Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Anda menggunakan versi browser dengan dukungan CSS terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau nonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Selain itu, untuk memastikan dukungan yang berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Menampilkan rangkaian tiga slide sekaligus. Gunakan tombol Sebelumnya dan Berikutnya untuk berpindah melalui tiga slide sekaligus, atau gunakan tombol penggeser di bagian akhir untuk berpindah melalui tiga slide sekaligus.
Penghalang darah-otak dan penghalang darah-otak mencegah agen bioterapi mencapai targetnya di sistem saraf pusat, sehingga menghambat pengobatan penyakit neurologis yang efektif. Untuk menemukan transporter otak baru secara in vivo, kami memperkenalkan pustaka peptida fag T7 dan darah serta cairan serebrospinal (CSF) yang dikumpulkan secara serial menggunakan model kumpulan besar sadar yang dikanulasi dari tikus. Klon fag tertentu sangat diperkaya dalam CSF setelah empat putaran seleksi. Pengujian peptida kandidat individu mengungkapkan pengayaan lebih dari 1000 kali lipat dalam CSF. Bioaktivitas pengiriman yang dimediasi peptida ke otak dikonfirmasi oleh pengurangan 40% dalam tingkat amiloid-β dalam cairan serebrospinal menggunakan inhibitor peptida BACE1 yang dikaitkan dengan peptida transit baru yang diidentifikasi. Hasil ini menunjukkan bahwa peptida yang diidentifikasi oleh metode seleksi fag in vivo dapat menjadi kendaraan yang berguna untuk pengiriman makromolekul sistemik ke otak dengan efek terapeutik.
Penelitian terapi target sistem saraf pusat (SSP) sebagian besar difokuskan pada identifikasi obat dan agen yang dioptimalkan yang menunjukkan sifat penargetan SSP, dengan sedikit upaya untuk menemukan mekanisme yang mendorong pengiriman obat aktif ke otak. Ini mulai berubah sekarang karena pengiriman obat, terutama molekul besar, merupakan bagian integral dari pengembangan obat neurosains modern. Lingkungan sistem saraf pusat dilindungi dengan baik oleh sistem penghalang serebrovaskular, yang terdiri dari penghalang darah-otak (BBB) ​​​​dan penghalang darah-otak (BCBB)1, sehingga menjadi tantangan untuk mengirimkan obat ke otak1,2. Diperkirakan bahwa hampir semua obat molekul besar dan lebih dari 98% obat molekul kecil dihilangkan dari otak3. Itulah sebabnya sangat penting untuk mengidentifikasi sistem transportasi otak baru yang menyediakan pengiriman obat terapeutik yang efisien dan spesifik ke SSP4,5. Namun, BBB dan BCSFB juga menghadirkan peluang yang sangat baik untuk pengiriman obat karena mereka menembus dan memasuki semua struktur otak melalui pembuluh darahnya yang luas. Dengan demikian, upaya saat ini untuk menggunakan metode pengiriman non-invasif ke otak sebagian besar didasarkan pada mekanisme transportasi yang dimediasi reseptor (PMT) menggunakan reseptor BBB6 endogen. Meskipun ada kemajuan penting baru-baru ini menggunakan jalur reseptor transferin7,8, pengembangan lebih lanjut dari sistem pengiriman baru dengan sifat yang lebih baik diperlukan. Untuk tujuan ini, tujuan kami adalah untuk mengidentifikasi peptida yang mampu memediasi transportasi CSF, karena pada prinsipnya dapat digunakan untuk mengirimkan makromolekul ke SSP atau untuk membuka jalur reseptor baru. Secara khusus, reseptor dan transporter spesifik dari sistem serebrovaskular (BBB dan BSCFB) dapat berfungsi sebagai target potensial untuk pengiriman obat bioterapi yang aktif dan spesifik. Cairan serebrospinal (CSF) adalah produk sekretori dari pleksus koroid (CS) dan bersentuhan langsung dengan cairan interstisial otak melalui ruang subaraknoid dan ruang ventrikel4. Baru-baru ini telah ditunjukkan bahwa cairan serebrospinal subaraknoid berdifusi secara berlebihan ke dalam interstitium otak9. Kami berharap dapat mengakses ruang parenkim menggunakan jalur masuk subaraknoid ini atau langsung melalui BBB. Untuk mencapainya, kami menerapkan strategi seleksi fag in vivo yang kuat yang idealnya mengidentifikasi peptida yang diangkut oleh salah satu dari dua jalur berbeda ini.
Kami sekarang menjelaskan metode penyaringan tampilan fag in vivo berurutan dengan pengambilan sampel LCS yang digabungkan dengan pengurutan throughput tinggi (HTS) untuk memantau putaran seleksi awal dengan keragaman pustaka tertinggi. Penyaringan dilakukan pada tikus yang sadar dengan kanula cisterna besar (CM) yang ditanamkan secara permanen untuk menghindari kontaminasi darah. Yang terpenting, pendekatan ini memilih peptida yang menargetkan otak dan peptida dengan aktivitas transpor melintasi penghalang serebrovaskular. Kami menggunakan fag T7 karena ukurannya yang kecil (~60 nm)10 dan menyarankan bahwa mereka cocok untuk pengangkutan vesikel yang memungkinkan penyeberangan transelular dari penghalang endotel dan/atau epitel-medula. Setelah empat putaran penyaringan, populasi fag diisolasi yang menunjukkan pengayaan LCS in vivo yang kuat dan asosiasi pembuluh darah mikro serebral. Yang terpenting, kami dapat mengonfirmasi temuan kami dengan menunjukkan bahwa peptida kandidat terbaik yang disukai dan disintesis secara kimia mampu mengangkut muatan protein ke dalam cairan serebrospinal. Pertama, efek farmakodinamik dari sistem saraf pusat ditetapkan dengan menggabungkan peptida transit utama dengan penghambat peptida BACE1. Selain menunjukkan bahwa strategi penyaringan fungsional in vivo dapat mengidentifikasi peptida transpor otak baru sebagai pembawa muatan protein yang efektif, kami berharap pendekatan seleksi fungsional serupa juga menjadi penting dalam mengidentifikasi jalur transpor otak baru.
Berdasarkan unit pembentuk plak (PFU), setelah langkah pengemasan fag, pustaka peptida fag T7 linier 12-mer acak dengan keragaman sekitar 109 dirancang dan dibuat (lihat Bahan dan Metode). Penting untuk dicatat bahwa kami menganalisis pustaka ini dengan hati-hati sebelum pemindaian in vivo. Amplifikasi PCR sampel pustaka fag menggunakan primer yang dimodifikasi menghasilkan amplikon yang secara langsung berlaku untuk HTS (Gambar Tambahan 1a). Karena a) kesalahan pengurutan HTS11, b) dampak pada kualitas primer (NNK)1-12, dan c) keberadaan fag tipe liar (wt) (sisipan kerangka) di pustaka siaga, prosedur penyaringan sekuens diterapkan untuk mengekstrak hanya informasi sekuens yang diverifikasi (Gambar Tambahan 1b). Langkah-langkah penyaringan ini berlaku untuk semua pustaka pengurutan HTS. Untuk pustaka standar, total 233.868 bacaan diperoleh, yang 39%-nya lolos kriteria filter dan digunakan untuk analisis dan pemilihan pustaka untuk putaran berikutnya (Gambar Tambahan 1c–e). Bacaan tersebut sebagian besar merupakan kelipatan dari 3 pasangan basa dengan puncak pada 36 nukleotida (Gambar Tambahan 1c), yang mengonfirmasi desain pustaka (NNK) 1-12. Khususnya, sekitar 11% anggota pustaka berisi sisipan PAGISRELVDKL backbone tipe liar (wt) 12 dimensi, dan hampir setengah dari sekuens (49%) berisi sisipan atau penghapusan. HTS dari pustaka pustaka mengonfirmasi keragaman peptida yang tinggi dalam pustaka: lebih dari 81% sekuens peptida ditemukan hanya sekali dan hanya 1,5% terjadi pada ≥4 salinan (Gambar Tambahan 2a). Frekuensi asam amino (aa) pada semua 12 posisi dalam repertoar berkorelasi baik dengan frekuensi yang diharapkan untuk jumlah kodon yang dihasilkan oleh repertoar NKK yang mengalami degenerasi (Gambar Tambahan 2b). Frekuensi residu aa yang diamati yang dikodekan oleh sisipan ini berkorelasi baik dengan frekuensi yang dihitung (r = 0,893) (Gambar Tambahan 2c). Penyiapan perpustakaan fag untuk injeksi mencakup langkah-langkah amplifikasi dan penghilangan endotoksin. Hal ini sebelumnya telah terbukti berpotensi mengurangi keberagaman perpustakaan fag12,13. Oleh karena itu, kami mengurutkan perpustakaan fag yang diperkuat pada pelat yang telah mengalami penghilangan endotoksin dan membandingkannya dengan perpustakaan asli untuk memperkirakan frekuensi AA. Korelasi yang kuat (r = 0,995) diamati antara kumpulan asli dan kumpulan yang diperkuat dan dimurnikan (Gambar Tambahan 2d), yang menunjukkan bahwa persaingan antara klon yang diperkuat pada pelat menggunakan fag T7 tidak menyebabkan bias utama. Perbandingan ini didasarkan pada frekuensi motif tripeptida di setiap pustaka, karena keragaman pustaka (~109) tidak dapat ditangkap sepenuhnya bahkan dengan HTS. Analisis frekuensi aa di setiap posisi mengungkapkan bias kecil yang bergantung pada posisi di tiga posisi terakhir dari repertoar yang dimasukkan (Gambar Tambahan 2e). Sebagai kesimpulan, kami menyimpulkan bahwa kualitas dan keragaman pustaka dapat diterima dan hanya perubahan kecil dalam keragaman yang diamati karena amplifikasi dan persiapan pustaka fag di antara beberapa putaran seleksi.
