Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Anda menggunakan versi peramban dengan dukungan CSS terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang diperbarui (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Selain itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Menampilkan carousel berisi tiga slide sekaligus. Gunakan tombol Sebelumnya dan Berikutnya untuk berpindah antar tiga slide sekaligus, atau gunakan tombol penggeser di bagian akhir untuk berpindah antar tiga slide sekaligus.
Sawar darah-otak mencegah agen bioterapeutik mencapai targetnya di sistem saraf pusat, sehingga menghambat pengobatan penyakit neurologis yang efektif. Untuk menemukan transporter otak baru secara in vivo, kami memperkenalkan pustaka peptida fage T7 dan secara serial mengumpulkan darah dan cairan serebrospinal (CSF) menggunakan model tikus sadar dengan kanulasi. Klon fage spesifik sangat diperkaya dalam CSF setelah empat putaran seleksi. Pengujian peptida kandidat individu mengungkapkan pengayaan lebih dari 1000 kali lipat dalam CSF. Bioaktivitas pengiriman yang dimediasi peptida ke otak dikonfirmasi oleh pengurangan 40% kadar amiloid-β dalam cairan serebrospinal menggunakan inhibitor peptida BACE1 yang dihubungkan dengan peptida transpor baru yang diidentifikasi. Hasil ini menunjukkan bahwa peptida yang diidentifikasi dengan metode seleksi fage in vivo dapat menjadi wahana yang berguna untuk pengiriman makromolekul secara sistemik ke otak dengan efek terapeutik.
Penelitian terapi yang ditargetkan pada sistem saraf pusat (SSP) sebagian besar berfokus pada identifikasi obat dan agen yang dioptimalkan yang menunjukkan sifat penargetan SSP, dengan sedikit upaya untuk menemukan mekanisme yang mendorong pengiriman obat aktif ke otak. Hal ini mulai berubah sekarang karena pengiriman obat, terutama molekul besar, merupakan bagian integral dari pengembangan obat neurosains modern. Lingkungan sistem saraf pusat terlindungi dengan baik oleh sistem sawar serebrovaskular, yang terdiri dari sawar darah-otak (BBB) ​​dan sawar darah-otak (BCSFB)1, sehingga menyulitkan pengiriman obat ke otak1,2. Diperkirakan bahwa hampir semua obat molekul besar dan lebih dari 98% obat molekul kecil dieliminasi dari otak3. Itulah mengapa sangat penting untuk mengidentifikasi sistem transportasi otak baru yang menyediakan pengiriman obat terapeutik yang efisien dan spesifik ke SSP4,5. Namun, BBB dan BCSFB juga menghadirkan peluang yang sangat baik untuk pengiriman obat karena menembus dan memasuki semua struktur otak melalui pembuluh darahnya yang luas. Dengan demikian, upaya saat ini untuk menggunakan metode pengiriman non-invasif ke otak sebagian besar didasarkan pada mekanisme transpor yang dimediasi reseptor (PMT) menggunakan reseptor BBB6 endogen. Meskipun terdapat kemajuan penting baru-baru ini menggunakan jalur reseptor transferrin7,8, pengembangan lebih lanjut dari sistem pengiriman baru dengan sifat yang lebih baik masih diperlukan. Untuk tujuan ini, tujuan kami adalah untuk mengidentifikasi peptida yang mampu memediasi transpor CSF, karena pada prinsipnya dapat digunakan untuk mengirimkan makromolekul ke SSP atau untuk membuka jalur reseptor baru. Secara khusus, reseptor dan transporter spesifik dari sistem serebrovaskular (BBB dan BSCFB) dapat berfungsi sebagai target potensial untuk pengiriman obat bioterapeutik yang aktif dan spesifik. Cairan serebrospinal (CSF) adalah produk sekresi pleksus koroid (CS) dan berada dalam kontak langsung dengan cairan interstisial otak melalui ruang subarachnoid dan ruang ventrikel4. Baru-baru ini telah ditunjukkan bahwa cairan serebrospinal subarachnoid berdifusi secara berlebihan ke dalam interstitium otak9. Kami berharap dapat mengakses ruang parenkim menggunakan jalur masuk subarachnoid ini atau langsung melalui sawar darah otak (BBB). Untuk mencapai hal ini, kami menerapkan strategi seleksi fage in vivo yang kuat yang idealnya mengidentifikasi peptida yang diangkut oleh salah satu dari dua jalur berbeda ini.
Kami sekarang menjelaskan metode penyaringan tampilan fage in vivo sekuensial dengan pengambilan sampel CSF yang digabungkan dengan pengurutan berthroughput tinggi (HTS) untuk memantau putaran seleksi awal dengan keragaman pustaka tertinggi. Penyaringan dilakukan pada tikus sadar dengan kanula cisterna besar (CM) yang ditanam secara permanen untuk menghindari kontaminasi darah. Yang penting, pendekatan ini memilih peptida yang menargetkan otak dan peptida dengan aktivitas transpor melintasi sawar serebrovaskular. Kami menggunakan fage T7 karena ukurannya yang kecil (~60 nm)10 dan menyarankan bahwa fage tersebut cocok untuk transpor vesikel yang memungkinkan penyeberangan transeluler sawar endotel dan/atau epitel-medula. Setelah empat putaran panning, populasi fage diisolasi yang menunjukkan pengayaan CSF in vivo yang kuat dan asosiasi mikrovaskular serebral. Yang penting, kami dapat mengkonfirmasi temuan kami dengan menunjukkan bahwa peptida kandidat terbaik yang disukai dan disintesis secara kimia mampu mengangkut muatan protein ke dalam cairan serebrospinal. Pertama, efek farmakodinamik pada sistem saraf pusat (SSP) ditetapkan dengan menggabungkan peptida transpor utama dengan inhibitor peptida BACE1. Selain menunjukkan bahwa strategi penyaringan fungsional in vivo dapat mengidentifikasi peptida transpor otak baru sebagai pembawa kargo protein yang efektif, kami memperkirakan pendekatan seleksi fungsional serupa juga akan menjadi penting dalam mengidentifikasi jalur transpor otak baru.
Berdasarkan unit pembentuk plak (PFU), setelah langkah pengemasan fage, sebuah pustaka peptida fage T7 linier 12-mer acak dengan keragaman sekitar 109 dirancang dan dibuat (lihat Bahan dan Metode). Penting untuk dicatat bahwa kami dengan cermat menganalisis pustaka ini sebelum penyaringan in vivo. Amplifikasi PCR sampel pustaka fage menggunakan primer yang dimodifikasi menghasilkan amplikon yang dapat langsung diterapkan pada HTS (Gambar Tambahan 1a). Karena a) kesalahan pengurutan HTS11, b) dampak pada kualitas primer (NNK)1-12, dan c) keberadaan fage tipe liar (wt) (sisipan kerangka) dalam pustaka siaga, prosedur penyaringan urutan diimplementasikan untuk mengekstrak hanya informasi urutan yang terverifikasi (Gambar Tambahan 1b). Langkah-langkah penyaringan ini berlaku untuk semua pustaka pengurutan HTS. Untuk pustaka standar, total 233.868 pembacaan diperoleh, di mana 39% lolos kriteria filter dan digunakan untuk analisis pustaka dan seleksi untuk putaran selanjutnya (Gambar Tambahan 1c–e). Pembacaan sebagian besar merupakan kelipatan 3 pasangan basa dengan panjang puncak pada 36 nukleotida (Gambar Tambahan 1c), yang mengkonfirmasi desain pustaka (NNK) 1-12. Perlu dicatat, sekitar 11% anggota pustaka mengandung sisipan tulang punggung tipe liar (wt) 12 dimensi PAGISRELVDKL, dan hampir setengah dari sekuens (49%) mengandung insersi atau delesi. HTS dari pustaka tersebut mengkonfirmasi keragaman peptida yang tinggi dalam pustaka: lebih dari 81% sekuens peptida hanya ditemukan sekali dan hanya 1,5% yang muncul dalam ≥4 salinan (Gambar Tambahan 2a). Frekuensi asam amino (aa) pada semua 12 posisi dalam repertoar berkorelasi baik dengan frekuensi yang diharapkan untuk jumlah kodon yang dihasilkan oleh repertoar NKK degeneratif (Gambar Tambahan 2b). Frekuensi residu aa yang diamati yang dikodekan oleh sisipan ini berkorelasi baik dengan frekuensi yang dihitung (r = 0,893) (Gambar Tambahan 2c). Persiapan pustaka fage untuk injeksi mencakup langkah-langkah amplifikasi dan penghapusan endotoksin. Hal ini sebelumnya telah ditunjukkan berpotensi mengurangi keragaman pustaka fage12,13. Oleh karena itu, kami mengurutkan pustaka fage yang diamplifikasi pada pelat yang telah menjalani penghapusan endotoksin dan membandingkannya dengan pustaka asli untuk memperkirakan frekuensi AA. Korelasi yang kuat (r = 0,995) diamati antara kumpulan asli dan kumpulan yang diamplifikasi dan dimurnikan (Gambar Tambahan 2d), menunjukkan bahwa persaingan antara klon yang diamplifikasi pada pelat menggunakan fage T7 tidak menyebabkan bias besar. Perbandingan ini didasarkan pada frekuensi motif tripeptida di setiap pustaka, karena keragaman pustaka (~109) tidak dapat sepenuhnya ditangkap bahkan dengan HTS. Analisis frekuensi asam amino pada setiap posisi mengungkapkan bias kecil yang bergantung pada posisi pada tiga posisi terakhir dari repertoar yang dimasukkan (Gambar Tambahan 2e). Kesimpulannya, kami menyimpulkan bahwa kualitas dan keragaman pustaka dapat diterima dan hanya perubahan kecil dalam keragaman yang diamati karena amplifikasi dan persiapan pustaka fage antara beberapa putaran seleksi.
