Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažuriranu verziju preglednika (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje karusel od tri slajda odjednom. Koristite dugmad Prethodno i Sljedeće za kretanje kroz tri slajda odjednom ili koristite klizače na kraju za kretanje kroz tri slajda odjednom.
Krvno-moždana barijera i krvno-moždana barijera sprječavaju bioterapeutske agense da dosegnu svoje ciljeve u centralnom nervnom sistemu, čime ometaju efikasno liječenje neuroloških bolesti. Kako bismo otkrili nove transportere u mozgu in vivo, uveli smo biblioteku T7 fagnih peptida i serijski prikupljali krv i cerebrospinalnu tečnost (CSF) koristeći kanilirani model velikog skupa pacova pri svijesti. Specifični fagni klonovi bili su visoko obogaćeni u CSF-u nakon četiri kruga selekcije. Testiranje pojedinačnih kandidatskih peptida otkrilo je više od 1000 puta veće obogaćenje u CSF-u. Bioaktivnost peptidom posredovane isporuke u mozak potvrđena je 40% smanjenjem nivoa amiloida-β u cerebrospinalnoj tečnosti korištenjem inhibitora peptida BACE1 povezanog s identificiranim novim tranzitnim peptidom. Ovi rezultati sugeriraju da peptidi identificirani in vivo metodama selekcije faga mogu biti korisna sredstva za sistemsku isporuku makromolekula u mozak s terapijskim učinkom.
Istraživanje terapije usmjerene na centralni nervni sistem (CNS) uglavnom se fokusiralo na identifikaciju optimiziranih lijekova i sredstava koja pokazuju svojstva usmjerena na CNS, s manje napora na otkrivanju mehanizama koji pokreću aktivnu isporuku lijekova u mozak. Ovo se sada počinje mijenjati jer je isporuka lijekova, posebno velikih molekula, sastavni dio modernog razvoja lijekova u neuroznanosti. Okruženje centralnog nervnog sistema dobro je zaštićeno cerebrovaskularnim barijernim sistemom, koji se sastoji od krvno-moždane barijere (KMB) i krvno-moždane barijere (KMB)1, što otežava isporuku lijekova u mozak1,2. Procjenjuje se da se gotovo svi lijekovi velikih molekula i više od 98% lijekova malih molekula eliminiraju iz mozga3. Zato je vrlo važno identificirati nove sisteme transporta u mozgu koji osiguravaju efikasnu i specifičnu isporuku terapijskih lijekova u CNS4,5. Međutim, KMB i KMBF također predstavljaju odličnu priliku za isporuku lijekova jer prodiru i ulaze u sve strukture mozga kroz njegovu opsežnu vaskulaturu. Stoga se trenutni napori za korištenje neinvazivnih metoda isporuke u mozak uglavnom zasnivaju na mehanizmu transporta posredovanog receptorima (PMT) korištenjem endogenog receptora BBB6. Uprkos nedavnom ključnom napretku u korištenju puta transferinskog receptora7,8, potreban je daljnji razvoj novih sistema isporuke s poboljšanim svojstvima. U tu svrhu, naš cilj je bio identificirati peptide sposobne za posredovanje transporta u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF), jer bi se oni u principu mogli koristiti za isporuku makromolekula u CNS ili za otvaranje novih puteva receptora. Posebno, specifični receptori i transporteri cerebrospinalnog sistema (BBB i BSCFB) mogu poslužiti kao potencijalne mete za aktivnu i specifičnu isporuku bioterapeutskih lijekova. Cerebrospinalna tečnost (CSF) je sekretorni produkt horoidnog pleksusa (KS) i u direktnom je kontaktu s intersticijskom tečnošću mozga kroz subarahnoidni prostor i ventrikularni prostor4. Nedavno je pokazano da subarahnoidna cerebrospinalna tečnost prekomjerno difundira u intersticij mozga9. Nadamo se da ćemo moći pristupiti parenhimskom prostoru koristeći ovaj subarahnoidni ulazni trakt ili direktno kroz KMB. Da bismo to postigli, implementirali smo robusnu in vivo strategiju selekcije faga koja idealno identificira peptide transportirane bilo kojim od ova dva različita puta.
Sada opisujemo metodu sekvencijalnog in vivo skrininga faga sa uzorkovanjem cerebrospinalne tečnosti (CSF) uparenim sa sekvenciranjem visokog protoka (HTS) kako bismo pratili početne runde selekcije sa najvećom raznolikošću biblioteka. Skrining je proveden na svjesnim pacovima sa trajno implantiranom kanilom velike cisterne (CM) kako bi se izbjegla kontaminacija krvi. Važno je da ovaj pristup odabire i peptide koji ciljaju mozak i peptide sa transportnom aktivnošću preko cerebrovaskularne barijere. Koristili smo T7 fage zbog njihove male veličine (~60 nm)10 i sugerirali da su pogodni za transport vezikula koje omogućavaju transcelularni prelazak endotelne i/ili epitelno-medularne barijere. Nakon četiri runde pretraživanja, izolovane su populacije faga koje pokazuju snažno in vivo obogaćivanje CSF-a i povezanost cerebralnih mikrovaskularnih sudova. Važno je da smo uspjeli potvrditi naše nalaze pokazujući da su preferirani i hemijski sintetizovani najbolji kandidati za peptide sposobni da transportuju proteinski teret u cerebrospinalnu tečnost. Prvo, farmakodinamički efekti CNS-a su utvrđeni kombinovanjem vodećeg tranzitnog peptida sa inhibitorom BACE1 peptida. Pored toga što pokazuje da in vivo strategije funkcionalnog skrininga mogu identificirati nove peptide za transport u mozgu kao efikasne nosače proteinskog tereta, očekujemo da će slični pristupi funkcionalnoj selekciji postati važni i u identificiranju novih puteva transporta u mozgu.
Na osnovu jedinica koje formiraju plak (PFU), nakon koraka pakovanja faga, dizajnirana je i kreirana biblioteka nasumičnih 12-mernih linearnih T7 fagnih peptida sa raznolikošću od približno 109 (vidi Materijali i metode). Važno je napomenuti da smo pažljivo analizirali ovu biblioteku prije in vivo panning analize. PCR amplifikacija uzoraka fagnih biblioteka korištenjem modificiranih prajmera generirala je amplikone koji su bili direktno primjenjivi na HTS (Dopunska slika 1a). Zbog a) grešaka u sekvenciranju HTS11, b) utjecaja na kvalitet prajmera (NNK)1-12 i c) prisustva faga divljeg tipa (wt) (skeletni umeci) u rezervnoj biblioteci, implementiran je postupak filtriranja sekvenci kako bi se izdvojile samo verificirane informacije o sekvenci (Dopunska slika 1b). Ovi koraci filtriranja primjenjuju se na sve HTS biblioteke sekvenciranja. Za standardnu ​​biblioteku dobijeno je ukupno 233.868 očitavanja, od kojih je 39% prošlo kriterije filtera i korišteno je za analizu i selekciju biblioteke za naredne runde (Dopunska slika 1c-e). Očitavanja su pretežno bila višekratnici 3 bazna para dužine s vrhom na 36 nukleotida (Dopunska slika 1c), što potvrđuje dizajn biblioteke (NNK) 1-12. Značajno je da je približno 11% članova biblioteke sadržavalo 12-dimenzionalni insert PAGISRELVDKL divljeg tipa (wt), a gotovo polovina sekvenci (49%) sadržavala je insercije ili delecije. HTS biblioteke potvrdio je visoku raznolikost peptida u biblioteci: više od 81% peptidnih sekvenci pronađeno je samo jednom, a samo 1,5% se pojavilo u ≥4 kopije (Dopunska slika 2a). Frekvencije aminokiselina (aa) na svih 12 pozicija u repertoaru dobro su se korelirale s frekvencijama koje se očekuju za broj kodona generiranih degeneriranim NKK repertoarom (Dopunska slika 2b). Uočena frekvencija aa ostataka kodiranih ovim insertima dobro se korelirala s izračunatom frekvencijom (r = 0,893) (Dopunska slika 2c). Priprema fagnih biblioteka za injekciju uključuje korake amplifikacije i uklanjanja endotoksina. Prethodno je pokazano da ovo potencijalno smanjuje raznolikost fagnih biblioteka12,13. Stoga smo sekvencirali fagnu biblioteku amplificiranu na ploči koja je prošla kroz uklanjanje endotoksina i uporedili je s originalnom bibliotekom kako bismo procijenili učestalost aminokiselina (AA). Uočena je jaka korelacija (r = 0,995) između originalnog skupa i amplificiranog i pročišćenog skupa (Dopunska slika 2d), što ukazuje da konkurencija između klonova amplificiranih na pločama korištenjem T7 faga nije uzrokovala veliku pristranost. Ovo poređenje se zasniva na učestalosti tripeptidnih motiva u svakoj biblioteci, budući da se raznolikost biblioteka (~109) ne može u potpunosti uhvatiti čak ni sa HTS-om. Analiza učestalosti aminokiselina na svakoj poziciji otkrila je malu pristranost zavisnu od pozicije u posljednje tri pozicije unesenog repertoara (Dopunska slika 2e). Zaključno, zaključili smo da su kvalitet i raznolikost biblioteke prihvatljivi i da su uočene samo manje promjene u raznolikosti zbog amplifikacije i pripreme fagnih biblioteka između nekoliko rundi selekcije.
