîdên dewlemend ên glîsînê ve dît. (Wêne 1g, Wêneyên Pêvek 4e, 4f). Fajên ku peptîdên glîsînê dihewînin dibe ku stabîltir bin û kêmtir îhtîmal e ku ji gera xwînê werin derxistin. Lêbelê, ev peptîdên dewlemend ên glîsînê di nimûneyên şilava mêjî de nehatin tespît kirin, ku ev yek nîşan dide ku pirtûkxaneyên ku hatine hilbijartin di du gavên hilbijartinê yên cûda re derbas bûne: yek di xwînê de û yek jî destûr hatiye dayîn ku di şilava mêjî de kom bibe. Klonên dewlemendkirî yên CSF yên ku ji gera çaremîn a hilbijartinê derketine holê bi berfirehî hatine ceribandin. Nêzîkî hemî klonên ku bi ferdî hatine ceribandin, li gorî faja kontrolê ya vala di CSF de dewlemend bûne, hat piştrast kirin. Yek peptîdek lêxistin (#2077) bi hûrgulîtir hate lêkolîn kirin. Wê nîv-jiyana plazmayê ya dirêjtir nîşan da li gorî lêxistinên din (Wêne 3d û Wêneya Pêvek 7), û balkêş e ku ev peptîd li C-termînusê bermahiyek sîsteînê dihewîne. Di demên dawî de hatiye nîşandan ku zêdekirina sîsteînê li peptîdan dikare taybetmendiyên wan ên farmakokînetîk bi girêdana bi albûmîn 29 re baştir bike. Ev niha ji bo peptîda #2077 nayê zanîn û pêdivî bi lêkolînek bêtir heye. Hin peptîdan di dewlemendkirina CSF de girêdayîbûnek valansê nîşan dan (dane nehatine nîşandan), ku dibe ku bi geometrîya rûyê kapsîda T7 ve girêdayî be. Sîstema T7 ya ku me bikar anî 5-15 kopiyên her peptîdê li ser perçeya fajê nîşan da. IHC li ser klonên fajê yên pêşeng ên namzetan ên ku bi damarî di korteksa mejî ya mişkan de hatine derzîkirin hate kirin (Wêneya Pêvek 8). Daneyan nîşan da ku herî kêm sê klon (Hejmar 2002, Hejmar 2009 û Hejmar 2077) bi BBB re têkilî danîne. Pêdivî ye ku were destnîşankirin ka ev têkiliya BBB dibe sedema kombûna CSF an jî tevgera van klonan rasterast ber bi BCSFB ve. Ya girîng, em nîşan didin ku peptîdên bijartî kapasîteya xwe ya veguhastina CSF dema ku têne sentezkirin û bi barkêşiya proteînê ve têne girêdan diparêzin. Girêdana peptîdên biyotînkirî yên N-termînal bi SA re di bingeh de encamên ku bi klonên fajê yên wan ên têkildar di xwîn û şileya mêjî de hatine bidestxistin dubare dike (Wêne 3e). Di dawiyê de, em nîşan didin ku peptîda pêşeng #2077 dikare çalakiya mêjî ya astengkerek peptîda biyotînkirî ya BACE1-ê ya bi SA-yê ve girêdayî pêşve bibe, û bi kêmkirina girîng a asta Abeta40-ê di CSF-ê de bandorên farmakodînamîkî yên berbiçav di CNS-ê de çêbike (Wêne 4). Em nekarîn bi lêgerîna homologiya rêza peptîdê ya hemî lêdanan di databasa de tu homologan nas bikin. Girîng e ku were zanîn ku mezinahiya pirtûkxaneya T7 bi qasî 109 e, lê mezinahiya pirtûkxaneya teorîk ji bo 12-meran 4 x 1015 e. Ji ber vê yekê, me tenê beşek piçûk ji qada cihêrengiya pirtûkxaneya peptîdê ya 12-mer hilbijart, ku dibe ku tê vê wateyê ku peptîdên çêtirkirîtir dikarin bi nirxandina qada rêza cîran a van lêdanên hatine destnîşankirin werin nas kirin. Bi awayekî hîpotetîk, yek ji sedemên ku me ti homologên xwezayî yên van peptîdan nedîtine, dibe ku ji ber nehilbijartinê di dema pêşveçûnê de be da ku pêşî li ketina bêkontrol a hin motîfên peptîdê nav mêjî were girtin.