Pengambilan sampel cairan serebrospinal secara serial dapat dilakukan dengan menanamkan kanula secara bedah ke dalam CM tikus sadar untuk memfasilitasi identifikasi fage T7 yang disuntikkan secara intravena (iv) melalui BBB dan/atau BCSFB (Gambar 1a-b). Kami menggunakan dua lengan seleksi independen (lengan A dan B) dalam tiga putaran pertama seleksi in vivo (Gambar 1c). Kami secara bertahap meningkatkan ketelitian seleksi dengan mengurangi jumlah total fage yang dimasukkan dalam tiga putaran pertama seleksi. Untuk putaran keempat penyaringan, kami menggabungkan sampel dari cabang A dan B dan melakukan tiga seleksi independen tambahan. Untuk mempelajari sifat in vivo partikel fage T7 dalam model ini, fage tipe liar (sisipan utama PAGISRELVDKL) disuntikkan ke tikus melalui vena ekor. Pemulihan fage dari cairan serebrospinal dan darah pada titik waktu yang berbeda menunjukkan bahwa fage ikosahedral T7 yang relatif kecil memiliki fase pembersihan awal yang cepat dari kompartemen darah (Gambar Tambahan 3). Berdasarkan titer yang diberikan dan volume darah tikus, kami menghitung bahwa hanya sekitar 1% berat fage dari dosis yang diberikan terdeteksi dalam darah 10 menit setelah injeksi intravena. Setelah penurunan cepat awal ini, pembersihan primer yang lebih lambat diukur dengan waktu paruh 27,7 menit. Yang penting, hanya sedikit fage yang diambil dari kompartemen CSF, menunjukkan latar belakang yang rendah untuk migrasi fage tipe liar ke dalam kompartemen CSF (Gambar Tambahan 3). Rata-rata, hanya sekitar 1 x 10-3% titer fage T7 dalam darah dan 4 x 10-8% fage yang awalnya diinfus terdeteksi dalam cairan serebrospinal selama seluruh periode pengambilan sampel (0-250 menit). Perlu dicatat, waktu paruh (25,7 menit) fage tipe liar dalam cairan serebrospinal mirip dengan yang diamati dalam darah. Data ini menunjukkan bahwa penghalang yang memisahkan kompartemen CSF dari darah tetap utuh pada tikus yang dikannulasi CM, memungkinkan seleksi pustaka fage secara in vivo untuk mengidentifikasi klon yang mudah diangkut dari darah ke kompartemen CSF.
(a) Menetapkan metode untuk pengambilan sampel ulang cairan serebrospinal (CSF) dari kumpulan besar. (b) Diagram yang menunjukkan lokasi seluler sawar sistem saraf pusat (SSP) dan strategi seleksi yang digunakan untuk mengidentifikasi peptida yang menembus sawar darah-otak (BBB). (c) Bagan alir skrining tampilan fage in vivo. Pada setiap putaran seleksi, fage (pengidentifikasi hewan di dalam panah) disuntikkan secara intravena. Dua cabang alternatif independen (A, B) disimpan secara terpisah hingga putaran seleksi ke-4. Untuk putaran seleksi ke-3 dan ke-4, setiap klon fage yang diekstrak dari CSF diurutkan secara manual. (d) Kinetika fage yang diisolasi dari darah (lingkaran merah) dan cairan serebrospinal (segitiga hijau) selama putaran seleksi pertama pada dua tikus yang dikannulasi setelah penyuntikan intravena pustaka peptida T7 (2 x 10¹² fage/hewan). Kotak biru menunjukkan konsentrasi awal rata-rata fage dalam darah, dihitung dari jumlah fage yang disuntikkan, dengan mempertimbangkan total volume darah. Kotak hitam menunjukkan titik perpotongan garis y yang diekstrapolasi dari konsentrasi fage dalam darah. (e,f) Menyajikan frekuensi relatif dan distribusi semua kemungkinan motif tripeptida yang tumpang tindih yang ditemukan dalam peptida. Jumlah motif yang ditemukan dalam 1000 pembacaan ditunjukkan. Motif yang diperkaya secara signifikan (p < 0,001) ditandai dengan titik merah. (e) Plot sebaran korelasi yang membandingkan frekuensi relatif motif tripeptida dari pustaka yang disuntikkan dengan fage yang berasal dari darah hewan #1.1 dan #1.2. (f) Plot sebaran korelasi yang membandingkan frekuensi relatif motif tripeptida fage hewan #1.1 dan #1.2 yang diisolasi dalam darah dan cairan serebrospinal. (g, h) Representasi ID urutan fage yang diperkaya dalam darah (g) dibandingkan dengan pustaka yang diinjeksikan dan fage yang diperkaya dalam CSF (h) dibandingkan dengan darah setelah satu putaran seleksi in vivo pada kedua hewan. Ukuran kode satu huruf menunjukkan seberapa sering asam amino tersebut muncul pada posisi tersebut. Hijau = polar, ungu = netral, biru = basa, merah = asam, dan hitam = asam amino hidrofobik. Gambar 1a, b dirancang dan diproduksi oleh Eduard Urich.