Serijsko uzorkovanje cerebrospinalne tečnosti može se izvršiti hirurškim ugradnjom kanile u koljeno svjesnih pacova kako bi se olakšala identifikacija T7 faga ubrizganog intravenozno (iv) putem KMB i/ili BCSFB (Sl. 1a-b). U prva tri kruga in vivo selekcije koristili smo dva nezavisna kraka selekcije (krakovi A i B) (Sl. 1c). Postepeno smo povećavali stringentnost selekcije smanjenjem ukupne količine faga uvedenog u prva tri kruga selekcije. Za četvrti krug pretraživanja, kombinovali smo uzorke iz grana A i B i izvršili tri dodatne nezavisne selekcije. Da bismo proučili in vivo svojstva čestica T7 faga u ovom modelu, fag divljeg tipa (PAGISRELVDKL glavni umetak) je ubrizgan pacovima putem repne vene. Oporavak faga iz cerebrospinalne tečnosti i krvi u različitim vremenskim tačkama pokazao je da relativno mali T7 ikosaedarski fagi imaju brzu početnu fazu čišćenja iz krvnog odjeljka (Dopunska slika 3). Na osnovu primijenjenih titara i volumena krvi pacova, izračunali smo da je samo približno 1% težinski faga iz primijenjene doze detektovano u krvi 10 minuta nakon intravenske injekcije. Nakon ovog početnog brzog pada, izmjeren je sporiji primarni klirens sa poluživotom od 27,7 minuta. Važno je napomenuti da je samo vrlo malo faga dobijeno iz cerebrospinalne tečnosti, što ukazuje na nisku pozadinu za migraciju faga divljeg tipa u cerebrospinalnu tečnost (Dodatna slika 3). U prosjeku, samo oko 1 x 10-3% titra T7 faga u krvi i 4 x 10-8% inicijalno infuziranih faga detektovano je u cerebrospinalnoj tečnosti tokom cijelog perioda uzorkovanja (0-250 min). Značajno je da je poluživot (25,7 min) faga divljeg tipa u cerebrospinalnoj tečnosti bio sličan onome uočenom u krvi. Ovi podaci pokazuju da je barijera koja odvaja odjeljak cerebrospinalne tečnosti od krvi netaknuta kod pacova kojima je kanilirana kongenitalna membrana (CM), što omogućava in vivo selekciju fagnih biblioteka za identifikaciju klonova koji se lako transportuju iz krvi u odjeljak cerebrospinalne tečnosti.
(a) Postavljanje metode za ponovno uzorkovanje cerebrospinalne tečnosti (CSF) iz velikog skupa. (b) Dijagram koji prikazuje ćelijsku lokaciju barijere centralnog nervnog sistema (CNS) i strategiju selekcije koja se koristi za identifikaciju peptida koji prelaze krvno-moždanu barijeru (KMB) ​​i krvno-moždanu barijeru. (c) Dijagram toka skrininga fagnim prikazom in vivo. U svakom krugu selekcije, fagi (identifikatori životinja unutar strelica) su injektirani intravenozno. Dvije nezavisne alternativne grane (A, B) čuvaju se odvojeno do 4. kruga selekcije. Za krugove selekcije 3 i 4, svaki klon faga ekstrahovan iz CSF je ručno sekvenciran. (d) Kinetika faga izolovanog iz krvi (crveni krugovi) i cerebrospinalne tečnosti (zeleni trouglovi) tokom prvog kruga selekcije kod dva kanilirana pacova nakon intravenske injekcije biblioteke T7 peptida (2 x 1012 faga/životinji). Plavi kvadrati označavaju prosječnu početnu koncentraciju faga u krvi, izračunatu iz količine injektiranog faga, uzimajući u obzir ukupni volumen krvi. Crni kvadrati označavaju tačku presjeka y linije ekstrapolirane iz koncentracija faga u krvi. (e,f) Predstavljaju relativnu učestalost i distribuciju svih mogućih preklapajućih tripeptidnih motiva pronađenih u peptidu. Prikazan je broj motiva pronađenih u 1000 očitanja. Značajno (p < 0,001) obogaćeni motivi označeni su crvenim tačkama. (e) Dijagram raspršenja korelacije koji poredi relativnu učestalost tripeptidnog motiva injektirane biblioteke sa fagom izvedenim iz krvi životinja #1.1 i #1.2. (f) Dijagram raspršenja korelacije koji poredi relativne učestalosti tripeptidnih motiva životinjskih faga #1.1 i #1.2 izolovanih u krvi i cerebrospinalnoj tečnosti. (g, h) Prikaz sekvencijalnog ID-a faga obogaćenog u krvi (g) u odnosu na injektirane biblioteke i faga obogaćenog u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) (h) u odnosu na krv nakon runde in vivo selekcije kod obje životinje. Veličina jednoslovnog koda označava koliko često se ta aminokiselina pojavljuje na toj poziciji. Zelena = polarna, ljubičasta = neutralna, plava = bazna, crvena = kisela i crna = hidrofobne aminokiseline. Sliku 1a, b dizajnirao je i izradio Eduard Urich.