Bi hev re, encamên me bingehek ji bo xebatên pêşerojê peyda dikin da ku pergalên veguhastinê yên astengiya serebrovaskuler di vivo de bi hûrgilîtir werin destnîşankirin û taybetmendîkirin. Sazkirina bingehîn a vê rêbazê li ser stratejiyek hilbijartina fonksiyonel e ku ne tenê klonên bi taybetmendiyên girêdana damarên mejî destnîşan dike, lê di heman demê de gavek krîtîk jî dihewîne ku tê de klonên serketî çalakiyek hundurîn hene ku di vivo de ji astengiyên biyolojîkî derbas bibin nav beşa CNS. ronîkirina mekanîzmaya veguhastina van peptîdan û tercîha wan ji bo girêdana bi mîkrovaskulatûra taybetî ya herêma mejî re ye. Ev dibe ku bibe sedema kifşkirina rêyên nû ji bo veguhastina BBB û receptoran. Em hêvî dikin ku peptîdên hatine destnîşankirin dikarin rasterast bi receptorên serebrovaskuler an jî bi lîgandên gerok ên ku bi rêya BBB an BCSFB têne veguhastin ve girêbidin. Vektorên peptîd ên bi çalakiya veguhastina CSF-ê yên ku di vê xebatê de hatine kifş kirin dê bêtir werin lêkolîn kirin. Em niha taybetmendiya mejî ya van peptîdan ji bo şiyana wan a derbasbûna BBB û/an BCSFB lêkolîn dikin. Ev peptîdên nû dê ji bo kifşkirina potansiyel a wergir an rêyên nû û ji bo pêşxistina platformên nû yên pir bikêrhatî ji bo radestkirina makromolekulan, wekî biyolojîkî, bo mêjî amûrên pir hêja bin.
Bi karanîna guhertoyek rêbaza berê hatî vegotin, sîsterna mezin (CM) kanul bikin. Mişkên Wistar ên bêhiş (200-350 g) li ser amûrek stereotaksîk hatin siwarkirin û birînek navîn li ser serê tazî û bi awayekî aseptîk amadekirî hate çêkirin da ku serê were eşkerekirin. Du kun li herêma qata jorîn bikolin û pêçên rastkirinê di kunan de bişidînin. Ji bo rêberiya stereotaktîk a kanûlayek pola zengarnegir di CM de, kunek din di lûtkeya oksîpîtal a alî de hate kolandin. Çîmentoya diranan li dora kanûlayê bidin ser û bi pêçan ewle bikin. Piştî foto-saxbûnê û hişkbûna çîmentoyê, birîna çerm bi dirûtina supramid a 4/0 hate girtin. Cihê rast ê kanûlayê bi rijandina xweber a şilava mêjî-hesinî (CSF) tê piştrast kirin. Mişk ji amûra stereotaksîk derxînin, lênêrîna piştî emeliyatê û rêveberiya êşê ya guncan bistînin, û bihêlin ku ew herî kêm hefteyekê baş bibe heya ku nîşanên xwînê di şilava mêjî-hesinî de werin dîtin. Mişkên Wistar (Crl:WI/Han) ji Charles River (Fransa) hatin wergirtin. Hemû mişk di bin şert û mercên taybetî yên bê patojen de hatin hiştin. Hemû ceribandinên li ser heywanan ji aliyê Ofîsa Veterîneriyê ya Bajarê Basel, Swîsre, ve hatin pejirandin û li gorî Lîsansa Heywanan a Hejmar 2474 (Nirxandina Veguhestina Çalak a Mejî bi Pîvandina Astên Namzetên Dermankirinê di Şileya Serebrospinal û Mejiyê Mişk de) hatin kirin.