Kami menyuntikkan pustaka peptida fage ke dalam dua tikus instrumen CM (klade A dan B) dan mengisolasi fage dari cairan serebrospinal dan darah (Gambar 1d). Pembersihan awal pustaka yang cepat kurang terlihat dibandingkan dengan fage tipe liar. Waktu paruh rata-rata pustaka yang disuntikkan pada kedua hewan adalah 24,8 menit dalam darah, mirip dengan fage tipe liar, dan 38,5 menit dalam CSF. Sampel fage darah dan cairan serebrospinal dari masing-masing hewan dianalisis menggunakan HTS dan semua peptida yang teridentifikasi dianalisis untuk keberadaan motif tripeptida pendek. Motif tripeptida dipilih karena memberikan dasar minimal untuk pembentukan struktur dan interaksi peptida-protein14,15. Kami menemukan korelasi yang baik dalam distribusi motif antara pustaka fage yang disuntikkan dan klon yang diekstrak dari darah kedua hewan (Gambar 1e). Data menunjukkan bahwa komposisi pustaka hanya sedikit diperkaya di kompartemen darah. Frekuensi asam amino dan urutan konsensus selanjutnya dianalisis pada setiap posisi menggunakan adaptasi perangkat lunak Weblogo16. Menariknya, kami menemukan pengayaan yang kuat pada residu glisin darah (Gambar 1g). Ketika darah dibandingkan dengan klon yang dipilih dari CSF, seleksi yang kuat dan beberapa deseleksi motif diamati (Gambar 1f), dan asam amino tertentu lebih disukai hadir pada posisi yang telah ditentukan dalam 12-anggota (Gambar 1h). Perlu dicatat, masing-masing hewan berbeda secara signifikan dalam cairan serebrospinal, sedangkan pengayaan glisin darah diamati pada kedua hewan (Gambar Tambahan 4a–j). Setelah penyaringan ketat data urutan dalam cairan serebrospinal hewan #1.1 dan #1.2, total 964 dan 420 peptida 12-mer unik diperoleh (Gambar Tambahan 1d–e). Klon fage yang diisolasi diperbanyak dan dikenai putaran kedua seleksi in vivo. Fag yang diekstraksi dari putaran seleksi kedua dianalisis menggunakan HTS pada setiap hewan dan semua peptida yang teridentifikasi digunakan sebagai masukan untuk program pengenalan motif guna menganalisis kemunculan motif tripeptida (Gambar 2a, b, ef). Dibandingkan dengan siklus pertama fag yang diperoleh dari CSF, kami mengamati seleksi dan deseleksi lebih lanjut dari banyak motif dalam CSF pada cabang A dan B (Gambar 2). Algoritma identifikasi jaringan diterapkan untuk menentukan apakah motif tersebut mewakili pola urutan konsisten yang berbeda. Kesamaan yang jelas diamati antara urutan 12 dimensi yang diperoleh dari CSF pada klade alternatif A (Gambar 2c, d) dan klade B (Gambar 2g, h). Analisis gabungan di setiap cabang mengungkapkan profil seleksi yang berbeda untuk peptida 12-mer (Gambar Tambahan 5c,d) dan peningkatan rasio titer CSF/darah dari waktu ke waktu untuk klon gabungan setelah putaran seleksi kedua dibandingkan dengan putaran seleksi pertama (Gambar Tambahan 5e).
Pengayaan motif dan peptida dalam cairan serebrospinal melalui dua putaran seleksi tampilan fage fungsional in vivo secara berurutan.
Semua faga cairan serebrospinal yang diperoleh dari putaran pertama setiap hewan (hewan #1.1 dan #1.2) dikumpulkan, diamplifikasi, diurutkan dengan HT, dan disuntikkan kembali bersama-sama (2 x 10¹⁰ faga/hewan) pada 2 tikus yang dikannulasi SM (#1.1 → #2.1 dan 2.2, 1.2 → 2.3 dan 2.4). (a,b,e,f) Plot sebaran korelasi yang membandingkan frekuensi relatif motif tripeptida dari semua faga yang berasal dari CSF pada putaran seleksi pertama dan kedua. Frekuensi relatif dan distribusi motif yang mewakili semua tripeptida tumpang tindih yang mungkin ditemukan dalam peptida di kedua orientasi. Jumlah motif yang ditemukan dalam 1000 pembacaan ditunjukkan. Motif yang secara signifikan (p < 0,001) dipilih atau dikecualikan dalam salah satu pustaka yang dibandingkan ditandai dengan titik merah. (c, d, g, h) Representasi logo urutan dari semua urutan asam amino sepanjang 12 yang kaya CSF berdasarkan putaran 2 dan 1 seleksi in vivo. Ukuran kode satu huruf menunjukkan seberapa sering asam amino tersebut muncul pada posisi tersebut. Untuk merepresentasikan logo, frekuensi urutan CSF yang diekstrak dari masing-masing hewan antara dua putaran seleksi dibandingkan dan urutan yang diperkaya pada putaran kedua ditampilkan: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 dan (h) #1.2–#2.4. Asam amino yang paling diperkaya pada posisi tertentu pada (c, d) hewan no. 2.1 dan no. 2.2 atau (g, h) pada hewan no. 2.3 dan no. 2.4 ditampilkan dalam warna. Hijau = polar, ungu = netral, biru = basa, merah = asam, dan hitam = asam amino hidrofobik.
Setelah putaran seleksi ketiga, kami mengidentifikasi 124 sekuens peptida unik (#3.1 dan #3.2) dari 332 klon fage yang direkonstitusi CSF yang diisolasi dari dua hewan (Gambar Tambahan 6a). Sekuens LGSVS (18,7%) memiliki proporsi relatif tertinggi, diikuti oleh sisipan tipe liar PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%), dan SARGSWREIVSLS (2,2%). Pada putaran keempat terakhir, kami menggabungkan dua cabang yang dipilih secara independen dari tiga hewan yang berbeda (Gambar 1c). Dari 925 klon fage yang diurutkan yang diperoleh dari CSF, pada putaran keempat kami menemukan 64 sekuens peptida unik (Gambar Tambahan 6b), di antaranya proporsi relatif fage tipe liar turun menjadi 0,8%. Klon CSF yang paling umum pada putaran keempat adalah LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) dan RLSSVDSDLSGC (3,2%). Rentang panjang peptida yang dipilih disebabkan oleh insersi/delesi nukleotida atau kodon stop prematur dalam primer pustaka ketika menggunakan kodon degeneratif untuk desain pustaka NNK. Kodon stop prematur menghasilkan peptida yang lebih pendek dan dipilih karena mengandung motif asam amino yang menguntungkan. Peptida yang lebih panjang dapat dihasilkan dari insersi/delesi dalam primer pustaka sintetik. Ini menempatkan kodon stop yang dirancang di luar kerangka dan membacanya sampai kodon stop baru muncul di hilir. Secara umum, kami menghitung faktor pengayaan untuk keempat putaran seleksi dengan membandingkan data masukan dengan data keluaran sampel. Untuk putaran penyaringan pertama, kami menggunakan titer fage tipe liar sebagai referensi latar belakang non-spesifik. Menariknya, seleksi fage negatif sangat kuat pada siklus CSF pertama, tetapi tidak pada darah (Gambar 3a), yang mungkin disebabkan oleh probabilitas rendah difusi pasif sebagian besar anggota pustaka peptida ke dalam kompartemen CSF atau fage relatif cenderung lebih efisien dipertahankan atau dihilangkan dari aliran darah daripada bakteriofage. Namun, pada putaran penyaringan kedua, seleksi fage yang kuat di CSF diamati pada kedua klad, menunjukkan bahwa putaran sebelumnya diperkaya dengan fage yang menampilkan peptida yang mendorong penyerapan CSF (Gambar 3a). Sekali lagi, tanpa pengayaan darah yang signifikan. Juga pada putaran ketiga dan keempat, klon fage diperkaya secara signifikan di CSF. Membandingkan frekuensi relatif setiap urutan peptida unik antara dua putaran seleksi terakhir, kami menemukan bahwa urutan tersebut bahkan lebih diperkaya pada putaran seleksi keempat (Gambar 3b). Sebanyak 931 motif tripeptida diekstrak dari semua 64 sekuens peptida unik menggunakan kedua orientasi peptida. Motif yang paling banyak diperkaya pada putaran keempat diperiksa lebih cermat profil pengayaannya di semua putaran dibandingkan dengan pustaka yang diinjeksikan (batas: pengayaan 10%) (Gambar Tambahan 6c). Pola seleksi umum menunjukkan bahwa sebagian besar motif yang dipelajari diperkaya di semua putaran sebelumnya dari kedua cabang seleksi. Namun, beberapa motif (misalnya SGL, VSG, LGS GSV) sebagian besar berasal dari klade alternatif A, sementara yang lain (misalnya FGW, RTN, WGF, NTR) diperkaya di klade alternatif B.
Validasi transpor CSF dari peptida yang ditampilkan fage yang diperkaya CSF dan peptida pemimpin berbiotinilasi yang dikonjugasikan dengan muatan streptavidin.