Ubrizgali smo biblioteku fagnih peptida u dva pacova s ​​CM instrumentom (kladovi A i B) i izolovali fag iz cerebrospinalne tečnosti i krvi (Slika 1d). Početno brzo uklanjanje biblioteke bilo je manje izraženo u poređenju sa fagom divljeg tipa. Srednje vrijeme poluraspada ubrizgane biblioteke kod obje životinje bilo je 24,8 minuta u krvi, slično fagu divljeg tipa, i 38,5 minuta u cerebrospinalnoj tečnosti. Uzorci faga krvi i cerebrospinalne tečnosti od svake životinje podvrgnuti su HTS-u i svi identifikovani peptidi su analizirani na prisustvo kratkog tripeptidnog motiva. Tripeptidni motivi su odabrani jer pružaju minimalnu osnovu za formiranje strukture i interakcije peptid-protein14,15. Pronašli smo dobru korelaciju u distribuciji motiva između ubrizgane biblioteke faga i klonova ekstrahovanih iz krvi obje životinje (Slika 1e). Podaci ukazuju na to da je sastav biblioteke samo marginalno obogaćen u krvnom odjeljku. Frekvencije aminokiselina i konsenzusne sekvence su dalje analizirane na svakoj poziciji korištenjem adaptacije Weblogo16 softvera. Zanimljivo je da smo pronašli snažno obogaćenje ostacima glicina u krvi (Slika 1g). Kada je krv upoređena s klonovima odabranim iz cerebrospinalne tečnosti (CSF), uočena je jaka selekcija i određena deselekcija motiva (Slika 1f), a određene aminokiseline su bile preferencijalno prisutne na unaprijed određenim pozicijama u 12-članom sistemu (Slika 1h). Primjetno je da su se pojedinačne životinje značajno razlikovale u cerebrospinalnoj tečnosti, dok je obogaćenje glicinom u krvi uočeno kod obje životinje (Dopunska slika 4a-j). Nakon strogog filtriranja podataka o sekvenci u cerebrospinalnoj tečnosti životinja #1.1 i #1.2, dobijeno je ukupno 964 i 420 jedinstvenih 12-mernih peptida (Dopunska slika 1d-e). Izolovani fagni klonovi su amplifikovani i podvrgnuti drugom krugu in vivo selekcije. Fagi ekstrahovani iz drugog kruga selekcije podvrgnuti su HTS-u u svakoj životinji i svi identifikovani peptidi su korišteni kao ulaz u program prepoznavanja motiva za analizu pojave tripeptidnih motiva (Slika 2a, b, ef). U poređenju sa prvim ciklusom faga dobijenog iz CSF-a, uočili smo dalju selekciju i deselekciju mnogih motiva u CSF-u u granama A i B (Slika 2). Primijenjen je algoritam za identifikaciju mreže kako bi se utvrdilo da li predstavljaju različite obrasce konzistentne sekvence. Uočena je jasna sličnost između 12-dimenzionalnih sekvenci dobijenih CSF-om u alternativnoj kladi A (Slika 2c, d) i kladi B (Slika 2g, h). Združena analiza u svakoj grani otkrila je različite profile selekcije za 12-merne peptide (Dopunska slika 5c, d) i povećanje odnosa titra CSF/krv tokom vremena za združene klonove nakon drugog kruga selekcije u poređenju sa prvim krugom selekcije (Dopunska slika 5e).
Obogaćivanje motiva i peptida u cerebrospinalnoj tekućini pomoću dva uzastopna kruga in vivo selekcije funkcionalnog prikaza faga.
Svi fagi cerebrospinalne tečnosti dobijeni iz prvog kruga svake životinje (životinje #1.1 i #1.2) su objedinjeni, amplifikovani, HT-sekvencirani i ponovo injektirani zajedno (2 x 1010 faga/životinji) 2 SM kanilirana pacova (#1.1 → #). 2.1 i 2.2, 1.2 → 2.3 i 2.4). (a,b,e,f) Dijagrami raspršenja korelacije koji porede relativnu učestalost tripeptidnih motiva svih faga izvedenih iz cerebrospinalne tečnosti u prvom i drugom krugu selekcije. Relativna učestalost i distribucija motiva koji predstavljaju sve moguće preklapajuće tripeptide pronađene u peptidima u obje orijentacije. Prikazan je broj motiva pronađenih u 1000 očitanja. Motivi koji su značajno (p < 0,001) odabrani ili isključeni u jednoj od upoređenih biblioteka su označeni crvenim tačkama. (c, d, g, h) Logo sekvence predstavlja sve sekvence bogate CSF-om, dužine 12 aminokiselina, na osnovu rundi 2 i 1 in vivo selekcije. Veličina jednoslovnog koda označava koliko često se ta aminokiselina pojavljuje na toj poziciji. Da bi se predstavio logo, upoređuje se učestalost CSF sekvenci ekstrahovanih iz pojedinačnih životinja između dvije runde selekcije, a prikazane su obogaćene sekvence u drugoj rundi: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 i (h) #1.2–#2.4. Najobogaćenije aminokiseline na datoj poziciji kod (c, d) životinja br. 2.1 i br. 2.2 ili (g, h) kod životinja br. 2.3 i br. 2.4 prikazane su u boji. Zelena = polarna, ljubičasta = neutralna, plava = bazna, crvena = kisela i crna = hidrofobne aminokiseline.
Nakon trećeg kruga selekcije, identificirali smo 124 jedinstvene peptidne sekvence (#3.1 i #3.2) iz 332 klona faga rekonstituiranih iz CSF-a, izoliranih iz dvije životinje (Dopunska slika 6a). Sekvenca LGSVS (18,7%) imala je najveći relativni udio, a slijede je umeci divljeg tipa PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) i SARGSWREIVSLS (2,2%). U posljednjem, četvrtom krugu, objedinili smo dvije nezavisno odabrane grane iz tri odvojene životinje (Slika 1c). Od 925 sekvenciranih klonova faga dobivenih iz CSF-a, u četvrtom krugu pronašli smo 64 jedinstvene peptidne sekvence (Dopunska slika 6b), među kojima je relativni udio faga divljeg tipa pao na 0,8%. Najčešći CSF klonovi u četvrtom krugu bili su LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) i RLSSVDSDLSGC (3,2%). Raspon dužine odabranih peptida posljedica je insercija/delecija nukleotida ili prijevremenih stop kodona u prajmerima biblioteke pri korištenju degeneriranih kodona za dizajn NNK biblioteke. Prijevremeni stop kodoni generiraju kraće peptide i odabrani su jer sadrže povoljan aminokiselinski motiv. Duži peptidi mogu nastati insercija/delecija u prajmerima sintetičkih biblioteka. Ovo pozicionira dizajnirani stop kodon izvan okvira i čita ga dok se nizvodno ne pojavi novi stop kodon. Općenito, izračunali smo faktore obogaćivanja za sva četiri kruga selekcije upoređujući ulazne podatke s izlaznim podacima uzorka. Za prvi krug skrininga koristili smo titre faga divljeg tipa kao nespecifične pozadinske reference. Zanimljivo je da je negativna selekcija faga bila vrlo jaka u prvom ciklusu CSF-a, ali ne i u krvi (Sl. 3a), što može biti posljedica male vjerovatnoće pasivne difuzije većine članova peptidne biblioteke u odjeljak CSF-a ili da se relativni fagi efikasnije zadržavaju ili uklanjaju iz krvotoka nego bakteriofagi. Međutim, u drugom krugu panninga, uočena je jaka selekcija faga u CSF-u u obje klade, što sugerira da je prethodni krug bio obogaćen fagima koji prikazuju peptide koji promoviraju unos CSF-a (Sl. 3a). Opet, bez značajnog obogaćivanja krvi. Također, u trećem i četvrtom krugu, klonovi faga su bili značajno obogaćeni u CSF-u. Upoređujući relativnu učestalost svake jedinstvene peptidne sekvence između posljednja dva kruga selekcije, otkrili smo da su sekvence bile još obogaćenije u četvrtom krugu selekcije (Sl. 3b). Ukupno 931 tripeptidni motiv je ekstrahovan iz svih 64 jedinstvene peptidne sekvence korištenjem obje peptidne orijentacije. Najobogaćeniji motivi u četvrtom krugu su pažljivije ispitani s obzirom na njihove profile obogaćenja u svim krugovima u poređenju sa ubrizganom bibliotekom (granica: 10% obogaćenja) (Dopunska slika 6c). Opći obrasci selekcije pokazali su da je većina proučavanih motiva obogaćena u svim prethodnim krugovima obje grane selekcije. Međutim, neki motivi (npr. SGL, VSG, LGS GSV) su pretežno bili iz alternativne klade A, dok su drugi (npr. FGW, RTN, WGF, NTR) bili obogaćeni u alternativnoj kladi B.
Validacija transporta peptida prikazanih fagom, obogaćenih cerebrospinalnom tečnošću, i biotiniliranih vodećih peptida konjugiranih sa streptavidinskim sadržajem, u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF).