Bi nermî, bi kanûla CM di dest de, mişkê hişyar bihêlin. Datura ji kanûlayê derxînin û 10 µl şileya mejî-hestyarî ya ku bi awayekî xweber diherike berhev bikin. Ji ber ku vebûna kanûlayê di dawiyê de xirab bû, tenê nimûneyên şileya mejî-hestyarî ya zelal bêyî delîlên qirêjbûna xwînê an guherîna rengê di vê lêkolînê de hatin girtin. Di heman demê de, bi qasî 10-20 μl xwîn ji birînek piçûk a li serê dûvikê di nav lûleyên bi heparîn (Sigma-Aldrich) de hat girtin. CSF û xwîn di demên cûda de piştî derzîkirina damarî ya faja T7 hatin berhev kirin. Berî ku her nimûneya CSF were berhev kirin, bi qasî 5-10 μl şilek hat avêtin, ku ev bi qebareya mirî ya kateterê re têkildar e.
Pirtûkxane bi karanîna vektora T7Select 10-3b wekî ku di rêbernameya pergala T7Select de hatiye vegotin (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) hatin çêkirin. Bi kurtasî, têxistina DNA-ya 12-mer a rasthatî bi formata jêrîn hate sentezkirin:
Kodona NNK ji bo dûrketina ji kodonên rawestandina ducar û zêdeîfadekirina asîda amînî di nav têketinê de hat bikar anîn. N rêjeyek ekîmolar a bi destan tevlihevkirî ya her nukleotîdê ye, û K rêjeyek ekîmolar a bi destan tevlihevkirî ya nukleotîdên adenîn û sîtozîn e. Herêmên yek-telî bi înkubasyona zêdetir bi dNTP (Novagen) û enzîma Klenow (New England Biolabs) di tampona Klenow (New England Biolabs) de ji bo 3 saetan li 37°C veguherî DNAya du-telî. Piştî reaksiyonê, DNAya du-telî bi barîna EtOH hat wergirtin. DNAya encam bi enzîmên sînorkirinê EcoRI û HindIII (her du jî ji Roche) hat helandin. Têketina perçekirî û paqijkirî (QIAquick, Qiagen) (lîgaza T4, New England Biolabs) dûv re di çarçoveyekê de piştî asîda amînî 348 a gena kapsîd 10B di nav vektorek T7 ya pêş-qetandî de hat girêdan. Reaksiyonên girêdanê berî pakkirina in vitro ji bo 18 saetan li 16°C hatin înkubasyon kirin. Pakêtkirina fajê li gorî rêwerzên ku bi kîta klona T7Select 10-3b (Novagen) re hatine dayîn, di vitro de hate kirin û çareseriya pakkirinê bi karanîna Escherichia coli (BLT5615, Novagen) carekê hate zêdekirin heta lîzê. Lîzat wekî çareseriya stokê ya glîserolê di -80°C de hatin santrifujkirin, tîtrîkirin û cemidandin.
Zêdekirina rasterast a PCR ya herêmên guhêrbar ên fajê yên ku di şorbe an plakayê de hatine zêdekirin bi karanîna primerên fusion ên 454/Roche-amplicon ên taybet. Primera fusion a pêşverû rêzikên ku li kêleka herêma guhêrbar (NNK) 12 (taybetî bi şablonê), GS FLX Titanium Adapter A, û ​​rêzek mifteya pirtûkxaneyê ya çar-bingehî (TCAG) ne dihewîne (Wêneya Pêvek 1a):
Prîmera hevgirtina berevajî di heman demê de biyotîn jî dihewîne ku ji bo girtina mûyên girêdayî ye û GS FLX Titanium Adapter B ya ku ji bo amplîfîkasyona klonal di dema emulsiyona PCR de hewce ye:
Piştre amplîkon li gorî protokola 454 GS-FLX Titanium ji bo pirosequencinga 454/Roche hatin ceribandin. Ji bo rêzkirina destî ya Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNAya faja T7 bi PCR hate zêdekirin û bi cotên primer ên jêrîn hate rêzkirin:
Pêvekên ji plakayên ferdî bi karanîna Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (li gorî rêwerzên çêker) ji bo amplîfîkasyona PCR-ê hatin kirin. Destpêkek germ (10 deqe li 95 °C) û 35 çerxên zêdekirinê (50 saniye li 95 °C, 1 deqe li 50 °C, û 1 deqe li 72 °C) pêk bînin.