(a) Rasio pengayaan yang dihitung dalam keempat putaran (R1-R4) berdasarkan titer fage (PFU) yang diinjeksikan (masukan = I) dan titer fage CSF yang ditentukan (keluaran = O). Faktor pengayaan untuk tiga putaran terakhir (R2-R4) dihitung dengan membandingkan putaran sebelumnya dan putaran pertama (R1) dengan data berat. Batang terbuka adalah cairan serebrospinal, batang berbayang adalah plasma. (***p<0,001, berdasarkan uji t Student). (b) Daftar peptida fage yang paling melimpah, diurutkan menurut proporsi relatifnya terhadap semua fage yang dikumpulkan dalam CSF setelah putaran seleksi ke-4. Enam klon fage yang paling umum disorot dengan warna, diberi nomor, dan faktor pengayaannya antara putaran seleksi ke-3 dan ke-4 (sisipan). (c,d) Enam klon fage yang paling diperkaya, fage kosong, dan pustaka peptida fage induk dari putaran ke-4 dianalisis secara individual dalam model pengambilan sampel CSF. Sampel CSF dan darah dikumpulkan pada titik waktu yang ditunjukkan. (c) Jumlah yang sama dari 6 klon fage kandidat (2 x 10¹⁰ fage/hewan), fage kosong (#1779) (2 x 10¹⁰ fage/hewan) dan pustaka peptida fage stok (2 x 10¹² fage/hewan) disuntikkan setidaknya 3 CM diberikan kepada hewan yang dikannulasi secara terpisah melalui vena ekor. Farmakokinetik CSF dari setiap klon fage dan pustaka peptida fage yang disuntikkan dari waktu ke waktu ditunjukkan. (d) menunjukkan rasio CSF/darah rata-rata untuk semua fage yang diperoleh/mL selama waktu pengambilan sampel. (e) Empat peptida pemimpin sintetik dan satu kontrol acak dihubungkan dengan biotin ke streptavidin melalui N-terminusnya (tampilan tetramer) diikuti dengan injeksi (vena ekor iv, 10 mg streptavidin/kg). Setidaknya tiga tikus yang diintubasi (N = 3). Sampel CSF dikumpulkan pada titik waktu yang ditunjukkan dan konsentrasi streptavidin diukur dengan ELISA anti-streptavidin CSF (nd = tidak terdeteksi). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, berdasarkan uji ANOVA). (f) Perbandingan urutan asam amino dari klon peptida fage #2002 (ungu) yang paling diperkaya dengan klon peptida fage terpilih lainnya dari putaran seleksi ke-4. Fragmen asam amino yang identik dan serupa diberi kode warna.
Dari semua fage yang diperkaya pada putaran keempat (Gambar 3b), enam klon kandidat dipilih untuk analisis individual lebih lanjut dalam model pengambilan sampel CSF. Jumlah yang sama dari enam fage kandidat, fage kosong (tanpa sisipan), dan pustaka peptida profage disuntikkan ke dalam tiga hewan CM yang dikannulasi, dan farmakokinetik ditentukan dalam uji CSF (Gambar 3c) dan darah (Gambar Tambahan 7). Semua klon fage yang diuji menargetkan kompartemen CSF pada tingkat 10-1000 kali lebih tinggi daripada fage kontrol kosong (#1779). Misalnya, klon #2020 dan #2077 memiliki titer CSF sekitar 1000 kali lebih tinggi daripada fage kontrol. Profil farmakokinetik setiap peptida yang dipilih berbeda, tetapi semuanya memiliki kemampuan penargetan CSF yang tinggi. Kami mengamati penurunan konstan dari waktu ke waktu untuk klon #1903 dan #2011, sedangkan untuk klon #2077, #2002, dan #2009 peningkatan selama 10 menit pertama mungkin menunjukkan transpor aktif tetapi perlu diverifikasi. Klon #2020, #2002, dan #2077 stabil pada tingkat tinggi, sementara konsentrasi CSF klon #2009 perlahan menurun setelah peningkatan awal. Kemudian kami membandingkan frekuensi relatif setiap kandidat CSF dengan konsentrasi darahnya (Gambar 3d). Korelasi titer rata-rata setiap kandidat CSF dengan titer darahnya pada semua waktu pengambilan sampel menunjukkan bahwa tiga dari enam kandidat diperkaya secara signifikan dalam CSF darah. Menariknya, klon #2077 menunjukkan stabilitas darah yang lebih tinggi (Gambar Tambahan 7). Untuk memastikan bahwa peptida itu sendiri mampu secara aktif mengangkut muatan selain partikel fage ke dalam kompartemen CSF, kami mensintesis empat peptida pemimpin yang didervatisasi dengan biotin pada N-terminus tempat peptida menempel pada partikel fage. Peptida berbiotin (no. 2002, 2009, 2020 dan 2077) dikonjugasikan dengan streptavidin (SA) untuk mendapatkan bentuk multimerik yang agak meniru geometri fage. Format ini juga memungkinkan kami untuk mengukur paparan SA dalam darah dan cairan serebrospinal sebagai peptida protein pengangkut muatan. Yang penting, data fage seringkali dapat direproduksi ketika peptida sintetik diberikan dalam format terkonjugasi SA ini (Gambar 3e). Peptida acak memiliki paparan awal yang lebih rendah dan pembersihan CSF yang lebih cepat dengan kadar yang tidak terdeteksi dalam waktu 48 jam. Untuk mendapatkan wawasan tentang jalur pengiriman klon fage peptida ini ke ruang CSF, kami menganalisis lokalisasi masing-masing peptida fage yang terdeteksi menggunakan imunohistokimia (IHC) untuk mendeteksi partikel fage secara langsung 1 jam setelah injeksi intravena in vivo. Perlu dicatat, klon #2002, #2077, dan #2009 dapat dideteksi dengan pewarnaan yang kuat di kapiler otak, sementara fage kontrol (#1779) dan klon #2020 tidak terdeteksi (Gambar Tambahan 8). Ini menunjukkan bahwa peptida-peptida ini berkontribusi pada efek di otak justru dengan menembus sawar darah otak (BBB). Analisis lebih rinci diperlukan untuk menguji hipotesis ini, karena jalur BSCFB mungkin juga terlibat. Ketika membandingkan urutan asam amino dari klon yang paling banyak ditemukan (#2002) dengan peptida terpilih lainnya, dicatat bahwa beberapa di antaranya memiliki ekstensi asam amino yang serupa, yang mungkin menunjukkan mekanisme transportasi yang serupa (Gambar 3f).
Karena profil plasmanya yang unik dan peningkatan CSF yang signifikan dari waktu ke waktu, klon tampilan fage #2077 dieksplorasi lebih lanjut selama periode 48 jam yang lebih lama dan mampu mereproduksi peningkatan CSF yang cepat yang diamati terkait dengan kadar SA yang berkelanjutan (Gambar 4a). Mengenai klon fage lain yang diidentifikasi, #2077 menunjukkan pewarnaan yang kuat untuk kapiler otak dan menunjukkan kolokalisasi yang signifikan dengan lektin penanda kapiler ketika dilihat pada resolusi yang lebih tinggi dan mungkin beberapa pewarnaan di ruang parenkim (Gambar 4b). Untuk menyelidiki apakah efek farmakologis yang dimediasi peptida dapat diperoleh di SSP, kami melakukan percobaan di mana versi biotinilasi dari i) peptida transpor #2077 dan ii) peptida penghambat BACE1 dicampur dengan SA pada dua rasio yang berbeda. Untuk satu kombinasi, kami hanya menggunakan peptida penghambat BACE1 dan untuk yang lain, kami menggunakan rasio 1:3 antara peptida penghambat BACE1 dan peptida #2077. Kedua sampel diberikan secara intravena dan kadar peptida beta-amiloid 40 (Abeta40) dalam darah dan cairan serebrospinal diukur dari waktu ke waktu. Abeta40 diukur dalam CSF karena mencerminkan penghambatan BACE1 di parenkim otak. Seperti yang diharapkan, kedua kompleks secara signifikan mengurangi kadar Abeta40 dalam darah (Gambar 4c, d). Namun, hanya sampel yang mengandung campuran peptida no. 2077 dan inhibitor peptida BACE1 yang dikonjugasikan dengan SA yang menyebabkan penurunan Abeta40 yang signifikan dalam cairan serebrospinal (Gambar 4c). Data menunjukkan bahwa peptida no. 2077 mampu mengangkut protein SA 60 kDa ke dalam SSP dan juga menginduksi efek farmakologis dengan inhibitor peptida BACE1 yang dikonjugasikan dengan SA.