(a) Omjeri obogaćivanja izračunati u sva četiri kruga (R1-R4) na osnovu titara injektiranih (ulaz = I) faga (PFU) i određenih titara faga u cerebrospinalnoj tečnosti (izlaz = O). Faktori obogaćivanja za posljednja tri kruga (R2-R4) izračunati su poređenjem s prethodnim krugom i prvim krugom (R1) s podacima o težini. Otvoreni stupci predstavljaju cerebrospinalnu tekućinu, zasjenjeni stupci predstavljaju plazmu. (***p<0,001, na osnovu Studentovog t-testa). (b) Popis najzastupljenijih fagnih peptida, rangiranih prema njihovom relativnom udjelu u svim fagima prikupljenim u cerebrospinalnoj tečnosti nakon 4. kruga selekcije. Šest najčešćih fagnih klonova istaknuto je bojom, numerirano, a njihovi faktori obogaćivanja između 3. i 4. kruga selekcije (umetci). (c,d) Šest najobogaćenijih fagnih klonova, prazni fagi i roditeljske biblioteke fagnih peptida iz 4. kruga analizirani su pojedinačno u modelu uzorkovanja cerebrospinalne tečnosti. Uzorci cerebrospinalne tečnosti i krvi prikupljeni su u naznačenim vremenskim tačkama. (c) Jednake količine 6 kandidatskih fagnih klonova (2 x 1010 faga/životinja), praznih faga (#1779) (2 x 1010 faga/životinja) i osnovnih biblioteka fagnih peptida (2 x 1012 faga/životinja). Ubrizgati najmanje 3 CM se primjenjuje kaniliranoj životinji odvojeno putem repne vene. Prikazana je farmakokinetika cerebrospinalne tečnosti (CSF) svakog ubrizganog fagnog klona i biblioteke fagnih peptida tokom vremena. (d) prikazuje prosječan odnos CSF/krv za sve oporavljene fage/mL tokom vremena uzorkovanja. (e) Četiri sintetička vodeća peptida i jedan pomiješani kontrolni peptid povezani su biotinom sa streptavidinom preko njihovog N-terminusa (tetramerni prikaz) nakon čega slijedi injekcija (iv repna vena, 10 mg streptavidina/kg). Najmanje tri intubirana pacova (N = 3). Uzorci cerebrospinalne tečnosti (CSF) su prikupljeni u naznačenim vremenskim tačkama, a koncentracije streptavidina su izmjerene CSF anti-streptavidin ELISA testom (nd = nije detektovano). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, na osnovu ANOVA testa). (f) Poređenje aminokiselinske sekvence najobogaćenijeg klona fagnog peptida #2002 (ljubičasta) sa drugim odabranim klonovima fagnog peptida iz 4. runde selekcije. Identični i slični fragmenti aminokiselina su označeni bojama.
Od svih obogaćenih faga u četvrtom krugu (slika 3b), šest kandidatskih klonova je odabrano za daljnju pojedinačnu analizu u modelu uzorkovanja cerebrospinalne tekućine (CSF). Jednake količine biblioteka od šest kandidatskih faga, praznih faga (bez umetka) i profagnih peptida injektirane su u tri kanilirane CM životinje, a farmakokinetika je određena u testovima CSF (slika 3c) i krvi (dodatna slika 7). Svi testirani fagni klonovi ciljali su odjeljak CSF na nivou 10-1000 puta većem od onog kod praznog kontrolnog faga (#1779). Na primjer, klonovi #2020 i #2077 imali su oko 1000 puta veće titre u CSF od kontrolnog faga. Farmakokinetički profil svakog odabranog peptida je različit, ali svi oni imaju visoku sposobnost navođenja u CSF. Za klonove #1903 i #2011 primijetili smo konstantan pad tokom vremena, dok je za klonove #2077, #2002 i #2009 porast tokom prvih 10 minuta mogao ukazivati ​​na aktivni transport, ali to je potrebno provjeriti. Klonovi #2020, #2002 i #2077 stabilizirali su se na visokim nivoima, dok se koncentracija u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) klona #2009 polako smanjivala nakon početnog povećanja. Zatim smo uporedili relativnu učestalost svakog kandidata u CSF s njegovom koncentracijom u krvi (Sl. 3d). Korelacija srednjeg titra svakog kandidata u CSF s njegovim titrom u krvi u svim vremenima uzorkovanja pokazala je da su tri od šest kandidata značajno obogaćena u CSF krvi. Zanimljivo je da je klon #2077 pokazao veću stabilnost u krvi (Dodatna slika 7). Kako bismo potvrdili da su sami peptidi sposobni aktivno transportovati teret osim fagnih čestica u CSF odjeljak, sintetizirali smo četiri vodeća peptida derivatizirana biotinom na N-terminusu gdje se peptidi vežu za fagnu česticu. Biotinilirani peptidi (br. 2002, 2009, 2020 i 2077) su konjugirani sa streptavidinom (SA) kako bi se dobili multimerni oblici koji donekle oponašaju geometriju faga. Ovaj format nam je također omogućio mjerenje izloženosti SA u krvi i cerebrospinalnoj tekućini kao proteinskih peptida koji transportiraju teret. Važno je napomenuti da su se podaci o fagima često mogli reproducirati kada su sintetički peptidi primijenjeni u ovom SA-konjugovanom formatu (slika 3e). Pomiješani peptidi imali su manju početnu izloženost i brže uklanjanje iz cerebrospinalne tekućine s nedetektabilnim nivoima unutar 48 sati. Kako bismo stekli uvid u puteve isporuke ovih peptidnih fagnih klonova u cerebrospinalnu tekućinu, analizirali smo lokalizaciju pojedinačnih pogodaka fagnih peptida koristeći imunohistokemiju (IHC) kako bismo direktno detektirali čestice faga 1 sat nakon intravenske injekcije in vivo. Značajno je da su klonovi #2002, #2077 i #2009 mogli biti detektovani jakim bojenjem u moždanim kapilarama, dok kontrolni fag (#1779) i klon #2020 nisu detektovani (Dodatna slika 8). Ovo ukazuje na to da ovi peptidi doprinose efektu na mozak upravo prelaskom kroz KMB. Potrebna je daljnja detaljna analiza kako bi se testirala ova hipoteza, jer bi i BSCFB ruta mogla biti uključena. Prilikom poređenja aminokiselinske sekvence najobogaćenijeg klona (#2002) sa drugim odabranim peptidima, uočeno je da neki od njih imaju slične aminokiselinske ekstenzije, što može ukazivati ​​na sličan mehanizam transporta (Slika 3f).
Zbog svog jedinstvenog profila u plazmi i značajnog povećanja cerebrospinalne tečnosti tokom vremena, klon fagnog displeja #2077 je dalje istraživan tokom dužeg perioda od 48 sati i bio je u stanju da reprodukuje brzi porast cerebrospinalne tečnosti uočen u vezi sa održanim nivoima SA (Slika 4a). Što se tiče drugih identifikovanih fagnih klonova, #2077 se snažno obojio za moždane kapilare i pokazao značajnu kolokalizaciju sa kapilarnim markerom lektinom kada se posmatra u većoj rezoluciji i moguće neko bojenje u parenhimalnom prostoru (Slika 4b). Da bismo istražili da li se farmakološki efekti posredovani peptidima mogu postići u CNS-u, izveli smo eksperiment u kojem su biotinilirane verzije i) tranzitnog peptida #2077 i ii) peptida inhibitora BACE1 pomiješane sa SA u dva različita omjera. Za jednu kombinaciju koristili smo samo inhibitor peptida BACE1, a za drugu smo koristili omjer 1:3 inhibitora peptida BACE1 i peptida #2077. Oba uzorka su primijenjena intravenozno, a nivoi beta-amiloidnog peptida 40 (Abeta40) u krvi i cerebrospinalnoj tečnosti su mjereni tokom vremena. Abeta40 je mjeren u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) jer odražava inhibiciju BACE1 u moždanom parenhimu. Kao što se i očekivalo, oba kompleksa su značajno smanjila nivoe Abeta40 u krvi (Sl. 4c, d). Međutim, samo uzorci koji sadrže mješavinu peptida br. 2077 i inhibitora peptida BACE1 konjugiranog sa SA uzrokovali su značajno smanjenje Abeta40 u cerebrospinalnoj tečnosti (Sl. 4c). Podaci pokazuju da je peptid br. 2077 sposoban da transportuje protein SA od 60 kDa u CNS, a također indukuje farmakološke efekte sa inhibitorima peptida BACE1 konjugiranim sa SA.