Faj ji pirtûkxaneyan, fajên cureyê kovî, fajên ji CSF û xwînê hatine rizgarkirin, an jî klonên takekesî di Escherichia coli BL5615 de di ava TB (Sigma Aldrich) an jî di firaxên 500 cm2 (Thermo Scientific) de ji bo 4 saetan li 37°C hatin zêdekirin. Faj bi şuştina plakan bi tampona Tris-EDTA (Fluka Analytical) an jî bi berhevkirina plakan bi serê pîpetên sterîl ji plakan hatin derxistin. Faj ji supernatantê çandî an jî tampona derxistinê bi yek dorê barîna polîetîlen glîkol (PEG 8000) (Promega) hatin veqetandin û di tampona Tris-EDTA de ji nû ve hatin îzolekirin.
Fajê zêdekirî berî derzîkirina damarî (IV) (500 μl/ajal) bi karanîna morîkên rakirina endotoksînê (Miltenyi Biotec) 2-3 dewreyên rakirina endotoksînê hat kirin. Di tûra yekem de, 2×1012 faj hatin danîn; di ya duyem de, 2×1010 faj; di tûrên hilbijartinê yên sêyem û çarem de, 2×109 faj ji bo her ajalekî. Naveroka fajê di nimûneyên CSF û xwînê yên ku di demên diyarkirî de hatine berhevkirin de li gorî rêwerzên çêker (rêbernameya pergala T7Select) bi jimartina plakê ve hat destnîşankirin. Hilbijartina fajê bi derzîkirina damarî ya pirtûkxaneyên paqijkirî nav damara dûvikê an jî bi ji nû ve derzîkirina fajê ku ji CSF ji tûra hilbijartinê ya berê hatiye derxistin hat kirin, û berhevkirinên paşê bi rêzê ve di 10 deqe, 30 deqe, 60 deqe, 90 deqe, 120 deqe, 180 deqe, û 240 deqeyan de nimûneyên CSF û xwînê hatin kirin. Bi tevahî çar dewreyên pankirina in vivo hatin kirin ku tê de her du şaxên bijartî di sê dewreyên pêşîn ên hilbijartinê de ji hev cuda hatin hilanîn û analîzkirin. Hemî insertên fajê yên ji CSF-ê yên ji du dewreyên pêşîn ên hilbijartinê hatine derxistin, ji bo pirosequencinga 454/Roche hatin derbaskirin, di heman demê de hemî klonên ku ji CSF-ê yên ji du dewreyên dawîn ên hilbijartinê hatine derxistin bi destan hatin rêzkirin. Hemî fajên xwînê yên ji dewreya yekem a hilbijartinê jî ji bo pirosequencinga 454/Roche hatin derbaskirin. Ji bo derzîkirina klonên fajê, fajên bijartî di E. coli (BL5615) de li ser plakayên 500 cm2 di 37°C de ji bo 4 saetan hatin zêdekirin. Klonên ku bi ferdî hatine hilbijartin û bi destan hatine rêzkirin, di navgîna TB de hatin belav kirin. Piştî derxistina fajê, paqijkirin û rakirina endotoksînê (wekî ku li jor hatî vegotin), 2×1010 faj/ajal di 300 μl de bi damarek damarî hatin derzîkirin.