(a) Injeksi klonal (2 × 10 fage/hewan) fage T7 menunjukkan profil farmakokinetik jangka panjang peptida CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) dan fage kontrol yang tidak diinjeksi (#1779) pada setidaknya tiga tikus yang diintubasi CM. (b) Gambar mikroskopik konfokal dari pembuluh mikro kortikal representatif pada tikus yang diinjeksi fage (2 × 10 fage/hewan) menunjukkan pewarnaan kontras peptida #2077 dan pembuluh darah (lektin). Klon fage ini diberikan kepada 3 tikus dan dibiarkan bersirkulasi selama 1 jam sebelum perfusi. Otak dipotong dan diwarnai dengan antibodi poliklonal berlabel FITC terhadap kapsid fage T7. Sepuluh menit sebelum perfusi dan fiksasi selanjutnya, lektin berlabel DyLight594 diberikan secara intravena. Gambar fluoresen menunjukkan pewarnaan lektin (merah) pada sisi luminal pembuluh mikro dan fag (hijau) di lumen kapiler dan jaringan otak perivaskular. Skala bar sesuai dengan 10 µm. (c, d) Peptida penghambat BACE1 berbiotinilasi sendiri atau dalam kombinasi dengan peptida transpor berbiotinilasi #2077 dihubungkan ke streptavidin diikuti dengan injeksi intravena setidaknya tiga tikus CM yang dikannulasi (10 mg streptavidin/kg). Pengurangan Aβ40 yang dimediasi oleh penghambat peptida BACE1 diukur dengan ELISA Aβ1-40 dalam darah (merah) dan cairan serebrospinal (oranye) pada titik waktu yang ditunjukkan. Untuk kejelasan yang lebih baik, garis putus-putus digambar pada grafik dengan skala 100%. (c) Persentase penurunan Aβ40 dalam darah (segitiga merah) dan cairan serebrospinal (segitiga oranye) pada tikus yang diobati dengan streptavidin yang dikonjugasikan dengan peptida transpor #2077 dan peptida penghambat BACE1 dengan rasio 3:1. (d) Persentase penurunan Aβ40 dalam darah (lingkaran merah) dan cairan serebrospinal (lingkaran oranye) pada tikus yang diobati dengan streptavidin yang dikonjugasikan hanya dengan peptida penghambat BACE1. Konsentrasi Aβ pada kontrol adalah 420 pg/ml (deviasi standar = 101 pg/ml).
Phage display telah berhasil diterapkan di beberapa bidang penelitian biomedis17. Metode ini telah digunakan untuk studi keragaman vaskular in vivo18,19 serta studi yang menargetkan pembuluh darah otak20,21,22,23,24,25,26. Dalam studi ini, kami memperluas penerapan metode seleksi ini tidak hanya untuk identifikasi langsung peptida yang menargetkan pembuluh darah otak, tetapi juga untuk penemuan kandidat dengan sifat transpor aktif untuk menembus sawar darah-otak. Kami sekarang menjelaskan pengembangan prosedur seleksi in vivo pada tikus yang diintubasi CM dan menunjukkan potensinya untuk mengidentifikasi peptida dengan sifat homing CSF. Dengan menggunakan fage T7 yang menampilkan pustaka peptida acak 12-mer, kami dapat menunjukkan bahwa fage T7 cukup kecil (sekitar 60 nm diameternya)10 untuk beradaptasi dengan sawar darah-otak, sehingga secara langsung menembus sawar darah-otak atau pleksus koroid. Kami mengamati bahwa pengambilan CSF dari tikus CM yang dikannulasi merupakan metode skrining fungsional in vivo yang terkontrol dengan baik, dan bahwa fage yang diekstrak tidak hanya berikatan dengan pembuluh darah tetapi juga berfungsi sebagai transporter melintasi sawar darah-otak. Lebih lanjut, dengan mengumpulkan darah secara bersamaan dan menerapkan HTS pada fage yang berasal dari CSF dan darah, kami memastikan bahwa pilihan CSF kami tidak dipengaruhi oleh pengayaan darah atau kebugaran untuk ekspansi antar putaran seleksi. Namun, kompartemen darah merupakan bagian dari prosedur seleksi, karena fage yang mampu mencapai kompartemen CSF harus bertahan hidup dan bersirkulasi dalam aliran darah cukup lama untuk memperkaya diri di otak. Untuk mengekstrak informasi urutan yang andal dari data HTS mentah, kami menerapkan filter yang disesuaikan dengan kesalahan pengurutan spesifik platform dalam alur kerja analisis. Dengan menggabungkan parameter kinetik ke dalam metode penyaringan, kami mengkonfirmasi farmakokinetik cepat dari fage T7 tipe liar (t½ ~ 28 menit) dalam darah24, 27, 28 dan juga menentukan waktu paruhnya dalam cairan serebrospinal (t½ ~ 26 menit per menit). Meskipun profil farmakokinetik serupa dalam darah dan CSF, hanya 0,001% dari konsentrasi fage dalam darah yang dapat dideteksi dalam CSF, menunjukkan mobilitas latar belakang yang rendah dari fage T7 tipe liar melintasi sawar darah-otak. Penelitian ini menyoroti pentingnya putaran seleksi pertama ketika menggunakan strategi panning in vivo, terutama untuk sistem fage yang cepat dibersihkan dari sirkulasi, karena hanya sedikit klon yang mampu mencapai kompartemen SSP. Dengan demikian, pada putaran pertama, pengurangan keragaman pustaka sangat besar, karena hanya sejumlah klon terbatas yang akhirnya dikumpulkan dalam model CSF yang sangat ketat ini. Strategi penyaringan in vivo ini mencakup beberapa langkah seleksi seperti akumulasi aktif di kompartemen CSF, kelangsungan hidup klon di kompartemen darah, dan penghapusan cepat klon fage T7 dari darah dalam 10 menit pertama (Gambar 1d dan Gambar Tambahan 4M). Dengan demikian, setelah putaran pertama, klon fage yang berbeda diidentifikasi di CSF, meskipun kumpulan awal yang sama digunakan untuk masing-masing hewan. Hal ini menunjukkan bahwa beberapa langkah seleksi ketat untuk pustaka sumber dengan jumlah anggota pustaka yang besar menghasilkan pengurangan keragaman yang signifikan. Oleh karena itu, kejadian acak akan menjadi bagian integral dari proses seleksi awal, yang sangat memengaruhi hasilnya. Kemungkinan besar banyak klon dalam pustaka asli memiliki kecenderungan pengayaan CSF yang sangat mirip. Namun, bahkan dalam kondisi eksperimental yang sama, hasil seleksi dapat berbeda karena jumlah masing-masing klon tertentu yang kecil dalam kumpulan awal.
Motif yang diperkaya dalam CSF berbeda dari yang ada dalam darah. Menariknya, kami mencatat pergeseran pertama menuju peptida kaya glisin dalam darah masing-masing hewan. (Gambar 1g, Gambar Tambahan 4e, 4f). Fag yang mengandung peptida glisin mungkin lebih stabil dan kecil kemungkinannya untuk dikeluarkan dari sirkulasi. Namun, peptida kaya glisin ini tidak terdeteksi dalam sampel cairan serebrospinal, menunjukkan bahwa pustaka yang dikurasi telah melalui dua langkah seleksi yang berbeda: satu dalam darah dan yang lainnya dibiarkan terakumulasi dalam cairan serebrospinal. Klon yang diperkaya CSF yang dihasilkan dari putaran seleksi keempat telah diuji secara ekstensif. Hampir semua klon yang diuji secara individual dikonfirmasi diperkaya dalam CSF dibandingkan dengan fag kontrol kosong. Satu peptida yang ditemukan (#2077) diperiksa lebih detail. Peptida ini menunjukkan waktu paruh plasma yang lebih lama dibandingkan dengan peptida lain (Gambar 3d dan Gambar Tambahan 7), dan yang menarik, peptida ini mengandung residu sistein di ujung C. Baru-baru ini telah ditunjukkan bahwa penambahan sistein pada peptida dapat meningkatkan sifat farmakokinetiknya dengan mengikat albumin 29. Hal ini saat ini belum diketahui untuk peptida #2077 dan memerlukan penelitian lebih lanjut. Beberapa peptida menunjukkan ketergantungan valensi dalam pengayaan CSF (data tidak ditampilkan), yang mungkin terkait dengan geometri permukaan kapsid T7 yang ditampilkan. Sistem T7 yang kami gunakan menunjukkan 5-15 salinan setiap peptida per partikel fage. IHC dilakukan pada klon fage kandidat utama yang disuntikkan secara intravena ke korteks serebral tikus (Gambar Tambahan 8). Data menunjukkan bahwa setidaknya tiga klon (No. 2002, No. 2009 dan No. 2077) berinteraksi dengan sawar darah otak (BBB). Masih perlu ditentukan apakah interaksi BBB ini menghasilkan akumulasi CSF atau pergerakan klon-klon ini langsung ke BCSFB. Yang penting, kami menunjukkan bahwa peptida yang dipilih mempertahankan kapasitas transportasi CSF-nya ketika disintesis dan diikat ke protein kargo. Pengikatan peptida biotinilasi N-terminal ke SA pada dasarnya mengulangi hasil yang diperoleh dengan klon fage masing-masing dalam darah dan cairan serebrospinal (Gambar 3e). Terakhir, kami menunjukkan bahwa peptida utama #2077 mampu meningkatkan aksi otak dari inhibitor peptida biotinilasi BACE1 yang dikonjugasikan ke SA, menyebabkan efek farmakodinamik yang nyata di SSP dengan secara signifikan mengurangi kadar Abeta40 dalam CSF (Gambar 4). Kami tidak dapat mengidentifikasi homolog apa pun dalam basis data dengan melakukan pencarian homologi urutan peptida dari semua hasil yang ditemukan. Penting untuk dicatat bahwa ukuran pustaka T7 kira-kira 10⁹, sedangkan ukuran pustaka teoritis untuk 12-mer adalah 4 x 10¹⁵. Oleh karena itu, kami hanya memilih sebagian kecil dari ruang keragaman pustaka peptida 12-mer, yang mungkin berarti bahwa lebih banyak peptida yang dioptimalkan dapat diidentifikasi dengan mengevaluasi ruang urutan yang berdekatan dari peptida yang teridentifikasi ini. Secara hipotetis, salah satu alasan mengapa kami belum menemukan homolog alami dari peptida ini mungkin karena seleksi negatif selama evolusi untuk mencegah masuknya motif peptida tertentu ke dalam otak secara tidak terkontrol.