(a) Klonalna injekcija (2 × 10 faga/životinji) faga T7 koja prikazuje dugoročne farmakokinetičke profile CSF peptida #2077 (RLSSVDSDLSGC) i neinjektiranog kontrolnog faga (#1779) kod najmanje tri CM-intubirana pacova. (b) Konfokalna mikroskopska slika reprezentativnih kortikalnih mikrovaskularnih sudova kod pacova kojima su injektirani fagi (2 × 10 10 faga/životinji) koja prikazuje kontrastno bojenje peptida #2077 i krvnih sudova (lektin). Ovi fagni klonovi su dani 3 pacova i ostavljeni su da cirkulišu 1 sat prije perfuzije. Mozgovi su secirani i obojeni poliklonskim FITC-obilježenim antitijelima protiv kapside faga T7. Deset minuta prije perfuzije i naknadne fiksacije, lektin obilježen sa DyLight594 je davan intravenozno. Fluorescentne slike koje prikazuju bojenje lektinom (crveno) luminalne strane mikrovaskularnih sudova i faga (zeleno) u lumenu kapilara i perivaskularnom moždanom tkivu. Mjerna traka odgovara 10 µm. (c, d) Biotinilirani BACE1 inhibitorni peptid, sam ili u kombinaciji s biotiniliranim tranzitnim peptidom #2077, spojen je sa streptavidinom, nakon čega je uslijedila intravenska injekcija najmanje tri kanilirana CM pacova (10 mg streptavidina/kg). Smanjenje Aβ40 posredovano inhibitorom BACE1 peptida mjereno je Aβ1-40 ELISA testom u krvi (crveno) i cerebrospinalnoj tekućini (narandžasto) u naznačenim vremenskim tačkama. Radi bolje jasnoće, isprekidana linija je nacrtana na grafiku u skali od 100%. (c) Procenat smanjenja Aβ40 u krvi (crveni trouglovi) i cerebrospinalnoj tekućini (narandžasti trouglovi) kod pacova tretiranih streptavidinom konjugiranim s tranzitnim peptidom #2077 i BACE1 inhibitornim peptidom u omjeru 3:1. (d) Procenat smanjenja Aβ40 u krvi (crveni krugovi) i cerebrospinalnoj tekućini (narandžasti krugovi) kod pacova tretiranih streptavidinom spojenim samo s BACE1 inhibitornim peptidom. Koncentracija Aβ u kontrolnoj grupi bila je 420 pg/ml (standardna devijacija = 101 pg/ml).
Fagni prikaz uspješno je primijenjen u nekoliko područja biomedicinskih istraživanja17. Ova metoda je korištena za in vivo studije vaskularne raznolikosti18,19, kao i za studije usmjerene na moždane sudove20,21,22,23,24,25,26. U ovoj studiji proširili smo primjenu ove metode selekcije ne samo na direktnu identifikaciju peptida koji ciljaju moždane sudove, već i na otkrivanje kandidata sa svojstvima aktivnog transporta za prelazak krvno-moždane barijere. Sada opisujemo razvoj in vivo postupka selekcije kod intubiranih pacova sa CM i demonstriramo njegov potencijal za identifikaciju peptida sa svojstvima vraćanja u cerebrospinalnu tečnost (CSF). Koristeći T7 fag koji prikazuje biblioteku 12-mernih nasumičnih peptida, uspjeli smo pokazati da je T7 fag dovoljno mali (približno 60 nm u promjeru)10 da se prilagodi krvno-moždanoj barijeri, čime direktno prelazi krvno-moždanu barijeru ili horoidni pleksus. Primijetili smo da je uzimanje CSF-a iz kaniliranih CM pacova dobro kontrolirana in vivo funkcionalna metoda skrininga, te da se ekstrahirani fag ne samo vezao za vaskulaturu, već je i funkcionirao kao transporter preko krvno-moždane barijere. Nadalje, istovremenim prikupljanjem krvi i primjenom HTS-a na CSF i fage izvedene iz krvi, potvrdili smo da naš izbor CSF-a nije bio pod utjecajem obogaćivanja krvi ili pogodnosti za širenje između rundi selekcije. Međutim, odjeljak krvi je dio postupka selekcije, budući da fagi sposobni dosegnuti odjeljak CSF-a moraju preživjeti i cirkulirati u krvotoku dovoljno dugo da se obogate u mozgu. Kako bismo izvukli pouzdane informacije o sekvenciranju iz sirovih HTS podataka, implementirali smo filtere prilagođene greškama sekvenciranja specifičnim za platformu u tijeku analize. Uključivanjem kinetičkih parametara u metodu skrininga, potvrdili smo brzu farmakokinetiku faga divljeg tipa T7 (t½ ~ 28 min) u krvi24, 27, 28, a također smo odredili njihov poluživot u cerebrospinalnoj tekućini (t½ ~ 26 min) u minuti). Uprkos sličnim farmakokinetičkim profilima u krvi i cerebrospinalnoj tečnosti (CSF), samo 0,001% koncentracije faga u krvi moglo se detektovati u CSF-u, što ukazuje na nisku pozadinsku mobilnost faga divljeg tipa T7 preko krvno-moždane barijere. Ovaj rad naglašava važnost prvog kruga selekcije pri korištenju in vivo strategija panninga, posebno za fagne sisteme koji se brzo uklanjaju iz cirkulacije, jer malo klonova može doći do odjeljka CNS-a. Stoga je u prvom krugu smanjenje raznolikosti biblioteke bilo vrlo veliko, jer je u ovom vrlo strogom CSF modelu na kraju prikupljen samo ograničen broj klonova. Ova in vivo strategija panninga uključivala je nekoliko koraka selekcije kao što su aktivna akumulacija u odjeljku CSF-a, preživljavanje klonova u odjeljku krvi i brzo uklanjanje klonova T7 faga iz krvi u prvih 10 minuta (slika 1d i dodatna slika 4M). Dakle, nakon prvog kruga, različiti klonovi faga identificirani su u CSF-u, iako je isti početni skup korišten za pojedinačne životinje. Ovo sugerira da višestruki strogi koraci selekcije za izvorne biblioteke s velikim brojem članova biblioteke rezultiraju značajnim smanjenjem raznolikosti. Stoga će slučajni događaji postati sastavni dio početnog procesa selekcije, uveliko utičući na rezultat. Vjerovatno je da su mnogi klonovi u originalnoj biblioteci imali vrlo sličnu sklonost obogaćivanju CSF-a. Međutim, čak i pod istim eksperimentalnim uslovima, rezultati selekcije mogu se razlikovati zbog malog broja svakog pojedinog klona u početnom skupu.