Pêvajoya pêşwext û fîlterkirina kalîtîf a daneyên rêzê. Daneyên xav ên 454/Roche ji formata nexşeya herikîna standard a dualî (sff) bo formata xwendina mirovan a Pearson (fasta) bi karanîna nermalava firoşkar hatin veguheztin. Pêvajoya bêtir a rêza nukleotîdê bi karanîna bername û skrîptên C yên taybet (pakêta nermalava nehatî weşandin) wekî ku li jêr hatî vegotin hate kirin. Analîza daneyên seretayî prosedurên fîlterkirina pir-qonaxî yên hişk vedihewîne. Ji bo fîlterkirina xwendinên ku rêza DNA-ya têxe ya 12mer a derbasdar tê de tunebûn, xwendin bi rêzê li gorî etîketa destpêkê (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), etîketa rawestandinê (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) û têxe paşxaneyê (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) bi karanîna testa gerdûnî ya Needleman-Wunsch hatin hevrêzkirin. hevrêzkirin dihêle ku heya 2 nelihevhatin di her hevrêzkirinê de31. Ji ber vê yekê, xwendinên bêyî etîketên destpêk û rawestandinê û xwendinên ku têxeyên paşxaneyê dihewînin, ango, hevrêzkirinên ku ji hejmara destûr a nelihevkirinan derbas dibin, ji pirtûkxaneyê hatin rakirin. Ji bo xwendinên mayî, rêza DNAya N-mer ku ji nîşana destpêkê dirêj dibe û berî nîşana rawestandinê diqede ji rêza xwendinê ya orîjînal hate derxistin û bêtir hate pêvajokirin (ji vir û pê ve wekî "insert" tê binavkirin). Piştî wergerandina insertê, beşa piştî kodona rawestandina yekem li dawiya 5' ya prîmerê ji insertê hate derxistin. Wekî din, nukleotîdên ku dibin sedema kodonên netemam ên li dawiya 3' ya prîmerê jî hatin rakirin. Ji bo derxistina insertên ku tenê rêzikên paşxaneyê dihewînin, insertên wergerandî yên ku bi şêweya asîda amînî "PAG" dest pê dikin jî hatin rakirin. Peptîdên ku dirêjahiya wan a piştî wergerandinê ji 3 asîdên amînî kêmtir e ji pirtûkxaneyê hatin rakirin. Di dawiyê de, zêdehiya di hewza insertê de were rakirin û frekansa her insertê ya bêhempa were destnîşankirin. Encamên vê analîzê navnîşek rêzikên nukleotîd (insert) û frekansên wan ên (xwendinê) vedihewîne (Wêneyên Pêvek 1c û 2).
Têxistinên DNA yên N-mer ên komê li gorî wekheviya rêzê: Ji bo rakirina xeletiyên rêzkirina taybetî yên 454/Roche (wek pirsgirêkên bi dirêjkirinên rêzkirina homopolîmer) û rakirina dubareyên kêm girîng, têxistinên rêza DNA ya N-mer ên berê hatine fîltrekirin (têxistin) li gorî wekheviyê têne rêzkirin. têxistin (heta 2 bingehên ne-hevber têne destûr kirin) bi karanîna algorîtmayek dubarekirî ya ku wiha tê pênase kirin: têxistin pêşî li gorî frekansa xwe (ji herî bilind ber bi herî nizm) têne rêzkirin, û heke ew wekhev bin, li gorî duyemîn a wan li gorî dirêjahiyê têne rêzkirin (ji ya herî dirêj ber bi ya herî kurt) ). Bi vî rengî, têxistinên herî pir û dirêj "koma" yekem diyar dikin. Frekansa komê li gorî frekansa mifteyê tê danîn. Dûv re, her têxistinek ku di navnîşa rêzkirî de maye, bi hevrêzkirina Needleman-Wunsch a cot-cot ve hate hewl kirin ku li komê were zêdekirin. Ger hejmara nelihevhatin, têxistin, an jêbirinên di hevrêzkirinê de ji sînorê 2 derbas nebe, têxistinek li komê tê zêdekirin, û frekansa giştî ya komê bi rêjeya zêdekirina têxistinê tê zêdekirin. Têxistinên ku li komekê têne zêdekirin wekî hatine bikar anîn têne nîşankirin û ji pêvajoya bêtir têne derxistin. Eger rêza têxistinê nikaribe li komeke heyî were zêdekirin, rêza têxistinê ji bo afirandina komeke nû bi frekansa têxistina guncaw tê bikar anîn û wekî ku tê bikar anîn tê nîşankirin. Dubarekirin diqede dema ku her rêza têxistinê ji bo avakirina komeke nû hatiye bikar anîn an jî dikare di komeke heyî de were bicîh kirin. Axir, têxistinên komkirî yên ji nukleotîdan pêk tên di dawiyê de têne wergerandin bo rêzên peptîd (pirtûkxaneyên peptîd). Encama vê analîzê komek têxistin û frekansên wan ên têkildar e ku hejmara xwendinên li pey hev pêk tînin (Wêneya Pêvek 2).