Pengambilan sampel cairan serebrospinal serial dapat dilakukan dengan menanamkan kanula secara bedah ke dalam CM tikus yang sadar untuk memfasilitasi identifikasi fag T7 yang disuntikkan secara intravena (iv) melalui BBB dan/atau BCSFB (Gbr. 1a-b). Kami menggunakan dua lengan seleksi independen (lengan A dan B) dalam tiga putaran pertama seleksi in vivo (Gbr. 1c). Kami secara bertahap meningkatkan keketatan seleksi dengan mengurangi jumlah total fag yang diperkenalkan dalam tiga putaran seleksi pertama. Untuk putaran keempat penyaringan, kami menggabungkan sampel dari cabang A dan B dan melakukan tiga seleksi independen tambahan. Untuk mempelajari sifat in vivo partikel fag T7 dalam model ini, fag tipe liar (sisipan utama PAGISRELVDKL) disuntikkan ke tikus melalui vena ekor. Pemulihan fag dari cairan serebrospinal dan darah pada titik waktu yang berbeda menunjukkan bahwa fag ikosahedral T7 yang relatif kecil memiliki fase pembersihan awal yang cepat dari kompartemen darah (Gambar Tambahan 3). Berdasarkan titer yang diberikan dan volume darah tikus, kami menghitung bahwa hanya sekitar 1% wt. fag dari dosis yang diberikan terdeteksi dalam darah 10 menit setelah injeksi intravena. Setelah penurunan cepat awal ini, pembersihan primer yang lebih lambat diukur dengan waktu paruh 27,7 menit. Yang penting, hanya sedikit fag yang diambil dari kompartemen CSF, yang menunjukkan latar belakang yang rendah untuk migrasi fag tipe liar ke kompartemen CSF (Gambar Tambahan 3). Rata-rata, hanya sekitar 1 x 10-3% titer fag T7 dalam darah dan 4 x 10-8% dari fag yang awalnya diinfus terdeteksi dalam cairan serebrospinal selama seluruh periode pengambilan sampel (0-250 menit). Khususnya, waktu paruh (25,7 menit) fag tipe liar dalam cairan serebrospinal mirip dengan yang diamati dalam darah. Data ini menunjukkan bahwa penghalang yang memisahkan kompartemen CSF dari darah masih utuh pada tikus yang diberi kanulasi CM, sehingga memungkinkan pemilihan pustaka fag secara in vivo untuk mengidentifikasi klon yang mudah diangkut dari darah ke kompartemen CSF.
(a) Menyiapkan metode untuk pengambilan sampel ulang cairan serebrospinal (CSF) dari kumpulan besar. (b) Diagram yang menunjukkan lokasi seluler penghalang sistem saraf pusat (SSP) dan strategi seleksi yang digunakan untuk mengidentifikasi peptida yang melintasi penghalang darah-otak (BBB) ​​​​dan penghalang darah-otak. (c) Diagram alir penyaringan tampilan fag in vivo. Pada setiap putaran seleksi, fag (pengidentifikasi hewan di dalam anak panah) disuntikkan secara intravena. Dua cabang alternatif independen (A, B) disimpan secara terpisah hingga putaran seleksi ke-4. Untuk putaran seleksi 3 dan 4, setiap klon fag yang diekstraksi dari CSF diurutkan secara manual. (d) Kinetika fag yang diisolasi dari darah (lingkaran merah) dan cairan serebrospinal (segitiga hijau) selama putaran pertama seleksi pada dua tikus yang dikanulasi setelah injeksi intravena pustaka peptida T7 (2 x 1012 fag/hewan). Kotak biru menunjukkan konsentrasi awal rata-rata fag dalam darah, dihitung dari jumlah fag yang disuntikkan, dengan mempertimbangkan volume darah total. Kotak hitam menunjukkan titik perpotongan garis y yang diekstrapolasi dari konsentrasi fag darah. (e,f) Sajikan frekuensi relatif dan distribusi semua kemungkinan motif tripeptida yang tumpang tindih yang ditemukan dalam peptida. Jumlah motif yang ditemukan dalam 1000 pembacaan ditunjukkan. Motif yang diperkaya secara signifikan (p < 0,001) ditandai dengan titik merah. (e) Diagram sebaran korelasi yang membandingkan frekuensi relatif motif tripeptida dari pustaka yang disuntikkan dengan fag yang berasal dari darah dari hewan #1.1 dan #1.2. (f) Diagram sebaran korelasi yang membandingkan frekuensi relatif motif tripeptida fag hewan #1.1 dan #1.2 yang diisolasi dalam darah dan cairan serebrospinal. (g, h) Representasi ID sekuens dari fag yang diperkaya dalam darah (g) versus pustaka yang disuntikkan dan fag yang diperkaya dalam CSF (h) versus darah setelah satu putaran seleksi in vivo pada kedua hewan. Ukuran kode satu huruf menunjukkan seberapa sering asam amino itu muncul pada posisi tersebut. Hijau = polar, ungu = netral, biru = basa, merah = asam dan hitam = asam amino hidrofobik. Gambar 1a, b dirancang dan diproduksi oleh Eduard Urich.