Secara keseluruhan, hasil kami memberikan dasar untuk pekerjaan di masa mendatang guna mengidentifikasi dan mengkarakterisasi sistem transpor sawar serebrovaskular secara in vivo dengan lebih detail. Pengaturan dasar metode ini didasarkan pada strategi seleksi fungsional yang tidak hanya mengidentifikasi klon dengan sifat pengikatan pembuluh darah otak, tetapi juga mencakup langkah penting di mana klon yang berhasil memiliki aktivitas intrinsik untuk melintasi sawar biologis secara in vivo ke dalam kompartemen SSP. Tujuannya adalah untuk menjelaskan mekanisme transpor peptida ini dan preferensi pengikatan mereka ke mikrovaskulatur spesifik untuk wilayah otak. Hal ini dapat mengarah pada penemuan jalur baru untuk transpor sawar darah otak (BBB) ​​dan reseptor. Kami memperkirakan bahwa peptida yang diidentifikasi dapat langsung berikatan dengan reseptor serebrovaskular atau ligan yang bersirkulasi yang diangkut melalui BBB atau sawar cairan serebrospinal (BCSFB). Vektor peptida dengan aktivitas transpor cairan serebrospinal (CSF) yang ditemukan dalam penelitian ini akan diselidiki lebih lanjut. Saat ini kami sedang menyelidiki spesifisitas otak dari peptida ini untuk kemampuannya melintasi BBB dan/atau BCSFB. Peptida-peptida baru ini akan menjadi alat yang sangat berharga untuk potensi penemuan reseptor atau jalur baru dan untuk pengembangan platform baru yang sangat efisien untuk pengiriman makromolekul, seperti biologis, ke otak.
Kanulasi sisterna besar (CM) dilakukan dengan modifikasi metode yang telah dijelaskan sebelumnya. Tikus Wistar yang dibius (200-350 g) dipasang pada alat stereotaksik dan sayatan median dibuat di atas kulit kepala yang telah dicukur dan disiapkan secara aseptik untuk mengekspos tengkorak. Bor dua lubang di area lipatan atas dan kencangkan sekrup pengikat di lubang tersebut. Lubang tambahan dibor di puncak oksipital lateral untuk panduan stereotaktik kanula baja tahan karat ke dalam CM. Oleskan semen gigi di sekitar kanula dan kencangkan dengan sekrup. Setelah pengerasan dengan cahaya dan pengerasan semen, luka kulit ditutup dengan jahitan supramid 4/0. Penempatan kanula yang tepat dikonfirmasi oleh kebocoran cairan serebrospinal (CSF) secara spontan. Lepaskan tikus dari alat stereotaksik, berikan perawatan pasca operasi dan manajemen nyeri yang sesuai, dan biarkan pulih setidaknya selama satu minggu sampai tanda-tanda darah terlihat di cairan serebrospinal. Tikus Wistar (Crl:WI/Han) diperoleh dari Charles River (Prancis). Semua tikus dipelihara dalam kondisi bebas patogen spesifik. Semua percobaan pada hewan disetujui oleh Kantor Hewan Kota Basel, Swiss, dan dilakukan sesuai dengan Lisensi Hewan No. 2474 (Penilaian Transportasi Otak Aktif dengan Mengukur Tingkat Kandidat Terapi dalam Cairan Serebrospinal dan Otak Tikus).
Dengan lembut, jaga agar tikus tetap sadar dengan kanula CM di tangan. Lepaskan Datura dari kanula dan kumpulkan 10 µl cairan serebrospinal yang mengalir secara spontan. Karena kelancaran kanula pada akhirnya terganggu, hanya sampel cairan serebrospinal yang jernih tanpa bukti kontaminasi darah atau perubahan warna yang disertakan dalam penelitian ini. Secara paralel, sekitar 10–20 μl darah diambil dari sayatan kecil di ujung ekor ke dalam tabung berisi heparin (Sigma-Aldrich). CSF dan darah dikumpulkan pada berbagai titik waktu setelah injeksi intravena fage T7. Sekitar 5–10 μl cairan dibuang sebelum setiap sampel CSF dikumpulkan, yang sesuai dengan volume mati kateter.
Pustaka dihasilkan menggunakan vektor T7Select 10-3b seperti yang dijelaskan dalam manual sistem T7Select (Novagen, Rosenberg dkk., InNovations 6, 1-6, 1996). Singkatnya, sisipan DNA 12-mer acak disintesis dalam format berikut:
Kodon NNK digunakan untuk menghindari kodon stop ganda dan ekspresi berlebih asam amino dalam sisipan. N adalah rasio ekimolar campuran manual dari setiap nukleotida, dan K adalah rasio ekimolar campuran manual dari nukleotida adenin dan sitosin. Daerah untai tunggal diubah menjadi DNA untai ganda dengan inkubasi lebih lanjut dengan dNTP (Novagen) dan enzim Klenow (New England Biolabs) dalam buffer Klenow (New England Biolabs) selama 3 jam pada suhu 37°C. Setelah reaksi, DNA untai ganda dipulihkan dengan pengendapan EtOH. DNA yang dihasilkan dicerna dengan enzim restriksi EcoRI dan HindIII (keduanya dari Roche). Sisipan yang telah dipotong dan dimurnikan (QIAquick, Qiagen) (ligase T4, New England Biolabs) kemudian diligasi secara berurutan ke dalam vektor T7 yang telah dipotong sebelumnya setelah asam amino 348 dari gen kapsid 10B. Reaksi ligasi diinkubasi pada suhu 16°C selama 18 jam sebelum pengemasan in vitro. Pengemasan fage in vitro dilakukan sesuai dengan instruksi yang disertakan dalam kit kloning T7Select 10-3b (Novagen) dan larutan pengemasan diperbanyak sekali hingga lisis menggunakan Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lisat disentrifugasi, dititrasi, dan dibekukan pada suhu -80°C sebagai larutan stok gliserol.