Çêkirina Motîfê: Li ser bingeha lîsteyek peptîdên bêhempa, pirtûkxaneyek hate afirandin ku hemî şablonên asîda amînî (aa) yên gengaz wekî li jêr tê nîşandan dihewîne. Her şablonek gengaz a bi dirêjahiya 3 ji peptîdê hate derxistin û şablona wê ya berevajî ligel pirtûkxaneyek motîf a hevpar ku hemî şablonan (trîpeptîd) dihewîne hate zêdekirin. Pirtûkxaneyên motîfên pir dubarekirî hatin rêzkirin û zêdebûn hate rakirin. Dûv re, ji bo her trîpeptîdê di pirtûkxaneya motîfê de, me hebûna wê di pirtûkxaneyê de bi karanîna amûrên hesabkirinê kontrol kir. Di vê rewşê de, frekansa peptîda ku trîpeptîda motîf a dîtî dihewîne tê zêdekirin û li motîfê di pirtûkxaneya motîfê de tê destnîşankirin ("hejmara motîfan"). Encama çêkirina motîfê rêzek du-alî ye ku hemî bûyerên trîpeptîdan (motîfan) û nirxên wan ên têkildar dihewîne, ku ew jî hejmara xwendinên rêzkirinê ne ku di encama motîfa têkildar de ne dema ku xwendin têne fîltrekirin, komkirin û wergerandin. Metrîk wekî ku li jor bi berfirehî hatine vegotin.
Normalîzekirina hejmara motîfan û nexşeyên belavbûnê yên têkildar: Hejmara motîfan ji bo her nimûneyê bi karanîna
ku ni hejmara xwendinên ku mijara i dihewîne ye. Bi vî awayî, vi rêjeya rêjeya xwendinên (an peptîdên) ku motîf i dihewîne di nimûneyê de temsîl dike. Nirxên P ji bo hejmara motîfên ne-normalîzekirî bi karanîna testa rast a Fisher hatin hesabkirin. Di derbarê korelogramên hejmara motîfan de, têkiliyên Spearman bi karanîna hejmara normalîzekirî ya motîfan bi R hatin hesabkirin.