Motivi obogaćeni u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) razlikuju se od onih u krvi. Zanimljivo je da smo primijetili prvo pomjeranje prema peptidima bogatim glicinom u krvi pojedinačnih životinja (Slika 1g, Dopunske slike 4e, 4f). Fagi koji sadrže glicinske peptide mogu biti stabilniji i manja je vjerovatnoća da će biti izbačeni iz cirkulacije. Međutim, ovi peptidi bogati glicinom nisu detektovani u uzorcima cerebrospinalne tečnosti, što ukazuje na to da su kurirane biblioteke prošle kroz dva različita koraka selekcije: jedan u krvi, a drugi kojem je dozvoljeno da se akumulira u cerebrospinalnoj tečnosti. Klonovi obogaćeni CSF-om, koji su rezultat četvrtog kruga selekcije, opsežno su testirani. Potvrđeno je da su gotovo svi pojedinačno testirani klonovi obogaćeni CSF-om u poređenju sa fagom u praznoj kontroli. Jedan pogodak peptida (#2077) je detaljnije ispitan. Pokazao je duži poluživot u plazmi u poređenju s drugim pogodcima (Slika 3d i Dopunska slika 7), i zanimljivo je da je ovaj peptid sadržavao ostatak cisteina na C-terminusu. Nedavno je pokazano da dodavanje cisteina peptidima može poboljšati njihova farmakokinetička svojstva vezivanjem za albumin 29. Ovo je trenutno nepoznato za peptid #2077 i zahtijeva daljnja istraživanja. Neki peptidi pokazali su valentnu zavisnost u obogaćivanju cerebrospinalne tečnosti (podaci nisu prikazani), što može biti povezano s prikazanom površinskom geometrijom T7 kapside. T7 sistem koji smo koristili pokazao je 5-15 kopija svakog peptida po čestici faga. IHC je proveden na kandidatskim vodećim klonovima faga ubrizganim intravenozno u moždanu koru pacova (Dopunska slika 8). Podaci su pokazali da su najmanje tri klona (br. 2002, br. 2009 i br. 2077) interagovala sa krvno-možganskom barijerom (KMB). Ostaje utvrditi da li ova interakcija KMB rezultira akumulacijom KMB ili kretanjem ovih klonova direktno u BCSFB. Važno je napomenuti da pokazujemo da odabrani peptidi zadržavaju svoj kapacitet transporta u KMB kada se sintetiziraju i vežu za proteinski teret. Vezivanje N-terminalnih biotiniliranih peptida za SA u suštini ponavlja rezultate dobijene sa njihovim odgovarajućim fagnim klonovima u krvi i cerebrospinalnoj tečnosti (Sl. 3e). Konačno, pokazujemo da je vodeći peptid #2077 sposoban da promovisanje djelovanja biotiniliranog peptidnog inhibitora BACE1 konjugiranog sa SA na mozak, uzrokujući izražene farmakodinamičke efekte u CNS-u značajnim smanjenjem nivoa Abeta40 u CSF-u (Sl. 4). Nismo bili u mogućnosti da identifikujemo nijedan homolog u bazi podataka pretragom homologije peptidne sekvence svih pogodaka. Važno je napomenuti da je veličina T7 biblioteke približno 109, dok je teorijska veličina biblioteke za 12-mere 4 x 1015. Stoga smo odabrali samo mali dio prostora raznolikosti 12-merne peptidne biblioteke, što može značiti da se optimizovaniji peptidi mogu identifikovati evaluacijom susjednog prostora sekvenci ovih identifikovanih pogodaka. Hipotetički, jedan od razloga zašto nismo pronašli prirodne homologe ovih peptida može biti deselekcija tokom evolucije kako bi se spriječio nekontrolirani ulazak određenih peptidnih motiva u mozak.
Uzeti zajedno, naši rezultati pružaju osnovu za budući rad na detaljnijoj identifikaciji i karakterizaciji transportnih sistema cerebrovaskularne barijere in vivo. Osnovna postavka ove metode zasniva se na strategiji funkcionalne selekcije koja ne samo da identificira klonove sa svojstvima vezivanja za cerebralne sudove, već uključuje i kritični korak u kojem uspješni klonovi imaju intrinzičnu aktivnost za prelazak bioloških barijera in vivo u CNS odjeljak. Cilj je razjasniti mehanizam transporta ovih peptida i njihovu sklonost vezivanju za mikrovaskulaturo specifičnu za regiju mozga. To može dovesti do otkrića novih puteva za transport KMB i receptora. Očekujemo da se identifikovani peptidi mogu direktno vezati za cerebrovaskularne receptore ili za cirkulirajuće ligande koji se transportuju kroz KMB ili BCSFB. Peptidni vektori sa aktivnošću transporta u CSF otkriveni u ovom radu bit će dalje istraženi. Trenutno istražujemo specifičnost ovih peptida za mozak zbog njihove sposobnosti da pređu KMB i/ili BCSFB. Ovi novi peptidi bit će izuzetno vrijedni alati za potencijalno otkrivanje novih receptora ili puteva i za razvoj novih visoko efikasnih platformi za isporuku makromolekula, poput bioloških lijekova, u mozak.
Kanilirati veliku cisternu (CM) koristeći modifikaciju prethodno opisane metode. Anestezirani Wistar pacovi (200-350 g) postavljeni su na stereotaksični aparat i napravljen je medijal rez preko obrijanog i aseptično pripremljenog vlasišta kako bi se otkrila lobanja. Izbušiti dvije rupe u području gornjeg dijela krila i pričvrstiti vijke za fiksiranje u rupe. Dodatna rupa izbušena je u lateralnom okcipitalnom grebenu za stereotaksičko vođenje kanile od nehrđajućeg čelika u CM. Nanijeti zubni cement oko kanile i pričvrstiti vijcima. Nakon fotosenzibilizacije i stvrdnjavanja cementa, rana na koži zatvorena je supraamid šavom 4/0. Pravilno postavljanje kanile potvrđuje se spontanim curenjem cerebrospinalne tekućine (CSF). Ukloniti pacova iz stereotaksičnog aparata, primiti odgovarajuću postoperativnu njegu i liječenje boli te mu ostaviti da se oporavlja najmanje jednu sedmicu dok se ne uoče znakovi krvi u cerebrospinalnoj tekućini. Wistar pacovi (Crl:WI/Han) nabavljeni su od Charles Rivera (Francuska). Svi pacovi su držani u specifičnim uslovima bez patogena. Sve eksperimente na životinjama odobrio je Veterinarski ured grada Bazela u Švicarskoj i provedeni su u skladu s Dozvolom za životinje br. 2474 (Procjena aktivnog transporta mozga mjerenjem nivoa terapijskih kandidata u cerebrospinalnoj tekućini i mozgu pacova).
Pažljivo držite štakora pri svijesti s CM kanilom u ruci. Izvadite Daturu iz kanile i sakupite 10 µl spontano tekuće cerebrospinalne tekućine. Budući da je prohodnost kanile na kraju bila ugrožena, u ovu studiju su uključeni samo bistri uzorci cerebrospinalne tekućine bez dokaza o kontaminaciji krvlju ili promjeni boje. Paralelno s tim, približno 10-20 μl krvi uzeto je iz malog reza na vrhu repa u epruvete s heparinom (Sigma-Aldrich). CSF i krv su sakupljani u različitim vremenskim tačkama nakon intravenske injekcije T7 faga. Otprilike 5-10 μl tekućine je odbačeno prije nego što je sakupljen svaki uzorak cerebrospinalne tekućine, što odgovara mrtvom volumenu katetera.
Biblioteke su generirane korištenjem T7Select 10-3b vektora kao što je opisano u priručniku za T7Select sistem (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Ukratko, nasumični 12-merni DNK insert je sintetiziran u sljedećem formatu:
NNK kodon je korišten kako bi se izbjegli dvostruki stop kodoni i prekomjerna ekspresija aminokiselina u insertu. N je ručno miješani ekvimolarni omjer svakog nukleotida, a K je ručno miješani ekvimolarni omjer adeninskih i citozinskih nukleotida. Jednolančane regije su pretvorene u dvolančanu DNK daljnjom inkubacijom s dNTP-om (Novagen) i Klenow enzimom (New England Biolabs) u Klenow puferu (New England Biolabs) tokom 3 sata na 37°C. Nakon reakcije, dvolančana DNK je izolirana precipitacijom EtOH. Rezultirajuća DNK je digestovana restrikcijskim enzimima EcoRI i HindIII (oba od Roche-a). Cijepljeni i pročišćeni (QIAquick, Qiagen) insert (T4 ligaza, New England Biolabs) je zatim ligiran u okviru u prethodno cjepljeni T7 vektor nakon aminokiseline 348 kapsidnog gena 10B. Reakcije ligacije su inkubirane na 16°C tokom 18 sati prije in vitro pakovanja. Pakovanje faga in vitro je izvršeno prema uputama koje su priložene uz T7Select 10-3b komplet za kloniranje (Novagen), a rastvor za pakovanje je jednom amplifikovan do lize korištenjem Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lizati su centrifugirani, titrirani i zamrznuti na -80°C kao osnovni rastvor glicerola.