Kami menyuntikkan pustaka peptida fag ke dalam dua tikus instrumen CM (klade A dan B) dan mengisolasi fag dari cairan serebrospinal dan darah (Gambar 1d). Pembersihan pustaka yang cepat dan awal kurang jelas dibandingkan dengan fag tipe liar. Waktu paruh rata-rata pustaka yang disuntikkan pada kedua hewan adalah 24,8 menit dalam darah, mirip dengan fag tipe liar, dan 38,5 menit dalam CSF. Sampel fag darah dan cairan serebrospinal dari setiap hewan dikenakan HTS dan semua peptida yang diidentifikasi dianalisis untuk mengetahui keberadaan motif tripeptida pendek. Motif tripeptida dipilih karena menyediakan dasar minimal untuk pembentukan struktur dan interaksi peptida-protein14,15. Kami menemukan korelasi yang baik dalam distribusi motif antara pustaka fag yang disuntikkan dan klon yang diekstraksi dari darah kedua hewan (Gbr. 1e). Data menunjukkan bahwa komposisi pustaka hanya sedikit diperkaya dalam kompartemen darah. Frekuensi asam amino dan urutan konsensus dianalisis lebih lanjut pada setiap posisi menggunakan adaptasi perangkat lunak Weblogo16. Menariknya, kami menemukan pengayaan yang kuat pada residu glisin darah (Gbr. 1g). Ketika darah dibandingkan dengan klon yang dipilih dari CSF, seleksi yang kuat dan beberapa deseleksi motif diamati (Gbr. 1f), dan asam amino tertentu secara istimewa hadir pada posisi yang telah ditentukan sebelumnya dalam 12 anggota (Gbr. 1h). Khususnya, masing-masing hewan berbeda secara signifikan dalam cairan serebrospinal, sedangkan pengayaan glisin darah diamati pada kedua hewan (Gambar Tambahan 4a–j). Setelah penyaringan ketat data urutan dalam cairan serebrospinal hewan #1.1 dan #1.2, total 964 dan 420 peptida 12-mer unik diperoleh (Gambar Tambahan 1d–e). Klon fag yang diisolasi diperkuat dan dikenakan putaran kedua seleksi in vivo. Fage yang diekstraksi dari putaran seleksi kedua dikenakan HTS pada setiap hewan dan semua peptida yang teridentifikasi digunakan sebagai masukan untuk program pengenalan motif guna menganalisis kemunculan motif tripeptida (Gbr. 2a, b, ef). Dibandingkan dengan siklus pertama fage yang diperoleh dari CSF, kami mengamati seleksi dan deseleksi lebih lanjut dari banyak motif di CSF pada cabang A dan B (Gbr. 2). Algoritma identifikasi jaringan diterapkan untuk menentukan apakah mereka mewakili pola yang berbeda dari urutan yang konsisten. Kesamaan yang jelas diamati antara urutan 12 dimensi yang diperoleh oleh CSF dalam klade alternatif A (Gbr. 2c, d) dan klade B (Gbr. 2g, h). Analisis gabungan di setiap cabang mengungkapkan profil seleksi yang berbeda untuk peptida 12-mer (Gambar Tambahan 5c,d) dan peningkatan rasio titer CSF/darah dari waktu ke waktu untuk klon gabungan setelah putaran seleksi kedua dibandingkan dengan putaran seleksi pertama (Gambar Tambahan 5e). ).
Pengayaan motif dan peptida dalam cairan serebrospinal melalui dua putaran berturut-turut seleksi tampilan fag fungsional in vivo.
Semua fag cairan serebrospinal yang diperoleh dari putaran pertama setiap hewan (hewan #1.1 dan #1.2) digabungkan, diperkuat, diurutkan HT, dan disuntikkan kembali bersama-sama (2 x 1010 fag/hewan) 2 tikus yang dikanulasi SM (#1.1 → #). 2.1 dan 2.2, 1.2 → 2.3 dan 2.4). (a,b,e,f) Plot sebaran korelasi yang membandingkan frekuensi relatif motif tripeptida dari semua fag turunan CSF pada putaran seleksi pertama dan kedua. Frekuensi relatif dan distribusi motif yang mewakili semua kemungkinan tripeptida yang tumpang tindih yang ditemukan dalam peptida pada kedua orientasi. Jumlah motif yang ditemukan dalam 1000 pembacaan ditampilkan. Motif yang secara signifikan (p < 0,001) dipilih atau dikecualikan dalam salah satu pustaka yang dibandingkan disorot dengan titik-titik merah. (c, d, g, h) Representasi logo sekuens dari semua sekuens panjang 12 asam amino kaya CSF berdasarkan putaran 2 dan 1 seleksi in vivo. Ukuran kode satu huruf menunjukkan seberapa sering asam amino itu muncul pada posisi itu. Untuk merepresentasikan logo, frekuensi sekuens CSF yang diekstraksi dari masing-masing hewan antara dua putaran seleksi dibandingkan dan sekuens yang diperkaya pada putaran kedua ditunjukkan: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 dan (h) #1.2–#2.4. Asam amino yang paling diperkaya pada posisi tertentu pada (c, d) hewan no. 2.1 dan no. 2.2 atau (g, h) pada hewan no. 2.3 dan no. 2.4 ditunjukkan dalam warna. Hijau = polar, ungu = netral, biru = basa, merah = asam dan hitam = asam amino hidrofobik.
Bahasa Indonesia: Setelah putaran ketiga seleksi, kami mengidentifikasi 124 urutan peptida unik (#3.1 dan #3.2) dari 332 klon fag yang direkonstitusi CSF yang diisolasi dari dua hewan (Gambar Tambahan 6a). Urutan LGSVS (18,7%) memiliki proporsi relatif tertinggi, diikuti oleh sisipan tipe liar PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%), dan SARGSWREIVSLS (2,2%). Di putaran keempat terakhir, kami menyatukan dua cabang yang dipilih secara independen dari tiga hewan terpisah (Gambar 1c). Dari 925 klon fag yang diurutkan yang diperoleh dari CSF, di putaran keempat kami menemukan 64 urutan peptida unik (Gambar Tambahan 6b), di antaranya proporsi relatif fag tipe liar turun menjadi 0,8%. Klon CSF yang paling umum di putaran keempat adalah LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) dan RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). Rentang panjang peptida yang dipilih disebabkan oleh penyisipan/penghapusan nukleotida atau kodon stop prematur di primer perpustakaan saat menggunakan kodon degenerasi untuk desain perpustakaan NNK. Kodon stop prematur menghasilkan peptida yang lebih pendek dan dipilih karena mengandung motif aa yang menguntungkan. Peptida yang lebih panjang dapat dihasilkan dari penyisipan/penghapusan di primer perpustakaan sintetis. Ini memposisikan kodon stop yang dirancang di luar bingkai dan membacanya hingga kodon stop baru muncul di hilir. Secara umum, kami menghitung faktor pengayaan untuk keempat putaran seleksi dengan membandingkan data masukan dengan data keluaran sampel. Untuk penyaringan tahap pertama, kami menggunakan titer fag tipe liar sebagai referensi latar belakang non-spesifik. Menariknya, seleksi fag negatif sangat kuat dalam siklus CSF pertama, tetapi tidak dalam darah (Gbr. 3a), yang mungkin disebabkan oleh rendahnya kemungkinan difusi pasif sebagian besar anggota pustaka peptida ke dalam kompartemen CSF atau fag relatif cenderung lebih efisien dipertahankan atau dikeluarkan dari aliran darah daripada bakteriofag. Namun, dalam penyaringan tahap kedua, seleksi fag yang kuat dalam CSF diamati di kedua klade, yang menunjukkan bahwa tahap sebelumnya diperkaya dengan fag yang menampilkan peptida yang meningkatkan penyerapan CSF (Gbr. 3a). Sekali lagi, tanpa pengayaan darah yang signifikan. Juga pada tahap ketiga dan keempat, klon fag diperkaya secara signifikan dalam CSF. Membandingkan frekuensi relatif setiap urutan peptida unik antara dua tahap seleksi terakhir, kami menemukan bahwa urutan tersebut bahkan lebih diperkaya dalam pemilihan tahap keempat (Gbr. 3b). Sebanyak 931 motif tripeptida diekstraksi dari semua 64 urutan peptida unik menggunakan kedua orientasi peptida. Motif yang paling diperkaya pada putaran keempat diperiksa lebih cermat untuk profil pengayaannya di semua putaran dibandingkan dengan pustaka yang disuntikkan (batas: pengayaan 10%) (Gambar Tambahan 6c). Pola seleksi umum menunjukkan bahwa sebagian besar motif yang dipelajari diperkaya dalam semua putaran sebelumnya dari kedua cabang seleksi. Namun, beberapa motif (misalnya SGL, VSG, LGS GSV) sebagian besar berasal dari klade alternatif A, sementara yang lain (misalnya FGW, RTN, WGF, NTR) diperkaya dalam klade alternatif B.
Validasi pengangkutan CSF dari peptida yang ditampilkan fag yang diperkaya CSF dan peptida pemimpin terbiotinilasi yang terkonjugasi dengan muatan streptavidin.