Ji bo dîtina naveroka asîdên amînî li her pozîsyonê di pirtûkxaneya peptîdê de, logogramên webê 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) hatin çêkirin. Pêşî, naveroka asîdên amînî li her pozîsyona peptîda 12-mer di matrîksek 20×12 de tê hilanîn. Dûv re, komek ji 1000 peptîdên ku heman naveroka asîdên amînî ya nisbî di her pozîsyonê de dihewînin di formata fasta-sequence de têne çêkirin û wekî têketin ji bo web-logo 3 têne peyda kirin, ku nûnertiyek grafîkî ya naveroka asîdên amînî ya nisbî li her pozîsyonê ji bo pirtûkxaneyek peptîdê ya diyarkirî çêdike. Ji bo dîtina setên daneyên piralî, nexşeyên germê bi karanîna amûrek ku di hundurê de hatî pêşve xistin di R de (biosHeatmap, pakêtek R ya ku hîn nehatiye berdan) hatin çêkirin. Dendrogramên ku di nexşeyên germê de têne pêşkêş kirin bi karanîna rêbaza komkirina hiyerarşîk a Ward bi metrîka dûrbûna Euclidean hatin hesab kirin. Ji bo analîza statîstîkî ya daneyên xala motîfê, nirxên P ji bo xala nenormalkirî bi karanîna testa rast a Fisher hatin hesab kirin. Nirxên P-yê ji bo setên daneyên din di R-yê de bi karanîna t-test-a Xwendekar an ANOVA-yê hatin hesab kirin.
Klonên fajê yên bijartî û fajên bê pêvek bi rêya damara dûvikê bi rêya damara dûvikê bi rêya damarê hatin derzîkirin (2×1010 faj/ajal di 300 μl PBS de). Deh deqe berî perfuzyonê û fiksasyona paşê, heman heywan bi rêya damarê 100 μl lektîna bi DyLight594-nîşankirî (Vector Laboratories Inc., DL-1177) bi heman ajal hatin derzîkirin. 60 deqe piştî derzîkirina fajê, mişk bi 50 ml PBS û dû re jî 50 ml 4% PFA/PBS bi rêya dil hatin perfuzkirin. Nimûneyên mêjî her wiha bi şev di 4% PFA/PBS de hatin sabîtkirin û bi şev di 30% sukrozê de di 4°C de hatin şilkirin. Nimûne di tevliheviya OCT de bi lez û bez têne cemidandin. Analîza îmmunohîstokîmyayî ya nimûneyên cemidî di germahiya odeyê de li ser krîoseksiyonên 30 µm ên ku bi 1% BSA hatine astengkirin û bi antîkorên polîklonal ên bi FITC-nîşankirî li dijî faja T7 (Novus NB 600-376A) di 4°C de hatine înkubasyonkirin, hate kirin. Şevê din înkubasyon bikin. Di dawiyê de, beş 3 caran bi PBS hatin şuştin û bi mîkroskopa lazer a konfokal (Leica TCS SP5) hatin lêkolînkirin.
Hemû peptîdên bi paqijiya herî kêm 98% ji hêla GenScript USA ve hatine sentezkirin, biyotînkirin û lîyofîlîzekirin. Biyotîn bi rêya sêqat spacer glîsîn a zêde li N-termînusê ve tê girêdan. Hemû peptîd bi karanîna spektrometriya girseyî kontrol bikin.
Streptavidin (Sigma S0677) bi zêdehiyeke 5-qatî ya ekîmolar a peptîda biyotînkirî, peptîda astengker a BACE1 ya biyotînkirî, an jî tevlîheviyek (rêjeya 3:1) a peptîda astengker a BACE1 ya biyotînkirî û peptîda astengker a BACE1 di 5-10% DMSO de hate tevlihevkirin/di PBS de hate înkubasyonkirin. 1 saet berî derzîkirinê di germahiya odeyê de. Peptîdên bi streptavidin ve girêdayî bi dozeke 10 mg/kg bi rêya damarên dûvikê yên mişkên bi valahiyek mejî bi rêya damaran hatin derzîkirin.