Amplifikasi PCR langsung dari daerah variabel fage yang diamplifikasi dalam kaldu atau pelat menggunakan primer fusi 454/Roche-amplikon milik perusahaan. Primer fusi maju mengandung sekuens yang mengapit daerah variabel (NNK) 12 (spesifik templat), GS FLX Titanium Adapter A, dan sekuens kunci pustaka empat basa (TCAG) (Gambar Tambahan 1a):
Primer fusi balik juga mengandung biotin yang terikat pada manik-manik penangkap dan Adaptor Titanium GS FLX B yang diperlukan untuk amplifikasi klonal selama PCR emulsi:
Amplikon kemudian dianalisis menggunakan pirosekuensing 454/Roche sesuai dengan protokol 454 GS-FLX Titanium. Untuk sekuensing Sanger manual (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNA fage T7 diamplifikasi dengan PCR dan diurutkan menggunakan pasangan primer berikut:
Fragmen DNA dari masing-masing plak dianalisis menggunakan PCR dengan Kit DNA Polimerase Roche Fast Start (sesuai petunjuk pabrik). Lakukan pemanasan awal (10 menit pada 95 °C) dan 35 siklus penguatan (50 detik pada 95 °C, 1 menit pada 50 °C, dan 1 menit pada 72 °C).
Fag dari pustaka, fag tipe liar, fag yang diselamatkan dari cairan serebrospinal (CSF) dan darah, atau klon individu diperbanyak dalam Escherichia coli BL5615 dalam kaldu TB (Sigma Aldrich) atau dalam cawan petri 500 cm2 (Thermo Scientific) selama 4 jam pada suhu 37°C. Fag diekstraksi dari cawan petri dengan membilas cawan petri dengan buffer Tris-EDTA (Fluka Analytical) atau dengan mengumpulkan plak menggunakan ujung pipet steril. Fag diisolasi dari supernatan kultur atau buffer ekstraksi dengan satu putaran presipitasi polietilen glikol (PEG 8000) (Promega) dan disuspensikan kembali dalam buffer Tris-EDTA.
Fag yang telah diamplifikasi kemudian menjalani 2-3 putaran penghilangan endotoksin menggunakan manik-manik penghilang endotoksin (Miltenyi Biotec) sebelum disuntikkan secara intravena (IV) (500 μl/hewan). Pada putaran pertama, 2×10¹² fag dimasukkan; pada putaran kedua, 2×10¹⁰ fag; pada putaran seleksi ketiga dan keempat, 2×10⁹ fag per hewan. Kandungan fag dalam sampel cairan serebrospinal (CSF) dan darah yang dikumpulkan pada titik waktu yang ditentukan ditentukan dengan penghitungan plak sesuai dengan instruksi pabrikan (manual sistem T7Select). Seleksi fag dilakukan dengan penyuntikan intravena pustaka yang telah dimurnikan ke dalam vena ekor atau dengan penyuntikan ulang fag yang diekstrak dari CSF dari putaran seleksi sebelumnya, dan panen selanjutnya dilakukan pada menit ke-10, 30, 60, 90, 120, 180, dan 240 masing-masing untuk sampel CSF dan darah. Sebanyak empat putaran penyaringan in vivo dilakukan di mana dua cabang terpilih disimpan dan dianalisis secara terpisah selama tiga putaran seleksi pertama. Semua sisipan fage yang diekstrak dari CSF dari dua putaran seleksi pertama dianalisis dengan pirosekuensing 454/Roche, sedangkan semua klon yang diekstrak dari CSF dari dua putaran seleksi terakhir diurutkan secara manual. Semua fage darah dari putaran seleksi pertama juga dianalisis dengan pirosekuensing 454/Roche. Untuk injeksi klon fage, fage terpilih diperbanyak dalam E. coli (BL5615) pada cawan petri 500 cm2 pada suhu 37°C selama 4 jam. Klon yang dipilih secara individual dan diurutkan secara manual dikembangbiakkan dalam medium TB. Setelah ekstraksi fage, pemurnian, dan penghilangan endotoksin (seperti yang dijelaskan di atas), 2×10¹⁰ fage/hewan dalam 300 μl disuntikkan secara intravena ke salah satu vena ekor.
Praproses dan penyaringan kualitatif data sekuens. Data mentah 454/Roche dikonversi dari format peta aliran standar biner (sff) ke format yang dapat dibaca manusia Pearson (fasta) menggunakan perangkat lunak vendor. Pemrosesan lebih lanjut dari sekuens nukleotida dilakukan menggunakan program dan skrip C milik perusahaan (paket perangkat lunak yang belum dirilis) seperti yang dijelaskan di bawah ini. Analisis data primer mencakup prosedur penyaringan multi-tahap yang ketat. Untuk menyaring bacaan yang tidak mengandung sekuens DNA sisipan 12mer yang valid, bacaan tersebut diselaraskan secara berurutan ke label awal (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), label akhir (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) dan sisipan latar belakang (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) menggunakan uji Needleman-Wunsch global. Penyelarasan ini memungkinkan hingga 2 inkonsistensi per penyelarasan31. Oleh karena itu, bacaan tanpa tag awal dan akhir serta bacaan yang mengandung sisipan latar belakang, yaitu, penyelarasan yang melebihi jumlah ketidakcocokan yang diizinkan, dihapus dari pustaka. Adapun sisa bacaan, sekuens DNA N-mer yang membentang dari tanda awal dan berakhir sebelum tanda berhenti dipotong dari sekuens bacaan asli dan diproses lebih lanjut (selanjutnya disebut sebagai "sisipan"). Setelah translasi sisipan, bagian setelah kodon berhenti pertama di ujung 5′ primer dihilangkan dari sisipan. Selain itu, nukleotida yang menyebabkan kodon tidak lengkap di ujung 3′ primer juga dihilangkan. Untuk mengecualikan sisipan yang hanya berisi sekuens latar belakang, sisipan yang ditranslasikan yang dimulai dengan pola asam amino "PAG" juga dihilangkan. Peptida dengan panjang pasca-translasi kurang dari 3 asam amino dihilangkan dari pustaka. Terakhir, redundansi dalam kumpulan sisipan dihilangkan dan frekuensi setiap sisipan unik ditentukan. Hasil analisis ini mencakup daftar sekuens nukleotida (sisipan) dan frekuensinya (bacaan) (Gambar Tambahan 1c dan 2).
Pengelompokan sisipan DNA N-mer berdasarkan kemiripan sekuens: Untuk menghilangkan kesalahan pengurutan spesifik 454/Roche (seperti masalah dengan pengurutan ekstensi homopolimer) dan menghilangkan redundansi yang kurang penting, sisipan sekuens DNA N-mer yang telah difilter sebelumnya (sisipan) diurutkan berdasarkan kemiripan. Sisipan (hingga 2 basa yang tidak cocok diperbolehkan) diurutkan menggunakan algoritma iteratif yang didefinisikan sebagai berikut: sisipan diurutkan terlebih dahulu berdasarkan frekuensinya (tertinggi ke terendah), dan jika sama, diurutkan lagi berdasarkan panjangnya (terpanjang ke terpendek). Dengan demikian, sisipan yang paling sering dan terpanjang mendefinisikan "grup" pertama. Frekuensi grup ditetapkan ke frekuensi kunci. Kemudian, setiap sisipan yang tersisa dalam daftar yang diurutkan dicoba untuk ditambahkan ke grup dengan penyelarasan Needleman-Wunsch berpasangan. Jika jumlah ketidakcocokan, sisipan, atau penghapusan dalam penyelarasan tidak melebihi ambang batas 2, sisipan ditambahkan ke grup, dan frekuensi grup keseluruhan ditingkatkan sesuai dengan seberapa sering sisipan tersebut ditambahkan. Sisipan yang ditambahkan ke suatu grup ditandai sebagai telah digunakan dan dikecualikan dari pemrosesan lebih lanjut. Jika urutan sisipan tidak dapat ditambahkan ke grup yang sudah ada, urutan sisipan tersebut digunakan untuk membuat grup baru dengan frekuensi sisipan yang sesuai dan ditandai sebagai telah digunakan. Iterasi berakhir ketika setiap urutan sisipan telah digunakan untuk membentuk grup baru atau dapat dimasukkan ke dalam grup yang sudah ada. Pada akhirnya, sisipan yang dikelompokkan yang terdiri dari nukleotida diterjemahkan menjadi urutan peptida (perpustakaan peptida). Hasil analisis ini adalah serangkaian sisipan dan frekuensinya yang membentuk jumlah pembacaan berurutan (Gambar Tambahan 2).