(a) Rasio pengayaan dihitung dalam keempat putaran (R1-R4) berdasarkan titer fag (PFU) yang disuntikkan (input = I) dan titer fag CSF yang ditentukan (output = O). Faktor pengayaan untuk tiga putaran terakhir (R2-R4) dihitung dengan membandingkan dengan putaran sebelumnya dan putaran pertama (R1) dengan data berat. Batang terbuka adalah cairan serebrospinal, batang yang diarsir adalah plasma. (***p<0,001, berdasarkan uji-t Student). (b) Daftar peptida fag yang paling melimpah, diberi peringkat menurut proporsi relatifnya terhadap semua fag yang dikumpulkan dalam CSF setelah putaran ke-4 seleksi. Enam klon fag yang paling umum disorot dalam warna, diberi nomor dan faktor pengayaannya antara putaran ke-3 dan ke-4 seleksi (sisipan). (c,d) Enam klon fag yang paling diperkaya, fag kosong, dan pustaka peptida fag induk dari putaran 4 dianalisis secara individual dalam model pengambilan sampel LCS. Sampel LCS dan darah dikumpulkan pada titik waktu yang ditunjukkan. (c) Jumlah yang sama dari 6 klon fag kandidat (2 x 1010 fag/hewan), fag kosong (#1779) (2 x 1010 fag/hewan), dan pustaka peptida fag stok (2 x 1012 fag/hewan) Suntikkan sedikitnya 3 CM ke hewan yang dikanulasi secara terpisah melalui vena ekor. Farmakokinetik LCS dari setiap klon fag yang disuntikkan dan pustaka peptida fag dari waktu ke waktu ditunjukkan. (d) menunjukkan rasio LCS/darah rata-rata untuk semua fag yang dipulihkan/mL selama waktu pengambilan sampel. (e) Empat peptida pemimpin sintetis dan satu kontrol acak dihubungkan dengan biotin ke streptavidin melalui N-terminusnya (tampilan tetramer) diikuti dengan injeksi (vena ekor iv, 10 mg streptavidin/kg). Setidaknya tiga tikus yang diintubasi (N = 3). ). Sampel CSF dikumpulkan pada titik waktu yang ditunjukkan dan konsentrasi streptavidin diukur dengan ELISA anti-streptavidin CSF (nd = tidak terdeteksi). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, berdasarkan uji ANOVA). (f) Perbandingan urutan asam amino dari klon peptida fag paling diperkaya #2002 (ungu) dengan klon peptida fag terpilih lainnya dari putaran seleksi ke-4. Fragmen asam amino yang identik dan serupa diberi kode warna.
Dari semua fag yang diperkaya pada putaran keempat (Gbr. 3b), enam klon kandidat dipilih untuk analisis individual lebih lanjut dalam model pengambilan sampel CSF. Jumlah yang sama dari enam fag kandidat, fag kosong (tanpa sisipan) dan pustaka peptida profag disuntikkan ke dalam tiga hewan CM yang dikanulasi, dan farmakokinetik ditentukan dalam pengujian CSF (Gbr. 3c) dan darah (Gambar Tambahan 7). Semua klon fag yang diuji menargetkan kompartemen CSF pada tingkat 10-1000 kali lebih tinggi daripada fag kontrol kosong (#1779). Misalnya, klon #2020 dan #2077 memiliki titer CSF sekitar 1000 kali lebih tinggi daripada fag kontrol. Profil farmakokinetik setiap peptida yang dipilih berbeda, tetapi semuanya memiliki kemampuan homing CSF yang tinggi. Kami mengamati penurunan konstan dari waktu ke waktu untuk klon #1903 dan #2011, sementara untuk klon #2077, #2002 dan #2009 peningkatan selama 10 menit pertama mungkin menunjukkan transpor aktif tetapi perlu diverifikasi. Klon #2020, #2002, dan #2077 stabil pada kadar tinggi, sementara konsentrasi CSF klon #2009 perlahan menurun setelah peningkatan awal. Kami kemudian membandingkan frekuensi relatif setiap kandidat CSF dengan konsentrasi darahnya (Gbr. 3d). Korelasi titer rata-rata setiap kandidat CSF dengan titer darahnya pada semua waktu pengambilan sampel menunjukkan bahwa tiga dari enam kandidat diperkaya secara signifikan dalam CSF darah. Menariknya, klon #2077 menunjukkan stabilitas darah yang lebih tinggi (Gambar Tambahan 7). Untuk mengonfirmasi bahwa peptida itu sendiri mampu secara aktif mengangkut kargo selain partikel fag ke dalam kompartemen CSF, kami mensintesis empat peptida pemimpin yang diderivatisasi dengan biotin di N-terminus tempat peptida menempel pada partikel fag. Peptida yang terbiotinilasi (no. 2002, 2009, 2020 dan 2077) dikonjugasikan dengan streptavidin (SA) untuk memperoleh bentuk multimerik yang agak meniru geometri fag. Format ini juga memungkinkan kami untuk mengukur paparan SA dalam darah dan cairan serebrospinal sebagai peptida protein pengangkut kargo. Yang penting, data fag sering kali dapat direproduksi ketika peptida sintetis diberikan dalam format terkonjugasi SA ini (Gbr. 3e). Peptida yang diacak memiliki paparan awal yang lebih sedikit dan pembersihan CSF yang lebih cepat dengan kadar yang tidak terdeteksi dalam waktu 48 jam. Untuk mendapatkan wawasan tentang jalur pengiriman klon fag peptida ini ke dalam ruang CSF, kami menganalisis lokalisasi masing-masing hit peptida fag menggunakan imunohistokimia (IHC) untuk mendeteksi partikel fag secara langsung 1 jam setelah injeksi intravena in vivo. Khususnya, klon #2002, #2077, dan #2009 dapat dideteksi dengan pewarnaan kuat di kapiler otak, sementara fag kontrol (#1779) dan klon #2020 tidak terdeteksi (Gambar Tambahan 8). Ini menunjukkan bahwa peptida ini berkontribusi terhadap efek pada otak justru dengan melintasi BBB. Analisis terperinci lebih lanjut diperlukan untuk menguji hipotesis ini, karena rute BSCFB mungkin juga terlibat. Ketika membandingkan urutan asam amino dari klon yang paling diperkaya (#2002) dengan peptida terpilih lainnya, dicatat bahwa beberapa di antaranya memiliki ekstensi asam amino yang serupa, yang mungkin menunjukkan mekanisme transpor yang serupa (Gbr. 3f).
Karena profil plasma yang unik dan peningkatan signifikan dalam CSF dari waktu ke waktu, klon tampilan fag #2077 dieksplorasi lebih lanjut selama periode 48 jam yang lebih lama dan mampu mereproduksi peningkatan cepat dalam CSF yang diamati terkait dengan kadar SA yang berkelanjutan (Gbr. 4a). Mengenai klon fag teridentifikasi lainnya, #2077 diwarnai dengan kuat untuk kapiler otak dan menunjukkan kolokalisasi yang signifikan dengan penanda kapiler lektin ketika dilihat pada resolusi yang lebih tinggi dan mungkin beberapa pewarnaan dalam ruang parenkim (Gambar 4b). Untuk menyelidiki apakah efek farmakologis yang dimediasi peptida dapat diperoleh di SSP, kami melakukan percobaan di mana versi biotinilasi dari i) peptida transit #2077 dan ii) peptida penghambat BACE1 dicampur dengan SA pada dua rasio yang berbeda. Untuk satu kombinasi, kami hanya menggunakan penghambat peptida BACE1 dan untuk yang lain kami menggunakan rasio 1:3 penghambat peptida BACE1 terhadap peptida #2077. Kedua sampel diberikan secara intravena dan kadar beta-amiloid peptida 40 (Abeta40) dalam darah dan cairan serebrospinal diukur dari waktu ke waktu. Abeta40 diukur dalam CSF karena mencerminkan penghambatan BACE1 di parenkim otak. Seperti yang diharapkan, kedua kompleks tersebut secara signifikan menurunkan kadar Abeta40 dalam darah (Gbr. 4c, d). Namun, hanya sampel yang mengandung campuran peptida no. 2077 dan penghambat peptida BACE1 yang terkonjugasi dengan SA yang menyebabkan penurunan Abeta40 yang signifikan dalam cairan serebrospinal (Gbr. 4c). Data menunjukkan bahwa peptida no. 2077 mampu mengangkut protein SA 60 kDa ke dalam SSP dan juga menginduksi efek farmakologis dengan penghambat peptida BACE1 yang terkonjugasi SA.