Direktna PCR amplifikacija varijabilnih regija faga amplifikovanih u bujonu ili na ploči korištenjem vlasničkih 454/Roche-amplicon fuzijskih prajmera. Prajmer za direktnu fuziju sadrži sekvence koje okružuju varijabilnu regiju (NNK) 12 (specifična za predložak), GS FLX Titanium Adapter A i ključnu sekvencu biblioteke s četiri baze (TCAG) (Dodatna slika 1a):
Primer za reverznu fuziju također sadrži biotin pričvršćen za kuglice za hvatanje i GS FLX Titanium Adapter B potreban za klonsku amplifikaciju tokom emulzijske PCR:
Amplikoni su zatim podvrgnuti pirosekvenciranju 454/Roche prema protokolu 454 GS-FLX Titanium. Za ručno Sanger sekvenciranje (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNK faga T7 je amplificirana PCR-om i sekvencirana sa sljedećim parovima primera:
Umetci iz pojedinačnih plakova podvrgnuti su PCR amplifikaciji korištenjem Roche Fast Start DNA Polymerase Kit-a (prema uputama proizvođača). Izvršen je vrući start (10 minuta na 95 °C) i 35 ciklusa pojačanja (50 sekundi na 95 °C, 1 minuta na 50 °C i 1 minuta na 72 °C).
Fagi iz biblioteka, fagi divljeg tipa, fagi oslobođeni iz cerebrospinalne tečnosti i krvi ili pojedinačni klonovi su amplificirani u Escherichia coli BL5615 u TB bujonu (Sigma Aldrich) ili u posudama od 500 cm2 (Thermo Scientific) tokom 4 sata na 37°C. Fagi su ekstrahovani sa ploča ispiranjem ploča Tris-EDTA puferom (Fluka Analytical) ili sakupljanjem plakova sterilnim vrhovima pipeta. Fagi su izolovani iz supernatanta kulture ili pufera za ekstrakciju jednim krugom precipitacije polietilen glikolom (PEG 8000) (Promega) i resuspendovani u Tris-EDTA puferu.
Amplificirani fag je podvrgnut 2-3 runde uklanjanja endotoksina korištenjem kuglica za uklanjanje endotoksina (Miltenyi Biotec) prije intravenske (IV) injekcije (500 μl/životinji). U prvoj rundi, uvedeno je 2×1012 faga; u drugoj, 2×1010 faga; u trećoj i četvrtoj rundi selekcije, 2×109 faga po životinji. Sadržaj faga u uzorcima cerebrospinalne tečnosti i krvi prikupljenim u navedenim vremenskim tačkama određen je brojanjem plaka prema uputama proizvođača (priručnik za T7Select sistem). Selekcija faga je izvršena intravenskom injekcijom pročišćenih biblioteka u repnu venu ili ponovnom injekcijom faga ekstrahovanog iz cerebrospinalne tečnosti iz prethodne runde selekcije, a naknadna sakupljanja su izvršena nakon 10 minuta, 30 minuta, 60 minuta, 90 minuta, 120 minuta, 180 minuta i 240 minuta, respektivno, uzoraka cerebrospinalne tečnosti i krvi. Ukupno su provedena četiri kruga in vivo panninga u kojima su dvije odabrane grane odvojeno pohranjene i analizirane tokom prva tri kruga selekcije. Svi fagni umetci ekstrahovani iz cerebrospinalne tečnosti (CSF) iz prva dva kruga selekcije podvrgnuti su 454/Roche pirosekvenciranju, dok su svi klonovi ekstrahovani iz CSF iz posljednja dva kruga selekcije ručno sekvencirani. Svi krvni fagi iz prvog kruga selekcije također su podvrgnuti 454/Roche pirosekvenciranju. Za injekciju fagnih klonova, odabrani fagi su amplificirani u E. coli (BL5615) na pločama od 500 cm2 na 37°C tokom 4 sata. Pojedinačno odabrani i ručno sekvencirani klonovi su propagirani u TB medijumu. Nakon ekstrakcije faga, pročišćavanja i uklanjanja endotoksina (kao što je gore opisano), 2×1010 faga/životinji u 300 μl je intravenozno injektirano u jednu repnu venu.
Prethodna obrada i kvalitativno filtriranje podataka o sekvenci. Sirovi 454/Roche podaci su konvertovani iz binarnog standardnog formata mape toka (sff) u Pearsonov format čitljiv ljudima (fasta) korištenjem softvera dobavljača. Dalja obrada nukleotidne sekvence izvršena je korištenjem vlasničkih C programa i skripti (neobjavljeni softverski paket) kao što je opisano u nastavku. Analiza primarnih podataka uključuje stroge višestepene procedure filtriranja. Da bi se filtrirali očitavanja koja nisu sadržavala validnu 12-mernu insertnu sekvencu DNK, očitavanja su sekvencijalno poravnata sa početnom oznakom (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stop oznakom (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) i pozadinskim insertom (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) korištenjem globalnog Needleman-Wunsch testa. poravnanje koje dozvoljava do 2 neusklađenosti po poravnanju31. Stoga su očitavanja bez početnih i stop oznaka i očitavanja koja sadrže pozadinske inserte, tj. poravnanja koja prelaze dozvoljeni broj neusklađenosti, uklonjena iz biblioteke. Što se tiče preostalih očitavanja, N-merna DNK sekvenca koja se proteže od početne oznake i završava prije stop oznake izrezana je iz originalne pročitane sekvence i dalje obrađena (u daljnjem tekstu: "insert"). Nakon translacije inserta, dio nakon prvog stop kodona na 5' kraju prajmera uklanja se iz inserta. Pored toga, uklonjeni su i nukleotidi koji vode do nepotpunih kodona na 3' kraju prajmera. Da bi se isključili inserti koji sadrže samo pozadinske sekvence, uklonjeni su i translirani inserti koji počinju sa aminokiselinskim obrascem "PAG". Peptidi sa posttranslacionom dužinom manjom od 3 aminokiseline uklonjeni su iz biblioteke. Konačno, uklonite redundanciju u skupu inserta i odredite frekvenciju svakog jedinstvenog inserta. Rezultati ove analize uključivali su listu nukleotidnih sekvenci (inserta) i njihove (očitane) frekvencije (Dopunske slike 1c i 2).
Grupiranje N-mer DNK inserata prema sličnosti sekvenci: Da bi se eliminirale greške u sekvenciranju specifične za 454/Roche (kao što su problemi sa sekvenciranjem homopolimernih ekstenzija) i uklonile manje važne redundancije, prethodno filtrirani N-mer DNK inserti (inserti) se sortiraju prema sličnosti insercija (dozvoljene su do 2 baze koje se ne podudaraju) korištenjem iterativnog algoritma definiranog na sljedeći način: insercije se prvo sortiraju po učestalosti (od najveće do najmanje), a ako su iste, po sekundarnom sortiranju po dužini (od najduže do najkraće). Dakle, najčešće i najduže insercije definiraju prvu "grupu". Učestalost grupe je postavljena na ključnu učestalost. Zatim je svaka preostala insercija na sortiranoj listi pokušana da se doda grupi parnim Needleman-Wunsch poravnanjem. Ako broj neusklađenosti, insercija ili brisanja u poravnanju ne prelazi prag od 2, insercija se dodaje grupi, a ukupna učestalost grupe se povećava za učestalost dodavanja insercije. Inserti dodani grupi su označeni kao korišteni i isključeni iz daljnje obrade. Ako se insertna sekvenca ne može dodati već postojećoj grupi, insertna sekvenca se koristi za kreiranje nove grupe sa odgovarajućom frekvencijom inserta i označava se kao korištena. Iteracija se završava kada je svaka insercijska sekvenca ili korištena za formiranje nove grupe ili se može uključiti u već postojeću grupu. Uostalom, grupisani inserti koji se sastoje od nukleotida se na kraju prevode u peptidne sekvence (peptidne biblioteke). Rezultat ove analize je skup insercija i njihovih odgovarajućih frekvencija koje čine broj uzastopnih očitavanja (Dopunska slika 2).