Pembuatan Motif: Berdasarkan daftar peptida unik, sebuah pustaka dibuat yang berisi semua pola asam amino (aa) yang mungkin seperti yang ditunjukkan di bawah ini. Setiap pola yang mungkin dengan panjang 3 diekstrak dari peptida dan pola inversnya ditambahkan bersama dengan pustaka motif umum yang berisi semua pola (tripeptida). Pustaka motif yang sangat berulang diurutkan dan redundansi dihilangkan. Kemudian, untuk setiap tripeptida dalam pustaka motif, kami memeriksa keberadaannya dalam pustaka menggunakan alat komputasi. Dalam hal ini, frekuensi peptida yang mengandung tripeptida motif yang ditemukan ditambahkan dan ditetapkan ke motif dalam pustaka motif ("jumlah motif"). Hasil pembuatan motif adalah array dua dimensi yang berisi semua kejadian tripeptida (motif) dan nilai masing-masing, yaitu jumlah pembacaan sekuensing yang menghasilkan motif yang sesuai ketika pembacaan difilter, dikelompokkan, dan diterjemahkan. Metrik seperti yang dijelaskan secara rinci di atas.
Normalisasi jumlah motif dan scatterplot yang terkait: Jumlah motif untuk setiap sampel dinormalisasi menggunakan
di mana ni adalah jumlah bacaan yang mengandung topik i. Dengan demikian, vi mewakili persentase frekuensi bacaan (atau peptida) yang mengandung motif i dalam sampel. Nilai P untuk jumlah motif yang tidak dinormalisasi dihitung menggunakan uji eksak Fisher. Mengenai korelogram jumlah motif, korelasi Spearman dihitung menggunakan jumlah motif yang dinormalisasi dengan R.
Untuk memvisualisasikan kandungan asam amino pada setiap posisi dalam pustaka peptida, logogram web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) dibuat. Pertama, kandungan asam amino pada setiap posisi peptida 12-mer disimpan dalam matriks 20×12. Kemudian, satu set 1000 peptida yang mengandung kandungan asam amino relatif yang sama pada setiap posisi dihasilkan dalam format fasta-sequence dan diberikan sebagai input ke web-logo 3, yang menghasilkan representasi grafis dari kandungan asam amino relatif pada setiap posisi untuk pustaka peptida tertentu. Untuk memvisualisasikan dataset multidimensi, peta panas dibuat menggunakan alat yang dikembangkan secara internal di R (biosHeatmap, paket R yang belum dirilis). Dendrogram yang disajikan dalam peta panas dihitung menggunakan metode pengelompokan hierarkis Ward dengan metrik jarak Euclidean. Untuk analisis statistik data penilaian motif, nilai P untuk penilaian yang tidak dinormalisasi dihitung menggunakan uji eksak Fisher. Nilai P untuk dataset lainnya dihitung di R menggunakan uji t Student atau ANOVA.
Klon fage terpilih dan fage tanpa sisipan disuntikkan secara intravena melalui vena ekor (2×10¹⁰ fage/hewan dalam 300 μl PBS). Sepuluh menit sebelum perfusi dan fiksasi selanjutnya, hewan yang sama disuntikkan secara intravena dengan 100 μl lektin berlabel DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 menit setelah penyuntikan fage, tikus diperfusi melalui jantung dengan 50 ml PBS diikuti oleh 50 ml 4% PFA/PBS. Sampel otak juga difiksasi semalaman dalam 4% PFA/PBS dan direndam dalam 30% sukrosa semalaman pada suhu 4°C. Sampel dibekukan secara cepat dalam campuran OCT. Analisis imunohistokimia sampel beku dilakukan pada suhu ruang pada sayatan krioseksi 30 µm yang diblokir dengan 1% BSA dan diinkubasi dengan antibodi poliklonal berlabel FITC terhadap fage T7 (Novus NB 600-376A) pada suhu 4 °C. Inkubasi semalaman. Terakhir, sayatan dicuci 3 kali dengan PBS dan diperiksa dengan mikroskop laser konfokal (Leica TCS SP5).
Semua peptida dengan kemurnian minimal 98% disintesis oleh GenScript USA, dibiotinilasi, dan diliofilisasi. Biotin diikat melalui spacer glisin rangkap tiga tambahan di ujung N. Periksa semua peptida menggunakan spektrometri massa.
Streptavidin (Sigma S0677) dicampur dengan kelebihan peptida berbiotinilasi 5 kali lipat secara ekuimolar, peptida penghambat BACE1 berbiotinilasi, atau kombinasi (rasio 3:1) peptida penghambat BACE1 berbiotinilasi dan peptida penghambat BACE1 dalam DMSO 5–10%/diinkubasi dalam PBS selama 1 jam pada suhu kamar sebelum injeksi. Peptida yang dikonjugasikan dengan streptavidin diinjeksikan secara intravena dengan dosis 10 mg/kg ke salah satu vena ekor tikus dengan rongga serebral.
Konsentrasi kompleks streptavidin-peptida dinilai dengan ELISA. Pelat mikrotiter Nunc Maxisorp (Sigma) dilapisi semalaman pada suhu 4°C dengan antibodi anti-streptavidin tikus 1,5 μg/ml (Thermo, MA1-20011). Setelah pemblokiran (buffer pemblokiran: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatin, 1% BSA) pada suhu kamar selama 2 jam, cuci pelat dengan 0,05% Tween-20/PBS (buffer pencuci) selama 3 detik, sampel CSF dan plasma ditambahkan ke sumur yang diencerkan dengan buffer pemblokiran (plasma 1:10.000, CSF 1:115). Kemudian, pelat diinkubasi semalaman pada suhu 4°C dengan antibodi pendeteksi (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Setelah tiga kali pencucian, streptavidin dideteksi dengan inkubasi dalam larutan substrat TMB (Roche) hingga 20 menit. Setelah menghentikan perkembangan warna dengan 1M H2SO4, ukur absorbansi pada 450 nm.
Fungsi kompleks streptavidin-peptida-inhibitor BACE1 dinilai dengan ELISA Aβ(1-40) sesuai dengan protokol pabrikan (Wako, 294-64701). Secara singkat, sampel CSF diencerkan dalam pengencer standar (1:23) dan diinkubasi semalaman pada suhu 4°C dalam pelat 96 sumur yang dilapisi dengan antibodi penangkap BNT77. Setelah lima langkah pencucian, antibodi BA27 terkonjugasi HRP ditambahkan dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu 4°C, diikuti dengan lima langkah pencucian. Aβ(1–40) dideteksi dengan inkubasi dalam larutan TMB selama 30 menit pada suhu kamar. Setelah perkembangan warna dihentikan dengan larutan penghenti, ukur absorbansi pada 450 nm. Sampel plasma diekstraksi fase padat sebelum ELISA Aβ(1–40). Plasma ditambahkan ke dalam 0,2% DEA (Sigma) dalam pelat 96 sumur dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Setelah pelat SPE (Oasis, 186000679) dicuci berturut-turut dengan air dan metanol 100%, sampel plasma ditambahkan ke pelat SPE dan semua cairan dihilangkan. Sampel dicuci (pertama dengan metanol 5% kemudian metanol 30%) dan dielusi dengan NH4OH 2%/metanol 90%. Setelah mengeringkan eluat pada suhu 55°C selama 99 menit dengan arus N2 konstan, sampel direduksi dalam pengencer standar dan Aβ(1–40) diukur seperti yang dijelaskan di atas.
Cara mengutip artikel ini: Urich, E. dkk. Pengiriman kargo ke otak menggunakan peptida transit yang diidentifikasi secara in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB dan Moos T. Pengiriman obat makromolekuler ke otak menggunakan terapi target. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., dan Martinez-Martinez, P. Pengiriman obat peptida dan protein melintasi sawar darah-otak. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM. Sawar darah-otak: hambatan dalam pengembangan obat otak. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, dan Byrd, A. Prospek untuk peningkatan pengiriman dan penargetan obat ke otak melalui jalur pleksus koroid-CSF. Penelitian Farmasi 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisasi biofarmasi dengan kuda Troya molekuler untuk pengiriman ke otak. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, Transport peptida yang dimediasi reseptor WM melintasi sawar darah-otak. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. dkk. Meningkatkan penetrasi otak dan efikasi antibodi terapeutik menggunakan pembawa molekul monovalen. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. dkk. Transport reseptor transferrin (TfR) menentukan penyerapan antibodi varian afinitas TfR ke otak. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).