(a) Injeksi klonal (2 × 10 fag/hewan) fag T7 yang menunjukkan profil farmakokinetik jangka panjang peptida CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) dan fag kontrol yang tidak disuntik (#1779) pada sedikitnya tiga tikus yang diintubasi CM. (b) Gambaran mikroskopis konfokal dari pembuluh darah mikro kortikal representatif pada tikus yang disuntik fag (2 × 10 10 fag/hewan) yang menunjukkan pewarnaan tandingan peptida #2077 dan pembuluh darah (lektin). Klon fag ini diberikan kepada 3 tikus dan dibiarkan bersirkulasi selama 1 jam sebelum perfusi. Otak dipotong dan diwarnai dengan antibodi poliklonal berlabel FITC terhadap kapsid fag T7. Sepuluh menit sebelum perfusi dan fiksasi berikutnya, lektin berlabel DyLight594 diberikan secara intravena. Gambar fluoresensi yang menunjukkan pewarnaan lektin (merah) pada sisi luminal pembuluh darah mikro dan fag (hijau) di lumen kapiler dan jaringan otak perivaskular. Skala batang sesuai dengan 10 µm. (c, d) Peptida penghambat BACE1 yang terbiotinilasi sendiri atau dalam kombinasi dengan peptida transit terbiotinilasi #2077 digabungkan dengan streptavidin diikuti dengan injeksi intravena sedikitnya tiga tikus CM yang dikanulasi (10 mg streptavidin/kg). Pengurangan Aβ40 yang dimediasi oleh penghambat peptida BACE1 diukur dengan ELISA Aβ1-40 dalam darah (merah) dan cairan serebrospinal (oranye) pada titik waktu yang ditunjukkan. Untuk kejelasan yang lebih baik, garis putus-putus digambar pada grafik pada skala 100%. (c) Persentase penurunan Aβ40 dalam darah (segitiga merah) dan cairan serebrospinal (segitiga oranye) pada tikus yang diobati dengan streptavidin yang dikonjugasikan dengan peptida transit #2077 dan peptida penghambat BACE1 dalam rasio 3:1. (d) Persentase penurunan Aβ40 dalam darah (lingkaran merah) dan cairan serebrospinal (lingkaran oranye) pada tikus yang diobati dengan streptavidin yang dikopel dengan peptida penghambat BACE1 saja. Konsentrasi Aβ dalam kontrol adalah 420 pg/ml (simpangan baku = 101 pg/ml).
Tampilan fag telah berhasil diterapkan di beberapa bidang penelitian biomedis17. Metode ini telah digunakan untuk studi keragaman vaskular in vivo18,19 serta studi yang menargetkan pembuluh darah otak20,21,22,23,24,25,26. Dalam studi ini, kami memperluas penerapan metode seleksi ini tidak hanya untuk identifikasi langsung peptida yang menargetkan pembuluh darah otak, tetapi juga untuk penemuan kandidat dengan sifat transpor aktif untuk melewati sawar darah-otak. Kami sekarang menjelaskan pengembangan prosedur seleksi in vivo pada tikus yang diintubasi CM dan menunjukkan potensinya untuk mengidentifikasi peptida dengan sifat homing CSF. Dengan menggunakan fag T7 yang menampilkan pustaka peptida acak 12-mer, kami dapat menunjukkan bahwa fag T7 cukup kecil (berdiameter sekitar 60 nm)10 untuk beradaptasi dengan sawar darah-otak, sehingga secara langsung melewati sawar darah-otak atau pleksus koroid. Kami mengamati bahwa pengambilan CSF dari tikus CM yang dikanulasi merupakan metode penyaringan fungsional in vivo yang terkontrol dengan baik, dan bahwa fag yang diekstraksi tidak hanya terikat pada pembuluh darah tetapi juga berfungsi sebagai transporter melintasi sawar darah-otak. Lebih jauh lagi, dengan mengumpulkan darah dan menerapkan HTS pada CSF dan fag yang berasal dari darah secara bersamaan, kami mengonfirmasi bahwa pilihan CSF kami tidak dipengaruhi oleh pengayaan darah atau kebugaran untuk ekspansi di antara putaran seleksi. Namun, kompartemen darah merupakan bagian dari prosedur seleksi, karena fag yang mampu mencapai kompartemen CSF harus bertahan hidup dan bersirkulasi dalam aliran darah cukup lama untuk memperkaya diri mereka sendiri di otak. Untuk mengekstrak informasi urutan yang andal dari data HTS mentah, kami menerapkan filter yang disesuaikan dengan kesalahan pengurutan khusus platform dalam alur kerja analisis. Dengan menggabungkan parameter kinetik ke dalam metode penyaringan, kami mengonfirmasi farmakokinetik cepat fag T7 tipe liar (t½ ~ 28 menit) dalam darah24, 27, 28 dan juga menentukan waktu paruhnya dalam cairan serebrospinal (t½ ~ 26 menit) per menit). Meskipun profil farmakokinetik serupa dalam darah dan CSF, hanya 0,001% dari konsentrasi fag darah yang dapat dideteksi dalam CSF, yang menunjukkan mobilitas latar belakang fag T7 tipe liar yang rendah melintasi sawar darah-otak. Pekerjaan ini menyoroti pentingnya putaran pertama seleksi saat menggunakan strategi penyaringan in vivo, terutama untuk sistem fag yang cepat dibersihkan dari sirkulasi, karena sedikit klon yang dapat mencapai kompartemen SSP. Dengan demikian, pada putaran pertama, pengurangan keragaman pustaka sangat besar, karena hanya sejumlah kecil klon yang akhirnya dikumpulkan dalam model CSF yang sangat ketat ini. Strategi penyaringan in vivo ini mencakup beberapa langkah seleksi seperti akumulasi aktif dalam kompartemen CSF, kelangsungan hidup klon dalam kompartemen darah, dan pembuangan cepat klon fag T7 dari darah dalam 10 menit pertama (Gbr. 1d dan Gbr. Tambahan 4M). ). Dengan demikian, setelah putaran pertama, klon fag yang berbeda diidentifikasi dalam CSF, meskipun kumpulan awal yang sama digunakan untuk masing-masing hewan. Hal ini menunjukkan bahwa beberapa langkah seleksi ketat untuk pustaka sumber dengan sejumlah besar anggota pustaka menghasilkan pengurangan keanekaragaman yang signifikan. Oleh karena itu, kejadian acak akan menjadi bagian integral dari proses seleksi awal, yang sangat memengaruhi hasilnya. Sangat mungkin bahwa banyak klon dalam pustaka asli memiliki kecenderungan pengayaan CSF yang sangat mirip. Namun, bahkan dalam kondisi eksperimen yang sama, hasil seleksi mungkin berbeda karena jumlah kecil setiap klon tertentu dalam kumpulan awal.