Generisanje motiva: Na osnovu liste jedinstvenih peptida, kreirana je biblioteka koja sadrži sve moguće obrasce aminokiselina (aa) kao što je prikazano ispod. Svaki mogući obrazac dužine 3 je ekstrahovan iz peptida i njegov inverzni obrazac je dodan zajedno sa zajedničkom bibliotekom motiva koja sadrži sve obrasce (tripeptide). Biblioteke visoko repetitivnih motiva su sekvencirane i redundantnost je uklonjena. Zatim, za svaki tripeptid u biblioteci motiva, provjerili smo njegovo prisustvo u biblioteci pomoću računarskih alata. U ovom slučaju, frekvencija peptida koji sadrži pronađeni motiv tripeptida se dodaje i dodjeljuje motivu u biblioteci motiva („broj motiva“). Rezultat generisanja motiva je dvodimenzionalni niz koji sadrži sva pojavljivanja tripeptida (motiva) i njihove odgovarajuće vrijednosti, koje predstavljaju broj sekvenciranih očitavanja koja rezultiraju odgovarajućim motivom kada se očitavanja filtriraju, grupišu i prevedu. Metrike su detaljno opisane iznad.
Normalizacija broja motiva i odgovarajućih dijagrama raspršenja: Broj motiva za svaki uzorak normalizovan je korištenjem
gdje je ni broj očitavanja koja sadrže temu i. Dakle, vi predstavlja procentualnu učestalost očitavanja (ili peptida) koji sadrže motiv i u uzorku. P-vrijednosti za nenormalizirani broj motiva izračunate su korištenjem Fisherovog egzaktnog testa. Što se tiče korelograma broja motiva, Spearmanove korelacije su izračunate korištenjem normaliziranog broja motiva sa R.
Za vizualizaciju sadržaja aminokiselina na svakoj poziciji u biblioteci peptida, kreirani su web logogrami 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Prvo, sadržaj aminokiselina na svakoj poziciji 12-mernog peptida pohranjuje se u matricu 20×12. Zatim se generira skup od 1000 peptida koji sadrže isti relativni sadržaj aminokiselina na svakoj poziciji u fasta-sequence formatu i daje kao ulaz web-logu 3, koji generira grafički prikaz relativnog sadržaja aminokiselina na svakoj poziciji za datu biblioteku peptida. Za vizualizaciju višedimenzionalnih skupova podataka, kreirane su toplotne mape korištenjem interno razvijenog alata u R-u (biosHeatmap, R paket koji još nije objavljen). Dendrogrami prikazani na toplotnim mapama izračunati su korištenjem Wardove metode hijerarhijskog klasteriranja s euklidskom metrikom udaljenosti. Za statističku analizu podataka o bodovanju motiva, P vrijednosti za nenormalizirano bodovanje izračunate su korištenjem Fisherovog egzaktnog testa. P-vrijednosti za ostale skupove podataka izračunate su u R-u korištenjem Studentovog t-testa ili ANOVA-e.
Odabrani fagni klonovi i fagi bez inserata injektirani su intravenozno putem repne vene (2×1010 faga/životinji u 300 μl PBS-a). Deset minuta prije perfuzije i naknadne fiksacije, istim životinjama je intravenozno injektirano 100 μl lektina obilježenog DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minuta nakon injekcije faga, pacovi su perfuzirani kroz srce sa 50 ml PBS-a, a zatim sa 50 ml 4% PFA/PBS-a. Uzorci mozga su dodatno fiksirani preko noći u 4% PFA/PBS-u i natopljeni u 30% saharozi preko noći na 4°C. Uzorci su brzo zamrznuti u OCT smjesi. Imunohistohemijska analiza zamrznutih uzoraka provedena je na sobnoj temperaturi na kriosekcijama od 30 µm blokiranim sa 1% BSA i inkubiranim sa poliklonskim FITC-obilježenim antitijelima protiv T7 faga (Novus NB 600-376A) na 4°C. Inkubirati preko noći. Konačno, rezovi su isprani 3 puta s PBS-om i pregledani konfokalnim laserskim mikroskopom (Leica TCS SP5).
Sve peptide s minimalnom čistoćom od 98% sintetizirala je kompanija GenScript USA, biotinilirala ih i liofilizirala. Biotin je vezan putem dodatnog trostrukog glicinskog razmaknika na N-terminusu. Provjerite sve peptide pomoću masene spektrometrije.
Streptavidin (Sigma S0677) je pomiješan sa 5-strukim ekvimolarnim viškom biotiniliranog peptida, biotiniliranog BACE1 inhibitornog peptida ili kombinacijom (omjer 3:1) biotiniliranog BACE1 inhibitornog peptida i BACE1 inhibitornog peptida u 5–10% DMSO/inkubirano u PBS-u. 1 sat na sobnoj temperaturi prije injekcije. Streptavidin-konjugirani peptidi su injektirani intravenozno u dozi od 10 mg/kg u jednu od repnih vena pacova sa moždanom šupljinom.
Koncentracija streptavidin-peptidnih kompleksa procijenjena je ELISA testom. Nunc Maxisorp mikrotitarske ploče (Sigma) su preko noći na 4°C obložene sa 1,5 μg/ml mišjeg anti-streptavidin antitijela (Thermo, MA1-20011). Nakon blokiranja (pufer za blokiranje: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% želatina, 1% BSA) na sobnoj temperaturi tokom 2 sata, ploča je isprana sa 0,05% Tween-20/PBS (pufer za pranje) tokom 3 sekunde. Uzorci cerebrospinalne tečnosti (CSF) i plazme su dodani u jažice razrijeđene puferom za blokiranje (plazma 1:10.000, CSF 1:115). Ploča je zatim inkubirana preko noći na 4°C sa detekcijskim antitijelom (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Nakon tri koraka ispiranja, streptavidin je detektovan inkubacijom u rastvoru TMB supstrata (Roche) do 20 minuta. Nakon zaustavljanja razvoja boje sa 1M H2SO4, izmjerite apsorbanciju na 450 nm.
Funkcija kompleksa streptavidin-peptid-BACE1 inhibitor procijenjena je Aβ(1-40) ELISA testom prema protokolu proizvođača (Wako, 294-64701). Ukratko, uzorci CSF-a su razrijeđeni u standardnom razrjeđivaču (1:23) i inkubirani preko noći na 4°C u pločama sa 96 jažica obloženim BNT77 antitijelom za hvatanje. Nakon pet koraka ispiranja, dodano je HRP-konjugirano BA27 antitijelo i inkubirano 2 sata na 4°C, nakon čega je uslijedilo pet koraka ispiranja. Aβ(1–40) je detektovan inkubacijom u TMB rastvoru tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon što je razvoj boje zaustavljen stop rastvorom, izmjerite apsorbanciju na 450 nm. Uzorci plazme su podvrgnuti ekstrakciji na čvrstoj fazi prije Aβ(1–40) ELISA testa. Plazma je dodana u 0,2% DEA (Sigma) u pločama sa 96 jažica i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Nakon sukcesivnog ispiranja SPE ploča (Oasis, 186000679) vodom i 100% metanolom, uzorci plazme su dodani na SPE ploče i sva tekućina je uklonjena. Uzorci su isprani (prvo sa 5% metanolom, a zatim sa 30% metanolom) i eluirani sa 2% NH4OH/90% metanolom. Nakon sušenja eluata na 55°C tokom 99 minuta pri konstantnoj struji N2, uzorci su reducirani u standardnim razrjeđivačima i Aβ(1–40) je mjeren kao što je gore opisano.
Kako citirati ovaj članak: Urich, E. i dr. Dostava tereta u mozak korištenjem tranzitnih peptida identificiranih in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB i Moos T. Isporuka makromolekularnih lijekova u mozak korištenjem ciljane terapije. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. i Martinez-Martinez, P. Isporuka peptidnih i proteinskih lijekova preko krvno-moždane barijere. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Krvno-moždana barijera: usko grlo u razvoju lijekova za mozak. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG i Byrd, A. Izgledi za poboljšanu dostavu lijekova i ciljanje mozga putem puta horoidnog pleksusa-CSF. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernizacija biofarmaceutika s molekularnim trojanskim konjima za dostavu u mozak. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptorom posredovan transport peptida preko krvno-moždane barijere. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. i dr. Povećanje penetracije mozga i efikasnosti terapijskih antitijela korištenjem monovalentnih molekularnih šatlova. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. i dr. Transport receptora transferina (TfR) određuje unos afinitetnih varijanti TfR antitijela u mozak. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).