Têkeliya kompleksên streptavidin-peptide bi ELISA hate nirxandin. Plaqeyên mîkrotîter ên Nunc Maxisorp (Sigma) bi şev li 4°C bi 1.5 μg/ml antîkorê antî-streptavidin a mişk (Thermo, MA1-20011) hatin pêçandin. Piştî astengkirinê (tampona astengkirinê: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% jelatîn, 1% BSA) li germahiya odeyê ji bo 2 saetan, plakayê bi 0.05% Tween-20/PBS (tampona şuştinê) ji bo 3 saniyeyan bişon, nimûneyên CSF û plazmayê li qulên ku bi tampona astengkirinê (plazma 1:10,000, CSF 1:115) hatine şilkirin hatin zêdekirin. Dûv re plaka bi antîkorê tespîtkirinê (1 μg/ml, antî-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) bi şev li 4°C hate înkubasyonkirin. Piştî sê gavên şuştinê, streptavidin bi rêya înkubasyonê di çareseriya substratê TMB (Roche) de heta 20 hûrdeman hate tespîtkirin. Piştî rawestandina pêşveçûna rengan bi 1M H2SO4, vegirtinê li 450 nm bipîvin.
Karê kompleksa astengker a streptavidin-peptide-BACE1 bi ELISA ya Aβ(1-40) li gorî protokola çêker (Wako, 294-64701) hate nirxandin. Bi kurtasî, nimûneyên CSF di diluenta standard (1:23) de hatin şilkirin û şevekê di 4°C de di plakayên 96-qulî de ku bi antîkorê girtina BNT77 hatine pêçandin, hatin înkubasyonkirin. Piştî pênc gavên şuştinê, antîkorê BA27 yê bi HRP ve girêdayî hate zêdekirin û 2 saetan di 4°C de hat înkubasyonkirin, û piştre pênc gavên şuştinê. Aβ(1–40) bi înkubasyonê di çareseriya TMB de ji bo 30 hûrdeman di germahiya odeyê de hate tespîtkirin. Piştî ku pêşveçûna reng bi çareseriya rawestandinê hate rawestandin, vegirtinê li 450 nm bipîvin. Nimûneyên plazmayê berî ELISA ya Aβ(1–40) ji bo derxistina qonaxa hişk hatin derbaskirin. Plazma li plakayên 96-qulî de li 0.2% DEA (Sigma) hate zêdekirin û 30 hûrdeman di germahiya odeyê de hat înkubasyonkirin. Piştî şuştina li pey hev a plakayên SPE (Oasis, 186000679) bi av û %100 metanolê, nimûneyên plazmayê li plakayên SPE hatin zêdekirin û hemû şilek hat derxistin. Nimûne hatin şuştin (pêşî bi %5 metanolê paşê bi %30 metanolê) û bi %2 NH4OH/%90 metanolê hatin eluatkirin. Piştî zuhakirina eluatê li 55°C bo 99 deqîqeyan bi herikîna N2 ya sabît, nimûne di diluentên standard de hatin kêmkirin û Aβ(1–40) wekî ku li jor hatî vegotin hat pîvandin.
Çawa vê gotarê binav bikin: Urich, E. û yên din. Radestkirina barhilgir bo mêjî bi karanîna peptîdên transîtê yên ku di vivo de hatine destnîşankirin. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB û Moos T. Radestkirina dermanên makromolekuler bo mêjî bi karanîna terapiya hedefgirtî. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., û Martinez-Martinez, P. Radestkirina dermanên peptîd û proteîn ji ser astengiya xwîn-mejî. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Astengiya xwîn-mejî: astengiyek di pêşveçûna dermanên mejî de. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, û Byrd, A. Îhtîmalên ji bo baştirkirina radestkirina dermanan û armanckirina wan bo mêjî bi rêya rêça pleksusa koroîd-CSF. Lêkolîna Dermanan 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernîzasyona biyofarmasûtîkan bi hespên Trojan ên molekulî ji bo radestkirina mêjî. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, Veguhestina peptîdê ya bi navbeynkariya reseptora WM di nav astengiya xwîn-mejî re. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. û yên din. Bi karanîna şûtlên molekulî yên yekvalent, zêdebûna penetrasyona mêjî û bandora antîkorên dermankirinê. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. û yên din. Veguhestina reseptora transferrîn (TfR) wergirtina guhertoyên afînîteyê yên antîkorên TfR ji hêla mêjî ve diyar dike. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).