Motif yang diperkaya dalam CSF berbeda dari yang ada dalam darah. Menariknya, kami mencatat pergeseran pertama ke arah peptida kaya glisin dalam darah hewan individu. (Gbr. 1g, Gambar Tambahan 4e, 4f). Peptida glisin yang mengandung fag mungkin lebih stabil dan kecil kemungkinannya untuk dikeluarkan dari sirkulasi. Namun, peptida kaya glisin ini tidak terdeteksi dalam sampel cairan serebrospinal, yang menunjukkan bahwa pustaka yang dikurasi melewati dua langkah seleksi yang berbeda: satu dalam darah dan yang lainnya dibiarkan terakumulasi dalam cairan serebrospinal. Klon yang diperkaya CSF yang dihasilkan dari putaran keempat seleksi telah diuji secara ekstensif. Hampir semua klon yang diuji secara individual dipastikan diperkaya dalam CSF dibandingkan dengan fag kontrol kosong. Satu hit peptida (#2077) diperiksa secara lebih rinci. Ini menunjukkan waktu paruh plasma yang lebih panjang dibandingkan dengan hit lainnya (Gambar 3d dan Gambar Tambahan 7), dan yang menarik, peptida ini mengandung residu sistein di C-terminus. Baru-baru ini telah ditunjukkan bahwa penambahan sistein ke peptida dapat meningkatkan sifat farmakokinetiknya dengan mengikat albumin 29 . Ini saat ini tidak diketahui untuk peptida #2077 dan memerlukan studi lebih lanjut. Beberapa peptida menunjukkan ketergantungan valensi dalam pengayaan CSF (data tidak ditampilkan), yang mungkin terkait dengan geometri permukaan kapsid T7 yang ditampilkan. Sistem T7 yang kami gunakan menunjukkan 5-15 salinan setiap peptida per partikel fag. IHC dilakukan pada klon fag utama kandidat yang disuntikkan secara intravena ke korteks serebral tikus (Gambar Tambahan 8). Data menunjukkan bahwa setidaknya tiga klon (No. 2002, No. 2009 dan No. 2077) berinteraksi dengan BBB. Masih harus ditentukan apakah interaksi BBB ini menghasilkan akumulasi CSF atau pergerakan klon-klon ini secara langsung ke BCSFB. Yang penting, kami menunjukkan bahwa peptida terpilih mempertahankan kapasitas transpor CSF mereka saat disintesis dan terikat pada muatan protein. Pengikatan peptida biotinilasi N-terminal ke SA pada dasarnya mengulangi hasil yang diperoleh dengan klon fag masing-masing dalam darah dan cairan serebrospinal (Gbr. 3e). Akhirnya, kami menunjukkan bahwa peptida utama #2077 mampu meningkatkan aksi otak dari penghambat peptida biotinilasi BACE1 yang terkonjugasi dengan SA, yang menyebabkan efek farmakodinamik yang nyata di SSP dengan secara signifikan mengurangi kadar Abeta40 di CSF (Gbr. 4). Kami tidak dapat mengidentifikasi homolog apa pun dalam basis data dengan melakukan pencarian homologi urutan peptida dari semua hasil. Penting untuk dicatat bahwa ukuran pustaka T7 kira-kira 109, sedangkan ukuran pustaka teoritis untuk 12-mer adalah 4 x 1015. Oleh karena itu, kami hanya memilih sebagian kecil dari ruang keragaman pustaka peptida 12-mer, yang mungkin berarti bahwa peptida yang lebih optimal dapat diidentifikasi dengan mengevaluasi ruang urutan yang berdekatan dari hasil yang diidentifikasi ini. Secara hipotetis, salah satu alasan mengapa kami belum menemukan homolog alami dari peptida ini mungkin adalah deseleksi selama evolusi untuk mencegah masuknya motif peptida tertentu yang tidak terkendali ke dalam otak.
Secara keseluruhan, hasil kami menyediakan dasar untuk pekerjaan di masa mendatang untuk mengidentifikasi dan mengkarakterisasi sistem transportasi sawar serebrovaskular secara in vivo secara lebih rinci. Pengaturan dasar metode ini didasarkan pada strategi seleksi fungsional yang tidak hanya mengidentifikasi klon dengan sifat pengikatan vaskular serebral, tetapi juga mencakup langkah penting di mana klon yang berhasil memiliki aktivitas intrinsik untuk melintasi sawar biologis secara in vivo ke kompartemen SSP. adalah untuk menjelaskan mekanisme pengangkutan peptida ini dan preferensinya untuk mengikat mikrovaskulatur yang khusus untuk wilayah otak. Hal ini dapat mengarah pada penemuan jalur baru untuk pengangkutan BBB dan reseptor. Kami berharap bahwa peptida yang diidentifikasi dapat secara langsung mengikat reseptor serebrovaskular atau ligan yang beredar yang diangkut melalui BBB atau BCSFB. Vektor peptida dengan aktivitas transportasi LCS yang ditemukan dalam pekerjaan ini akan diselidiki lebih lanjut. Saat ini kami sedang menyelidiki spesifisitas otak dari peptida ini untuk kemampuannya melintasi BBB dan/atau BCSFB. Peptida baru ini akan menjadi alat yang sangat berharga untuk penemuan potensial reseptor atau jalur baru dan untuk pengembangan platform baru yang sangat efisien untuk pengiriman makromolekul, seperti biologik, ke otak.
Kanulasi sisterna besar (CM) menggunakan modifikasi metode yang dijelaskan sebelumnya. Tikus Wistar yang dibius (200-350 g) dipasang pada aparatus stereotaxic dan sayatan median dibuat di atas kulit kepala yang dicukur dan disiapkan secara aseptik untuk mengekspos tengkorak. Bor dua lubang di area selempang atas dan kencangkan sekrup pengikat di lubang tersebut. Lubang tambahan dibor di puncak oksipital lateral untuk panduan stereotaxic kanula baja tahan karat ke dalam CM. Oleskan semen gigi di sekitar kanula dan kencangkan dengan sekrup. Setelah foto-curing dan pengerasan semen, luka kulit ditutup dengan jahitan supramid 4/0. Penempatan kanula yang tepat dikonfirmasi oleh kebocoran spontan cairan serebrospinal (CSF). Keluarkan tikus dari aparatus stereotaxic, terima perawatan pascaoperasi dan manajemen nyeri yang tepat, dan biarkan pulih setidaknya selama satu minggu sampai tanda-tanda darah diamati dalam cairan serebrospinal. Tikus Wistar (Crl:WI/Han) diperoleh dari Charles River (Prancis). Semua tikus dipelihara dalam kondisi bebas patogen tertentu. Semua percobaan pada hewan telah disetujui oleh Kantor Kedokteran Hewan Kota Basel, Swiss, dan dilakukan sesuai dengan Lisensi Hewan No. 2474 (Penilaian Transportasi Otak Aktif dengan Mengukur Kadar Kandidat Terapi dalam Cairan Serebrospinal dan Otak Tikus).
Jaga agar tikus tetap sadar dengan kanula CM di tangan. Keluarkan Datura dari kanula dan kumpulkan 10 µl cairan serebrospinal yang mengalir spontan. Karena patensi kanula pada akhirnya terganggu, hanya sampel cairan serebrospinal bening tanpa bukti kontaminasi darah atau perubahan warna yang disertakan dalam penelitian ini. Secara paralel, sekitar 10–20 μl darah diambil dari sayatan kecil di ujung ekor ke dalam tabung dengan heparin (Sigma-Aldrich). CSF dan darah dikumpulkan pada berbagai titik waktu setelah injeksi intravena fag T7. Sekitar 5–10 μl cairan dibuang sebelum setiap sampel CSF dikumpulkan, yang sesuai dengan volume mati kateter.
Pustaka dibuat menggunakan vektor T7Select 10-3b seperti yang dijelaskan dalam manual sistem T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Secara singkat, sisipan DNA 12-mer acak disintesis dalam format berikut:
Kodon NNK digunakan untuk menghindari kodon stop ganda dan ekspresi asam amino berlebih pada sisipan. N adalah rasio ekuimolar yang dicampur secara manual dari setiap nukleotida, dan K adalah rasio ekuimolar yang dicampur secara manual dari nukleotida adenin dan sitosin. Daerah untai tunggal diubah menjadi DNA untai ganda dengan inkubasi lebih lanjut dengan dNTP (Novagen) dan enzim Klenow (New England Biolabs) dalam buffer Klenow (New England Biolabs) selama 3 jam pada suhu 37°C. Setelah reaksi, DNA untai ganda dipulihkan dengan presipitasi EtOH. DNA yang dihasilkan dicerna dengan enzim restriksi EcoRI dan HindIII (keduanya dari Roche). Sisipan yang dibelah dan dimurnikan (QIAquick, Qiagen) (ligase T4, New England Biolabs) kemudian diligasi dalam bingkai ke dalam vektor T7 yang telah dibelah sebelumnya setelah asam amino 348 dari gen kapsid 10B. Reaksi ligasi diinkubasi pada suhu 16° C selama 18 jam sebelum pengemasan in vitro. Pengemasan fag in vitro dilakukan sesuai dengan petunjuk yang disertakan dengan kit kloning T7Select 10-3b (Novagen) dan larutan pengemasan diamplifikasi sekali hingga mengalami lisis menggunakan Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lisat disentrifugasi, dititrasi, dan dibekukan pada suhu -80° C sebagai larutan stok gliserol.
Amplifikasi PCR langsung dari daerah variabel fag yang diamplifikasi dalam kaldu atau pelat menggunakan primer fusi amplikon 454/Roche yang dipatenkan. Primer fusi maju berisi urutan yang mengapit daerah variabel (NNK) 12 (khusus templat), Adaptor Titanium GS FLX A, dan urutan kunci pustaka empat basa (TCAG) (Gambar Tambahan 1a):
Primer fusi terbalik juga mengandung biotin yang ditempelkan pada manik penangkap dan Adaptor Titanium GS FLX B yang diperlukan untuk amplifikasi klonal selama PCR emulsi:
Amplikon kemudian dikenai pyrosequencing 454/Roche menurut protokol 454 GS-FLX Titanium. Untuk sequencing Sanger manual (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNA fag T7 diamplifikasi melalui PCR dan diurutkan dengan pasangan primer berikut:
Sisipan dari plak individual mengalami amplifikasi PCR menggunakan Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (sesuai petunjuk pabrik). Lakukan hot start (10 menit pada suhu 95 °C) dan 35 siklus boost (50 detik pada suhu 95 °C, 1 menit pada suhu 50 °C, dan 1 menit pada suhu 72 °C).
Fage dari perpustakaan, fage tipe liar, fage yang diselamatkan dari CSF dan darah, atau klon individu diperbanyak dalam Escherichia coli BL5615 dalam kaldu TB (Sigma Aldrich) atau dalam cawan berukuran 500 cm2 (Thermo Scientific) selama 4 jam pada suhu 37°C. Fage diekstraksi dari pelat dengan membilas pelat dengan penyangga Tris-EDTA (Fluka Analytical) atau dengan mengumpulkan plak dengan ujung pipet steril. Fage diisolasi dari kultur supernatan atau penyangga ekstraksi dengan satu putaran presipitasi polietilen glikol (PEG 8000) (Promega) dan disuspensikan kembali dalam penyangga Tris-EDTA.
Fag yang diperkuat mengalami 2-3 putaran penghilangan endotoksin menggunakan manik penghilang endotoksin (Miltenyi Biotec) sebelum injeksi intravena (IV) (500 μl/hewan). Pada putaran pertama, 2×1012 fag diperkenalkan; pada putaran kedua, 2×1010 fag; pada putaran seleksi ketiga dan keempat, 2×109 fag per hewan. Kandungan fag dalam CSF dan sampel darah yang dikumpulkan pada titik waktu yang ditunjukkan ditentukan dengan penghitungan plak sesuai dengan petunjuk pabrik (manual sistem T7Select). Seleksi fag dilakukan dengan injeksi intravena pustaka yang dimurnikan ke dalam vena ekor atau dengan injeksi ulang fag yang diekstraksi dari CSF dari putaran seleksi sebelumnya, dan panen berikutnya dilakukan pada 10 menit, 30 menit, 60 menit, 90 menit, 120 menit, 180 menit, dan 240 menit masing-masing pada sampel CSF dan darah. Sebanyak empat putaran penyaringan in vivo dilakukan di mana dua cabang yang dipilih disimpan dan dianalisis secara terpisah selama tiga putaran pertama seleksi. Semua sisipan fag yang diekstraksi dari CSF dari dua putaran pertama seleksi dikenakan pyrosequencing 454/Roche, sementara semua klon yang diekstraksi dari CSF dari dua putaran terakhir seleksi diurutkan secara manual. Semua fag darah dari putaran pertama seleksi juga dikenakan pyrosequencing 454/Roche. Untuk penyuntikan klon fag, fag yang dipilih diperkuat dalam E. coli (BL5615) pada pelat 500 cm2 pada suhu 37°C selama 4 jam. Klon yang dipilih secara individual dan diurutkan secara manual diperbanyak dalam media TB. Setelah ekstraksi fag, pemurnian dan penghilangan endotoksin (seperti dijelaskan di atas), 2×1010 fag/hewan dalam 300 μl disuntikkan secara intravena ke dalam satu vena ekor.
Praproses dan penyaringan kualitatif data sekuens. Data mentah 454/Roche diubah dari format peta aliran standar biner (sff) ke format Pearson yang dapat dibaca manusia (fasta) menggunakan perangkat lunak vendor. Pemrosesan lebih lanjut dari sekuens nukleotida dilakukan menggunakan program dan skrip C milik sendiri (paket perangkat lunak yang belum dirilis) seperti yang dijelaskan di bawah ini. Analisis data primer mencakup prosedur penyaringan multitahap yang ketat. Untuk menyaring bacaan yang tidak mengandung sekuens DNA sisipan 12mer yang valid, bacaan tersebut disejajarkan secara berurutan ke label awal (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), label akhir (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) dan sisipan latar belakang (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) menggunakan uji Needleman-Wunsch global. penyelarasan yang memungkinkan hingga 2 inkonsistensi per penyelarasan31. Oleh karena itu, bacaan tanpa tag awal dan akhir dan bacaan yang mengandung sisipan latar belakang, yaitu, penyelarasan yang melebihi jumlah ketidakcocokan yang diizinkan, dihapus dari pustaka. Untuk pembacaan yang tersisa, urutan DNA N-mer yang memanjang dari tanda awal dan berakhir sebelum tanda berhenti dikeluarkan dari urutan pembacaan asli dan diproses lebih lanjut (selanjutnya disebut sebagai "sisipan"). Setelah penerjemahan sisipan, bagian setelah kodon stop pertama pada ujung 5′ primer dikeluarkan dari sisipan. Selain itu, nukleotida yang mengarah ke kodon tidak lengkap pada ujung 3′ primer juga dikeluarkan. Untuk mengecualikan sisipan yang hanya berisi urutan latar belakang, sisipan yang diterjemahkan yang dimulai dengan pola asam amino "PAG" juga dikeluarkan. Peptida dengan panjang pasca-translasi kurang dari 3 asam amino dikeluarkan dari perpustakaan. Akhirnya, hilangkan redundansi dalam kumpulan sisipan dan tentukan frekuensi setiap sisipan unik. Hasil analisis ini mencakup daftar urutan nukleotida (sisipan) dan frekuensinya (pembacaan) (Gambar Tambahan 1c dan 2).
Kelompokkan sisipan DNA N-mer berdasarkan kesamaan sekuens: Untuk menghilangkan kesalahan sekuensing khusus 454/Roche (seperti masalah dengan ekstensi homopolymer sekuensing) dan menghilangkan redundansi yang kurang penting, sisipan sekuens DNA N-mer yang sebelumnya difilter (sisipan) diurutkan berdasarkan kesamaan. penyisipan (hingga 2 basa yang tidak cocok diizinkan) menggunakan algoritma iteratif yang ditetapkan sebagai berikut: penyisipan diurutkan terlebih dahulu berdasarkan frekuensinya (tertinggi ke terendah), dan jika sama, berdasarkan urutan sekundernya berdasarkan panjang (terpanjang ke terpendek) ). Dengan demikian, penyisipan yang paling sering dan terpanjang menentukan "kelompok" pertama. Frekuensi kelompok ditetapkan ke frekuensi kunci. Kemudian, setiap penyisipan yang tersisa dalam daftar yang diurutkan dicoba untuk ditambahkan ke kelompok dengan penyelarasan Needleman-Wunsch berpasangan. Jika jumlah ketidakcocokan, penyisipan, atau penghapusan dalam penyelarasan tidak melebihi ambang batas 2, penyisipan ditambahkan ke kelompok, dan frekuensi kelompok keseluruhan ditingkatkan dengan seberapa sering penyisipan ditambahkan. Sisipan yang ditambahkan ke grup ditandai sebagai digunakan dan dikecualikan dari pemrosesan lebih lanjut. Jika urutan sisipan tidak dapat ditambahkan ke grup yang sudah ada, urutan sisipan digunakan untuk membuat grup baru dengan frekuensi sisipan yang sesuai dan ditandai sebagai digunakan. Iterasi berakhir ketika setiap urutan sisipan telah digunakan untuk membentuk grup baru atau dapat dimasukkan ke dalam grup yang sudah ada. Bagaimanapun, sisipan yang dikelompokkan yang terdiri dari nukleotida akhirnya diterjemahkan menjadi urutan peptida (perpustakaan peptida). Hasil analisis ini adalah serangkaian sisipan dan frekuensi terkait yang membentuk jumlah pembacaan berurutan (Gambar Tambahan 2).
Pembuatan Motif: Berdasarkan daftar peptida unik, dibuatlah pustaka yang berisi semua kemungkinan pola asam amino (aa) seperti yang ditunjukkan di bawah ini. Setiap kemungkinan pola dengan panjang 3 diekstraksi dari peptida dan pola kebalikannya ditambahkan bersama dengan pustaka motif umum yang berisi semua pola (tripeptida). Pustaka motif yang sangat berulang diurutkan dan redundansi dihilangkan. Kemudian, untuk setiap tripeptida dalam pustaka motif, kami memeriksa keberadaannya di pustaka menggunakan perangkat komputasi. Dalam kasus ini, frekuensi peptida yang berisi tripeptida motif yang ditemukan ditambahkan dan ditetapkan ke motif dalam pustaka motif ("jumlah motif"). Hasil pembuatan motif adalah larik dua dimensi yang berisi semua kemunculan tripeptida (motif) dan nilai masing-masing, yang merupakan jumlah pembacaan sekuensing yang menghasilkan motif yang sesuai saat pembacaan difilter, dikelompokkan, dan diterjemahkan. Metrik seperti yang dijelaskan secara rinci di atas.
Normalisasi jumlah motif dan scatterplot yang sesuai: Jumlah motif untuk setiap sampel dinormalisasi menggunakan
di mana ni adalah jumlah bacaan yang mengandung topik i. Dengan demikian, vi merupakan persentase frekuensi bacaan (atau peptida) yang mengandung motif i dalam sampel. Nilai-P untuk jumlah motif yang tidak dinormalisasi dihitung menggunakan uji eksak Fisher. Mengenai korelogram jumlah motif, korelasi Spearman dihitung menggunakan jumlah motif yang dinormalisasi dengan R.
Untuk memvisualisasikan kandungan asam amino pada setiap posisi dalam pustaka peptida, logogram web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) dibuat. Pertama, kandungan asam amino pada setiap posisi peptida 12-mer disimpan dalam matriks 20x12. Kemudian, satu set 1000 peptida yang mengandung kandungan asam amino relatif yang sama pada setiap posisi dibuat dalam format fasta-sequence dan diberikan sebagai input ke logo-web 3, yang membuat representasi grafis dari kandungan asam amino relatif pada setiap posisi untuk pustaka peptida tertentu. Untuk memvisualisasikan kumpulan data multidimensi, peta panas dibuat menggunakan alat yang dikembangkan secara internal dalam R (biosHeatmap, paket R yang belum dirilis). Dendrogram yang disajikan dalam peta panas dihitung menggunakan metode pengelompokan hierarkis Ward dengan metrik jarak Euclidean. Untuk analisis statistik data penilaian motif, nilai P untuk penilaian yang tidak dinormalisasi dihitung menggunakan uji eksak Fisher. Nilai P untuk kumpulan data lainnya dihitung dalam R menggunakan uji t Student atau ANOVA.
Klon fag terpilih dan fag tanpa sisipan disuntikkan secara intravena melalui vena ekor (2×1010 fag/hewan dalam 300 μl PBS). Sepuluh menit sebelum perfusi dan fiksasi berikutnya, hewan yang sama disuntik secara intravena dengan 100 μl lektin berlabel DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 menit setelah injeksi fag, tikus diperfusi melalui jantung dengan 50 ml PBS diikuti oleh 50 ml 4% PFA/PBS. Sampel otak juga difiksasi semalaman dalam 4% PFA/PBS dan direndam dalam 30% sukrosa semalaman pada suhu 4°C. Sampel dibekukan dengan cepat dalam campuran OCT. Analisis imunohistokimia sampel beku dilakukan pada suhu kamar pada kriosiseksi 30 µm yang diblokir dengan 1% BSA dan diinkubasi dengan antibodi poliklonal berlabel FITC terhadap fag T7 (Novus NB 600-376A) pada suhu 4 °C. Inkubasi semalaman. Terakhir, irisan dicuci 3 kali dengan PBS dan diperiksa dengan mikroskop laser confocal (Leica TCS SP5).
Semua peptida dengan kemurnian minimal 98% disintesis oleh GenScript USA, dibiotinilasi, dan dikeringkan dalam suhu beku. Biotin diikat melalui pengatur jarak tiga glisin tambahan di N-terminus. Periksa semua peptida menggunakan spektrometri massa.
Streptavidin (Sigma S0677) dicampur dengan kelebihan ekimolar 5 kali lipat dari peptida terbiotinilasi, peptida penghambat BACE1 terbiotinilasi, atau kombinasi (rasio 3:1) peptida penghambat BACE1 terbiotinilasi dan peptida penghambat BACE1 dalam 5–10% DMSO/diinkubasi dalam PBS. 1 jam pada suhu ruangan sebelum injeksi. Peptida terkonjugasi streptavidin disuntikkan secara intravena dengan dosis 10 mg/kg ke salah satu vena ekor tikus dengan rongga otak.
Konsentrasi kompleks streptavidin-peptida dinilai dengan ELISA. Plat mikrotiter Nunc Maxisorp (Sigma) dilapisi semalaman pada suhu 4°C dengan antibodi anti-streptavidin tikus 1,5 μg/ml (Thermo, MA1-20011). Setelah pemblokiran (buffer pemblokiran: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatin, 1% BSA) pada suhu ruangan selama 2 jam, cuci plat dengan 0,05% Tween-20/PBS (buffer pencuci) selama 3 detik, sampel CSF dan plasma ditambahkan ke sumur yang diencerkan dengan buffer pemblokiran (plasma 1:10.000, CSF 1:115). Plat tersebut kemudian diinkubasi semalam pada suhu 4°C dengan antibodi deteksi (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Setelah tiga langkah pencucian, streptavidin dideteksi melalui inkubasi dalam larutan substrat TMB (Roche) hingga 20 menit. Setelah menghentikan perkembangan warna dengan 1M H2SO4, ukur absorbansi pada 450 nm.
Fungsi kompleks penghambat streptavidin-peptida-BACE1 dinilai dengan ELISA Aβ(1-40) menurut protokol pabrik pembuatnya (Wako, 294-64701). Secara singkat, sampel CSF diencerkan dalam pengencer standar (1:23) dan diinkubasi semalam pada suhu 4°C dalam pelat 96-sumur yang dilapisi dengan antibodi penangkap BNT77. Setelah lima langkah pencucian, antibodi BA27 terkonjugasi HRP ditambahkan dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu 4°C, diikuti oleh lima langkah pencucian. Aβ(1–40) dideteksi dengan inkubasi dalam larutan TMB selama 30 menit pada suhu ruangan. Setelah perkembangan warna dihentikan dengan larutan penghenti, ukur absorbansi pada 450 nm. Sampel plasma dikenakan ekstraksi fase padat sebelum ELISA Aβ(1–40). Plasma ditambahkan ke 0,2% DEA (Sigma) dalam pelat 96-well dan diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Setelah mencuci pelat SPE (Oasis, 186000679) secara berurutan dengan air dan 100% metanol, sampel plasma ditambahkan ke pelat SPE dan semua cairan dibuang. Sampel dicuci (pertama dengan 5% metanol kemudian 30% metanol) dan dielusi dengan 2% NH4OH/90% metanol. Setelah mengeringkan eluat pada suhu 55°C selama 99 menit pada arus N2 konstan, sampel direduksi dalam pengencer standar dan Aβ(1–40) diukur seperti dijelaskan di atas.
Cara mengutip artikel ini: Urich, E. et al. Pengiriman kargo ke otak menggunakan peptida transit yang diidentifikasi secara in vivo. sains. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB dan Moos T. Penghantaran obat makromolekul ke otak menggunakan terapi tertarget. Jurnal Neurokimia 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., dan Martinez-Martinez, P. Penghantaran obat peptida dan protein melewati sawar darah-otak. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Penghalang darah-otak: hambatan dalam pengembangan obat otak. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, dan Byrd, A. Prospek untuk peningkatan penghantaran obat dan penargetannya ke otak melalui jalur pleksus koroid-CSF. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisasi biofarmasi dengan kuda Troya molekuler untuk pengiriman ke otak. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM reseptor-dimediasi transportasi peptida melintasi penghalang darah-otak. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. dkk. Meningkatkan penetrasi otak dan kemanjuran antibodi terapeutik menggunakan transportasi molekuler monovalen. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. dkk. Pengangkutan reseptor transferin (TfR) menentukan penyerapan varian afinitas antibodi TfR oleh otak. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).